Download PDF
ads:
Universidade Federal do Rio de Janeiro
“
“Estudo químico e potencial antitrombótico da
espécie medicinal Petroselinum crispum (Apiaceae)”
D
D
o
o
u
u
g
g
l
l
a
a
s
s
S
S
i
i
q
q
u
u
e
e
i
i
r
r
a
a
d
d
e
e
A
A
l
l
m
m
e
e
i
i
d
d
a
a
C
C
h
h
a
a
v
v
e
e
s
s
2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
II
“
“Estudo químico e potencial antitrombótico da espécie
medicinal Petroselinum crispum (Apiaceae)”
DOUGLAS SIQUEIRA DE ALMEIDA CHAVES
Tese de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Química de Produtos Naturais, Núcleo de
Pesquisas de Produtos Naturais da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Sônia Soares Costa
Co-orientadora: Profa. Dra. Ana Paula de Almeida
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais
Bloco H, CCS, Cidade Universitária
21 941-590 Rio de Janeiro
Fax 55-21-2562 6512
ads:
III
Rio de Janeiro novembro, 2006
“
“Estudo químico e potencial antitrombótico da espécie
medicinal Petroselinum crispum (Apiaceae)”
DOUGLAS SIQUEIRA DE ALMEIDA CHAVES
Tese submetida ao Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos à obtenção do grau de Mestre em
Ciências.
Rio de Janeiro, 28 de novembro de 2006.
Aprovada pelos Doutores:
____________________________
Prof. Massayoshi Yoshida
____________________________
Profa. Russolina Benedeta Zingali
____________________________
Profa. Luzineide W. Tinoco
____________________________
Prof. Robson de Queirós Monteiro
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais
Bloco H, CCS, Cidade Universitária
21 941-590 Rio de Janeiro
Fax 55-21-2562 6512
IV
Chaves, Douglas Siqueira de.
“Estudo químico e potencial antitrombótico da espécie
medicinal Petroselinum crispum (Apiaceae)”. Rio de
Janeiro:UFRJ/ NPPN, 2006.
XXV,114f.:il.; 31 cm.
Orientadora: Sônia Soares Costa
Co-orientadora: Ana Paula de Almeida
Tese: Mestre em Ciências/Química de Produtos Naturais, 2006.
1 – Apiaceae 2 – Petroselinum crispum
3 – CLAE 4 – Flavonóides
5 – Anticoagulante 6 – Antiplaquetário
7 – Coagulação Sangüínea 8 - Trombose
9 – RMN
I. Costa, Sônia Soares. II. Almeida, Ana Paula. III. Universidade Federal do
Rio de Janeiro – Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, Programa de
Pós-graduação em Química de Produtos Naturais. IV. Título.
V
A Deus, por ter me dado força e coragem durante
toda a minha trajetória acadêmica e por estar sempre
derramando o Espírito Santo em mim.
VI
Aos meus queridos pais, Romeu de Almeida
Chaves e Régea Maria de Siqueira Chaves e meu
irmão Rômel R. Siqueira Chaves, pelo amor, pela
força, carinho e formação; por terem me
acompanhado, me incentivado e sempre me
ensinaram a nunca desistir de nossos ideais.
VII
VIII
À professora Sônia Soares Costa, pela orientação,
dedicação, aprendizado, ensinamentos, formação,
carinho e exemplo de profissionalismo.
IX
A professora Ana Paula de Almeida, pois foi a
pessoa mais importante em minha vida acadêmica,
pois, foi com ela que iniciei minha vida de
pesquisador. Palavras nunca serão o suficiente para
expressar minha enorme gratidão.
X
“Andei... Por caminhos difíceis, eu sei. Mas olhando o chão sob meu
s
pés, vejo a vida correr. E assim a cada passo que der tentarei faze
r
o melhor que puder.
A
prendi... Não tanto quanto quis, mas vi que conhecendo o universo
ao meu redor aprendo a me conhecer melhor; Assim escutarei o
tempo que me ensinará a tomar a decisão certa a cada momento.
E partirei... Em busca de muitos ideais, mas sei que hoje se encontram
meu passado, presente e futuro. Hoje sinto em mim a emoção da
despedida. Hoje é o ponto de chegada. Mas, ao mesmo tempo,
tempo de partida”.
(Autor desconhecido)
XI
AGRADECIMENTOS
^ Aos professores Massayoshi Yoshida (Universidade de São Paulo), Russolina Benedeta
Zingali (Instituto de Bioquímica Médica - UFRJ), Luzineide W. Tinoco (NPPN - UFRJ) e Robson
de Queirós Monteiro (suplente – Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ) por terem aceitado
fazer parte da banca examinadora desta dissertação de Mestrado.
^ Ao professor Carlos Roland Kaiser (Instituto de Química, UFRJ) pela realização dos espectros
de Ressonância Magnética Nuclear.
^ Ao professor Ricardo Vieira do Departamento de Botânica da Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro pela identificação botânica da salsa.
^ Ao professor Franco Francesco Vincieri (Universidade de Florença, Itália) pela utilização do
aparelho de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas.
^ A todos os professores do Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais que colaboraram com a
minha formação.
^ A Michelle Frazão Muzitano pela realização das analises de CLAE-EM na Universidade de
Florença (Itália), por ocasião do seu estagio PDEE-CAPES.
^ À professora Sônia Ubatuba pela grande ajuda na parte biológica desta e por estar sempre
disposta a nos ajudar.
^ Ao técnico Francisco de Assis Vieira dos Santos (Central Analítica - NPPN) e a técnica Camila
Barros de Oliveira Mansur, pela realização de alguns espectros de RMN.
^ Á minha grande amiga, posso até dizer irmã, mestranda Maria Fernanda Paresqui Corrêa por
estar sempre presente nas horas de trabalho e até mesmo fora do trabalho, sempre com suas
palavras de carinho, conforto e seu jeito meigo. A você meu muito obrigado por estar ao meu
lado todos os dias.
^ Aos doutores Giany Oliveira de Melo, Michelle Frazão Muzitano, Daniela Barros de Oliveira e
Zenildo Buarque de Morais Filho, que muito contribuíram para meu aprimoramento, pela
amizade e pelo companheirismo.
^ À grande amiga professora Angélica Ribeiro Soares que traz muita alegria, harmonia, paz e
tranquilidade para o nosso dia-dia.
^ À amiga doutoranda Camilla Djenne Buarque que, apesar de estar sempre estressada, foi
uma pessoa importante nesta caminhada.
XII
^ Ao amigo Ricardo Borges pela amizade e brincadeiras pelos corredores do NPPN.
^ À doutoranda Maria de Lourdes M. de Souza pela amizade, incentivo e grande
disponibilidade.
^ À doutoranda Mariane Assafim com seu jeito acolhedor, companheira, atenciosa e sempre
disposta a ajudar. Muito obrigado Mari.
^ À doutoranda Flávia Frattani pela imensa ajuda nos ensaios antiplaquetários, sempre
pontual e responsável. Além de tudo sempre extrovertida.
^ À amiga doutoranda Luciana S. Wermelinger do instituto de Bioquímica médica, por sempre
querer tirar o meu sangue e estar sempre de bom humor.
^ A todos os alunos de Iniciação Científica que fazem ou fizeram parte do Laboratório de
Química de Produtos Naturais Bioativos (LPN-Bio), em especial às alunas Caroline Ferreira de
Souza, Luciana Santos de Oliveira, Nathalia S. Segreto, Isabel Cristina V. Silva e Marcela
Coutinho, que muito contribuíram para o clima familiar de nossa equipe.
^ A todos os alunos de Iniciação Científica do (LAQUEFAR) da Universidade Severino Sombra
que me deram incentivo, em especial Jaqueline, Daiane, Joane e Luciana.
^ Ao meu grande amigo-irmão Marcel de Souza e Silva Santos que esteve presente em cada
passo desta dissertação, muitas vezes servindo até de conselheiro mesmo estando trabalhando
em outra área.
^ A toda minha família, tios, primos e avós, pela paciência e palavras de incentivo, que
deixaram minha vida um pouco mais alegre e menos tensa neste momento tão importante e
decisivo.
^ Aos funcionários do NPPN pelas gentilezas.
^ À Coordenação de Ensino de Pós-Graduação do NPPN pelo apoio prestado.
^ Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Técnológico (CNPq), pela bolsa de
estudos concedida durante a realização deste trabalho.
^ A todos que de alguma forma contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste
trabalho, o meu sincero agradecimento.
XIII
ÍNDICE GERAL
Índice de Esquemas ................................................................................................ XV
Índice de Espectros ................................................................................................ XVI
Índice de Cromatogramas ........................................................................................ XVIII
Índice de Figuras .................................................................................................. XIX
Índice de Tabelas ................................................................................................... XXI
Lista de Abreviaturas .............................................................................................. XXII
Resumo .............................................................................................................. XXIV
Abstract ................................................................................................................ XXV
INTRODUÇÃO .................................................................................................... 01
O Sistema Hemostático ....................................................................................... 03
Hemostasia Primária ........................................................................................... 04
Coagulação Sangüínea ....................................................................................... 06
Controle da Hemostasia ....................................................................................... 07
Trombose .......................................................................................................... 09
Fármacos Utilizados no Tratamento da Trombose .................................................... 10
A Família Apiaceae.............................................................................................. 13
Estudos anteriores da espécie Petroselinum crispum ................................................ 15
Aspectos Químicos .......................................................................................... 15
Aspectos Biológicos ......................................................................................... 17
Flavonóides: Aspectos Químicos e importância Biológica .......................................... 18
Substâncias isoladas de espécies vegetais que interferem na coagulação plasmática ... 21
Flavonóides Isolados e Identificados na espécie P. crispum ....................................... 24
OBJETIVOS ........................................................................................................ 27
MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 29
Experimental Geral .............................................................................................. 30
Obtenção do Material Vegetal e Preparo do extrato .................................................. 30
Secagem das amostras ....................................................................................... 30
Fracionamento do Decocto ................................................................................... 30
Suportes Cromatográficos .................................................................................... 31
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ...................................................... 32
Ressonância Magnética Nuclear (RMN) .................................................................. 33
XIV
Espectrometria de Massas (EM) ............................................................................ 34
Desvio de Rotação Óptica .................................................................................... 35
Ponto de Fusão .................................................................................................. 35
Ensaio Antiplaquetário e Anticoagulante ................................................................. 35
Experimental I .................................................................................................... 36
Preparo e Fracionamento do Decocto das Folhas Frescas .......................................... 37
Purificação e isolamento de Pc1 ........................................................................ 39
Purificação e isolamento de Pc2 ........................................................................ 41
Parte Farmacológica ............................................................................................ 42
Ensaio Biológico – Atividade Antiplaquetária ........................................................... 42
Ensaio Biológico – Atividade Anticoagulante ........................................................... 44
RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 45
Elucidação Estrutural dos Flavonóides isolados das Folhas .................................. 46
Elucidação Estrutural de Pc1 ................................................................................ 46
Elucidação Estrutural de Pc2 ................................................................................ 53
Perfil Químico de Petroselinum crispum .............................................................. 70
Análise Qualitativa do Decocto das Folhas .............................................................. 71
CLAE-UV-EM para Pcppt e identificação do flavonóide Pc1 ........................................ 72
CLAE-UV-EM para PcA e identificação do flavonóide Pc2 ........................................... 76
Análise Quantitativa dos Flavonóides de P. crispum ................................................. 80
Ensaio Biológico .................................................................................................. 85
Ensaio de aPTT e PT ............................................................................................ 86
Ensaio de Agregação Plaquetária .......................................................................... 89
Induzida por ADP (adenosil difosfato) ................................................................ 89
Induzida por trombina ..................................................................................... 93
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ....................................................................... 98
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 102
XV
ÍNDICE DE ESQUEMAS
Esquema 1: Sistema de purificação do extrato com solventes orgânicos ...................... 31
Esquema 2: Marcha de obtenção do decocto ............................................................ 37
Esquema 3: Partição de Pcsn em acetato de etila seguido de n-butanol ....................... 39
Esquema 4: Isolamento do flavonóide Pc1 .............................................................. 40
Esquema 5: Isolamento do flavonóide Pc2 .............................................................. 41
XVI
ÍNDICE DE ESPECTROS
Espectro 1: Espectro de RMN
1
H (300,13 MHz) de Pc2 (DMSO-d
6
) ............................... 47
Espectro 2:
Ampliação da região entre 5,5 - 8,4 ppm do espectro de RMN
1
H
(300,13 MHz) de Pc2 (DMSO-d
6
) ............................................................ 47
Espectro 3: Espectro de RMN 2D COSY (300,13 MHz) de Pc2 (DMSO-d
6
) ...................... 48
Espectro 4: Ampliação da região entre 6,0 - 8,4 ppm do espectro de RMN 2D COSY (300,13
MHz) de Pc2 (DMSO-d
6
) ........................................................................
Espectro 5: Espectro de RMN 2D HMQC (400,13 x 100,63 MHz) de Pc2 (DMSO-d
6
) ........ 50
Espectro 6: Ampliação da região entre 6,0 - 8,2 ppm do espectro de RMN 2D HMQC
de Pc2 (DMSO-d
6
) ................................................................................ 50
Espectro 7: Espectro de RMN
1
H (300,13 MHz) de Pc1 (DMSO-d
6
) ............................... 54
Espectro 8:
Ampliação da região entre 6,0 - 8,0 ppm do espectro de RMN
1
H (300,13 MHz)
de Pc1 (DMSO-d
6
) ................................................................................ 54
Espectro 9: Ampliação da região entre 2,0 - 5,5 ppm do espectro de RMN
1
H
(300,13 MHz)
de Pc1 (DMSO-d
6
) ................................................................................ 56
Espectro 10: Espectro de RMN
13
C (75,47 MHz) de Pc1 (DMSO-d
6
) .............................. 57
Espectro 11: Espectro de RMN 2D COSY (300,13 MHz) de Pc1 (DMSO-d
6
) .................... 58
Espectro 12: Ampliação da região entre 6,0 - 8,4 ppm do espectro de RMN 2D COSY
(300,13 MHz) de Pc1 (DMSO-d
6
) ............................................................ 59
Espectro 13: Ampliação da região entre 1,2 - 5,4 ppm do espectro de RMN 2D COSY
(300,13 MHz) de Pc1 (DMSO-d
6
) ............................................................ 60
Espectro 14: Espectro de RMN 2D HMQC (400,13 x 100,63 MHz) de Pc1 (DMSO-d
6
) ...... 61
Espectro 15: Ampliação da região entre 6,0 - 8,2 ppm do espectro de RMN 2D HMQC
de Pc1 (DMSO-d
6
) ................................................................................ 62
Espectro 16: Ampliação da região entre 2,8 - 4,4 ppm do espectro de RMN 2D HMQC de Pc1
(DMSO-d
6
) .......................................................................................... 62
XVII
Espectro 17: Espectro de RMN 2D HMBC (400,13 x 100,63 MHz MHz)
de Pc1 (DMSO-d
6
) ................................................................................ 64
Espectro 18: Espectro de ultravioleta para Pc1 e comosiina ........................................ 72
Espectro 19: Espectro de massas para o tempo de retenção 8,028 minutos .................. 72
Espectro 20: Espectro ultravioleta para o tempo de retenção 7,776 minutos ................. 73
Espectro 21: Espectro massas para o tempo de retenção 7,776 minutos ....................... 74
Espectro 22: Espectro de ultravioleta para a apiina .................................................... 75
Espectro 23: Espectro de massas para a apiina ......................................................... 76
Espectro 24: Espectro de ultravioleta para a apigenina e luteolína ............................... 77
Espectro 25: Espectro de massas para a aglicona apigenina ........................................ 77
Espectro 26: Espectro de massas para a aglicona luteolina ......................................... 78
Espectro 27: Espectro de ultravioleta para a aglicona apigenina .................................. 78
Espectro 28: Espectro de massas para a aglicona apigenina ........................................ 79
XVIII
ÍNDICE DE CROMATOGRAMAS
Cromatograma 1: Perfil químico de Pcsn ................................................................ 71
Cromatograma 2: Perfil químico de Pcppt ............................................................... 73
Cromatograma 3: Cromatograma da apiina ............................................................ 75
Cromatograma 4: Perfil químico de PcA .................................................................. 76
XIX
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: O papel das plaquetas na formação do trombo ............................................ 05
Figura 2: A cascata de Coagulação ......................................................................... 07
Figura 3: Fármacos Anticoagulantes ........................................................................ 10
Figura 4: Fármacos Antiplaquetários ....................................................................... 11
Figura 5: Rota Biossintética dos Flavonóides ............................................................ 19
Figura 6: Glicirrizina ............................................................................................. 23
Figura 7: Estágios de crescimento da espécie P. crispum e atividade enzimática ............ 24
Figura 8: Rota de fragmentação para flavonas via RDA (Retro-Diels-Alder) ................... 34
Figura 9: Técnica utilizada para o ensaio de agregação plaquetária in vitro ................... 43
Figura 10: Estrutura de Pc2 (Apigenina) ............................................................... 51
Figura 11: Estrutura da apigenina .......................................................................... 55
Figura 12: Correlações H-C a longa distância para o anel A ........................................ 65
Figura 13: Correlações H-C a longa distância para o anel B ........................................ 65
Figura 14: Correlações H-C a longa distância para o anel C ........................................ 65
Figura 15: Correlações H-C a longa distância para glicose e apiose............................... 66
Figura 16: Estrutura de Pc1 (Apiina) ..................................................................... 68
Figura 17: Curva de calibração da Rutina ................................................................. 81
Figura 18: Concentração dos flavonóides no decocto .................................................. 83
Figura 19:
Efeito in vitro das frações de Petroselinum crispum sobre a coagulação do plasma, após a
ativação da via intrínseca induzida pelo reagente aPTT
..................................... 87
Figura 20:
Efeito in vitro das frações de Petroselinum crispum sobre a coagulação do plasma,
após a ativação da via intrínseca induzida pelo reagente aPTT ................................ 88
Figura 21: Agregação plaquetária in vitro induzida por ADP, frente à fração Pcsn .................... 90
Figura 22:
Agregação plaquetária in vitro induzida por ADP, frente à fração PcAq .................... 90
Figura 23:
Agregação plaquetária in vitro induzida por ADP, frente à fração PcB ..................... 91
XX
Figura 24: Agregação plaquetária in vitro induzida por trombina, frente à fração Pcsn .............. 93
Figura 25:
Agregação plaquetária in vitro induzida por trombina, frente à fração PcAq ............. 94
Figura 26:
Agregação plaquetária in vitro induzida por trombina, frente à fração PcB ............... 94
XXI
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Gêneros nativos no Brasil e introduzidos na família Apiaceae ..................... 13
Tabela 2: Flavonóides isolados e identificados da espécie P. crispum ........................ 25
Tabela 3: Sistema de gradiente utilizado para a realização da CLAE .......................... 32
Tabela 4: Rendimento das frações estudadas em relação as folhas frescas ................ 39
Tabela 5: Purificação de Pcppt............................................................................. 40
Tabela 6: Purificação de PcA ............................................................................... 41
Tabela 7: Dados de RMN
1
H e
13
C de Pc2 (DMSO-d
6
) ............................................. 51
Tabela 8: Dados de RMN
1
H e
13
C de Pc1 (DMSO-d
6
) ............................................. 67
Tabela 9: Percentual dos flavonóides calculados .................................................... 82
Tabela 10:
Inibição da agregação plaquetária frente ao indutor ADP e seus respectivos
valores de IC
50
calculados para frações de Petroselinum crispum ...................... 91
Tabela 11:
Inibição da agregação plaquetária frente ao indutor trombina e seus respectivos
valores de IC
50
calculados para frações de Petroselinum crispum ...................... 95
Tabela 12: V
alores de IC
50
das frações de P. Crispum frente aos indutores ADP e trombina .... 96
XXII
LISTA DE ABREVIATURAS
2D bidimensional
12-HETE ácido 12-hidroxi-5, 8, 10, 14-eicosatetraenóico
AChE acetilcolinesterase
ADP adenosil difosfato
AMP adenosil monofosfato
APC proteína C ativada
aPTT tempo de tromboplastina parcial ativado
BAW n-Butanol/acetic acid/water
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
COSY Correlation Spectroscopy
DCV Doenças cardiovasculares
DMSO-d
6
Hexadeuteriodimetil-sulfóxido
EM Espectrometria de Massas
EPCR receptor endotelial de proteína C
FHT flavanona 3β-sintetase
FNS I flavona sintetase I
GA ácido glicirrético
GL glicirizina
GP glicoproteína
GU ácido glicurônico
HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple-Quantum
HDL High density lipoprotein
LDL Low density lipoprotein
NO óxido nítrico
PAF fator de ativação plaquetária
PBS phosphate buffered saline
Pc1 Apigenina – 7-O-apiosil-(1→2)-O-glicosídeo
Pc2 Apigenina
PcA fração em acetato de etila
PcAq fração aquosa resultante
PcB fração butanólica
PcD decocto
Pcppt precipitado obtido a partir do decocto de salsa
XXIII
Pcsn sobrenadante obtido após a filtração do decocto
PG prostaglandina
PPP plasma pobre em plaquetas
PRP plasma rico em plaquetas
PT tempo de protrombina
RMN de
13
C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
RMN de
1
H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RP Reversed Phase
TFPI inibidor da via do fator tecidual
THR trombina
t-PA ativador tecidual do plasminogênio
TT tempo de trombina
TXA
2
tromboxano A
2
TXB
2
tromboxano B
2
u-PA ativador de plasminogênio tipo uroquinase
UV Ultravioleta
XXIV
RESUMO
ESTUDO QUÍMICO E POTENCIAL ANTITROMBÓTICO DA ESPÉCIE MEDICINAL
Petroselinum crispum (APIACEAE)
DOUGLAS SIQUEIRA DE ALMEIDA CHAVES
Orientadora: Sônia Soares Costa
Co-orientadora: Ana Paula de Almeida
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Química de Produtos
Naturais, Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ,
como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências.
Petroselinum crispum, conhecida no Brasil principalmente como salsa, é uma erva aromática
utilizada como condimento e na ornamentação de pratos, principalmente peixes. A salsa é uma
planta muito utilizada para tratar reumatismo, problemas gástricos (facilitando a digestão),
estimulante do apetite e hipotensor.
O extrato aquoso (decocto) foi preparado a partir das folhas frescas de Petroselinum crispum
coletadas no município de Vassouras – RJ, fora do período de floração. Subfrações obtidas a partir
da purificação do decocto foram avaliadas nos ensaios da inibição da coagulação e da agregação
plaquetária in vitro. Para avaliar a ação anticoagulante das frações foram realizados os ensaios do
tempo de tromboplastina parcial ativado (aPTT) e do tempo de protrombina (PT), utilizando plasma
pobre em plaquetas (PPP). Para a verificação da ação antiplaquetária foram utilizados como
indutores ADP (adenosil difosfato) e trombina, e o plasma utilizado foi rico em plaquetas (PRP).
O estudo da composição química do decocto de P. crispum levou ao isolamento de um
flavonóide majoritário de estrutura conhecida: Apigenina – 7-O-apiosilfuranosideo-(1→2)-O-
glicopiranosídeo (Apiina) (Pc1). Um segundo flavonóide, 5,7,4`-triidroxiflavona (Apigenina) (Pc2),
foi isolado. Ambas as substâncias já haviam sido previamente descritas para a espécie. A elucidação
estrutural das substâncias foi feita com base nas análises de RMN de
1
H e de
13
C, HMQC, HMBC,
COSY e espectrometria de massas. Outras duas flavonas, comosiina e luteolina, relatadas
anteriormente para a espécie Petroselinum crispum foram identificadas através de cromatografia
líquida de alta eficiência e espectrometria de massas.
As frações obtidas através de processo de partição, Pcsn, PcAq e PcB apresentaram
flavonóides em sua composição. Estas frações (Pcsn, PcAq e PcB) foram testadas e apresentaram
ação anticoagulante tanto para aPTT quanto para PT. A ação antiagregante plaquetária também foi
observada, principalmente para Pcsn (IC
50
= 0,16 mg/ml), sendo a inibição da agregação induzido
pela trombina aquele no qual foram observados os melhores resultados. Nossos dados permitem
sugerir que Pcsn, PcAq e PcB interferem na hemostasia, principalmente através das plaquetas. Neste
trabalho, a ação anticoagulante in vitro é descrita pela primeira vez para a espécie Petroselinum
crispum.
Palavras-chave: Petroselinum crispum, salsa, Apiaceae, flavonóides glicosilados, flavonas, apiina,
decocção, ensaio anticoagulante, ensaio antiplaquetário, antitrombótico, tempo de tromboplastina
ativado (aPTT), tempo de protrombina (PT).
Rio de Janeiro
Novembro, 2006
XXV
ABSTRACT
CHEMICAL STUDY AND POTENTIAL ANTITHROMBOTIC OF MEDICINAL SPECIES
PETROSELINUM CRISPUM (APIACEAE)
DOUGLAS SIQUEIRA DE ALMEIDA CHAVES
Orientadora: Sônia Soares Costa
Co-orientadora: Ana Paula de Almeida
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Química de Produtos
Naturais, Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ,
como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências.
Petroselinum crispum known in Brazil as parsley, is an aromatic herb used as condiment
and in the ornamentation of plates, mainly sea food dishes. The parsley is a plant very used to
treat rheumatism, gastric problems (facilitating the digestion), as stimulant of the appetite and
hipotensive.
Petroselinum crispum leaves were collected from plant specimens, out of blooming
season, cultivated at Vassouras-RJ. The sub-fractions, obtained from the decoct of the leaves,
were evaluated in two models: inhibition of plasma clotting and platelet aggregation in vitro
assays. The anticoagulant action of the fractions were measumed through activated parcial
thromboplastin time (aPTT) and prothrombin time (PT), using platelet-poor-plasma (PPP). To
verification of antiplatelet action ADP (adenosine diphosphate) and thrombin were used as
inductors, and the plasma used was platelet-rich-plasma (PRP).
The chemical study of Petroselinum crispum led to the isolation of a major flavonoid with
a known structure: Apigenin 7-O-apiofuranosyl-(1→2)-O-glucopyranoside (Apiin) (Pc1). A
second known flavonoid was isolated: 5,7,4`-trihydroxyflavone (Apigenin) (Pc2). Both
substances were previously described for the species. The structural elucidation of the
substances was based on NMR
1
H and
13
C, HMQC, HMBC, COSY and Mass Spectrometry (MS)
data. Comosiin and luteolin, two flavones previously related for this species, were identified
through High Performance Liquid Chromatographic/Mass Spectrometry.
The flavonoid fractions Pcsn, PcAq and PcB, obtained by partition process, showed an
anticoagulant action to aPTT and PT. The antiplatelet action also was observed, mainly for Pcsn
(IC
50
= 0.16 mg/ml). The best results of platelet aggregation inhibition were observed using
thrombin as inductor. Our data suggest that these fractions (Pcsn, PcAq and PcB) interfere in
haemostasis, through platelets. In this work, the anticoagulant action in vitro is described for
the first time for the species P. crispum.
Keywords: Petroselinum crispum, parsley, Apiaceae, flavonoids glycosylated, flavone, apiin,
decoction, anticoagulant assay, antiplatelet assay, antithrombotic, activated partial
thromboplastin time (aPTT), prothrombin time (PT).
Rio de Janeiro
November, 2006
2 Introdução
I
I
N
N
T
T
R
R
O
O
D
D
U
U
Ç
Ç
Ã
Ã
O
O
Nas últimas décadas a busca por produtos naturais tem envolvido não só pesquisadores,
mas também todos aqueles que procuram investigar e divulgar os benefícios destes produtos.
Estes, a cada dia, apresentam um maior emprego, sendo utilizados em diversas áreas, como
por exemplo, na alimentação, na indústria farmacêutica e na indústria de cosméticos.
Na alimentação, as ervas condimentares e aromáticas atuam realçando o sabor dos
alimentos e ativando a ação das glândulas salivares, que iniciam o processo digestivo. Além
disso, cada espécie apresenta uma fitoquímica diferente de forma que atua no organismo
mesmo quando a planta é utilizada como tempero (CARDOSO et al., 2005).
Através de pesquisas científicas visando à busca de substâncias bioativas para as mais
diversas enfermidades, verificou-se que os alimentos denominados condimentos possuem
princípios ativos que estão relacionados com a prevenção ou até mesmo a cura de diversas
doenças. O aipo (Apium graveolens) da família Apiaceae, por exemplo, possui ação
antioxidante, digestiva e atividade antiinflamatória (CARDOSO et al., 2005). A cebola (Allium
cepa) da família Liliaceae, também representa um alimento importante. Seu uso foi relacionado
com a redução de LDL, com o aumento do HDL, com a diminuição da pressão arterial e da
arritmia cardíaca, bem como com a redução da formação de coágulos sanguíneos (CARDOSO et
al., 2005). Zingiber officinales (gengibre) da família Zingiberaceae, possui propriedades
terapêuticas como antiemética, antissépitica e de estimulação da circulação periférica
(CARDOSO et al., 2005).
As espécies que interferem na circulação como Petroselinum crispum, salsa, têm
despertado o interesse de pesquisadores. Verifica-se que para as doenças cardiovasculares, os
tratamentos com ervas vêm sendo intensificados na Noruega (DUTTAROY et al., 2005).
As doenças cardiovasculares (DCV) são responsáveis pelo maior número de casos de
óbitos em todo o mundo. Dados apontam um número crescente de óbitos relacionados às
doenças cardiovasculares desde 1990, e atualmente estima-se que aproximadamente 17
milhões de pessoas em todo o mundo estão sendo vitimas das DCV (MACKAY & MENSAH,
2002; JACKSON & SCHOENWAELDER, 2003; DING et al., 2006).
A doença tromboembólica ainda é a principal causa de morte nos países desenvolvidos
(GRESELE & AGNELLI, 2002; ESMON, 2000). Nos Estados Unidos, mais de dois milhões de
pessoas morrem todos os anos de trombose arterial ou venosa, ou ainda de suas
conseqüências. Segundo os dados do Ministério da Saúde (2002), no Brasil, o grupo das DCV,
já é responsável por 31% dos óbitos em capitais - na década de 30, esse número era de 12% -
e representam 75% dos gastos com atenção à saúde no Brasil.
3 Introdução
Vários riscos e fatores estão envolvidos com a DCV como: uso de tabaco, aumento da
pressão arterial, aumento de colesterol circulante no sangue, diabetes, obesidade,
predisposição genética e distúrbios no sistema de coagulação (MACKAY & MENSAH, 2002).
Todos estes fatores geram uma modificação na hemostase, fazendo com que ocorram
problemas no sistema de coagulação levando à trombose. Com isso, é de extrema importância
à busca de novas moléculas através das plantas medicinais, que poderiam interferir nos
processos de coagulação plasmática.
As ervas e outras plantas são usadas para tratar pacientes com hipertensão arterial,
angina, aterosclerose, insuficiência cerebral, insuficiência venosa, e arritmia cardíaca
(GOOLDMAN, 2001; COLQUHOUN, 2001).
CARDOSO et al. (2005) apontam a espécie Petroselinum crispum, salsa, como uma planta
que “pode interferir no processo sanguíneo”. Desta forma, considerando o atual panorama
relacionado ao número de pessoas que sofrem de doenças cardiovasculares em todo o mundo,
e paralelamente o uso das ervas medicinais para os mais diversos fins terapêuticos, justifica-se
um estudo mais aprofundado com o intuito de avaliar a interferência da Petroselinum crispum
na coagulação sanguínea, bem como na agregação plaquetária.
O Sistema Hemostático
Hemostasia é o mecanismo que mantém a fluidez do sangue pelos vasos. Inclui o controle
da hemorragia e a dissolução do coágulo, por meio de eventos mecânicos e bioquímicos. A
hemostasia compreende três grandes fases, divididas em: hemostasia primária (que tem como
componente principal as plaquetas), hemostasia secundária (fase em que envolve toda a
cascata de coagulação com seus componentes, culminando na formação de fibrina) e
hemostasia terciária onde estão envolvidas enzimas responsáveis pela eliminação do trombo.
Os componentes do sistema vascular exercem um papel fundamental no transporte de
oxigênio e nutrientes para os tecidos, além de regular o extravasamento de fluidos, solutos,
hormônios e macromoléculas. A manutenção da integridade do sistema vascular é
absolutamente vital para o organismo, uma vez que a perda de uma grande quantidade de
sangue através de uma injúria vascular é incompatível com a vida (KALAFATIS et al., 1994).
Deste modo, um mecanismo complexo denominado sistema hemostático reconhece o dano
vascular e recruta componentes celulares e proteínas plasmáticas solúveis, produzindo um
“tampão” insolúvel, que cessa a perda sangüínea (KALAFATIS et al., 1994; ROSENBERG, 2001;
DAVIE et al., 1991). Os principais constituintes deste “tampão” incluem as plaquetas e um
polímero insolúvel de fibrina, que é formado a partir de uma proteína plasmática solúvel
4 Introdução
denominada fibrinogênio. O sistema hemostático é relativamente quiescente se o dano vascular
não está presente, entretanto, em caso de injúria vascular, ocorre à deposição de plaquetas e
fibrina rapidamente e de acordo com a extensão da lesão (KALAFATIS et al., 1994; ESMON,
2000; BOURIN & LINDAHL; 1993; ROSENBERG, 2001; DAVIE et al., 1991).
Hemostasia Primária
Quando a integridade da parede vascular é interrompida, ocorre a ativação do sistema
hemostático. Este fenômeno envolve diversas interações entre componentes endoteliais e
subendoteliais, plaquetas e outras células sangüíneas periféricas e proteínas procoagulantes
circulantes. As plaquetas desempenham um papel essencial nestas interações, pois participam
diretamente da primeira fase da hemostasia, contribuindo com seus receptores de membrana
que facilitam e amplificam a atividade localizada dos fatores da coagulação sangüínea (BHATT
& TOPOL, 2003; KALAFATIS et al., 1994; RUGGERI, 1997; RUGGERI, 2002; HAWINGER et al.,
1994; DAVIE et al., 1991).
Em condições normais, as plaquetas circulam no sangue em estado de repouso sob a
forma discóide. Entretanto, quando recrutadas devido a alterações das células endoteliais e à
exposição de moléculas do espaço da matriz subendotelial, sofrem uma drástica mudança
morfológica (KALAFATIS et al., 1994). Quando expostas a agonistas (ADP, serotonina,
trombina, colágeno, etc.), são ativadas mudando da forma discóide para a forma esférica com
extensa emissão de pseudópodos, respondendo rapidamente à lesão vascular (KALAFATIS et
al., 1994; RUGGERI, 1997). A mudança morfológica é também acompanhada pela
redistribuição de fosfolipídios plaquetários. No estado não-estimulado, os fosfolipídios de
membrana carregados negativamente (fosfatidilserina e fosfatidilinositol) estão localizados
quase exclusivamente na membrana interna das plaquetas. Quando ocorre o evento de
ativação plaquetária, estes são expostos na parte externa da membrana, criando uma
superfície para ligação de fatores e cofatores plasmáticos da coagulação (a ativação da
coagulação é promovida pela exposição do fator tecidual) (BHATT & TOPOL, 2003; RUGGERI,
2002; KALAFATIS et al., 1994; HAWINGER et al., 1994).
A adesão das plaquetas ao sub-endotélio é mediada por diversas proteínas, incluindo o
colágeno, o fator de von Willebrand e as glicoproteínas plaquetárias Ia/IIa e Ib/IX/V (BHATT &
TOPOL, 2003; RUGGERI, 2002; KALAFATIS et al., 1994; RUGGERI, 1997; HAWINGER et al.,
1994; DAVIE et al., 1991). Num evento subseqüente, ocorre a agregação das plaquetas junto à
lesão vascular envolvendo o fibrinogênio plasmático e as glicoproteínas plaquetárias IIb/IIIa,
que são expostas após o fenômeno de ativação plaquetária (RUGGERI, 1997; HAWINGER et
5 Introdução
al., 1994; DAVIE et al., 1991) - Figura 1. Em conjunto, estes eventos plaquetários resultam
numa ponte entre a hemostasia e moléculas sub-endoteliais, plaquetas e outras células
sangüíneas periféricas e proteínas envolvidas na hemostasia primária e a coagulação
sangüínea, uma vez que os fosfolipídios expostos durante a ativação, são necessários à várias
reações da coagulação sangüínea (MONTEIRO, 2001).
Figura 1: O papel das plaquetas na formação do trombo; A – plaquetas circulantes na forma inativa
devido a presença de óxido nítrico (NO) e prostaciclinas produzidas pelo endotélio dos vasos sangüíneos.
As células endoteliais também expressam CD39, a qual inibe a ativação plaquetária pela conversão de
adenosina difosfato (ADP), um potente indutor da ativação plaquetária, em adenosil monofosfato (AMP).
B e C – Locais onde a parede do vaso sangüíneo foi lesada, as plaquetas se aderem neste local para
expor ao subendotélio seus receptores que interagem com colágeno, fator von Willebrand e fibrinocetina e
os receptores integrina α2β1, glicoproteína Ib-IX (GP Ib-IX) e integrina α5β1, respectivamente. Trombina
e ADP fazem com que a plaqueta mude sua conformação (na forma ativa). D – Plaqueta ativada secreta
B – Adesão plaquetária
A
C – Mudança morfológica
F – Estabilização, retração
do coágulo
D – Secreção, produção de TXA
2
,
atividade procoagulante.
E – plug hemostático
Plaqueta inativa
Trombina
Subendotélio
Célula
endotelial
Complexo
Protrombinase
ADP, PDGF,
fibrinogênio
ADP
Prostaglandina
AMP
ADP
CD39
6 Introdução
ADP, fator de crescimento plaquetário e fibrinogênio a partir de grânulos, e tromboxano A
2
(TXA
2
),
produzido pela biossintese intermediária. ADP e TXA
2
levam a mudança morfológica e sua ativação. E –
Receptores de glicoproteínas IIb/IIIa presentes na superfície das plaquetas ativadas se ligam ao
fibrinogênio, principalmente para a formação de pontes de fibrinogênio entre as plaquetas, resultando na
agregação. Isto e a formação simultânea de uma malha de fibrina, levam a formação de um trombo
plaquetário. F – Retração do coágulo, levando então, a um trombo estável (modificado de BHATT &
TOPOL, 2003).
Coagulação Sangüínea
A coagulação sangüínea envolve a ativação seqüencial de uma série de reações
enzimáticas, na qual o produto de cada reação converte uma proteína plasmática inativa
(zimogênio) em um produto ativo. Cada zimogênio é convertido em uma forma ativa através
da proteólise limitada de uma ou duas ligações peptídicas culminando na geração de uma
grande quantidade de trombina (ESMON, 2000; BOURIN & LINDAHL; 1993; DAVIE et al.,
1991). Esta enzima cliva fibrinogênio em fibrina insolúvel e ativa as plaquetas através da
ligação a receptores de trombina presentes na superfície destas células (ESMON, 2000; DAVIE
et al., 1991). A trombina também ativa os fatores da coagulação sangüínea V, VIII, XI e XIII
amplificando, assim sua própria produção (FURIE & FURIE, 1992; DAVIE et al., 1991).
O mecanismo hemostático conduz a reações procoagulantes de extrema relevância
envolvendo três complexos enzimáticos dependentes de vitamina K: o complexo
protrombinase, o complexo tenase intrínseco e o complexo tenase extrínseco. Cada complexo é
composto de serinoproteases e um cofator protéico não enzimático. Durante a coagulação
sangüínea, estes complexos se organizam junto à superfície da membrana da plaqueta
resultando na ativação dos zimogênios, fator X e protrombina (KALAFATIS et al., 1994; MANN
et al., 1998; MANN, 1999; DAVIE et al., 1991). Os complexos protrombinase e tenase
intrínseco contêm componentes derivados do plasma, enquanto que o complexo tenase
extrínseco possui um componente de origem celular ou tecidual (KALAFATIS et al., 1994). A
produção de trombina é acionada por duas diferentes vias que conduzem à ativação do fator X
(DAVIE et al., 1991). Atualmente, o processo de coagulação tem sido revisto e muitos estudos
têm proposto um mecanismo que seria dividido em duas fases: a fase de iniciação, disparada
pela exposição do fator tecidual e formação do complexo tenase extrínseco, e a fase de
propagação, controlada pela α-trombina que ativa os fatores XI, V e VIII. O complexo tenase
extrínseco apresenta uma meia-vida curta no plasma devido à rápida inibição pelo TFPI
(inibidor da via do fator tecidual) e serviria para iniciar o processo de coagulação, ao passo que
a via de propagação manteria uma produção mais prolongada de α-trombina e
7 Introdução
conseqüentemente de fibrina (MONTEIRO, 2001; MANN et al., 1998; MANN, 1999; MARSHALL,
2003). A Figura 2 mostra um quadro esquemático das reações envolvidas na hemostasia.
Figura 2: Cascata de coagulação; a coagulação é iniciada pela exposição do fator tecidual, com fator VII,
o qual gera o fator VII ativado (Fator VIIa). O complexo fator tecidual - fator VIIa então, catalisa a
conversão do fator X em fator Xa, e sequencialmente ativando o fator V em fator Va, a conversão de
protrombina em trombina e a conversão de fibrinogênio em fibrina. Três vias anticoagulantes importantes
podem inibir este processo. Proteína C é ativada pela interação da trombina com trombomodulina e inibe
os fatores V e VIII ativados. Antitrombina bloqueia a ativação dos fatores XII, XI, IX, X e II
(protrombina), enquanto o inibidor da via tecidual interfere diretamente com o complexo tenase
extrínseco (adaptado de MARSHALL, 2003).
Controle da Hemostasia
O sistema fibrinolítico representa também um importante mecanismo de controle
impedindo acúmulo de fibrina na luz do vaso. Enzimas ativadoras de plasminogênio tipo
uroquinase (u-PA) e tipo tecidual (t-PA) convertem o plasminogênio em plasmina, que é sua
forma ativa. A plasmina uma vez formada degrada a fibrina em fragmentos solúveis, que
possuem atividade antitrombótica. Estes fragmentos solúveis competem com os monômeros de
Injúria
Tecidual
Fator Tecidual
Protrombina
Fibrinogênio
Antitrombina
Proteína C ativada
Proteína C
Inibidor da via
fator tecidual
8 Introdução
fibrina pelos sítios ligantes de polímeros de fibrina do trombo formado e também com
fibrinogênio por sítios ligantes de glicoproteína IIb/IIIa na superfície de plaquetas (LOSCALZO
& SCHAFER, 2003).
A ativação do plasminogênio e a atividade da plasmina são reguladas por outras
moléculas membros da classe das serpinas como α
2
-antiplasmina e inibidor do ativador de
plasminogênio (tipos I e II), que inibem, respectivamente, plasmina e ativadores de
plasminogênio através da formação de um complexo estequiométrico de 1:1 com estas
enzimas ativas (LOSCALZO & SCHAFER, 2003).
A presença de múltiplos inibidores plasmáticos como, por exemplo, antitrombina, proteína
C e S, e o inibidor da via do fator tecidual, são também de extrema importância pois
coletivamente mantêm a fluidez do sangue (ZAVALOVA et al., 2002; DAVIE et al., 1991) .
Estes inibidores plasmáticos agem através de mecanismos diversos. A antitrombina (58.000
Da) forma complexos com fatores da coagulação, onde seus principais alvos são a trombina, o
fator Xa e o fator IXa (LINDHAL et al., 1979; MONTEIRO, 2001; DAVIE et al., 1991) e sua
atividade é aumentada em aproximadamente 3000 vezes na presença de heparina, pois esta
molécula possui um sítio de ligação a heparina (MARSHALL, 2003; LINDHAL et al., 1979;
MONTEIRO, 2001). Outro inibidor que também pertencente à família das serpinas é o cofator II
da heparina. Ao contrário da antitrombina, este inibidor possui atividade específica contra
trombina. O cofator II da heparina também tem sua atividade aumentada por heparina e
dermatan sulfato (ESMON et al., 1999; ESMON et al., 2000; DAVIE et al., 1991).
A via da proteína C é uma importante via inibitória, na qual a proteína C se liga ao
complexo trombomodulina – trombina no endotélio vascular, e é convertida pela trombina em
uma protease ativa. A proteína C ativada (APC) interage com a proteína S sobre a superfície de
membranas plaquetárias para catalisar a inativação dos cofatores da coagulação Va e VIIIa e
bloquear assim a geração de trombina. APC e proteína C podem se ligar ao EPCR (receptor
endotelial de proteína C), sendo essa uma interação que acelera a produção de APC
(MARSHALL, 2003). Os inibidores responsáveis pela inativação da proteína C ativada são α
1
-
antitripsina, inibidor de proteína C e α
2
-macroglobulina. A deficiência de qualquer uma dessas
proteínas leva, como se poderia prever, a estados de hipercoagulabilidade (ESMON et al.,
1999; ESMON et al., 2000; DAVIE et al., 1991).
9 Introdução
T
T
R
R
O
O
M
M
B
B
O
O
S
S
E
E
A trombose é a ativação inapropriada do processo hemostático normal, resultando na
formação de trombo(s) em um vaso sem lesão ou na oclusão vascular após injúria (ESMON,
2000; HORAN et al., 2001).
As causas predisponentes da trombose venosa profunda foram descritas por Virchow em
1856 e incluem: estase sangüínea; injúria vascular; e alterações dos fatores da coagulação do
sangue, levando à hipercoagulabilidade. Os diversos fatores de risco sejam adquiridos ou
herdados, atuam através de pelo menos um dos três componentes da tríade de Virchow e o
seu reconhecimento auxilia no diagnóstico e profilaxia da doença tromboembólica (ESMON,
2000; HORAN et al., 2001).
Estudos relatam que estas doenças estão integradas a fatores de risco herdados e/ou
adquiridos (MARTINELLI, 2001; SIMMONDS et al., 2001). Sendo assim, muitas condições
clínicas podem estar associadas com o alto risco de trombose arterial, venosa e
tromboembolia. A aterosclerose, o fumo, a hipertensão e o diabetes são algumas condições
clínicas relacionadas com a trombose arterial, enquanto que a cirurgia geral, a cirurgia
ortopédica, o trauma e o câncer estão entre as condições associadas com episódios de
trombose venosa (BICK & FAREED, 1997).
Em particular, eventos como as isquemias cardiovasculares continuam ocorrendo em
número muito significativo, e igualmente as complicações associadas a hemorragias (GRESELE
& AGNELLI, 2002). Além disso, a prevenção à estenose após o procedimento de
revascularização ainda não foi obtida, nem com o estabelecimento de um procedimento
preventivo e nem com o uso de agentes antiplaquetários. A necessidade de monitoramento
laboratorial contínuo no tratamento com heparina ou varfarina é igualmente, considerado
desvantajoso. Diante das limitações dos chamados agentes antitrombóticos de primeira
geração e, apesar do progresso com os chamados agentes de segunda geração, diversos
antitrombóticos foram recentemente desenvolvidos, contribuindo para a expansão do
conhecimento sobre a fisiopatologia da agregação das plaquetas e ativação da coagulação
(GRESELE & AGNELLI, 2002).
Assim, a abordagem terapêutica bem sucedida não compreende apenas o controle do
processo trombótico, mas inclui a identificação e, quando possível, a modificação dos fatores de
risco implicados neste processo.
10 Introdução
F
F
Á
Á
R
R
M
M
A
A
C
C
O
O
S
S
U
U
T
T
I
I
L
L
I
I
Z
Z
A
A
D
D
O
O
S
S
N
N
O
O
T
T
R
R
A
A
T
T
A
A
M
M
E
E
N
N
T
T
O
O
D
D
A
A
T
T
R
R
O
O
M
M
B
B
O
O
S
S
E
E
Os fármacos utilizados como antitrombóticos são subdivididos em duas classes:
anticoagulantes (Figura 3) e antiplaquetários (Figura 4).
Fármacos Anticoagulantes
Figura 3: Fármacos anticoagulantes utilizados na clínica (WEITZ & HIRSH, 2003).
O O
ONa
CH
3
O
O O
OH
CH
3
O
NO
O O
OH
Varfarina Acenocumarol Femprocumona
O
OH
OH
COOH
O
O
O
NHSO
3
-
OH
CH
2
OSO
3
-
O
O
NHSO
3
-
OH
CH
2
OSO
3
-
O
O
OSO
3
-
OH
COOH
O
NHSO
3
-
OH
CH
2
OSO
3
-
O
Heparina
O
OH
O
O
O
OH
H
H
H
N
N
O
O
OH
O
NH NH
NH
2
Dicumarol Melagatran
Na Figura 3 estão mostradas as estruturas químicas de vários compostos anticoagulantes
utilizados na clínica. No entanto, outras substâncias são encontradas como a hirudina (primeira
substância anticoagulante isolada das glândulas salivares de Hirudo medicinales) sendo este
um polipeptídio de sessenta e cinco aminoácidos que atua como inibidor específico da trombina
(WEITZ & HIRSH, 2003). Bivalirudina é um polipeptídio sintético de vinte e cinco aminoácidos
inibidor da trombina e possui tempo de meia vida plasmática de 25 minutos. Argatroban e
Ximelagatran também são bastante utilizados na clínica, sendo este último um anticoagulante
oral que é gerado após a metabolização do melagatran inibidor de trombina (WEITZ & HIRSH,
2003; WEITZ & HIRSH, 1999).
11 Introdução
A varfarina é um anticoagulante oral antagonista da vitamina K e muito utilizada na
terapia antitrombótica. É relatado que a varfarina diminui o risco de trombose venosa profunda
em aproximadamente 90% (CROWTHER, 2003). Acenocumarol e femprocumona são
substâncias sintéticas antagonistas da vitamina K, assim como o dicumarol (MANN, 2005).
Heparina é um fármaco composto de moléculas de oligossacarídeos sulfatados. A função
biológica da heparina é seu efeito anticoagulante que é mediado pela antitrombina III.
Fármacos Antiplaquetários
Figura 4: Fármacos antiplaquetários utilizados na clínica
(SHARIS & LOSCALZO, 2003).
OH
O
O
O CH
3
N
S
Cl
HH
N
S
Cl
H
H
3
CO
2
C
Ácido acetil salicílico Ticlopidina Clopidogrel
Agentes antiplaquetários são usados extensivamente para prevenir e tratar eventos de
trombose arterial. A aspirina é relativamente usada como um inibidor plaquetário, e tem
mostrado efeitos benéficos significativos em pacientes com síndrome coronariana aguda
(SHARIS & LOSCALZO, 2003).
Ticlopidina vem sendo avaliada há muitos anos, mas seu uso é limitado pelo risco de
provocar neutropenia (SHARIS & LOSCALZO, 2003). Clopidogrel foi inicialmente aprovado para
o tratamento sintomático da aterosclerose, mas estudos posteriores têm revelado que o
clopidogrel é um agente para a prevenção da trombose coronariana. Ambos agentes atuam
inibindo a ligação do ADP a seus receptores presentes na membrana plaquetária (SHARIS &
LOSCALZO, 2003).
Embora o tratamento com agentes inibidores de agregação plaquetária, como a aspirina,
ticlopidina e o clopidogrel, e agentes anticoagulantes como a heparina e a varfarina constituam
um extraordinário progresso no tratamento de doenças tromboembólicas (WEITZ & HIRSH,
2001), estas substâncias possuem limitações consideráveis. A aspirina, por exemplo, reduz
eventos vasculares agudos em aproximadamente 25 % dos pacientes com problemas
vasculares, sendo assim, a taxa residual de pacientes com altos ricos, continua alta, o que
justifica a necessidade de um maior desenvolvimento de drogas antitrombóticas efetivas ou
combinações de terapias antiplaquetárias (JACKSON & SCHOENWAELDER, 2003).
12 Introdução
Em particular, eventos como as isquemias cardiovasculares continuam altas e tamém as
complicações associadas às hemorragias (GRESELE & AGNELLI, 2002). Além disso, a prevenção
à estenose após o procedimento de revascularização ainda não foi alcançada, nem com o
estabelecimento de um procedimento preventivo e nem com o uso de agentes antiplaquetários.
A necessidade de monitoramento laboratorial contínuo no tratamento com heparina ou
varfarina é igualmente, considerado desvantajoso. Diante das limitações dos chamados
agentes antitrombóticos de primeira geração e, apesar do progresso com os chamados agentes
de segunda geração, diversos antitrombóticos foram recentemente desenvolvidos (como
inibidores de trombina, inibidores de fator Xa e moduladores de proteína C), contribuindo para
a expansão do conhecimento sobre a fisiopatologia da agregação das plaquetas e ativação da
coagulação (GRESELE & AGNELLI, 2002).
Nos últimos anos, alternativas naturais vêm sendo utilizadas como fonte de busca de
várias substâncias que podem prevenir e até mesmo curar vários tipos de doenças. O reino
vegetal tem se destacado como um grande fornecedor de substâncias com as mais variadas
atividades biológicas. Dos 868 novos fármacos aprovados entre 1981 e 2002, 40% eram
produtos naturais ou derivados de produtos naturais; e 60-80% de fármacos antibacterianos e
anticancerígenos foram derivados de produtos naturais (NEWMAN et al., 2003). Além disso,
entre os 25 agentes farmacêuticos mais vendidos em todo o mundo, 12 são derivados de
produtos naturais (MULLER et al., 2005). Os produtos derivados de plantas, usados na
indústria farmacêutica, representam 6,25% dos produtos farmacêuticos comercializados por
ano no mundo todo (US$ 20 bilhões/ano de produtos derivados de vegetais em um total de
US$ 30 bilhões/ano). No Brasil, em 1996, 25% do total de medicamentos comercializados (US$
8 bilhões) representam os produtos derivados de plantas, ou baseados em componentes
vegetais; embora apenas 8% (cerca de 1.100 espécies) dos recursos vegetais brasileiros
tenham sido identificados como detentores de princípios ativos (MULLER et al., 2005).
13 Introdução
A
A
F
F
A
A
M
M
Í
Í
L
L
I
I
A
A
A
A
p
p
i
i
a
a
c
c
e
e
a
a
e
e
A família Apiaceae possui distribuição cosmopolita, incluindo aproximadamente 400
gêneros e 4000 espécies, representando uma das maiores famílias de Angiospermas. No Brasil
ocorrem oito gêneros e cerca de 100 espécies (SOUZA, 2005). São ervas, raramente arbustos
ou árvores e geralmente aromáticas; folhas alternas, às vezes com pecíolo invaginante
semelhante a uma bainha (Foeniculum), simples ou compostas, ocasionalmente sectas.
Inflorescências do tipo umbela, mais frequentemente composta, às vezes reduzida a um
glomérulo (Eryngium): flores não vistosas, bissexuadas (Klotzschia), actinomorfas, diclamídeas
ou raramente monoclamídeas: cálice geralmente pouco desenvolvido e pentâmero,
dialissépalo; corola em geral pentâmera, dialipétala de forma secundária, já que nos estágios
embrionários é gamopétala, prefloração valvar; ovário ínfero (com o desenvolvimento
freqüente de um estilopódio, que dá a aparência de ser súpero), bicapelar, bilocular, muito
raramente unicapelar por aborto, placentação pêndula, lóculos uniovulados, raramente
biovulados, sendo um deles abortivo. Fruto em forma de esquizocárpico, com mericarpos
semelhantes a aquênios (SOUZA, 2005).
Muitas espécies da família Apiaceae são cultivadas no Brasil como condimentos e
alimentos. Na alimentação são utilizadas as partes subterrâneas como é o caso da cenoura
(Daucus carota) e da mandioquinha ou batata-baroa (Arracacia graveolens), ou as partes
aéreas, incluindo-se neste grupo o aipo (Anethum graveolens), o funcho (Foeniculum vulgare),
a salsa (Petroselinum crispum - foco principal desta dissertação), o salsão (Apium graveolens)
e o coentro - Coriandrum sativum - (SOUZA, 2005).
Pertence também a esta família a cicuta (Conium maculatum), planta utilizada como
raticida e que é mundialmente conhecida por ter sido utilizada como veneno.
Vários gêneros da família Apiaceae são encontrados no Brasil sendo alguns naturais e
outros introduzidos (Tabela 1).
Tabela1: Gêneros da família Apiaceae nativos do Brasil e introduzidos (SOUZA, 2005).
Gêneros nativos Gêneros introduzidos
Apium Aegopodium Ammi
Bowlesia Anethum Angélica
Centella Anthriscus Arracacia
Daucus Carum Chaerophyllum
Eryngium Conium Coriandrum
Klotzschia Cuminum Cyclospermum
Lilaeopsis Foeniculum Pastinaca
Spananthe Petroselinum Pimpinella
14 Introdução
Classificação Botânica de Petroselinum crispum
Reino: Plantae
Divisão: Spermatophyta
Classe: Magnoliatae
Ordem: Apiales
Família: Apiaceae
Gênero: Petroselinum
Espécie: Petroselinum crispum (Mill) Nym.ex A.W. Hill
http://www.uni-graz.at/~katzer/engl/spice_bot.html (GERNOT, 2006)
Classificação Botânica do gênero Petroselinum
Para o gênero Petroselinum, é descrita somente uma única espécie, a Petroselinum
crispum, objeto de nosso estudo. Diversas sinonímias botânicas como P. sativum L., P.
hortense Hoffm. e Apium petroselinum Mill. (KREYDIYYEH & USTA, 2002) são conhecidas.
Petroselinum crispum
Originária do sul da Europa, provavelmente do Mediterrâneo, e conhecida por mais de
dois mil anos, a salsa é uma espécie cosmopolita muito consumida em grande quantidade no
mundo inteiro (ROULIER, 2005).
A salsa ou salsinha talvez seja uma das ervas mais antigas utilizadas pelo homem como
condimento. O nome em latim vem do radical grego, sélinon que significa aipo, ou salsão, e
quando se coloca o radical petro o significado passa a ser “aipo da pedra”. Isto provavelmente
devido a sua origem ser justamente de lugares rochosos.
Já fazia parte do conhecimento dos gregos já no terceiro século antes de Cristo o uso
desta erva. Muito difundida por todos os continentes, se tornou tão popular que passou a ser o
condimento mais empregado na cozinha no dia-a-dia, possui ação diurética, emenagoga
(estimula a menstruação) e previne as doenças cardiovasculares (TRUDEAU, 2006).
É uma erva bianual de 40-80 cm de altura, glabra, brilhante aromática, caule estriado,
ramoso; folhas triangulares no contorno, as inferiores bitripinatissetas de segmentos inciso-
dentadas, as superiores ordinariamente de três segmentos inteiras lanceolado-lineares, flores
Foto: Douglas Siqueira Chaves
15 Introdução
de um verde amarelado, em umbelas longamente pedunculadas, invólucros com três folíolos
lineares; fruto subgloboso e aromático. Floresce de outubro a dezembro (PIO CORREA, 1988;
MATHIAS et al., 1972).
Muito cultivada no Brasil é facilmente encontrada em muitas localidades. Fornece folhas
condimentares universalmente utilizadas na culinária. A raiz é aperitiva e os frutos
carminativos; deste se extrai o apiol substância oleaginosa e útil no tratamento da amenorréia
e dismenorréia, entretanto perigosa porque uma dose de quatro gramas basta para produzir
um efeito alucinógeno. Acredita-se que esta planta tem a propriedade de suprir a secreção
láctea das mulheres (PIO CORREA, 1988; MATHIAS et al., 1972).
Estudos anteriores da espécie Petroselinum crispum
Aspectos Químicos
No levantamento bibliográfico realizado sobre a espécie P. crispum no banco de dados ISI
(Information Science Institute) foram encontrados diversos trabalhos relacionados à parte
química. A partir deste levantamento foram selecionados alguns estudos sobre as diferentes
classes químicas presentes, sendo assim, podemos citar:
Terpenos
De acordo com a literatura, foram encontrados três sesquiterpenos identificados para esta
espécie, sendo estes crispana, crispanona, angelato lasidiol e dois monoterpenos petrosideo e
petranol (APPENDINO et al., 1998; YOSHIKAWA et al., 2000).
OO
O
OH
H
O
O
OH
H
O
O
O
HO
Crispanona Crispana Angeloil lasidíol
HO
O
HO
O
H
OH
OH
HO
HO
O
HO
Petrosideo Petranol α-terpeno
16 Introdução
O estudo fitoquímico sobre a espécie P. crispum conduziu ao isolamento e a identificação
de seis estruturas químicas com esqueleto de fenilpropanóides e presentes em óleos essenciais,
representadas abaixo (APPENDINO et al., 1998). É importante ressaltar que de acordo com
MINIJA & TROPPIL (2003) o componente majoritário na espécie é a miristicina, chegando a
62,02 % em 100 g de folhas frescas e 93,15 % em 100 g de sementes.
O
O
OCH
3
O
O
OCH
3
OCH
3
O
O
OCH
3
OCH
3
O
Miristicina Apiol Fenilpropanóide aldeído
H
3
CO
H
3
CO
OCH
3
OCH
3
H
3
CO
H
3
CO
OCH
3
Elemicina Tetra-metoxialilbenzeno
Cumarinas
Existem relatos na literatura que indicam que esta espécie produz algumas substâncias
que podem ocasionar queimadura da pele quando expostas à luz. Estas substâncias são
furanocumarinas e DUINSLAEGER & VANDERKELEN (1995) demonstraram que a produção
máxima destas substâncias ocorre no mês de junho e a produção mínima no mês de agosto, na
Bélgica. As principais furanocumarinas encontradas são:
O
O
O
O
O
O
OCH
3
O
O
O
OCH
3
Psoraleno Bergapteno Xantotoxina
17 Introdução
Éster graxo
Foi encontrada na literatura somente uma substância graxa para P. crispum, denominada
ácido petroselinico (GUIET et al., 2003).
H
3
CO
O
Éster Petroselinico
Aspectos biológicos
A espécie Petroselinum crispum largamente difundida no Brasil e no mundo vem
recebendo uma grande atenção por parte dos pesquisadores e é uma das espécies mais
estudadas da família Apiaceae.
KREYDIYYEH & USTA (2002) verificaram o efeito diurético do extrato aquoso das
sementes de P. crispum quando administrado por via oral em ratos. Os autores observaram um
aumento do volume de urina eliminado durante 24 horas após administração do extrato. O
efeito ainda foi evidente na presença de amiloride e furosemida (agentes diuréticos) e na
ausência de sódio, mas não na ausência de potássio, sugerindo assim que o efeito diurético da
espécie é mediado pela diminuição de retenção de potássio no lúmen.
Foi observada atividade laxativa do extrato aquoso da P. crispum através de perfusão, na
avaliação da absorção de água no cólon do rato. O extrato provocou uma alta redução da
absorção de água. Quando o extrato foi administrado concomitantemente com sódio livre, a
absorção de água foi praticamente a mesma. Os autores sugerem que o provável mecanismo
de ação seria a inibição da bomba de sódio e potássio ATPase no cólon do animal (KREYDIYYEH
et al., 2001).
O extrato metanólico contendo cumarinas mostrou uma modesta ação antimicrobiana. Foi
relatada essa ação, frente às espécies de bactérias, como: Bacillus subtilis, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus e Saccharomyces cerevisiae. O
extrato mostrou também uma clara inibição do crescimento de fungos patogênicos como
Heterobasidion annosum. Nesse mesmo estudo, o extrato de P. crispum promoveu o
crescimento do patógeno Phytophtora cactorum (OJALA et al., 2000).
Foi demonstrado por AL-HOWIRINY et al. (2003) que o extrato etanólico de Petroselinum
crispum, administrado oralmente, possui propriedade gastroprotetora com efeitos significantes
na inibição da secreção gástrica basal e formação de lesões gástricas induzidas pela ligação de
Helicobacter pylori, indometacina e estresse. Testes de toxicidade aguda mostraram uma larga
18 Introdução
margem de segurança para o extrato. O estudo químico da folha de P. crispum revelou a
presença de taninos, flavonóides, esteróis e triterpenos (AL – HOWIRINY et al., 2003).
Há relatos populares onde se afirma que a espécie P. crispum pode ter ação benéfica em
desordens prostáticas, reduzindo assim as alterações fisiológicas, provocadas pela patologia
(ALI – SHTAYED et al, 2000).
Os estudos realizados no Departamento de Toxicologia, do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina de Montevidéu – Uruguai, CIGANDA & LABORDE (2003) relataram que o
infuso da espécie P. crispum após ser ingerido, causou sérios efeitos tóxicos em vinte e três
pacientes. E ainda foram diagnosticados três casos de intoxicação grave, quando ocorre a
administração da P. crispum concomitantemente com a espécie Ruta graveolens.
Com base nas indicações populares do uso de P. crispum no tratamento da hipertensão
vêm sendo realizados, em Marrocos, estudos com a parte aérea desta planta e de mais
dezessete espécies. Os autores observaram uma significativa ação antiagregante plaquetária,
para o extrato aquoso da planta (ZIYYAT et al., 1997), sem que as substâncias responsáveis
por esta atividade tenham sido identificadas.
Em virtude do alto crescimento da doença de
Alzheimer, estudos relacionados com a
inibição da acetilcolinesterase (AChE) vêm sendo realizado por diversos grupos com as mais
diversificadas plantas. ADSERSEN et al. (2006) realizaram a produção de um extrato aquoso e
metanólico das folhas de P. crispum, e observaram que o extrato aquoso não apresentou ação
inibitória nenhuma frente esta enzima, não mostrou ser tão ativo o quanto esperado.
FLAVONÓIDES: ASPECTOS QUÍMICOS E A IMPORTÂNCIA BIOLÓGICA
Os flavonóides são pigmentos sintetizados a partir da fenilalanina (Figura 5),
responsáveis pelas maravilhosas cores das pétalas da flor, e muitas vezes emitem uma
coloração fluorescente brilhante quando excitados pela luz UV. Os flavonóides são utilizados
pelos botânicos para a classificação taxonômica. Regulam o crescimento e o desenvolvimento
das plantas, inibem ou matam muitas bactérias e inibem importantes enzimas virais, tais como
a transcriptase reversa e outras proteases e matam alguns protozoários patogênicos. Ainda
possuem uma baixa toxidade aos animais.
Os flavonóides são componentes funcionais de muitas preparações para o uso médico, por
exemplo, a própolis e o mel do inseto, que são usados desde épocas antigas. O uso dos
flavonóides vem sendo aumentado para tratar as mais diversas doenças, devido a sua
habilidade de inibir enzimas específicas, simular alguns hormônios neurotransmissores, e de
atuarem como seqüestradores de radicais livres (HAVSTEEN, 2002).
19 Introdução
Compreende um grupo de aproximadamente 4000 compostos de ocorrência natural que
são produzidos em todas as plantas vasculares (DI CARLO et al., 1999).
Os flavonóides são compostos estruturalmente de dois anéis aromáticos (anéis A e B)
interligados por um anel heterocíclico (anel C) formando um sistema –C
6
-C
3
-C
6
-, sendo duas
unidades da molécula com seis carbonos aromáticos. Modificações no anel central C levam à
diferenciação dos subtipos de flavonóides como flavanonas, flavonas, isoflavonas,
diidroflavonol, flavonol, flavan-3-ol e antocianinas (GEBHARDT et al., 2005).
Biossíntese dos flavonóides
De acordo com DEWICK (2002), a rota biossintética dos flavonóides pode ser
esquematizada como mostra a Figura 5.
Figura 5: Rota biossintética dos flavonóides (adaptado de DEWIC, 2002).
OH
CoAS
O
3x Malonyl CoA
OH
O
O
OO
SCoA
OH
OO
O
SCoAO
Reação aldólica
HO
OH
OH
Estilbeno
Chalcona sintetase
O
OH
OH
OH
HO
NADPH
OH
OOH
O
SCoAO
O
OH
OH
HO
O
O
OH
OH
HO
O
O
OH
HO
Flavanona
Flavanona
O
O
OH
OH
HO
Flavona
O
2
2-oxoglutarato
20 Introdução
Estrutura química de alguns flavonóides
O
O
4
5
6
7
8
2´
3´
4´
5´
6´
A
B
O
O
4
5
6
7
8
2´
3´
4´
5´
6´
A
B
O
O
5
6
7
8
2´
3´
4´
5´
6´
B
A
O
O
4
5
6
7
8
2´
3´
4´
5´
6´
OH
A
B
Flavanona Flavona Isoflavona Flavonol
O
O
5
6
7
8
2´
3´
4´
5´
6´
OH
A
B
O
5
6
7
8
2´
3´
4´
5´
6´
OH
A
B
O
5
6
7
8
2´
3´
4´
5´
6´
A
B
O
O
5
6
7
8
2´
3´
4´
5´
6´
B
A
OH
Flavanolol Flavan-3-ol Antocianina Isoflavonol
De acordo com a rota biossintética, os padrões de oxidação mais comum para o anel
estão nas posições 5 e 7. Na posição 7 é muito freqüente ocorrer açúcares ligados. No anel B
as posições preferenciais de oxidação são 3’, 4’ e 5’.
Metilação e glicosilação de flavonóides
As reações de metilação e glicosilação ocorrem através da catálise de enzimas. Pode- se
citar, como exemplo, o caso da glicosilação na posição 3 de esqueletos de flavonóide, do tipo
quercetina e kaempferol, pela ação da O-glucosiltransferase, agindo a UDPglicose como
doadora de glicose. A glicosilação de flavanonas, flavonas, diidroxiflavonóis e antocianidinas
não ocorrem diretamente, como no caso do flavonol.
As reações de metilação de flavonóides ocorrem através da ação da enzima O-
metiltransferase (ALMEIDA, 2000).
Propriedades Biológicas dos Flavonóides
Os flavonóides apresentam uma alta reatividade química que é expressa pela grande
afinidade por polímeros biológicos, metais pesados, pela interferência no transporte de elétrons
e captação de radicais livres (HAVSTEEN, 2002).
21 Introdução
Devido à alta capacidade de modulação enzimática, os flavonóides apresentam diversas
atividades biológicas como efeito neuro-estimulatório, efeito analgésico, ação hormonal,
potencial antitumoral, antibacteriana, antialérgico, antiulcerogênico, e atuam na prevenção e
cura das doenças cardiovasculares (HAVSTEEN, 2002; DI CARLO et al., 1999).
Abaixo serão listadas algumas atividades biológicas dos flavonóides, principalmente
aquelas relacionadas com os ensaios realizados nesta dissertação.
Substâncias isoladas de espécies vegetais que interferem na coagulação
plasmática
Compostos fenólicos
Evidências epidemiológicas sugerem que a ingestão inadequada de certos nutrientes leva
à predisposição humana a certas doenças degenerativas crônicas. Foi demonstrado que com
uma dieta adequada, rica em vegetais e frutas foi possível reduzir a probabilidade de doenças
cardiovasculares, mas o exato mecanismo da ação protetora não é conhecido (CHENG, 2006;
DI CARLO et al., 1999).
Porém, o aumento circulante de moléculas antioxidantes é importante, uma vez que as
mesmas reduzem os radicais livres produzidos por diversas patologias. A ingestão de flavonóis
antioxidantes levam a uma diminuição da mortalidade por doenças cardiovasculares em
mulheres. Em particular, os estudos epidemiológicos mostram que uma dieta rica em
flavonóides (quercetina, catequina e epicatequina, presentes em vinho tinto, mas também em
frutas e vegetais) está associada com a diminuição dos riscos de doenças cardiovasculares
(SUOMELA et al., 2006; CIRICO & OMAYE, 2006; DI CARLO et al., 1999; JANSSEN et al., 1998;
HERTOG & HOLLMAN, 1996; GRYGLEWSKY et al., 1987).
A ação antioxidante dos flavonóides parece estar relacionada com a ação antitrombótica,
uma vez que, as ações antitrombótica e vasoprotetora da quercetina, rutina e outros
flavonóides foram atribuídas à capacidade destes se ligarem às membranas das plaquetas e
eliminar os radicais livres. Mas nem toda a ação antitrombótica dos flavonóides está
relacionada com a atividade antioxidante. Os flavonóides levam à redução da agregação
plaquetária ou danos após isquemia. Ainda deve se considerar que, estes promovem um
aumento de óxido nítrico produzido pelo endotélio, inibem a síntese de tromboxano em
plaquetas e leucotrienos em neutrófilos, e modulam a produção de lipoproteínas (CHENG,
2006; COOK & SAMMAN, 1996; DI CARLO et al., 1999; GRYGLEWSKY, et al., 1987).
Os flavonóides quercetina 3-acetil-7-3’-4’-trissulfato e quercetina 3,7,3’-4’-tetrassulfato
representam um grupo de compostos sulfatados que têm sido produzidos em um grande
22 Introdução
número de plantas, especialmente na família Asteraceae. A incubação das plaquetas com estes
flavonóides causou uma inibição tempo-dependente da agregação plaquetária frente a vários
agonistas, incluindo adenosil difosfato (ADP), trombina (THR) e colágeno (GUGLIELMONE et al.,
2005).
No entanto, ainda não está claro se os grupos sulfatos são de extrema importância para
esta atividade (GLUGLIELMONE et al., 2005) visto que outros flavonóides, não sulfatados,
mostraram uma atividade inibitória frente ao colágeno. Quando alguns flavonóides apresentam
substituintes como o trans-p-cumaroil e o aumento do número de açúcares (maior do que três
unidades na mesma molécula), os autores demonstraram uma diminuição da atividade destas
moléculas (CARATENUTO et al., 1996).
Estudos mostram que moléculas como quercetina, apigenina, catequina e quercetina-3-
glicosideo – que foram administradas através de uma dieta suplementar a voluntários -
estariam relacionadas com a diminuição do risco de doenças cardiovasculares, uma vez que as
mesmas inibiram a agregação plaquetária significantemente (JANSSEN et al., 1998).
Moléculas como resveratrol, catequina, epicatequina e ácido gálico, foram isoladas do
extrato de uvas vermelhas. A agregação plaquetária foi induzida pelo agonista ADP e estes
compostos fenólicos demonstraram uma inibição dose-dependente através do ensaio com
plaqueta lavada.
Procianidinas são substâncias presentes em grandes concentrações em cacao, uvas,
vinhos, maçãs e outras frutas incluindo ameixa. O metabolismo destas substâncias ainda não é
bem conhecido. Muitos efeitos biológicos são relatados para estas substâncias, incluindo um
potencial efeito sobre o sistema vascular, fazendo com que ocorra uma diminuição da
agregação plaquetária, diminuição da produção do colesterol LDL (Low density lipoprotein -
lipoproteína de baixa densidade) (CASSIDY & HOOPER, 2006).
Saponina
A Glicirrizina (GL) (
Figura 6) é um composto natural, obtido do extrato aquoso da raiz da
Leguminosae Glycyrrhiza glabra (alcaçuz-da-europa), que tem sido intensamente estudada. A
GL é uma saponína que possui uma molécula de ácido glicirrético (GA) e duas moléculas de
ácido glicurônico (GU) (FRANCISCHETTI et al., 1997). A partir de estudos in vitro, foi
observado que a GL exibe uma atividade anticoagulante significativa, através da inibição da
trombina. A GL também foi avaliada em ensaios de tempo de recalcificação mostrando desde
um ligeiro aumento do tempo de coagulação, até uma incoagulabilidade total do plasma, de
acordo com as doses testadas. Estes ensaios também foram realizados com o GA e o GU, mas
estes componentes não apresentaram ação inibitória, sugerindo que estes constituintes agem
23 Introdução
de maneira conjunta para o efeito inibitório apresentado pela GL.
Estudos para a avaliação do efeito da GL sobre a hidrólise induzida por trombina de um
pequeno substrato cromogênico específico, mostraram que a glicirrizina não foi capaz de inibir
a hidrólise, mas de aumentar as atividades catalíticas da trombina, sugerindo que a glicirrizina
não se liga ao sítio catalítico da enzima, mas promove uma mudança conformacional na
estrutura molecular da trombina. Esta sugestão é reforçada por diversos estudos que têm
demonstrado que diferentes ligantes do exosítio I causam mudanças conformacionais no sítio
catalítico da enzima que poderiam contribuir para uma alteração na sua especificidade
(FRANCISCHETTI et al., 1997).
Figura 6: Glicirrizina
O
COOH
O
O
O
OH
COOH
OH
O
OH
OH
COOH
OH
Alcalóides
SHEU et al. (1998) demonstraram para a substância denominada rutecarpina, que sua
ação inibitória da agregação plaquetária não estava relacionada com as glicoproteínas IIb/IIIa,
proteínas importantes na agregação. Os autores sugerem que o mecanismo pela qual a
rutecarpina poderia estar atuando, seria através da inibição da fosfolipase C, levando a
diminuição da produção de Tromboxano A
2
(TXA
2
), um importante indutor da agregação
plaquetária.
Alcalóides diterpênicos isolados da espécie Spiraea japonica apresentaram ação inibitória
da agregação plaquetária in vitro a partir de plasma rico em plaquetas obtido do sangue de
coelhos. A agregação foi induzida por ácido araquidônico e ADP. O efeito inibitório foi em dose-
24 Introdução
dependente, totalmente seletivo. A substância de maior efeito inibitório foi a spiramina C1 que
mostrou ser tão eficaz quanto à aspirina, controle positivo (LI et al., 2002).
Flavonóides isolados e identificados na espécie P. crispum
Espécies de plantas da família Apiaceae são altas produtoras de flavonóides
especialmente flavonas e flavonol cuja biossíntese está relacionada com três enzimas
extremamente importantes: flavona sintetase I (FNS I), flavona sintetase II (FNS II) e
flavanona 3β-sintetase (FHT).
GEBHARDT et al. (2005) observaram que a espécie P. crispum apresenta diversos
flavonóides que são produzidos de acordo com a atividade enzimática presente em cada fase
de crescimento da espécie. Para o segundo estágio foram observados 100 % de atividade da
enzima FNS I, sendo assim, nesta fase de crescimento da planta ocorre uma alta produção de
flavona nesta espécie. Flavanonas quase não foram identificadas para a espécie, somente nas
amostras adultas (estágio 3 e 4) (Figura 7).
Figura 7: Estágios de crescimento da espécie P. crispum e sua atividade enzimática (GEBHARDT et al.,
2005).
HAHLBROCK & KREUZALER (1972) realizaram cultura de células de P. crispum, com a
intenção de aumentar a produção de flavonóides glicosilados (flavonas e flavonol). Foi
provocado um estresse emitindo luminosidade as células em cultura durante vinte e quatro
horas. Sob esta condição foram isolados vinte e quatro flavonóides glicosilados, sendo as
principais agliconas: apigenina, luteolina e crisoeriol para flavonas e quercetina e isoramnetina
para flavonol. Foram detectados ainda dois açúcares majoritários: apiose e glicose.
Em 1953 foi descrito pela primeira vez um flavonóide denominado apiína por HEMMING &
OLLIS, isolado de extrato aquoso de P. crispum. Esta substância foi contestada por diversos
0
20
40
60
80
100
Estágio 1 Estágio 2 Estágio 3 Estágio 4
(%) máximo de atividade
FNS I
FHT
25 Introdução
autores e em 1957, BEDERKE et al. demonstraram a presença desta molécula em salsa e ainda
identificaram outros flavonóides como a diosmina (metoxilada na posição 4’ do anel B),
luteolina, apigenina e luteolina 7-apiosil-glicosideo.
Apiina foi descrita como sendo o componente majoritário desta espécie, e ela vem sendo
estudada por muitos pesquisadores em todo o mundo. São conhecidas diversas propriedades
dentre as quais a propriedade gelificante, que vem chamando muito a atenção de vários
pesquisadores, podendo ser utilizada na indústria na composição de fórmulas contendo gel e na
indústria alimentícia (LUTHRIA et al., 2006; KOGYO, 1992).
Tabela 2: Flavonóides isolados e identificados da espécie Petroselinum crispum
Composto Fonte Referência
Apigenina
Folhas BEDERKE et al., 1957.
Folhas, raiz e caules GEBHARDT et al., 2005.
Luteolina
Folhas BEDERKE et al., 1957.
Folhas, raiz e caules GEBHARDT et al., 2005.
Luteolina 7-O-apiosilglicosidio Folhas BEDERKE et al., 1957.
Diosmina Folhas BEDERKE et al., 1957.
Crisoeriol Cultura de células HEMPEL et al., 1999.
Kaempferol Cultura de células HEMPEL et al., 1999.
Quercetina Cultura de células HEMPEL et al., 1999.
Isoramnetina Cultura de células HEMPEL et al., 1999.
Malonilapiina Folhas LUTHRIA et al., 2006.
Apiina Folhas, raiz e caules
HEMMING & OLLIS, 1953;
BEDERKE et al., 1957;
YOSHIKAWA et al., 2000;
LUTHRIA et al., 2006.
O
O
O
OH
OH
O
O
OH
HO
HO
O
OH
HO
OH
H
H
H
O
O
O
OH
OH
O
O
OH
HO
HO
O
OH
HO
OH
H
H
H
OH
Apiina Luteolina 7-apiosilglicosideo
26 Introdução
O
O
HO
OH
OH
O
O
HO
OH
O
H
OH
O
O
HO
OH
OCH
3
OH
O
O
HO
OH
OH
OCH
3
Apigenina Luteolina Diosmina Crisoeriol
27 Objetivos
OBJETIVOS
28 Objetivos
O
O
B
B
J
J
E
E
T
T
I
I
V
V
O
O
G
G
E
E
R
R
A
A
L
L
O crescimento do número de casos de morte decorrente da formação de trombos que
obstruem os vasos sanguíneos é um fato importante. Isto pode ser observado através do
crescimento contínuo de artigos científicos publicados sobre a trombose (GRESELE & AGNELLI,
2002). Sabe-se que vários compostos fenólicos estão relacionados com a cura ou até mesmo a
prevenção desta patologia, segundo estudos relatados. Com base no fato de espécies da
família Apiaceae serem ricas em compostos fenólicos da classe dos flavonóides, os objetivos
deste trabalho foram avaliar a composição química das frações de P. crispum e avaliar a
capacidade destas frações atuarem sobre a hemostase.
O
O
B
B
J
J
E
E
T
T
I
I
V
V
O
O
S
S
E
E
S
S
P
P
E
E
C
C
Í
Í
F
F
I
I
C
C
O
O
S
S
Parte Química:
9 Isolar, a partir do extrato aquoso de folhas de Petroselinum crispum, as frações e
componentes responsáveis pela atividade sobre a coagulação plasmática.
9 Determinar a estrutura química dos flavonóides identificados na espécie.
9 Estabelecer um perfil químico das frações estudadas (Pcsn, PcAq e PcB) através
da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) acoplada a Espectrometria de
Massas (EM).
Parte Biológica:
9 Avaliar o efeito anticoagulante in vitro das frações de Petroselinum crispum por
ensaios de coagulação (aPTT e PT);
9 Avaliar a atividade antiplaquetária das frações estudadas em plaquetas humanas
utilizando como indutor a trombina humana e ADP.
29 Materiais e métodos: Experimental Geral
MATERIAIS E M
É
TODOS:
EXPERIMENTAL GERAL
30 Materiais e métodos: Experimental Geral
E
E
x
x
p
p
e
e
r
r
i
i
m
m
e
e
n
n
t
t
a
a
l
l
A parte experimental encontra-se dividida em duas etapas com a finalidade de facilitar o
entendimento do leitor. A primeira parte trata-se da Experimental Geral, nesta estão descritas
todas as técnicas utilizadas.
Na segunda parte, Experimental I, encontra-se descrita toda a purificação do decocto de
P. crispum, que foi realizado no LPN-Bio - Laboratório de substâncias naturais bioativas, que
resultou na obtenção de duas substâncias flavonoídicas e a descrição dos ensaios biológicos.
Técnicas Gerais
Parte Fitoquímica
Obtenção do material vegetal e preparo dos extratos
O material vegetal foi coletado no campo experimental da Universidade Severino Sombra,
Vassouras – RJ, fora do período de floração. Após a coleta foi realizada uma exsicata que está
depositada no instituto no Instituto de Botânica da Universidade Federal do Rio de Janeiro –
UFRJ sob o número RFA 31241.
As folhas frescas de P. crispum foram coletadas, lavadas com água destilada e trituradas
em um liquidificador de uso doméstico. As folhas trituradas foram submetidas à decocção. Esta
técnica se baseia em ferver o material vegetal em água por um determinado tempo (10
minutos). Após este período o material resultante esfria à temperatura ambiente e o decocto é
retirado por meio de filtração. A filtração do decocto e subfrações foi realizada utilizando papel
de filtro Whatman nº 1
Secagem das Amostras
O decocto e as frações aquosas obtidas através de cromatografias foram secos em
liofilizador da marca Liobrás do Brasil L105, sob vácuo reduzido (100 – 200 µmHg) a uma
temperatura de -43
o
C.
Fracionamento do Decocto
Após a filtração do decocto foi observada a presença de um precipitado branco floculoso,
o qual foi separado por centrifugação, obtendo-se duas frações denominadas sobrenadante e
31 Materiais e métodos: Experimental Geral
precipitado. A fim de separar as substâncias presentes no sobrenadante em três faixas distintas
de polaridade, foram feitas partições em acetato de etila e n-butanol, em ordem crescente de
polaridade. Foram obtidas uma fração em acetato de etila, uma fração butanólica e uma fração
aquosa residual (Esquema 1). A partição utilizando acetato de etila permite separar moléculas
de baixa e média polaridade, como por exemplo, ácidos graxos e flavonóides (agliconas
principalmente), terpenos e cumarinas. Já as moléculas de maior polaridade, como aquelas que
possuem unidades de carboidratos, preferencialmente são encontradas na fase butanólica. Os
carboidratos, ácidos aminados e taninos, por exemplo, são encontrados na fase aquosa residual
(FALKENBERG et al., 2004).
Esquema 1: Sistema de purificação do extrato com solventes orgânicos
Suportes Cromatográficos
As cromatografias em fase inversa foram realizadas em sílica silanizada RP-2, tamanho da
partícula 0,063-0,200mm (70-230 mesh) e as cromatografias por exclusão molecular foram
realizadas em gel Sephadex LH-20-100 lipofílico (25-100 nm, Sigma).
O fracionamento em colunas cromatográficas foi monitorado por cromatografia em
camada delgada (CCD) utilizando sílica 60 F
254
em Al (Merck) como suporte e n-butanol / ácido
acético / água (BAW 8:1:1) e acetato de etila / acetona / ácido acético / água (AAAA 30:3:1:1)
como fase móvel. Os cromatogramas foram visualizados sob luz ultravioleta de diferentes
comprimentos de onda (UV; 254 nm e 365 nm) e revelados com solução de sulfato cérico para
a detecção de substâncias fenólicas (flavonóides), seguidas de aquecimento (50
o
C) em chapa
aquecedora Corning.
Sobrenadante
Fração
Aquosa
Fração
Orgânica
Fração
Aquosa
Fração
Orgânica
Fração em AcOEt
Fração em BuOH
n-butanol
Acetato de Etila
32 Materiais e métodos: Experimental Geral
Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE)
As análises de CLAE-UV-EM foram executadas em instrumento HP 1100L com detector
“Diode Array” e controladas por uma estação de trabalho HP 9000 (Hewlett & Packard, Palo
Alto, CA, EUA). A coluna de fase inversa utilizada era uma RP-18 (5 µm, 250 mm, 2,5 mm d.i.,
Luna , Phenomenex, USA) mantida a 30ºC.
Os espectros no UV-Vis foram registrados no intervalo de 200-450 nm. O sistema do
CLAE foi acoplado com um espectrômetro de massas HP 1100 MSD API-electrospray (Hewlett &
Packard, Palo Alto, CA, USA). Os espectros de massas foram registrados na modalidade íon-
negativa. A temperatura capilar era de 220ºC, a tensão do capilar de 3.0 V, a tensão da fonte
de 4.2 kV, a tensão das lentes do tubo de 30 V e a energia de colisão de 35%.
As análises foram realizadas pela então doutoranda Michelle Frazão Muzitano (NPPN –
UFRJ) no Dipartimento di Schienze Farmaceutiche - Universidade de Florença – Itália, sob
orientação do professor Dr. Franco Francesco Vincieri.
Gradiente utilizado: ácido fosfórico 0,01 % (A) e acetonitrila (B), como descrito na
Tabela 3, fluxo 1 ml/min e detector de UV a 254 nm e 365 nm (volume de injeção: 20 µl de
1,5 mg/ml).
Tabela 3: Sistema de gradiente utilizado para a realização da CLAE
Tempo Concentração de A
(ácido fosfórico 0,01%)
Concentração de B
(acetonitrila)
0 minuto 100 % 0 %
5 minutos 55 % 45 %
15 minutos 53 % 47 %
25 minutos 52 % 48 %
35 minutos 48 % 52 %
45 minutos 45 % 55 %
50 minutos 40 % 60 %
55 minutos 100 % 0 %
As amostras foram preparadas em 6 mg/ml e filtradas antes da injeção para evitar o
entupimento do sistema cromatográfico.
33 Materiais e métodos: Experimental Geral
Espectros de Ressonância Magnética Nuclear de
1
H,
13
C, COSY, HMQC e HMBC
Os espectros de RMN (Ressonância Magnética Nuclear)
1
H e
13
C, foram realizados
utilizando como solvente DMSO-d
6
e como padrão de referência TMS (tetrametilsilano).
Espectros em duas dimensões (2D), homo (
1
H,
1
H) e heteronuclear (
1
H,
13
C) foram também
realizados. As técnicas 2D permitem correlacionar hidrogênios e/ou carbonos que possuam
alguma relação escalar ou espacial e distinguir sinais que se encontram sobrepostos. Desta
forma é possível fazer um mapeamento estrutural mais preciso do que utilizando somente as
técnicas 1D e dados de possíveis compostos similares da literatura (KAISER, 2000; TIMOTHY,
1999).
Um resumo das técnicas 2D utilizadas neste trabalho é mostrado a seguir:
COSY (COrrelation SpectroscopY)
Com esta técnica foi possível estabelecer as correlações entre os hidrogênios que estão
acoplados por
2-3
J
H,H
(acoplamentos geminais e vicinais, mensuráveis no espectro 1D) e assim
discernir a multiplicidade dos sinais observados no espectro de RMN
1
H. Eventualmente, sinais
devidos a
4-6
J
H,H
são também visíveis (KAISER, 2000; TIMOTHY, 1999).
HMQC (Heteronuclear Multiplet Quantum Coherence)
Com esta técnica foi possível assinalar os carbonos que contém hidrogênios, caso já
tenham sido assinalados todos os hidrogênios do espectro de RMN
1
H ou vice-versa, pois a
técnica depende dos acoplamentos
1
J
C,H
. O espectro é apresentado com o eixo vertical aos δ
C
e
o eixo horizontal correspondendo aos δ
H
(KAISER, 2000; TIMOTHY, 1999).
HMBC (Heteronuclear Multiplet Bond Correlation)
As correlações referem-se aos acoplamentos
n
J
C,H
(n > 2). Os sinais devidos ao
1
J
C,H
estão
invariavelmente presentes, o que torna imprescindível a realização de um HMQC. As
informações obtidas das correlações
n
J
C,H
são muito importantes em uma determinação
estrutural, principalmente para estabelecer a posição dos carbonos não hidrogenados (KAISER,
2000; TIMOTHY, 1999).
34 Materiais e métodos: Experimental Geral
Para a realização dos espectros 1D e 2D, os seguintes aparelhos foram utilizados em
colaboração com o professor Carlos Roland Kaiser – Instituto de Química – UFRJ.
Bruker DRX-300 (
1
H: 300,13 MHz;
13
C: 75,48 MHz);
Varian Gemini 200 (
1
H: 200 MHz;
13
C: 50 MHz).
Espectrometria de massas para flavonóides
A espectrometria de massas (EM) é importante para a determinação estrutural de
flavonóides glicosilados e agliconas. A vantagem da EM é a alta sensibilidade, especialmente
quando se dispõe de pouca quantidade de amostra.
Os íons mais comuns nos espectros de flavonóides são os resultantes de fragmentação
dos anéis A e B. Estes fragmentos são denominados A
+
e B
+
, respectivamente (RIJKE et al.,
2006).
RIJKE et al. (2006) demonstraram que uma reação de fragmentação importante para os
flavonóides é a reação RDA (Retro Diels-Alder), a qual pode ocorrer em anéis cíclicos de seis
membros, que contém duplas ligações e envolve rearranjo dos pares de elétrons do anel
cíclico. O resultado destes rearranjos é a clivagem de duas ligações σ e a formação de duas
ligações π (Figura 8).
Figura 8: Rota de fragmentação para flavonas via reação RDA (RIJKE et al., 2006).
H
O
OOH
HO
OH
HO OH
OH
C
O
A
+
HO OH
OH
O
H
O
O
OH
HO
OH
OH
C
H
2
C
OH
C
H
2
C
B
+
HO OH
OH
O
35 Materiais e métodos: Experimental Geral
Desvios de Rotação Óptica [α]
25
D
Os desvios de rotação óptica [α]
25
D
das substâncias descritas foram medidos em
polarímetro Perkin-Elmer 243B, tendo como lâmpada de sódio de 589 nm.
Ponto de Fusão
Os pontos de fusão foram medidos em triplicata no aparelho de ponto de fusão do tipo
bloco de Koppler acoplado a um microscópio.
Parte Biológica Geral: Ensaios antiplaquetário e anticoagulante
Todos os ensaios biológicos foram realizados em colaboração com o grupo do Laboratório
de Hemostase e Venenos, do Instituto de Bioquímica Médica na Universidade Federal do Rio de
Janeiro – UFRJ, sob orientação da professora Russolina B. Zingali. Os ensaios foram
acompanhados pelas alunas de doutorado Mariane Assafim (anticoagulante como aPTT - tempo
de tromboplastina parcial ativado – e PT, tempo de protrombina) e Flávia Frattani
(antiplaquetários induzidos por ADP – adenosil difosfato - e trombina).
Materiais Utilizados
A tromboplastina tecidual cálcica foi obtida da Biolab (Rio de Janeiro, Brasil); o reagente
de aPTT (cefalina mais caulim) foi comprado da Diamed (Rio de Janeiro, Brasil).
O tempo de coagulação do plasma foi medido (em segundos) através do
microcoagulômetro AMELUNG, modelo KC4A, Alemanha.
A α-Trombina humana que foi utilizada nos ensaios, foi isolada e purificada pelo grupo do
Instituto de Bioquímica Médica.
O ensaio de agregação foi realizado em um agregômetro Chronolog (Havertown, PA).
Para realizar as análises estatísticas, foi utilizado o software SigmaPlot for Windows version 8.0
(Copyright© 1986-1995 Jandel Corporation).
36 Materiais e métodos: Experimental I
MATERIAIS E M
É
TODOS:
EXPERIMENTAL I
37 Materiais e métodos: Experimental I
P
P
R
R
E
E
P
P
A
A
R
R
A
A
Ç
Ç
Ã
Ã
O
O
E
E
F
F
R
R
A
A
C
C
I
I
O
O
N
N
A
A
M
M
E
E
N
N
T
T
O
O
Q
Q
U
U
Í
Í
M
M
I
I
C
C
O
O
D
D
O
O
D
D
E
E
C
C
O
O
C
C
T
T
O
O
D
D
A
A
S
S
F
F
O
O
L
L
H
H
A
A
S
S
F
F
R
R
E
E
S
S
C
C
A
A
S
S
D
D
E
E
P
P
e
e
t
t
r
r
o
o
s
s
e
e
l
l
i
i
n
n
u
u
m
m
C
C
r
r
i
i
s
s
p
p
u
u
m
m
A espécie P. crispum foi coletada em Abril de 2005 e codificada como Pc. Foram coletadas
160 g de folhas que foram submetidas ao processo de decocção e ao final do processo foi
obtido um rendimento de 15 % de extrato bruto.
Preparo do decocto
A planta fresca (160 g) foi lavada rapidamente em água destilada, para retirar resíduos
de areia ou outras impurezas. A planta foi triturada com o auxílio de um liquidificador com a
intenção de aumentar a superfície de contato do material para a extração com água em
ebulição.
A decocção foi preparada a 10% (p/v). Neste procedimento o material vegetal é colocado
em contato com a água fervente durante 10 minutos em constante agitação. Após este
período, a preparação foi deixada em repouso e aguardada o seu resfriamento a temperatura
ambiente.
O decocto (Pcd) foi obtido por filtração em papel transvasado para um outro recipiente e
medido o seu volume (1250 ml). Após a filtração, observou-se um precipitado em toda a
extensão do frasco, sendo assim, o mesmo foi separado por centrifugação, a temperatura
ambiente.
O sobrenadante (1250 ml) foi denominado Pcsn e concentrado em banho maria (T = 50
o
C durante 1 hora) até chegar a um volume de 175 ml, do qual, 25 ml foram separados e
liofilizados. Foram obtidos 3,400 g de material. Esta amostra foi reservada como padrão do
extrato para posteriores ensaios biológicos. O restante do volume (150 ml) foi utilizado para a
realização das etapas de purificação - partição em acetato de etila, seguida de partição em
butanol. O precipitado separado por centrifugação foi congelado e posteriormente liofilizado
gerando uma massa de 2,707 g (Esquema 2).
Esquema 2: Marcha de obtenção do decocto de Petroselinum crispum
Planta fresca
(160 g)
Decocto
(Pcd)
Sobrenadante
(Pcsn)
Precipitado
(Pcppt)
1 – decocção 10%
2 – Filtração T.A.
38 Materiais e métodos: Experimental I
Fracionamento de Pcsn por partição em Acetato de Etila e Butanol
Partição em Acetato de Etila (AcOEt)
A partição foi realizada em quatro etapas, visando um esgotamento das moléculas de
menor polaridade contidas na fração Pcsn. Na primeira etapa foi realizada uma partição 1:1
(150 ml de AcOEt e 150 ml de Pcsn). A segunda, terceira e quarta etapas foram realizadas com
75 ml de AcOEt para 150 ml de Pcsn (1:2).
Observou-se a presença de emulsão em todas as etapas da partição. Sendo assim, a
parte contendo a emulsão foi separada e congelada por vinte e quatro horas com o intuito de
desfazer a emulsão. Após o resfriamento, a emulsão se desfez quase completamente. A fase
líquida foi retirada e o restante da emulsão foi filtrado com auxílio de algodão e água para a
obtenção do rendimento total das frações (fração em AcOEt e fração aquosa).
A fração em AcOEt (PcA) foi levada ao banho maria (temperatura de 55
o
C), para total
eliminação do solvente por evaporação, e posteriormente re-suspensa em água obtendo duas
subfrações: a fração solúvel em água (PcAa m= 160 mg) e a fração insolúvel em água (PcAb
m= 141,7 mg). Foi realizada uma análise por cromatografia em camada delgada (CCD) das
duas subfrações. Observou-se que as duas apresentaram perfil químico semelhante, sendo
possível a união das mesmas. O material resultante foi codificado como PcA (Esquema 3).
Partição em Butanol (BuOH)
A partição em n-butanol foi realizada a partir da fração aquosa resultante da partição em
AcOEt. A fração aquosa PcAq foi particionada em quatro etapas, de maneira análoga à descrita
para a partição em acetato de etila, visando um esgotamento das moléculas de alta e média
polaridade contidas no decocto. Na primeira etapa foram utilizados 130 ml de BuOH e 130 ml
de fração aquosa (1:1); a segunda, terceira e quarta etapas foram realizadas com 70 ml de n-
butanol para 150 ml de fração aquosa (1:2) - (Esquema 3).
39 Materiais e métodos: Experimental I
Esquema 3: Partição do sobrenadante (Pcsn) do decocto de P. crispum em acetato de estila seguido de
n-butanol.
Rendimentos obtidos
Tabela 4: Rendimentos das frações estudadas em relação às folhas frescas.
Extração
Massa das folhas
(em gramas)
Rendimentos (%)
Pcsn Pcppt PcA PcB PcAq
Pc 160 g 98,3
1,7 1,5 7,0 89,8
Purificação das subfrações
Purificação de Pcppt e isolamento de Pc1
Após a obtenção de Pcppt, o mesmo foi avaliado por CCD seguido de revelação com
lâmpada U.V. e sulfato cérico. Foi observada uma mancha intensa no cromatograma, de
coloração amarela (R
f
= 0,57) e uma outra na origem que não se revelou com sulfato cérico.
Pcppt foi submetido a uma lavagem com metanol com a intenção de se obter uma
substância mais purificada, resultando assim, em uma fração solúvel em metanol (Pcppt sol
m= 1,0202 g), de coloração esverdeada, e uma insolúvel (Pcppt ins m= 1,6342 g).
(PcB)
m= 1,400 g
Decocto
Pcsn
150 ml
PcA
m= 301,7 mg
Fração
A
q
uosa
1 – Partição AcOEt
PcAq
1 – Partição BuOH
40 Materiais e métodos: Experimental I
A parte solúvel em metanol do Pcppt (m= 1,0202 g) foi cromatografada em uma coluna
de gel Sephadex LH-20 (30 cm x 1,5 cm) utilizando 50% MeOH/EtOH como fase móvel de
acordo com a Tabela 5.
Tabela 5: Frações obtidas a partir da purificação de Pcppt sol realizada em Sephadex LH-20 (30 cm x 1,5
cm) eluente 50% MeOH/EtOH.
Conjuntos Volume Gradiente Coloração
F
1
- F
9
310 ml 50 % Amarelo escuro
F
10
- F
22
400 ml 50 % Amarelo esverdeado
F
23
- F
32
410 ml 50 % Incolor
Os conjuntos foram avaliados por CCD (BAW 8:1:1) e após revelação sob luz UV, seguida
de oxidação com sulfato cérico em aquecimento, o conjunto F
10
– F
22
resultou em uma
substância fenólica com R
f
0,57. Este composto foi codificado como Pc1 (Esquema 4).
Esquema 4: Isolamento do flavonóide Pc1
A substância Pc1 foi submetida às análises espectroscópicas de RMN de
1
H e
13
C,
experimentos mono e bidimensionais. Foram realizadas também análises em CLAE - UV
(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – Ultravioleta) e espectrometria de massas (EM).
Planta
Decocto
1
–
Decocção
10%
2 – Filtração a T. A.
Pcppt
Pcppt ins
Pcppt sol
Pc1
676,8 mg
1 – Sephadex LH – 20
(23 cm x 0,7 cm)
1
–
Lavagem
MeOH
2 – Centrifugação
41 Materiais e métodos: Experimental I
Purificação de PcA e isolamento de Pc2
A fração PcA foi submetida à cromatografia em Sephadex LH-20 (23 cm x 0,7 cm) e com
etanol como fase móvel. Foram coletadas 45 frações de diversas colorações e formados os
conjuntos de acordo com o perfil em CCD das frações (Tabela 6).
Tabela 6: Frações obtidas na purificação de PcA realizada em Sephadex LH-20 (23 cm x 0,7 cm), em
EtOH.
Frações Conjuntos Volume Coloração
F
1
– F
17
PcA
1
105 ml Marrom claro
F
18
– F
35
PcA
2
70 ml Amarelo claro
F
36
– F
45
PcA
3
105 ml Amarelo escuro
Após a reunião das frações o conjunto PcA
2
apresentou um precipitado cristalino amarelo
claro, que foi separado através de centrifugação. O precipitado foi monitorado por CCD em
sílica (BAW 8:1:1), nas mesmas condições anteriores, e mostrou ser um outro composto
fenólico (R
f
= 0,92). Esta substância foi codificada como Pc2 (Esquema 5).
Esquema 5: Isolamento do flavonóide Pc2
O composto fenólico Pc2 foi submetido às análises espectroscópicas de RMN de
1
H e
13
C,
experimentos mono e bidimensionais. Foram realizadas também análises em CLAE - UV
(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – Ultravioleta) e espectrometria de massas (EM).
Sephadex LH – 20 (23 cm X 0,7 cm)
Pc2
23,4 mg
Precipitação
(PcA)
m= 301,7 mg
PcA1
156,0 mg
PcA2
64,8 mg
PcA3
80,9 mg
42 Materiais e métodos: Experimental I
Ensaios Biológicos – Atividade antiplaquetária
Isolamento da α-Trombina Humana
A α-trombina humana foi cedida pelo grupo de laboratório de hemostáse e venenos
chefiado pelo professora Russolina B. Zingali do Instituto de Bioquimica Médica da Universidade
Federal do Rio de Janeiro.
Agregação plaquetária com plaquetas humanas
Sangue humano foi coletado em tubos de vácuo com EDTA (0,2 M) ou citrato de sódio
(9:1 v/v). O plasma rico em plaquetas (PRP) foi preparado por centrifugação em 800 rpm por
10 minutos. O plasma pobre em plaquetas (PPP) foi preparado por centrifugação, 3500 rpm por
12 minutos. As plaquetas lavadas foram obtidas por método de centrifugação (SOSLAU et al.,
2001). A agregação plaquetária foi monitorada por método turbidimétrico de BORN & CROSS
utilizando-se um agregômetro Chrono-log (Havertown, PA, USA). PRP (400 µl) foi incubado a
37° C por 1 minuto. A agregação plaquetária foi induzida por ADP (2 µM). Pcsn, PcA, PcB,
foram re-suspensos em DMSO (50 mg / 200 µl), e adicionados 1 minuto antes da adição dos
agentes agregantes. Para todos os testes uma curva inicial com os diferentes agonistas foi
realizada. A concentração do indutor escolhida para análise foi aquela que provocou 80-90 %
de agregação plaquetária (Figura 9).
43 Materiais e métodos: Experimental I
Figura 9: Esquema da técnica utilizada para o ensaio de agregação plaquetária in vitro (adaptado de
FRATTANI, 2005).
Análise estatística
Foi utilizado o software SigmaPlot for Windows version 8.0 (Copyright© 1986-1995 Jandel
Corporation). Os resultados foram expressos em média ± SD e as análises estatísticas foram
obtidas através da determinação da variância, seguida do teste de Bonferroni, com mudanças
consideradas significativas, sendo p-valor menor ou igual a 0,05.
Detector
Detector
%
T
t (min)
Detector
t (min)
t (min)
ENSAIO DE AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA
% T
% T
AGONISTA + FRAÇÕES DE
P. crispum
AGONISTA
44 Materiais e métodos: Experimental I
Ensaios Biológicos – Atividade anticoagulante
Ensaios de Coagulação
Esses experimentos são realizados em um coagulômetro equipado com um sistema de
agitação e aquecimento. Os tubos com as amostras de sangue humano são centrifugados por
10 minutos a 3000 rpm para obtenção de plasma deficiente em plaquetas que é utilizado nos
ensaios de coagulação.
Ensaio de aPTT (Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada)
Alíquotas de plasma pobre em plaquetas (50 µl) são incubadas a 37 ºC por 60 segundos,
acrescentando 50 µl de reagente para aPTT (Cefalina ativada). A reação é iniciada com 100 µl
de cloreto de cálcio 25 mM após 120 segundos. O aparelho indica o tempo decorrido desde o
início da reação de coagulação até a formação do coágulo. Desta forma, os resultados são
registrados em segundos. Porém, para uma melhor avaliação os resultados foram expressos
como uma relação entre o tempo de coagulação das amostras pelo controle (vezes de aumento
acima do controle).
Ensaio de PT (Tempo de Protrombina)
Alíquotas de plasma (50 µl) são incubadas a 37º por 60 segundos, iniciando a reação com
100 µl de reagente para PT (Tromboplastina cálcica). O aparelho indica o tempo decorrido
desde o disparo da reação de coagulação até a formação do coágulo. Os resultados foram
expressos como descritos para ensaio de aPTT.
Análise estatística
Foi utilizado o software SigmaPlot for Windows version 8.0 (Copyright© 1986-1995 Jandel
Corporation). Os resultados foram expressos em média ± SD e sua análise estatística foi obtida
através da determinação da variância, seguida do teste de Bonferroni, com mudanças
consideradas significativas, sendo p-valor menor ou igual a 0,05.
45 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
RESULTADOS E DISCUSSÃO:
ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DOS FLAVONÓIDES
46 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
E
E
l
l
u
u
c
c
i
i
d
d
a
a
ç
ç
ã
ã
o
o
E
E
s
s
t
t
r
r
u
u
t
t
u
u
r
r
a
a
l
l
d
d
o
o
F
F
l
l
a
a
v
v
o
o
n
n
ó
ó
i
i
d
d
e
e
P
P
c
c
2
2
A substância codificada como Pc2, isolada de PcA, apresentou características de
flavonóide quando analisada por CCD e revelada sob luz ultravioleta e com sulfato cérico. Sua
proposta estrutural foi baseada em dados de RMN
1
H, COSY e HMQC.
A fórmula molecular C
15
H
10
O
5
foi deduzida a partir do íon pseudomolecular m/z 269 [M-H]
-
e de seu fragmento m/z 151, encontrados no espectro de massas
Características físico-químicas
R
f
=
0,92 em BAW 8:1:1;
[α]
D
25
= - 15,43 (DMSO; c, 0,023);
Ponto de fusão não foi possível realizar devido à amostra ter carbonizado.
RMN
1
H
O espectro de RMN
1
H para Pc2, realizado em DMSO-d
6
, apresentou sinais compatíveis
para um flavonóide. Com base nesse espectro foi possível sugerir a presença da flavona
apigenina (5,7,4'-triidroxiflavona) (Espectro 1).
O sinal mais deslocado, ou seja, mais desblindado, como um simpleto em 12,9 ppm
corresponde ao hidrogênio da hidroxila 5 da aglicona que se encontra em ligação de hidrogênio
com o oxigênio da carbonila em 4.
A região entre 6,00 e 8,20 ppm (Espectro 2) – correspondente aos hidrogênios dos anéis
aromáticos - apresentou sinais duplos (dupletos) em 7,92 ppm (J= 8,7 Hz) e 6,92 ppm (J= 8,7
Hz), com integração para dois hidrogênios cada um. As constantes de acoplamento observadas
(8 - 9 Hz) indicam uma relação orto entre esses hidrogênios. Esses sinais foram atribuídos aos
hidrogênios H-2’,6’ e H-3’,5’ do anel B, respectivamente, característicos de um anel aromático
substituído na posição 4’ (padrão 4’-OH). Isso ocorre devido à simetria apresentada por este
anel, fazendo com que os hidrogênios das posições 2’ e 3’ apresentem equivalência em
deslocamento químico com os hidrogênios das posições 6’ e 5’, respectivamente.
Para o anel A foram observados dupletos em 6,18 ppm (H-6, J= 1,8 Hz) e 6,47 ppm (H-8,
J= 1,8 Hz). A constante de acoplamento observada (aproximadamente 2 Hz) confirma um
47 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
acoplamento meta entre esses hidrogênios, mostrando tratar-se de um flavonóide 5,7-
diidroxilado no anel A.
Foi observado um simpleto em 6,78 ppm que indica um hidrogênio que não possui
acoplamento com outro hidrogênio, indicando assim, o H-3 de uma flavona.
Espectro 1: Espectro de RMN
1
H de Pc2 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 16, SW
7788 Hz, TD 32768, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 16 mg/ml.
Espectro 2: Espectro de RMN
1
H de Pc2 (300 MHz). Ampliação da região entre 5,5 - 8,4 ppm. Solvente
utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 16, SW 7788 Hz, TD 32768, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC,
Concentração da amostra 16 mg/ml.
OH-5
Solvente
H
2
O
H-2`/6`
H-3`/5`
H-8
H-6
H-3
48 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
COSY
1
H -
1
H
A partir da análise do COSY (correlação direta homonuclear
1
H-
1
H) foi possível identificar
os deslocamentos químicos de todos os hidrogênios da molécula através do acoplamento
seqüenciado dos hidrogênios (Espectro 3). Na expansão entre 5,60 e 8,20 ppm (Espectro 4),
observou-se o acoplamento entre H-2’,6’ com H-3’,5’, confirmando-se o padrão 4’-OH para o
anel B evidenciado no espectro de RMN
1
H. Da mesma forma observou-se a correlação entre H-
6 com H-8 corroborando o padrão 5 e 7 diidroxilado para o anel A da aglicona evidenciado no
espectro de RMN
1
H.
Espectro 3: Espectro de RMN 2D – COSY 90 de Pc2 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
.
Parâmetros: NS 4, SW 3591 Hz, TD 2048, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 16
mg/ml.
49 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
Espectro 4: Espectro de RMN 2D – COSY 90 de Pc2 (300 MHz). Ampliação da região entre 6,0 - 8,4 ppm.
Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 4, SW 3591 Hz, TD 2048, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC,
Concentração da amostra 16 mg/ml.
HMQC
Os dados do espectro de HMQC permitiram estabelecer a correlação direta entre os
núcleos de
1
H com os núcleos de
13
C a eles diretamente ligados
Portanto, a partir dos dados obtidos no espectro de HMQC (Espectros 5 e 6) e COSY, foi
possível estabelecer os deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono para a aglicona.
H-8 →H-6
H-2’/6’ →H-3’/5’
OH
H
HO
H
5
6
7
8
A
H
H OH
H
H
2'
3'
4'
5'
6'
B
50 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
Espectro 5: Espectro de RMN 2D – HMQC de Pc2 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros:
NS 24, SW 3591 Hz, TD 2048, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 16 mg/ml.
Espectro 6: Espectro de RMN 2D – HMQC de Pc2 (300 MHz). Ampliação da região entre 6,0 - 8,2 ppm.
Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 24, SW 3591 Hz, TD 2048, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC,
Concentração da amostra 16 mg/ml.
H-2’/6’→C-2’/6’
H-3’/5’
→C-3’/5’
H-3→C-3
H-8→C-8
H-6→C-6
51 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
Pelos dados acima apresentados, confirma-se para Pc2 a estrutura 5,7,4'-triidroxiflavona,
também conhecida como apigenina (Figura 10). Os dados de RMN
1
H e
13
C para a molécula,
estão listados na Tabela 7.
Figura 10: Estrutura de Pc2.
O
O
H
H OH
H
H
OH
H
HO
H
2'
3'
4'
5'
6'
5
6
7
8
3
A
B
C
Tabela 7: Deslocamentos químicos de hidrogênios e carbonos para apigenina (Pc2).
A
A
g
g
l
l
i
i
c
c
o
o
n
n
a
a
δ
δ
C
C
(
(
p
p
p
p
m
m
)
)
δ
δ
H
H
(
(
p
p
p
p
m
m
)
)
;
;
m
m
;
;
J
J
(
(
H
H
z
z
)
)
2 - -
3 103,1 6,78; s
4 - -
5 - -
6 99,3 6,18; d; 1,8
7 - -
8 94,8 6,47; d; 1,8
9 - -
10 - -
1’ - -
2’,6’ 128,6 7,92; d; 8,7
3’,5’ 116,0 6,92; d; 8,7
4’ - -
LUTHRIA et al. (2006) relataram o isolamento da apigenina e de outros compostos
fenólicos através de diferentes técnicas utilizando como material vegetal a espécie
Petroselinum crispum. Os autores demonstraram que a apigenina é o componente minoritário
encontrado nesta espécie corroborando assim com os dados desta dissertação.
52 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
Em estudo realizado na Dinamarca foram analisados quinze extratos de diferentes
espécies vegetais, através da técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e
espectrometria de massas. A espécie Petroselinum crispum mostrou uma composição química
composta principalmente de flavonóides. Neste trabalho os autores demonstraram também que
a apigenina é o componente minoritário presente nesta espécie (JUSTESEN & KNUTHSEN,
2001).
A partir do extrato metanólico da espécie P. crispum obteve-se também a aglicona
apigenina que apresentou atividade estrogênica. A produção de apigenina no extrato
metanólico mostrou ser baixa também, mostrando que este flavonóide é o componente
minoritário nesta espécie quando se utiliza o processo de decocção ou da maceração
metanólica (YOSHIKAWA et al., 2000).
53 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
E
E
l
l
u
u
c
c
i
i
d
d
a
a
ç
ç
ã
ã
o
o
E
E
s
s
t
t
r
r
u
u
t
t
u
u
r
r
a
a
l
l
d
d
o
o
F
F
l
l
a
a
v
v
o
o
n
n
ó
ó
i
i
d
d
e
e
P
P
c
c
1
1
A substância codificada como Pc1, isolada de Pcppt, apresentou características de
flavonóide quando analisada por CCD e revelada sob luz ultravioleta e com sulfato cérico. Sua
proposta estrutural foi baseada em dados de RMN
1
H,
13
C, COSY, HMQC e HMBC.
A fórmula molecular C
26
H
28
O
14
foi deduzida a partir do íon pseudomolecular m/z 563 [M-
H]
-
encontrado no espectro de massa.
Características físico-químicas
R
f
=
0,57 em BAW 8:1:1;
[α]
D
25
= - 94,1 (DMSO; c, 0.034);
Ponto de fusão = 225 – 228
o
C.
RMN
1
H
O espectro de RMN
1
H para Pc1, realizado em DMSO-d
6
, apresentou sinais compatíveis
para um flavonóide de natureza glicosídica. Com base nesse espectro foi possível sugerir a
presença da flavona apigenina (5,7,4'-triidroxiflavona) (Espectro 7).
A região entre 6,00 e 8,20 ppm (Espectro 8) – correspondente aos hidrogênios dos anéis
aromáticos - apresentou sinais duplos (dupletos) em 7,95 ppm (J= 8,8 Hz) e 6,93 ppm (J= 8,8
Hz), com integração para dois hidrogênios cada um. As constantes de acoplamento observadas
(8 - 9 Hz) indicam uma relação orto entre esses hidrogênios. Estes sinais foram atribuídos aos
hidrogênios H-2’,6’ e H-3’,5’ do anel B, respectivamente, característicos de um anel aromático
substituído na posição 4’ (padrão 4’-OH). Isso ocorre devido à simetria apresentada por este
anel, fazendo com que os hidrogênios das posições 2’ e 3’ apresentem equivalência em
deslocamento químico com os hidrogênios das posições 6’ e 5’, respectivamente.
Para o anel A foram observados dupletos em 6,42 ppm (H-6, J= 2,2 Hz) e 6,81 ppm (H-8,
J= 2,2 Hz). A constante de acoplamento observada (entre 2 - 3 Hz) confirma um acoplamento
meta entre esses hidrogênios, mostrando tratar-se de um flavonóide 5,7-diidroxilado no anel A.
Foi observado um simpleto em 6,87 ppm que indica um hidrogênio que não possui
acoplamento com outro hidrogênio, indicando assim, o H-3 de uma flavona.
54 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
Espectro 7: Espectro de RMN
1
H de Pc1 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 16, SW
7788 Hz, TD 32768, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 16 mg/ml.
Espectro 8: Espectro de RMN
1
H de Pc1 (300 MHz). Ampliação da região entre 6,0 ppm e 8,0 ppm.
Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 16, SW 7788 Hz, TD 32768, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC,
Concentração da amostra 90 mg/ml.
Solvente
X
X
X
X
X Impureza
X
X
X
H-2`/6`
H-3`/5`
H-3
H-8
H-6
X Impureza
55 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
De acordo com esses dados foi possível propor para a aglicona deste flavonóide a
estrutura da apigenina (5,7,4'-triidroxiflavona; Figura 11).
Figura 11: Estrutura da apigenina.
O
O
H
H OH
H
H
OH
H
HO
H
2'
3'
4'
5'
6'
5
6
7
8
3
A
B
C
De acordo com o deslocamento observado para H-6 e H-8, a posição 7 da aglicona
apresenta substituição uma vez que, quando a hidroxila desta posição está livre, os sinais para
os hidrogênios das posições 6 e 8 apresentam-se em campo mais alto (6,20 e 6,40 ppm,
respectivamente) (PIZZOLATTI et al., 2003).
A ampliação da região entre 2,0 - 5,5 ppm do espectro de RMN
1
H (Espectro 9) mostrou
dois sinais de hidrogênio anomérico (5,35 ppm e 5,16 ppm) compatíveis com O-glicosilação,
sendo uma diretamente no anel da aglicona (5,35 ppm) e outra no açúcar interno (5,16 ppm).
Foi observado uma constante trans-diaxial para o hidrogênio anomérico em 5,16 ppm (J~7,2
Hz) e um simpleto em 5,35 ppm para o outro anomérico.
O espectro de RMN
1
H mostrou ainda dupletos em 3,91 ppm e 3,11 ppm, os quais
correspondem a hidrogênios que possuem um acoplamento geminal (J~9,5 Hz), sendo estes
referentes a hidrogênios metilênicos.
Foi observado um simpleto largo em 3,74 ppm, compatível com uma constante de
acoplamento baixa, do tipo trans-diequatorial.
Vários multipletos foram observados na região ampliada do espectro, para os quais, no
entanto, não puderam ser calculadas as constantes de acoplamento.
Estes dados estão de acordo com relatos de diversas substâncias flavonoídicas di-
glicosiladas para a espécie P. crispum (YOSHIKAWA et al., 2000).
56 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
Espectro 9: Espectro de RMN
1
H de Pc1 (300 MHz). Ampliação da região entre 2,0 ppm e 5,5 ppm.
Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 16, SW 7788 Hz, TD 32768, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC,
Concentração da amostra 90 mg/ml.
RMN de
13
C
O espectro de RMN
13
C forneceu 24 sinais (Espectro 10). Treze destes sinais foram
atribuídos aos carbonos da aglicona do flavonóide e os onze sinais restantes aos carbonos das
duas unidades de açúcar.
Os sinais observados entre 189,1 - 116,1 ppm bem como aqueles em 105,4 ppm, 103,1
ppm, 99,3 ppm e 94,8 ppm correspondem aos deslocamentos químicos para os carbonos da
aglicona.
Para o anel C observa-se o sinal mais desprotegido do espectro, em 181,9 ppm,
confirmando a presença de uma carbonila cetônica α-β insaturada em C-4 (YOSHIKAWA et al.,
2000). Observa-se ainda um sinal característico de carbono 3 de flavona em 103,1 ppm.
Para o anel B, devido a sua simetria, apenas quatro sinais são observados. Isto devido o
fato dos carbonos das posições 3’ e 5’ (116,0 ppm) e os carbonos das posições 2’ e 6’ (128,6
ppm) apresentarem equivalência em deslocamento químico.
H anomérico da unidade externa
H anomérico da unidade interna
Solvente
57 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
Os sinais em 108,7 ppm e 98,1 ppm são atribuídos aos carbonos anoméricos,
confirmando-se a presença de O-glicosilação na aglicona. Entre 79,3 - 60,4 ppm são
observados 9 sinais de carbono, correspondentes às unidades de carboidratos (Espectro 10).
De acordo com MUZITANO (2006) o carbono dois da glicose possui um deslocamento
químico no valor de 74,2 ppm em DMSO quando o mesmo não se encontra substituído. Em
nossos dados de RMN
13
C, o carbono dois está em campo mais baixo, portanto, mais
desblindado o que confirma que o carbono dois possui uma substituição por uma outra unidade
de açúcar que é possível visualizar no espectro.
De acordo com CHOU et al. (1999) e YOSHIKAWA et al. (2000) o hidrogênio anomérico
em 98,1 ppm confirma a presença da glicose. O anomérico em 108,7 ppm é caracterizado
como um sinal que indica a presença de açúcares que possuem anel de cinco membros.
Baseado em dados da literatura para este tipo de açúcar, é possível sugerir a presença de um
açúcar de cinco membros, sendo este, a apiose (CHOU et al., 1999; YOSHIKAWA et al., 2000;
WANG et al., 2006).
A partir dos dados obtidos de RMN de
13
C é possível propor para o flavonóide Pc1 a
estrutura da apigenina apiosil-glicosideo.
Espectro 10: Espectro de RMN de
13
C de Pc1 (75 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS
36130, SW 14124 Hz, TD 65536, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 90 mg/ml.
C-2’,6’
C-1’
C-3’,5’
C-9
C-1”
C-6
C-4
C-7
C-1’”
C-3
C-10
C-5
C-2
C-4’
C-2’’’
C-4’’’
C-3’”
C-3’’
C-5”
C-8
C-2’’
C-4’’
C-5’”
C-6”
58 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
COSY
1
H -
1
H
A partir da análise do COSY (correlação direta homonuclear
1
H-
1
H) foi possível identificar
os deslocamentos químicos de todos os hidrogênios da molécula através do acoplamento
seqüenciado dos hidrogênios (Espectro 11). Na expansão entre 5,60 e 8,20 ppm (Espectro
12), observou-se o acoplamento entre H-2’,6’ com H-3’,5’, confirmando-se o padrão 4’-OH
para o anel B evidenciado no espectro de RMN
1
H. Da mesma forma observou-se a correlação
entre H-6 e H-8 corroborando o padrão 5 e 7 diidroxilado para o anel A da aglicona evidenciado
no espectro de RMN
1
H. A correlação entre os hidrogênios dos açúcares é mostrada para cada
unidade monomérica (Espectro 13) na expansão da região entre 1,2 - 5,6 ppm.
Espectro 11: Espectro de RMN 2D – COSY 90 de Pc1 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
.
Parâmetros: NS 8, SW 3004 Hz, TD 2048, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 90
mg/ml.
59 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
Espectro 12: Espectro de RMN 2D – COSY 90 de Pc1 (300 MHz). Ampliação da região entre 6,0 - 8,4
ppm. Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 8, SW 3004 Hz, TD 2048, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC,
Concentração da amostra 90 mg/ml.
H-2’/6’ →H-3’/5’
H-8 →H-6
OH
H
HO
H
5
6
7
8
A
H
H OH
H
H
2'
3'
4'
5'
6'
B
60 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
S
Espectro 13: Espectro de RMN 2D – COSY 90 de Pc1 (300 MHz). Ampliação da região entre 1,2 - 5,4
ppm. Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 8, SW 3004 Hz, TD 2048, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC,
Concentração da amostra 90 mg/ml.
Correlações Apiose
Correlações Glicose
Impureza
61 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
HMQC
Os dados do espectro de HMQC permitiram estabelecer a correlação direta entre os
núcleos de
1
H com os núcleos de
13
C a eles diretamente ligados.
Portanto, a partir dos dados obtidos no espectro de HMQC (Espectros 14, 15 e 16) e
COSY, foi possível estabelecer os deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono para a
aglicona e os açúcares.
Espectro 14: Espectro de RMN 2D – HMQC de Pc1 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros:
NS 24, SW 3004 Hz, TD 1024, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 90 mg/ml.
62 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
Espectro 15: Espectro de RMN 2D – HMQC de Pc1 (300 MHz). Ampliação da região entre 6,0 - 8,2 ppm. Solvente
utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 24, SW 3004 Hz, TD 1024, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra
90 mg/ml.
Espectro 16: Espectro de RMN 2D – HMQC de Pc1 (300 MHz). Ampliação da região entre 2,8 - 4,4 ppm.
Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 24, SW 3004 Hz, TD 1024, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC,
Concentração da amostra 90 mg/ml.
H-2’
/
6’→C-
H-3’
/
5’→C-
H-3
→C-3
H-8→C-8
H-6→C-6
H-1```→C-1```
H-1``→C-1``
H-6``
H-4``
H-6``
H-4``` H-4```
H-5```
H-2```
H-2``
H-3``
H-5``
Correlações H-C apiose
Correla
ç
ões H-C
g
licose
63 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
HMBC
O espectro de HMBC mostrou as correlações a longa distância entre H-1” (5,16 ppm) da
glicose e C-7 (162,7 ppm) da aglicona, confirmando uma O-glicosilação na posição 7 da
aglicona e entre H-1”’ (5,35 ppm) e C-2” (75,7ppm), confirmando uma O-glicosilação na
posição 2 da glicose.
Foram observadas diversas correlações para os hidrogênios da aglicona e para os
hidrogênios dos açúcares.
O espectro mostrou correlações à longa distância, para hidrogênios do anel A da aglicona
(Espectro 17) entre o H-8 (6,81 ppm), C-10 (105,4 ppm) e C-6 (99,3 ppm) ambos com
3
J
H-C
e
C-7 (162,7 ppm) e C-9 (157,0 ppm) ambos com
2
J
H-C
. Foram observadas ainda correlações
entre H-6 (6,42 ppm), C-10 (105,4 ppm) e C-8 (94,9 ppm), ambos com
3
J
H-C
, e C-5 (161,4
ppm), com
2
J
H-C
(Figura 12).
Correlações à longa distância, para hidrogênios do anel B da aglicona também foram
observadas entre o H-2` (7,95 ppm) com os carbonos C-6`(128,7 ppm), C-2 (164,3 ppm) e C-
4`(161,2 ppm) ambos com
3
J
H-C
. Correlações de H-6`(7,95 ppm) foram observadas com os
carbonos C-2`(128,7 ppm), C-2 (164,3 ppm) e C-4`(161,2 ppm). O hidrogênio 3`(6,93 ppm)
apresentou correlações
3
J
H-C
com os carbonos C-5`(116,1 ppm), C-1`(121,1 ppm) e
correlações com
2
J
H-C
para C-4`(161,2 ppm). H-5`(6,93 ppm) apresentou correlações entre C-
3`(116,1 ppm), C-1`(121,1 ppm) ambos com
3
J
H-C
, e C-4`(161,2 ppm) com
2
J
H-C
. Estas
correlações comprovam a simetria do anel B, com uma única substituição na posição 4`
(Figura 13).
O anel C apresenta somente um hidrogênio em 6,87 ppm (H-3), o qual apresenta
correlações a longa distância com C-10 (105,4 ppm), C-1`(121,1 ppm) ambos com
3
J
H-C
, e C-2
(164,3 ppm) e C-4 (181,9 ppm), ambos com
2
J
H-C
(Figura 14).
64 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
Espectro 17: Espectro de RMN 2D – HMBC de Pc1 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros:
NS 24, SW 3004 Hz, TD 1024, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 90 mg/ml.
C-7
C-2’’
’
65 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
Figura 12: Correlações H-C a longa distância para o anel A.
H
8
H
6
O
H
O
O
H
H
1
''
OH
H
8
H
6
O
H
O
H
8
H
6
O
H
O
Figura 13: Correlações H-C a longa distância para o anel B.
H
3
'
H
6
'
H
2
'
H
5
'
O
H
H
3
'
H
6
'
H
2
'
H
5
'
O
H
H
3
'
H
6
'
H
2
'
H
5
'
O
H
Figura 14: Correlações H-C a longa distância para o anel C.
O
O
H
1'
9
10 3
Correlações para os hidrogênios foram confirmadas, principalmente, para a apiose,
enquanto que para a glicose foi observada apenas uma correlação para o hidrogênio 4’’.
66 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
A correlação entre H-1”’ (5,35 ppm) e C-2” (75,7ppm), comprova que o açúcar apiose é
externo. Outras correlações tais como entre H-2’’’ (3,72 ppm), C-1’’’ (108,7 ppm) e C-4’’’ (74,0
ppm); entre H-4’’’ (3,90 ppm) e C-1’’’ (108,7 ppm), C-2’’’ (76,1 ppm) e C-5’’’ (64,2 ppm),
também foram de fácil observação.
Para a glicose, além da correlação entre H-1’’ com C-7 da aglicona, foi observada a
correlação entre H-4’’ (3,20 ppm) e C-2’’ (75,7 ppm) para
3
J
H-C
(Figura 15).
Figura 15: Correlação a longa distância H-C para os hidrogênios da glucopiranose e apiofuranose.
O
OH
H
1
'''
HO
H
2
'''
H
4
'''
H
O
H
4
HO
H
HO
H
H
1
''
O
H
OH
HO
Com base nos dados acima apresentados, confirma-se para Pc1 a estrutura da Apigenina
– 7-O-apiosilfuranosideo-(1→2)-O-glicopiranosídeo, também conhecida como apiina (Figura
16). Os dados de RMN de
1
H e
13
C para a molécula estão listados na Tabela 8.
Glucopiranose
Apiofuranose
67 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
Tabela 8: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono para apiina.
A
A
g
g
l
l
i
i
c
c
o
o
n
n
a
a
δ
δ
C
C
(
(
p
p
p
p
m
m
)
)
δ
δ
H
H
(
(
p
p
p
p
m
m
)
)
;
;
m
m
;
;
J
J
(
(
H
H
z
z
)
)
2 164,2 -
3 103,1 6,87; s
4 181,9 -
5 161,3 -
6 99,3 6,42; d; 2,2
7 162,6 -
8 94,8 6,81; d; 2,2
9 156,9 -
10 105,4 -
1’ 121,0 -
2’,6’ 128,6 7,95; d; 8,8
3’,5’ 116,0 6,93; d; 8,8
4’ 161,1 -
G
G
l
l
i
i
c
c
o
o
s
s
e
e
7
7
-
-
O
O
-
-
a
a
p
p
i
i
o
o
s
s
i
i
l
l
-
-
(
(
1
1
→
→
2
2
)
)
-
-
O
O
-
-
g
g
l
l
i
i
c
c
o
o
s
s
í
í
d
d
e
e
o
o
1” 98,1 5,16; d; 7,2
2” 75,7 3,50; m
3” 76,8 3,35; m
4” 69,8 3,20; m
5” 77,0 3,40; m
6” 60,5 3,70; m
A
A
p
p
i
i
o
o
s
s
e
e
1”’ 108,7 5,35; s;
2”’ 76,1 3,72; m
3”’ 79,3 ----------
4”’ 74,0 3,90; d
5”’ 64,2 3,30; m
68 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
O
O
O
OH
OH
O
O
OH
HO
HO
O
OH
HO
OH
H
H
H
Figura 16: Estrutura de Pc1.
Para o flavonóide apigenina – 7-O-apiosil-(1→2)-O-glicosídeo, são relatadas várias
atividades biológicas, entre elas a atividade antiestrogênica e imunomodulatória (YOSHIKAWA
et al., 2000; MIKHAEIL et al., 2004). FEJES et al. (2000_a) demonstraram que a apiina isolada
de um decocto das folhas de Anthriscus cerefolium (Apiaceae) apresentou excelente atividade
antioxidante em todas as concentrações estudadas.
O primeiro relato para apiina na espécie Petroselinum crispum foi apresentado por
HEMMING & OLLIS (1953). A confirmação da estrutura foi realizada por BEDERKE et al. (1957)
que também relataram o ponto de fusão para a substância. Os autores também demonstraram
que a apiina é o componente majoritário nesta espécie da família Apiaceae.
Alguns anos depois, PERRY et al. (1965) realizaram um estudo da apiina com a intenção
de obterem o açúcar apiose. As folhas frescas de P. crispum foram extraídas com acetona em
refluxo por 18 h. O extrato foi concentrado, obtendo-se um material gelatinoso. Através deste
processo extrativo, os autores obtiveram um rendimento de 0,01 % de apiina em relação ao
extrato bruto. O ponto de fusão foi medido 228 – 230
o
e foi medido o desvio óptico [α]
D
25
= -
130
o
(c, 0.12 metanol). Em nosso estudo o ponto de fusão medido foi entre 225 – 228
o
corroborando assim com os dados de PERRY et al. (1965), no entanto, o desvio óptico medido
neste trabalho foi de -94,1 (c, 0.034 DMSO), o qual, não está de acordo com os dados da
literatura. Um ponto a ressaltar é que o [α]
D
25
obtido pelo autor em 1965 foi realizado em
metanol e neste trabalho foi em DMSO, uma vez que, a solubilidade em metanol não foi
conseguida. Observa-se uma diferença elevada em relação ao desvio óptico, no entanto, este
dado é de extrema importância, visto que, as técnicas para a realização deste experimento
estão mais avançadas, do que, em 1965.
LUTHRIA et al. (2006) isolaram o flavonóide apiina da espécie Petroselinum crispum
através de cinco diferentes técnicas, utilizando como solvente, metanol, etanol ou acetona.
YOSHIKAWA et al. (2000), também relatam à presença de apiina nesta espécie, através de um
69 Resultados e Discussão: Elucidação Estrutural dos Flavonóides
extrato metanólico, no entanto, obtendo um rendimento de 1,5 % em relação ao extrato bruto.
FEJES et al. (2000_b) através do mesmo processo extrativo, usando metanol como solvente,
obteve a substância apiina.
Com estes dados observamos que os autores utilizaram métodos extrativos com solventes
orgânicos para a extração. Nesta dissertação o método escolhido foi a decocção, onde foi
utilizada a água como solvente extrator. Foi observado que este com este método o
rendimento obtido foi de até 6,60 %.
Ainda foi possível afirmar em nosso trabalho que este flavonóide, apiina, é o componente
majoritário desta espécie, corroborando assim com os dados de JUSTESEN, 1998; JUSTESEN,
2000; LUTHRIA et al. (2006).
MEYER et al. (2006) demonstraram que após a ingestão das folhas de P. crispum,
enriquecida em apiina, a apigenina torna-se presente no sangue humano em altas
concentrações. Isto é possível, pois a apiina após sofrer uma hidrólise (seja ela ácida ou
enzimática), ocorre à liberação da apigenina que é absorvida, através de difusão passiva, e é
disponibilizada na corrente sangüínea.
70 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
RESULTADOS E DISCUSSÃO:
Cromatografia Líquida de Alta eficiência (CLAE)
3.419
3.595
6.865
7.479
7.598
7.772
8.032
8.428
10.999
11. 589
Max: 65376
284.0
299.0
150.9
271.0
300.0
119.1
200.9
71 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
C
C
r
r
o
o
m
m
a
a
t
t
o
o
g
g
r
r
a
a
f
f
i
i
a
a
L
L
í
í
q
q
u
u
i
i
d
d
a
a
d
d
e
e
A
A
l
l
t
t
a
a
E
E
f
f
i
i
c
c
i
i
ê
ê
n
n
c
c
i
i
a
a
A padronização química de extratos de plantas medicinais pode envolver técnicas
cromatográficas como a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) que permite análises
qualitativas e quantitativas de misturas complexas com alta resolução e sensibilidade. Esta
técnica é intensamente utilizada na detecção de substâncias como flavonóides, terpenos,
saponinas, ácidos fenólicos e carotenóides. Torna-se claro que constitui uma importante
ferramenta para que se possa conhecer a composição química de extratos vegetais, bem como
para a padronização dos mesmos visando o desenvolvimento de um fitoterápico (PAIVA et al.,
2002).
Com o objetivo de avaliar o perfil químico do extrato (folhas) e das frações de P. crispum
e determinar o percentual de cada flavonóide isolado no extrato, estes foram submetidos à
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE-UV), utilizando o detector de massas.
Análise Qualitativa do decocto das folhas de Petroselinum crispum
A identificação dos flavonóides isolados de P. crispum foi avaliada a partir de seu tempo
de retenção no extrato, comparado com o tempo de retenção observado para a substância
isolada e então confirmada pelo espectro de massas.
É possível observar a presença de quatro componentes majoritários, com diferentes
tempos de retenção. No entanto, somente dois deles correspondem à flavonóides como pode
ser verificado pelas bandas de absorção, no espectro de ultravioleta (Cromatograma 1,
Espectros 18 e 19).
DAD1 C, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\UFRJ\TESE\HPLC\LC-MS\PCSN.D)
Cromatograma 1: Cromatograma obtido para Pcsn (preparado com folhas). Concentração: 10 mg/ml;
volume de injeção: 10 µl.
Pc1
Pc3
Pc2
72 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
*DAD1, 7.767 (272 mAU, - ) Ref=5.634 & 9.314 of PCSN.D
*DAD1, 8.034
(
320 mAU,A
p
x
)
Ref=5.634 & 9.314 of PCSN.D
Espectro 18: Ultravioleta para os tempos de retenção 7,774 (Pc1) e 8,028 (
Pc3) minutos
respectivamente, detecção a 254 nm.
*MSD1 SPC, time=8.084 of D:\UFRJ\TESE\HPLC\LC-MS\PCSN.D API-ES, Neg, Scan, 120
Max: 69608
431.0
432.0
433.0
Espectro 19: Espectro de massas para a molécula com t
R
= 8,028 minutos (Pc3).
De acordo com o espectro de massas, foi observado o íon pseudomolecular m/z= 431 [M-
H]
-
. Estes dados corroboram com os dados de PERRY et al., (1965) e HEMMING & OLLIS
(1953), que isolaram e identificaram esta molécula da espécie P. crispum que é denominada
comosiina.
CLAE-UV-EM para Pcppt e identificação do Flavonóide Pc1
A fração Pcppt, obtida após a realização do processo de decocção e enriquecida em
flavonóides, quando avaliada por CLAE-UV-EM apresentou uma substância com
t
R
= 7,776
minutos, sendo esta de maior concentração. Uma outra substância de
t
R
= 8,034 minutos
[M-H]
-
O
OOH
O
OH
O
H
HO
H
HO
H
H
OH
H
OH
C
21
H
20
O
10
73 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
também pode ser identificada (Cromatograma 2). Os dados de ultravioleta (Espectro 20)
revelaram bandas de absorção características para a aglicona apigenina em 254 e 350 nm,
para o composto identificado.
DAD1 C, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\UFRJ\TESE\HPLC\LC-MS\PCPPT.D)
Cromatograma 2: Cromatograma obtido para Pcppt, fração enriquecida em flavonóides, Concentração:
10 mg/ml; volume de injeção: 10 µl.
*DAD1, 7.754 (252 mAU, - ) Ref=7.674 & 8.234 of PCPPT.D
Espectro 20: Espectro de ultravioleta para a molécula com tempo de retenção 7,776 minutos, detecção a
254 nm.
Pc1
74 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
O espectro de massas (Espectro 21) para a fração Pcppt revelou o íon psedudomolecular
de m/z = 563 [M-H]
-
, sendo assim, foi possível afirmar a presença de Pc1 (apiina). Este
composto possui uma estrutura diglicosilada, logo, fragmentos destes açúcares não são
esperados.
*MSD1 SPC, time=7.816 of D:\UFRJ\TESE\HPLC\LC-MS\APIINA.D API-ES, Neg, Scan, 12
0
Max: 162304
563.2
564.2
Espectro 21: Espectro de massas para a molécula com t
R
= 7,776 minutos.
De acordo com os dados cromatográficos, foi observada a presença de uma molécula
flavonoídica na fração Pcppt. No entanto, a mesma não estava purificada, sendo assim foi
realizada uma etapa de purificação por meio de uma cromatografia em coluna gel sephadex
LH-20 e foi obtida a molécula mais purificada, sendo agora possível observar uma maior
absorção através da cromatografia líquida de alta eficiência, do espectro de ultravioleta da
amostra (Cromatograma 3 e Espectro 22) e através do espectro de massas (Espectro 23).
Observa-se que o íon pseudomolecular está de acordo com o encontrado na literatura
(JUSTESEN, 2000; LUTHRIA et al., 2006).
[M-H]
-
75 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
DAD1 C, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\UFRJ \ TESE \ HPLC\LC-MS \ APIINA.D)
3.419
3.595
6.865
7.479
7.598
7.772
8.032
8.428
10.999
11.589
Cromatograma 3: Cromatograma obtido para apiina. Concentração: 1 mg/ml;
volume de injeção: 10 µl.
*DAD1, 7.806 (1944 mAU, - ) Ref=7.219 & 8.872 of APIINA.D
Espectro 22: Espectro de ultravioleta para apiina, detecção a 254 nm.
Pc1
76 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
*MSD1 SPC, time=7.816 of D:\UFRJ\TESE\HPLC\LC-MS\APIINA.D API-ES, Neg, Scan, 120
Max: 162304
563.2
564.2
Espectro 23: Espectro de massas para apiina. Tempo de retenção 7,772 minutos.
CLAE-UV-EM para PcA e identificação do Flavonóide Pc2
Para o isolamento do flavonóide mais apolar, foi realizado um sistema de purificação em
acetato de etila, visando à separação dos flavonóides de acordo com sua polaridade.
Ao realizar a purificação com acetato de etila, foi possível observar dois novos picos com
tempo de retenção de
t
R
= 11,576 e 11,904 minutos respectivamente, além do pico em t
R
=
7,777 minutos (Cromatograma 4).
DAD1 C, Sig=280,8 Ref=598,8 (D:\UFRJ\TESE\HPLC\LC-MS\PCA.D)
5.981
6.159
6.456
6.716
6.868
7.182
7.575
7.777
8.035
8.246
8.525
8.868
9.178
9.572
9.833
10.356
10.554
10.873
11.576
11.904
12.403
13.126
13.534
14.072
15.823
16.196
17.452
20.580
21.168
26.779
Cromatograma 4: Cromatograma obtido para PcA. Concentração: 10 mg/ml; volume de injeção: 10 µl.
[M-H]
-
O
O
O
OH
OH
O
O
OH
HO
HO
O
OH
HO
OH
H
H
H
C
26
H
28
O
14
Pc1
Pc2
77 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Os dados de ultravioleta, para estes picos, mostraram bandas de absorção em 270 e 350
nm (
t
R
= 11,576 minutos) e 254, 270 e 350 nm (t
R
= 11,904 minutos) – Espectro 24. Através
dos dados de espectrometria de massas (Espectros 25 e 26), foram identificados íons
pseudomoleculares de m/z = 269 [M-H]
-
e m/z = 284 [M-H]
-
. Estes valores mostram a
presença de duas agliconas sendo estas apigenina e luteolina, respectivamente. É importante
ressaltar que para o Espectro 26 é observada mais de uma substância, logo, temos uma
mistura.
*DAD1, 11.488 (111 mAU, - ) Ref=3.088 & 12.715 of PCA.D
*DAD1, 11.915 (316 mAU, - ) Ref=3.088 & 12.715 of PCA.D
Espectro 24: Espectros de ultravioleta para apigenina e luteolina respectivamente, detecção a 254
nm.
*MSD1 SPC, time=11.635 of D:\UFRJ\TESE\HPLC\LC-MS\PCA.D API-ES, Neg, Scan, 120
Max: 150272
269.0
270.0
150.9
Espectro 25: Espectro de massas para a aglicona apigenina. Tempo de retenção 11,576 minutos.
O
O
OH
HO
OH
C
15
H
10
O
5
[M-H]
-
78 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
*MSD1 SPC, time=11.976 of D:\UFRJ\TESE\HPLC\LC-MS\PCA.D API-ES, Neg, Scan, 120
Max: 65376
284.0
299.0
150.9
271.0
300.0
119.1
200.9
Espectro 26: Espectro de massas para a aglicona luteolina. Tempo de retenção 11,904 minutos.
O espectro 27 mostra bandas de absorção característica para apigenina e o espectro de
massas mostra um íon molecular m/z = 270 e íons pseudomoleculares m/z = 269 [M-H]
-
e m/z
= 151, característico da fragmentação clássica para o anel A da aglicona - Espectro 28 -
(JUSTESEN, 2000).
*DAD1, 11.541 (1785 mAU, - ) Ref=11.381 & 12.341 of APIGEN~1.D
Espectro 27: Espectro de ultravioleta para apigenina, detecção a 254 nm.
O
O
OH
HO
OH
OH
C
15
H
10
O
6
[M-H]
-
79 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
*MSD1 SPC, time=11.690 of D:\UFRJ\TESE\HPLC\LC-MS\APIGEN~1.D API-ES, Neg, Scan, 120
Max: 181184
269.0
270.0
150.9
Espectro 28: Espectro de massas para a aglicona apigenina. Tempo de retenção 11,904 minutos.
O
O
OH
HO
OH
C
15
H
10
O
5
[M-H]
-
HO OH
OH
C
O
80 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A
A
n
n
á
á
l
l
i
i
s
s
e
e
q
q
u
u
a
a
n
n
t
t
i
i
t
t
a
a
t
t
i
i
v
v
a
a
d
d
o
o
s
s
f
f
l
l
a
a
v
v
o
o
n
n
ó
ó
i
i
d
d
e
e
s
s
d
d
e
e
P
P
e
e
t
t
r
r
o
o
s
s
e
e
l
l
i
i
n
n
u
u
m
m
c
c
r
r
i
i
s
s
p
p
u
u
m
m
Os flavonóides eventualmente presentes no extrato e frações da espécie Petroselinum
crispum foram quantificados através da técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.
A apiina, apigenina e comosiina foram quantificados através de uma curva área x massa
(µg) preparada utilizando padrão de rutina comercial. A curva obtida e a equação da reta
utilizada nos cálculos se encontram abaixo.
massa (µg) injetada de rutina Área calculada para o pico
2 3766
4 7347
6 11136
8 14763
10 18331
massas injetadas de rutina 10 vezes menores
0,2 329
0,4 654
0,6 975
0,8 1295
1 1617
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU2.D)
17.821
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU4.D)
17.897
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU6.D)
17.862
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU8.D)
17.725
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU10.D)
17.736
Rutina 2
µ
g
Rutina 4
µ
g
Rutina 6
µ
g
Rutina 8
µ
g
Rutina 10
µ
g
81 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Utilização de concentrações 10 vezes mais diluídas:
Figura 17: Curva de calibração da rutina
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU2D.D)
17.772
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU4D.D)
17.762
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU6D.D)
17.798
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU8D.D)
17.775
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU10D.D)
17.743
y = 0,000x
R² = 0,999
0
2
4
6
8
10
12
0 5000 10000 15000 20000
µg
Area 254 nm
Rutina 0,2
µ
g
Rutina 0,4
µ
g
Rutina 0,6
µ
g
Rutina 0,8
µ
g
Rutina 1
µ
g
µg
82 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Após a construção da curva de calibração, a determinação da concentração de cada
flavonóide nas amostras analisadas foi feita pela equação da reta determinada por regressão
linear. O percentual (m/m) dos flavonóides no extrato liofilizado (em termos de quantidade de
rutina) foi corrigido utilizando o fator de correção de peso molecular (f
PM
):
*PM = peso molecular
Desta forma, os percentuais (% m/m) de cada flavonóide no extrato seco foram
expressos em relação a cada flavonóide específico. A Tabela 9 mostra as áreas
correspondentes aos flavonóides presentes no extrato, e a Figura 18 representa um gráfico
com a porcentagem dos flavonóides presentes no extrato da espécie.
Tabela 9: Área (254 nm) e percentual dos flavonóides isolados (% m/m) calculados em relação ao
extrato liofilizado.
(Pc1) Apiina
(t
R
=7,77 min)
(Pc3) Comosiina
(t
R
=8,02 min)
(Pc2) Apigenina
(t
R
=11,41 min)
Área 11914,54 1525,83 18,16
(%) 6,60 0,64 0,01
Apiina (Pc1) é o flavonóide majoritário no decocto das folhas de Petroselinum crispum
conforme foi evidenciado nas análises cromatográficas. Este fato já havia sido relatado na
literatura (HEMMING & OLLIS, 1953; PERRY et al., 1965; LUTHRIA et al., 2006) a partir de
outros tipos de extrações com diferentes solventes.
Embora a apiina seja o componente majoritário na espécie P. crispum outros flavonóides,
isolados e identificados nesta dissertação, foram quantificados. Observamos que o componente
mais representativo, em massa, após a apiina é a molécula a comosiina (Pc3) embora
representada em concentrações dez vezes menor.
PERRY et al. (1965) isolaram e identificaram em extrato desta espécie a substância
comosiina que mostrou ser o segundo componente de maior massa, corroborando assim com
nossos dados apresentados.
f
PM
= PM* flavonóide .
PM* rutina
83 Resultados e Discussão: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Em seguida, em termos de massa apigenina (Pc2) se apresenta como o flavonóide
minoritário no decocto de P. crispum. Estes dados corroboram com os encontrados na literatura
(JUSTESEN, 1998; JUSTESEN, 2000).
Figura 18: Concentração (%, m/m) dos flavonóides no decocto das folhas frescas de P. crispum (PcD).
6.6
0.64
0.01
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Apiina
(Pc1)
Comosiina
(Pc3)
Apigenina
(Pc2)
Porcentagem %
84 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
RESULTADOS E DISCUSSÃO:
Ensaios biológicos
Atividade inibitória sobre a coagulação plasmática
85 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
E
E
n
n
s
s
a
a
i
i
o
o
s
s
B
B
i
i
o
o
l
l
ó
ó
g
g
i
i
c
c
o
o
s
s
Todos os ensaios foram realizados no laboratório de hemostase e veneno dirigido pela
professora Russolina B. Zingali (IBqM – UFRJ). Os mesmos foram supervisionados pelas
doutorandas Mariane Assafim (ensaios anticoagulante) e Flávia Frattani (ensaios plaquetários).
Todas as amostras foram testas em triplicata (n= 3).
Importante ressaltar, que algumas frações não puderam ser avaliadas frente aos ensaios
antitrombóticos. O decocto (PcD) não foi testado nestes ensaios, uma vez que, ao realizar o
processo de decocção foi obtido um precipitado (Pcppt). A separação deste precipitado
conduziu à obtenção de duas subfrações, as quais, separadas, não correspondiam
quimicamente à composição original do decocto.
A fração PcA não pode ser avaliada frente a agregação plaquetária, pois o rendimento
desta fração foi muito baixo. Considerando que esta fração encontrava-se enriquecida em uma
substância flavonoídica, priorizou-se o isolamento dos compostos químicos presentes na
mesma (Esquema 5 – página 41).
Os flavonóides isolados nesta dissertação não foram testados nos ensaios biológicos,
considerando que estes não apresentaram solubilidade no sistema tamponado utilizado nos
ensaios biológicos, não permitindo assim a realização dos mesmos.
A apiina (Pc1) além de não ser solúvel em sistema tamponado, ao entrar em contato
com o plasma torna-se um gel, fazendo com que o mesmo não permita a passagem da luz no
ensaio de agregação plaquetária. A apigenina (Pc2) foi obtida em baixo rendimento, logo, não
foi possível a realização dos ensaios, pois a massa obtida não seria suficiente para a realização
dos ensaios em triplicata.
Foi realizado um sistema de solubilização para estes flavonóides em α-ciclodextrina, no
entanto, estas substâncias não foram solúveis neste sistema, não permitindo a realização dos
ensaios.
86 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
E
E
n
n
s
s
a
a
i
i
o
o
d
d
e
e
a
a
P
P
T
T
T
T
e
e
P
P
T
T
Os ensaios de tempo de tromboplastina parcial ativado (aPTT) e tempo de protrombina
(PT) foram realizados utilizando plasma pobre em plaquetas (n= 3) e as amostras testadas
foram solubilizadas em sistema tampão.
No ensaio de aPTT, que avalia a via intrínseca da coagulação, foi observado que dentre as
frações estudadas, a Pcsn não mostrou atividade significativa em ambos os ensaios.
Entretanto, quando foi realizada uma etapa de purificação resultando em três outras frações
(PcAq, PcA e PcB), foi observado que a fração PcAq não mostrou uma atividade inibitória
significante nestes ensaios de coagulação. Já PcB, na concentração de 4 mg/ml, apresentou
uma ligeira atividade inibitória da coagulação em aPTT prolongando seu tempo de coagulação
plasmática em até 3 vezes mais frente ao controle (PBS). Diante deste resultado podemos
sugerir que está fração estaria interferindo na coagulação, através dos fatores da coagulação
presentes na via intrínseca (Figura 19).
A fração em acetato de etila (PcA) não foi testada no ensaio de coagulação, uma vez que
o seu rendimento foi muito baixo, fazendo com que não tivéssemos massa suficiente para a
realização dos ensaios (aPTT e PT).
No ensaio de PT, que avalia a via extrínseca da coagulação, a fração Pcsn novamente não
apresentou atividade inibitória significativa frente aos fatores que compõem esta via, pois não
apresentou nenhum aumento no tempo de coagulação plasmática. A fração PcAq novamente
não apresentou potência inibitória até uma concentração de 5,0 mg/ml. A fração butanólica
(PcB) foi a de maior importância em nossos ensaios anticoagulantes, uma vez que tornou o
plasma incoagulável (Figura 20). Vários trabalhos são relatados para a espécie P. crispum na
literatura, no entanto, todos relacionados a diversas atividades biológicas, mas nenhuma
relacionada a atividade anticoagulante, logo, esta dissertação relata pela primeira vez esta
atividade para esta espécie da família Apiaceae.
De acordo com o perfil químico relatado na parte de cromatografia liquida de alta
eficiência e com as substâncias identificadas com base nos dados de ressonância magnética
nuclear observamos que a fração PcB possui flavonóides em pequenas concentrações.
A atividade em 5,0 mg/ml pode estar relacionada a estas substâncias, pois, dados da
literatura mostram que flavonóides são mediadores da ação anticoagulante.
MOZZICAFREDDO et al. (2006) demonstraram a atividade amidolítica da trombina frente
a diversos flavonóides como quercetina, luteolina e rutina. Os resultados mostraram que ao
87 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
aumentar a concentração dos flavonóides, a atividade amidolítica diminui, sugerindo assim,
que os flavonóides atuam como anticoagulantes.
Quatro flavonóides foram testados frente aos ensaios de aPTT, PT e TT (tempo de
trombina), sendo eles: rutina, quercetina, morina e hesperidina. Estes tiveram suas ações
avaliadas e os autores observaram um significante prolongamento do tempo de coagulação
medido de acordo com o controle. Com estes resultados os autores puderam confirmar uma
interação dos flavonóides estudados com proteínas plasmáticas humanas (KUNTIC et al.,
1999).
GUGLIELMONE et al. (2002) avaliaram flavonóides sulfatados em ensaios de aPTT e PT.
Estas substâncias altamente purificadas mostraram uma importante ação anticoagulante in
vitro, evidenciada pelo aumento do tempo de coagulação.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
mg/ml
aPTT (segundos)
PBS
Pcsn
PcAq
PcB
PBS
Pcsn
PcAq
PcB
PBS 1,4 2,2 3,0 4,0
Figura 19: Efeito in vitro das frações de Petroselinum crispum sobre a coagulação do plasma, após a
ativação da via intrínseca induzida pelo reagente aPTT.
Tempo de coagulação do plasma (segundos) ativado pelo reagente aPTT na ausência ou na presença das
frações de P. crispum em diversas doses. Os resultados são a média dos valores observados em três
experimentos independentes.
88 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
0
20
40
60
80
100
120
140
160
mg/ml
PT (segundos)
PBS 1,8 2,9 3,8 5,0
PBS
Pcsn
PcAq
PcB
PBS
Pcsn
PcAq
PcB
Figura 20: Efeito in vitro das frações de Petroselinum crispum sobre a coagulação do plasma, após a
ativação da via extrínseca induzida pelo reagente PT.
Tempo de coagulação do plasma (segundos) ativado pelo reagente PT na ausência ou na presença das
frações de P. crispum em diversas doses. Os resultados são a média dos valores observados em três
experimentos independentes.
* Plasma incoagulável (tempo > 150 segundos).
Com base nos resultados observados em nossos ensaios, podemos sugerir que,
possivelmente, a fração PcB atua interferindo na atividade dos fatores da coagulação, e
principalmente nos fatores que compõem a via extrínseca da coagulação que é avaliada pelo
ensaio de PT. Isto é possível, pois foi observada nitidamente uma interferência desta fração no
tempo de coagulação, fazendo com que o mesmo fosse aumentado.
*
89 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
E
E
n
n
s
s
a
a
i
i
o
o
d
d
e
e
A
A
g
g
r
r
e
e
g
g
a
a
ç
ç
ã
ã
o
o
p
p
l
l
a
a
q
q
u
u
e
e
t
t
á
á
r
r
i
i
a
a
Os ensaios de agregação plaquetária foram realizados pela doutoranda Flávia Frattani e
acompanhados por mim no laboratório de hemostase e veneno, dirigido pela professora
Russolina B. Zingali. Todos os ensaios foram realizados utilizando plaquetas humanas (n= 3) e
as amostras testadas foram solubilizadas em dimetilsulfóxido (DMSO).
Agregação plaquetária em plaquetas humanas
Induzida por ADP (adenosil difosfato)
Apesar de buscarmos compostos que possuam uma ação inibitória específica frente à
trombina, foi necessário observar a ação destes frente a outros agonistas da agregação
plaquetária para que fosse possível comparar também os diferentes tipos de mecanismos.
Desta forma, nossas frações foram avaliadas frente ao indutor adenosil difosfato (ADP).
Foi realizado então o ensaio de agregação frente ao ADP com o intuito de avaliar se as frações
estariam atuando por um mecanismo diferente, não mediado pela trombina.
Os ensaios foram realizados em DMSO. A curva controle foi realizada utilizando plasma
rico em plaquetas (PRP), o indutor (APD) e DMSO no lugar de tampão, visto que, as
substâncias não eram totalmente solúveis em água. Para que o DMSO não interferisse na
agregação plaquetária, foi utilizado um volume máximo de 13 µl de DMSO, pois foi observado
através da curva controle que utilizando este volume o mesmo não interfere na agregação
plaquetária. É importante ressaltar que estes ensaios foram realizados em triplicata e que para
o controle não existia nenhuma substância que pudesse interferir na atividade plaquetária.
As Figuras 21 a 23 mostram os resultados obtidos na agregação plaquetária induzida
por ADP. Obtivemos em torno de 94,4 +
2,8 % de inibição da agregação com Pcsn (3,8 mg/ml)
e IC
50
= 1,81 mg/ml, inibição de 59,2 + 9,5 % (1,5 mg/ml) para a fração aquosa PcAq e IC
50
=
1,19 mg/ml e na presença da fração butanólica verificou-se um percentual de inibição em torno
de 85,9 +
3,9 % (9,5 mg/ml) com IC
50
= 4,79 mg/ml.
A seguir são apresentados os gráficos de inibição da agregação plaquetária e na Tabela
10 são mostrados os valores IC
50
calculados para as frações Pcsn, PcAq e PcB frente ao indutor
ADP.
90 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
mg/ml
0.00.51.01.52.02.53.03.54.0
% Inibição
0
20
40
60
80
100
120
0,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
3,5 4,0
Figura 21: Agregação plaquetária in vitro induzida por ADP (2 µM) utilizando plasma rico em plaqueta
humana (PRP), frente à fração Pcsn em diversas concentrações (n= 3).
mg/ml
0.00.20.40.60.81.01.21.41.6
% Inibição
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0,2
0,4
0,8 1,0 1,2 1,4 1,60,6
Figura 22: Agregação plaquetária in vitro induzida por ADP (2 µM) utilizando plasma rico em plaqueta
humana (PRP), frente à fração PcAq em diversas concentrações (n= 3).
91 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
mg/ml
0246810
% inibição
0
20
40
60
80
100
2,0
2,0
0,0
4,0 6,0 8,0
10,0
Figura 23: Agregação plaquetária in vitro induzida por ADP (2 µM) utilizando plasma rico em plaqueta
humana (PRP), frente à fração PcB em diversas concentrações (n= 3).
Tabela 10: Inibição da agregação plaquetária frente ao indutor ADP e seus respectivos valores de IC
50
calculados para frações de Petroselinum crispum.
Fração
% de inibição da
agregação plaquetária
IC
50
Pcsn 94,4 + 2,8 (3,80 mg/ml) 1,81 mg/ml
PcAq 59,2 + 9,5 (1,50 mg/ml) 1,19 mg/ml
PcB 85,9 +
3,9 (9,50 mg/ml) 4,79 mg/ml
Pcsn mostrou uma atividade inibitória significativa com IC
50
= 1,81 mg/ml. Vale ressaltar
que o IC
50
indica a concentração necessária para que ocorra 50 % de inibição da agregação
plaquetária. Nas análises de CLAE–EM–UV a fração Pcsn apresentou substâncias de natureza
flavonoídica, que em muitos casos possuem atividade antiplaquetária frente a este indutor
(KOBZAR et al., 2005; GUGLIELMONE et al., 2005).
92 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
A purificação de Pcsn gerou as frações PcA (acetato de etila), PcB (n-butanol) e PcAq
(aquosa). Verificou-se que por meio destas partições com solventes orgânicos de diferentes
polaridades, foram obtidas frações mais ativas.
Observou-se que em relação ao IC
50
, a fração PcAq mostrou ser a mais ativa. Já a fração
butanólica PcB apresenta uma pequena ação sobre a atividade plaquetária, no entanto o valor
de IC
50
é muito elevado, o que indica que esta fração não seria de interesse para ser estudada
frente ao indutor ADP. Possivelmente as substâncias presentes nesta fração poderiam estar
interagindo de forma a provocar uma diminuição desta atividade, ou até mesmo, simplesmente
a fração PcB reúne substâncias que não atuam por esta via de indução.
MEKHFI et al. (2004) observaram através de seus ensaios de agregação plaquetária
induzida por ADP, que o infuso de P. crispum foi capaz de inibir a atividade plaquetária.
Entretanto, os autores utilizaram na obtenção do extrato bruto uma técnica de extração
diferente daquela utilizada em nosso trabalho (decocção). Teoricamente, a infusão é menos
eficiente em termos de capacidade de extração de substancias que aquela utilizada neste
trabalho. Para resultar em inibição da agregação plaquetária de 78 %, os autores utilizaram
uma concentração final de 10 mg/ml de extrato bruto.
Em nosso estudo conseguimos observar uma interferência mais significativa usando
concentrações menores das frações mais purificadas Pcsn, PcAq e PcB
no ensaio de agregação
plaquetária induzido por ADP, com plasma humano rico em plaquetas. Para a obtenção de uma
porcentagem de inibição maior do que aquela alcançada por MEKHFI et al. (2004) (78 % com
10 mg/ml de extrato), foram usadas concentrações de Pcsn 2,63 vezes menores (3,80 mg/ml
de extrato) e a porcentagem de inibição da agregação plaquetária verificada foi de 94,4 %.
93 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
Induzida por Trombina
A trombina é considerada a enzima chave no processo hemostático. Por isso, diversos
estudos visam à busca de inibidores desta enzima (GUGLIELMONE et al., 2002).
Neste estudo também foi avaliada a ação das frações mais purificadas (PcAq e PcB) frente
à agregação plaquetária induzida por trombina. As Figuras 24 a 26 mostram os valores da
agregação induzida por trombina. Para Pcsn observamos 98,4 +
0,9 % de inibição em uma
concentração de 0,31 mg/ml e com IC
50
= 0,16 mg/ml. A fração PcAq apresentou 80,4 + 0,4 %
(1,15 mg/ml) com IC
50
= 0,71 mg/ml e a fração butanólica PcB apresentou inibição da
agregação em torno de 94,9 +
0,4 % em concentração de 1,50 mg/ml com IC
50
= 0,72 mg/ml.
A seguir são apresentados os gráficos de inibição da agregação plaquetária e na Tabela
11 são mostrados os valores IC
50
calculados para as frações Pcsn, PcAq e PcB frente ao indutor
trombina.
mg/ml
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
% Inibição
0
20
40
60
80
100
120
0,05
0,10 0,20 0,25 0,30 0,350,0 0,15
Figura 24: Agregação plaquetária in vitro induzida por trombina (6 ηM) utilizando plaqueta lavada
humana, frente à fração Pcsn em diversas concentrações (n= 3).
94 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
mg/ml
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
% Inibição
0
20
40
60
80
100
0,2
0,4 0,8 1,0 1,20,0 0,6
Figura 25: Agregação plaquetária in vitro induzida por trombina (6 ηM) utilizando plaqueta lavada
humana, frente à fração PcAq em diversas concentrações (n= 3).
mg/ml
0.00.20.40.60.81.01.21.41.6
% Inibição
0
20
40
60
80
100
0,2
0,4 0,8 1,0 1,2 1,40,0 0,6 1,6
Figura 26: Agregação plaquetária in vitro induzida por trombina (6 ηM) utilizando plaqueta lavada
humana, frente à fração PcB em diversas concentrações (n= 3).
95 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
Tabela 11: Porcentagem de inibição da agregação plaquetária frente ao indutor trombina e seus
respectivos valores de IC
50
calculados para frações de Petroselinum crispum.
Fração
% de inibição da agregação
plaquetária
IC
50
Pcsn 98,4 + 0,9 (0,31 mg/ml) 0,16 mg/ml
PcAq 80,4 + 0,4 (1,15 mg/ml) 0,71 mg/ml
PcB 94,9 +
0,4 (1,50 mg/ml) 0,72 mg/ml
Os valores de IC
50
mostram que a fração Pcsn é a mais ativa. O processo de purificação
gerou as frações PcAq e PcB que também possuem atividade inibitória, entretanto menor do
que Pcsn. Com este dado podemos sugerir que as substâncias presentes nestas frações
possuem um efeito conjunto.
A substância majoritária presente na fração PcB não é de natureza flavonoídica. Apresenta
uma única banda de absorção no ultravioleta e um espectro de massas com várias
fragmentações, incompatíveis com o esqueleto de um flavonóide. Entretanto, flavonóides
também estão presentes nesta fração, porém em concentrações muito baixas.
MEKHFI et al. (2004) relataram uma pequena atividade inibitória da agregação
plaquetária para o extrato bruto de P. crispum, no entanto, eles alcançaram uma inibição de 73
% com uma concentração final de 10 mg/ml e apresentaram um IC
50
= 6,4 mg/ml. Em nossos
estudos observamos para Pcsn, fração mais purificada, uma inibição de 98,4 %, na
concentração de 0,31 mg/ml com IC
50
= 0,16 mg/ml. MEKHFI et al. (2004) sugerem que os
componentes que poderiam estar inibindo a agregação plaquetária seriam os flavonóides. Em
nosso trabalho, observamos que Pcsn possui uma concentração elevada de flavonóides, o que
nos permite sugerir que estes compostos sejam os responsáveis por esta atividade.
Dados da literatura comprovam que flavonóides e outros compostos fenólicos possuem a
propriedade de alterar o sistema plaquetário.
EL-HAOUARI et al. (2006) mostraram a ação inibitória de substâncias em plaquetas
isoladas de ratos. Das folhas de Urtica dioica foram isolados diversos flavonóides, os quais
foram avaliados frente à capacidade de inibição da agregação plaquetária. Os flavonóides
isolados apresentaram uma potente atividade inibitória da agregação plaquetária induzida por
trombina. Flavonóides glicosilados apresentaram um IC
50
= 0,4 mg/ml.
Comparando os resultados obtidos na agregação plaquetária induzida por ADP e na
agregação induzida por trombina temos os seguintes valores, mostrados na Tabelas 12.
96 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
Tabela 12: Valores de IC
50
das frações de Petroselinum crispum frente ao indutor ADP e trombina.
Fração IC
50
(ADP) IC
50
(Trombina)
Pcsn 1,81 mg/ml 0,16 mg/ml
PcAq 1,19 mg/ml 0,71 mg/ml
PcB 4,79 mg/ml 0,72 mg/ml
As frações de P. crispum mostraram ser inibidoras da agregação plaquetária induzida
tanto por ADP quanto por trombina. No entanto, observou-se maior atividade frente à
agregação induzida por trombina.
A fração PcB mostrou ser muito mais ativa frente a agregação induzida por trombina. O
valor de IC
50
mostrou-se sete vezes menor do que o obtido para a agregação induzida por ADP,
caracterizando assim uma fração de bastante interesse frente à inibição da agregação induzida
por trombina.
As três frações Pcsn, PcAq e PcB possuem um perfil de inibição da agregação plaquetária
em plasma humano mais eficaz frente à agregação induzida por trombina, do que, por ADP.
Sendo assim, é possível sugerir que estas frações podem estar atuando nos receptores para
trombina, presentes nas plaquetas, através de um mecanismo de competição ou até mesmo
inibindo a trombina através de uma ligação direta a mesma.
Estudos indicam que o flavonóide quercetina possui a habilidade de inibir a trombina
através de uma forte ligação de hidrogênio com o aminoácido His57 que está presente na
tríade catalítica da trombina (MOZZICAFREDDO et al. 2006). Visto que Pcsn é enriquecida em
flavonóide e que Pcb é pobre nesta classe química, isto indica que estes compostos possam
estar provocando esta inibição, visto que esta classe de substância é biologicamente ativa.
Para o flavonóide apigenina (5,7,4`-triidroxiflavona), são relatadas várias atividades
biológicas, entre elas a atividade antimicrobiana e atividade estrogênica (SOUZA et al., 2006;
INNOCENTIN et al., 2006). FEJES et al. (2000_a) demonstraram que a apigenina isolada de um
decocto das folhas de Anthriscus cerefolium (Apiaceae) apresentou excelente atividade
antioxidante em todas as concentrações estudadas.
Uma dieta rica em compostos fenólicos pode favorecer uma atividade antiplaquetária
resultando na proteção cardiovascular por diversos mecanismos. Em trabalhos anteriores, as
flavonas apigenina (isolada e identificada nesta dissertação) e luteolina (identificada nesta
dissertação) apresentaram uma inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno e
ácido araquidônico. Os autores sugerem que esta atividade esteja relacionada com a
capacidade destes flavonóides estarem competindo com o receptor de tromboxano A
2
(TXA
2
),
97 Resultados e Discussão: Ensaios Biológicos
sendo assim, o antagonismo de receptores de TXA
2
pode representar um mecanismo para o
efeito inibitório destes compostos na função plaquetária (GUERRERO et al., 2004).
Estudos recentes mostram que compostos contendo as agliconas apigenina e luteolina
desempenham uma potente atividade frente ao ácido araquidônico. De acordo com ZHENG et
al. (2005) dois principais metabólitos do ácido araquidônico, tromboxano B
2
(TXB
2
) e ácido 12-
idroxi-5, 8, 10, 14-eicosatetraenóico (12-HETE), induzem a agregação plaquetária e a reação
das lipoxigenases que também estão envolvidas no processo trombótico. A apigenina mostrou
ser uma molécula importante no mecanismo inibitório não somente 12-HETE, mas também do
TXB
2
.
JANSSEN et al. (1998) demonstraram o efeito inibitório da quercetina e apigenina frente
aos indutores colágeno e ADP utilizando plasma rico em plaquetas (PRP) in vitro. A inibição da
agregação plaquetária foi ainda avaliada frente à trombina utilizando plaqueta lavada, e a
apigenina apresentou em torno de 90 % de inibição. Os autores concluem que o efeito
antiagregante plaquetário dos flavonóides observados in vitro nas concentrações estudadas
(10-1000 µmol/L) podem alcançar facilmente um efeito in vivo.
DOBRYDNEVA et al. (1999) demonstraram que um componente essencial do processo de
agregação plaquetária é o aumento da concentração intracelular de cálcio livre. Neste estudo o
trans-resveratrol, isolado de cascas de uvas, inibiu o influxo de cálcio nas plaquetas induzidas
por trombina com IC
50
= 0,5 µM. Estes dados indicam que este composto fenólico inibe
diretamente a atividade dos canais de cálcio das plaquetas. Os autores avaliaram outros
compostos fenólicos como a flavona apigenina, que apresentou efeito inibitório parecido com o
trans-resveratrol.
98 Conclusões e Perspectivas
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
99 Conclusões e Perspectivas
C
C
o
o
n
n
c
c
l
l
u
u
s
s
õ
õ
e
e
s
s
O estudo da composição química do decocto das folhas de Petroselinum crispum
(procedente de Vassouras – RJ) levou ao isolamento e à identificação de dois flavonóides com
esqueleto de flavona. Estes são: Apigenina 7-O-apiofuranosideo-(1→2)-O-glicopiranosideo
(Pc1), também conhecido por Apiina, e apigenina 5,7,4`-triidroxiflavona (Pc2) ou apigenina.
Foram identificados ainda dois outros flavonóides na espécie, através de Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas e ultravioleta, sendo eles:
Apigenina 7-O-glicosídeo (comosiina) e luteolina 5,7,3`,4`-tetraidroxiflavona
A Análise por CLAE-EM-UV do decocto da folhas de P. crispum permitiu ainda determinar
que a apiina (Pc1) é o componente majoritário das folhas de salsa, correspondendo a
aproximadamente 6,6 % do extrato seco, seguido de comosiina (Pc3) 0,64 % e apigenina
(Pc2) 0,01 % referente ao extrato seco.
A fração butanólica PcB apresentou uma significativa alteração no tempo de coagulação
plasmática, provocando um aumento deste. O tempo foi aumentado em até 3 vezes mais
frente ao controle, sugerindo que esta fração poderia estar atuando nos fatores da coagulação
que compõem a via intrínseca da coagulação.
A fração butanólica PcB apresentou ainda uma interferência na via extrínseca que é
avaliada por PT. Esta fração mostrou ser bem ativa frente aos fatores que compõem esta via,
uma vez que, na concentração de 5,0 mg/ml o plasma tornou-se incoagulável.
Foi realizado o ensaio de agregação plaquetária induzida por diversos agonistas, como
ADP e trombina. No ensaio induzido por ADP todas as frações (Pcsn, PcAq e PcB) apresentaram
resultados significativos, atuando como inibidores da agregação plaquetária, no entanto, PcAq
mostrou ser a fração mais ativa (IC
50
= 1,19 mg/ml).
No ensaio de inibição da agregação plaquetária induzida por trombina, a fração de maior
atividade foi Pcsn (IC
50
= 0,19 mg/ml). PcAq e PcB mostraram valores mais elevados de IC
50
. É
possível sugerir que as frações de Petroselinum crispum possuem uma maior atividade frente à
trombina, uma vez que apresentaram um IC
50
de até dez vezes menor como no caso de PcAq.
100 Conclusões e Perspectivas
Os ensaios anticoagulante e antiplaquetários permitem sugerir que estas frações
interferem na hemostasia primária (mediada principalmente pelas plaquetas) e na hemostasia
secundária (mediada pelos fatores da coagulação), uma vez que, todas as frações (Pcsn, PcAq
e PcB) interferiram em todos os ensaios realizados.
Apiina é o componente majoritário nas frações Pcsn e PcB, sendo assim é possível
sugerir que este flavonóide possa estar relacionado a estas atividades (anticoagulante e
antiplaquetária in vitro).
Através destes resultados observamos uma significativa atividade antiplaquetária e/ou
anticoagulante das frações de Petroselinum crispum, o que torna esta planta medicinal
potencialmente útil no tratamento de doenças que envolvem o sistema plasmático.
101 Conclusões e Perspectivas
P
P
e
e
r
r
s
s
p
p
e
e
c
c
t
t
i
i
v
v
a
a
s
s
Avaliação através de LC-MS da composição química dos extratos de espécimes de
Petroselinum crispum de diferentes procedências.
Realização de novos testes biológicos com a fração PcA, para que possamos saber o real
efeito desta fração frente aos fatores da coagulação e a agregação plaquetária, de maneira a
completar nossos dados visando a publicação dos resultados em forma de artigo científico.
Avaliar PcAq e PcB, conjuntamente, frente a agregação plaquetária induzida por
trombina, pois, estas frações apresentaram um IC
50
maior do que a fração Pcsn. Este ensaio é
necessário para sabermos se as duas frações atuam em separado ou não, sobre a agregação
plaquetária.
Será dada continuidade ao estudo procedendo in vivo à avaliação da atividade
antitrombótica das frações que foram testadas nesta dissertação de mestrado.
102 Referências Bibliográficas
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
103 Referências Bibliográficas
R
R
e
e
f
f
e
e
r
r
ê
ê
n
n
c
c
i
i
a
a
s
s
B
B
i
i
b
b
l
l
i
i
o
o
g
g
r
r
á
á
f
f
i
i
c
c
a
a
s
s
ADSERSEN, A.; GAUGUIN, B.; GUDIKSEN, L.; JAGER, A.K.; Screening of plants used in Danish
folk medicine to treat memory dysfunction for acetylcholinesterase inhibitory activity.
Journal of Ethnopharmacology, v. 104, p. 418-422, 2006.
ALMEIDA, A.P.; Extratos de Kalanchoe pinnata (Crassulaceae), uma planta usada na medicina
popular: estudo químico guiado pelo ensaio de proliferação de linfócitos. Tese para
obtenção do grau de doutor, Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais - NPPN, UFRJ, 2000.
AL-HOWIRINY, T.; AL-SOHAIBANI, M.; EL-TAHIR, K.; RAFATULLAH, S.; Prevention of
experimentally-induced gastric ulcers in rats by an ethanolic extract of "Parsley"
Petroselinum crispum. The American Journal of Chinese Medicine, v. 31, n. 5, p. 699-711,
2003.
ALI-SHTAYED, M.S.; YANIV, Z.; MAHAJNA, J.; Ethnobotanical survey in the Palestinian area: a
classification of the healing potential of medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology, v.
73, n. 1-2, p. 221-232, 2000.
APPENDINO, G.; JAKUPOVIC, J.; BOSSIO, E.; Structural revision of the parsley sesquiterpenes
crispanona and crispane. Phytochemistry, v. 49, n. 6, p. 1719–1722, 1998.
BEDERKE, E.; BROCKMANN, H.; BRUGGENCATE, P.; CORRENS, C.W.; WEIDEL, W.; On the
glycosides of Apium petroselinum (parsley). Naturwissenschaften, v. 44, n. 16, p. 444,
1957.
BHATT, D.L. & TOPOL, E.J.; Scientific and Therapeutic Advances in Antiplatelet Therapy. Nature
Reviews drug discovery, v. 2, p. 15-28, 2003.
BICK, R.L. & FAREED, J.; Current status of thrombosis: A multidisciplinary medical issue and
major American health problem beyond the year 2000. Clinical and Applied Thrombosis and
Haemostasis 3 (suppl1): S1, 1997.
BORN, G.V.R. & CROSS, M.J.; The aggregation of blood platelets. Journal of Physiology, v.
168, p. 178 – 195, 1963.
104 Referências Bibliográficas
BOURIN, M.C. & LINDAHL, U.; Glycosaminoglycans and the regulation of blood coagulation.
Journal of Biochemical, v. 289, p. 313-330, 1993.
CARDOSO, M.G.; CASTRO, D.P.; AGUIAR, P.M.; SILVA, V.F.; SALGADO, A.P.S.P.; MUNIZ, F.R.;
GAVILANIS, M.R.; PINTO, J.E.B.P.; Plantas aromáticas e condimentares. Lavras, MG,
Editora UFLA, p. 1-78, 2005, [http://www.editora.ufla.br/Boletim/pdf/bol_62.pdf].
CARATENUTO, A.; FEO, V.; FATTORUSSO, E.; LANZOTTI, V.; MAGNOT, S.; CICALA, C.; The
flavonoids of Allium ursinum. Phytochemistry, v. 41, n. 2, p. 531-536, 1996.
CASSIDY, A. & HOOPER, L.; A review of the health care potential of bioactive compounds.
Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 86, n. 12, p. 1805-1813, 2006.
CHENG, T.O.; All teas are not created equal The Chinese green tea and cardiovascular health.
International journal of Cardiology, v. 108, p. 301-308, 2006.
CHOU, C-J.; KO, H-C.; LIN, L-C.; Flavonoid Glycosides from Viscum alniformosanae. Journal of
Natural Products, v. 62, p. 1421-1422, 1999.
CIGANDA, C.; LABORDE, A.; Herbal infusions used for induced abortion. Journal of Toxicology-
Clinical Toxicology, v. 41, n. 3, p. 235-239, 2003.
CIRICO, T.L. & OMAYE, S.T.; Additive or synergetic effects of phenolic compounds on human
low density lipoprotein oxidation. Food and Chemical Toxicology, v. 44, p. 510-516, 2006.
COLQUHOUN, D.M.; Nutraceuticals: Vitamins and other nutrients in coronary heart disease.
Current Opinion in Lipidology, v. 12, p. 639–646, 2001.
COOK, N.C. & SAMMAN, S.; Flavonoids – Chemistry, metabolism, cardioprotective effects, and
dietary sources. Nutritional Biochemistry, v. 7, p. 66–76, 1996.
CROWTHER, M.A.; Oral-direct Thrombin Inhibitors. In: LOSCALZO, J. & SCHAFER, A.I.; New
therapeutics agents in thrombosis and thrombolysis. Chapter 02, p. 265-271, 2003.
DAVIE, E.W.; FUJIKAWA, K.; KISIEL, W.; The coagulation cascade: Initiation, maintenance and
regulation. Biochemistry, v. 30, n. 43, p. 103631-103639, 1991.
105 Referências Bibliográficas
DEWICK, P.M.; Medicinal Natural Products. A biosynthetic Approach. John Wiley & Sons, second
edition, p. 147–151, 2002.
DI CARLO, G.; MASCOLO, N.; IZZO, A.A.; CAPASSO, F.; Flavonoids: old and new aspects of a
class natural therapeutics drugs. Life Sciences, v. 65, n. 4, p. 337–353, 1999.
DING, E.; HUTFLESS, S. M.; DING, X.; GIROTRA, S.; Chocolate and prevention of
Cardiovascular Disease: A systematic review. Nutrition & Metabolism, v. 3, n. 2, p. 1-12,
2006.
DOBRYDNEVA, Y.; WILLIANS, R.L.; BLACKMORE, P.F.; trans-Resveratrol inhibits calcium influx
in thrombin-stimulated human platelets. Britsh Journal of Pharmacology, v. 128, p.149-157,
1999.
DUINSLAEGER, L. & VANDERKELEN, A.; Burn induced by plants. Burns, v. 21, n. 7, p. 542–
543, 1995.
DUTTAROY, A.K.; PIERRE S.; CROSBIE, L.; Inhibitory effect of aqueous extracts of some herbs
on human platelet aggregation in vitro. Platelets, v. 16, n. 8, 469-473, 2005.
EL-HAOUARI, M.; BNOUHAM, M.; BENDAHOU, M.; AZIZ, M.; ZIYYAT, A.; LEGSSYER, A.;
MEKHFI, H.; Inhibition of Rat Platelet Aggregation by Urtica dioica Leaves Extracts.
Phytoteraphy Research, v. 20, p. 568-572, 2006.
ESMON, C.T.; FUKUDOME, K.; MATHER, T.; BODE, W.; REGAN, L.M.; STEARNS-KUROSAWA,
D.J. E KUROSAWA, S.; Inflammation, sepsis, and coagulation. Haematologica, v. 84, p.
254-59, 1999.
ESMON, C.T.; Regulation of blood coagulation. Biochemical and Biophysical Acta, v. 1477, p.
349-360, 2000.
FALKENBERG, M.B.; SANTOS, R.I.; SIMÕES, C.M.O.; Introdução à análise fitoquímica. In:
SHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R.,
Farmacognosia: da planta ao medicamento. Rio Grande do Sul: Editora da Universidade –
UFRGS, p. 229-246, 2004.
106 Referências Bibliográficas
FEJES, F.; BLÁZOVICS, A.; LUGAZI, A.; LEMBERKOVICS, E.; PETRI, G.; KÉRY, A.; In vitro
antioxidant activity of Anthriscus cerefolium L. (Hoffm.) extracts. Journal of
Ethnophamacology, v. 69, p. 259–265, 2000_a.
FEJES, F.; BLÁZOVICS, A.; LEMBERKOVICS, E.; PETRI, G.; KÉRY, A.; Free radical scavenging
and membrane protective effects of methanol extracted fractions of parsley. Acta
Alimentaria, v. 29, n. 1, p. 81-87, 2000_b.
FENTON, J.W.; FASCO, M.J.; STACKROW, A.B.; ARONSON, D.L.; YOUNG, A.M.; FINLAYSON,
J.S.; Human thrombins. Production, evaluation and properties of α-thrombin. Journal of
Biological Chemistry, v. 252, p. 3587-3598, 1977.
FRANCISCHETTI, B.; MONTEIRO, R.; MAURICIO, B.; GUIMARÃES, J. A.; Identification of
Glycyrrhizin as a Thrombin Inhibitor. Biochemical and Biophysical Research
Communications, v. 235, p. 259-263, 1997.
FRATTANI, F.S.; Caracterização farmacológica do perfil anti-hemostático de derivados
acilhidrazônicos. Tese para obtenção do grau de mestre, Departamento de Bioquímica
Médica, UFRJ, 2005.
FURIE, B. & FURIE, B.C.; Molecular and cellular biology of blood coagulation. The New England
Journal of Medicine, v. 326 n. 12, p. 800-806, 1992.
GEBHARDT, Y.; WITTE, S.; FORKMANN, G.; LUKACIN, R.; MATERN, U.; MARTENS, S.;
Molecular evolution of flavonoid dioxygenases in the family Apiaceae. Phytochemistry, v.
66, p. 1273–1284, 2005.
GERNOT, K.; Botanic Spice. 2006, [http://www.uni-graz.at/~katzer/engl/spice_bot.html]
acessado em 02 de novembro de 2006.
GOOLDMAN, P.; Herbal medicines today and the roots of modern pharmacology. Annal of
Internal Medicine, v. 135, p. 594–600, 2001.
GRESELE, P. & AGNELLI, G.; Novel approaches to the treatment of thrombosis. Trends in
Pharmacological Sciences, v. 23, n. 1, p. 25-32, 2002.
107 Referências Bibliográficas
GRYGLEWSKY, R.J.; KORBUT, R.; ROBAK, J.; SWIES, J.; On the mechanism of antithrombotic
action of flavonoids. Biochemical Pharmacology, v. 36, n. 3, p. 317–322, 1987.
GUERRERO, J.A.; LOZANO, M.L.; CASTILHO, J.; BENAVENTE-GARCIA, O.; VICENTE, V.;
RIVERA, J.; Flavonoids inhibit platelet function through binding to the thromboxane A
2
receptor. Journal of Thrombosis and Haemostasis, v. 3, n. 2, p. 369-376, 2004.
GUGLIELMONE, H.A.; AGNESE, A.M.; MONTOYA, S.C.N.; CABRERA, J.L.; Inhibitory effects of
sulphated flavonoids isolated from Flaveria bidentis on platelet aggregation. Thrombosis
Research, v. 115, p. 495-502, 2005.
GUGLIELMONE, H.A.; AGNESE, A.M.; MONTOYA, S.C.N.; CABRERA, J.L.; Anticoagulant effect
and action mechanism of sulphated flavonoids from Flaveria bidentis. Thrombosis Research,
v. 105, n. 2, p. 183-188, 2002.
GUIET, S.; ROBINS, R.J.; LEES, M.; BILLAULT, I.; Quantitative
2
H NMR analysis of deuterium
distribution in petroselinic acid isolated from parsley seed. Phytochemistry, v.64, p. 227-
233, 2003.
HAHLBROCK, K. & KREUZALER, F.; Flavonoid glycosides from illuminated cell suspension
cultures of Petroselinum crispum. Phytochemistry, v. 12, p. 1149–1152, 1972.
HAVSTEEN, B.H.; The biochemistry and medicinal significance of the flavonoids. Pharmacology
& Therapeutics, v. 96, p. 67–202, 2002.
HAWINGER, J.; BRASS, L.F.; SALZMAN, E.W.; Signal transduction and intracellular regulatory
processes in platelets. Haemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Pratice.
Third edition, edited by Robert W. Colman, Jack Hirsh, Victor J. Marder and Edwin W.
Salzman. J.B. Lippincott Company, Philadelphia, ch. 29, p. 603-627, 1994.
HEMMING, R. & OLLIS, W.D.; The flavone glycosides of Parsley. 2. The structure of apiin.
Chemistry and Industry, v. 4, p. 85–86, 1953.
HEMPEL, J.; PFORTE, H.; RAAB, B.; ENGST, W.; BOHM, H,; JACOBASH, G.; Flavonols and
flavones of parsley cell suspension culture change the antioxidative capacity of plasma in
rats. Nahrung-food, v. 43, n. 3, p. 201-204, 1999.
108 Referências Bibliográficas
HERTOG, M.G.L. & HOLLMAN, P.C.H.; Potencial health effects of the dietary flavonol quercetina.
European Journal of Clinical Nutrition, v.50, p. 63–71, 1996.
HORAN, J.T. & FRANCIS, C.W.; Fibrin degradation products, fibrin monomer and soluble fibrin
in dissemined intravascular coagulation. Seminars in Thrombosis and Haemostasis, v. 27,
n. 6, p. 657-666, 2001.
INNOCENTIN, G.; VEGETO, E.; ACQUA, D.; CIANA, P.; GIORGETI, M.; AGRADI, E.; SOZZI, A.;
FICO, G.; TOMÈ, F.; In vitro estrogenic activity of Achillea millefolium L.. Phytomedicine,
Available online 24 July 2006.
JACKSON, S.P. & SCHOENWAELDER, S.M.; Antiplatelet therapy: in search of the “magic bullet”.
Nature Reviews drug discovery, v. 2, p. 1–15, 2003.
JANSSEN, P.L.T.M.K.; MENSINK, R.P.; COX, F.J.J.; HARRYVAN, J.L.; HOVENIER, R.; HOLLMAN,
P.C.H.; KATAN, M.B.; Effects of the flavonoids quercetina and apigenina on haemostasis in
healthy volunteers: results from an in vitro and a dietary supplement study. American
Journal of Clinical Nutrition, v. 67, p. 255–262, 1998.
JUSTESEN, U.; Quantitative analysis of flavonols, flavones, and flavanones in fruits, vegetables
and beverages by high-performance liquid chromatography with photo-diode array and
mass spectrometric detection. Journal of Chromatography A, v. 799, p. 101-110, 1998.
JUSTESEN, U.; Negative atmospheric pressure chemical ionisation low-energy collision
activation mass spectrometry for the characterisation of flavonoids in extracts of fresh
herbs. Journal of Chromatography A, v. 902 n. 2, p. 369-379, 2000.
JUSTESEN, U. & KNUTHSEN, P.; Composition of flavonoids in fresh herbs and calculation of
flavonoid intake by use of herbs in traditional Danish dishes. Food Chemistry, v. 73, n. 2,
p. 245-250, 2001.
KAISER, C.R.; RMN 2D: detecção inversa e gradiente de campo na determinação estrutural de
compostos orgânicos. Química Nova, v. 23, n. 2, p. 231–236, 2000.
109 Referências Bibliográficas
KALAFATIS, M.; SWORDS, N.A.; RAND, M.D.; MANN, K.G.; Membrane-dependent reactions in
blood coagulation: role of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Biochemical and
Biophysical Acta, v. 1227, p. 113-129, 1994.
KOBZAR, G.; MARDLA, V.; SAMEL, N.; Effects of α-tocopherol, L-arginine, and quercetin on
aggregation of human platelets. Nutrition Research, v. 25, p. 569–575, 2005.
KREYDIYYEH, S.I. & USTA, J.; Diuretic effect and mechanism of action of Parsley. Journal of
Ethnopharmacology, v. 79, n. 3, p. 353-357, 2002.
KREYDIYYEH, S.I.; USTA, J.; KAOUK, I.; AL-SADI, R.; The mechanism underlying the laxative
properties of Parsley extract. Phytomedicine, v. 8, n. 5, p. 382-388, 2001.
KOGYO, H.S; Gelling agent for foodstuffs and alcohol@-contg. Compsns – contg. Apiin or
material contg. Apiin obtd. From Petroselinum sativum. Patent number: JP5316964-A;
JP2731882-B2, 1992.
KUNTIC, V.; FILIPOVIC-LJESKOVIC, I.; MALESEV, D.; JELIC, S.; Effects of flavonoids on plasma
coagulation tested in vitro by (screening) tests. Jugoslovenska Medicinska Biokemija, v. 18,
n. 4, p. 167-169, 1999.
LI, L.; SHEN, Y-M.; YANG, X-S.; ZUO, G-Y.; SHEN, Z-Q.; CHEN, Z-H.; HAO, X-J.; Antiplatelet
aggregation activity of diterpene alkaloids from Spiraea japonica. European Journal of
Pharmacology, v. 449, p. 23- 28, 2002.
LINDHAL, U.; BÄCKSTRÖM, G.; HÖÖK, M.; THUNBERG, L.; FRANSSON, L.; LINKER, A.;
Structure of the antithrombin-binding site in heparin. Proceedings of the National Academy
of Sciences USA, v. 76, n. 7, p. 3198-3202, 1979.
LOSCALZO, J. & SCHAFER, A.I.; Overview of Haemostasis and Fibrinolysis. New Therapeutic
Agents in Thrombosis and Thrombolysis, ch.1, p. 01-08, 2003.
LUTHRIA, D.L.; MUKHOPADHYAY, S.; KWANSA, A.L.; A systematic approach for extraction of
phenolic compounds using parsley (Petroselinum crispum) flakes as a model substrate.
Journal of the science of food and agriculture, v. 86, n. 9, p. 1350–1358, 2006.
110 Referências Bibliográficas
MACKAY, J. & MENSAH, G.; The Atlas of Heart Disease and Stroke. Wolrd Health Organization,
2002, [http://www.who.int/cardiovascular_diseases/resources/atlas/en/] acessado em 15
de outubro de 2006.
MANN, K.G.; VAN’T VEER, K.C. AND BUTENAS, S.; The role of tissue factor pathway in initiation
of coagulation. Blood Coagulation and Fibrinology, v. 9 (Suppl. 1), S3-S7, 1998.
MANN, K.G.; Biochemistry and physiology of blood coagulation. Thrombosis and Haemostasis,
v. 82, p. 165-174, 1999.
MANN, K.G.; The challenge of regulating anticoagulant drugs: Focus on warfarin. American
Heart Journal, v. 149, p. S36-S42, 2005.
MARSHALL, J.C.; Such stuffs as dreams are made on: Materiated-directed therapy in sepsis.
Nature Reviews drug discovery, v. 2, p. 391–405, 2003.
MARTINELLI, I.; Risk factors in venous thromboembolism. Thrombosis and Haemostasis, v. 86,
p. 395-403, 2001.
MATHIAS, E.M.; CONSTANCE, L.; ARAUJO, D.; Umbelíferas. Herbário Barbosa Rodrigues –
Itajaí – Santa Catarina – Brasil, p.62-66, 1972.
MEKHFI, H.; HAOUARI, M.E.; LEGSSYER, A.; BNOUHAM, M.; AZIZ, M.; ATAMI, F.; REMMAL, A.;
ZIYYAT, A.; Platelet anti-aggregant property of some Moroccan medicinal plants. Journal of
Ethnopharmacology, v. 94, p. 317-322, 2004.
MEYER, H.; BOLARINWA, A.; WOLFRAN, G.; LINSEINSEN, J.; Bioavailability of Apigenin from
Apiin-Rich Parsley in Humans. Annals of Nutrition and Metabolism, v. 50, p. 167-172, 2006.
MIKHAEIL, B.R.; BADRIA, F.A.; MAATOOQ, G.T.; AMER, M.M.A.; Antioxidant and
immunomodulatory constituents of henna leaves. Zeitschrift Fur Naturforschung C-A Journal
of Biosciences, v. 59, n. 7-8, p. 468-476, 2004.
MINIJA, J.; TROPPIL, J.E.; Studies on essential oil composition and microbiocidal activities of
two south Indian spices of Apiaceae. The international Journal Aromatherapy, v. 12, n. 4,
p. 213–215, 2002.
111 Referências Bibliográficas
MINISTÉRIO DA SAÚDE; III Fórum Global sobre redução de doenças Cardiovasculares. 2002
[http://portal.saude.gov.br/portal/aplicacoes/noticias/noticias_detalhe.cfm?co_seq_noticia=
7452] acessado em 24 de Setembro de 2006.
MONTEIRO, R.Q.; Interação entre botrojaracina x protrombina: caracterização do sítio de
ligação e efeito na ativação do zimogênio. Tese para obtenção do grau de doutor,
Departamento de Bioquímica Médica, UFRJ, 2001.
MOZZICAFREDDO, M.; CUCCIOLONI, M.; ELEUTERI, A. M.; FIORETTI, E.; ANGELETTI, M.;
Flavonoids inhibit the amidolytic activity of human thrombin. Biochimie, v. 88, p. 1297–
1306, 2006.
MULLER, A.C.; MACEDO, M.F.; Patents of phytomedicines: how to ensure benefit sharing and
sustainable use of genetic resources. Revista Fitos, v. 1, n. 2, p.19-24, 2005.
MUZITANO, M.F.; Flavonóides de Kalanchoe pinnata (Crassulaceae): Avanços na pesquisa da
utilização desta espécie medicinal no tratamento da leishmaniose cutânea. Tese para
obtenção do grau de doutor, Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais - NPPN, UFRJ, 2006.
NGAI, P.N. & CHANG, J.Y.; A novel one-step purification of human α-thrombin after direct
activation of crude prothrombin enriched form plasma. Biochemical Journal, v. 280, p.
805-808, 1991.
NEWMAN, P.J.; CRAGG, G.M.; SNADER, K.M.; Natural products as sources of new drugs over
the period 1981 – 2002, Journal of Natural Products, v. 66, p. 1022-1037, 2003.
OJALA, T.; REMES, S.; HAANSUU P.; VUORELA, H.; HILTUNEN, R.; HAAHTELA, K.; VUORELA
P.; Antimicrobial activity of some coumarin containing herbal plants growing in Finland.
Journal of Ethnopharmacology, v. 73, n. 1-2, p. 299-305, 2000.
PAIVA, S.R.; MAZZEI, J.L.; KAPLAN, M.A.C.; Perfil cromatográfico de duas espécies de
plumbaginaceae: plumbago scandens l. e plumbago auriculata lam. Quimica Nova, v.
25, n. 5, p. 717-721, 2002.
112 Referências Bibliográficas
PERRY, M.B.; HULYALKAR, R.K.; JONES, J.K.N.; The chemistry of apiose part II. The
configuration of D-apiose in apiin. Canadian Journal of Chemistry, v. 43, p. 2085–2091,
1965.
PIO CORRÊA, M.; Dicionário de plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Rio de Janeiro,
Imprensa Nacional, 1988.
PIZZOLATTI, M.G.; CUNHA J.R., A.; SZPOGANICZ, B.; DE SOUZA, E.; BRAZ-FILHO, R.;
SCHRIPSEMA, J.; Flavonóides glicosilados das folhas e flores de Bauhinia forficata
(Leguminosae). Química Nova, v. 26, p. 466-469, 2003.
RIJKE, E.; OUT, P.; NIESSEN, W.M.A.; ARIESE, F.; GOOIJER, C.; BRINKMAN, U.A.Th.;
Analytical separation and detection methods for flavonoids. Journal of Chromatography A,
v. 1112, n. 1-2, p. 31–61, 2006.
ROSENBERG, R.D.; Vascular-bed-specific haemostasis and hypercoagulable states: Clinical
utility of activation peptide assays in predicting thrombotic events in different clinical
populations. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 41-50, 2001.
ROULIER, A.; Le Persil. 2005, [http://www.naturemania.com/produits/persil.html] acessado
em 02 de novembro de 2006.
RUGGERI, Z.M.; Mechanisms initiating platelet thrombus formation. Thrombosis and
Haemostasis, v. 78, n. 1, p. 611-616, 1997.
RUGGERI, Z.M.; Plateles in atherothrombosis. Nature Medicine, v. 8, p. 1227-1234, 2002.
SHARIS, P.J & LOSCALZO, J.; Thienopyridines: Ticoplidine and Clopidogrel. In: LOSCALZO, J.
& SCHAFER, A.I.; New therapeutics agents in thrombosis and thrombolysis. Chapter 03, p.
431-449, 2003.
SHEU, J.R.; KAN, Y.H.; HUNG, W.C.; SU, C.H.; LIN, C.H.; LEE, YM.; YEN, M.H.; The Antiplatelet
Activity of Rutaecarpine, an Alkaloid Isolated from Evodia rutaecarpa, Is Mediated through
Inhibition of Phospholipase C. Thrombosis Research, v. 92, n. 2, p. 53-64, 1998.
113 Referências Bibliográficas
SIMMONDS, R.E.; HERMIDA, J.; REZENDE, S.M.; LANE, D.A.; Haemostatic genetic risk factors
in arterial thrombosis. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 374-383, 2001.
SOSLAU, G.; CLASS, R.; MORGAN, D.A.; FOSTER, C.; LORD, S.T.; MARCHESE, P.; RUGGERI,
Z.M.; Unique pathway of thrombin-induced platelet aggregation mediated by glycoprotein-
Ib. Journal of Biological Chemistry, v. 276, n. 24, p. 21173-21183, 2001.
SOUZA, V.C.; LORENZI, H.; Botânica sistemática: guia ilustrado para identificação das famílias
de Angiospermas da flora brasileira, baseado em APG II. Nova Odessa, SP: Instituto
Plantarum, 2005.
SOUSA, A.; FERREIRA, I.C.F.R.; CALHELHA, R.; ANDRADE, P.B.;VALENTÃO, P.; SEABRA, R.;
ESTEVINHO, L.; BENTO, A.; PEREIRA, J.A.; Phenolics and antimicrobial activity of traditional
stoned table olives ‘alcaparra’. Bioorganic & Medicinal Chemistry, Available online 12
September 2006.
SUOMELA, J-P.; AHOTUPA, M.; YANG, B.; VASANKARI, T.; KALLIO, H.; Absorption of flavonoids
derived from sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) and their effect on emerging risk
factors for cardiovascular disease in humans. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.
54, p. 7364-7369, 2006.
TRUDEAU, C.; Persil. Institut des nutraceutiques et des aliments fonctionnels, Université
Laval.[http://www.passeportsante.net/fr/Nutrition/EncyclopedieAliments/Fiche.aspx?doc=p
ersil_nu] acessado em 02 de novembro de 2006.
TIMOTHY, D.W.; Claridge. High-resolution NMR Techniques in Organic Chemistry. Pergamon,
1999.
WANG, J.; YANG, X.; DI, Y.; WANG, Y.; XEN, Y.; HAO, X.; Isoflavone Diglycosides from
Glycosmis pentaphylla. Journal of Natural Products, v. 69, p. 778-782, 2006.
WEITZ, J. I & HIRSH, J.; New antithrombotics agents. The Lancet, v. 353, p. 1431-1436, 1999.
WEITZ, J. I & HIRSH, J.; Overview of new anticoagulant drugs. In: LOSCALZO, J. & SCHAFER,
A.I.; New therapeutics agents in thrombosis and thrombolysis. Chapter 02, p. 61-74, 2003.
114 Referências Bibliográficas
WEITZ, J.I. & HIRSH, J.; New anticoagulant drugs. Chest, v. 119, p. S95-S107, 2001.
YOSHIKAWA, M.; UEMURA, T.; SHIMODA, H.; KISHI, A.; KAWAHARA, Y.; MATSUDA, H.;
Medicinal foodstuffs. XVIII. Phytoestrogens from the aerial parts of Petroselinum crispum
MILL. (Parsley) and structures of 6”- Acetylapiin and a new monoterpeno glycoside,
petroside. Chemical Pharmaceutical Bulletin, v. 48, n. 7, p. 1039–1044, 2000.
ZAVALOVA, L.L.; BASANOVA, A.V.; BASKOVA, I.P.; Fibrinogen-fibrin system regulators from
bloodsuckers. Biochemistry (Mosc.), v. 67, n. 1, p. 135-142, 2002.
ZHENG, Y-N.; ZHANG, J; HAN, L-K.; SEKIYA, K.; KIMURA, Y.; OKUDA, H.; Effects of
compounds in leaves of Salix matsudana on Arachdonic acid metabolism. Yakugaku Zasshi,
v. 125, n. 12, p. 1005-1008, 2005.
ZIYYAT, A.; LEGSSYER, A.; MEKHFI, H.; DASSOULI, A.; SERHROUCHNI, M.; BENJELLOUN, W.;
Phytotherapy of hypertension and diabetes in oriental Morocco. Journal of
Ethnopharmacology, v. 58, n. 1, p. 45-54, 1997.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo