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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
CAMPUS DE BOTUCATU
ESTRESSE, ALCOOLISMO E VITAMINA E: AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS
BIOQUÍMICOS E MORFOFISIOLOGIA PROSTÁTICA
OTÁVIO AUGUSTO MARTINS
Tese apresentada ao Instituto de Biociências,
Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do
título de Doutor no Programa de Pós-Graduação
em Biologia Geral e Aplicada.
BOTUCATU – SP
2007
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
CAMPUS DE BOTUCATU
ESTRESSE, ALCOOLISMO E VITAMINA E: AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS
BIOQUÍMICOS E MORFOFISIOLOGIA PROSTÁTICA
OTÁVIO AUGUSTO MARTINS
Prof. Dr. FRANCISCO EDUARDO MARTINEZ
(Orientador)
Prof. Dr. WÍLSON DE MELLO JÚNIOR
(Co-Orientador)
Tese apresentada ao Instituto de Biociências,
Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do
título de Doutor no Programa de Pós-Graduação
em Biologia Geral e Aplicada.
BOTUCATU – SP
2007
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS
Martins, Otávio Augusto.
Estresse, alcoolismo e vitamina E: avaliação de parâmetros bioquímicos
e morfofisiologia prostática / Otávio Augusto Martins. – 2007.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de
Biociências de Botucatu 2007.
Orientador: Francisco Eduardo Martinez
Co-Orientador: Wilson de Mello Júnior
Assunto CAPES: 20604000
1. Reprodução - Biologia 2. Estresse - Aspectos bioquímicos 3.
Lipídios - Metabolismo - Distúrbios 4. Álcool no organismo -
Estudos experimentais 5. Próstata - Aspectos bioquímicos
CDD 574.192
Palavras-chave: Bioquímica; Estresse; Etanol; Nutrição; Próstata; Rato
DEDICATÓRIA
“Ninguém acende uma lâmpada para colocá-la
debaixo de uma vasilha, e sim para colocá-la no
candeeiro, onde ela brilha para todos os que
estão em casa. Assim também: que a luz de vocês
brilhe diante dos homens, para que eles vejam as
boas obras que vocês fazem, e louvem o Pai de
vocês que está no céu” (Mateus 5,14-16).
Ao nosso criador universal DEUS, ao seu filho primogênito Jesus Cristo e à nossa mãe Maria
Ungida, por conduzirem os meus objetivos profissionais.
À minha esposa Andréia Cristina Gabriel Martins que com amor, amizade e incentivo me
possibilitou atingir este objetivo.
Ao meu grande amigo e irmão Wílson de Mello Júnior pela amizade, pelo incentivo e por
mostrar-me a importância de uma trajetória de ideais solidificadas na sabedoria.
Eu dedico a essas pessoas especiais este trabalho.
Otávio Augusto Martins
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Francisco Eduardo Martinez pela orientação, amizade, atenção e sugestões.
Ao meu grande incentivador e co-orientador Prof. Dr. Wílson de Mello Júnior que me ajudou
em todos os momentos de forma sábia e sensata.
Ao grupo de pesquisa Biologia da Reprodução – Departamento de Anatomia – Instituto de
Biociências – UNESP – Botucatu, liderado pelo Prof. Dr. Francisco Eduardo Martinez, que
colaboraram com sugestões e auxiliaram na melhoria do trabalho.
Aos meus familiares, minha mãe D. Narciza de Jesus Biazon Martins, meu pai Sr. Antônio
Brás Martins (em memória), minha sogra D. Lourdes Sganzella Gabriel, meu sogro Sr.
Genival Batista Gabriel e meus cunhados, Patrícia Maria Gabriel e Genival Batista Gabriel
Júnior.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada – Instituto de Biociências –
UNESP - Botucatu pela oportunidade, aprendizagem e incentivo na realização do doutorado.
Ao Departamento de Anatomia do Instituto de Biociências – UNESP – Botucatu, incluindo os
servidores técnicos e os docentes, pela possibilidade de desenvolver o experimento.
À Profa. Dra. Maria Isabel Arenas Jimenez do Departamento de Biologia Celular e Genética –
Universidad de Alcalá – Espanha pela grande amizade, ensinamentos sábios e princípio de
cooperativismo durante o estágio de doutorado no exterior e até hoje.
Aos professores Dr. Ricardo Paniagua, Dra. Maria del Mar Royela Garcia, Dra. Maria del Val
Toledo Lobo, Dr. Benito Fraile Laiz e o pós-graduando Ignácio Garcia-Tunon do
Departamento de Biologia Celular e Genética – Universidad de Alcalá – Espanha pela
amizade e pelos ensinamentos durante o estágio de doutorado no exterior.
Aos professores Dr. Kristijan Jezernik, Dra. Mateja Erdani Kreft, Dra. Andreja Erman, Dr.
Maksimiljan Sterle, Dr. Rok Romih, Dra. Majda Pšeninik e Dr. Peter Verani do Instituto de
Biologia Celular – Universidade de Liubliana – Eslovênia pela amizade e ensinamentos
durante o estágio no exterior.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada pela
aprendizagem.
Aos professores Dra. Patrícia F. F. Pinheiro, Dra. Camila C. D. Almeida-Francia, Dr. Sérgio
Pereira e Dra. Selma M. M. Matheus pelo incentivo e auxílio na execução deste trabalho.
Aos professores Dr. José Paes Nogueira Pinto, Dr. Germano F. Biondi, Dr. Aristides Cunha
Rudge e Dr. Dirceu Rodrigues Meira pelo incentivo em realizar a pós-graduação.
Aos meus colegas professores Dr. Vladimir Eliodoro Costa e Dr. Alexandre Dal Pai pela
amizade e auxílio em programa de computador.
Aos meus colegas pós-graduandos Rafael Kremer e Giovana R. Teixeira pela união e pelo
espírito cooperativo durante o experimento.
Aos meus colegas estagiários Henrique K. Roffato, André E. B. Camargo e Edgar V. Oliveira
pela ajuda durante o experimento.
Aos meus colegas servidores públicos Gelson Rodrigues (Departamento de Anatomia – IB –
UNESP – Botucatu) e Wanderlei Tiago da Silva (Biotério Central – UNESP – Botucatu) que
ajudaram tecnicamente a compreender as etapas durante o desenvolvimento do experimento.
Aos meus colegas do Serviço de Orientação à Alimentação Pública do Departamento de
Higiene Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia –
UNESP – Botucatu pela oportunidade da realização deste trabalho.
Aos meus novos colegas técnicos Sanja ebraja, Nada Pavlica, Linda Štrus e Sabina Železnik
do Instituto de Biologia Celular – Universidade de Liubliana – Eslovênia pela amizade
durante o estágio no exterior.
Aos meus colegas da Seção de Pós-Graduação do Instituto de Biociências – UNESP –
Botucatu pela amizade, atenção e auxílios prestados.
Aos colegas do Laboratório Experimental da Clínica Médica – Faculdade de Medicina de
Botucatu – UNESP pela preparação da ração suplementada com vitamina E.
À Fundação Regional Educacional de Avaré pelo afastamento autorizado, sem remuneração,
para a realização do estágio no exterior.
Ao Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública - Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia - Universidade Estadual Paulista – Botucatu pelo afastamento para a
realização do estágio no exterior.
Ao Prof. Dr. Celso Augusto Fessel Graner (em memória) que sempre me apoiou na época de
graduação e na pós-graduação, demonstrando ser um verdadeiro educador por ressaltar que
um pesquisador nato tem que entender e saber fazer.
Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Padovani pela colaboração na execução e compreensão dos
cálculos estatísticos.
Sumário
Resumo............................................................................................................................ 08
Abstract ........................................................................................................................... 09
I – INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 10
1. Estresse ............................................................................................................ 10
2. Estresse na fase do desenvolvimento pós-natal ................................................. 12
3. Relação mãe-filhote.......................................................................................... 13
4. Modelos experimentais de relação mãe-filhote.................................................. 15
5. Estresse e reprodução ....................................................................................... 16
6. Estresse e alcoolismo........................................................................................ 17
7. Metabolismo do álcool ..................................................................................... 19
8. Modelos experimentais de alcoolismo .............................................................. 20
9. Morfofisiologia e fisiopatologia da próstata...................................................... 21
10. Lipídios e próstata .......................................................................................... 22
11. Próstata e vitamina E ...................................................................................... 25
12. Bioquímica do sangue..................................................................................... 26
13. Justificativa e Objetivos.................................................................................. 27
II – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 28
III – ARTIGOS................................................................................................................ 38
1. Síndrome metabólica, estresse e alcoolismo em ratos machos submetidos à
dieta suplementada com vitamina E...................................................................... 39
2. Lipid (CD36, LIMPII, CLA-1/SR-BI and LDLR) and androgen receptors
on ventral prostate of alcoholic (UChB) and Wistar adult rats submitted to
Maternal Separation and vitamin supplementation (-tocopherol)......................... 63
3. Short Communication: Pode o comportamento materno ter influenciado
gerações de ratos, selecionados pelo consumo de etanol, considerados
modelos experimentais de alcoolismo?................................................................. 94
IV – CONCLUSÕES ..................................................................................................... 100
8
Estresse, alcoolismo e vitamina E: avaliação de parâmetros bioquímicos e
morfofisiologia prostática
Eventos estressantes nas primeiras fases do desenvolvimento contribuem significativamente
para tornar o adulto vulnerável a psicopatologias, incluindo o alcoolismo. A formação do eixo
hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) no desenvolvimento pós-natal é influenciada pela relação
materno-infantil e perturbações nessa relação resultam em alterações permanentes do sistema
de estresse. Em indivíduos adultos, a hiper-reatividade ao estresse foi associada à Síndrome
Metabólica, ao alcoolismo e a alterações reprodutivas. O consumo de álcool também tem sido
associado a alterações metabólicas e reprodutivas, ao estresse e a patologias como o câncer de
próstata. Os efeitos deletérios do estresse crônico e do consumo de etanol parecem estar
associados e essa hipótese foi analisada neste trabalho, avaliando parâmetros bioquímicos e a
morfofisiologia prostática, bem como foi testada a quimioproteção da vitamina E. Utilizou-se
modelo de alcoolismo experimental (ratos UChB) e modelo de indução de hiper-reatividade
do eixo HHA, Separação Materna (SM). Foram analisados os teores plasmáticos de glicose,
proteína total, colesterol total, HDL, LDL, VLDL, triglicérides, desidrogenase lática,
testosterona e corticosterona; e realizadas análises imuno-histoquímicas dos receptores de
lipídios CD36, LIMPII, CLA-1/SR-BI, LDLR e do receptor de andrógeno (AR), no epitélio
da próstata ventral. Verificou-se que o estresse crônico e o consumo de etanol alteram o
metabolismo lipídico, tanto sistêmico, quanto no epitélio prostático. Observou-se que a SM
produz alterações metabólicas sistêmicas semelhantes às descritas para a Síndrome
Metabólica. A ingestão de etanol e a SM modificam o perfil dos receptores de lipídios nas
células prostáticas. Os níveis plasmáticos de testosterona e os receptores de andrógenos no
epitélio da próstata apresentaram-se diminuídos pela ingestão de etanol. A dieta suplementada
com vitamina E atenuou os efeitos deletérios da ingestão de etanol e da SM. Portanto,
conclui-se que os efeitos da SM potencializam os efeitos do etanol no organismo, evidenciado
pelas alterações metabólicas sistêmicas e das funções prostáticas. A ingestão de etanol e a SM
produzem efeitos isolados e integrados nos parâmetros estudados e a vitamina E possui ação
quimioprotetora na manifestação dessas alterações.
Palavras-chaves: estresse, álcool, próstata, síndrome metabólica, receptores de lipídios,
vitamina E, ratos.
9
Stress, alcoholism and vitamin E: evaluation of biochemical parameters and prostatic
morphophysiology
Stressing events in the first stages of development significantly contribute to make an adult
vulnerable to psychopathologies, including alcoholism. The formation of the hypothalamic-
pituitary-adrenal axis (HPA) in the postnatal development is influenced by the mother-child
relation and disturbances in such relation result in permanent alterations in the stress system.
In adults, the hyper-reactivity to stress was associated to the Metabolic Syndrome, alcoholism
and reproductive alterations. The alcohol consumption has also been associated to metabolic
and reproductive alterations, stress and pathologies such as the prostate cancer. The
deleterious effects of the chronic stress and the ethanol consumption seem to be associated
and this hypothesis was analyzed in this work, assessing biochemical parameters and the
prostatic morphophysiology, as well as the chemoprotection of the vitamin E was tested. The
experimental alcoholism model (UChB rats) and the HPA axis hyper-reactive induction
model, Maternal Separation (MS) were used. The glucose plasmatic levels, total protein, total
cholesterol, HDL, LDL, VLDL, triglycerides, lactate dehydrogenase, testosterone and
corticosterone were analyzed, and immunohistochemical analyses of the lipid receptors CD
36, LIMPII, CLA-1/SR-BI, LDLR and of the androgen receptor (AR) were made in the
epithelium of the ventral prostate. It was verified that the chronic stress and the ethanol
consumption altered the lipid metabolism, both systemic, as in the prostatic epithelium. It was
observed that the MS produces systemic metabolic alterations similar to the ones described
for the Metabolic Syndrome. The ethanol ingestion and the MS modified the profile of the
lipid receptors in the prostatic cells. The testosterone plasmatic levels and the androgen
receptors in the epithelium of the prostate were diminished by the ethanol ingestion. The diet
supplemented with vitamin E attenuated the deleterious effects of the ethanol ingestion and
the MS. Therefore, it is concluded that the MS effects potentialized the ethanol effects in the
organism, which was made evident by the systemic metabolic and prostatic function
alterations. The ethanol ingestion and the MS produce isolated and integrated effects in the
studied parameters and the vitamin E has a chemoprotection action in the manifestation of
these alterations.
Keywords: stress, alcohol, prostate, metabolic syndrome, lipid receptors, vitamin E, rats.
10
I - INTRODUÇÃO
1. Estresse
O termo estresse designa uma série de diferentes conceitos e definições que
evoluíram tanto em termos históricos, quanto por sua utilização em diferentes áreas do
conhecimento. De etimologia latina (stringere: apertar, cerrar, comprimir), foi primeiramente
utilizado pela Física no século XVII, por Robert Hooke, para designar uma carga pesada que
afeta uma determinada estrutura física (Lazarus, 1993). Posteriormente, através dos trabalhos
do fisiologista Walter Cannon e do endocrinologista canadense Hans Selye, o termo estresse
foi trazido para as Ciências Biológicas, tendo seu uso também pela Psicologia, pelas Ciências
Sociais, dentre outras áreas, bem como um amplo uso popular do termo (Lazarus, 1993;
Ramos, 2004).
Desta forma, torna-se necessário a conceituação de estresse, visto que, mesmo
dentro dos trabalhos científicos especializados, possui diferentes aplicações e definições.
Hans Selye, em 1936, aplicou o termo às ciências biomédicas, conceituando estresse como a
resposta não específica do organismo frente a agentes ameaçadores de sua integridade. Assim,
Selye assumiu o estresse como uma resposta do organismo à ação de estímulos adversos e
nocivos que ameaçam a homeostase, os quais denominaram de estressores (Lazarus, 1993).
Encontra-se na literatura especializada, até mesmo dentro de um mesmo trabalho
(Chrousos & Gold, 1992; Lazarus, 1993; De Bellis et al., 1999; Heim & Nemeroff, 2001;
Newport et al., 2002; Tsigos & Chrousos, 2002; Gluckman et al., 2005; Kyrou et al., 2006;
Meijer, 2006), a utilização do termo estresse com diferentes concepções, ora sendo sinônimo
de estressor (ou agente estressor), ora como o sistema de resposta orgânica frente a um
estressor, ora como doença advinda de alterações orgânicas crônicas. Assim, conforme a
perspectiva teórica da pesquisa realizada, o termo estresse tem sido definido como: 1)
condição ambiental externa ou interna que perturba o normal funcionamento do organismo,
sendo neste caso sinônimo de estressor; 2) resposta do organismo, automática, global e não
específica, a qualquer agente perturbador, neste caso assumindo o conceito inicial de Selye e
3) interação desajustada entre as exigências do ambiente e a capacidade de resposta do
indivíduo (Chrousos & Gold, 1992; Lazarus, 1993; Sapolsky, 2000; Ramos, 2004).
A evolução do conceito apresenta a união de várias características atribuídas ao
termo, apresentando o estresse como um estado do organismo. Assim, estresse foi
11
conceituado como o estado de ameaça à homeostasia ou de desarmonia, causado por forças
adversas intrínsecas ou extrínsecas, que é contrabalanceado por um repertório intricado de
respostas fisiológicas e comportamentais (resposta adaptativa ao estresse), que visa
restabelecer o equilíbrio corpóreo ameaçado; podendo ser específico para determinado
estressor ou generalizado e inespecífico (Chrousos & Gold, 1992; Tsigos & Chrousos, 2002;
Kyrou et al., 2006).
No presente trabalho, utilizou-se o termo estresse vinculado ao conceito de
resposta orgânica frente a um agente estressor, muitas vezes, mesmo que redundante, utilizou-
se o termo resposta ao estresse, para dar ênfase à resposta orgânica, independentemente do
agente estressor, também denominado de reação, reatividade ou responsividade ao estresse.
Ainda, muitas vezes o termo foi utilizado em diferentes conotações, quando necessário, a fim
de respeitar a idéia, mesmo que ambígua, do autor consultado. Procurou-se não utilizar o
termo com conotação de doença, visto que o estresse como resposta orgânica, faz parte da
normalidade e do mecanismo de manutenção da saúde e da vida (Chrousos & Gold, 1992). No
entanto, a expressão estresse crônico tem sido utilizada com conotação patológica, pois a
constante ameaça a homeostase pela persistência ou freqüência de estressores, ou mesmo pela
resposta exacerbada, pode ser um fator significativo na manifestação de diversas doenças e
síndromes (Kyrou et al., 2006). As reações ao estresse graves e os transtornos de adaptação
são considerados como doença e estão relacionados na CID-10 (Classificação Estatística
Internacional de Doenças e Problemas Relacionados à Saúde).
Na perspectiva biológica, precisa-se ainda conceituar sistema de estresse, que é o
conjunto de estruturas e ações orgânicas que coordenam as respostas adaptativas do
organismo frente a agentes estressores. Os principais componentes deste sistema são: 1) o
sistema autônomo simpático e medula da glândula supra-renal e 2) os hormônios do eixo
hipotálamo-hipófise-córtex da glândula supra-renal
1
(Tsigos & Chrousos, 2002; de Kloet,
2002). A ativação do sistema de estresse leva a alterações orgânicas e comportamentais que
melhoram a habilidade do organismo para ajuste da homeostase e aumenta suas chances de
sobrevivência (Tsigos & Chrousos, 2002). Os trabalhos de Cannon foram os primeiros a
elucidar o sistema de estresse. Seus trabalhos descreveram as funções do sistema nervoso
simpático (SNS) e da medula da glândula supra-renal. Posteriormente, os trabalhos de Selye
descreveram as ações do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (Lazarus, 1993, Ramos, 2004).
1
Glândula supra-renal no homem e glândula adrenal em animais e na língua inglesa. Devido aos inúmeros
trabalhos experimentais e pelo uso na língua inglesa, também será utilizado o termo eixo hipotálamo-hipófise-
adrenal (HHA).
12
Quando a homeostasia (equilíbrio fisiológico) é alterada, devido à falha no
sistema de estresse em estabelecer uma resposta adequada, equilibrada em tempo e
intensidade ao agente estressor, ou mesmo devido à permanência do estressor; a regulação ao
redor deste novo estado alterado denomina-se alostasia. Quando há falha do sistema de
estresse, o resultado é a sobrecarga alostática, que produz danos a vários órgãos e sistemas
(Goldstein, 2003; Kyrou et al., 2006).
2. Estresse na fase do desenvolvimento pós-natal
Eventos estressantes, durante as primeiras fases do desenvolvimento, contribuem
significativamente para tornar o adulto vulnerável a psicopatologias. Os cuidados paternos
contribuem para proteger a criança, porém a privação da presença dos pais, especialmente
materna, pode romper com essa proteção (De Bellis et al., 1999; Heim & Nemeroff, 2001;
Newport et al., 2002; Gluckman et al., 2005; Meijer, 2006). Crianças que sofreram estresse
durante a infância, devido a alterações no comportamento dos pais, demonstraram alterações
permanentes no comportamento (Teicher, 2000). Traumas e negligências na infância exercem
influências no comportamento emocional e riscos para o desenvolvimento de depressão,
ansiedade e abuso de substâncias químicas (Kendler et al., 1995; Dube et al., 2001; Heim &
Nemeroff, 2001).
Estudos com animais indicam que perturbações, durante período de cuidados
maternos, produzem impactos prejudiciais e persistentes no comportamento da prole. Fatores
estressantes, incluindo a separação materna, produzem no animal comportamento
característico de ansiedade e de desordem afetiva. Esses fatores induzem hiper-reatividade
persistente no eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, secundária à hipersecreção do hormônio
liberador de corticotrofinas (ACTH
2
) (Newport et al., 2002).
Nos mamíferos, a mãe é a fonte nutricional da prole, no entanto, a relação
complexa mãe-prole vai além do suprimento das necessidades nutricionais. A mãe provê
estímulos essenciais térmicos, somatossensórios, olfatórios, visuais e auditivos durante parte
do desenvolvimento pós-natal. O ambiente produz impressões, tanto em animais quanto no
ser humano, que influenciarão, neurobiologicamente e psicologicamente, a vida inteira (De
Bellis et al., 1999; Teicher, 2000; Pryce & Feldon, 2003).
2
ACTH, do inglês adrenocortitotrophic hormone.
13
3. Relação mãe-filhote
Na relação mãe-filho, durante os primeiros meses de vida, a criança vive e
experimenta o corpo da mãe como sendo o mundo. Embora o desenvolvimento ocorra
gradualmente, há uma forte tendência, na criança, em manter-se nessa relação simbiótica com
a mãe, porque depende dela material e psicologicamente. Uma ruptura abrupta nessa relação
causará danos irreparáveis ao desenvolvimento da criança. A ausência da figura materna
poderá provocar uma perda de contato com o mundo e deficiências na formação do ego. A
mãe possibilita ao filho um desenvolvimento saudável, capacitando-o a enfrentar o mundo
com segurança. A forma como a mãe lida com os aspectos da maternidade, por exemplo,
dispensando atenção em demasia ou negando, ausentando-se mesmo que involuntariamente e
estando em um estado psicológico desfavorável; poderá trazer problemas na formação da
personalidade da criança, muitas vezes irremediáveis (Dobkin et al., 1997; Seipp & Johnston,
2005).
O desenvolvimento adequado em muitas espécies depende da relação estável entre
mãe e seu infante (recém-nascido). Variações no cuidado materno representam um fator
importante no desenvolvimento do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) e na regulação
comportamental dos filhotes. A ativação do eixo HHA é um componente central da resposta
fisiológica que ocorre após variações internas ou estressores ambientais. A deficiência de
cuidados maternos deixa o infante estressado e, conseqüentemente, suscetível a doenças e
problemas sociais na vida adulta (Liu et al., 1997; Francis et al., 1999a; Walker et al., 2004).
Estudo realizado com mães dependentes de substâncias químicas (principalmente
álcool), cujos filhos possuíam até quatro anos de idade, demonstrou que essas mães
apresentavam maiores dificuldades em cuidar de suas crianças, quando comparadas às mães
não dependentes (Savonlahti et al., 2004). Evidenciando, dessa forma, um distúrbio no
comportamento materno durante o período pós-natal. Encontrando dados semelhantes,
Brudenell (2000) enfatizou que os primeiros três meses após o nascimento é o período mais
crítico para a maternidade. Sendo um período especialmente difícil para mãe alcoólica, que
mesmo tentando abster-se da ingestão de álcool, acaba suspendendo atividades de ajuda na
recuperação. Concluindo que, o uso do álcool pela mãe, após o nascimento, pode aumentar os
riscos para a saúde da criança, causando efeitos sociais e psicológicos, como abuso e
negligência infantil.
Lieberman (2000), ao rever diversos trabalhos sobre filhos de alcoólicos,
observou que esses apresentavam alto risco de dependência alcoólica, não somente devido às
14
características genéticas ou às congênitas, mas também aos fatores do convívio familiar.
Salientou que, mesmo após uma reestruturação familiar, os problemas comportamentais dos
filhos de alcoólicos persistiam, sugerindo que tais problemas iniciavam precocemente. Muitos
estudos têm documentado o uso de álcool durante a gravidez e sua conseqüência na saúde do
infante, como a Síndrome Alcoólica Fetal e Efeitos do Álcool no Feto (Eustace et al., 2003),
porém pouca atenção tem sido dada à relação materno-infantil, durante o período pós-natal.
Experiências traumáticas na infância precoce estão associadas ao aumento do
risco de abuso de álcool e substâncias na adolescência e no adulto. Crianças e adolescentes
maltratados manifestam distúrbios do sistema biológico em resposta ao estresse, incluindo
efeitos prejudiciais no desenvolvimento cerebral. Esses distúrbios podem ser a causa do
aumento do risco de abuso de álcool durante a adolescência e na vida adulta (De Bellis, 2002;
Roman et al., 2004).
Diferenças individuais nas características da personalidade são transmitidas para a
prole. Como relatado anteriormente, estudos com gêmeos têm provido evidências de
mecanismos genéticos envolvidos nos mais complexos padrões de comportamento e
personalidade, como o alcoolismo. Por outro lado, transmissões não genéticas de
comportamento também foram descritas (Francis et al., 1999b).
Em ratos Wistar naturalmente ocorrem variações no comportamento materno de
lamber/limpar e amamentar com o dorso arcado seus filhotes (Licking/grooming and arched-
back nursing - LG-ABN). Quando adultos, os filhotes de mãe com alto índice de cuidados
(High LG-ABN) possuem comportamento de menor temor frente a situações novas e uma
resposta branda do eixo HHA ao estresse, quando comparados aos filhotes de mãe com baixo
índice de cuidados maternos (Low LG-ABN) (Francis et al., 1999a, b). Ou seja, o
comportamento materno é capaz de modular o desenvolvimento de respostas individuais do
eixo HHA e, assim, influenciar as respostas comportamentais ao estresse no adulto (Liu et al.,
1997; Caldji et al., 1998; Francis et al., 1999 a e b). Francis et al. (1999b), através de estudos
experimentais com ratos, concluíram que essas variações do comportamento materno e da
resposta ao estresse são formas de transmissão não genética de comportamento através de
gerações, pois através de experimentos de adoção cruzada entre mãe com alto e baixo
cuidados maternos (LG-ABN), verificam que o filhote fêmea reproduz o comportamento da
mãe adotiva e não da mãe biológica, o mesmo ocorrendo em relação à resposta ao estresse.
15
4. Modelos experimentais de relação mãe-filhote
Diferentes modelos experimentais foram propostos para estudar os efeitos da
relação mãe-filhote na neurobiologia e no comportamento do adulto. Diferentes intervenções
que modificam o cuidado materno neonatal, ou que são estressantes por si só, produzem
efeitos diversos permanentes na prole. Procedimentos que aumentam os cuidados maternos,
em lamber/limpar e amamentar a ninhada, produzem resultados positivos na reposta biológica
e comportamental a estressores no adulto. Por outro lado, intervenções que minimizam o
contato e os cuidados da mãe com o filhote, durante o desenvolvimento deste, provocam
resposta excessiva a estressores quando adulto, especialmente a hiper-reatividade do eixo
HHA (Pryce et al., 2001; Newport et al., 2002; Pryce & Feldon, 2003). Os diferentes graus de
comportamento materno, intensos ou baixos, que naturalmente ocorrem nas linhagens de
ratos, estão diretamente relacionados à resposta do sistema de estresse no adulto (Liu et al.,
1997; Caldji et al., 1998; Francis et al., 1999 a e b).
O modelo de experimentação, inicialmente utilizado, relacionado ao efeito do
estresse neonatal na vida adulta, foi denominado de Manipulação Neonatal. Nesse modelo, os
filhotes de roedores são removidos diariamente, durante 15 minutos, de suas caixas e
rapidamente manuseados pelo pesquisador. Como resultado, os filhotes apresentam
diminuição dos comportamentos de ansiedade e das respostas biológicas a estressores quando
adultos. Filhotes manipulados são resistentes ao estresse e à diminuição temporal da
capacidade cognitiva, exibem alto nível de comportamento exploratório em ambientes novos
e demonstram atenuada ativação dos circuitos neuronais de estresse na vida adulta (Pryce et
al., 2001; Newport et al., 2002; Pryce & Feldon, 2003). Segundo Newport et al. (2002), a
manipulação melhora a adaptabilidade do rato a subseqüentes estressores, visto que, o breve
afastamento da mãe produz aumento dos cuidados maternos à prole, causando benefícios à
adaptabilidade do filhote, ou seja, o efeito modulador no eixo HHA é devido aos cuidados
maternos, causando sua resposta mais branda, quando o animal adulto.
Outro modelo utilizado denomina-se Separação Materna (SM). Nesse modelo, os
filhotes são separados da mãe em intervalos superiores a uma hora, geralmente com duração
de 4 horas, durante dias do desenvolvimento pós-natal, antes do desmame. Assim, os filhotes
não só ficam privados dos cuidados maternos durante o período, mas também sofrem pela
alteração do comportamento materno, que persiste aberrante e torna-se menos intenso, após a
reunião mãe-filhotes, bem como o filhote e a mãe ficam sujeitos a fatores estressantes desse
isolamento. A SM induz hiperatividade do eixo HHA permanente no adulto, aumentando as
16
concentrações séricas de ACTH. O eixo HHA está normalmente quiescente durante o período
hiporresponsivo ao estresse (SHRP
3
), que nos ratos estende-se do 4
o
ao 14
o
dia pós-natal.
Nesse período, o rato neonato demonstra, aparentemente, pouca ou nenhuma resposta
adrenocortical a estímulos estressores, o que no adulto resultaria em aumento significativo das
concentrações plasmáticas de ACTH e corticosterona (Smith et al., 1997; Yoshimura et al.,
2003; Schmidt et al., 2003). No entanto, a Separação Materna pode desinibir o eixo HHA,
durante o SHRP, possibilitando ao rato neonato responder a fatores estressantes brandos. São
observadas diferentes alterações neurobiológicas conforme diferentes modelos de SM, no
entanto, essas alterações tornam-se duradouras quando a separação ocorre durante o
desenvolvimento do sistema nervoso central e podem ser um fator significativo de risco de
psicopatologias na vida adulta (Smith et al., 1997; Levine, 2001; Pryce et al., 2001; Lehmann
et al., 2002; Newport et al., 2002; Pryce & Feldon, 2003; Schmidt et al., 2004, Macrì &
Würbel, 2006).
Estudos experimentais que consideram os efeitos de impactos crônicos, ocorridos
no ambiente pós-natal, sobre o neurocomportamento, constituem exemplos de abordagem
interdisciplinar, considerando as interfaces entre as ciências biológicas, sociais e médicas
(Pryce & Feldon, 2003). Esses dois modelos apresentados tornaram-se amplamente utilizados,
apresentando efeitos antagônicos no animal adulto, em relação à atividade do sistema de
estresse.
5. Estresse e reprodução
O conhecimento atual das complexas inter-relações dos processos orgânicos
relacionados ao estresse, ao controle dos sistemas nervoso e endócrino e as funções
reprodutivas é elementar. No entanto, sabe-se que o estresse pode suprimir a atividade do eixo
reprodutivo, que os hormônios reprodutivos podem modular a atividade nervosa controladora
das respostas orgânicas a estressores e que indivíduos com depressão podem ter, tanto as
funções reprodutivas quanto o sistema de estresse, alterados (Cameron, 2004).
A exposição crônica a fatores estressantes aumenta a atividade do eixo HHA e,
concomitantemente, reduz a atividade do eixo hipotálamo-hipófise-gônada (HHG) (Young &
Korszun, 2002; Retana-Marquez et al., 2003). Estressores sociais e ambientais produzem
3
SHRP, do inglês stress-hyporesponsive period.
17
efeitos prejudiciais à função reprodutiva (Wingfield & Sapolsky, 2003), no entanto, observa-
se especificidade dos efeitos do estresse na reprodução, considerando diferentes espécies, bem
como ao considerar diferenças sexuais nos níveis de funcionamento do eixo HHG (Tilbrook et
al., 2000; Mazaro & Lamano-Carvalho, 2006; Motzer & Hertig, 2004).
Mazaro & Lamano-Carvalho (2006) demonstrou a importância do ambiente
neonatal para o desenvolvimento posterior do sistema genital. Utilizando manipulação
neonatal em ratos machos, observou efeitos deletérios prolongados em parâmetros
reprodutivos na puberdade, como diminuição na quantidade de gametas no testículo e
epidídimo. Também observou diminuição na concentração plasmática de LH
4
, porém não nas
concentrações de FSH
5
e de testosterona.
6. Estresse e alcoolismo
O consumo crônico de álcool é um problema médico de grande magnitude com
repercussões sócio-econômicas importantes. O consumo de álcool está entre as principais
causas de doenças no mundo (Ezzati et al., 2002). Está associado à causa de mais de 60
problemas de saúde, incluindo diferentes tipos de carcinomas, assim como outras alterações
orgânicas e psíquicas (Llobera et al., 1990; Caballería, 2003; Room et al., 2005). O
alcoolismo consiste numa ingestão abusiva ou prolongada de bebidas alcoólicas, a ponto de
criar hábito, dependência ou vício causando transtornos mentais e comportamentais
(Classificação Estatística Internacional de Doenças e Problemas Relacionados à Saúde - CID-10).
Tem sido amplamente demonstrado o componente genético para dependência e
consumo alcoólicos, sendo descritos muitos genes responsáveis, ao menos em parte, pelo
alcoolismo. São estudados principalmente os genes para enzimas envolvidas no metabolismo
alcoólico (álcool desidrogenase e aldeído desidrogenase) e os genes para receptores cerebrais
afetados pelo álcool (como, receptores GABA
6
). Porém, a herança dos problemas
relacionados ao álcool não segue um padrão de dominância ou recessividade mendeliana, mas
resulta de efeitos integrados e cumulativos de múltiplos genes (Li et al., 2001; Rhee et al.,
2003; Whitfield, 2005; Worst & Vrana, 2005).
Pesquisas sobre alcoolismo em seres humanos são realizadas coletando dados em
casos de adoção, histórico múltiplo de alcoolismo na família, bem como da prevalência da
4
LH, do inglês luteinizing hormone.
5
FSH, do inglês follicle- stimulating hormone.
6
GABA, do inglês gamma-aminobutyric acid.
18
doença em gêmeos monozigóticos e dizigóticos (Jacob et al., 2003). Esses tipos de estudos
concordam que cerca de 60% da suscetibilidade à dependência de álcool é devida à variação
genética, tanto para homens quanto para mulheres. Portanto, fatores ambientais contribuem
com cerca de 40% para a dependência alcoólica, visto que, um número significante de gêmeos
monozigóticos é discordante para essa condição (Gordis, 2000; Whitfield et al., 2004;
Whitfield, 2005).
Embora parte da pré-disposição ao alcoolismo seja devida à hereditariedade, nem
todos com histórico familiar para o alcoolismo desenvolvem a doença. O ambiente social e
familiar foi apresentado como capaz de moderar o impacto do alto risco genético em
desenvolver desordens relacionadas ao consumo de álcool (Jacob et al., 2003).
Conseqüentemente, é importante identificar os fatores ambientais que estão envolvidos no
desenvolvimento do alcoolismo, a forma e a extensão que esses fatores interagem com os
fatores genéticos. Segundo Gordis (2000), uma das questões mais proeminentes na pesquisa
sobre o alcoolismo é a recíproca combinação de estudos comportamentais e biológicos a fim
de entender a interação da expressão genética com o ambiente na manifestação do alcoolismo.
Fatores ambientais foram estudados quanto à prevalência de alcoolismo ou de
problemas com o álcool considerando, principalmente, o meio social do adulto (Withfield et
al., 2004; Withfield, 2005), do adolescente (Rhee et al., 2003; Jacob et al., 2003) e da criança
em idade escolar (Lieberman, 2000; Jacob et al., 2003). No entanto, pouco se estudou sobre a
importância da relação materno-infantil, no primeiro período do desenvolvimento pós-natal,
na relação de dependência ou de consumo de álcool.
Experiências traumáticas na infância precoce estão associadas ao aumento do
risco de abuso de álcool e substâncias na adolescência e no adulto. Crianças e adolescentes
maltratados manifestam distúrbios do sistema biológico em resposta ao estresse, incluindo
influências prejudiciais no desenvolvimento cerebral. Esses distúrbios podem ser a causa do
aumento do risco de abuso de álcool durante a adolescência e na vida adulta (De Bellis, 2002;
Roman et al., 2004).
As características da personalidade, a educação e a situação social estão
relacionadas ao risco de desenvolver alterações no sistema de estresse, que podem ser
agravadas pelo abuso de estimulantes, como o fumo, álcool e drogas (Bjorntorp, 2001).
Estudos em animais e em seres humanos sugerem que situações de estresse aumentam o
consumo de etanol (Soderpalm & Wit, 2002). No entanto, quanto mais se utiliza álcool para
aliviar situações de estresse, menos efeito ele produz, necessitando de maiores doses para
19
obter o efeito de relaxamento desejado, entrando num ciclo vicioso de causa e efeito (San José
et al., 2000; Oberley, 2002). Recentes estudos nos Estados Unidos da América têm
demonstrado que 12,5% dos adultos (>26 milhões de americanos) já foram dependentes de
álcool e o consumo tem aumentado significativamente entre os jovens menores de 18 anos.
Hingson et al. (2006) relataram que esse aumento resultou dos inúmeros fatores estressantes
que ocorrem na infância, principalmente os problemas familiares e a depressão.
Utilizando modelo experimental de Separação Materna em ratos Wistar, Roman et
al. (2004) não verificaram alteração do consumo voluntário de etanol em fêmeas. Contudo,
dados na literatura especializada são controversos a respeito de alterações do consumo
voluntário de etanol em ratos machos, submetidos à separação materna durante o
desenvolvimento pós-natal, indicando diferenças sexuais da separação materna (Ploj et al.,
2003; Roman et al., 2004). Estudo utilizando estresse neonatal, através de separação materna,
com linhagens selecionadas para maior (AA
7
) ou menor (ANA
8
) consumo de etanol,
apresentou diferentes resultados quanto ao consumo de etanol em adultos, porém deixou
evidente que manipulações no ambiente durante o desenvolvimento pós-natal afetam o
consumo de etanol na vida adulta (Roman et al., 2005).
7. Metabolismo do álcool
São muitos fatores que influenciam o metabolismo do etanol e,
conseqüentemente, determinam seu efeito tóxico (Caballería, 2003). No fígado existem três
sistemas de metabolismo do etanol que estão localizados em regiões diferentes do hepatócito:
1) enzima álcool desidrogenase (ADH), no citossol; 2) sistema de oxidação microssomal do
etanol (MEOS), no retículo endoplasmático e 3) catalase, nos peroxissomas. Cada sistema usa
metabolismo específico, porém produz em comum o acetaldeído, altamente tóxico,
mutagênico e carcinogênico (Lieber, 1991; Badger et al., 2003; Caballería, 2003; Lieber,
2005).
Enzima álcool desidrogenase (ADH). A principal via de transformação do etanol
ocorre pela enzima ADH, que converte o etanol em acetaldeído. Nessa reação, o hidrogênio é
transferido do etanol para o NAD
+
, gerando o NADH + H
+
. As enzimas álcool desidrogenase
7
AA, do significado Alko Alcohol.
8
ANA, do significado Alko-Non-Alcohol.
20
e aldeído desidrogenase possuem propriedades catalíticas específicas, apresentando diferenças
entre os grupos raciais (Lieber, 1991; Murty, 2004).
Sistema de oxidação microssomal do etanol (MEOS). O álcool também pode ser
transformado pelo MEOS, utilizando o NADP
+
, ao invés do NAD
+
. A enzima álcool
desidrogenase é o principal sistema oxidante para baixas concentrações de etanol e o MEOS
ocorre em concentrações altas, especialmente em indivíduos que fazem uso crônico de álcool
(Lieber, 1991; Murty, 2004). O consumo crônico de etanol ativa o MEOS, cuja enzima
CYP2E1, forma induzida pelo etanol do P-450 hepático, é responsável pela formação de
espécies reativas de oxigênio (ERO), sendo um dos principais mecanismos de danos hepáticos
(Badger et al., 2003; Willner & Reuben, 2005).
Catalase. A catalase, ao oxidar o etanol em acetaldeído, consome peróxido de
hidrogênio, gerando água. A produção de peróxido de hidrogênio pelo hepatócito é lenta,
limitando a atividade da catalase (Lieber, 1991; Murty, 2004).
Outras reações de óxido-redução do NAD
+
, que ocorrem no ciclo do ácido
tricarboxílico (Krebs), tornam-se lentas na presença de etanol. A produção máxima de
oxidação do acetato não pode ser mais que 25% do normal. Com isso, o acetato é desviado
para a síntese de ácidos graxos, ocorrendo a esteatose hepática (doença gordurosa do fígado),
características de alcoólicos (Murty, 2004).
O metabolismo alcoólico pode ser sobrecarregado com ativação crônica dos
mecanismos de estresse. Em resposta ao estresse, processos de desintoxicação são
intensificados em níveis sistêmico e celular, a fim de rapidamente liberar o organismo de
substâncias tóxicas e de subprodutos metabólicos produzidos sob condições de estresse
(Kyrou et al., 2006). O consumo crônico de etanol está associado ao aumento da resistência à
insulina e por inibição da lipólise, alterando os metabolismos de glicose e lipídios, bem como
a distúrbios hemodinâmicos (Vacanti et al., 2004).
8. Modelos experimentais de alcoolismo
Fatores genéticos e ambientais contribuem para o risco de abuso do álcool e
alcoolismo. Devido às dificuldades e implicações éticas em pesquisas com seres humanos
sobre o tema, a grande parte do conhecimento, descrito na literatura especializada, provém de
estudos com roedores.
21
Ratos e camundongos, em geral, não bebem soluções aquosas contendo mais de
5% de etanol, não alcançando níveis sanguíneos de intoxicação. Para solucionar esse
problema, pesquisadores selecionaram, principalmente a partir de ratos da linhagem Wistar,
animais com comportamento anormal em relação ao consumo de álcool (Li et al., 2001).
Iniciando nos anos 50, linhagens consumidoras de grande quantidade de etanol,
foram selecionadas, quase que contemporaneamente, no Chile, na Finlândia, nos Estados
Unidos e no Canadá (Li et al., 2001). Recentemente, vários pesquisadores de outros países
como Itália (Permufi et al., 2005), Japão (Kitanaka et al., 2004) e Polônia (Dyr & Kostowski,
2004), desenvolveram novos modelos, basicamente tendo em comum a origem em ratos
Wistar e a seleção de dois pares de linhagens (pouco e muito consumo de etanol).
As variedades de ratos UChA (pouco bebedor) e UChB (bebedor) constituem
modelos raros para estudos relacionados aos fatores genéticos, bioquímicos, fisiológicos,
nutricionais e farmacológicos dos efeitos do álcool, além do apetite e a tolerância que são
importantes fatores do alcoolismo humano (Mardones & Segovia-Riquelme, 1983; Mardones,
1993; Tampier et al., 2000; Quintanilla et al., 2006).
9. Morfofisiologia e fisiopatologia da próstata
A Organização Mundial da Saúde (OMS) prevê para 2015 e para 2030 um total de
9 milhões e de 11,4 milhões de mortes no mundo por câncer, respectivamente. A nota da
OMS (2006) cita que um dos tipos de câncer mais comum no homem é o de próstata.
Também relata fatores que causam o câncer, tais como: os fatores dietéticos, como a
obesidade e a escassez de uma dieta saudável; inatividade física; estresse e o uso abusivo de
álcool (Bidoli et al., 2005; Velicer et al., 2006; Mitsuyama et al., 2006; Favaro & Cagnon,
2006; Cândido et al., 2006).
A próstata de ratos é multilobada, estruturada ao redor do início da uretra pélvica.
Os lobos são nomeados conforme sua posição anatômica em: ventral, dorsolateral (muitas
vezes separada em lateral e dorsal) e anterior, também denominada de glândula de coagulação
(Marker et al., 2003; Cunha et al., 2004). Existem diferenças na morfogênese e na histologia
dos lobos e em proteínas secretadas, contudo, uma homologia com a próstata humana
compacta não foi bem estabelecida, porém apresenta desenvolvimento e função análogos. O
epitélio adulto prostático consiste de células secretoras, basais e neuroendócrinas (Wang et
al., 2001; Schalken & Leenders, 2003). A próstata de roedores consiste de coleção de ductos
22
ramificados que emergem a partir da uretra, estendendo-se distalmente a sua cápsula externa,
denominado de sistema ductal. Possui partes distal, intermediária e proximal em relação à
uretra (Marker et al., 2003).
A manutenção do epitélio prostático adulto é dependente da atuação de
andrógenos (Royuela et al., 2001; Pang et al., 2002; Cunha et al., 2004; Pereira et al., 2006),
mediada pela interação estroma-epitélio. A homeostase das interações epitélio-estroma
mantém a alta diferenciação celular, o equilibro proliferação-quiescência-morte celular
funcional das células prostáticas. A carcinogênese e a progressão de tumores malignos são
reguladas via essas importantes interações (Thomson et al., 2002; Marker et al., 2003; Cunha
et al., 2004). Os andrógenos atuam na fisiologia prostática, principalmente, através de seus
receptores (AR). A testosterona liga-se ao receptor de andrógenos estimulando o crescimento
celular (Heinlein & Chang, 2004; Moura et al., 2006), dessa forma o receptor de andrógenos e
os moduladores de sua atividade são de grande importância na fisiopatologia do câncer de
próstata.
10. Lipídios e próstata
Alterações fisiopatológicas da próstata, como efeito do consumo de etanol
(Saravanan et al., 1994; Martinez et al., 1993, 2001; Cagnon et al., 1996, 1998, 2001;
Cândido et al., 2006; Fávaro & Cagnon, 2006), tumores (Heemers et al., 2001; Swinnen et
al., 2004), pós-vasectomia (Mello Júnior, 1998) e envelhecimento em roedores (Pegorin de
Campos et al., 2006; Zanetoni et al., 2007), têm sido associadas ao acúmulo de gotas lipídicas
no citoplasma das células secretoras.
O aumento na lipogênese é uma importante característica das células neoplásicas
(Swinnen et al., 1996; Kuhajda, 2000; Zanetoni et al., 2007) e os andrógenos são os principais
agentes reguladores desse processo em células de câncer prostático (Swinnen et al., 2004). A
estimulação da lipogênese por andrógenos, coordena a expressão de múltiplas enzimas
envolvidas na síntese, metabolismo e transporte de ácidos graxos e colesterol (Heemers et al.,
2001, 2004; Swinnen et al., 2004). Embora o aumento da lipogênese seja inicialmente
dependente de andrógenos, também ocorre no desenvolvimento de cânceres independentes de
andrógenos, sugerindo que a lipogênese desempenha papel fundamental na biologia celular do
câncer prostático (Swinnen et al., 2004).
23
A regulação da lipogênese prostática ocorre através da ativação da proteína
SREBP (sterol-regulatory element-binding protein). Essa enzima apresenta-se inativa pela
interação SREBP-SCAP (SREBP-cleavage-activating protein), que permanece retida no
retículo endoplasmático pelas proteínas de retenção INSIG (insulin-induced gene). O
complexo SREBP-SCAP-INSIG é estabilizado pelo colesterol. Quando níveis de esteróis são
baixos, o complexo SREBP-SCAP é liberado da proteína de retenção INSIG e migra para o
aparelho de Golgi, onde é proteoliticamente clivado e ativado o fragmento amino-terminal
SREBP. O fragmento SREBP então é translocado para o núcleo, onde interage com sítios de
transcrição de genes envolvidos na síntese de lipídios e de receptores lipídicos e no
metabolismo de ácidos graxos e colesterol (Heemers et al., 2001; Swinnen et al., 2004;
Sampath & Ntambi, 2006). Os receptores de andrógenos atuam principalmente no aumento da
expressão de SCAP, alterando o balanço entre SCAP e sua proteína de retenção (INSIG),
favorecendo a liberação do complexo SREBP-SCAP (Heemers et al., 2004).
Heemers et al. (2004) observaram que o gene para transcrição de SCAP pode
interagir, não só com receptor de andrógeno, mas também com receptor de glicocorticóide,
conferindo resposta a glicocorticóides ao complexo SREBP-SCAP, que como já descrito,
constitui o regulador do metabolismo lipídico, maior alvo da ação de andrógenos em células
de câncer prostático (Swinnen et al., 2004).
Os lipídios plasmáticos, colesterol, triglicérides e fosfolipídios com compostos
hidrofóbicos como a vitamina E são carregados na corrente sanguínea pelas lipoproteínas
solúveis em água. Para prover adequado suprimento de colesterol às células, diversos
mecanismos de captura das lipoproteínas plasmáticas envolvem receptores, importantes no
metabolismo de lipídio, como CD36, CLA-1/SR-BI, LDLR, LIMPII, dentre outros (Calvo et
al., 1997; Fidge, 1999; Lobo et al., 2001; Rigotti et al., 2003; Arenas et al., 2004). Os
receptores CD36, CLA-1/SR-BI e LIMPII são denominados de scavenger receptors, baseado
na função de limpeza (varrer) e por reconhecer e remover macromoléculas desnecessárias no
meio celular, como a LDL (lipoproteínas de baixa densidade) modificada. Pertencem à
mesma classe B e possuem alto grau de homologia, embora apresentem funções distintas no
metabolismo lipídico (Moore & Freeman, 2006; Shetty et al., 2006).
O receptor de LDL (LDLR) é uma glicoproteína da superfície celular que se
conecta e internaliza LDL, os principais transportadores de colesterol e ácidos graxos no
sangue. A expressão de LDLR é regulada pela SREBP (fator de transcrição) (Chen &
Hughes-Fulford, 2001; Swinnen et al., 2004). Chen & Hughes-Fulford (2001) e Hughes-
24
Fulford et al. (2001) demonstraram que células de câncer prostático expressam mais
moléculas de LDLR que células normais, sugerindo que a maior absorção de ácidos graxos
pela elevada concentração de LDLR, provê às células tumorais recursos extras de energia e de
moléculas estruturais, que promovem seu crescimento incontrolado.
O CD36, scavenger receptor classe B é receptor de LDL oxidado, LDL, HDL,
VLDL, trombospondina, colágeno, ácidos graxos e derivados de patógenos. Devido a sua
ampla especificidade, o CD36 está envolvido em vários processos normais e patológicos
(Moore & Freeman, 2006). O CD36, além de receptor de lipídios, também é um dos
receptores de transmembrana de trombospondina (TSP), glicoproteína que naturalmente inibi
a angiogênese, essencial para o crescimento tumoral (Calvo & Vega, 1993; Vallbo et al.,
2004; Vallbo & Damber, 2005; Damber et al., 2006). O papel da trombospondina no
desenvolvimento do câncer prostático ainda não foi extensamente estudado, porém Vallbo et
al. (2004) observaram que a TSP está expressa em próstata normal e em hiperplasia benigna
de próstata (BPH), porém sua expressão está diminuída em tecido prostático pré-maligno
(PIN – neoplasia intra-epitelial) e está ausente em câncer prostático.
A LIMPII (Lysosomal Integral Membrane Protein II) é uma proteína que
pertence, como CD36, à família denominada scavenger receptor classe B (Calvo & Vega,
1993; Cao et al., 1997; Crombie & Silverstein, 1998; Pussinen et al. 2000). Crombie &
Silverstein (1998) relataram que o LIMPII pode ter função semelhante ao CD36, além de
receptor de lipídios, pode conectar-se a trombospondina.
O receptor de lipoproteína CLA-1/SR-BI é um membro glicoprotéico da família
do gene CD36, que se liga ao HDL, colesterol livre, fosfolipídios e outras moléculas (Ji et al.,
1997; Cao et al., 1997; Crombie & Silverstein, 1998; Pussinen et al., 2000; Lobo et al., 2001;
Arenas et al., 2004).
Os receptores de lipídios foram bem estudados em diversos órgãos,
principalmente no fígado (Pussinen et al., 2000) e em células de defesa (Calvo & Vega, 1993;
Handberg et al., 2006). No entanto, mesmo diante da importância do metabolismo lipídico na
fisiologia e na patologia da reprodução, a participação de receptores de lipídios no sistema
genital tem sido pouco estudada. Arenas et al. (2004) estudando receptores de lipídios em
testículos humanos normais e patológicos, demonstraram a importância dessas proteínas no
suprimento de colesterol na síntese de testosterona. No entanto, há pouco conhecimento sobre
o mecanismo de ação dos receptores de lipídios na fisiopatologia da próstata (Chen &
25
Hughes-Fulford, 2001; Damber et al. 2006); embora há crescente busca por novas terapias
anticarcinogênicas voltadas para metabolismo de lipídios (Swinnen et at., 2004).
11. Próstata e vitamina E
O câncer de próstata é uma doença crônica, que mesmo com os avanços no
conhecimento de seus mecanismos, tem aumentado em incidência e é a segunda causa de
mortalidade por câncer em homens. Conseqüentemente, segundo Singh & Agarwal (2006),
sua quimioprevenção revela-se como uma estratégia adicional e atrativa no controle da
doença, principalmente porque as terapias existentes para diminuir sua morbidade e
mortalidade são, muitas vezes, ineficazes.
A vitamina E (alfa-tocoferol) é elemento nutricional lipossolúvel, cuja
importância inicial foi demonstrada nas pesquisas sobre fertilidade. É o principal antioxidante
de membranas biológicas, catador de radicais livres, quebrando reações em cadeia, inibindo a
peroxidação lipídica, especialmente na atividade biológica relacionada à carcinogênese
induzida por danos ao DNA (Klein et al., 2001). A deficiência de vitamina E é associada ao
dano oxidativo tecidual, sendo sua suplementação relacionada a ação quimioprotetora para o
organismo, embora não se recomende sua suplementação na dieta indiscriminadamente
devido as controvérsias de seu benefício (Fleshner & Klotz, 1999; Chen et al., 2000; Sonn et
al, 2005).
Estudo realizado com dieta enriquecida com vitamina E e licopeno, junta ou
separadamente, em modelo experimental de carcinoma prostático em rato, sugeriu que a
vitamina E acumula-se no tecido tumoral, aumentando sua necrose, por inibição de receptores
de andrógenos (Siler et al., 2004). Também foi observado que a vitamina E inibi a
biodisponibilidade de receptores de andrógenos em linhagens de células de câncer de próstata
(Heinlein & Chang, 2004). Ni et al. (2003), em cultura de células tumorais prostáticas
humanas, sugeriram que a vitamina E atua inibindo o crescimento celular através da
modulação dos processos do ciclo celular proliferativo. Jiang et al. (2004), também,
sugeriram que a vitamina E age na indução de morte celular nas células de carcinoma
prostático humano, interrompendo a síntese de esfingolipídios. A vitamina E, associada ao
selênio, induz apoptose em cultura de células tumorais prostáticas humanas, através da
26
ativação de diferentes tipos de caspases, iniciadoras do processo de morte celular (Zu & Ip,
2003).
No entanto, os estudos epidemiológicos sobre os benefícios da suplementação da
dieta com vitamina E são controversos e não conclusivos (Kantoff, 2006). Por outro lado, há
evidência de que a suplementação, em grandes doses, pode aumentar o risco para outras
doenças (Sonn et al., 2005). A comunidade científica internacional aguarda a conclusão de
um importante estudo sobre vitamina E e câncer de próstata, denominado SELECT (Selenium
and Vitamin E Cancer Prevention Trial), para elucidar o papel da vitamina E na
carcinogênese prostática (Soon et al., 2005). SELECT um estudo em larga escala sobre
quimioprevenção para câncer prostático, cuja conclusão está prevista para o ano de 2013
(Klein et al., 2001).
12. Bioquímica do sangue
O teor de glicose no sangue é importante na avaliação de distúrbios do
metabolismo de carboidratos. A glicose apresenta alterações em indivíduos obesos, em
parentes de primeiro grau de pacientes diabéticos, em etnias de alto risco, pacientes
hipertensos e muito outros (Westgard et al., 1981). A determinação do colesterol total faz
parte do perfil lipídico do sangue e é transportado por três lipoproteínas: lipoproteína de alta
densidade (HDL), lipoproteína de baixa densidade (LDL) e lipoproteína de muito baixa
densidade (VLDL) (Young, 1997). Os triglicérides formam a maior parte do tecido adiposo,
constituído na forma de armazenamento de energia e produz com grande rapidez em resposta
a diversos estímulos (dieta, atividade física, estresse, idade) (Tietz, 1995). Westgard (1981)
cita que o nível de proteína total é um reflexo de sínteses hepáticas ou de perda de proteínas
devido à enfermidade renal, desnutrição severa, queimaduras graves e hemodiluição. A
desidrogenase lática (LDH) pertence a uma classe de enzimas que catalizam reações de oxi-
redução que são amplamente distribuídas em todos os tecidos humanos e qualquer
modificação nos teores sangüíneos sugere alteração orgânica (Young, 1997).
27
13. Justificativa e Objetivos
O estresse crônico e o alcoolismo são doenças cuja incidência tem aumentado na
sociedade de diferentes países. Há evidências, sob perspectiva social, que ambos estão
associados. Sob a perspectiva biológica seus efeitos no organismo têm sido estudados
considerando diferentes aspectos, porém muitas questões necessitam ser esclarecidas.
As funções reprodutivas são afetadas tanto pelo estresse, quanto pelo alcoolismo.
No entanto, o mecanismo fisiopatológico envolvido nas alterações é complexo e a interação
dos efeitos do estresse e do alcoolismo na função reprodutiva necessita de maior
compreensão.
Visto que uma das patologias mais importantes que acomete o homem é o câncer
de próstata, cuja incidência também tem aumentado, foi estudado, em modelo experimental, o
efeito de alterações do sistema de estresse e da ingestão de álcool na fisiopatologia desse
órgão, bem como do organismo como um todo.
Os estudos sobre o efeito da vitamina E na proteção do organismo não são
conclusivos, principalmente quanto ao câncer de próstata, assim, acrescentamos em nosso
estudo a avaliação da suplementação dessa vitamina nos parâmetros estudados.
Considerando as premissas acima, os objetivos deste trabalho foram:
- verificar a integração dos efeitos da Separação Materna e da ingestão crônica de
etanol no metabolismo sistêmico e na morfofisiologia prostática;
- estudar os receptores de lipídios e de andrógenos no epitélio secretor prostático
normal e de animais submetidos ao alcoolismo crônico e à Separação Materna;
- avaliar o metabolismo sistêmico, através dos parâmetros bioquímicos do sangue,
de ratos alcoólicos e de ratos que sofreram Separação Materna;
- verificar o efeito quimioprotetor da vitamina E nos parâmetros estudados.
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38
III – ARTIGOS
1. Síndrome metabólica, estresse e alcoolismo em ratos machos submetidos à dieta
suplementada com vitamina E.
2. Lipid (CD36, LIMPII, CLA-1/SR-BI and LDLR) and androgen receptors on ventral
prostate of alcoholic (UChB) and Wistar adult rats submitted to Maternal Separation and
vitamin supplementation (-tocopherol).
3. Pode o comportamento materno ter influenciado gerações de ratos, selecionados pelo
consumo de etanol, considerados modelos experimentais de alcoolismo?
39
Artigo I
SÍNDROME METABÓLICA, ESTRESSE E ALCOOLISMO EM RATOS MACHOS
SUBMETIDOS À DIETA SUPLEMENTADA COM VITAMINA E
40
SÍNDROME METABÓLICA, ESTRESSE E ALCOOLISMO EM RATOS MACHOS
SUBMETIDOS À DIETA SUPLEMENTADA COM VITAMINA E
Resumo
Eventos estressantes nas primeiras fases do desenvolvimento contribuem
significativamente para tornar o adulto vulnerável a psicopatologias, incluindo o alcoolismo.
A formação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) no desenvolvimento pós-natal é
influenciada pela relação materno-infantil e perturbações nessa relação resultam em alterações
permanentes do sistema de estresse. Em indivíduos adultos, a hiper-reatividade ao estresse foi
associada à Síndrome Metabólica, doença que resulta em alterações orgânicas e psíquicas,
caracterizada pela hiperglicemia, hiperlipidemia, excesso de peso ou obesidade e pela
hipertensão arterial, dentre outras alterações. O objetivo deste trabalho foi verificar as
alterações metabólicas nos animais adultos que foram submetidos à Separação Materna (SM)
e/ou ao consumo crônico de álcool, verificando os efeitos de dieta suplementada com
vitamina E nos parâmetros avaliados. Foram analisados os teores plasmáticos de glicose,
proteína total, colesterol total, HDL, LDL, VLDL, desidrogenase lática e corticosterona de
ratos adultos alcoólicos (UChB) e Wistar. A ingestão de etanol e a Separação Materna
causaram hiperglicemia, hiperlipidemia e alterações nos teores de desidrogenase lática. O teor
de proteína total plasmática foi menor nos animais UChB. A vitamina E influenciou muitos
dos parâmetros estudados. Conclui-se que a Separação Materna causa alterações semelhantes
às descritas para a Síndrome Metabólica, que, portanto, pode também ter sua causa em
eventos na infância. Há interação dos efeitos da ingestão de etanol e do estresse nas funções
orgânicas, bem como, a vitamina E representa um agente quimioprotetor, evitando parte das
alterações metabólicas causadas pela ingestão de etanol ou pelo estresse crônico.
Palavras-chaves: síndrome metabólica, estresse, alcoolismo, vitamina E, rato.
41
Introdução
O estresse é um mecanismo de regulação da homeostase que visa, através de
respostas fisiológicas e comportamentais, restabelecer o equilíbrio organísmico (holístico do
indivíduo) após a ameaça de um agente estressor. Seu mecanismo de ação envolve o sistema
nervoso simpático, o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) e um complexo de circuitos
neuronais que regulam a resposta autonômica, endócrina e comportamental. No entanto, o
estresse crônico constitui um estado patológico, envolvido na patogênese de muitas
psicopatologias e síndromes (Kam et al., 2005; Ricart-Jané et al., 2005; Kyrou et al., 2006;
Macri & Würbel, 2006).
Eventos estressantes, durante as primeiras fases do desenvolvimento, contribuem
significativamente para tornar o adulto vulnerável a psicopatologias. Os cuidados paternos
contribuem para proteger a criança, porém a privação da presença dos pais, especialmente
materna, pode romper com essa proteção (De Bellis et al., 1999; Heim & Nemeroff, 2001;
Newport et al., 2002; Gluckman et al., 2005; Meijer, 2006). Crianças que sofreram estresse
durante a infância, devido a alterações no comportamento dos pais, demonstraram alterações
permanentes no comportamento (Teicher, 2000). Traumas e negligências na infância exercem
influências no comportamento emocional e riscos para o desenvolvimento de depressão,
ansiedade e abuso de substâncias químicas (Kendler et al., 1995; Dube et al., 2001; Heim &
Nemeroff, 2001).
Um modelo experimental bem estabelecido para estudar o efeito permanente da
relação materno-infantil, durante o desenvolvimento pós-natal, denomina-se Separação
Materna (SM). Os filhotes são separados da mãe em intervalos superiores a uma hora, durante
dias do desenvolvimento pós-natal, antes do desmame. Assim, os filhotes não só ficam
privados dos cuidados maternos durante o período, mas também sofrem pela alteração do
comportamento materno, que persiste após a reunião mãe-filhotes. A SM resulta na hiper-
reatividade do eixo HHA no adulto (Pryce et al., 2001; Newport et al., 2002; Pryce & Feldon,
2003; Schmidt et al., 2004; Macri & Würbel, 2006). A ausência da mãe priva os filhotes de
cuidados maternos essenciais ao desenvolvimento do sistema nervoso (Meaney, 2001), sendo
um modelo, segundo Zimmerberg et al. (2003), que se assemelha a negligência materna na
infância em humanos. Boccia et al. (2006) relataram que períodos de separação materna pós-
natal produzem, na fêmea, comportamento semelhante à depressão, sugerindo a SM como
modelo para depressão maternal.
42
Em indivíduos adultos, a hiper-reatividade ao estresse foi associada à síndrome
metabólica. A síndrome metabólica é a mais comum doença metabólica da atualidade e
também a principal responsável por eventos cardiovasculares, dentre outras alterações
orgânicas e psíquicas. Caracterizada pela associação dos metabolismos de carboidratos e de
lipídios, excesso de peso ou obesidade e pela hipertensão arterial, dentre outras alterações
(Bjorntorp, 2001; Matos et al., 2003; Kyrou et al., 2006; Tenenbaum et al., 2006). Devido ao
aumento da incidência em todo mundo de síndrome metabólica e diabetes, muitos trabalhos
procuram novas opções terapêuticas e dietas no combate aos efeitos danosos ao organismo,
principalmente na diminuição do risco de patologias cardiovasculares (Tenenbaum et al.
2006).
A síndrome metabólica também foi associada a eventos na infância, como o peso
baixo ao nascer de crianças (Bjorntorp, 2001) e a amamentação excessiva experimental em
ratos (Boullu-Ciocca et al., 2005). Loizzo et al. (2006), recentemente associaram a
manipulação neonatal do filhote (10 min por dia) a alterações metabólicas e hormonais em
camundongo macho adulto, similares as encontradas em modelos de diabetes mellitus. Em
seres humanos, a utilização de diferentes dietas por neonatos, principalmente prematuros,
produziu efeitos a longo prazo no metabolismo (Singhal et al., 2003).
As características da personalidade, a educação e a situação social estão
relacionadas ao risco de desenvolver alterações no sistema de estresse, que podem ser
agravadas pelo abuso de estimulantes, como o fumo, álcool e drogas (Bjorntorp, 2001).
Estudos em animais e em seres humanos sugerem que situações de estresse aumentam o
consumo de etanol (Soderpalm & Wit, 2002). No entanto, quanto mais se utiliza álcool para
aliviar situações de estresse, menos efeito ele produz, necessitando de maiores doses para
obter o efeito de relaxamento desejado, entrando num ciclo vicioso de causa e efeito (San José
et al., 2000; Oberley, 2002). Estudos recentes nos Estados Unidos da América têm
demonstrado que 12,5% dos adultos (>26 milhões de americanos) já foram dependentes de
álcool e o consumo tem aumentado significativamente entre os jovens menores de 18 anos.
Hingson et al. (2006) relataram que esse aumento resultou dos inúmeros fatores estressantes
que ocorrem na infância, principalmente os problemas familiares e a depressão. Manipulações
no ambiente durante o desenvolvimento pós-natal afetam o consumo de etanol na vida adulta
de ratos geneticamente selecionados pelo consumo de etanol (Ploj et al., 2003; Roman et al.,
2004; Roman et al., 2005). O metabolismo alcoólico pode ser sobrecarregado com ativação
crônica dos mecanismos de estresse. Em resposta ao estresse, processos de desintoxicação são
43
intensificados em níveis sistêmico e celular, a fim de rapidamente liberar o organismo de
substâncias tóxicas e de subprodutos metabólicos produzidos nessas condições (Kyrou et al.,
2006). O consumo crônico de etanol está associado ao aumento da resistência à insulina e a
inibição da lipólise, levando a alterações do metabolismo glicídico e lipídico, bem como a
distúrbios hemodinâmicos (Vacanti et al., 2004).
O estresse crônico tem efeito negativo em diversas funções celulares, dentre elas,
o desequilíbrio dos agentes antioxidantes, levando ao dano bioquímico. A exposição a
situações estressantes pode estimular vias de produção de radicais livres e diminuir as defesas
antioxidantes (Torres et al., 2004; Kyrou et al., 2006). A vitamina E (alfa-tocoferol) é um
elemento nutricional lipossolúvel e o principal antioxidante de membranas biológicas, catador
de radicais livres, quebrando reações em cadeia, inibindo a peroxidação lipídica. A deficiência
de vitamina E é condição nutricional associada também ao dano oxidativo tecidual, sendo sua
suplementação relacionada a um papel quimioprotetor para o organismo (Fleshner & Klotz,
1999; Klein et al., 2001; Sonn et al., 2005).
O estresse é mediado por um complexo de interações entre sistemas nervoso,
psíquico, endócrino, imunológico, hematopoiético e metabólico. Da mesma forma, o
alcoolismo atua de forma sistêmica e seus efeitos são semelhantes aos efeitos deletérios da
hiper-reatividade ao estresse, ou seja, ambos envolvem, reciprocamente, fatores orgânicos e
psíquicos. Portanto, como a formação do eixo HHA depende do desenvolvimento pós-natal,
bem como é influenciada, ao menos em roedores, pelo comportamento materno, postulamos a
hipótese que a síndrome metabólica, observada em adultos, poderia ser resultado da
perturbação da relação materno-infantil e a subseqüente alteração permanente do sistema de
estresse no adulto. Testamos também a hipótese que um agente agressor como o consumo de
álcool, cujo comportamento adictivo está relacionado ao estresse, poderia potencializar os
efeitos no adulto dos distúrbios de formação do eixo HHA e de suas conseqüências.
Procuramos entender como a inter-relação desses fatores complexos poderia ajudar na
compreensão de patologias importantes, como o alcoolismo e os distúrbios provocados pelo
estresse. Bem como, discutimos a ação da suplementação de vitamina E na dieta, como um
possível agente quimioprotetor, na manifestação das alterações metabólicas e na atenuação
dos efeitos, integrados ou não, do estresse e do alcoolismo, em parâmetros metabólicos. Tais
hipóteses foram testadas utilizando modelo experimental de Separação Materna em ratos
alcoólicos UChB (Mardones & Segovia-Riquelme, 1983), com dieta suplementada ou não
com vitamina E, avaliando parâmetros bioquímicos no animal adulto.
44
Materiais e Métodos
Animais
Os animais da linhagem UChB (bebedores voluntários de etanol) foram
provenientes do Biotério do Departamento de Anatomia do Instituto de Biociências de
Botucatu (IBB), Universidade Estadual Paulista (UNESP) e os ratos Wistar foram adquiridos
do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da Universidade Estadual
de Campinas (UNICAMP), São Paulo, Brasil.
Foram formados doze casais de cada linhagem UChB e Wistar. As fêmeas
adultas, após fertilização, foram acompanhadas durante o período gestacional. O dia do
nascimento foi estipulado dia zero, quando a ninhada foi padronizada com oito filhotes,
selecionando o maior número de machos possível. Ao longo do experimento, os filhotes
machos foram agrupados em oito tratamentos experimentais. De tal forma que de cada
linhagem de ratos (UChB e Wistar) foram formados dois grupos experimentais com seis
ninhadas cada (Controle - C e Separação Materna - SM). Dos filhotes de cada grupo foram
formados dois subgrupos: um subgrupo recebeu ração normal (C e SM) e outro, após os 50
dias de idade, recebeu ração suplementada com vitamina E (CE e SME). O número final de
animais por tratamento foi sete e o período total de experimento foi de 120 dias.
O protocolo experimental seguiu os princípios éticos em pesquisa animal adotado
pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e submetido à apreciação do
Comitê de Ética em Experimentação Animal, IBB/UNESP, Campus Botucatu, São Paulo,
Brasil.
Indução de hiper-reatividade ao estresse por Separação Materna (SM)
Os filhotes das ninhadas dos grupos SM foram separados da mãe diariamente,
durante o Período Hiporresponsivo ao Estresse (SHRP
1
), do 4
o
ao 14º dia de idade, sempre no
mesmo horário. Durante a SM, os filhotes foram individualizados em caixa com oito
subdivisões, uma para cada filhote, durante 4 h. Os filhotes foram acomodados em sala anexa,
com temperatura de 30
o
C e a umidade superior a 50 %. Posteriormente, os filhotes foram
devolvidos aos cuidados da mãe, retirando-se a mãe de sua caixa antes de retornar a prole. Os
1
SHRP, do inglês stress-hyporesponsive period.
45
filhotes dos grupos controle não foram separados da mãe, apenas receberam os cuidados
padrão de manejo para criação de animais de laboratório.
Os animais foram manejados por único pesquisador do início ao fim da
experimentação. As mãos do investigador foram lavadas em água corrente, secas e esfregadas
na maravalha de forro das caixas da ninhada, eliminado os odores que levassem a rejeição da
mãe à prole. A sala de experimentação foi mantida isolada ao máximo de ruídos externos.
Os filhotes machos após o desmame, aos 21 dias, foram alojados em caixas com o
mínimo de dois e o máximo de quatro animais, evitando o estresse pelo isolamento social.
Aos 50 dias de idade foram individualizados e receberam manejo regular para a espécie.
Seleção dos animais bebedores de etanol
Aos 65 dias de idade, os ratos UChB receberam, além de água ad libitum, solução
de etanol a 10 %, durante 15 dias, alternando as posições das garrafas (água e álcool) na
caixa, durante as mensurações. Os animais que apresentaram maior consumo de etanol foram
selecionados. A administração de etanol a 10% para os ratos UChB, juntamente com
provimento de água, ambos ad libitum, permaneceu até o final do experimento (120 dias). A
seleção e padronização da linhagem UChB foi realizada segundo Mardones & Segovia-
Riquelme (1983).
Após a seleção dos animais bebedores de etanol (UChB), permaneceu o número
de sete animais para cada tratamento. Na linhagem Wistar também foi selecionado, ao acaso,
o mesmo número de animais.
Suplementação vitamínica
A vitamina E (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) foi administrada a partir dos 50
dias de idade, acrescida na ração sólida da marca Nuvital Nutrientes S/A (Colombo – PR,
Brasil), totalizando 750 UI, aos subgrupos suplementados. Os demais animais receberam
ração sólida da marca Nuvital. Ambas as rações foram administradas ad libitum.
Dosagens bioquímicas e hormonal
Após aferição da massa corpórea (g), foi realizada eutanásia por decapitação aos
120 dias de idade e o sangue do tronco foi coletado com heparina e devidamente
acondicionado para análises bioquímicas e hormonal. A coleta do sangue foi realizada entre
8:00 e 10:00h, após 12 horas de jejum.
46
As dosagens bioquímicas: glicemia, proteína total, colesterol total, HDL
(lipoproteína de alta densidade), LDL (lipoproteína de baixa densidade), VLDL (lipoproteína
de muita baixa densidade), triglicérides e desidrogenase lática foram realizadas através do
método espectrofotométrico de acordo com protocolos padrão (Bioclin, Belo Horizonte –
MG, Brasil). A corticosterona plasmática foi dosada pelo método de rádio-imunoensaio de
duplo anticorpo de acordo com o protocolo do fabricante (NEN Life Science Products, USA).
Análise estatística
O estudo estatístico das variáveis descritas foi realizado através da ANOVA e
complementado com o teste de comparações múltiplas de Tukey para contraste entre médias
dos tratamentos. Os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média. As
conclusões estatísticas foram realizadas com 5% de significância. Detalhes a respeito da
metodologia empregada podem ser encontrados em BANZATTO & KRONKA (1989).
47
Resultados
Massa corpórea
A massa corpórea dos animais foi significativamente maior na linhagem Wistar
(398,10 g ± 5,48 g) comparada à linhagem UChB (344,40 g ± 7,60 g). O grupo Separação
Materna (357,14 g ± 7,49 g) apresentou a massa corpórea significativamente maior
comparada ao grupo controle (331,67 g ± 12,82 g) na linhagem UChB. As massas corpóreas
dos animais que receberam dieta enriquecida com vitamina E foram significativamente
maiores (Figura 1).
C SM CE SME -- C SM CE SME
0
100
200
300
400
500
600
Massa corpórea do animal (g)
Wistar UChB
Figura 1 – Massa corpórea (g) das linhagens Wistar e UChB no 120
o
dia de idade (média ±
erro padrão). C = controle; SM = separação materna; CE = controle com vitamina E; SME =
separação materna com vitamina E. As linhas indicam as diferenças significativas a 5%.
Dosagens bioquímicas
O teor médio de glicose plasmática nos ratos UChB (133,50 mg/dL ± 3,80 mg/dL)
foi significativamente maior do que nos ratos Wistar (118,0 mg/dL ± 2,30 mg/dL). Os animais
que sofreram Separação Materna apresentaram teor médio de glicose significativamente
48
maior na linhagem UChB (142,79 mg/dL ± 4,80 mg/dL), comparado aos seus controles
(124,21 mg/dL ± 4,87 mg/dL), porém na linhagem Wistar não foi observada diferença
significativa. Na linhagem UChB, os grupos que receberam suplementação vitamínica
apresentaram teor médio de glicose significativamente menor (125,36 mg/dL ± 5,48 mg/dL),
comparados aos que receberam ração normal (141,64 mg/dL ± 4,46 mg/dL), o mesmo não foi
observado nos ratos Wistar. O teor médio de glicose plasmática foi semelhante em todos os
tratamentos na linhagem Wistar, não sendo observado alterações como efeito da SM ou da
suplementação vitamínica (Figura 2).
C SM CE SME -- C SM CE SME
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
Glicose (mg/dL)
Wistar UChB
Figura 2 – Teor plasmático de glicose (mg/dL) nas linhagens Wistar e UChB (média ± erro
padrão). C = controle; SM = separação materna; CE = controle com vitamina E; SME =
separação materna com vitamina E. As linhas indicam as diferenças significativas a 5%.
O teor médio de proteína total plasmática dos ratos Wistar (6,67 mg/dL ± 0,08
mg/dL) apresentou valor superior significativo comparado ao teor médio da linhagem UChB
(7,46 mg/dL ± 0,09 mg/dL). Os animais que sofreram Separação Materna apresentaram
valores protéicos semelhantes aos animais controles, com exceção dos ratos Wistar com
suplementação vitamínica, que apresentaram valor médio de proteína total significativamente
menor no grupo de SM. Os valores médios de proteína total dos ratos do grupo controle com
49
vitamina E foram significativamente menores, comparados aos controles que não receberam
suplementação, na linhagem UChB (Figura 3).
C SM CE SME -- C SM CE SME
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Proteína total (g/dL)
Wistar
UChB
Figura 3 - Teor plasmático de proteína total (g/dL) nas linhagens Wistar e UChB (média ±
erro padrão). C = controle; SM = separação materna; CE = controle com vitamina E; SME =
separação materna com vitamina E. As linhas indicam as diferenças significativas a 5%.
Na avaliação dos parâmetros lipídicos, o teor médio de colesterol total na
linhagem UChB foi significativamente maior nos ratos que passaram por Separação Materna
(83,07 ± 2,52), comparado ao valor médio do grupo controle (74,07 mg/dL ± 3,79 mg/dL). Na
linhagem Wistar, os grupos SM (85,00 mg/dL ± 3,2 mg/dL) e controle (81,64 mg/dL ± 4,10
mg/dL) não apresentaram diferença significativa no teor médio de colesterol total. Não houve
diferença significativa na comparação entre linhagens, quanto aos níveis de colesterol total
(Figura 4).
50
C SM CE SME -- C SM CE SME
0
20
40
60
80
100
120
Colesterol total (mg/dL)
Wistar
UChB
Figura 4 - Teor plasmático de colesterol total (mg/dL) nas linhagens Wistar e UChB (média ±
erro padrão). C = controle; SM = separação materna; CE = controle com vitamina E; SME =
separação materna com vitamina E. As linhas indicam as diferenças significativas a 5%.
Os teores de triglicérides apresentaram comportamento semelhante ao observado
na avaliação dos teores de colesterol total. O teor médio de triglicérides na linhagem UChB
foi significativamente maior nos ratos que passaram por Separação Materna (92,07 mg/dL ±
7,21 mg/dL), comparado ao valor médio do grupo controle (74,50 mg/dL ± 6,91 mg/dL). Na
linhagem Wistar, os grupos SM e C não apresentaram diferença significativa. Também,
quanto aos níveis de triglicérides não houve diferença significativa na comparação entre
linhagens (Figura 5). Embora não significativo, os animais com suplementação vitamínica
apresentaram teores médios de colesterol e, principalmente, de triglicérides menores, quando
comparados aos que receberam ração normal.
Os teores de HDL, LDL, VLDL não apresentaram diferenças significativas entre
linhagens (UChB e Wistar), grupos (SM e C) ou subgrupos (suplementados ou não com
vitamina E) (Figura 6).
51
C SM CE SME -- C SM CE SME
0
20
40
60
80
100
120
Triglicérides (mg/dL)
Wistar
UChB
Figura 5 - Teor plasmático de triglicérides (mg/dL) nas linhagens Wistar e UChB (média ±
erro padrão). C = controle; SM = separação materna; CE = controle com vitamina E; SME =
separação materna com vitamina E. As linhas indicam as diferenças significativas a 5%.
52
C SM CE SME -- C SM CE SME
0
5
10
15
20
25
30
35
HDL (mg/dL)
Wistar
UChB
C SM CE SME -- C SM CE SME
0
10
20
30
40
50
60
LDL (mg/dL)
Wistar UChB
C SM CE SME -- C SM CE SME
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
VLDL (mg/dL)
Wistar
UChB
Figura 6 - Teores plasmáticos de HDL (mg/dL), LDL (mg/dL) e VLDL (mg/dL) nas
linhagens Wistar e UChB (média ± erro padrão). C = controle; SM = separação materna; CE
= controle com vitamina E; SME = separação materna com vitamina E.
Houve grande variabilidade dos valores nas concentrações plasmáticas da enzima
desidrogenase lática, cujas comparações entre as médias entre linhagens não apresentou
53
diferença significativa. O teor médio da enzima nos animais dos grupos de Separação Materna
(1391 U/L ± 171,72 U/L) foi significativamente menor comparado com os grupos controles
(2184 U/L ± 408 U/L) na linhagem UChB. Os animais que receberem dieta suplementada
com vitamina E, independentemente da linhagem e grupo, apresentaram teores plasmáticos
médios da enzima maiores, sendo significativo na comparação entre os ratos Wistar, dentro do
grupo SM (Figura 7).
C SM CE SME -- C SM CE SME
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Desidrogenase lática (U/L)
Wistar UChB
Figura 7 - Teor plasmático de desidrogenase lática (U/L) nas linhagens Wistar e UChB
(média ± erro padrão). C = controle; SM = separação materna; CE = controle com vitamina E;
SME = separação materna com vitamina E. As linhas indicam as diferenças significativas a
5%.
Dosagem hormonal
O teor plasmático de corticosterona foi significativamente maior na linhagem
UChB (65,86 ng/mL ± 5,40 ng/mL) comparado à linhagem Wistar (51,81 ng/mL ± 5,80
ng/mL). O grupo Separação Materna (78,60 ng/mL ± 5,72 ng/mL) apresentou o nível de
corticosterona significativamente elevado comparado com o grupo controle (53,12 ng/mL ±
7,95 ng/mL) na linhagem UChB. As concentrações de corticosterona, nas linhagens (UChB e
54
Wistar), nos grupos que receberam dieta enriquecida com vitamina E, foram
significativamente maiores (Figura 8).
C MS CE MSE -- C MS CE MSE
0
20
40
60
80
100
120
140
Corticosterona (ng/mL)
Wistar
UChB
Figura 8 - Teor plasmático de corticosterona (ng/mL) nas linhagens Wistar e UChB (média ±
erro padrão). C = controle; SM = separação materna; CE = controle com vitamina E; SME =
separação materna com vitamina E. As linhas indicam as diferenças significativas a 5%.
55
Discussão
A Separação Materna é um modelo experimental bem estabelecido para estudar o
efeito permanente da relação materno-infantil no adulto, que resulta na hiper-reatividade do
eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, produzindo um animal com características de estresse
crônico (Pryce et al., 2001; Newport et al., 2002; Pryce & Feldon, 2003; Schmidt et al., 2004,
Macri & Würbel, 2006). Os ratos UChB são modelos de alcoolismo experimental, que no
início dos anos 50, no Chile, foram selecionados da linhagem Wistar, conforme consumo
elevado de etanol, permanecendo como modelo importante para estudo dos efeitos da ingestão
crônica de etanol (Mardones & Segovia-Riquelme, 1983; Mardones, 1993; Tampier et al.,
2000, Quintanilla et al., 2006; Cândido et al., 2006).
O consumo de álcool (Herrera & Llobera, 1981; Vacanti et al., 2004; Lieber,
2005) e o estresse (Sapolsky et al., 2000; Torres et al., 2004; Kyrou et al., 2006) são fatores
que alteram os teores de glicose no sangue. Durante o estresse, diversas alterações hormonais
e metabólicas ocorrem no organismo, visando a mobilização de recursos energéticos. A taxa
de glicose precisa estar elevada na corrente sanguínea para suprir o organismo de energia no
período de estresse. Herrera & Llobera (1981) mencionam que os efeitos do etanol nos níveis
sanguíneos de glicose podem ser tanto a hiperglicemia, quanto a hipoglicemia, pois depende
do estoque de carboidrato hepático. Se o suprimento hepático é adequado, o etanol induz
hiperglicemia secundária à liberação de catecolaminas, que possuem efeitos na glicogenólise
e na gliconeogênese no fígado, portanto aumentando a produção da glicose. Esses efeitos
permanecem pela ação de glicocorticóides (Sapolsky et al., 2000). O acetaldeído e o acetato,
produtos da oxidação do etanol, têm efeitos hiperglicêmicos, pois aumentam a atividade de
glicogenólise hepática, por um mecanismo não mediado por catecolaminas (Herrera &
Llobera, 1981). Isso explica nossos resultados, que demonstraram que os níveis plasmáticos
de glicose estavam alterados com a ingestão crônica de etanol e potencializados pela
Separação Materna, demonstrando a interação entre alcoolismo e estresse nos efeitos
hiperglicêmicos.
Por outro lado, a suplementação de vitamina E manteve os níveis glicêmicos dos
animais alcoólicos semelhante ao normal, ou seja, aos dos ratos Wistar controle, ainda limitou
a alteração causada pela SM nos ratos UChB, apresentando, um efeito protetor quanto à
hiperglicemia. A vitamina E, nos ratos alcoólicos, atenuou os efeitos hiperglicêmicos do
alcoolismo e do estresse, possivelmente evitando o dano oxidativo dos metabólitos
56
produzidos pelo etanol e pelos subprodutos do estresse. Park et al. (2001) sugeriam um
tratamento combinado de insulina e antioxidante (vitamina E) na redução dos efeitos do
diabetes, causada pelo estresse oxidativo.
Os níveis plasmáticos das proteínas totais sofrem variações de acordo com as
alterações das suas várias frações (albumina, globulinas, fibrinogênio e outras). A
concentração de proteína total é influenciada pelo estado nutricional, hepático, renal e por
erros metabólicos (Lima et al., 1985). Nossos resultados demonstraram diferença significativa
nos teores de proteínas no sangue entre as linhagens UChB e Wistar, sendo os valores médios
de proteínas maiores nos ratos Wistar. Independente das linhagens, o estresse não influenciou
nos teores de proteínas. Pode-se atribuir essa diferença, possivelmente, aos danos no
metabolismo hepático causados pelo consumo crônico de etanol, ou pela inibição da síntese
protéica causada pelo acetaldeído (Herrera & Llobera, 1981; Feinman & Lieber, 1999). É
provável que o nível baixo de proteínas no sangue nos ratos UChB, seja devido a alteração do
estado nutricional, causada pelo consumo de álcool (Herrera & Llobera, 1981; Feinman &
Lieber, 1999).
Entre os ratos UChB e Wistar não ocorreram diferenças significativas nos níveis
plasmáticos de lipídios (colesterol total, LDL, HDL, VLDL e triglicérides). Szkudelski et al.
(2004) também não observaram alterações em alguns parâmetros lipídicos sangüíneos, como
triglicérides e ácidos graxos, em ratos Wistar, após consumirem por duas semanas etanol a
10%, como único líquido. Entretanto, Herrera & Llobera (1981) citam que a hiperlipidemia
alcoólica corresponde à elevação dos níveis plasmáticos de colesterol, triglicérides e
fosfolipídios. Ricart-Jané et al. (2005) relataram que nos estudos, tanto em humano como em
animais experimentais, o estresse altera o metabolismo de lipídios. Isso foi demonstrado em
nosso experimento, onde a Separação Materna elevou os níveis plasmáticos de colesterol e
triglicérides do animal adulto. Os animais que receberam dieta suplementada com vitamina E,
obtiveram um efeito protetor na alteração dos teores plasmáticos de lipídios, visto que os
valores médios foram inferiores aos que receberam uma dieta normal.
A desidrogenase lática (LDH) catalisa a redução do piruvato com NADH + H
+
,
obtendo-se lactato e NAD
+
(Stubbs et al., 1972). A enzima está presente em todas as células
do organismo, sendo que as maiores concentrações estão no fígado, coração, rim, músculo
esquelético e eritrócitos. A concentração no soro ou plasma está aumentada em pacientes com
enfermidades hepáticas, alterações renais, infarto do miocárdio e muitas enfermidades
malignas. Strubelt et al. (1999) estudaram os efeitos de diferentes álcoois na atividade
57
enzimática, principalmente da desidrogenase lática, e constataram que o álcool etílico eleva os
níveis hepáticos dessa enzima. O teor de desidrogenase lática superior, observado nos ratos
alcoólicos (UChB), pode ser devido a alterações das funções hepáticas pelo etanol. Os
animais dos grupos SM, nas linhagens (UChB e Wistar), apresentaram nível plasmático da
enzima desidrogenase lática inferior aos controles. Não encontramos na literatura
especializada dados que pudessem ser correlacionados a esses resultados. Os níveis
plasmáticos de desidrogenase lática, nos animais que receberam dieta suplementada com
vitamina E, foram maiores ao comparar aos animais que receberam dieta normal.
Na linhagem UChB, a massa corpórea foi significativamente maior no grupo
Separação Materna comparada ao grupo controle. Bjorntorp & Rosmond (2000) e Matos et al.
(2003) relataram que o excesso de massa corpórea ou obesidade e o estresse estão associados
com a elevada concentração de cortisol em humanos. Os ratos da linhagem UChB, que
passaram por Separação Materna, apresentaram nível de corticosterona significativamente
elevado comparado ao controle. Já na linhagem Wistar, ocorreu diminuição dos níveis basais
de corticosterona com a SM. Na literatura especializada, encontram-se dados contraditórios
quanto aos teores de corticosterona em ratos que foram submetidos a SM (Newport et al.,
2002; Pryce & Feldon, 2003; Schmidt et al., 2004; Macri & Würbel, 2006). Provavelmente, o
consumo de etanol atue como agente estressor, desencadeando resposta do eixo HHA nos
ratos UChB. Como não submetemos os animais adultos a estressores, possivelmente os níveis
basais de corticosterona nos ratos Wistar estejam diminuídos pelo feedback nos reguladores
do eixo HHA, mesmo em animais que sofreram SM. O excesso de massa corpórea ou
obesidade e elevado níveis de cortisol também foram associados à Síndrome Metabólica
(Matos et al., 2003).
A vitamina E eleva os níveis plasmáticos de corticosterona e de desidrogenase
lática, que podem comprometer as funções orgânicas. Segundo Sonn et al. (2005), há
evidência de que a suplementação de vitamina E, em grandes doses, pode aumentar o risco
para determinadas patologias. Portanto, mesmo com evidências de quimioproteção da
vitamina E em diferentes parâmetros observados, novas pesquisas devem elucidar esse papel,
principalmente no que se refere à dose ideal de administração.
A Síndrome Metabólica tem sido associada ao estresse crônico no adulto
(Bjorntorp, 2001; Matos et al., 2003; Kyrou et al., 2006; Tenenbaum et al., 2006), no entanto,
não encontramos essa associação com SM. Em nosso experimento, encontramos alterações
semelhantes às descritas para Síndrome Metabólica, como hiperlipidemia, hiperglicemia,
58
alteração dos níveis plasmáticos de corticosterona, aumento da massa corpórea e diminuição
da testosterona (Martins et al., dados não publicados
2
), em ratos que foram submetidos à
Separação Materna.
Portanto, devido às alterações metabólicas observadas como efeito da Separação
Materna, acreditamos que a Síndrome Metabólica possa também ter sua causa em eventos na
infância, que modulam o sistema de estresse, sendo potencializada pela ingestão crônica de
etanol. Também é possível concluir que há interação dos efeitos da ingestão de etanol e do
estresse nas funções orgânicas. Bem como, que a vitamina E representa um agente
quimioprotetor, evitando parte das alterações metabólicas causadas pela ingestão de etanol ou
pelo estresse crônico.
Agradecimentos
Ao Grupo de Pesquisa Biologia da Reprodução pelas sugestões e discussões e ao
Departamento de Anatomia do IB/UNESP pela utilização dos laboratórios e demais
dependências físicas.
2
Martins O.A. et al. Lipid (CD36, LIMPII, CLA-1/SR-BI and LDLR) and androgen receptors on ventral
prostate of alcoholic (UChB) and Wistar adult rats submitted to maternal separation and to vitamin
supplementation (alfa-tocopherol). Dados não publicados.
59
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63
Artigo II
LIPID (CD36, LIMPII, CLA-1/SR-BI and LDLR) AND ANDROGEN RECEPTORS
ON VENTRAL PROSTATE OF ALCOHOLIC (UChB) AND WISTAR ADULT RATS
SUBMITTED TO MATERNAL SEPARATION AND VITAMIN
SUPPLEMENTATION (-TOCOPHEROL)
64
LIPID (CD36, LIMPII, CLA-1/SR-BI and LDLR) AND ANDROGEN RECEPTORS
ON VENTRAL PROSTATE OF ALCOHOLIC (UChB) AND WISTAR ADULT RATS
SUBMITTED TO MATERNAL SEPARATION AND VITAMIN
SUPPLEMENTATION (-TOCOPHEROL)
Summary
The prostate cancer is one most severe condition which affects thousands of men
all over the world. Many factors have been associated to the incidence of prostate cancer, such
as alcohol abuse, chronic stress and fat-rich diet. The vitamin E (-tocopherol), on the other
hand, has been pointed as a potential chemoprotection agent as it inhibits the development of
the tumoral tissue. The disturbance in the lipid metabolism is an important characteristic of
the neoplastic cells and the androgens are the main regulatory agents on this process in
prostate cancer cells. The lipid receptors and the androgen receptors (AR) are important tools
to understand the lipid metabolism on the prostate. This way, due to the importance of the
lipid metabolism in physiology and prostatic pathogenesis, the objective of this research was
to study the lipid receptors on the normal prostatic secretory epithelium and on the animals
submitted to alcoholism and Maternal Separation, supplemented with a diet rich in vitamin E.
Immunohistochemical analyses of the CD36, LIMPII, CLA-1/SR-BI, LDLR and AR
receptors on the ventral prostate epithelium and the dosage of plasmatic testosterone in Wistar
and UChB (voluntary consumers of ethanol) were carried out. The results showed that the
lipid and the androgen receptors, the plasmatic testosterone and the relative prostate mass all
suffer alcohol and chronic stress effects. The experimental alcoholism and the chronic stress
altered the prostatic morphophysiology and the vitamin E plays a chemoprotection role
against many of the showed alterations.
Key-words: lipid receptors, prostate, alcoholism, stress, vitamin E, maternal separation.
65
Introduction
The World Health Organization (WHO) forecasts for 2015 and for 2030 a number
of 9 million and 11.4 million deaths by cancer worldwide, respectively. The WHO (2006)
note mentions that one of the most common cancers in men is the prostate one. It also
mentions factors which cause such cancer, as: diet factors, like obesity and the lack of a
healthy diet; sedentarism; stress and alcohol abuse (Bidoli et al., 2005; Velicer et al., 2006;
Mitsuyama et al., 2006).
The prostate cancer is a chronic disease, which even with the advances in the
knowledge of its mechanisms, has increased its incidence and is the second cancer mortality
cause in men. Consequently, according to Singh & Agarwal (2006), its chemoprevention is
revealed as an additional and attractive strategy for the disease control, mainly because the
existing therapies to reduce its morbidity and mortality are, many times, inefficient. Another
concern is the search for the new anti-carcinogenic therapies aimed to the lipid metabolism
(Swinnen et al., 2004).
The pre and postnatal prostatic development, as well as its morphophysiologic
maintenance in the adult are dependent on the androgens, whose regulation is carried out by
the hypothalamic-pituitary-gonadal axis (Ulrix et al., 1998; Marker et al., 2003; Cunha et al.,
2004). On the other hand, the pathologies which occur in the prostate, such as the benign
prostatic hyperplasia (BPH) and the prostate cancer, have been associated to high levels of
plasmatic androgens (Swinnen et al., 2004).
Physiopathologic alterations on the prostate, such as ethanol consumption effect
(Martinez et al., 1993, 2001; Cagnon et al., 1996, 1998, 2001; Fávaro & Cagnon, 2006;
Cândido et al., 2006), tumors (Heemers et al., 2001; Swinnen et al., 2004), post-vasectomy
(Mello Júnior, 1998) and rodent aging (Pegorin de Campos et al., 2006; Zanetoni et al., 2007)
have been associated to the accumulation of lipid drops on the secretory cells cytoplasm.
The increase in the lipogenesis is an important characteristic of neoplastic cells
(Swinnen et al., 1996; Kuhajda, 2000) and the androgens are the main regulatory agents in
this process on prostate cancer cells (Swinnen et al., 2004). The lipogenesis stimulation by
androgens coordinates the expression of multiple enzymes involve in the synthesis,
metabolism and transport of fatty acids and cholesterol (Heemers et al., 2001, 2004; Swinnen
et al., 2004). Even though the increase of the lipogenesis is initially dependent on androgens,
66
it also occurs in the development of cancers which are androgen-independent, suggesting that
the lipogenesis is fundamental on the cellular biology of the prostate cancer (Swinnen et al.,
2004).
The prostatic lipogenesis regulation occurs through the activation of the SREBP
(sterol-regulatory element-binding protein). This enzyme is presented as inactive for the
SREBP-SCAP interaction (SREBP-cleavage-activating protein), which keeps retained in the
endoplasmatic reticulum by the INSIG (insulin-induced gene) retention proteins. The SREBP-
SCAP-INSIG complex is stabilized by the cholesterol. When the sterol levels are low, the
SREBP-SCAP complex is released from the INSIG retention protein and migrates to the
Golgi apparatus, where it is proteolythically cleaved and the amino-terminal SREBP fragment
is activated. The SREBP fragment is then translocated to the nucleus, where it interacts with
transcription sites of the genes involved in the lipid and lipid receptors synthesis and on the
fatty acids and cholesterol metabolism (Heemers et al., 2001; Swinnen et al., 2004; Sampath
& Ntambi, 2006). The androgen receptors act mainly in the increase of the SCAP expression,
altering the balance between SCAP and its retention protein (INSIG), favoring the release of
the SREBP-SCAP complex (Heemers et al., 2004).
Heemers et al. (2004) observed that the gene for SCAP transcription may interact,
not only with the androgen receptor, but also with the glucocorticoid receptor, giving a
response to glucocorticoids to the SREBP-SCAP complex, which as previously described,
constitutes the lipid metabolism regulator, the greatest target for the androgen action in
prostate cancer cells (Swinnen et al., 2004).
The plasmatic lipids, cholesterol, triglycerides and phospholipids with
hydrophobic compounds as vitamin E are carried on the blood flow by water-soluble
lipoproteins. In order to provide an adequate cholesterol supply to the cells, several plasmatic
lipoprotein capture mechanisms involve receptors, important on the lipid metabolism, such as
CD36, CLA-1/SR-BI, LDLR, LIMPII, among others (Calvo et al., 1997; Fidge, 1999; Lobo et
al., 2001; Rigotti et al., 2003; Arenas et al., 2004). The CD36, CLA-1/SR-BI and LIMPII
receptors are named scavenger receptors, based in their cleaning function and for recognizing
and removing unnecessary macromolecules on the cellular medium, as modified LDL (low
density lipoproteins). They belong to the same B class and possess a high degree of
homology, even though they present distinct functions on the lipid metabolism (Moore &
Freeman, 2006; Shetty et al., 2006).
The lipid receptors were well studied in several organs, mainly on the liver
67
(Pussinen et al., 2000) and in defense cells (Calvo & Vega, 1993; Handberg et al., 2006).
However, even facing the importance of the lipid metabolism on the physiology and
reproduction pathology, the participation of lipid receptors on the reproductive system has
been poorly studied. Arenas et al. (2004) studying lipid receptors in normal and pathologic
human testes demonstrated the importance of these proteins in the cholesterol supply on
testosterone synthesis. Nevertheless, there is little knowledge about the action mechanism of
the lipid receptors on the prostate physiopathology (Chen & Hughes-Fulford, 2001; Damber
et al. 2006).
Studies with human prostatic tumoral cell culture and vitamin E cells presented
evidences that the vitamin E may cause death or inhibit the tumoral tissue growing (Ni et al.,
2003; Zu & Ip, 2003; Siler et al., 2004; Jiang et al., 2004), although its action mechanism has
not been completely established. However, the epidemiologic studies about the vitamin E diet
supplementation benefits are controversial and inconclusive (Kantoff, 2006). On the other
hand, there is evidence that the supplementation, in large doses, may increase the risk for
other diseases (Sonn et al., 2005). The international scientific community awaits the
conclusion of an important study about vitamin E and prostate cancer, named SELECT
(Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial) in order to elucidate the role of vitamin E
on the prostatic carcinogenesis (Klein et al., 2001).
The ethanol consumption influences the lipid metabolism and affects the
pathogenesis of alcoholic fatty liver, the hyperlipidemia and the atherosclerosis. The alcoholic
hyperlipidemia causes a plasmatic alteration on the three lipid class types: triglycerides,
cholesterol and phospholipids. On this metabolic chart, the kilomicrons concentration, very
low density lipoproteins (VLDL), low density lipoproteins (LDL) and high density lipoprotein
(HDL) are increased (Herrera & Llobera, 1981; Saravanan et al., 1994; Feinman & Lieber,
1999).
Studies in human beings, as well as in animals, have demonstrated that the
psychological and/or physiological stress alters the metabolism, mobilizing the glucose and
lipid reserves. Some of the alterations, caused by stress, may contribute to the development of
different diseases, such as obesity, hypertension, diabetes, hyperlipidemia and cardiovascular
alterations (Ricart-Jané et al., 2005). The stress may suppress the activity of the reproductive
axis, as the chronic exposure to stressing factors increases the activity in the HPA axis and
concomitantly, reduces the activity in the hypothalamic-pituitary-gonadal axis (Tilbrook et
al., 2000; Young & Korszun, 2002; Retana-Marquez et al., 2003; Wingfield & Sapolsky,
68
2003; Cameron, 2004; Motzer & Hertig, 2004; Kyrou et al., 2006; Mazaro & Lamano-
Carvalho, 2006).
In a previous work of our research group (Martins et al., unpublished data
1
),
studying the effect of Maternal Separation in rats, which is a model for hyper-reactivity of the
HPA axis in adults (Newport et al., 2002; Schmidt et al., 2004, Macrì & Würbel, 2006), we
observed alterations on the levels of plasmatic lipids.
Thus, due to the importance of lipid metabolism on the prostatic physiology and
pathogenesis, the objective of this research was to study the lipid receptors on the prostatic
secretory epithelium of both normal and animals submitted to chronic alcoholism and chronic
stress caused by Maternal Separation (MS), which constitute lipid and androgen levels
modifying models. The chemoprotection hypothesis of vitamin E on the studied parameters
was also verified.
1
Martins, O.A. et al. Síndrome metabólica, estresse e alcoolismo em ratos machos submetidos à dieta
suplementada com vitamina E. Unpublished data.
69
Materials and Methods
Animals
The UChB (ethanol voluntary consumers) strain rats were from the Anatomy
Department Animal Facility at the Institute of Bioscience (IB), UNESP, Botucatu, São Paulo,
Brazil and the Wistar rats were acquired from the Multidiscipline Center for Biological
Investigation (CEMIB), UNICAMP, Campinas, São Paulo, Brazil.
Twelve couples from each UChB and Wistar strain were formed. The adult
females, after fertilization, were followed during the pregnancy period. The birth date was
stipulated as day zero, when the litter was standardized with eight pups, selecting the highest
possible number of males. Along the experiment, the male pups were grouped in eight
experimental treatments. In a way that from each rats strain (UChB and Wistar) two
experimental groups with six litters each were formed (Control – C and Maternal Separation –
MS). From the pups of each group, two subgroups were formed: one subgroup which received
normal chow and another group which, starting on 50 days old, received vitamin E
supplemented chow. The final number of animals per treatment was of seven rats and the total
experiment period was of 120 days.
The experimental protocol followed the ethical principles in animal research
adopted by the Animal Experimentation Brazilian College (COBEA) and submitted to the
appreciation of the Animal Experimentation Ethics Committee, IB/UNESP, Campus
Botucatu, São Paulo, Brazil.
Stress hyper-reactivity induction by Maternal Separation (MS)
The pups were separated from their mothers daily, during the stress hypo-
responsive period (SHRP), from the 4
th
to the 14
th
day of age, always on the same time.
During the MS, the pups were individualized in a cage with eight subdivisions, one for each
pup, for 4 hours. The pups were accommodated in a neighboring room, with 30
o
C temperature
and humidity over 50%. Afterwards, the pups were brought back to the care of their mothers,
removing the mother from her cage before coming back to litter. The pups from the control
group were not separated from their mother, only received the standard management care for
laboratory animal raising.
The animals were managed by only one researcher from the beginning to the end
70
of the experiment. The animal facility room was kept the most possible isolated from external
noise. The investigator hands were washed in running water, dried and rubbed on the roof
wood from the litter cages, eliminating the smells which could cause a rejection from the
mother to the offspring.
The male pups after the weaning, at 21 days of age, were lodged in cages with at
least two and the maximum of four animals, avoiding the social isolation stress. At 50 days
old they were individualized and received regular management for the species.
Selection of the ethanol consumer animals
At 65 days old, the UChB rats received, besides water ad libitum, ethanol 10%
solution for 15 days, alternating the bottle positions (water and alcohol) in the cage, during
the measurements. The animals which presented the highest ethanol consumption were
selected. The ethanol 10% administration to the UChB rats, together with the water provision,
both ad libitum, was kept until the end of the experiment (120 days). The selection and
standardization of the UChB strain was performed according to Mardones & Segovia-
Riquelme (1983).
After the ethanol consumer animal selection (UChB), the number of animals for
each treatment remained on seven rats. On the Wistar strain, the same number of animals was
selected randomly.
Vitamin supplementation
The vitamin E (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) added on the solid chow of the
Nuvital Nutrientes S/A brand (Colombo – PR, Brazil), in a total of 750 UI, was administered
starting from 50 days old, to the supplemented subgroups. The remaining animals received
solid chow of Nuvital brand. Both chows were administered ad libitum.
Testosterone plasmatic dosage
After body mass measurement, the euthanasia by decapitation was carried out at
120 days old and the trunk blood was collected, with heparin, for hormone analysis. The
blood collection was carried out from 8:00 to 10:00, after a 12-hour fasting. The testosterone
dosage was performed by the double antibody radio-immunoassay method according to the
manufacturer protocol (NEN Life Science Products, USA).
Prostate immunohistochemical analysis
The ventral part of the prostate was dissected, mass measured and fixed in Bouin.
71
The histological and immunohistochemical analyses focused on the secretory epithelium of
the intermediate region of the ventral prostate ductal system. The analyses were performed in
the Reproduction Biology Laboratory at the Genetic and Cellular Biology Department, Alcalá
University, Alcalá de Henares (Madrid), Spain.
The lipid receptors (CD36, LIMPII, CLA-1/SR-BI, and LDLR) and the hormonal
receptor (AR) were studied. Sections of 5µm thick each were processed using the
streptavidin-biotin-peroxidase method. After deparaffinization, the sections were hydrated in
alcoholic series and, for the antigen exposure and recovery, they were incubated in citrate
buffer 0.01M at pH 6.0 and Tris-EDTA (20mM Tris, 1mM EDTA) pH 9.0 (for AR); in a
pressure cooker for 2 minutes. The endogenous peroxidase inhibition was obtained through a
H
2
O
2
solution at 3% in a Tris buffer saline (TBS), for 20 minutes. After TBS washing, the
unspecific reactions blocking was carried out with normal donkey serum at 3%¨, diluted in
TBS buffer plus Triton X-100 0.05%, for one hour. Afterwards, the incubation with primary
antibody, diluted in a blocking solution (1:10 in TBS) was performed at 4
o
C, overnight. The
primary antibodies used were: goat polyclonal CD36 (1:300, Santa Cruz Biotechnologies) and
LIMPII (1:500, R&D Systems); rabbit polyclonal CLA-1/SR-BI (1:300, Calvo et al., 1997,
Lobo et al., 2001) and AR (1:60, Neomarkers) and chicken polyclonal LDLR (1:500,
Chemicon).
After TBS washing, the biotinized secondary antibodies (swine anti-rabbit, rabbit
anti-goat, goat anti-chicken (Dako, Glostrup, Denmark) according to the primary antibody),
on the 1:500 dilution in blocking solution, were incubated for 1h. After TBS washing, the
sections were incubated with StreptABComplex/HRP (Dako) for 45 minutes and revealed
with diaminobenzidine (DAB), using an intensification method with oxidase-
diaminobenzidine-nickel glucose. For the detection of the CLA-1/SR-BI reaction,
streptavidin-biotin-alkaline phosphatase (Dako) and Zymed’s AP-red solution (Zymed, CA,
USA) were used. The slides were mounted and a microscopic analysis of the proteins was
performed using the Computerized Image Analysis System Axio Vision 4.1 (Zeiss) of the
Anatomy Department at the Bioscience Institute, UNESP, Botucatu, São Paulo, Brazil.
For the quantification of the CD36 and AR positive cells, 100 secretory epithelial
cells were analyzed in 10 distinct sections from the intermediate region on the ventral prostate
duct system, totalizing 1,000 cells per animal, being seven animals in eight analyzed
treatments. After reading, the following formula was applied: positive cells percentage (%) =
number of positive cells x 100/1000. For the analysis of the remaining receptors (LIMPII,
72
CLA-1/SR-BI and LDLR), the interpretation of the immunohistochemical reaction was
defined in a cross system, from negative (-) to extremely positive (+++++).
Statistical analysis
The statistical study of the described variables was performed through ANOVA
and complemented with the multiple comparison Tukey test for the contrast among the group
averages. The results were expressed in mean ± standard error of mean (SEM). The statistical
conclusions were performed with 5% of significance. Details concerning the applied
methodology can be found in Banzatto & Kronka (1989).
73
Results
Prostate relative mass
On the UChB strain (153.44 mg/100g ± 4.83 mg/100g), the ventral prostate
relative mass was significantly higher compared to the Wistar strain (100.23 mg/100g ± 2.97
mg/100g). The ventral prostate relative mass of the MS group, compared to the control group
of the Wistar strain, did not show a significant difference; nevertheless, on the UChB strain, it
was significantly higher on the control group (161.21 mg/100g ± 5.72 mg/100g) compared to
the MS group (145.72 mg/100g ± 7.36 mg/100g). The ventral prostate relative mass did not
show difference due to the vitamin E supplementation, except in the comparison between
control group (C and CE) of UChB rats (Figure 1).
C MS CE MSE -- C MS CE MSE
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Prostate relative mass (mg/100g)
Wistar UChB
Figure 1 – Ventral prostate relative mass (mg/100g) of the adult rats in the Wistar and UChB
strains (mean ± SEM). C = control; MS = Maternal Separation; CE = Vitamin E control, and
MSE = Maternal Separation - Vitamin E. The lines indicate 5% significant differences.
74
Testosterone
In the evaluation of the testosterone hormone, Wistar value was significantly
higher than UChB strain in the comparison between the groups MS and C. The animals with
vitamin E supplemented diet did not show a significant difference in the testosterone
concentrations, only in the comparison between the C and CE rats of the Wistar strain (Figure 2).
C MS CE MSE -- C MS CE MSE
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Testosterone (mg/mL)
Wistar
UChB
Figure 2 – Testosterone plasmatic level (mg/mL) on the Wistar and UChB strains (mean ±
SEM). C = control; MS = Maternal Separation; CE = Vitamin E control, and MSE = Maternal
Separation – Vitamin E. The lines indicate 5% significant differences.
Immunohistochemistry
Androgen Receptor (AR)
The AR presence was made evident on the prostatic epithelial cell nucleus. The
percentage of positive AR cells was significantly higher on the prostatic epithelium of the
Wistar strain, compared to the UChB strain. In the mean values analysis, the AR expression
was significantly more evident in the prostate epithelium in the C group compared to the MS
group in both strains. In the Wistar strain, on the control group, in the comparison among the
75
subgroups, the animals which received a normal diet (C) showed a significantly higher
percentage of positive AR cells, compared to the subgroup which received supplemented diet
(CE). Nevertheless, in the UChB strain, the control group with vitamin E (CE) showed a
significantly higher percentage of positive AR cells in the prostatic epithelium, compared to
the control group which received a normal diet (C), which means, the opposite was observed
between the strains. Also, there was significant difference between CE subgroups in the
comparison of strains (Figures 3 and 4).
C MS CE MSE -- C MS CE MSE
0
20
40
60
80
100
120
140
AR (% positive cells)
Wistar
UChB
Figure 3 – Percentage (%) of positive AR cells in the ventral prostate epithelium of Wistar
and UChB rats (mean ± SEM). C = control; MS = Maternal Separation; CE = Vitamin E
control, and MSE = Maternal Separation – Vitamin E. The lines indicate 5% significant
differences.
Lipid receptors
The CD36 protein positive labeling occurred in the supra-nuclear region of the
epithelial cell so evidently that an easy accounting of positive cells was possible. The positive
CD36 cell number was significantly higher in the Wistar strain rat prostates (89.53% ±
1.11%) compared to the UChB strain (22.27% ± 1.26%). The percentage of positive CD36
cells was significantly higher in the control animal prostates compared to the MS, in the
76
groups without vitamin supplementation. The animals (UChB and Wistar) which suffered MS
and received a vitamin E enriched diet presented a significantly higher percentage of positive
CD36 cells, when compared to the animals which received a normal diet (Figures 5 and 6).
C MS CE MSE -- C MS CE MSE
0
20
40
60
80
100
120
CD36 (% positive cells)
Wistar
UChB
Figure 5 – Percentage (%) of positive CD36 cells in the ventral prostate epithelium of Wistar
and UChB rats (mean ± SEM). C = control; MS = Maternal Separation; CE = Vitamin E
control, and MSE = Maternal Separation – Vitamin E. The lines indicate 5% significant
differences.
The presence of the LIMPII protein was observed in the perinuclear basal region
of the epithelial cell. The LIMPII receptor was shown as more marked on the prostatic
epithelial cells of the Wistar strain, compared to the UChB strain. Concerning the groups,
LIMPII was more expressed on the prostatic epithelium of the C group, compared to the MS
group in the UChB strain. In the Wistar strain, the LIMPII was more marked on the prostatic
epithelium of animals which received normal diet compared to the animals which received a
vitamin E enriched diet. Nevertheless, the LIMPII marking was more evidenced in the
prostatic epithelium of the rats in the MS group which received vitamin E, compared to the
rats in the same group which received normal diet in the UChB strain (Table 1 and Figure 7).
The CLA-1/SR-BI protein showed a marking in almost all the cytoplasmatic
77
region in the epithelial cell. Usually, the reaction was found in adjacent points to the nucleus
and/or in points adjacent to the apical membrane. The CLA-1/SR-BI was more marked on the
prostatic epithelial cells in the UChB strain, compared to the Wistar strain. The presence of
CLA-1/SR-BI was more evident in the MS group than in the C group, in the UChB strain. In
rats which received vitamin E, a more intense marking of CLA-1/SR-BI was observed,
compared to the rats which received normal chow in both strains (UChB and Wistar) (Table 1
and Figure 8).
The reaction for LDLR was observed in small points of the apical part, adjacent to
the plasmatic membrane, in the secretory epithelial cell. The LDLR was more marked in the
prostatic epithelium of the UChB strain, compared to the Wistar strain. In the strains (UChB
and Wistar), the LDLR was more marked in the prostatic epithelium of the MS groups,
compared to the C groups. Practically, the LDLR marking in the prostatic cells did not show a
difference between the treatments which received a vitamin E enriched diet, compared to the
treatments which received a normal diet (Table 1 and Figure 9).
Table 1 – Lipid receptor analysis (LIMPII, CLA-I/SR-BI and LDLR), by the
immunohistochemical method, in epithelial cells of the intermediate region of the ventral
prostate ductal system in adult UChB and Wistar rats, submitted to Maternal Separation and
vitamin E supplemented diet.
Group
Receptor Strain
Vitamin E
Supplementation
Control
Maternal
Separation
Absent + + + + + + + +
Wistar
Present + + + + + +
Absent + + + + +
LIMPII
UChB
Present + + + + + +
Absent + + + + + +
Wistar
Present + + + + + + + +
Absent + + + + + + +
CLA-1/SR-BI
UChB
Present + + + + + + + +
Absent + + + + +
Wistar
Present + + + + +
Absent + + + + + + + + +
LDLR
UChB
Present + + + + + + + +
The interpretation of the immunohistochemical reaction was defined in terms of crosses, from – (negative) to
+++++ (extremely positive).
78
C-W
MS
-
W
MSE-W
CE-W
C-B
MS
-
B
MSE-B
CE-B
Figure 4
- Photomicrograph of immunohistochemistry reaction for AR in the
epithelium of the ventral prostate rat. Wistar (W), UChB (B), Control (C),
Maternal Separation (MS), Control vitamin E (CE), Maternal Separation vitamin E
(MSE). Arrow – positive nucleus. Bar: 50 µm.
79
C
-
W
MS-W
MSE-W
CE
-
W
C- B
M
S
-
B
MSE
-
B
CE
-
B
Figure 6
- Photomicrograph of immunohistochemistry reaction for CD36 in the
epithelium of the ventral prostate rat. Wistar (W), UChB (B), Control (C),
Maternal Separation (MS), Control vitamin E (CE), Maternal Separation vitamin E
(MSE). Arrow – positive cell. Bar: 50 µm.
80
C-W
MS
-
W
MSE
-
W
CE-W
C-B
MS
-
B
MSE
-
B
CE-B
Figure 7
- Photomicrograph of immunohistochemistry reaction for LIMPII in the
epithelium of the ventral prostate rat. Wistar (W), UChB (B), Control (C),
Maternal Separation (MS), Control vitamin E (CE), Maternal Separation vitamin E
(MSE). Arrow – positive immunoreaction. Bar: 50 µm.
81
C-W
MS
-
W
MSE
-
W
CE-W
C-B
MS-B
MSE
-
B
CE
-
B
Figure 8
- Photomicrograph of immunohistochemistry reaction for CLA-1/SR-BI
in the epithelium of the ventral prostate rat. Wistar (W), UChB (B), Control (C),
Maternal Separation (MS), Control vitamin E (CE), Maternal Separation vitamin E
(MSE). Arrow – positive immunoreaction. Bar: 50 µm.
82
C-W
MS-W
M
M
S
S
E
E
-
-
W
W
CE
-
W
C-B
M
M
S
S
-
-
B
B
M
M
S
S
E
E
-
-
B
B
CE
-
B
Figure 9
- Photomicrograph of immunohistochemistry reaction for LDLR in the
epithelium of the ventral prostate rat. Wistar (W), UChB (B), Control (C),
Maternal Separation (MS), Control vitamin E (CE), Maternal Separation vitamin E
(MSE). Arrow – positive immunoreaction. Bar: 25 µm.
83
Discussion
In this study, we described the expression of lipid receptors in normal prostate and
under experimental conditions of metabolic alterations. In our results, we observed alterations
in the expression of lipid receptors of rats submitted to alcohol chronic consumption, to
chronic stress and to these conditions associated. The ethanol chronic consumption produces
an alteration in the metabolism of lipids in the prostate, made evident by the significant
decrease of positive CD36 cells, by the small expression of LIMPII and by the increase in the
LDLR expression. The neonatal Maternal Separation causes effects on the prostatic lipid
receptor expression, attributed to the hyper-reactivity to stress in adult, as a reduction of
CD36 and an increase to the LDLR expression in prostatic epithelium. Besides, associated
effects of the ethanol chronic ingestion and stress effects could be observed, possibly
deleterious effects from the ethanol ingestion potentialized by the stress, observed in the
results of the MS group of the UChB strain, which presented significant alterations in all the
studied lipid receptors.
The Maternal Separation is a well established experimental model to study the
permanent effect of the mother-child relation in adult, which results in hyper-reactivity of the
hypothalamic-pituitary-adrenal axis, producing an animal with chronic stress characteristics
(Pryce et al., 2001; Newport et al., 2002; Pryce & Feldon, 2003; Schmidt et al., 2004; Macri
& Würbel, 2006). The UChB rats are an experimental alcoholism model, which, in the
beginning of the 50s, in Chile, were selected from the Wistar strain, according to high ethanol
consumption, remaining as an important model for the study of the ethanol chronic ingestion
effects (Mardones & Segovia-Riquelme, 1983; Mardones, 1993; Tampier et al., 2000,
Quintanilla et al., 2006; Cândido et al., 2006).
The lipid receptors, scavenger receptors, regulate the selective cellular obtaining
of lipids (fatty acids, cholesterol) and lipoproteins (oxidized LDL, HDL, VLDL) as well as of
other molecules from the cellular matrix, as collagen and thrombospondin (Calvo & Vega,
1993; Handberg et al., 2006). The increase in the lipogenesis is an important characteristic in
neoplastic cells (Kuhajda, 2000) and the androgens are the main regulatory agents in this
process in prostate cancer cells (Swinnen et al., 2004).
The LDL receptor (LDLR) is a glycoprotein of cellular surface which binds to and
internalizes the LDL, the main cholesterol and fatty acids transporters in blood. The LDLR
84
expression is regulated by SREBP (transcription factor) (Chen & Hughes-Fulford, 2001;
Swinnen et al., 2004). Chen & Hughes-Fulford (2001) and Hughes-Fulford et al. (2001)
demonstrated that prostate cancer cells express more LDLR molecules than normal cells,
suggesting that the higher fatty acids absorption by the high LDLR concentration, provides
the tumoral cells with extra energy resources and with structural molecules, which promote its
uncontrolled growth. We observed an increase on the LDLR expression on prostatic cells,
both as an effect of ethanol ingestion as an MS effect.
The CD36, B class scavenger receptor is a receptor of oxidized LDL, LDL, HDL,
VLDL, thrombospondin, collagen, fatty acids and pathogen derivates. Due to its wide
specificity, CD36 is involved in several normal and pathological processes (Moore &
Freeman, 2006). CD36, besides a lipid receptor, is also one of the thrombospondin (TSP)
transmembrane receptors, a glucoprotein which naturally inhibits the angiogenesis, essential
to the tumoral growth (Calvo & Vega, 1993; Vallbo et al., 2004; Vallbo & Damber, 2005;
Damber et al., 2006). The role of TSP in the development of the prostate cancer was not
extensively studied yet, but Vallbo et al. (2004) observed that the TSP is expressed in normal
prostate and in benign prostate hyperplasia (BPH), but its expression is reduced in the pre-
malign prostatic tissue (PIN – Intraepithelial neoplastic) and is absent in prostate cancer. In
our results, the CD36 expression was diminished in the ventral prostate epithelial cells in
alcoholic rats (UChB), compared to non-alcoholic rats (Wistar), as well as reduced in animals
submitted to MS.
The LIMPII (Lysosomal Integral Membrane Protein II) is a protein which
belongs, as the CD36, to the family named B class scavenger receptor (Calvo & Vega, 1993;
Cao et al., 1997; Crombie & Silverstein, 1998; Pussinen et al. 2000). Crombie & Silverstein
(1998) reported that the LIMPII may have a similar function to the CD 36, besides being a
lipid receptor; it may get connected to thrombospondin. We observed a low LIMPII
expression in the ventral prostate secretory epithelial cells of alcoholic rats (UChB) compared
to the non-alcoholic rats (Wistar).
The lipoprotein receptor CLA-1/SR-BI is a glucoproteic member of the CD36
gene family, which is bound to the HDL, free cholesterol, phospholipids and other molecules
(Ji et al., 1997; Cao et al., 1997; Crombie & Silverstein, 1998; Pussinen et al., 2000; Lobo et
al., 2001; Arenas et al., 2004). We did not find data in the literature to compare its expression
in prostate. The main result of this receptor expression was its higher expression in animals
which received vitamin E supplemented diet, whose meaning needs further studies.
85
According to our previous work (Martins et al., unpublished data
2
), the plasmatic
lipid levels are altered in alcoholic rats which went through neonatal Maternal Separation. In
an altogether analysis, we can suppose that the observed effects on the prostate are not only
from the ethanol action or from the stress directly on the organ, but also from the alterations
in the lipid systemic metabolism. The alteration of blood lipids, due to the fat-rich diet, has
been reported as a prostate cancer risk factor in epidemiologic studies (Dennis et al., 2004;
Bidoli et al., 2005; WHO, 2006).
Due to the high incidence of prostate cancer, new therapeutic and preventive
strategies have been constantly tested. The current studies towards the prophylaxis of prostate
cancer have studied the finasteride, antioxidant agents (vitamin E, selenium, lycopene) and
the use of drugs which reduce the lipid levels, such as stadin, as potential chemoprotection
agents (Kantoff, 2006). The hypothesis that the cholesterol is a tumoral cell survival mediator
has been presented and the pharmacological intervention to alter the cholesterol levels of
tumoral cells may be important in terms of therapy and chemoprotection, mainly in prostatic
tumors and other kinds of solid cancers, which has been related to a cholesterol-rich diet or to
the high levels of plasmatic cholesterol (Kim et al., 2004).
Morphophysiological prostatic alterations result in the accumulation of lipid drops
in the secretory cells cytoplasm (Heemers et al., 2001; Martinez et al., 2001; Cagnon et al.,
2001; Swinnen et al., 2004; Fávaro & Cagnon, 2006; Cândido et al., 2006; Pegorin de
Campos et al., 2006; Zanetoni et al., 2007). Zanetoni et al., (2007) reported that the increase
of these lipid drops may indicate the predisposition to tumorigenesis. We believe that the
described accumulations of lipid drops are reflexes of the lipid receptor expression alteration,
regulated by the androgens action and important in the prostatic physiopathology.
The prostate normal development and its maintenance depend on androgens
which act through their receptors (AR). The testosterone is bound to the androgen receptors
stimulating the cellular growth (Heinlein & Chang, 2004; Moura et al., 2006), this way, the
AR and the AR activity modulators are of great importance on prostate cancer. The vitamin E
inhibited the AR bioavailability in prostate cancer cell lines (Heinlein & Chang, 2004). In our
research, the vitamin E reduced the AR expression in the prostate of Wistar rats and the AR
expression was lower in the prostatic cells of alcoholic rats, making evident that the prostatic
function regulation was altered. The chronic stress also modified the AR expression,
2
Martins, O.A. et al. Síndrome metabólica, estresse e alcoolismo em ratos machos submetidos à dieta
suplementada com vitamina E. Unpublished data.
86
demonstrated in Wistar rats. The testosterone level was higher in the Wistar strain compared
to the alcoholic strain (UChB), which was also observed by Cândido et al. (2006) studying
UChB alcoholic rats. We observed that the level of plasmatic testosterone was presented as
directly proportional to the AR expression of the ventral prostate secretory epithelium of rats.
The congruence between the AR expression and the plasmatic testosterone levels
demonstrates the importance of the ethanol effects and of the hyper-reactivity of the HPA axis
in the regulation of the hypothalamic-pituitary-testes axis, making evident an indirect action
of alcoholism and of stress in the prostatic physiopathology, considering that the MS produces
permanent alterations in the HPA axis (Newport et al., 2002; Pryce & Feldon, 2003) and that
it interferes in the reproductive functions, by the influence in the hypothalamic-pituitary-
gonadal axis (Ferin, 1999).
The alpha-tocopherol (vitamin E), a known antioxidant, is important in the
reduction of cellular damage caused by different pathological situations involving lipid
peroxidation, as in the prostatic cell lines involution (Ni et al., 2003, 2005; Zu & Ip, 2003;
Siler et al., 2004; Jiang et al., 2004), oxidative damage in liver (Tsiakitzis et al., 2005) and in
the protection against the toxicity induced by the ethanol in different tissues (Celec et al.,
2003). In our experiment, we observed vitamin E effects in the prostatic physiology
modulation, mainly in the lipid metabolism, made evident in the attenuation of the chronic
stress effects in the CD36 expression and in the attenuation of the ethanol effects in the LDLR
expression and in the prostate relative mass. The vitamin E altered the CLA-1/SR-BI
expression, reduced the LIMPII expression, diminished the AR expression and the level of
testosterone in Wistar rats and increased it in UChB rats. Therefore, the vitamin E possesses,
in several aspects, a chemoprotection effect in the studied prostatic functions. Nevertheless,
its action in the lipid metabolism must be better studied, mainly concerning the ideal dosage
which represents the chemoprotection, as according to what we observed (Martins et al.,
unpublished data), the vitamin E elevates the corticosterone plasmatic levels, which can
compromise other organic functions. Sonn et al. (2005) reported that there is some evidence
that the vitamin E supplementation, in large doses, may increase the risk for other diseases
besides the prostate cancer.
The prostate relative mass was significantly higher in the UChB strain. Also, in
this strain, the most important metabolic alterations in the prostate were made evident. The
CD36 and LIMPII expressions were considerably smaller in UChB rats. Both receptors could
get bound to thrombospondin (Calvo & Vega, 1993; Damber et al., 2006), which is an
87
angiogenesis inhibitor. As the thrombospondin has been related to the tumoral growth (Vallbo
& Damber, 2005; Damber et al., 2006), we believe that it may be one of the factors which
best explains the higher prostatic mass observe in the alcoholic rats. The increase in the
LDLR expression on alcoholic rats, the altered balance of the lipid receptors and the
consequent accumulation of cytoplasmatic lipids (Cândido et al., 2006), could also explain
such mass increase. However, new studies are necessary to clarify such question.
In conclusion, the experimental alcoholism and chronic stress alter the prostatic
morphophysiology, independently or associated. The vitamin E plays a chemoprotection role
against the evidenced alterations. However, further investigations are necessary to determine
the functions of each lipid receptor kind in the prostate. Such studies could provide new
therapeutic strategies, which acting in these transporters could regulate the lipid metabolism,
directly related to the prostate cancer mechanisms.
Acknowledgements
To the Reproduction Biology research group, for the laboratory conditions, and to
the Prof. Dr. Maria V. T. Lobo, for providing the primary antibodies, from the Genetics and
Cellular Biology Department, Alcalá University, Alcalá de Henares (Madrid), Spain.
88
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Short Communication
PODE O COMPORTAMENTO MATERNO TER INFLUENCIADO GERAÇÕES DE
RATOS, SELECIONADOS PELO CONSUMO DE ETANOL, CONSIDERADOS
MODELOS EXPERIMENTAIS DE ALCOOLISMO?
95
Short Communication
PODE O COMPORTAMENTO MATERNO TER INFLUENCIADO GERAÇÕES DE
RATOS, SELECIONADOS PELO CONSUMO DE ETANOL, CONSIDERADOS
MODELOS EXPERIMENTAIS DE ALCOOLISMO?
O consumo crônico de álcool é um problema médico de grande magnitude com
repercussões sócio-econômicas importantes e está entre as principais causas de doenças no
mundo (Ezzati et al., 2002). São relacionados mais de 60 problemas de saúde devido ao
consumo de álcool, incluindo diferentes tipos de carcinomas, assim como outras alterações
orgânicas e psíquicas (Llobera et al., 1990; Caballería, 2003).
Cerca de 60% da suscetibilidade à dependência de álcool é devida à variação
genética, tanto para homens quanto para mulheres. Portanto, fatores ambientais contribuem
com cerca de 40% para a dependência alcoólica, visto que, um número significativo de
gêmeos monozigóticos é discordante para essa condição (Gordis, 2000; Whitfield, 2005).
Embora parte da pré-disposição ao alcoolismo seja devida à hereditariedade, nem
todos com histórico familiar para o alcoolismo desenvolvem a doença. O ambiente social e
familiar é capaz de moderar o impacto do alto risco genético em desenvolver desordens
relacionadas ao consumo de álcool (Jacob et al., 2003). Conseqüentemente, é importante
identificar os fatores ambientais que estão envolvidos no desenvolvimento do alcoolismo, a
forma e a extensão que esses fatores interagem com os fatores genéticos. Segundo Gordis
(2000), uma das questões mais proeminentes na pesquisa sobre o alcoolismo é a recíproca
combinação de estudos comportamentais e biológicos, a fim de entender a interação da
expressão genética com o ambiente na manifestação do alcoolismo.
Em ratos Wistar naturalmente ocorrem variações no comportamento materno de
lamber/limpar e amamentar, com o dorso arcado, seus filhotes (Licking/grooming and arched-
back nursing - LG-ABN). Quando adultos, os filhotes de mãe com alto índice de cuidados
(High LG-ABN) possuem comportamento de menor temor frente a situações novas e uma
resposta branda do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) ao estresse, quando comparados
aos filhotes de mãe com baixo índice de cuidados maternos (Low LG-ABN) (Francis et al.,
96
1999a, b). Ou seja, o comportamento materno é capaz de modular o desenvolvimento de
respostas individuais do eixo HHA e, assim, influenciar as respostas comportamentais a
agentes estressores no adulto (Liu et al., 1997; Caldji et al., 1998; Francis et al., 1999 a e b).
Francis et al. (1999b), através de estudos experimentais com ratos, concluíram que essas
variações do comportamento materno e da resposta ao estresse são formas de transmissão não
genética de comportamento através de gerações, pois através de experimentos de adoção
cruzada, entre mãe com alto e baixo cuidados maternos (LG-ABN), verificam que o filhote
fêmea reproduz o comportamento da mãe adotiva e não da mãe biológica, o mesmo ocorrendo
em relação à resposta ao estresse.
Um modelo experimental para estudo do efeito da relação mãe-filhote no
comportamento do adulto denomina-se Separação Materna. Neste modelo, os filhotes são
separados da mãe em intervalos superiores a uma hora, durante dias do desenvolvimento pós-
natal, antes do desmame. Assim, os filhotes não só ficam privados dos cuidados maternos
durante o período, que pode ser de até 24 horas, mas também sofrem pela alteração do
comportamento materno aberrante, que persiste após a reunião mãe-filhotes (Pryce & Feldon,
2003; Schmidt et al., 2004).
Devido às dificuldades e implicações éticas em pesquisas com seres humanos
sobre o alcoolismo, a grande parte do conhecimento, descrito na literatura especializada,
provém de estudos com roedores (Martinez et al., 2002). Iniciando nos anos 50, linhagens de
roedores consumidoras de grande quantidade de etanol foram selecionadas, quase que
contemporaneamente, no Chile, na Finlândia, nos Estados Unidos e no Canadá (Li et al.,
2001). Hoje, vários pesquisadores de outros países como Itália (Permufi et al., 2005), Japão
(Kitanaka et al., 2004) e Polônia (Dyr & Kostowski, 2004) têm desenvolvido sua própria
linhagem, geralmente, tendo em comum a origem em ratos Wistar e a seleção de um par de
linhagens: baixo e alto consumo de etanol.
As variedades de ratos UChA (baixo consumo) e UChB (alto consumo)
constituem modelos raros para estudos relacionados aos fatores genéticos, bioquímicos,
fisiológicos, nutricionais e farmacológicos dos efeitos do álcool, além do apetite e a tolerância
que são importantes fatores do alcoolismo humano (Mardones & Segovia-Riquelme, 1983;
Tampier et al., 2000; Martinez et al., 2002; Quintanilla et al., 2006).
97
Estudando os efeitos da Separação Materna nas linhagens UChA e UChB, durante
nosso experimento de doutorado, com o objetivo de estudar parâmetros reprodutivos no
adulto, observamos durante o manejo dos animais, no início do período de Separação
Materna, diferenças no comportamento materno entre as linhagens UChA e UChB. Mesmo
não tendo por objetivo a avaliação do comportamento materno, devido à importância dessa
observação, realizamos breve avaliação do comportamento materno, entre os dias 7 a 14 pós-
natal, cinco minutos após a união mãe-filhotes, no experimento de Separação Materna.
Foi observado que as fêmeas da linhagem UChA (baixo consumo de etanol)
apresentaram, em sua totalidade (12 fêmeas), comportamento de intenso cuidado materno, por
nós denominado comportamento alfa, que acreditamos ser equivalente ao comportamento
High LG-ABN, descrito na literatura. A mãe UChA, ao ser devolvida a sua prole,
imediatamente interagia com seus filhotes na tentativa de proteger a ninhada, procurando
escondê-los sob a maravalha. Posteriormente, a fêmea reunia todos os filhotes e com o dorso
arcado, amamentava-os.
Por outro lado, a totalidade (n = 12) das fêmeas UChB apresentou comportamento
materno de baixo cuidado com a prole, o qual denominamos de beta, que acreditamos ser
equivalente ao comportamento Low LG-ABN, encontrado também na linhagem Wistar em
nosso experimento. A mãe UChB apresentou comportamento completamente diferente
comparada à fêmea UChA. A fêmea UChB, ao ser devolvida a sua ninhada, primeiramente
explorava o ambiente, ignorando completamente a presença dos filhotes, que buscavam a mãe
para amamentação. A amamentação só ocorria, quando os filhotes alcançavam as mamas,
após insistência e busca pela fêmea. Muitas vezes a amamentação não ocorria durante o
tempo de observação (cinco minutos).
Infelizmente, não pôde ser realizada uma análise do comportamento materno
quantitativa neste experimento. No entanto, a diferença entre as linhagens foi constante e em
todos os animais observados. Dessa forma, acreditamos na possibilidade que, além da
característica quanto ao consumo de etanol, também tenha sido selecionado o comportamento
materno dessas linhagens, visto que, o comportamento materno pode ser transmitido de
geração a geração, de uma forma não genética.
Não é possível saber se as diferenças observadas no comportamento materno
acompanharam o início da linhagem no Chile em 1942, visto que, nenhum estudo ou
98
observação comportamental foi relatado. Há a possibilidade que essa característica tenha sido
selecionada nas matrizes trazidas ao Brasil em 1999. Contudo, coincidentemente ou não,
obtiveram-se linhagens, por muitos anos selecionadas, segundo o consumo de etanol; bem
como, ao menos nas últimas gerações, quanto ao comportamento materno.
Identificamos, portanto, nessa constatação uma ferramenta importante para
estudar experimentalmente a interação genética e ambiental, especialmente do
comportamento materno neonatal, na manifestação do alcoolismo. Enquanto realizamos
estudos mais adequados do comportamento materno dessas linhagens, comunicamos a
comunidade científica esta observação, a fim de que o comportamento materno seja avaliado
nas demais linhagens alcoólicas.
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100
IV – CONCLUSÕES
• O alcoolismo e a Separação Materna experimentais alteram o metabolismo sistêmico e
a morfofisiologia prostática, de forma independente ou integrada.
• A ingestão de etanol e a Separação Materna, de forma independente ou associada,
alteram a expressão de receptores de lipídios e de andrógenos no epitélio da próstata.
• A Separação Materna resulta em quadro de Síndrome Metabólica no rato adulto, cujas
alterações são potencializadas pela ingestão de etanol.
• A vitamina E desempenha papel quimioprotetor contra as alterações evidenciadas na
morfofisiologia da próstata, bem como atenua parte das alterações metabólicas
sistêmicas, causadas pela ingestão de etanol ou pela Separação Materna.
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