( PDF ) Células-tronco foliculares na alopecia difusa não-cicatricial de pacientes HIV positivos

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CARLOS BAPTISTA BARCAUI

Células-tronco foliculares na alopecia difusa

não-cicatricial de pacientes HIV positivos

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do

título de Doutor em Ciências.

Área de concentração: Dermatologia

Orientadora: Prof

. Dr

. Mírian Nacagami Sotto

São Paulo

2005

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iii

À Julia e Clara, minhas células-filhas.

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AGRADECIMENTOS

À Prof

. Mírian Nacagami Sotto, por ter acreditado em nossa proposta

e pela sua disponibilidade e dedicação com que conduziu este trabalho.

À bióloga Ana Maria Gonçalves da Silva pelo seu esmero no preparo

das reações imunohistoquímicas.

À técnica Cristina Galhardo pelo auxílio dado no preparo dos cortes

histológicos.

Ao colega e ex-aluno Leonardo Zacharias Gonçalves pela sua ajuda

na triagem dos pacientes investigados.

Ao amigo Bernd Genser pelas suas orientações na elaboração de

nossa análise estatística.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e

ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(472715/2003-8 e 504726/2003-0) pelo investimento financeiro em nossa

pesquisa.

Esta tese está de acordo com:

Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals

Editors (Vancouver)

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e

Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.

Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A.L. Freddi,

Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso,

Valéria Vilhena. São Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação; 2004.

Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals

Indexed in Index Medicus.

SUMÁRIO

Lista de figuras

Lista de siglas

Lista de tabelas

Resumo

Summary

INTRODUÇÃO................................................................................ 1

OBJETIVOS.................................................................................... 3

REVISÃO DA LITERATURA.......................................................... 4

3.1

Alopecia na infecção pelo HIV....................................................... 4

3.2

Células -tronco no epitélio folicular............................................... 6

3.3

Protuberância folicular nas alopecias............................................ 15

3.3.1

Alopecia da doença enxerto versus hospedeiro............................ 15

3.3.2

Liquen plano pilar.......................................................................... 16

3.3.3

Alopecia no lupus eritematoso discóide......................................... 17

3.3.4

Alopecia areata............................................................................... 17

3.3.5

Alopecia androgenética.................................................................. 17

3.3.6

Foliculite de células-tronco............................................................. 19

3.4

Apoptose......................................................................................... 19

3.4.1

Controle da apoptose..................................................................... 21

3.4.2 Alterações das moléculas controladoras da apoptose na infecção

pelo HIV.......................................................................................... 24

3.4.3

Apoptose e auto-imunidade............................................................ 24

3.4.4

Auto-imunidade e infecção pelo HIV.............................................. 25

3.5

Cinética tecidual da epiderme e do folículo pilo-sebáceo.

Equilíbrio entre proliferação, diferenciação e morte celular........... 26

MÉTODOS..................................................................................... 30

4.1

Casuística...................................................................................... 30

4.2

Análise Histológica......................................................................... 35

vii

4.3

Demonstração de apoptose de células tronco-foliculares e

células amplificadoras transitórias, da bainha radicular externa

da protuberância folicular.............................................................. 36

4.4

Correlação da incidência de apoptose das células

indiferenciadas pluripotenciais da protuberância folicular no

couro cabeludo de pacientes HIV-1 positivos, com alopecia

difusa não cicatricial, com o grau de imunodeficiência.................. 44

RESULTADOS............................................................................... 45

5.1

Análise histopatológica ................................................................. 45

5.2

Demonstração de apoptose de células tronco-foliculares e

células amplificadoras transitórias, da bainha radicular externa

da protuberância folicular............................................................... 49

5.3

Correlação da incidência de apoptose das células

indiferenciadas pluripotenciais da protuberância folicular no

couro cabeludo de pacientes HIV-1 positivos, com alopecia

difusa não cicatricial, com o grau de imunodeficiência.................. 57

DISCUSSÃO................................................................................... 58

CONCLUSÕES .............................................................................. 71

ANEXO........................................................................................... 72

REFERÊNCIAS.............................................................................. 73

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Teoria da ativação das células da protuberância....................... 11

Figura 2

Representação esquemática da unidade epidermo-pilo-

sebácea...................................................................................... 14

Figura 3 Alopecia difusa não cicatricial de paciente HIV-1 positivo.

Aspecto clínico da observação 9. Rarefação capilar difusa na

região frontal............................................................................... 32

Figura 4

Alopecia difusa não cicatricial de paciente HIV-1 positivo.

Aspecto clínico da observação 9. Paciente queixava-se de

alteração do volume e da textura capilar; região temporal

esquerda..................................................................................... 32

Figura 5

Representação esquemática da clivagem do material............... 34

Figura 6 Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 13).

Corte transversal de couro cabeludo ao nível da inserção do

músculo eretor do pêlo. Observa-se desorganização das

fibras colágenas perifoliculares (→). (Tricrômico de Gomori;

aumento original x40).................................................................

Figura 7

Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 6).

Corte transversal de couro cabeludo ao nível da inserção do

músculo eretor do pêlo. Observa-se o aumento do número de

folículos telógenos e de unidades telógenas germinativas (→).

(Tricrômico de Gomori; aumento original x40)...........................

Figura 8

Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 6).

Detalhe da desintegração da bainha de mielina de um folículo

telógeno. (Tricrômico de Gomori; aumento original

x100)........................................................................................... 50

Figura 9 Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 12).

Corte transversal de couro cabeludo. Observa-se dupla

marcação CK19 (BCIP/NBT, azul) e TUNEL (DAB, marrom)

em células da bainha radicular externa de dois folículos

pilosos (→); (aumento original x100).........................................

Figura 10

Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 12).

Detalhe da dupla marcação CK19/TUNEL de células da

bainha radicular externa de folículo piloso; (aumento original

x400)........................................................................................... 51

Figura 11 Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 12).

Corte transversal de folículo piloso exibindo células CK19

(BCIP/NBT, azul) e TUNEL (DAB, marrom) positivas na

bainha radicular externa ao nível da protuberância folicular;

(aumento original x1000)............................................................ 52

Figura 12

Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 6).

Corte transversal de couro cabeludo. Presença células CK19+

apoptóticas (TUNEL positivas) na bainha radicular externa

que delimitam as projeções epiteliais características da

protuberância folicular; (aumemto original x400)....................... 52

Figura 13

Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 5).

Detalhe da bainha radicular externa de um folículo piloso

exibindo queratinócitos apoptóticos (núcleos TUNEL positivos

– DAB, marrom) que não expressam CK 19 no citoplasma (→)

e células da camada basal com dupla marcação; (aumento

original ×1000)............................................................................

Figura 14

Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 1).

Corte transversal de folículo piloso exibindo células com dupla

marcação CK19 (BCIP/NBT, azul) e TUNEL (DAB, marrom)

em toda a circunferência da bainha radicular externa de

folículo piloso; (aumento original x400)...................................... 53

Figura 15

Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 1).

Corte transversal de couro cabeludo ao nível da

protuberância. Observa-se queratinócitos apoptóticos (→) na

bainha radicular externa, evidenciados pelo anticorpo anti-

caspase 3 clivada; (aumento original x400)..............................

LISTA DE SIGLAS

ADNC alopecia difusa não cicatricial

3HT timidina tritiada

AAG alopecia androgenética

AIDS síndrome da imunodeficiência adquirida

Apaf fator ativador da protease apoptótica

BCIP/NBT

nitro blue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-cloro-3 indoyl

phosphate, toluidine salt

BRE bainha radicular externa

BRI bainha radicular interna

BSA soro-albumina bovina

CAD DNase ativada por caspase

CK19 anticorpo monoclonal anti-citoqueratina 19

DEVH doença enxerto versus hospedeiro

DISC complexo sinalizador indutor de morte

DP desvio padrão

FADD domínio mortal associado ao Fas

Fas/Fas antígeno Fas e ligante do antígeno Fas

Fas/Apo receptor de apoptose do antígeno Fas

FGF fator de crescimento fibroblástico

FLIP proteína celular inibitória FLICE-símile

FPS folículo pilo-sebáceo

HAART terapia anti-retroviral altamente agressiva

HIAP proteína inibidora da apoptose H

HIV vírus da imunodeficiência humana

HLA antígeno leucocitário humano

IAP proteínas inibidoras de apoptose

ICAM molécula de adesão intercelular

ICE/ced

enzima conversora de interleucina 1β/gene relacionado à

morte celular

xii

IGF fator de crescimento insulina-símile

MEP músculo eretor do pêlo

PARP poli ADP-ribose polimerase

PBS solução salina tamponada com fosfato

P75NTR receptor de neurotrofinas de baixa atividade subunidade 75

PTHrp proteína relacionada ao hormônio similar ao da paratireóide

TAC células amplificadoras transitórias

TFR tratos fibrosos residuais

TGF fator de crescimento transformador

TGU unidades telógenas germinativas

TNF fator de necrose tumoral

TRADD domínio mortal associado ao TNF

TRAIL/APO ligante indutor de apoptose relacionada com TNF

TUNEL

terminal deoxynucleotidyltransferase d-UTP fluorescein nick-

end labeling

XIAP proteína inibidora da apoptose X

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

Caracterização dos pacientes HIV-1 positivos, com

alopecia difusa não cicatricial, quanto ao sexo, idade,

nível de células CD4+ no sangue, data da

confirmação da infecção pelo vírus da

imunodeficiência humana e drogas em uso na ocasião

do estudo.......................................................................

Tabela 2

Grupo controle – dados de sexo e idade dos

indivíduos hígidos não alopécicos.................................

Tabela 3

Resultados da análise histopatológica / morfométrica

nos pacientes HIV-1 positivos com alopecia difusa não

cicatricial (casos)...........................................................

Tabela 4 Resultados da análise histopatológica / morfométrica

de couro cabeludo de indivíduos hígidos sem alopecia

(controles)......................................................................

Tabela 5

Apoptose de células tronco-foliculares e células

amplificadoras transitórias, da bainha radicular externa

da protuberância folicular, evidenciada pela técnica de

dupla marcação TUNEL/CK19 e pelo anticorpo anti-

caspase 3 clivada, na alopecia difusa não cicatricial de

pacientes HIV-1 positivos..............................................

Tabela 6

Apoptose de células tronco-foliculares e células

amplificadoras transitórias, da bainha radicular externa

da protuberância folicular evidenciada pela técnica de

dupla marcação TUNEL/CK19 e pelo anticorpo anti-

caspase 3 clivada em grupo controle de couro

cabeludo normal............................................................

xiv

Tabela 7

Correlação da incidência de apoptose das células

indiferenciadas pluripotenciais da protuberância

folicular no couro cabeludo de pacientes HIV-1

positivos, com alopecia difusa não cicatricial, com o

nível de células CD4+ apresentado pelos

pacientes........................................................................

RESUMO

Barcaui CB. Células-tronco foliculares na alopecia difusa não-cicatricial

de pacientes HIV positivos [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina,

Universidade de São Paulo; 2005. 89p.

INTRODUÇÃO: Aproximadamente 7% dos pacientes HIV positivos

apresentam alopecia difusa não-cicatricial (ADNC),

principalmente nos

estágios mais avançados da doença. Neste trabalho analisou-se as

alterações histológicas encontradas em cortes transversais de couro

cabeludo de pacientes HIV-1 positivos com ADNC, constatou-se a

ocorrência de apoptose das células indiferenciadas pluripotenciais da

protuberância folicular e comparou-se sua incidência com a de couro

cabeludo de indivíduos hígidos. Observou-se se houve correlação da

frequência de apoptose com o grau de imunodeficiência apresentado por

esses pacientes. MÉTODOS: Fez-se estudo de tipo caso-controle para

comparar os achados histológicos e frequência de apoptose de células

tronco foliculares e células amplificadoras transitórias, da protuberância

folicular, através de técnica de dupla marcação com anticorpo anti-

citoqueratina 19/TUNEL e técnica imuno-histoquímica com anticorpo anti-

caspase 3 clivada, em cortes transversais de couro cabeludo de 15

pacientes HIV-1 positivos com ADNC e de 12 controles sadios. Verificou-se

se havia correlação entre a freqüência de apoptose, na protuberância

folicular, com a contagem de linfócitos T CD4+ no sangue dos pacientes,

através do teste de correlação de Pearson. RESULTADOS: O exame

histopatológico demonstrou maior desorganização das fibras colágenas

perifoliculares nos casos quando comparados aos controles. A média do

número de unidades foliculares foi de 9,2 (±1,1) nos casos e de 9,8 (±1,1)

nos controles. A proporção de folículos telógenos foi maior nos casos (7%

±6%) do que nos controles (2%±12%). Não foi observado infiltrado

inflamatório perifolicular em nenhum dos casos e controles. Apoptose de

células tronco-foliculares e amplificadoras transitórias na protuberância

folicular foi demonstrada pela dupla marcação TUNEL/CK19 em 80% dos

casos e em 25% dos controles e, pelo anticorpo anti-caspase 3 clivada em

61% dos casos e 16% dos controles. Não houve correlação entre a

frequência de apoptose de células da protuberância folicular e níveis de

linfócitos T CD4+ no sangue dos pacientes HIV-1 positivos. CONCLUSÕES:

O quadro histopatológico da ADNC de pacientes HIV-1 positivos

caracterizou-se pela desorganização estrutural das unidades foliculares e

maior número de folículos telógenos quando comparado ao couro cabeludo

de indivíduos hígidos sem alopecia. Demonstrou-se apoptose de células

indiferenciadas pluripotenciais (células tronco e células amplificadoras

transitórias) da bainha radicular externa da protuberância folicular na ADNC

de pacientes HIV-1 positivos. Entretanto, a apoptose não parece ser

resultante de quadro de foliculite citotóxica, uma vez que não foram

observadas alterações inflamatórias em todos os casos estudados. O

fenômeno da apoptose das células indiferenciadas pluripotenciais (células-

xvi

tronco e células amplificadoras transitórias) presentes na bainha radicular

externa, na região da protuberância folicular, foi observado com uma

freqüência maior na ADNC de pacientes HIV-1 positivos, do que no couro

cabeludo de indivíduos hígidos, sem alopecia. A incidência de apoptose das

células indiferenciadas pluripotenciais (células-tronco e células

amplificadoras transitórias), presentes na região da protuberância folicular,

do couro cabeludo de pacientes HIV-1 positivos com ADNC, não guardou

relação com o grau de imunodepressão desses pacientes.

Descritores: 1.HIV 2.CÉLULAS-TRONCO 3.FOLÍCULO PILOSO

4.ALOPECIA

xvii

SUMMARY

Barcaui CB. Hair follicle stem cells in diffuse non-scarring alopecia in

HIV positive patients. [thesis]. São Paulo: Faculdade de Medicina,

Universidade de São Paulo; 2005. 89p.

INTRODUCTION: Approximately 7% of HIV positive patients presents diffuse

non-scarring alopecia (DNSA). This kind of alopecia is observed mainly in

the late stages of acquired immune deficiency syndrome. This research

contains an analysis of the histopathological aspects observed in transverse

scalp sections of HIV-1 positive patients with DNSA. The occurrence of

apoptosis of the undifferentiated pluripotencial bulge cells was demonstrated

and its incidence was compared with a control normal group. It was verified

whether there was a correlation between the apoptosis frequency and the

immunodeficiency stage of the patients. METHODS: A case-control study

was performed in order to compare the histopathological aspects and bulge

cells apoptosis on the transverse scalp samples of 15 HIV-1 positive patients

with DNSA and 12 healthy controls. The apoptosis was demonstrated

through immunohistochemical technique using anti-cytokeratin 19/TUNEL

double labeling and cleaved caspase 3 antibody. The correlation between the

apoptosis frequency and the immunodeficiency stage of the patients was

verified through the statistical test of correlation of Pearson. RESULTS: The

histopathological analysis revealed perifollicular collagen bundles

disorganization in DNSA samples. The mean of follicular units in the cases

was 9.2 (±1.1) and, in the controls, 9.8 (±1.1). The proportion of telogen

follicles was higher in cases (7%±6%) than in controls (2%±12%). No

perifollicular inflammatory infiltration was observed neither in cases nor in the

controls. Hair follicle stem cell and transit amplifying cells apoptosis was

demonstrated through double labeling with CK19/TUNEL in 80% of the cases

and 25% of the controls, and through the anti-cleaved caspase 3 antibody in

61% of the cases and 16% of the controls. There was no correlation between

bulge cell apoptosis and the CD4+ lymphocytes blood levels in the HIV-1

positive patients. CONCLUSIONS: Through the case control study

performed, it was demonstrated that DNSA in HIV-1 positive patients was

characterized by the structural disorganization of the follicular units and a

higher number of telogen follicles. Apoptosis of the undifferentiated

pluripotencial cells (stem cells and transit amplifying cells) of the outer root

sheath at the bulge was demonstrated in DNSA HIV-1 positive patients.

Nevertheless, the apoptosis doesn’t seem to be related to a cytotoxic

folliculitis, since no inflammatory alterations were observed in any of the

studied cases. Apoptosis of the undifferentiated pluripotencial cells (stem

cells and transit amplifying cells), present at the outer root sheath at the

bulge level, proved to be more frequent in DNSA HIV-1 patients than in the

scalp of healthy non-alopecic subjects. The incidence of apoptosis of the

undifferentiated pluripotencial cells (stem cells and transit amplifying cells)

present at the bulge of HIV-1 positive patients with DNSA, showed no

correlation with the degree of immunosuppression of the patients.

Key words: 1.HIV 2.STEM CELLS 3.HAIR FOLLICLE 4.ALOPECIA

1. INTRODUÇÃO

Diferentes alterações capilares são relatadas na infecção pelo vírus

da imunodeficiência 1 (HIV-1). Em pacientes com síndrome da

imunodeficiência adquirida (AIDS), os cabelos tendem a se tornar mais lisos,

finos e descolorados.

Apesar de se tratar de um problema eminentemente

estético, a alopecia pode afetar a auto-estima do indivíduo e

consequentemente suas relações sociais e qualidade de vida.

Estima-se

que aproximadamente 7% dos pacientes HIV-1 positivos apresentam

alopecia difusa não-cicatricial,

principalmente nos estágios mais avançados

da doença com níveis baixos de células CD4+.

Dentre os mecanismos

etiopatogênicos envolvidos temos a própria infecção pelo HIV-1, infecções

oportunistas, deficiências nutricionais, distúrbios imunológicos, endócrinos e

utilização de diversas drogas. Como consequência, há uma interrupção do

ciclo folicular seguida de um eflúvio anágeno ou telógeno, dependendo do

grau da agressão.

O folículo piloso é um micro-orgão anexo da pele de mamíferos

responsável pela produção de pêlos. Diferentemente da epiderme

interfolicular, que permanece em constante estado de auto-renovação, o

folículo piloso apresenta um comportamento cíclico. Períodos de alta

atividade mitótica e de diferenciação celular (fase anágena) são

interrompidos por uma fase de remodelação (catágena), seguidos por um

período de quiescência (fase telógena) para, em seguida, iniciar novamente

seu crescimento. Durante esses três processos evolutivos distintos, um

princípio básico tem que ser respeitado: o equilíbrio entre proliferação,

diferenciação e morte celular programada - apoptose. O balanço desse

equilíbrio é a chave para o controle do crescimento e regressão do folículo

piloso e é o fator determinante para o tratamento de distúrbios do ciclo

folicular.

A apoptose de células-tronco, apesar de parecer paradoxal, é um

fenômeno encontrado, de forma fisiológica, em outros tecidos com poder de

auto-renovação. No folículo piloso, está correlacionada com o

remodelamento estrutural que ocorre durante a fase catágena.

Na alopecia

difusa de pacientes HIV-1 positivos, Smith et al.

, em 1996, descreveram

queratinócitos apoptóticos na protuberância folicular como um achado

característico dessa forma de alopecia. Porém, até o momento, nenhum

estudo comparativo foi realizado.

Nosso principal objetivo foi constatar a ocorrência de apoptose nas

células indiferenciadas (células-tronco e células amplificadoras transitórias)

da protuberância folicular em pacientes HIV-1 positivos com alopecia difusa

não cicatricial. Através de técnicas de biologia molecular e de

imunohistoquímica aplicadas em cortes transversais de couro cabeludo

realizamos um estudo caso-controle, no qual comparamos os achados

obtidos em 15 pacientes HIV-1 positivos com alopecia difusa não-cicatricial e

12 controles hígidos sem alopecia.

2. OBJETIVOS

A - Analisar as alterações histológicas encontradas em cortes

transversais de couro cabeludo de pacientes HIV-1 positivos com alopecia

difusa não cicatricial.

B - Constatar a ocorrência do fenômeno da apoptose das células

indiferenciadas pluripotenciais (células-tronco e células amplificadoras

transitórias) da protuberância folicular do couro cabeludo de pacientes HIV-1

positivos com alopecia difusa não cicatricial.

C - Comparar a incidência de apoptose das células indiferenciadas

pluripotenciais da protuberância folicular do couro cabeludo de pacientes

HIV-1 positivos com alopecia difusa não cicatricial e do couro cabeludo de

indivíduos hígidos.

D - Correlacionar a incidência de apoptose das células indiferenciadas

pluripotenciais da protuberância folicular no couro cabeludo de pacientes

HIV-1 positivos, com alopecia difusa não cicatricial, com o grau de

imunodeficiência apresentado por esses pacientes.

3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Alopecia na infecção pelo HIV

A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) pode se

apresentar com quatro fases distintas em sua evolução: infecção aguda,

período assintomático, linfadenopatia persistente generalizada e fase

sintomática, que inclui a síndrome da imunodeficiência adquirida. Em todos

os estágios da infecção podem ocorrer manifestações dermatológicas,

desde a erupção cutânea roseoliforme, vista na infecção aguda até as

alterações associadas à imunodeficiência propriamente dita, como infecções

oportunistas e o sarcoma de Kaposi. Estas últimas encontradas na fase mais

avançada da doença. Assim como a pele, os fâneros também podem

apresentar manifestações como a síndrome das unhas amarelas encontrada

na pneumocistose, alongamento dos cílios associado ao aumento da

prolactina sérica, canície precoce, alopecias e outras.

7,8

A adoção de esquemas terapêuticos combinados mais agressivos, a

chamada terapia anti-retroviral altamente ativa (“highly active antiretroviral

therapy” ou HAART), provocou uma mudança substancial na expectativa e

na qualidade de vida dos pacientes infectados pelo HIV. As classes de

drogas utilizadas compreendem os inibidores da enzima viral protease e os

inibidores da enzima transcriptase reversa nucleosídeos, não-nucleosídeos e

nucleotídeo. A HAART é capaz de reduzir a replicação viral, elevar o número

de células CD4+ e, consequentemente, diminuir a prevalência de infecções

oportunistas, a taxa de progressão da infecção pelo HIV, o número de

internações e de óbitos.

9-12

Com o advento da HAART também houve uma

significativa mudança na prevalência das doenças cutâneas. O número de

infecções oportunistas diminuiu, acompanhado de um aumento das reações

alérgicas medicamentosas, principalmente associadas aos inibidores de

protease. Curiosamente, a dermatite seborréica também apresentou uma

diminuição de sua intensidade e extensão, provavelmente, relacionada com

a redução da secreção sebácea e a diminuição da população de

Pityrosporum ovale ocasionadas pelo efeito retinóide-símile de alguns

inibidores de protease. Por outro lado, houve o aumento da incidência de

outras manifestações como a lipodistrofia e a lipomatose difusa. Queixas

que até então não motivavam o paciente a procurar auxílio médico, como

onicodistrofias e alopecias, passaram a constar na lista dos principais

motivos de consulta ao dermatologista.

Diferentes alterações capilares são relatadas na infecção pelo HIV.

Em pacientes com AIDS, os cabelos tendem a se tornar mais lisos, finos e

descolorados.

Apesar de se tratar de um problema eminentemente estético,

a alopecia pode afetar a auto-estima do indivíduo e, consequentemente,

suas relações sociais e qualidade de vida.

Estima-se que

aproximadamente 7% dos pacientes HIV positivos apresentam alopecia

difusa

principalmente nos estágios mais avançados da doença com níveis

baixos de células CD4+.

Dentre os mecanismos etiopatogênicos envolvidos,

temos a própria infecção pelo HIV, infecções oportunistas, deficiências

nutricionais, distúrbios imunológicos, alterações endócrinas e utilização de

diversas drogas. Como consequência, há uma interrupção do ciclo folicular

seguida de um eflúvio anágeno ou telógeno, dependendo do grau da

agressão. Outra forma de alopecia relatada em pacientes HIV positivos é a

areata, inclusive em sua forma universal.

13-15

Existem ainda na literatura

relatos de alopecia induzida pelos inibidores da protease, em particular o

indinavir, cujo mecanismo etiopatogênico parece estar relacionado com os

efeitos retinóide-símiles dessa droga.

16,17

Smith et al.

, em um trabalho envolvendo 10 pacientes HIV-1 positivos

com alopecia difusa não-cicatricial, relataram a presença de queratinócitos

apoptóticos na bainha radicular externa ao nível da protuberância

18,19

bojo

(bulge), onde estão albergadas as células-tronco foliculares.

autores também descreveram infiltração inflamatória perifolicular, leve a

moderada, como um achado significante. Baseados no fato da protuberância

também ser o sítio folicular mais acometido na doença enxerto versus

hospedeiro (DEVH),

22,23

onde as células-tronco são o principal alvo, os

autores levantaram a hipótese de que uma reação auto-imune (DEVH-

símile) pudesse ser um dos mecanismos envolvidos na patogênese dos

distúrbios causados pelo HIV, incluindo a alopecia.

3.2 Células-tronco do epitélio folicular

A manutenção da homeostase de qualquer tecido com poder de auto-

renovação depende da presença e da integridade das células-tronco ou

células-mãe. As células-tronco são células progenitoras indiferenciadas tanto

bioquímica quanto ultra-estruturalmente. Possuem um alto potencial

proliferativo e são capazes de dar origem a todos os elementos de um

determinado tecido (multipotentes).

São clonogênicas in vitro e possuem

um ciclo celular longo e lento, provavelmente para conservar seu potencial

proliferativo e minimizar as chances de erros de DNA que podem ocorrer

durante a replicação.

Podem ser estimuladas a proliferar em resposta à

cicatrização e a fatores de crescimento e, frequentemente, estão localizadas

em áreas bem protegidas, bem vascularizadas e inervadas.

Devido a seu ciclo celular ser lento, a divisão das células-tronco é um

evento relativamente raro e muito bem regulado. Em média, uma das duas

células-filhas derivadas de sua divisão irá deixar o nicho onde está situada

sua progenitora e irá se transformar em uma célula amplificadora, com

potencial proliferativo limitado, fadada à diferenciação terminal. As outras

células-filhas permanecem indiferenciadas, mantendo assim a fonte para

renovação celular do tecido. A multiplicação mitótica das células derivadas

da célula-mãe, situadas nos estágios intermediários de maturação, é

suficiente para manter o equilíbrio da cinética tecidual normal (crescimento x

diferenciação x morte celular), o que justifica o pequeno número de células-

tronco encontrado, por exemplo, na medula óssea.

As células oriundas das células-tronco, ao deixararem o nicho onde

se encontram, tornam-se células amplificadoras transitórias (TAC - “transit

amplifying cells”). As TAC possuem potencial proliferativo limitado e quando

esse potencial se esgota, elas se tornam pós-mitóticas. Existe uma

hierarquia entre as TAC, que vai desde a célula jovem capaz de várias

divisões, até as células mais maduras, com pouca capacidade de divisão.

Devido à dificuldade em se estabelecer um marcador específico para

células-tronco, vários pesquisadores lançaram mão da cinética celular para

distinguir as células de ciclo lento (tronco) das TAC, que se proliferam mais

frequentemente.

21,28,29

Essa marcação geralmente é feita com timidina

tritiada (3HT) ou bromodeoxi-uridina (BrdU), de forma que as células com

ciclo lento retêm a marcação por um período maior (4-8 semanas).

O folículo piloso é um micro-orgão anexo da pele de mamíferos

responsável pela produção de pêlos. Diferentemente da epiderme

interfolicular, que permanece em constante estado de auto-renovação, o

folículo piloso apresenta um comportamento cíclico. Períodos de alta

atividade mitótica e de diferenciação celular (fase anágena) são

interrompidos por uma fase de remodelação (catágena), seguidos por um

período de quiescência (fase telógena) para, em seguida, iniciar novamente

seu crescimento.

Um grupamento de células epiteliais relativamente indiferenciadas,

denominadas células matriciais, situadas na base do bulbo folicular foi

considerado durante muito tempo como sendo as células-tronco foliculares.

A natureza pluripotencial dessa população celular foi atribuída à sua

capacidade de originar linhagens celulares distintas (medula, córtex,

cutículas, camadas de Huxley e Henle), de acordo com sua diferenciação,

durante a fase anágena.

O papel das células matriciais, como células-

tronco foliculares, começou a ser questionado quando foi demonstrado que

o bulbo pode ser gerado a partir das células da bainha radicular externa

(BRE) folicular, após as células matriciais terem sido totalmente destruídas

por raios X.

Oliver et al.

32,33

e Ibrhaim et al.

, demonstraram que vibrissas

de ratos são capazes de se regenerar após a excisão cirúrgica de seus

bulbos que contém as células matriciais.

A pesquisa da cinética celular com 3 HT aplicada ao FPS levou, em

1990, à descoberta de que as células retentoras de marcação estão restritas

à BRE ao nível da inserção do músculo eretor do pêlo (MEP), em uma

região denominada protuberância ou bojo folicular. As células

indiferenciadas da protuberância folicular apresentam atributos importantes

que as caracterizam como células-tronco: (1) as células das porções

superiores do FPS, incluindo a protuberância, apresentam maior capacidade

de crescimento in vitro quando comparadas com células de outras porções

do FPS e da epiderme;

35,36

(2) as células, normalmente quiescentes da

protuberância, atravessam um período transitório de proliferação celular

durante o início da fase anágena ou após serem estimuladas (p.ex. por

arrancamento da haste pilosa, pela ação de ácido retinóico e forbol éster),

dando origem as TAC, de ciclo celular rápido

29,37

; (3) as células da

protuberância são relativamente indiferenciadas

21,38

; (4) a aplicação tópica

de um agente iniciador tumoral na pele de murinos, durante o início da fase

anágena (quando as células da protuberância folicular estão se dividindo),

produz um número maior de tumores do que a mesma aplicação durante a

fase telógena (quando as células da protuberância folicular estão

quiescentes). Partindo-se do princípio de que as células-tronco estão

envolvidas na formação de tumores, este fato não pode ser considerado

como uma mera coincidência e indica que as células-tronco foliculares

podem originar cânceres cutâneos, induzidos experimentalmente

O reconhecimento da localização exata das células-tronco no epitélio

folicular levantou a possibilidade de que interações específicas entre as

células-tronco da protuberância e as células mesenquimais da papila

folicular durante o início da fase anágena pudessem levar à “ativação” das

células quiescentes da protuberância – Teoria da Ativação das Células da

Protuberância.

(Figura 1) Segundo essa teoria, o FPS reinicia sua fase

anágena quando “sinais” da papila folicular ativam, de forma transitória, as

células quiescentes da protuberância de folículos telógenos, resultando na

geração das TAC. As TAC formam um novo germe secundário que, em

conjunto com a papila, formam o novo bulbo folicular. Conforme a papila é

empurrada para baixo pela projeção epitelial, as células-tronco da

potuberância retornam ao seu estado normal de quiescência. Após um

período de intensa proliferação, as TAC, de ciclo celular rápido, esgotam seu

potencial proliferativo e sofrem uma diferenciação terminal. Isso resulta na

degeneração (catágena) dos dois terços inferiores do folículo pilo-sebáceo

(FPS). Durante a fase catágena a papila folicular migra para cima e

posiciona-se na base do folículo telógeno. Essa localização ao lado da

protuberância é essencial para o re-início de outro ciclo. De todas as teorias

até então propostas para explicar a cinética do ciclo folicular, esta é

considerada a mais abrangente e amplamente aceita até o momento.

Figura 1 – Teoria da ativação das células da protuberância. Adaptado de

Sun TT, Cotsarelis G, Lavker RM. Hair follicular stem cells: The bulge

activation hypothesis. J Invest Dermatol. 1991; 98:77s–78s. As células-

tronco são ativadas/estimuladas ao final da fase telógena, pelo contato com

as células da papila folicular. Em seguida, apresentam um período transitório

de proliferação durante o início da fase anágena. A partir dessa proliferação

celular forma-se o germe secundário, que são as células existentes na

matriz, as quais sofrem uma amplificação transitória, levando à formação de

um novo bulbo e que são capazes de se diferenciar em medula, córtex e

cutícula pilar. Durante a fase anágena IV, as células da papila folicular

proliferam e apresentam uma “descondensação” transitória. O contato entre

a papila e área saliente é de fundamental importância para que haja o início

de um novo ciclo.

NÁGENO IIANÁGENO IV

tiva

ão

tiva

ão

ANÁGENO VI

CATÁGENO TELÓGENO

Porção

permanente

Ativação

ANÁGENO IV

NÁGENO II

*1- Unna PG. Arch Microskop Anat Entiwicklungsmech. 1846; 12:665-741.*2- Sthor P. Anat

Hefte Abt. 1903; 23:1-66.

A protuberância folicular, considerada anteriormente um mero

acidente anatômico, onde se dá a inserção do músculo eretor do pêlo, foi

originalmente descrita por Unna (1876)*1 e por Sthor (1904)*2 apud

Cotsarelis (1990),

com o nome de “Der Wulst” e, posteriormente, chamada

de “bulge”, por autores de origem anglo-saxônica.

41,42

Essa área protrusa

está situada abaixo da abertura do ducto da glândula sebácea, e delimita o

final da porção permanente do folículo piloso. Durante o período embrionário

(16-18 semanas), apresenta-se como uma estrutura proeminente,

hemisférica, composta por queratinócitos indiferenciados, podendo

ultrapassar até mesmo o tamanho do bulbo.

Representa o brotamento

mais inferior, encontrado na face posterior, do germe epitelial primário. Em

folículos terminais de adultos, apresenta-se como uma zona levemente

saliente da bainha radicular externa, na qual podem ser evidenciadas células

epiteliais com núcleos grandes e claros.

A protuberância folicular pode

apresentar variações morfológicas normais, como projeções epiteliais em

forma de vilosidades ou brotamentos, de tamanho e formato variáveis.

determinadas condições, como na psoríase e durante a regeneração

epidérmica, também podem ocorrer alterações de sua morfologia.

As células epiteliais da BRE ao nível da protuberância folicular

expressam citoqueratinas, moléculas de adesão celular, citoquinas e

receptores de fatores de crescimento, que são distintos daqueles

encontrados em outras células epidérmicas.

45-47

Através da demonstração

do baixo nível da enzima telomerase, Ramirez et al,

em 2000,

comprovaram o baixo índice de atividade mitótica existente

nessa região. Ultra-estruturalmente, as células encontradas nessa região

possuem achados característicos de células indiferenciadas como

ribossomas abundantes, partículas de glicogênio e organelas

citoplasmáticas esparsas.

Taylor et al

, em 2000, demonstraram, em murinos, que as células

derivadas das células-tronco da protuberância podem dar origem a vários

compartimentos do FPS, incluindo a parte inferior da BRE, matriz e medula.

Esses achados deixam claro que as células da protuberância dão origem às

células multipotentes indiferenciadas da matriz, que são capazes de gerar a

haste pilosa. Oshima et al

, em 2001, demonstraram que a região da

protuberância da vibrissa de murinos, que expressa [beta]-galactosidase

quando transplantada para vibrissa de ratos normais, pode dar origem a

todas as células do epitélio folicular, assim como produzir a haste pilosa.

Recentemente,

foi demonstrado que as células da protuberância expressam

o gene da nestina e que podem dar origem ou fornecer as células endoteliais

que constituem os vasos sanguíneos da pele.

Lavker et al

demonstraram o caráter multipotente das células-tronco

foliculares e propuseram a existência de uma unidade epidermo-pilo-

sebácea, na qual as células derivadas das células-tronco da protuberância

folicular dão origem não só à haste pilosa, mas também à epiderme e à

glândula sebácea. (Figura 2) Taylor et al.

demonstraram que as células

originadas na protuberância folicular migram para a epiderme e continuam a

proliferar, contribuindo para a homeostase da epiderme. Morris et al.

Blanpain et al.

, em 2004, demonstraram que células isoladas da

protuberância folicular, são capazes de reconstituir todo o epitélio cutâneo.

Com base nessas informações, pode-se concluir que a protuberância

folicular é o maior reservatório de queratinócitos da pele e que, portanto,

deve ser considerada como a principal fonte de células-tronco epidérmica

Em 2002, Ito et al.

demonstraram que as células da protuberância

entram em apoptose após a depilação mecânica da haste pilosa. Essas

células são substituídas por células do germe secundário em um processo

que os autores denominaram de “desdiferenciação”. A protuberância sofre

uma diminuição e um remodelamento durante a fase catágena devido à

apoptose.

Figura 2 – Representação esquemática da unidade epidermo-pilo-sebácea.

Adaptado de: Lavker RM, Miller S, Wilson C, Cotsarelis G, Wei ZG, Yang JS,

Sun TT. Hair follicle stem cells. Their location, role in hair cycle, and

involvement in skin tumor formation. J Invest Dermatol. 1993; 101:16S–26S.

As células da protuberância através da via 1 dão origem às células

amplificadoras transitórias da matriz, capazes de formar a haste pilosa.

Através da via 2, as células da protuberância dão origem às células

progenitoras da epiderme.

3.3 Protuberância folicular nas alopecias

Independentemente da forma de agressão (inflamatória, traumática,

tumoral ou degenerativa), o esgotamento do potencial proliferativo das

células-tronco pode levar a uma perda irreversível da capacidade

regenerativa tecidual, cuja representação clínica, em se tratando do folículo

piloso, seria a alopecia. Segundo a “teoria da ativação das células da

protuberância”, quatro elementos são fundamentais para o controle do ciclo

folicular: ativação da protuberância, ativação da papila dérmica, potencial

proliferativo limitado das células matriciais e a migração para cima da papila

folicular. Uma alteração em qualquer um desses elementos pode resultar em

uma alteração do crescimento ou perda do pêlo.

3.3.1 Alopecia da doença enxerto versus hospedeiro (DEVH) – foliculite

citotóxica

Apesar da patogênese da doença enxerto versus hospedeiro ainda

não estar totalmente esclarecida, sabe-se que as células-alvo da resposta

imune celular na pele são as células-tronco epidérmicas encontradas nas

cristas interpapilares. Murphy et al.

demonstraram que, assim como as

células-tronco da epiderme interfolicular, as células-tronco da protuberância

de folículos anágenos também são seletivamente atingidas durante a fase

aguda da doença, levando a um quadro conhecido como foliculite citotóxica.

Os infiltrados de células T encontrados na região da protuberância precedem

a infiltração da epiderme interfolicular e estão associados à transição do

folículo acometido para a fase telógena. Esta observação levou os autores a

especularem sobre o valor do achado histopatológico da foliculite citotóxica

como indicador precoce da DEVH, mesmo antes de haver um dano

significativo da epiderme. Sale et al.

compararam o comprometimento da

região da protuberância com a lesão dos bulbos foliculares de 22 pacientes

com DEVH. Em 19 casos houve um dano preferencial da protuberância, dois

acometeram as duas regiões e em um nenhuma das regiões foi atingida.

3.3.2 Líquen plano pilar

O líquen plano pilar é caracterizado clinicamente pela presença de

pápulas foliculares ceratósicas que, frequentemente, evoluem com a

formação de áreas de alopecia cicatricial. Essa, em seu estágio final, não

pode ser diferenciada da alopecia decorrente de outras doenças

inflamatórias que levam à destruição do FPS e à fibrose.

Mehregan et al.

, após realizarem um estudo clínico-patológico de

45 casos de liquen plano pilar, observaram que a região mais atingida do

epitélio folicular parece ser o infundíbulo, sendo que o istmo é acometido em

1/3 dos casos. Em todos os casos o infiltrado inflamatório poupou a região

do bulbo folicular. Tais achados justificariam o porquê do caráter cicatricial

desta forma de alopecia, uma vez que o compartimento onde estão situadas

as células-tronco é frequentemente envolvido.

3.3.3 Alopecia no lupus eritematoso discóide

Assim como o líquen plano pilar, o lupus eritematoso discóide pode

levar a um quadro de alopecia cicatricial, decorrente da destruição

irreversível do epitélio folicular. O acometimento, predominantemente, do

istmo pelo infiltrado inflamatório e não da papila folicular, parece indicar a

importância da integridade das células-tronco da protuberância folicular na

gênese desta forma de alopecia.

3.3.4 Alopecia areata

A alopecia areata é caracterizada, fundamentalmente, pela presença

de um infiltrado inflamatório mononuclear peribulbar, pelo aumento da

expressão da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e dos antígenos

HLA-DR na porção folicular inferior. A região da protuberância folicular é

poupada.

Embora seja considerada uma forma de alopecia inflamatória,

não possui um caráter cicatricial, sendo observada a repilação da área

comprometida.

3.3.5 Alopecia androgenética

A alopecia androgenética (AAG) caracteriza-se por ser um processo

espontâneo, progressivo e irreversível, no qual as células da matriz folicular

perdem o seu potencial de produzir um novo ciclo anagênico ao longo dos

anos, levando a uma miniaturização dos folículos do couro cabeludo.

Jaworsky et al.

, a partir de um estudo histológico, imunohistoquímico e

ultra-estrural de 4 pacientes com AAG, demonstraram que em áreas

transicionais (alopécicas x não alopécicas) havia infiltração de células T

ativadas ao redor da protuberância, levando à indução de antígenos de

classe II na adventícia de vênulas do tecido conjuntivo e hiperplasia de

células dendríticas CD1a positivas. Embora essa reação mediada por

células possa ser encarada como secundária à ação androgenética no

metabolismo folicular, foi sugerido que a fibrose progressiva da bainha

perifolicular, que ocorre na alopecia androgenética, possa ser decorrente da

ação de linfócitos T ativados no reservatório de células-tronco. “Apesar de

não ter sido evidenciada uma citotoxicidade direta na população de células-

tronco, é possível que mediadores solúveis resultantes do processo de

inflamação criem um ambiente local deletério às estimulações cíclicas das

células-tronco”. Assim como o acometimento da protuberância, o

espessamento da bainha de tecido conjuntivo pode levar a uma interrupção

do ciclo folicular, resultando na queda do cabelo.

Em nossa dissertação de Mestrado, após compararmos a densidade

de estruturas foliculares com a densidade de folículos que apresentavam

células CK19+ da protuberância folicular (células-tronco) das regiões

acometida e não acometida do couro cabeludo de pacientes com alopecia

androgenética, concluímos que quanto menor é a relação folículos

terminais/velos mais difícil é a identificação da área de inserção do músculo

eretor do pêlo/protuberância e, menor é o número de folículos que

apresentam células CK19 positivas.

Cowper et al.

, em 2002, relataram um aumento da expressão de

Bcl-2 nas regiões acometidas pela AAG. Foi sugerido que um aumento da

susceptibilidade aos mediadores da expressão do Bcl-2, ou que uma

resposta alterada dos receptores de Bcl-2, nessas regiões, possam estar

envolvidos na gênese da AAG. Os autores descreveram ainda que os sítios

TUNEL positivos encontrados na região do istmo/protuberância em couro

cabeludo de murinos, também ocorrem em humanos.

3.3.6 Foliculite de células-tronco

Kossard

, em 1999, relatou o caso de uma paciente de 34 anos,

com história de queda de cabelos difusa não-cicatricial, com evolução de 8

anos. No exame histopatológico do couro cabeludo foram observadas

miniaturização folicular e a presença de infiltrado inflamatório,

predominantemente linfocítico, em cunha, concentrado ao redor da

protuberância folicular. A ausência de qualquer outro dado clínico

significativo e a evolução difusa, arrastada do quadro levou o autor a cogitar

a hipótese da existência de um quadro de foliculite de células-tronco como

entidade isolada, e não como parte de processos mais complexos como a

DEVH e a alopecia areata.

3.4 Apoptose

É uma forma de morte celular, muito bem regulada, que obedece

padrões morfológicos e bioquímicos característicos. Distingue-se da

necrose por dois aspectos básicos: primeiro, porque é um processo ativo

durante o qual os constituintes celulares se reorganizam e se agrupam,

sendo a célula fragmentada em componentes envoltos por uma membrana

(corpos apoptóticos), os quais não sofrem autólise, mas são fagocitados por

células residentes no tecido enquanto ainda estão viáveis; o outro aspecto é

que a apoptose acomete células individualmente ou pequenos grupos

celulares.

Por acometer células de forma isolada e por não induzir exsudação de

fagócitos, a apoptose não é facilmente visível à microscopia óptica. Sua

principal característica é uma acentuada retração da célula, que chega a

perder um terço de seu volume, em alguns minutos.

O mecanismo

responsável por essa contração celular ainda não é totalmente conhecido,

mas está relacionado com a troca de íons e de água através da membrana

plasmática. Os característicos fragmentos ou corpos apoptóticos basofílicos,

podem ser vistos no interstício ou no interior de outras células. São

estruturas diminutas e possuem vida curta, sendo removidos do tecido em

um período de horas. Desta forma, a quantificação de um índice apoptótico

através de um exame morfológico isolado pode ser difícil. À microscopia

eletrônica, as células em apoptose são facilmente identificáveis. O núcleo

mostra cromatina agrupada, formando massas junto à membrana nuclear; o

contorno nuclear fica progressivamente irregular (aspecto cerebriforme), os

poros da membrana nuclear desaparecem e esta termina por se romper,

ficando os fragmentos nucleares dispersos no citoplasma. Este se desidrata

e condensa; as organelas agrupam-se, mas mantêm seu padrão morfológico

característico; as microvilosidades desaparecem, os aparelhos juncionais se

desfazem e surgem depressões ou fendas na membrana que

progressivamente separa a célula em glóbulos delimitados por membrana.

Esses podem ser observados no interstício ou no interior de células vizinhas.

Uma vez incorporados por endocitose, os corpos apoptóticos são digeridos

pela ação das enzimas lisossômicas.

A apoptose é encontrada nos processos chamados de morte

fisiológica, como os que ocorrem durante a morfogênese de órgãos, tanto na

vida embrionária quanto após o nascimento. Atua como um mecanismo

regulador do número de células e de defesa contra células danificadas,

infectadas por vírus ou transformadas. Pode ser observada durante a

involução da glândula mamária após a lactação ou no útero durante o ciclo

menstrual. A involução de órgãos hiperplasiados, após a cessação do

estímulo que produziu a hiperplasia, também depende da apoptose. Como

processo patológico, a apoptose é observada em lesões induzidas por

agressão imunitária celular (células T citotóxicas e natural killer), radiações

ionizantes, infecções virais (p.ex. hepatite viral e pelo HIV-1) ou por drogas

citostáticas. Particularmente marcante é a ocorrência da apoptose durante a

rejeição a enxertos.

3.4.1 Controle da apoptose

Independentemente do tipo celular ou sítio anatômico, a morfologia da

apoptose tende a ser estereotipada. Vias diferentes levam à ativação de um

mesmo mecanismo final.

Quatro receptores celulares estão envolvidos:

Fas (CD95)

, p55 TNF

, receptoresTRAIL/APO2-L (TNF “related apoptosis-

inducing ligand”) 1 e 2

. Eles se ligam respectivamente ao Fas-ligante (Fas-

L), TNF e TRAIL/APO 2-L. A ativação desses receptores mortais recruta

proteínas adaptadoras FADD (“Fas-associated death domain”),

71-73

TRADD

(TNF “receptor-associated death domain”) ou ambas

74,75

, que

sequencialmente ativam a família das enzimas caspases. Atualmente, 14

caspases são conhecidas. As caspases 3 (CPP32) e 8 (FLICE) estão

relacionadas com a apoptose mediada pelos receptores Fas, p55TNF e

TRAIL/APO.

76-81

As caspases ativadas catalisam a clivagem de outras

caspases, que por sua vez ativam várias proteases e endonucleases

celulares que clivam proteínas celulares estruturais e reguladoras, assim

como o DNA nuclear, levando as alterações morfológicas e bioquímicas

vistas na apoptose. O complexo de proteínas Fas, FADD e pró-caspase 8,

que desencadeia a apoptose também é conhecido pela sigla DISC (“death

inducing signaling complex”).

A apoptose induzida pela via Fas está relacionada primordialmente com

as seguintes situações: morte celular induzida por linfócitos T citotóxicos

(p.ex. células infectadas com vírus), destruição de linfócitos T ativados ao

final da resposta imune e destruição de células inflamatórias em sítios

imunologicamente privilegiados.

Diversos estímulos, que não os mediados pelos receptores, como

proteínas virais, quimioterápicos, radiação ultravioleta e ionizante, produzem

alterações mitocondriais que provocam a liberação de proteínas reguladoras

da apoptose (citocromo-c, fator ativador da protease apoptótica - Apaf-1 e

caspase 9), levando a ativação das caspases (pró-caspase 9) e a morte

celular.

82-85

Embora a apoptose clássica induzida pela via Fas leve a

ativação das caspases sem envolver a via mitocondrial (Tipo 1), certos tipos

de apoptose Fas-induzidas podem requerer a ativação mitocondrial (Tipo

2).

Outras proteínas que estão envolvidas na inibição da apoptose são: a c-

FLIP (“cellular FLICE-like inhibitory protein”), que se liga ao FADD e previne

a ativação da caspase 8; a família das proteínas inibidoras de apoptose

(IAP), incluindo a HIAP, XIAP e outras, que atuam através da inibição da

caspase 3; o Bcl-2 e proteínas afins, como Bax, Bcl XS, Bcl XL e Bad, que

regulam sinais intracelulares que ativam ou inibem a apoptose.

87-88

Como consequência da ativação da cascata das caspases temos as

alterações nucleares encontradas na apoptose como a clivagem do DNA

celular em unidades nucleossomais. Esse processo de fragmentação do

DNA é devido às seguintes alterações: 1) inativação de enzimas envolvidas

no reparo do DNA, como a poli (ADP-ribose) polimerase ou PARP; 2)

inativação de enzimas envolvidas na replicação celular, como a DNA

topoisomerase III; 3) quebra de proteínas nucleares estruturais, como as

lamininas (caspase 6); 4) fragmentação do DNA devido a ação da enzima

DNase ativada por caspase ou CAD.

3.4.2 Alterações das moléculas controladoras da apoptose na infecção

pelo HIV

Células obtidas de pacientes infectados pelo HIV e células infectadas in

vitro pelo HIV apresentam alterações moleculares nos receptores que

induzem a apoptose. As principais são:

A- Aumento da expressão na membrana de Fas e Fas-L através da

diminuição das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl XL e

aumento das proteínas pró-apoptóticas Bax e Bcl XS. Também há

uma diminuição dos níveis intracelulares de c-FLIP.

B- Aumento dos níveis séricos de TNF-α em pacientes sintomáticos.

A infecção de linfócitos e monócitos pelo HIV leva a um aumento

da produção de TNF-α. O TNF-α ativa a transcrição do fator NFk B,

que ativa a transcrição do HIV. Inicia-se um ciclo autócrino que

resulta em altos níveis de TNF-α e de transcrição de HIV.

C- Disfunção dos receptores TRAIL/APO2-L e do TRAIL/APO2-L.

3.4.3 Apoptose e auto-imunidade

A resposta imune a um agente externo envolve a proliferação de

linfócitos T e B. Após desempenharem seu papel, essas células devem ser

removidas da corrente sanguínea, restando apenas uma pequena população

de células de memória. Essa remoção é feita por apoptose. O não

reconhecimento dessas células, ou qualquer alteração na indução da

apoptose, podem levar a geração inapropriada de células T auto-reativas ou

auto-anticorpos.

Um modelo de alteração no mecanismo da apotose de linfócitos é, a

recentemente descrita, síndrome linfoproliferativa auto-imune.

O defeito

principal está relacionado com uma mutação nos receptores Fas e TNF,

resultando no acúmulo crônico de células linfóides não malignas nos

gânglios linfáticos e baço e no surgimento de clones auto-reativos,

responsáveis pelo desencadeamento de fenômenos de auto-imunidade.

3.4.4 Auto-imunidade e infecção pelo HIV

Pacientes infectados pelo HIV apresentam uma diminuição do número

de linfócitos CD4+ circulantes, resultando em imunodepressão e

susceptibilidade aumentada a infecções oportunistas e tumores. Embora a

produção de células CD4+ esteja comprometida, existem atualmente

evidências de que o motivo primordial para depleção de células CD4+ seja a

apoptose

. Apenas uma pequena fração desses linfócitos está de fato

infectada, indicando que o mecanismo que desencadeia a apoptose é outro,

e não a infecção viral das células em si. Proteínas virais (gp120, Nef, Tat,

Vpu, Vpr e protease) ligam-se ao CD4 de células não infectadas

ocasionando sua morte devido a uma reação cruzada. Os mecanismos

envolvidos estão relacionados com a ativação dos receptores de morte

celular: aumento da expressão do Fas (CD95), Fas-L (CD95L) e do TNFR-

TNF/TRAIL ; ou através da via mitocondrial: fosforilação da proteína p53,

aumento da expressão do Bax, dissipação do potencial transmembrana,

liberação do citocromo c e ativação das caspases.

91-94

Outro exemplo de auto-imunidade encontrada na infecção pelo HIV é

a presença de altos níveis de auto-anticorpos circulantes

, incluindo

anticorpos anti-nucleares, anti-fosfolipídeos, anti-músculo liso, anti-

plaquetários, anti-eritrócitos e fator reumatóide.

96-100

Manifestações clínicas

como vasculites sistêmicas,

101

síndrome de Reiter

102

, poliartrite

103

síndrome de Sjögren

104

também foram descritas no contexto da infecção

pelo HIV e outros vírus (p.ex. Epstein-Barr, citomegalovírus, hepatite A, B e

C).

3.5 Cinética tecidual da epiderme e do folículo pilo-sebáceo. Equilíbrio

entre proliferação, diferenciação e morte celular programada

A morte celular programada é o destino final dos queratinócitos

epidérmicos, do bulbo e da BRE folicular. Conforme vai ocorrendo a

diferenciação dos queratinócitos, há produção de filamentos protéicos

intermediários (queratina), enzimas (p.ex. transglutaminase) e proteínas

estruturais (p.ex. involucrina), que formam um envelope córneo rígido. A

desintegração nuclear dessas células ocorre por apoptose.

105

O folículo pilo-sebáceo (FPS) é um micro-orgão anexo do tecido

cutâneo caracterizado por sua natureza cíclica. Durante o seu

desenvolvimento e ciclo, o FPS atravessa repetidamente três padrões de

desenvolvimento. Inicialmente, durante sua morfogênese, dois grupamentos

celulares, um de células epiteliais e outro de células mesenquimais, se

entrelaçam e formam uma estrutura complexa responsável pela produção da

haste pilosa. Em segundo, durante a fase de involução (catágena) esse

complexo mini-orgão atravessa um processo muito bem controlado de

regressão, que leva a uma redução de seu comprimento, seguida de

reconstrução de um folículo menor que entra na fase de repouso (telógena).

Em terceiro, o FPS reinicia sua atividade, tornando novamente a fabricar a

haste pilosa (anágena).

106

Durante esses três processos evolutivos distintos,

um princípio básico tem que ser respeitado: o equilíbrio entre proliferação,

diferenciação e morte celular programada - apoptose. O balanço desse

equilíbrio é a chave para o controle do crescimento e regressão do FPS e é

o fator determinante para o tratamento de distúrbios do ciclo folicular.

104

A regressão, associada à fase catágena, é um processo único,

caracterizado pela apoptose maciça dos queratinócitos do bulbo piloso.

Mesmo durante os estágios iniciais da morfogênese do FPS, em murinos,

uma quantidade considerável de células apoptóticas pode ser detectada

através da microscopia eletrônica. A indução da apoptose vista durante o

período catágeno está relacionada com múltiplos fatores: Fas, TGF-β, TNF-

α, FGF-5, IGF-1, PTHrp, neurotrofinas e outros. Muller-Rover et al.

104

através de marcadores imunohistoquímicos relacionados com apoptose

(TUNEL, Bcl-2, Bax, enzima conversora da interleuquina 1-β, Fas/Apo-1, p55

TNFR e p75 NTR ), identificaram os principais sítios de apoptose no FPS

durante o ciclo folicular em murinos. Curiosamente, durante a fase anágena

(VI), células epiteliais TUNEL-positivas (apoptóticas) foram vistas na parte

distal da BRE, incluindo o istmo e a protuberância folicular, onde estão

situadas as células-tronco. Os queratinócitos nessa região mostraram-se

Bcl-2 (anti-apoptótico) positivos e Bax (pró-apoptótico) negativos. Em sua

discussão, os autores sugerem que a expressão de Bcl-2 talvez esteja

envolvida com a proteção da população de células-tronco contra a

diferenciação pós-mitótica, senescência e morte. Frente à quantidade

significativa de apoptose encontrada na BRE, nas porções distais ao MEP,

os autores questionaram o caráter permanente desta porção do FPS e

sugeriram que a indução da apoptose envolve o remodelamento de todo o

FPS de murinos e, não somente, as porções proximais. A apoptose de

células-tronco, em condições fisiológicas, é descrita em outros tecidos com

poder de auto-renovação. A provável causa seria o controle do número de

células ou a remoção de células danificadas, diminuindo, dessa forma, a

probabilidade de uma transformação carcinogênica.

107

A apoptose vista na

protuberância folicular durante a fase catágena pode estar simplesmente

relacionada com as alterações arquiteturais associadas com a regressão

folicular.

A alopecia relacionada com a infecção pelo HIV-1 é difusa e de tipo

não cicatricial. Caracteriza-se por alteração da textura e diminuição

progressiva da densidade dos cabelos. Os mecanismos patogenéticos

desse processo ainda não foram elucidados. Há um único trabalho na

literatura médica

que descreve a apoptose de células tronco-foliculares da

protuberância folicular, como um achado característico dessa alopecia e

propõe, para essa alopecia, um mecanismo semelhante ao observado na

DEVH. Entretanto, esses autores não realizaram estudo comparativo com

grupo controle de indivíduos hígidos não alopécicos.

A apoptose é evento que ocorre no processo do ciclo evolutivo e

remodelamento do FPS, particularmente na fase catágena. Na AIDS é

descrita a alteração de moléculas controladoras de apoptose, o que resulta

na facilitação desse processo.

Pareceu-nos interessante realizar estudo para caracterizar as

alterações histopatológicas e morfométricas da alopecia difusa não cicatricial

de grupo de doentes HIV-1 positivos. Assim como, demonstrar e comparar a

frequência de apoptose de células tronco-foliculares e amplificadoras

transitórias da protuberância folicular desses casos, comparando-os com

grupo controle de indivíduos não alopécicos.

4. MÉTODOS

4.1 Casuística

No período de janeiro de 2003 a janeiro de 2005, foram selecionados

pacientes HIV-1 positivos que, quando questionados, apresentavam como

queixa, uma diminuição do volume e/ou alteração da textura capilar e

apresentavam ao exame clínico alopecia difusa não cicatricial. Quinze

pacientes concordaram em participar do estudo. Sete pacientes eram do

sexo masculino e oito do sexo feminino, com idade variando entre 22 e 42

anos (média=35,3; DP=6,5), com níveis de CD4 variando entre 66 e 601

células/mm

(média=302,7; DP=134,5). Foram excluídos do estudo

pacientes que relatassem uma queda efetiva dos cabelos, ou

apresentassem qualquer outro tipo de alopecia (cicatricial, androgenética) e

eflúvio telógeno agudo. Adotamos como critério para o diagnóstico de eflúvio

telógeno agudo o teste de tração leve positivo, ou seja, o desprendimento de

mais de 10 fios capilares quando realizamos uma tração leve em todo o

couro cabeludo. (Tabela 1) (Figuras 3 e 4)

Como controle foram selecionados 12 indivíduos voluntários, hígidos,

cinco do sexo masculino e sete do sexo feminino, com idade variando entre

25 e 64 anos (média= 34,0; DP=11,0), que não apresentassem nenhum tipo

de queixa capilar ou forma de alopecia e não estivessem em uso de

qualquer medicação. (Tabela 2)

Tabela 1 - Caracterização dos pacientes HIV-1 positivos, com alopecia difusa não cicatricial, quanto ao sexo, idade, nível de

células CD4+ no sangue, data da confirmação da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana e drogas em uso na

ocasião do estudo.

CASO

SEXO

IDADE

(anos)

CD4

(céls/mm

)

DIAG. HIV

DROGAS

1 M 35 356 1995 laminovudina*, estavudina**, efavirenz*

2 M 41 401 1998 laminovudina*, zidovudina* efavirenz*, sulfametoxazol+trimetropin,

metronidazol, ciprofloxacina, haloperidol, captopril

3 M 37 200 2003 rifampicina, sulfametoxazol+trimetropin, insulina NPH

4 M 42 273 1999 sulfadiazina, pirimetamina, ácido fólico

5 M 40 300 2000 nelfinavir***, DDI

6 M 44 66 2000 laminovudina*, zidovudina*, indinavir***

7 M 41 215 1982 laminovudina*, zidovudina*, efavirenz*

8 F 35 398 1999 -

9 F 42 150 1998 nelfinavir*** e DDI

10 F 28 601 2002 laminovudina*, zidovudina*, efavirenz*, sulfadiazina, acido fólico,

pirimetamina, estavudina**

11 F 34 333 NR -

12 F 31 200 1994 -

13 F 31 301 1998 ampicilina, laminovudina*, zidovudina*, efavirenz*

14 F 22 267 2000 efavirenz*, laminovudina*

15 F 27 480 1999 AZT*, laminovudina*, efavirenz*, sulfametoxazol+trimetropin, azitromicina

M - sexo masculino; F - sexo feminino; CD4 (céls/mm

) - número de linfócitos CD4+/mm

; NR - não relatado; DIAG. HIV - ano do diagnóstico da

infecção pelo HIV-1; *inibidor da transcriptase reversa; **análogo da timidina; ***inibidor de protease; DDI - nucleosídeo inibidor da transcriptase

reversa

Figura 3- Alopecia difusa não cicatricial de paciente HIV-1 positivo. Aspecto

clínico da observação 9. Rarefação capilar difusa na região frontal.

Figura 4- Alopecia difusa não cicatricial de paciente HIV-1 positivo. Aspecto

clínico da observação 9. Paciente queixava-se de alteração do volume e da

textura capilar; região temporal esquerda.

Tabela 2- Grupo controle – dados de sexo e idade dos indivíduos hígidos

não alopécicos.

CONTROLE

SEXO

IDADE

(anos)

1 M 43

2 F 25

3 F 32

4 F 26

5 F 30

6 F 25

7 F 34

8 M 28

9 M 28

10 F 64

11 M 39

12 M 34

M - sexo masculino; F - sexo feminino

Após terem sido devidamente informados a respeito da pesquisa, na

qual estariam envolvidos e expresso, por escrito, seu desejo de participar

(Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Anexo 1), os pacientes

foram submetidos à biópsia de couro cabeludo da região occipital com

“punch” de 4 mm, sob anestesia local com lidocaína a 2%. Após ser fixada

em solução tamponada de formol a 10%, por um período mínimo de 24

horas, a amostra tecidual foi clivada no sentido transversal a 0,8 cm da

junção da derme com a gordura, segundo a técnica de Headington

modificada.

(Figura 5) Obtivemos, dessa forma, dois fragmentos de

formato cilíndrico, que foram marcados com tinta Nanquim, nas suas

superfícies de corte (superfície inferior do fragmento superior e a superfície

superior do fragmento inferior) e processados para inclusão em um único

bloco de parafina, com as superfícies marcadas voltadas para baixo. O

material emblocado em parafina foi submetido à microtomia para obtenção

de cortes histológicos de 4µm de espessura (dois cortes em cada lâmina)

colhidos em lâminas de vidro tratadas com solução adesiva de 3 amino-

propyltriethoxy-silane (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO/USA, cód.

A3648). Uma das lâminas foi corada pela técnica tricrômica de Gomori e os

demais destinados às técnicas imunohistoquímicas.

Figura 5- Representação esquemática da clivagem do material. Adaptado

de: Atlas of differential diagnosis of hair loss. Whiting D e Howsden FL.

Canfield Publishing. New Jersey, USA, 1998.

JDG – junção entre derme e tecido gorduroso da hipoderme.

0,8 cm

JDG

4.2 Análise histopatológica

Realizou-se análise morfométrica na qual foram levadas em

consideração as seguintes estruturas, encontradas em cada corte

histológico:

• Número de unidades foliculares

• Número total de folículos

• Número de folículos terminais

• Número de folículos velos

• Número de folículos anágenos

• Número de folículos catágenos

• Número de folículos telógenos

• Número de tratos fibrosos residuais

• Número de unidades telógenas germinativas

Para padronizar a coleta de dados, consideramos o maior número de

estruturas representado em um dos dois cortes histológicos presentes em

cada lâmina.

A contagem do número de unidades foliculares foi feita levando-se em

conta a quantidade de unidades foliculares anatomicamente completas

encontradas na área circunferencial da amostra. Em seguida, foi traçada

uma linha divisória no local de maior diâmetro da amostra, e as unidades

foliculares parcialmente representadas nas margens de um dos lados foram

somadas.

A classificação dos folículos pilosos em terminais ou velos foi baseada na

comparação entre a espessura da bainha radicular interna (BRI) folicular e o

diâmetro da haste pilosa, da seguinte maneira:

• Diâmetro da haste pilosa maior que a espessura da BRI - Pêlo terminal

• Diâmetro haste pilosa menor que a espessura da BRI - Pêlo velo

Para fins de classificação, não levamos em consideração a ocorrência de

pêlos intermediários. Tanto as unidades telógenas germinativas (TGU),

quanto os tratos fibrosos residuais (TFR) não foram contabilizados no

número total de folículos, mas como estruturas foliculares individuais.

O infiltrado inflamatório foi considerado presente ou ausente, de acordo

com o achado de células inflamatórias na região perifolicular.

4.3. Demonstração de apoptose de células tronco-foliculares e células

amplificadoras transitórias, da bainha radicular externa da

protuberância folicular

Com a finalidade de pesquisarmos a ocorrência do fenômeno da

apoptose nas células indiferenciadas pluripotenciais (células-tronco e células

amplificadoras transitórias) presentes na região da protuberância folicular

foi realizada a técnica da dupla marcação simultânea com o anticorpo anti-

citoqueratina 19 (CK19), marcador de células-tronco e pelo TUNEL

(Terminal deoxynucleotidyltransferase d-UTP fluorescein Nick-End Labeling),

marcador de apoptose.

Como segundo marcador de apoptose foi utilizado, de forma isolada

(não em dupla marcação), o anticorpo anti-caspase 3 clivada.

Anticorpo monoclonal anti-citoqueratina 19 (CK19)

Devido à falta da porção terminal não-α-helicoidal em sua estrutura, a

citoqueratina 19 é uma proteína que não possui a capacidade de formar

filamentos e sua expressão é considerada como um indicador de

indiferenciação celular. Narisawa et al.

108

, baseados em três fatos  que as

células-tronco são consideradas células relativamente indiferenciadas tanto

ultra-estruturalmente quanto bioquimicamente, que sua heterogenia

morfológica é interpretada como um achado indicativo de células

germinativas, e que até então não se conseguira isolar um marcador

imunohistoquímico específico para células-tronco  propuseram o uso de

anticorpos monoclonais específicos para citoqueratina 19, como uma

alternativa para demonstração direta dessa subpopulação de células. Michel

et al.,

109

demonstraram, através de estudos imunohistoquímicos, que a

citoqueratina 19 atuaria como um marcador bioquímico das células

germinativas pluripotenciais cutâneas in vivo e in vitro. Esses achados

corroboraram os de Stasiak et al.,

110

que demonstraram que os

queratinócitos basais da saliência folicular expressavam o gene da

citoqueratina 19.

TUNEL (Terminal deoxynucleotidyltransferase d-UTP fluorescein Nick-

End Labeling)

É sistema misto de biologia molecular e imunohistoquímica capaz de

identificar as quebras das fitas de DNA simples e de dupla hélice associadas

com apoptose, através da marcação enzimática do terminal livre 3`OH com

nucleotídeos modificados. As novas terminações de DNA, que são geradas

com a fragmentação da cromatina durante a apoptose, situam-se

caracteristicamente no núcleo e nos corpos apoptóticos. Caso o dano ao

DNA seja induzido por drogas não há marcação, exceto se houver indução

do mecanismo da apoptose. Os nucleotídeos modificados são

enzimaticamente ligados ao DNA fragmentado através da ação catalizadora

da transferase deoxinucleotidil terminal (TdT). Os nucleosídeos incorporados

formam oligômeros compostos por nucleotídeos conjugados à digoxigenina

e nucleotídeos não marcados em uma sequência randômica. Os fragmentos

de DNA marcados com nucleotídeos-digoxigenina ligam-se então a

anticorpos anti-digoxigenina conjugados à peroxidase. De acordo com

McCloskey et al.

111

, o TUNEL é o método mais específico para detecção de

apoptose em células do sangue periférico em pacientes HIV-positivos.

Protocolo utilizado para realização da dupla marcação - TUNEL e CK19:

1- Cortes histológicos de quatro micrômetros (colhidos em lâminas

tratadas com a solução adesiva de 3 amino-propyltrietoxy-silane [Sigma

Chemical Co, St. Louis, MO/USA, cód A3648]) e selecionadas ao

microscópio de luz, como representativas de perfis de folículos pilosos ao

nível da protuberância, foram submetidos a desparafinização em xilol e

hidratação em cadeia descendente de etanol, seguida de lavagem com

água destilada e solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2 por

cinco minutos.

2- O material foi submetido a pré-tratamento com proteinase K (Sigma

Chemical Co, St. Louis, MO/USA, P6556 ) (20µg/ml) diluída em PBS por 15

minutos, à temperatura ambiente para melhor exposição dos sítios

antigênicos; seguido de duas lavagens em água destilada de dois minutos

cada.

3- Fez-se o bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de

hidrogênio 2% em PBS por 10 minutos; seguido de lavagem em água

corrente, três lavagens de três minutos em água destilada; uma lavagem em

PBS, por cinco minutos.

4- Submeteu-se o material a bloqueio com leite desnatado Molico

(Nestlé) 6% em PBS pH 7,4, por 30 minutos a 37ºC; seguido de três

lavagens de três minutos com PBS.

5- Fez-se, a seguir, a incubação do material sobre as lâminas com

“equilibration buffer”, por 10 segundos à temperatura ambiente;

6- A seguir, os cortes histológicos foram secos e aplicou-se o “working

strength TdT Enzyme” (diluição do “TdT Enzyme” 1:12, ou seja, 1µg de TdT

e 11µg de “Reaction Buffer”), com incubação em câmara úmida a 37ºC por

uma hora.

7- Colocou-se o material em jarras de Coplin com “working strength

stop/wash buffer”, sob agitação e fez-se, a seguir, incubação por 10 minutos

à temperatura ambiente, seguida por três lavagens (cinco minutos cada)

com PBS.

8- Fez-se novo bloqueio com soro albumina bovina (BSA) 2% diluída em

PBS, por 10 minutos à temperatura ambiente. A seguir, procedeu-se a três

lavagens, de três minutos, com PBS.

9- Após a secagem das lâminas, fez-se a aplicação do conjugado anti-

digoxigenina. O material foi incubado por 30 minutos à temperatura ambiente

e, após lavado por quatro vezes, por cinco minutos com PBS.

10- Fez-se a revelação da reação com 3´3 – Diaminobenzidina (DAB)

diluída a 1:100, por três a seis minutos, observando-se ao microscópio. A

seguir o material foi lavado com água destilada, três vezes, por um minuto e

a quarta lavagem, com água destilada, por cinco minutos. A seguir o material

foi lavado com PBS por cinco minutos.

11- Após os procedimentos acima, o material foi incubado com o

anticorpo anti CK-19, diluído 1:100 em PBS com 1% de BSA e incubado

“overnight” à temperatura de 4

C. A seguir o material foi lavado, três vezes,

por cinco minutos, com PBS.

12- Fez-se a incubação do material com o sistema de revelação Envision

AP “anti mouse/rabbit”, por 30 minutos à temperatura ambiente, que foi

seguida por três lavagens, de cinco minutos com PBS.

13- A revelação da reação foi feita com BCIP/NBT (“nitro blue tetrazolium

chloride/ 5-bromo-4-chloro-3 indoyl phosphate, toluidine salt”),

acompanhando ao microscópio. O material foi, a seguir, lavado em água

destilada, por três vezes, três minutos cada vez.

14- Após os procedimentos descritos, o material foi desidratado em

cadeia ascendente de etanol, diafanizado e montado com resina Permount

(FISHER Scientific Fair Lawn, cód. SP15-100, NJ/USA) e lamínulas de vidro.

Como controles positivos das reações foram utilizados cortes histológicos

de linfonodo reativo, pele com Doença de Bowen (controle de apoptose) e

cortes histológicos de couro cabeludo normal e tricoepitelioma (para

citoqueratina 19). Os controles negativos foram obtidos pela omissão da

“working strength TdT Enzyme” e do anticorpo primário anti-citoqueratina

19, nos procedimentos.

De acordo com o protocolo utilizado, foi considerado como resultado

positivo o aparecimento de coloração marrom acastanhada nos núcleos

celulares para o método TUNEL e coloração azul escura citoplasmática para

a citoqueratina 19. A reação foi analisada qualitativamente (positiva ou

negativa) de acordo com a presença ou não de células marcadas

simultaneamente, com os dois padrões descritos, e situadas na bainha

radicular externa ao nível da protuberância folicular. O número total de

folículos imunomarcados em cada corte histológico também foi

contabilizado.

Especificação dos reagentes utilizados:

ApopTag® Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit cod. S7101 –

CHEMICON INTERNATIONAL – Temecula, CA 92590.

Mouse monoclonal antibody anti-Cytokeratin 19 – cód. NCL-CK 19 –

NOVOCASTRA LABORATORIES LTD (Benton Lane, UK).

Envision® Labelled Polymer – AP Mouse/Rabbit cód. K4017, DAKO

CORPORATION (Carpinteria, CA/USA).

BCIP/NBT (nitro blue tetrazolium chloride/ 5-bromo-4-chloro-3 indoyl

phosphate, toluidine salt) Substrate System, cód. K0598, DAKO

CORPORATION (Carpinteria, CA/USA).

Protocolo para demonstração de expressão de caspase 3 clivada

(Cysteiniyl aspartate- specific protease)

Caspases são proteases de cisteína (“c”). Isto é, têm um centro ativo de

cisteína, da família ICE/Ced-3 e são sintetizadas sob a forma de precursores

que necessitam ser clivados ao nível de resíduos contíguos de ácido

aspártico para adquirirem atividade proteolítica (“asp-ase”; c + asp-ase =

caspase ). As caspases formam, portanto, uma cascata de “proteases de

cisteína aspartato-específicas”. A ICE é a caspase 1; a CPP32/apopaina é a

caspase 3. A família das caspases vem crescendo rapidamente. As

caspases são consideradas como as moléculas que representariam a via

efetora comum da apoptose.

Fez-se os procedimentos abaixo descritos para a demonstração de

caspase 3 clivada:

1- Desparafinização, hidratação e lavagem do material como acima

descrito.

2- Para a melhor exposição dos sítios antigênicos o material foi submetido a

tratamento enzimático com 25 mg de tripsina (SIGMA Chemical Co, St Louis,

MO/USA, cód. T-8253) acrescido de 134 mg cloreto de cálcio diluídos em

PBS 0,01M pH 7,4, por 20 minutos à temperatura ambiente. A seguir fez-se

lavagem em água corrente, destilada e em seguida com PBS 0,01 M pH 7,4.

3- Procedeu-se à incubação com anticorpo anti-caspase 3 clivada, diluído

1:100, em PBS 0,01M pH 7,4 com 1% BSA, “overnight” à 4

C; a seguir

fez-se três lavagens em PBS 0,01 M pH 7,4.

4- O material foi incubado com Envision AP, por 30 minutos à temperatura

ambiente e, a seguir, lavado por três vezes em PBS 0,01 M pH 7,4.

5- Fez-se a revelação com BCIP/NBT, controlando ao microscópio, seguida

por lavagem em água corrente e destilada.

6- O material foi contra-corado com “Nuclear Fast Red”, desidratado em

cadeia ascendente de etanol e montado com resina Permount (FISHER

Scientific Fair Lawn, cód. SP15-100, NJ/USA) e lamínulas de vidro.

De acordo com o protocolo utilizado, foi considerado como resultado

positivo o aparecimento de coloração azul escuro nos sítios de acoplamento

antígeno-anticorpo.

Como controle positivo para a reação foram utilizadas amostras teciduais

de linfonodo reativo e pele com Doença de Bowen. O controle negativo das

reações foi obtido por omissão do anticorpo primário.

Especificação dos regentes utilizados:

• Anticorpo primário: Cleaved Caspase-3 (Asp175), CELL SIGNALING,

cód. 9661 (Beverly, MA/ USA).

• Anticorpo secundário: DAKO Envision Alkaline Phosphatase

Mouse/Rabbit, cód. K4017, DAKO Corporation (Carpinteria, CA/USA).

Substrato: BCIP/NBT NBT (nitro blue tetrazolium chloride/ 5-bromo-4-chloro-

3 indoyl phosphate, toluidine salt) Substrate System, cód. K0598, DAKO

Corporation (Carpinteria, CA/USA).

4.4 Correlação da incidência de apoptose das células indiferenciadas

pluripotenciais da protuberância folicular no couro cabeludo de

pacientes HIV-1 positivos, com alopecia difusa não cicatricial, com o

grau de imunodeficiência

A relação entre a proporção de folículos pilosos com dupla marcação

(CK19/TUNEL) e a contagem de células CD4+ no sangue dos casos, foi

obtida através do coeficiente de correlação de Pearson. Estabeleceu-se o

nível de significância em 95%. Considerou-se como evidência do grau de

imunodeficiência a contagem de linfócitos T CD4+ no sangue dos pacientes.

Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de

Projetos de Pesquisa (CAPPesq) da Diretoria Clínica do Hospital das

Clínicas e da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, em

sessão de 13 de agosto de 2003, sob o número 336/03.

5. RESULTADOS

5.1 Análise histopatológica

O nível desejado (inserção do MEP) foi alcançado em todos os cortes

histológicos avaliados. A média do número de unidades foliculares

encontrada foi de 9,2 (±1,1) nos casos e de 9,8 (±1,1) nos controles. Do

ponto de vista morfológico, houve uma maior desorganização das fibras

colágenas perifoliculares nos casos quando comparados aos controles.

(Figura 6) A média do número total de folículos nos casos foi de 23,7(±7,1)

nos casos e de 20,5 (±3,0) nos controles. Classificando-se os folículos em

terminais e velos, observamos uma maior proporção de folículos terminais

nos casos 95% (±2%) do que nos controles 80% (±1%). Quando

classificamos os folículos de acordo com a fase do ciclo folicular,

observamos uma menor proporção de folículos anágenos nos casos 91%

(±2%) do que nos controles 96% (±1%). A proporção de folículos catágenos

foi semelhante nos casos 2% (±3%) e nos controles 2% (±4%). A proporção

de folículos telógenos foi maior nos casos 7% (±6%) do que nos controles

2% (±12%). (Figura 7) A média no número de unidades telógenas

germinativas (TGU) e de tratos fibrosos residuais (TFR) foi de 0,7 (±0,7) e

0,1 (±0,4) nos casos e de 0,7 (±0,5) e 0,2 (±0,4) nos controles,

respectivamente. Não foi encontrado infiltrado inflamatório perifolicular em

nenhum dos casos e dos controles. (Tabelas 3 e 4)

Figura 6 - Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 13). Corte

transversal de couro cabeludo ao nível da inserção do músculo eretor do pêlo.

Observa-se desorganização das fibras colágenas perifoliculares (→). (Tricrômico de

Gomori; aumento original x40).

Figura 7 - Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 6). Corte

transversal de couro cabeludo ao nível da inserção do músculo eretor do pêlo.

Observa-se o aumento do número de folículos telógenos e de unidades telógenas

germinativas (→). (Tricrômico de Gomori; aumento original x40).

Tabela 3 - Resultados da análise histopatológica / morfométrica nos pacientes HIV-1 positivos com alopecia difusa não

cicatricial (casos).

CASO

TOTAL

FOLÍCULOS

TERMINAIS

FOLÍCULOS

VELOS

FOLÍCULOS

ANÁGENOS

FOLÍCULOS

CATÁGENOS

FOLÍCULOS

TELÓGENOS

TGU

TFR

INF. INFLA-

MATÓRIO

IDENTIFICA-

ÇÃO MEP

1 10 26 26 0 23 0 3 1 0 Ausente +

2 10 34 32 2 33 0 1 1 0 Ausente +

3 10 15 15 0 12 1 2 0 0 Ausente +

4 10 30 29 1 30 0 0 2 0 Ausente +

5 8 25 24 1 22 2 1 0 0 Ausente +

6 10 19 18 1 13 1 5 1 0 Ausente +

7 8 13 13 0 13 0 0 0 0 Ausente +

8 10 34 33 1 33 1 0 1 1 Ausente +

9 8 22 21 1 22 0 0 0 0 Ausente +

10 10 19 17 2 18 0 1 1 0 Ausente +

11 7 25 25 0 22 0 3 2 1 Ausente +

12 8 19 15 4 17 1 1 0 0 Ausente +

13 9 14 12 2 13 0 1 1 0 Ausente +

14 10 29 27 2 25 0 4 1 0 Ausente +

15 10 32 31 1 29 0 3 0 0 Ausente +

Média

± DP

9,2

± 1,1

23,7

± 7,1

0,7

± 0,7

0,1

± 0,4

% dos tipos de

folículos pilosos ±DP

95%

± 2%

± 4%

91%

± 2%

± 3%

± 6%

UF - unidades foliculares; TGU - unidades telógenas germinativas; TFR - tratos fibrosos residuais; MEP - músculo eretor do pêlo; + identificado

Tabela 4 - Resultados da análise histopatológica / morfométrica de couro cabeludo de indivíduos hígidos sem alopecia

(controles).

CASO

TOTAL

FOL.

TERMINAIS

FOL.

VELOS

FOL.

ANÁGENO

FOL.

CATÁGENOS

FOL.

TELÓGENOS

TGU

TFR

INFILT.

INFLAMATÓ

RIO

IDENTIFI-

CAÇÃO

MEP

1 9 23 20 3 22 1 0 0 0 Ausente +

2 10 20 18 2 19 0 1 0 1 Ausente +

3 8 17 15 2 16 0 1 1 0 Ausente +

4 10 19 15 4 17 2 0 1 0 Ausente +

5 11 17 16 1 17 0 0 0 0 Ausente +

6 9 25 19 6 25 0 0 1 0 Ausente +

7 10 19 13 6 18 1 0 1 0 Ausente +

8 9 16 12 4 15 1 0 0 1 Ausente +

9 12 22 15 7 21 0 1 1 0 Ausente +

10 10 25 20 5 24 0 1 1 0 Ausente +

11 11 21 18 3 21 0 0 1 0 Ausente +

12 9 22 17 5 22 5 0 1 0 Ausente +

Média

± DP

9,8

± 1,1

20,5

± 3,0

0,7

± 0,5

0,2

± 0,4

% dos tipos de

folículos pilosos

± DP

80%

± 1%

20%

96%

± 1%

± 4%

± 12%

UF - unidades foliculares; TGU - unidades telógenas germinativas; TFR - tratos fibrosos residuais; MEP - músculo eretor do pêlo; + Identificado;

FOL. - folículos

5.2 Demonstração de apoptose de células tronco-foliculares e células

amplificadoras transitórias, da bainha radicular externa da

protuberância folicular

As células que exibiram dupla marcação positiva apresentavam o

núcleo marcado pelo cromógeno marrom (reação de TUNEL) e o citoplasma

marcado em azul pelo cromógeno BCIP/NBT (expressão de CK19).

Foram encontradas células com dupla marcação TUNEL/CK19

positivas na bainha radicular externa ao nível da protuberância folicular, em

pelo menos um folículo por corte histológico, em 80% dos casos e em 25%

dos controles. (Figuras 8, 9, 10, 11 e 12) A média percentual de folículos

imunoreagentes (positivos) encontrados em cada corte histológico foi de

48% (±7%) nos casos e de 26% (±13%) nos controles (Tabela 5).

Queratinócitos situados na BRE, TUNEL positivos e CK19 negativos,

foram observados, tanto nos casos como nos controles. (Figura 13) Em

alguns cortes histológicos foram observados folículos com células CK19+

e/ou CK19/TUNEL + ao redor de toda circunferência folicular e não somente

na protuberância. (Figura 14)

As células com expressão de caspase 3 clivada apresentavam o

citoplasma marcado em azul (cromógeno BCIP/NBT). Foram encontradas

células imunoreativas para o anticorpo anti-Caspase 3 na protuberância

folicular em pelo menos um folículo piloso por corte histológico em 61% dos

casos avaliados e em 16% dos controles. A média percentual de

protuberâncias foliculares imunorreagentes encontradas nos casos positivos,

foi de 99% (±6%) nos casos e de 100% (±6%) nos controles. (Figura 15) Em

dois casos, a amostra tecidual não foi considerada representativa para a

investigação da caspase 3 clivada, devido a não identificação da

protuberância folicular, no corte histológico avaliado.

As tabelas 5 e 6 demonstram os resultados da dupla marcação

TUNEL/CK19 e de caspase 3 clivada de células da BRE da protuberância

folicular nos casos de alopecia difusa, não cicatricial de doentes HIV-1

positivos e grupo controle normal, respectivamente.

Figura 8 - Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 6).

Detalhe da desintegração da bainha de mielina de um folículo telógeno.

(Tricrômico de Gomori; aumento original x100).

Figura 9 - Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 12).

Corte transversal de couro cabeludo. Observa-se dupla marcação CK19

(BCIP/NBT, azul) e TUNEL (DAB, marrom) em células da bainha radicular

externa de dois folículos pilosos (→); ( aumento original x100).

Figura 10 - Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 12).

Detalhe da dupla marcação CK19/TUNEL de células da bainha radicular

externa de folículo piloso; (aumento original x400).

Figura 11 - Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 12).

Corte transversal de folículo piloso exibindo células CK19 (BCIP/NBT, azul)

e TUNEL (DAB, marrom) positivas na bainha radicular externa ao nível da

protuberância folicular; (aumento original x1000).

Figura 12 - Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 6).

Corte transversal de couro cabeludo. Presença células CK19+ apoptóticas

(TUNEL positivas) na bainha radicular externa, que delimitam as projeções

epiteliais características da protuberância folicular; (aumento original x400).

Figura 13 -

Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 5). Detalhe

da BRE de um folículo piloso exibindo queratinócitos apoptóticos (núcleos TUNEL

positivos – DAB, marrom) que não expressam CK 19 no citoplasma (→) e células

da camada basal com dupla marcação; (aumento original ×1000).

Figura 14 -

Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 1). Corte

transversal de folículo piloso exibindo células com dupla marcação CK19

(BCIP/NBT, azul) e TUNEL (DAB, marrom) em toda a circunferência da bainha

radicular externa de folículo piloso; (aumento original x400).

Figura 15 - Alopecia difusa não-cicatricial de paciente HIV-1+ (caso 1).

Corte transversal de couro cabeludo ao nível da protuberância. Observa-se

queratinócitos apoptóticos (→) na bainha radicular externa, evidenciados

pelo anticorpo anti-caspase 3 clivada; (aumento original x400).

Tabela 5 – Apoptose de células tronco-foliculares e células amplificadoras transitórias, da bainha radicular externa da

protuberância folicular, evidenciada pela técnica de dupla marcação TUNEL/CK19 e pelo anticorpo anti-caspase 3 clivada, na

alopecia difusa não cicatricial de pacientes HIV-1 positivos.

TUNEL/CK19 CASPASE 3 CLIVADA

Caso N

de PF N

positivas

% PF

positivas

de PF N

positivas

% PF

positivas

1 10 6 60 17 17 100

2 9 4 44 19 19 100

3 2 2 100 0 0 0

4 24 8 33 19 19 100

5 23 7 30 15 15 100

6 11 9 82 12 12 100

7 15 7 47 14 13 93

8 13 6 46 0 0 0

9 0 0 0 0 0 0

10 0 0 0 0 0 0

11 0 0 0 25 25 100

12 9 6 67 0 0 0

13 27 7 26 0 0 0

14 25 6 24 21 21 100

15 35 30 86 32 32 100

Total 203 98 48 174 173 99

TUNEL/CK19 – dupla marcação com TUNEL e anticorpo anti-citoqueratina 19; No – número; PF – protuberância folicular

Tabela 6 – Apoptose de células tronco-foliculares e células amplificadoras transitórias, da bainha radicular externa da

protuberância folicular evidenciada pela técnica de dupla marcação TUNEL/CK19 e pelo anticorpo anti-caspase 3 clivada em

grupo controle de couro cabeludo normal.

TUNEL/CK19 Caspase 3 clivada

Caso N

de PF N

PF positivas % PF positivas N

de PF N

PF POSITIVAS % PF POSITIVAS

1 23 0 0 23 0 0

2 21 6 30 20 0 0

3 27 7 26 17 0 0

4 19 0 0 19 0 0

5 17 0 0 17 0 0

6 25 0 0 25 0 0

7 19 0 0 19 19 100

8 16 0 0 16 16 100

9 22 0 0 22 0 0

10 25 0 0 25 0 0

11 21 0 0 21 0 0

12 22 0 0 22 0 0

Total 257 13 5 246 35 14

TUNEL/CK19 – dupla marcação com TUNEL e anticorpo anti-citoqueratina 19; N

– número; PF – protuberância folicular

5.3 Correlação da incidência de apoptose das células indiferenciadas

pluripotenciais da protuberância folicular no couro cabeludo de

pacientes HIV-1 positivos, com alopecia difusa não cicatricial, com o

grau de imunodeficiência

Não houve correlação entre a proporção de folículos com dupla

imunomarcação e os níveis de linfócitos T CD4+ no sangue dos pacientes

(Tabela 7).

Tabela 7 - Correlação da incidência de apoptose das células indiferenciadas

pluripotenciais da protuberância folicular no couro cabeludo de pacientes

HIV-1 positivos com alopecia difusa não cicatricial, com o nível de células

CD4+ apresentado pelos pacientes.

OBSERVAÇÃO

% PF IMUNOMARCADAS

(CK19/TUNEL+)

NÍVEIS CÉL. CD4

(céls/mm

)

1 60 356

2 44 401

3 100 200

4 33 273

5 30 300

6 82 66

7 47 215

8 46 398

9 0 150

10 0 601

11 0 333

12 67 200

13 26 301

14 24 267

15 86 480

PF – protuberâncias foliculares; Céls. CD4 – linfócitos CD4

Coeficiente de correlação de Pearson (r = 0)

6. DISCUSSÃO

A análise histológica da região occipital do couro cabeludo do grupo de

pacientes HIV-1 positivos com alopecia difusa não cicatricial revelou um

número total de folículos (23,7±7,1) pouco maior que o do grupo controle

(20,5±3,0). Entretanto, ambos os grupos apresentaram menor número de

folículos pilosos que o descrito por Sperling & Lupton (1995)

112

ao analisar

cortes transversais de couro cabeludo normal de biópsias obtidas com

“punch” de quatro milímetros.

Poderíamos relacionar essa diferença com a localização da área de

couro cabeludo examinada (região occipital). Esse local, e não o vértice, foi

intencionalmente escolhido para ser excluída a possibilidade de provável

alopecia androgenética incipiente, que pudesse estar ocorrendo nos

pacientes dos grupos em estudo. Entretanto, os autores acima referidos

demonstraram não haver diferenças morfométricas de folículos pilosos das

duas regiões do couro cabeludo (vértice e occipício). Desse modo,

interpretamos essa diferença como uma variação aleatória, dentro da

normalidade.

Observamos uma desorganização, do ponto de vista estrutural, dos

folículos pilosos do grupo de casos. Essa desorganização foi refletida no

menor número de unidades foliculares identificáveis nos casos, quando

comparados com os controles. Essa desorganização estrututral é mais

comumente encontrada em alopecias cicatriciais. No entanto, em

determinadas formas de alopecias não cicatriciais, em estágios mais

avançados, como a androgenética e a areata, ela também pode ser

encontrada.

113

Quando comparados os dois grupos de estudo, observamos que a

proporção de folículos terminais e velos, em ambos os grupos, foi a

esperada para o couro cabeludo normal.

113

A proporção de folículos

anágenos foi de 95% nos casos e de 96% nos controles. A proporção de

folículos telógenos nos casos (7%) e nos controles (2%) está dentro dos

limites da normalidade. No couro cabeludo normal a proporção de folículos

telógenos pode variar de 0 – 15%.

114

Uma vez que a infecção pelo HIV é uma doença crônica e

consumptiva, poderíamos relacionar a alopecia difusa não cicatricial

observada nos doentes, como provável eflúvio telógeno. Entretanto, este

pode ser afastado, uma vez que a proporção de folículos telógenos deve ser

maior que 25% nessa condição.

112

Outras formas de alopecia, que devem ser consideradas na diagnose

diferencial da alopecia difusa não cicatricial em estudo, são as relacionadas

com a sífilis. A alopecia “essencial” difusa da sífilis secundária, devido a

perda de fios telógenos, pode ser afastada, pois exibe quadro

histopatológico semelhante ao do eflúvio telógeno (com mais de 25% de

folículos pilosos em fase telógena). A alopecia inflamatória difusa da sífilis

pode ser também afastada, uma vez que, nesta condição ocorre processo

inflamatório expressivo, semelhante ao observado na alopecia areata, com

infiltrado inflamatório mononuclear acometendo 100% dos folículos

representados, maior proporção da relação folículos catágenos/telógenos e

presença de folículos pilosos miniaturizados.

112

Ainda, na análise histopatológica e morfométrica dos casos

estudados, observamos média de 2% de folículos catágenos no couro

cabeludo dos dois grupos, o que não difere do relatado para as condições de

normalidade.

112

Apesar dos resultados da análise histopatológica e morfométrica do

couro cabeludo dos casos não diferirem, de modo expressivo, do grupo

controle, todos os doentes apresentavam alterações capilares objetivas,

como a alteração da textura e rarefação difusa dos cabelos. Esse quadro

clínico aproxima-se daquele descrito para a alopecia senil.

112,115

Nesse tipo

de alopecia ocorre diminuição progressiva da densidade e afilamento dos

cabelos, a partir dos 50 anos de idade. O quadro histopatológico descrito é

semelhante ao por nós observado no grupo de doentes HIV-1 positivos,

com alopecia difusa não cicatricial. Há leve diminuição do número de

folículos pilosos, proporção adequada de pelos terminais e velos, e o

número de folículos telógenos apresenta-se dentro dos limites descritos para

a normalidade (menos de 20%). Na alopecia senil, não há diferenças entre

os achados de biópsia tomadas do vértice e da região occipital do couro

cabeludo.

112

Embora semelhante, tanto pelo quadro clínico como pelo

histopatológico, a alopecia difusa não cicatricial de doentes HIV-1 positivos

deve ser entidade distinta da alopecia senil. A condição objeto de nosso

estudo ocorre em doentes HIV-1 positivos de faixa etária menor. A idade do

grupo por nós estudado variou de 22 a 44 anos (média de 35,3 anos).

Smith et al.

, ao estudarem grupo de 10 pacientes HIV-1 positivos

com alopecia difusa não-cicatricial, relataram a presença de queratinócitos

apoptóticos na bainha radicular externa, ao nível da protuberância folicular.

Os autores consideraram que a apoptose de queratinócitos da BRE de

folículos pilosos, seria fator de distinção da alopecia difusa da infecção pelo

HIV-1, de outras condições de estresse, causadoras de provável eflúvio

telógeno.

Demonstramos, através de técnica de dupla marcação

(CK19/TUNEL), que ocorre apoptose das células-tronco foliculares e células

amplificadoras transitórias, da BRE da protuberância folicular do couro

cabeludo de pacientes HIV-1 positivos em uma proporção maior do que em

controles sadios.

Devido à dificuldade em se obter marcadores imunohistoquímicos,

grande parte dos trabalhos com células-tronco utiliza a marcação com

radioisótopos. A CK19 pode ser considerada um marcador de

indiferenciação celular, porém sua expressão não é restrita às células-

tronco. Também é expressa pelas células amplificadoras transitórias, que

dão origem ao germe secundário. Portanto, em nosso trabalho, não

podemos afirmar que a apoptose encontrada foi restrita exclusivamente às

células-tronco foliculares. Em grande parte dos casos, assim como dos

controles, foram observadas células CK19 positivas ao redor de toda BRE e

não apenas nas projeções da protuberância folicular. Esse achado pode ser

justificado admitindo-se que o músculo eretor do pêlo pode envolver toda

circunferência folicular e não somente alcançar o FPS em sua face posterior.

Esse fato sugere que a interação entre protuberância-MEP é de fundamental

importância na manutenção do fenótipo das células da protuberância

folicular.

116

Realizamos também a demonstração de apoptose através do

anticorpo anti-caspase 3 clivada, para corroborar as observações pela

marcação com o método do TUNEL. Escolhemos a caspase 3 clivada como

marcador de apoptose, uma vez que essa caspase está envolvida nos

processos de apoptose deflagrados tanto por mecanismos extrínsecos (via

receptores de membrana) como pela via mitocondrial.

Entretanto, não

realizamos técnica de dupla marcação, uma vez que a expressão de CK19 e

da caspase 3 clivada são citoplasmáticas. Apesar de tentativas com o uso

de diferentes cromógenos, os resultados não foram satisfatórios para

assegurar a demonstração inequívoca de ocorrência concomitante de dupla

marcação. Entretanto, observamos que ocorria imunomarcação de células

da BRE ao nível da protuberância folicular, que correspondia à localização

observada quando da dupla marcação CK19/TUNEL. Outra dificuldade

encontrada foi a representada pelos níveis adequados dos cortes

histológicos para a representação das protuberâncias foliculares. Essas

estruturas foram representadas em somente cerca de três a quatro lâminas

com cortes consecutivos, de cada espécime estudado. Através do exame ao

microscópio das lâminas dos cortes de parafina sem coloração, pudemos

escolher os mais representativos da protuberância, pela identificação da

inserção do MEP nessas estruturas. Priorizamos os cortes mais

representativos para a realização da técnica de dupla marcação

(CK19/TUNEL). A apoptose de queratinócitos da BRE, demonstrada pelo

anticorpo anti-caspase 3 clivada, foi observada em 61% dos casos e 16%

dos controles. Pela técnica da dupla marcação CK19/TUNEL a frequência de

apoptose de células CK19+ foi de 80% e 25% respectivamente. No nosso

estudo, a técnica do TUNEL mostrou-se mais sensível para a demonstração

de apoptose.

Kishimoto et al. (1998)

117

demonstraram apoptose de células

foliculares, pela técnica do TUNEL, em três espécimes de couro cabeludo

humano normal, obtidos durante cirurgia cutânea. Os autores não

especificaram a região do couro cabeludo estudada. Observaram células

TUNEL positivas na camada de Henle próximo do bulbo folicular, em células

cuticulares da bainha radicular interna e ao nível do istmo em células logo

abaixo da camada córnea. Os autores, entretanto, não descrevem apoptose

de células tronco-foliculares, presentes na BRE ao nível da protuberância

folicular.

A apoptose de células-tronco, apesar de parecer paradoxal, é

encontrada, de forma fisiológica, em outros tecidos com poder de auto-

renovação. No folículo piloso de murinos está correlacionada com o

remodelamento estrutural que ocorre durante a fase catágena.

Até que

ponto a apoptose encontrada na alopecia difusa dos doentes HIV-1

positivos, estaria relacionada os seus mecanismos patogenéticos ou

simplesmente representaria uma alteração do ciclo folicular, com maior

regressão catágena dos folículos, ainda não está totalmente esclarecido. A

análise morfométrica do couro cabeludo do grupo em estudo não favorece

essa última possibilidade, uma vez que não encontramos aumento da

proporção de folículos catágenos nos casos estudados.

Smith et al. (1996)

baseados no fato da protuberância também ser o

sítio folicular mais acometido na doença enxerto versus hospedeiro (DEVH),

22,23

onde as células-tronco são o principal alvo, levantaram a hipótese de

que uma reação auto-imune (DEVH-símile) pudesse ser um dos

mecanismos envolvidos na patogênese da infecção pelo HIV, incluindo a

alopecia. Pudemos demonstrar que realmente há apoptose nas células-

tronco foliculares do couro cabeludo de pacientes HIV-1 positivos com

alopecia difusa não cicatricial, em uma proporção maior do que em controles

sadios. Entretanto, em nenhuma de nossas observações foi encontrado

infiltrado inflamatório ao nível da protuberância, como seria esperado numa

reação DEVH-símile.

Doze dos 15 doentes estudados estavam recebendo esquema

terapêutico anti-retroviral. De acordo com a literatura, a única droga que

pode compor esses esquemas terapêuticos e relacionada com distúrbios

capilares é o indinavir. Devido à semelhança existente na sequência de

aminoácidos entre a protease do HIV-1 e a proteína citoplasmática ligadora

de ácido retinóico tipo 1 (“cytoplasmic retinoid acid binding protein type 1” ou

CRABP-1), os pacientes HIV-1 positivos em uso de indinavir podem

apresentar efeitos colaterais retinóide-símiles como queilite, xerodermia,

granulomas piogênicos, paroníquia, lipoatrofia e alopecia. Esses efeitos

colaterais dermatológicos são causa de interrupção do tratamento em 10%

dos pacientes. De acordo com a literatura,

a alopecia ocorre em 12% dos

pacientes em uso de indinavir, tem início nos seis primeiros meses de

tratamento e acomete inicialmente os pêlos dos membros inferiores e, em

menor escala, o couro cabeludo.

1,16,118,119

O mecanismo provável de atuação

da droga, segundo os autores, seria um eflúvio telógeno, devido à alteração

do ciclo folicular. Ginarte et al.

, em 2002, baseados no fato da alopecia

indinavir-induzida nem sempre estar associada com outras manifestações

cutâneas retinóide-símiles e no fato da gravidade do quadro não estar

correlacionada com a severidade das outras manifestações muco-cutâneas,

ou com o grau de imunodepressão, levantou a hipótese do mecanismo

retinóide-símile não ser o único envolvido nesse tipo de alopecia. Nossa

observação número seis havia interrompido há um mês o uso do indinavir

quando da colheita da biópsia de couro cabeludo para exame. A droga tinha

sido utilizada por um período de aproximadamente seis meses. De acordo

com nossos critérios de inclusão, esse paciente não apresentava uma queda

acentuada de cabelos, mas relatava uma diminuição de volume e alteração

de textura dos mesmos. O paciente também não apresentava outras

manifestações cutâneas relacionadas com o efeito retinóide-símile. Os

cortes transversais de seu couro cabeludo apresentaram imunomarcação

para CK19/TUNEL (82% das protuberâncias foliculares representadas/corte)

e caspase 3 clivada (100% das protuberâncias foliculares

representadas/corte). É possível que o outro mecanismo sugerido por

Ginarte et al.

, envolvido na alopecia indinavir-induzida, seja a indução da

apoptose das células indiferenciadas da protuberância folicular.

Poderíamos relacionar a maior atividade apoptótica das células

tronco-foliculares da BRE com o nível de imunossupressão dos doentes.

Entretanto, quando tomamos a contagem de linfócitos CD4+ no sangue dos

pacientes como parâmetro de intensidade de imunossupressão não

encontramos correlação com a frequência de apoptose de queratinócitos da

BER de folículos pilosos.

Na infecção pelo HIV-1 e AIDS são descritas alterações nos

mecanismos controladores da apoptose celular, como o aumento de

expressão de receptores de membrana como o Fas-L , diminuição de

expressão de proteínas anti-apoptose como o Bcl-2 e aumento de expressão

de proteínas pró-apoptose como o Bax.

A lise de linfócitos T CD4+ é

propiciada por mecanismos dependentes, não somente da infecção celular

pelo HIV-1, mas também por atuação de proteínas virais e ativação dos

receptores de morte celular, como o aumento da expressão do Fas (CD95),

Fas-L (CD95L) e do TNFR-TNF/TRAIL ; ou através da via mitocondrial:

fosforilação da proteína p53, aumento da expressão do Bax, dissipação do

potencial transmembrana, liberação do citocromo c e ativação das

caspases.

91-94

Devido às alterações das moléculas indutoras da apoptose, ao

aumento dos níveis de interleucinas (4, 6, 10 e TNF alfa), e ao estresse

oxidativo que ocorre na infecção pelo HIV-1, nossa hipótese inicial era de

que uma alteração na expressão de genes pudesse levar a um quadro de

auto-imunidade, no qual as células-tronco foliculares fossem induzidas à

apoptose pela ação citotóxica das células inflamatórias envolvidas, como o

sugerido por Smith et al. (1996)

. Uma vez que nenhuma de nossas

observações apresentou infiltrado inflamatório junto da protuberância

folicular, torna-se improvável que um quadro de foliculite citotóxica DEVH-

símile seja o responsável pela indução da apoptose e pela alopecia desses

pacientes. Além disso, a agressão do reservatório de células-tronco

foliculares por células inflamatórias, provavelmente, iria culminar numa

alopecia de caráter inflamatório, seguida de alopecia de tipo cicatricial, o

que não se observa nesses pacientes.

Excluindo-se a possibilidade de apoptose das células da

protuberância folicular ser deflagrada por mecanismos dependentes de

receptores pró-apoptóticos de membrana celular (via extrínseca da

apoptose), podemos postular que o processo ocorreria pela via mitocondrial.

Existem fatores relacionados ao HIV-1, como a proteína Vpr, presente no

nucleocapsídeo do HIV, que é capaz de induzir a ativação direta da família

das caspases.

120

Além de sua ação indutora da apoptose, essa pequena

(14Kd) proteína acessória é considerada uma espécie de monitora e

desempenha funções como: (a) auxiliar no processo de replicação viral em

células que não estejam em replicação, através de sua ligação com a

carioferina-α; (b) induzir a parada do ciclo celular, através de sua ligação

com o regulador positivo (MOV34) do complexo ciclina B p34, essencial

para a transição da fase G2 para M; (c) estimular a expressão de genes

através da interação física com fatores de transcrição, e/ou através de suas

conseqüências sobre o ciclo celular.

121,122

Jacot et al

123

, em 2000,

demonstraram que a Vpr induz a apoptose através de sua interação física

direta com o translocador da adenina nucleotídeo (TAN), um componente da

membrana mitocondrial externa (na mesma localização do Bax), levando à

alteração da permeabilidade, ruptura da membrana e liberação de agentes

apoptogênicos.

Uma explicação plausível, na tentativa de correlacionarmos a infecção

pelo HIV-1 com o quadro de alopecia difusa não cicatricial, onde

encontramos apoptose de células da BRE ao nível da protuberância folicular,

na ausência de agressão inflamatória local, seria o da atuação do próprio

vírus através de um componente como a Vpr. Através de sua atuação

direta, essa proteína viral seria capaz de induzir a parada do ciclo celular das

células-tronco foliculares na fase G2, o que, por si só, já explicaria a

alteração do ciclo folicular levando à alopecia. Através de sua interação com

componentes da membrana mitocondrial (com consequente aumento da

expressão de Bax e diminuição da expressão de Bcl-2) induziria a apoptose

celular na BRE da protuberância folicular.

Devemos levar em consideração que a apoptose, conforme já

exposto, é um fenômeno efêmero e que sua aferição apenas através de um

método morfológico, como o que utilizamos, é difícil. Logo, o que

conseguimos identificar é apenas uma pequena amostra momentânea de

um fenômeno que, provavelmente, está ocorrendo em larga escala.

Indução de apoptose relacionada a outro fator do HIV-1 foi descrito

por Bin Shi et al.

124

, no qual a proteína viral Tat aliada ao estresse oxidativo

relacionado com os altos índices de TNF-α, induzem a apoptose de células

neuronais em pacientes infectados pelo HIV-1 com quadro de demência.

Corroborando nossa hipótese, a família das caspases, que constituem

o braço efetor da apoptose, estão diretamente relacionadas com a apoptose

das células foliculares e possuem um papel fundamental no controle do ciclo

folicular.

125

Embora nossa casuística seja pequena, em nosso trabalho

demonstramos que a alopecia difusa não cicatricial encontrada em pacientes

HIV-1 positivos seria resultante de interrupção do ciclo folicular que se

manifesta através de alopecia difusa, de tipo não cicatricial, e tem como

alteração histopatológica importante a apoptose de células da BRE dos

folículos pilosos. Esse processo não exibe características morfológicas de

eflúvio telógeno observado em outras condições adversas. Demonstramos

que parte da população de células indiferenciadas da protuberância entra

em apoptose em uma proporção maior do que a encontrada em controles

sadios. A incidência da apoptose não está relacionada com o grau de

imunodepressão desses pacientes. Admitindo-se que a apoptose das células

indiferenciadas da protuberância folicular esteja relacionada com a

patogenia dessa alopecia, uma vez que não há substratos morfológicos que

expliquem apoptose resultante de mecanismos de auto-imunidade,

poderíamos considerar um fator solúvel capaz de induzi-la. Devido a sua

capacidade de alterar o ciclo celular e de induzir a ativação das caspases,

propomos a proteína viral Vpr como uma possível responsável pelo processo

observado na alopecia difusa não cicatricial da infecção pelo HIV-1.

O nosso estudo sugere que a alopecia difusa não cicatricial que

ocorre durante a infecção pelo HIV-1 se assemelha, sob o ponto de vista

clínico e histopatológico, com a alopecia senil (Kligman, 1988; Sperling;

Lupton, 1995). Como dessa alopecia, o quadro histopatológico exibe

alterações discretas que não o distingue, de modo expressivo, do couro

cabeludo normal. Entretanto, a alopecia difusa não cicatricial dos doentes

HIV-1 positivos caracterizou-se por apoptose das células indiferenciadas da

BRE da protuberância folicular. No processo de envelhecimento cutâneo,

ocorre apoptose de queratinócitos das camadas inferiores da epiderme, o

que não se observa na epiderme de indivíduos jovens.

126

Esse processo

poderia estar ocorrendo também nas células da BRE dos folículos pilosos.

Um estudo da apoptose das células da BRE da protuberância folicular na

alopecia senil seria interessante, para comparação com o observado na

alopecia difusa não cicatricial dos pacientes HIV-1 positivos.

7. CONCLUSÕES

O quadro histopatológico da alopecia difusa não cicatricial de

pacientes HIV-1 positivos caracterizou-se pela desorganização estrutural das

unidades foliculares e maior número de folículos telógenos quando

comparado ao couro cabeludo de indivíduos hígidos sem alopecia.

Ocorre apoptose de células indiferenciadas pluripotenciais (células

tronco e células amplificadoras transitórias) na bainha radicular externa da

protuberância folicular na alopecia difusa não cicatricial de pacientes HIV-1

positivos. Entretanto, a apoptose não parece ser resultante de quadro de

foliculite citotóxica, uma vez que, não foram observadas alterações

inflamatórias em todos os casos estudados.

O fenômeno da apoptose das células indiferenciadas pluripotenciais

(células-tronco e células amplificadoras transitórias) presentes na bainha

radicular externa, na região da protuberância folicular, foi observado com

uma frequência maior na alopecia difusa não cicatricial de pacientes HIV-1

positivos, do que no couro cabeludo de indivíduos hígidos, sem alopecia.

A incidência de apoptose das células indiferenciadas pluripotenciais

(células-tronco e células amplificadoras transitórias), presentes na região da

protuberância folicular, do couro cabeludo de pacientes HIV-1 positivos com

alopecia difusa não cicatricial, não guardou relação com o grau de

imunodepressão desses pacientes.

8. ANEXO

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Essas informações estão sendo fornecidas para sua participação

voluntária neste estudo, cujo objetivo é identificar a causa específica da

queda de cabelos em pacientes HIV positivos. Somente no final do trabalho

poderemos concluir a presença de algum benefício para coletividade.

Como voluntário você será submetido à retirada de um fragmento

(biópsia) de pele do couro cabeludo, de quatro milímetros. Esse

procedimento é precedido da aplicação de anestesia local, que pode causar

desconforto local, bem como pode haver um pequeno sangramento durante

o ato da retirada do material.

Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais

responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas,

assim como terá o direito de permanecer atualizado sobre os resultados

parciais obtidos. O principal investigador é o Dr. Carlos Baptista Barcaui, que

pode ser encontrado no endereço R. Enéas de Carlho Aguiar 255, 3

andar,

telefone 30829232.

É garantida a liberdade de retirada do consentimento a qualquer

momento e deixar de participar do estudo sem qualquer prejuízo a

continuidade de seu tratamento na instituição.

As informações obtidas serão analisadas em conjunto com a de

outros pacientes, não sendo divulgado a identificação de nenhum paciente.

Não há despesas pessoais para o participante em qualquer fase do

estudo, incluindo exames e consultas. Também não há compensação

financeira relacionada à sua participação. Se existir qualquer despesa

adicional, ela será absorvida pelo orçamento da pesquisa.

Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos

ou tratamentos propostos neste estudo (nexo causal comprovado), o

participante tem direito a tratamento médico na Instituição, bem como às

indenizações legalmente estabelecidas.

Declaro que, após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e

ter entendido o que me foi explicado, consinto em participar do presente

Protocolo de Pesquisa.

__________________________

Assinatura do Paciente ou responsável

______________________________

Assinatura do pesquisador responsável

Local e data

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