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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE FILOSOFIA CIÊNCIAS E LETRAS DE
RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE FÍSICA E MATEMÁTICA
MARINA PIACENTI DA SILVA
ESTUDO DA FLUORESCÊNCIA DE ELEMENTOS TRAÇOS
PARA IDENTIFICAR A PRESENÇA DE NEOPLASIAS
MAMÁRIAS
RIBEIRÃO PRETO
2007
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MARINA PIACENTI DA SILVA
ESTUDO DA FLUORESCÊNCIA DE ELEMENTOS TRAÇOS
PARA IDENTIFICAR A PRESENÇA DE NEOPLASIAS
MAMÁRIAS
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação
em Física Aplicada à Medicina e Biologia da Faculdade
de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, da
Universidade de São Paulo, como requisito para a
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Martin Eduardo Poletti.
RIBEIRÃO PRETO
2007
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ii
Dedico esta dissertação a algumas pessoas especiais:
Ao meu namorado Luiz Carlos, por todo seu amor, amizade, por estar sempre ao meu
lado e ser uma pessoa tão importante em minha vida.
A meus pais Geraldo e Maria José, pela formação que me proporcionaram, e por
sempre me apoiarem, nunca me deixando desistir.
À Santa Luzia, por uma enorme graça a mim concedida.
(... o que importa não é o que você tem na vida, mas QUEM você tem na vida...)
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela minha vida e pelas oportunidades proporcionadas.
Ao Prof. Dr. Martin Eduardo Poletti pela orientação em todas as etapas deste trabalho.
À minha irmã Carolina, uma pessoa tão especial.
À Tia Mara, Tio César, Tati, Bruna, Tia Aninha, Tio Elias, Gabriel Elias, Maria Luiza, Tio
Binho, Tia Dri, Letícia e Lucas, por tornarem os momentos em família tão agradáveis.
A meus avós Geraldo, Maria, Carlos e Lourdes que me guiam, mesmo não estando mais
conosco.
À minha amiga Alessandra por ser companheira em todas as horas e me ajudar neste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Virgílio Franco do Nascimento Filho do Laboratório de Instrumentação
Nuclear do Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA) da Universidade de São
Paulo/USP - Campus Piracicaba, pela disposição e ajuda nos experimentos com feixe
polienergético.
Ao Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) por disponibilizar a linha de
Fluorescência de Raios-X para as medidas com feixe monoenergético, ao pesquisador
Carlos Alberto Pérez pela atenção e construtivas discussões acerca dos resultados e à
técnica Simone do laboratório de apoio ao usuário.
Ao Prof. Dr. Alfredo Ribeiro da Silva, pelos esclarecimentos e discussões sobre as
características histopatológicas das doenças de mama.
Ao Serviço de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo, por fornecer os materiais analisados neste trabalho.
iv
Aos professores do curso de pós-graduação em Física Aplicada à Medicina e Biologia, do
Departamento de Física e Matemática da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de
Ribeirão Preto, que contribuíram para minha formação.
Aos técnicos do Departamento de Física e Matemática pela ajuda e atenção.
Aos meus amigos da faculdade: Andréa, Andrezão, Ana Paula, Betinho, Brunão, Bruno
José, Carô, Chico, Fernanda, Ju, Karina, Khallil, Marcelão, Rick, Silvio e tantos outros,
por sempre poder compartilhar e discutir importantes assuntos na hora do almoço.
Aos amigos Diego, Mirko, André e Marcelo pelos dias compartilhados no laboratório.
Às meninas de casa: Luciana, Juliana, Tati, Lílian, Ana e Renata, por dividir experiências
e as contas...
Aos meus amigos de Araraquara e meu amigo Mario Henrique, pela amizade, mesmo à
distância.
Às amigas Valéria e Kátia.
À FAPESP, pela concessão da bolsa ao projeto “Estudo da fluorescência de elementos
traços para identificar a presença de neoplasias mamárias”, processo 04/12509-6.
A todos que contribuíram, direta e indiretamente, para a realização deste trabalho.
v
SUMÁRIO
1. Introdução
........................................................................................................................... 1
2. Fundamentos Teóricos.................................................................................................... 6
2.1. Princípios físicos da fluorescência de raios-X.................................................................. 6
2.1.1. Modelo atômico e raios-X característicos .................................................................... 6
2.1.2. Interação da radiação com a matéria........................................................................... 7
2.1.3. Coeficiente de atenuação .............................................................................................. 9
2.2. As técnicas de Fluorescência de Raios-X induzida por fótons ..................................... 10
2.2.1. Descrição do espectrômetro de EDXRF ..................................................................... 11
2.2.2. Relação entre a intensidade de fluorescência com a concentração............................ 13
2.2.3. Intensidade de radiação espalhada: Espalhamentos incoerente e coerente............... 17
2.2.4. Métodos de análise quantitativa para a técnica de EDXRF....................................... 19
3. Materiais e Métodos ...................................................................................................... 22
3.1. Amostras............................................................................................................................ 22
3.1.1. Aspectos gerais anatômicos e histológicos ................................................................. 22
3.1.2. Coleta das amostras e classificação histológica......................................................... 23
3.1.3. Preparação das amostras............................................................................................ 24
3.2. Arranjo experimental....................................................................................................... 25
3.3. Metodologia para quantificação dos elementos traços.................................................. 27
3.3.1. Procedimento de calibração: Métodos de correção para os efeitos de matriz........... 27
3.3.2. Análise das intensidades dos espectros obtidos.......................................................... 30
3.4. Análise estatística.............................................................................................................. 31
3.4.1. Testes estatísticos ........................................................................................................ 31
3.4.2. Correlação................................................................................................................... 31
4. Resultados e Discussões................................................................................................ 32
4.1. Curvas de calibração........................................................................................................ 32
4.1.1. Método de correção para feixe polienergético............................................................ 32
4.1.2. Método de correção para feixe monoenergético......................................................... 35
4.2. Valores de concentrações................................................................................................. 38
vi
4.3. Comparação entre os resultados da utilização de feixes polienergéticos e
monoenergéticos com a literatura.......................................................................................... 42
4.4. Testes estatísticos.............................................................................................................. 44
4.4.1. Frequências de distribuição........................................................................................ 44
4.4.2. Comparação entre tecidos normais e neoplásicos...................................................... 46
4.4.3. Comparação entre neoplasias benignas e malignas................................................... 47
4.4.4. Correlações ................................................................................................................. 47
Conclusões................................................................................................................................. 50
Referências................................................................................................................................ 53
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1: (a) excitação de um átomo e (b) emissão de raios-X característicos........................... 6
Figura 2.2: Configuração típica de um equipamento de fluorescência de raios-X ...................... 12
Figura 2.3: Espectro de fluorescência de solução aquosa contendo ferro, cobre e zinco. ........... 13
Figura 2.4: Modelo relacionado aos parâmetros experimentais................................................... 14
Figura 3.1: Representação da estrutura da glândula mamária...................................................... 22
Figura 3.2: Número total de amostras estudadas.......................................................................... 24
Figura 3.3: Arranjo experimental para as medidas com feixe polienergético.............................. 26
Figura 3.4: Porta amostras e detector na análise com feixe monoenergético. ............................. 27
Figura 4.1: Espectros de tecidos mamários e soluções padrão obtidos com feixe polienergético
de potencial de excitação de 10 kVp. ........................................................................ 32
Figura 4.2: Curvas de calibração para os elementos (a) cálcio (10kVp) e (b) zinco (25kVp)..... 34
Figura 4.3: Espectros de tecidos mamários e soluções padrão obtidos com feixe monoenergético
de energia 11keV....................................................................................................... 35
Figura 4.4: Curvas de calibração para os elementos ferro e cobre (a) e (c) não normalizadas pelo
espalhamento e (b) e (d) normalizadas pelo espalhamento, obtidas com feixe
monoenergético de 11 keV........................................................................................ 36
Figura 4.5: Curvas de calibração teóricas para os elementos ferro e cobre (a) e (c) não
normalizadas pelo espalhamento e (b) e (d) normalizadas pelo espalhamento......... 37
Figura 4.6: Distribuição das concentrações dos elementos traços (a) cálcio, (b) ferro, (c) cobre e
(d) zinco em diferentes tecidos, obtidas com feixe monoenergético......................... 41
Figura 4.7: Freqüências de distribuição dos elementos traços em tecidos normais, tecidos
neoplásicos e tecidos normais periféricos – distribuições obtidas com feixe
monoenergético. ........................................................................................................ 45
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1: Características dos métodos comparativos de análise quantitativa........................... 20
Tabela 3.1: Valores da composição elementar (frações em massa) de tecidos encontrados na
literatura e nas soluções utilizadas, com exceção dos elementos traços. ................ 28
Tabela 4.1: Valores de concentração de cálcio em tecidos mamários ......................................... 39
Tabela 4.2: Valores de concentração de ferro em tecidos mamários ........................................... 39
Tabela 4.3: Valores de concentração de cobre em tecidos mamários .......................................... 40
Tabela 4.4: Valores de concentração de zinco em tecidos mamários .......................................... 40
Tabela 4.5: Valores da magnitude de elevação das concentrações dos elementos traços em
tecidos mamários em estado natural...................................................................... 42
Tabela 4.6: Valores de magnitude de elevação entre as medianas das concentrações dos
elementos traços em tecidos mamários desidratados .............................................. 44
Tabela 4.7: Significâncias do teste de normalidade para as distribuições de frequências ........... 46
Tabela 4.8: Correlações entre elementos traços em tecidos mamários normais periféricos,
normais e neoplásicos (feixe monoenergético). ...................................................... 48
ix
RESUMO
SILVA MP. Estudo da Fluorescência de Elementos Traços para Identificar a Presença de
Neoplasias Mamárias. [Dissertação]. Ribeirão Preto: Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo; 2007. 68p.
Uma das maiores causas da alta taxa de mortalidade em todo o mundo está relacionada
com a neoplasia em tecidos. Particularmente, o câncer de mama é o segundo tipo desta doença
que mais atinge mulheres no Brasil. O diagnóstico precoce certamente pode diminuir o risco de
morte de pessoas com este tipo de doença e o tratamento e a prevenção são certamente um dos
grandes desafios enfrentados pela medicina contemporânea. Atualmente, vem surgindo uma nova
ferramenta de potencial diagnóstico, baseada no estudo de alguns elementos químicos que estão
presentes em pequena quantidade no organismo, conhecidos como elementos traços. Estes
elementos, responsáveis por algumas funções biológicas, podem apresentar-se em diferentes
concentrações em tecidos normais e neoplásicos, o que pode indicar as mudanças
histopatológicas dos tecidos e tornar possível a identificação de cada tipo de neoplasia. Desta
forma, o estudo e determinação dos elementos traços em tecidos neoplásicos, que é o foco deste
trabalho, apresenta uma nova área de interesse de investigação, principalmente pela possibilidade
de oferecer informações diagnósticas, melhorando sua eficiência e em conseqüência, melhorando
o prognóstico da paciente. Neste trabalho, utilizando a técnica de Fluorescência de Raios-X com
feixes polienergéticos e monoenergéticos, determinamos as concentrações dos elementos traços
em tecidos mamários normais e neoplásicos. Foram estudadas ao total 101 amostras de tecidos
mamários normais, neoplásicos e tecidos normais adjacentes às neoplasias. As correções para os
efeitos de matriz foram realizadas pelo método de padrão externo e pelo método de radiação
espalhada para feixes polienergético e monoenergético respectivamente. Os resultados obtidos
mostraram que todos os elementos analisados estão em níveis elevados nas espécies neoplásicas
em relação às normais. Nas medidas com feixe polienergético foram verificadas diferenças
significativas entre as concentrações dos elementos cobre e zinco entre tecidos normais e
neoplásicos de amostras pareadas (p < 0,005) e não pareadas (p < 0,001). Com feixe
monoenergético, foram obtidas diferenças significativas entre as concentrações de todos os
elementos (Ca, Fe, Cu e Zn) em tecidos normais e neoplásicos de amostras pareadas e não
pareadas (ambas com p < 0,001). Para as concentrações dos elementos cálcio e zinco foram
observadas ainda diferenças significativas entre tecidos neoplásicos benignos e malignos (p <
0,001 e p < 0,002 respectivamente). A quantificação das concentrações dos elementos traços em
tecidos normais e neoplásicos pode vir, portanto, auxiliar com precisão o diagnóstico das
neoplasias de mama.
Palavras-chave: Câncer de mama; Diagnóstico; Elementos traços; Fluorescência de Raios-X
x
ABSTRACT
SILVA MP. Study of Trace Elements Fluorescence to identify the presence of breast cancer.
[Dissertation]. Ribeirão Preto: Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo; 2007. 68 p.
One of the major causes of the elevated rate of mortality in the whole world is related with the
neoplasies in tissues. Particularly, the breast cancer is the second type of this disease that more
reaches women in Brazil. Early diagnosis certainly can reduce the death risk in people with this
type of disease and the treatment and prevention are certainly the great challenges found by
medicine today. At present, it comes appearing a new diagnostic tool, based in the study of some
chemical elements that are in small amount in the organism, known as trace elements. These
elements, responsible for some biological functions, can be in different concentrations in healthy
and neoplasics tissues that can indicate histopatological changes of breast cancer tissues, and
become possible the identification of each type of neoplasies. In this way, the study and
determination of trace elements in neoplastic tissues, the aim of this work, can be a new area of
interest, mainly for the possibility to offer diagnostic information, improving its efficiency and in
consequence, to improve the prognostic of the patient. In this work, using X-ray Fluorescence
technique with polienergetic and monoenergetic beams, we determined the concentrations of the
trace elements in healthy and neoplastic breast tissues. A total of 101 samples of healthy,
neoplastic and adjacent normal tissues to neoplasies had been studied. The corrections for the
matrix effect had been carried through by the method of external standard and by the method of
scattered radiation for polienergetic and monoenergetic beams respectively. Results showed that
all the analyzed elements are in raised levels in the neoplastic tissues in relation to the normal
ones. In procedures with polienergetic beam significant differences between the concentrations of
the elements copper and zinc had been verified between normal and neoplastic tissues of paired
samples (p < 0,005) and independent samples (p < 0.001). With monoenergetic beam,
concentrations of all elements (Ca, Fe, Cu and Zn) in healthy and neoplastic tissues of paired and
independent samples showed significant differences (all with p < 0.001). For concentrations of
the elements calcium and zinc significant differences between benign and malignant neoplastic
tissues had been observed (0.001 p < and p < 0,002 respectively). The quantification of
concentrations of trace elements in normal and neoplastic tissues can, therefore, support with
precision the diagnosis of the breast cancer.
Keywords: Breast Cancer; Diagnosis; Trace Elements; X-Ray Fluorescence
1
Capítulo 1
1. Introdução
Introdução
O tratamento e a prevenção do câncer de tecidos é certamente um dos grandes desafios
enfrentados pela medicina contemporânea. No Brasil, os carcinomas mamários são o segundo
tipo mais comum de câncer, responsáveis por uma alta taxa de mortalidade. As estimativas
divulgadas pelo Instituto Nacional do Câncer (INCa) para o ano de 2006, apontaram a ocorrência
de 472.050 novos casos de câncer e dentre estes, 48.930 casos de câncer de mama,
acompanhando a mesma tendência observada em todo o mundo (INSTITUTO NACIONAL DO
CÂNCER, 2005).
O diagnóstico do câncer de mama é na maioria das vezes estabelecido em uma fase tardia
da doença, resultado de uma política ineficaz de controle e rastreamento, que tem na mamografia,
aliada ao exame clínico das mamas e ao auto-exame, seus instrumentos fundamentais (ABREU E
KOIFMAN, 2002; THULER, 2003). Apesar de a mamografia ser atualmente a ferramenta
diagnóstica de maior poder de detecção do câncer de mama, em muitos casos esta técnica não
fornece critérios definitivos que permitam diferenciar os tipos de tecidos devido à semelhança de
atenuação entre tecidos glandulares e neoplásicos (JOHNS E YAFFE, 1987). Desta forma, novos
métodos de diferenciação entre os tipos de neoplasia, como o ultra-som, a ressonância magnética,
biópsias e avaliação anatomo-patológica dos tecidos, vêm surgindo com o objetivo de diferenciar
os tipos de neoplasias e permitir a detecção precoce do câncer de mama, que representa grande
importância no aumento da expectativa de vida das mulheres afetadas (HOUSSAMI ET AL,
2005; MAKLUF ET AL, 2006).
Atualmente, vem surgindo uma nova ferramenta de potencial diagnóstico, baseada no
estudo de alguns elementos químicos que estão presentes em pequena quantidade no organismo
(CESAREO, 1988). Estes elementos são classificados como elementos traços e geralmente
representam menos de um por cento (1%) do peso do material e podem ser classificados como
essenciais e não essenciais dependendo da necessidade do organismo com relação a estes
(CESAREO, 1988), sendo que cerca de 15 elementos traços são essenciais ao organismo
humano: Ca, Cu, Cl, F, I, Fe, Mg, Mn, Mo, N, P, K, Na, S e Zn (TOLGYESSY ET AL, 1990).
Todos os tecidos humanos apresentam uma composição de elementos traços semelhante, que
Introdução 2
varia de acordo com a função exercida pelo tecido ou órgão. Elementos essenciais para o
metabolismo celular, em níveis normais, participam de um grande número de processos
biológicos que incluem desde a ativação ou inibição de reações enzimáticas até modificações na
permeabilidade das membranas celulares, entre outros. É reconhecido, também, que alguns
elementos traços representam importantes fatores de risco, uma vez que podem induzir desordens
patológicas no organismo (CESAREO, 1998).
Elementos como cálcio, ferro, cobre e zinco, que participam de alguns processos
fisiológicos capazes de regular o funcionamento de células e tecidos, podem estar em
concentrações elevadas em tecidos tumorais devido principalmente ao aumento do metabolismo
celular na região. O cálcio e o zinco, entre outras funções, compõem algumas metaloproteinases
de matriz (MMPs), uma família de proteases, cujo papel é degradar a matriz extracelular de
tecidos neoplásicos, favorecendo o crescimento do tumor e metástases (GERBER ET AL, 1996;
DUFFY ET AL, 2000; BAKER ET AL, 2002; FREIJE ET AL, 2003). Além disso, o Zn é um dos
elementos responsáveis pela ativação da enzima transcriptase reserva, o que faz aumentar sua
concentração em regiões tumorais, de alta atividade celular [PRASAD E OBERLEAS, 1976]. O
ferro e o cobre participam do processo de angiogênese, promovendo a formação de novos vasos
sanguíneos e favorecendo o crescimento do tumor e sua disseminação (KIM ET AL, 1993;
ELLIS E FIDLER, 1996; LUDOVINI ET AL, 2003). Destaca-se ainda que o cobre é o principal
regulador de enzimas essenciais para a respiração celular, defesa contra radicais livres e um
importante cofator para o metabolismo do ferro (NASULEWICZA ET AL, 2004).
Atualmente, existem diversos tipos de técnicas, qualitativas e quantitativas, que permitem
determinar as concentrações dos elementos traços em tecidos humanos (SANTOLIQUIDO ET
AL, 1976; RIZK E SKY-PECK, 1984; VON BOHLEN ET AL, 1987; ROSEN, 1996; NG ET
AL, 1997; BENNINGHOFF ET AL, 1997; BALCERZAK, 1997; MAJEWSKA, 1999; MARCÒ
ET AL, 2001; GERAKI ET AL, 2002; HOLLAND, 2003; POLETTI ET AL, 2004; RAO ET AL,
2004; RIBEIRO-SILVA ET AL, 2005; NAGA RAJU ET AL, 2006). As mais tradicionais,
aplicadas na área da medicina, realizam exames imuno-histoquímicos, que usam marcadores
biológicos para caracterizar o local de origem e o tipo de malignidade presente no tecido, bem
como o grau de atividade proliferativa do tumor (ROSEN, 1996; HOLLAND, 2003; RIBEIRO-
SILVA ET AL, 2005). Outras técnicas de caráter analítico são: a Espectroscopia por Absorção
Atômica (SANTOLIQUIDO ET AL, 1976); ICP-AES (Inductively Coupled Plasma Atomic
Introdução 3
Emission Spectrometry) (BALCERZAK,1997); a Análise por Ativação Neutrônica (NG ET AL,
1997); PIXE (Particle-induced X-ray emission) (MAJEWSKA, 1999); e a Fluorescência de
Raios-X (FRX ou XRF – X-Ray Fluorescence) (GERAKI ET AL, 2004.a; GERAKI ET AL,
2004.b; POLETTI ET AL, 2004). Estas técnicas permitem medir e monitorar, simultaneamente,
uma ampla quantidade de elementos.
Vários autores vêm estudando os elementos traços em tecidos mamários através das
diferentes técnicas analíticas (RIZK E SKY-PECK, 1984; NG ET AL, 1997; GERAKI ET AL,
2002; GERAKI ET AL, 2004.a; POLETTI ET AL, 2004; NAGA RAJU, 2006; SIDDIQUI ET
AL, 2006).
Rizk e Sky-Peck (1984) avaliaram através de EDXRF as concentrações de elementos
traços em 25 amostras de tecidos mamários, encontrando diferenças significativas (p < 0,001)
entre amostras normais e neoplásicas para os elementos Ca, V, Cu, Zn, Se e Rb.
Ng et al (1997) estudaram através da Análise por Ativação Neutrônica os elementos Al,
Br, Ca, Cl, Co, Cs, Fe, K, Mn, Na, Rb e Zn em 46 amostras de tecidos mamários, encontrando
para todos estes elementos concentrações significativamente maiores em tecidos neoplásicos (p <
0,001), exceto para o Co (p < 0,003). Observou ainda que a elevação dessas concentrações pode
estar relacionada ao aparecimento de calcificações na mama.
Geraki et al (2002) e Poletti et al (2004) estudaram respectivamente 80 e 9 amostras de
tecidos mamários utilizando a técnica de Fluorescência de Raios-X com radiação monoenergética
para determinar a concentração de elementos como K, Ca, Mn, Fe, Cu e Zn em tecidos mamários
utilizando curvas de calibração de soluções aquosas de elementos traços com concentrações
conhecidas. Ambos trabalhos mostraram que as concentrações dos elementos traços encontram-se
em níveis elevados em tecidos neoplásicos. Em outro trabalho, Geraki et al. (2004.a) combinou
ainda técnicas de XRF, XRD (X-Ray Diffraction) e o método de Monte Carlo com o objetivo de
melhorar a convergência entre a matriz tecidual e as curvas de calibração, para quantificar os
elementos K, Fe, Cu e Zn. Embora esta aproximação tenha permitido que os dados de XRF de
cada espécie fossem corrigidos de acordo com sua composição, pouca melhora na acurácia dos
resultados foi obtida.
Naga Raju et al, (2006) utilizando PIXE em 18 amostras de tecidos mamários verificou
um aumento significativo (p < 0,05) de vários elementos traços em tecidos mamários.
Introdução 4
Siddiqui et al (2006) avaliou as concentrações dos elementos Pb, Zn, Cu, Fe e Ca em 75
amostras de tecidos mamários com a técnica de Espectroscopia por Absorção Atômica. Seus
resultados mostraram um aumento significativo das concentrações destes elementos em tecidos
neoplásicos, com exceção do chumbo, que apesar de apresentar concentração elevada em tecidos
neoplásicos, a diferença não era significativa.
Os resultados das concentrações de elementos traços reportados por estes autores não são
consistentes (e muita vezes provém da análise de um pequeno número de amostras), além do
procedimento experimental e da análise das medidas gerarem dúvidas, principalmente no que se
refere a como corrigir o parâmetro físico que está sendo medido, embora todos os trabalhos
indiquem um aumento dos elementos traços em tecidos alterados quando comparados com
tecidos normais (GERAKI ET AL, 2004.a; NAGA RAJU, 2006; SIDDIQUI ET AL, 2006).
O presente trabalho teve como objetivo dar uma seqüência natural a esses estudos,
aumentando o número de amostras para um número estatisticamente significativo e testando as
potencialidades reais de relacionar o acúmulo ou diminuição de elementos traços em tecidos
mamários com suas patologias através da espectroscopia de Fluorescência de Raios-X. Espera-se
que estes resultados sirvam para colaborar no desenvolvimento de uma técnica promissora na
identificação dos tecidos patológicos, contribuindo à área diagnóstica, pois permitiria a
diferenciação entre tecidos normais e os diversos tipos de câncer.
O trabalho foi organizado da seguinte forma:
O capítulo 2 descreve os conceitos físicos envolvidos com a FRX, como a produção de
fluorescência por um átomo (raios-X característicos), processos de interação da radiação com a
matéria, e os princípios da técnica de FRX. São deduzidas também as relações teóricas para a
intensidade de fluorescência em função da concentração dos elementos traços e para a
intensidade da radiação espalhada pela amostra. Finalmente, são descritos de forma geral os
diversos métodos de análise quantitativa da técnica de FRX.
No capítulo 3 uma breve discussão é feita acerca dos aspectos anatômicos e histológicos
dos tecidos mamários. São apresentados ainda os tipos de tecidos analisados, o arranjo
experimental utilizado para a medida das concentrações dos elementos traços, utilizando feixes
polienergéticos e monoenergéticos, bem como a metodologia utilizada para a quantificação das
concentrações e uma descrição dos testes estatísticos realizados para o estudo da significância das
possíveis diferenças nas concentrações dos elementos traços em diferentes tecidos.
Introdução 5
O capítulo 4 apresenta os resultados obtidos para os valores de concentração dos
elementos traços, obtidos com feixes polienergéticos e monoenergéticos. São apresentados ainda
os resultados dos testes estatísticos.
No capítulo 5 são apresentadas as conclusões do trabalho e perspectivas para futuros
estudos.
6
Capítulo 2
2. Fundamentos Teóricos
Fundamentos Teóricos
2.1. Princípios físicos da fluorescência de raios-X
2.1.1. Modelo atômico e raios-X característicos
O modelo atômico proposto por Niels Bohr resulta na distribuição dos elétrons em
camadas quantizadas em torno do núcleo (CESAREO, 1988). Na terminologia de raios-X, a
camada eletrônica mais próxima do núcleo é denominada camada K, e as camadas subseqüentes
são denominadas camadas L, M, N, etc (CESAREO, 1988). A figura 2.1(a) representa um átomo
em seu estado normal, submetido à excitação apropriada, seja na forma de partícula corpuscular
ou de radiação eletromagnética. Se a energia incidente possuir valor igual ou maior à energia de
ligação do elétron, este será ejetado do átomo formando uma vacância, que será posteriormente
preenchida através da captura e/ou decaimento de outro elétron de uma camada mais externa
(figura 2.1.(b)). Essa transição eletrônica faz com que o átomo perca energia, emitindo um fóton
de raio-X característico (fluorescência), com energia correspondente à diferença de energia entre
as camadas (TERTIAN E CLAISSE, 1982).
Figura 2.1: (a) excitação de um átomo e (b) emissão de raios-X característicos
A lacuna formada pelo elétron que preencheu a vacância da camada K pode ser por sua
vez preenchida por elétrons mais externos dando origem a outras linhas de emissão. A radiação
característica correspondente ao preenchimento das vacâncias na camada K é denominada série
Fundamentos Teóricos 7
K, a corresponde ao preenchimento das vacâncias da camada L é denominada série L, e assim
sucessivamente. Em geral, cada série de raios-X é seguida de uma letra grega que indica qual
camada sofreu a transição. De forma geral, raios K
α
correspondem à transição eletrônica da
camada L para K, e raios K
β
correspondem à transição de uma camada M para uma camada K
(CESAREO, 1988).
2.1.2. Interação da radiação com a matéria
Quando um feixe de raios-X atravessa um meio absorvedor podem ocorrer vários
fenômenos de interação dependendo da energia da radiação. Na faixa de energia da fluorescência
de raios-X, que vai de 1 keV a aproximadamente 100 keV, as interações predominantes são o
efeito fotoelétrico, o espalhamento coerente e o espalhamento incoerente (efeito Compton).
No efeito fotoelétrico um fóton de energia hν colide com um átomo transferindo toda sua
energia para um elétron que é então ejetado. Para que este fenômeno ocorra, a energia do fóton
incidente deve ser maior ou igual à energia de ligação do elétron. Devido a esse fenômeno, os
átomos da amostra irradiada irão emitir raios-X característicos como descrito na seção 2.1.1 e as
diferentes energias de fluorescência possibilitarão a identificação dos elementos constituintes da
amostra (TERTIAN E CLAISSE, 1982). A probabilidade de que um átomo sofra um processo
fotoelétrico é dada pela seção de choque τ, que para energias menores que 100 keV é
proporcional ao número atômico Z e inversamente proporcional à energia do fóton, como
descrito pela equação 2.1 (ATTIX, 1986):
()
3
4
hv
Z
∝
τ
(2.1)
De uma forma geral, para energias maiores que a energia de ligação da camada K, toda a
energia transferida no efeito fotoelétrico é restrita aos elétrons da camada K, com uma menor
contribuição da camada L e contribuições negligenciáveis para outras camadas (ATTIX, 1986).
O espalhamento coerente ou elástico ocorre quando a radiação incidente desvia de sua
direção inicial sem variação de energia. O campo elétrico associado a esse fóton dá origem a uma
vibração dos elétrons presentes na matéria, que por sua vez emitem radiação eletromagnética na
Fundamentos Teóricos 8
mesma frequência da radiação incidente, portanto, nenhuma energia é transferida (JOHNS E
CUNNINGHAN, 1983). A probabilidade de que um átomo sofra um espalhamento coerente é
dada pela seção de choque σ
coe
. Para energias menores que 100 keV, e considerando um material
puro com número atômico Z, a seção de choque para o espalhamento coerente é dada pela
equação 2.2:
()
2
2
~
hv
Z
coe
∝
σ
(2.2)
A seção de choque diferencial para espalhamento coerente pode ser descrita através da
equação 2.3, na qual é o fator de forma e representa a transformada de Fourier da
distribuição de cargas do material, x é proporcional ao momento transferido na interação do fóton
com o átomo ( , onde λ é o comprimento de onda), θ é o ângulo de espalhamento
e r
(
ZxF ,
)
)2/(
1
θλ
senx
−
=
0
= 2,8.10-13 cm é o raio clássico do elétron (JOHNS e YAFFE, 1983).
()
()
()
2
2
2
0
,.1cos
2
coe
Ray
dr
FxZ
d
σ
θ
⎛⎞
=+
⎜⎟
Ω
⎝⎠
(2.3)
Valores para os fatores encontram-se tabulados por Hubbell et al (HUBBELL ET
AL, 1975) para uma grande quantidade de elementos químicos.
(
ZxF ,
)
O espalhamento incoerente ou inelástico (efeito Compton) ocorre quando o fóton
incidente transfere parte de sua energia para os elétrons do meio na forma de energia cinética,
desviando-se de sua trajetória inicial. Nesta interação, um elétron é ejetado e o fóton resultante é
espalhado com uma energia menor que a inicial. A equação 2.4 mostra a relação entre a energia
do fóton incidente E
0
e a do fóton espalhado E
C
, dependendo do ângulo de espalhamento θ. Nesta
equação m
0
é a massa de repouso do elétron e c é a velocidade da luz (CESAREO, 1988).
)cos1(
.
1
1
.
2
0
0
0
θ
−+
=
cm
E
EE
C
(2.4)
Fundamentos Teóricos 9
A seção de choque diferencial para espalhamento incoerente pode ser descrita através da
equação 2.5, definindo uma função do espalhamento incoerente S(x,Z) análoga ao fator de forma
do espalhamento coerente.
()
()
2
2
0
,1cos
2
inc
K
N
inc
dr
SxZ F
d
σ
θ
⎛⎞
=+
⎜⎟
Ω
⎝⎠
(2.5)
onde é o fator de Klein-Nishina, descrito pela equação 2.6:
KN
F
()
(
)
()
[]
()
⎪
⎭
⎪
⎬
⎫
⎪
⎩
⎪
⎨
⎧
+×−+
−
+×
⎭
⎬
⎫
⎩
⎨
⎧
−+
=
θθγ
θγ
θγ
2
2
2
2
cos1cos1.1
cos1.
1
cos1.1
1
KN
F
(2.6)
onde
2
0
cmh
νγ
=
.
Valores para os fatores encontram-se tabulados por Hubbell et al (HUBBELL ET
AL, 1975).
(
ZxS ,
)
A probabilidade total para a interação de um fóton com um elétron através do
espalhamento incoerente (
inc
σ
) é obtida integrando-se a seção de choque diferencial dada pela
equação 2.5 para todo intervalo de ângulo sólido (JOHNS E CUNNINGHAN, 1983). Para o caso
de materiais heterogêneos, pode-se supor que cada átomo que compõem a amostra contribui de
forma independente para estes três efeitos (fotoelétrico, espalhamentos coerente e incoerente).
Esta suposição é conhecida como Modelo Atômico Independente (JOHNS E YAFFE, 1983).
2.1.3. Coeficiente de atenuação
Se um feixe monoenergético de energia h
ν
e intensidade inicial I
0
atravessa um meio
absorvedor de espessura x (cm) e densidade
ρ
(g/cm
3
), a intensidade total de radiação que
atravessa o material (I) pode ser descrita pela lei de atenuação exponencial (equação 2.7).
Fundamentos Teóricos 10
xZ
eII
).,h,(
0
.
νρμ
−
=
(2.7)
A quantidade
μ
é chamada de coeficiente de atenuação linear, ou simplesmente
coeficiente de atenuação, que depende do número atômico (Z), da densidade do material (
ρ
) e da
energia da radiação (h
ν
), podendo ser escrita como a somatória das seções de choque dos
processos individuais de interação de fótons com a matéria
()
inccoev
i
iv
nn
σστσμ
++==
∑
,
onde n
v
é o número de átomos por unidade de volume (JOHNS E CUNNINGHAM, 1983).
2.2. As técnicas de Fluorescência de Raios-X induzida por fótons
A análise por fluorescência de raios-X (FRX) induzida por fótons é um método de análise
para determinação qualitativa e quantitativa das concentrações de elementos em uma ampla
variedade de amostras (SANTOLIQUIDO ET AL, 1976; POTTS ET AL, 2006), e consiste na
excitação de uma amostra com radiação de energia e intensidade adequadas e a posterior emissão
de raios-X característicos pelos elementos que a constituem.
Dentre os tipos de análises por Fluorescência de Raios-X pode-se citar a Fluorescência
de Raios-X por Dispersão de Comprimento de onda (WDXRF - Wavelength Dispersive X-
Ray Fluorescence), a Fluorescência de Raios-X por Dispersão de Energia (EDXRF - Energy
Dispersive X-Ray Fluorescence), a Fluorescência de Raios-X por Reflexão Total (TRXRF –
Total Reflection X-Ray Fluorescence), e a Microfluorescência (μ-XRF) (BERTIN, 1978;
TERTIAN E CLAISSE, 1982).
A WDXRF utiliza radionucídeos ou fontes de raios-X para excitar a amostra e um cristal
analisador para separar os raios-X fluorescentes em diferentes comprimentos de onda (λ) de
acordo com a lei de Bragg (CESAREO, 1988).
A análise por EDXRF surgiu com o aparecimento dos detectores semicondutores
dispersivos em energia, o que tornou a análise por XRF menos dispendiosa, uma vez que não
necessita a utilização de cristais defletores (BERTIN, 1978). Esta técnica, uma vez que será
empregada neste trabalho, será melhor discutida na seção 2.2.1.
Fundamentos Teóricos 11
A análise por TRXRF é realizada fazendo-se com que raios-X incidam com ângulo
rasante em uma superfície de tal forma que ocorra reflexão total do feixe de acordo com a lei de
Snell (KLOCKENKAPER E VON BOHLEN, 1992). Os raios-X excitam os átomos da superfície
da amostra e a emissão fluorescente é captada através de detectores de estado sólido (BERTIN,
1978).
A μ-XRF é realizada utilizando um feixe de raios-X com poucos micrômetros de
diâmetro, de forma a conseguir dados acerca da distribuição espacial dos elementos. Um detector
de estado sólido coleta os fótons emitidos e o resultado final é um mapa espacial das espécies
presentes na amostra (BERTIN, 1978; TERTIAN E CLAISSE, 1982).
Na próxima seção serão discutidos especificamente os aspectos da técnica de EDXRF,
utilizada neste trabalho.
2.2.1. Descrição do espectrômetro de EDXRF
A análise por EDXRF pode possuir vários tipos de configuração: a excitação direta da
amostra por uma fonte polienergética (radionuclídeos ou tubo de raios-X), a excitação da amostra
a partir de um tubo de raios-X com o auxílio de alvos secundários constituídos de elementos
puros (feixe monoenergético), e a excitação feita com o auxílio de monocromadores colocados
entre a fonte e a amostra (feixe monoenergético). Os feixes monoenergéticos permitem a escolha
da energia de forma a aumentar a eficiência de excitação dos elementos fluorescentes e reduzir o
espalhamento.
Um típico sistema de EDXRF está representado na figura 2.2. Este sistema consiste em
uma fonte de excitação, um objeto de medida, um detector de radiação, um amplificador e um
sistema de leitura.
Fundamentos Teóricos 12
Figura 2.2: Configuração típica de um equipamento de fluorescência de raios-X
As fontes utilizadas neste trabalho foram o tubo de raios-X (polienergética) e radiação
síncrotron (monoenergética). Os fótons gerados nos tubos de raios-X são divididos em
bremsstrahlung, responsável pelo espectro contínuo polienergético e os fótons de radiação
característica, responsáveis pelo espectro discreto (BERTIN, 1978; TERTIAN E CLAISSE,
1982). A radiação síncrotron é gerada quando elétrons de alta energia cinética são defletidos por
um campo magnético (CESAREO, 1988). Esta radiação é caracterizada por possuir um alto fluxo
de fótons e radiação polarizada, o que reduz os espalhamentos coerente e incoerente (POLETTI
ET AL, 2004).
Diferentes tipos de detectores podem ser empregados na espectroscopia de raios-X e a
escolha depende entre outros fatores, do tipo de elemento a ser analisado e a sensibilidade
desejada. Na técnica de EDXRF os detectores semicondutores (Si/Li, Ge), são hoje os mais
empregados em análises multielementares, devido à sua sensibilidade e alta resolução energética
(CESAREO, 1988). Após absorver os fótons fluorescentes, os detectores dispersivos em energia
os convertem em pulsos eletrônicos com amplitudes proporcionais à energia do fóton (pré-
amplificador). A eletrônica associada ao detector é composta de um amplificador e um analisador
multicanal. Este conjunto é responsável por organizar a seqüência de pulsos com amplitudes
variáveis de forma a refletir a distribuição de fótons do espectro fluorescente e converter essa
Fundamentos Teóricos 13
informação em um número digital que é armazenado em um histograma, disponível para
posterior interpretação e análise (CESAREO, 1988).
Um exemplo do espectro de uma solução aquosa de ferro, cobre e zinco, produzido com
energia de excitação de 11 keV com feixe monoenergético é mostrado na figura 2.3. Observam-
se neste espectro os picos de emissão, correspondentes às linhas K
α
e K
β
dos elementos Fe, Cu e
Zn e os picos de espalhamento coerente (11,0 keV) e incoerente (10,8 keV).
6 8 10 12
0
1000
2000
3000
4000
5000
Zn (Kβ)
Cu (Kβ)
Fe (Kβ)
Zn (K
α)
Cu (K
α)
Intensidade (u.a.)
Energia (keV)
Fe (Kα)
Espalhamentos
incoerente e coerente
Figura 2.3: Espectro de fluorescência de solução aquosa contendo ferro, cobre e zinco.
A determinação quantitativa das concentrações dos elementos presentes na amostra a
partir do espectro pode ser realizada através da relação matemática descrita a seguir.
2.2.2. Relação entre a intensidade de fluorescência com a concentração
A intensidade de fluorescência total de um material de composição heterogênea e
distribuição isotrópica, depende da emissão das fluorescências primária (I
P
), secundária (I
S
) e
terciária (I
T
). A fluorescência primária resulta do efeito direto do feixe incidente sob a amostra e
Fundamentos Teóricos 14
é responsável pela maior contribuição da intensidade fluorescente. A fluorescência secundária
ocorre quando a fluorescência emitida por um elemento possui energia suficiente para excitar um
segundo elemento. Desta forma, este segundo elemento será excitado tanto pelo feixe primário,
quanto pela emissão do primeiro elemento. A emissão adicional do segundo elemento pode
também ser chamada de Realce, e a diminuição na intensidade de fluorescência detectada do
primeiro elemento é chamada de Supressão. Pode ocorrer ainda a fluorescência terciária
envolvendo um terceiro elemento, através do mesmo mecanismo da fluorescência secundária
(BERTIN, 1978; TERTIAN E CLAISSE, 1982).
Para calcular teoricamente a relação entre a intensidade de fluorescência primária e a
concentração de um elemento, é necessário definir um modelo relacionado aos parâmetros
experimentais. Na figura 2.4, considera-se uma espécie plana, homogênea, de espessura h e que
contém um elemento fluorescente i com concentração C
i
.
Figura 2.4: Modelo relacionado aos parâmetros experimentais
Se um feixe monoenergético de intensidade espectral I
0
incidir a um ângulo θ
1
com
relação à superfície da amostra, a contribuição da fluorescência primária (dI
P
) referente à emissão
da linha k
α
do elemento de volume entre x e x+dx , é descrita na equação 2.8 (BERTIN, 1978;
TERTIAN E CLAISSE, 1982):
Fundamentos Teóricos 15
(
)
()
)'(
.
ν
ε
h
2
)'(
)(
)(
1
)(
1
)(
0)(
..exp
...
1
1.
/
/
...exp
ν
ν
ννν
θρ
μ
ω
ρμ
ρτ
θρ
μ
θρ
μ
hM
kK
ih
hi
i
hhM
xP
d
sen
x
f
j
C
sen
dx
sen
x
IdI
ii
Ω
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
−
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
−
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
−=
(2.8)
Na equação 2.8, o fator F
1
representa a intensidade de radiação que atinge o elemento de
volume depois de ser atenuada pelo caminho x/senθ
1
, onde
ρ
é a densidade da amostra e
ρ
μ
ν
/
)(hM
é o coeficiente de atenuação mássico da amostra na energia incidente h
ν
. O fator F
2
representa o número de interações fotoelétricas do feixe primário com o elemento i, no elemento
de volume. O termo
(
)
(
1)(
F
2 F
3
F
5
F
4
F
1
)
θ
ρ
μ
ν
sendx
h
representa a fração do número total de interações do
feixe incidente e
(
)
(
)
[
]
ρ
μ
ρ
τ
νν
///.
)()( hhii
C
é probabilidade que o elemento fluorescente i sofra
efeito fotoelétrico. Neste termo,
)(
ν
τ
hi
é a seção de choque para o efeito fotoelétrico do elemento i
na energia h
ν
. O fator F
3
considera que a probabilidade de produção de fluorescência devido a
transições para a camada K. O termo j
i
(jump ratio) indica a probabilidade de retirar elétrons de
todas as camadas em relação à probabilidade de retirar elétrons de todas as camadas com exceção
da camada K; o termo indica a probabilidade que a vacância criada seja preenchida com
elétrons da camada L e
i
K
f
i
ω
(rendimento de fluorescência) representa a probabilidade que o raio-X
emitido saia do átomo sem ser reabsorvido. O fator F
4
representa a radiação fluorescente emitida
pelo elemento i, transmitida pelo material após atravessar o caminho x/senθ
2
, sendo θ
2
o ângulo
de emergência da radiação com relação à superfície da amostra e
ρ
μ
ν
)'(hM
o coeficiente de
atenuação da amostra na energia da fluorescência emitida pelo elemento i (h
ν
’). O fator F
5
representa um fator geométrico que depende do ângulo sólido formado entre a amostra e o
detector e a eficiência do detector
Ωd
)'(
ν
ε
h
na energia de emissão h
ν
´, assumindo que a emissão
fluorescente é isotrópica (BERTIN, 1978; TERTIAN E CLAISSE, 1982; CESAREO, 1988).
Integrando a equação 2.8 para uma amostra infinita
)(
∞
→x
, chega-se à seguinte relação
para a expressão da intensidade fluorescente primária referente à emissão k
α
(equação 2.9):
Fundamentos Teóricos 16
ρ
μ
θ
θ
ρ
μ
ρ
σ
ρ
τ
νν
νν
)'(
2
1
)(
)()(
)(
.
1
...
hMhM
i
hinchi
iiP
sen
sen
ECI
+
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
+=
(2.9)
em que
)'(0
....
1
1.
ν
εω
hkK
i
i
df
j
IE
ii
Ω
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
−=
Na geometria utilizada nos experimentos deste trabalho foram escolhidos os ângulos de
incidência e emergência iguais (θ
1
= θ
2
= 45º) e portanto, a equação 2.9 pode ser simplificada,
resultando na equação 2.10:
ρ
μ
ρ
μ
ρ
σ
ρ
τ
νν
νν
)'()(
)()(
)(
..
hMhM
i
hinchi
i
iP
EC
I
+
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
+
=
(2.10)
Esta equação entretanto, não apresenta uma relação direta entre a intensidade de
fluorescência e a concentração do elemento fluorescente na amostra, uma vez que os coeficientes
de atenuação mássicos no denominador também dependem da composição do material.
As intensidades de fluorescência secundária e terciária, que são responsáveis pelos efeitos
de matriz (realce e supressão), também podem ser explicitadas de forma teórica (TERTIAN E
CLAISSE, 1982), mas são geralmente corrigidas a partir de métodos experimentais de análise,
melhor discutidos na seção 2.2.2. Cabe lembrar ainda que para a determinação quantitativa das
concentrações dos elementos de interesse em amostras desconhecidas, o conhecimento dos
coeficientes de atenuação através de métodos experimentais ou teóricos é fundamental. Uma das
formas experimentais de estimar as propriedades de atenuação de uma amostra é através da
intensidade de radiação espalhada, cuja relação será obtida a seguir.
Fundamentos Teóricos 17
2.2.3. Intensidade de radiação espalhada: Espalhamentos incoerente e coerente
Os cálculos teóricos das intensidades das radiações espalhadas incoerente e coerente são
semelhantes ao cálculo da intensidade fluorescente primária, desta forma, o modelo da figura 2.4
será utilizado. O feixe primário de intensidade espectral I
0
monoenergético incide a um ângulo θ
1
na amostra e a radiação espalhada emerge a um ângulo θ
2
. A contribuição da radiação incoerente
espalhada pelo elemento de volume (dI
E
) pode ser descrita pela equação 2.11 (BERTIN, 1978;
TERTIAN E CLAISSE, 1982):
´´)
(
2
)
(
) (
1
)(
1
)
(
0 ) (
...
exp
.
/
/
....
exp
ν
υ
ν
ν
ε
θρ
μ
ρ
μ
σ
θρ
μ
θρ
μ
h
υ
M
h
h
inc
h
h M
x
Einc
d
sen
x
d d
sen
dx
sen
x
I
dI
Ω
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
−
Ω
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
− =
E
2
´´)
(
h
υ
E
1
(2.11)
E
3
Na equação 2.11, ρ é a densidade da amostra e
ρ
μ
ν
/
)(hM
é o coeficiente de atenuação
mássico da amostra na energia incidente h
ν. O fator E
1
representa a intensidade de radiação que
atinge o elemento de volume depois de atenuada pelo caminho x/sen
θ
1
. O fator E
2
representa a
fração de fótons que interagem no elemento de volume da amostra e sofrem espalhamento
incoerente. O termo
(
)
(
1)(
/./
)
θ
ρ
μ
ν
sendx
h
representa a fração do número total de interações no
elemento de volume e
(
)
(
)
ρ
μ
σ
νυ
///
)()( hhinc
dd
Ω
é a fração das interações que sofrerão
espalhamento incoerente. Como a radiação espalhada não é isotrópica, estes fatores de seção de
choque por unidade de ângulo sólido devem ser calculados teoricamente para energia e ângulo de
espalhamento apropriados. O fator E
3
representa a radiação espalhada incoerentemente de energia
h
ν
´´ pelo elemento de volume, transmitida pelo caminho x/senθ
2
.
ρ
μ
ν
/
)''(hM
é o coeficiente de
atenuação mássico da amostra na energia do espalhamento e
)''(
.
υ
ε
h
d
Ω
é o produto do ângulo
Fundamentos Teóricos 18
sólido formado entre a amostra e o detector e a eficiência do detector na energia espalhada.
(BERTIN, 1978; TERTIAN E CLAISSE, 1982).
Integrando a equação 2.11 para uma amostra infinita
)(
∞
→x
, chega-se à seguinte relação
para a expressão da intensidade de radiação espalhada (equação 2.12):
ρ
μ
θ
θ
ρ
μ
ε
σ
νν
υ
υ
)'(
2
1
)(
)'(
)(
0
.
sen
sen
1
....
hMhM
h
hinc
Einc
d
d
d
II
+
Ω
Ω
=
(2.12)
Como θ
1
= θ
2
= 45º, podemos simplificar a equação 2.12 equação para:
ρ
μ
ρ
μ
ε
σ
νν
υ
υ
)'()(
)'(
)(
0
...
hMhM
h
hinc
Einc
d
d
d
I
I
+
Ω
Ω
=
(2.13)
A equação 2.13 é para a intensidade de espalhamento incoerente. Para calcular a
intensidade de espalhamento coerente (equação 2.14), utiliza-se a seção de choque diferencial
Ωdd
hcoe
/
)(
υ
σ
. Cabe lembrar que os coeficientes de atenuação no denominador no caso de
espalhamento coerente são iguais, e o fator de eficiência do detector na energia h
ν
, uma vez que a
energia espalhada é a mesma que a energia incidente (BERTIN, 1978; TERTIAN E CLAISSE,
1982).
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
Ω
Ω
=
ρ
μ
ε
σ
ν
υ
υ
)(
)(
)(
0
.2
...
hM
h
hcoe
Ecoe
d
d
d
I
I
(2.14)
Considerando os dois espalhamentos, e supondo que a energia do fóton espalhado
incoerentemente seja aproximadamente igual à energia incidente, a intensidade espalhada final
será a soma das equações 2.13 e 2.14:
Fundamentos Teóricos 19
() ()
0()
()
..
2.
inc h coe h
h
Einc
Mh
dd
Id
dd
I
υυ
υ
ν
σσ
ε
μ
ρ
⎛⎞
Ω+
⎜⎟
ΩΩ
⎝⎠
=
⎛⎞
⎜⎟
⎝⎠
(2.15)
Assim como na equação 2.10, a equação 2.15 depende do coeficiente de atenuação da
amostra, sendo possível, como será mostrado na próxima seção, utilizar a medida da intensidade
espalhada no espectro obtido para eliminar a dependência com o coeficiente de atenuação. A
seguir descreveremos este e outros métodos de análise quantitativa para a determinação das
concentrações de elementos.
2.2.4. Métodos de análise quantitativa para a técnica de EDXRF
Como a intensidade da fluorescência de um elemento depende da composição da amostra,
vários procedimentos são utilizados para a obtenção dos valores de concentração na análise
quantitativa (ROUSSEAU, 2006). Estes procedimentos estão divididos em dois principais
grupos: os métodos matemáticos e os métodos comparativos (TERTIAN E CLAISSE, 1982).
Os métodos matemáticos são mais aplicados em casos de análises nas quais a composição
da amostra é conhecida, com exceção de apenas alguns elementos traços. Nestes métodos os
efeitos de matriz são calculados através de algoritmos ou equações de correção e os termos
desconhecidos calculados por técnicas de iteração. Dois tipos de procedimentos matemáticos são
bastante utilizados: o método dos parâmetros fundamentais, cujos algoritmos consideram as
complexas equações fundamentais para as intensidades de fluorescência de cada elemento; e o
método de influência dos coeficientes, no qual simples algoritmos envolvendo a matriz são
utilizados (TERTIAN E CLAISSE, 1982).
Os métodos comparativos são mais aplicados em análises parciais, ou seja, na
determinação de alguns elementos da amostra. Nestes métodos os efeitos de matriz são
compensados, ou seja, a matriz é indiretamente considerada. Os métodos comparativos são
divididos em três grupos: os métodos de compensação, os métodos de atenuação e os métodos de
Fundamentos Teóricos 20
correção por absorção. A tabela 2.1 resume as características de cada tipo de método
comparativo.
Tabela 2.1: Características dos métodos comparativos de análise quantitativa (TERTIAN E CLAISSE, 1982).
Métodos de compensação
1) Padrão externo As composições da matriz e do padrão externo são consideradas iguais,
permitindo o uso de curvas de calibração.
2) Padrão interno Um padrão interno com propriedades fluorescentes é adicionado à
amostra. A taxa entre a intensidade fluorescente do elemento da amostra e
o padrão interno é independente da matriz e proporcional à concentração
do elemento.
3) Adição Quantidades conhecidas de um elemento fluorescente são adicionadas
sequencialmente à amostra. A comparação entre as intensidades de
fluorescência antes e após cada adição permite a compensação para os
efeitos de matriz.
4) Diluição Dupla Diluindo a amostra de diferentes formas e comparando as intensidades
fluorescentes, os efeitos de matriz também podem ser compensados.
Métodos de atenuação minimizada
1) Diluição A amostra é diluída com excesso de solvente, o que minimiza a variação
na composição da matriz, fazendo a intensidade fluorescente
aproximadamente proporcional à concentração.
2) Filme fino A espessura da amostra é muito pequena, da ordem de centenas de Å, e
neste caso, os efeitos de matriz são desprezíveis.
Métodos de correção por atenuação
1) Intensidade
espalhada
A intensidade de radiação espalhada pela matriz é uma medida das
características da amostra, e conseqüentemente a taxa entre a intensidade
fluorescente e intensidade espalhada é praticamente independente da
matriz e proporcional à concentração do elemento.
2) Transmissão –
Emissão
Aplicado à amostras finas, este método permite através da medida da
transmissão determinar a absorção da fluorescência e da radiação primária
pela amostra.
Fundamentos Teóricos 21
Dentre estes métodos, foram utilizados neste trabalho para inferir as concentrações dos
elementos traços em amostras mamárias, os métodos comparativos de padrão externo e o de
intensidade espalhada, que serão melhor discutidos no capítulo 3.
22
Capítulo 3
3. Materiais e Métodos
Materiais e Métodos
3.1. Amostras
3.1.1. Aspectos anatômicos e histológicos gerais
A figura 3.1 representa esquematicamente a anatomia da mama. A glândula mamária é
constituída basicamente por tecido glandular e tecido adiposo. Suas menores unidades funcionais
são os ácinos, glândulas produtoras de leite, que se agrupam formando um conjunto chamado
lóbulo e o conjunto de lóbulos forma o lobo mamário. Cada mama contém entre 15 e 20 lóbulos
com um respectivo ducto lactífero, que conduz o leite até um ducto maior chamado sino lactífero,
onde o leite é armazenado. Um tecido fibroso rico em fibras e colágeno (estroma) sustenta os
ductos mamários e os lóbulos, sendo responsável pela reserva nutricional da célula
(KIERSZENBAUM, 2004).
Figura 3.1: Representação da estrutura da glândula mamária
Materiais e Métodos 23
As neoplasias mamárias benignas estão geralmente associadas a mudanças fibrocísticas
(conjunto de mudanças decorrentes de alterações hormonais), possuem como característica um
crescimento lento, sem a ocorrência de invasão tecidual ou metástases e geralmente localizam-se
no estroma e nos ductos mamários (STEVENS E LOWE, 2002).
As neoplasias malignas (tumores) estão geralmente associadas a células geneticamente
alteradas, de volume maior e que podem invadir os tecidos adjacentes. A maioria dos tumores
consiste de adenocarcinomas invasivos, originários dos ductos terminais ou unidades lobulares,
dando origem a carcinomas ductais invasivos ou carcinomas lobulares invasivos. Existem
também os carcinomas in situ de ductos ou de lóbulos mamários (intraductais ou intralobulares),
que constituem fator de risco para posterior desenvolvimento de carcinoma mamário invasivo.
Além dos carcinomas ductais e lobulares, existem outros tipos de tumores mamários, como o
carcinoma tubular, o carcinoma mucinoso, etc (STEVENS E LOWE, 2002).
3.1.2. Coleta das amostras e classificação histológica
As amostras de tecido mamário foram fornecidas pelo Serviço de Patologia do Hospital
das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (SERPAT/HCFMRP/USP). O material
coletado era residual de tecidos retirados em procedimentos cirúrgicos de mastoplastia (cirurgia
plástica para redução da mama) e mastectomia (cirurgia para retirada total ou de parte da mama
invadida por neoplasias). Foi coletado um total de 101 amostras, todas provenientes de pacientes
do sexo feminino. Após a coleta os tecidos foram preservados em formol tamponado 10%, em
temperatura ambiente. O gráfico da figura 3.2 indica a quantidade de amostras de cada tipo de
tecido.
A classificação histológica foi realizada por profissionais do SERPAT através da análise
microscópica das lâminas dos tecidos. O critério de Bloom e Richardson foi utilizado para a
determinação do grau de diferenciação nos casos de carcinomas ductais (BLOMM E
RICHARDSON, 1957). Este critério é baseado em aspectos encontrados no tecido, como a
formação tubular, o tamanho e a forma das células e seus núcleos.
Materiais e Métodos 24
Figura 3.2: Número total de amostras estudadas
O grupo de tecidos normais (56 amostras) compreende amostras de tecido adiposo, tecido
normal com adenose (pequena proliferação de ácinos e lóbulos) e tecido glandular. Neste
trabalho os tecidos normais provenientes de cirurgias de mastoplastia serão denominados de
tecidos normais (TN) e os tecidos normais provenientes das adjacências das neoplasias de tecidos
normais periféricos (TNP).
O grupo de tecidos neoplásicos (45 amostras) é formado por fibroadenomas, carcinomas
ductais invasivos de grau I, II e III, carcinomas intraductais e carcinomas mucinosos.
3.1.3. Preparação das amostras
Existem vários procedimentos alternativos para preparação da amostra. Alguns autores a
congelam a uma temperatura de 70 K e analisam a amostra congelada (BENNINGHOFF ET AL,
1997; CZARNOWSKI ET AL, 1997; NG ET AL, 1997), alguns descongelam no momento da
análise colocando a amostra em uma solução fisiológica (GERAKI ET AL, 2002), outros
digerem em blocos digestores (VIVES ET AL, 2006) ou retiram água desidratando através de
combustão, secagem ou liofilização (TOLGYESSY ET AL, 1990; CARVALHO ET AL, 1998),
outros conservam apenas em formol até a análise (SIDDIQUI ET AL, 2006). É esperado que
qualquer um destes procedimentos possa gerar erro sistemático ou de interpretação do resultado
obtido quando extrapolados para as condições reais no tecido. Os métodos de combustão e
Materiais e Métodos 25
secagem levam a uma considerável diminuição do volume da amostra, porém não podem ser
utilizados na determinação de elementos que formam compostos voláteis em amostras biológicas
como, por exemplo Hg, As, Sb, Cr, Se. A liofilização é considerada o melhor método de
desidratação de amostras biológicas para análises a níveis traços, apesar de não preservar sua
estrutura natural.
Neste trabalho, as amostras foram submetidas à análise em seu estado natural, sem pré-
processamento químico, com o objetivo de preservar a estrutura dos tecidos mamários e evitar
algumas desvantagens dos métodos de secagem, como a grande quantidade de amostra
necessária, o aumento da possibilidade de contaminação com outros elementos, e o elevado
tempo de preparação.
Para as medidas com feixe polienergético os tecidos foram cortados em fatias de cerca de
1,0 cm x 1,0 cm com bisturis cirúrgicos em local apropriado e tomando todo tipo de cuidado para
evitar a contaminação. As amostras cortadas foram colocadas em um porta amostras cilíndrico de
acrílico e apoiadas em uma fina camada de plástico Mylar
®
de 0,1mm de espessura. Um total de
57 amostras foi analisado com feixe polienergético: 20 tecidos normais (TN), 10 tecidos normais
periféricos (TNP) e 27 tecidos neoplásicos. Dentre os tecidos neoplásicos, 8 fibroadenomas (FA),
5 carcinomas ductais de grau I (CD-I), 6 de grau II (CD-II) e 7 de grau III (CD-III).
Para as medidas com feixe monoenergético os tecidos foram cortados com bisturis
cirúrgicos em fatias de cerca de 1,0 cm x 0,5 cm, e colocadas em um porta amostras retangular.
Após a acomodação, os porta amostras foram envolvidos por fita Kapton
®
e Parafilm M
®
. Um
total de 101 amostras foi analisado com feixe polienergético: 30 tecidos normais (TN), 26 tecidos
normais periféricos (TNP) e 45 tecidos neoplásicos. Dentre os tecidos neoplásicos, 9
fibroadenomas (FA), 5 carcinomas ductais de grau I (CD-I), 16 de grau II (CD-II), 6 de grau III
(CD-III) e 9 amostras de outros tipos de neoplasias malignas.
3.2. Arranjo experimental
As medidas de EDXRF com feixe polienergético foram realizadas no Laboratório de
Instrumentação Nuclear do Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA) no Campus da
Universidade de São Paulo na cidade de Piracicaba. A figura 3.3 mostra o arranjo experimental
utilizado. A fonte de excitação utilizada foi um tubo de raios-X com alvo de Molibdênio (K
α
=
17,5 keV e K
β
= 19,6 keV), potência máxima de 2kW e acoplado a um gerador de alta tensão.
Materiais e Métodos 26
Para a análise de elementos com números atômicos baixos foi utilizado um filtro de Níquel (K
α
=
7,5 keV e K
β
= 8,3 keV), tensão de 10 kVp e corrente de 25mA. Para a análise de elementos de
maiores números atômicos, foi utilizado um filtro de Zircônio (K
α
= 15,7 keV e K
β
= 17,7 keV),
tensão de 25kVp e corrente de 10mA. Os diferentes filtros foram escolhidos para que a energia de
excitação ficasse próxima da borda de absorção dos elementos de interesse. O tempo de cada
medida foi fixado em uma média de 3600s de forma a manter as incertezas estatísticas na
determinação dos picos de interesse menores a 4%. O porta amostras e o detector estavam
posicionados a 45º e 90º respectivamente com relação ao feixe incidente. Esta condição
geométrica minimiza a quantidade de espalhamento que chega ao detector (TERTIAN E
CLAISSE, 1982). O sistema de detecção era composto por um detector semicondutor de Si(Li),
com resolução de 165eV a 5,89keV, janela de Berílio de 12,7μm, e 80mm
2
de área ativa,
acoplado a um módulo amplificador e uma placa multicanal da marca EG&G Ortec.
Figura 3.3: Arranjo experimental para as medidas com feixe polienergético.
As medidas com feixe monoenergético foram realizadas na linha de Fluorescência de
Raios-X do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) em Campinas. Um feixe
monocromático de 11 keV foi utilizado para excitar os elementos cálcio, ferro, cobre e zinco. O
porta amostras e o detector foram, da mesma forma que na análise com feixe polienergético,
posicionados a 45º e 90º respectivamente com relação ao feixe incidente. Na figura 3.4 estão
representados o porta amostras e o detector da configuração experimental. Para a detecção da
Materiais e Métodos 27
fluorescência emitida foi utilizado um detector hiperpuro de Germânio (HPGe), com resolução de
150eV na energia de 5,9 keV, conectado a um colimador com abertura de 3 mm de diâmetro,
para diminuir o volume sensível de fótons espalhados compreendido pelo detector. As amostras e
as soluções de calibração foram analisadas em 3 diferentes pontos, de forma a minimizar
possíveis efeitos da distribuição espacial não homogênea dos elementos traços. O tempo de
aquisição dos espectros de fluorescência foi fixado em 300s de forma que a incerteza estatística
permanecesse abaixo de 4%.
Figura 3.4: Porta amostras e detector na análise com feixe monoenergético.
3.3. Metodologia para quantificação dos elementos traços
3.3.1. Procedimento de calibração: Métodos de correção para os efeitos de matriz
Para a análise com feixe polienergético, a correção dos efeitos de matriz foi realizada
utilizando o método de padrão externo. Este método, como foi descrito brevemente no capítulo 2,
consiste em determinar a concentração de um elemento em uma espécie desconhecida, por
comparação com as concentrações do mesmo elemento em espécies conhecidas, através de
curvas de calibração (intensidade fluorescente vs. concentração) (TERTIAN E CLAISSE, 1982).
Essas curvas podem ser obtidas a partir de sistemas multielementares, cuja taxa de variação dos
elementos permanece constante. De forma geral, este método é aplicado rotineiramente em
Materiais e Métodos 28
análises cujas variações da matriz são pequenas, e por este motivo, a composição elementar da
matriz foi um parâmetro importante na escolha do tipo de solução utilizada para as curvas de
calibração. Foram preparados dois tipos de soluções multielementares com concentrações
conhecidas de elementos traços Ca, Fe, Cu e Zn. A tabela 3.1 mostra a composição elementar dos
tecidos mamários encontrados na literatura e a composição das soluções utilizadas.
Tabela 3.1: Valores da composição elementar (frações em massa) de tecidos encontrados na literatura e nas soluções
utilizadas, com exceção dos elementos traços.
H (%) C (%) N (%) O (%)
Outros
(%)
ρ (g.ml
-1
)
Tecido Adiposo
ICRP (1975)
12,0 64,0 0,8 23,3 0,62 0,92
Tecido Adiposo
(Hammerstein et al,
1970)
11,2 61,9 1,7 25,1 - 0,93
Tecido Adiposo
(Poletti et al, 2002)
12,4 76,5 0,4 10,7 - 0,92
Tecido Glandular
(Hammerstein et al
1970)
10,2 18,4 3,2 67,7 - 1,04
Tecido Glandular
(Poletti et al, 2002)
9,3 18,4 4,4 67,9 - 1,04
Solução Aquosa 11,1 - - 88,9 - 1,00
Solução Etanólica 13,0 52,0 - 34,0 1,0 0,84
Solução com Uréia 12,1 29,3 0,8 57,4 0,4 0,95
Poletti et al (2002) mostrou que as composições de tecidos glandulares e neoplásicos são
equivalentes, assim como sua atenuação e espalhamento, mostrando que a água seria um bom
material equivalente a estes tecidos. Desta forma, a primeira solução foi feita com água mili-Q e
sais inorgânicos (CaCl
2
, KCl, CuCl
2
, FeCl
3
e ZnCl
2
) da marca Vetec
®
. A segunda solução foi
Materiais e Métodos 29
feita com os mesmos sais inorgânicos dissolvidos em álcool etílico (etanol) 95%, devido à
semelhança elementar do etanol com tecidos normais adiposos (tabela 3.1; MORGAN ET AL,
1998).
Para a análise com feixe monoenergético, foram utilizados dois métodos de correção: o
método descrito anteriormente (padrão externo) e o método da intensidade espalhada. O método
da intensidade espalhada foi proposto por Andermann e Kemp (ANDERMANN E KEMP, 1958),
que observaram que as intensidades fluorescentes e a radiação espalhada primária são afetadas da
mesma forma pela absorção da amostra, então sua taxa é praticamente independente da matriz, o
que pode ser deduzido a partir da razão entre as equações 2.10 e 2.15. Além disso, essa razão
pode ser independente de outras variáveis, como as condições de excitação, variações das
características físicas das espécies, como o tamanho das partículas e massa da amostra
(TERTIAN E CLAISSE, 1982).
Para estas análises foram utilizadas três soluções multielementares. As duas primeiras
soluções foram as mesmas utilizadas para as medidas com feixe polienergético (aquosa e
etanólica) e a terceira solução foi preparada com os mesmos sais (CaCl
2
, KCl, CuCl
2
, FeCl
3
e
ZnCl
2
) diluídos em uma solução aquosa de uréia (12,64 g), álcool isopropílico (336,34 ml) e
ácido fosfórico (2,79 ml), em um volume final de 1 litro. Esta solução foi escolhida por possuir
propriedades de atenuação similares à de tecidos adiposos (ICRU 44, 1989) e permitirá testar e
validar as metodologias empregadas para a determinação das concentrações dos elementos
presentes nas amostras de tecidos mamários.
A partir das duas primeiras soluções foram estudados dois tipos de curvas de calibração,
sendo o primeiro através da relação direta entre as áreas dos fotopicos e as concentrações de cada
elemento das soluções (método de padrão externo), e o segundo através da relação linear entre a
razão área do fotopico/área do pico de espalhamento e as concentrações dos elementos (método
de intensidade espalhada).
Para todas as análises, foram feitas diluições das soluções padrões de modo a obter
soluções com menores concentrações de elementos traços. As concentrações foram escolhidas de
acordo com a faixa esperada de concentração dos elementos traços em tecidos mamários normais
e neoplásicos (RIZK E SKY-PECK, 1984; GERAKI ET AL, 2002; GERAKI ET AL, 2004.a;
GERAKI ET AL, 2004.b; POLETTI ET AL, 2004). A concentração Ca variava entre 35 e 400
ppm, Fe entre 2 e 20 ppm, Cu entre 0,1 e 1 ppm e Zn entre 0,9 e 10 ppm nas análises com feixe
Materiais e Métodos 30
polienergético. Para feixe monoenergético a concentração de Ca variava entre 1,8 e 700 ppm, Cu
de 0,1 a 30 ppm, Fe entre 0,2 e 80 ppm, e Zn entre 0,1 e 50 ppm.
3.3.2. Análise das intensidades dos espectros obtidos
Para a determinação das áreas dos fotopicos das linhas características de interesse nos
espectros foi utilizado o software AXIL (Analysis of X-ray spectra by Iterative Least-squares
fitting) contido no pacote de análise quantitativa QXAS (Quantitative X-ray Analysis System),
desenvolvido e distribuído livremente pela IAEA (Agência Internacional de Energia Atômica)
(IAEA, 2006). A análise feita pelo AXIL é realizada através do ajuste de funções matemáticas
aos espectros de fluorescência obtidos, considerando funções gaussianas para os picos
fluorescentes e funções polinomiais para o background. O método utilizado é baseado na
minimização do Qui-quadrado, com otimização feita pelo algoritmo de Marquardt, no qual as
iterações são interrompidas se a diferença percentual entre dois Qui-quadrados consecutivos for
menor que um determinado valor (neste caso menor que 0,1%), ou um número máximo de
iterações for alcançado (MARQUARDT, 1963). Neste trabalho foram considerados com
qualidade os ajustes de Qui-quadrado menor ou igual a 2 e resíduos menores que ± 5. Para
facilitar a análise foi criado no próprio programa, um modelo de análise que incluía condições
específicas de calibração, região e elementos químicos de interesse, além dos parâmetros de
background.
As áreas correspondentes à soma das intensidades dos espalhamentos coerente e
incoerente foram calculadas utilizando também a função correspondente do software AXIL,
definindo a mesma ROI para todos os espectros.
As incertezas apresentadas nos valores de concentração estão relacionadas ao desvio
padrão das áreas dos fotopicos, devido à contagem estatística e às curvas de calibração.
Materiais e Métodos 31
3.4. Análise estatística
3.4.1. Testes estatísticos
O primeiro passo da análise estatística é a exploração dos dados de forma a definir se os
testes aplicados serão paramétricos ou não paramétricos, uma vez que a aplicação de testes
paramétricos exige que os valores da variável estudada tenham distribuição normal (CONOVER,
1980). Desta forma, a primeira análise foi aplicar o teste Kolmogorov-Smirnov de aderência à
curva normal. Neste teste o nível baixo de significância (menor que 0,05) indica que a
distribuição dos dados difere significativamente da distribuição normal. Se as distribuições das
variáveis não cumprem a hipótese de normalidade, testes não paramétricos devem ser aplicados.
Neste trabalho, utilizamos para verificar as significâncias das diferenças entre as
distribuições dos elementos traços em tecidos normais, normais periféricos e neoplásicos, o teste
de Wilcoxon (no caso de amostras pareadas) e o teste de Mann-Whitney (no caso das amostras
não pareadas). Para estes testes, que comparam as tendências centrais de duas amostras, foi
escolhido o nível de significância de α = 0,05, de forma que valores de p < 0,05 indicavam que
os dois grupos possuíam diferenças estatisticamente significativas com relação ao parâmetro
analisado (CONOVER, 1980).
3.4.2. Correlação
Para verificar a existência de correlação entre as concentrações de elementos traços, o
teste não paramétrico de Spearman foi realizado entre pares de elementos, em tecidos normais
periféricos, normais e neoplásicos. Este teste analisa quanto os dados se aproximam de uma reta,
de forma que os valores variam de –1 a 1, indicando associações lineares inversas e diretas,
respectivamente, e o valor zero indica ausência de correlação (CONOVER, 1980).
32
Capítulo 4
4. Resultados e Discussões
Resultados e discussão
4.1. Curvas de calibração
4.1.1. Método de correção para feixe polienergético
A figura 4.1 apresenta a média dos espectros obtidos com feixe polienergético com
potencial de excitação de 10kVp para os tecidos mamários, água pura e etanol puro, sendo que
nesta energia, foi possível identificar nos tecidos apenas o elemento cálcio. Pode-se observar
através dos picos de espalhamento as semelhanças das propriedades de atenuação (absorção e
espalhamento) entre tecidos neoplásicos com a água e entre etanol com os tecidos normais. Este
fato permite qualitativamente, afirmar que as soluções escolhidas satisfazem as condições
impostas pelo método de padrão externo, como descrito na seção 3.3.1.
3,6 3,8 4,0 4,2 4,4
300
400
500
600
Ca-Kβ
Ca-Kα
456789
0
2000
4000
6000
8000
Ca-Kα
Neoplasias
TNP
TN
Água
Etanol
Intensidade (u.a.)
Energia (keV)
Espalhamento
Figura 4.1: Espectros de tecidos mamários esoluções padrão obtidos com feixe
polienergético com potencial de excitação de 10 kVp.
Resultados e Discussões
34
Os mesmos comportamentos foram observados nas medidas realizadas com potencial de
excitação igual a 25kVp, que permitiram identificar a presença dos elementos ferro, cobre e
zinco.
A figura 4.2 apresenta as curvas de calibração típicas para as medidas com feixe
polienergético com potenciais de excitação de 10kVp e 25kVp, obtidas através da relação direta
entre as áreas dos fotopicos dos elementos cálcio e zinco e suas concentrações. Em ambos os
casos a resposta fluorescente dos elementos é fortemente influenciada pelo meio.
Figura 4.2: Curvas de calibração para os elementos (a) cálcio (10kVp) e (b) zinco (25kVp).
Foram determinados, para ambas configurações experimentais, os limites de detecção
com base na relação entre os picos fluorescentes e o background para cada elemento, de acordo
com a equação
iBGii
NNCLD /.3= , na qual C
i
representa a concentração do elemento i, N
BG
o
números de contagens por segundo do background sob o pico do elemento i e N
i
número de
contagens por segundo do pico fluorescente do elemento i (AIGINGER E WOBRAUSCHEK,
1985). Desta forma, os limites obtidos a partir dos espectros das soluções de calibração medidos
com um tempo de 1500s, determinaram as menores concentrações elementares que o
procedimento conseguiria diferenciar confiavelmente do ruído de fundo. Os limites de detecção
obtidos com feixe polienergético para os elementos cálcio, ferro, cobre e zinco, foram
respectivamente de 38,0 ppm, 6,3 ppm, 0,2 ppm, 0,5 ppm.
A acurácia deste método de quantificação foi avaliada através de padrões de referência da
marca MicroMatter
®
de CaF
2
, Fe, CuS e ZnTe, com concentrações conhecidas de Ca, Fe, Cu e
Zn. As concentrações obtidas pelo método apresentaram diferenças percentuais em relação aos
valores nominais, de 30%, 38%, 34% e 29% para os elementos cálcio, ferro, cobre e zinco,
respectivamente. Estas discrepâncias podem ser explicadas pelo fato dos padrões certificados
Resultados e Discussões 35
estarem em estado físico diferente (em formato de filme fino) das soluções, tendo, portanto,
diferentes efeitos de matriz.
4.1.2. Método de correção para feixe monoenergético
A figura 4.3 apresenta os espectros dos tecidos mamários e de soluções de calibração,
obtidos com feixe monoenergético de 11keV. Nesta energia foi possível determinar
simultaneamente os elementos cálcio, ferro, cobre e zinco. Nota-se novamente a similaridade dos
picos de espalhamento coerente e incoerente entre a água e tecidos tumorais, assim como entre as
soluções de etanol com tecidos normais e tecidos normais periféricos, resultado que confirma a
proposta do método de padrão externo.
468
0,0
1,0x10
-5
2,0x10
-5
3,0x10
-5
Zn - Kα
Cu - Kα
Fe - Kβ
Fe - Kα
Ca - Kβ
Ca - Kα
891011
0,0
4,0x10
-5
8,0x10
-5
1,2x10
-4
1,6x10
-4
Zn - Kα
Zn - Kβ
Neoplasias
TNP
TN
Água
Etanol
Solução de uréia
Intensidade (u.a.)
Energia (keV)
Figura 4.2: Espectros de tecidos mamários e soluções padrão obtidos com feixe monoenergético de energia 11keV.
A figura 4.4 apresenta as curvas de calibração típicas para as medidas com feixe
monoenergético, obtidas através da relação direta entre as áreas dos fotopicos e as concentrações
de cada elemento (gráficos a e c), e as curvas obtidas através da relação entre a razão área do
fotopico e área de espalhamento e as concentrações de cada elemento (gráficos b e d).
Resultados e Discussões 36
Figura 4.3: Curvas de calibração para os elementos ferro e cobre (a) e (c) não normalizadas pelo espalhamento e (b) e
(d) normalizadas pelo espalhamento, obtidas com feixe monoenergético de 11 keV.
Na figura 4.4, os gráficos a e c mostram que as curvas obtidas a partir do método de
padrão externo são fortemente influenciadas pelo meio, assim como encontrado para a análise
com feixe polienergético. Entretanto, nos gráficos b e d, cujas curvas foram obtidas através do
segundo método (radiação espalhada), é observada uma diminuição da influência da matriz. Cabe
lembrar, que este método também evita a variação das condições experimentais como espessura
da amostra, tamanho das partículas e variações no feixe incidente (NIELSON, 1977).
A diminuição da influência da matriz foi comprovada através de cálculos teóricos para a
fluorescência primária e para o espalhamento, utilizando as equações 2.10 e 2.15. A composição
elementar das soluções padrão foi utilizada em combinação com o programa XCOM (BERGER e
HUBBELL, 1987) para calcular os coeficientes de atenuação nas energias de interesse. Os
parâmetros fundamentais, como τ, j, f e ω para cada elemento foram obtidos no programa AXIL
(IAEA, 2006). Os gráficos teóricos obtidos são apresentados na figura 4.5. Pode ser observada
através de uma comparação entre as figuras 4.4 e 4.5 uma boa concordância entre as medidas
experimentais e os resultados teóricos.
Resultados e Discussões 37
Figura 4.4: Curvas de calibração teóricas para os elementos ferro e cobre (a) e (c) não normalizadas pelo
espalhamento e (b) e (d) normalizadas pelo espalhamento
Os limites de detecção para a análise com feixe monoenergético foram determinados da
mesma forma que na análise com feixe polienergético e os valores para os elementos cálcio,
ferro, cobre e zinco, foram respectivamente de 1,7 ppm, 0,2 ppm, 0,1 ppm, 0,1ppm.
Foram realizados dois testes de validação do método de correção para feixe
monoenergético: de forma experimental e através de padrões certificados. A forma experimental
consistia em realizar medidas sobre soluções de uréia e determinar as concentrações dos
elementos traços (previamente conhecidas), utilizando o segundo método (método de radiação
espalhada). Após a análise foram observadas diferenças de 12% para as concentrações de cálcio,
14% para as concentrações de ferro, 15% para as concentrações de cobre e 10% para as
concentrações de zinco.
Como padrão certificado foi utilizado o fígado bovino, do National Institute of Standards
and Technology (NIST). Os valores nominais para os elementos cálcio, ferro, cobre e zinco eram
respectivamente (116±4)ppm, (184±15)ppm, (160±8)ppm, (127±16)ppm e as diferenças
percentuais encontradas entre as concentrações obtidas e os valores nominais foram de 15%,
17%, 17% e 12% para os elementos Ca, Fe, Cu e Zn, respectivamente.
Resultados e Discussões 38
4.2. Valores de concentrações
Após os procedimentos de validação para o método de padrão externo com feixe
polienergético, as concentrações dos elementos traços em tecidos normais foram determinadas
através do ajuste linear das curvas das soluções etanólicas para cada elemento e em tecidos
neoplásicos através do ajuste das curvas de soluções aquosas. Na análise com feixe
monoenergético esta determinação foi feita a partir da comparação direta das áreas dos fotopicos
de fluorescência (normalizados pelo pico de espalhamento da amostra) dos espectros de tecidos
com a equação de ajuste linear da curva de calibração da água, também corrigida pelo método de
radiação espalhada.
Um resumo estatístico dos valores de concentrações dos elementos traços em tecidos
mamários pareados e não pareados, encontrados através das análises com feixes polienergéticos e
monoenergéticos são apresentados nas tabelas 4.1, 4.2, 4.3 e 4.4.
Observa-se um amplo intervalo de variação para as concentrações de todos os elementos,
analisados com feixes polienergéticos e monoenergéticos, fato que pode ser justificado pela
variabilidade entre diferentes indivíduos, bem como a distribuição espacial possivelmente não
homogênea dos elementos traços na amostra (POLETTI ET AL, 2004), embora os procedimentos
experimentais adotados neste trabalho tentassem diminuir este último efeito.
39
Tabela 4.1: Valores de concentração de cálcio em tecidos mamários
Amostras pareadas Amostras não pareadas
Cálcio
Polienergético Monoenergético Polienergético Monoenergético
TNP Neoplasias TNP Neoplasias TN Neoplasias TN Neoplasias
Mín –Máx (ppm)
90,5 - 1483,4 186,1 –2541,9 97,9 – 1830,0 291,0 – 8230,0 188,6 – 1372,2 143,8 – 2441,9 77,4 – 1824,2 291,0 – 8233,4
Média (ppm)
850,6 1635,6 726,4 2434,9 445,9 824,2 461,9 3086,9
Mediana (ppm)
828,4 1515,9 679,0 1450,0 459,6 841,1 367,7 2400,2
25%-75% (ppm)
101,9 – 1272,2 194,3 – 2244,1 399,5 – 1017,5 817,3 – 3650,0 221,8 – 1296,5 184,7 – 1241,7 196,7 – 568,4 942,4 – 5092,5
Tabela 4.2: Valores de concentração de ferro em tecidos mamários
Amostras pareadas Amostras não pareadas
Ferro
Polienergético Monoenergético Polienergético Monoenergético
TNP Neoplasias TNP Neoplasias TN Neoplasias TN Neoplasias
Mín –Máx (ppm)
7,2 – 12,6 7,6 – 23,38 2,4 – 36,5 9,2 – 57,9 6,0 – 16,2 5,4 – 23,4 0,6 – 21,4 9,2 – 57,9
Média (ppm)
7,3 12,9 9,0 25,3 5,5 10,9 7,9 24,2
Mediana (ppm)
8,7 20,8 7,0 22,4 6,6 20,6 5,4 21,6
25%-75% (ppm)
8,3 – 10,3 7,9 – 16,0 4,8 – 10,4 15,5 – 34,1 7,6 – 10,9 7,6 – 13,9 3,2 – 12,4 14,9 – 31,2
40
Tabela 4.3: Valores de concentração de cobre em tecidos mamários
Amostras pareadas Amostras não pareadas
Cobre
Polienergético Monoenergético Polienergético Monoenergético
TNP Neoplasias TNP Neoplasias TN Neoplasias TN Neoplasias
Mín –Máx (ppm)
0,2 – 1,7 0,7 – 14,5 0,2 – 1,8 0,4 – 4,9 0,2 – 1,8 0,4 – 15,9 0,3 – 1,8 0,4 – 3,9
Média (ppm)
0,5 0,6 0,6 1,8 0,3 0,6 0,7 1,8
Mediana (ppm)
0,6 1,0 0,5 1,5 0,7 1,2 0,6 1,5
25%-75% (ppm)
0,3 – 1,5 0,9 – 9,2 0,3 – 0,7 1,0 – 2,3 0,5 – 1,5 0,8 – 9,1 0,4 – 0,8 1,0 – 2,3
Tabela 4.4: Valores de concentração de zinco em tecidos mamários
Amostras pareadas Amostras não pareadas
Zinco
Polienergético Monoenergético Polienergético Monoenergético
TNP Neoplasias TNP Neoplasias TN Neoplasias TN Neoplasias
Mín –Máx (ppm)
0,5 – 7,3 2,5 – 24,9 1,0 – 8,6 2,2 – 29,9 0,5 – 8,1 1,8 – 28,9 1,2 – 6,9 2,2 – 31,9
Média (ppm)
2,9 12,8 3,8 12,9 3,8 18,5 3,1 14,9
Mediana (ppm)
3,8 13,5 3,2 12,2 4,3 20,2 3,5 14,2
25%-75% (ppm)
0,7 – 5,4 4,9 – 19,3 1,8 – 5,3 6,4 – 15,7 0,7 – 5,9 4,5 – 23,9 1,7 – 3,9 8,9 – 19,3
Resultados e Discussões 41
A figura 4.6 apresenta estes mesmos resultados através de gráficos do tipo box-plot para
cada elemento medido com feixe monoenergético, com o objetivo de visualizar as diferenças
existentes entre as concentrações.
Figura 4.5: Distribuição das concentrações dos elementos traços (a) cálcio, (b) ferro, (c) cobre e (d) zinco em
diferentes tecidos, obtidas com feixe monoenergético. Os símbolos º (outliers) representam concentrações fora dos
limites inferiores e superiores definidos entre os 25º e 75º percentis.
Os gráficos da figura 4.6 indicam a diferença entre as concentrações dos elementos traços
em tecidos normais e neoplásicos, embora visualmente não seja possível afirmar se estas
diferenças são significativas. A presença dos pontos discrepantes (outliers) nos gráficos pode
ocorrer devido à ampla variação das concentrações dos elementos traços em diferentes pacientes.
Estes pontos são importantes pois acrescentam ao conjunto de dados uma variabilidade que pode
ser fisiologicamente real.
Resultados e Discussões 42
4.3. Comparação entre os resultados da utilização de feixes polienergéticos e
monoenergéticos com a literatura
A magnitude da elevação das concentrações dos elementos em tecidos é um bom
parâmetro de comparação das concentrações obtidas com feixes poli e monoenergéticos, bem
como para comparar os resultados obtidos neste trabalho com outras publicações. Quando se
descreve um conjunto de dados de distribuição assimétrica, a melhor medida da tendência central
de um conjunto de valores é dada pela mediana (CALLEGARI-JACQUES, 2003), desta forma, a
magnitude de elevação das concentrações foi obtida através da razão entre as medianas de tecidos
neoplásicos e tecidos normais. A tabela 4.5 resume os resultados das magnitudes de elevação dos
elementos traços encontrados neste trabalho e por outros autores através da técnica de EDXRF,
aplicada em tecidos em estado natural.
Tabela 4.5: Valores da magnitude de elevação das concentrações dos elementos traços
em tecidos mamários em estado natural.
Magnitude de elevação das concentrações
Amostras pareadas Amostras não pareadas
Técnica
Ca Fe Cu Zn Ca Fe Cu Zn
Este trabalho - feixe
polienergético
EDXRF 1,8 2,4 1,6 3,6 1,8 3,1 1,7 4,7
Este trabalho - feixe
monoenergético
SR-EDXRF 2,1 3,2 3,0 3,8 6,5 4,0 2,5 4,1
Geraki et al, 2002 SR-EDXRF - 2,2 3,0 2,3 - 3,4 4,2 5,2
Geraki et al, 2004.a
SR-EDXRF e
EDXRD
- 2,0 3,2 4,2 - 6,1 4,5 4,8
Geraki et al, 2004.b SR-EDXRF - 2,1 2,8 2,3 - 4,8 3,3 4,2
Poletti et al, 2004 SR- EDXRF - - - - 2.3 - 4.0 3.7
Resultados e Discussões 43
Ao avaliar estas razões, a elevação das concentrações dos elementos traços em amostras
pareadas é menos pronunciada quando comparada à elevação de amostras não pareadas. Isso
pode ser justificado tanto pelo aumento do metabolismo celular na região adjacente à neoplasia
quanto pelo próprio pareamento das amostras, uma vez que são retirados neste caso fatores como
dieta, idade, tratamento com medicamentos, etc, que podem ser diferentes entre as pacientes. Os
resultados deste trabalho apresentam boa concordância com os reportados anteriormente por
Geraki (GERAKI ET AL, 2002; GERAKI ET AL, 2004.a GERAKI ET AL, 2004.b) e Poletti
(POLETTI ET AL, 2004) para Fe, Cu e Zn. A razão entre as medianas de concentração de cálcio
em tecidos normais e tecidos neoplásicos obtidas na análise com feixe polienergético são
equivalentes às obtidas por Poletti (POLETTI ET AL, 2004).
A tabela 4.6 apresenta os resultados das razões entre as medianas das concentrações dos
elementos traços em tecidos neoplásicos com relação aos normais, obtidos por diferentes autores
através de outras técnicas de preparação de amostras e de análise, como a Ativação de Nêutrons
(INAA) (NG ET AL, 1997; SCHWARTZ ET AL, 1974; OTHMAN E SPYROU, 1979;
MANGAL E KUMAR, 1984), PIXE (NAGA RAJU ET AL, 2006) e Absorção Atômica (AAS)
(SIDDIQUI ET AL, 2006). Os resultados publicados por estes foram obtidos após a análise de
material desidratado (dry), de forma que é esperado que estes procedimentos possam gerar erros
de interpretação do resultado obtido quando extrapolados para as condições reais no tecido.
Porém, com a finalidade de comparar os valores reportados com os resultados obtidos neste
trabalho, as concentrações foram convertidas através de um fator igual a 2,37 (wet-to-dry ratio),
para transformá-las em um valor que representaria o tecido em seu estado natural (wet), como
sugerido por Ng et al (1997). Os valores em negrito na tabela 4.6 representam as concentrações
em tecido natural (wet) após a conversão.
Resultados e Discussões 44
Tabela 4.6: Valores de magnitude de elevação entre as medianas das concentrações dos elementos traços em tecidos
mamários desidratados, e valores convertidos pela “wet-to-dry ratio” (em negrito).
Magnitude de elevação das concentrações
Técnica
Ca Fe Cu Zn
Ng et al, 1997 (dry) INAA 6,4 (2,7) 3,0 (1,3) - 4,2 (1,8)
Schwartz et al, 1974 (wet) INAA -
2,4
-
5,7
Othman e Spyrou, 1979 (dry) INAA 15,1 (6,4) 3,6 (1,5) - 5,9 (2,5)
Mangal e Kumar, 1984 (dry) INAA -
5,0 (2,1) - 9,7 (4,1)
Naga Raju et al, 2006 (dry) PIXE
7,11 (3,0) 2,8 (1,2) 3,3 (1,4) 5,2 (2,2)
Siddiqui et al, 2006 (wet) AAS
4,4 2,1 1,6 1,8
A discrepância entre os resultados da tabela 4.6 pode ser justificada pelas diferenças entre
os procedimentos experimentais e pela análise das medidas gerarem dúvidas, principalmente no
que se refere a como corrigir o parâmetro físico que está sendo medido. Porém, de forma geral,
observa-se nas tabelas 4.5 e 4.6, que todos os autores mostram que as neoplasias mamárias
apresentam concentrações elevadas para todos os elementos, quando comparadas aos tecidos
normais.
4.4. Testes estatísticos
4.4.1. Frequências de distribuição
Na figura 4.7 estão os histogramas que representam as distribuições de frequências das
concentrações dos elementos traços obtidas com feixe monoenergético. Estes histogramas
mostram que os elementos apresentam comportamentos de distribuição positiva, característica
comum em parâmetros biológicos (ALTMAN, 1991).
Resultados e Discussões 45
Figura 4.6: Freqüências de distribuição dos elementos traços em tecidos normais, tecidos neoplásicos e tecidos
normais periféricos – distribuições obtidas com feixe monoenergético.
Para verificar a natureza das distribuições de concentrações, foi realizado o teste
Kolmogorov-Smirnov de aderência à curva normal, no qual níveis de significância abaixo de 0,05
indicam que a distribuição dos dados difere significativamente da distribuição normal. A tabela
4.7 mostra os resultados das significâncias do teste de normalidade para as distribuições obtidas
com feixes polienergético e monoenergético. Pode-se observar que a maioria das distribuições
obtidas não pode ser considerada como normal, e portanto, a comparação entre os valores de cada
grupo deve ser realizada com a aplicação de testes de hipóteses não paramétricos (CALLEGARI-
JACQUES, 2003).
Resultados e Discussões 46
Tabela 4.7: Significâncias do teste de normalidade para as distribuições de frequências
obtidas com feixes polienergéticos e monoenergético. Os valores em negrito representam
as distribuições diferentes da distribuição normal
Kolmogorov-Smirnov (significância)
Polienergético Monoenergético
TN TNP Neoplasias TN TNP Neoplasias
Cálcio ,200
,034 ,006 ,004
,200 ,153
Ferro
,001 ,014 ,044 ,037 ,003
,099
Cobre ,200 ,200
,000 ,015 ,008
,171
Zinco ,200
,029
,169
,008 ,003 ,016
4.4.2. Comparação entre tecidos normais e neoplásicos
Ao avaliar as diferenças das concentrações entre tecidos normais e neoplásicos pode-se
fazer dois tipos de comparação: o primeiro avaliando tecidos neoplásicos e seus respectivos
tecidos normais periféricos (amostras pareadas), utilizando o teste de Wilcoxon e o segundo tipo
avaliando tecidos neoplásicos e tecidos normais obtidos de pacientes independentes (amostras
não pareadas), utilizando o teste de Mann-Whitney.
Os resultados encontrados para a análise com feixe polienergético mostraram que em
amostras pareadas somente as concentrações dos elementos cobre e zinco diferiam
significativamente com p < 0,005. Para amostras não pareadas, novamente as concentrações de
cobre e zinco apresentaram diferenças significativas, com p < 0,001.
Os resultados encontrados para a análise com feixe monoenergético mostraram que para
todos os elementos (Ca, Fe, Cu e Zn) as concentrações em tecidos neoplásicos eram
significativamente maiores que em tecidos normais (p < 0,001), tanto para amostras pareadas
quanto em amostras não pareadas.
Estes resultados mostram a existência de diferenças significativas entre as concentrações
dos elementos traços em tecidos normais e neoplásicos e que estes elementos podem ser
considerados como identificadores da presença de neoplasias. Biologicamente, estes resultados
corroboram com a hipótese do aumento da atividade metabólica na região tumoral.
Resultados e Discussões 47
4.4.3. Comparação entre neoplasias benignas e malignas
Embora os resultados da comparação entre tecidos normais e neoplásicos indiquem
diferenças significativas entre estes tecidos é interessante avaliar quais elementos permitiriam
identificar a natureza benigna ou maligna das neoplasias mamárias.
Ao verificar as diferenças entre as concentrações dos elementos traços em neoplasias
benignas e malignas, não foram encontradas diferenças significativas na análise com feixe
polienergético, provavelmente devido ao reduzido número de amostras analisadas. Pela análise
com feixe monoenergético, os elementos cálcio e zinco apresentaram diferenças significativas,
com p < 0,001 e p < 0,002 respectivamente
Pode-se supor que os elementos cálcio e zinco permitiram diferenciar os tipos de
neoplasias, devido à presença de ambos nas metaloproteinases de matriz, que em neoplasias
malignas podem estar em maiores concentrações devido à característica invasora deste tipo de
tumor. Além disso, estas metaloproteínas possuem atividade total na presença de Ca
2+
(NGUYEN, 2001). Cabe lembrar ainda que o cálcio é um elemento essencial ao processo de
calcificações nos tecidos mamários, como proposto por Ng et al (1997), e o zinco é um dos
elementos responsáveis pela ativação da enzima transcriptase reserva, que atua no processo de
divisão celular (PRASAD E OBERLEAS, 1976). Este resultado, portanto, mostra esta técnica de
análise uma promissora ferramenta de auxílio ao diagnóstico na diferenciação entre neoplasias
mamárias benignas e malignas.
4.4.4. Correlações
Com o objetivo de avaliar as regras existentes entre os elementos traços, bem como
associações relacionadas aos aspectos biológicos dos tecidos mamários, foram realizados testes
de correlação. Os testes de Spearman realizados com as concentrações dos elementos traços
obtidas com feixe polienergético mostrou correlação entre os elementos cálcio e ferro (r = 0,586 /
p = 0,002), em tecidos normais. A análise com feixe monoenergético permitiu identificar a
existência de correlação entre os elementos apresentados na tabela 4.8 (valores em negrito).
Resultados e Discussões 48
Tabela 4.8: Correlações entre elementos traços em tecidos mamários normais periféricos, normais e neoplásicos
(feixe monoenergético). *correlação significante com p < 0,05 **correlação significante com p < 0,001
Coeficientes de correlação do teste de Spearman
Fe / Cu Fe / Zn Cu / Zn Ca / Cu Ca / Zn Ca / Fe
TNP 0,364* 0,486*
0,092 -0,318
0,551**
0,236
TN 0,594** 0,744** 0,397*
0,196
0,622** 0,455*
Neoplasias 0,376*
0,250 0,279 -0,096
0,554**
0,038
A tabela 4.8 indica correlações entre os elementos ferro e cobre em tecidos normais e
neoplásicos, que pode ser justificada pela participação destes elementos no processo de formação
de novos vasos sanguíneos que nutrem tecidos normais, assim como a região neoplásica
(angiogênese). Além disso, este resultado destaca a função do cobre como um importante cofator
para o metabolismo do ferro (NASULEWICZA ET AL, 2004).
As correlações mais expressivas entre cálcio e zinco encontradas nos três tipos de tecidos,
confirmam as conclusões obtidas na seção 4.4.2, acerca da presença destes elementos nas
metaloproteínas de matriz (MMPs), responsáveis pela degradação da matriz extracelular de
tecidos neoplásicos, favorecendo o crescimento do tumor e metástases. Não foram encontradas
correlações entre as idades das pacientes e as concentrações dos elementos traços.
Os níveis elevados dos elementos traços em tecidos mamários neoplásicos observados
neste trabalho podem estar associados tanto à causa como consequência do câncer de mama. Com
relação às causas, pode-se citar que os níveis elevados de Fe, Cu e Zn podem promover a
formação de radicais livres ou outras espécies reativas de oxigênio (reactive oxygen species -
ROS) que afetam o DNA, causando câncer de mama (NAGA RAJU ET AL, 2006). Isto pode ser
afirmado uma vez que radicais livres e outras ROS estão presentes nas células em condições
fisiológicas normais, e seu estado de redução (Fe
2+
ou Fe
3+
/ Cu
+
ou Cu
2+
/ Zn
2+
) na célula é
precisamente regulado. Quando a taxa de geração de ROS aumenta, os efeitos tóxicos destes
metais oxidantes aparecem (HALLIWELL E GUTTERIDGE, 1999) e podem atuar como
catalisadores no dano oxidativo de macromoléculas biológicas (STOHS E BAGCHI, 1995;
ABALEA ET AL, 1998).
Resultados e Discussões 49
Com relação às conseqüências, pode-se citar além das características anteriormente
discutidas acerca do papel de Fe e Cu na angiogênese e de Ca e Zn nas metaloproteinases de
matriz, as diferenças histológicas e bioquímicas entre tecidos normais e neoplásicos. Os tumores,
caracterizados pela multiplicação desregulada das células, necessita de um substancioso aumento
de nutrientes, incluindo os elementos traços. Isso provavelmente, realça a concentração dos
elementos nos tumores, devido ao aumento da vascularização dos tecidos malignos.
Desta forma, as técnicas de FRX que permitem determinar os níveis dos elementos traços,
bem como suas concentrações nos tecidos, pode ser uma importante ferramenta diagnóstica.
50
Conclusões
Metodologia de medida e comparação entre feixes polienergéticos e monoenergéticos
Na análise com feixe polienergético, o método de padrão externo permitiu através das
soluções de água e etanol, específicas para os diferentes tipos de tecidos, determinar as
concentrações presentes nos tecidos analisados. Entretanto, a precisão e exatidão deste método
são questionáveis pelos resultados obtidos pelos padrões certificados, além das concentrações
apresentarem ainda a influência dos efeitos de matriz.
Na análise com feixe monoenergético, o método de correção por radiação espalhada
permitiu, através da normalização das áreas dos fotopicos fluorescentes pelos picos de
espalhamento, diminuir a influência das condições experimentais no procedimento de
quantificação dos elementos traços. O teste de acurácia do método mostrou pequenas diferenças
percentuais dos valores obtidos com relação aos valores nominais, nos dois tipos de testes de
validação (experimental e através de padrões certificados).
Quando comparados os resultados dos dois métodos, verifica-se que a utilização de feixes
monoenergéticos é mais indicada se o elemento de interesse apresentar-se em menores
concentrações, devido aos menores limites de detecção desta técnica. Dentre as vantagens da
radiação síncrotron sobre o tubo de raios-X pode-se citar ainda que o alto fluxo de fótons
incidente na amostra e a radiação altamente polarizada permitiram reduzir o espalhamento. Além
disso, considerando que o tempo de análise em feixe monoenergético foi em média de 500s e nas
análises com feixe polienergético o tempo médio de cada medida foi de 3600s, experimentos com
radiação monoenergética tornam viáveis a análise de um grande número de amostras. A
metodologia de preparação das amostras para os dois tipos de feixes, utilizando técnicas não
destrutivas, permitiu que os tecidos fossem analisados em seu estado natural.
Conclusões 51
Medidas: Valores de concentração
Observou-se nos dois tipos de medidas um amplo intervalo de variação para as
concentrações de todos os elementos, justificado pela variabilidade entre diferentes indivíduos,
além da distribuição espacial possivelmente não homogênea dos elementos traços na amostra.
Embora exista a disponibilidade de técnicas de homogeneização, a intenção do projeto era
preservar a estrutura natural dos tecidos.
A magnitude da elevação dos níveis de elementos em tecidos calculada pela razão entre as
medianas das concentrações dos elementos em tecidos neoplásicos e normais, foi o parâmetro
escolhido para comparar as concentrações obtidas, bem como com outras publicações. A
elevação das concentrações dos elementos traços em amostras pareadas mostrou-se menos
pronunciada quando comparada à elevação de amostras não pareadas, indicando que o processo
de acumulação dos elementos nas neoplasias pode alterar também suas concentrações nos tecidos
normais adjacentes à lesão. Os resultados deste trabalho apresentam boa concordância com os
reportados anteriormente por Geraki (GERAKI ET AL, 2002; GERAKI ET AL, 2004.a GERAKI
ET AL, 2004.b) e Poletti (POLETTI ET AL, 2004) para Fe, Cu e Zn. A razão entre as medianas
de concentração de cálcio em tecidos normais e tecidos neoplásicos obtidas na análise com feixe
polienergético são equivalentes às obtidas por Poletti (POLETTI ET AL, 2004).
Nova ferramenta diagnóstica
Diferenças significativas entre tecidos normais e neoplásicos
Nas medidas com feixe polienergético, a análise estatística dos valores mostrou diferenças
significativas das concentrações dos elementos cobre e zinco entre tecidos normais e neoplásicos
de amostras pareadas (p < 0,005) e não pareadas (p < 0,001). Nas medidas com feixe
monoenergético, a análise estatística mostrou diferenças significativas entre as concentrações de
todos os elementos (Ca, Fe, Cu e Zn) em tecidos normais e neoplásicos de amostras pareadas e
não pareadas (ambas com p < 0,001).
Conclusões 52
Diferenças significativas entre neoplasias benignas e malignas
Pela análise com feixe monoenergético, os elementos cálcio e zinco apresentaram
diferenças significativas nos valores de concentração entre neoplasias benignas e malignas, sendo
portanto, elementos que permitiram diferenciar os diferentes tipos de neoplasias.
Perspectivas futuras
Uma vez que a técnica de FRX com feixe monoenergético permitiu diferenciar as
concentrações dos elementos traços em neoplasias benignas e malignas, pretendemos analisar um
maior número de amostras com um tubo de raios-X associado a um monocromador ou utilizando
alvos secundários, visando a aplicação prática deste método no diagnóstico dos tumores de
mama, uma vez que esta técnica pode ser facilmente implementada em pequenos laboratórios, a
um custo relativamente baixo. Pretendemos ainda, através de técnicas mais sensíveis de análise,
como a TRXRF, avaliar as concentrações de importantes elementos como, entre outros, o
manganês e selênio, de menores concentrações nos tecidos.
Para estender o conhecimento das funções fisiológicas dos elementos traços e sua
importância no processo carcinogênico, pretendemos ainda investigar aspectos acerca da
distribuição espacial destes elementos nos tecidos e suas expressões em diferentes componentes
celulares através de técnicas como a microfluorescência de raios-X.
53
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