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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP
Instituto de Biociências de Botucatu
Análise da expressão de miosinas da classe V em
diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
Kátia Gisele de Oliveira Rancura
Orientador: Prof. Dr. Alexandre de Azevedo
Co-orientador: Prof. Dr. Cesar Martins
Botucatu – SP
2007
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Universidade Estadual Paulista – UNESP
Instituto de Biociências de Botucatu
Kátia Gisele de Oliveira Rancura
Análise da expressão de miosinas da classe V em
diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
Orientador: Prof. Dr. Alexandre de Azevedo
Co-orientador: Prof. Dr. Cesar Martins
Botucatu – SP
2007
Dissertação apresentada ao
programa de Pós-
Graduação
em Ciências Biológicas
(Zoologia) do I
nstituto de
Biociências de Botucatu, para a
obtenção do título de Mestre.
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Dedico este trabalho a minha família, em especial aos
meus pais, Aristides e Cleuza, pelos cuidados comigo,
por me incentivarem e acreditarem na minha
capacidade. Tudo o que sou de
vo a vocês, tudo o que
faço é para vocês...
Portanto, devemos:
Fazer da interrupção
um caminho novo...
Da queda, um passo
de dança...
Do medo, uma
escada...
Do sonho, uma
ponte...
Da procura, um
encontro...
Fernando Pessoa
De tudo, ficaram três
coisas:
A certeza de que
estamos sempre
começando...
A certeza de que
precisamos continuar...
A certeza de que
seremos interrompidos
antes de terminar...
Agradecimentos
A Deus, por iluminar meus caminhos e me ajudar a ser perseverante,
A minha família, por me apoiar e confiar em mim,
Ao meu orientador, Prof. Dr. Alexandre de Azevedo, por me inserir no mundo
da ciência, por me orientar nesse trabalho e em outros durante a minha vida
acadêmica, pela amizade, pelos conselhos e pela compreensão;
Ao Prof. Dr. Cesar Martins, por me acolher prontamente quando precisei, por
sua amizade, pelos conhecimentos repartidos e pela disposição com que me auxiliou
no andamento e conclusão desta pesquisa;
Ao Prof. Dr. Roy Edward Larson, por fornecer os anticorpos anti-miosina Va,
utilizados nesse trabalho;
Ao Pós-doutorando Antônio Sérgio Kimus Braz, pelo auxílio com as
ferramentas de bioinformática;
Ao Laboratório de Biologia e Genética de Peixes, ao Departamento de
Morfologia, a Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Zoologia), ao Instituto de
Biociências e a UNESP – Universidade Estadual Paulista, pela oportunidade de
realização do meu mestrado;
A todos os colegas do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes e do
Departamento de Morfologia, pelo auxílio dado na condução da minha pesquisa e
pela agradável convivência diária;
Aos técnicos de laboratório e demais funcionários do Departamento de
Morfologia do Instituto de Biociências, pela assistência prestada e pelos cuidados
conosco e com nosso ambiente de trabalho, em especial a José Eduardo Bozano,
pelos ensinamentos, pelo apoio e principalmente pela amizade;
A minha colega de casa e amiga Nathalie, pela paciência, por me ouvir e me
aconselhar;
Aos meus amigos antigos e recentes, amizades de infância, de escola, de
graduação e de pós-graduação, amizades de trabalho, de academia e de baladas,
enfim todos aqueles que acreditaram no meu potencial, que estiveram sempre
prontos a me ajudar, que dividiram comigo momentos tristes e felizes, pessoas com
quem eu sei que poderei contar e que poderão sempre contar comigo;
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pela concessão da minha bolsa de estudos e a Fundação de Amparo a Pesquisa do
Estado de São Paulo (FAPESP), pelo auxílio financeiro;
A todos que de alguma forma participaram da execução desse trabalho e
contribuíram para o meu desenvolvimento profissional e pessoal.
ÍNDICE
Resumo 1
Abstract 2
1. Introdução 3
1.1. Considerações gerais sobre as miosinas 3
1.2. A superfamília das miosinas 4
1.3. As miosinas da classe V 7
1.4. A miosina V de cérebro (miosina Va) 10
1.5. Os membros da classe V em vertebrados 14
2.Objetivos 16
3. Material e Métodos 17
3.1. Obtenção dos exemplares de truta arco-íris 17
3.2. Produção e purificação de anticorpos policlonais anti-miosina Va 17
3.3. Dosagem de proteínas, eletroforese e “western blot” seguido de
imunomarcação de cérebro de truta 18
3.4. Imunohistoquímica 20
3.5. Extração de RNA, síntese do cDNA e seqüenciamento nucleotídico 21
3.5.1. Extração de RNA 21
3.5.2. Síntese de cDNA 23
3.5.2.1. Reação de Transcrição Reversa (RT-PCR) 23
3.5.2.2. Reação em cadeia da polimerase (PCR) para a miosina V 24
3.5.2.3. Ligação de fragmentos de DNA a vetores de clonagem 26
3.5.2.4. Transformação de bactérias competentes e identificação de
colônias recombinantes 26
3.5.2.5. PCR para a confirmação da presença de insertos e
purificação das amostras 27
3.5.2.5.1. Purificação de produtos de PCR (Kit GFX PCR DNA
and Purification – Amershan Biosciences) 28
3.5.2.5.2. Mini-preparações para a purificação de plasmídios
recombinantes (Kit Wizard Plus Minipreps DNA
Purification System – Promega) 28
3.5.2.6. Seqüenciamento nucleotídico 29
3.5.2.7. Análise das seqüências 30
4. Resultados e Discussão 32
4.1. Capítulo I 33
4.2. Capítulo II 47
4.3. Discussão geral 71
5. Conclusões 73
6. Referências Bibliográficas 74
Anexo 83
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
1
Resumo
As miosinas constituem uma ampla família de motores moleculares que
surgiram e se diversificaram precocemente durante a evolução eucariótica. Essas
mecanoenzimas estão implicadas em um número importante de processos celulares,
tendo um papel fundamental na motilidade celular. As miosinas V compõem uma das
classes de miosinas não-convencionais mais bem caracterizada atualmente sendo
composta por vários membros identificados desde leveduras a humanos. Apesar de
apresentar uma ampla distribuição nos diferentes táxons, sua expressão e
distribuição tecidual em vertebrados primitivos têm sido pouco investigadas. Este
trabalho objetivou, portanto, determinar a distribuição tecidual e caracterizar o RNAm
que codifica as miosinas da classe V em truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss). Os
resultados obtidos revelaram a distribuição tecidual e celular desta proteína em
diferentes regiões do sistema nervoso central de truta contribuindo para a
compreensão de sua função na fisiologia e plasticidade cerebral, principalmente no
que diz respeito a sua característica como mecanoenzima. A análise comparativa do
segmento referente aos domínios cabeça e pescoço da miosina Va entre os
diferentes organismos demonstrou que a evolução dessa classe de miosinas tem
acompanhado a divergência dos principais grupos de vertebrados. Ainda, dados
obtidos através do seqüenciamento de porções da cauda das miosinas Va, Vb e Vc
evidenciaram a presença de mais de um membro desta classe de proteínas num
mesmo tecido. Dessa forma, esperamos ter contribuído para o conhecimento das
funções das miosinas da classe V nos vertebrados primitivos e para o entendimento
de seu comportamento evolutivo nos diferentes grupos animais.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
2
Abstract
Myosins constitute a wide family of molecular motors that appeared and
diversified early during the eukaryotic evolution. These mecanoenzymes are
implicated in an important number of cellular processes, having a fundamental role in
the cellular motility. The myosins V constitute one of the classes of unconventional
myosins better characterized nowadays being composed by several members
identified from yeasts to humans. Despite of its broad distribution in the different taxa,
its expression and tissue distribution in primitive vertebrates has been a little
investigated. Therefore, this work had as objective to determine the tissue distribution
and to characterize the mRNA that codifies the myosins of the class V in rainbow
trout (Oncorhynchus mykiss). The obtained results revealed the tissue and cellular
distribution of this protein in different areas of the central nervous system contributing
to the understanding of its function in the physiology and cerebral plasticity, mainly in
relation to its characteristic as mecanoenzyme. The comparative analysis of the
segment regarding the head and neck domains of the myosin Va among the different
organisms demonstrated that the evolution of that myosins has been accompanying
the divergence of the main groups of vertebrates. Still, data obtained through the
sequencing of portions of the myosins Va, Vb and Vc tails evidenced the presence of
more than one member of this class of proteins in the same tissue. In that way, we
waited to have contributed to the knowledge of the functions of the class V myosins in
the primitive vertebrates and for the understanding of its evolutionary behavior in the
different animal groups.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
3
1. INTRODUÇÃO
O objetivo deste trabalho é a determinação da distribuição tecidual e
caracterização gênica de miosinas da classe V em tecidos de vertebrados primitivos
utilizando como modelo peixes (Oncorhynchus mykiss), contribuindo assim para o
conhecimento de suas funções nos vertebrados primitivos e para o entendimento de
seu comportamento evolutivo nos diferentes grupos animais.
Os peixes teleósteos representam o mais numeroso grupo de
vertebrados, possuem um encéfalo relativamente pequeno e uma organização
cerebral homóloga a de outros vertebrados constituindo, portanto, um excelente
modelo para estudos de desenvolvimento, estrutura e função do sistema nervoso e
de proteínas motoras envolvidas na fisiologia neural. Ainda, apesar da ampla
distribuição nos diferentes táxons, a presença e distribuição tecidual das miosinas da
classe V em peixes não têm sido até o momento investigada.
1.1. Considerações gerais
O citoesqueleto participa de uma grande variedade de eventos
celulares, não somente promovendo a estruturação celular, mas também mediando o
transporte de organelas, determinando o posicionamento de receptores para células
alvo, polarizando a célula durante o desenvolvimento, participando em processos de
secreção, formação de extensões celulares, mitose e citocinese (Drubin & Hirokawa,
1998).
Os eventos de motilidade celular envolvem a participação dos
microtúbulos, filamentos de actina e mecanoenzimas. As mecanoenzimas
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
4
conhecidas são divididas em três famílias: as dineínas e cinesinas associadas aos
microtúbulos e as miosinas associadas aos filamentos de actina (Vale et al, 1985;
Vale, 1993; Vandrekerckhove, 1993; Spudich, 1994).
1.2. A superfamília das miosinas
As miosinas constituem uma ampla família de motores moleculares que
surgiram e se diversificaram precocemente durante a evolução eucariótica
(Thompson & Langford, 2002; Richards & Cavalier-Smith, 2005). A maioria dos
eucariotos dependem das miosinas e somente uns poucos grupos taxonômicos
parecem viver sem elas como, por exemplo, as algas vermelhas e protistas
diplomonados (Vale, 2003). Essas mecanoenzimas geram força e movimento através
do deslizamento sobre a actina polimérica utilizando a energia da hidrólise do ATP e
estão implicadas em um número importante de processos celulares, tendo um papel
fundamental na motilidade celular (Sellers, 1999). As miosinas são tipicamente
caracterizadas pela presença de uma cadeia pesada que compreende três
subdomínios funcionais: (i) um domínio cabeça conservado, geralmente próximo à
região N-terminal da molécula, responsável pela ligação à actina, pela atividade
ATPásica e pela geração de movimento; (ii) um pescoço curto que interage com
cadeias leves e é frequentemente formado por um ou mais “motivos IQ”; (iii) uma
cauda C-terminal muito variável em relação a tamanho, estrutura e presença de
sequências específicas, que comumente está envolvida nas interações com cargas
particulares e determina a especificidade funcional da proteína (Foth et al, 2006).
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
5
Por meio de comparações e análises filogenéticas do domínio motor
das miosinas foram estabelecidas 18 classes de moléculas estruturalmente distintas
distribuídas desde leveduras à mamíferos, sendo a classe II constituída pelas
miosinas denominadas de convencionais e as demais de não-convencionais (Cheney
& Mooseker, 1992; Cheney et al, 1993b; Mooseker & Cheney, 1995, Mermall et al,
1998, Hodge & Cope, 2000;) (Figura 1).
Figura 1: Esquema linear de 17 classes de miosinas comparando os domínios
cabeça, pescoço e cauda. A classe XVIII não está representada. Os domínios estão
definidos na coluna à direita de acordo com o código de cores utilizado no esquema
(Sellers, 2000).
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
6
Porém, formas adicionais de miosinas têm sido descritas e pesquisas
recentes chegaram a revelar o impressionante número de 37 tipos de miosinas
dentro de sua família gênica, com diferentes combinações de domínios e uma ampla
distribuição taxônomica (Richards & Cavalier-Smith, 2005) (Figura 2).
Figura 2: Distribuição taxonômica de 37 tipos de parálogas de miosinas em 23
táxons eucarióticos principais. Os táxons são demonstrados no eixo X e a ordem dos
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
7
domínios das miosinas e sua classificação no eixo Y. Pontos pretos indicam
detecção, pontos em branco indicam dados não disponíveis e pontos laranja indicam
ausência de um projeto genoma completo (Richards & Cavalier-Smith, 2005).
A diversidade estrutural apresentada pelas miosinas reflete sua
diversidade funcional (Kieke & Titus, 2003). Humanos tem pelo menos 11 diferentes
classes de miosinas, cada uma com um domínio motor claramente distinto e uma
variedade única de outras sequências motivos (Kieke & Titus, 2003; Berg et al,
2001). Outros organismos tem seus próprios complementos de miosinas, alguns
similares aos dos humanos, mas muitos são únicos ou encontrados somente em
poucas espécies (Foth et al, 2006; Richards & Cavalier-Smith, 2005; Berg et al,
2001).
A superfamília das miosinas tem despertado muito interesse
atualmente, devido ao grande número de processos intracelulares, inclusive alguns
eventos fisiológicos e patológicos, nos quais essas mecanoenzimas estão
envolvidas. Múltiplas abordagens vêm sendo utilizadas em sua investigação entre
elas a genética, bioquímica, estudos de motilidade in vitro, análise e manipulação de
células em cultura, engenharia molecular e sondas fluorescentes (Larson, 2000).
1.3. As miosinas da classe V
Embora as miosinas convencionais (miosinas da classe II),
responsáveis por processos tais como contração muscular e citocinese, tenham sido
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
8
intensivamente estudadas, relativamente pouco se sabe sobre as propriedades das
miosinas não-convencionais (Nascimento et al, 1996).
As miosinas V compõem uma das classes de miosinas não-
convencionais mais bem caracterizada atualmente, sendo um dos grupos mais
antigo e amplamente distribuído de miosinas (Berg et al, 2001). As miosinas V foram
inicialmente caracterizadas em cérebro, como proteínas não usuais de ligação a
calmodulina, com propriedades bioquímicas semelhantes às das miosinas (Larson et
al, 1988; Larson et al,1990; Espindola et al, 1992). Subseqüentemente, os genes da
cadeia pesada da miosina V foram clonados e seqüenciados de rato, levedura e
galinha, definindo então a quinta classe de motores associados a actina (Mercer et
al, 1991; Johnston et al, 1991; Espreafico et al, 1992; Sanders, 1992; Cheney and
Mooseker, 1992).
A classe V de miosinas difere estruturalmente das outras miosinas por
apresentar um domínio pescoço estendido e um domínio cauda que permite a
dimerização, mas não a formação de filamentos devido à presença de uma região
globular carboxi-terminal (Provance & Mercer, 1999).
Inúmeras funções tem sido propostas para as miosinas da classe V. A
análise de mutantes e de características bioquímicas tem sugerido sua participação
no tráfico de membrana, transporte de mRNA, polarização celular e no transporte de
organelas e outros componentes celulares (Espreafico et al, 1992, Mooseker &
Cheney, 1995; Larson, 1996; Titus, 1997). Ainda, evidências mais recentes sugerem
que as miosinas da classe V podem ter diferentes funções dentro de uma única
célula (Reck-Peterson et al, 2000). Esta classe é composta de vários membros
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
9
identificados em leveduras (genes Myo2 (Johnston et al, 1991) e Myo4 (Haarer et al,
1994)) e amebas (gene Myoj (Peterson et al, 1996)), em metazoários invertebrados
como Caenorhabditis elegans (gene Hum-2 (Baker & Titus, 1997)), ouriço-do-mar
(Sirotkin & Bonder, 1997), lula (Molyneaux & Langford, 1997) e drosófila (Bonafe &
Sellers, 1998) e em vertebrados como rã (Solc et al, 1994), galinha (Evans et al,
1997; Espreafico et al, 1992; Sanders et al 1992), camundongo (Mercer et al, 1991),
rato (Zhao et al, 1996) e humanos (Engle & Kennett, 1994).
A maioria dos organismos estudados tem ao menos um membro da
classe V de miosinas, muitos têm múltiplos membros. A ampla gama de espécies em
que as miosinas V tem sido identificadas sugerem que elas são um componente
fundamental no transporte de organelas em todos os eucariotos superiores
(Provance & Mercer, 1999).
Em vertebrados, foram identificados três membros de miosinas da
classe V denominados Va, Vb e Vc (Figura 3). A miosina Va tem sido a mais
investigada (Rodriguez & Cheney, 1998, 2002) sendo expressa em altos níveis
principalmente no cérebro e em melanócitos. O segundo membro dessa classe, a
miosina Vb, foi clonada e sequenciada de rato (Zhao et al, 1996), mas tem recebido
relativamente pouca atenção. O terceiro membro dessa família, a miosina Vc, foi
descoberto e clonado mais recentemente e é relativamente abundante em tecidos
secretórios e glandulares, onde é expressa principalmente nas células epiteliais
(Rodriguez & Cheney, 2002).
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
10
Figura 3: Esquema representativo dos três membros da classe V de miosinas
(Rodriguez & Cheney, 2002). Essas proteínas apresentam homologia nos domínios
cabeça, pescoço e cauda, porém a miosina Vc não apresenta a região PEST,
susceptível a clivagem pela calpaína, na cauda medial.
1.4. A miosina V de cérebro (miosina Va)
A miosina Va ou miosina V de cérebro (BM-V) é um motor molecular
envolvido na motilidade celular baseada na actina. Ela foi inicialmente identificada
em cérebro de coelho durante a investigação da regulação por cálcio/calmodulina da
atividade ATPásica de uma fosfoproteína com peso molecular de 190 kDa. Essa
proteína já se encontra purificada e caracterizada como enzima nativa, clonada,
seqüenciada e expressa em bactéria, visualizada ao microscópio eletrônico e suas
propriedades motoras investigadas (Larson et al, 1988; 1990; Espindola et al, 1992;
Espreafico et al, 1992; Cheney et al, 1993a, Nascimento et al, 1996).
Trata-se de uma molécula dimérica, composta pelos domínios cabeça,
pescoço e cauda. O domínio cabeça (N-terminal), o mais conservado entre as
miosinas, possui sítios de hidrólise de ATP e de ligação para actina, gerando a força
requerida para o movimento de cargas e portanto, conferindo propriedades motoras
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
11
à molécula. O domínio pescoço α-helicoidal é mais alongado nesta classe de
miosinas e apresenta sítios de ligação para calmodulina e outras cadeias leves. A
estrutura primária do pescoço contém seis repetições em tandem de motivos IQ
(sequência consenso IQXXXRGXXXRXXX, onde X representa qualquer aminoácido).
Acredita-se que cada motivo IQ seja um sítio de ligação para calmodulina ou outra
cadeia leve (Xie et al, 1994; Larson, 1996) e que o domínio pescoço está
provavelmente envolvido na regulação do domínio mecanoquímico (cabeça) (Larson,
1996; Nascimento et al, 1996). O domínio cauda consiste em segmentos em dupla
alfa-hélice intercalados com domínios globulares podendo ser dividido em três
regiões: a) cauda proximal, maior segmento deste domínio, que forma uma estrutura
em dupla alfa-hélice (“coiled coil”), responsável pela dimerização da molécula; b)
cauda medial, composta de regiões globulares intercaladas com estruturas em dupla
alfa-hélice sendo que a primeira região globular contém a seqüência PEST (rica em
prolina, glutamato, serina e treonina), susceptível à clivagem pela calpaína; c) cauda
distal, uma região globular carboxi-terminal, possivelmente envolvida na interação da
miosina V com seus alvos intracelulares através de sua ligação com outras proteínas
e receptores (Figura 4).
Esta miosina é expressa principalmente em células do sistema nervoso
e em melanócitos (Rodriguez & Cheney, 2002). Trabalhos anteriores demonstravam
serem estes os únicos tecidos a expressar esse membro da classe V de miosinas,
porém ela já foi encontrada também em outros tecidos e células como linfócitos,
adrenal, ovários, testículo e outras células secretoras (Espreafico, dados não
publicados).
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
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CLE
CaM
912
755
1106
1420
Cauda Globular
Cauda Proximal
Cauda Medial
PEST
Cabeça
Pescoço
CLE
CaM
912
755
1106
1420
Cauda Globular
Cauda Proximal
Cauda Medial
PEST
Cabeça
Pescoço
Figura 4: Modelo hipotético da miosina Va mostrando os domínios estruturais e as
cadeias leves. Os números indicam as posições dos resíduos de aminoácidos nas
junções entre os domínios (adaptado de Larson, 1996). CLE (cadeia leve essencial);
CaM (calmodulina); PEST (seqüência PEST).
São descritas ao menos três isoformas distintas dessa proteína, que
variam por apresentar ou não os exons alternativos B (3 aminoácidos), D (25
aminoácidos) e F (27 aminoácidos). As isoformas mais abundantes, expressas em
melanócitos e leucócitos, apresentam os exons D e F, enquanto que a cerebral
carece desses exons, mas apresenta o exon B.
Através de técnicas imunoquímicas e de imunolocalização em células e
regiões subcelulares tem-se sugerido a participação da miosina-Va em processos
como neurotransmissão (Costa et al, 1999; Mani et al, 1994; Prekeris & Terrian,
1997), motilidade de cones de crescimento (Evans et al, 1997; Wang et al, 1996) e
translocação de organelas (Evans et al, 1998; Tabb et al, 1998, Nascimento et al,
1997). Nos melanócitos ela faz parte do complexo de transporte de melanossomos (
Wu et al, 1997). Mutações no gene que codifica a miosina Va (Myo5a) causam o
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
13
fenótipo dilute em camundongos, que é geralmente associado a várias desordens
neurológicas, como convulsões e alterações de postura e equilíbrio, provocando a
morte em até três semanas após o nascimento (Mercer et al, 1991), o fenótipo dilute-
opisthotonus em ratos mutantes (Futaki et al, 2000) e, em humanos, a rara síndrome
de Griscelli, com danos neurológicos (Pastural el al, 1997; Ménasche et al, 2000).
Estas desordens recessivas autossomais resultam num fenótipo com diluição da
pigmentação da pele e cabelos, a presença de um grande acúmulo de pigmentos
nas hastes dos cabelos e o acúmulo de melanossomas nos melanócitos, além de
defeitos neurológicos. O gene Myo5a está localizado no cromossomo 15q21→ q22
em humanos e nos cromossomos homólogos 8 e 9 em camundongo e rato,
respectivamente (Hasson et al, 1996; Ohuo et al, 1996).
Estudos imunohistoquímicos em cérebro de ratos adultos forneceram
um mapeamento da distribuição regional e celular da miosina Va no sistema nervoso
central destes mamíferos, contribuindo para o entendimento de suas funções e
plasticidade no cérebro, particularmente no que diz respeito aos fenômenos que
envolvem motores moleculares, tais como crescimento de neuritos, transporte de
organelas e ciclagem de vesículas de neurotransmissores (Tilelli et al, 2003). Ainda,
trabalhos recentes têm demonstrado a presença de miosinas da classe V em tecidos
embrionários de galinha (Azevedo et al, 2004) e evidenciam sua participação nos
mecanismos de motilidade celular durante o desenvolvimento.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
14
1.5. Os membros da classe V em vertebrados
Em vertebrados, a maior parte dos trabalhos sobre miosinas V tem
focado a miosina Va (dilute, Myo5a, BM-V). Ela é a mais estudada tanto bioquímica,
genética quanto morfologicamente, sendo abundante em células nervosas
(Espreafico et al, 1992; Provance et al, 1996; Wu et al, 1998). A proteína humana,
deduzida de cDNA, contendo todos os exons alternativos, apresenta 1880 resíduos
de aminoácidos, com massa molecular calculada de 215 kDa e massa molecular
aparente em SDS-PAGE de aproximadamente 200 kDa. O segundo membro da
classe V em vertebrados, miosina Vb (myr6, Myo5b), teve sua seqüência completa
inferida a partir da seqüência do cDNA por Zhao et al. (1996), revelando uma
proteína de 1846 resíduos de aminoácidos, com massa molecular calculada de 214
kDa e massa molecular aparente em SDS-PAGE de aproximadamente 200 kDa, mas
tem sido relativamente pouco explorada. O terceiro membro, miosina Vc (Myo5c), foi
recentemente descoberto e clonado a partir de tecido humano (Rodriguez & Cheney,
2002), sendo constituída de 1742 resíduos de aminoácidos, com massa molecular
calculada de aproximadamente 203 kDa e massa molecular aparente em SDS-PAGE
de aproximadamente 180 kDa.
A partir de “northern blots” e “dot blots”, Rodriguez e Cheney (2002)
determinaram sistematicamente o padrão de expressão dos três membros de
miosina da classe V em tecidos e células de vertebrados, verificando que as três
proteínas são ubiquamente expressas. Entretanto, a abundância de expressão varia
para os três membros nos diferentes tecidos ou órgãos analisados. Como esperado
a partir de dados anteriores (Espreafico et al, 1992) a expressão da miosina Va foi
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
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abundante no sistema nervoso central (embora tenha sido detectada menor
expressão em pituitária, adrenal, tireóide, glândulas salivares, intestino delgado,
baço, timo, leucócitos, linfonodos, medula óssea, apêndice, pulmão, traquéia e
placenta). A miosina Vb foi amplamente expressa, apresentando maior abundância
em rim, fígado e placenta (além de cólon, próstata, estômago, testículo, pituitária,
tireóide, glândulas salivares, intestino delgado, traquéia e pulmão). A miosina Vc foi
encontrada expressa com abundância em tecidos epiteliais e secretores (colon,
próstata, estômago, testículo, ovário, pâncreas, pituitária, tireóide, glândulas
salivares, glândulas mamárias, rim, intestino delgado, pulmão e traquéia). A
presença de três membros da classe V de miosinas em vertebrados faz surgir várias
questões, principalmente no que diz respeito aos papéis relativos destes diferentes
tipos de miosina V dentro das células. Uma dada célula expressaria somente um tipo
de miosina V ou todas as três formas? Teriam os membros da classe V funções
sobrepostas dentro das células? O compartilhamento de mecanismos para a
regulação e a associação a cargas específicas existiria? Com quais ligantes
específicos estaria interagindo cada tipo de miosina? Embora significante progresso
venha sendo alcançado no estudo desta proteína, ainda são necessárias muitas
pesquisas adicionais para que possamos responder às questões que permanecem
pendentes acerca das características, distribuição, mecanismos e funções das
miosinas da classe V.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
16
2. OBJETIVOS
Embora tenha sido demonstradas a essencialidade das miosinas-V nos
mecanismos de motilidade celular e sua ampla distribuição em diversos tecidos e nos
diferentes táxons, sua presença e distribuição tecidual em peixes têm sido pouco
investigadas. Desta forma, este trabalho objetivou:
- isolar, sequenciar e comparar o cDNA que expressa cadeias pesadas
de miosinas com identidade aos membros da classe V em diferentes tecidos da truta
Oncorhynchus mykiss;
- realizar análises comparativas entre os dados de seqüenciamento
obtidos para peixe com informações disponíveis na literatura e em bancos de
seqüências para outros vertebrados;
- verificar a expressão de miosinas da classe V através de técnicas
imunohistoquímicas no sistema nervoso de peixe utilizando anticorpos policlonais
anti-miosina Va;
- correlacionar o padrão de expressão espacial com possíveis funções
motora e/ou estrutural das miosinas-V.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
17
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Obtenção dos exemplares de truta arco-íris
Indivíduos adultos de Oncorhynchus mykiss (truta arco-íris) foram
fornecidos pela Estação Experimental de Salmonicultura de Campos do Jordão
(APTA - Instituto de Pesca), de acordo com parceria previamente estabelecida, e
mantidos no Biotério de Peixes do Departamento de Morfologia (IBB-UNESP).
Para as análises moleculares e da distribuição tecidual da miosina V,
foram coletados diferentes tecidos de O. mykiss, a saber: diferentes porções do
sistema nervoso central, hipófise, coração, aorta, músculo esquelético, ovário,
testículo, estômago, baço, intestino, rim, fígado e brânquia. Para a extração de RNA
total, os tecidos coletados foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido e
posteriormente transferidos e estocados em freezer a – 80°C. Para os estudos de
imunohistoquímica, cérebro e medula de alguns indivíduos foram coletados e
armazenados inteiros em fixador de Boüin.
3.2. Produção e purificação de anticorpos policlonais anti-miosina
Va
Os procedimentos relativos à obtenção dos anticorpos primários (como
descrito a seguir) foram realizados pela equipe do Dr. Roy Edward Larson (FMRP-
USP), de acordo com parceria previamente estabelecida.
Coelhos (albinos) foram inoculados com frações purificadas da cauda
(cauda medial) da miosina V de cérebro (BM-V), expressa em bactéria como descrito
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
18
por Espreafico et al (1992). Foram feitas três inoculações num intervalo de 45 dias,
no final dos quais coletou-se o sangue por punção cardíaca. Foram realizadas quatro
punções cardíacas (7 em 7 dias) e o soro, obtido por coagulação do sangue à
temperatura ambiente seguido de centrifugação, foi analisado em “western blots” de
cérebros de pintainhos e estocado no freezer para posterior purificação.
Para purificação dos anticorpos a partir do soro de coelhos imunizados,
a cauda da BM-V expressa em bactéria foi aderida em membrana de nitrocelulose e
a mesma foi incubada por 24 horas em tampão TBS pH 7,6 (Tris-HCl 40 mM, NaCl
150 mM) contendo BSA 3% (albumina de soro bovino) e leite molico 5% (bloqueio de
sítios de ligação inespecífica). A seguir a membrana foi incubada por 24 horas a 4°C
no soro total coletado de coelhos imunizados, lavada em tampão TBS-T pH 7,6 (Tris-
HCl 40 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05%) e os anticorpos, aderidos
especificamente, eluídos com solução de trietilamina a 1,4% (v/v) por 5 minutos sob
agitação rigorosa. O eluído (cerca de 500 µl) foi submetido à diálise (3 trocas a cada
12 horas) em tampão TBS pH 7,6 a 4°C.
Após a diálise, a solução contendo os anticorpos foi titulada e sua
especificidade testada em "western blots" de músculo cardíaco e cérebro de
pintainho de acordo com a metodologia descrita mais adiante.
3.3. Dosagem de proteínas, eletroforese e “western blot” seguido
de imunomarcação de cérebro de truta.
Os cérebros de trutas foram coletados por dissecção após anestesia
com benzocaína, homogeneizados em tampão Tris-HCl 0,0396 M pH 6,8 contendo
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
19
SDS 1%, benzamidina 1 mM, aprotinina 1 mM, DTT 2 mM, EDTA 5 mM, EGTA 5
mM, ATP 5 mM e submetidos à dosagem de proteínas pelo método do ácido
bicinconínico (Smith et al, 1985).
Após a dosagem de proteínas, 25 µg de proteínas/amostra receberam
o tampão Stop (Tris-HCl 0,185 M, pH 6,8 contendo SDS 6%, EDTA 6 mM, glicerol
27,6%, β-mercaptoetanol 1:1000 e azul de bromofenol) na proporção de 4:1
(amostra:tampão), foram aquecidas a 100
o
C por 3 minutos e submetidas à
eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de 7 a 15%. O gel foi então fixado
em metanol-ácido acético, e após coloração do mesmo com Cromassie Brilliant Blue
R a 0,25% observou-se o padrão de bandas protéicas.
Após a análise do padrão de bandas protéicas, cerca de 60 µg de
proteínas/amostra foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-
PAGE) de 7 a 15% e transferidas eletroforeticamente para membranas de
nitrocelulose. As membranas de nitrocelulose foram então incubadas em leite molico
desnatado a 5% (v/v) diluído em tampão TBS-T por 2 horas à temperatura ambiente
e, em seguida, incubadas nos anticorpos policlonais anti BM-V (1:1000) por 1 hora à
temperatura ambiente. Foram utilizados diferentes anticorpos para verificação da
expressão de miosina V em cérebro de truta, a saber: anti-cauda medial (fração 8c
produzido como descrito acima), anti-domínio cabeça, anti-cauda inteira e pescoço
(fração 32A), anti-miosina Vb e anti-miosina II de cérebro. A seguir as membranas
foram lavadas em tampão TBS-T (4 x 5 minutos), incubadas no anticorpo secundário
IgG de cabra anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase (1:5000) (Amersham) por
1 hora à temperatura ambiente e lavadas em tampão TBS-T (4 x 5 minutos). Para
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
20
revelação da peroxidase as membranas foram lavadas em tampão Fosfato de Sódio
100 mM pH 7,4 e reveladas por 10 minutos em tampão Fosfato de Sódio 100 mM pH
7,4 contendo DAB (diaminobenzidina) 0,06% e H
2
O
2
0,03%. Como controle da
especificidade do anticorpo primário e secundário, utilizou-se no lugar do anticorpo
primário o soro pré-adsorvido com o antígeno. Como controle positivo utilizou-se
“western blots” de cérebros de pintainhos ao lado das amostras de cérebros de truta.
Os resultados foram documentados por digitalização da imagem (HP ScanJet
6100C) e posterior impressão.
3.4. Imunohistoquímica
Os cérebros de indivíduos adultos de truta coletados, dissecados e
fixados inteiros em solução de Boüin (75% solução saturada de ácido pícrico, 25%
formaldeído, 5% ácido acético glacial) foram lavados várias vezes em álcool 70%,
desidratados em série crescente de etanol, diafanizados em xilol e incluídos em
parafina. Os cortes semi-seriados com espessura de 10 µm foram distendidos em
lâminas histológicas, desparafinizados e processados para a imunohistoquímica. A
recuperação dos sítios antigênicos foi realizada incubando as seções histológicas em
solução de tampão citrato 20 mM pH 6,0 e submetendo-as à irradiação em
microondas doméstico (potência máxima) por 10 minutos. (Martins et al, 1999).
O bloqueio de sítios inespecíficos de ligação foi feito incubando as
secções em tampão Tris-Glicina 100 mM pH 7,4 por 1 hora à temperatura ambiente e
a seguir no tampão de bloqueio (Fosfato de Sódio 100 mM pH 7,4 contendo Triton X-
100 0,3% (v/v), NaCl 400 mM, BSA 5% e soro normal de cabra (1:6) (v/v)) por 4
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
21
horas à temperatura ambiente. Logo após, as amostras foram incubadas no
anticorpo primário anti-BM-V (1:100) diluído no tampão de bloqueio “overnight” à 4ºC,
lavadas em tampão Fosfato de Sódio 100 mM contendo Triton X-100 a 0,3% (v/v) (5
X 30 minutos) e incubadas no anticorpo secundário IgG de cabra anti-IgG de coelho
acoplado a peroxidase diluídos 1:500 em tampão Fosfato de Sódio 100 mM pH 7,4
contendo Triton X-100 0,3% (v/v) por 4 horas à temperatura ambiente. Para a
revelação da peroxidase as amostras foram lavadas em tampão Fosfato de Sódio
100 mM pH 7,4 e reveladas no escuro por 10 minutos em tampão Fosfato de Sódio
100 mM pH 7,4 contendo DAB (diaminobenzidina) 0,06% e H
2
O
2
0,03%.
As amostras foram analisadas e fotografadas no microscópio óptico
Axiophot (ZEISS).
3.5. Extração de RNA, síntese de cDNA e sequenciamento
nucleotídico
3.5.1. Extração de RNA
Exemplares adultos de truta arco-íris foram sacrificados por transecção
espinhal e seus cérebros, além de outros órgãos e tecidos, foram dissecados e
congelados em nitrogênio líquido para posterior extração do RNA total.
Amostras com aproximadamente 100mg de tecido congelado foram
homogeneizadas com homogeneizador de tecidos (IKA UltraTurrax/T-25) em tubos
com 1 ml de TRIzol (Invitrogen). O material insolúvel resultante da homogeneização
foi retirado por centrifugação a 12.000g por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi
então transferido para tubos de 1,5 ml e incubado durante 5 minutos à temperatura
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
22
ambiente para permitir a completa dissociação dos complexos núcleo-protéicos.
Após esse período, foi acrescentado 0,2 ml de clorofórmio, por ml de TRIzol utilizado,
homogeneizado vigorosamente e incubado novamente, por 3 minutos à temperatura
ambiente. Em seguida, o material foi centrifugado a 12.000g por 15 minutos a 4°C.
Para a precipitação do RNA, a fase aquosa formada após a
centrifugação do material foi separada e precipitada por intermédio da incubação
com 0,5 ml de isopropanol (por ml de TRIzol utilizado inicialmente) por 10 minutos à
temperatura ambiente. Após esse período, o material foi novamente centrifugado a
12.000g por 10 minutos a 4 °C. O sedimento formado foi lavado com 1ml de etanol
75% (em água tratada com Dietilpirocarbonato-Sigma® - DEPC, a 0,1%) gelado e
centrifugado a 7.500g por 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi removido
cuidadosamente e, após a retirada do excesso de líquido do fundo do tubo com
auxílio de uma ponteira de micropipeta, o pellet foi seco à temperatura ambiente
durante cerca de 10 minutos. O RNA total foi dissolvido em água ultra pura RNAse
free (Invitrogen) e incubado por 10 minutos em banho-maria à 60ºC. Finalmente, foi
armazenado em freezer a - 80ºC.
As amostras foram quantificadas por espectrofotometria a 260 nm,
usando-se o fator de correção próprio para o RNA (40). Foi também determinada a
razão entre as leituras a 260 e 280 nm, o que nos forneceu uma estimativa da
qualidade da extração (razão ≥ 1.65). A integridade do RNA extraído foi avaliada por
eletroforese em gel de agarose a 1%.
Para digestão de possíveis contaminantes de DNA seguiram-se as
instruções do protocolo DNAse I - Amplification Grade (Invitrogen®). O RNA total
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
23
destinado à reação de transcrição reversa foi transferido para um microtubo estéril,
onde foram acrescentados 1µl de tampão de DNAse, 1µl de DNAse I (1unidade/ml) e
água destilada autoclavada (tratada com DEPC) na quantidade suficiente para
completar 10µl de solução. Essa solução permaneceu à temperatura ambiente
durante 15 minutos e, em seguida, foi acrescida de 1µl de EDTA (25mM) e incubada
a 65ºC por 10 minutos.
3.5.2. Síntese do cDNA
3.5.2.1. Reação de Transcrição Reversa (RT-PCR)
A transcrição reversa do RNA total obtido foi realizada por meio do kit
Super Script First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen), utilizando-se
alíquotas contendo 2 µl da amostra de RNA total. A elas foram adicionadas 1 µl de
Random Primers (50 ng/µl), 1µl de dNTP (10mM) mix e o volume ajustado para 10 µl
com H
2
O tratada com DEPC. Cada amostra foi incubada a 65°C por 5 minutos e
então transferidas para o gelo por pelo menos 1 minuto. Em seguida, foram
adicionados 9 µl de uma mistura composta de 2 µl de tampão da transcriptase
reversa (10X RT buffer), 4µl de MgCl
2
25 mM, 2 µl de DTT 0,1 M e 1 µl de inibidor de
ribonuclease (RNase Out
TM
Recombinant Rnase Inhibitor). Essa mistura foi incubada
a 25°C por 2 minutos e em seguida foi adicionado 1 µl da enzima transcriptase
reversa (50 unidades). A mistura foi incubada a 25°C por 10 minutos, seguida de um
período de 50 minutos a 42°C e, na seqüência, por 15 minutos a 70°C. Depois de
serem resfriados no gelo, cada tubo contendo as amostras recebeu 1 µl da enzima
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
24
Rnase H (E. coli Rnase H 2 un/µl) e foi incubado por 20 minutos a 37°C. Após a
síntese do cDNA, as amostras foram conservadas em freezer a -20°C.
3.5.2.2. Reação em cadeia da polimerase (PCR) para a Miosina V
Para proceder à amplificação do cDNA para miosina V, alíquotas de 2
µl da reação de RT-PCR foram adicionadas a 48 µl de uma mistura contendo 38,3 µl
de água destilada autoclavada, 5 µl de tampão 10X PCR, 1,5 µl de MgCl
2
(50 mM) 1
µl de dNTPs (10 mM), 1 µl de primers “sense” e “anti-sense” (10 µM) e 0,2 µl de
Platinum® DNA Taq polimerase (1 unidade/µl) (Invitrogen) para cada amostra. Para
a amplificação do domínio cabeça foi utilizado o conjunto de primers BM5-F e BM5-
R1, para o domínio pescoço, o conjunto MyRC1 e BM5-R e para a amplificação de
fragmentos das caudas das miosinas Va, Vb e Vc, os conjuntos Tail-5a-F1 e Tail-5a-
R1, Tail-5b-F1 e Tail-5b-R1 e Tail-5c-F1 e Tail-5c-R1, nessa ordem. Os primers
utilizados para amplificar os domínios cabeça e pescoço foram desenhados a partir
da smilaridade encontrada entre a seqüência expressa da miosina V de galinha com
a seqüência nucleotídica do DNA genômico de zebrafish depositada no GenBank
(clone CH211-286c4-g25) e para as caudas das miosinas Va, Vb e Vc, a partir de
seqüências de miosinas V de rato, depositadas também no GenBank sob os
números de acesso AB035736, U60416 e XM_236411, respectivamente. Os primers
empregados foram desenhados com utilização do software Primer3 (Rozen and
Skaletsky, 2000) disponível para uso on line http://www.frodo.wi.mit.edu/cgi-
bin/primer3.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
25
Os programas utilizados na PCR variaram de acordo com o tamanho
do fragmento a ser amplificado e estão descritos na Tabela 1, assim como a
seqüência nucleotídica dos primers usados.
Ao final desse processo, 3 µl do produto da reação de PCR foram
analisados em gel de agarose 1% em tampão TAE (1x) e corados com SYBR safe.
As bandas referentes à amplificação foram visualizadas em transiluminador e
fotografadas.
Tabela 1: Descrição dos programas e da seqüência nucleotídica dos primers
utilizados na amplificação dos domínios funcionais da miosina V.
Domínio
funcional
Conjunto de Primers Programa
Cabeça
BM5-F (5’-CTGGTGGGTGAGAATGACCT-3’)
BM5-R1 (5’-CTTGATGCAGCGCACATAGT-3’)
94°C - 1 minuto
94°C - 30 segundos
55°C - 30 segundos 35x
72°C - 3 minutos
68°C - 10 minutos
Pescoço
MyRC1 (5’-AAGACTGTTGGCTGCCAGTT-3’)
BM5-R (5’-GCAGCTGCATGATCTTGTTT-3’)
94°C - 2 minutos
95°C - 30 segundos
57°C - 30 segundos 35x
68°C - 2 minutos
68°C - 3 minutos
Caudas Va, Vb e Vc
Tail-5a-F1 (5’-TAGAAGTGGGGCAGATGGAG-3’)
Tail-5a-R1 (5’-ACTGGAGGTTCGCTTTCTGA-3’)
Tail-5b-F1 (5’-TGAGAGTATCCAGGGGCTGT-3’)
Tail-5b-R1 (5’-AGCATCCTCCTGGGTCTTCT-3’)
Tail-5c-F1 (5’-CCAAGCAACTTTTGGAGAGC-3’)
Tail-5c-R1 (5’-CTGCTTGCTTCTTTGGGAAC-3’)
94°C - 2 minutos
95°C - 1 minuto
58°C - 1 minuto 35x
72°C - 1 minuto
68°C - 10 minutos
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
26
3.5.2.3. Ligação de fragmentos de DNA a vetores de clonagem
Os fragmentos de DNA gerados por PCR foram ligados aos vetores de
clonagem pCR2.1 (Invitrogen) e pGEM-T (Promega).
Para a reação utilizando o vetor pCR2.1, foram adicionados em um
tubo 3 µl do fragmento de DNA de interesse, 1 µl de tampão de ligação 10x, 1 µl da
enzima T4 ligase (4U), 2 µl de vetor (50 ng/µl) e 3 µl de água estéril, totalizando um
volume de 10 µl. A mistura foi agitada cuidadosamente e incubada por
aproximadamente 12 horas a 14°C.
A reação utilizando o vetor pGEM-T foi realizada acrescentando a um
tubo 3 µl do fragmento de DNA de interesse, 5 µl de tampão de ligação 2x, 1 µl da
enzima T4 ligase (3U) e 1 µl do vetor (50ng/µl), totalizando um volume de 10 µl. A
mistura foi agitada cuidadosamente e incubada por cerca de 12 horas a 4°C.
3.5.2.4. Transformação de bactérias competentes e identificação de
colônias recombinantes
Em um tubo estéril, foram colocados 50 µl de bactérias competentes
(Escherichia coli DH 5α), adquiridas de empresas comerciais ou preparadas no
próprio laboratório, mais os 10 µl da reação de ligação, os quais foram misturados
cuidadosamente. Os tubos foram mantidos no gelo por 30 minutos, submetidos a
choque térmico a 37°C por 40 segundos e transferidos novamente para o gelo onde
permaneceram por mais 2 minutos. Em seguida foram adicionados a cada tubo 950
µl de meio líquido LB (peptona 1%/ NaCl 0,17M, extrato de levedura 0,5%, pH 7,5) à
temperatura ambiente. Após serem cuidadosamente misturados, os tubos foram
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
27
incubados a 37°C por cerca de 1 hora, sob agitação (250 rpm) e depois
centrifugados por 20 segundos a 10.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o
produto da transformação espalhado em placas de Petri estéreis, contendo meio
sólido LB (peptona 1%/ NaCl 0,17M, extrato de levedura 0,5%, agar 1,5%, pH 7,5),
ampicilina (50 mg/ml/ml de meio LB) e 50 µl de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-
galactoside, 50 mg/ml). As placas foram incubadas overnight em estufa a 37°C. No
dia seguinte, as colônias de coloração branca foram selecionadas e a presença de
inserto nos plasmídios foi confirmada por PCR.
3.5
.2.5. PCR para a confirmação da presença de insertos e
purificação das amostras
As colônias brancas, potencialmente portadoras do inserto de
interesse, foram repicadas em meio LB sólido e submetidas diretamente à reação de
amplificação por PCR. O conjunto de primers utilizados foi o M13F e M13R, que
possui homologia às regiões que flanqueiam o local de inserção do fragmento no
plasmídio. A reação foi realizada com tampão de PCR 10x, 10 mM de dNTPs, 50 mM
de MgCl
2
, 10 µM de cada primer e 1 unidade de Platinum® DNA Taq polimerase
(Invitrogen), totalizando um volume final de 25 µl. O programa utilizado no
termociclador consistia em um passo a 95°C por 3 minutos, seguido por 34 ciclos de
95°C por 30 segundos, 50°C por 1 minuto, 72°C por 2 minutos. Ainda, uma extensão
final foi realizada a 72°C por 5 minutos.
O sucesso da clonagem foi verificado através da visualização do
produto resultante da PCR em gel de agarose 1%. Para a realização do
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
28
seqüenciamento nucleotídico dos clones obtidos, foram utilizados plasmídios
contendo os fragmentos de DNA de interesse, purificados por mini-preparações, e
produtos de PCR das bactérias recombinantes contendo os insertos clonados.
3.5.2.5.1. Purificação de produtos de PCR (Kit GFX PCR DNA and
Purification – Amershan Biosciences)
Tubos e colunas do kit foram acoplados e foram adicionados 500 µl de
tampão de captura e 20 µl do produto de PCR dos clones recombinantes na coluna.
A mistura foi pipetada de 4 a 6 vezes e centrifugada a 14.000 rpm por 30 segundos.
A solução que passou pela coluna foi descartada e foram adicionados mais 500 µl de
tampão de lavagem a coluna que foi novamente centrifugada a 14.000 rpm por 30
segundos. Após o descarte da solução que passou pelas colunas, estas foram
transferidas para tubos de 1,5 ml e então foram adicionados a elas 20 µl de água
estéril a 37°C. Depois as amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 1
minuto e centrifugadas a 14.000 rpm por mais 1 minuto para a recuperação do DNA.
3.5.2.5.2. Mini-preparações para a purificação de plasmídios
recombinantes (Kit Wizard Plus Minipreps DNA Purification System – Promega)
As bactérias contendo os plamídios recombinantes cresceram overnight
em 3 ml de meio de cultura líquido LB (peptona 1%, NaCl 0,17M, extrato de levedura
0,5%, pH 7,5), acrescido de ampicilina (50mg/ml/ml de meio LB). No dia seguinte as
bactérias foram transferidas para tubos de 1,5 ml e centrifugadas em temperatura
ambiente, por 2 minutos a 10.000g. O sobrenadante foi descartado e o pellet
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
29
formado ressuspendido em 200 µl de solução de ressuspensão. Logo após, foram
adicionados 200 µl da solução de lise celular e os tubos foram invertidos lentamente
4 vezes. Então 200 µl de solução de neutralização foram acrescidos aos tubos que
foram invertidos novamente por mais 4 vezes. O lisado foi centrifugado por 5 minutos
a 10.000g e a porção líquida obtida foi transferida para uma seringa acoplada a uma
minicoluna contendo 1 ml de resina de purificação. Vagarosamente a mistura foi
filtrada em minicoluna a vácuo, proporcionado pelo acoplamento do êmbolo da
seringa. Em seguida, foram adicionados 2 ml de solução de lavagem à seringa e a
solução foi filtrada na minicoluna da mesma forma. Finalmente a minicoluna foi
transferida para um tubo de 1,5 ml e centrifugada por 2 minutos a 10.000g. Um novo
tubo foi acoplado a minicoluna e 50 µl de água deionizada foi acrescentada a ela
para eluir o DNA. Após 1 minuto de incubação em temperatura ambiente, mais uma
centrifugação foi realizada por 20 segundos a 10.000g, para a recuperação do DNA.
A minicoluna foi descartada e o tubo com o DNA purificado, armazenado em freezer
a -20° C.
3.5.2.6. Seqüenciamento nucleotídico
As amostras de DNA purificadas foram utilizadas em reações de
seqüenciamento através do kit DYEnamic
TM
ET Terminator Cycle Sequencing, da
Amersham Bioscience. A reação consistiu na adição a um tubo de microcentrífuga de
2 µl de premix, 1 µl do produto a ser seqüenciado, 2 µl de um dos primers (M13F ou
M13R) na concentração de 3 µM e 4 µl de água destilada autoclavada, para um
volume final de 9 µl. As condições da PCR de seqüenciamento foram: um ciclo inicial
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
30
a 95°C por 2 minutos, seguido de 30 ciclos a 95°C por 45 segundos, 50°C por 30
segundos e 60°C por 2 minutos. A reação de seqüenciamento foi realizada num
termociclador MJ Research, INC, modelo PTC-200
TM
Programmable Thermal
Controller.
Em seguida, o produto da reação foi submetido a um procedimento de
limpeza para a retirada dos dideoxinucleotídeos não incorporados. A cada amostra
foram acrescentados 1 µl de acetato de sódio 1,5 M / EDTA 250 mM e 80 µl de
etanol 95% gelado, que foram misturados utilizando-se um vórtex e então
centrifugados por 20 minutos a 14.000 rpm, a 4°C. O sobrenadante foi descartado e
400 µl de etanol 70% gelado foram adicionados a cada amostra, centrifugadas
novamente por 5 minutos a 14.000 rpm, a 4°C. Em seguida, o sobrenadante foi
descartado e o material mantido em estufa a 37°C até que secasse completamente
(aproximadamente 1 hora), protegido da luz. Antes da aplicação para a corrida de
seqüenciamento, as amostras foram ressuspendidas em uma solução contendo
formamida e blue dextran (5:2) e levadas ao termociclador para desnaturar por 5
minutos a 95°C. Então foram mantidas no gelo e aplicadas em gel de poliacrilamida
4,5%, acoplado a um seqüenciador automático ABI Prism
TM
377 DNA Sequencer
(Applied Biosystems).
3.5.2.7. Análise das seqüências
As seqüências foram processadas retirando-se as regiões
correspondentes ao plasmídio e a direção 5’- 3’das fitas foi organizada, quando
necessário, através do programa Gene Runner versão 3.0. Em seguida, foram
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
31
submetidas a pesquisas em bancos de seqüências (DNA Data Bank of Japan,
European Molecular Biology Laboratory e GenBank Data Base) através dos
programas BLAST/N (Altschul et al 1990), para busca por similaridade entre as
seqüências obtidas e as previamente depositadas para miosina V e BLAST/X, para a
dedução da seqüência de aminoácidos e subseqüente busca por similaridade, todos
do National Center for Biotechnology Information (NCBI), website
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast. Depois de selecionadas, as seqüências foram
alinhadas utilizando o programa ClustalW, online através do website
http://www2.ebi.ac.uk/clustalw e processadas por meio do programa BioEdit (Hall,
1999). Para a análise da distância genética e construção de filogenias, os dados
obtidos foram trabalhados através do programa MEGA versão 2.1 (Kumar et al,
2001).
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
32
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados e a discussão dos dados obtidos neste estudo
encontram-se apresentados na forma de capítulos, referentes a trabalhos que serão
submetidos à publicação em revistas científicas. Embora as citações presentes em
cada um destes trabalhos não tenham sido listadas nos mesmos, estas se
encontram no item Referências Bibliográficas.
4.1. Capítulo I: Brain distribution of myosin Va in rainbow trout
Oncorhynchus mykiss.
4.2. Capítulo II: Analysis of the expression and cDNA sequence of
myosin V in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).
4.3. Discussão geral
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
33
4.1. Capítulo I: Brain distribution of myosin Va in rainbow trout
Oncorhynchus mykiss
Abstract
This study present data on myosin Va localization in the central nervous
system of rainbow trout. We demonstrate, via immunoblots and
immunocytochemistry, the expression of myosin Va in several neuronal populations
of forebrain, midbrain, hindbrain, and spinal cord. The populations that express
myosin Va in trout constitute a very diverse group that do not seem to have many
specific similarities as neurotransmitters used, cellular size or length of their
processes. The intensity of the immunoreactivity and the number of cells
immunorreactive differ from region to region. Although there is a broad distribution of
myosin Va, it is not present in all neuronal populations. This result is in agreement
with a previous report, which indicates that myosin Va is approximately as abundant
as conventional myosin II and kinesin, and it is broadly involved into neuronal motility
events such as axoplasmatic transport. Furthermore, this distribution pattern is in
accordance with what was evidenced in rats and mice and it point out a phylogenetic
maintenance of the myosin Va main functions.
Running title: Brain distribution of myosin Va in trout.
Key words: myosin V, cytoskeleton, rainbow trout, immunocitochemistry.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
34
Introduction
Class V myosins are one of the most ancient groups of the myosin superfamily.
In vertebrates such as rats, mice, and humans, the class V myosins include three
isoforms, Va, Vb, and Vc, and nowadays they are attracting great interest due to
evidence which supports their role in the intracellular transport and location of
organelles (Langford and Molyneaux, 1998; Provance and Mercer, 1999; Reck-
Peterson et al, 2000; Berg et al, 2001). Furthermore, the class V myosin presents a
broad phylogenetic distribution and it is expressed from yeasts to humans (Reck-
Peterson et al, 2000). Specifically the myosin Va has been purified and biochemically
characterized (Espindola et al, 1992; Espreafico et al, 1992; Cheney et al, 1993;
Nascimento et al, 1996, Tauhata et al, 2001), and current evidence suggests that
myosin Va has an important role in neuronal process, including organelle and vesicle
transport within axons, neurotransmitter-vesicle cycling, and neurite outgrowth
(Prekeris and Terrain, 1997; Evans et al, 1998; Tabb et al, 1998; Costa et al, 1999;
Ohyama et al, 2001; Casaletti et al, 2003).
The essential function of myosin Va is evidenced by analysis of the dilute lethal
and opisthotonus mutant in mice and rats, which is null for myosin Va (Futaki et al,
2000). This mutation not only affects coat-color in these animals, but it also makes
homozygous pups manifest neurological defects such as convulsions and posture as
well as balance alterations, and die within 3 weeks after birth. Similar traits are
observed in humans with Griscelli’s syndrome (Griscelli et al, 1978), which presents
partial albinism, neurological alterations and immunodeficiency. One of the known
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
35
causes of this syndrome is a mutation in the gene that codifies the human myosin Va,
present in the 15q21 chromosome (Pastural et al, 1997).
Several immunohistochemical studies described the broad distribution of
myosin Va in many brain regions. (Mercer et al, 1991; Espindola et al, 1992;
Espreafico et al, 1992) and, recently, Tilelli et al (2003) have described a
comprehensive map of myosin Va distribution in the central nervous system of the
adult rat by immunohistochemistry. These studies contribute to the basic
understanding of its role in the nervous system function and plasticity.
For the first time in fish, the present study reveals the presence of one member
of myosin V class expressed in brain (myosin Va) and its localization in different
portions of the central nervous system of rainbow trout, which evidences that in fish
the myosin Va is broadly expressed suggesting its involvement into neuronal
processes.
Material and Methods
Protein quantification, electrophoresis and immunoblots
Adult rainbow trout were sacrificed with an overdose of benzocaine and their
brains were dissected, immediately frozen in liquid nitrogen and stored at –20
o
C until
prepared for SDS-PAGE. Samples were homogenized in 40 mM Tris-HCl buffer, pH
6,8, containing 1% SDS, 1mM benzamidine, 1mM aprotinin, 2mM DTT, 5mM EDTA,
5mM EGTA, 1 mM pefabloc, and 5mM ATP. The protein content was estimated by
the Bradford method (Bradford, 1976), by using bovine serum albumin as a standard.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
36
Samples containing approximately 20 µg of protein were submitted to SDS-PAGE 7%
(Laemmli and Favre, 1973) and stained with Cromassie Brilliant Blue R. For Western
blots, approximately 60 µg protein were loaded on the gels and, following SDS-
PAGE, blotted to nitrocellulose membranes (Towbin et al, 1979). The membranes
were probed with primary antibody rabbit IgG anti chick myosin Va tail (1:100),
followed by incubation with secondary antibody peroxidase-conjugated goat IgG anti
rabbit IgG (1:1000), following standard procedures for peroxidase methods. The
primary antibody recognizes an epitope located between amino acids 1117-1435 and
it was characterized by Espindola et al (1992) and Espreafico et al (1992) in extracts
of chicken brain.
Immunocytochemistry
Rainbow trout were anesthetized with benzocaine and the brains were fixed in
Bouin’s fluid for 8 hours at room temperature. Then they were washed in several
changes of phosphate buffer (100 mM sodium phosphate, 400 mM NaCl, pH 7.4),
dehydrated in a graded series of ethanol, diaphanized in xylene, embedded in
paraffin and semi serially and transversely sectioned (10 µm thickness). The sections
were submitted to microwave retrieval of antigenic sites (Martins et al, 1999), blocked
for nonspecific binding sites in 100 mM Tris-glycine buffer, pH 7,4 for 1 hour at room
temperature and in phosphate-blocking buffer (100 mM sodium phosphate, pH 7.4,
with 0,3% Triton X-100, 400 mM NaCl, 5% bovine serum albumin, and 10% normal
goat serum) for 4 hours at room temperature. Subsequently, the sections were
incubated overnight at 4
o
C with primary antibody anti myosin Va (1:25) diluted in
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
37
phosphate-blocking buffer, washed for 1 hour in phosphate buffer (100 mM sodium
phosphate, pH 7.4, with 0,3% Triton X-100), incubated for 2 hours at room
temperature in secondary antibody (1:1000) goat IgG anti rabbit IgG biotinilated, and
processed following standard procedures for avidin-biotin-peroxidase methods
(Vectarstain). Controls were performed by omission of the primary antibody. For
topographic purposes, hematoxylin-eosin was employed to stain alternate series of
the adult brains used in this study. Micrograph images were obtained under a Zeiss
Axiophot microscope. The images were digitalized, converted to a gray scale, and
adjusted for brightness and contrast by using Corel Photo-Paint 8 program.
Photomontage and lettering were done by using Power Point program.
Results
Expression of myosin Va in homogenates of brains
Western blots of homogenates of chick (positive control) and trout brain were
probed with anti myosin Va. Both samples showed that this antibody recognized a
single band with 190 kDa which corresponded to the well-defined position of the
myosin Va heavy chain (Figure 1). This result evidenced the presence of myosin V,
similar to the myosin Va of chicken or rat in trout brain.
Immunolocalization of myosin Va in brain sections
The myosin Va immunoreactive (MVa-ir) populations were broadly distributed
in the adult trout brain, which was the basal plate of mesencephalon and
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
38
rombencephalon, the regions with a major number of immunoreactive populations.
The controls show total absence of reaction product (not shown).
Forebrain. In the trout telecephalon, faint Mva-ir cells were observed in areas
such as pars ventralis and lateralis, pars centralis and pars dorsalis (Figures 2 A, B).
In the diencephalon, Mva-ir was observed in the magnocellular pre optic nucleus, in
the neurons of the parvocellular superficial pretectum, suprachiasmatic nucleus,
habenular nucleus and ventral thalamus (Figures 2 C, D).
Midbrain. Several populations of cells were Mva-ir in mesencephalic portion.
Immunoreactivity. was observed in neurons of oculomotor nucleus, semicircular and
longitudinal torus, nucleus diffusus of the inferior hypothalamic lobe and in cells of
midbrain roof (periventricular stratum) (not shown) (Figures 2 H, I, J, K). In
mesencephalic rostral portions and in mesencephalic-diencephalic transition Mva-ir
was observed in large neurons of fasciculus longitudinalis medialis, hypothalamic
magnocellular nuclei (not shown), magnocellular pretectal superficial nuclei, in
preglomerular complex cells and in neurons of mesencephalic nucleus of trigeminal
nerve (not shown) (Figures 2 E, F, G).
Hindbrain. In the rhombencephalon at VI cranial nerve level, Mva-ir was
observed in cells of the abducen nucleus pars rostralis (Fig. 2Q), medial octavolateral
nucleus, magnocellular octaval nucleus (Fig. 2 R) and in neurons of the cerebellar
crest (Figure 2 S). At V cranial nerve level, Mva-ir cells were observed in the
trigeminal nerve nucleus and in the superior portion of the reticular formation (Figures
2 L, M). Other regions such as the facial nerve motor nucleus (Fig. 2 O), the abducen
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
39
nucleus pars caudalis (Fig. 2 P), the vagus nerve motor nucleus (Fig. 2 T), the
glossopharingeal nerve motor nucleus (Fig. 2 V) show immunoreactivity for Myosin
Va. In the cerebellar region, Mva-ir cells and neurites were observed in the granular
and ganglionic layer (Figure 2 N).
Spinal cord. In the dorsal horn, Mva-ir cells were observed in the fusiform and
intermediate-sized neurons (Fig. 2 W) and in the Cajal commissural nucleus cells at
obex region level (Fig. 2 Y). In the ventral horn, the motoneurons showed myosin Va
immunoreactivity (Fig. 2 Z).
Discussion
This work reports the tissue distribution of myosin Va in the central nervous
system of rainbow trout. The presence of myosin V class members has been
evidenced in several organisms through the phylogenetic scale (Reck-Peterson et al,
2000). However, this is the first evidence in fish.
Although there is evidence that supports the notion that myosins V are
molecular motors and have a specific role in organelle transport and location, there is
still a great deal of uncertainty about the exact functions in cellular processes.
Specifically, myosin Va is highly expressed in melanocytes and neurons and is clearly
associated with the transport of melanosomes (Wu et al, 1998; Rogers et al, 1999)
and membrane receptors in neurons (Takagishi et al, 1996). Furthermore, its
association with the synaptic vesicles and associated proteins (Prekeris and Terrian,
1997; Costa et al, 1999; Ohyama et al, 2001), localization in brain nerve terminals
(Mani et al, 1994; Prekeris and Terrian, 1997), and its involvement with organelle
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
40
movement in axons (Evans et al, 1998; Tab et al, 1998) indicated that myosin Va has
a specific role in organelle transport during synaptic function.
The immunohistochemical studies show that myosin Va is broadly distributed
in the vertebrate nervous system. In mice, intense labeling was reported in specific
cell types such as Purkinje cells of the cerebellum (Espindola et al, 1992; Espreafico
et al, 1992), in cells of the retina (Sclamp and Williams, 1996) and a subset of
neurons in the myenteric ganglia (Drengk et al, 2000). Tilelli et al (2003) described a
comprehensive map of myosin Va distribution in the central nervous system of the rat
evidencing several neuronal cells and nuclei immunoreactives. Our results show that
myosin Va is amply expressed throughout the central nervous system of rainbow
trout, which indicates a general role in neuron function. The populations that express
myosin Va in trout constitute a very diverse group that do not seem to have many
specific similarities as neurotransmitters used, cellular size or length of their
processes. This fact together with its broad distribution is indicative of myosin Va
participation in basic neuronal activities. It is not present in all neuronal populations or
similarly distributed in neurons. Thus, alternative mechanisms should be operating in
different cells. This distribution pattern is in accordance with what was evidenced in
rats and mice, and it point out a phylogenetic maintenance of the myosin Va main
functions such as axoplasmatic transport. Furthermore, this result is in agreement
with a previous report which indicates that myosin Va is approximately as abundant
as conventional myosin II and kinesin (Cheney et al., 1993).
Although there is a broad distribution of the myosin Va in the trout brain, the
intensity of immunoreactivity and the number of cells immunorreactive differ from
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
41
region to region. For example, all nuclei of cranial nerves show strong immunostaing
for myosin Va in detriment to the weak immunostaing of cells in the diencephalic and
telencephalic regions. This same pattern is observed as the number of reactive cells.
In conclusion, for the first time this work described the presence of myosin V
class in fish and it supports the idea of the phylogenetically conserved functions of the
brain myosin V as well as it contributes to the basic understanding of its role in brain
function particularly related to its nature as molecular motor.
Acknowledgements
We thank Dr. Roy Edward Larson for his generous myosin Va antibody gift.
This work was supported by grants from FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa
do Estado de São Paulo).
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
42
Figure 1. Western blot of the brain homogeneates of chicken (1) and trout (2) probed
with policlonal antibody anti tail domain of myosin V showing a single band (arrow) of
the 190 kDa (in chicken and trout) coincident with the molecular weight of myosin Va
of higher vertebrates. Molecular mass markers are indicated on the left.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
43
Dc
Dd
nflm
psm
pg
hab
Pm
Thv
psp
nIII
ts
dif
A
B
C
D
E F
G
H
I
J
Figure 2
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
44
tl
nVm
rets
ggl
gran
nVIIm
nVIc
nVIr
mg
crcb
nXm
K
L
M
N
O
P
Q
R
S T
Figure 2
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
45
nc
reti
nIX
reti
cn
cmsp
U
V
X
W
Y
Z
Figure 2
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
46
Figure 2. Myosin V immunoreactivity in rainbow trout brain (A-Z). A-B,
Transversal section of the telencephalon. A, Detail of the pars centralis (Dc). B, Detail
of the pars dorsalis (Dd). C-D, Transversal section of the diencephalon. C, Detail of
the magnocelular pre optic nucleus (Pm), habenular nucleus (hab) and ventral
thalamus (Thv). D, Detail of the parvocellular superficial pretectal nucleus (psp). E-G,
Transversal section of the mesencephalon rostralmost portion. E, Detail of the
fasciculus longitudinalis medialis nucleus (nflm). F, Detail of the magnocellular
pretectal superficial nucleus (psm). G, Detail of the preglomerular complex (pg). H-K,
Transversal section of the mesencephalon caudalmost portion. H, Detail of the
oculomotor nerve nucleus (nIII), I, Detail of the semicircular torus (ts). J, Detail of
nucleus diffusus neurons of the inferior hypothalamic lobe (dif). K, Detail of the
longitudinal torus (tl). L-N, Transversal section of the rombencephalon rostralmost
portion, L, Detail of the trigeminal nerve nucleus (nVm). M, Detail of the neurons in
the superior portion of reticular formation (rets). N, Transversal section of the
cerebellum showing the molecular granular (gran) and ganglionar (ggl) layers, 100x.
O-P, Transversal section of the rombencephalon at VII cranial nerve level. O, Detail
of the facial nerve motor nucleus (nVIIm). P, Detail of the abducen nerve nucleus pars
caudalis (nVIc). Q-X, Transversal section of the rostral portion of the
rombencephalon. Q, Detail of the abducen nerve nucleus pars rostralis (nVIr). R,
Magnocellular octaval nucleus (mg). S, Detail of the cerebellar crest (crcb). T, Vagal
motor nucleus neurons (nXm). U, Reticular formation neurons (reti). V, Detail of the
glossopharingeal nerve motor nucleus (nIXm). X, Detail of the reticular formation (reti)
at level nerve IX motor nucleus, 160x. W-Z, Transversal section of the spinal cord. W,
Detail of the spinal dorsal horn neurons (cnd).Y, Detail of the Cajal commissural
nucleus (ncC). Z, The spinal ventral horn neurons (cmsp). Scale bars: (C) = 200 µm;
(A, I, J, K,) = 100 µm; (B, D, F, G, H, N, T, U, V, X, W) = 50 µm; (E, L, M, O, P, Q, R,
S, Y, Z) = 25 µm.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
47
4.2. Capítulo II: Analysis of the expression and cDNA sequence of myosin
V in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).
Abstract
Myosins are a diverse family of actin-based mechanoenzymes that appeared
early in eukaryotic evolution. The class V is the best characterized class of
unconventional myosins that participate in essential cellular processes as a molecular
motor. In vertebrates, this class includes three members, Va, Vb and Vc, that are
generating a lot of interest due to evidences that support their roles in the intracellular
transport and localization of organelles. Despite of its broad distribution in the
different taxa, the expression and tissue distribution of the myosins V in ancient
vertebrates has been little investigated. This work had as objective to verify the
expression and to characterize the mRNA that encodes the myosin V in the rainbow
trout Oncorhynchus mykiss looking for contributions to the basic knowledge of the
functions and evolutionary behavior of this protein class among fishes.
Running title: Analysis of class V myosins in rainbow trout.
Key words: Myosin V, nucleotide sequence, amino acid sequence, Oncorhynchus
mykiss, evolution, distribution.
Abbreviations: aa (amino acid), bp (base pair), RT-PCR (Reverse Transcriptase –
Polymerase Chain Reaction).
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
48
Introduction
Myosins constitute a large superfamily of molecular motors that appeared early
in eukaryotic evolution (Sellers, 2000; Goodson and Dawson, 2006). They are
mechanoenzymes that bind to actin and hidrolyze ATP to produce mechanical force
and their members participate in activities as diverse as cytokinesis, muscle
contraction and organelle motility (Goodson and Spudich, 1993).
Myosins are typically composed of three functional subdomains: (1) the motor
domain wich interacts with actin and binds ATP, (2) the neck domain wich binds light
chains or calmodulin and (3) the tail domain involved in protein-protein interactions.
Although most of the myosins have the same general structure, the nonmotor regions
vary enormously. This structural diversity reflects functional diversity (Kieke and Titus,
2003). Myosin heavy chains have been categorized into 18 classes of proteins
structurally distincts, mostly based on comparisons and phylognetics analysis of the
conserved motor domain. However, current studies about the myosin gene family
revealed 37 myosin types with different combinations of protein domains and
scattered taxonomic distribution (Richards and Cavalier-Smith, 2005).
Class V myosin are one of the most ancient and extensively studied group of
the myosin superfamily and the wide range of species in wich it has been identified
suggests that myosin V is a fundamental component of organelle transport in all
higher eukaryotes (Provance and Mercer, 1999). It was initially characterized as an
unusual calmodulin binding protein from brain with a number of myosin-like
biochemical properties (Larson et al, 1988, 1990; Espindola et al, 1992).
Subsequently, myosin V heavy chain genes were cloned from mouse, yeast and
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
49
chicken, thus defining the fifth class of actin-based motors (Mercer et al, 1991;
Johnston et al, 1991; Espreafico et al, 1992; Sanders, 1992; Cheney and Mooseker,
1992). In vertebrates the class V myosins include three members, Va, Vb and Vc.
Myosin Va has been the most investigated and is expressed at high levels essentially
in brain and melanocytes. The second member, myosin Vb, has been cloned from rat
(Zhao et al, 1996), but has received relatively little attention. The third member of the
myosin V family, myosin Vc, was discovery and cloned recently and is relatively
abundant in many secretory and glandular tissues, where is expressed predominantly
in epithelial cells (Rodriguez and Cheney, 2002). The presence of the three members
of the class V myosin in vetebrates makes to appear a lot of questions about their
relative roles into the cell. Furthermore, the expression and tissue distribution of these
myosins in ancient vertebrates has been little investigated. In this way, myosin V-
encoding cDNAs were investigated in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss looking
for contributions to the basic knowledge of the functions and evolutionary behavior of
this protein class among fishes.
Material and Methods
Adult rainbow trouts animals were sacrificed with an overdose of benzocaine
following by spinal transection (Protocol 01204 – Committee of Ethical in the Animal
Experimentation – Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, Brazil) and their
hypophysis, brain, aorta, heart, gill, muscle, stomach, liver, kidney, intestine, spleen,
and ovary were dissected and frozen in liquid nitrogen for subsequent RNA
extraction.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
50
Total RNA samples were obtained using TRIzol reagent (Invitrogen), following
the manufacturer’s instructions. The RNA was quantified by spectrophotometry
(Biophotometer Eppendorf) at 260nm and 280nm, using the RNA correction factor.
First-strand cDNA synthesis reaction was performed with the commercial kit
“SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR” (Invitrogen Life
Technologies) using random hexamer primers.
The cDNA amplification was performed using the primer sets BM5-F and BM5-
R1 for the head domain of myosin V, MYCR1 and BM5-R for the neck domain and
Tail-5a-F1 and Tail-5a-R1, Tail-5b-F1 and Tail-5b-R1 and Tail-5c-F1 and Tail-5c-R1
for the tail domains of myosin Va, Vb and Vc, respectively. The primer sets employed
were designed from published cDNA sequence of the myosin V of chicken, genomic
nucleotidic sequence of zebrafish (GenBank, clone CH211-286c4-g25) and cDNA
sequences of rat myosin V (GenBank access numbers AB035736, U60416 and
XM_236411). Primer sequences and specific conditions of the PCR experiments are
described in the Table 1.
PCR products were visualized by 1% agarose gel electrophoresis and cloned
in the plasmid pCR2.1 (kit TA Cloning – Invitrogen) and pGEM-T (Promega) and used
to transform competent cells of the E. coli DH5α strain (Invitrogen Life Technologies).
The recombinant plasmids containing genes of interest were purified with the Kit
“Wizard Plus Minipreps DNA Purification System” (Promega) and were submitted to
nucleotide sequencing on an ABI 377 Automated DNA Sequencer (Applied
Biosystems).
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
51
The obtained sequences of the myosin V head and neck were subjected to
CAP3 (Contig Assembling Program) software available at (http://pbil.univ-
lyon1.fr/cap3.php) to obtain a contiguous and unique sequence for this region. It was
not possible to connect the obtained sequences of the tail portion of the myosin V
with the head-neck segment. The obtained sequences were submitted to BLAST/N
and the amino acid (aa) sequences were predicted using Gene Runner and subjected
to BLAST/X searches (Altschul et al, 1990) at the National Center for Biotechnology
Information (NCBI) website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast. Furthermore, a search
for similarity to the myosin V was made between the sequence obtained and those
previously deposited in DNA Data Bank of Japan (DDBJ), European Molecular
Biology Laboratory (EMBL) and GenBank Data Base (GB). The selected sequences
were aligned using the program ClustalX (Thompson et al, 1997) and molecular
evolutionary analyses were conducted through of the program MEGA version 2.1
(Kumar et al., 2001), using the predicted aa sequences of the myosin head and neck
domains of the rainbow trout and GenBank database aa sequences of the myosin V
of other organisms. Species and accession numbers of the analyzed sequences were
described in the Table 2.
Results and Discussion
RT-PCR amplification of O. mykiss cDNAs from total RNA extracted from brain
and other tissues using primer sets allowed the amplification of a 1.800 bp band for
the head domain of myosin Va, 850 bp for the neck domain of myosin Va, and 650 bp
for myosin Va, 400 bp for myosin Vb and 500 bp for myosin Vc of the tail domains.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
52
The RT-PCR DNA fragments were cloned and sequenced. The nucleotide
sequence analysis achieved throughout searches at DDJB/EMBL/GenBank
databases by means of Blast/N program indicated that the isolated cDNA nucleotide
sequences of rainbow trout were very similar to sequences of myosin V of other
vertebrates. The nucleotide sequences of head and neck domains of myosin V were
edited with the CAP3 software and by hands and resulted in a total fragment with
2.545 pb. The deduced amino acid sequence of O. mykiss myosin V head and neck
corresponds to the aa residues 68 to 910 with high similarity to myosin Va (Figure 1).
The comparative analysis of O. mykiss myosin segment to the aa sequences of other
organisms obtained from GenBank evidenced a high conservation degree (Figure 2).
All myosin share a core of conserved residues in their motor domains, many of which
are known to participate in actin binding (for review, see Cope et al, 1996). The ATP-
binding site of the myosin Va was highly conserved and no variation related to
nucleotide or aa sequences was observed among several non-related organisms
(Figure 2). This characteristic is probably related to the fundamental role of this region
in the conversion of energy in mechanical force required by the head domain for the
movement of the protein (Provance and Mercer, 1999). The actin-binding site was
also shown well conserved with only two amino acid substitutions in the residues 644
and 645 (A/H or Q an M/L). In the first substitution, a hydrophobic amino acid
(alanine) was substituted by other (histidine ou glutamine) more soluble in water in
the sequences of several organisms (Nelson and Cox, 2002). The second alteration
occurs among aa with same properties, what should not carry damages in the protein
structure because both are hydrophobic and important in the stabilization of the
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
53
protein structure by means of the promotion of hydrophobic interactions inside it
(Nelson and Cox, 2002).
Among the analyzed sequences, the neck domain showed to be a more
variable region, with several substitutions of amino acid residues. However, most
variable residues are neutral or basic. Even with such variation it is possible
recognize six imperfect aa repetitions that constitute the called IQ-motifs (Mooseker
and Cheney, 1995; Wolenski, 1995; Larson, 1996), feature of class V myosins,
represented by the consensus sequence IQXXXRGXXXR, that are calmodulin and
others light chains binding sites (for review see Rhoads and Friedberg, 1997).
Comparative analysis of the amino acid frequency of the head and neck
domains of myosins V of several organisms and the aa composition of rainbow trout
myosin V can be seen in Table 3 and Figure 3, evidencing a high frequency of neutral
and basic aa like Leucine and Lysine.
Genetic distance analyzes showed that the sequences of O. mykiss myosin V
are close related to the myosins Va (Table 4 A) and quite distant from the myosins Vb
and Vc of several organisms (Table 4 B and C). Among the analyzed sequences the
myosin V of trout had lower genetic distance values in relation to other fish species
when compared to other vertebrates. Such data can also be visualized in the
phylogenetic reconstruction based in the aa sequences of several vertebrates
including rainbow trout (Figure 4). Distant non-related species such as Nematodes,
Arthropods and Echinoderms were included in the analysis as out-groups. It can be
observe that the similarity degree among the sequences in the different animal
groups follow the phylogenetic distance among them. The event that resulted in the
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
54
formation of the paralogous Va, Vb and Vc copies of myosins occurred in a common
ancestral before the separation of the vertebrates in the different classes. This
evolutionary event generated two copies of myosin V that diverged, one of them
originating the myosins Vc in the several animal groups and the other, that follow one
more duplication event, generating the Va and Vb isoforms which were distributed in
different vertebrate classes. It is interesting to notice that, even inside of vertebrates
clade, all the myosin V members suffered evolutionary events that lead to the
divergence of a specific class among the different groups. All this evolutionary events
of gene duplication and divergence are supported in the analyses by high values of
bootstraps (97%).
The nucleotide sequences regarding portions of myosins Va, Vb and Vc tail
domain were submitted to searches by similarity in GenBank databases through
Blast/N program. The results showed a high similarity mainly among the myosin Va
sequences, with smaller values for myosins Vb and Vc (Table 5A, B and C).
Myosin Va tail was amplified in hypophysis and a very discreet band was also
seen in brain (Figure 5a), what is in agreement with the data described in the
literature which indicates that isoform is expressed mainly in nervous tissue
(Rodriguez and Cheney, 2002; Tilleli et al, 2003). Vb and Vc isoforms were found in
practically all tissues analyzed (Figures 5b and 5c), being Vc more widely distributed,
with a high expression level in epithelial tissues, corroborating previous observation in
mammals (Rodriguez and Cheney, 2002).
The comparative analysis of the head-neck segment of myosin Va among
different animal species clearly demonstrated that the evolution of myosins has
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
55
accompanied the divergence of the main vertebrate groups. The obtained data also
evidence the presence of more than one member of the class V myosins in a same
tissue, what forward us to the question about the functions of those different isoforms:
Would they have different or complement in the same cell?
Acknowledgements
This work was supported by grants from FAPESP (Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo) and CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior).
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
56
Tables
Table 1: Description of the specific conditions of the PCR experiments and nucleotide
sequences of the primers used to amplify functional domains of myosin V.
Functional
Domain
Primer Sets PCR Conditions
Head
BM5-F (5’-CTGGTGGGTGAGAATGACCT-3’)
BM5-R1 (5’-CTTGATGCAGCGCACATAGT-3’)
94°C - 1 minute
94°C - 30 seconds
55°C - 30 seconds 35x
72°C - 3 minutes
68°C - 10 minutes
Neck
MyRC1 (5’-AAGACTGTTGGCTGCCAGTT-3’)
BM5-R (5’-GCAGCTGCATGATCTTGTTT-3’)
94°C - 2 minutes
95°C - 30 seconds
57°C - 30 seconds 35x
68°C - 2 minutes
68°C - 3 minutes
Tail Va, Vb e Vc
Tail-5a-F1 (5’-TAGAAGTGGGGCAGATGGAG-3’)
Tail-5a-R1 (5’-ACTGGAGGTTCGCTTTCTGA-3’)
Tail-5b-F1 (5’-TGAGAGTATCCAGGGGCTGT-3’)
Tail-5b-R1 (5’-AGCATCCTCCTGGGTCTTCT-3’)
Tail-5c-F1 (5’-CCAAGCAACTTTTGGAGAGC-3’)
Tail-5c-R1 (5’-CTGCTTGCTTCTTTGGGAAC-3’)
94°C - 2 minutes
95°C - 1 minute
58°C - 1 minute 35x
72°C - 1 minute
68°C - 10 minutes
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
57
Table 2: Species and accession numbers of the GenBank database amino acid
sequences of the myosin V of other organisms used in this work.
Abreviation Specie Accession number
BTAURUSVA Bos taurus XP_615219
BTAURUSVC Bos taurus XP_611694
BTAURUSTAILVA Bos taurus XM_615219
BTAURUSTAILVC Bos taurus XM_611694
CELEGANSV Caenorhabditis elegans NP_505433
CFAMILIARISVA Canis familiaris XP_535487
CFAMILIARISVB Canis familiaris XP_537345
CFAMILIARISVC Canis familiaris XP_544680
CFAMILIARISTAILVA Canis familiaris XM_535487
CFAMILIARISTAILVB Canis familiaris XM_537345
CFAMILIARISTAILVC Canis familiaris XM_544680
DRERIOVA Danio rerio CAK 04124
DRERIOVB Danio rerio XP_695789
DRERIOVC Danio rerio XP_691143
DMELANOGASTERV Drosophila melanogaster AAC 99496
GGALLUSVA Gallus gallus CAA 77782
HSAPIENSVA Homo sapiens NP_000250
HSAPIENSVB Homo sapiens XP_944193
HSAPIENSVC Homo sapiens EAW 77446
HSAPIENSTAILVA Homo sapiens NM_000259
HSAPIENSTAILVB Homo sapiens XM_939100
HSAPIENSTAILVC Homo sapiens NM_018728
MMULATTAVA Macaca mulatta XP_001084476
MMULATTAVB Macaca mulatta XP_001090434
MMULATTATAILVA Macaca mulatta XM_00108476
MMULATTATAILVB Macaca mulatta XM_001090668
MMUSCULUSVA Mus musculus NP_034994
MMUSCULUSVB Mus musculus NP_963894
MMUSCULUSVC Mus musculus XP_988841
MMUSCULUSTAILVA Mus musculus NM_010864
MMUSCULUSTAILVB Mus musculus NM_201600
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
58
MMUSCULUSTAILVC Mus musculus XM_983747
PTROGLODYTESVC Pan troglodytes XP_510411
PTROGLODYTESTAILVA Pan troglodytes XM_001170332
PTROGLODYTESTAILVB Pan troglodytes XR_024243
PTROGLODYTESTAILVC Pan troglodytes XM_510411
RNORVEGICUSVA Rattus norvegicus NP_071514
RNORVEGICUSVB Rattus norvegicus NP_058779
RNORVEGICUSVC Rattus norvegicus XP_236411
RNORVEGICUSTAILVA Rattus norvegicus NM_022178
RNORVEGICUSTAILVB Rattus norvegicus NM_017083
RNORVEGICUSTAILVC Rattus norvegicus XM_001057675
SPURPURATUS Strongylocentrotus purpuratus NP_999655
SSCROFAVA Sus scrofa BAE 03307
SSCROFATAILVA Sus scrofa AB 209957
TNIGROVIRIDISVA Tetraodon nigroviridis CAG 00830
TNIGROVIRIDISVB Tetraodon nigroviridis CAG 01035
XLAEVISVA Xenopus laevis AAH 45050
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
59
Table 3: Comparison between the frequency of amino acids in the deduced
sequences of the head and neck domains of rainbow trout myosin V and the amino
acid sequences of other organisms obtained from GenBank.
Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro
Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Total
OMYKISS1 7.69 2.25 4.73 5.68 4.50 4.38 2.72 5.92 8.88 8.99 2.60 4.85 3.20
5.56 6.39 5.21 4.85 6.51 0.95 4.14 845
OMYKISS8 7.69 2.49 4.38 6.15 4.50 4.38 2.60 6.15 8.28 9.11 2.60 4.85 2.72
6.04 6.51 5.44 4.97 6.27 0.83 4.02 845
OMYKISS2 7.93 2.25 4.38 6.63 4.26 4.85 2.72 5.80 7.81 9.11 2.49 4.85 3.55
5.92 6.27 5.33 4.73 6.39 0.71 4.02 845
OMYKISS5 7.35 2.37 4.74 6.52 4.63 4.86 3.08 5.58 8.07 8.90 2.25 4.86 4.03
5.69 5.81 5.34 4.74 6.29 0.83 4.03 843
DRERIOVA 8.73 2.24 4.72 5.78 4.60 4.48 2.83 6.96 9.43 8.84 2.83 4.48 2.83
5.19 5.90 4.95 4.60 5.07 0.94 4.60 848
BTAURUSVA 7.88 2.34 4.19 6.53 5.05 4.56 2.96 7.27 8.50 8.25 2.59 4.06 2.71
4.93 7.27 5.30 5.17 4.93 1.11 4.43 812
SSCROFAVA 7.66 2.24 4.24 6.24 4.83 4.71 2.71 7.07 8.48 8.60 2.83 4.36 2.94
4.71 7.30 5.18 5.30 4.59 1.06 4.95 849
CFAMILIARISVA 7.77 2.12 4.12 6.48 4.83 4.59 2.71 7.07 8.72 8.60 2.83 4.00 2.94
4.71 7.30 5.30 5.18 4.71 1.06 4.95 849
HSAPIENSVA 8.01 2.36 4.00 6.60 4.95 4.71 2.71 7.07 8.60 8.60 2.83 4.24 2.94
4.71 7.42 4.83 5.06 4.71 0.94 4.71 849
MMULLATAVA 7.72 2.41 4.34 6.63 5.07 4.83 2.77 7.24 8.32 8.69 2.65 4.22 3.02
4.83 7.12 4.95 4.83 4.95 0.97 4.46 829
MMUSCULUSVA 7.77 2.36 4.12 6.48 4.83 4.83 2.59 6.95 8.60 8.36 2.83 3.89 2.94
4.71 7.42 4.83 5.42 5.06 0.94 5.06 849
RNORVEGICUSVA 7.89 2.36 4.00 6.48 4.83 4.95 2.59 7.07 8.60 8.60 2.83 3.89 2.94
4.83 7.30 4.83 5.18 4.95 0.94 4.95 849
GGALLUSVA 8.12 2.24 4.35 6.35 4.71 4.47 3.06 7.29 8.47 8.47 2.94 4.24 3.06
4.71 6.94 4.94 4.71 5.18 0.82 4.94 850
XLAEVISVA 7.43 2.29 4.95 7.43 5.14 5.14 2.86 7.62 6.86 8.95 2.67 5.52 3.05
4.19 4.19 5.90 4.57 5.52 0.76 4.95 525
TNIGROVIRIDISVA 6.37 2.43 4.52 8.00 4.87 5.33 2.55 5.79 6.03 11.70 2.43 5.21 4.06
5.21 4.87 6.95 3.94 5.45 1.04 3.24 863
HSAPIENSVB 8.74 1.53 4.72 6.26 5.08 4.60 3.90 6.38 6.97 8.38 2.24 3.66 2.72
5.55 7.32 5.79 4.96 6.14 0.83 4.25 847
MMULLATAVB 8.74 1.53 4.72 6.49 5.08 4.49 3.90 6.61 6.85 8.38 2.13 3.66 2.60
5.55 7.56 6.02 5.08 5.67 0.83 4.13 847
CFAMILIARISVB 8.61 1.89 4.60 6.60 5.07 4.72 3.54 7.08 6.72 8.84 2.00 3.66 2.48
5.66 7.43 5.90 4.72 5.42 0.94 4.13 848
MMUSCULUSVB 8.37 1.77 4.83 6.60 5.31 4.01 3.42 6.84 7.19 8.61 2.00 4.60 2.48
5.07 7.43 6.37 4.83 5.31 0.83 4.13 848
RNORVEGICUSVB 8.60 1.88 4.59 6.71 4.95 4.12 3.42 6.83 7.07 8.60 1.88 4.24 2.71
5.42 7.30 6.01 5.30 5.30 0.82 4.24 849
DRERIOVB 6.92 1.96 4.38 6.92 5.31 4.61 3.69 7.38 7.38 8.30 2.08 4.61 2.31
5.31 7.27 5.65 4.61 6.11 0.81 4.38 867
TNIGROVIRIDISVB 7.88 1.76 4.71 7.53 4.47 4.12 3.18 6.35 8.00 8.71 2.82 4.82 1.88
6.24 6.82 6.35 4.24 5.29 0.82 4.00 850
CFAMILIARISVC 7.19 1.46 3.65 6.82 5.72 4.63 2.19 6.82 6.94 9.14 2.07 5.36 2.68
5.85 6.82 5.72 5.36 6.21 0.85 4.51 821
BTAURUSVC 7.47 1.42 3.80 6.88 5.58 4.63 2.49 6.64 6.88 9.73 2.25 5.34 2.61
5.46 6.52 5.93 4.74 6.29 0.83 4.51 843
HSAPIENSVC 7.19 1.46 3.65 6.82 5.85 4.51 2.56 6.58 6.70 8.77 2.80 5.24 2.56
5.97 6.70 6.33 4.75 6.33 0.85 4.38 821
PTROGLODYTESVC 7.31 1.46 3.65 6.82 5.85 4.51 2.56 6.58 6.70 8.77 2.68 5.24 2.56
5.97 6.82 6.09 4.75 6.46 0.85 4.38 821
MMUSCULUSVC 7.31 1.46 3.90 6.46 5.72 4.26 2.68 6.70 6.58 9.26 2.31 5.36 2.31
6.21 6.82 5.97 5.24 6.21 0.85 4.38 821
RNORVEGICUSVC 7.55 1.46 3.78 6.58 5.85 4.38 2.80 6.58 6.70 9.38 2.07 5.24 2.31
6.21 6.70 5.72 5.24 6.46 0.85 4.14 821
DRERIOVC 7.58 1.71 3.91 6.36 5.13 4.89 2.57 6.72 7.09 9.41 2.32 4.65 2.81
5.50 7.70 5.13 4.40 6.60 1.10 4.40 818
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
60
CELEGANSV 8.45 1.64 4.46 6.81 4.81 5.63 1.76 6.46 6.81 8.92 1.76 3.64 2.58
4.69 8.57 7.39 3.87 7.16 1.06 3.52 852
DMELANOGASTERV 7.59 1.87 4.09 6.31 5.26 5.61 2.45 7.01 6.43 8.88 2.45 4.32 2.10
5.72 8.18 6.31 4.21 6.19 0.82 4.21 856
SPURPURATUSV 6.91 2.03 4.17 7.51 5.01 4.41 2.50 6.20 7.51 8.34 2.86 3.81 3.10
5.01 7.99 5.24 5.36 6.20 1.19 4.65 839
Avg 7.77 1.97 4.29 6.63 5.05 4.66 2.85 6.69 7.58 8.88 2.46 4.52 2.80
5.36 6.97 5.66 4.84 5.75 0.91 4.36 831.8
Table 4: Pairwise distances (Amino Poisson correction) of deduced amino acid
sequences of myosin V from Oncorhynchus mykiss and sequences of myosin Va (A),
Vb (B) and Vc (C) of several organisms.
A
[ 1] OMYKISS8
[ 2] OMYKISS2
[ 3] OMYKISS1
[ 4] OMYKISS5
[ 5] DRERIOVA
[ 6] BTAURUSVA
[ 7] SSCROFAVA
[ 8] CFAMILIARISVA
[ 9] HSAPIENSVA
[10] MMULLATAVA
[11] MMUSCULUSVA
[12] RNORVEGICUSVA
[13] GGALLUSVA
[14] XLAEVISVA
[15] TNIGROVIRIDISVA
[16] CELEGANSV
[17] DMELANOGASTERV
[18] SPURPURATUSV
[ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
14 15 16 17 18 ]
[ 1]
[ 2] 0.011
[ 3] 0.011 0.013
[ 4] 0.008 0.011 0.011
[ 5] 0.088 0.090 0.088 0.088
[ 6] 0.180 0.182 0.180 0.180 0.128
[ 7] 0.185 0.187 0.185 0.182 0.126 0.030
[ 8] 0.177 0.180 0.177 0.177 0.123 0.026 0.019
[ 9] 0.177 0.180 0.177 0.177 0.128 0.030 0.021 0.019
[10] 0.180 0.182 0.180 0.180 0.133 0.032 0.026 0.023 0.008
[11] 0.172 0.175 0.172 0.172 0.123 0.032 0.021 0.019 0.023 0.026
[12] 0.177 0.180 0.177 0.177 0.126 0.034 0.023 0.021 0.026 0.028 0.004
[13] 0.162 0.165 0.162 0.162 0.114 0.065 0.059 0.059 0.065 0.068 0.052 0.056
[14] 0.180 0.182 0.177 0.180 0.140 0.111 0.109 0.102 0.111 0.111 0.100 0.102 0.093
[15] 0.131 0.133 0.131 0.131 0.126 0.165 0.165 0.160 0.167 0.165 0.162 0.162 0.162
0.162
[16] 0.660 0.652 0.656 0.664 0.640 0.624 0.636 0.628 0.620 0.624 0.624 0.628 0.632
0.632 0.620
[17] 0.523 0.526 0.523 0.523 0.519 0.474 0.481 0.484 0.488 0.484 0.478 0.474 0.484
0.502 0.512 0.676
[18] 0.451 0.451 0.447 0.451 0.441 0.444 0.434 0.438 0.434 0.434 0.434 0.434 0.425
0.428 0.415 0.624 0.555
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
61
Table 4: Continuation
B
[ 1] OMYKISS8
[ 2] OMYKISS2
[ 3] OMYKISS1
[ 4] OMYKISS5
[ 5] HSAPIENSVB
[ 6] MMULLATAVB
[ 7] CFAMILIARISVB
[ 8] MMUSCULUSVB
[ 9] RNORVEGICUSVB
[10] DRERIOVB
[11] TNIGROVIRIDISVB
[12] CELEGANSV
[13] DMELANOGASTERV
[14] SPURPURATUSV
[ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
14 ]
[ 1]
[ 2] 0.068
[ 3] 0.043 0.089
[ 4] 0.080 0.076 0.078
[ 5] 0.345 0.391 0.354 0.387
[ 6] 0.341 0.387 0.351 0.385 0.011
[ 7] 0.340 0.385 0.349 0.387 0.068 0.061
[ 8] 0.354 0.394 0.356 0.389 0.085 0.078 0.086
[ 9] 0.349 0.392 0.356 0.389 0.089 0.082 0.090 0.041
[10] 0.343 0.392 0.356 0.391 0.210 0.209 0.207 0.210 0.214
[11] 0.414 0.467 0.430 0.465 0.298 0.298 0.295 0.311 0.305 0.265
[12] 0.701 0.741 0.701 0.739 0.678 0.675 0.672 0.683 0.691 0.670 0.741
[13] 0.586 0.625 0.596 0.615 0.577 0.577 0.582 0.594 0.589 0.575 0.637 0.722
[14] 0.469 0.525 0.473 0.514 0.432 0.430 0.424 0.408 0.410 0.430 0.507 0.662 0.630
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
62
Table 4: Continuation
C
[ 1] OMYKISS8
[ 2] OMYKISS2
[ 3] OMYKISS1
[ 4] OMYKISS5
[ 5] CFAMILIARISVC
[ 6] BTAURUSVC
[ 7] HSAPIENSVC
[ 8] PTROGLODYTESVC
[ 9] MMUSCULUSVC
[10] RNORVEGICUSVC
[11] DRERIOVC
[12] CELEGANSV
[13] DMELANOGASTERV
[14] SPURPURATUSV
[ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
14 ]
[ 1]
[ 2] 0.066
[ 3] 0.043 0.088
[ 4] 0.078 0.074 0.077
[ 5] 0.444 0.495 0.450 0.489
[ 6] 0.444 0.489 0.446 0.479 0.050
[ 7] 0.444 0.491 0.450 0.485 0.056 0.063
[ 8] 0.442 0.489 0.448 0.483 0.056 0.063 0.005
[ 9] 0.446 0.489 0.456 0.487 0.059 0.067 0.063 0.063
[10] 0.438 0.479 0.446 0.477 0.064 0.070 0.068 0.068 0.018
[11] 0.454 0.495 0.462 0.491 0.272 0.257 0.273 0.272 0.265 0.268
[12] 0.724 0.764 0.724 0.762 0.698 0.696 0.709 0.709 0.716 0.709 0.732
[13] 0.599 0.636 0.608 0.627 0.610 0.620 0.615 0.617 0.613 0.615 0.634 0.727
[14] 0.495 0.551 0.499 0.540 0.534 0.534 0.538 0.534 0.544 0.542 0.571 0.686 0.641
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
63
Table 5: Similarity between the partial nucleotide sequence of the myosin Va (A), Vb
(B) and Vc (C) tail domain of rainbow trout and the sequences of myosins V of
several organisms obtained from GenBank.
A
Sequence
number (A)
Sequence name Sequence
length (pb)
Sequence
number (B)
Sequence
name
Sequence
length (pb)
Similarity
(%)
1
OMYKISSTAILVA 658 2 BTAURUSTAILVA 642 80
1
OMYKISSTAILVA 658 3 RNORVEGICUSTAILVA 642 89
1
OMYKISSTAILVA 658 4 MMUSCULUSTAILVA 641 86
1
OMYKISSTAILVA 658 5 HSAPIENSTAILVA 642 81
1
OMYKISSTAILVA 658 6 PTROGLODYTESTAILVA 642 81
1
OMYKISSTAILVA 658 7 MMULATTATAILVA 642 81
1
OMYKISSTAILVA 658 8 SSCROFATAILVA 642 81
1
OMYKISSTAILVA 658 9 CFAMILIARISTAILVA 642 80
B
Sequence
number (A)
Sequence name Sequence
length (pb)
Sequence
number (B)
Sequence
name
Sequence
length (pb)
Similarity
(%)
1
OMYKISSTAILVB 683 2 CFAMILIARISTAILVB 675 50
1
OMYKISSTAILVB 683 3 RNORVEGICUSTAILVB 675 59
1
OMYKISSTAILVB 683 4 MMUSCULUSTAILVB 675 54
1
OMYKISSTAILVB 683 5 MMULATTATAILVB 675 51
1
OMYKISSTAILVB 683 6 HSAPIENSTAILVB 675 50
1
OMYKISSTAILVB 683 7 PTROGLODYTESTAILVB 675 50
C
Sequence
number (A)
Sequence name Sequence
length (pb)
Sequence
number (B)
Sequence
name
Sequence
length (pb)
Similarity
(%)
1
OMYKISSTAILVC 638 2 RNORVEGICUSTAILVC 597 83
1
OMYKISSTAILVC 638 3 MMUSCULUSTAILVC 597 79
1
OMYKISSTAILVC 638 4 CFAMILIARISTAILVC 597 68
1
OMYKISSTAILVC 638 5 HSAPIENSTAILVC 597 68
1
OMYKISSTAILVC 638 6 PTROGLODYTESTAILVC 597 68
1
OMYKISSTAILVC 638 7 BTAURUSTAILVC 611 66
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
64
Figures
284 CTGGTGGGTGAGAATGACCTCACAGCTCTTAGCTACCTCCACGAGCCGGCCGTCCTGCACAACCTTAAAGTCCGCTTCACCGACTCCAAACTCATCTACA
L V G E N D L T A L S Y L H E P A V L H N L K V R F T D S K L I Y
384 CATACTGTGGTATTGTGCTGGTGGCCATTAATCCCTATGAGAACCTTCCCATCTACGGTAGTGACATCATCAATGCGTACAGTGGCCAGAACATGGGAGA
T Y C G I V L V A I N P Y E N L P I Y G S D I I N A Y S G Q N M G D
484 CATGGACCCTCATATCTTTGCTGTGGCTGAGGAGGCTTACAAACAGATGGCCAGAGATGAGAGGAACCAGTCTATAATCGTAAGCGGTGAGTCAGGAGCA
M D P H I F A V A E E A Y K Q M A R D E R N Q S I I V S G E S G A
584 GGGAAGACTGTCTCAGCTAAATACGCCATGCGCTACTTTGCTACGGTCAGTGGAGCAGCCACAGAGGCCAACGTAGAGGAGAAGGTCCTCGCATCCAANC
G K T V S A K Y A M R Y F A T V S G A A T E A N V E E K V L A S X
684 CCATCATGGAGGCGATAGGAAACGCTAAGACGACTCGTAACGACAACAGCAGTCGTTTTGGGAAGTACATTGAGATTGGCTTCGACAAACGCTACCGTAT
P I M E A I G N A K T T R N D N S S R F G K Y I E I G F D K R Y R I
784 CATTGGAGCTAACATGAGGACATATCTACTGGAGAAGTCTAGAGTGGTGTTTCAGGCGGACGAGGAGAGGAACTATCATATATTCTACCAGCTGTGTGCG
I G A N M R T Y L L E K S R V V F Q A D E E R N Y H I F Y Q L C A
884 TCCTCCCATCTACCAGAGTTCAAGAATCTGAAGCTAGGTAGTGCTGATGTCTTCCACTGCACCAATCAGGGCCGGAACCCGGTCATCGATGGAGTCGACG
S S H L P E F K N L K L G S A D V F H C T N Q G R N P V I D G V D
984 ATGCTAAAGAGATGTGCACAACACAACATGCCTTCTCACTGCTAGGCATCAACGAGTTGAACCAGAAGGGGCTGTTCCAGGTCCTGGCTGCCATCTTACA
D A K E M C T T Q H A F S L L G I N E L N Q K G L F Q V L A A I L H
1084 TCTGGGCAACGTGGAGATCAAGGACCGAGACTCTGACAGCAGCATCATACCTCCCAATAACCGCCACCTGACGGTGTTCTGTGAGCTGATGGGCGTGACC
L G N V E I K D R D S D S S I I P P N N R H L T V F C E L M G V T
1184 TACCAGGACATGTCTCATTGGCTGTGCCACAAGAAGCTGAAGACAGCCCAGGAGACCTACATCAAGCCCATCCCTCGGCTGCAAGCCTCCAATGCCCGCG
Y Q D M S H W L C H K K L K T A Q E T Y I K P I P R L Q A S N A R
1284 AAGCGCTCGCCAAACACATTTACGCCAAAGTCTTCAACTGGATCGTGGACCATGTCAACAAATCTCTACGCGCCACCGTCAAACAGCACTCCTTCATAGG
E A L A K H I Y A K V F N W I V D H V N K S L R A T V K Q H S F I G
1384 AGTCCTGGATATCTATGGGTTTGAGACGTTTGAGATCAACAGTTTTGAACAGTTCTGTATCAACTATGCTAACGAGAAACTGCAACAGCAGTTTAACATG
V L D I Y G F E T F E I N S F E Q F C I N Y A N E K L Q Q Q F N M
1484 CATGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAGTATTTGAAGGAGCAGATTCCCTGGACTCTGATAGACTTCTATGATAACCAGCCATGTATCAACCTCATAGAGG
H V F K L E Q E E Y L K E Q I P W T L I D F Y D N Q P C I N L I E
1584 CCAAGATGGGGGTACTCGACCTACTGGATGAAGAGTGCAAGATGCCTNNTAAAGGTTCAGATGACTCGTGGGCCCAGAAGCTGTGTAACACCCATCTGAA
A K M G V L D L L D E E C K M P X K G S D D S W A Q K L C N T H L K
1684 GACCTGCTCTCTGTTTGAGAAACCTCGCATGTCCAACAAAGCCTTCATCATACAGCACTTCGCTGACAAGGTGCAGTACCAGTGTGATGGCTTTCTGGAG
T C S L F E K P R M S N K A F I I Q H F A D K V Q Y Q C D G F L E
1784 AAGAACAAGGACACAGTGAATGAAGAGCAGATCAATGTCCTGAAGGCCAGCAAGTTGGACCTGCTAGTGGAGCTGTTTCAGGATGAGGAGAAAGTGACCA
K N K D T V N E E Q I N V L K A S K L D L L V E L F Q D E E K V T
1884 GTCCAACAGGGACCGCTCCAGGAGGTCGAACACGACTCAGCGTCAAACCAAAAGAGGTCAGATCTGGAGCAAGCAGCAAGGAGCACAAGAAGACTGTTGG
S P T G T A P G G R T R L S V K P K E V R S G A S S K E H K K T V G
1984 CTTGCAGTTCCGGAACTCTCTGGCTATGTTGATGGAGACTCTGAATGCAACCACTCCTCACTATGTGCGCTGCATCAAGCCCAACGACCTCAAGTTCCCC
L Q F R N S L A M L M E T L N A T T P H Y V R C I K P N D L K F P
2084 TTCACGTTTGACCCTAAGCGAGCGGTGCAGCAGCTCAGAGCCTGTGGTGTTCTGGAGACCATCCGCATCTCAGCCGCAGGCTTCCCATCCAGATGGACCT
F T F D P K R A V Q Q L R A C G V L E T I R I S A A G F P S R W T
2184 ACCAGGAGTTCTTCAGTCGTTACCGGGTTCTGATGAAGCAGAAGGACGTCCTGTCGGACAGGAGGCTGACCTGTAGGAACGTCCTGGAGAAACTGGTGCA
Y Q E F F S R Y R V L M K Q K D V L S D R R L T C R N V L E K L V Q
2284 GGACCAGGACAAGTACCAGTTTGGTAAGACTAAGATCTTCTTCAGGGCTGGTCAGGTTGCCTACCTGGAGAAGCTGAGGGCTGATAAGCTGAGGAAGGCG
D Q D K Y Q F G K T K I F F R A G Q V A Y L E K L R A D K L R K A
2384 TGCGTCCGTATCCAAAAGACCATCCGCTGCTGGCTGGTAAGCCAAGAAAGTACCTCCGAAAGAAGCATGCTTGCCATCACCATCCAGAGATACACCCGCG
C V R I Q K T I R C W L V S Q E S T S E R S M L A I T I Q R Y T R
2484 GACACCAGGCCCGCTGTCTGGTTAAGTACATGCGTCAGACCCTGGCAGCCATCACTATCCAGAAGTTCCAGAGGATGTGTGTCCAGAGGAAAGTGTACCT
G H Q A R C L V K Y M R Q T L A A I T I Q K F Q R M C V Q R K V Y L
2584 ACAGAAGCAGGCTGCTGCCCTGGTCATGCAGACTATCCTCAGAGCGTACATGGCCCGACAGAAATACCAAGGGTTGCTGCGTAACCACAATGCTGTGTTC
Q K Q A A A L V M Q T I L R A Y M A R Q K Y Q G L L R N H N A V F
2684 ATCCAGAAACACGTGCGTGGCTGGCTGGCCAGACAGCGGTACAAGCGCTCCCTGCGAGCCATCGTCTATNTGCAGTGCTGCATCAGGAGGATGAAGGCCA
I Q K H V R G W L A R Q R Y K R S L R A I V Y Q C C I R R M K A
2784 AGAAAGAGCTGAAGAAGCTGAAAATCGAGGCCCGCTCCGTTGAAC
K K E L K K L K I E A R S V E
Figure 1: Nucleotide and amino acid deduced sequence of the domains head and
neck of trout brain myosin V. The ATP-binding site is enhanced in gray and the actin-
binding site in black. The underlined amino acid sequence denotes the neck domain
of myosin containing the six IQ-motifs.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
65
OMYKISS8 LVGENDLTAL SYLHEPAVLH NLKVRFTDSK LIYTYCGIVL VAINPYENLP IYGSDIINAY SGQNMGDMDP HIFAVAEEAY
OMYKISS1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
OMYKISS2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
OMYKISS5 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
DRERIOVA .......... .......... ......I... .......... .......T.. ...A...... .......... ..........
BTAURUSVA ---------- ---------- ---------- -------... .......Q.. ...E...... .......... ..........
SSCROFAVA .......... .......... ..R...I... .......... .......Q.. ...E...... .......... ..........
CFAMILIARISVA .......... .......... ..R...I... .......... .......Q.. ...E...... .......... ..........
HSAPIENSVA .......... .......... ..R...I... .......... .......Q.. ...E...... .......... ..........
MMULLATAVA .......... .......... ..R...I... .......... .......Q.. ...E...... .......... ..........
MMUSCULUSVA .......... .......... ..R...I... .......... .......Q.. ...E...... .......... ..........
RNORVEGICUSVA .......... .......... ..R...I... .......... .......Q.. ...E...... .......... ..........
GGALLUSVA .......... .......... ......I... .......... .......Q.. ...E...... .......... ..........
XLAEVISVA .......... .......... ......I... .......... .......Q.. ...T...... .......... ..........
TNIGROVIRIDISVA .......... .......... ......V... .......... .......S.. ...T...... .......... .........F
OMYKISS8 KQMARDERNQ SIIVSGESGA GKTVSAKYAM RYFATVSGAA TEANVEEKVL AS-PIMEAIG NAKTTRNDNS SRFGKYIEIG
OMYKISS1 .......G.. .......... .......... .......... .......... ..N....... .......... ..........
OMYKISS2 .......... .......... .......... .......... .......... ..N....... .......... ..........
OMYKISS5 .......... .......... .......... .......... .....X.... ..N....... .......... ..........
DRERIOVA .......... .......... .......... ........S. S......... ..N....S.. .......... ..........
BTAURUSVA .......... .......... .......... ........S. S......... ..N....S.. .......... ..........
SSCROFAVA .......... .......... .......... ........S. S......... ..N....S.. .......... ..........
CFAMILIARISVA .......... .......... .......... ........S. S......... ..N....S.. .......... ..........
HSAPIENSVA .......... .......... .......... ........S. S......... ..N....S.. .......... ..........
MMULLATAVA .......... .......... .......... ........S. S......... ..N....S.. .......... ..........
MMUSCULUSVA .......... .......... .......... ........S. S......... ..N....S.. .......... ..........
RNORVEGICUSVA .......... .......... .......... ........S. S......... ..N....S.. .......... ..........
GGALLUSVA .......... .......... .......... ........S. S......... ..N....S.. .......... ..........
XLAEVISVA .......... .......... .......... ........S. S.T....... ..N....S.. .......... ..........
TNIGROVIRIDISVA .......... .......... .......... ........S. S...ID.... ..N....... .......... ..........
ATP-binding site
OMYKISS8 FDKRYRIIGA NMRTYLLEKS RVVFQADEER NYHIFYQLCA SSHLPEFKNL KLGSADVFHC TNQGRNPVID GVDDAKEMCT
OMYKISS1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........R.
OMYKISS2 .......... .......... .......... .......... ......S... .......... .......... ..........
OMYKISS5 .......... .......... .......... .......... .......E.. .......... .......... ..........
DRERIOVA ...K.H.... .......... .......... .......... .A......A. ...K.ND..Y .K........ ........S.
BTAURUSVA .......... .......... ......E... .......... .AD.S...V. R..D.NN..Y ....GS...E ........AH
SSCROFAVA .......... .......... ......E... .......... .AK....NM. R..N.NN.NY .K..GS.M.E ........AH
CFAMILIARISVA .......... .......... ......E... .......... .AK.....M. R..N..N..Y .K..GS...E ....T...AH
HSAPIENSVA .......... .......... ......E... .......... .AK.....M. R..N..N.NY .K..GS...E ........AH
MMULLATAVA .......... .......... ......E... .......... .AK.....M. R..N..D.NY .Q..GS...E ........AH
MMUSCULUSVA .......... .......... ......E... .......... .AK.....M. R..N..S..Y .K..GS.M.E ........AH
RNORVEGICUSVA .......... .......... ......E... .......... .AK.....M. R..N..S..Y .K..GS.M.E ........AH
GGALLUSVA .......... .......... ......E... .......... .AA.....T. R..N.NY..Y .K..GS.... .I......VN
XLAEVISVA .......L.. H......... ......E... .......... .AS.....M. R..T.ND..Y .K..GS.... ....Q...RN
TNIGROVIRIDISVA ..S....... .......... .......... .......... ........P. .....NE.LY .R..GS...E ....TR.LS.
OMYKISS8 TQHAFSLLGI NELNQKGLFQ VLAAILHLGN VEIKDRDSDS SIIPPNNRHL TVFCELMGVT YQDMSHWLCH KKLKTAQETY
OMYKISS1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
OMYKISS2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
OMYKISS5 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
DRERIOVA .RN..I.... ..SY.M.... I..S...... .DV....... .......G.. S......... .......... ......T...
BTAURUSVA .RQ.CT.... S.SH.M.I.R I..G...... .VFMS..... CT...KHEP. SI..D....D FEELC..... R..A..T...
SSCROFAVA .RQ.CT.... SDSY.M.I.R I..G...... .GFTS..... CT...KHEP. SI..D....D .DE.C..... R..A..T...
CFAMILIARISVA .RQ.CT.... S.SY.M.I.R I..G...... .AFTS..... CT...KHEP. SI.SD....D .EE.C..... R..A..T...
HSAPIENSVA .RQ.CT.... S.SH.M.I.R I..G...... .GFTS..A.. CT...KHEP. CI.......D .EE.C..... R..A..T...
MMULLATAVA .RQ.CT.... S.SH.M.I.R I..G...... .GFTS..A.. CT...KHEP. CI..D....D .EE.C..... R..A..T...
MMUSCULUSVA .RQ.CT.... S.SY.M.I.R I..G...... .GFAS..... CT...KHEP. .I..D....D .EE.C..... R..A..T...
RNORVEGICUSVA .RQ.CT.... S.SY.M.I.R I..G...... .GFAS..... CT...KHEP. II..D....D .EE.C..... R..A..T...
GGALLUSVA .RQ.CT.... SDSY.M.I.R I..G...... ..FAS..... CA...KHDP. .I..D....D .EE.A..... R..A..T...
XLAEVISVA .RQ.CT.... G.SY.M.I.R I......... ..F.S..... CL...KHVP. .I..D....D .EE....... R..V..A...
TNIGROVIRIDISVA .RQ..A.... ..SA.M.V.R .......... ...R.K.... .T.A...L.. MA..D.V... .......... R.....T...
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
66
OMYKISS8 IKPIPRLQAS NAREALAKHI YAKVFNWIVD HVNKSLRATV KQHSFIGVLD IYGFETFEIN SFEQFCINYA NEKLQQQFNM
OMYKISS1 .......... ...D...... .......... .......... .......... .......V.. .......... ..........
OMYKISS2 .......... ...D...... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
OMYKISS5 .......... ...D...... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
DRERIOVA .....K...I ...D...... ...L...... ....A.HS.. .......... .......... .......... ..........
BTAURUSVA ....SK...T ...D...... ...L...... ...QA.HSA. .......... .......... .......... ..........
SSCROFAVA ....SK...T ...D...... ...L...... ...QA.HSA. .......... .......... .......... ..........
CFAMILIARISVA ....SK...T ...D...... ...L...... ...QA.HSA. .......... .......... .......... ..........
HSAPIENSVA ....SK...T ...D...... ...L...... N..QA.HSA. .......... .......... .......... ..........
MMULLATAVA ....SK...T ...D...... ...L...... N..QA.HSA. .......... .......... .......... ..........
MMUSCULUSVA ....SK...T ...D...... ...L...... ...QA.HSA. .......... .......... .......... ..........
RNORVEGICUSVA ....SK...T ...D...... ...L.....G ...QA.HSA. .......... .......... .......... ..........
GGALLUSVA ....SK.H.I ...D...... ..NL...... ....A.HS.. .......... .......... .......... ..........
XLAEVISVA ....S....T ...D...... ..FL.....C ....A.LSST ..N....... .......... .......... .........L
TNIGROVIRIDISVA ...L.....T ...D..S... ...L.....E ....A.ITS. .......... ........V. .......... ..........
OMYKISS8 HVFKLEQEEY LKEQIPWTLI DFYDNQPCIN LIEAKMGVLD LLDEECKMPK GSDDSWAQKL CNTHLKTCSL FEKPRMSNKA
OMYKISS1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... Y......... ..........
OMYKISS2 .......... .........V .......... ........P. .......... .......... Y......... ..........
OMYKISS5 R......... .......... .......... .......... .......... .......... Y......... ..........
DRERIOVA .......... M......... .......... .......I.. .......... .......... Y.......A. ..........
BTAURUSVA .......... M......... .......... ...S.L.I.. .......... .T..T..... Y....NK.A. .....L....
SSCROFAVA .......... M......... .......... ...S.L.I.. .......... .T..T..... Y....NK.A. .....L....
CFAMILIARISVA .......... M......... .......... ...S.L.I.. .......... .T..T..... Y....NK.A. .....L....
HSAPIENSVA .......... M......... .......... ...S.L.I.. .......... .T..T..... Y....NK.A. .....L....
MMULLATAVA .......... M......... .......... ...S.L.I.. .......... .T..T..... Y....NK.T. .....L....
MMUSCULUSVA .......... M......... .......... ...S.L.I.. .......... .T..T..... Y....NK.A. ..........
RNORVEGICUSVA .......... M......... .......... ...S.L.I.. .......... .T..T..... Y....NK.A. ..........
GGALLUSVA .......... M......... .......... .......... .......... ....T..... Y....NK.A. .....L....
XLAEVISVA .......... M......... .......... .......I.. .......... ...ST..... Y.....K.A. .....L..V.
TNIGROVIRIDISVA .......... M......... .......... .......... .......... .......... Y......... ........R.
OMYKISS8 FIIQHFADKV QYQCDGFLEK NKDTVNEEQI NVLKASK-LD LLVELFQ--- -DEEKVTSPT GTAPG--GRT RLS---VKPK
OMYKISS1 .......... .......... .......... .......-.. .......--- -......... .....--... ...---....
OMYKISS2 .......... .......... .......... .......-.. ..A....--- -......... .....--... ...---....
OMYKISS5 .......... .......... .......... .......-.. .......--- -......... .....--... ...---....
DRERIOVA .......... E......... .......... .......-F. ......H--- -....A.... .A...PG... ...---...D
BTAURUSVA .......... E...E..... .....F.... K...S..-FK M.P....--- -.D..AI... SATSS--... P.TRTLS..T
SSCROFAVA .......... E...E..... .....F.... K...S..-FK M.P....--- -.D..AI... SATSS--... P.TRTPS..T
CFAMILIARISVA .......... E...E..... .....F.... K...S..-FK M.P....--- -.D..AI... SATSS--..M P..RTPA..T
HSAPIENSVA .......... E...E..... .....F.... K...S..-FK M.P....--- -.D..AI... SATSS--... P.TRTPA..T
MMULLATAVA .......... E...E..... .....F.... K...S..-FK M.P....--- -.D..AI... SATSS--... P.TRIPA..I
MMUSCULUSVA ...K...... E...E..... .....F.... K...S..-FK M.P....--- -.D..AI... SATSS--... P.TRVP...T
RNORVEGICUSVA ...K...... E...E..... .....F.... K...S..-FK M.P....--- -.D..AI... SATSS--... P.TRVP...T
GGALLUSVA ...K...... E...E..... .....Y.... K...S..KFK ..P....--- -....AI... SAT.S--..V P..RTP...A
XLAEVISVA ...K...... E......... .....F.... K....IYTAN ---------R VVPR------ ---------- ----------
TNIGROVIRIDISVA .......... E...E..... .......... .......T.P G.FCFHKNRR LEPAEAVWLS AHV.PSSSFL P.LFCD.LVF
OMYKISS8 E----VRSGA SSKEHKKTVG ------LQFR NSLAMLMETL NATTPHYVRC IKPNDLKFPF TFDPKRAVQQ LRACGVLETI
OMYKISS1 .----..... .......... ------C... .......... .......... .......... .........H .-........
OMYKISS2 .----..... .......... ------C... .........R .......... .......... .......... ..........
OMYKISS5 .----..... .......... ------C... .......... .......... .......... .......... ..........
DRERIOVA K----GK.SQ A......... ------.... ...QL..... .......... .....Y.HA. .......... ..........
BTAURUSVA K----G.P.Q TA........ ------H... ...HL..... .......... .....F.... ...E...... ..........
SSCROFAVA K----G.P.Q MA........ ------H... ...HL..... .......... .....F.... ...E...... ..........
CFAMILIARISVA K----G.P.Q TA........ ------H... ...HL..... .......... .....F.... ...E...... ..........
HSAPIENSVA K----G.P.Q MA........ ------H... ...HL..... .......... .....F.... ...E...... ..........
MMULLATAVA K----G.P.Q MA........ ------H... ...HL..... .......... .....F.... ...E...... ..........
MMUSCULUSVA K----G.P.Q TA........ ------H... ...HL..... .......... .....F.... ...E...... ..........
RNORVEGICUSVA K----G.P.Q TA........ ------.... ...HL..... .......... .....F.... ...E...... ..........
GGALLUSVA K----A.P.Q T......... ------H... ...HL..... .......... .....F.... ...E...... ..........
XLAEVISVA ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
TNIGROVIRIDISVA LCCVL...A. PDLQKLNED. ELWLVNQGL. ETVRCRLSSM SLWPF.GEGG RERGSFTCSS SCFFCSCCLF SGLR.DQLQL
Actin-binding site
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
67
OMYKISS8 RISAAGFPSR WTYQEFFSRY RVLMKQKDVL SDRRL-TCRN VLEKLVQDQD KYQFGKTKIF FRAGQVAYLE KLRADKLRKA
OMYKISS1 .......... .......... .......... .....-.... .......... .......... .......... ..........
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CFAMILIARISVA .......... .......... .......... ...KQ-..K. .....IL.K. .......... .......... ........A.
HSAPIENSVA .......... .......... .......... ...KQ-..K. .....IL.K. .......... .......... ........A.
MMULLATAVA .......... .......... .......... ...KQ-..K. .....IL.K. .......... .......... ........A.
MMUSCULUSVA .......... .......... .......... G..KQ-..K. .....IL.K. .......... .......... ........A.
RNORVEGICUSVA .......... .......... .......... G..KQ-..Q. .....IL.K. .......... .......... ........A.
GGALLUSVA .......... .......... .......... ...KQ-..K. .....IL.K. .......... .......... .I......A.
XLAEVISVA ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
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OMYKISS8 CVRIQKTIRC WLVSQESTSE RSMLAITIQR YTRGHQARCL VKYMRQTLAA ITIQKFQRMC VQRKVYLQKQ AAALVMQTIL
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CFAMILIARISVA .I.......G ..LRKKYLRM .-KA...V.. .V..Y....Y A.FL.R.K.. TI...YW..Y IV.RK.KIRR T.TI.L.SY.
HSAPIENSVA .I.......G ..LRKKYLRM .-KA...M.. .V..Y....Y A.FL.R.K.. TI...YW..Y .V.RR.KIRR ..TI.L.SY.
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MMUSCULUSVA .I.......G ..LRKRYLCM Q-RA...V.. .V..Y....Y A.FL.R.K.. T....YW..Y .V.RR.KIRR ..TI.I.SY.
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GGALLUSVA .I.......G ..MRKKYMRM .-RA...... .V.......Y ATFL.R.R.. .I.......Y .V..R.QCMR D.TIAL.AL.
XLAEVISVA ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
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1 IQ-motif 2 IQ-motif 3 IQ-motif 4 IQ-
OMYKISS8 RAYMARQKYQ GLLRNHNAVF IQKHVRGWLA RQRYKRSLRA IVY-QCCIRR MKAKKELKKL KIEARSVE
OMYKISS1 .......... ......K... .......... .......... ...M...... .......... ........
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BTAURUSVA .G.L..NR.H KI..E.K..I ...W...... .TC.R..IH. .I.L...F.. .M..R..... ........
SSCROFAVA .G.L..NR.R KI..E.K..I ...W...... .TY....MH. .I.L...F.. .M..R..... ........
CFAMILIARISVA .G.L..NR.R KM..E.K..I ...W...... .T.....MH. .I.L...F.. .M..R..... ........
HSAPIENSVA .GFL..NR.R KI..E.K..I ...R...... .TH....MH. .I.L...F.. .M..R..... ........
MMULLATAVA .GFL..NR.R KI..E.K..I ...R...... .TH....MH. .I.L...F.. .M..R..... ........
MMUSCULUSVA .G.LT.NR.R KI..EYK..I ...R...... .TH...TMK. ...L...F.. .M..R..... ........
RNORVEGICUSVA .G.L..NR.R KI..E.K..I ...R...... .TH...TMK. .I.L...F.. .M..R..... ........
GGALLUSVA .G.LV.N... MM..E.KSII .......... .VH.H.T.K. ...L...Y.. .M..R..... ........
XLAEVISVA ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --------
TNIGROVIRIDISVA P---R.E.DF QGMLEYKKED EL.LIKNLIL ELKPRGVAVN LIPGLPAYIL FMCLRHADYV NDDQKV--
motif 5 IQ-motif 6 IQ-motif
Figure 2: Comparison of the primary structure of the head and neck domains of
Oncorhynchus mykiss myosin V with sequences of the myosin Va obtained from
GenBank database. Dashes indicate gaps introduced in the sequence to optimize the
alignment. Residues shared among the sequences are show as points. Regions
conserved as the ATP-binding site, actin-binding site and the calmodulin binding sites
(IQ-motifs) are block-shaded.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
68
Figure 3: Amino acid composition of the sequence of cDNAs isolated from
Oncorhynchus mykiss evidencing a larger frequency of neutral and basic amino acids.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
69
Figure 4: Phylogenetic tree obtained from neighboor-joining analysis of the myosin V
head and neck domains protein sequences of the rainbow trout and other vertebrates.
Sequences of Nematodes, Arthropods and Echinoderms were included as out-
groups. Branch lengths are proportional to evolutionary distance (scale bar).
Bootstrap resampling (2.000 trials) was used to judge the robustness of nodes.
Accession numbers and abbreviations are described in Material and Methods.
HSAPIENSVA
MMULLATAVA
BTAURUSVA
SSCROFAVA
CFAMILIARISVA
MMUSCULUSVA
RNORVEGICUSVA
GGALLUSVA
XLAEVISVA
DRERIOVA
TNIGROVIRIDISVA
OMYKISS1
OMYKISS5
OMYKISS8
OMYKISS2
DRERIOVB
TNIGROVIRIDISVB
HSAPIENSVB
MMULLATAVB
CFAMILIARISVB
MMUSCULUSVB
RNORVEGICUSVB
DRERIOVC
MMUSCULUSVC
RNORVEGICUSVC
CFAMILIARISVC
BTAURUSVC
HSAPIENSVC
PTROGLODYTESVC
SPURPURATUSV
DMELANOGASTERV
CELEGANSV
100
98
35
50
100
100
94
89
36
100
77
63
100
100
97
32
100
56
96
100
98
99
98
93
99
48
82
44
0.05
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
70
Figure 5: 1% agarose gel demonstrating the expression of the myosins Va (a) Vb (b)
and Vc (c) in the different tissues of rainbow trout. Legend: 1 - hypophysis; 2 - brain; 3
- aorta; 4 - heart; 5 - gill; 6 - muscle; 7 - stomach; 8 - liver; 9 - kidney; 10 - intestine;
11 - spleen; 12-ovary. The analyze of myosins Va and Vb expression was not
conducted in ovary. M – molecular weight marker in bp.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
71
4.3. Discussão geral
Este trabalho revela a presença e a distribuição tecidual de miosinas da
classe V em diferentes tecidos de truta arco-íris. Ainda, descreve e analisa a
seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos deduzida que codificam os domínios
cabeça e pescoço dessa proteína em vertebrados primitivos.
Através de técnicas de imunohistoquímica detectamos a expressão da miosina
V de cérebro em diferentes regiões do sistema nervoso central de truta, fornecendo
um mapa de sua distribuição tecidual e celular, contribuindo para a compreensão de
sua função na fisiologia e plasticidade cerebral, principalmente no que diz respeito a
sua característica como mecanoenzima. Esses resultados evidenciaram a presença
dessa proteína em virtualmente todas as células neurais examinadas em diferentes
regiões encefálicas confirmando sua ampla expressão no sistema nervoso central e
indicando sua participação em funções neuronais gerais. Os dados obtidos estão de
acordo com os resultados descritos na literatura para mamíferos (Tilelli et al, 2003), o
que praticamente vem confirmar nossa hipótese de conservação filogenética das
principais funções da miosina Va nos diferentes grupos vertebrados.
A análise comparativa do segmento referente aos domínios cabeça e pescoço
da miosina Va entre os diferentes organismos mostrou que a evolução dessa classe
de miosinas tem acompanhado a divergência dos principais grupos de vertebrados.
Ainda, dados obtidos através do seqüenciamento de porções da cauda das miosinas
Va, Vb e Vc evidenciaram a presença de mais de um membro desta classe de
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
72
proteínas num mesmo tecido o que nos leva a refletir sobre os possíveis papéis
dessas diferentes isoformas.
Esperamos, com o presente trabalho, ter avançado os estudos sobre a
expressão gênica e distribuição tecidual das miosinas V em vertebrados inferiores,
contribuindo assim para o conhecimento de suas funções e para o entendimento do
comportamento evolutivo dessa classe de proteínas nos diferentes grupos animais.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
73
5. Conclusões
Este trabalho demonstrou a presença de miosinas da classe V em diferentes
tecidos de Oncorhynchus mykiss, sua distribuição em cérebro e a seqüência
nucleotídica e deduzida de aminoácidos dos domínios cabeça e pescoço desta
proteína em vertebrados primitivos. Os resultados imunohistoquímicos revelaram
uma ampla distribuição desta proteína em diferentes regiões do sistema nervoso
central, indicando sua intensa participação como motor molecular nas funções
neuronais. A presença e o padrão de distribuição em truta corroboram os dados que
apontam para a conservação filogenética das principais funções da miosina Va nos
diferentes grupos animais. Através da análise comparativa da seqüência de miosina
V com a de outros organismos ficou evidente uma alta similaridade com a miosina
Va, que obedece ao padrão de distância filogenética existente entre os grupos
analisados.
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
74
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
83
ANEXOS
Seqüências nucleotídicas dos cDNAs dos domínios cabeça, pescoço e
cauda da miosina V de Oncorhynchus mykiss isoladas e analisadas no presente
trabalho.
>Cabeça1
CTGGTGGGTGAGAATGACCTCACAGCTCTTAGCTACCTCCACGAGCCGGCCGTCCTGCACAACCTTAAAGTCCGC
TTCACCGACTCCAAACTCATCTACACATACTGTGGTATTGTGCTGGTGGCCATTAATCCCTATGAGAACCTTCCC
ATCTACGGTAGTGATATCATCAATGCGTACAGTGGCCAGAACATGGGAGACATGGACCCTCATATCTTTGCTGTG
GCTGAGGAGGCTTACAAACAGATGGCCAGAGATGAGGGGAACCAGTCTATAATCGTAAGCGGTGAGTCAGGAGCA
GGGAAGACTGTCTCAGCTAAATACGCCATGCGCTACTTTGCTACGGTCAGTGGAGCAGCCACAGAGGCCAACGTA
GAGGAGAAGGTCCTCGCATCCAACCCCATCATGGAGGCGATAGGAAACGCTAAGACGACTCGTAACGACAACAGC
AGTCGTTTTGGGAAGTACATTGAGATTGGCTTCGACAAACGCTACCGTATCATTGGAGCTAACATGAGGACATAT
CTACTGGAGAAGTCTAGAGTGGTGTTTCAGGCGGACGAGGAGAGGAACTATCATATATTCTACCAGCTGTGTGCG
TCCTCCCATCTACCAGAGTTCAAGAATCTGAAGCTAGGTAGTGCTGATGTCTTCCACTGCACCAATCAGGGCCGG
AACCCGGTCATCGATGGAGTCGACGATGCTAAAGAGATGCGCACAACACAACATGCCTTCTCACTGCTAGGCATC
AACGAGTTGAACCAGAAGGGGCTGTTCCAGGTCCTGGCTGCCATCTTACATCTGGGCAATGTGGAGATCAAGGAC
CGAGACTCTGACAGCAGCATCATACCTCCCAATAACCGCCACCTGACGGTTTTCTGTGAGCTGATGGGCGTGACC
TACCAGGACATGTCTCATTGGCTGTGCCACAAGAAGCTGAAGACAGCCCAGGAGACCTACATCAAGCCCATCCCT
CGGCTGCAAGCCTCCAATGCCCGCGACGCGCTCGCCAAACACATCTACGCCAAAGTCTTCAACTGGATCGTGGAC
CATGTCAACAAATCTCTACGCGCTACCGTCAAACAGCACTCCTTCATAGGAGTCCTGGATATCTATGGGTTTGAG
ACGTTTGTGATCAACAGTTTTGAACAGTTCTGTATCAACTATGCTAACGAGAAACTGCAACAGCAGTTTAACATG
CATGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAGTATTTGAAGGAGCAGATTCCCTGGACTCTGATAGACTTCTATGATAAC
CAGCCATGTATCAACCTCATAGAGGCCAAGATGGGGGTACTCGACCTACTGGATGAAGAGTGCAAGATGCCTNNT
AAAGGTTCAGATGACTCGTGGGCCCAGAAGCTGTATAACACCCATCTGAAGACCTGCTCTCTGTTTGAGAAACCT
CGCATGTCCAACAAAGCCTTCATCATACAGCACTTCGCTGACAAGGTGCAGTACCAGTGTGATGGCTTTCTGGAG
AAGAACAAGGACACAGTGAATGAAGAGCAGATCAATGTCCTGAAGGCCAGCAAGTTGGACCTGCTAGTGGAGCTG
TTTCAGGATGAGGAGAAAGTGACCAGTCCAACAGGGACCGCTCCAGGAGGTCGAACACGACTCAGCGTCAAACCA
AAAGAGGTCAGATCTGGAGCAAGCAGCAAGGAGCACAAGAAGACTGTTGGCTGCCAGTTCCGGAACTCTCTGGCT
ATGTTGATGGAGACTCTGAATGCAACCACTCCTCACTATGTGCGCTGCATCAAG – 1779 pb
>Cabeça2
CTGGTGGGTGAGAATGACCTCACAGCTCTTAGCTACCTCCACGAGCCGGCCGTCCTGCACAACCTTAAAGTCCGC
TTCACCGACTCCAAACTCATCTACACATACTGTGGTATTGTGCTGGTGGCCATTAATCCCTATGAGAACCTTCCC
ATCTACGGTAGTGACATCATCAATGCGTACAGTGGCCAGAACATGGGAGACATGGACCCTCATATCTTCGCTGTG
GCTGAGGAGGCTTACAAACAGATGGCCAGAGATGAGAGGAACCAGTCTATAATCGTAAGCGGTGAGTCAGGAGCA
GGGAAGACTGTCTCAGCTAAATACGCCATGCGCTACTTTGCTACGGTCAGTGGAGCAGCCACAGAGGCCAACGTA
GAGGAGAAGGTCCTCGCATCCAACCCCATCATGGAGGCGATAGGAAACGCTAAGACGACTCGTAACGACAACAGC
AGTCGTTTTGGGAAGTACATTGAGATTGGCTTCGACAAACGCTACCGTATCATAGGAGCTAACATGAGGACATAT
CTACTGGAGAAGTCTAGAGTGGTGTTTCAGGCGGACGAGGAGAGGAACTATCATATATTCTACCAGCTGTGTGCG
TCCTCCCATCTACCAGAGTCCAAGAATCTGAAGCTAGGTAGTGCTGATGTCTTCCACTGCACCAATCAGGGCCGG
AACCCGGTCATCGATGGAGTCGACGATGCTAAAGAGATGTGCACAACACAACATGCCTTCTCACTGCTAGGCATC
AACGAGTTGAACCAGAAGGGGCTGTTCCAGGTCCTGGCTGCCATCTTACATCTGGGCAATGTGGAGATCAAGGAC
CGAGACTCTGACAGCAGCATCATACCTCCCAATAACCGCCACCTGACGGTGTTCTGTGAGCTGATGGGCGTGACC
TACCAGGACATGTCTCATTGGCTGTGCCACAAGAAGCTGAAGACAGCCCAGGAGACCTACATCAAGCCCATCCCT
CGGCTGCAAGCCTCCAATGCCCGCGACGCGCTCGCCAAACACATCTACGCCAAAGTCTTCAACTGGATCGTGGAC
CATGTCAACAAATCTCTACGCGCTACCGTCAAACAGCACTCCTTCATAGGAGTCCTGGATATCTATGGGTTTGAG
ACGTTTGAGATCAACAGTTTTGAACAGTTCTGTATCAACTATGCTAACGAGAAACTTCAACAGCAGTTTAACATG
CATGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAGTATTTGAAGGAGCAGATTCCCTGGACTCTGGTAGACTTCTATGATAAC
CAGCCATGTATCAACCTCATAGAGGCCAAGATGGGGGTACCCGACCTACTGGATGAAGAGTGCAAGATGCCTNNT
AAAGGTTCAGATGACTCGTGGGCCCAGAAGCTGTATAACACCCATCTGAAGACCTGCTCTCTGTTTGAGAAACCT
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
84
CGCATGTCCAACAAAGCCTTCATCATACAGCACTTCGCTGACAAGGTGCAGTACCAGTGTGATGGCTTTCTGGAG
AAGAACAAGGACACAGTGAATGAAGAGCAGATCAATGTCCTGAAGGCCAGCAAGTTGGACCTGCTAGCGGAGCTG
TTTCAGGATGAGGAGAAAGTGACCAGTCCAACAGGGACCGCTCCAGGAGGTCGAACACGACTCAGCGTCAAACCA
AAAGAGGTCAGATCTGGAGCAAGCAGCAAGGAGCACAAGAAGACTGTTGGCTGCCAGTTCCGGAACTCTCTGGCT
ATGTTGATGGAGACTCGGAATGCAACCACTCCTCACTATGTGCGCTGCATCAAG – 1779 pb
>Cabeça5
CTGGTGGGTGAGAATGACCTCACAGCTCTTAGCTACCTCCACGAGCCGGCCGTCCTGCACAACCTTAAAGTCCGC
TTCACCGACTCCAAACTCATCTACACATACTGTGGTATTGTGCTGGTGGCCATTAATCCCTATGAGAACCTTCCC
ATCTACGGTAGTGACATCATCAATGCGTACAGTGGCCAGAACATGGGAGACATGGACCCTCATATCTTCGCTGTG
GCTGAGGAGGCTTACAAACAGATGGCCAGAGATGAGAGGAACCAGTCTATAATCGTAAGCGGTGAGTCAGGAGCA
GGGAAGACTGTCTCAGCTAAATACGCCATGCGCTACTTTGCTACGGTCAGTGGAGCAGCCACAGAGGCCAACGTA
TAGGAGAAGGTCCTCGCATCCAACCCCATCATGGAGGCGATAGGAAACGCTAAGACGACTCGTAACGACAACAGC
AGTCGTTTTGGGAAGTACATTGAGATTGGCTTCGACAAACGCTACCGTATCATTGGAGCTAACATGAGGACATAT
CTACTGGAGAAGTCTAGAGTGGTGTTTCAGGCGGACGAGGAGAGGAACTATCATATATTCTACCAGCTGTGTGCG
TCCTCCCATCTACCAGAGTTCGAGAATCTGAAGCTAGGTAGTGCTGACGTCTTCCACTGCACCAATCAGGGCCGG
AACCCGGTCATCGATGGAGTCGACGATGCTAAAGAGATGTGCACAACACAACATGCCTTCTCACTGCTAGGCATC
AACGAGTTGAACCAGAAGGGGCTGTTCCAGGTCCTGGCTGCCATCTTACATCTGGGCAATGTGGAGATCAAGGAC
CGAGACTCTGACAGCAGCATCATACCTCCCAATAACCGCCACCTGACGGTTTTCTGTGAGCTGATGGGCGTGACC
TACCAGGACATGTCTCATTGGCTGTGCCACAAGAAGCTGAAGACAGCCCAGGAGACCTACATCAAGCCCATCCCT
CGGCTGCAAGCCTCCAATGCCCGCGACGCGCTCGCCAAACACATCTACGCCAAAGTCTTCAACTGGATCGTGGAC
CATGTCAACAAATCTCTACGCGCTACCGTCAAACAGCACTCCTTCATAGGAGTCCTGGATATCTATGGGTTTGAG
ACGTTTGAGATCAACAGTTTTGAACAGTTCTGTATCAACTATGCTAACGAGAAACTGCAACAGCAGTTTAACATG
CGTGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAGTATTTGAAGGAGCAGATTCCCTGGACTCTGATAGACTTCTATGATAAC
CAGCCATGTATCAACCTCATAGAGGCCAAGATGGGGGTACTCGACCTACTGGATGAAGAGTGCAAGATGCCTNNT
AAAGGTTCAGATGACTCGTGGGCCCAGAAGCTGTATAACACCCATCTGAAGACCTGCTCTCTGTTTGAGAAACCT
CGCATGTCCAACAAAGCCTTCATCATACAGCACTTCGCTGACAAGGTGCAGTACCAGTGTGATGGCTTTCTGGAG
AAGAACAAGGACACAGTGAATGAAGAGCAGATCAATGTCCTGAAGGCCAGCAAGTTGGACCTGCTAGTGGAGCTG
TTTCAGGATGAGGAGAAAGTGACCAGTCCAACAGGGACCGCTCCAGGAGGTCGAACACGACTCAGCGTCAAACCA
AAAGAGGTCAGATCTGGAGCAAGCAGCAAGGAGCACAAGAAGACTGTTGGCTGCCAGTTCCGGAACTCTCTGGCT
ATGTTGATGGAGACTCTGAATGCAACCACTCCTCACTATGTGCGCTGCATCAAG – 1779 pb
>Cabeça8
CTGGTGGGTGAGAATGACCTCACAGCTCTTAGCTACCTCCACGAGCCGGCCGTCCTGCACAACCTTAAAGTCCGC
TTCACCGACTCCAAACTCATCTACACATACTGTGGTATTGTGCTGGTGGCCATTAATCCCTATGAGAACCTTCCC
ATCTACGGTAGTGACATCATCAATGCGTACAGTGGCCAGAACATGGGAGACATGGACCCTCATATCTTTGCTGTG
GCTGAGGAGGCTTACAAACAGATGGCCAGAGATGAGAGGAACCAGTCTATAATCGTAAGCGGTGAGTCAGGAGCA
GGGAAGACTGTCTCAGCTAAATACGCCATGCGCTACTTTGCTACGGTCAGTGGAGCAGCCACAGAGGCCAACGTA
GAGGAGAAGGTCCTCGCATCCAANCCCATCATGGAGGCGATAGGAAACGCTAAGACGACTCGTAACGACAACAGC
AGTCGTTTTGGGAAGTACATTGAGATTGGCTTCGACAAACGCTACCGTATCATTGGAGCTAACATGAGGACATAT
CTACTGGAGAAGTCTAGAGTGGTGTTTCAGGCGGACGAGGAGAGGAACTATCATATATTCTACCAGCTGTGTGCG
TCCTCCCATCTACCAGAGTTCAAGAATCTGAAGCTAGGTAGTGCTGATGTCTTCCACTGCACCAATCAGGGCCGG
AACCCGGTCATCGATGGAGTCGACGATGCTAAAGAGATGTGCACAACACAACATGCCTTCTCACTGCTAGGCATC
AACGAGTTGAACCAGAAGGGGCTGTTCCAGGTCCTGGCTGCCATCTTACATCTGGGCAACGTGGAGATCAAGGAC
CGAGACTCTGACAGCAGCATCATACCTCCCAATAACCGCCACCTGACGGTGTTCTGTGAGCTGATGGGCGTGACC
TACCAGGACATGTCTCATTGGCTGTGCCACAAGAAGCTGAAGACAGCCCAGGAGACCTACATCAAGCCCATCCCT
CGGCTGCAAGCCTCCAATGCCCGCGAAGCGCTCGCCAAACACATTTACGCCAAAGTCTTCAACTGGATCGTGGAC
CATGTCAACAAATCTCTACGCGCCACCGTCAAACAGCACTCCTTCATAGGAGTCCTGGATATCTATGGGTTTGAG
ACGTTTGAGATCAACAGTTTTGAACAGTTCTGTATCAACTATGCTAACGAGAAACTGCAACAGCAGTTTAACATG
CATGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAGTATTTGAAGGAGCAGATTCCCTGGACTCTGATAGACTTCTATGATAAC
CAGCCATGTATCAACCTCATAGAGGCCAAGATGGGGGTACTCGACCTACTGGATGAAGAGTGCAAGATGCCTNNT
AAAGGTTCAGATGACTCGTGGGCCCAGAAGCTGTGTAACACCCATCTGAAGACCTGCTCTCTGTTTGAGAAACCT
CGCATGTCCAACAAAGCCTTCATCATACAGCACTTCGCTGACAAGGTGCAGTACCAGTGTGATGGCTTTCTGGAG
AAGAACAAGGACACAGTGAATGAAGAGCAGATCAATGTCCTGAAGGCCAGCAAGTTGGACCTGCTAGTGGAGCTG
TTTCAGGATGAGGAGAAAGTGACCAGTCCAACAGGGACCGCTCCAGGAGGTCGAACACGACTCAGCGTCAAACCA
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
85
AAAGAGGTCAGATCTGGAGCAAGCAGCAAGGAGCACAAGAAGACTGTTGGCTGCCAGTTCCGGAACTCTCTGGCT
ATGTTGATGGAGACTCTGAATGCAACCACTCCTCACTATGTGCGCTGCATCAAG – 1779 pb
>Cabeça10
CTGGTGGGTGAGAATGACCTCACAGCTCTTAGCTACCTCCACGAGCCGGCCGTCCTGCACAACCTTAAAGTCCGC
TTCACCGACTCCAAACTCATCTACACATACTGTGGTATTGTGCTGGTGGCCATTAATCCCTATGAGAACCTTCCC
ATCTACGGTAGTGACATCATCAATGCGTACAGTGGCCAGAACATGGGAGACATGGACCCTCATATCTTCGCTGTG
GCTGGGGAGGCTTACAAACAGATGGCCAGAGATGAGAGGAACCAGTCTATAATCGTAAGCGGTGAGTCAGGAGCA
GGGAAGACTGTCTCAGCTAAATACGCCATGCGCTACTTTGCTACGGTCAGTGGAGCAGCCACAGAGGCCAACGTA
TAGGAGAAGGTCCTCGCATCCAACCCCATCATGGAGGCGATAGGAAACGCTAAGACGACTCGTAACGACAACAGC
AGTCGTTTTGGGAAGTACATTGAGATTGGCTTCGACAAACGCTACCGTATCATTGGAGCTAACATGAGGACATAT
CTACTGGAGAAGTCTAGAGTGGTGTTTCAGGCGGACGAGGAGAGGAACTATCATATATTCTACCAGCTGTGTGCG
TCCTCCCATCTACCAGAGTTCAAGAATCTGAAGCTAGGTAGTGCTGATGTCTTCCACTGCACCAATCAGGGCCGG
AACCCGGTCATCGATGGAGTCGACGATGCTAAAGAGATGTGCACAACACAACATGCCTTCTCACTGCTAGGCATC
AACGAGTTGAACCAGAAGGGGCTGTTCCAGGTCCTGGCTGCCATCTTACATCTGGGCAATGTGGAGATCAAGGAC
CGAGACTCTGACAGCAGCATCATACCTCCCAATAACCGCCACCTGACGGTTTTCTGTGAGCTGATGGGCGTGACC
TACCAGGACATGTCTCATTGGCTGTGCCACAAGAAGCTGAAGACAGCCCAGGAGACCTACATCAAGCCCATCCCT
CGGCTGCAAGCCTCCAATGCCTGCGACGCGCTCGCCAAACACATCTACGCCAAAGTCTTCAACTGGATCGTGGAC
CATGTCAACAAATCTCTACGCGCTACCGTCAAACAGCACTCCTTCATAGGAGTCCTGGATATCTATGGGTTTGAG
ACGTTTGAGATCAACAGTTTTGAACAGTTCTGTATCAACTATGCTAACGAGAAACTGCAACAGCAGTTTAACATG
CATGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAGTATTTGAAGGAGCAGATTCCCTGGACTCTGATAGACTTCTATGATAAC
CAGCCATGTATCAACCTCATAGAGGCCAAGATGGGGGTACTCGACCTACTGGATGAAGAGTGCAAGATGCACAGC
CCATGAGACATGTAAAACAAGNNTGCCNAAGGGTTCAGATGACTNNNGGGCCCAGNAGCTGNATAACACCCATCT
GAAGACCTNCTNTCTGTTTGAGAACCTCGCATTGTCCAAACAAAGCCTTCATCATACAGCACTTCGCTGACAAGG
TGCAGTACCAGTGTGATGGCTTTCTGGAGAAGAAACAAGGACACAGTGAATGAAGAGCAGATCAATGTCCTGAAG
GCCAGCAAGTTGGACCTGCTAGTGGAGCTGTTTCAGGATGAGGAGAAAGTGACCAGTCCAACAGGGACCGCTCCA
GGAGGTCGAACACGACTCAGCGTCAAACCAAAAGAGGCCAGATCTGGAGCAAGCAGCAAGGAGCACAAGAAGACT
GTTGGCTGCCAGTTCCGGAACTCTCTGGCTATGTTGATGGAGACTCTGAATGCAACCACTCCTCACTATGTGCGC
TGCATCAAG – 1809 pb
>Cabeça7
CTGGTGGGTGAGAATGACCTCACAGCTCTCAGCTACCTGCACGAGCCTGCTGTCCTGCACAACCTCAAAGTCCGC
TTCACCGAGTCCAATCACATCTACACATACTGTGGCATTGTGCTGGTGGCCATCAACCCCTACGAGCAGCTGCAA
ATCTATGGAGAGGAGGTCATCAATGCCTACAGTGGGCAGAACATGGGAGACATGGACCCCCACATCTTTGCTGTT
GCTGAGGAGGCATACAAGCAGATGGCCAGAGATGAGAGGAACCAATCCATCATAGTAAGTGGAGAGTCAGGGGCA
GGGAAGACCGTCTCTGCTAAGTACGCCATGCGGTTCTTCGCCACTGTGGGAGGGTCAGCTAACGACACCAATGTT
GAGGAGAAGGTGCTGGCCTCCAGCCCCATCATGGAAGCTATTGGGAAATGCGAAAACCAACTCGCAACGACAAAC
AGCAGTCGGTTTTTGGGAAGTACATCCAGATTGGTTTNGACAGGAGTTATCACATCATAGGAGCCAACATGCGCA
CGTATCTGCTGGAGAAGTCAAGGGTAGTCTTTCAGGCAGAGGATGAGAGGAATTACCACATCTTCTACCAGCTGT
GTGCCTCGGCTAGCTTGCCGGAGTTCAAAGACCTAGCCTTGAAAGCCAGTGCAGAGGACTTCATCTTCACATCAC
AAGGAGAGAACATCTTCATTGAGGGGGTTAATGATGCTGAGGACTTTGAGAANACGAGAGAAGCCTTTACGTTAC
TGGGTGTTAATGACAGCAATCAAAGCAGCATATTCAGAATCATAGCTTCCATCCTGCATCTTGGGAAATGTGGAG
ATCTGCTCGGAGAGAGACCGGAGACTCCTGCCACATATTAAAGAACGACCCCTCACTTGGCACATTTTTGCCAGT
TGCTGGGGGTGGAGCTGGAGCAGATGGAGCACTGGCTATGTCACAGGAANGCTGGTTACCACGTCAGAGACCTAC
GTCAAGAACATGNTCTCGCAAACAGGCAGCTAATGCACGCGACGCACTCGCCAAGCACATCTACGCCCACATGTT
TGACTGGATCGTGGAGTACGTCAACNAGTCCCTGCACACCTCCTCCAAACAACACTCTTTCATTGGTGTTCTGGA
CATCTACGGATTTGAGACCTTTGAAATAAACAGCTTTGAGCAGTTCTGCATCAACTACGCCAATGAGAAACTTCA
GCAGCAGTTCAACCAGCATGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAGTATTTGAAGGAGCAGATTCCCTGGACTCTGAT
AGACTTCTATGATAACCAGCCATGTATCAACCTCATAGAGGCCAAGATGGGGGTACTCGACCTACTGGATGAATG
AGGAGTGCAAGGTGCCAAAAGGGACAGATCAGAACTGGTGCCCAGAAGCTGTACGATCGCCTATCAAGCAGCGTC
CATTTCCAGAAACCACGGATGTCCAACACATCTTTCATTGTCATTCACTTTGCTGATAAGGTTGAGTACCAGTGT
GACGGGTTCCTGGAGAAGAACAGAGACACTGTCTACGAGGAACAGATTAACATTCTGAAGGCCAGCAAGTTCCAG
CTCATGGCAGATCTGTTCCAGGACACTAATAAAGACAGCAGCATTTCCACATCTTCCTCCAGCAAGTCCTCCAGG
GTCAACGTGCGGGCGTCCAAACCAACACCCAAAGTCCCCAACAAGGAGCATAGGAAAACCGTGGGCCACCAGTTC
CGTAGCCCCCTGCAGCTTCTCATGGAGACCCTGAATGCCACCACCCCCCACTATGTGCGCTGCATCAAG – 1794
pb
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
86
>Pescoço1
AATGCAACCACTCCTCACTATGTTCGCTGCATCAAGCCCAACGACCTCAAGTTCCCCTTCACGTTTGACCCTAAG
CGAGCGGTGCAGCACCTCANAGCCTGTGGTGTTCTGGAGACCATCCGCATCTCAGCCGCAGGCTTCCCATCCAGA
TGGACCTACCAGGAGTTCTTCAGTCGTTACCGGGTTCTGATGAAGCAGAAGGACGTCCTGTCGGACAGGAGGCTG
ACCTGTAGGAACGTCCTGGAGAAACTGGTGCAGGACCAGGACAAGTACCAGTTTGGTAAGACTAAGATCTTCTTC
AGGGCTGGTCAGGTTGCCTACCTGGAGAAGCTGAGGGCTGATAAGCTGAGGAAGGCGTGCGTCCGTATCCAGAAG
ACCATCCGCTGCTGGCTGGTACGCAAGAAGTACCTCCGAAAGAAGCATCTGCCATCACCATCCAGAGATACACCC
GCGGACACCAGGCCCGCTGTCTGGGTTAAGTACATGCGTCAGACCCTGGCAGCCATCACTATCCAGAAGTTCCAG
AGGATGTGTGTCCAGAGGAAAGTGTACCTACAGAAGCAGGCTGCTGCCCTGGTCATGCAGACTATCCTCAGAGCG
TACATGGCCCGACAGAAATACCAAGGGTTGCTGCGTAACCACAAAGCTGTGTTCATCCAGAAACACGTGCGTGGC
TGGCTGGCCAGACAGCGGTACAAGCGCTCCCTGCGAGCCATCGTCTATATGCAGTGCTGCATCAGGAGGATGAAG
GCCAAGAAAGAGCTGAAGAAGCTGAAAATCGAGGCCCGCTCCGTTGAAC – 799 pb
>Pescoço2
ACTGTTGGCTTGCCAGTTCCGGAACTCTCTGGCTATGTTGATGGGAGACTCTGAATGCAACCACTCCTCACTATG
TTCGCTGCATCAAGCCCAACGACCTCAAGTTCCCCTTCACGTTTGACCCTAAGCGAGCGGTGCAGCAGCTCAGAG
CCTGTGGTGTTCTGGAGACCATCCGCATCTCAGCCGCAGGCTTCCCATCCAGATGGACCTACCAGGAGTTCTTCA
GTCGTTACCGGGTTCTGATGAAGCAGAAGGACGTCCTGTCGGACAGGAGGCTGACCTGTAGGAACGTCCTGGAGA
AACTGGTGCAGGACCAGGACAAGTACCAGTTTGGTAAGACTAAGATCTTCTTCAGGGCTGGTCAGGTTGCCTACC
TGGAGAAGCTGAGGGCTGATAAGCTGAGGAAGGCGTGCGTCCGTATCCAAAAGACCATCCGCTGCTGGCTGGTAA
GCCAAGAAAGTACCTCCGAAAGAAGCATGCTTGCCATCACCATCCAGAGATACACCCGCGGACACCAGGCCCGCT
GTCTGGTTAAGTACATGCGTCAGACCCTGGCAGCCATCACTATCCCAGAAGTTCCAGAGGATGTGTGTCCAGAGG
AAAGTGTACCTACAGAAGCAGGCTGCTGCCCTGGTCATGCAGACTATCCTCAGAGCGTACATGGCCCGACAGAAA
TACCAAGGGTTGCTGCGTAACCACAATGCTGTGTTCATCCAGAAACACGTGCGTGGCTGGCTGGCCAGACAGCGG
TACAAGCGCTCCCTGCGAGCCATCGTCTATNTGCAGTGCTGCATCAGGAGGATGAAGGCCAAGAAAGAGCTGAAG
AAGCTGAAAATCGAGGCCCGCTCCGTTGAAC – 856 pb
>Pescoço4
AATGCAACCACTCCTCACTATGTTCGCTGCATCAAGCCCAACGACCTCAAGTTCCCCTTCACGTTTGACCCTAAG
CGAGCGGTGCAGCAGCTCAGAGCCTGTGGTGTTCTGGAGACCATACGCATCTCAGCCGCAGGCTTCCCATCCAGA
TGGACCTACCAGGAGTTCTTCAGTCGTTACCGGGTTCTTGATGAAGCAGAAGGACGTCCTGTCGGACAGGAGGCT
GACCTGTAGGAACGTCCTGGAGAAACTGGTGCAGGACCAGGAACAAGTANCCAGTTTGGTAAGACTTAAGATCTT
CTTCAGGGCTGGTCAGGTTGGCCTACCTGGAGAAGCTGAGGGCTGATAAGCTGAGGAAGGCGTGCGTCCGTATCC
AGAAGACCATCCGCTGCTGGCTGGTACGCAAGAAGTACCTCCGAAAGAAGCATTGCTTGCCATCACCATCCAGAG
ATACACCCGTGGACACCAGGCCCGCTGTCTGGTTAAGTACATGCGTCAGACCCTGGCAGCCATCACTATCCAGAA
GTTCCAGAGGATGTGTGTCCAGAGGAAAGTGTACCTACAGAAGCAGGCTGCTGCCCTGGTCAATGCAGACTATCC
TCAGAGCGTACATGGCCCGACAGAAATACCAAGGGTTGCTGCGTAACCACAAAGCTGTGTTCATCCAGAAACACG
TGCGTGGCTGGCTGGCCAGACAGCGGTACAAGCGCTCCCTGCGAGCCATCGTCTATCTGCAGTGCTGCATCAGGA
GGATGAAGGCCAAGAAAGAGCTGAAGAAGCTGAAAATCGAGGCCCGCTCCGTTGAAC – 807 pb
>Pescoço5
AATGCAACCACTCCTCACTATGTTCGCTGCATCAAGCCCAACGACCTCAAGTTCCCCTTCACGTTTGACCCTAAG
CGAGCGGTGCAGCAGCTCAGAGCCTGTGGTGTTCTGGAGACCATCCGCATCTCAACCGCAGGCTTCCCATCCAGA
TGGACCTACCAGGAGTTCTTCAGTCGTTACCGGGTTCTGATGAAGCAGAAGGACGTCCTGTCGGACAGGAGGCTG
ACCTGTAGGAACGTCCTGGAGAAACTGGTGCAGGACCAGGACAAGTACCAGTTTGGTAAGACTAAGATCTTCTTC
AGGGCTGGTCAGGTTGCCTACCTGGAGAAGCTGAGGGCTGATAAGCTGGAGGAAGGCGTGCGTCCGTATCCAGAA
GACCATCCGCTGCTGGCTGGTACGCAAGAAGTACCTCCGAAAGAAGCATGCTGCCATCACCATCCAGAGATACAC
CCGTGGACACCAGGCCCGCTGTCTGGTTAAGTACATGCGTCAGACCCTGGGCAGCCATCACTATTCCAGAAGTTC
CAGAGGACGTGTGTCCAGAGGAAAGTGTACCTACAGAAGCAGGCTGCTGCCCTGGTCATGCAGACTATCCTCAGA
GCGTACATGGCCCGACAGAAATACCAAGGNNTGNTGCGTAACCACAAGGCTGTGTTCATCCAGAAACACGTGCGT
GGCTGGCTGGCCAGACAGCGGTACAAGCGCTCCCTGCGAGCCATCGTCTATCTGCAGTGCTGCATCAGGAGGATG
AAGGCCAAGAAAGAGCTGAAGAAGCTGAAAATCGAGGCCCGCTCCGTTGAAC – 802 pb
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
87
>Pescoço3
AATATGACACCATAGAATACTCAAGCTATGCATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCG
GCCGCACTAGTGATATCCCGCGGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGT
CGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGATGGGATCCCCTTCACGTTTGACCCTAAGCGAGCGG
TGCAGCAGCTCAGAGCCTGTGGTGTTCTGGAGACCATCCGCATCTCAGCCGCAGGCTTCCCATCCAGATGGACCT
ACCAGGAGTTCTTCAGTCGTTACCGGGTTCTGATGAAGCAGAAGGACGTCCTGTCAGACAGGAGGCTGACCTGTA
GGAACGTCCTGGAGAAACTGGTGCAGGACCAGGACAAGTACCAGTTTGGTAAGACTAAGATCTTCTTCAGGGCTG
GTCAGGTTGCCTACCTGGAGAAGCTGAGGGCTGATAAGCTGAGGAAGGCGTGCGTCCGTATCCAGAAGACCATCC
GCTGCTGGCTGGTACGCAAGAAGTACCTCCGAAAGAAGCATTGCTGCCATCACCATCCAGAAATACACCCGTGGA
CACCAGGCCCGCTGTCTGGTTAAGTACATGCGTCAGACCCTGGCAGCCATCACTATCCAGAAGTTCCAGAGGATG
TGTGTCCAGAGGAAAGTGTACCTACAGAAGCAGGCTGCTGCCCTGGTCATGCAGACTATCCTCAGAGCGTACATG
GCCCGACAGAAATACCAAGGGTTGCTGCGTAACCACAAAGCTGTGTTCATCCAGAAACACGTGCGTGGCTGGCTG
GCCAGACAGCCGGTACAAGCGCTCCCTGCGAGCCATCGTCTATCTGCAGTGCTGCATCAGGAGGATGAAGGCCAA
GAAAGACCTGAAGAAGCTGAAAATCGAGGCCCGCTCCCTTGAACATTTCAAGAAACTTAACATTGGCATGGAAAA
CAAGATCATGCAGCTGCAA – 994 pb
>Pescoço6
AATGCAACCACTCCTCACTATGTTCGCTGCATCAAGCCCAACGACCTCAAGTTCCCCTTCACGTTTGACCCTAAG
CGAGCGGTGCAGCAGCTCANAGCCTGTGGTGTTCTGGAGACCATCCGCATCTCAGCCGCAGGCTTCCCATCCAGA
TGGACCTACCAGGAGTTCTTCAGTCGTTACCGGGTTCTGATGAAGCAGAAGGACGTCCTGTCGGACAGGAGGCTG
ACCTGTAGGAACGTCCTGGAGAAACTGGTGCAGGACCAGGACAAGTACCAGTTTGGTAAGACTAAGATCTTCTTC
AGGGCTGGTCAGGTTGCCTACCTGGAGAAGCTGAGGGCTGATAAGCTGAGGAAGGCGTGCGTCCGTATCCAGAAG
ACCATCCGCTGCTGGCTGGTACGCAAGAAGTACCTCCGAAAGAAGCATGCTGCCATCACCATCCAGAGATACACC
CGTGGACACCAGGCCCGCTGTCTGGTTAAGTACATGCGTCAGACCCTGGCAGCCATCACTATCCAGAAGTTCCAG
AGGATGTGTGTCCAGAGGAAAGTGTACCTACAGAAGCAGGCTGCTGCCCTGGTCATGCAGACTATCCTCAGAACG
TACATGGCCCGATAGAAATACCAAGGGTTGGCTGCGTTAACCACAAAAGCTGTGTTCATCCAGAAACACGTGCGT
GGCTGGCTGGCCAGACAGCGGTACAAGCGCTCCCTGCGAGCCATCGTCTATCTGCAGTGCTGCATCAGGAGGATG
AAGGCCAAGAAAGAGCTGAAGAAGCTGAAAATCGAGGCCCGCTCCGTTGAAC – 802 pb
>CaudaVa
TAGAAGTGGGGCAGATGGAGAACATATCCCCANGACAGATCATCGATGAGCCTATCCGGCCGGTCAACATTCCCC
GGAAAGAAAAGGATTTCCAAGGGATGCTGGAGTACNAGCGGGAGGACGAACAGAAGCTTGTTAAGAACCTGATTC
TAGAACTAAAGCCACGTGGTGTGGCTGTCAATCTGATTCCAGGGTTACCGGCATATATCTTGTTTATGTGTGTGC
GACATGCCGACTACCTGAACGATGATCAGAAAGTAAGATCATTGCTGACATCAACAATTAACAGCATCNAAAAAG
TCCTGAAGAAAAGAGGTGACGATTTTGAAACTGTCTCCTTCTGGCTCTCTAACACATGTCGATTTTTGCACTGTT
TGAAGCAATATAGTGGAGAAAAGGGNTTCATTGAAACACAAAACGTCTCCCAGAATGAACACTGGCCTCACCAAT
TTTGANCTTGCTGAGTNTCGGAANTNCTGANTTGATTGGGCATTCANATNNTTNAATAGCTTGTGAGNGTGTNNG
AAAAAATTTTTTTAACNCATGATAATCCCCANGGGTTGCTCANACCATTGAAACAAAATCCNGGNGTTTTNTCGG
GGGTGAAAGCCCCCCCGGGCCNCANAAAAGCCNNAACCCCCCATTATCCCTGNGTGGA – 658 pb
>CaudaVb
TTTCCCCATTCAAGACGTTGTAAAACGACCGGCCCAGTTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGC
CCGACGTCGCAATGCTCCCGNCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTTGAGAGTATCCAGGGGCTGTCAGGGG
TGAGGCAAACTGGCTACCGGAAGCGCTCGTCCAGCATGGTGGACGGAGAAAATTCGTATTGCCTGGAGGCCATCA
TCCGCCAGATGAATTTCTTTCATACAGTCCTGTGTGACCAGGGCCTGGACCCTGAGATTATCCTGCAGGTGTTCA
AACAGCTTTTCTACATGATCAATGCGGTGACTCTTAACAACCTACTCCTGCGGAAAGATGCCTGCTCCTGGAGCA
CCGGCATGCAACTCAGGTACAACATAAGTCAACTCGAAGAGTGGCTTCGGGGAAAAAACCTTCAGCAGAGTGGAG
CGGTTCAGACCATGGAGCCCTTGATCCAGGCAGCCCAACTCCTTCAGCTGAAGAAGAAGACCCAGGAGGATGCTA
ATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGA
GTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGGCGTAATCATGGTCATAAGCTGTTTCCTGGGTGAAAATTGTTATC
CCCAAAAA – 683 pb
Análise da expressão de miosinas da classe V em diferentes tecidos e órgãos de Oncorhynchus mykiss
88
>CaudaVc
GAGCTTATGANCATTGNNANNACGTTAGNAAGCCAGGCTCTNCNNNTGGAAGATNNTNNGAACATTTTGAANTGA
AGATGGGAGAACTTTGGTTTGCTTANNNNAAGGACTTAAANNNAAAGCNAACTCGCNTTTCTGGAGACCCNNNTT
TCCAGTCTCAGAANGGATTGCNTATGAAAAAGAGATTGAAGGTCTGAACTTCNAAAGTCGTGCATCCTGAGNCCA
AGAAATCAACCACCTGCAGAAGCTGTTCAGAGAAGAGACAGACATCAATGAAAGTATTCGTCATGAAGTCACC
CAGGCTGACAATCAGAAAACATGACTTTAAGCAGCAGATTTCAGAGCTGGAGAGGCAGAAGCAGGATCTCGAATC
CCGCCTGAAGGAGCAGACGGAGAAGATGGAAGGAAAGCAGGAAGAACCATTCAGCCACCTGAACCGAGGCCTAAA
AAAGGAGGGAAGGCAGGGCAAAGCCCCTCGTCCCTTCCTCAGGNGCCGTGNNATCACAGAGCGAGACGCATNCNG
NAANGNNAAGNAAAGGCTTGGTGGGTTTACANNCCAAANAACCCCAGGAAGGTCNNCAAGTTTCCCNAAGAAAGC
GAAGCCNANNCNCTAAGNTGAATTCCGCGGGCCNCCTGCC – 638 pb
Gel de agarose 1% mostrando clone contendo fragmento de miosina V com
aproximadamente 1.800 pb (A) e produto de RT-PCR de 850 pb (B),
correspondentes aos domínios cabeça e pescoço, respectivamente. (M – marcador
de peso molecular de 1 Kb).
2000 pb
850 pb
M
M
A
B
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