ads:
Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Avaliação de proteases extracelulares da linhagem Chryseobacterium sp. Kr6 e
purificação e caracterização de uma metaloprotease queratinolítica
Alessandro Riffel
Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em
Agronomia. Área de concentração: Microbiologia Agrícola.
Piracicaba
2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Alessandro Riffel
Farmacêutico
Avaliação de proteases extracelulares da linhagem Chryseobacterium sp. Kr6 e purificação e
caracterização de uma metaloprotease queratinolítica
Orientador:
Prof. Dr. FLÁVIO CESAR ALMEIDA TAVARES
Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em
Agronomia. Área de concentração: Microbiologia Agrícola
Piracicaba
2006
ads:
Dados
Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Riffel, Alessandro
Avaliação de proteases extracelulares da linhagem Chryseobacterium sp. Kr6 e
purificação e caracterização de uma metaloprotease queratinolítica / Alessandro Riffel. - -
Piracicaba, 2006.
98 p. : il.
Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2006.
Bibliografia.
1. Bactérias aeróbicas gram-negativos 2. Enzimas proteolíticas 3. Esderoproteinas
4. Metaloprotease 5. Proteinase I. Título
CDD 574.1925
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
Dedicatória
Dedico este trabalho a:
todo cidadão brasileiro - pelo suor e esforço,
meus pais Darci Riffel e Celita Tereza Knebel Riffel - pela educação e aposta
e minha querida irmã Ana Cláudia - pela alegria
4
Agradecimentos
A Deus.
A CAPES pelo invetimento na pesquisa e apoio financeiro durante esses últimos 4 anos
de doutorado.
A Universidade de São Paulo e a Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” pela
estrutura acadêmica e pessoal e todos os funcionários, alunos e professores.
A meus pais, Chico Riffel e Celita e minha alegre e querida irmã Ana Cláudia.
A meus colegas de laboratório, Betão, Keila, Rebeca, Ana, Gildemberg, Polé, Simone,
Marina, Rodrigão, Varejeira (Luis) e outros que passaram, Nervo, Fossa, Pupin e Daniele pela
convivência quase sempre harmoniosa.
Aos laboratórios dos Professores Ricardo Azevedo e Márcio Lambais e todos os seus
integrantes pela paciência e pelo acesso a estrutura, sem o qual esse trabalho não seria possível.
A Professora Siu Mui Tsai por mais uma vez abrir as portas de seu laboratório que
juntamente com a Fabi facilitaram o sequenciamento de DNA.
A Dra. Cláudia Bellato pela ajuda com o processamento da proteína para a espectrometria
e as boas dicas de sempre.
Ao Gustavo do Laboratório Thomson de Espectroetria pela ajuda com a espectrometria de
massas.
Ao camarada Renato pela ajuda com a microscopia.
A meu amigo Darião pela ajuda com a espectrometria atômica e as longas conversas sobre
a ciência no Brasil.
A Dani Takahashi pela grande ajuda com as extrações de RNA e a transmissão do
conhecimento em biologia molecular.
Aos colegas de moradia Simão Lindoso, Dyemão Bento, Paulinho de Tarso, Paulo Tobias,
Maurão e anteriormente Gildemberg, Bilola, João de Deus dos Santos Cachaça e Robertão
Wagner pela amizade e pela possibilidade de conhecer e entender melhor o Brasil.
Ao Tabajara Futebol Clube pela oportunidade de conviver em equipe, principalmente
após o futebol e pela oportunidade de erguer tantos troféus em tão pouco tempo. Que se
5
mantenha vivo e até 2014. Também aos integrantes dos outros times aos quais o tabajara obteve
tanto sucesso e que constituem a comunidade piracicabana dos fomes de bola.
Ao Perneta futebol Clube e a todos os seus integrantes pela camaradagem e por
participarem desta verdadeira terapia que foi o futebol da sexta sem a qual esse trabalho também
não seria possível.
Ao Professor Flavio Cesar Almeida Tavares, pela aceitação, orientação e principalmente
pelo ensinamento de como andar com as próprias pernas.
Pelos meus colegas do Rio Grande do Sul, Mandita, Bacana, Luis, Julio, que mesmo a
distância mantiveram o contato, a amizade e as trocas de conhecimento.
Ao Professor Adriano Brandelli, a quem devo inspiração, iniciação e gosto pela ciência,
pela presença e ajuda de sempre.
Aos meus amigos de Santo Cristo pela grande irmandade que existe, apesar de muitas
vezes não sabermos disto.
A Piracicaba que eu adoro tanto, cheia de amores e cheia de encantos....
A Carla Mello, pela compreenção e ajuda de sempre.....
A todos os amigos e pessoas que de alguma forma fazem e fizeram parte da minha vida
bem com as loiras geladas que me acompanharam neste período.
.
6
SUMÁRIO
RESUMO......................................................................................................................................... 9
ABSTRACT .................................................................................................................................. 10
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................... 11
LISTA DE TABELAS................................................................................................................... 13
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................................... 14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................................... 16
2.1
PROTEASES ............................................................................................................................... 16
2.1.1 Classificação......................................................................................................................... 16
2.1.2 Relação Evolutiva das Proteases .......................................................................................... 19
2.1.3 Funções Fisiológicas das Peptidases .................................................................................... 20
2.1.4 Aplicações ............................................................................................................................ 21
2.2
QUERATINÓLISE MICROBIANA.................................................................................................. 21
2.2.1 Queratinas............................................................................................................................. 21
2.2.2 Microrganismos Queratinolíticos......................................................................................... 23
2.2.3 Queratinases ......................................................................................................................... 24
2.2.4 Clonagem e Superexpressão de Quertatinases ..................................................................... 28
2.2.5 Aplicações das Queratinases ................................................................................................ 29
2.2.5.1 Reaproveitamento de Penas de Frango ........................................................................... 29
2.2.5.2 Depilação do Couro......................................................................................................... 31
2.2.6 O Processo de Degradação da queratina .............................................................................. 32
2.2.6.1 Queratinólise Mecânica................................................................................................... 32
2.2.6.2 Hidrólise de Pontes Dissulfeto ........................................................................................ 32
2.2.6.3 Proteólise......................................................................................................................... 33
2.3
O GÊNERO CHRYSEOBACTERIUM.............................................................................................. 33
3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................................ 35
3.1
INFLUÊNCIA DAS CONDIÇÕES NUTRICIONAIS SOBRE O CRESCIMENTO E ATIVIDADE
PROTEOLÍTICA DE CHRYSEOBACTERIUM SP. KR6 ........................................................................... 35
3.1.1 Microrganismo, Meios de Cultura e Condições de Crescimento......................................... 35
3.1.2 Determinação do Número de Células Viáveis...................................................................... 35
3.1.3 Ensaio de Atividade Proteolítica ..........................................................................................36
3.1.4 Ensaio de Atividade Queratinolítica..................................................................................... 36
3.1.5 Zimografia ............................................................................................................................ 37
3.1.6 Efeito de inibidores de protease na atividade queratinolítica............................................... 37
3.1.7 Quantificação de proteína..................................................................................................... 37
3.1.8 Doseamento de glicose......................................................................................................... 38
3.1.9 Análise Microscópica (Microscopia Eletrônica de Varredura)............................................ 38
3.2
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA QUERATINASE DE CHRYSEOBACTERIUM SP. KR6.38
3.2.1 Produção da Enzima............................................................................................................. 38
3.2.2 Ensaios de Atividade Enzimática ......................................................................................... 39
3.2.2.1 Atividade Proteolítica..................................................................................................... 39
3.2.2.2 Atividade Queratinolítica;............................................................................................... 39
3.2.3 Purificação............................................................................................................................ 39
3.2.3.1 Cromatografia de Interação Hidrofóbica......................................................................... 39
3.2.3.2 Cromatografia em Gel Filtração:..................................................................................... 40
7
3.2.4 Técnicas Eletroforéticas ....................................................................................................... 40
3.2.4.1 Determinação de Peso Molecular.................................................................................... 40
3.2.4.2 Zimografia....................................................................................................................... 40
3.2.5 Quantificação de proteína..................................................................................................... 41
3.2.6 Caracterização ...................................................................................................................... 41
3.2.6.1 Determinação de pH ótimo.............................................................................................. 41
3.2.6.2 Determinação de Temperatura Ótima ............................................................................. 41
3.2.6.3 Estabilidade Térmica....................................................................................................... 42
3.2.6.4 Efeito de Interferentes na atividade proteolítica ............................................................. 42
3.2.6.5 Determinação do metal.................................................................................................... 42
3.2.7 Identificação da Proteína ...................................................................................................... 43
3.2.7.1 Ionização a Lazer com MS com TOF de Alta Resolução (Maldi-Tof/MS).................... 43
3.2.7.2 Espectrometria de Massas em Tandem com Ionização por Electrospray (ESI-MS/MS) 43
3.2.8 Hidrólise de Substratos Protéicos Insolúveis ....................................................................... 44
3.2.8.1 Método Colorimétrico para Quantificação e Aminoácidos Solúveis.............................. 44
3.2.8.2 Análise de Aminoácidos Solúveis por Cromatografia Líquida de Alta Resolução
(HPLC) ................................................................................................................................ 44
3.3
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA DO GENE DA QUERATINASE DE CHRYSEOBACTERIUM SP. KR645
3.3.1 Extração de DNA Total ........................................................................................................ 45
3.3.2 Desenho dos Iniciadores Degenerados e Amplificação de DNA por PCR.......................... 46
3.3.3 Clonagem.............................................................................................................................. 46
3.3.4 Preparo de Células de E. coli Competentes por Cloreto de Rubídio.................................... 46
3.3.5 Transformação de E. coli por Choque Térmico ................................................................... 47
3.3.6 Extração de DNA Plasmidial................................................................................................47
3.3.7 Seqüenciamento.................................................................................................................... 48
3.3.8 Extração de RNA Total ........................................................................................................ 48
3.3.9 Síntese da Primeira Fita de cDNA........................................................................................ 49
3.3.10Amplificação do cDNA....................................................................................................... 50
3.4
ANÁLISE DOS RESULTADOS ...................................................................................................... 50
4 RESULTADOS .......................................................................................................................... 51
4.1
EFEITO DAS CONDIÇÕES NUTRICIONAIS NO CRESCIMENTO E ATIVIDADE PROTEOLÍTICA......... 51
4.1.1 Crescimento e Atividade Enzimática ................................................................................... 51
4.1.2 Efeito de inibidores na atividade proteolítica....................................................................... 54
4.1.3 Análise Microscópica ........................................................................................................... 54
4.2
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA QUERATINASE DE CHRYSEOBACTERIUM SP. KR6 ......... 54
4.2.1 Purificação............................................................................................................................ 54
4.2.2 Caracterização da Queratinase .............................................................................................59
4.2.2.1 Determinação do Peso Molecular ................................................................................... 59
4.2.2.2 Efeitos da Temperatura e pH na atividade e Estabilidade Térmica da Protease............. 59
4.2.2.3 Efeito de Interferentes ..................................................................................................... 64
4.2.2.4 Determinação do Metal ...................................................................................................64
4.2.2.5 Hidrólise de Substratos Insolúveis.................................................................................. 64
4.2.2.6 Identificação da queratinase............................................................................................66
4.3
IDENTIFICAÇÃO DO GENE DA QUERATINASE DE CHRYSEOBACTERIUM SP. KR6 ........................ 66
4.3.1 Amplificação do DNA com os Iniciadores Degenerados..................................................... 66
4.3.2 Clonagem e Seqüenciamento................................................................................................ 69
8
4.3.3 Extração de RNA e amplificação do cDNA......................................................................... 69
5 DISCUSSÃO.............................................................................................................................. 72
6 CONCLUSÕES.......................................................................................................................... 82
REFERÊNCIAS ............................................................................................................................ 84
9
RESUMO
Avaliação de proteases extracelulares da linhagem Chryseobacterium sp. kr6 e purificação e
caracterização de uma metaloprotease queratinolítica
A linhagem queratinolítica Chryseobacterium sp. Kr6 mostrou-se com possibilidade de
aplicação em processos envolvendo queratinólise, principalmente na hidrólise de penas de frango
e depilação de couro bovino. No presente trabalho avaliou-se o efeito da composição do meio
sobre o crescimento e atividade proteolítica deste isolado e uma protease queratinolítica
(queratinase) foi purificada e caracterizada. O microrganismo mostrou-se adaptado à utilização
de queratina como substrato durante o crescimento, produziu diferentes proteases dependendo do
meio utilizado e a maior atividade proteolítica foi atingida quando utilizado meio de cultivo com
penas como única fonte de carbono e nitrogênio. A adição de fonte extra de nutrientes resultou
em uma parcial repressão catabólica. Uma protease extracelular (Q1) foi purificada cerca de 14
vezes utilizando cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL 4B e gel
filtração em Superose H12R. Q1 mostrou ser uma proteína monomérica com peso molecular de
64 KDa determinado por SDS-PAGE e pH e temperatura ótimos de 8,5 e 50°C respectivamente.
O perfil de inibição indica tratar-se uma metaloprotease e as seqüências internas dos peptídeos
resultantes de digestão tríptica mostraram homologia ao sítio ativo e de ligação ao Zn da família
M14 (Carboxipeptidase). A atividade proteolítica foi estimulada pela presença de íons Ca
2+
e
Mg
2+
e inibida por Cu
2+
, Zn
2+
, Al
2+
, Hg
2+
e agentes redutores. Q1 apresentou atividade
queratinolítica sobre o substrato keratin azure, mas não foi capaz de hidrolisar penas de frango
sugerindo a necessidade de outras enzimas durante o processo de degradação de penas.
Utilizando os iniciadores degenerados desenhados com base na seqüência dos peptídeos, foi
amplificado um fragmento de 470 pb correspondente a uma região do possível gene desta
metaloproteína utilizando DNA e cDNA como molde. A seqüência do fragmento pode estar
sendo expressa, mas não apresentou similaridade e homologia a proteínas conhecidas e portando,
indicativa de uma nova metaloprotease.
Palavras-Chave: Proteases; Queratina; Chryseobacterium; Queratinase; Metaloprotease
10
ABSTRACT
Evaluation of extracellular proteases from Chryseobacterium sp. Kr6 strain and
purification and characterization of a keratinolytic metalloprotease
The strain Chryseobacterium sp. kr6 shown to be useful for biotechnological purposes such as
hydrolysis of poultry feathers and de-hairing of bovine pelts. The effect of media composition on
the protease production and growth by this strain was studied and a keratinolytic protease
(keratinase) was purified and characterized. The strain was adapted to use keratin as substrate to
growth, produced different proteases in different media composition and the higher proteolytic
activity was reached when used feather as only source of carbon and nitrogen. The addition of
sources of nutrients has resulted in partially repressed catabolism. An extracellular protease (Q1)
was purified 14-fold by chromatography using the hydrophobic interaction Phenyl-Sepharose CL
4B column and gel filtração in Superose 12HR. SDS-PAGE indicated that the Q1 is a monomeric
protein with molecular mass of 64 KDa. and optima pH and temperature were 8,5 e 50°C,
respectively. The inhibition profile indicates to be a Zn-metalloprotease and analysis of tryptic
peptides sequence revealed sequence homology to the conserved active site and Zn binding site,
which may characterize keratinase Q1 as a member of M14 metalloprotease family
(Carboxipeptidase). The activity was stimulated by of Ca
2+
and Mg
2+
and inhibited by Cu
2+
, Zn
2+
,
Al
2+
, Hg
2+
and reducing agents. Q1 presented keratinolytic activity under substrate keratin azure,
but was unable to hydrolyze poultry feather, suggesting the requirement by other enzymes in the
feather hydrolysis mechanism. Degenerate primers amplified a 470 bp, corresponding to a
probable gene region of this metalloprotein, with DNA and cDNA. The sequence is being
expressed but do not showed similarity and homology to known proteins, thus indicating a new
metalloprotease.
Key words: Protease; Keratin; Chryseobacterium; Keratinase; Metalloprotease
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 - Famílias de Metalopeptidases com base na estrutura do sítio de ligação ao
cátion. As letras indicadas com os números representam os ligantes de Zn já
identificados. Resíduos da linha a correspondem ao primeiro e segundo ligantes;
resíduos em b o terceiro ligante e em c o provável quinto ligante .............................18
Figura 4.1 - Curva de crescimento de Chryseobacterium sp. Kr6 em diferentes meios de
cultivo. (●) Triptona; (□ ) CPG; (♦) CP; (∆) CPN; (x) Ccas e (▲) e CGli a 30°C,
150 RPM e pH inicial 7..............................................................................................52
Figura 4.2 - Atividade Proteolítica durante curva de crescimento de Chryseobacterium sp.
Kr6 em diferentes meios de cultivo. (●) Triptona; (□ ) CPG; (♦) CP e (∆) CPN;
a 30°C, 150 RPM e pH inicial 7.................................................................................52
Figura 4.3 - Liberação de proteína solúvel para o meio durante curva de crescimento de
Chryseobacterium sp. Kr6 nos meios: (♦) CP; (□) CPG e CPN(▲) cultivado a
30°C, 150 RPM e pH inicial 7....................................................................................53
Figura 4.4 - Concentração de glicose residual no meio de cultivo: (□) CPG e (●) Cgli durante
curva de crescimento de Chryseobacterium sp. Kr6 cultivado a 30°C, 150 RPM
e pH inicial 7 ..............................................................................................................53
Figura 4.5 - Zimografia das proteases secretadas pela linhagem Chryseobacterium sp. Kr6
cultivada nos meios: A – Ctrip(1,2,5 e 6); B – CP(3,4,5 e 6); C – CPG(3,4,5 e 6)
e D – CPN(3,4,5 e 6) após 20 horas de cultivo ..........................................................55
Figura 4.6 - Micrografia das penas em suspensão após cultivo de Chryseobacterium sp. Kr6
em meio CP em diferentes tempos de coleta: (A) – 0; (B) - 8; (C) - 18 e (D) - 36
horas. O tamanho das células bacterianas é de 1 µm. Q – fibra de queratina, C –
célula de Chryseobacterium sp. Kr6 e R – Ráquis da pena. Aumento de 2000
vezes ...........................................................................................................................56
Figura 4.7 - Micrografia das penas em suspensão após cultivo de Chryseobacterium sp. Kr6
de 18 horas em meio CP. (A)- aumento de 1000 vezes e (B)- aumento de 2000
vezes. O tamanho das células bacterianas é de 1 µm. Q – fibra de queratina, C –
célula de Chryseobacterium sp. Kr6 e R – Ráquis da pena........................................57
Figura 4.8 - Perfil de eluição em cromatografia de Interação hidrofóbica em coluna Phenyl-
Sepharose das proteases de Chryseobacterium sp.A coluna foi eluída com
tampão fosfato gradiente de 1 a 0 M de (NH
4
)
2
SO
3
(- -) e monitorada
absorbância a 280 nm (○) e atividade proteolítica (●)...............................................58
12
Figura 4.9 - Perfil de eluição da cromatografia em Gel-filtração (Superose 12 HR
TM
) do pico
HIC1. A coluna foi eluída com tampão fosfato 100 mM e NaCl 50 mM e as
frações monitoradas para absorbância a 280 nm () e atividade (- - ).......................58
Figura 4.10 - SDS-PAGE da queratinase Q1 de Chryseobacterium sp. Kr6. A - Marcador de
Peso Molecular (170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 e 10 KDa); B - Q1
purificada e C - Zimografia de Q1 purificada ............................................................60
Figura 4.11 - Determinação do pH ótimo para protease Q1 (●) após purificação. Atividade
determinada a 50°C utilizando caseína como substrato .............................................62
Figura 4.12 - Determinação de temperatura ótima para protease Q1 (●) após purificação.
Atividade determinada em pH 8,5 utilizando caseína como substrato.......................62
Figura 4.13 - Determinação de Estabilidade Térmica da queratinase Q1 nas temperaturas de
37°C (●), 50°C (■) e 80°C (▲) após purificação. Atividade determinada
utilizando caseína como substrato..............................................................................63
Figura 4.14 - Seqüência de peptídeos resultantes de digestão tríptica de Q1 de
Chryseobacterium sp. Kr6. As seqüências foram alinhadas com outras proteases
pertencentes a família M14 (↓) indica o sítio obrigatório de ligação ao metal e
(*)indica o resíduo obrigatório do sítio......................................................................67
Figura 4.15 - Produto de amplificação do DNA de Chryseobacterium sp. Kr6 com os
diversos iniciadores degenerados. MM: Marcador de massa molecular (O´Gene
Ruler
TM
-1kb DNA Ladder – Fermentas Inc. – Canadá); 1: Iniciadores 1 e 3; 2:
Iniciadores 1 e 4; 3: Iniciadores 2 e 3; 4: Iniciadores 2 e 4; 5: Iniciador 1; 6:
Iniciador 2; 7: Iniciador 3; 8: Iniciador 4; 9: Controle sem DNA..............................68
Figura 4.16 - Extração de RNA total de Chryseobacterium sp. Kr6 cultivado em meios com
penas como única fonte de carbono e nitrogênio .......................................................71
Figura 4.17 - Produtos de amplificação utilizando par de iniciadores degenerados 1 e 3 MM:
Marcador de massa molecular (O´Gene Ruler
TM
-1kb DNA Ladder - Fermentas
Inc. – Canadá); 1: DNA de Chryseobacterium sp. Kr6 como seqüência molde; 2:
cDNA de Chryseobacterium sp. Kr6 como seqüência molde e 3: Controle sem
fita molde....................................................................................................................71
.
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1 - Características das queratinases de alguns microrganismos..................................... 25
Tabela 4.1 - Purificação da queratinase de Chryseobacterium sp. Kr6......................................... 61
Tabela 4.2 - Influência de Inibidores, metais e compostos na atividade proteolítica de Q1......... 65
Tabela 4.3 - Tabela da seqüência dos peptídeos resultantes de digestão tríptica da queratinase
Q1............................................................................................................................... 67
14
1 INTRODUÇÃO
A capacidade dos microrganismos de degradar macromoléculas insolúveis como celulose,
lignina, quitina e queratina é sempre dependente da secreção de enzimas extracelulares, com
habilidade de atuação na superfície destes substratos. A queratina é o principal componente dos
tecidos queratináceos como a pele, pelos, unhas e penas, servindo como suporte para formação
das fibras nestes tecidos. A estrutura molecular da queratina, altamente estável e resistente, é
resultado de um alto empacotamento das cadeias polipeptídicas em estruturas secundárias
repetitivas de α-hélices e folhas ß-pregueadas, que ao mesmo tempo são estabilizadas por
numerosas pontes dissulfeto e interações hidrofóbicas. Em conseqüência desta estrutura, a
degradação microbiana da queratina, limita-se a certo número de fungos, actinomicetos e
bactérias que são chamados de microrganismos queratinolíticos.
As proteases, produzidas por microrganismos queratinolíticos, que possuem certa
especificidade pela queratina como substrato são chamadas de queratinases. Grande parte destas
enzimas é secretada nos meios de cultivo, mas há relatos também de queratinases intracelulares
ou aderidas à membrana. A regulação da expressão dessas enzimas parece ser bastante complexa
e a composição dos meios onde são produzidas, tem influenciado consideravelmente a sua
produção. Muitas vezes, para alguns microrganismos, a presença de queratina atua como um
indutor da expressão destas enzimas e a presença de outras fontes de carbono e nitrogênio podem
reprimí-las
Um grande número de queratinases tem sido purificado e caracterizado até o momento.
Estas enzimas têm se apresentado altamente diversas, principalmente quanto a sua estrutura,
natureza catalítica, propriedades físico-químicas e especificidade de hidrólise. A expressão
heteróloga dessas enzimas também tem sido bastante explorada. Os objetivos da produção de
queratinases pela tecnologia recombinante têm sido de: i) facilitar o seu estudo, buscando
elucidar novas seqüências, estruturas, promotores e mecanismos de ação, já que a obtenção de
proteases nativas puras em grandes quantidades mostra-se bastante trabalhosa e ii) um aumento
de produção e estabilidade, principalmente no caso de queratinases de interesse industrial. Um
exemplo de queratinase produzida industrialmente é a queratinase de Bacillus licheniformis
PWD-1, atualmente comercializada pela empresa BioResource International (BRI) com o nome
de Versazyme
TM
.
15
Nosso grupo teve sucesso no isolamento e caracterização da linhagem queratinolítica
Chryseobacterium sp. Kr6, visto que as enzimas produzidas por esta bactéria têm mostrado
possível aplicação biotecnológica em processos envolvendo hidrólise de penas de frango e
depilação de couro. Apesar de bem caracterizada, pouco ainda se sabe sobre o mecanismo de
queratinólise desta linhagem e das propriedades individuais de suas proteases (queratinases). Este
trabalho teve como objetivo, verificar a influência das condições nutricionais sobre o
crescimento, hidrólise de queratina e a atividade proteolítica desta linhagem e a purificação e
caracterização bioquímica e molecular de uma queratinase por ela produzida.
16
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Proteases
Proteases (também conhecidas como peptidases ou proteinases) são uma classe de
enzimas com a capacidade de hidrolisar ligações peptídicas em proteínas e fragmentos de
proteínas. Fazendo isto, elas causam alterações irreversíveis ou destruição dos substratos, que do
ponto de vista biológico podem ser importantes, principalmente nos processos fisiológicos,
patológicos e também tecnológicos (BARRET; RAWLINGS; O´BRIEN, 2001). As proteases
modificam os substratos com grande seletividade e especificidade, como exemplificado em
reações de ativação de formas zimogênicas em enzimas líticas e o processamento e transporte de
enzimas extracelulares (RAO, et al., 1998). O número de proteases atualmente descritas é muito
grande, estimando-se que compreendem cerca de 2% de todos os produtos gênicos e
aproximadamente 10% de todas as enzimas incluídas na lista (EC) do Comitê de Nomenclatura
da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (BARRET; RAWLINGS; O´BRIEN,
2001).
2.1.1 Classificação
As proteases não são facilmente inseridas nos sistemas gerais de nomenclatura de enzimas
por causa de sua grande diversidade de atividade e estrutura. Atualmente as proteases são
classificadas segundo três critérios principais: i) quanto ao tipo de reação catalisada,
Exopeptidases e endopeptidases, que clivam respectivamente ligações peptídicas próximas ou
distantes das regiões terminais das proteínas; ii) quanto à natureza química do sítio catalítico, as
quais de acordo com a composição do sítio ativo, dividem-se em serina, aspartil, cisteína e
metalopetidases e iii) quanto às relações evolutivas, onde são classificadas em famílias e
subdivididas em clans, de acordo com a convergência ou divergência de um ancestral comum.
Baseando-se nestes critérios as famílias de peptidases são denominadas com uma letra, S, C, A,
M e U para os tipos serina, cisteína, aspartil, metalo e não conhecidas, quanto ao tipo de catálise
realizada (BARRET; RAWLINGS; O´BRIEN, 2001, RAO et. al., 1998).
As serina proteases são caracterizadas pela presença de um resíduo de serina em seu sítio
ativo. Elas são bastante numerosas, amplamente distribuídas entre os vírus, procariotos e
17
eucariotos sugerindo importância vital para todos os organismos. De acordo com suas
similaridades estruturais, são divididas em 20 famílias e seis “clans“. Outro aspecto interessante é
a presença de resíduos conservados de glicina (Gly) próximo ao resíduo de serina (Ser) do sítio
ativo, formando o motivo característico Gly-Xaa-Ser-Yaa-Gly, onde Xaa e Yaa podem ser
qualquer aminoácido. As serina proteases podem ser reconhecidas por sua inibição irreversível
pelos compostos 3,4–dicloroisocumarina-3,4-DCI, diisopropilfluorfosfato-DFP, 3-carboxitrans
2,3-epoxipropil-leucilamido e Fluoreto de fenilmetilsulfonil-PMSF (BARRET, 1994, RAO et al.,
1998).
As aspartil proteases, também são conhecidas como proteases ácidas e dependem da
presença de resíduos de ácido aspártico (Asp) para a atividade catalítica. A maioria delas
apresenta atividade máxima em baixos valores de pH e são agrupadas em três famílias. O resíduo
de ácido aspártico no sítio ativo está situado geralmente dentro do motivo Asp-X-Gly onde X
pode ser o aminoácido serina ou treonina e são inibidas por pepstatina (BARRET, 1995, RAO et
al., 1998).
As Cisteína proteases ocorrem em procariotos e eucariotos. Cerca de 20 famílias são
conhecidas e a atividade de todas elas depende da presença de uma díade de cisteína (Cys) e
histidina (His) no sítio ativo, sendo que a ordem, Cys-His ou His-Cys, difere entre as famílias.
Geralmente, estas enzimas são ativas somente na presença de condições redutoras. As cisteína
proteases em sua maioria são ativas em pH neutro, mas algumas que são encontradas em
lisossomos têm pH ótimo na faixa ácida. Outra característica é a inibição por agentes sulfidrila
como p-cloromercurilbenzoato-PCMB e Iodoacetamida.(BARRET, 1994).
As metaloproteases estão distribuídas em todos os organismos vivos e são as enzimas que
apresentam a maior diversidade de sítios catalíticos. Elas são caracterizadas pela necessidade da
presença de um íon metálico divalente para atividade e são distribuídas em cerca de 30 famílias,
sendo 17 com atividade endopeptidase, 12 com atividade exopeptidase e uma contendo ambas
(BARRET; RAWLINGS; O´BRIEN, 1995). As metalopetidases são agrupadas em “clans” de
acordo com a natureza dos aminoácidos que compõem o sítio de ligação ao metal. Os “clans”
MA e MB, os mais bem conhecidos, apresentam as seqüências HEXXH-E e HEXXH-H
respectivamente onde X pode ser qualquer aminoácido. Existem também outros sítios de ligação
ao metal que podem apresentar constituição diferente das até então citadas (MYOSHI;
SHINODA, 2000) como mostrado na figura 1.1. As metaloproteases são inibidas por agentes
18
quelantes como ácido etileno diamino tetracético –EDTA, ácido etileno glicol tetra acético –
EGTA e 1,10 orto fenantrolina –OP (BARRET, 1995).
Figura 1.1 - Famílias de metalopeptidases com base na estrutura do sítio de ligação ao cátion. As
letras indicadas com os números representam os ligantes de Zn já identificados.
Resíduos da linha a correspondem ao primeiro e segundo ligantes; resíduos em b o
terceiro ligante e em c o provável quinto ligante (MYOSHI; SHINODA, 2000).
19
2.1.2 Relação Evolutiva das Proteases
As proteases estão presentes em todos os seres vivos e sugere-se que tenham surgido
durante as fases iniciais da evolução biológica há alguns bilhões de anos, já que mesmo nos
organismos mais primitivos, sua presença era necessária para a digestão e metabolismo de suas
próprias proteínas. Considera-se que as proteínas tem origem em um ancestral comum. Essa
evolução pode ser divergente, quando possuem funções, sítio ativo, seqüência de aminoácidos e
estrutura tri-dimensional semelhantes, ou convergente, também chamada de independente, na
qual as proteínas podem apresentar função e sítio ativo semelhantes, mas a seqüência e estrutura
tri-dimensional diferem (NEURATH, 1983). Essas comparações de seqüências de aminoácidos,
estrutura tridimensional e mecanismo de ação das proteases têm ajudado na elucidação de seus
cursos evolutivos, pois se considera que as diferenças na estrutura molecular surgiram por causa
da necessidade de alterações de função durante a evolução (RAO et al., 1998).
A elucidação da relação estrutura-função das proteínas tem sido facilitada com o
desenvolvimento da bioinformática, principalmente com o estudo da homologia entre as
seqüências para análise filogenética e a dedução da estrutura secundária e terciária das proteínas.
As proteases, sendo um grupo bastante heterogêneo e complexo de enzimas, apresentam enormes
variações em suas propriedades físico-químicas e catalíticas, e são divididas de acordo com suas
linhas evolutivas em famílias e grupos de famílias (clans). As proteínas são agrupadas na mesma
família quando elas apresentam uma relação evolutiva entre toda a seqüência ou no mínimo entre
a região responsável pela atividade catalítica. Os “clans” correspondem a grupos de famílias,
onde há indicações de relação evolutiva, mas há falta similaridade comprovada estatisticamente
entre as seqüências. Através da análise rigorosa das seqüências das proteases foram reconhecidas
aproximadamente 84 famílias distintas. Algumas famílias foram alocadas em “clans”, ainda
assim, mais de 60 grupos não apresentaram relação evolutiva e, portanto, concluindo haver
muitas linhas evolutivas com origens independentes dentro das proteases (RAWLINGS;
BARRET, 1993).
Existem proteases que possuem sua origem evolutiva bastante recente. Famílias que são
encontradas em procariotos também podem ser encontradas em eucariotos como as famílias S1
(subtilisina), S8 (chimotripsina), M14 (carboxipeptidase A). Existem famílias que estão presentes
somente em organismos eucariotos como as famílias S1 (tripsina), C1 (papaína) e A1 (pepsina).
20
Estas possivelmente tiveram seu desenvolvimento juntamente com a capacidade das células
eucarióticas de endocitose, pois funcionam em organelas compartimentalizadas por membranas e
muitas vezes em pH ácido. Todas as proteases virais encontradas são endopeptidases e a grande
maioria delas não se apresenta relacionada às de outros organismos (RAWLINGS; BARRET,
1993).
Através da análise das seqüências das famílias de proteases também se descobriram
exemplos de evolução divergente. Seis famílias (S1, S12, S14, C1, M1 e M16) contêm proteínas
sem atividade proteolítica. Algumas famílias contêm enzimas com atividade endo e
exopeptidases (S8, S9, C1, e M3) e outras amino e carboxipeptidase (S12), ou seja, na maioria
das vezes, enzimas da mesma família possuem especificidades diferentes. Por outro lado,
exemplificando a convergência evolutiva, especificidades semelhantes são exibidas por enzimas
de famílias diferentes, como exemplificado na especificidade por resíduos carboxiterminal
básicos por ambas famílias S10 e M14. Essas observações sugerem que devemos levar sempre
em consideração as seqüências das proteases e utilizá-las como um recurso aditivo durante a
classificação, não observando apenas o tipo catalítico (RAWLINGS; BARRET, 1993).
2.1.3 Funções Fisiológicas das Peptidases
As peptidases executam uma variedade enorme de funções fisiológicas de grande
complexidade. Elas são importantes na manutenção e regulação de várias vias metabólicas, e por
isto estão presentes e todos os seres vivos. As peptidases, principalmente intracelulares,
apresentam-se como ponto chave nos processos de: coagulação sanguínea, crescimento e
migração celular, organização tecidual, morfogênese e desenvolvimento, inflamação, crescimento
tumoral e metástase, ativação de zimogênios, liberação de hormônios e precursores protéicos,
morte celular programada e transporte de proteínas através da membrana. A função das
peptidases extracelulares, quase sempre está ligada ao catabolismo, pois catalisam a hidrólise e
despolimerização de grandes proteínas a peptídeos menores e aminoácidos, facilitando assim a
absorção celular (RAO et. al., 1998).
21
2.1.4 Aplicações
As peptidases possuem uma grande variedade de aplicações, principalmente nas indústrias
farmacêutica, de detergentes, alimentos e no desenvolvimento de tecnologias menos agressivas
ao ambiente. As peptidases são um dos ingredientes padrão adicionado a todos os detergentes,
principalmente por causa da especificidade para alguns substratos constituintes do material a ser
removido. Na indústria de alimentos são amplamente utilizadas em laticínios, massas e na
produção de hidrolisados protéicos. Na indústria farmacêutica proteases são utilizadas em
formulações como auxiliares digestivos, combinações com antibióticos e para tratamentos de
lesões. Outra aplicação que vem despertando bastante interesse é a e substituição de compostos
químicos na indústria e a utilização em processos de tratamentos de resíduos industriais, além da
grande utilização de proteases na pesquisa científica. Estima-se que são movimentados
anualmente somente com enzimas de interesse industrial cerca U$ 1,6 bilhões, destas, as
proteases correspondem a 60% do total produzido (RAO et. al., 1998).
2.2 Queratinólise Microbiana
2.2.1 Queratinas
As queratinas são proteínas fibrosas, ricas em enxofre e insolúveis, que são o principal
componente dos tecidos encontrados na superfície dos vertebrados superiores (peles, pêlos,
penas, unhas, cascos e escamas). As queratinas foram vitais nos processos adaptativos aos
ambientes naturais, atuando como barreira mecânica, estrutural e térmica e despertaram
interesses por sua aplicação na indústria têxtil, médico-farmacêutica e mais recentemente na
indústria de polímeros e fibras sintéticas (BUSSON; ENGSTRÖN; DOUCET, 1999).
As queratinas fazem parte de uma família de proteínas denominada proteínas de filamento
intermediário (FI). A estrutura protéica altamente empacotada em α-hélice (α-queratina) ou β-
pregueada (β-queratina) e o super enovelamento da cadeia polipeptídica das queratinas conferem
resistência mecânica e de digestão proteolítica à maioria das peptidases. As queratinas possuem
também um alto índice de ligações intercadeia, conseqüência da grande quantidade de formação
de pontes dissulfeto, pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas (ONIFADE et al., 1998).
22
As queratinas são extremamente diversas em estrutura molecular. As α e β-queratinas têm
sido amplamente estudadas e historicamente consideradas convergentes em termos de estrutura e
função. No entanto há poucas similaridades em seqüência e muitas diferenças moleculares entre
elas. As α-queratinas são encontradas em todos os vertebrados superiores enquanto que as β-
queratinas são encontradas exclusivamente em répteis e aves. Todas as β-queratinas são menores
que as α-queratinas e são produzidas por uma família de genes altamente relacionados. Suas
características químicas, como a capacidade de formar filamentos, são similares, mas os
mecanismos pelos quais isso ocorre diferem. Um aspecto em comum é a presença de cistina na
formação das fibras, o que confere também a insolubilidade destas moléculas. As β-queratinas
tendem a conter mais aminoácidos pequenos e não essenciais e o monômero apresenta um único
tamanho, enquanto que as α-queratinas requerem dois monômeros de tamanhos diferentes para a
formação do filamento. Conseqüentemente suas configurações terciárias e estrutura dos
filamentos diferem (BRUSH, 1996).
As queratinas foram primeiramente classificadas quanto a biossíntese e características
físico-químicas em “leves” e “rígidas”. As queratinas “leves”, encontradas no extrato córneo, são
isentas ou contêm muito pouco conteúdo de cisteína e são constituídas principalmente de
aminoácidos com cadeias laterais pequenas como glicina, alanina e serina. As queratinas
“rígidas” são relativamente ricas em cisteína e contêm muitas ligações dissulfeto bem como a
presença da maioria dos aminoácidos. Incluem-se nesta classe penas e pêlos com cerca de 10 a
14% de cisteína (HOOD; HEALY, 1994). Outra classificação foi baseada em padrões de difração
de raios-X. Foram divididas em quatro classes: α, β, pena e amorfa encontradas em tecidos
rígidos de mamíferos; tecidos elásticos de mamíferos; tecidos rígidos de aves e répteis e na
cutícula de cabelos respectivamente (BUSSON; ENGSTRÖN; DOUCET, 1999).
A estrutura da α-queratina é conseqüência de sua estrutura primária. As regiões terminais
são mais ricas em resíduos de cisteína do que a região central. Esta região, no entanto, apresenta
uma estrutura com seqüências repetidas de sete aminoácidos (a-b-c-d-e-f-g) onde as posições a e
d são ocupadas geralmente por resíduos apolares. A associação destes resíduos permite a
formação de um arranjo com uma conformação de superespiralamento das cadeias em paralelo
umas sobre as outras, de maneira a formar uma estrutura filamentar (JONES et al., 1997). Os
domínios N e C-terminal facilitam a agregação de monômeros em dímeros (protofilamentos) que
23
juntos constituem uma protofibrila. Quatro protofibrilas constituem uma microfibrila que se
associa a outras formando uma macrofibrila e assim a estrutura superior da queratina é formada
(LEHNINGER; NELSON; COX, 2000).
A estrutura primária da molécula da β-queratina consiste em uma longa seqüência de
polipeptídeos que alternam resíduos de glicina, alanina e serina, sempre apresentando uma
glicina entre um resíduo e outro. Como resultado as glicinas situam-se na parte superior do plano
da folha β-pregueada enquanto outros resíduos ficam abaixo do plano. Pares de folhas
pregueadas, então, empacotam-se perfeitamente. Não há formação de pontes dissulfeto neste
estágio sendo a estabilização permitida por pontes de hidrogênio. A associação linear de
monômeros forma então os microfilamentos e a associação destes, estabilizada por pontes
dissulfeto, formará as fibras de β-queratina (GARRET; GRISHAM, 1995).
2.2.2 Microrganismos Queratinolíticos
Apesar de as moléculas das queratinas serem altamente estáveis e resistentes à maioria
das peptidases verifica-se que não há acúmulo na natureza. Isto confirma a existência de
microrganismos decompositores naturais, capazes de utilizar a queratina como substrato para seu
crescimento. Estes são chamados de microrganismos queratinolíticos e podem crescer em
diferentes condições ecológicas e ambientais, demonstrando uma capacidade variada de
solubilização de substratos queratinosos, bem como de outros substratos protéicos compactados.
Geralmente, essa solubilização se faz através da síntese e secreção de proteases para a superfície
destes substratos viabilizando a hidrólise e assim a assimilação de nutrientes (ONIFADE et al.,
1998).
Existem vários microrganismos queratinolíticos isolados e caracterizados, sendo a maioria
deles dermatófitos (TAKIUCHI; HIGUCHI; SEI, 1983, HÄNEL et al., 1991,
WAWRZKIEWICZ; WOLSKI; LOBARZEWSKI, 1991, PAPINI; MANCIANTI, 1996), gram-
positivos do gênero Bacillus (WILLIAMS et al., 1990; ATALO; GASCHE, 1993; ZAGHLOUL;
ABDELAZIZ; MOSTAFA, 1998, KIM; LIM; SUH, 2001, EL-REFAI et al., 2005;) ou
Streptomyces (NOVAL; NICKERSON, 1958, BOCKLE; GALUNSKI; MULLER, 1995,
LETORNEAU et al. 1998, CHITE; NALAWADE; DEY, 1999, MOHAMEDIN, 1999; SZABO,
2000). Apesar disto, a queratinólise não tem se limitado somente a esses grupos, as gram-
24
negativas Vibrio sp. Kr2 (SANGALI; BRANDELLI, 2000), a Cythophagale Chryseobacterium
sp. Kr6 (RIFFEL; BRANDELLI, 2003) e a Thermotogale Fervidobacterium pennavorans
(FRIEDRICH; ANTRANIKIAN, 1996) também mostraram capacidade de degradação de
queratina.
Lucas et al. (2003) observaram a diversidade de bactérias queratinolíticas ativas
encontradas em solos de regiões temperadas. Foram obtidos 33 isolados capazes de crescer em
penas como única fonte de nutriente e estes foram agrupados filogeneticamente em 13 grupos:
quatro foram gram-positivos, dois pertencentes ao grupo Cytophaga-Flavobacterium e o restante
ao grupo das Proteobacterias. Com isso demonstrou-se que a diversidade de microrganismos
queratinolíticos é grande e bem maior do que a até então descrita, pois nenhum dos isolados
ativos tinha sido até então associado a queratinólise. Portanto, o papel ecológico dos
microrganismos queratinolíticos no ambiente permanece ainda a ser estudado.
2.2.3 Queratinases
As proteases específicas, intra ou extracelulares, elaboradas pelos microrganismos
queratinolíticos são chamadas de queratinases. Estas enzimas distinguem-se das outras peptidases
por uma maior capacidade de degradação de substratos compactos como, por exemplo, a
queratina. A maioria das queratinases é induzida por queratina e é ativa somente no meio
extracelular. No entanto, verificou-se também atividade queratinolítica associada às células do
microrganismo queratinolítico Trichophyton mentagrophytes (ONIFADE et al., 1998).
Queratinases de vários microrganismos têm sido purificadas e caracterizadas até o
momento (Tabela 1.1). Dependendo da espécie do microrganismo produtor, as propriedades
físico químicas destas enzimas têm se mostrado bastante diversa. Já foram encontradas enzimas
de pesos moleculares de 18 KDa (BRESSOLLIER et al., 1999) até maiores de 200 KDa (NAM et
al., 2002) sendo a maioria delas pertencente à classe das serina proteases, mas tiol e
metalopeptidases também têm sido caracterizadas. Os pH e temperaturas de maior atividade
também variam bastante, de 5,5 (QIN; DEKIO; JIDOI, 1992) a 10 (BERNAL, CAIRÓ;
COELLO, 1995) e 30°C (MUKHOPADHYAY; CHANDRA, 1990) até 100°C (NAM et al.,
2002) respectivamente.
Tabela 1.1 - Características das queratinases de alguns microrganismos.
(Continua)
Espécie Tipo M
(KDa)
pH Temp
(°C)
Substrato Referência
Streptomyces sp.
–
49
7,5
30
Cabelo, penas de frango e lã
(MUKHOPADHYAY;
CHANDRA, 1990)
Streptomyces pactum
Serina 30 7-10 40-75 Penas, albumina sérica bovina
(BSA)
(BOCKLE et. al., 1995)
Streptomyces albidoflavus
Serina
18
6-9,5
40-70
Queratina
BRESSOLLIER et al,. 1999)
Bacillus licheniformis
PWD-1
Serina
33
7,5
50
BSA, caseína, colágeno e penas
(LIN et al., 1992)
Bacillus licheniformis
Tiol
42
8,5
52
-
(ROZS et al., 2001)
Bacillus subtilis KS-1
Serina
25,4
–
–
Caseína e penas
(SUH; LEE, 2001)
Tabela 1.1 - Características das queratinases de alguns microrganismos.
(Continuação)
26
Espécie Tipo M
(KDa)
pH Temp
(°C)
Substrato Referência
Bacillus sp.SCB3 Metalo 134 7,0 40 Caseína e queratina de Penas (LEE et al., 2002)
Trichophyton schoenleinii
–
38
5,5
50
Cabelo, pêlos, unhas e caseína e
(QIN et al., 1992)
Kocurea Rosea
Serina 240 10 40 Queratina solúvel de penas (BERNAL; CARNÓ
COELLO, 1995)
Aspergillus fumigatus
–
– 6,5-9 45 Pena autoclavada, nativa e caseína (SANTOS et al., 1996)
Microsporum canis
Metalo 43,5 8 50 Queratina, elastina e colágeno (BROUTA et al., 2001)
Fervidobacterium
islandicum AW-1
Serina >200 9,0 100 Penas
(NAM et al., 2002)
Stenotrophomonas sp.
Serina 40 8,0-9,0 Queratina e colágeno
(YAMAMURA et al., 2002)
Tabela 1.1 - Características das queratinases de alguns microrganismos.
(Conclusão)
Espécie Tipo M
(KDa)
pH Temp
(°C)
Substrato Referência
Lisobacter sp.
NCIMB-9497
Metalo 148 - 50 “Keratin Azure
TM
” (ALLPRESS; MOUNTAIN;
GOWLAND, 2002)
Xanthomonas maltophilia
Serina 36 9,0 60 Azoqueratina e Azocaseína (De TONI et al., 2002)
Kytococcus sedentarius*
Serina 30/50 7,1/7,5 40/50 Queratina de calo humano (LONGSHAW et al., 2002)
Aspergillus orizae
Metalo 60 8,0 50 Penas, queratina e lã (FARAG; HASSAN, 2004)
* Duas queratinases purificadas: Q1/P2
28
2.2.4 Clonagem e Superexpressão de Queratinases
O isolamento e a clonagem de genes que codificam proteases têm sido usados na
engenharia de melhores e mais eficientes microrganismos para produção destas. Um grande
número de genes que codificam peptidases tem sido clonado e expressado em novos hospedeiros
sendo os dois principais microrganismos de escolha são a Escherichia coli e o Bacillus subtilis
(GUPTA; BEG; LORENZ, 2002).
O gene (Ker A) da queratinase do Bacillus licheniformis PWD-1 foi isolado e
seqüenciado. A enzima foi caracterizada como sendo uma serina peptidase da grande família das
subtilases (LIN et al., 1995). Com o objetivo de aumentar o rendimento da produção da
queratinase, o gene Ker A foi clonado e expresso em Bacillus subtilis. Utilizaram-se, seu próprio
promotor, o promotor de crescimento vegetativo P43 e a associação desses dois promotores.
Todos os transformantes foram capazes de expressar a queratinase ativa com um rendimento de
até três vezes com o promotor P43, mas ainda não em quantidades suficientes para utilização
industrial (LIN et al., 1997). Otimizando as condições de fermentação em larga escala o mesmo
recombinante não foi capaz de aumentar a expressão de KerA em níveis consideráveis,
conseqüência da instabilidade do plasmídeo durante a fermentação, enquanto que no mesmo
experimento, utillizando o próprio Bacillus licheniformis PWD-1, houve um aumento de até dez
vezes a sua expressão, demonstrando que a regulação e otimização das condições de fermentação
são necessárias e extremamente rigorosas (WANG; SHIH, 1999).
A levedura metilotrófica Pichia pastoris também foi utilizada como sistema para
expressão de KerA de Bacillus licheniformis (PORRES; BENITO; LEI, 2002). O rendimento
obtido, sem otimização das condições de fermentação, foi maior do que o conseguido por Lin et
al. (1997) com B. subtilis. As características bioquímicas da enzima se mantiveram as mesmas
com a exceção do pH ótimo de atividade que pode ter sido alterado por causa das glicosilações
mais freqüentes dos sistemas eucariotos.
Wang, Swaisgood e Shih (2003) desenvolveram uma construção para a produção da
queratinase (Ker A) fundida a streptavidina com o objetivo de imobilização em matriz
biotinilada. Para isso foram utilizados como sistemas de expressão Escherichia coli e Bacillus
subtilis. Em B. subtilis a proteína fundida foi produzida no meio extracelular e rapidamente
imobilizada diretamente do meio. Em E. coli a proteína foi expressa em corpúsculos de inclusão,
29
requerendo ressolubilização e renaturação adicional para obtenção da queratinase ativa antes da
imobilização. No entanto houve uma baixa eficiência neste processo de cerca de 24-28% para
ambos sistemas. Adicionalmente, na tentativa de aumentar a expressão de KerA, foi a
integração de múltiplas cópias do gene, juntamente com o promotor P43 no cromossomo do
próprio Bacillus licheniformis. Com esta estratégia o gene se manteve estável, as células puderam
crescer em meios com uma alta concentração de substrato e a atividade aumentou em até seis
vezes (WANG; ROJANATAVORM; SHIH, 2004).
Algumas queratinases de outros microrganismos também foram clonadas. Noronha et al.,
(2002) purificaram, clonaram e expressaram o cDNA de uma queratinase de Aspergillus
fumigatus, um fungo patogênico em Pichia pastoris. A enzima recombinante apresentou
atividade proteolítica e queratinolítica, sendo capaz de hidrolisar farinha de pena em até 10%.
Zaghloul et al. (1994) clonaram uma protease alcalina de Bacillus subtilis em um plasmídeo de
alta expressão. A enzima recombinante apresentou alta estabilidade e capacidade de degradação
de penas. Kluskens et al. (2002) isolaram e caracterizaram o gene fls da bactéria termofílica
Fervidobacterium pennivorans, codificante da fervidolisina, uma queratinase. O gene foi clonado
tanto em E. coli e Bacillus sp., e a enzima recombinante, apesar de mesmo peso molecular da
enzima nativa (FRIEDRICH; ANTRANIKIAN, 1996), não foi expressa em sua forma ativa,
possivelmente por deficiências tanto no enovelamento como no processamento pós-traducional
que deve ser realizado pelo hospedeiro original Fervidobacterium pennivorans.
2.2.5 Aplicações das Queratinases
2.2.5.1 Reaproveitamento de Penas de Frango
Penas representam cerca de 5-7% do corporal de aves domésticas. Elas constituem a mais
abundante fonte de queratina encontrada. Durante o processamento de aves para consumo
humano, penas são geradas em grande quantidade como resíduo que geralmente se acumula e
apresenta-se como poluente ambiental. Uma grande quantidade de proteínas e aminoácidos
presentes nas penas poderia ser utilizada beneficamente na alimentação de animais como
alternativa para reciclagem deste produto. No entanto, ainda existem limitações para esta
utilização, que são principalmente a baixa digestibilidade (conseqüência da composição e a
30
conformação molecular da queratina), o baixo valor biológico e a deficiência de alguns
aminoácidos nutricionalmente essenciais como metionina, lisina, histidina e triptofano
(ONIFADE et al., 1998; PAPADOPOULOS; BOUSHY; ROODBEEN, 1986, DALEV;
IVANOV; LIUBOMIROVA, 1997).
Atualmente, um destino para o aproveitamento das penas, tem sido a produção de farinha
de pena (FP). As penas são processadas por tratamento térmico sob pressão, secagem em estufa e
moagem. A farinha quando pronta é utilizada como suplemento alimentar em rações para
animais. Segundo Papadopoulos; Boushy e Roodben (1986), não existe uma condição ótima para
o tratamento térmico das penas, pois a digestibilidade in vivo é aumentada com o tempo de
processamento, mas o conteúdo de aminoácidos é influenciado pelo processamento. Os
aminoácidos como valina, leucina, tirosina e fenilalanina apresentaram melhor estabilidade ao
processamento térmico. Moritz e Latschaw (2001), em experimento para verificar qualidade
nutricional da FP alterando a relação tempo/pressão durante o processamento, também não
chegaram a uma condição ótima. O aumento destes fatores faz com que haja um aumento na
digestibilidade da farinha, mas o teor de aminoácidos disponíveis sempre diminui.
Considerando o custo termoenergético do processo convencional de produção de FP
combinado com a baixa digestibilidade e valor nutricional, tem-se buscado alternativas
tecnológicas para otimização na utilização de penas visando o aumento do valor nutricional,
diminuição do impacto ambiental e otimização destes recursos renováveis. Por isso, tem-se
pensado em uma abordagem biotecnológica utilizando microrganismos queratinolíticos e
queratinases como alternativa (ONIFADE et al., 1998).
Lee; Fercket e Shih (1991), em um experimento adicionando uma preparação crua da
queratinase de Bacillus licheniformis PWD-1 em rações observaram um aumento na
digestibilidade de aminoácidos totais de penas cruas, de 30% para 60% e em FP comercial de
77% para 99%. Em um segundo experimento tratando frangos durante 8 dias com farinha de soja,
FP comercial e FP suplementada com queratinase. O ganho de peso diário foi de 66g, 50g e 56g
respectivamente. Odetallah et al., (2003), em experimento utilizando rações suplementadas com
queratinase purificada de Bacillus licheniformis-PW1, utilizando frangos jovens de 1 a 26 dias
observaram um maior aumento na performance de crescimento, taxa de conversão alimentar e
ganho de peso quando a enzima foi adicionada à ração.
31
2.2.5.2 Depilação do Couro
Na indústria do couro, o processamento das peles envolve uma série de operações até o
produto acabado: i) ribeira, onde as peles são limpas (remolho, depilação, desencalagem, purga,
desengraxe e o píquel); ii) curtimento, onde as peles são estabilizadas tornando-se resistentes a
putrefação e o iii) acabamento, em que são definidas as características estéticas ao produto. Em
todos estas etapas, uma grande quantidade de resíduos químicos é gerada (THANIKAIVELAN et
al., 2004).
Tradicionalmente, a depilação envolve a o desenvolvimento de condições extremamente
alcalinas com utilização de grandes quantidades de sulfeto de sódio, altamente tóxico, gerando
cerca de 80% de toda poluição do curtume. A substituição ou adição de enzimas ao processo
poderia ser uma alternativa para: redução da quantidade de sulfeto empregado, aumento na
qualidade do couro, recuperação dos pêlos e eliminação da necessidade um banho extra para
remoção dos agentes responsáveis pela depilação (HUANG et al., 2002). Desta forma seria
possível uma redução da demanda química de oxigênio (DQO) em cerca de 50% e da demanda
bioquímica de oxigênio (DBO) em cerca de 35% (AHUJA; FERREIRA; MOREIRA, 2004). As
enzimas utilizadas no processo de depilação são geralmente peptidases, no entanto nem todas
podem ser utilizadas por causa da atividade de degradação do colágeno que pode danificar a
estrutura e assim diminuir a qualidade do couro (HUANG et al., 2002).
Um processo enzimático efetivo para remoção dos pêlos deve liberar os pêlos e o sistema
epidérmico e abrir a estrutura fibrosa nas peles. Experimentos utilizando enzimas microbianas
têm atingido esse objetivo (MALATHI; CHAKRABORTY, 1991). Experimentos utilizando
sobrenadante de cultivo de Bacillus subtilis (VARELA et al., 1996), Bacillus amyloliquefaciens
(GEORGE et al., 1995), Aspergillus tomarii (DAYANANDAN et al., 2003) e algumas bactérias
queratinolíticas (RIFFEL; ORTOLAN: BRANDELLI, 2003) têm promovido resultados
esperados para um processo de depilação efetivo sem dano a qualidade das peles. Experimentos
utilizando enzimas puras com atividade depilatória em peles também têm sido relatados como
com as proteases de Bacillus pumilus (HUANG et al., 2003) e a queratinase de Bacillus subtilis
(MACEDO et al., 2005).
32
2.2.6 O Processo de Degradação da queratina
Sendo a queratina, constituída quase que exclusivamente de proteína (95% em peso), a
queratinólise é um evento basicamente proteolítico. Apesar da grande diversidade de
características físico-químicas entre queratinases, a atividade de protease e sua ação de hidrólise
da queratina têm sido demonstradas. No entanto o processo exato da degradação de queratina
permanece ainda não totalmente compreendido, mas uma série de prováveis processos para o
entendimento desse mecanismo de ação tem sido proposta (ONIFADE, et al., 1998).
2.2.6.1 Queratinólise Mecânica
Este tipo de degradação só tem se aplicado a fungos produtores de micélio. A degradação
mecânica da queratina é aquela em que ocorre como resultado da pressão ou penetração do
micélio no substrato queratinoso. Presume-se que o processo mecânico procede à hidrólise
enzimática, funcionando como mecanismo sinérgico, já que em alguns casos observou-se
degradação de queratina antes mesmo de ser detectada a atividade proteolítica (ONIFADE, et al.,
1998).
2.2.6.2 Hidrólise de Pontes Dissulfeto
A indicação de sulfitólise surge por causa do alto conteúdo de cisteína encontrado nas
queratinas. Há o consenso de que a degradação completa de queratina é conseguida somente após
a desnaturação por clivagem das pontes dissulfeto, que representam a principal fonte de
estabilidade e resistência à digestão proteolítica (ONIFADE, et al., 1998).
De acordo com Kunert et al. (1992), fungos podem metabolizar cisteína livre ou
combinada como fonte de enxofre e nitrogênio. Os produtos deste metabolismo são enxofre
inorgânico (sulfato e sulfito) e outros produtos intermediários. O sulfito excretado pode reagir em
pH neutro a alcalino com cistina clivando em cisteína e sulfocisteína. Essa reação pode acontecer
em proteínas, inclusive queratinas, sendo assim desnaturada antes da atividade proteolítica das
queratinases (ONIFADE et al. 1998).
33
A formação de tiol livre tem sido observada durante o crescimento em penas de frango de
Vibrio sp. Kr2 (SANGALI; BRANDELLI, 2000), Chryseobacterium sp. Kr6 (RIFFEL et al.,
2003), e Streptomyces pactum (BOCKLE; MULLER, 1997). Yamamura et al. (2002) isolaram,
da linhagem queratinolítica Stenotrophomonas sp., uma proteína de 15 KDa com atividade
redutora de pontes dissulfeto em proteínas. Esta proteína apresentou homologia muito baixa a
outras proteínas conhecidas e foi sugerido, para a degradação de queratina, o sinergismo entre
esta e uma protease também isolada, ou seja, a dissulfeto redutase reduz a pontes dissulfeto da
queratina nativa facilitando assim o ataque proteolítico e o acesso às ligações peptídicas pela
protease.
2.2.6.3 Proteólise
A fase proteolítica da queratinólise pode ser simplificada e comparada à proteólise em
outras proteínas. A diversidade das queratinases, quanto a condições ótimas, pesos moleculares e
ativadores e inibidores mostra o pouco conhecimento ainda sobre a especificidade de hidrólise da
queratina. Várias proteases não específicas são capazes de hidrolisar queratina sulfitolisada
dificultando um entendimento da especificidade e metabolismo destes substratos orgânicos
complexos (KUNERT et al., 1989).
No entanto, algumas queratinases, por apresentar alta atividade proteolítica sobre
queratina mostra-se diferenciadas sobre outras proteases (KUNERT, 1992, LIN et al., 1992).
Portanto a preferência das queratinases purificadas por moléculas compactas como a queratina
evidencia sua especificidade (LIN et al., 1992, BOCKLE et al., 1995).
2.3 O Gênero Chryseobacterium
O gênero Chryseobacterium apresenta hoje 12 espécies e foi criado por Vandamme et al.
(1994) para acomodar algumas espécies que até então eram classificadas como pertencentes ao
gênero Flavobacterium. As espécies reclassificadas foram Chryseobacterium balustinum, C.
gleum, C. indologenes, C. indoltheticum C. meningosepticum e C. scophthalmum e recentemente
mais algumas espécies têm sido isoladas e adicionadas como: Chryseobacterium defluvii
(KAMPFER et al., 2003), C. joostei (HUGO et al., 2003), C. miricola (LI et al., 2003), C.
34
daecheongense (KIM et al., 2005a), C. formosense (YOUNG et al., 2005), C. taichungense
(SHEN et al., 2005), C. shigense (SHIMURA; KAJI; HIRASHI; 2005) e C. vrystaatense (BEER
et al., 2005). No entanto as espécies C. meningosepticum e C. miricola foram recentemente
transferidas ao novo gênero Elizabethkingia.(KIM et al., 2005b).
As espécies do gênero Chryseobacterium apresentam-se como bastonetes gram-negativos,
não-móveis, não formadoras de esporos e pigmentação amarelada e têm sido isoladas de uma
grande variedade de ambientes tais como: sistemas de lodo ativado (KAMPFER et al., 2003),
indústria de laticínios (HUGO et al., 2003), bebidas lácteas (SHIMURA; KAJI; HIRASHI;
2005), rizosfera (YOUNG et al., 2005) sedimentos de lagos (KIM et al., 2005a), solo
contaminado (SHEN et al., 2005) e abatedouro de aves (BEER et al., 2005) e têm também sido
associados à atividade proteolítica (VENTER; OSTHOFF; LITTHAUER, 1999, YAMAGUCHI;
YOKOE, 2000, LIJNEN et al., 2000).
Riffel et al., (2003) isolaram, em um abatedouro de aves, a linhagem Chryseobacterium
sp. Kr6. Essa espécie, através da análise da seqüência parcial da região do 16S rRNA, mostrou
99% de similaridade a Chryseobacterium gleum ATCC 35910. A linhagem isolada apresentou
alta atividade proteolítica e capacidade de degradação completa de penas de frango em
temperaturas mesofílicas de 22 a 37°C e nos pH de 5 a 8. Apesar da maioria das queratinases
terem a atividade proteolítica associada a serina proteases a linhagem Kr6 apresentou como
principal responsável pela atividade proteolítica metaloproteases. Em outro trabalho Riffel,
Ortolan e Brandelli, (2003), verificaram que o sobrenadante de cultivo da linhagem
Chryseobacterium sp. Kr6 apresentou atividade depilatória, com fácil remoção dos pêlos em
peles bovina sem a necessidade da alcalinização prévia, tradicionalmente necessária, das peles. A
análise microscópica das peles após o tratamento apresentou ausência de pêlos nos folículos,
destruição da bainha externa e abertura das fibras sem danos à estrutura do colágeno profundo.
Essas características são desejáveis e também têm sido observadas para outros microrganismos
utilizados e considerados com potencial para o propósito de depilação.
35
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Influência das Condições Nutricionais sobre o Crescimento e Atividade Proteolítica de
Chryseobacterium sp. Kr6
3.1.1 Microrganismo, Meios de Cultura e Condições de Crescimento
Utilizou-se neste estudo a linhagem Chryseobacterium sp. Kr6 (Genebank AY157745).
Os meios empregados foram o meio mínimo mineral (NaCl 0.5 g.L
-1
, K
2
HPO
4
0.3 g.L
-1
, KH
2
PO
4
0.4 g.L
-1
) suplementado com as diferentes fontes de carbono e nitrogênio: CP: penas de frango
(10 g.L
-1
); CPG: penas (10 g.L
-1
) e glicose (50mM); CPN: penas (10 g.L
-1
) e cloreto de amônio
(50mM); CGli: nitrogênio base (Difco) e glicose (50 mM); Ccas: caseína (10 g.L
-1
); CTrip:
triptona (10 g.L
-1
). O cultivo do pré-inóculo foi em meio CP durante 16h sob agitação de 150
RPM (rotações por minuto) e temperatura de 30 °C. Para evitar o carreamento de nutrientes do
pré-inóculo, 10 mL da suspensão celular foram centrifugados a 3000xg por 5 minutos e as células
foram lavadas com tampão fosfato 50 mM estéril. As células foram ressuspendidas em 5 mL do
mesmo tampão e inoculadas, cultivadas e monitoradas por 44 horas nas mesmas condições do
pré-inóculo e em repetições de três experimentos independentes.
3.1.2 Determinação do Número de Células Viáveis
A contagem do número de unidades formadoras de colônias por mL (UFC.mL
-1
) foi
realizada segundo modificação do método de Milles e Misra (1983). A suspensão bacteriana foi
diluída em séries de 10 vezes com solução de NaCl 0,875% (m/v) em tubos de ensaio
sucessivamente até 10
8
vezes. As amostras foram homogeneizadas em vórtex e aplicadas em três
repetições de 20 µL em placas de ágar nutriente (AN). As placas foram incubadas por 24 horas
em estufa à temperatura de 30
o
C. A contagem foi efetuada em contador de colônias (Phoenix CP
608) para a diluição onde as colônias apresentavam-se isoladas com contagem entre de 30 e 300
colônias. Os procedimentos que requereram ambiente estéril foram realizados em câmara de
fluxo laminar vertical. Os resultados foram expressos em log UFC.mL
-1
. O pH dos meios CP,
CPG e CPN foram determinados ao final das 44 horas.
36
3.1.3 Ensaio de Atividade Proteolítica
A atividade proteolítica foi determinada utilizando caseína Hammerstein (Merk,
Darmstadt, Alemanha) como substrato, de acordo com modificação do método de Kunitz (1947).
A reação foi iniciada adicionando-se 150µL da enzima a 500 µL de solução 0,5% (m/v) de
caseína em tampão Tris-HCl 50 mM, CaCl
2
2 mM e pH 8,0 e pré-aquecida na temperatura do
ensaio. Após incubação por 20 minutos a 50°C a reação foi parada adicionando-se 650µL de
solução de TCA 10% (m/v), submetida a vórtex e centrifugada a 13000xg por 15 minutos. A
absorbância do sobrenadante foi determinada a 280 nm. Os controles foram preparados da mesma
forma exceto pela adição prévia da solução de TCA à enzima. Uma unidade (U) de atividade
proteolítica foi definida como a quantidade de enzima necessária para liberação de 1 µmol de
tirosina por minuto nas condições mencionadas acima. O coeficiente de extinção molar da
tirosina adotado foi de 1380 a 280 nm.
Neste trabalho, caseína foi utilizada para determinação da atividade proteolítica nos
ensaios de produção, monitoramento durante a purificação caracterização. A atividade
queratinolítica foi confirmada com keratin azure. O ensaio com caseína é um ensaio padrão para
a determinação da atividade proteolítica e segundo Cheng et al. (1995), as atividades
caseinolíticas e queratinolíticas estão correlacionadas, sendo que com caseína o método mostra-
se muito mais acurado e comparativo do que utilizando queratina insolúvel como substrato.
3.1.4 Ensaio de Atividade Queratinolítica
O substrato utilizado para determinação da atividade queratinolítica foi o substrato
insolúvel keratin azure (Sigma-Aldrich Chimie, St. Quentin Fallavier, France). Incubaram-se 500
µL das amostras da protease em uma suspensão de 5 mg de substrato em tampão Tris-HCl 100
mM, CaCl
2
2 mM e pH 8,5 durante 1 hora a 50°C. Em seguida os tubos foram centrifugados a
13000xg por 5 minutos e a absorbância do sobrenadante determinada a 595 nm. O controle foi
preparado da mesma forma exceto pela adição de tampão ao invés da enzima. Uma unidade
queratinolítica (U) foi definida como a quantidade de enzima necessária para aumentar a
absorbância (A
595
) em 0,01 unidades nas condições descritas acima.
37
3.1.5 Zimografia
A zimografia foi desenvolvida em gel de poliacrilamida contendo SDS e com 1mg/mL de
gelatina copolimerizada segundo modificação do método de Quesada et al. (1996). As amostras
de protease foram diluídas no tampão de amostra exceto a adição de agente redutor e
desnaturação por calor. SDS-PAGE segundo Laemmli et al. (1970) foi desenvolvida a 4°C em
gel de 7.5% de poliacrilamida com 1 mg.mL
-1
de gelatina que foi copolimerizada ao gel. Após a
eletroforese o gel foi lavado por 30 minutos com solução de Triton X-100 2,5% (m/v) seguido de
lavagem com Tris 50 mM pH 8,0 por mais 30 minutos e uma lavagem com H
2
O destilada por
mais 30 minutos. Após lavagem o gel foi incubado por 30 minutos a 50°C em tampão de
substrato (Tris 50mM; CaCl
2
2 mM e pH 8,0). O gel foi corado com solução de Azul de
Comassie R-250 e as bandas com atividade proteolítica aparecem como bandas claras em fundo
azul.
3.1.6 Efeito de inibidores de protease na atividade queratinolítica
Uma alíquota de 900 µL do sobrenadante de cultivo dos meios CP e CTrip foram
incubados por uma hora a 20 °C com os seguintes inibidores a uma concentração final de: 50 mM
de EDTA, e 1 mM de Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF). Após uma hora de incubação as
soluções de sobrenadante-inibidor foram adicionadas ao substrato e a atividade proteolítica
determinada juntamente com os brancos para cada tratamento em triplicata. O controle utilizado
foi a adição de H
2
O ao invés dos inibidores à enzima. A atividade do controle foi considerada
100% e a inibição como atividade relativa ao controle. Como a inibição para metaloproteases
pode ser reversível, a mesma concentração de EDTA foi adicionada ao tampão de reação com o
substrato.
3.1.7 Quantificação de proteína
Para determinação da concentração de proteína solúvel das amostras utilizou-se o método
descrito por Lowry et al. (1951) utilizando BSA como padrão.
38
3.1.8 Doseamento de glicose
A quantificação de glicose no sobrenadante dos meios contendo o carboidrato foi
determinada segundo modificação do método descrito por Somogyi (1944) e Nelson (1952),
utilizando D-glicose como padrão.
3.1.9 Análise Microscópica (Microscopia Eletrônica de Varredura)
O microrganismo Chryseobacterium sp. Kr6 (Genebank AY157745) foi pré-inoculado em
100 mL meio CP (0,5 g.L
-1
NaCl, 0,3 g.L
-1
K
2
HPO
4
, 0,4 g.L
-1
KH
2
PO
4
e 10 g.L
-1
de penas de
frango, pH 7,5) a 150 RPM e 30°C e após 20 horas de cultivo foi inoculado em meio CP sob
idênticas condições ao pré-inóculo. Foram retiradas, por filtração, alíquotas das penas em
suspensão em diferentes intervalos de tempo (0; 8; 18 e 36 horas) para análise microscópica. As
amostras foram pré-fixadas em uma solução de glutaraldeído 2,5% (v/v), paraformaldeído 2,5%
(v/v) em tampão cacodilato 50 mM pH 7 por 24 horas. Em seguida as amostras foram
equilibradas no mesmo tampão e pós-fixadas com tetróxido de ósmio (OsO
4
) por 1 hora. Após a
fixação as amostras foram desidratadas com soluções com concentrações crescentes de acetona
(30,50, 70, 90 e 100%) (v/v) e submetidas a estufa a 40°C até completa evaporação da acetona.
As amostras foram metalizadas com ouro e visualizadas em microscópio eletrônico de varredura
(MEV DSM940-A).
3.2 Purificação e Caracterização de uma Queratinase de Chryseobacterium sp. Kr6
3.2.1 Produção da Enzima
O microrganismo Chryseobacterium sp. Kr6 (Genebank AY157745) foi pré-inoculado em
100 mL meio CP (NaCl 0,5 g.L
-1
, K
2
HPO
4
0,3 g.L
-1
, KH
2
PO
4
0,4 g.L
-1
e de penas de frango 10
g.L
-1
, pH 7,5) a 150 RPM e 30°C. Antes de utilizadas as penas foram submetidas a lavagem com
água destilada e secas em estufa a 37°C. Os meios foram esterilizados por autoclave. Para
39
produção da enzima inocularam-se 10 mL do inóculo em 1L de meio CP, e o cultivo foi realizado
nas mesmas condições descritas acima por 20 horas.
3.2.2 Ensaios de Atividade Enzimática
3.2.2.1 Atividade Proteolítica
A atividade proteolítica foi determinada utilizando caseína Hammerstein (Merck,
Darmstadt, Alemanha) semelhante ao descrito no ítem 3.1.3.
3.2.2.2 Atividade Queratinolítica;
O substrato utilizado para determinação da atividade queratinolítica foi o substrato
insolúvel keratin azure, semelhante ao descrito no ítem 3.1.4.
3.2.3 Purificação
Após 20 horas de cultivo, o meio foi cenrtrifugado a 12000xg por 20 minutos a 4°C e o
sobrenadante foi filtrado através de membrana com poro de 0,22 µm de poro (Millipore corp.,
Bredford) para remoção completa das células. O filtrado foi utilizado como fonte de enzima crua.
A atividade durante a purificação foi monitorada utilizando caseína como substrato e a atividade
queratinolítica em cada etapa de purificação foi confirmada utilizando keratin azure (Sigma-
Aldrich Chimie, St. Quentin Fallavier, France) como substrato. Os procedimentos de purificação
quando possível foram realizados a 8°C.
3.2.3.1 Cromatografia de Interação Hidrofóbica
O filtrado foi ajustado a uma concentração de 1 M de (NH
4
)
2
SO
4
e pH 7,2 e em seguida
transferido a um fluxo de 0,5 mL.min
-1
a uma coluna “Phenyl Sepharose CL 4B” (2,4 x 8,0 cm)
previamente equilibrada em tampão fosfato 50 mM, pH 7,2 e (NH
4
)
2
SO
4
1M. A coluna foi eluída
com mesmo tampão a um fluxo de 1 mL.min
-1
, seguido de 250 mL de um gradiente de 1 a 0M de
40
(NH
4
)
2
SO
4
. Coletaram-se frações de 5 mL e a atividade foi monitorada utilizando caseína como
substrato. As frações com atividade foram agrupadas, dialisadas “overnight” a 4°C contra tampão
fosfato 10 mM e pH 7,2 e liofilizadas.
3.2.3.2 Cromatografia em Gel Filtração
As frações liofilizadas foram ressuspendidas em tampão fosfato 10 mM pH 7,2, aplicadas
a uma coluna gel filtração “Superose 12HR
TM
” (Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden)
utilizando sistema HPLC-ÄKTA-Purifier (Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden) e eluídas
com tampão fosfato 50mM e NaCl 50 mM a um fluxo de 0,5 mL.min
-1
. Coletaram-se frações de
500 µL e a atividade foi monitorada utilizando caseína como substrato. A coluna foi calibrada
utilizando padrões de peso molecular: BSA (66 KDa), álcool desidrogenase (150 KDa), β-
Amilase (200 KDa), Anidrase Carbônica (29 KDa) e Citocromo C (12,4 KDa). As frações após
gel filtração foram utilizadas como enzima pura para caracterização.
3.2.4 Técnicas Eletroforéticas
3.2.4.1 Determinação de Peso Molecular
A eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE) foi
realizada em gel de separação 12% e gel de empilhamento 4% de acrilamida/bisacrilamida
segundo descrito por Laemmli (1970). Utilizaram-se padrões de peso molecular de 10000 a
170000 Da (Fermentas Inc. Canadá), e o método de coloração com prata (SWITZER; MERRIL;
SHIFRIN; 1979). As amostras foram dessalinizadas antes da eletroforese contra água destilada
quando necessário e concentradas por liofilização.
3.2.4.2 Zimografia
A zimografia foi desenvolvida em gel de poliacrilamida contendo SDS e com 1mg.mL
-1
de gelatina copolimerizada segundo descrito no item 3.1.5.
41
3.2.5 Quantificação de proteína
Para determinação da concentração de proteína solúvel das amostras utilizou-se o método
descrito por Lowry et al. (1951) utilizando BSA como padrão. A concentração de proteína foi
também estimada assumindo que a absorbância de uma solução a 1% a 280 nm é igual de 10.
3.2.6 Caracterização
3.2.6.1 Determinação de pH ótimo
Para determinação do pH ótimo, utilizou-se a faixa de pH entre 6 a 10 com intervalos de
0,5 unidades. Tampão fosfato de sódio foi utilizado para pH de 5,5 a 7,5, Tris-HCl para pH de 8 a
9 e tampão carbonato-bicarbonato para pH de 9,5 a 10 em uma concentração final de 80 mM.
Caseína foi dissolvida a uma concentração de 2,5% (m/v) em H
2
O e 100µL desta solução foi
adicionada a 400µL de cada tampão. As diferentes soluções tampão-substrato (500µL) foram
incubadas com 150µL de solução de enzima e determinada atividade proteolítica. O ensaio e o
branco foram realizados em triplicata para cada valor de pH. Determinaram-se as atividades
relativas considerando-se como 100% o pH com maior atividade.
3.2.6.2 Determinação de Temperatura Ótima
A temperatura ótima de atividade proteolítica foi determinada em intervalos de 10°C nas
temperaturas de 30 a 100°C. A mistura de reação, exceto a enzima, foi previamente incubada na
temperatura requerida. O ensaio e o branco foram realizados em triplicata para cada temperatura.
Determinaram-se as atividades relativas considerando-se 100% a temperatura onde houve a
maior atividade.
42
3.2.6.3 Estabilidade Térmica
A estabilidade térmica foi determinada nas temperaturas de 37, 50 e 80°C em diferentes
intervalos de tempo (2; 10; 30; 60; 150 e 240 min). Uma alíquota de 5 mL da enzima foi
incubada em Banho Maria nas temperaturas apropriadas. Alíquotas foram retiradas nos diferentes
intervalos de tempo e resfriadas em gelo. Os ensaios de atividade proteolítica foram realizados
junto com os brancos para cada fração em triplicata. A fração que não sofreu tratamento térmico
foi considerada como 100% de atividade.
3.2.6.4 Efeito de Interferentes na atividade proteolítica
Uma alíquota de 900 µL da enzima purificada foi incubada durante uma hora a 20 °C com
os seguintes inibidores para uma concentração final de: 100 µM de Iodoacetamida; 10 mM e 50
mM de EDTA, 10 mM e 50 mM de EGTA; 1 mM de pepstatina; 1 mM de Fluoreto de
fenilmetilsulfonil (PMSF) e 10 mM de 1,10 orto-fenantrolina. 2 mM dos íons (CaCl
2
, ZnCl
2
,
MgCl
2
, AlCl
2
, CuCl
2
e CdCl
2
), 5% de DMSO e SDS e 5 mM de DTT e mecaptoetanol. Após uma
hora de incubação as soluções de enzima-interferente foram adicionadas ao substrato e a
atividade proteolítica determinada juntamente com os brancos para cada tratamento em triplicata.
O controle utilizado foi adição de H
2
O ao invés dos interferentes à enzima. A atividade do
controle foi considerada 100% e a inibição ou estímulo determinados como atividade relativa ao
controle. Como a inibição para metaloproteases pode ser reversível, a mesma concentração de
inibidor (EDTA, EGTA e 1,10 orto-fenantrolina) foi adicionada ao tampão de reação juntamente
com o substrato.
3.2.6.5 Determinação do metal
A proteína purificada foi exaustivamente dialisada contra água destilada por 24 horas a
uma temperatura de 4°C. Após diálise a presença do metal foi determinado em Espectrômetro
Varian SpectrAA-220 com atomizador de tungstênio e lâmpada de cátodo oco. As medidas foram
baseadas no comprimento de onda máximo de absorção de 324,8 e 213,9 nm para cobre e zinco
43
respectivamente. O branco analítico foi preparado dialisando-se, juntamente com a enzima, o
tampão em que a enzima se encontrava.
3.2.7 Identificação da Proteína
Após SDS-PAGE a banda com a proteína foi recortada do gel submetida a digestão
tríptica in gel de acordo com modificação do método descrito por VIRGINIA TECH CENTER
FOR GENOMICS. Os peptídeos foram extraídos, concentrados e submetidos à espectrometria de
massas.
3.2.7.1 Ionização a Lazer com MS com TOF de Alta Resolução (Maldi-Tof/MS)
A análise da amostra obtida por digestão tríptica foi preparada usando o método “dried
droplet”. A amostra foi acidificada pela adição de água/TFA (100:0,1) e mantida a temperatura
ambiente por alguns minutos até redução de volume por evaporação. A matriz, ácido α-Ciano-4-
hidroxicinâmico, foi preparada a 1% (m/v) em H
2
O/Acetonitrila 1/1 (v/v) contendo TFA 0,1% e
adicionada a amostra a temperatura ambiente. A análise foi determinada em MALDI-TOF
(Waters - Micromass, UK) espectrômetro de massas. A análise foi exclusivamente de íons
carregados positivamente por reflexão. Para avaliação dos dados, incluindo identificação dos
peptídeos utilizou-se Mascot Wizard (Matrix Science, London, UK) software.
3.2.7.2 Espectrometria de Massas em Tandem com Ionização por Electrospray (ESI-
MS/MS)
A análise ESI-MS/MS foi desenvolvida em equipamento Q-TOF (Micromass) acoplado
ao sistema cromatográfico CapLC®. Os peptídeos resultantes de digestão tríptica foram
dessalinizados usando uma coluna C-18 Opti-Pak (Waters). Os peptídeos foram eluídos
utilizando gradiente água/acetonitrila 0,1% de ácido fórmico e separados em uma coluna capilar
C-18. Os peptídeos multiplamente carregados foram submetidos a MS/MS. Os espectros MS/MS
foram processados usando o programa MaxEnt3 e manualmente usando o programa PepSeq
44
(Micromass). As condições foram: Fluxo da cromatografia de 200 nL.min
-1
, ionização com
voltagem capilar de 3 kV, fonte a 80°C e voltagem de cone de 40V.
3.2.8 Hidrólise de Substratos Protéicos Insolúveis
A atividade proteolítica da enzima purificada foi testada também com os substratos
insolúveis keratin azure e penas de frango. O ensaio de degradação de keratin azure foi
desenvolvido segundo item 3.2.2.2. Para verificar a atividade de hidrólise sobre penas nativas a
enzima purificada foi incubada com 0,5% (m/v) de penas moídas em tampão Tris-HCl 50 mM,
CaCl
2
2 mM e pH 8,5 em um volume final de 2 mL e outro tratamento adicionando 1% (v/v) de
β-mercaptoetanol a reação. A reação foi conduzida a 50°C durante 24 horas e interrompida
adicionando-se 500 µL de uma solução de TCA 50% (m/v), centrifugado a 13000 g.
Paralelamente um controle foi preparado da mesma maneira adicionando-se TCA 50% antes da
enzima. Os controle foram preparados da mesma maneira exceto pela adição de água ao invés da
enzima. A atividade foi determinada pela quantificação de peptídeos e aminoácidos solúveis
liberados durante a reação.
3.2.8.1 Método Colorimétrico para Quantificação e Aminoácidos Solúveis
A quantificação dos aminoácidos solúveis foi determinada adicionando-se 500 µL de
tampão citrato 100 mM e pH 5, 200 µL do reagente de ninhidrina 5% (m/v) e 1 mL de solução de
KCN 0,2 mM a 1 mL do sobrenadante descrito acima. A reação foi conduzida a 100°C por 20
minutos seguida de resfriamento e adição de 1 mL de etanol 60% (v/v). Fez-se a leitura a 570 nm
em espectrofotômetro (Beckman DU-640) e utilizou-se glicina como padrão.
3.2.8.2 Análise de Aminoácidos Solúveis por Cromatografia Líquida de Alta Resolução
(HPLC)
Os aminoácidos solúveis foram separados e analisados por HPLC de fase reversa em
equipamento Akta Purifier
®
(Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden). A coluna utilizada foi a
45
Spherisorb ODS-2 C18
®
e eluída em um gradiente de metanol e tampão fosfato pH 7,5 (Acetato
de Sódio 50 mM; Fosfato dissódico 50 mM; 1,5 mL de ácido acético; 20 mL tetraidrofurano e 20
mL metanol) a um fluxo de 800 µL/min. Durante o gradiente a proporção de metanol aumentou
de 20 a 28% entre 0 e 5 minutos, 28 a 58% entre 5 a 35 minutos, 58 a 75% entre 35 e 40 minutos,
75 a 95% entre 40 e 56 minutos, 95 a 96% entre 56 a 60 minutos e 96 a 100% entre 60 e 61
minutos. A eluição foi monitorada por detector de florescência (Shimadzu RF-350) operando
com um comprimento de onda de excitação e emissão de 250 nm e 388 nm respectivamente. A
amostra foi injetada após 2 minutos de incubação de 30µL de o-ftaldeído (OPA) com 10 µL da
amostra.
3.3 Identificação da Seqüência do gene da Queratinase de Chryseobacterium sp. Kr6
3.3.1 Extração de DNA Total
A extração de DNA total de Chryseobacterium sp. Kr6 foi realizada utilizando o kit
“DNA Extration Kit” (Fermentas Inc. Canadá) seguindo instruções do fabricante a partir de um
cultivo da bactéria em meio LB [triptona 1% (m/v), cloreto de sódio 1% (m/v), extrato de
levedura 0,5% (m/v)]. O DNA foi precipitado com 0,6 volumes de isopropanol e mantendo a -20
°C por 2 horas. Após centrifugação a 13000xg por 5 minutos o pellet foi lavado com etanol 70%
(v/v), recentrifugado, secado a temperatura ambiente e ressuspendido em 50 µL de tampão TE
(Tris-HCl e EDTA). Adicionou-se 15 µg de RNAse e a solução foi incubada por 1 hora a 37°C.
A concentração e a qualidade da extração foi monitorada em espectrofotômetro (Beckman
DU-640) a 260 e 280 nm. Considerou-se 1 unidade de DO
260
como 50 µg/mL
-1
de DNA e DO
260
/
DO
280
≥ 1,72 como DNA com bom grau de pureza (SAMBROOK; FRITSCH; MANIATIS,
1989). A integridade do DNA foi monitorada através de gel de agarose 1,2% (m/v) em TBE (Tris
400mM; Ácido Bórico 400 mM; EDTA 10 mM) corado com o corante fluorescente Brometo de
Etidium (0,5 µg.mL
-1
)
-
e observado em transiluminador com lâmpada de UV (Amersham
Pharmacia, Uppsala, Sweden).
46
3.3.2 Desenho dos Iniciadores Degenerados e Amplificação de DNA por PCR
Baseando-se na seqüência de dois peptídeos da queratinase (KHSFENFIEGK e
IDVEVEQGGIK) desenharam-se os seguintes iniciadores degenerados:
1. 5’-CAYTGNTTYGARAAYTTYATYGARGG-3’
2. 5’-CCYTCRATRAARTTYTCRAANCARTG-3’
3. 5’-GARGTNGARCARGGNGGNATNAAR-3’
4. 5’-YTTTRATNCCNCCYTGYTCNACYTC-3’
As reações de PCR foram realizadas para pares de iniciadores em volume final de 25 µL
contendo KCl 50 mM; Tris-HCl 20 mM e pH 8,4; MgCl
2
1,5 mM; 50 ng de DNA; 1 mM de cada
iniciador; dNTP 100 mM e 1,5 unidades de Taq DNA polimerase. As amplificações foram
conduzidas em GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystems, Norwalk, CT, EUA) com
desnaturação prévia de 95°C por 5 minutos, 40 ciclos de desnaturação a 95°C por 1 minuto,
anelamento a 55°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 1 minuto, finalizando com 6 minutos de
extensão. O resultado da reação foi monitorado através de eletroforese em gel de agarose 1,2%
(m/v) em TE, e o tamanho e concentração dos fragmentos amplificados foram determinados e
documentados através do programa Kodak
TM
Digital Science 1D.
3.3.3 Clonagem
O fragmento amplificado pela reação de PCR foi primeiramente extraído do gel de
agarose 1,2% (m/v) através do kit “GFX
TM
DNA and Gel Band Purification” (Amersham
Pharmacia, Uppsala, Sweden) e clonado utilizando o kit “InsT/Aclone
TM
PCr Product Cloning
Kit” (Fermentas Inc. Canadá) segundo recomendações dos fabricantes. A relação inserto e vetor
utilizada foi de 3:1.
3.3.4 Preparo de Células de E. coli Competentes por Cloreto de Rubídio
A linhagem foi multiplicada em meio LB até DO a 600 nm atingir valor entre 0,45 e 0,55.
O cultivo foi transferido para dois tubos, mantidos em gelo por 10 minutos e centrifugado a
3000xg por 10 minutos. As células foram ressuspendidas em 15 mL de solução RF1 (Acetato de
47
Potássio 30 mM; Cloreto de Rubídio 100 mM; Cloreto de Manganês 50 mM e glicerol 15%) e
incubadas em gelo por 15 minutos. A suspensão celular foi novamente centrifugada a 3000xg por
10 minutos. A massa celular foi ressuspendida em solução RF2 (MOPS 10 mM; Cloreto de
Rubídio 10 mM; Cloreto de Cálcio 75 mM e glicerol 15%) e incubada em gelo por 30 minutos.
Alíquotas de 100 µL de células competentes foram transferidas a tubos de 1,5 mL e armazenadas
a temperatura de -70°C.
3.3.5 Transformação de E. coli por Choque Térmico
Alíquotas 100 µL contendo células competentes foram transformadas com o vetor
pTZ57R contendo inserto da reação de PCR. As células congeladas foram mantidas no gelo por 5
minutos as quais 5 µL do vetor/fragmento foi adicionado. As células foram mantidas em gelo por
30 minutos e após submetidas a choque térmico a 42°C por 50 segundos, retornando
imediatamente ao gelo por mais 2 minutos. Adicionaram-se às células transformantes 950 µL de
meio LB e incubou-se a 37°C por 30 minutos. Após incubação as células foram inoculadas com
alça de Drigalski em placas com meio LB sólido seletivo (IPTG 0,5 mM; X-Gal 80 µg.mL
-1
e
ampicilina 100 µg.mL
-1
). As placas foram incubadas entre 16 e 24 horas até o surgimento de
colônias isoladas. As colônias transformadas com inserto/vetor (brancas) foram multiplicadas em
meio LB líquido com 100 µg.mL
-1
de ampicilina para isolamento plasmidial.
3.3.6 Extração de DNA Plasmidial
As colônias transformadas foram crescidas em meio LB líquido com ampicilina e
utilizadas para extração do DNA Plasmidial. A extração foi realizada utilizando Kit “Concert
Rapid Plasmid Purification Systens" (GibcoBRL, Life Technologies) conforme recomendações
do fabricante.
48
3.3.7 Seqüenciamento
Para a reação de sequenciamento foi utilizado o Kit ABI Prism
®
Big Dye
TM
(Applied
Biosystems, Foster City, CA, EUA) e as condições de da reação foram estabelecidas de acordo
com recomendações do fabricante. Os nucleotídeos marcados incorporados foram precipitados,
adicionando-se 30 µL de isopropanol e 10 µL de H
2
O destilada estéril aos 10 µL da reação de
amplificação. A reação foi homogeneizada e incubada a temperatura ambiente por 5 minutos.
Centrifugou-se a 1000 g por 20 minutos e descartado o sobrenadante. O precipitado foi lavado
com etanol 70% (v/v) e centrifugado por 5 minutos a 10000 g. O etanol foi aspirado e evaporado
e o precipitado foi ressuspendido em tampão Dextran loading solution (Promega) e utilizado para
seqüenciamento em ABI Prism 3100
TM
(Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). A
seqüência foi processada para retirar contaminação com vetor através do programa Vec Screen e
comparadas com banco de dados GenBank utilizando os programas BLASTn e BLASTx
(ALTSCHUL et al, 1997).
3.3.8 Extração de RNA Total
A bactéria foi inoculada em meio CP (0.5g.L
-1
NaCl, 0.3 g.L
-1
K
2
HPO
4
, 0.4 g.L
-1
KH
2
PO
4
e penas 10 g.L
-1
) e cultivada por 18 horas a 30 °C e 150 RPM. Após este período o meio foi
filtrado para remoção de sólidos em suspensão. As células foram coletadas pipetando-se 10 mL
da cultura bacteriana em tubos contendo 1,25 mL de solução de fenol saturado 5%(m/v) e
centrifugadas a 6800xg a 4°C. As células foram lisadas ressuspendendo-se o pellet em 800 µL de
TE pH 8 contendo 400 µg de lisozima. Adicionou-se 80 µL de solução de SDS 10% (m/v) e a
amostra foi incubada a 64°C por 2 minutos. Após incubação, 80 µL de Acetato de Sódio 1M pH
5,5 foi adicionado. Adicionou-se igual volume de fenol saturado e os tubos foram incubados a
64°C por 6 minutos, homogeneizando a cada 40 segundos. Os tubos foram resfriados em gelo e
centrifugados a 20000xg por 10 minutos a 4°C. A fase aquosa foi transferida para tubos novos,
adicionando-se igual volume de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1 v:v) com posterior
centrifugação a 20000xg por 5 minutos a 4°C. A fase aquosa foi separada e adicionou-se Acetato
de Sódio 300 mM pH 5,5, EDTA 1mM e 2,5 volumes de etanol absoluto “overnight” a -20°C. Os
49
pellets foram lavados com etanol 80% (v/v),. Secos a temperatura ambiente e ressuspendidos em
100 µL de H
2
O tratada com dietil pirocarbonato (DEPC).
As amostras de RNA total foram tratadas com 10 U de DNAse I (Boehringer Mannhein),
40 U de inibidor de RNAse (Stratagene), em Tris-HCL 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM e MgCl
2
20
mM, incubando-se por 1,5 horas a 37°C. O RNA foi extraído uma vez com fenol saturado,
seguido de uma extração com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1, v:v:v) e duas vezes
com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1, v:v). O sobrenadante foi precipitado com acetato de
sódio 300 mM pH 5,5 e 2,5 volumes de etanol absoluto. Os pellets foram lavados com 1 mL de
etanol 80% (v/v) secos a temperatura ambiente e ressuspendidos em 50 µL de H
2
O tratada com
DEPC.
A concentração de RNA total foi determinada por espectrofotometria a 260 nm
considerando-se 1 DO
260
igual a 50 µg.mL
-1
de RNA. (SAMBROOK; FRITSCH; MANIATIS,
1989). A qualidade do RNA foi determinada através das razões das absorbâncias A
260
/A
280
. A
integridade foi verificada através de eletroforese em gel de agarose 1,2% (m/v) e corados com
brometo de etidium (50 µg/mL
-1
).
3.3.9 Síntese da Primeira Fita de cDNA
A síntese da primeira fita de cDNA foi feita utilizando o kit “Superscript
TM
Preamplification system for first strand cDNA synthesis” (Gibco-BRL), conforme instruções do
fabricante. Partiu-se de 2 µg de RNA total extraído segundo item 3.3.3, 100 ng dos
hexaoligonucleotídeos aleatórios e H
2
O tratada com DEPC para um volume final de 12 µL. A
solução foi aquecida a 70°C por 10 minutos e então resfriada em gelo por 1 minuto. Adicionou-se
então, tampão para PCR, MgCl
2
2,5 mM, dNTPs 500 µM e DTT 10 mM. As amostras foram
incubadas por 5 minutos a 25°C, 50 minutos a 42 °C e, em seguida, as enzimas foram inativadas
a 70°C por 15 minutos. Em seguida foram adicionados 2 U de RNAse H às reações incubando-se
a 37°C por 20 minutos para degradação das fitas de RNA dos híbridos RNA:cDNA formados.
50
3.3.10 Amplificação do cDNA
Para verificação da possível expressão do gene da queratinase em estudo utilizou-se o
cDNA sintetizado para amplificação com os iniciadores degenerados testados na amplificação do
DNA. As condições de amplificação foram as mesmas descritas no ítem 3.3.3 partindo de 25 ng
de cDNA.
3.4 Análise dos Resultados
As diferenças entre as médias nos experimentos foram realizadas de acordo com o método
de Tuckey, utilizando o programa SAS versão 8.2, módulo “proc glm”.
51
4 RESULTADOS
4.1 Efeito das Condições Nutricionais no Crescimento e Atividade Proteolítica
4.1.1 Crescimento e Atividade Enzimática
Diferentes fontes de carbono e nitrogênio foram empregadas para avaliar o crescimento
(Figura 4.1) e a atividade de proteases extracelulares (Figura 4.2) da linhagem Chryseobacterium
sp. Kr6 durante 44 horas de cultivo. No meio com glicose como única fonte de carbono as células
mantiveram-se estáveis, com crescimento lento durante o tempo de monitoramento. Com caseína
(Ccas), houve um crescimento inicial nas primeiras horas, mas logo a bactéria entrou em fase
estacionária. Quando utilizado o meio com penas (CP) e penas mais glicose (CPG) não houve
diferença de crescimento com um máximo de aproximadamente 10
10
UFC.mL
-1
, entrando na fase
estacionária a partir das 20 horas de cultivo. Em meio com penas suplementado com NH
4
Cl
como fonte extra de nitrogênio o crescimento foi um pouco mais lento que CP e CPG e com
triptona (Ctrip) a fase lag foi menor em relação aos outros, porém se assemelhando à CP e CPG
após 10 horas de crescimento. O pH dos meios crescendo em queratina ao final das 44 horas
chegou a 8,3.
Quando monitorada a atividade enzimática (Figura 4.2) nos meios Ccas e Cgli não foi
detectada atividade proteolítica durante o monitoramento. No meio Ctrip nas primeiras 5 horas de
cultivo já pôde ser medida atividade proteolítica chegando a um máximo no final da fase
exponencial de aproximadamente 250 U.mL
-1
. Em CP, CPG e CPN o máximo também ocorreu
no final da fase exponencial (20 horas) com uma maior atividade sempre na ordem
CP>CPG>CPN, chegando a mais de 400 U.mL
-1
em CP. Estes resultados se confirmam através
da solubilização de proteínas no meio (Figura 4.3) onde a solubilização foi maior e chegou a 946,
626 e 520 µg.mL
-1
para os meios CP, CPG e CPN respectivamente, no final das 44 horas de
cultivo. Quando analisada a concentração de glicose residual (Figura 4.4) nos meio de cultivo em
que esta foi adicionada observou-se que no meio com penas suplementado com glicose (CPG)
houve um consumo de cerca de 50% durante o cultivo de 44 horas, enquanto que praticamente
não houve consumo muito baixo no meio com glicose como fonte de carbono.
52
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
9
9,5
10
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (h)
Log UFC.mL -1
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (h)
Atividade Protelítica (U.mL-1)
Figura 4.1 – Curva de crescimento de Chryseobacterium sp. Kr6 em diferentes meios de cultivo.
(●) Triptona; (□ ) CPG; (♦) CP; (∆) CPN; (x) Ccas e (▲) e CGli a 30°C, 150 RPM e
pH inicial 7.
Figura 4.2 – Atividade Proteolítica durante curva de crescimento de Chryseobacterium sp. Kr6
em diferentes meios de cultivo. (●) Triptona; (□ ) CPG; (♦) CP e (∆) CPN; a 30°C,
150 RPM e pH inicial de 7.
53
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (h)
Proteína (µg.mL-1)
Figura 4.3 – Liberação de proteína solúvel para o meio durante curva de crescimento de
Chryseobacterium sp. Kr6 nos meios: (♦) CP; (□) CPG e CPN(▲) cultivado a
30°C, 150 RPM e pH inicial 7.
Figura 4.4 – Concentração de glicose residual no meio de cultivo: (□) CPG e (●) Cgli durante
curva de crescimento de Chryseobacterium sp. Kr6 cultivado a 30°C, 150 RPM e
pH inicial 7.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (h)
Glicose (µg.mL-1)
54
Quando monitorada a atividade queratinolítica com o substrato keratin azure após 20
horas de cultivo, os sobrenadantes dos meios CP, CPG, CPN e Ctrip mostraram atividade
queratinolítica de cerca de 25 U.mL
-1
não apresentando diferença significativa entre eles. A
zimografia (Figura 4.5) dos sobrenadantes de cultivo dos meios Ctrip, CP, CPG e CPN mostrou
várias bandas de atividade proteolítica e com diferentes perfis destas, principalmente entre o
meio Ctrip e os demais.
4.1.2 Efeito de inibidores na atividade proteolítica
A inibição da atividade proteolítica total no sobrenadante de cultivo em CP com os
inibidores EDTA e PMSF foi de 90 e 10% respectivamente. Quando testado o mesmo efeito no
sobrenadante de cultivo em Ctrip a inibição foi de 30% para ambos inibidores.
4.1.3 Análise Microscópica
A evolução da colonização bacteriana, durante o cultivo de Chryseobacterium sp. Kr6
(Figura 4.6), foi avaliada também através de análise microscópicas. Primeiramente visualizou-se
a integridade das fibras de queratina sem inoculação. Após as primeiras 8 horas de cultivo houve
uma alteração na estrutura das fibras mas com visualização de poucas células. Após 18 horas o
número de células presentes aumentou consideravelmente com pontos de degradação e presença
apenas da ráquis da pena no meio. Com 36 horas visualiza-se a ráquis bastante degradada. Na
figura 4.7, em outra imagem, após 18 horas, visualiza-se intensa colonização com formação de
uma espécie de filme de células sobre a superfície da ráquis da pena.
4.2 Purificação e Caracterização da Queratinase de Chryseobacterium sp. Kr6
4.2.1 Purificação
Após cultivo em meio CP, o sobrenadante foi submetido à cromatografia de interação
hidrofóbica. Houve resolução em três picos, HIC1, HIC2 e HIC3 (Figura 4.8), com
55
B
A
Figura 4.5 – Zimografia das proteases secretadas pela linhagem Chryseobacterium sp. Kr6
cultivada nos meios: A – Ctrip (1,2,5 e 6); B – CP (3,4,5 e 6); C – CPG (3,4,5 e 6) e
D – CPN (3,4,5 e 6) após 20 horas de cultivo.
A B C D
1
2
3
4
5
6
56
A
B
Figura 4.6 - Micrografia das penas em suspensão após cultivo de Chryseobacterium sp. Kr6 em
meio CP em diferentes tempos de coleta: (A)- 0; (B)- 8; (C)- 18 e (D)- 36 horas.
Aumento de 2000 vezes. O tamanho das células bacterianas é de 1 µm. Q – fibra de
queratina, C – célula de Chryseobacterium sp. Kr6 e R – Ráquis da pena.
Q
C
R
C
Q
C
R
R
57
Figura 4.7 - Micrografia das penas em suspensão após cultivo de Chryseobacterium sp. Kr6 de
18 horas em meio CP. (A)- aumento de 1000 vezes e (B)- aumento de 2000 vezes. O
tamanho das células bacterianas é de 1 µm. Q – fibra de queratina, C – célula de
Chryseobacterium sp. Kr6 e R – Ráquis da pena
C
C
R
58
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1020304050
Fração
mA (280nm)
0
5
10
15
20
25
30
35
Atividade (U.mL-1)
0
50
100
150
200
250
0
2
4
7
9
11
13
15
18
20
22
V
olume (mL)
mA(280 nm)
0
10
20
30
40
50
60
Activity (U.mL-1)
Figura 4.8 - Perfil de eluição em cromatografia de Interação hidrofóbica em coluna Phenyl-
Sepharose das proteases de Chryseobacterium sp.A coluna foi eluída com tampão
fosfato gradiente de 1 a 0 M de (NH
4
)
2
SO
3
(- -) e monitorada absorbância a 280
nm (○) e atividade proteolítica (●).
Figura 4.9 - Perfil de eluição da cromatografia em Gel-filtração (Superose 12 HR
TM
) do pico
HIC1. A coluna foi eluída com tampão fosfato 100 mM e NaCl 50 mM e as frações
monitoradas para absorbância a 280 nm () e atividade (- -).
1
0
,
75
0
,
5
0
,
25
0
HIC1
HIC2
HIC3
Q1
59
atividade proteolítica, que foram eluídos nas concentrações aproximadas de 0,5 M; 0,17 M e 0 M
de sulfato de amônio respectivamente durante o gradiente. As frações correspondentes ao pico
HIC1 que foram concentradas e aplicadas a seguir na coluna de gel filtração, resultaram em um
pico (Q1) com atividade proteolítica (Figura 4.9). Q1 foi submetida a SDS-PAGE e mostrou-se
como uma única banda homogênea e a atividade proteolítica foi visualizada pela zimografia
(Figura 4.10). As frações deste pico foram utilizadas para caracterização. Nota-se que a atividade
proteolítica total no extrato cru provém de mais de uma protease, portanto cálculos de
enriquecimento da enzima tornam-se um tanto ambíguos. O rendimento final de purificação foi
de 1,18%, no entanto houve um aumento na atividade específica do extrato cru para a enzima
purificada de 168 para 2406 U.mg
-1
(Tabela 4.1), com um fator de purificação de 14,26 vezes.
Quando determinada a atividade queratinolítica com keratin azure como substrato a atividade
específica foi de 967 U.mg
-1
.
4.2.2 Caracterização da Queratinase
4.2.2.1 Determinação do Peso Molecular
O peso molecular relativo da protease Q1 foi estimado comparando-se a mobilidade
eletroforética com os padrões de peso molecular conhecidos, através de SDS-PAGE (Figura
4.10). A enzima apresentou-se como uma banda monomérica de aproximadamente 64 KDa.
4.2.2.2 Efeitos da Temperatura e pH na atividade e Estabilidade Térmica da Protease
A enzima apresentou-se ativa numa variação de temperatura (30 a 60°C) e pH (7,5 a 9,5)
com temperatura e pH ótimos de 50°C e 8,5 respectivamente (Figura 4.11 e 4.12). A enzima
manteve-se estável a 37°C por mais de 3 horas com mais de 80% da atividade inicial. A 50°C,
após 3 horas 50% da atividade ainda foi detectada, enquanto que a 80°C a enzima foi
completamente inativada nos primeiros minutos de incubação (Figura 4.13).
60
Figura 4.10 - SDS-PAGE da queratinase Q1 de Chryseobacterium sp. Kr6. A - Marcador de Peso
Molecular (170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 e 10 KDa); B - Q1 purificada e C -
Zimografia de Q1 purificada.
100KDa
70KDa
55KDa
A B
C
61
0
20
40
60
80
100
120
5,566,577,588,599,51010,5
pH
Atividade Relativa (%)
Tabela 4.1 - Purificação da queratinase de Chryseobacterium sp. Kr6.
* Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade necessária de enzima necessária para liberar 1 µmol de
tirosina por minuto, utilizando caseína como substrato.
Fase
Proteína
total
(mg)
Atividade
Total
(Unidades)*
Atividade
Específica
(U.mg
-1
)
Purificação
(vezes)
Rendimento
(%)
Enzima
crua
2796
471867
168,77
1
100
Phenyl
Sepharose
Hic1
11,15 6162
552,45
3,27
1,31
Superose 12 HR
Q1
2,30 5545
2406,68
14,26
1,18
62
0
20
40
60
80
100
120
20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temperatura (°C)
Atividade Relativa (%)
Figura 4.11 - Determinação do pH ótimo para protease Q1 (●) após purificação. Atividade
determinada a 50°C utilizando caseína como substrato.
Figura 4.12 - Determinação de temperatura ótima para protease Q1 (●) após purificação.
Atividade determinada em pH 8,5 utilizando caseína como substrato.
63
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200 250
Tempo (min)
Atividade Relativa (%)
Figura 4.13 - Determinação de Estabilidade Térmica da queratinase Q1 nas temperaturas de 37°C
(●), 50°C (■) e 80°C (▲) após purificação. Atividade determinada utilizando
caseína como substrato.
64
4.2.2.3 Efeito de Interferentes
O efeito de vários inibidores e interferentes na atividade proteolítica da queratinase Q1 foi
examinado e está listado na tabela 4.2. O inibidor de serina protease (PMSF) e cisteína protease
(Iodoacetamida) exerceram pouco efeito sobre a atividade enzimática com 5 e 6% de inibição
respectivamente. Os quelantes de metal (EDTA, EGTA e 1,10-fenantrolina) exerceram efeito
inibitório sobre a enzima, sendo que com 1,10 orto-fenantrolina houve inibição total. EGTA e
EDTA tiveram diferentes efeitos inibitórios sobre a atividade. EDTA na concentração de 10 mM
inibiu somente 35% da atividade, enquanto que a 50 mM a inibição foi de 81%. EGTA nas
concentrações de 10 e 50 mM inibiu 71 e 77% da atividade. Na presença dos íons Ca
++
, Cd
++
e
Mg
++
a atividade relativa foi de 355, 123 e 114% respectivamente. No entanto, com Al
++
, Zn
++
e
Cu
++
a atividade relativa foi de 72, 64 e 24% respectivamente. A queratinase mostrou-se instável
na presença de agentes redutores. Não foi detectada atividade com mercaptoetanol e, na presença
DTT a atividade residual foi de 23%. O solvente orgânico DMSO causou um pequeno aumento
na atividade.
4.2.2.4 Determinação do Metal
A confirmação da presença de Zn na proteína foi realizada através de Espectrometria
Atômica. Através da análise qualitativa do provável metal ligado ao sítio catalítico da enzima,
baseando-se no comprimento de onda máximo de absorção para cobre e zinco, a presença de
Zn
++
foi cerca de 17 vezes maior que o branco analítico, enquanto que para cobre o aumento foi
de apenas 2 vezes.
4.2.2.5 Hidrólise de Substratos Insolúveis
A atividade hidrolítica sobre substratos insolúveis foi verificada com os substratos keratin
azure e penas nativas. Q1 foi capaz de hidrolisar o substrato keratin azure com uma atividade
específica de 967 U.mg
-1
conforme citado no item 4.2.1. Quando testada a capacidade de
hidrólise de queratina em penas nativas, tanto o teste colorimétrico com ninhidrina quanto as
análises em HPLC, não detectaram a liberação de peptídeos e aminoácidos solúveis da reação
quando comparados aos controles.
65
Tabela 4.2 - Influência de Inibidores, metais e compostos na atividade proteolítica de Q1.
Interferente Concentração P1-Atividade Residual
(%)
Nenhum
-
100
EDTA 10mM 65
50mM 19
EGTA 10mM 29
50Mm 23
Iodoacetamida 100µM 95
PMSF 1mM 91
1,10-fenantrolina 10mM 0
Ca
++
2mM 355
Mg
++
2mM 114
Al
++
2mM 72
Zn
++
2mM 64
Cu
++
2mM 24
Hg
++
2mM 0
MeSH 5mM 0
DTT 5mM 33
DMSO 5% 111
SDS 5% 0
66
4.2.2.6 Identificação da queratinase
A protease purificada foi extraída do gel, hidrolisada com tripsina e os peptídeos
submetidos a Espectrometria de Massas. A análise de “finger print” dos peptídeos resultantes de
digestão tríptica através da espectrometria de massas não mostrou homologia significativa entre a
queratinase Q1 e outras proteases dificultando a identificação da proteína. Através de Ionização
por Electrospray foi gerada a seqüência de 23 peptídeos (Tabela 4.3). As seqüências não
apresentaram similaridade significativa para identificação da proteína em pesquisas nos diversos
bancos de dados de proteínas, mas algumas seqüências internas de alguns peptídeos mostraram
similaridade a regiões conservadas à família das metaloproteases M14 (Figura 4.14) tanto para o
sítio de ligação ao metal (peptídeo 8 - KHSFENFIEGK) como para sítio ativo (peptídeo 16 -
RRIDVEVEQGGIKL
) (BARRETT; RAWLINGS; O´BRIEN, 2001). Outra observação na
análise das seqüências internas dos peptídeos foi a presença da seqüência ácido aspártico-serina
(DS*) encontrada no peptídeo 5 (KGSSADS*PNSEEK). Esta seqüência tem sido referida como
seqüência consenso para orto-glicosilações em proteínas do gênero Chryseobacterium
meningosepticum (PLUMMER; TARENTINO; HAUER, 1995).
4.3 Identificação do gene da Queratinase de Chryseobacterium sp. Kr6
4.3.1 Amplificação do DNA com os Iniciadores Degenerados
O DNA extraído foi submetido a PCR utilizando os iniciadores degenerados, desenhados
com base na seqüência de dois peptídeos resultantes da digestão tríptica seqüenciados. A figura
4.15 mostra o fragmento amplificado pela PCR. A amplificação, nas condições da reação
testadas, foi positiva somente quando utilizados os iniciadores 1 e 3 e o tamanho do fragmento
foi de aproximadamente 470 pares de base (pb).
67
↓
↓
↓
*
Família Organismo
KHSFENFIEGK- - LVQLNRQ
- -NTVSARIHR - - RRIDVEVEQGG
- Chryseobacterium sp. Kr6
145
IHSGEIDGKDA- - NLNLNRD - -PDLYIDIHV - - KGIDYRVEQSP
M14X
- Shewanella frigidimarina
111
IHPGEIPGKDA - -NLNLNRD - -PDLIVDTHD - - QGFETTLELSA
M14X
- Gloeobacter violaceus
186
IHSREWITHAT - -GVDLN
R
N - -FKAMISIHS - - IKYAFSFELRD
M14A
- Mus musculus
Tabela 4.3 – Tabela da seqüência dos peptídeos resultantes de digestão tríptica da queratinase Q1
Figura 4.14 - Seqüência de peptídeos resultantes de digestão tríptica de Q1 de Chryseobacterium
sp. Kr6. As seqüências foram alinhadas com outras proteases pertencentes a família
M14. (↓) indica o sítio obrigatório de ligação ao metal e (*)indica o resíduo
obrigatório do sítio ativo.
Peptídeos Obtidos por ESI - MS/MS
1- VVTVNDKIIPK 13- EAAMRGDVPGLVK
2- QATNKPVVGVGR 14- KGSKVVAVLTGNGLKD
3- EVTESCKSSQQ 15- RVGSDLTSLVPNIKT
4- THLLQDKIIVR 16- RRIDVEVEQGGIKL
5- KGSSADSPNSEEK 17- RSLQAAGLEVTLIKD
6- AEDFPFVLGQGR 18- RRLSELDNIVGVKD
7- LSLKWLFAMAR 19- DIIIETRPNGNTVSARIHR
8- KHSFENFIEGK 20- RAALEAVCYQTRDLLEAMHKD
9- RALSEAERAIAALKS 21- TVPLFQDAVNFVGKTVANGGK
10- KGLTGKLAEEVLGRA 22- KEVNALMALFMQALDLEVK
11- QKLSDLEPQER 23- NAATGDLFSAQVTRGDAEALR
12- RKVMELLVQLNRQ
68
Figura 4.15 – Produto de amplificação do DNA de Chryseobacterium sp. Kr6 com os
diversos iniciadores degenerados. MM: Marcador de massa molecular
(O´Gene Ruler
TM
-1kb DNA Ladder – Fermentas Inc. – Canadá); 1:
Iniciadores 1 e 3; 2: Iniciadores 1 e 4; 3: Iniciadores 2 e 3; 4: Iniciadores 2 e
4; 5: Iniciador 1; 6: Iniciador 2; 7: Iniciador 3; 8: Iniciador 4; 9: Controle sem
DNA.
500
250
1000
750
pb MM 1 2 3 4 5 6 7 8
9
69
4.3.2 Clonagem e Seqüenciamento
O fragmento amplificado pela PCR foi extraído do gel, ligado ao vetor e clonado.
Selecionaram-se 6 clones e o DNA plasmidial extraído dos clones foi utilizado para
seqüenciamento. O seqüenciamento foi realizado para ambos lados da fitas de todos os clones,
efetuando comparações entre as seqüências “forward” e “reverse” para correções necessárias.
Após eliminação da seqüência pertencente ao vetor obteve-se a seguinte seqüência:
5´─CAATGGTTCGAGAATTTTATTGAGGGGCCTGTCCTGNCTTTGGTTGGTAAATACACTCCTGA
GATTACTGCGGGCATTGAAATACGCAATAAAACAGGCTGCATTCAGATCTCTGCTGAACTCTTCA
AAACCGATCGTATGGGTAAGCCCGTGTTTGGCAATTTATGAAGCTCAAGCTTTTTTGATTCATGA
ATGAACTTTTGAAGTCTTATTTCGATCCGTTTCAAAAGCCTCCATTTTTTGTTGTAACTCCTTTT
GGAAATATCCAGCCCGGCCAGTTTTCTCAGATCTTTATTAAGACGGTCGCTTCTGAAATCATTTT
GCCCGACATCCTTGCGAATGACGGGAGAAACTTCATTCAGAAATGTTTCAATGCCATCTGCCGTA
TGGTAAGAACTTTCTTTTTCACTGATCCTGAAGATTTCAATGGCTT─3´
Na seqüência do inserto foi localizado somente a seqüência do iniciador 1 (negrito), sendo
que a ligação do iniciador 3 pode ter sido inespecífica.
Quando analisada a seqüência, os resultados de homologia foram muito baixos, sendo que
utilizando o programa BLASTn apresentou maior homologia com o DNA genômico de Bacillus
clausii KSM-K16
com um valor de “E”(e-value) de 1,4. Quando utilizado o programa BLASTx
a maior homologia foi a uma proteína GGDEF de Clostridium beijerincki NCIMB 8052 com um
valor de
“E” (e-value) de 0,75.
A seqüência foi também traduzida, utilizando quadro de leitura a partir da primeira base
do iniciador um, através do programa “Translator” (http://www.justbio.com
). A partir da
seqüência do transcrito alinharam-se as seqüências dos peptídeos (Tabela 4.3) resultantes da
espectrometria de massas utilizando o programa “Pairwise Sequence Alignment”
(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu
) e não houve alinhamento dos peptídeos com a seqüência
traduzida.
4.3.3 Extração de RNA e amplificação do cDNA
O RNA Chryseobacterium sp. Kr6 foi extraído, monitorada sua qualidade em
espectrofotômetro e determinada sua integridade através de eletroforese em gel de agarose como
70
mostrado na figura 4.16. A partir do RNA íntegro foi sintetizada a primeira fita de cDNA e esta
foi submetida a PCR, utilizando as mesmas condições descritas para o DNA genômico, com o par
de iniciadores 1 e 3. O produto da reação foi a amplificação de um fragmento com mesmo
tamanho do amplificado com o DNA genômico, visualizado através de eletroforese em gel de
agarose (Figura 4.17), e sugerindo que a seqüência em estudo está sendo expressa nas condições
de cultivo empregadas.
71
500
250
1000
750
pb
MM 1 2 3
Figura 4.16 – Extração de RNA total de Chryseobacterium sp. Kr6 cultivado em meios com
penas como única fonte de carbono e nitrogênio.
Figura 4.17 – Produtos de amplificação utilizando par de iniciadores degenerados 1 e 3 MM:
Marcador de massa molecular (O´Gene Ruler
TM
-1kb DNA Ladder – Fermentas
Inc. – Canadá); 1: DNA de Chryseobacterium sp. Kr6 como seqüência molde; 2:
cDNA de Chryseobacterium sp. Kr6 como seqüência molde e 3: Controle sem fita
molde.
72
5 DISCUSSÃO
As proteases, principalmente as extracelulares, têm um papel nutricional importante para
todos os organismos, pois são responsáveis pela hidrólise de polipeptídeos a peptídeos menores e
aminoácidos, viabilizando sua absorção pelas células (RAO et al., 1998). Bactérias do gênero
Chryseobacterium têm sido associadas à atividade proteolítica (VENTER; OSTHOFF;
LITTHAUER, 1999, YAMAGUCHI; YOKOE, 2000, LIJNEN et al., 2000) e a linhagem
Chryseobacterium sp. Kr6 teve suas proteases caracterizadas quanto à hidrólise de queratina de
penas de frango (RIFFEL et al., 2003). Esta bactéria pôde crescer em meio utilizando as penas de
frango, de constituição quase que exclusivamente protéica, como única fonte de energia (meio
CP). Essa característica mostra adaptação à utilização de queratina como nutriente, pois a
proteína foi metabolizada mesmo na presença de um açúcar (Figura 4.4) no meio CPG. Uma
certa especificidade por queratina também foi verificada, pois uma vez substituída por caseína
(Ccas), o crescimento bacteriano foi bem menos pronunciado. Com a utilização de caseína
hidrolisada (Ctrip), um substrato mais prontamente disponível, o crescimento foi o mais rápido,
comprovando a possibilidade de crescimento com fonte protéica como único nutriente.
De modo similar a outros microrganismos que degradam material protéico, durante o
cultivo, nos meios contendo penas, houve um aumento no pH. Esse é um mecanismo utilizado
por microrganismos queratinolíticos de eliminação do excesso de nitrogênio, através da
deaminação e produção de amônia, refletindo a utilização da proteína pelo microrganismo.
Alguns autores inclusive classificam o grau de queratinólise é proporcional ao aumento do pH, e
que essa alcalinização pode estar também auxiliando na degradação da queratina (KUNERT,
2000).
A atividade proteolítica também foi proporcional ao crescimento microbiano (Figura 4.2),
sendo que os máximos de atividade foram atingidos sempre no final da fase logarítmica de
crescimento, semelhante ao descrito para vários microrganismos (CHENG et al., 1995,
MACFARLANE; MACFARLANE, 1992), e indicando que as proteases têm importantância do
ponto de vista nutricional para esta linhagem, viabilizando seu crescimento através da hidrólise
protéica.
A observação da zimografia (Figura 4.5), reforça a importância das proteases secretadas.
Várias bandas de atividade, com diferentes pesos moleculares, foram visualizadas na zimografia
73
dos sobrenadantes de cultivo de Chryseobacterium sp. Kr6. Outras bactérias também produzem
mais de uma protease extracelular, por exemplo, Butyrivibrio fibrisolvens chega aproduzir mais
de dez proteases (STRYDOM; MACKIE; WOODS, 1986) e no sobrenadante de cultivo de
Kytococcus sedentarius
são encontradas duas proteases com atividade queratinolítica
(LONGSHAW et al., 2002). Os perfis destas bandas também se mostraram diferentes. Algumas
delas apareceram diferencialmente entre os tratamentos, ou seja, diferentes proteases podem estar
sendo produzidas dependendo da fonte protéica disponível. Destas não se pode afirmar o número
exato de proteases correspondentes a produtos gênicos diferentes, pois uma protease pode ser
modificada por proteólise extracelular e manter atividade residual. A diferença do padrão de
inibição da atividade proteolítica dos sobrenadantes dos meios CP (90% de inibição por EDTA e
10 % por PMSF) e Ctrip (33% de inibição por EDTA e 31 % por PMSF) reforça a tese de que há
uma composição diferente de proteases quando Chryseobacterium sp. Kr6 é cultivado sob
diferentes condições nutricionais. Têm-se observado que, para muitos microrganismos, a síntese
destas enzimas extracelulares pode ser constitutiva ou parcialmente induzida por proteínas ou
peptídeos (CHENG et al, 1995, WANG; SHIH, 1999). El-Refai et al. (2005) demonstraram que
proteases queratinolíticas em Bacillus pumilus são altamente induzidas na presença de queratina
e para Chrysosporium keratinophilum a indução é parcial (DOZIE; OKEKE; UNAEZE, 1994),
com as proteases queratinolíticas ficando aderidas às células durante expressão constitutiva.
Quando a queratina está presente, como indutor, elas são secretadas para o meio extracelular.
Para Chryseobacterium sp Kr6, as proteases foram induzidas pela queratina, pois em sua
presença observou-se uma atividade proteolítica muito maior (Figura 4.2) e o padrão de bandas
de atividade observado através da zimografia também apresentou-se diferente, quando
comparados ao meio sem queratina.
Em meio com queratina suplementado de glicose (CPG) houve uma redução na atividade
enzimática. As enzimas induzidas, quando submetidas à fonte extra de carbono, sofrem repressão
catabólica. Esse comportamento é comumente encontrado em espécies do gênero Bacillus.
Espécies desse gênero usam preferencialmente glicose como fonte de energia, portanto, a
biossíntese de enzimas envolvidas no catabolismo protéico só é observado na ausência de fontes
de carbono facilmente metabolizáveis, como a glicose (STULKE; HILEN, 2000). O mecanismo
de repressão pode também ser parcial, onde a expressão é somente diminuída, como acontece
com os microrganismos produtores de proteases, Staphylococcus aureus (YOSHIKAWA et al.,
74
1974), Pseudomonas aeruginosa (WHOOLEY; O’CALLAGHAN; MC´LONGHLIN, 1983) e
Vibrio sp. SA1 (WIERSMA; HANSEN; HARDER, 1978), e inclusive com alguns produtores de
proteases queratinolíticas (queratinases), Streptomyces fradie (NOVAL; NICKERSON, 1958),
Bacillus licheniformis (WANG; SHIH, 1999) e Microbacterium sp. (THYS et al., 2004). A
presença de amônio como fonte extra de nitrogênio também reduziu a atividade proteolítica,
similar ao descrito para Vibrio sp SA1 (WIERSMA; HANSEN; HARDER, 1978) e Pseudomonas
aeruginosa (WHOOLEY; O’CALLAGHAN; MC´LANGHLIN, 1983) sendo a repressão amônio
específica a hipótese mais provável. Verificou-se assim, que as proteases de Chryseobacterium
sp. Kr6 são parcialmente inibidas por fontes extras de carbono e de nitrogênio durante a
degradação de queratina, semelhantes ao descrito para microrganismo queratinolítico
Streptomyces fradie, onde a repressão catabólica apenas diminui a produção de sua queratinase
(NOVAL; NICKERSON, 1958).
A capacidade de produção de proteases de Chryseobacterium sp. Kr6, com os maiores
rendimentos no meio contendo somente penas como nutriente, pode também trazer algumas
implicações biotecnológicas. Estas enzimas, com potencial de aplicação em processos
envolvendo queratinólise (RIFFEL et al., 2003, RIFFEL; ORTOLAN; BRANDELLI, 2003),
poderiam ter sua produção, utilizando penas como única matéria-prima, portanto, um meio de
baixo custo e com reaproveitamento de um resíduo industrial que atualmente se acumula no
ambiente e é sub-aproveitado durante o processamento de frangos.
A partir dos resultados de produção e indução das proteases por queratina,
Chryseobacterium sp. Kr6 foi cultivado em meio CP, com o objetivo de purificar e caracterizar
uma protease queratinolítica extracelular (queratinase). A queratinase, denominada Q1,
apresentou uma alta atividade específica no final da purificação, de 2406 U.mg
-1
(Tabela 4.1) e
967 U.mg
-1
para os substratos caseína e keratin azure, respectivamente. O fator de purificação foi
de cerca de 14 vezes e o rendimento da purificação foi baixo, de pouco mais de 1%. Esse cálculo
pode se apresentar subestimado, pois várias proteases são secretadas ao mesmo tempo no meio de
cultura de Chryseobacterium sp. Kr6 (Figura 4.5), e pela falta de um substrato específico para a
protease purificada, considerou-se a totalidade da atividade proteolítica no extrato bruto.
O peso molecular estimado de 64 KDa foi semelhante ao da queratinase de Aspergillus
oryzae que é de 60 KDa, também determinado por SDS-PAGE (FARAG; HASSAN, 2004), mas
um pouco maior do que a maioria das proteases e queratinases, que normalmente apresentam
75
peso molecular entre 20 e 50 KDa (BÖCKLE; GALUNSKI; MÜLLER, 1995, CHENG et al.,
1999, SUH; LEE, 2001).
Q1 apresentou maior atividade em pH alcalino, com um ótimo de 8,5, como a maioria das
proteases secretadas pelos microrganismos queratinolíticos (BÖCKLE; GALUNSKI; MÜLLER,
1995, SANTOS et al., 1996, BRESSOLIER et al., 1999, FARAG; HASSAN, 2002, NAM et al.,
2002). A atividade em pHs alcalinos também possui algumas implicações biotecnológicas. As
proteases alcalinas são as enzimas de maior comercialização mundial, e são aplicadas nas mais
diversas áreas, como em formulações de detergentes, síntese de peptídeos, indústria de alimentos,
indústria do couro e também em alguns processos de biorremediação (GUPTA; BEG; LORENZ,
2002). A temperatura ótima de 50°C foi similar à encontrada para algumas queratinases do
gênero Bacillus (LIN et. al., 1992, ATALO; GASHE, 1993) e a enzima apresentou-se bem menos
termoestável do que as queratinases de Aspergillus orizae (FARAG; HASSAN, 2004), Bacillus
licheniformis (LIN; SHIH; SWAISGOOD, 1996) e Streptomyces sp KS
1-02
(LETORNEAU et al.
1998) as quais a estabilidade foi testada.
Os inibidores de serina e cisteína protease, PMSF e iodoacetamida, não inibiram a
atividade de Q1, portanto, não havendo o envolvimento de resíduos de serina e cisteína no
mecanismo catalítico, apesar de a maioria das queratinases descritas até o momento pertencerem
à classe das serina proteases (LIN et al., 1992; FRIEDRICH; ANTRANIKIAN, 1995;
BRESSOLIER et al., 1999; SUH; LEE, 2001; NAM et al., 2002).
Os quelantes EDTA, EGTA e 1,10 orto-fenantrolina inibiram Q1. A inibição parcial pelo
EDTA, na concentração de 10 mM pode ser explicada pela possível ligação do EDTA a íons
presentes em locais que não o sítio ativo. Esse comportamento tem sido observado para algumas
metaloproteases e, nestes casos, a adição de íons após inibição pôde inclusive deslocar o EDTA
do sítio ativo e a atividade ser restabelecida. (GRINWOOD; HECHEMY; STEVENS, 1994,
VENTER; OSTHOFF; LITTHAUER, 1999). A não observação deste comportamento com o
EGTA podese dar porque o EDTA possui as constantes de estabilidade de ligação quelante-metal
sempre maiores que o EGTA, a exceção do Ca
2+
, onde são praticamente iguais (BARRET, 1995).
Com o aumento na concentração de EDTA a inibição enzimática foi semelhante ao EGTA. Na
presença de 1,10 orto-fenantrolina, um quelante com afinidade ao Zn
2+
muito maior do que a
outros cátions, houve inibição total de Q1 na concentração testada. Através do perfil de inibição,
a queratinase Q1 pode ser classificada como uma Zn-metaloprotease. A presença de Zn à
76
molécula foi confirmada através da espectrometria de absorção atômica. Outras metaloproteases
já foram descritas em espécies do gênero Chryseobacterium (TARENTINO et al, 1995, LIJNEN
et al, 2000) e algumas metaloproteases também têm sido relacionadas com a atividade
queratinolítica (BROUTA et al., 2001; BOCKLE et al., 1995, ALPRESS; MOUNTAIN;
GOWLAND, 2002; FARAG; HASSAN, 2004).
A presença de íons Ca
2+
no meio reacional resultou em um aumento de três vezes na
atividade enzimática (Tabela 4.2). O aumento da atividade na presença dos cátions como Ca
++
,
Mg
++
e Mn
++
, tem sido associado a uma proteção da desnaturação térmica, estabilização
conformacional da estrutura terciária e proteção contra autoproteólise para algumas
metaloproteases (KUMAR; TAKAGI, 1999). Íons Cd
2+
, como o Ca
2+
, também resultaram em um
aumento na atividade. Esses cátions podem estar exercendo o mesmo efeito sobre a enzima, pois
seus raios iônicos são muito semelhantes, de 0,97 Ǻ para Cd
2+
e 0,99 Ǻ para o
Ca
2+
(EXTERKATE; ALTING, 1999). Já a presença dos cátions Zn
2+
, Al
2+
e Cu
2+
,
causou um
efeito inibitório sobre a enzima. O estímulo por Ca
2+
e inibição por Zn
2+
também foi demonstrada
pela queratinase de Vibrio sp. Kr2 (SANGALI; BRANDELLI, 2002) e algumas Calpaínas
(SORIMACHI; ISHIURA; SUZUKI, 1997). Os agentes redutores DTT e mercaptoetanol
inibiram a atividade, portanto, a presença de pontes dissulfeto pode ser importante na
manutenção da conformação molecular requerida para a atividade de Q1, semelhante ao descrito
para a metaloprotease de Flavobacterium psychrophilum (SECADES; ALVAREZ; GUIJARRO,
2001). Outro possível mecanismo de inibição pelo DTT pode ser o de quelação dos íons
necessários para manutenção da estrutura e assim da atividade (CHENG et al., 1999).
A classificação como metaloprotease possui algumas implicações biotecnológicas. Um
aspecto importante é a reversibilidade da inibição por agentes quelantes. Esta característica pode
ser usada como método para inativação temporária durante armazenamento, reduzindo autólise,
que está sempre associada a proteases. Além disso, o caráter de metaloenzima viabiliza e facilita
uma possível imobilização, que também tem sido utilizado para aumentar estabilidade enzimática
(LIN; SHIH; SWAISGOOD, 1996).
As metaloproteases entre as proteases apresentam-se excepcionalmente diversas e são
divididas em cerca de 16 clans, que relaciona a um ancestral comum, e em mais de 50 famílias. A
classificação de proteases em famílias, através de critérios estruturais, esbarra no mesmo
problema encontrado para classificar proteínas, que é a sua natureza quimérica. As moléculas de
77
muitas proteínas são construídas através de módulos distintos, que foram combinados durante a
evolução. Cada um destes módulos tem sua própria relação estrutural e evolutiva a outras
proteínas apesar de fazerem parte da mesma proteína. Para a classificação das proteases então se
sugere trabalhar com as regiões da proteína que são responsáveis pela atividade hidrolítica,
chamado de unidade peptidase. Nesta, é obrigatória a presença de todos os aminoácidos
responsáveis pela atividade e o alinhamento destes com alguma proteína previamente conhecida
dentro da família (BARRETT, RAWLINGS; O´BRIEN, 2001). Quando analisados o finger print
(MALDI-Tof/MS) e as seqüências dos peptídeos resultantes da digestão tríptica (ESI-MS/MS)
não foi encontrada homologia óbvia a qualquer proteína com seqüência já depositada nos bancos
de dados disponíveis, nem a seqüências curtas ou motivos no programa PROSITE. Outras
proteínas isoladas de microrganismos do gênero Chryseobacterium também têm apresentado
pouca homologia a proteínas conhecidas. A seqüência de uma glutaminase de Chryseobacterium
proteoliticum (YAMAGUCHI; JEENES; ARCHER, 2001) também não mostrou homologia a
proteínas conhecidas e uma metaloprotease isolada de Chryseobacterium meningosepticum
apesar da baixa homologia, apresentou a seqüência de aminoácidos correspondentes ao sítio ativo
da família astacin das metaloproteases (TARENTINO et al., 1995). A análise das seqüências
internas dos peptídeos resultantes da digestão tríptica da queratinase Q1 mostrou algumas
similaridades às metaloproteases da família M14 (Figura 4.14), principalmente entre as regiões
fundamentais para catálise, como o sítio de ligação ao metal e o sítio ativo (Figura 4.14). As
seqüências dos aminoácidos do sítio ativo entre os representantes das subfamílias difere, mas a
família caracteriza-se por um motivo de ligação, onde o Zn é tetraedricamente coordenado por
duas histidinas (H), um glutamato (E) e uma molécula de H
2
O. Uma das histidinas e o glutamato
são encontrados no motivo conservado HXXE (onde X é qualquer aminoácido) e o terceiro
ligante está a cerca de 103 a 143 resíduos deste motivo (RAWLINGS; TOLLE; BARRETT,
2004).
A família das peptidases M14 é também conhecida como família carboxipeptidase A. Os
membros desta família estão amplamente distribuídos entre todos o tipos de organismos, com
exceção dos vírus onde ainda não foram encontradas. É dividida em três subfamílias (M14A, B e
C), mas há membros que divergem em termos de seqüência e ainda não foram classificados,
sendo assim enquadrados assim na subfamília M14X. Q1 mostrou maior similaridade com
membros desta subfamília. A maioria das peptidases na família são carboxipeptidases,
78
hidrolisando aminoácidos na porção C-terminal de proteínas, no entanto outros tipos de atividade
catalítica têm sido demonstrados. Geralmente são sintetizadas sem um peptídeo sinal, mas na
maioria das vezes são pró-peptídeos que devem ser processados para tornarem-se ativos. As
funções biológicas destas enzimas são numerosas e diversas e incluem desde processamento de
peptídeos bioativos (Carboxipeptidase E) até o metabolismo de proteínas e de parede celular
bacteriana (RAWLINGS; TOLLE; BARRETT, 2004). A queratinase Q1 aparece então como a
primeira protease representante desta família encontrada dentro do gênero Chryseobacterium e
associada à atividade queratinolítica.
Outro aspecto interessante nas seqüências dos peptídeos foi a presença de um sítio
consenso de orto-glicosilação DS* no peptídeo 5 (KGSSADS*PNSEEK), seqüência esta que
sempre que encontrada em proteínas secretadas pela espécie relacionada Chryseobacterium
meningosepticum (Plummer et al., 1995), apresenta uma o-glicosilação no resíduo serina.
Tarentino et al. (1995) caracterizaram uma metaloprotease extracelular deste microrganismo
chamada flavastacin que apresentou um heptapolissacarídeo de 1,2 KDa ligado ao sítio DS*.
Considerou-se durante muito tempo que as proteínas de procariotos não apresentavam
glicosilações. Hoje já está bem estabelecido que glicosilações estão presentes tanto no domínio
Archae quanto no domínio Bactéria. As funções atribuídas a glicosilação tem sido a estabilidade
e manutenção da conformação, adesão, reconhecimento de superfície e proteção contra o ataque
proteolítico e aumento na afinidade pelo substrato (MOENZ; VANDERLEYDEN, 1997). Para a
queratinase Q1 a possível glicosilação pode ter um papel na proteção contra autoproteólise bem
como de proteólise por outras proteases, já que são secretadas várias proteases por esse
microrganismo, conforme já visto.
Quando analisada a seqüência do fragmento do gene amplificado utilizando os iniciadores
degenerados, também não se verificou homologia à proteínas conhecidas, surgindo como mais
um indicativo de que Q1 trata-se de uma nova proteína. O cDNA também foi amplificado
confirmando que esta seqüência corresponde a uma seqüência protéica e está sendo expressa. A
queratinase Q1, apresentando um peso molecular de 64 KDa, possui aproximadamente 600
aminoácidos. Entre os peptídeos seqüenciados por espectrometria, obteve-se a seqüência de 330
aminoácidos, o que cobre pouco mais da metade da proteína Q1. O fragmento do gene
corresponde a 156 aminoácidos, portanto ainda difícil relacionar as seqüências dos aminoácidos
79
dos peptídeos com os nucleotídeos do fragmento, sendo necessário mais estratégias para a busca
da seqüência gene completo.
A capacidade de hidrólise de substratos insolúveis pela enzima Q1 também foi verificada,
utilizando os substratos keratin azure e penas cruas. Q1 mostrou atividade queratinolítica apenas
contra keratin azure, enquanto que com penas cruas, não houve a detecção de peptídeos e
aminoácidos liberados para o meio, mesmo na presença de agente redutor. Os agentes redutores
exercem forte efeito inibitório sobre Q1, podendo ser necessário um poder redutor menor. As
queratinases de Doratomyces microsporus (FRIEDRICH; KERN, 2003) e Paecilomyces
marquandii (Gradisar et al., 2005) também se mostraram incapazes de degradação da queratina
de penas de frango, apesar de apresentarem alta atividade frente a outros substratos queratinosos
como pele, cabelo e unhas. A queratinase de Streptomyces pactum (BOCKLE; GALUNSKY;
MULLER, 1995) teve atividade hidrolítica sobre keratin azure e sobre a queratina de penas, no
entanto esta atividade foi extremamente baixa para ambos substratos. Na presença de um agente
redutor (DTT) houve pronunciado aumento na degradação de queratina das penas, cerca de 70%,
enquanto que somente com a enzima purificada a degradação foi de 10%, apesar de sucessivas
adições da enzima fresca. Esses resultados mostraram que a protease não possui um efeito de
hidrólise total desses substratos.
A clivagem enzimática das ligações peptídicas da molécula de queratina é difícil
principalmente pela dificuldade da interação entre a enzima e a superfície das partículas de
queratina. O acesso ao substrato e a atividade das proteases queratinolíticas pode estar ligada à
especificidade por substratos compactos. Uma possibilidade é a presença de domínios
hidrofóbicos como acontece em quitinases, celulases e xilanases que facilitam a interação
enzima-substrato (BOCKLE; GALUNSKY; MULLER, 1995). Outro fator de estabilidade
mecânica e de digestão proteolítica das queratinas tem sido atribuído, entre outros, à presença de
pontes dissulfeto. Portanto, a presença dos domínios de ligação e a hidrólise das pontes
dissulfeto, são indispensáveis para o acesso das proteases a seu substrato. A formação de tiol
livre durante os cultivos de Vibrio sp. Kr2 (SANGALI; BRANDELLI, 2000), Streptomyces
pactum (BOCKLE; MULLER, 1997) e para a própria bactéria em estudo Chryseobacterium sp.
Kr6 (RIFFEL et al., 2003) crescendo em penas foi demonstrada. A clivagem de pontes dissulfeto
pode ocorrer diretamente (por um mecanismo até então não elucidado), por secreção de sulfito
(causando sulfitólise) ou pode estar relacionada à atividade enzimática de dissulfeto redutase
80
(ONIFADE et al. 1998). Yamamura et al, (2002) estudando queratinólise por Stenotrophomonas
sp., purificaram uma proteína com atividade de dissulfeto redutase, capaz de redução de cistina e
glutationa oxidada. A combinação desta com uma protease do mesmo microrganismo, produziu
alta atividade queratinolítica e quando utilizado DTT com a protease, a atividade queratinolítica
foi semelhante. Sugeriu-se então que o mecanismo bacteriano e até mesmo fúngico de
degradação de queratina possa ser primeiramente o ataque das pontes dissulfeto por uma
dissulfeto redutase seguido da ação das proteases sob um substrato que esteja bem mais acessível.
O mecanismo de hidrólise de queratina por Chryseobacterium sp. Kr6 pode ser
semelhante ao descrito para Stenotrophomonas sp.(YAMAMURA et al, 2002). Durante o cultivo
de Chryseobacterium sp. Kr6 em penas, verificou-se a redução de pontes dissulfeto (RIFFEL et
al., 2003) e as enzimas extracelulares foram capazes de hidrolisar substratos queratinosos como
pele, penas e cabelo (BRANDELLI, 2005). Quando Q1 purificada foi utilizada sobre penas cruas
não houve atividade hidrolítica. Além da redução das pontes dissulfeto, pode ser necessário um
processo sinergístico entre as várias proteases secretadas por Chryseobacterium sp. Kr6 (Figura
4.5), facilitando a hidrólise da queratina e dos peptídeos formados durante a degradação. Esse
comportamento tem sido demonstrado por microrganismos queratinolíticos, como em algumas
espécies de Streptomyces (LETORNEAU et al., 1998, BOCKLE, GALUNSKY, MULLER,
1995, BRESSOILIER et al., 1999), Xanthomonas maltophilia (de TONI et al., 2002) e também
no caso do dermatófito Trichophyton rubrum, onde a capacidade de degradação de queratina e a
conseqüente virulência têm sido associadas à atividade conjunta de exo e endo proteases
(MONOD et al., 2005).
Apesar da capacidade de hidrólise de substratos queratinosos, através da redução de
pontes dissulfeto e atividade proteolítica, estes eventos não têm sido suficientes para a
degradação completa de penas. Alguns autores (BOCKLE; MULLER, 1997, ONIFADE et al.,
1998, RAMNANI; SINGH, GUPTA, 2005) sugerem que a colonização bacteriana das penas seja
fundamental. Ramnani; Singh, Gupta (2005) encontraram aumentada a concentração se sulfito no
meio extracelular e alta atividade de dissulfeto redutase presente, principalmente no extrato
celular de Bacillus licheniformis RG1 colonizando a superfície das penas. Nas observações
microscópicas de Chryseobacterium sp. Kr6 observou-se que durante as primeiras horas de
cultivo a colonização é baixa, mas a estrutura da fibra de queratina já apresenta alguma alteração
de superfície (Figura 4.6B), quando comparada ao controle. Esta pode ser devido ao poder
81
redutor e algumas proteases secretadas pela bactéria, pois neste tempo a bactéria encontra-se em
fase exponencial com alta atividade enzimática. Após 18 horas, percebeu-se um aumento
substancial na colonização das penas (Figura 4.6C, 4.7) com uma quantidade maior liberação de
proteína solúvel para o meio, ou seja, com uma taxa de degradação de queratina maior (Figura
4.3). Estes resultados demonstram a relação proporcional entre o aumento da colonização
bacteriana das penas e a degradação da queratina, sugerindo-se mais estudos sobre poder redutor
e de proteólise associado á célula de Chryseobacterium sp. Kr6, relacionado a esta degradação.
Queratinases possuem grande potencial de aplicação, principalmente na indústria avícola
e do couro. Recentemente a queratinase de Bacillus licheniformis PWD-1 foi caracterizada
quanto a hidrólise enzimática dos príons PrP
SC
(LANGEVELD et al. 2003) e SUP35NM (CHEN
et al., 2005) abrindo uma nova e relevante perspectiva para a aplicação de queratinases. Este
estudo apresentou a influência das condições nutricionais sobre a produção de proteases da
bactéria queratinolítica Chryseobacterium sp. Kr6 durante a degradação de penas, bem como a
purificação e caracterização de uma nova queratinase classificada como metaloprotease e
pertencente a família M14. Para a avaliação da aplicação biotecnológica desta enzima são
necessários maior estudos sobre os fatores que tornam esta enzima hábil por atuar em substratos
compactos bem como continuar a busca de mais detalhes dos seus aspectos moleculares.
82
6 CONCLUSÕES
Através das análises e discussão dos resultados deste trabalho, colocou-se em evidência
uma série de aspectos:
Num primeiro momento, foi estudado o crescimento e a produção de proteases
extracelulares da linhagem queratinolítica Chryseobacterium sp. Kr6 cultivada com queratina e
outros nutrientes. Verificou-se que a bactéria se desenvolve preferencialmente em meios
contendo queratina e a atividade proteolítica foi induzida por esta proteína. Por outro lado, a
presença de fonte extra de carbono e nitrogênio resultou em uma repressão catabólica parcial
desta atividade. Esse microrganismo foi capaz de produzir várias proteases extracelulares com
pesos moleculares distintos, e dependendo da constituição do meio de cultivo, perfis distintos
destas proteases foram observados, reforçando o caráter indutivo e sua importânciana na hidrólise
e metabolismo de queratina.
Depois de estabelecidas as condições de maior produção e indução das proteases, buscou-
se purificar e caracterizar uma protease com atividade queratinolítica (queratinase). Purificou-se
uma queratinase, denominada de Q1, através de dois passos cromatográficos, interação
hidrofóbica e gel-filtração. A proteína foi purificada cerca de 14 vezes, com um rendimento de
1,18%. Através de SDS-PAGE, a proteína apresentou-se como monomérica com um peso
molecular aproximado de 64 KDa. O pH e a temperatura ótimos para atividade foram de 8,5 e
50°C, respectivamentem e a atividade proteolítica foi estimulada pela presença de íons Ca
2+
e
Mg
2+
e inibida por Cu
2+
, Zn
2+
, Al
2+
, Hg
2+
e agentes redutores.
O perfil de inibição, permitiu classificar a queratinase com sendo uma Zn-metaloprotease,
sendo a presença de Zn confirmada pela espectrometria atômica. Após a purificação, a enzima foi
submetida a digestão tríptica e espectrometria de massas para identificação, mas houve uma baixa
homologia a proteínas disponíveis em bancos de dados conhecidos. Quando analisada a
seqüência dos 23 peptídeos, obtida pela espectrometria de massas, a queratinase pôde ser
classificada como sendo membro pertencente à família M14 (Carboxipeptidase) das
metaloproteases contendo Zn.
83
Através das análises microscópicas verificou-se intensa degradação de penas na presença
do microrganismo, e uma intensa colonização das penas. A enzima purificada apresentou
atividade queratinolítica, uma vez que foi capaz de hidrolisar o substrato keratin azure, mas foi
ineficiente sobre penas cruas, sugerindo a necessidade de outras enzimas, como dissulfeto
redutase e proteases, durante o processo de degradação de penas.
Baseando-se na seqüência de dois peptídeos da digestão com tripsina, desenharam-se dois
pares de iniciadores degenerados. A utilização destes em uma PCR, resultou na amplificação de
um fragmento de cerca de 470 pares de base, utilizando DNA ou cDNA como molde. Sugeriu-se,
com isso, que o fragmento faz parte de uma região do gene desta queratinase e que este gene
estava sendo expresso nas condições de extração do RNA. Após sequenciamento, a seqüência
deste fragmento também não mostrou homologia e similaridade a seqüências de proteínas
conhecidas, indicando tratar-se de uma nova metaloprotease.
84
REFERÊNCIAS
AHUJA, S.; FERREIRA, G.; MOREIRA, A. Uutilization of enzymes for environmental
applications. Critical Reviews in Biotechnology, Philadelphia, v. 24, n. 2, p. 125-134, 2004.
ALLPRESS, J.D.; MOUNTAIN, G.; GOWLAND, P.C. Production, purification and
characterization of an extracellular keratinase from Lysobacter NCIMB 9497. Letters in
Applied Microbiology, Oxon, v. 34, n. 5. p. 337-342, 2002.
ALTSCHUL, S.F.; MADDEN, T.L.; SCHAFFER, A.A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.; MILLER,
W.; LIPMAN, D.J.
Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database
search programs. Nucleic Acids Research, Oxford,v. 25, p. 3389–3402, 1997
ATALO , K.; GASHE, B.A. Protease production by a Termophilic Bacillus species (p-001A)
which degrades various kinds of fibrous proteins. Biotechnology Letters, Dordrecht, v. 15, n.
11, p. 1151-1156, 1993.
BARRET, A.J.; RAWLINGS, N.D.; O´BRIEN, E.A. The MEROPS database as a proteases
information system. Journal of Structural Biology, San Diego, v. 134, p, 95-102, 2001.
BARRET, A.J. Proteolytic Enzymes: serine and cysteine peptidases. Methods in Enzymology,
San Diego, v. 244, p. 1-15, 1994.
BARRET, A.J. Proteolytic Enzymes: aspartic and metallopeptidases. Methods in Enzymology,
San Diego, v. 248, p. 183, 1995.
BEER, H.; HUGO, C.J.; JOOSTE,P.J.; WILLEMS, A.;VANCANNEYT, M.; COENYE, T.
VANDAMME, P.A.R. Chryseobacterium vrystaatense sp. nov., isolated from raw chicken in a
chicken-processing plant. International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,
Berks, v. 55, p. 2149-2152, 2005.
BERNAL, C.; CAIRÓ J.; COELLO N. Purification and characterization of a novel exocellular
keratinase from Kocuria rosea. Enzyme and Microbial Technology, New York, 2005. In press.
85
BÖCKLE, B.; GALUNSKI, B.; MÜLLER, R. Characterization of a keratinolytic serine
proteinase from Streptomyces pactum DSM 40530. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, v. 61, n. 10, p. 3705-3710, 1995.
BÖCKLE, B.; MÜLLER, R. Reduction of disulfide bonds by Streptomyces pactum during
growth on chicken feathers.
Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 63, p.
790-792, 1997.
BRESSOLLIER P.; LETOURNEAU, F.; URDACI M.; VERNEUIL B. Purification and
characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces albidoflavus. Applied
and Environmental Microbiology, Washington, v. 65, p. 2570-2576, 1999.
BROUTA, F.; DESCAMPS, F.; FETT, T.; LOSSON, B.; GERDAY, C. Purification and
characterization of a 43.5 Kda keratinolytic metalloprotease from Microsporum canis. Medical
Micology, Norwalk, v. 39, n. 3, p. 269-275, 2001.
BRUSH, A. H. On the origin of feathers. Journal of Evolutionary Biology, Oxon, v. 9, p. 131-
142, 1996.
BUSSON, B.; ENGSTRÖN, P.; DOUCET, J. Existence of various structural zones in keratinous
tissues revealed by X-ray microdiffraction, Journal of Synchrotron Radiation, Copenhagen,
v. 6, p. 1021-1030, 1999.
CHEN, C.Y.; ROJANATAVORN, K.; CLARK, A.C.; SHIH, J.C.H. Characterization and
enzymatic degradation of Sup35NM, a yeast prion-like protein. Protein Science, v. 14, n. 9,
p. 2228-2235, 2005.
CHENG; S.W.; HU, H.M.; SHEN, S.W.; TAKAGI, H.; ASANO, M.; TSAI, Y.C. Production and
characterization of keratinase of feather-derading Bacillus licheniformis PWD-1. Bioscience,
Biotechnology and Biochemistry,Tokio, v. 59, n. 12, p. 2239-2243, 1995.
CHITTE, R.R; NALAWADE, V.K; DEY, S. Keratinolytic activity from the broth of a feather
degrading thermophilic Streptomyces tthermoviolaceus. Letters in Applied Microbiology,
Oxon, v. 28, p. 131-136, 1999
DALEV, P.; IVANOV, I.; LIUBOMIROVA, A. Enzymic modification of feather keratin
hydrolysates with lysine aimed at increasing the biological value. Journal of the Science of
Food and Agriculture, London, v. 73, p. 242-244, 1997.
86
DAYANANDAN, A.; KANAGARAJ, J.; SOUNDERRAJ, L.; GOVINDARAJU, R.;
RAJKUMAR, G.S. Application of an alkaline protease in leather processing: an ecofriendly
approach. Journal of Cleaner Production, Oxon, v. 11, n. 5, p. 533-536, 2003.
DOZIE, I.N.S; OKEKE, C.N.; UNAEZE, N.C. A thermostable, alkaline-active, keratinolytic
proteinase from Chrysosporium keratinophilum. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, New York, v. 10, p. 563–567, 1994.
EL-REFAI, H.A.; ABDELNABY, M.A; GABALLA, A; EL-ARABY, M.H.; FATTAH, A.F.
Improvement of the newly isolated Bacillus pumilus FH9 keratinolytic activity. Process
Biochemistry, Oxon, v. 40, p. 2325-2332, 2005.
FARAG, A.M; HASSAN, M.A. Purification, Characterization and immobilization of a keratinase
from Aspergillus orizae. Enzyme and Microbial Technology, New York, v. 34, p. 85-93, 2004.
FRIEDRICH, A.B.; ANTRANIKIAN, G. Keratin degradation by Fervidobacterium pennavorans,
a novel thermophilic anaerobic species of the order Thermatogales. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, v. 61, n. 10, p. 3705-3710, 1995.
FRIEDRICH, J; KERN, S. Hydrolysis of native proteins by keratinolytic protease of
Doratomyces microsporus. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, Amsterdam, v. 21, p.
53-57, 2003.
GARRET, R.H.; GRISHAN, C.M. Protein Folding and Tertiary Struture.
In:______Biochemistry. London: Saunders College Publ., 1995. Chap. 5, p.159-168.
GEORGE, S.; RAJU, V.; KRISHNAN, M.R.V.; SUBRAMANIAN, T.V.; JAYARAMAN, K.
Production of protease by Bacillus amyloliquefaciens in solid-state fermentation and it´s
aplication in the unhairing of hides and skins. Process Biochemisty, Oxon, v. 30, n. 5, p. 457-
462, 1995.
GRADISAR, H; FRIEDRICH, J; KRIZAJ, I; JERALA, R. similarities and specificities of fungal
keratinolytic proteases: comparison of keratinases of Paecilomyces marquandii and doratomyces
87
microsporus to some known proteases. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, v. 71, n.7, p. 2420-2426, 2005.
GRIMWOOD, B.G.; HECHEMY, K.; STEVENS, R.W. Purification and characterization of a
neutral zinc endopeptidase secreted by Flavobacterium meningosepticum. Archives of
Biochemistry and Biophysics, New York, v. 311, p. 127-132, 1994.
GUPTA, R; BEG, Q.K.; LORENZ, P. Bacterial alcaline proteases: molecular approaches and
industrial applications. Applied Microbiology and Biotechnology, New York, v. 59, p. 15-32,
2002.
HÄNEL, H.; KALISCH, J.; KEIL, M.; MARSCH, W.C.; BUSLAU, M. Quantification of
keratinolytic activity from Dermatophilus congolensis. Medical Microbiology and
Immunology, New York, v. 180, p. 45-51, 1991.
HOOD, C.M.; HEALY, M.G. Bioconversion of waste keratins: wool and feathers. Resources,
Conservation and Recycling, Amsterdam, v. 11, p. 179-188, 1994.
HUANG, Q.; PENG, Y.; LI, X.; WANG, H.; ZHANG, Y. Purification and characterization of an
extracellular alkaline serine protease with dehairing function from Bacillus pumilus. Current
Microbiology, New York, v. 46, p. 169-173, 2003.
HUGO, C. J.; SEGERS, P.; HOSTE, B.; VANCANNEYT, M.; KERSTERS, K.
Chryseobacterium joostei sp. nov., isolated from the dairy. International Journal of Systematic
Evolutionary Microbiology, Berks, v. 53, p. 751-757, 2003.
JONES, L.N. SIMON M.; WATTS, N.R.; BOOY, F.P.; STEVEN, A.C.; PARRY, D.A.D.
Intermediate filament structure: hard α-Keratin. Biophysical Chemistry, Amsterdam, v. 68,
p. 83-93, 1997.
KAMPFER, P.; DREYER, U.; NEEF, A.; DOTT, W.; BUSSE, H.-J. Chryseobacterium defluvii
sp. nov., isolated from wastewater. International Journal of Systematic Evolution
Microbiology, Berks, v. 53, p. 93–97, 2003.
KIM, J.M.; LIM, W.J.; SUH, H.J. Feather degrading Bacillus species from poultry waste.
Process Biochemstry, Oxon, v. 37, p. 287-291, 2001.
88
KIM, K.K.; KIM, M.K.; LIM, J.; PARK, H.Y.; LEE, S. T. Transfer of Chryseobacterium
meningosepticum and Chryseobacterium miricola to Elizabethkingia gen. nov. as Elizabethkingia
meningoseptica comb. nov. and Elizabethkingia miricola comb. nov. International Journal of
Systematic Evolution Microbiology, Berks, v. 55, p. 133-138, 2005.
KIM, K. K.; BAE, H.S.; SCHUMANN, P.; LEE, S.T. Chryseobacterium daecheongense sp. nov.,
isolated from freshwater lake sediment. International Journal of Systematic Evolution
Microbiology, Berks, v. 55, p. 133-138, 2005.
KLUSKENS, L.D.; VOORHORST, W.G.; SIEZEN, R.J.; SCHWERDTFEGER, R.M.;
ANTRANIKIAN, G.; OOST, J.; van der; VOS W.M. de. Molecular characterization of
fervidolysin, a subtilisin-like serine protease from the thermophilic bacterium Fervidobacterium
pennivorans. Extremophiles, Tokio, v. 6, p. 185-194, 2002.
KUMAR, C.G.; TAKAGI, H. Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial viewpoint.
Biotechnology Advances, Oxford, v.17, n.7, p. 561-594, 1999.
KUNERT, J. Biochemical mechanism of keratin degradation by the actnomycete Sreptomyces
fradie and the fungus Microsporum gypseum: a comparison. Journal Basic Microbiology, Oxon,
v. 29, p. 597-604, 1989.
KUNERT, J. Effects of reducind agents on proteolytic and keratinolytic activity of enzymes of
Mycrosporum gryseum. Mycoses, Berlin, v. 35, p. 343-348, 1992.
KUNERT, J. Physiology of keratinophilic fungi. Revista Iberoamericana de Micologia, Bilbao,
2000.
KUNITZ, M. Crystalline soybean trypsin inhibitor. II. General properties Journal of General
Physiology, New York, v. 30, p. 291-310, 1947.
LANGEVELD, J.P.M.; WANG, J.J.; VAN DE WIEL, D.F.M.; SHIH, G.C.; GARSSEN, J.;
BOSSERS, A.; SHIH, J.C.H. Enzymatic degradation of prion protein in brain stem from infected
cattle and sheep. Journal of Infectious Diseases, v. 188, n. 11, p. 1782-1789, 2003.
89
LEE, G.G.; FERCKET, P.R.; SHIH, J.C.H. Improvment of feather digestibilty by bacterial
keratinase as a feed additive. Faseb Journal, Bethesda, v. 59, p. 1312, 1991.
LEE, H.; SUH, D.B; HWANG, J.H; SUH H.J. Characterization of a Keratinolytic
Metalloprotease from Bacillus sp. SCB-3. Applied Biochemistry and Biotechnology, Totowa,
v. 97, p. 123-133, 2002.
LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L.; COX, M.M. Principles of biochemistry. 3.ed. New York:
Worth Publishers, 2000.
LETOURNEAU, F.; SOUSSOTTE, V.; BRESSOLLIER, P.; BRANLAND, P.;VERNEUIL, B.
Keratinolytic activity of Streptomyces sp. S. K1-02: a new isolated strain. Letters in Applied
Microbiology, Oxon, v. 26, p. 77-80, 1998.
LIJNEN, H.R.; HOEF, B.V.; UGVU, F.; COLLEN, D.; ROELANTS, I. Specific proteolysis of
human plasminogen by a 24 kda endopeptidase from a novel Chryseobacterium Sp.
Biochemistry, Washington, v. 39, p. 479-488, 2000.
LIN, X.; LEE, C.G.; CASALE E.S; SHIH, J.C.H. Purification and characteriztion of a keratinase
from a feather-degrading Bacillus licheniformis strain. Applied Environmental Microbiology,
Washington, v. 58, n. 10, p. 3271-3275, 1992
LIN, X.; KELEMEN, D. W.; MILLER, E. S.; SHIH, J. C. H. Nucleotide sequence and
expression of KerA, the gene encoding a keratinolitic protease of Bacillus licheniformis PWD-1.
Applied Environmental Microbiology, Washington, v. 61, n. 4, p. 1469-1474, 1995.
LIN, X , WONG, S.L.; MILLER, E.S.; SHIH, J.C.H. Expression of the Bacillus licheniformis
PWD-1 keratinase gene in Bacillus subtilis. Journal of Industrial Microbiology &
Biotechnology, Heidelberg. v. 19, p. 134-138, 1997.
LIN, X.; SHIH, J.C.H.; SWAISGOOD, H.E. Hydrolysis of feather keratin by immobilised
keratinase. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 62, n. 11, p. 4273-4275,
1996.
90
LI, Y., KAWAMURA, Y.; FUJIWARA, N.; NAKA, T.; LIU, H.; HUANG, X.; KOBAYASHI,
K.; EZAKI, T. Chryseobacterium miricola sp. nov., a novel species isolated from condensation
water of space station Mir. International Journal of Systematic Evolution Microbiology,
Berks, v. 26, p. 523-528, 2003.
LONGSHAW, C.M.; WRIGHT, J.D.; FARRELL, A.M.; HOLLAND K. Kytococcus sedentarius,
the organism associated with pitted keratolysis, produces two keratin-degrading enzymes.
Journal of Applied Microbiology, Oxon, v. 93, p. 810-816, 2002.
LOWRY, O.H.; ROSEBROUGH, N.J.; FARR, A.L.; RANDALL, R.J. Protein measurement with
the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, Bethesda, v. 193, p. 265-275, 1951.
LUCAS, P.S.; BROENNIMANN, L.; FEBBRARO, P.; HEEB. P. High diversity among feather-
degrading bacteria from a dry meadow soil. Microbial Ecology, New York, v. 45, p. 282-290,
2003.
MACFARLANE G.T.; MACFARLANE S. Physiological and nutritional factors affecting
synthesis of extracellular metalloproteases by Clostridium bifermentans NCTC 2914. Applied
and Environmental Microbiology, Washington, v. 58, n. 4, p. 1195-1200, 2005.
MACEDO, A. J.; DA SILVA, W.O.B.; GAVA, R.; DRIEMEIER, D.; HENRIQUES, J.A.P.;
TERMIGNONI, C. Novel keratinase from bacillus subtilis s14 exhibiting remarkable dehairing
capabilities, Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 71, n. 1, p. 594-596,
2005.
MALLATHI, S.; CHAKRABORTY, R. Production of alkaline peptidase by a new Aspergillus
flavus isolate under solid-substrate fermentation condictions for use as a depilation agent.
Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 57, n. 3, p. 712-716, 1991.
MILLES, A.A.L.; MISSA, S.S. The estimation of the bacterial prower of blood. Journal of
Hygiene, Cambridge, v. 38 p. 732-749, 1938.
MIYOSHI, S; SHINODA, S; Microbial metalloproteases e pathogenesis. Microbes and
Infection, Amsterdam, v. 2, p. 91-98, 2000.
MOENS, S; VANDERLEYDEN, J. Glycoproteins in prokaryotes. Archives of Microbiology,
New York, v. 168, n.3, p. 169-175, 1997
91
MUKHOPADHYAY, R.P.; CHANDRA, A.L. Keratinase of Streptomycete. Indian Journal of
Experimental Biology, Calcutta, v. 28, p. 575-577, 1990.
MOHAMEDIN, A. H. Isolation, identification and some cultural conditions of a protease
producing thermophilic streptomyces strain grown on chicken father as substrate. International
Biodeterioration & Biodegradation, Oxon, v. 49, p. 13-21, 1999.
MONOD, M; LÉCHENNE,
B; JOUSSON,
O; GRAND, D; ZAUGG, C; STÖCKLIN,
R;
GROUZMANN, E. Aminopeptidases and dipeptidyl-peptidases secreted by the dermatophyte
Trichophyton rubrum. Microbiology, New York, v. 151, p. 140-145, 2005.
MORITZ, J.Z; LATSHAW, J.D. Indicators of nutritional value of hydrolyzed feather meal.
Poultry Science, Savoy, v. 80, p.79-86, 2001.
NAM, G. W.; LEE, D.W.; LEE, H.S.; LEE, N.J.; KIM, B.J.; CHOE, E.A.; HWANG, J.K.;
SUHARTONO, M.P.; PYUN Y.R. Native feather degradation by Fervidobacterium islandicum
AW-1 a newly isolating keratinase-producing thermophilic anaerobe. Archives of Microbiology,
New York, v. 178, p. 538-547, 2002.
NELSON, N.J. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of
glucose. Journal of Biological Chemistry, Bethesda, v. 153, p. 375-380, 1944.
NEURATH, H. Evolution of proteolytic enzymes. Science, Washington, v. 224, p. 350-356,
1984.
NOVAL. J. J.; NICKERSON, W. J. Decomposition of native keratin by Streptomyces fradie.
Journal of Bacteriology, Washington, v. 77, p. 251-263, 1958.
ODETALLAH, N.H.; WANG, J.J.; GARLICH, J.D.; SHIH, J.C. Keratinase in starter diets
improves growth of broiler chicks. Poultry Science, Savoy, v. 82, p. 664-670, 2003.
ONIFADE, A. A.; AL-SANE, N.A.; AL-MUSALLAM, A.A.; AL-ZARBAN, S. A review:
potentials for biotechnological applications of keratin-degrading microorganisms and their
92
enzimes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resources.
Bioresource Technology, Oxon, v. 66, p. 1-11, 1998.
PAPADOPOULUS, M.C.; BOUSHY, E..; ROODBEEN, A.E. Effects of processing time and
moisture content on aminoacid composition and nitrogen characteristics of feather meal. Animal
Feed Science and Technology, Amsterdam, v. 14, p. 279-290, 1986.
PAPAINI, R.; MANCIANTI, F. Extracellular enzymatic activity of Microsporum canis.
Mycophatologia, Dordrecht, v. 132, p. 129-132, 1996.
PLUMMER, T. H.; TARENTINO, A. L; HAUER, C. R. Novel, specific o-glycosylation of
secreted Flavobacerium meningosepticum proteins. Journal of Biological Chemistry, Bethesda,
v. 270, n. 32, p. 33192-33196, 1995.
PORRES, J.M.; BENITO, M.J.; LEI, X.J. Functional expression of keratinase (Ker-A)gene de
Bacillus licheniformis in Pichia pastoris. Biotechnology Letters, Dordrecht, v. 24, p. 631–636,
2002.
QIN, L.M.; DEKIO, S.; JIDOI J. Some biochemical characteristics of a partially purified
extracellular keratinase from Trichophyton schoenleinii. The Journal of Dermatology, Tokio,
v. 277, p. 236-244, 1992.
QUESADA, A.R.; FAJARDO, I.; AGUDO, D.R.; PANCHÓN, J.M.; MEDINA, M.A.
Zymography of extracellular matrix proteases. Biochemical Education, Bethesda, v. 24, n. 3,
p. 170-171, 1996.
RAMNANI, P; SINGH; R; GUPTA, R. Keratinolytic potential of Bacillus licheniformis RG1:
structural and biochemical mechanism of feather degradation. Canadian Journal of
Microbiology, v. 51, n. 3, , p. 191-196, 2005
RAO, B.; TANKSALE, A.M.; GHATGE, M.S.; DESHPANDE, V.V. Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology
Rewiews, Washington, v. 62, n. 3, p. 597-635, 1998.
RAWLINGS, N.D.; BARRET, A.J. Evolutionary families of Peptidases. Biochemical Journal,
London, v. 290, p. 205-218, 1993.
93
RAWLINGS, N.D.; TOLLE, D.P.; BARRETT, A.J. MEROPS: the peptidase database. Nucleic
Acids Research. 32 Database issue, D160-D164, 2004
RIFFEL, A.; ORTOLAN, S.; BRANDELLI, A. De-hairing activity of extracellular proteases
produced by keratinolytic bacteria. Journal of Chemical Technology and Biotechnology,
Sussex, v.78, p.855 - 859, 2003.
RIFFEL, A; BRANDELLI, A, Isolation and characterization of a feather-degrading bacterium
from the poultry processing industry. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,
v.29(5): 255-8, 2002.
RIFFEL, A.; LUCAS, F.; HEEB, P.; BRANDELLI, A. Characterization of a new keratinolytic
bacterium that completely degrades native feather keratin. Archives of Microbiology; New
York, v. 179, n. 4, p. 258-65, 2003.
ROZS, M.; MANCZINGER, L.; VAGVOLGYI, C.; KEVEI F. Secretion of a trypsin-like thiol
protease by a new keratinolytic strain of Bacillus licheniformis. FEMS Microbiology Letters,
Amsterdam, v. 205, p. 221-224, 2001.
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd
ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
SANGALI, S.; BRANDELLI, A. Isolation and characterization of a novel feather-degrading
bacterial strain. Applied Biochemistry and Biotechnology, Totowa, v. 87, p. 17-24, 2000.
SANTOS R.M.D.B.; FIRMINO, A.A.P.; SÁ, C.M. DE.; FELIX, C.R. Keratiolytic activity of
Aspergillus fumigatus fresenius. Current Microbiology, New York, v. 33, p. 364-370, 2000.
SECADES, P.; ALVAREZ, B.; GUIJARRO, J.A. Purification and characterization of a
psychrophilic, calcium- induced, growth-phase-dependent metalloprotease from the fish patogen
Flavobacterium psychrophilum. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 67,
p. 2436-2444, 2001.
94
SHEN, F.T.; KAMPFER, P.; YOUNG, C.-C.; LAI, W.A.; ARUN, A. B. Chryseobacterium
taichungense sp. nov., isolated from contaminated soil. International Journal of Systematic
Evolution Microbiology, Becks, v. 55, p. 423-436, 2005.
SHIMURA K.; KAJI S.; HIRASHI A. Chryseobacterium shigense sp. nov., a yellow-pigmented,
aerobic bacterium isolated from a lactic acid beverage International Journal of Systematic
Evolution Microbiology, Becks, v. 55, p. 1903-1906, 2005.
SOMOGYI, M. Notes on sugar determination. Journal of Biological Chemistry, Bethesda
v.195, p. 19-23, 1952.
SORIMACHI, H.; ISHIURA, S.; SUZUKI, K. Structure and physiological function of calpains.
Biochemical Journal, London, v. 328, p. 721–732, 1997.
STRYDOM, E.; MACKIE, R.I.; WOODS, D.R. Detection and characterization of extracellular
proteases in Butyrivibrio fibrisolvens. Applied Microbiology and Biotechnology, New York,
v.24, p. 214-217, 1986
STULKE, J.; HILLEN, W. Regulation of carbon catabolism in Bacillus species. Annual.
Reviews of Microbiology, Palo Alto, v. 54, p. 849–880. 2000
SUH, H. J.; LEE, H. K. Characterization of a keratinolytic serine proteasefrom Bacillus subtilis
Ks-1. Journal of Protein Chemistry, New York, v.20, n.2, p.165-169, 2001.
SWITZER, R. C.; MERRIL, C. R.; SHIFRIN, S. A highly sensitive silver stain for detecting
proteins and peptides in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry, San Diego, v. 98,
p. 231–237, 1979.
SZABÓ, I.; BENEDEK, A.; SZABO, I.M.; BARABAS, G. Feather degradation with a
thermotolerant Streptomyces graminofaciens strain. World Journal of Microbiology &
Biotechnology, New York, v. 16, p. 253-255, 2000.
TARENTINO, A.L.; QUINONES G.; GRIMWOOD B.G.; HAUER C.R.; PLUMMER T.H.
Molecular cloning and sequence analysis of flavastacin: an O-glycosylated prokaryotic zinc
95
metalloendopeptidase. Archives of Biochemistry and Biophysics, New York, v. 319, n. 1, p.
281-285, 1995.
TAKIUCHI, I.; HIGUCHI, D.; SEI, Y. Immunological studies of extracellular keratinase.
Journal of Dermatology, Tokio, v.10, p.327-330, 1983.
THANIKAIVELAN, P.; RAO, J.R.; NAIR, B.U.; RAMASAMI, T. Progress and recent trends in
biotechnological methods for leather processing. Trends in Biotechnology, London, v. 22, n. 4,
p. 181-188, 2004.
THYS, R.C.S.; LUCAS, F.S.; RIFFEL, A.; HEEB, P.;BRANDELLI, A. Characterization of a
protease of a feather-degrading Microbacterium species. Letters in Applied Microbiology,
v. 39, n. 2, p. 181-186, 2004.
TONI DE, C.H. de; RICHTER, M.F.; CHAGAS, J.R.; HENRIQUES, J.A.; TERMIGNONI, C.
P.Purification and characterization of an alkaline serine endopeptidase from a feather-degrading
Xanthomonas maltophilia strain. Canadian Journal of Microbiology, Ontario, v. 48, n. 4,
p. 342-348, 2002
VANDAMME, P.; BERNARDET, J.F.; SEGERS, P.; KERSTERS, K.; HOLMES, B. New
perspectives in the classification of the flavobacteria: description of Chryseobacterium gen. nov.,
Bergeyella gen. nov., and Empedobacter nom. rev. International Journal of Systematic
Bacteriology, Becks, n. 44, p. 827–831, 1994.
VARELA, H..; FERRARI, M.D.; BELOBRAJDIC, L.; WEYRAUCH, R.; LOPERENA, L.M.
Short communication: effect of medium composition on the production by a new Bacillus subtilis
isolate of peptidase with promising unhairing activity. World Journal of Microbiology &
Biotechnology, New York, v. 12, p. 643-645, 1996.
VARELA, H..; FERRARI, M.D.; BELOBRAJDIC, L.; VASQUEZ, A.; LOPERENA, L.M. Skin
uhairing peptidases of a Bacillussubtilis: production and partial characterization. Biotechnology
Letters, Dordrecht, v. 19, n. 18, p. 755-758, 1997.
VENTER, H.; OSTHOFF, G.; LITTHAUER, D. Purification and characterization of a
metalloprotease from Chryseobacterium indologenes ix9a and determination of the amino acid
96
specificity with electrospray mass spectrometry. Protein Expression and Purification, San
Diego, v. 15, p. 282-295, 1999.
VIDAL, L.; CHRYSTEN, P; COELHO, M. N. Feather degradation by Kocurea rosea in
submerged culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. New York, v. 16,
p. 551-554, 2000.
VIRGINIA TECH CENTER FOR GENOMICS. Disponível em:
http://vigen.biochem.vt.edu/protocols/digestprotocol.pdf Acesso em: 10 de jun. 2005
WANG, J.J.; SHIH, J.C.H. Fermentation production of keratinase from Bacillus licheniformis
PWD-1 and a recombinant B. subtilis FDB-29. Journal of Industrial Microbiology &
Biotechnology, Heidelberg, v. 22, p. 608-616, 1999.
WANG, J.J.; SWAISGOOD, H.E.; SHIH J.C.H. Bioimmobilization of keratinase using Bacillus
subtilis and Escherichia coli systems. Biotechnology and Bioengineering, Hoboken, v. 81, n. 4,
p. 421-429, 2003.
WANG, J.J.; ROJANATAVORN, K.; SHIH J.C.H. Increased production of Bacillus keratinase
by chromosomal integration of multiple copies of the Ker A gene. Biotechnology and
Bioengineering, Hoboken, v. 87, n. 4, p. 459-464, 2004.
WAWRZKIEWICZ, K; WOLSKI, T.; ŁOBARZEWSKI, J. Screening the keratinolytic activity
of dermathophytes in vitro. Mycopathologia, Dordrecht, v. 114, p. 1-8, 1991.
WHOOLEY, M.A.;.O’CALLAGHAN J.A.; MCLANGHLIN. A.J. Effect of substrate on the
regulation of exoprotease production by Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145.
Microbiology, New York, v. 129, p. 981–988, 1983.
97
WIERSMA, M.; HANSEN, T.A.; HARDER W. Effect of environmental conditions on the
production of two extracellular proteolytic enzymes by Vibrio SA1. Antonie Van
Leeuwenhoek., Amsterdam, v. 44, p. 129–140, 1978.
WILLIAMS, C.M.; RICHTER, C.S.; MACKENZIE, J.M.; SHIH, J.C.H. Isolation, identification,
and characterization of a feather-degrading Bacterium. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, v. 56, p.1509-1515 , 1990.
YAMAGUCHI, S.; YOKOE, M. A novel protein-deamidating enzyme from Chryseobacterium
proteolyticum sp. nov, a newly isolated bacterium from soil. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, v. 66, p. 3337–3343, 2000.
YAMAGUCHI, S.; JEENES, D.J.; ARCHER D.B. Protein-glutaminase from Chryseobacterium
proteolyticum, an enzyme that deamidates glutaminyl residues in proteins. European Journal of
Biochemistry, Oxon, v. 268, p. 1410-1421, 2001.
YAMAMURA, S.; MORITA, Y.; HASAN, Q.; YOKOYAMA, K.; TAMIYA, E. Keratin
degradation: a cooperative action of two enzymes from Stenotrophomonas sp. Biochemical and
Biophysical Research Communications, San Diego, v. 294, p. 1138-1143, 2002.
YOSHIKAWA, M.; MATSUDA, F.; NAKA, M.; MUROFUSHI, E.; TSUNEMATSU, J.
Pleiotropic alterations of activities of several toxins and enzymes in mutants of Staphylococcus
aureus. Journal of Bacteriology, Washington, v. 119, p. 117–122, 1974.
YOUNG, C. C.; KAMPFER, P.; SHEN, F. T.; LAI, W. A.; ARUN, A. B. Chryseobacterium
formosense sp. nov., isolated from the rhizosphere of Lactuca sativa L. (garden lettuce).
International Journal of Systematic Evolution Microbiology, Becks, v. 55, p. 423-436, 2005.
ZAGHLOUL, T.I. ABDELAZIZ, A.; MOSTAFA, M.H. High level of expression and stability of
the cloned alkaline protease (aprA) gene in Bacillus subtilis. Enzyme and Microbial
Technology, New York, v. 16, n. 6, p. 534-537, 1994.
ZAGHLOUL, T.I.; AL-BAHRA, M.; AL-AZMEH, H. Isolation, identification and keratinolytic
activity of a several feather-degrading bacterial isolates. Applied Biochemistry and
Biotechnology, Totowa, v.72, p. 207-213, 1998.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
