( PDF ) Composição química, atividade fitonematicida e inseticidade de Tipi: Petiveria alliacea

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ORGÂNICA

COMPOSIÇÃO QUÍMICA, ATIVIDADE FITONEMATICIDA E INSETICIDA DE

TIPI (Petiveria alliaceae)

JOSÉ NOBERTO SOUSA BEZERRA

FORTALEZA-CEARÁ

2006

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COMPOSIÇÃO QUÍMICA, ATIVIDADE FITONEMATICIDA E INSETICIDA DE

TIPI (Petiveria alliaceae)

JOSÉ NOBERTO SOUSA BEZERRA

DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À COORDENAÇÃO DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO

EM QUÍMICA ORGÂNICA COMO REQUISITO PARCIAL PARA A OBTENÇÃO DO

TÍTULO DE MESTRE.

ORIENTADOR: PROF. Dr. MANOEL ANDRADE NETO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ORGÂNICA

FORTALEZA-CEARÁ

2006

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Ficha catalográfica elaborada pelo Bibliotecário Hamilton Rodrigues Tabosa CRB-3/888

B469c Bezerra, José Noberto Sousa

Composição química, atividade fitonematicida e inseticidade de Tipi:

Petiveria alliacea / José Noberto Sousa Bezerra

112 f. il., color., enc.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2006.

Orientador: Dr. Manoel Andrade Neto

Área de concentração: Química Orgânica e Produtos Naturais

1. Benzaldeído 2. Meloidogyne incognita 3. Bemisia tabaci I. Andrade

Neto, Manoel II. Universidade Federal do Ceará – Mestrado em Química

Orgânica III. Título

CDD 547

Aos meus pais, pelas angústias e

preocupações que passaram por

minha causa, por terem dedicado suas

vidas a mim, pelo amor, carinho e

estímulo que me ofereceram, dedico-

lhes essa conquista como gratidão.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, pela força infinita durante toda a minha vida, ajudando a alcançar os

meus objetivos.

Agradeço a ajuda grandiosa de meu orientador, Andrade, pela paciência, amizade e

respeito com que sempre me acolheu.

Agradeço a meus professores que sempre souberam me encaminhar nos estudos;

A todos os colegas do Curso Pós-Graduação em Química pelo apoio e estímulo para

que eu chegasse até aqui.

Aos funcionário(a)s, Lana, Mundinha, Sr. Paulo, pela a amizade e disposição em

colaborar para que eu concluísse este trabalho.

Ao amigo Francisco Sales, funcionário do Horto de Plantas Medicinais, pelo serviço

de coleta do tipi, pela paciência, companheirismo e pelos momentos de conversas e

descontrações.

Aos amigo(a)s de Laboratório, Nirla Romero, Franciglauber Bezerra, Elton Luz,

Antonio Honório e Marília.

Aos amigos e colegas, Francisco Gonçalves, Raimundo Regivaldo, Francisco Antonio

Lobato, Marcos Aurélio e Helano Luz, pela realização dos testes de atividade biológica.

A minha mãe, Maria Anézia Sousa Bezerra, pelo apoio, incentivo, carinho e

compreensão em todos os momentos de minha vida.

Aos meus irmãos, Nilberto, Cláudio, Clédio, Nádia, Clésia e Natalice por acreditarem

em mim e me apoiarem nesta caminhada.

Ao casal Arão Andrade Filho e Francisca da Silva Andrade, pela amizade fraterna

compreensão e paciência, abrigo em sua casa aos fins de semana.

Agradeço pela amizade que tenho encontrado na, Arneide, Norma Graciela, Jonathan e

Ana Caroline, pessoas de convívio diário as quais tornam o ambiente alegre e agradável.

Em especial, agradeço a minha esposa Ana Beatriz, a qual se empenhou junto comigo

para a conclusão deste trabalho, pois foi compreensiva, amiga e companheira.

A todos aqueles que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

Aos órgãos financiadores BNB, CAPES, PRONEX e FUNCAP, pelo suporte

financeiro. E ao CNPQ pela bolsa concedida.

Sumário

Introdução............................................................................................................01

Capítulo 01 Levantamento bibliográfico

1.1 Considerações botânicas............................................................................. 05

1.2 Levantamento bibliográfico sobre o estudo químico e biológico de P.

Alliaceae ..........................................................................................................05

Capitulo 02 Estudo dos Constituintes Voláteis

2.1 Estudo dos constituintes voláteis das raízes de P. alliaceae ........................16

2.2 Determinação estrutural dos constituintes voláteis das raízes de P.

alliaceae..................................................................................................... 22

2.2.1 Determinação estrutural de PAR-01................................................ 22

2.2.2 Determinação estrutural de PAR-02................................................ 32

Capítulo 03 Determinação Estrutural

3.1 Determinação estrutural dos constituintes químicos não-voláteis das

raízes de P. alliaceae............................................................................... 38

3.1.1 Determinação estrutural de PAR-03................................................ 38

3.1.2 Determinação estrutural de PAR-04................................................ 47

3.1.3 Determinação estrutural de PAR-05................................................ 57

Capítulo 04 Atividade Biológica de P. alliaceae

4.1 Atividade biológica das raízes de P. alliaceae ......................................... 67

4.1.1 Mosca branca (Bemisia tabaci) ....................................................... 67

4.1.2 Resultados obtidos dos testes de atividade inseticida do óleo

essencial das raízes contra a mosca branca Bemisia tabaci ..............68

4.2 Gorgulho-do-feijão de corda Callosobruchus maculatus.......................... 71

4.2.1 Atividade inseticida do óleo essencial das raízes de P. alliaceae

sobre (Callosobruchus maculatusI)..............................................71

4.3 Nematóides - Meloidogyne incógnita.......................................................72

4.3.1 Testes de atividade nematicida do óleo essencial das raízes de P.

alliaceae sobre M. incognita..............................................................73

Capítulo 05 Parte Experimental

5.1 Material botânico..................................................................................... 77

5.1.1 Raízes.......................................................................................... 77

5.2 Método de análise.................................................................................... 77

5.3 Métodos Espectrométricos.......................................................................78

5.3.1 Espectroscopia na região do infravermelho ..................................78

5.3.2 Espectrometria de massa ............................................................. 78

5.3.3 Espectrometria de ressonância magnética nuclear de Hidrogênio-

1 (RMN

H) e Carbono -13 (RMN

C)........................................78

5.4 Obtenção do óleo essencial das raízes de P. alliaceae.............................. 80

5.5 Obtenção dos extratos das raízes de P. alliaceae...................................... 81

5.6 Fracionamento cromatográfico ................................................................83

5.6.1 Cromatografia de PARE/H........................................................... 83

5.6.2 Cromatografia de PARE/HF2....................................................... 84

5.6.3 Cromatografia de PARE/HF2.1.................................................... 85

5.6.4 Cromatografia de PAR-OE .......................................................... 85

5.6.5 Cromatografia de PARE/EtOAC..................................................86

5.6.6 Cromatografia de PARE/EtOH das raízes de P. Alliaceae ............ 88

5.7 Obtenção de PAR-05...............................................................................91

5.8 Ensaios de atividade inseticida e nematicida do óleo essencial das raízes

de P. alliaceae......................................................................................... 91

5.8.1 Atividade inseticida do óleo essencial das raízes de P. alliaceae

contra B. tabaci biotipo B ............................................................91

5.8.1.1 Origem da população de Bemisia tabaci biótipo B

(mosca branca) ..............................................................91

5.8.1.2 Criação massal da mosca branca....................................92

5.8.1.3 Preparação das soluções ................................................92

5.8.1.4 Ensaios de atividade inseticida.......................................92

5.8.2 Atividade inseticida do óleo essencial das raízes de P. alliaceae

sobre o Callosobruchus maculatus ...............................................93

5.8.2.1 Origem dos insetos Callosobruchus maculatus ..............93

5.8.2.2 Ensaios de atividade inseticida.......................................93

5.8.3 Atividade nematicida do óleo essencial das raízes de P. alliaceae

contra M. incognita ......................................................................94

5.8.3.1 Obtenção de juvenis de M. incognita .............................94

CONCLUSÃO......................................................................................................95

CONSTANTES FISICAS E DADOS ESPECTROMÉTRICOS DAS

SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DE P. ALLIACEAE..............................................97

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 104

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Fotografia de Petiveria alliaceae – Tipi ................................................... 06

Figura 02 Cromatograma do óleo essencial das raízes de P. alliaceae coletada no

Horto de Plantas Medicinais, no Campus do Pici ..................................... 18

Figura 03 Cromatograma do óleo essencial das raízes coletadas no Horto de Plantas

Medicinais, Campus do Pici, 30 dias após a extração ............................... 18

Figura 04 Cromatograma do óleo essencial das raízes de P. alliaceae coletada em

Canafístula............................................................................................... 19

Figura 05 Espectro de massa do benzaldeido ........................................................... 21

Figura 06 Espectro de massa do cinamaldeido ......................................................... 21

Figura 07 Espectro de massa do trans-estilbeno ....................................................... 21

Figura 08 Espectro de massa do dissulfeto dibenzila................................................ 21

Figura 09 Espectro de absorção na região do infravermelho (filme) de PAR–01 ...... 26

Figura 10 Espectro de RMN

C -BB [125 MHz, CDCl

] de PAR–01...................... 26

Figura 11 Espectro de RMN

C – DEPT 135° [125 MHz, CDCl

] de PAR–01 ....... 26

Figura 12 Espectro de RMN

H [500 MHz, CDCl

] de PAR–01 .............................. 27

Figura 13 Espectro RMN

H expandido na região de aromático [500 MHz, CDCl

]

de PAR-01............................................................................................... 27

Figura 14 Espectro bidimensional de correlação homonuclear

H x

H-COSY [500

MHz, CDCl

] de PAR-01......................................................................... 28

Figura 15 Espectro bidimensional de correlação heteronuclear HMQC [500 e 125

MHz, CDCl

] de PAR–01........................................................................ 29

Figura 16 Espectro bidimensional de correlação heteronuclear HMBC [500 e 125

MHz, CDCl

] de PAR–01........................................................................ 30

Figura 17 Espectro de massa obtido por impacto eletrônico (70 eV) de PAR–01...... 31

Figura 18 Espectro de RMN

H [500 MHz, CDCl

] de PAR–02 .............................. 34

Figura 19 Espectro de expansão de RMN

H em 7,8 a 6,8 ppm, [500 MHz,

(CDCl

)] de PAR–02 ............................................................................... 34

Figura 20 Espectro de RMN

C - BB [125 MHz, CDCl

)] de PAR-02 ................... 35

Figura 21 Espectro de RMN

C – DEPT 135° [ 125 MHz, CDCl

)] de PAR–02 ..... 35

Figura 22 Espectro de massa obtido por impacto eletrônico (70 eV) de PAR–02...... 36

Figura 23 Espectro de absorção na região do infravermelho (filme) de PAR–03 ...... 40

Figura 24 Espectro de RMN

H [500 MHz, CHCl

] de PAR–03 .............................. 41

Figura 25 Espectro de RMN

C BB [500 MHz, CHCl

] de PAR–03 ....................... 42

Figura 26 Espectro de RMN

C – DEPT 135º [500MHz, CHCl

] de PAR–03......... 43

Figura 27 Espectro de massa obtido por impacto eletrônico (70 eV) de PAR–03...... 43

Figura 28 Espectro bidimensional COSY [500 MHz, CHCl

] de PAR–03................ 44

Figura 29 Espectro bidimensional de HMQC na região de aromático [500 MHz,

CHCl

], de PAR–03................................................................................. 45

Figura 30 Espectro bidimensional HMBC [500 e 125, MHz, D

O] de PAR–04........ 46

Figura 31 Espectro de absorção na região de infravermelho (Pastilha de KBr) de

PAR-04.................................................................................................... 50

Figura 32 Espectro de RMN

H [500 MHz, DMSO) de PAR-04.............................. 51

Figura 33 Espectro de RMN

C [125 MHz, DMSO) de PAR-04............................. 52

Figura 34 Espectro RMN

C DEPT 135º [125 MHz, DMSO) de PAR-04 .............. 53

Figura 35 Espectro bidimensional de correlação homonuclear

H x

H-COSY

[500MHz, DMSO) de PAR–04 ................................................................ 54

Figura 36 Espectro bidimensional de correlação heteronuclear HMQC [500, 125

MHz, DMSO] de PAR–04 ....................................................................... 55

Figura 37 Espectro bidimensional de correlação heteronuclear HMBC [500 e 125

MHz, DMSO] de PAR-04........................................................................ 56

Figura 38 Espectro de RMN

H [500 MHz, D

O] de PAR-05 .................................. 60

Figura 39 Espectro de expansão de RMN

H [500 MHz, D

O] de PAR–05.............. 61

Figura 40 Espectro de RMN

C BB [MHz, D

O] de PAR–05 ................................. 62

Figura 41 Espectro de COSY [500 MHz, D

O] de PAR-05...................................... 63

Figura 42 Espectro de correlação heteronuclear de HMQC [500, 125 MHz, D

O] de

PAR–05................................................................................................... 64

Figura 43 Espectro de HMBC [500, 125 MHz, D

O] de PAR–05 ............................ 65

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Estudo químico e biológico dos compostos isolados de P. alliaceae......... 09

Tabela 2 Composição química do óleo essencial das raízes de P. alliaceae ............ 20

Tabela 3 Dados comparativos de RMN

C e

H (125 e 500MHz, CDCl

). de

PAR-01 com os dados literatura............................................................... 23

Tabela 4 Dados de RMN bidimensional (HMQC e HMBC) de PAR–01, ............... 24

Tabela 5 Dados comparativos de RMN

C de PAR-02 com os dados da literatura. 33

Tabela 6 Dados referentes aos deslocamentos químicos de carbono de PAR-03

comparados com os da literatura .............................................................. 39

Tabela 7 Dados comparados de RMN

C e

H de PAR-04 com os dados

encontrados na literatura .......................................................................... 48

Tabela 8 Dados de RMN bidimensional (HMQC e HMBC) de PAR–04 ................ 49

Tabela 9 Dados de RMN bidimensional (HMQC e HMBC) de PAR–05 ................ 58

Tabela 10 Dados comparados de RMN

C de PAR-04 com os dados encontrados

na literatura.............................................................................................. 59

Tabela 11 Avaliação da atividade inseticida do óleo essencial das raízes de P.

alliaceae sobre adultos de Bemisia tabaci,. .............................................. 68

Tabela 12 Avaliação da atividade inseticida do óleo essencial das raízes de P.

alliaceae sobre o número de ovos postos de Bemisia tabaci,.................... 69

Tabela 13 Avaliação da atividade inseticida do benzaldeido sobre adultos de

Bemisia tabaci, biótipo B......................................................................... 69

Tabela 14 Avaliação da atividade inseticida do benzaldeido sobre o número de ovos

postos de B. tabaci, biótipo B................................................................... 60

Tabela 15 Número de insetos mortos 24h após aplicação do óleo essencial das

raízes da P. alliaceae ............................................................................... 72

Tabela 16 Avaliação da atividade nematicida do óleo essencial das raízes de P.

alliaceae coletado no Horto de Plantas Medicinais................................... 74

Tabela 17 Teste de atividade nematicida do óleo essencial das raízes de P.

alliaceae, 30 dias após a extração. ........................................................... 74

Tabela 18 Atividade nematicida dos constituintes isolados do óleo essencial do tipi

na concentração de 0,5 g/L....................................................................... 75

Tabela 19 Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de PARE/H............... 79

Tabela 20 Junção das frações da coluna de PARE/H que apresentaram Rfs

semelhantes ............................................................................................. 80

Tabela 21 Dados referente ao tratamento cromatográfico da fração PARE/HF2 ....... 80

Tabela 22 Junção das frações segundo a semelhança dos seus Rfs............................ 81

Tabela 23 Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de PAR-OE............... 86

Tabela 24 Junção das frações da coluna de PAR-OE que apresentaram Rfs

semelhantes ............................................................................................. 86

Tabela 25 Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de PARE/EtOAc....... 87

Tabela 26 Dados referentes a junção das frações de PARE/ EtOAc .......................... 88

Tabela 27 Tratamento cromatográfico de 3,2g do extrato etanólico (PARE/EtOH)... 89

Tabela 28 Dados referente a junção das frações do (PARE/EtOH) ........................... 90

LISTA DE FLUXOGRAMA

FLUXOGRAMA 01 - Obtenção dos constituintes voláteis das raízes de P. alliaceae..... 80

FLUXOGRAMA 02 - Obtenção dos extratos das raízes de P. alliaceae......................... 82

LISTA DE SIGLAS

CCD Cromatografia em Camada Delgada

COSY

H Correlation Spectroscopy

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

EM Espectro de Massa

IE Impacto Eletrônico

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HMQC Heteronuclear Multiple Quantun Correlation

P. F. Ponto de Fusão

RMN

H Ressonância Magnética Nuclear de prótio

RMN

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

IV Infravermelho

δ Deslocamento Químico

BOD Demanda Bioquímica de Oxigênio

CCDP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa

RESUMO

Este trabalho descreve o estudo dos componentes voláteis e não voláteis das raízes de

Petiveria alliaceae, incluindo as atividades nematicida e inseticida do óleo essencial.

Para o estudo químico, fitonematicida e inseticida utilizou-se as raízes da planta, das

quais foram obtidos o óleo essencial e os constituintes não-voláteis.

Do óleo essencial das raízes foram identificados os seguintes componentes:

benzaldeido (61,5%) (constituinte majoritário) dissulfeto de dibenzila (18,1%), trans-

estilbeno (14,1%) e cinamaldeido (6,3%), sendo que esses dois últimos compostos também

foram isolados através de cromatografia em camada delgada preparativa e identificados por

RMN

H e

O tratamento cromatográfico dos extratos etanólico, acetato de etila e hexânico

permitiu o isolamento de uma mistura de duas mercaptanas, dissulfeto de dibenzila e o

trissulfeto de dibenzila, dissulfeto de dibenzila, uma alantoina e a sacarose, que pela primeira

vez foram isoladas das raízes de Petiveria alliaceae. As mercaptanas isoladas são conhecidas

na literatura por suas atividades fungicidas e nematicida.

O óleo essencial extraído das raízes de P. alliaceae e seus constituintes foram

submetidos aos ensaios de atividades nematicida contra larvas de Meloidogyne incognita

(nematóide de galhas) e inseticida contra a Mosca branca (Bemisia tabaci) inseto do feijão

(Callosobruchus maculatus). Os óleos essenciais obtidos de P. alliaceae coletadas nas duas

localidades diferentes apresentaram significantes atividades inseticida e nematicida.

Os constituintes isolados tiveram suas estruturas elucidadas através de métodos

espectrométricos de IV, EM, RMN

H e

C uni e bidimensionais (COSY, HMQC e HMBC).

ABSTRACT

This work describes the study of the volatile and the non-volatile components from the

roots of Petiveria alliaceae, including the nematicidal and insecticidal activities of the

essential oil.

The following components were identified in the essential oil: benzaldehyde as the

major constituent (61, 5 %), cinnamaldehyde (6, 3%), dibenzyl disulphide (18, 1%), trans-

stilbene (14, 1%). The two last compounds were also isolated through a chromatography in a

preparative thin layer identified by RMN

H and

The isolation of a mixture of two mercaptans, benzyl disulphide and dibenzyl

trisulphide, saccharose and allantoin, which were isolated for the first time from the Petiveria

alliaceae, was permitted by the chromatographic treatment of the ethyl acetate, hexane, and

ethanolic extracts. The isolated mercaptans are known in literature for their fungicide and

insecticide activities.

The constituents of the essential oil, extracted from the roots of Petiveria alliaceae,

were submitted to the nematicidal activities against Meloidogyne incognita larva, insecticide

against white fly (Bemisa tabaci) and insect of the beans (Callosobruchus maculatos).

Significant insecticidal and nematicidal activities were present in the essential oil from the P.

alliaceae, collected in two different localities.

The isolated constituents had their structure elucidated through spectrometric methods

of IV, EM, RMN

H and

C uni and bi-dimensional (COSY, HMQC and HMBC)

Introdução

INTRODUÇÃO

Petiveria alliaceae (Fitolacaceae), conhecida popularmente por: tipi, erva de guiné,

pipi, dentre outros, é originária da África e foi trazida para o Brasil pelos escravos. É bastante

utilizada na medicina popular, essa planta habita locais úmidos e sombrios e apresenta odor

característico de alho. Esta espécie tem sido amplamente utilizada nas práticas medicinais

caseiras, sendo recomendado o uso externo contra afecções bucais e infecções da garganta na

forma de chá por infusão. É também utilizada em aplicação tópica localizada no combate a

contusões, traumatismo, dores lombares, reumáticas e de cabeça [LORENZI, 2002].

Este trabalho relata o estudo da composição química do óleo essencial e dos extratos:

etanólico, acetato de etila e hexânico das raízes de Petiveria alliaceae. Relata também a

atividade inseticida do óleo essencial e de alguns constituintes isolados contra Bemisia tabaci

e Callosobruchus maculatus, além da atividade nematicida contra larvas de Meloidogyne

incógnita. Os espécimes estudados foram coletados no Horto de Plantas Medicinais Francisco

José de Abreu Matos no Campus do Pici, na localidade de Canafístula, distrito de Apuiarés-

CE e na Serra de Maranguape-CE.

A planta foi coletada em localidades diferentes, Maranguape (Serra), Canafístula

(sertão) e no Horto de Plantas Medicinais Dr. Francisco José de Abreu Matos no Campus do

Pici (planta cultivada).

Para a obtenção do óleo essencial das raízes de P. alliaceae foi utilizada a técnica de

hidrodestilação. Foi realizado o estudo comparativo dos óleos essenciais das raízes coletadas

na localidade de Canafístula e no Horto de Plantas Medicinais, do tipi coletado em

Maranguape não foi possível obter os constituintes voláteis, pois, a quantidade de raízes foi

pequena, foi realizado apenas o estudo dos constituintes fixos.

O extrato volátil obtido das plantas coletadas no Horto de Plantas Medicinais foi

detectado quatro compostos, no óleo essencial dos espécimens coletados na comunidade de

Canafístula apresentaram sete compostos.

A investigação dos constituintes não-voláteis foi feita a partir dos extratos hexânico,

acetato de etila e etanólicos.

O tratamento cromatográfico do extrato hexânico resultou no isolamento de uma

substância, a qual havia sido isolada no óleo essencial das raízes do tipi, que foi denominada

PAR-01. Esta foi identificada, através de análise espectroscópica e consulta à literatura

(BENEVIDES et al, 2001), como dissulfeto de dibenzila [4].

Com o tratamento cromatográfico do extrato acetato de etila foi possível isolar uma

substância que, após analises espectrométricas e consulta à literatura [BENEVIDES et al,

2001], foi identificada como uma mistura de duas mercaptanas, o dissulfeto de dibenzila e

trissulfeto de dibenzila [5].

Através do tratamento cromatográfico do extrato etanólico, inclusive por exclusão

molecular LH-20, foram obtidas duas substâncias: um sólido solúvel em dimetil sufóxido

(DMSO) denominado PAR-04 que foi identificado por espectrometrias de RMN

C e

I.V. e por consulta à literatura [FERREIRA et al., 2000] e um composto denominado PAR-05,

que foi identificado como sacarose (BEHNKE, 1993). Os compostos isolados e identificados

são mostrados no quadro 01, pag. 4.

O óleo essencial foi submetido a ensaios de atividades, nematicida contra larvas de

“Meloidogyne incognita” microrganismo que ataca as raízes das plantas e inseticida contra

Bemisia tabaci, mosca branca, inseto que ataca várias culturas inclusive a folha do meloeiro,

Callosobruchus maculatus, gorgulho do feijão-de-corda, inseto que danifica a semente do

feijão, mostrando-se significativamente ativo em ambos os ensaios.

A composição química do óleo essencial apresentou quatro constituintes, dois dos

quais foram identificados com auxílio da literatura como sendo o benzaldeído e o

cinamaldeído. A determinação dos outros dois compostos foi realizada através do isolamento

por cromatografia e identificados por RMN e comparação à literatura. Todos os compostos

identificados foram submetidos a ensaios de atividade nematicida.

Para o gorgulho do feijão-de-corda analisou-se a atividade inseticida do óleo em

insetos adultos de no máximo 24 horas de idade, apresentando atividade bastante promissora.

Este trabalho encontra-se dividido em cinco capítulos como mostrado a seguir:

O capítulo 01 está constituído de levantamento bibliográfico dos estudos químicos e

biológicos e uma breve consideração botânica;

O capítulo 02 apresenta o estudo da composição química e identificação dos

constituintes voláteis das raízes de P. alliaceae;

O capítulo 03 discorre sobre a determinação estrutural dos compostos isolados dos

extratos acetato de etila e etanólico das raízes de P. alliaceae;

O capítulo 04 reúne todos os resultados obtidos sobre atividade inseticida e

nematicida do óleo essencial e de seus constituintes;

O capítulo 05 descreve o procedimento experimental e as técnicas utilizadas para

isolamento, identificação, realização dos testes de atividades inseticida e nematicida;

Quadro 01 - Substâncias isoladas das raízes de Petiveria alliaceae neste trabalho.

Trans-1,2-difenileteno [03]

β-D-Frutofuranosil α-D-glucopiranosideo [β-D-Fruf-(2 1)-α-D-Glcp] –

[01]

Trissulfeto de dibenzila [05]

Dissulfeto de dibenzila

]

2,5

dioxo

(imidazolidinil)

uréi

[02]

O N

N H

Capítulo 01

Capítulo 01Capítulo 01

Capítulo 01

Levantamento Bibliográfico

Levantamento BibliográficoLevantamento Bibliográfico

Levantamento Bibliográfico

Figura 01:

fotografia do Tipi

Fonte: internet

1.1 CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS

A família Fitolacaceae consta de 17 gêneros e 80

espécies distribuídas predominantemente pela América do Sul,

com algumas espécies distribuídas pela Austrália, África e

Havaí. No Brasil ocorrem 9 gêneros, 5 dos quais estão

representados na região Amazônica. [READER, 1961].

Petiveria alliaceae é conhecida popularmente por: guiné, erva-

de-guiné, tipi, erva-de-tipi, erva-de-pipi, pipi, tipi-verdadeiro,

amansa-senhor, raiz de congonha, raiz-do-congo e mucuracaá.

De acordo com LORENZI [2002],

Petiveria alliaceae é uma herbacea ereta, perene, rizomatosa,

toda a planta especialmente a raiz cheira a alho, com aproximadamente

70cm de altura. Ramos delgados, compridos, quase eretos ou ascendentes.

Folhas curtamente pecioladas, alternas, membranosas, inteiras elípticas,

oblongas ou obovais, agudas ou compridas no ápice, estritamente na base,

escassamente pubescentes ou glabras, de 3-12 cm de comprimento por

2,5-5 cm. de largura, atenuada na extremidade livre, lisa e flores discretas,

dispostas em longas inflorescências racemosas. Possui hábito persistente

em algumas regiões, se tornado difícil de ser erradicada. O fruto é uma

cápsula pequena cuneiforme e dotada de espinhos que lhe servem de meio

de disseminação por se prenderem em animais e roupas de transeuntes.

1.2 LEVANTAMENTO BIBLIOGRAFICO SOBRE O ESTUDO QUÍMICO E

BIOLÓGICO DE P. ALLIACEAE.

Através do levantamento bibliográfico a respeito da espécie Petiveria alliaceae,

verificou-se que têm sido isolados vários compostos pertencentes a diversas classes; a parte

aérea mostrou-se rica em flavonóides [MONACHE et al., 1992] e as raízes demonstram ter

grandes quantidades de mercaptanas [BENVIDES et al., 2001]. Com base nos relatos da

literatura, observou-se que a parte da planta que apresenta maior atividade biológica são as

raízes.

Dentre ás várias espécies de Petiveria, a P. alliaceae, conhecida popularmente por tipi,

é a que tem despertado maior interesse fitoquímico por seu uso na medicina popular como

anti-reumática, anti-espasmódica, sudorífera e diurética [LORENZI, 2002]. O extrato

alcoólico das raízes (frações metanólica e butanólica) e o extrato hidroetanólico apresentaram

atividade anticâncer quando testados em ratos. Vale ressaltar que o extrato hidroetanólico

apresentou-se duas vezes mais potente, nesse tipo de doença, do que as outras duas frações

[MALPEZZI et al., 1994]. O extrato das raízes do tipi mostrou decrescimento da ação do

sistema nervoso central e o extrato das folhas apresentou hiperexcitabilidade [CIFUENTES et

al., 2001]. O extrato metanólico apresentou atividade citotóxica em células cancerígenas

hepatocelular [RUFFA et al., 2002].

Dentre as plantas utilizadas na medicina popular da Guatemala no tratamento de

infecção causada por protozoário, Petiveria alliaceae é bastante empregada na forma de

extrato, sendo que o extrato hexânico das raízes apresenta atividade contra Trypanosoma cruzi

[BERGER et al., 1998]. O extrato metanólico das sementes desta planta causa aumento da

freqüência e amplitude das contrações uterinas [OLUWOLE et al., 2000]. De acordo com

Oliveira et al., [2004] os extratos hidroalcoólico, acetato de etila e hexânico das raízes do tipi

revelaram atividade analgésica quando testado em camundongo. Suas raízes demonstraram

ação analgésica e antiinflamatória na forma de extrato, testado em camundongo [LOPES-

MARTINS et al., 2002].

Os extratos acetato de etila e diclorometano apresentaram-se ativos contra o vírus que

causa doença no gado [RUFFA et al., 2002]. O trissulfeto de dibenzila, composto isolado das

raízes do tipi, apresentou atividade inseticida contra Cylas formicarius alegantulus, inseto que

ataca a batata doce; Cylas formicarius e Hipotenemus hampei, insetos conhecidos como broca

do café e Boophilus micropulus, acaro que ataca o gado [JOHNSON et al., 1997].

Segundo PONTE et al., [1996] as raízes do tipi na forma de chá apresentaram

acentuado potencial nematicida contra Meloidigyne incognita. O anidrido sulfônico, composto

sintético derivado do trissulfeto de dibenzila que foi isolado das raízes do tipi, apresentou

atividade anti-microbiana em Bacillus subtilis e Pseudomonas fluorescens. O anidrido

mostrou-se mais potente do que os agentes antimicrobianos comerciais e o seu precursor,

trissulfeto de dibenzila [WILLIAMS et al., 2003].

Estudos dos constituintes voláteis das raízes da P. alliaceae descritos na literatura

revelam que 13 compostos foram identificados, correspondendo a 97% dos constituintes

presentes, tendo o benzaldeído aparecido como composto majoritário (48,3%) [AYEDUON et

al., 1998]. Nos constituintes voláteis das inflorescências da mesma espécie foram

identificados apenas 3 compostos, correspondendo a 93,1% dos constituintes presentes no

óleo; novamente, o benzaldeído foi o constituinte majoritário (54,8%) [ZOGHBI et al., 2002].

Os estudos dos constituintes isolados descritos na literatura destacam-se as

mercaptanas e os tioaminiácidos (Tabela 01, pag. 9). O estudo fitoquímico das raízes de P.

alliaceae descrito na literatura relata o isolamento de sete mercaptanas com atividade

fungicida e o trissulfeto de dibenzila apresentou atividades inseticida, acaricida, neurotóxica e

citostática [JOHNSON et al.,1997, DE SOUSA et al., 1990 e BENEVIDES et al., 2001].

REFERENCIAS

BENVIDES et al

2001

BENVIDES et al

2001

BENVIDES et al

2001

BENVIDES et al

2001

“

KUBEC et al, 2001

PARTE DA PLANTA

Raiz

“

ATIVIDADE

Fungicida

Fungicida, Acaricida

Inseticida, Citotóxica

Neurotoxica, imunomodulatória

Fungicida

Tabela 01 – Estudo químico e biológico dos compostos isolados de P. alliaceae

SUBSTÂNCIA

Dissulfeto de dibenzila

Trissulfeto de dibenzila

Dissulfeto de dipropila

Sulfeto de dibenzila

Tetrassulfeto de dibenzila

Sulfeto de

benzilhidroximetila

Di (benziltritio] metano

(RcRs)-S-sulfoxido-S-benzil

–

cisteina

(RcSs)-S-sulfoxido-S-benzil

–L-cisteina

Nº

DE SOUSA et al, 1990

BENVIDES et al,

2001

“

MONACHE et al, 1990

“

MONACHE et al, 1990

MONACHE et al, 1992

“

KUBEC et al, 2005

Raiz

Folha

“

Raiz

Folha

“

Raiz

N-metil-metoxi-prolina

6-formil-8-metil-7-O-

metilpinocembrin

6-hidroximetil-8-metil-O-7-

metilpinocembrin

6-hidroximetil-8-metil-O-5,7-

metilpinocebrin

7-dimetileridal

Chalcona-leridal

4-etilpetiveral

Petiveral

Acido Barbinevic

3-epiilexgenina A

Cis-3,5-difenil-1,2,4-tritiolan

(Sc

Rs)-γ-glutamil-S-

benzilcisteina sulfòxido

KUBEC et al, 2005

“

William, et al. 2003

Raiz

Derivado do trissulfeto

de dibenzila

fungicida

(Sc

Ss)-γ-glutamil-S-

benzilcisteina sulfòxido

(RsRc)-S-(2-

hidroxietil)cisteina sulfoxido

(R)-S-(2-hidroxietil)cisteina

(SsRc)-S-(2-

hidroxietil)cisteina sulfoxido

Benziltritiohidroxietano

(Sc

-γ-glutamil-S-

benzilcisteina

anidrido sulfônico

(03)

(04)

(05)

(06)

(07)

S OH

(08)

S S

(09)

(10)

R=:

R O

R=:

(11)

O-

OCH

(12)

OOH

OHC

(13)

OOH

(14)

(15)

(16)

(17)

(18)

(19)

(20)

(21)

S S

(22)

NH OH

OHO

(23)

O OH

(24)

(25)

(26)

(75)

(28)

O OH

(29)

(30)

O R

Capítulo 02

Capítulo 02Capítulo 02

Capítulo 02

Estudo dos Constituintes

Estudo dos Constituintes Estudo dos Constituintes

Estudo dos Constituintes

Voláteis

oláteisoláteis

oláteis

2.1 ESTUDO DOS CONSTITUINTES VOLATEIS DAS RAIZES DE P. alliaceae

Os óleos essenciais são produtos vegetais armazenados em órgãos especiais de

excreção; estes são responsáveis pelo aroma de diversas plantas. São formados por misturas

complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, odoríferas e geralmente, líquidas. [SIMÕES,

1999]

Os constituintes voláteis são de grande importância na função biológica da planta,

podendo atuar como proteção contra predadores, proteger contra perda de água, atuar como

inibidores de germinação e atração de polinizadores. Os constituintes voláteis têm sido de

grande importância nas industrias, utilizados como flavorizantes, repelentes, conservantes e

antioxidantes [SIMÕES, 1999].

Os constituintes de óleos essenciais estão envolvidos em todos os aspectos da interação

planta-micróbio, planta-planta, planta-animal. Em se tratando da relação planta-micróbio,

quando infestada por microorganismos, ou seja, induzida pelo estímulo de um fluxo de um

arsenal químico estranho, a planta tóxica produz fitoalexinas, numa tentativa de conter o

patógeno. Os óleos essenciais contêm um enorme número de substâncias cuja bioatividade

apenas recentemente começou a ser descrita. A intensificação do estudo biológico dos

constituintes dos óleos resultará na descoberta de produtos que poderão ser usados no controle

de pragas e doenças, substituindo defensivos agrícolas convencionais que têm causado grandes

problemas ao homem e a natureza, dos quais o Brasil é o 3º consumidor mundial

[GONÇALVES, 2003].

O óleo essencial das raízes de P. alliaceae foi extraído por hidrodestilação (Item 5.4,

pag. 76), as quais foram coletadas no Horto de Plantas Medicinais no campus do Pici e na

comunidade de Canafístula-Apuiarés-CE; obteve-se rendimento de 0,04%.

A analise da composição química do óleo foi realizada através de cromatografia gás-

líquido acoplada à espectrometria de massa (CGL/EM). No óleo, foram identificados quatro

compostos através de comparação visual dos respectivos espectros de massa com os da

literatura [ADAMS, 2001], comparação em espectroteca e analise do tempo de retenção. O

dissulfeto de dibenzila e o trans-estilbeno só foram identificados após o isolamento por

cromatografia e determinação estrutural realizada por Ressonância Magnética Nuclear de

Hidrogênio-1 e Carbono-13 (RMN

H e

C). Dentre os compostos identificados do óleo, o

benzaldeído apresentou-se como constituinte majoritário (61,5%) [Fig. 05, pag. 18]. Os demais

compostos foram: trans-estilbeno (18,1%) [Fig. 07, pag, 18], dissulfeto de dibenzila (14,1%),

[Fig. 08, pag. 18] e o cinamaldeído (6,3%) [Fig. 06, pag. 18], totalizando 100% dos picos

apresentados no cromatograma do óleo analisado [Fig. 02, pag, 15].

Após análise, o óleo foi armazenado a baixa temperatura e submetido à nova analise por

CG/EM após 30 dias. Através do cromatograma do óleo analisado obtiveram-se apenas dois

picos [Fig. 03, pag 15], concluindo-se que sua composição química havia sido alterada, pois

estavam presentes apenas dissulfeto de dibenzila (73,7%) e o trans-estilbeno (26,3%), estando

ausentes o benzaldeído e cinamaldeído.

Foi também realizada a extração do óleo essencial das raízes da planta coletada em

Canafístula. Utilizando o mesmo processo, o óleo foi analisado e armazenado. Neste óleo

foram observados sete compostos em sua composição química [Fig. 04, pag.16], dos quais três

foram identificados como: benzaldeído (53,8%), dissulfeto de dibenzila (29,7%) e trans-

estilbeno (13,3%), correspondendo a 96,8% dos constituintes presentes no óleo.

Dados da literatura revelaram que o óleo essencial das raízes do tipi coletada no Canadá

apresentou 13 compostos, sendo o benzaldeído o constituinte majoritário (48,3%)

[AYDEDOUN et al., 1998]. Na parte aérea foram identificados 3 compostos (93,1%), sendo que

o mais abundante foi o mesmo das raízes [ZOGHBI et al., 2002]. O estudo da composição

química dos constituintes voláteis das raízes do tipi, coletadas em locais diferentes, e de todas

as partes da planta, mostrou que o benzaldeído é o composto majoritário. Dentre os

constituintes voláteis das raízes, verificou-se que a composição química apresenta variação no

número de compostos e na quantidade do constituinte majoritário (Tabela 02, pag.17).

Figura 02: Cromatograma do óleo essencial das raízes de P. alliaceae coletada no Horto de Plantas Medicinais no

Campus do Pici

Figura 03: Cromatograma do óleo essencial das raízes coletada no Horto de Plantas Medicinais Campus do Pici

30 dias após a extração.

Figura 04: Cromatograma do óleo essencial das raízes de P. alliaceae coletada em Canafístula.

%PAINF-OE

[ZOGHBI

et al 2002].

54,8

18,0

20,3

93,1

%PAR-0E

[AYDEDON

et al, 1998]

48,3

6,8

23,3

2,5

0,4

0,3

0,2

2,0

1,3

0,6

9,4

1,5

97,4

T. R.

8.85

19.78

34.31

39.48

%PAR-OE

HORTO

61,4

6,3

14,0

18,3

100

I.K

969

1677

1981

%PAR-OE

CANAFÍSTULA

53,8

13,3

29,7

96,8

SUBSTÂNCIAS

benzaldeido

cinamaldeido

tras-estilbeno

dissulfeto de dibenzila

álcool benzílico

p-cresol

borneol

geraniol

acetate de geranila

2,5-dimetoxi-p-cimeno

cis-estilbeno

benzoate de dibenzoíla

trissulfeto de dibenzila

feniltiol

fitol

Tabela 02 – Composição química do óleo essencial de Petiveria alliaceae

Nº

TOTAL

Figura 05: Espectro de massa do benzaldeido.

Figura 06: Espectro de massa do cinamaldeido

Figura 07: Espectro de massa do trans-estilbeno

igura 08:

Espectro de massa do dissulfeto

dibenzila

2.2 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DOS CONSTITUINTES VOLÁTEIS DAS

RAÍZES DE P. ALLIACEAE

2.2.1 Determinação estrutural de PAR-01

Através do tratamento cromatográfico do óleo essencial das raízes de P. alliaceae foi

possível isolar uma substância líquida de cor amarelo claro, solúvel em clorofórmio e

homogênea em CCD, sendo denominada de PAR–01.

O espectro de absorção na região do infravermelho [Fig. 9, pag. 25] exibiu banda

centrada em 3061 cm

-1

de deformação axial de C-H aromático. Mostrou banda em 2921cm

-1

de deformação axial de C - H alifático; deformação axial de C = C aromático em 1494 e 1453

-1

; exibiu uma banda de deformação axial fraca em 468 cm

-1

, caracterizando a presença da

ligação S-S (SILVERSTEIN,2000).

O espectro de RMN

C-BB [Fig. 10, pag. 26] de PAR–01 exibiu cinco linhas

espectrais, quatro na região de carbonos sp

e com deslocamentos químicos entre 137,64 –

127,45 ppm. A análise comparativa do padrão de hidrogenação DEPT 135° [Fig. 11, pag. 26]

com o espectro de carbono RMN

C – BB revelou a presença de um carbono não-

hidrogenado δ

137,64 ppm, três sinais para carbonos sp

(CH) e um sinal de carbono

metilênico (CH

) em 43,95 ppm.

O espectro de RMN

H [Fig. 12, pag. 27] revelou dois sinais: δ

3,68 ppm (s, 2H)

relativos a “H” ligados a carbonos sp

, um sinal na faixa de δ

7,42 – 7,30 ppm (m, 5H)

característico de hidrogênios (Hs) aromáticos monossubstituídos. O espectro de RMN

[Fig. 13. pag. 27], expansão na região de aromático revela sinais sobrepostos, podendo assim

caracterizar como um multipleto.

As correlações heteronuclear H x

C – HMQC [Fig 15, pag. 29] e homonuclear

H x

H – COSY [Fig. 14, pag. 28] confirmaram a presença do CH

e, também através da

correlação HMBC [Fig 16, pag. 30], garantiu a posição do CH

vizinha ao anel aromático.

O espectro de massa [Fig. 17, pag. 31] revelou o pico do íon molecular M

246 e um

fragmento correspondente ao pico base de m/z 91, característico do cátion benzila, o que

novamente garante a presença do “CH

“ ligado ao anel aromático.

Baseado no conjunto de informações discutidas anteriormente, foi possível propor

uma estrutura de uma substância aromática e simétrica e a comparação com os dados da

literatura nos levou à confirmação da estrutura do dissulfeto de dibenzila, mercaptana já

isolada do tipi [BENEVIDES et al., 2001].

Tabela 03 - Dados comparativos de RMN

C e

H (125 e 500MHz, CDCl

) de PAR-01 com os dados

encontrados na literatura (BENEVIDES et al., 2001).

# C *δ

PAR–01 **δ

dissulfeto

de dibenzila

PAR–01 ** δ

H -

dissulfeto

de dibenzila

137,63

136,71

02/06

127,81

127,80

7,42 - 7,30

7,32 m

03/05

128,73

7,42 - 7,30

7,32 m

129,66

129,56

7,42 - 7,30

7,32 m

43,44

43,15

3,68 s

4,05 s

* CDCl

125 e 500MHz ** CDCl

75 e 300MHz

Tabela 04 - Dados de RMN bidimensional (HMQC e HMBC) de PAR–01, com deslocamento para hidrogênios

do multipleto aromático.

H x

C-HMQC –

H x

C-HMBC –

# C δ

01 137,63 - H-2, H-6, H-7 H-3, H-5

02 129,73 7,42 - 7,30 H-3 H-4, H-6, H-7,

03 128,91 7,42 - 7,30 H-2, H-4 H-5

04 127,81 7,42 - 7,30 H-3, H-5 H-2, H-6

07 43,57 3,68 (s, 2H) - H-2, H-6

Figura 09: Espectro de absorção na região do infravermelho (filme) de PAR–01

3061,45

697,36

1069,34

Figura 10: Espectro de RMN

C -BB [125 MHz, CDCl

] de PAR–03

Figura 11: Espectro de RMN

C – DEPT 135° [125 MHz, CDCl

] de PAR-01

2’

6’

1’

7, C

7’

3, C

3’ (C

5, C

5’)

Figura 12: Espectro de RMN

H [500 MHz, CDCl

] de PAR–01

Figura 13: Espectro RMN

H expandido na região de aromático [500 MHz, CDCl

] de PAR-01

H-2, H-3 e H-4

Figura 14: Espectro bidimensional de correlação homonuclear

H x

H-COSY [500 MHz, CDCl

] de PAR-01

Figura 15: Espectro bidimensional de correlação heteronuclear HMQC [500 e 125 MHz, CDCl

] de PAR-01

Figura 16: Espectro bidimensional de correlação heteronuclear HMBC [500 e 125 MHz, CDCl

] de PAR-01

Figura 17: Espectro de massa obtido por impacto eletrônico (70 eV) de PAR-01

2.2.2 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE PAR-02.

Através do tratamento cromatográfico do óleo essencial das raízes de P. alliaceae foi

isolado um sólido branco, solúvel em clorofórmio, que se apresentou homogêneo em CCD,

com faixa de variação do ponto de fusão entre 121,1 – 121,5 °C, denominado de PAR–02.

O espectro de RMN

H [Fig.18, pag. 34] exibiu dois sinais, um singleto [1H] com

deslocamento químico de 7,18 ppm, característico de hidrogênio ligado a carbono sp

, e um

multipleto [5H] com deslocamento entre 7,60-7,30 ppm, caracterizando a presença de

composto aromático. O espectro RMN

H [Fig.19, pag. 34], revela sinais como tripletes e

dubletos deformados, não permitindo a identificação das constantes de acoplamentos dos

hidrogênios correspondentes de cada sinal.

O espectro de RNM

C – BB de PAR–02 [Fig. 20, pag 35] exibiu cinco linhas

espectrais na região de carbono sp

com deslocamento químico entre 137,54 – 126,75 ppm. O

carbono com deslocamento químico 137,54 ppm, característico de carbono aromático, foi

comparado com o espectro RMN

C - DEPT 135º [Fig. 21, pag. 35], conferindo a existência

do carbono não-hidrogenado e aromático. Os demais sinais são caracterizados como três

carbonos metínicos aromáticos e um olefínico.

O espectro de massa [Fig. 22, pag. 36], obtido por impacto eletrônico, revelou vários

fragmentos, sendo o de razão massa carga m/z 180 o mais importante, que foi caracterizado

como o pico do íon molecular.

Os dados espectrais acima mencionados e comparados com os dados de deslocamento

químico de carbono da literatura [BEHNKE, 1993] nos levaram a concluir que o composto

PAR-02 se tratava de uma substância aromática e simétrica, o trans-estilbeno.

Tabela 05 - Dados comparativos de RMN

C [125 MHz, CDCl

] de PAR-02 com os dados da literatura

[BEHNKE, 1993].

Nº

PAR-02 δ

- trans-estilbeno

01 137,64

137,26

02 129,00

129,63

03 128,90

128,58

04 127,83

127,52

05 126,75

126,44

Figura 18: Espectro de RMN

H [500 MHz, CDCl

)] de PAR–02

Figura 19: Espectro de expansão de RMN

H em 7,8 a 6,8 ppm, [500 MHz, (CDCl

)] de PAR–02.

Figura 20: Espectro de RMN

C - BB [125 MHz, CDCl

)] de PAR–02

Figura 21: Espectro de RMN

C – DEPT 135° [125 MHz, CDCl

] de PAR–02

Figura 22: Espectro de massa obtido por impacto eletrônico (70 eV)de PAR–02

Capítulo 03

Determinação Estrutural dos

Determinação Estrutural dos Determinação Estrutural dos

Determinação Estrutural dos

Constituintes Fixos

Constituintes FixosConstituintes Fixos

Constituintes Fixos

3.1 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS NÃO-

VOLÁTEIS DAS RAÍZES DE P. alliaceae

3.1.1 Determinação Estrutural de PAR–03

Por meio de tratamento cromatográfico do extrato acetato de etila [Item 5.6.6, pag. 86]

foi obtido 9,4 mg de um óleo amarelo, solúvel em clorofórmio e homogênea em CCD,

denominada de PAR–03.

O espectro de absorção na região do infravermelho [Fig. 23, pag. 40] exibiu banda

centrada em 3061cm

-1

, 3028 cm

-1

de deformação axial de C-H aromático; mostrou banda em

2921 de deformação axial de C - H alifático, deformação angular fora do plano da ligação C-

H de aromático em 762 cm

-1

; forneceu bandas de deformação axial em 697, que foi atribuída

a ligação S-C; exibiu também deformação axial em 468, caracterizando a ligação S-S

(SILVERSTEIN, 2000).

O espectro de RMN

C [Fig. 25, pag. 42] exibiu dez linhas espectrais, oito delas na

região de aromático com deslocamento químico entre 137,62 – 127,83 ppm. Pela analise

comparativa do padrão de hidrogenação DEPT 135° [Fig. 26, pag. 43] com o espectro de

carbono RMN

C – BB foi revelada a presença de dois carbonos não-hidrogenados com

deslocamento químico em 137,62 ppm, seis sinais para carbonos metínicos (CH) sp

(129,69;

129,67; 128,86; 128,74; 127,83 e 127,68 ppm) e dois sinais para carbono metilênico (CH

) em

43,55 e 43,41 ppm.

Em relação ao espectro de RMN

H [Fig. 24, pag. 41], ele revelou os sinais δ

4,04

ppm e 3,61 ppm (2s, 4H) relativo a “H” ligados a carbonos sp

; e um sinal δ

7,6 – 7,3 ppm

(m, 10H), característico de hidrogênios (Hs) aromáticos.

O espectro de massa [Fig. 27, pag. 43] revelou os fragmentos de razão massa carga,

dentre eles o de m/z 91 como pico base, característico do cátion benzila, 246 e 278, sendo o

ultimo o íon molecular.

Os espectros bidimensionais de PAR-03 Figuras 28, 29, 30; Paginas 44, 45, 46, vieram

para confirmar a estrutura do trissulfeto de dibenzila, vista que os demais dados dos espectros

bidimensionais estão relacionados com o dissulfeto de dibenzila.

Trissulfeto de dibenzila Dissulfeto de dibenzila

Comparando o conjunto de informações fornecidas pelos dados espectrais acima

citados com os dados de deslocamentos químico de carbono e hidrogênios da literatura,

concluiu-se que o composto PAR-03 se tratava de uma mistura de duas mercaptanas, as quais

se diferenciam por um átomo de enxofre, dissulfeto de dibenzila (44,5%) e trissulfeto de

dibenzila (55,5%); as proporções foram determinadas pela integração dos hidrogênios no

espectro de RMN

H. Ambos os compostos haviam sido isolados por BENEVIDES et al

[2001]. As mercaptanas acima mencionadas são compostos que apresentam atividades

biológicas [Tabela 01, pag. 07].

Tabela 6 - Dados referentes aos deslocamentos químicos de carbonos de PAR-03 comparados com os da

literatura [BEHNKE, 1993].

Nº δ

PAR-03 δ

-dissulfeto de dibenzila [ALDRICH, 1993]

01 137,62 137,24

129,69 129,31

03 128,86 128,37

127,83 127,31

07 43,55 43,18

PAR-03 δ

trissulfeto de dibenzila [ALDRICH, 1993]

01’

136,76 136,42

02’ 129,67 129,34

03’

128,74 128,50

04’

127,68 127,46

07’

43,41 43,10

S S

Figura 23

: Espectro de absorção na região do infravermelho (filme) de PAR-03

697

3061,65

1453,45

762,88

2921,63

1494,02

468,72

1229,84

Figura 24: Espectro de RMN

H [500 MHz, CHCl

] de PAR - 03

Figura 25

: Espectro de RMN

C BB [125 MHz, CHCl

] de PAR-03

Figura 26: Espectro de RMN

C – DEPT 135º [125 MHz, CHCl

] de PAR-03

Figura 27

Espectro de massa obtido por impacto eletrônico (70 eV) de PAR

Figura 28: Espectro bidimensional homonuclear COSY [500 MHz, CHCl

] de PAR-03

Figura 29: Espectro bidimensional heteronuclear de HMQC na região de aromático [500 MHz, CHCl

], de PAR-03

Figura 30: Espectro bidimensional HMBC [500 e 125, MHz, CDCl

] de PAR-03

3.1.2 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE PAR–04.

O tratamento cromatográfico do extrato etanólico, inclusive por exclusão molecular

em Sephadex LH-2 das raízes de P. alliaceae, levou ao isolamento da substância denominada

PAR-04, que apresentou-se na forma sólida, com, p.f. 297,4-301,3 °C e solúveis em dimetil

sufóxido [DMSO].

O espectro de absorção na região do infravermelho de PAR-04 [Fig. 31, pag. 50]

revelou bandas agudas centrada em 3.439 e 3.345 cm

-1

, característicos de deformação axial da

ligação de N – H, banda múltipla em 3194 cm

-1

. Foram detectadas três bandas de vibrações de

deformação axial entre 1781 1712 e 1660 cm

-1

, características de carbonilas de anel de cinco

membros. Apresentou banda de deformação axial característica da ligação C – N em 1432 cm

; apresentou bandas de deformação angular fora do plano de N – H em 779, 776 e 708 cm

-1

(SILVERSTEIN, 2000).

O espectro de RMN

H [Fig. 32, pag. 51] revelou cinco sinais, três singletos com

deslocamento químico (δ

10,5, 1H), (δ

8,05,1H) e (δ

5,82, 2H) e dois dubletos, com

constante de acoplamento J = 8,0 e deslocamento químico em 6,97 e 5,24 ppm.

O espectro de RMN

C [Fig.33, pag. 52] exibiu 4 linhas espectrais, as quais foram

realizadas analises comparativas com o padrão de hidrogenação DEPT 135º [Fig. 34, pag. 53],

que indicaram a existência de três carbonos não-hidrogenados com deslocamentos químico

173,4, 157,5 e 156,8 ppm e um carbono metínico (CH) com deslocamento em 62,5 ppm.

O espectro bidimensional de correlação homonuclear COSY [Fig. 35, pag. 54]

apresentou a conectividade dos hidrogênios dos dubletos 5,2 e 6,8 ppm e, através do espectro

de correlação heteronuclear a uma ligação HMQC [Fig. 36, pag. 55], foi confirmada a

presença do carbono com deslocamento 62,2 ppm hidrogenado correlacionando com o

hidrogênio com deslocamento em 5,2 ppm.

Baseado nas informações obtidas e comparadas com os dados de deslocamentos de

carbono e hidrogênio da literatura [FERREIRA et al., 2000], foi possível identificar a

substância PAR-04 como sendo uma alantoina, composto com ação cicatrizante. Foi o

primeiro registro deste composto a ser isolado das raízes do tipi.

Tabela 7 - Dados comparados de RMN

C e

H de PAR-04 com os dados encontrados na literatura

[FERREIRA et al., 2000].

# C δ

PAR–04 δ

C -

Alantoina δ

PAR–04 δ

H -

Alantoina

10,54 (s)

157,5

157,7

8,05 (s)

173,6

173,4

62,5

62,65

5,25(d, J = 8,0 Hz)

5,21(d, J = 8, H)

6,97(d, J = 8,0 Hz)

6,91(d, J = 8, H)

156,8

156,7

5,81 (s)

5,82 (s)

Dados de RMN 125 MHz, DMSO d

50 MHz DMSOd

O N

Tabela 8 - Dados de RMN bidimensional heteronuclear (HMQC e HMBC) [500, 125 MHz, DMSO] de PAR-04.

H x

C-HMQC –

H x

C-HMBC –

# C δ

01 - - - -

02 156,8 - H -3

H-5

03 - - -

04 173,6 - H-3, H-5

H-6

05 62,5 5,81(s) H-6

H-3

06 - - - -

07 157,5 - H-6, H-8

H-5

08 - - - -

O N

Figura 31: Espectro de absorção na região de infravermelho (partilha de KBr) de PAR-04

O N

Figura 32: Espectro de RMN

H [500 MHz, DMSO] de PAR-04

O N

H-3

H-1

H-6

H-5

H-8

Figura 33: Espectro de RMN

C [125 MHz, DMSO] de PAR-04

O N

C-4

C-5

C-7; C-2

Figura 34: Espectro RMN

C DEPT 135º [125 MHz, DMSO] de PAR-04

O N

C-5

Figura 35: Espectro bidimensional de correlação homonuclear

H x

H-COSY [500 MHz, DMSO] de PAR–04.

O N

Figura 36: Espectro bidimensional de correlação heteronuclear HMQC [500, 125 MHz, DMSO] de PAR–04.

O N

Figura 37: Espectro bidimensional de correlação heteronuclear HMBC [500 e 125 MHz, DMSO] de PAR-04

O N

C-5

3.1.3 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE PAR–05

Após a obtenção do extrato etanólico das raízes de P. alliaceae [Item 5.4, pag. 76], o

mesmo forneceu um precipitado que, após sucessivas lavagens com metanol, resultou num

sólido solúvel em água e/ou dimetil sufóxido [DMSO] e com p.f. 171,8-174,2 ºC .

O espectro de RMN

H [Fig 38, pag. 60] revelou 9 sinais, sendo melhor visualizado

suas multiplicidades pelo espectro expandido [Fig. 39 pag. 62], mostra dois dubletos, 5,3 (1H,

d, J=3,6) e 4,1 (1H, d, J= 8,45), constantes relativas a acoplamentos de hidrogênio axial-

equatorial e axial-axial, respectivamente; três tripletos, 3,93, 3,64 e 3,35 ppm (1H, J, 8,45 para

ambos), relativos a hidrogênios de acoplamentos axial-axial, um duplo-dubleto (dd) em 3,44

ppm (1H, J=3,7 e 9,9) constantes relativas de acoplamentos axial-equatorial e axial-axial

respectivamente; os demais sinais são: dois multipletos em 3,70 e 3,78 ppm e um singleto em

3,55 ppm, referentes a carbonos sp

oxigenado.

O espectro de RMN

C-BB [Fig. 40, pag. 62] exibiu 12 linhas espectrais, 3 carbonos

com deslocamentos químicos (61,70; 62,93 e 63,92 ppm), característicos de carbonos

metilênicos oxigenados. Também exibiu 7 linhas espectrais na região de carbonos metínicos

(CH) oxigenados entre 89,92-70,78 e dois sinais em 105,23 e 93,72 ppm, relativos a carbonos

anoméricos.

O espectro de correlação homonuclear COSY [Fig. 41, pag. 63] revelam as correlação

dos hidrogênios dos sinais [5,3 ppm (d) e 3,44 ppm (dd)], [3,64 ppm (t) com 3,44 ppm (dd) e

3,35 ppm (t)] e a correlação do tripleto [3,93 ppm com o dupleto 4,1 ppm] e o multipleto em

3,38 ppm. Com o auxilio dos espectros de correlações heteronuclear HMQC [Fig. 42, pag 64]

e de HMBC [Fig. 43 pag. 65], pôde-se relacionar a ligação dos hidrogênios com deslocamento

em (δ) 5,2; 3,9; 3,7; 3,6; 3,4; 3,3 ppm com os carbonos com deslocamento (δ) em 92, 79, 75,

74, 72 e 70 ppm respectivamente.

Comparando o conjunto de dados fornecidos pelos dados espectrais acima citados com

os dados da literatura, viu-se que se o composto PAR-05 se tratava da sacarose [BEHNKE

1993]. Este composto foi isolado desta espécie pela primeira vez, neste trabalho.

Tabela 9 - Dados de RMN bidimensional (HMQC e HMBC) de PAR-05

H x

C-HMQC H X

C – HMBC δ

# C δ

1 93,72 5,3 (d, J

ax-eq

= 3,7) H-2 H-3

2 72,62 3,49(dd, J

ax-ax

= 9,9; J

ax-eq

= 3,7) H-1, H-3 H-4

3 74,13 3,64(t, J

ax-ax

= 9,7) H-2, H-4 H-2, H-6

4 70,78 3,35(t, J

ax-ax

= 9,45) H-5, H-3 H-6

5 73,95 3,77 (m) H-4, H-6 H-3

6 61,70 3,77 (m) H-5 H-4

1’ 62,93 3,55 (s) - H-3’

2’ 105,23 - H-1’, H-3’ H-4’

3’ 82,92 4,09 (d, J

ax-ax

= 8,75) H-4’ H-1’, H-5’

4’ 75,57 3,93 (t, J

ax-ax

= 8,55) H-3’, H-4’ H-6’

5’ 78,92 3.76 (m) H-4’, H-6’ H-3’

6’ 63,92 3.76 (m) H-5’ H-4’

Tabela 10 - Dados comparados de RMN 13C de PAR-04 com os dados encontrados na literatura

[BEHNKE,1993], para a sacarose.

Nº #C LITERATURA

01 93,72 94,91

02 72,62 73,81

03 74,13 75,31

04 70,78 71,96

05 73,95 75,14

06 61,70 62, 88

1’ 62,93 64,10

2’ 105,23 106,41

3’ 82,92 84,11

4’ 75,57 76,73

5’ 78,92 79,15

6’ 63,92 65,12

Figura 38:

Espectro de RM

H [500 MHz, D

O] de PAR

Figura 39: Espectro de expansão de RMN

H [500MHz, D

O] de PAR-05

Figura 40: Espectro de RMN

C BB [125 MHz, (D

O)] de PAR–05

Figura 41: Espectro de correlação homonuclear COSY [500MHz, D

O] de PAR-05

Figura 42: Espectro de correlação heteronuclear de HMQC [500, 125 MHz, D

O] de PAR–05

Figura 43: Espectro de correlação heteronuclear HMBC [500MHz, D

O] de PAR–05

Capítulo 04

Atividade Biológica

Atividade BiológicaAtividade Biológica

Atividade Biológica

4.1 ATIVIDADE BIOLÓGICA DAS RAIZES DE P. ALLIACEAE

Neste capítulo relatam-se os resultados dos ensaios de atividade biológica do óleo

essencial das raízes de P. alliaceae contra mosca branca (Bemisia tabaci, biótipo B), gorgulho

(Callosobruchus maculatus) e de atividade contra larvas de Meloidogyne incognita. Os testes

de atividade inseticida foram realizados sobre cultura de meloeiro e na semente do feijão-de-

corda.

4.1.1 Mosca branca (Bemisia tabaci) biótipo B.

Os insetos conhecidos como mosca-branca pertencem à Ordem Hemíptera, a qual

inclui, aproximadamente, 126 gêneros e 1156 espécies. Dentre os gêneros mais importantes,

destacam-se: Bemisia, Aleurothrixus, Trialeurodes, Dialeurodes e Aleurodicus. Atualmente, o

gênero Bemisia é o que apresenta maiores problemas para a agricultura, com 37 espécies

conhecidas. A espécie Bemisia tabaci é cosmopolita, originária do sul da Ásia, provavelmente

da Índia ou Paquistão [SOUSA, 2000].

Estes insetos são considerados pragas de importância econômica por atuarem como

vetores de viroses. Segundo COSTA et al.,[1973], em 1963, vinte e cinco viroses tinham

como vetor a mosca B. tabaci. Já são conhecidas 70 diferentes viroses transmitidas pela

mosca branca em todo o mundo. Para alguns pesquisadores, B. tabaci desenvolve-se em altas

temperaturas, tem uma alta capacidade de adaptação em relação às mudanças climáticas e se

multiplicam num grande número de hospedeiros. Em 1977, a ocorrência desta espécie foi

registrada nos estados de: São Paulo, M. Gerais, Goiás, Paraná, Bahia, Pernambuco, Ceará,

Mato Grosso, Rio G. do Norte, Tocantins, Rio de Janeiro e no Distrito Federal, tendo como

principais hospedeiros: melão, tomate, abóbora, berinjela, brócolis, mandioca [SOUSA,

2000].

Com o objetivo de encontrar uma forma alternativa de controlar essa praga, a literatura

revela que o óleo essencial de Vanillosmopsis pohlii foi testado, in vivo, em insetos adultos

sobre folhas de meloeiros cultivados em casa de vegetação e mostrou que o óleo testado

apresentou excelente ação inseticida nas concentrações de 2; 1; 0,5; 0,25 g/L [De

ANDRADE, et al., 2004].

4.1.2 Resultados obtidos dos testes de atividade inseticida do óleo essencial das raízes

contra a mosca branca (Bemisia tabaci)

Foi avaliada a atividade inseticida do óleo essencial das raízes do Tipi, coletadas no

Horto de Plantas Medicinais, contra a mosca branca. O teste foi realizado com o óleo diluído

em diferentes concentrações. Cada concentração (tratamento) foi submetida à avaliação em

quatro repetições (R). Para cada teste, foram avaliados os resultados (mortalidades) em

intervalos de 24h durante 72 horas e comparado com os resultados da testemunhas (água),

medindo-se o percentual médio de moscas mortas neste intervalo de tempo. Ver tabelas

abaixo.

Tabela 11 – Avaliação da atividade inseticida do óleo essencial das raízes de P. alliaceae sobre adultos de

Bemisia tabaci.

Tratamento

Concentração Número de moscas mortas após 72h

R1 R2 R3 R4 %MÉDIO

OETipi 2,00g/L 10 9 10 10

97,5

OETipi 1.00g/L 10 10 10 9

97,5

OETipi 0,50g/L 10 7 10 9

90,0

OETipi 0,25g/L 10 10 10 10

100,0

DMSO 2% 2 5 3 6

40,0

Testemunha 6 10 2 1

47,5

R1, R2, R3, R4 =Número de repetições.

OE Tipi = Óleo Essencial do Tipi

% MÉDIO = Percentagem média de mortalidade

Testemunha = Água destilada

Tabela 12 – Avaliação da atividade inseticida do óleo essencial das raízes de P. alliaceae em função do número

de ovos postos de B. tabaci

Tratamento

Concentração Número de ovos postos após 72h

R1 R2 R3 R4 MÉDIA

OETipi 2,00 g/L 3 3 1 7

3,5

OETipi 1.00 g/L 0 0 0 0

0,0

OETipi 0,50 g/L 0 12 0 2

3,5

OETipi 0,25 g/L 0 0 0 0

0,0

DMSO 2% 109 23 16 63

52,7

Testemunha 59 0 78 35

R1, R2, R3, R4 =Número de repetições

OETipi = Óleo Essencial do Tipi

MÉDIA = média de ovos postos.

Testemunha = Água destilada

O óleo essencial das raízes do tipi foi diluído em diferentes concentrações para

avaliação de sua atividade inseticida contra a mosca branca. O óleo apresentou excelente

atividade inseticida em todas as concentrações. O mesmo aconteceu para avaliação da

oviposição. Diante dos resultados, foram realizados novos testes utilizando o composto

majoritário do óleo, benzaldeido.

Tabela 13 – Avaliação da atividade inseticida do benzaldeido sobre adulto de Bemisia tabaci

Tratamento Concentração Número de moscas mortas após 72h

R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8

% MÉDIO

Benzaldeido 1g/L 7 9 10 8 9 8 9 9

86,25

DMSO 2% 7 7 2 3 7 8 4 7

56,25

Testemunha 0 5 0 0 4 4 8 9

37,50

R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 = Número de repetições

OETipi = Óleo Essencial do Tipi

% MÉDIO = Percentagem média de mortalidade.

Testemunha = Água destilada

Tabela 14 – Avaliação da atividade inseticida do benzaldeido sobre o número de ovos postos de B. tabaci

Tratamento Concentração Número de ovos postos após 72h

R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 MÉDIA

Benzaldeido 1g/L 26 5 0 20 57 52 17 2

22,38

DMSO 2% 63 5 29 41 50 6 5 8

25,88

Testemunha 116 50 100 152 113 51 52 21

81,88

R1, R2, R3, R4 = Número de repetições

OETipi = Óleo Essencial do Tipi

MÉDIA = média de ovos postos

Testemunha = Água destilada

Diante dos resultados mostrados nas tabelas 11 e 12 que revelaram consideráveis

índices de mortalidade dos insetos “mosca branca”, e como os estudos dos constituintes

voláteis “capítulo 02” que mostrou o benzaldeído como “constituinte majoritário” do óleo

essencial. Quando foi testado nas mesmas condições e concentrações que o óleo essencial,

tabela 13 e 14, observou-se que o benzaldeído também apresenta semelhança no índice de

mortalidade dos inseticidas. Conclui-se, então, que tanto o benzaldeido quanto o óleo

essencial encerram atividade inseticida contra a mosca branca, insetos que tem causado

grandes prejuízos aos agricultores.

4.2 Gorgulho-do-feijão de corda (Callosobruchus maculatus).

Callosobruchus maculatus, o gorgulho do feijão-de-corda, vem causando perdas

quantitativa e qualitativa, manifestada por meio de perfuração da semente e causando redução

do peso e diminuindo a capacidade de germinação da mesma. É um outro tipo de inseto que

vem ocasionando grandes prejuízos aos produtores de feijão. Tem aproximadamente 3 mm de

comprimento, apresentando nos élitros manchas amarronzadas que, em repouso, formam um

"X"; vivem cerca de 5 a 8 dias. As fêmeas põem em média 80 ovos nas superfícies dos grãos.

Ao eclodirem, as larvas penetram na semente, alimentando-se do conteúdo interno. Dentro

dos grãos transforma-se em pupa e, após a emergência, o adulto perfura um orifício de saída;

fora dos grãos, reiniciam o ciclo biológico.

De acordo com PASCUAL-VILLALOBOS [2003], que realizou testes com o óleo

essencial Ocimum basilicum, coletados em dezoito locais diferentes, apenas 10 apresentaram

atividades contra o Callosobruchus maculatus. Através da análise dos constituintes voláteis,

verificou-se que esses óleos que apresentaram atividades continham metil chavicol ou

eugenol.

4.2.1 Atividade inseticida do óleo essencial das raízes de P. alliaceae sobre

Callosobruchus maculatus.

A avaliação da atividade inseticida contra o gorgulho foi realizada com insetos adultos

de 24h de idade; utilizaram-se seis insetos para cada tratamento. Os testes foram realizados

em quatro repetições (R). O óleo foi aplicado em 100, 50 e 10 µL e os testes foram avaliados

após 24 horas da aplicação. O resultado foi obtido através da contagem dos insetos mortos e

expresso em percentagem.

Tabela 15 - Número de insetos mortos 24h após aplicação do óleo essencial das raízes da P. alliaceae.

Tratamento Número de insetos mortos 24h após aplicação

Volume (µL) R1 R2 R3 R4 %M. I M

OETipi

100 6 6 6 6 100

OETipi

50 6 6 6 6 100

OETipi

10 1 1 1 1 16,6

CONTROLE 0 0 0 0 0

R1, R2, R3, R4 = Número de repetições;

%M.I.M.= Percentual médio de insetos mortos

%MEDIO= Percentual médio de insetos mortos

OETipi = Óleo Essencial do Tipi.

CONTROLE = Sementes selecionadas ( ausência de insetos)

Como pôde ser observado, nos volumes de 50 e 100 µl do óleo essencial das raízes de

tipi quando aplicadas sobre o gorgulho, causaram 100% de mortalidades dos insetos. O

volume de 10 µl, no entanto, não foi suficientemente letal, haja vista que matou apenas 16,6%

dos insetos após 24 h. Portanto, o óleo no volume de 50 microlitros apresentou-se como

potente agente inseticida, contra gorgulho do feijão de corda.

4.3 Nematóides (Meloidogyne incógnita)

Os nematóides são organismos alongados e afilados em ambos as extremidades,

representando um dos grupos de animais mais numerosos da terra. Acredita-se que existem

cerca de 500.000 espécies de nematóides, podendo ser encontrados desde regiões

extremamente frias até regiões de deserto. Os nematóides causam enormes danos a diversas

culturas, ocasionando grandes perdas na produção agrícola. Conseqüentemente, o controle

desses patógenos é vital para a exploração agrícola comercial, o qual pode ser feito com o uso

de nematicidas sintéticos, resultantes da indústria petroquímica. Essas substâncias podem

contaminar águas subterrâneas, intoxicar agricultores ou deixar resíduos em alimentos, o que

tem ensejado a pesquisa sobre o uso de moléculas menos nocivas ao homem e ao ambiente

[GONÇALVES, 2003].

O Meloidogyne incognita está sendo considerado como o nematóide que causa

maiores prejuízos à cafeicultura; além disso foi também constatado que este nematóide é

problema em inúmeras outras culturas como: tomate, abóbora, algodão, feijão, trigo, etc.

Foram descobertas entre 4 - 5 espécies deste nematóide. Plantas atacadas por nematóides são

caracterizadas pelo baixo vigor e pouco desenvolvimento da parte aérea. Estes sintomas são

reflexos típicos da presença de galhas e de massas de ovos nas raízes.

As raízes infectadas por nematóides apresentam-se engrossadas, com rachaduras e

aspecto de cortiça. Esse sintoma aparece ao longo das raízes, intercalado com partes sadias.

Os nematóides sobrevivem melhor em regiões com temperatura de solo acima de 28°C. M.

arenaria é muito comum em locais com solos arenosos; M. hapla é mais encontrado em clima

ameno e tolera temperatura de solo abaixo de 12°C; M. incognita e M. javanica são mais

cosmopolitas e são bem adaptados às diferentes condições climáticas brasileiras. A espécie de

maior importância é M. incognita que, pela agressividade dos ataques, ocasiona redução na

produção e muitas vezes a morte das plantas.

PONTE [1997] realizou testes preliminares contra M. incognita utilizando o chá das

raízes de P. alliaceae no tomateiro infestado em casa de vegetação, mostrando excelente

atividade nematotóxica.

Outros ensaios foram realizados contra o nematóide M. incognita, sendo que, foi

utilizado o óleo essencial das folhas de Lippia Alba em juvenis de 2º instar, in vitro,

encerrando atividade nematicida do mesmo [GONÇALVES, 2003].

4.3.1 Testes de atividade nematicida do óleo essencial das raízes de P. alliaceae contra M.

incognita.

Para ensaios nematicidas preliminares utilizou-se o óleo essencial das raízes de P.

alliaceae, coletada na comunidade de Canafístula-CE e no Horto de Plantas Medicinais do

Pici. Foram diluídos em solução de H

O/DMSO 2% nas concentrações de 0,25 0,1 e 0,05 g/L

e avaliados durante 72h. Para cada tratamento (concentração) fizeram-se quatro repetições

(R). A cada 24h avaliou-se o número de larvas mortas em cada tratamento. Foram realizados

os ensaios com os óleos separadamente, oriundo da Canafístula e do Horto, e nas mesmas

concentrações, observou-se o mesmo número de mortalidade em cada óleo. Por isso, foram

descritos neste trabalho apenas os resultados do óleo obtido do Horto de Plantas Medicinais,

por apresentar apenas quatro compostos em sua composição química.

Tabela 16 – Avaliação da atividade nematicida do óleo essencial das raízes de P. alliaceae coletado no Horto de

Plantas Medicinais.

R1, R2, R3, R4 = Número de repetições;

%MÉDIO: Percentual médio de larvas mortas

Diante dos resultados expostos na tabela 16, concluímos que o óleo essencial de P.

alliaceae é um nematicida promissor para o combate desta espécie de nematóides, pois

apresentou-se bastante ativo contra as larvas de M. incognita na concentração de 0,1g/L. Os

resultados obtidos possibilitaram a realização de novos ensaios. Através da analise do óleo

por CG/EM após 30 dias da extração, constatou-se que apenas dois compostos estavam

presentes no óleo, o dissulfeto de dibenzila e trans-estilbeno. Foram realizados novos testes

nematicida nas mesmas concentrações do teste anterior, mas desta vez o óleo mostrou-se

inativo diante das larvas de M. incognita.

Tabela 17 - Teste de atividade nematicida do óleo essencial das raízes de P. alliaceae 30 dias após a extração.

R1, R2, R3, R4 = Número de repetições;

%MÉDIO: Percentual médio de larvas mortas

R = Número de repetições

Observa-se que resultado do teste com o óleo após 30 dias, não confere seu alto índice

de mortalidade apresentada no teste anterior. Revelando assim que a atividade nematicida do

óleo está relacionada a constituintes benzaldeído e/ou cinamaldeído. Constituintes que

volatilizaram com o tempo.

Concentração g/L % Juvenis Mortos de Meloidogyne incognita

R1 R2 R3 R4 %MÉDIO

0,25 100 100 100 100

100

0,1 99 99 97

97 98

0,05 30 28 27

29 28

DMSO 2% 0 0 0

0 0

Concentração g/L % Juvenis Mortos de Meloidigyne incognita

R1 R2 R3 R4 %MÉDIO

0,25 1 0 2 2

1,25

0,1 0 0 0 0

Água destilada 0 0 0 0

DMSO 2% 0 0 0 0

Tabela 18 - Atividade nematicida dos constituintes isolados do óleo essencial do tipi na concentração de 0,5 g/L

Substâncias

% Junenis mortas de Meloidogyne incognita

R1 R2 R3 R4 %MÉDIO

Benzaldeido 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Cinamaldeido 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Trans-estilbeno 0,0 0,0 0,0 1,0 0,25

Dissulfeto de dibenzila

0,0 1,0 2,0 0,0 0,75

DMSO % 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

%MÉDIO: Percentual médio de larvas mortas

R = Número de repetições

Os testes realizados com os constituintes químicos do óleo mostraram que o

benzaldeído e cinamaldeído causaram mortalidades de 100% na concentração de 0,5 g/L,

confirmando a inatividade dos outros dois.

O óleo da planta coletada na localidade de Canafístula apresentou atividade

semelhante à atividade do óleo das raízes coletada no Horto de Plantas Medicinais. Baseado

nos cromatograma dos óleos essenciais extraídos das raízes, constatou-se que o cinamaldeído

esteve presente apenas no óleo obtido no Horto de Plantas Medicinais [Tabela 2, pag. 17].

Baseado nos ensaios de atividade nematicida do óleo essencial e das substâncias isoladas,

obteve-se excelente índice de mortalidade provocada pelo óleo, benzaldeido e cinamaldeido.

O óleo essencial das raízes do Tipi coletado na localidade de Canafístula (sem o

cinamaldeído) apresentou atividade nematicida semelhante a do Horto e os testes foram

realizados nas mesmas concentrações. Comparando os índices de mortalidade causada pelas

substâncias isoladas e dos óleos essenciais foi possível à identificação do benzaldeído como

princípio ativo do óleo essencial diante desta espécie de nematóides.

Capítulo 05

Parte Experiment

Parte ExperimentParte Experiment

Parte Experimental

alal

5.1 MATERIAL BOTÂNICO

5.1.1 RAÍZES

Raízes de P. alliaceae foram coletadas na Serra de Maranguape, Horto de Plantas

Medicinais Professor Francisco Jose de Abreu Matos no Campus do Pici, Universidade

Federal do Ceará e na localidade de Canafístula município de Apuiarés-Ceará. A identificação

botânica foi feita por Manoel Andrade Neto, professor de química da Universidade Federal do

Ceará e a exsicata sob o número 35577 encontra-se depositada no Herbário Prisco Bezerra do

Departamento de Biologia da mesma .

5.2 METODO DE ANÁLISE

Na cromatografia de adsorção em coluna, foi empregado como fase estacionária gel de

sílica 60 (Ф 0,063 – 0,200/ Merck) e na cromatografia em camada delgada (CCD), utilizou-se

como fase estacionária gel de sílica 60 F

254

(Merck). No auxilio a purificação das substâncias

isoladas foi utilizado a técnica cromatográfica de peneiramento por exclusão molecular

utilizando como suporte o gel de dextrano sephadex LH – 20. Como fase móvel foram

utilizados os seguintes eluentes: hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, puro ou

como mistura binária de eluição por gradiente. O diâmetro e o comprimento das colunas

utilizadas variaram de acordo com a quantidade de sílica-gel empregada e do material a ser

cromatrografado. Na cromatografia líquido-líquido, partição, foram utilizados os seguintes

solventes: hexano, acetato de etila e etanol.

As substâncias analisadas em cromatoplacas foram reveladas em exposição à luz UV

(radiação ultravioleta) em 254, 312 e 365 nm, obtidos por lâmpada modelo UVSL-25 da

Mineral Light, e por borrifação da solução vanilina (C

) / ácido perclórico (HClO

etanol (C

O), seguido de aquecimento em estufa a 100°C por 5 a 10 minutos.

5.3 MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS

5.3.1 Espectroscopia na região de Infravermelho (IV)

Os espectros de absorção na região do infravermelho (IV) foram obtidos no

Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará, em

espectrômetro PERKIN-ELMER, modelo FT-IR SPECTRUM 1000. utilizou-se partilhas de

brometo de potássio (KBr) para a analise das amostras sólidas e filme em pastilhas de cloreto

de sódio (NaCl) para amostras líquidas.

5.3.2 Espectrometria de Massa (EM)

Os espectros de massa das substâncias isoladas do óleo essencial das raízes de P.

alliaceae foram obtidos em espectrômetro de massa Hewlett-Parckar, modelo Hp-5971 A,

acoplado a cromatógrafo de gás-líquido, modelo Hp-5890 A série II (CG/EM), provido de

coluna capilar DB-5 dimetilpolisiloxano (30m x 0,25mm id), utilizando um gradiente de

aumento de temperatura de 4ºC/min. De 180-200ºC.

5.3.3 Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1 (RMN

H) e

Carbono – 13 (RMN

C).

Os espectros de RMN

H e RMN

C unidimensionais e bidimensionais foram obtidos

em espectrômetros Brucker, modelo Avance DPX-300 e DRX-500, pertencentes ao Centro

Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear (CENAUREMN), do

Departamento de Química Orgânica e Inorgânica (DQOI) da Universidade Federal do Ceará,

operando, nas freqüências, de 300 e 500 MHz para hidrogênio-1 e 75MHz e 125 MHz para

carbono – 13.

As amostras foram dissolvidas nos seguintes solventes deuterados: dimetil sufóxido

[(CD

)

SO], clorofórmio (CDCl

) e água (D

O). Os deslocamentos químicos foram expressos

em partes por milhão (ppm) e referenciado para RMN

H pelo pico de hidrogênio pertencente

a fração não-deuterada do solvente: dimetilsulfoxido

δ 2,5; clorofórmio δ 7,27. Para RMN

C, o padrão foi sinal do carbono-13 em δ 39,78 para o dimetilssulfóxido, em δ 77,23 para o

clorofórmio.

As multiplicidades dos sinais em RMN

H foram indicadas seguindo a convenção: s

(singleto), d (dubleto), dd (duplo dubleto), t (tripleto), m (multipleto). O padrão de

hidrogenação dos carbonos em RMN

C foi determinado através da técnica DEPT

(Distortionaless Enhancement by Polarization Transfer), com ângulo de nutação de 135°, (CH

e CH

com amplitudes em oposição aos CH

) e foi discutido segundo a convenção: C (não-

hidrogenado), CH (carbono metínico) CH

(carbono metilênico). Os carbonos não-

hidrogenados foram caracterizados pela subtração do espectro DEPT 135º pelo HBBD

(Hydrogen Broad Band Decoupled).

5.4 OBTENÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DAS RAIZES DE PETIVERIA ALLIACEAE.

O óleo essencial de P. alliaceae foi obtido empregando o processo de hidrodestilação

em doseador tipo Cleavenger, utilizando 740g de raízes coletadas no Horto de plantas

medicinais. As raízes de P. alliaceae recém coletadas foram colocadas num balão de vidro de

5L, juntamente com 2L de água e mantido por 3h três horas em ebulição. Após este período, a

mistura água/óleo armazenada no doseador foi coletada num frasco limpo e, com o auxilio de

uma pipeta, foi retirada a água; o óleo coletado, foi tratado com sulfato de sódio anidro e

filtrado, fornecendo 0,8mL do óleo (0,04%). Os óleos essenciais obtidos foram analisados em

CG/EM e o resultado da identificação dos constituintes químicos encontram-se na Tabela 02,

p.17.

Fluxograma 01: Obtenção dos constituintes voláteis das raízes de P. alliaceae

Raízes de

P. alliaceae

(740g)

Extração em doseador tipo Cleavenger

Torta / Decocto

Óleo / Água

Decocto

Torta

desprezado

Separação

Óleo / Água

Hidrolato

desprezado

1. Na

(anidro)

2. Filtração

ÓLEO

0,04%

Análise por CG/EM

Identificação e Quantificação

5.4 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DAS RAÍZES DA P. ALLIACEAE

5.5

450g das raízes da P. alliaceae, coletadas na Serra de Maranguape, foram secadas e

trituradas, sendo em seguida submetidas a extração com etanol bruto à temperatura ambiente.

O solvente foi trocado 4 vezes em um intervalo de 24h entre cada troca. Em seguida foram

reunidos e destilados à aproximadamente dois terços do volume total sob pressão reduzida. A

solução restante foi dividida em duas partes, uma foi submetida à partição com hexano,

acetato de etila, sendo em seguida evaporada sob pressão reduzida, gerando assim as frações

PARE/H 720 mg, PARE/EtOAc 358 mg e PARE/EtOH 6 g (Fluxograma 02, pag. 78). A

outra metade foi evaporada sob pressão reduzida, fornecendo 8g do extrato etanólico bruto

denominado PAREtOH.

Fluxograma 02: Obtenção dos extratos das raízes de P. alliaceae

Concentrado fracionado

4 x hexano

4 x acetato de etila

Extrato etanólico

PAREtOH

(8,0g)

Resíduo

PARE/H

(720,0 mg)

PARE/EtOAc

(358,0 mg)

PARE/EtOH

(6,0 g)

P. alliaceae

Raízes (450g)

Etanol

5.6 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO.

5.6.1 Cromatografia de PARE/H

720mg de PARE/H foram misturados à gel de sílica, pulverizados em grau de

porcelana e acondicionados sobre uma coluna de (Φ 1,5cm, h = 16cm), pré-empacotada com

gel de sílica sucessivas eluições com hexano, acetato de etila e metanol, puros e em misturas

binárias com escala crescente de polaridade, forneceu 71 frações de 10mL cada. As frações

entre F1 e F71 foram coletadas com volume de 10 mL, F72 e F73 com 50mL.

Tabela 19 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de PARE/H

FRAÇÕES ELUENTE

PARE/H 1 – 3 HEX. 100%

PARE/H 4 – 6 HEX./EtOAc 05%

PARE/H 7 – 33 HEX./EtOAc 15%

PARE/H 34 – 47 HEX./EtOAc 30%

PARE/H 48 – 59 HEX./EtOAc 50%

PARE/H 60 -71 HEX./EtOAc 80%

PARE/H 72 EtOAc 100%

PARE/H 73 MeOH 100%

Tabela 20 - Junção das frações da coluna de PARE/H que apresentaram Rfs semelhantes

FRAÇÃO SIGLA PESO (g)

1-4

PARE/HF1

11,2

5-6

PARE/HF2

205,2

PARE/HF3

55,4

8-15

PARE/HF4

3,5

16-22

PARE/HF5

80,2

23-28

PARE/HF6

22,2

29-42

PARE/HF7

31,8

43-52

PARE/HF8

11,4

53-57

PARE/HF9

10,5

58-64

PARE/HF11

65-67

PARE/HF12

26,5

68-73

PARE/HF13

22,0

A fração PARE/H, após sucessivas cromatografias, possibilitou o isolamento de uma

substância PAR-01. As frações coletadas (10mL) foram analisadas por CCD e reunidas de

acordo com suas semelhanças, obtendo-se 12 grupos.

5.6.2 Fracionamento de PARE/HF2

A fração PARE/HF2

apresentou-se na forma de óleo de cor amarela. O mesmo foi

submetido a uma nova cromatografia, utilizando os seguintes eluentes: hexano, clorofórmio e

acetato de etila, puros ou como mistura binária em gradiente crescente de polaridade. Obteve-

se 21 frações com volumes de 10 mL.

Tabela 21 - Dados referentes ao tratamento cromatográfico da fração PARE/HF2.

FRAÇÕES ELUENTE

1-2 Hexano 100%

3-13 Hex/CHCl

50%

14-19 CHCl

100%

20-21 Acetato de etila

Tabela 22 - Junção das frações segundo a semelhança dos seus Rfs .

NUMERO FRAÇÃO SIGLA PESO (mg)

1-2 PARE/HF2.1 34,3

2 3 PARE/HF2.2 21,5

3 4 PARE/HF2.3 12,2

4 5 PARE/HF2.4 2,1

5 6 PARE/HF2.5 -

6 7 PARE/HF2.6 -

7 8-12 PARE/HF2.7 29,2

8 13-14 PARE/HF2.8 15,3

9 15-20 PARE/F2.9 4,8

10 21 PARE/F2.10 4,7

A fração PARE/HF2, após serem analisadas por CC e reunidas as frações pela sua

semelhança de rf, destacou-se a fração denominada PARE/HF2.1 que tornou possível a

obtenção de PAR-02 por meio de análise cromatográfica em camada delgada preparativa

(CCDP).

5.6.3 Purificação da fração PARE/HF2.1 para a obtenção de PAR–02

Após a análise em CCD das frações, foi possível reunir as que apresentavam Rf

semelhantes e em seguida evaporá-las à pressão atmosférica. A fração PARE/HF2.1 rendeu

34 mg; quando analisada em CCD observou-se a presença de duas manchas com Rfs distintos.

Esta fração foi submetida a uma cromatografia em ”CCDP” levando a obtenção de 26 mg de

um líquido amarelo solúvel em clorofórmio, após a analise por espectrometria foi identificado

como sendo o mesmo composto PAR – 02, isolado do óleo.

5.6.4 Cromatografia de PAR-OE

276 mg de óleo essencial das raízes de P. alliaceae (PAR-OE) foram acondicionados

sobre uma coluna de (Φ 1,5cm, h = 11cm), pré-empacotada com gel de sílica, realizando

sucessivas eluições com hexano, clorofórmio e acetato de etila puros e em misturas binárias,

com escala crescente de polaridade. Foram coletadas 106 frações de 3 mL cada e reunidas em

frasquinhos pequenos.

Tabela 23 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de PAR-OE

Tabela 24 - Junção das frações da coluna de PAR-OE que apresentaram Rfs semelhantes

Da fração PAR-OEF1 obteve-se 13 mg de um sólido branco e solúvel em clorofórmio

que foi denominado PAR–02.

5.6.5 Tratamento cromatográfico de PARE/EtOAc

358mg de PARE/EtOAc foram misturados em gel de sílica, pulverizado num grau de

porcelana e acondicionados sobre uma coluna de (Φ 1,5cm, h = 16cm), pré-empacotada com

gel de sílica. Após sucessivas eluições com hexano, acetato de etila e metanol puros e em

misturas binárias, com escala crescente de polaridade foram coletadas 186 frações de 10ml

cada.

FRAÇÕES ELUENTES

1 – 29 HEXANO 100%

30 – 49 HEX./CHCl

10%

50 – 65 HEX./CHCl

30%

66 – 77 HEX./CHCl

50%

78 – 94 CHCl

100%

95 – 100 CHCl

/EtOAc 50%

101 – 106 EtOAc 100%

FRAÇÕES SIGLAS PESOS

1 PAR-OEF1 13,0

4-6 PAR-OEF2 21,8

7-11 PAR-OEF3 5,6

12-21 PAR-OEF4 1,6

22-50 PAR-OEF5 5,2

51-55 PAR-OEF6 4,4

56-106 PAR-OEF7 6,5

Tabela 25 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de PARE/EtOAc

FRAÇÕES ELUENTE

1 – 22 HEX./ 100%

23 – 41 HEX./EtOAc 10%

42 – 53 HEX./EtOAc 20%

54 – 65 HEX./EtOAc 30%

66 – 77 HEX./EtOAc 40%

78 – 88 HEX./EtOAc 50%

89 – 98 HEX./EtOAc 60%

99 – 109 HEX./EtOAc 70%

110 – 114 HEX./EtOAc 80%

115 – 134 EtOAc 100%

135 – 145 EtOAc./MeOH 10%

146 – 152 EtOAc./MeOH 20%

153 – 158 EtOAc./MeOH 30%

159 – 163 EtOAc./MeOH 40%

164 – 169 EtOAc./MeOH 50%

170 – 174 EtOAc./MeOH 60%

175 – 186 MeOH 100%

Tabela 26 - Dados referente a junção das frações de PARE/EtOAc

FRAÇÂO SIGLA PESO

1-3 PARE/ EtOAcF1 -

4-5 PARE/ EtOAcF2 9,4

6 PARE/ EtOAcF3 2,1

7-32 PARE/ EtOAcF4 14,1

33-61 PARE/ EtOAcF5 35

62-68 PARE/ EtOAcF6 15,1

69-84 PARE/ EtOAcF7 -

85-93 PARE/ EtOAcF8 7,4

94-121 PARE/ EtOAcF9 81,5

122-150 PARE/ EtOAcF10 -

151-186 PARE/ EtOAcF11 -

As frações foram reunidas através de análise em CCD e o solvente evaporado numa

capela à temperatura ambiente. Na fração PARE/EtOAcF2 foi obtido 9,4 mg de um óleo

amarelo solúvel em CDCl

, denominado PAR – 03.

5.6.6 Cromatografia do extrato etanólico (PARA/ETOH) das raízes de P. alliaceae

3,2g do PARE/EtOH foram misturados em gel de sílica, pulverizado num grau de

porcelana e acondicionados sobre uma coluna de (Φ 1,5 cm, h = 16cm), pré-empacotada com

gel de sílica. Após sucessivas eluições com hexano, acetato de etila e metanol puros e em

misturas binárias, com escala crescente de polaridade, foram coletadas 70 frações de 10ml

cada.

Tabela 27 - Tratamento cromatográfico de 3,2g do extrato etanólico (PARE/EtOH).

Frações Eluente

1 Hexano 100%

2 Hex/acet.10%

3-28 Hex/acet.50%

29-48 Acetato 100%

49-66 Acetato/etanol 50%

67 Etanol

68-70 Metanol

Após comparação através de cromatografia em camada delgada (CCD), foram

reunidas as frações que apresentaram fator de retenção semelhante como mostra a tabela 28.

abaixo.

Tabela 28 - Dados referente a junção das frações do (PARE/EtOH)

NÚMERO FRAÇÕES SIGLAS PESO

01 01 PARE/F1 1,5

02 02 PARE/F2 -

03 03 PARE/F3 64,4

04 4-10 PARE/F4 36,9

05 11-16 PARE/F5 9,1

06 17-20 PARE/F6 10,1

07 21-35 PARA/F7 61,0

08 36-46 PARE/F8 28,8

09 47-48 PARE/F9 12,3

10 49 PARE/F10 9,5

11 50-51 PARE/F11 -

12 52 PARE/F12 30,1

13 53-55 PARE/F13 86,3

14 56-57 PARE/F14 49,5

15 58-64 PARE/F15 185,3

16 65 PARE/F16 96

17 66 PARE/F17 154,4

18 67 PARE/18 383,1

19 68 PARE/19 405

20 69-70 PARE/F20 741,3

A fração PARE/F18 foi submetida à cromatografia em sephadex LH – 20, tendo

metanol como fase móvel. Ela forneceu 13 mg de um sólido com ponto de fusão entre 297,6 –

301 e solúvel em dimetil sufóxido que foi denominado de PAR – 04.

5.7 OBTENÇÃO DE PAR–05

O extrato etanólico bruto foi fracionado por meio de uma partição com hexano e

acetato de etila; após o fracionamento, as mesmas foram concentradas e colocadas em frascos,

limpos, tarados, e armazenado numa geladeira (8 – 10ºC). Um dia após o armazenamento,

observou-se a presença de precipitado na fração etanólica. Após sucessivas lavagens com

metanol, obteve-se 900 mg de um sólido solúvel em água ou dimetil sufóxido (DMSO), o

qual foi denominado PAR-05

5.8 ENSAIOS DE ATIVIDADES INSETICIDA E NEMATICIDA DO ÓLEO

ESSENCIAL DAS RAÍZES DE P. ALLIACEAE

As raízes de P. alliaceae foram coletadas em Canafístula, Maranguape e Horto de

Planta Medicinais Francisco José de Abreu Matos no Campus do Pici. Partes das raízes foram

destinadas para obtenção dos extratos; hexânico, acetato de etila e etanólico, o restante das

raízes foram utilizadas para extração do óleo essencial, dos quais foram realizados analises

em CG/EM e identificados os constituintes químicos presentes. Duas substâncias foram

testadas suas atividades biológicas a partir de amostras comerciais, benzaldeído e

cinamaldeído, e as outras duas, dibenzil dissulfeto e trans-estilbeno, compostos presentes no

óleo obtido no Horto, foram isoladas por métodos cromatográficos, possibilitando assim o

teste de atividade nematicida do óleo e de todas as substâncias presentes. Além do teste de

atividade nematicida, realizou-se teste de atividade inseticida, contra a mosca branca (Bemisia

tabaci) biotipo B e gorgulho do feijão-de-corda (Callosobruchus maculatus).

5.8.1 ATIVIDADE INSETICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS RAÍZES DE P.

ALLIACEAE CONTRA B. TABACI BIÓTIPO B

5.8.1.1 Origem da população de Bemisia tabaci biótipo B (mosca branca).

Os insetos que originaram a criação foram obtidos de um plantio de melão localizado na

estação experimental da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), em

Paraipaba, CE. A colônia é mantida em plantas de meloeiro em uma casa de vegetação da

EMBRAPA, no Campus do Pici, UFC.

5.8.1.2 Criação massal da mosca branca

Os vasos contendo as plantas foram colocados em gaiola de plásticos com dimensões

de 35 cm de altura, 45 cm de comprimento e 32 cm de profundidade. As paredes laterais e a

parte superior da gaiola foram revestidas por um tecido de malha fina conhecida como filó.

Numa mesma gaiola foram mantidos vários vasos com plantas de idades diferentes a fim de

manter a colônia com insetos em diferentes estágios de desenvolvimento. Na mesma casa de

vegetação, foram mantidas plantas isentas de insetos, cujas folhas foram utilizadas nos testes

in vitro.

5.8.1.3 Preparação das soluções

O óleo essencial obtido das raízes da Petiveria alliaceae foi diluído em uma solução

de dimetil-sulfóxido (DMSO) 2% em diferentes concentrações. Da mesma forma foi

preparado uma solução com o benzaldeido, composto majoritário do óleo essencial da P.

alliaceae.

5.8.1.4 Ensaio de atividade inseticida.

Destacaram-se folhas com aproximadamente uma semana de idade e isentas de

insetos. Em seguida, as soluções foram aplicadas na face abaxial destas folhas com auxílio de

um pequeno pulverizador portátil e imediatamente seus pecíolos foram introduzidos

individualmente em pequenos frascos de vidro com água destilada. Cada frasco contendo uma

folha, foi em seguida, colocado no interior de um copo de acrílico transparente de 9,5 cm de

altura 5 e 7 cm de diâmetro inferior e superior, respectivamente. Estes copos foram

parcialmente cobertos com uma película de polietileno, deixando uma abertura por onde

foram introduzidos os insetos adultos (10 em cada folha) o qual foi fechado logo após. Em

seguida, foram mantidos numa incubadora tipo BOD a 25ºC de temperatura e fotoperíodo de

14 horas. Os resultados foram analisados após 72 horas, considerando-se o número de insetos

mortos e o número de ovos postos por folha.

5.8.2 ATIVIDADE INSETICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS RAÍZES DE P.

ALLIACEAE SOBRE O CALLOSOBRUCHUS MACULATUS

5.8.2.1 Origem dos insetos, Callosobruchus maculatus

O gorgulho do feijão-de-corda, Callosobruchus maculatus, utilizados nos ensaios, foi

obtido de uma criação de insetos do laboratório do Departamento de Biologia da Universidade

Federal do Ceará. Todos os insetos utilizados nos ensaios tinham de 0 – 24h de idade sendo

selecionado insetos machos e fêmeas.

Os insetos foram retirados dos frascos (viveiros) um dia antes do teste, os frascos são

limpos para garantir que os insetos presentes no dia seguinte terão no máximo 24 h de vida.

O frasco utilizado para a testemunha não pode ser contaminado, não pode haver

nenhum ovo ou larva do inseto, de modo a ser avaliado corretamente, pois no mesmo será

colocada semente selecionada e averiguado a eclosão de algum inseto durante o período do

teste.

5.8.2.2 Ensaios de atividade inseticida

Para a realização dos ensaios utilizaram-se potes de polipropileno com capacidade de

50mL com pequenos orifícios nas tampas. Colocou-se papel de filtro no fundo do pote com o

mesmo diâmetro da parte inferior interna do pote. Em seguida, com o auxilio de uma pipeta,

colocou-se o óleo essencial no papel de filtro, posteriormente foi colocado uma tela com o

mesmo tamanho do papel de filtro para evitar o contato direto das sementes com o papel

embebido com o óleo essencial. Posteriormente, foram colocadas 200 sementes de feijão de

corda devidamente selecionadas em cada pote, logo após a adição das sementes adicionaram-

se três casais de insetos com idade entre 0 - 24h, em seguida o frasco foi tampado.

Os ensaios foram realizados com quatro tratamentos e quatro repetições cada.

Utilizaram-se quatro tratamentos, variando-se os volumes 100, 50 e 10µL e para o controle

foram utilizadas sementes isentas de insetos.

5.8.3 ATIVIDADE NEMATICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS RAÍZES DE P.

ALLIACEAE CONTRA M. INCOGNITA

5.8.3.1 Obtenção de Juvenis de M. incognita.

Foram coletadas raízes de tomateiro infestadas com nematóides, juvenis de M.

incognita. Em seguida, as massas de ovos foram extraídas de forma manual e postas à

temperatura de 25ºC, durante 24h para que houvesse a eclosão dos juvenis. Após a eclosão, as

larvas de juvenis de M. incognita foram submetidas aos testes com óleo essencial,

benzaldeido, dibenzil dissulfeto, trans-estilbeno e cinamaldeido, em solução com

dimetilsufóxido (DMSO) 2%; os ensaios foram avaliados durante 24h, 48, 72 horas. Foram

realizados 4 tratamentos com 4 repetições para cada teste. Utilizou-se como controle, solução

de DMSO 2% e água destilada.

Capítulo 06

Conclusão

6. CONCLUSÃO

Do estudo dos constituintes voláteis das raízes de P. alliaceae foi possível, identificar,

isolar seus constituintes e realizar os testes de atividades inseticidas e nematicida. Nos testes

de atividades inseticidas foram utilizados os insetos mosca branca e gorgulho do feijão de

corda. E a atividade nematicida foi realizada sobre a larva da espécie de Meloidogyne

incognita. Dos extratos etanólicos, acetato de etila e hexânico das raízes do tipi foi possível

isolar três compostos, dois deles estão sendo descritos pela primeira vez, sendo isolados das

raízes do tipi.

Foi possível realizar o estudo comparativo da composição química do óleo essencial.

Baseado nos dados obtidos e comparados com os dados da literatura detectou-se a nítida

diferença dos constituintes voláteis, levando a crer que a composição muda de acordo com a

região de onde é coletada. No entanto, o benzaldeido apareceu como o constituinte majoritário

do óleo essencial em todos os óleos e de todas as partes da planta.

Após a obtenção do óleo essencial e identificação de seus constituintes, os mesmos

foram submetidos a ensaios de atividades biológicas, através dos quais foi possível determinar

a atividade nematicida contra larvas de Meloidogyne incognita e inseticida contra mosca

branca (Bemisia tabaci) e gorgulho do feijão (Callosobruchus maculatus). O teste nematicida

foi realizado com o óleo e seus constituintes, separadamente. Este teste possibilitou a

identificação o benzaldeido como o princípio ativo do óleo essencial das raízes de P. alliaceae

contra as larvas de nematóides M. incognita. Diante dos resultados obtidos neste trabalho

conclui-se que óleo essencial P. alliaceae apresentou atividades inseticidas e nematicida

contra, Bemisia tabaci, Callosobruchus maculatus e Meloidogyne incognita, respectivamente.

Foi possível isolar cinco substâncias das raízes do tipi, as quais foram identificadas

como: trans-estilbeno e dissulfeto de dibenzila, isoladas do óleo essencial, e trissulfeto de

dibenzila [5], alantoina [2] e sacarose [1] dos extratos.

Capítulo 07

Constantes Físicas e Dados

Constantes Físicas e Dados Constantes Físicas e Dados

Constantes Físicas e Dados

Espectrométricos

Espectrométricos Espectrométricos

Espectrométricos

7.0 CONSTANTES FÍSICAS E DADOS ESPECTROMÉTRICOS DAS SUBSTÂNCIAS

ISOLADAS DAS RAÍZES DE P. alliaceae.

PAR-01

F.M. – C

M.M.- (g/mol) – 246

Aspecto – líquido amarelo dissulfeto de dibenzila

Espectroscopia na região de absorção infravermelho (filme, cm

-1

) – 3061, 2921, 1494,

1453, 1229, 762, 697 e 468.

Espectroscopia de RMN

H [500 MHz, CDCl

] – δ

δδ

δ - (multiplicidade)

7,40 – 7,30 (m), 3,68 (s).

Espectroscopia de RMN

C [125 MHz, CDCl

] – δ

δδ

δ – (padrão de hidrogenação,

correlação estrutural) – 137,79; 129,65; 128,85; 127,81; 43,57.

PAR-02

F.M. – C

M.M. (g/mol) – 180

p.f. – 121,1-121,5 ºC

Aspecto – sólido branco trans-estilbeno

Espectroscopia de RMN

H [500 MHz, CDCl

] – δ

δδ

δ - (multiplicidade)

7,60 – 7,30 (m), 7,18 (s).

Espectroscopia de RMN

C [125 MHz, CDCl

] – δ

δδ

δ – (padrão de hidrogenação,

correlação estrutural) – 137,26; 129,00; 128,90; 127,83; 126,44.

PAR-03

F.M. – C

F.M. - C

M.M.- (g/mol) – 246

M.M.- (g/mol) – 278 dissulfeto de dibenzila trissulfeto de dibenzila

Aspecto – líquido amarelo.

Solubilidade - clorofórmio

Espectroscopia na região de absorção do infravermelho (filme, cm

-1

) – 3061, 2921, 1494,

1453, 1229, 762, 697 e 468.

Espectroscopia de RMN

H [500 MHz, CDCl

] – δ

δδ

δ - (multiplicidade)

7,40 – 7,30 (m), 3,61 (s); 4,01 (s)

Espectroscopia de RMN

C [125 MHz, CDCl

] – δ

δδ

δ – (padrão de hidrogenação,

correlação estrutural) – 137,62; 136,76; 129,69; 129,67; 128,86; 128,74; 127,83; 127,68;

43,55; 43,41.

Obs. os valores de deslocamentos de carbono sublinhados referem-se aos carbonos do

dissulfeto de dibenzila.

S S

PAR-04

F.M. – C

M.M.- (g/mol) - 110

p.f. 297,4 – 301,3 ºC

Aspecto – sólido

Solubilidade – dimetil sufóxido

Alantoina

Espectroscopia na região de absorção do infravermelho (filme, cm

-1

) – 3441; 3346; 3192;

3058; 1781; 1712; 1658; 1530; 1430; 1184; 1059.

Espectroscopia de RMN

H [500 MHz, DMSO] – δ

δδ

δ - (multiplicidade, constantes de

acoplamentos) - 10,54 (s); 8,05 (s); 6,96 (d, J = 8,0); 5,81 (s); 5,24 (d, J = 8,0)

Espectroscopia de RMN

C [125 MHz, CDCl

] – δ

δδ

δ – (padrão de hidrogenação,

correlação estrutural) –173,6 (C-4); 157,5 (C-2); 156,8(C-7); 62,5(C-5);

O N

PAR-05

F.M. – C

M.M. (g/mol) – 342

p.f. –171,8 -174,2 ºC

Aspecto – sólido branco Sacarose

Solubilidade – água e/ou dimetil sufoxido

Espectroscopia de RMN

H [500 MHz, CDCl

] – δ

δδ

δ - (multiplicidade e constantes de

acoplamento) – 5,3 (d, J = 3,70); 4,10 (d, J = 8,75), 3,93 (t, J = 8,55); 3,78 (m); 3,75 (m);

3,64 (t, J = 9,70); 3,55 (s); 3,44 (dd, J = 3,70 e J = 9,90); 3,35 (t, J = 9,45).

Espectroscopia de RMN

C [125 MHz, CDCl

] – δ

δδ

δ – (padrão de hidrogenação,

correlação estrutural) – 105,23; 93,72; 82,92; 78,00; 75,57; 74,13; 73,95; 72,62; 70,78;

63,92; 62,93; 61,70.

Capítulo 08

Referências Bibliográficas

Referências BibliográficasReferências Bibliográficas

Referências Bibliográficas

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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