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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
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2006
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“Flavonóides de Kalanchoe pinnata (Crassulaceae): Avanços na
Pesquisa da Utilização desta Espécie Medicinal no Tratamento da
Leishmaniose Cutânea”
MICHELLE FRAZÃO MUZITANO
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Química de Produtos Naturais, Núcleo de
Pesquisas de Produtos Naturais da Universidade Federal
do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientador: Profa. Dra. Sônia Soares Costa
Co-orientador: Profa. Bartira Rossi-Bergmann
Rio de Janeiro
Setembro, 2006
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais
Bloco H, CCS, Cidade Universitária
21 941-590 Rio de Janeiro
Fax 55-21-2562 6512
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“Flavonóides de Kalanchoe pinnata (Crassulaceae): Avanços na
Pesquisa da Utilização desta Espécie Medicinal no Tratamento da
Leishmaniose Cutânea”
MICHELLE FRAZÃO MUZITANO
Tese submetida ao Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos à obtenção do grau de Doutor em Ciências.
Rio de Janeiro, 29 de setembro de 2006.
Aprovada pelos Doutores:
___________________________
Profa. Alaíde Braga de Oliveira
___________________________
Dr. Marco Aurélio Martins
___________________________
Prof. Celso Luís Salgueiro Lage
___________________________
Prof. Antonio Jorge Ribeiro da Silva
___________________________
Profa. Luzineide Wanderley Tinoco
___________________________
Dr. Eduardo Caio Torres dos Santos
___________________________
Prof. Alessandro Bolis Costa Simas
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais
Bloco H, CCS, Cidade Universitária
21 941-590 Rio de Janeiro
Fax 55-21-2562 6512
Muzitano, Michelle Frazão.
Flavonóides de Kalanchoe Pinnata (Crassulaceae): Avanços na Pesquisa da
Utilização desta Espécie Medicinal no Tratamento da Leishmaniose
Cutânea/Michelle Frazão Muzitano. Rio de Janeiro: UFRJ/NPPN, 2006.
xxvii,186f.:il.; 30 cm.
Orientador: Sônia Soares Costa
Co-orientador: Bartira Rossi-Bergmann
Tese (doutorado) - UFRJ/ NPPN/ Programa de Pós-graduação em
Química de Produtos Naturais, 2006.
Referências Bibliográficas: f.177-186.
1. Kalanchoe pinnata. 2. Crassulaceae. 3. Flavonóides glicosídicos. 4.
Quercitrina. 5. Leishmaniose. 6. Antileishmania. 7. Leishmania
amazonensis. 8. CLAE-EM. 9. Micropropagação. 10. RMN. I. Costa, Sônia
Soares. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Núcleo de Pesquisas de
Produtos Naturais, Programa de Pós-graduação em Química de Produtos
Naturais. III. Título.
“Sempre me pareceu estranho que todos
aqueles que estudam seriamente esta ciência
acabam tomados de uma espécie de paixão pela
mesma. Em verdade, o que proporciona o máximo
prazer não é o conhecimento e, sim, a
aprendizagem, não é a posse, mas a aquisição;
não é a presença, mas o ato de atingir a meta.”
Carl Friedrich Gauss
À Deus pela vida, pela minha família, pelos
meus amigos e pela natureza.
Aos meus queridos pais e irmã, Neucir Peixoto
Muzitano, Kátia Frazão Muzitano, Grazielle Frazão
Muzitano, e às avós, Ceny Silva Frazão e Neuza
Peixoto Muzitano pelo amor, pela força, incentivo e
carinho; pelo exemplo de conduta, honestidade e
de família.
Ao meu marido Cláudio Vinicius Pereira de
Araújo pelo amor, carinho e incentivo em cada
etapa da minha caminhada; por ser hoje e sempre,
para mim, uma pessoa muito especial.
À professora Sônia Soares Costa, pela
orientação, dedicação, formação de profissional e
Ser Humano, carinho, incentivo, amizade e
exemplo de amor à ciência.
À professora Bartira Rossi-Bergmann, pela
orientação, dedicação, formação, carinho, incentivo
e amizade.
AGRADECIMENTOS
^ Ao professor Franco Francesco Vincieri do Departamento de Ciências Farmacêuticas da
Universidade de Florença, Itália, pela orientação durante meus seis meses de estágio no
exterior (PDEE-CAPES). Agradeço o apoio da Profa Anna Rita Bilia e da Dra. Maria Camila
Bergonzi durante a minha estada na UNIFI.
^ Ao professor Celso Luíz Salgueiro Lage (Instituto de Biofísica, UFRJ) pelo
desenvolvimento de espécimes monoclonais de Kalanchoe pinnata.
^ Ao professor Carlos Roland Kaiser (Instituto de Química, UFRJ) e à professora Luzineide
Wanderley Tinoco (NPPN,UFRJ) pela realização dos espectros de Ressonância Magnética
Nuclear.
^ Ao Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear (Bioquímica Médica, UFRJ) pela
disponibilidade de uso dos espectrômetros.
^ À professora Catherine Guette (SONAS UFR Sciences Pharmaceutiques et Ingénierie de la
Santé – França) pela obtenção dos espectros de massas.
^ A todos os professores do NPPN que colaboraram com a minha formação.
^ À professora Sônia Ubatuba pela constante disponibilidade ao longo deste trabalho.
^ À grande amiga Dra. Giany Oliveira de Melo pela amizade, carinho, companheirismo,
incentivo, disponibilidade e presença constante nos momentos mais importantes da minha
vida; por ter contribuído com este trabalho no dia-a-dia do laboratório.
^ Às amigas e doutorandas Camila Alves Bandeira Falcão, Elaine dos Anjos da Cruz e
Suzana Passos Chaves, pela amizade, carinho e apoio durante os experimentos. Em especial
à Elaine e Camila pela grande ajuda durante meu período de estágio no exterior.
^ Aos doutores Ana Paula de Almeida, Daniela Barros de Oliveira e Zenildo Buarque de
Morais Filho, que muito contribuíram para meu aprimoramento, pela amizade e pelo
companheirismo.
^ À mestranda Maria Fernanda Paresqui Corrêa pela amizade, carinho e incentivo,
especialmente na Itália.
^ Ao mestrando Douglas Siqueira de Almeida Chaves pela alegria constante, bom humor e
amizade.
^ À todos que fazem ou fizeram parte do Laboratório de Química de Produtos Naturais
Bioativos (LPN-Bio), em especial às alunas Fernanda do Nascimento José, Camila A.
Linhares, Luciana Santos de Oliveira, Marina J. Santiago, Nathalia S. Segreto, Natalia
Bousquet, Isabel Cristina V. Silva, Marcela Coutinho, Luiza Magalhães e Angélica Ribeiro,
que muito contribuíram para o clima familiar de nossa equipe. Às alunas de Iniciação
científica Luciana Santos de Oliveira, Camila Linhares e Marcela Coutinho pela oportunidade
de ensinar e aprender.
^ À todos os alunos de Iniciação Científica que fazem ou fizeram parte do Laboratório de
Inumofarmacologia do IBCCF, pela amizade, pelo apoio e pelos momentos de descontração.
^ À toda minha família, avós, tios, padrinho, primos, sogros e cunhada pelo amor,
paciência e palavras de incentivo.
^ Aos grandes amigos do trabalho na Comunidade do Canal do Anil pelo carinho e alegria
de viver. Em especial às amigas, Melissa Hatherly, Fernanda Padrón e Larissa Medeiros.
^ Aos meus amigos de viagem, rafting e caminhadas, em especial ao Marcos e Juliana
Moreno.
^ Aos funcionários do NPPN pelas gentilezas.
^ À Coordenação de Ensino de Pós-Graduação do NPPN pelo apoio prestado.
^ À Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de
estudos concedida durante a realização deste trabalho aqui no Brasil e na Itália.
^ À FAPERJ e ao CNPq pela bolsa de Iniciação Científica.
^ Ao Projeto SUS-FAPERJ que financiou o último ano de desenvolvimento deste trabalho.
^ À todos que de alguma forma contribuíram direta ou indiretamente para a realização
deste trabalho, o meu sincero agradecimento.
ÍNDICE GERAL
ÍNDICE DE FLUXOGRAMAS xiv
ÍNDICE DE ESPECTROS xv
ÍNDICE DE FIGURAS xix
ÍNDICE DE TABELAS xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS xxv
RESUMO xxvi
ABSTRACT xxvii
INTRODUÇÃO
001
LEISHMANIOSES 002
CICLO DE VIDA DA Leishmania 005
FORMAS CLÍNICAS DA LEISHMANIOSE 007
TRATAMENTO CONVENCIONAL 009
PRODUTOS NATURAIS E A LEISHMANIOSE 011
PROPOSTA PARA UM FITOTERÁPICO DE USO ORAL
A ESPÉCIE Kalanchoe pinnata (Crassulaceae) 014
FLAVONÓIDES E O GÊNERO Kalanchoe 020
ESTUDO PRÉVIO DA ATIVIDADE DE Kalanchoe pinnata NA LEISHMANIOSE 024
RELEVÂNCIA DO PRESENTE ESTUDO 027
EQUIPE ENVOLVIDA NO PROJETO 027
OBJETIVOS 029
MATERIAIS
E MÉTODOS 031
PARTE QUÍMICA 032
TÉCNICAS
GERAIS 032
EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO 033
METODOLOGIA DAS ANÁLISES DE CLAE 039
MÉTODO DE EXTRAÇÃO DO PLASMA DOS CAMUNDONGOS 040
PARTE
BIOLÓGICA 041
GERAL 041
ENSAIOS IN VITRO 042
AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTI-PROMASTIGOTA 042
AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIAMASTIGOTA 043
ATIVIDADE CITOTÓXICA EM CÉLULAS DE MAMÍFERO 043
PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO) 043
ENSAIOS IN VIVO 044
INFECÇÃO 044
TRATAMENTO IN VIVO 044
ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS 044
RESULTADOS
E DISCUSSÃO 045
FRACIONAMENTO DO EXTRATO DE K. pinnata GUIADO POR ENSAIOS BIOLÓGICOS E
POR RMN DE
1
H 047
ENSAIOS BIOLÓGICOS 047
PERFIL QUÍMICO 053
ANÁLISE POR RMN DE
1
H DO EXTRATO, SOBRENADANTE E PRECIPITADO 053
PERFIL QUÍMICO DAS FRAÇÕES ORGÂNICAS F1, F2 E F3 053
PERFIL QUÍMICO DE F3-C1 E F3-C2 054
ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DOS FLAVONÓIDES ISOLADOS 063
E
LUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE KP1 065
E
LUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE KP2 083
E
LUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE KP3 090
E
LUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE KP4 101
E
LUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE KP5 106
ATIVIDADE ANTILEISHMANIA E CITOTOXIDEZ DOS FLAVONÓIDES ISOLADOS DE K.
pinnata 121
RESULTADOS IN VITRO 123
RESULTADOS IN VIVO 127
ESTUDO DO MODO DE AÇÃO DE KP2 130
ÓXIDO NÍTRICO (NO): SÍNTESE E FUNÇÕES 131
INDUÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO POR KP2 132
FLAVONÓIDES 134
FLAVONÓIDES E ATIVIDADE ANTILEISHMANIA 135
VARIAÇÕES SAZONAIS E DE CONDIÇÕES DE CULTIVO SOBRE O PERFIL QUÍMICO DO
EXTRATO DE Kalanchoe pinnata 139
RESUMO SOBRE A TÉCNICA DE IONIZAÇÃO POR ELÉTRON-SPRAY 140
ANÁLISE QUALITATIVA DOS FLAVONÓIDES PRESENTES NO EXTRATO DE K. pinnata 140
ANÁLISE QUANTITATIVA DOS FLAVONÓIDES PRESENTES NO EXTRATO DE K. pinnata 145
ANÁLISE QUANTITATIVA E QUALITATIVA DA FRAÇÃO FLAVONOÍDICA ATIVA – F3 148
AVALIAÇÃO DOS FATORES QUE PODERIAM INTERFERIR NO PERFIL QUÍMICO DO
EXTRATO DE Kalanchoe pinnata 149
ESTUDO DAS MUDAS OBTIDAS A PARTIR DE ESPÉCIMES MONOCLONAIS DE KP
ATIVO PRODUZIDOS in vitro 154
ABSORÇÃO E METABOLISMO DE FLAVONÓIDES 159
CONCLUSÕES 174
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 177
ÍNDICE DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1: Fracionamento do extrato aquoso de KP – obtenção de F1, F2 e F3 035
Fluxograma 2: Resumo das massas obtidas de F1, F2 e F3 após as extrações 036
Fluxograma 3: Purificação de F3 – obtenção dos flavonóides KP1 e KP2 037
Fluxograma 4: Continuação da Purificação de F3 – obtenção dos flavonóides KP1, KP2,
KP3, KP4 e KP5 037
Fluxograma 5: Método de extração das amostras de plasma de camundongos tratados
com extrato e flavonóides de KP 040
ÍNDICE DE ESPECTROS
Espectro 1: Espectro de RMN de
1
H do extrato aquoso de K. pinnata (400 MHz).
Solvente utilizado: D
2
O. 055
Espectro 2: Espectro de RMN de
1
H do precipitado (KMC) do extrato aquoso de K.
pinnata (200 MHz). Solvente utilizado: D
2
O. 056
Espectro 3: Espectro de RMN de
1
H do sobrenadante do extrato aquoso de K. pinnata
(400 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. 057
Espectro 4: Espectro de RMN de
1
H da Fração Orgânica 1 (F1) do sobrenadante de K.
pinnata (300 MHz). Solvente utilizado: CDCl
3
. 058
Espectro 5: Espectro de RMN de
1
H da Fração Orgânica 2 (F2) do sobrenadante de K.
pinnata (300 MHz). Solvente utilizado: CDCl
3
. 059
Espectro 6: Espectro de RMN de
1
H da Fração Orgânica 3 (F3) do sobrenadante de K.
pinnata (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. 060
Espectro 7: Espectro de RMN de
1
H da Fração F3-C1 do sobrenadante de K. pinnata
(400 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. 061
Espectro 8: Espectro de RMN de
1
H da Fração F3-C2 do sobrenadante de K. pinnata
(300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. 062
Espectro 9: Espectro de RMN de
1
H de KP1 (300 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD. 073
Espectro 10: Espectro de RMN de
1
H de KP1 (300 MHz). Ampliação da região entre
3,00 e 7,50 ppm. Solvente utilizado: CD
3
OD. 074
Espectro 11: Espectro de RMN de
1
H de KP1 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. 075
Espectro 12: Espectro de RMN de
13
C de KP1 (75 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD. 076
Espectro 13: Espectro de RMN de
13
C – DEPT 135 de KP1 (75 MHz). Solvente utilizado:
CD
3
OD. 077
Espectro 14: Espectro de RMN 2D – COSY 90 de KP1 (300 MHz). Solvente utilizado:
CD
3
OD 078
Espectro 15: Espectro de RMN 2D – HMQC de KP1 (300 MHz). Solvente utilizado:
CD
3
OD 079
Espectro 16: Espectro de RMN 2D – HMBC de KP1 (300 MHz). Solvente utilizado:
CD
3
OD. 080
Espectro 17: Espectro de RMN 2D – HMBC de KP1 (300 MHz). Ampliação da região
entre 5,50-7,50 ppm (
1
H) e 110,0-180,0 ppm (
13
C). Solvente utilizado:
CD
3
OD. 081
Espectro 18: RMN 1D – TOCSY seletivo de KP1 (300 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD. 082
Espectro 19: Espectro de RMN de
1
H de KP2 (300 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD. 088
Espectro 20: Espectro de RMN de
13
C de KP2 (75 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD. 089
Espectro 21: Espectro de RMN de
1
H de KP3 (400 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. 095
Espectro 22: Espectro de RMN de
1
H de KP3 (400 MHz). Ampliação da região entre 5,20
e 7,80 ppm. Solvente utilizado: DMSO-d
6
. 095
Espectro 23: Espectro de RMN de
1
H de KP3 (300 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD. 096
Espectro 24: Espectro de RMN de
13
C de KP3 (100 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. 097
Espectro 25: Espectro de RMN 2D – COSY 90 de KP3 (400 MHz). Solvente utilizado:
DMSO-d
6
. 098
Espectro 26: Espectro de RMN 2D – HMQC de KP3 (400 MHz). Solvente utilizado:
DMSO-d
6
. 099
Espectro 27: Espectro de RMN 2D – HMBC de KP3 (400 MHz). Solvente utilizado:
DMSO-d
6
. 100
Espectro 28: Espectro de RMN de
1
H de KP4 (300 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD. 104
Espectro 29: Espectro de RMN 2D – COSY 90 de KP4 (300 MHz). Solvente utilizado:
CD
3
OD. 105
Espectro 30: Espectro de RMN de
1
H de KP5 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. 111
Espectro 31: Espectro de RMN de
1
H de KP5 (300 MHz). Ampliação da região entre 8,00
e 4,80 ppm. Solvente utilizado: DMSO-d
6
. 112
Espectro 32: Espectro de RMN de
1
H de KP5 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
anidro. 113
Espectro 33: Espectro de RMN de
13
C de KP5 (75 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. 114
Espectro 34: Espectro de RMN 2D – COSY 90 de KP5 (300 MHz). Solvente utilizado:
DMSO-d
6
. 115
Espectro 35: Espectro de RMN 2D – HMQC de KP5 (300 MHz). Solvente utilizado:
DMSO-d
6
. 116
Espectro 36: Espectro de RMN 2D – HMBC de KP5 (300 MHz). Solvente utilizado:
DMSO-d
6
. 117
Espectro 37: Espectro de RMN de
1
H - NOE 1D seletivo de KP5 (300 MHz). Solvente
utilizado: DMSO-d
6
anidro. 118
Espectro 38: Espectros de Ultravioleta dos picos de tempo de retenção (T
r
) igual a
22,763 min, correspondente ao flavonóide KP1 (Rosa); 24,389 min,
correspondente ao flavonóide KP2 (Verde); 28,580 min, correspondente ao
flavonóide KP3 (Vermelho) e 31,075 min, correspondente ao flavonóide
KP4 (Azul). 142
Espectro 39: Espectro de Massas do pico de tempo de retenção (T
r
) igual a 22,763 min,
correspondente ao flavonóide KP1 (C
26
H
28
O
15
)
.
142
Espectro 40: Espectro de Massas do pico de tempo de retenção (Tr) igual a 24,389
min, correspondente ao flavonóide KP2 (C
21
H
20
O
10
). 143
Espectro 41: Espectro de Massas do pico de tempo de retenção (T
r
) igual a 28,580 min,
correspondente ao flavonóide KP3 (C
26
H
28
O
14
). 143
Espectro 42: Espectro de Massas do pico de tempo de retenção (T
r
) igual a 31,075 min,
correspondente ao flavonóide KP4 (C
21
H
20
O
10
). 144
Espectro 43: Espectro de Massas do pico de tempo de retenção (Tr) igual a 27,324
min, correspondente ao flavonóide KP5 (C
23
H
24
O
12
). 144
Espectro 44: Espectro de RMN de
1
H do extrato aquoso de K. pinnata monoclonal in
vitro (400 MHz). Solvente utilizado: D
2
O. 157
Espectro 45: Espectro de ultravioleta dos picos correspondentes a quercetina (27,664
min) e ao glicuronídeo de quercetina (27,877 min). 164
Espectro 46: Espectro de massas dos picos correspondentes a quercetina (27,708
min). 164
Espectro 47: Espectro de massas dos picos correspondentes ao glicuronídeo de
quercetina (27,924 min). 164
Espectro 48: Espectro de ultravioleta do pico correspondente ao kampferol (padrão
interno). 167
Espectro 49: Espectro de massas do pico correspondente ao kampferol (padrão
interno). 167
Espectro 50: Espectro de massas do pico correspondente ao diglicosídeo de quercetina
– flavonóide KP1 (18,047 min). 168
Espectro 51: Espectro de ultravioleta do pico correspondente ao diglicuronídeo de
quercetina (25,920 min). 169
Espectro 52: Espectro de massas do pico correspondente ao diglicuronídeo de
quercetina (25,930 min). 170
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Notificações para Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e leishmaniose
Visceral (LV) na rede do SUS no período de 1990 a 2005. 002
Figura 2: Distribuição geográfica das Leishmanioses no Brasil no período de 1994 a
1999. 003
Figura 3: Distribuição geográfica das notificações para Leishmaniose Tegumentar
Americana (LTA) no Brasil no período de 1995 a 2005. 004
Figura 4: Contribuição de cada estado para o total de notificações de Leishmaniose
Tegumentar Americana (LTA) na região sudeste nos anos de 1980-2005. 005
Figura 5: Distribuição geográfica das Leishmanioses no Brasil no período de 1994 a
1999, considerando o território de cada município. 005
Figura 6: Ciclo Biológico da Leishmania 006
Figura 7: Forma promastigota (A) e amastigota (B) da Leishmania 006
Figura 8: Leishmaniose Tegumentar (A) e Leishmaniose Mucocutânea (B). 008
Figura 9: Fórmula estrutural dos medicamentos padrões para leishmaniose, Pentostam
(estibogliconato de sódio) e Glucantime (antimoniato de meglumina). 010
Figura 10: Exemplos de Substâncias de Origem Natural com Atividade Antileishmania
Figura 11: Kalanchoe pinnata (foto cedida por Maria Mínguez, Ilha Grande – RJ). 016
Figura 12: Eficácia do tratamento oral com Kp em comparação com Glucantime
parenteral 025
Figura 13: Inibição do crescimento de amastigotas de L. amazonensis pelo extrato
aquoso 20 % - 50ºC (EA) e sumo de Kalanchoe pinnata. 048
Figura 14: Inibição do crescimento de amastigotas de L. amazonensis pelo extrato
aquoso 20 % - 50ºC (EA) e frações de Kalanchoe pinnata. 049
Figura 15: Inibição do crescimento de amastigotas de L. amazonensis e Citotoxicidade
das frações do extrato de Kalanchoe pinnata. 050
Figura 16: Inibição do crescimento de amastigotas de L. a mazonensis e Citotoxicidade
das frações do extrato de Kalanchoe pinnata. 052
Figura 17: Estrutura da aglicona quercetina 066
Figura 18: Estrutura de KP1 (3-O-α-arabinopiranosil (1→2) α-ramnopiranosídeo de
quercetina) 070
Figura 19: Estrutura de KP2 (3-O-α-ramnopiranosídeo de quercetina) - quercitrina. 085
Figura 20: Estrutura da aglicona kaempferol 091
Figura 21: Estrutura de KP3 (3-O-α-arabinopiranosil (1→2) α-ramnopiranosídeo de
kaempferol) - kapinnatosídeo. 093
Figura 22: Estrutura de KP4 (kaempferol-3-O-α-ramnopiranosídeo) – afzelina 102
Figura 23: Algumas correlações observadas para KP5 utilizando a técnica de HMBC 108
Figura 24: Estrutura de KP5 (8,3’-dimetoxi-5,4’-diidroxiflavona 7-O-β-glicopiranosídeo) 109
Figura 25: Inibição do crescimento de amastigotas de L. amazonensis pelos flavonóides
isolados de Kalanchoe pinnata. 123
Figura 26: Estrutura de KP2 (quercetina 3-O-α-L-ramnopiranosídeo)-quercitrina 125
Figura 27: Atividade citotóxica dos flavonóides isolados de Kalanchoe pinnata. 126
Figura 28: Inibição do crescimento de amastigotas de L. amazonensis pelos favonóides
KP2 (quercitrina) e quercetina. 127
Figura 29: Fotografia da lesão na orelha esquerda dos camundongos do grupo controle
20 dias após a infecção. 128
Figura 30: Eficácia do tratamento oral utilizando os flavonóides de Kalanchoe pinnata,
KP1 e KP2, em comparação com o extrato aquoso (EA) e com a aglicona
comercial quercetina. 129
Figura 31: Inibição do crescimento do parasita no local da lesão pelos flavonóides de
Kalanchoe pinnata, KP1 e KP2, pela aglicona comercial quercetina e pelo
extrato de KP. 130
Figura 32: Efeito de KP2 (quercitrina) no crescimento de promastigotas de L.
amazonensis. 131
Figura 33: Efeito do extrato aquoso de Kalanchoe pinnata (EA), de sua fração F3 e do
flavonóide KP2 na produção de óxido nítrico (NO) em macrófagos não
infectados.
133
Figura 34: Efeito do inibidor da NOS, N-metil-monoarginina (NMMA), na atividade
antileishmania de KP2 (quercitrina) e do extrato aquoso de KP (EA) in
vitro. 134
Figura 35: Cromatogramas obtidos para o extrato ativo de KP (preparado com folhas
coletadas no verão) a 254 nm e utilizando o detector de massas. 141
Figura 36: Cromatogramas obtidos para os flavonóides KP1 e KP2 a 254 nm. 145
Figura 37: Cromatogramas obtidos para os padrões de rutina (2-10
µg) a 254 nm. 146
Figura 38: Cromatogramas obtidos para os padrões de rutina (0,2-1,0 µg) a 254 nm. 147
Figura 39: Curva de calibração da rutina. 147
Figura 40: Ocorrência dos flavonóides KP 1-5 no extrato bruto de Kalanchoe pinnata
expressa em porcentagem. 148
Figura 41: Percentual dos flavonóides KP 1-5 na fração F3 liofilizada. 149
Figura 42: Cromatogramas obtidos para a fração ativa de KP (F3), a 254 nm e
utilizando o detector de massas (TIC). 149
Figura 43: Cromatogramas obtidos para os extratos aquosos de KP coletado no outono
(cultivo ao sol e à sombra), a 254 nm. 151
Figura 44: Quantificação dos flavonóides de KP no extrato aquoso preparado com folhas
frescas, coletadas no outono, a partir de indivíduos expostos ou não à luz
solar. 152
Figura 45: Cromatogramas obtidos para os extratos aquosos de KP coletado no outono,
inverno, primavera e verão (cultivo à sombra), a 254 nm. 153
Figura 46: Quantificação dos flavonóides de KP nos extratos aquosos preparados com
folhas frescas, coletadas em diferentes estações do ano, a partir de
espécimes cultivados à sombra. 153
Figura 47: Cromatograma obtido para o extrato aquoso e para o sumo de KP, a 254
nm. 154
Figura 48: Quantificação dos flavonóides de KP no extrato aquoso e sumo preparados
com folhas frescas, coletadas no inverno, a partir de indivíduos cultivados à
sombra. 154
Figura 49: Foto de KP monoclonal in vitro 155
Figura 50: Perfil cromatográfico dos extratos de KP monoclonal in vitro (1); de KP
monoclonal após cinco meses em vaso contendo terra (2) e de KP que o
originou (3). 156
Figura 51: Percentual dos flavonóides KP 1-5 presentes no extrato liofilizado das folhas
de KP monoclonal (5 meses de idade). 157
Figura 52: Ampliação do cromatograma do plasma dos animais tratados com quercetina
(1: 254 nm, 2: Massas TIC, 3: Massas EIC=301). 163
Figura 53: Cromatograma obtido com o padrão de quercetina (254 nm). 165
Figura 54: Ampliação do cromatograma do plasma dos animais tratados com o
quercitrina 1 vez. Identificação do padrão interno adicionado na amostra de
plasma (1: 254 nm, 2: Massas TIC). 166
Figura 55: Ampliação do cromatograma do plasma dos animais tratados com o
diglicosídeo de querceina 2 vezes – Grupo 6 (1: 254 nm, 2: Massas TIC, 3:
Massas EIC=579). 168
Figura 56: Ampliação do cromatograma do plasma dos animais tratados com quercetina
2 vezes – grupo 4 (1: 254 nm, 2: Massas TIC). 168
Figura 57: Esquema proposto para o possível metabolismo da aglicona quercetina e dos
flavonóides de KP 172
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Características das Principais Formas Clínicas de Leishmanioses 008
Tabela 2: Plantas medicinais com atividade antileishmania 013
Tabela 3: Atividades farmacológicas descritas para a espécie medicinal Kalanchoe
pinnata 018
Tabela 4: Classes de compostos descritas para Kalanchoe pinnata
Tabela 5: Flavonóides isolados do gênero Kalanchoe 020
Tabela 6: Flavonóides isolados do gênero Kalanchoe e suas respectivas atividades
biológicas. 023
Tabela 7: Equipe participante deste projeto 028
Tabela 8: Purificação do conjunto F3 038
Tabela 9: Purificação do conjunto F3-C2 038
Tabela 10: Purificação do conjunto F3-C2b: obtenção de KP1 e KP2. 038
Tabela 11: Purificação do conjunto F3-C2c: obtenção de KP1, KP2, KP3, KP4 e KP5 038
Tabela 12: Purificação do conjunto F3-C2c 4 - obtenção de KP4 e KP2 039
Tabela 13: Gradiente de solventes utilizado na análise dos extratos por CLAE 040
Tabela 14: Gradiente de solventes utilizado na análise por CLAE dos plasmas dos
camundongos - Experimento 1. 041
Tabela 15: Gradiente de solventes utilizado na análise por CLAE dos plasmas dos
camundongos - Experimento 2. 041
Tabela 16: Dados de
13
C (75 MHz) e
1
H (300 MHz) para 3-O-α-arabinopiranosil (1→2)
α-ramnopiranosídeo de quercetina – KP1 (CD
3
OD e DMSO-d
6
). 071
Tabela 17: Dados de
13
C para 3-O-α-arabinopiranosil (1→2) α-ramnopiranosídeo de
quercetina – KP1 e deste mesmo flavonóide isolado de Kalanchoe
blossfeldiana (Nielsen et al., 2005). 072
Tabela 18: Dados de
13
C (75 MHz) e
1
H (300 MHz) para 3-O-α-ramnopiranosídeo de
quercetina (quercitrina) – KP2 (CD
3
OD). 086
Tabela 19: Dados de
13
C entre 3-O-α-ramnopiranosídeo de quercetina (quercitrina) –
KP2 e deste mesmo flavonóide isolado de Eugenia jambos (SLOWING et al.,
1994). Ambos os espectros foram realizados utilizando CD
3
OD como
solvente. 087
Tabela 20: Dados de
13
C e
1
H para 3-O-α-arabinopiranosil (1→2) α-ramnopiranosídeo
de kaempferol (kapinnatosídeo). RMN em CD
3
OD (300 MHz), RMN em
DMSO-d
6
(400 MHZ). 094
Tabela 21: Dados de
13
C (100 MHz) e
1
H (300 MHz) para 3-O-α-arabinopiranosil (1→2)
α-ramnopiranosídeo de kaempferol (afzelina) – KP4 (CD
3
OD). 103
Tabela 22: Dados de
13
C (75 MHz) e
1
H (300 MHz) para 8,3’-dimetoxi-5,4’-
diidroxiflavona 7-O-β-glicopiranosídeo. 110
Tabela 23: Flavonóides isolados de K. pinnata. 122
Tabela 24: IC
50
aproximado para KP 1-5 em µg/mL e µM. 124
Tabela 25: Áreas obtidas a 254 nm utilizando padrão de rutina em diferentes
concentrações. 146
Tabela 26: Percentual p/p de quercitrina (KP2) e KP1 em amostras de KP. 157
LISTA DE ABREVIATURAS
AAAA Acetato de Etila/Acetona/Ácido acético/Água
BAW n-butanol/Ácido acético/Água
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
COSY Correlation Spectroscopy Homonuclear (
1
H-
1
H)
COX ciclooxigenase
DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
Dexa Dexametasona
DMSO-d
6
d6 Hexadeuteriodimetil-sulfóxido
EM Espectrometria de Massas
HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation Spectroscopy
HMQC Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence Experiment
i.m. via intramuscular
i.v. via intravenosa
IC
50
Concentração Inibitória 50%
iNOS óxido nítrico sintetase indutível
MeOH Metanol
n-BuOH n–butanol
NO óxido nítrico
NOS óxido nítrico sintetase
OMS Organização Mundial da Saúde
RMN de
13
C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
RMN de
1
H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RP Reverse Phase
KP1 quercetina-3-O-α-L-arabinopiranosil (1→2) α-L-ramnopiranosídeo
KP2 quercetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (quercitrina)
KP3 kaempferol-3-O-α-L-arabinopiranosil (1→2) α-L-ramnopiranosídeo
sssssssssssss(kapinnatosídeo)
KP4 kaempferol-3-O-α-L- ramnopiranosídeo (afzelina)
KP5 4’,5-diidroxi-3’,8-dimetoxiflavona-7-O-β-D-glicopiranosídeo
UV Ultravioleta
RESUMO
“Flavonóides de Kalanchoe Pinnata (Crassulaceae): Avanços na Pesquisa da Utilização desta
Espécie Medicinal no Tratamento da Leishmaniose Cutânea”
MICHELLE FRAZÃO MUZITANO
Orientadora: Profa Sônia Soares Costa
Co-orientadora: Profa Bartira Rossi-Bergmann
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Química de Produtos
Naturais, Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, da Universidade Federal do Rio de Janeiro –
UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências.
Nossa equipe iniciou o estudo da atividade de Kalanchoe pinnata – denominada KP em
nossos trabalhos - na leishmaniose há alguns anos e muito tem contribuído para que o uso
desta planta no tratamento da leishmaniose se torne uma realidade. Nestes estudos prévios
foi demonstrada a atividade antileishmania do extrato aquoso de KP in vitro, in vivo e em
um caso clínico de leishmaniose cutânea.
O presente trabalho visou identificar as substâncias antileishmania presentes no extrato
aquoso de KP utilizando fracionamento guiado por ensaios com amastigotas intracelulares.
O fracionamento bioguiado do extrato aquoso de KP em amastigotas intracelulares de
Leishmania amazonensis levou a uma fração flavonoídica altamente ativa na leishmaniose e
permitiu o isolamento de um flavonóide, quercitrina (quercetina-3-O-α-L-
ramnopiranosídeo), com considerável atividade antileishmania. Nos experimentos
realizados, a quercitrina apresentou IC
50
de 4 µg/ml, enquanto o medicamento de uso
clínico, Pentostam, um IC
50
de 20 µg/ml. Nenhuma citotoxicidade foi observada usando
concentrações abaixo de 10 µg/ml deste flavonóide. Outros quatro flavonóides foram
isolados desta fração ativa, quercetina-3-O-α-L-arabinopiranosil (1→2) α-L-
ramnopiranosídeo, kaempferol-3-O-α-L-arabinopiranosil (1→2) α-L-ramnopiranosídeo,
kaempferol-3-O-α-L- ramnopiranosídeo e 4’,5-diidroxi-3’,8-dimetoxiflavona-7-O-β-D-
glicopiranosídeo, mas nenhum deles foi mais ativo do que a quercitrina no ensaio de
atividade antileishmania.
Experimentos em camundongos infectados por L. amazonensis mostraram que a quercitrina
é também capaz de exercer atividade antileishmania in vivo, sendo tão ativa quanto o
extrato aquoso de KP, ambos administrados por via oral. O estudo do metabolismo de
flavonóides em plasma de camundongos tratados com estas substâncias, associado à
pesquisa bibliográfica, sugere que os glicuronídeos são os principais metabólitos in vivo
dessa classe de substâncias.
Com o objetivo de garantir a qualidade do extrato de KP, algumas amostras foram
analisadas utilizando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao detector de
Ultravioleta e ao Espectrômetro de Massas (CLAE-UV-EM). Os resultados mostraram que o
momento apropriado para a colheita é em estações quentes, que é melhor colher as folhas
de KP cultivado sob a luz solar e que a extração aquosa sob aquecimento é o melhor
procedimento para obtenção de um extrato ativo. Adicionalmente foi verificado que a
propagação de Kalanchoe pinnata a partir de indivíduos monoclonais produzidos in vitro
leva a mudas capazes de produzir o composto ativo quercitrina.
A alta atividade do extrato aquoso de K. pinnata no tratamento oral da leishmaniose em
camundongos, a identificação das substâncias que contribuem para esta atividade e o
estabelecimento das condições que garantem a qualidade do extrato ativo, tornam esta
espécie medicinal um alvo promissor para o desenvolvimento de um novo fitoterápico.
Palavras-chave: Kalanchoe pinnata; Crassulaceae; Flavonóides glicosídicos; Quercitrina;
Leishmaniose; Leishmania amazonensis; CLAE-MS; RMN; Controle de Qualidade;
Micropropagação.
Rio de Janeiro
Setembro, 2006
ABSTRACT
Kalanchoe pinnata (Crassulaceae) Flavonoids: an advance in the usage of this medicinal
species in the treatment of cutaneous leishmaniasis
MICHELLE FRAZÃO MUZITANO
Orientadora: Profa Sônia Soares Costa
Co-orientadora: Profa Bartira Rossi-Bergmann
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Química de Produtos
Naturais, Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, da Universidade Federal do Rio de Janeiro –
UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências.
Previous studies on the antileishmanial properties of Kalanchoe pinnata led to the
demonstration of its in vitro activity on intracellular parasites as well as its efficacy in orally
treating cutaneous leishmaniasis of both mice and human.
The present study aimed at identifying the antileishmanial compounds of K. pinnata
aqueous extract using Leishmania amazonensis antiamastigote activity-guided
fractionation.
The bioguided fractionation led to the separation of an active flavonoid fraction followed by
the isolation of quercitrin (quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside – KP2), a flavonoid with
strong antileishmanial activity. Quercitrin was more active than the current drug Pentostam
(IC50 ~ 4 µg/ml and 20 µg/ml, respectively). No inespecific citotoxicity was observed with
concentrations bellow 10 µg/ml.
Four additional flavonoids were isolated from the same active fraction: quercetin-3-O-α-L-
arabinopyranosil (1→2) α-L-rhamnopyranoside (KP1), kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranosil
(1→2) α-L-rhamnopyranoside, kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside and 4’,5-dihydroxy-
3’,8-dimethoxyflavone-7-O-β-D-glucopyranoside, but none was superior to quercitrin when
tested on leishmania-infected macrophages.
When administered to Leishmania amazonensis-infected mice by the oral route, quercitrin
was shown to be as potent as the K. pinnata aqueous extract in inhibiting the lesion growth.
Metabolism study in mice orally given KP1, KP2 and quercetin corroborates the literature
data indicating that glucuronides are the main plasma metabolites of this class of molecules.
For K. pinnata extract quality control, samples of plants grown under different conditions
were analyzed by High Performance Liquid Chromatograhy coupled with Diode Array and
Mass Spectrometry (HPLC-DAD-MS), with emphasis on its antileishmanial flavonoid
contents. For quality control purposes, we found that plants grown under direct sunlight and
harvested during the summer yielded the most flavonoid enriched extracts. Also, aqueous
extraction under heating was the best way of obtaining active extracts. Furthermore, it was
verified that the K. pinnata propagation using in vitro monoclonal specimens led to shoots
producing the active flavonoid quercitrin.
This study has identified the flavonoid quercitrin as the main active component of the
aqueous extract of Kalanchoe pinnata in cutaneous leishmaniasis and proposes its use as a
biological marker for the quality control of this potential phytomedicine. In addition, this
study provides further information on the standardization and preparation of active K.
pinnata extracts.
Key Words: Kalanchoe pinnata; Crassulaceae; Flavonoid Glicosides; Quercitrin;
Leishmaniasis; Leishmania amazonensis; HPLC-DAD-MS; NMR; Quality Control;
Micropropagation.
Rio de Janeiro
Setembro, 2006
LEISHMANIOSES
As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por protozoários do gênero
Leishmania e atingem aproximadamente 12 milhões de pessoas em 88 países. Entretanto, é
provável que os números reais sejam 3 a 4 vezes maiores, considerando a dificuldade de
notificação da doença. Sabe-se ainda que 350 milhões de pessoas encontram-se em área de
risco (WHO, 2005). Os parasitas encontram-se difundidos nas Américas do Sul e Central, na
Europa, na África e na Ásia. Mais de 90% dos casos de leishmaniose cutânea ocorrem no
Irã, Afeganistão, Síria, Arábia Saudita, Brasil e Peru. No caso da leishmaniose visceral, mais
de 90% dos casos ocorrem no Brasil, Bangladesh, Índia e Sudão (WHO, 2005).
No Brasil, a Leishmaniose Cutânea ou Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA)
apresenta-se bastante estabelecida, tanto em magnitude quanto em expansão geográfica,
observando-se a coexistência de um duplo perfil epidemiológico, expresso pela manutenção
de casos oriundos de focos antigos e pelo aparecimento de surtos epidêmicos associados a
fatores tais como o acelerado processo de expansão das fronteiras agrícolas, a implantação
de áreas de garimpos, a construção de estradas, entre outros (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
1999).
Na análise da evolução temporal da LTA para o Brasil (Figura 1), verifica-se que os
valores das taxas de incidência têm oscilado no decorrer do período, variando de 21.801 a
35.748 casos notificados. Em relação à Leishmaniose Visceral (LV), os números parecem
estáveis variando de 1.510 a 4.858 casos notificados (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Casos Notificados de Leishmaniose no Brasil
0
10.000
20.000
30.000
40.000
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
Número de Ocorrências
LTA
LV
Figura 1: Notificações para Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e
leishmaniose Visceral (LV) na rede do SUS no período de 1990 a 2005 (Fonte: Ministério da
Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, www.saude.gov.br/svs, acessado em
17/08/2006).
No mapa a seguir é possível verificar a distribuição geográfica da leishmaniose no
Brasil (Figura 2). A LTA e a LV fazem parte da lista de doenças de notificação compulsória
atualmente adotada pelo Centro Nacional de Epidemiologia (CENEPI) e utilizada como
referência nacional em toda rede do SUS.
Figura 2: Distribuição geográfica das Leishmanioses no Brasil no período de 1994 a
1999. (Boletim Epidemiológico – Ano V, nº17, Novembro 2002, Secretaria Municipal de
Saúde de Porto Alegre).
A região Norte sempre contribuiu com altos números de notificações para LTA, cerca
de 36% do total de casos notificados no Brasil no período estudado, 1990-2005. A Figura 3
mostra a distribuição dos casos notificados por Unidade Federada nos últimos 10 anos
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). Estudos mostram que a taxa média de incidência nesta
região no período de 1990 a 1998 foi de 75,4 por 100 mil habitantes, cinco vezes superior à
média do país (13,9 por 100 mil habitantes) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1999).
No Nordeste, foi registrado um número semelhante de notificações, 35% dos casos,
entre 1990-2005 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). Todavia, seu risco médio (18,4 por 100
mil habitantes) no período estudado corresponde, apenas, a 1,3 vezes ao da média nacional
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1999). Nessa região, destacaram-se os estados do Ceará,
Maranhão e Bahia (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
De um modo geral, pode-se dizer que, nas regiões Norte e Centro-Oeste as frentes
agrícolas e garimpeiras mais recentes seriam as responsáveis pelo crescimento da doença.
Já nos estados do Nordeste o mesmo processo não vem ocorrendo de modo tão intenso.
Entretanto, registram-se novos focos em áreas agrícolas, como também em outras áreas
próximas à periferia de centros urbanos, em virtude do desenvolvimento de pólos
industriais e turísticos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1999).
As regiões Sul e Sudeste apresentaram freqüências bem menores que a região
anterior, tendo, ambas, no período correspondente a 1980-1997, taxas de incidências
médias em torno de 3,1 por 100 mil habitantes. É importante salientar que os estados de
Santa Catarina e Rio Grande do Sul registraram apenas casos esporádicos (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2006). Os estados de Minas Gerais e Espírito Santo são os que mais contribuem
para a taxa de incidência de LTA da região sudeste (Figura 4). A partir da análise dos dados
disponíveis para a região sudeste foi possível observar um franco crescimento no número de
casos de LTA no estado de São Paulo, principalmente nos últimos 4 anos, e um número
constante de casos nos estados do Rio de Janeiro e Minas Gerais. Tendências de Redução
no número de casos foram observadas apenas para o estado do Espírito Santo (MINISTÉRIO
DA SAÚDE, 2006).
A região sudeste pode ser observada, em destaque, na Figura 5 onde são
apresentados os dados acumulados no período de 1994 a 1999 proporcionais ao território
de ocorrência dos casos (densidade média).
Distribuição dos Casos no Brasil
0
2.500
5.000
7.500
10.000
12.500
15.000
17.500
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
Número de Ocorrências
Norte
Nordeste
Sudeste
Sul
Centro-Oeste
Figura 3: Distribuição geográfica das notificações para Leishmaniose Tegumentar
Americana (LTA) no Brasil no período de 1995 a 2005. (Fonte: Ministério da Saúde,
Secretaria de Vigilância em Saúde, www.saude.gov.br/svs, acessado em 17/08/2006).
Distribuição dos Casos - Região Sudeste
60%
17%
9%
14%
MG ES RJ SP
Figura 4: Contribuição de cada estado para o total de notificações de Leishmaniose
Tegumentar Americana (LTA) na região sudeste nos anos de 1980-2005. (Fonte: Ministério
da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, www.saude.gov.br/svs, acessado em
17/08/2006).
Figura 5: Distribuição geográfica das Leishmanioses no Brasil no período de 1994 a
1999, considerando o território de cada município. Os valores entre parênteses são os
números de municípios em cada categoria. Em destaque encontra-se a Região Sudeste.
(Boletim Epidemiológico – Ano V, nº17, Novembro 2002, Secretaria Municipal de Saúde de
Porto Alegre).
CICLO DE VIDA DA Leishmania
O gênero Leishmania compreende protozoários parasitas que vivem alternadamente
em hospedeiros vertebrados e insetos vetores, estes últimos sendo responsáveis pela
transmissão dos parasitas de um mamífero a outro. Todas as espécies do gênero são
transmitidas pela picada de fêmeas infectadas de dípteros da sub-família Phlebotominae,
pertencentes aos gêneros Lutzomyia – no Novo Mundo, e Phlebotomus – no Velho Mundo.
As leishmanioses constituem zoonoses de animais silvestres, e mais raramente domésticos,
incluindo marsupiais, desdentados, carnívoros e mesmo primatas. O homem representa
hospedeiro acidental e parece não ter um papel importante na manutenção dos parasitas na
natureza (GONTIJO & CARVALHO, 2003).
Nos hospedeiros mamíferos as formas promastigotas do parasita, inoculadas pelo
vetor, infectam os macrófagos da pele e multiplicam-se na forma amastigota dentro do
vacúolo parasitóforo até o rompimento da célula hospedeira. Livres, estas amastigotas são
fagocitadas por outros macrófagos, dando continuidade ao ciclo intracelular. Quando um
novo flebotomíneo fêmea fizer seu repasto sangüíneo neste mamífero infectado poderá
ingerir os macrófagos com as formas amastigotas do parasita. No tubo digestivo do
flebotomíneo as amastigotas se transformam em promastigotas que se multiplicam
intensamente e diferenciam-se em promastigotas metacíclicas infectantes, quando então se
dirigem para a região do aparelho bucal do inseto onde poderão ser inoculadas em outro
hospedeiro mamífero, completando-se o ciclo biológico do parasita (WHO, 2005).
Figura 6: Ciclo Biológico da Leishmania (Fonte: www.who.int).
Figura 7: Forma promastigota (A) e amastigota (B) da Leishmania (Fonte:
www.who.int).
A
B
FORMAS CLÍNICAS DA LEISHMANIOSE
Infecções por várias espécies de Leishmania causam um amplo espectro de
enfermidades no homem, com manifestações clínicas muito diferentes; a severidade da
doença é ditada pelo estado imunológico do indivíduo infectado e pela espécie de
Leishmania envolvida.
A forma visceral da doença causada por L. donovani, L. infantum ou L. chagasi (esta
última comum no Brasil), pode ser potencialmente fatal se não tratada. Ela provoca
destruição e hiperplasia do baço, fígado e medula óssea, órgãos com grande número de
macrófagos. Leishmaniose visceral (VL) ou calazar é encontrada em regiões tropicais e
subtropicais do mundo e possui uma incidência mundial acima de 500 mil casos. Co-
infecções com L. infantum e HIV têm sido um crescente problema em países do
mediterrâneo e têm indicado que este parasita é também um oportunista (SMITH et al.,
2000).
O tipo de leishmaniose mais comum é a leishmaniose tegumentar americana
manifestada normalmente por lesões na pele, que inicialmente são pápulas vermelhas e
evoluem para úlceras de bordos altos.
A leishmaniose tegumentar pode ser causada por várias espécies de Leishmania,
assumindo diversas formas clínicas. Até o momento, seis espécies de Leishmania foram
identificadas no Brasil como causadoras de LTA humana (GONTIJO & CARVALHO, 2003):
L. braziliensis: é a espécie mais prevalente no homem e pode causar lesões cutâneas e
mucosas. é encontrada em todas as zonas endêmicas do país, desde o norte até o sul,
estando geralmente associada à presença de animais domésticos. É transmitida por
diferentes espécies de flobotomíneos como Lutzomyia whitmani, L. wellcomei, L.
intermedia, dentre outras.
L. guyanensis: causa sobretudo lesões cutâneas. Ocorre na margem norte do rio
Amazonas em áreas de colonização recente, estando associada com desdentados e
marsupiais. As principais espécies de flebotomíneos envolvidas na transmissão são:
Lutzomyia umbratilis, L. anduzei e L. whitmani.
L. amazonensis: agente etiológico de LTA, incluindo a forma anérgica ou cutânea
difusa. Seus reservatórios são roedores e marsupiais e a Lutzomyia flaviscutellata e L.
olmeca os principais vetores.
L. naiffi: ocorre na Amazônia, tendo o tatu como reservatório natural. O parasita causa
LTA de evolução benigna e seus principais vetores são a Lutzomyia squamiventris, L.
paraensis e L. ayrozai.
L. shawi: responsável por casos esporádicos no Amazonas e Pará, tem como
reservatórios vários animais silvestres como macacos, preguiças e como vetor a Lutzomyia
whitmani.
L. lainsomi: registrada apenas na Amazônia, tem a paca como animal suspeito de
reservatório e como vetor a Lutzomyia ubiquitalis.
As seis espécies são capazes de produzir a forma cutânea localizada, onde a úlcera
desenvolve-se de maneira crônica e pode curar-se espontaneamente em alguns indivíduos.
Outras formas clínicas de leishmaniose tegumentar podem ocorrer: a leishmaniose
mucocutânea (LMC) e a leishmaniose cutânea difusa (LCD). A LMC inicia-se com úlceras
simples na pele que, após variado período de tempo, meses ou anos, produzem metástases
na região oronasal que progressivamente podem destruir estes tecidos e causar mutilações.
Esta forma clínica da doença é causada principalmente pela L. braziliensis. A LCD é uma
forma clínica rara causada principalmente pela L. amazonensis e caracteriza-se pela
disseminação de inúmeras lesões não ulceradas na pele contendo um alto número de
parasitas.
As sérias conseqüências das formas mais graves de leishmaniose, a visceral e
mucocutânea, levaram a Organização Mundial da Saúde (OMS), através do Programa
Especial para Pesquisa e Treinamento em Doenças Tropicais, a incluir as leishmanioses
entre as doenças para estudo prioritário (WHO, 2003).
Figura 8: Leishmaniose Tegumentar (A) e Leishmaniose Mucocutânea (B).
Tabela 1: Características das Principais Formas Clínicas de Leishmanioses
Formas Clínicas Localização
Leishmaniose Cutânea Infecção na derme, com epiderme ulcerada.
Leishmaniose Mucocutânea
Infecções na derme, com úlceras. Lesões metastáticas,
invasão de mucosas e destruição de cartilagens.
Leishmaniose Visceral (Calazar)
Infecção generalizada, caracterizada por
hepatoesplenomegalia, anemia, leucopenia, edema, levando
ao óbito.
(COUTINHO et al., 1987)
A B
TRATAMENTO CONVENCIONAL
A base da terapêutica na leishmaniose é constituída pelos antimoniais pentavalentes
que são fármacos utilizados desde o início do século XX. Os membros dessa classe de
substâncias são o estibogliconato de sódio (Pentostam®- GlaxoSmithKline, Reino Unido) e o
antimoniato de meglumina (Glucantime®-Aventis, França), ainda amplamente utilizados
(CROFT & YARDLEY, 2002).
O mecanismo de ação dos antimoniais não é bem conhecido, mas parece interferir
especialmente com as formas amastigotas de Leishmania, inibindo tanto a glicólise como a
oxidação de ácidos graxos, que é acompanhada da diminuição da capacidade do parasita
formar ATP e GTP (BERMAN, 1988). Estudos posteriores mostraram que o Sb
V
(antimônio
pentavalente) penetra no vacúolo parasitóforo e é reduzido a Sb
III
(antimônio trivalente),
que seria mais tóxico para as formas amastigotas (EPHROS et al., 1999).
O esquema de tratamento recomendado pela OMS em 1984 para o calazar é de 20 mg
de Sb/Kg/dia, intramuscular ou intravenoso, com a dose máxima diária de 850 mg de Sb
por, no mínimo, 20 dias e até duas semanas após a cura parasitológica. Para a leishmaniose
cutânea, a recomendação é de 10-20 mg de Sb/Kg/dia até que a lesão se cure; e para a
mucocutânea, de 20 mg de Sb/Kg/dia durante 30 dias (WHO, 2005).
Os antimoniais pentavalentes são administrados por via parenteral (i.m. ou i.v.) em
altas doses diárias e por um longo curso de tratamento, promovendo sérios efeitos
colaterais, tais como hepatotoxicidade, alterações cardíacas, elevação dos níveis séricos das
transaminases, anorexia, náusea, vômito e mialgia (HEPBURN et al., 1994; ARANA et al.,
2001), causando mortalidade em 2-5% dos pacientes com calazar e toxidez em 10-15%
(MATTOCK, 2000). Em virtude destes efeitos, os antimoniais são contra-indicados durante a
gravidez e em pacientes com doenças renais, hepáticas e cardíacas (ROSEN & KOFF, 1994;
ARANA et al., 2001). Outras desvantagens do tratamento convencional que podem ser
citadas são a resistência aos antimoniais, que é um fenômeno crescente em todas as
formas clínicas da leishmaniose (SUNDAR et al., 2000; OUELLETTE et al., 2004), e o alto
custo desse tratamento.
A segunda linha de fármacos empregada para o tratamento da leishmaniose é
constituída pela anfotericina B e a pentamidina. A anfotericina B é um fármaco antifúngico
com atividade antileishmania. Apesar de mais eficaz que os antimoniais, a anfotericina B
requer infusão venosa a cada dois ou três dias, causando febre, dores generalizadas,
toxicidade renal e às vezes anafilaxia. A anfotericina age pela sua capacidade de ligar-se a
esteróis presentes nas membranas celulares de fungos e Leishmania (ergosterol e
episterol), promovendo a formação de poros e o extravasamento de pequenas moléculas. A
sua toxicidade é conseqüência da sua ligação ao colesterol, presente nas células do
hospedeiro mamífero (CROFT & YARDLEY, 2002; OUELLETTE et al., 2004). A apresentação
da anfotericina B em lipossomas tem reduzido sua nefrotoxidade, mas o alto custo da
formulação e dos royalties inviabiliza sua distribuição nos países do Terceiro Mundo (CROFT
et al., 2006).
Diaminas como a pentamidina ainda não têm mecanismo de ação conhecido, mas
sabe-se que danificam o DNA do parasita. Os efeitos tóxicos da pentamidina são
importantes nas doses terapêuticas, provocando 7-9% de morte em pacientes com calazar
e em 60% danos irreversíveis como o diabetes, sendo o seu uso limitado aos casos
especiais como de resistência ou grande intolerância aos antimoniais (MATTOCK, 2000;
CROFT & COOMBS, 2003; OUELLETTE et al., 2004).
Atualmente, duas novas substâncias mostraram-se promissoras para o tratamento da
leishmaniose: miltefosina e sitamaquina. A sitamaquina ou kalazaquina, uma 8-
aminoquinolina mostrou-se efetiva no tratamento oral do calazar. Estudos clínicos
encontram-se em andamento sob a responsabilidade da Glaxo Smith Kline no Brasil, Quênia
e Índia (CROFT et al., 2006). A miltefosina (hexadecilfosfocolina), uma substância
originalmente desenvolvida como agente anti-tumoral, mostrou-se efetiva no tratamento da
Leishmaniose, por via oral, em ensaios clínicos realizados na Índia. Este medicamento foi
então aprovado pelo Governo Indiano em 2002 para o tratamento da leishmaniose visceral.
Posteriormente, em 2005, a miltefosina foi aprovada para uso na Colômbia no tratamento
da Leishmaniose Cutânea. Entretanto, o tratamento com essa droga apresentou alguns
efeitos colaterais como vômito e diarréia, além de ser teratogênica, apresentar pequena
janela terapêutica e possuir alto potencial para desenvolvimento de resistência em parasitas
(CROFT & COOMBS, 2003; OUELLETTE et al., 2004; CROFT et al., 2006).
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ABFOTERICINA B MILTEFOSINA
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PENTAMIDINA SITAMAQUINA
Figura 9: Fórmula estrutural dos medicamentos padrões para leishmaniose,
Pentostam (estibogliconato de sódio) e Glucantime (antimoniato de meglumina); da
segunda linha de fármacos utilizados: anfotericina B e pentamidina; e de duas substâncias
promissoras: miltefosina e sitamaquina.
PRODUTOS NATURAIS E A LEISHMANIOSE
Os produtos naturais possuem um papel importante na descoberta de fármacos. No
período de 1981 a 2002, 61% das pequenas moléculas descobertas e em processo de
desenvolvimento são produtos naturais ou tiveram suas origens em produtos naturais
(NEWMAN et al., 2003).
A avaliação científica de plantas medicinais usadas popularmente contribuiu, no
passado, para a medicina moderna com muitas drogas efetivas no tratamento de doenças
parasitárias (IWU et al., 1994).
1. Quinina (Cinchona succirubra), a primeira droga a combater a malária.
2. Emetina (Cephaelis ipecacuanha), usada há séculos na China no tratamento da
amebíase e só depois reconhecida pela medicina moderna.
3. Artemisinina (Artemisia annua), usada atualmente como antimalárico.
Devido à dificuldade de acesso ao meio hospitalar, às limitações no tratamento
convencional e à distribuição escassa das drogas, uma grande parte dos doentes se trata
com extratos de plantas por via oral, para a forma sistêmica da Leishmaniose e uso tópico
para a forma cutânea.
No caso da leishmaniose, alguns estudos relacionados à atividade biológica de extratos
de plantas podem ser encontrados na literatura. Segundo IWU et al. (1994) mais de 20
espécies de plantas mostraram significante atividade contra várias espécies de Leishmania.
Dentre elas destacaram-se Desmodium gangeticum (Fabaceae), Oxandra espintana
(Annonaceae) e Pera benensis (Euphorbiaceae).
Com o aumento do interesse em novas alternativas para o tratamento da
Leishmaniose, alguns estudos baseados em informações etnobotânicas foram realizados.
Desta forma, pesquisas conduzidas na Colômbia, no Peru e no Brasil revelaram um número
significativo de espécies vegetais com atividade antileishmania. No Peru, algumas espécies
se destacam por serem muito utilizadas pela população e por terem sua atividade
antileishmania comprovada (ensaios realizados em promastigotas de Leishmania major).
São elas: Minquartia guianensis (Olacaceae), Copaifera pauperi (Caesalpinaceae),
Tabernaemontana sp. (Apocynaceae) e Maytenus spp. (Celestraceae) (KVIST et al., 2006).
No trabalho realizado na Colômbia, os extratos das plantas mais utilizadas pela população
foram testados em promastigotas e amastigotas de Leishmania panamensis. As espécies
que se destaram foram: Hygrophila guianensis (Acanthaceae), Otoba novogranatensis
(Myristicaceae) e Otoba parviflora (Myristicaceae) (WENIGER et al., 2001). No Brasil, uma
pesquisa foi realizada com plantas presentes na região de Cerrado da cidade de Brasília.
Este estudo foi baseado na atividade in vitro de extratos hexânicos e etanólicos em
promastigotas de Leishmania donovani. As espécies vegetais que se destacaram foram:
Annona crassiflora (Annonaceae), Duguetia furfuracea (Annonaceae) e Casearia sylvestris
(Flacourtiaceae), conhecidas popularmente na região como araticum-do-cerrado, araticum-
seco e erva-de-lagarto, respectivamente (MESQUITA et al., 2005).
Além desses estudos envolvendo triagem de atividade biológica de um grande número
de espécies, alguns estudos mais aprofundados relacionados a atividade antileishmania de
um extrato em específico e de suas substâncias ativas foram realizados.
As cascas do tronco da Pera benensis
são utilizadas pelos índios Chimane da Amazônia
boliviana para o tratamento da leishmaniose causada por L. brasiliensis. Desta planta foram
extraídas quinonas, tais como a plumbagina, com atividade inibitória in vitro sobre
Leishmania sp e Trypanosoma cruzi (FOURNET et al., 1992). O alcalóide berberina mostrou
atividade in vivo contra L. panamensis em hamster (VENNESTRON et al., 1990). Espintanol,
um monoterpeno isolado a partir de cascas de Oxandra espintana (Annonaceae),
apresentou significante atividade contra promastigotas de 12 espécies de Leishmania,
incluindo L. mexicana. Entretanto, apresentou alta toxidez para macrófagos, mostrando
apenas uma baixa atividade quando testado in vivo em camundongos infectados por L.
amazonensis. A chalcona isolada de Piper aduncum mostrou atividade inibitória sobre L.
amazonensis in vitro e protegeu camundongos BALB/c contra a doença (TORRES-SANTOS
et al., 1999). A lignana (+)-medioresinol de Doliocarpus dentatus (Dilleniaceae) mostrou-se
ativa contra formas amastigotas de L. amazonensis (SAUVAIN et al., 1995).
Recentemente, foi demonstrada a eficácia do extrato de Desmodium gangeticum e de
suas frações no tratamento da leishmaniose visceral experimental em hamsters (SINGH et
al., 2005). Esta atividade foi atribuída a glicolipídeos presentes em seu extrato etanólico
(MISHRA et al., 2005).
A atividade desses extratos vegetais é devida a substâncias de diversas classes
químicas. Entre as classes mais promissoras encontramos: triterpenos, lignanas (SAUVAIN
et al., 1995) e chalconas (CRISTENSEN et al., 1994). Alguns compostos naturais com
atividade antileishmania encontram-se mostrados na Figura 10, junto à classe química as
quais pertencem.
Tabela 2: Plantas medicinais com atividade antileishmania
Espécie
Família Referência
Annona crassiflora Annonaceae MESQUITA et al., 2005
Casearia sylvestris Flacourtiaceae MESQUITA et al., 2005
Copaifera pauperi Caesalpinaceae KVIST et al., 2006
Desmodium gangeticum Fabaceae IWU et al., 1994
Duguetia furfuracea Annonaceae MESQUITA et al., 2005
Hygrophila guianensis Acanthaceae WENIGER et al., 2001
Maytenus sp. Celestraceae KVIST et al., 2006
Minquartia guianensis Olacaceae KVIST et al., 2006
Otoba novogranatensis Myristicaceae WENIGER et al., 2001
Otoba parviflora Myristicaceae WENIGER et al., 2001
Oxandra espintana Annonaceae IWU et al., 1994
PERA BENENSIS
Euphorbiaceae
IWU et al., 1994
Tabernaemontana sp. Apocynaceae KVIST et al., 2006
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Terpenos Chalconas
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PROPOSTA PARA UM FITOTERÁPICO DE USO ORAL
Apesar de alguns esforços visando a descoberta de substâncias de origem vegetal com
atividade antileishmania, nenhum se tornou ainda uma realidade para o tratamento das
Leishmanioses. Além disso, não existe ainda nenhum fitoterápico em uso no tratamento
desta doença, embora a atividade do extrato de algumas espécies vegetais tenha sido
estudada e confirmada.
Sabendo que algumas plantas foram fonte de agentes antiparasitários no passado, que
parte da população brasileira utiliza empiricamente plantas no tratamento das
leishmanioses e que o tratamento convencional é tóxico, pouco efetivo e administrado por
via parenteral, torna-se necessário o estudo aprofundado de novas alternativas visando um
medicamento fitoterápico seguro, eficaz e que possa ser administrado por via oral. Esta é a
proposta do estudo da espécie vegetal Kalanchoe pinnata apresentado nesta tese.
A ESPÉCIE Kalanchoe pinnata (Crassulaceae)
A família Crassulaceae engloba cerca de 33 gêneros e 1500 espécies de repartição
geográfica mundial, com exceção da Austrália e das ilhas do Pacífico. O gênero Kalanchoe
encontra-se distribuído nas regiões leste e sul da África (56 espécies), em Madagascar (60
espécies) e no sudeste asiático, onde se estende até a China. No total, este gênero
compreende cerca de 125 espécies (ALLORGE-BOITEAU, 1996).
O nome do gênero, Kalanchoe, foi empregado pela primeira vez por Michel Adanson
em 1753, durante uma longa viagem de exploração ao Senegal. Tendo publicado em 1757
“Histoire Naturelle du Sénégal” e, em 1763, “Les Familles Naturelles des Plantes”. Adanson
indicou a China como país de origem do gênero. Na China usa-se um nome o qual tem
transcrição fonética de “Kalan Chauhuy”, que significa: “que cai e que cresce”, certamente
em referência à forma da planta propagar seus embriões foliares (ALLORGE-BOITEAU,
1996).
A espécie Kalanchoe pinnata (Lamarck) Persoon é uma erva perene, suculenta, de
cerca de 1,5 metro de altura. Possui folhas opostas, longo-pecioladas, simples, crenadas,
carnudas e com cerca de 18 cm de comprimento. Suas flores são roxas, pendentes e em
cachos. Esta planta é nativa dos trópicos do Velho Mundo e cultivada no Sul da Flórida,
Bermudas, Bahamas, oeste da Índia e América tropical, inclusive no Brasil. Possui
reprodução vegetativa mediada por embriões foliares nas margens das folhas (ALLORGE-
BOITEAU, 1996). É conhecida popularmente no Brasil como saião-roxo, folha-da-fortuna,
folha-do-pirarucu, coirama, folha-da-costa e saião. Apresenta as seguintes sinonímias
botânicas: Bryophyllum pinnatum Kentz., Bryophyllum calycinum Salisb. e Cotiledon
rhizophylla Roxb. Na medicina popular usa-se o K. pinnata para tratar artrite reumatóide,
úlcera gástrica e como cicatrizante em afecções cutâneas (CORREA, 1975).
Heyne, um botânico amador, em 1815 teve a idéia de provar as folhas de K. pinnata e
observou que estas, pela manhã, eram fortemente ácidas e que se tornavam ligeiramente
amargas à noite. O metabolismo ácido das Crassuláceas (CAM) foi descoberto: fixação de
CO
2
durante a noite e acumulação de ácidos orgânicos durante o mesmo período. Este
processo metabólico foi então pouco a pouco sendo descrito na primeira metade do século
XX e permaneceu durante algum tempo como assunto de curiosidade entre os cientistas.
Sabe-se hoje que o CAM é um extraordinário exemplo de adaptação ecológica da
fotossíntese e do metabolismo que envolve a fixação de CO
2
(LUTTGE, 2004).
Classificação Botânica (www.mobot.org)
Divisão: Angiospermae
Classe: Dicotyledoneae
Ordem: Saxifragales
Família: Crassulaceae
Gênero: Kalanchoe
Espécie: Kalanchoe pinnata
Figura 11: Kalanchoe pinnata (foto cedida por Maria Minguez, Ilha Grande – RJ)
Kalanchoe pinnata é a espécie mais pesquisada deste gênero, tendo sido relatados
estudos químicos, toxicológicos e farmacológicos para a mesma. A seguir encontram-se os
principais relatos referentes a esta importante espécie vegetal.
Atividades Farmacológicas:
A atividade antiinflamatória de extratos de K. pinnata foi descrita em diferentes
modelos de inflamação (PAL & CHAUDHURI, 1990 e 1991; HEMA et al., 1986). Nesta última
referência a atividade antiinflamatória de K. pinnata foi atribuída ao sitosterol e a álcoois
alifáticos. Uma subfração do macerado em metanol das folhas frescas desta planta
apresentou atividade antiulcerogênica em nove modelos experimentais diferentes, tais como
lesão gástrica induzida por aspirina, indometacina, serotonina, reserpina, estresse, etanol e
ácido acético em ratos, bem como, lesão gástrica induzida por ácido acetil salicílico em
porcos da Índia (PAL & CHAUDHURI, 1991). Estudos in vitro, in vivo e histopatológicos
mostraram recentemente que o sumo de K. pinnata possui atividade hepatoprotetora
(YADAV & DIXIT, 2003).
Em relação à atividade antiparasitária, já foi descrita para K. pinnata moderada
atividade contra Plasmodium falciparum (agente causador da malária): 63% de inibição
(dose=1000 mg/Kg/4 dias, ensaio in vivo) (MUÑOZ et al., 2000).
O extrato metanólico das folhas de K. pinnata mostrou-se capaz de inibir o
crescimento de cinco espécies de bactérias: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Shigella
dysenteriae, Staphylococcus aureus e Proteus vulgaris (AKINPELU, 2000).
Kalanchoe pinnata foi estudada também em relação a sua capacidade de modular o
sistema imunológico. Neste estudo, realizado pela equipe coordenada pela Profa Sônia S.
Costa e pela Profa Bartira Rossi-Bergmann, foi constatado que o extrato aquoso de K.
pinnata é capaz de inibir a proliferação de linfócitos humanos e murinos in vitro. Esta
atividade foi atribuída a uma fração de ácidos graxos presentes no extrato (ALMEIDA et al.,
2000).
Recentemente, foi comprovada a atividade antidiabética do extrato aquoso das folhas
de K. pinnata em ratos (OJEWOLE, 2005). Neste mesmo artigo o autor comprova a
atividade antiinflamatória da planta e demonstra a atividade antinociceptiva (OJEWOLE,
2005). Este mesmo autor relatou atividade antiipertensiva para os extratos aquoso e
metanólico das folhas de K. pinnata em ratos, espontaneamente hipertensos (OJEWOLE,
2002).
O extrato aquoso de K. pinnata foi também estudado quanto a sua ação no sistema
nervoso central. Recentes pesquisas em ratos mostraram que este extrato possui atividade
neurossedativa. Adicionalmente, foi verificado que este extrato possui atividade relaxante
muscular (YEMITAN & SALAHDEEN, 2005).
Em 2004, foi relatada atividade para o extrato de K. pinnata na inibição das
contrações espontâneas do miométrio humano ex-vivo (GWEHENBERGER et al., 2004). Em
2006 foi publicado um estudo em mulheres grávidas (25 a 35 semanas de gestação) onde
foi comprovado que o extrato de K. pinnata é capaz de prolongar a gravidez reduzindo as
contrações uterinas durante o trabalho de parto precoce. Neste estudo, envolvendo 67
mulheres grávidas em cada grupo, o extrato de K. pinnata foi comparado a β-agonistas
utilizando a via intravenosa. Os pesquisadores pretendem aprimorar as pesquisas para que
este extrato possa ser utilizado na clínica (PLANGGER et al., 2006).
A atividade antileishmania do extrato aquoso de K. pinnata foi demonstrada pela nossa
equipe através de experimentos in vitro, in vivo e de um caso clínico (DA-SILVA et al.,
1995; DA-SILVA et al., 1999; TORRES-SANTOS et al., 2003). Esta atividade biológica será
discutida detalhadamente mais adiante.
A tabela abaixo mostra as atividades biológicas descritas para Kalanchoe pinnata.
Tabela 3: Atividades farmacológicas descritas para a espécie medicinal Kalanchoe
pinnata
Atividade Farmacológica Referências
Antibacteriana AKINPELU, 2000
Antidiabético OJEWOLE, 2005
Antiinflamatória PAL & CHAUDHURI, 1990 e 1991; HEMA et al., 1986
Antiipertensivo OJEWOLE, 2002
Antileishmania
DA-SILVA et al., 1995; DA-SILVA et al., 1999; TORRES-
SANTOS et al, 2003
Antimalárico MUÑOZ et al., 2000
Antinociceptiva OJEWOLE, 2005
Antiúlcerogênica PAL & CHAUDHURI, 1991
Hepatoprotetora YADAV & DIXIT, 2003
Imunomoduladora ALMEIDA et al., 2000
Inibição das contrações do
miométrio; relaxante muscular
GWEHENBERGER et al., 2004; PLANGGER et al., 2006;
YEMITAN & SALAHDEEN, 2005
Neurossedativa YEMITAN & SALAHDEEN, 2005
Análises Toxicológicas:
A toxidez do extrato de K. pinnata foi avaliada pela equipe coordenada pela Profa
Sônia S. Costa e Profa Bartira Rossi-Bergmann em camundongos e em humano e nenhuma
reação adversa foi observada. Os níveis séricos de alanina-aminotransferase, de aspartato-
aminotransferase, de uréia e de fosfatase alcalina permaneceram inalterados indicando
ausência de toxidez crônica ao fígado, ao coração e aos rins (TORRES-SANTOS et al.,
2003).
Posteriormente, outros autores tentaram determinar a toxidez aguda através da DL
50
para o extrato aquoso de K. pinnata. Doses entre 0,1 até 8 g/Kg foram administradas por
via oral a camundongos e nem mesmo as doses mais elevadas foram capazes de levar à
morte estes animais. Desta forma, não foi possível determinar o valor de DL
50
para esse
extrato (SOUSA et al., 2005). A segurança do extrato de K. pinnata foi confirmada em
ensaio clínico realizado em 67 mulheres grávidas (25 a 35 semanas de gestação), onde não
foi verificado qualquer sinal de toxidez na mãe e no neonato (PLANGGER et al., 2006).
Estudos Químicos:
Quanto à parte química, esta espécie medicinal, por ser a mais difundida dentre todas
as repertoriadas do gênero, foi objeto de diferentes estudos químicos que permitiram o
isolamento e a identificação de alguns flavonóides glicosídicos (GAIND & GUPTA, 1971;
ICHIKAWA, 1986), terpenos (SIDDIQUI et al., 1989), ácidos orgânicos (MARRIAGE &
WILSON, 1970) e bufadienolidos (YAMAGISHI et al., 1988 & 1989; SUPRATMAN et al.,
2000). Uma revisão sobre este assunto foi publicada por COSTA et al. (1995).
O estudo fitoquímico de K. pinnata realizado pela equipe coordenada pela Profa Sônia
S. Costa e pela Profa Bartira Rossi-Bergmann levou ao isolamento e a caracterização de um
glicolipídeo, 3-O-(-arabinopiranosil-(1-6)--glicopiranosil)-1-octen-3-ol, inédito para a
família Crassulaceae e descrito pela segunda vez na literatutra (ALMEIDA, 2000). Além
desta substância, alguns lipídeos foram também isolados, dentre eles, ácido palmítico e
esteárico. Estes ácidos graxos mostraram-se inibidores da proliferação de linfócitos
humanos in vitro (ALMEIDA et al., 2000).
A equipe, da qual faço parte, contribuiu também para a identificação de flavonóides
presentes em K. pinnata. Assim, três flavonas metoxiladas foram isoladas das folhas desta
espécie (ALMEIDA, 2000).
Tabela 4: Classes de compostos descritas para Kalanchoe pinnata
Classe Química Referências
Flavonóides GAIND & GUPTA, 1971; ICHIKAWA, 1986; ALMEIDA, 2000
Terpenos SIDDIQUI et al., 1989; GAIND et al., 2000
Bufadienolidos YAMAGISHI et al., 1988 & 1989; SUPRATMAN et al., 2000;
Ácidos Graxos ALMEIDA et al., 2000
Ácidos Orgânicos MARRIAGE & WILSON, 1970
Glicolipídeos ALMEIDA, 2000
FLAVONÓIDES E O GÊNERO Kalanchoe
Os flavonóides englobam uma classe muito importante de metabólitos secundários em
espécies do gênero Kalanchoe. A maior parte dos relatos relacionados ao estudo fitoquímico
destas espécies diz respeito ao isolamento e a caracterização dessa classe de compostos. A
Tabela 5 mostra os flavonóides descritos para cada espécie de Kalanchoe estudada e a
Tabela 6 mostra as atividades biológicas que foram relatadas para estas moléculas. As
moléculas para as quais não foram encontrados relatos de atividade biológica foram
excluídas da Tabela 6.
Tabela 5: Flavonóides isolados do gênero Kalanchoe
Espécies e flavonóides isolados Referências
Kalanchoe pinnata
1
Quercetina 3-O-ramnopiranosil-(1→6)-glicopiranosídeo (Rutina)
GAIND & GUPTA,
1971
2 Quercetina 3-O-diarabinosídeo
GAIND & GUPTA,
1971
3 Kaempferol 3-O-glicosídeo
GAIND & GUPTA,
1971
4
Quercetina 3-O-arabinopiranosil-(1→2)-ramnopiranosídeo
ICHIKAWA et al.,
1986
A
5 Quercetina 3-O-α-L-ramnopiranosídeo (Quercitrina) ALMEIDA, 2000
6 Kaempferol 3-O-ramnopiranosídeo (Afzelina) ALMEIDA, 2000
7 5,7,4’-triidroxi-8,3’-dimetoxi-flavona ALMEIDA et al., 2005
8 5,7-diidroxi-8,4’-dimetoxi-flavona (Galangustina) ALMEIDA et al., 2005
9 5,7,4’-triidroxi-6,3’-dimetoxi-flavona (Jaceosidina) ALMEIDA et al., 2005
10 flavan-3-ol acilado OGUMGBAMILA, 1997
Kalanchoe gracilis
1 Patuletina LIU et al., 1989
a
2 Patuletina 3-O-ramnosídeo LIU et al., 1989
a
3 Patuletina 3,7-di-O-ramnosídeo LIU et al., 1989
a
4 Patuletina 3-O-ramnosil-7-O-(3-O-acetilramnosídeo) LIU et al., 1989
a
5 Patuletina 3-O-ramnosil-7-O-(4-O-acetilramnosídeo) LIU et al., 1989
a
6 Patuletina 3-O-ramnosil-7-O-(3,4-O-diacetilramnosídeo) LIU et al., 1989
a
7 Patuletina 3-O-(4-O-acetilramnosil)-7-O-(3-O-acetilramnosídeo) LIU et al., 1989
a
8 Patuletina 3-O-(3-O-acetilramnosil)-7-O-(3-O-acetilramnosídeo) LIU et al., 1989
a
9 Patuletina 3-O-(4-O-acetilramnosil)-7-O-(3,4-O-diacetilramnosídeo) LIU et al., 1989
a
10 Patuletina 3-O-(4-O-acetilramnosil)- 7-O-(2,4-O-diacetilramnosídeo) LIU et al., 1989
a
11 Eupafolina 4'-O-ramnosídeo LIU et al., 1989
b
12 Eupafolina 3,7-di-O-ramnosídeo LIU et al., 1989
b
13 Eupafolina 3-O-ramnosil-7-O-(4-O-acetilramnosídeo) LIU et al., 1989
b
14 Eupafolina 3-O-(3-O-acetilramnosil)-7-O-(3-O-acetilramnosídeo) LIU et al., 1989
b
15 Eupafolina LIU et al., 1989
b
16 Quercetina 3-O-α-L-ramnopiranosídeo (Quercitrina) LIU et al., 1989
b
17 Quercetina LIU et al., 1989
b
18 Kaempferol LIU et al., 1989
b
19 Luteolina LIU et al., 1989
b
Kalanchoe spathulata
1 Quercetina GAIND et al., 1981
2 Quercetina 3-O-glicosídeo-7-O-ramnosídeo GAIND et al., 1981
3 Kaempferol GAIND et al., 1981
4 Kaempferol 3-O-ramnosídeo GAIND et al., 1981
5 Patuletina GAIND et al., 1981
6 Patuletina 3,7-di-O-ramnosídeo GAIND et al., 1981
Kalanchoe brasiliensis
1
Patuletina 3-O-α-L-ramnopiranosídeo
COSTA et al., 1994
2
Patuletina 3-O-(4"-O-acetil-α-L-ramnopiranosídeo (kalambrosídeo D)
ROSSI-BERGMANN et
al., 1997
3
Patuletina 3-O-α-L-ramnopiranosil-7-O-α-L-ramnopiranosídeo
COSTA et al., 1994
4
Patuletina 3-O-(4"-O-acetil-α-L-ramnopiranosil)- 7-O-(2"'-O-acetil-α-
L-ramnopiranosídeo) (kalambrosídeo A)
COSTA et al., 1994
5
Patuletina 3-O-α-L-ramnopiranosil-7-O-(2"'-O-acetil-α-L-
ramnopiranosídeo) (kalambrosídeo B)
COSTA et al., 1994
6
Patuletina 3-O-(4"-O-acetil-α-L-ramnopiranosil)-7-O-
ramnopiranosídeo (kalambrosídeo C)
COSTA et al., 1994
7
Patuletina 3-O-(4"-O-acetil-α-L-ramnopiranosil)- 7-O-(3"'-O-acetil-α-
L-ramnopiranosídeo)
COSTA et al., 1994
8
Patuletina 3-O-α-L-ramnopiranosil-7-O-(3"'-O-acetil-α-L-
ramnopiranosídeo)
COSTA et al., 1994
9 Quercetina 3-O-α-L-ramnopiranosídeo (Quercitrina)
ROSSI-BERGMANN et
al., 1997
10
Quercetina 3-O-β-D-glicopiranosídeo (Isoquercitrina)
ROSSI-BERGMANN et
al., 1997
Kalanchoe prolifera
1
Quercetina 3-O-glicopiranosil-(1→2)-xilopiranosídeo
DEMETZOS et al.,
1994
Kalanchoe streptantha
1
Kaempferol 3-O-β-D-xilopiranosil-(1→2)- α -L-ramnopiranosídeo-7-
O- α -L-ramnopiranosídeo (Sagittatin A)
COSTA et al., 1996
2
Kaempferol 3-O-β-D-xilopiranosil-(1→2)- α -L-ramnopiranosídeo-7-
O- 4""-O-acetil- α -L-ramnopiranosídeo
COSTA et al., 1996
Kalanchoe fedtschenkoi
1
Kaempferol 3-O-β-D-xilopiranosil-(1→2)-O- α -L-ramnopiranosídeo
CASTRICINI, 2004
2
Kaempferol 3-O-β-D-xilopiranosil-(1→2)-O- α -L-ramnopiranosídeo-
7-O- α -L-ramnopiranosídeo
CASTRICINI, 2004
3
Kaempferol 3-O-β-D-glicopiranosídeo-7-O- α -L-ramnopiranosídeo
CASTRICINI, 2004
Kalanchoe blossfeldiana
1 Cianidina 3,5-diglicosídeo LIU et al., 1989
2 Cianidina 3-glicosídeo LIU et al., 1989
3 Pelargonidina 3,5-diglicosídeo LIU et al., 1989
4 Leucocianidina LIU et al., 1989
5
quercetina 3-O- β -D-glicopiranosídeo
NIELSEN et al., 2005
6
quercetina 3-O-(2’’-O- β -D-glicopiranosil- α -L-ramnopiranosídeo)
NIELSEN et al., 2005
7
quercetina 3-O-(2’’-O- α -L-arabinopiranosil- α -L-ramnopiranosídeo) NIELSEN et al., 2005
8
quercetina 3-O-(2’'-O-β-D-xilopiranosil- α -L- ramnopiranosídeo)
NIELSEN et al., 2005
9
kaempferol 3-O-(2’’-O-β-D-glicopiranosil- α -L- ramnopiranosídeo)
NIELSEN et al., 2005
10
kaempferol 3-O-(2’’-O- α -L-arabinopiranosil- α -L-
ramnopiranosídeo)
NIELSEN et al., 2005
11
kaempferol 3-O-(2’'-O-β-D-xilopiranosil- α -L- ramnopiranosídeo)
NIELSEN et al., 2005
12
Peonidina 3,5-diglicosídeo NIELSEN et al., 2005
13
Delfinidina 3,5-diglicosídeo NIELSEN et al., 2005
14
Petunidina 3,5-diglicosídeo NIELSEN et al., 2005
15
Malvidina 3,5-diglicosídeo NIELSEN et al., 2005
Kalanchoe daigremontiana
1 Kaempferol-cumaroilarabinosídeo (Bryophyllosídeo)
GAIND & GUPTA,
1973
Kalanchoe laxiflora
1 Kaempferol
GAIND & GUPTA,
1973
2 Quercetina
GAIND & GUPTA,
1973
Tabela 6: Flavonóides isolados do gênero Kalanchoe e suas respectivas atividades
biológicas
Flavonóides Atividade Biológica REFERÊNCIAS
Glicosídeos
1
Quercetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo
(Quercitrina)
Antiinflamatória PATHAK et al., 1991
2
Quercetina-3-O-arabinopiranosil-(1→2)-
ramnopiranosídeo
Antialérgica
ICHIKAWA et al.,
1986
3
Quercetina-3-O-ramnopiranosil-(1→6)-
glicopiranosídeo (Rutina)
Antiinflamatória,
Antiulcera,
Antibacteriana,
Analgésica
ROTELLI et al.,
2003; BORRELLI &
IZZO, 2000; PATHAK
et al., 1991
4
Quercetina-3-O-α-L-glicopiranosídeo
(Isoquercitrina)
Antibacteriana
PATHAK et al., 1991
Acil-glicosídeos
5
Patuletina-3-O-(4"-O-acetil- α -L-
ramnopiranosil)- 7-O-(3"'-O-acetil- α -L-
ramnopiranosídeo)
Imunomoduladora
COSTA et al., 1994
6
Patuletina-3-O-(4"-O-acetil- α -L-
ramnopiranosil)- 7-O-(2"'-O-acetil- α -L-
ramnopiranosídeo)
Imunomoduladora COSTA et al., 1994
7
Patuletina-3-O- α -L-ramnopiranosil-7-
O-(2"'-O-acetil- α -L-ramnopiranosídeo)
(kalambrosídeo B)
Imunomoduladora COSTA et al., 1994
Agliconas
8 Eupafolina
Citotóxica em células KB,
Antiepatotóxica
OLIVEIRA et al.,
2001
9 Kaempferol
Antiulcera, Antiinflamatória,
Antibacteriana, Antialérgica
BORRELLI & IZZO,
2000; PATHAK et al.,
1991
10 Leucocianidina Antiulcera LEWIS et al., 1999
11 Luteolina
Antiinflamatória,
Antiepatotóxica,
Antialérgica
PATHAK et al., 1991.
12 Quercetina
Antiinflamatória,
Antiulcera, Antialérgica,
Antiepatotóxica,
Antibacteriana
MORIKAWA et al.,
2003; BORRELLI &
IZZO, 2000; PATHAK
et al., 1991
Flavonas
13
5,7,4’-triidroxi-6,3’-dimetoxi-flavona
(Jaceosidina)
Antiinflamatória,
antibacteriana
PELZER et al., 1998;
PATHAK et al., 1991
Observando a Tabela 5 é possível notar que grande parte dos flavonóis relatados para
o gênero Kalanchoe são glicosídeos de kaempferol, patuletina e quercetina. Essas agliconas
pertencem à classe dos flavonóis, que portanto é o subtipo de flavonóide preponderante no
gênero.
Na espécie K. pinnata a classe dos flavonóis predomina e especificamente é a aglicona
quercetina a mais comum. Glicosídeos de quercetina também foram encontrados em K.
blossfeldiana, K. prolifera, K. spathulata, K. gracilis e K. brasiliensis.
Conforme pode ser verificado na Tabela 6, dentre os glicosídeos simples são os que
possuem quercetina como aglicona aqueles que apresentam maior potencial de atividade
biológica.
ESTUDO PRÉVIO DA ATIVIDADE DE Kalanchoe pinnata NA LEISHMANIOSE
A equipe coordenada pela Profa Sônia S. Costa e Profa Bartira Rossi-Bergmann, da
qual faço parte, iniciou o estudo da atividade de Kalanchoe pinnata na leishmaniose há
alguns anos e muito tem contribuído para que o uso desta planta no tratamento da
leishmaniose se torne futuramente uma realidade. Ao longo deste trabalho, serão utilizadas
as letras KP para designar Kalanchoe pinnata.
Efeito terapêutico do extrato de KP na leishmaniose cutânea
murina (DA-SILVA et al, 1995).
Inicialmente, o extrato aquoso das folhas de KP foi avaliado num modelo murino de
leishmaniose cutânea onde foi observado que KP protege camundongos contra uma infecção
progressiva por L. amazonensis e que a via oral é tão eficaz quanto o tratamento parenteral
com Glucantime (Figura 5). A carga parasitária nestas lesões foi medida quantitativamente,
mostrando que a diminuição do tamanho das lesões não era devida simplesmente ao
possível efeito antiinflamatório de KP, mas sim à destruição dos parasitas. É importante
ressaltar que, em outros experimentos, a via oral de administração do KP mostrou-se
superior à via tópica e à endovenosa, sugerindo que metabólitos ativos são gerados no trato
gastrintestinal.
Figura 12: Eficácia do tratamento oral com Kp em comparação com Glucantime
parenteral: Camundongos BALB/c foram infectados na pata traseira com 4x10
6
promastigotas de L. amazonensis. Os tratamentos com o extrato de Kp (8 mg) por via oral
diariamente ou Glucantime (8mg) ip em dias alternados, foram iniciados após 7 dias de
infecção. As lesões foram medidas 2 vezes por semana. (x ± SE, n=5 a 6). Da-Silva et al
(1995) Acta Tropica 60:201-210.
O efeito antileishmania de KP é mediado por intermediários de
óxido nítrico (DA-SILVA et al., 1999).
Os macrófagos possuem uma função central na leishmaniose, onde são importantes
não só como os hospedeiros dos parasitas, mas também como células reguladoras da
resposta imune, sendo excelentes apresentadoras de antígenos às células T específicas. A
ativação dos macrófagos desencadeia a produção de óxido nítrico (NO), que é um
importante mecanismo de destruição dos parasitos intracelulares principalmente no que se
refere a Leishmania. O mecanismo de ação microbicida do NO envolve vários alvos celulares
tais como a inibição do processo respiratório mitocondrial e do sistema de transporte nas
membranas, a oxidação de proteínas e a indução de alterações no DNA conduzindo a
apoptose (FLORA-FILHO & ZILBERSTEIN et al., 2000; DUSSE et al., 2003).
O efeito do extrato do KP nos parasitas e na ativação dos macrófagos foi investigado,
mais especificamente na produção de NO, para determinar se a proteção contra a doença é
direta sobre os parasitas ou envolve mecanismos indiretos. Macrófagos foram tratados com
extrato de KP antes e depois da infecção com Leishmania amazonensis para avaliação das
amastigotas intracelulares. Observou-se uma inibição do crescimento intracelular dos
parasitas.
Para investigar se o decréscimo no crescimento intracelular das amastigotas foi devido
a uma estimulação da atividade dos macrófagos, a produção de NO foi avaliada. KP foi
administrado antes e depois da infecção e observou-se um aumento significativo na
produção de NO. Este resultado indica que a ativação da produção de NO pelos macrófagos
pode ser responsável pela redução no crescimento do parasita na presença de KP.
Para avaliar a importância deste mecanismo no efeito terapêutico de KP na
leishmaniose, associou-se ao tratamento com KP uma droga inibidora da enzima NO
sintase, a N-monometil L-arginina. Tanto os resultados in vitro como os experimentos com
os animais infectados mostraram que, na incapacidade de produzir NO, o KP perde toda sua
eficácia em inibir os parasitas, confirmando que seu mecanismo de ação está associado à
indução da produção de NO, um potente agente leishmanicida produzido pelos macrófagos.
Em experimentos usando a forma livre do parasita, promastigota, não se observou efeito
inibitório do KP.
O efeito antileishmania de KP foi evidenciado em um relato de caso clínico
(TORRES-SANTOS et al., 2003).
Este estudo foi realizado em um paciente que havia contraído a leishmaniose cutânea
durante seu serviço como oficial do Exército na Amazônia. Este paciente recebeu
voluntariamente tratamento oral com KP pelo período de 14 dias. Este tratamento consistiu
na ingestão de 15 g de folhas de KP trituradas, duas vezes ao dia (aproximadamente 10 mg
de extrato seco/Kg peso corporal). A lesão que crescia exponencialmente,
surpreendentemente estancou e permaneceu estável, chegando a diminuir 2 mm durante os
14 dias de tratamento. Com a suspensão do KP oral, a lesão voltou a crescer e o paciente
foi então submetido às injeções diárias convencionais de Glucantime®. Foram necessárias
duas séries de 20 dias de injeções intramusculares e endovenosas para que o paciente se
curasse, ressaltando a severidade do caso.
Através desse estudo foi possível verificar que a eficácia de KP não é restrita a
leishmaniose murina, e que pode ser estendida à leishmaniose humana. O
acompanhamento dos níveis plasmáticos das enzimas séricas mostrou que não houve
nenhuma alteração indicativa de toxicidade hepática, renal ou cardíaca durante o
tratamento.
RELEVÂNCIA DO PRESENTE ESTUDO
Com um número crescente de casos no país não somente nas zonas rurais, mas
também nos centros urbanos (35.000 casos registrados em 2000), a leishmaniose hoje
representa um grande problema de saúde pública no Brasil. A leishmaniose tegumentar
embora não seja fatal induz grande morbidade, comprometendo a atividade econômica e
social de muitas famílias. Além disso o custo do tratamento, totalmente fornecido pelo
sistema público de saúde, é elevado. Os antimoniais pentavalentes são a primeira escolha
terapêutica, sendo administrados através de injeções diárias e promovendo diversos efeitos
indesejáveis, que podem comprometer a adesão do paciente ao tratamento. Seus efeitos
tóxicos tais como nefro, hepato e cardiotoxicidades tornam o tratamento ainda mais
complicado.
Estudos conduzidos por diversos grupos no mundo tentam encontrar alternativas
eficazes para o tratamento das leishmanioses com um mínimo de efeitos tóxicos e
diminuição de custos. O grupo multidisciplinar do qual faço parte desenvolve há vários anos
estudos com a planta Kalanchoe pinnata. Foi demonstrado que seu extrato é eficiente no
tratamento da leishmaniose experimental murina quando administrado pela via oral. O
estudo piloto envolvendo um caso clínico de leishmaniose tegumentar mostrou que o
tratamento impede o crescimento da lesão sem qualquer efeito tóxico, sinalizando o
potencial dessa espécie vegetal para a terapia da leishmaniose.
Os resultados obtidos durante o desenvolvimento da fase atual deste projeto
contribuirão para que o uso do extrato aquoso de KP no tratamento clínico da leishmaniose
se torne uma realidade. A terapia usando um medicamento administrado por via oral e sem
efeitos indesejáveis facilita a aceitação do tratamento pelo paciente, além de reduzir os
gastos operacionais.
EQUIPE ENVOLVIDA NO PROJETO
Por se tratar de um projeto multidisciplinar, alguns grupos contribuíram para os
resultados apresentados nesta tese (Tabela 7). A parte química do projeto foi por mim
realizada no NPPN, durante o período do doutorado, sob a orientação da Profa Sônia S.
Costa. Pude atuar também no desenvolvimento dos experimentos referentes à atividade
antileishmania in vitro e in vivo, realizados no Laboratório de Imunofarmacologia (IBCCF),
sob orientação da Profa Bartira Rossi-Bergmann.
Durante o período do meu doutorado, tive a oportunidade de realizar 6 meses de
estágio PDEE-CAPES na Universidade de Florença-Itália, sob orientação do Prof Franco F.
Vincieri. Neste período pude analisar as amostras obtidas durante o meu doutorado através
da técnica hifenada de CLAE-EM.
Tabela 7: Equipe participante deste projeto
Chefe de equipe/Unidade Atuação
Profa. Sônia Soares Costa
Laboratório de Química de Produtos Naturais Bioativos
Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, UFRJ
Fitoquímica: Extração; isolamento;
purificação e determinação estrutural de
substâncias bioativas.
Profa. Bartira Rossi-Bergmann
Laboratório de Imunofarmacologia
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ
Imunofarmacologia: Leishmaniose in vitro
e in vivo; Modulação da resposta imune.
Prof. Celso Luiz Salgueiro Lage
Laboratório de Fisiologia Vegetal
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ
Biotecnologia vegetal: Micropropagação
de mudas monoclonais; optimização das
condições de crescimento vegetal.
Prof. Carlos Roland Kaiser
Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear
INSTITUTO DE QUÍMICA, UFRJ
Profa. Luzineide Wanderley Tinoco
Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear
Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, UFRJ
Ressonância Magnética Nuclear: Análises
por espectroscopia de amostras obtidas
no estudo químico.
Profa. Catherine Guette
SONAS UFR Sciences Pharmaceutiques et
Ingénierie de la Santé – França
Espectrometria de Massas: Análises de
amostras obtidas no estudo químico.
Prof. Franco Francesco Vincieri
Dipartimento di Schienze Farmaceutiche
Universidade de Florença (UNIFI), Itália
CLAE-UV-EM: Análise dos extratos das
diferentes condições de cultivo e de
metabólitos em plasma de animais
tratados.
OBJETIVO GERAL
9 Dar continuidade ao estudo da atividade antileishmania de Kalanchoe pinnata visando o
desenvolvimento de um medicamento fitoterápico, que possa ser usado por via oral no
tratamento clínico da leishmaniose humana.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
9 Isolar, a partir do extrato aquoso de folhas de Kalanchoe pinnata, as frações e
componentes responsáveis pela atividade antileishmania em L. amazonensis.
9 Determinar a estrutura química das substâncias bioativas.
9 Avaliar a atividade das substâncias bioativas em experimento in vivo.
9 Avaliar possíveis variações no perfil químico do extrato de Kalanchoe pinnata em
decorrência da incidência de luz solar e da coleta em diferentes estações do ano.
9 Micropropagar um indivíduo ativo de K. pinnata visando obter indivíduos monoclonais
para minimizar as variações individuais da planta e otimizar a produção de extrato ativo.
9 Estudar o metabolismo do extrato aquoso de K. pinnata e das suas substâncias ativas
em camundongos BALB/c.
PARTE QUÍMICA
TÉCNICAS GERAIS
As cromatografias em fase inversa foram realizadas em sílica silanizada RP-2 (70-230
mesh) ou RP-18 (40-63 µM, Merck) e as cromatografias por exclusão molecular foram
realizadas em gel Sephadex G-15-120 (40-120 µM, Sigma).
O fracionamento em colunas cromatográficas foi monitorado por cromatografia em
camada delgada (CCD) utilizando Silica 60 F
254
(Merck) e n-butanol/ácido acético/água
(BAW 8:1:1) e acetato de etila/acetona/ácido acético/água (AAAA 30:3:1:1) como eluentes.
Os cromatogramas foram visualizados sob luz ultravioleta (UV; 254 nm e 365 nm) e
revelados com solução de sulfato cérico para detecção de manchas características para
flavonóides (sulfato cérico positivo) ou Dragendorff para detecção de manchas
características de alcalóides (Dragendorff positivo).
Os desvios de rotação óptica [α]
D
25
das substâncias isoladas foram medidos em um
polarímetro Perkin-Elmer 243B.
Os pontos de fusão foram medidos em um aparelho do tipo Kofler (Bausch e Lomb –
Rochester).
Os espectros de RMN (Ressonância Magnética Nuclear) de
1
H e
13
C, utilizando como
solvente DMSO-d
6
, D
2
O e CD
3
OD, foram obtidos nos seguintes espectrômetros utilizando
sonda de detecção inversa:
9 Bruker DRX-400 (
1
H: 400,13 MHz;
13
C: 100,61 MHz) – Centro Nacional de
Ressonância Magnética Nuclear-UFRJ;
9 Bruker DRX-300 (
1
H: 300,13 MHz;
13
C: 75,48 MHz) – Instituto de Química-
UFRJ;
9 Bruker AC200A (
1
H: 200 MHz;
13
C: 50 MHz) – Instituto de Química-UFRJ;
9 Varian Gemini 200 (
1
H: 200 MHz;
13
C: 50 MHz) – NPPN-UFRJ.
As análises de Espectrometria de Massas MALDI e MALDI de Alta Resolução foram
realizadas em espectrômetro Biflex III (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA) em modo de
reflexão, IS1: 19 kV, IS2: 16.5 kV, reflector: 20 kV. Matriz: ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico
(HCCA, Aldrich, Milwaukee, WI). Nestas análises, as amostras foram diluídas em H
2
O/MeOH
(1:1) (1µg/ml). Alíquotas de 0,5 µl da amostra e da matriz foram utilizadas. O espectro foi
calibrado internamente utilizando os picos da matriz (SONAS UFR Sciences Pharmaceutiques
et Ingénierie de la Santé – França).
EXTRAÇÃO
E FRACIONAMENTO
Procedência do material vegetal
A espécie Kalanchoe pinnata (KP) foi cultivada em escala-piloto no jardim que o grupo
responsável pelo projeto mantinha no Centro de Ciências da Saúde (UFRJ). KP foi cultivada
em canteiros ao sol e à sombra com objetivo de avaliar aspectos relacionados às condições
de cultivo. Sua exsicata, sob número 29709, encontra-se depositada no herbário do
Departamento de Botânica do Instituto de Biologia - UFRJ.
Preparo do Extrato Aquoso
As folhas coletadas foram lavadas em água corrente e depois rinsadas com água
destilada. Após secagem da água da superfície das folhas, em temperatura ambiente, elas
foram picadas e trituradas em liquidificador com água suficiente para obter concentração de
20% p/v (20 g de folhas para 100 ml de água destilada).
A preparação obtida foi aquecida durante 30 minutos, em temperatura controlada de
50—55ºC. Então o extrato foi obtido por filtração em algodão e por último papel de filtro,
até obtenção de uma solução translúcida, que então foi submetida ao processo de
liofilização para secagem.
Preparo do Sumo
As folhas coletadas foram lavadas em água corrente e depois rinsadas com água
destilada. Após secagem da água da superfície das folhas, em temperatura ambiente, elas
foram picadas e trituradas em liquidificador.
Então o sumo foi obtido por filtração em algodão e por último papel de filtro, até
obtenção de uma solução translúcida.
Precipitação com etanol
A fim de separar as macromoléculas, e realizar uma primeira separação, foi feita uma
precipitação com etanol dos extratos na proporção de 1:1. A precipitação com etanol
permite a separação de polímeros, como os polissacarídeos e as proteínas, dos
micrometabólitos. Isso porque a adição de etanol no meio aquoso muda a solvatação entre
as moléculas e, conseqüentemente, a interação entre elas. Os polímeros são encontrados
no precipitado e os micrometabólitos,, no sobrenadante (SCHMOURLO et al., 2005).
Após a precipitação, o sobrenadante foi separado do precipitado por filtração. O
precipitado, retomado em água, e o sobrenadante, após evaporação do etanol, foram
liofilizados e quantificados.
Fracionamento químico do extrato aquoso de KP: obtenção de F1, F2 e F3
Alguns fatores nos levaram a optar pela realização de uma marcha de extração de
alcalóides como primeira etapa da purificação do sobrenadante:
9 Certos alcalóides possuem atividade antileishmania (CARVALHO & FERREIRA,
2001).
9 O gênero Sedum, também da família Crassulaceae, possui alcalóides descritos
na literatura (KIM et al., 1996).
Descrição do procedimento de extração química:
1- A amostra aquosa é acidificada com HCl P.A. até uma concentração de 2% p/v
deste ácido na amostra. Desta maneira os alcalóides presentes tomam a forma de sais
solúveis em água.
2- A amostra acidificada é extraída com diclorometano. A fração orgânica (F1) é
reservada e a aquosa, contendo os alcalóides, é alcalinizada usando NaOH 10N, até pH 11.
A alcalinização retorna os alcalóides à sua forma de amina, fazendo com que tenham,
agora, mais afinidade pelo diclorometano, do que pela água.
3- Extração com diclorometano da fração aquosa alcalina.
4- A fração aquosa é reservada, enquanto que a fração em diclorometano (F2) é
evaporada e quantificada.
Posteriormente, de forma a isolar os flavonóides presentes na fração aquosa final, esta
foi neutralizada, utilizando HCl P.A., e extraída com acetato de etila. A partição utilizando
acetato de etila permite separar moléculas de média polaridade, como por exemplo,
flavonóides, terpenos e cumarinas. Os carboidratos, ácidos aminados e taninos, por
exemplo, serão encontrados na fase aquosa residual (FALKENBERG et al., 2004).
O extrato e frações tiveram sua atividade antileishmania avaliada in vitro, em
amastigotas intracelulares de L. amazonensis. O perfil químico das frações obtidas durante
a purificação do extrato aquoso foi avaliado utilizando a técnica de Ressonância Magnética
Nuclear de
1
H (Resultados e Discussão).
F
F
L
L
U
U
X
X
O
O
G
G
R
R
A
A
M
M
A
A
1
1
:
:
F
F
R
R
A
A
C
C
I
I
O
O
N
N
A
A
M
M
E
E
N
N
T
T
O
O
Q
Q
U
U
Í
Í
M
M
I
I
C
C
O
O
D
D
O
O
E
E
X
X
T
T
R
R
A
A
T
T
O
O
A
A
Q
Q
U
U
O
O
S
S
O
O
D
D
E
E
K
K
P
P
–
–
O
O
B
B
T
T
E
E
N
N
Ç
Ç
Ã
Ã
O
O
D
D
E
E
F
F
1
1
,
,
F
F
2
2
E
E
F
F
3
3
.
.
1) HCl
2) Extração com CH
2
Cl
2
1) Neutralização
2) Extração com ACOEt
Fase aquosa 3
Fase AcOEt
F3
1) NaOH até pH 11
2) Extração com CH
2
Cl
2
Sobrenadante
Fase CH
2
Cl
2
F1
Fase aquosa 1
Fase CH
2
Cl
2
F2
Fase aquosa 2
Extrato aquoso
de KP
Precipitado
1
)
Preci
p
it
ação
c
o
m Et
a
n
o
l
Rendimentos obtidos para as extrações
Para permitir a purificação e a caracterização das frações obtidas pelo processo de extração
de alcalóides, oito partidas de extratos foram precipitadas com etanol e o sobrenadante
submetido ao processo de extração já descrito.
Fluxograma 2: Resumo das massas obtidas de F1, F2 e F3 após as
extrações
Erro!
OBS: Não foi possível quantificar a Fração Aquosa devido a presença de NaCl resultante da
acidificação seguida de alcalinização no processo de extração de alcalóides.
Purificação da F3
O material seco, rico em flavonóides, foi purificado através de coluna de sílica de
fase inversa do tipo RP-2. A única fração enriquecida em flavonóides resultante desta
primeira coluna cromatográfica foi então purificada em coluna de sílica de fase inversa RP-
18.
O segundo conjunto obtido desta última coluna, enriquecido em dois flavonóides, foi
purificado em coluna de gel Sephadex G-15, resultando no isolamento dos flavonóides KP1
e KP2. A segunda fração da coluna de sílica de fase inversa RP-18, majoritária em massa,
forneceu por cristalização espontânea durante a evaporação do solvente o flavonóide KP4.
Esta fração, após separação de KP4, foi purificada em coluna de gel Sephadex G-15
resultando no isolamento de KP5 e de massa adicional de KP1. A última fração obtida a
F1
415,7 mg
F2
121,4 mg
F3
1083,1 mg
Extrato seco
146 g
KP
Folhas frescas
6,764 Kg
partir desta coluna foi novamente purificada em coluna de gel Sephadex G-15 resultando no
isolamento de KP4 e de maior massa de KP2.
Fluxograma 3: Purificação de F3 – obtenção dos flavonóides KP1 e KP2
Fluxograma 4: Continuação da Purificação de F3 – obtenção dos flavonóides KP1, KP2, KP3,
KP4 e KP5
C2c 1
m=113,5 mg
C2c2
m=78,5 mg
C2c 3
m= 5,2 mg
C2c 4
m= 37,1 mg
C2c 4-1
m=30,8 mg
C2c 4-2
m= 3,2 mg
C2c
m= 205,6 mg
Sephadex G-15 (H
2
O)
Sephadex G-15 (H
2
O)
Precipitação durante a evaporação
KP1 KP3
KP2 KP4
C2c sol
m=201,6 mg
C2c insol
m= 4,0 mg
KP5
F3
m= 1067mg
C1
m= 354,9 mg
C3
m= 215,0 mg
Sílica RP-18 (H
2
O/MeOH)
C2b
m=51,0 mg
C2c
m= 205,6 mg
C2b I
m=40,5 mg
C2b II
m= 10,0 mg
Sephadex G-15 (H
2
O)
C2d
m= 90,8 mg
C2a
m= 147,1 mg
C2
m=496,7 mg
KP2
Sílica RP-2 (H
2
O/MeOH)
KP1
Informações relativas às colunas cromatográficas:
Tabela 8: Purificação do conjunto F3
Coluna cromatográfica 1: Sílica Gel RP-2 (29,0 x 2,2 cm; gradiente H
2
O/MeOH)
Massa de F3: 1,067 mg
Conjuntos Gradiente de Eluição Volume (ml) Massa (mg)
F3-C1 0:10 – 3:7 MeOH/H
2
O 500
354,9
F3-C2 3:7 – 5:5 MeOH/H
2
O 300 496,7
F3-C3 5:5 – 10:0 MeOH/H
2
O 600 215,0
Tabela 9: Purificação do conjunto F3-C2
Coluna cromatográfica 2: Sílica Gel RP-18 (32,0 x 2,5 cm; gradiente H
2
O/EtOH)
Massa de F3-C2: 496,7 mg
Conjuntos Gradiente de Eluição Volume (ml) Massa (mg)
F3-C2a 0:10 – 1:9 EtOH/H
2
O 300
147,1
F3-C2b 1:9 – 3:7 EtOH/H
2
O 230 51,0
F3-C2c 3:7 – 5:5 EtOH/H
2
O 320 205,6
F3-C2d 5:5 – 10:0 EtOH/H
2
O 500 90,8
Tabela 10: Purificação do conjunto F3-C2b: obtenção de KP1 e KP2
Coluna cromatográfica 3: Sephadex G-15-120 (31,0 x 0,8 cm; H
2
O)
Massa de F3-C2b: 51,0 mg
Conjuntos Gradiente de Eluição Volume (ml) Massa (mg)
F3-C2bI H
2
O 120
40,5
F3-C2bII H
2
O 50 10,0
Tabela 11: Purificação do conjunto F3-C2c: obtenção de KP1, KP2, KP3, KP4 e KP5
Coluna cromatográfica 4: Sephadex G-15-120 (31,0 x 0,8 cm; H
2
O)
Massa de F3-C2c: 205,6 mg
Conjuntos Gradiente de Eluição Volume (ml) Massa (mg)
F3-C2c 1 H
2
O 160
113,5
F3-C2c 2 H
2
O 135 78,5
F3-C2c 3 H
2
O 15 5,2
F3-C2c 4 H
2
O 90 37,1
Tabela 12: Purificação do conjunto F3-C2c 4 - obtenção de KP4 e KP2
Coluna cromatográfica 4: Sephadex G-15-120 (31,0 x 0,8 cm; H
2
O)
Massa de F3-C2c 4: 37,1 mg
Conjuntos Gradiente de Eluição Volume (ml) Massa (mg)
F3-C2c 4 I H
2
O 120
30,8
F3-C2c 4 II H
2
O 60 3,2
Massas dos flavonóides isolados:
KP1 – 110,0 mg
KP2 – 40,8 mg
KP3 – 5,2 mg
KP4 – 3,2 mg
KP5 – 4,0 mg
METODOLOGIA DAS ANÁLISES POR CLAE
As análises de CLAE-UV-EM foram executadas em instrumento HP 1100L com detector
“Diode Array” e controladas por uma estação de trabalho HP 9000 (Hewlett & Packard, Palo
Alto, CA, EUA). Utilizou-se uma coluna de fase inversa RP-18 (5 µm, 250 mm, 0.5 mm d.i.,
Luna, Phenomenex, USA) mantida a 30ºC.
Os espectros do UV-Vis foram registrados na escala de 200-450 nm. O sistema do
CLAE foi acoplado a um espectrômetro de massas HP 1100 MSD API-ESI (atmospheric
pressure ionization-electrospray) (Hewlett & Packard, Palo Alto, CA, USA). Os espectros de
massas foram registrados na modalidade íon-negativa. A temperatura capilar era de 220ºC,
a tensão do capilar de 3.0 V, a tensão da fonte de 4.2 kV, a tensão das lentes do tubo de 30
V e a energia de colisão de 35%.
Análise das amostras de extrato:
Os eluentes utilizados foram: A- H
2
O com pH 3.2 ajustado por HCOOH e B-
Acetonitrila. O seguinte gradiente de solvente foi aplicado: 100% de A e 0% de B a 80% de
A e 20% de B em 10 minutos; 80% de A e 20% de B a 78% de A e 22% de B em 10
minutos; 78% de A e 22% de B a 75% de A e 25% de B em 15 minutos; 75% de A e 25%
de B a 70% de A e 30% de B em 5 minutos; resultando em 40 minutos como tempo total
de análise. O fluxo de eluição foi de 1 ml/min, 10 µl das amostras foram injetados.
Tabela 13: Gradiente de solventes utilizado na análise dos extratos por CLAE
Tempo (minutos) Solvente A (%) Solvente B (%)
0 100 0
10 80 20
20 78 22
35 75 25
40 70 30
MÉTODO DE EXTRAÇÃO E ANÁLISE DO PLASMA DOS CAMUNDONGOS
(Adaptado de Wang & Morris, 2005; Paganga & Rice-Evans, 1997 e Manach et al.,
1996).
Fluxograma 5: Método de extração das amostras de plasma de camundongos
tratados com extrato e flavonóides de KP
Método de CLAE para análise das amostras de plasma dos camundongos:
Os eluentes utilizados foram: A- H
2
O com pH 3.2 ajustado por HCOOH e B-
Acetonitrila. Os gradientes de solvente utilizados nos experimentos 1 e 2 encontram-se
descritos nas tabelas abaixo. O fluxo de eluição foi de 1 ml/min, 70 µl das amostras foram
injetados. Todos os outros itens são idênticos ao método de CLAE descrito anteriormente.
Segundo Wang & Morris (2005), o modo se ionização ESI é o que permite obter maior
sensibilidade para detecção de quercetina e seus metabólitos. Os autores também
demonstraram que o modo de ionização negativo permite melhor quantificação desses
Precipitado Sobrenadante
Amostra para CLAE
(volume 500 µl)
CLAE
(1) pH 5.0 usando HCOOH
(2) 2400 µl de MeOH
(3) Centrifugação
(1) Redução de
volume
600 µl de plasma
metabólitos. Desta forma, o método utilizado no presente trabalho nas análises das
amostras de plasma é o mais indicado.
Tabela 14: Gradiente de solventes utilizado na análise por CLAE dos plasmas dos
camundongos - Experimento 1
Tempo (minutos) Solvente A (%) Solvente B (%)
0 100 0
10 80 20
15 75 25
20 70 30
30 50 50
45 0 100
Tabela 15: Gradiente de solventes utilizado na análise por CLAE dos plasmas dos
camundongos - Experimento 2
Tempo (minutos) Solvente A (%) Solvente B (%)
0 100 0
10 80 20
15 75 30
20 70 40
35 50 50
48 0 100
PARTE BIOLÓGICA
GERAL
Obtenção da Leishmania amazonensis-GFP
Foram usadas promastigotas fluorescentes de Leishmania amazonensis da cepa Josefa
(designação MHOM/BR/75/Josefa) isoladas originalmente de um caso clínico de
leishmaniose cutânea humana (cedida pelo Dr. C. A. Cuba – Cuba). As promastigotas foram
transfectadas por eletroporação com plasmídeo pXG contendo os genes da Green Fluorescet
Protein (GFP), ligado à porção C-terminal de cisteíno protease, e de resistência à
Geneticina. Posteriormente, as leishmanias transfectadas foram rotineiramente selecionadas
em meio de cultura 199 (Sigma Chemical Co.) suplementado com Geneticina 100µg/ml,
HEPES (Sigma Chemical Co.) a 20 mM e 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor -
HIFCS (Cultilab), mantido à 27°C.
Animais
Camundongos BALB/c foram mantidos com água e maravalha autoclavadas e ração
comercial. Os camundongos foram utilizados com idade aproximada de 2 meses nos
experimentos de infecção e tratamento in vivo, e acima de três meses, na infecção de
macrófagos peritoneais in vitro. Este trabalho está de acordo com as normas institucionais
relacionadas ao uso de modelos envolvendo animais para fins de pesquisa.
Preparação de macrófagos peritoneais para ensaios in vitro
Camundongos BALB/c foram sacrificados por inalação de éter etílico. Com o auxílio de
pinça e tesoura, foi feito um pequeno corte na pele do animal na altura do abdômen e o
peritôneo foi exposto. Com o uso de seringa, foram injetados 5 ml de meio DMEM gelado e,
para o descolamento das células, o animal foi massageado por 5 min. Cerca de 4 ml de
exsudato foram retirados. As células foram contadas em Câmara de Neubauer e distribuídas
em placa de 24 poços a 2 x 10
6
células/poço, em 0,3 ml de meio DMEM+5% HIFCS. A placa
foi mantida em estufa de 37°C/5%CO
2
por 1-2 h para permitir a aderência dos macrófagos.
ENSAIOS IN VITRO
Avaliação de atividade antipromastigota
As substâncias a serem testadas foram diluídas em meio 199 e distribuídas em placa
de 96 poços, em concentrações iniciais de 400 µM (triplicatas), com diluições sucessivas de
1:2 até a concentração final de 3,2 µM, em volumas de 100 µl. Acrescentou-se uma
quantidade fixa de 2 x 10
5
promastigotas/poço, em um volume de 100 µl e 10 % HIFCS.
Com a adição de 100 µl de cultura de leishmania, a concentração ficou reduzida à metade,
sendo a concentração inicial de 200 µM e a final, 1,3 µM. A placa foi incubada a 27 °C por
72 h. Após o período de incubação, o conteúdo dos poços foi transferido para placa negra e
a carga parasitária analisada por fluorimetria. Os resultados foram expressos em unidades
de fluorescência.
Avaliação de atividade antiamastigota
Após o preparo das células, o sobrenadante foi descartado e os macrófagos infectados
com 0,3 ml de cultura de Leishmania amazonensis GFP/poço, com uma taxa de infecção de
5 promastigotas/macrófago, sendo a placa incubada por mais 4 h à 34 °C. As leishmanias
livres foram removidas lavando-se os poços 2 x com PBS morno e as substâncias para teste
foram adicionadas em diferentes concentrações, nunca ultrapassando a concentração
máxima de 1 % de DMSO em cultura. Como controle positivo foi usado o estibogluconato de
sódio (Pentostan ® - Glaxo Wellcome), fármaco utilizado na terapia convencional. Após 72
h a 37 °C / 5 % CO
2
, centrifugou-se a placa por 2 min a 1000 rpm, apenas para baixar
possíveis células soltas. Após a retirada do sobrenadante, as células foram raspadas em 200
µl de água destilada e transferidas para placa negra. A carga parasitária das culturas foi
analisada por fluorimetria no fluorímetro de placa Fluoroskan II ou BioTek. A fluorescência
máxima foi obtida com a leitura de uma cultura infectada e a mínima, com uma cultura de
macrófagos não infectados, a fim de descontar a autofluorescência da cultura.
Atividade citotóxica em células de mamífero
Com o sobrenadante do item anterior, foi feita a análise do teor da enzima Lactato
Desidrogenase (LDH) liberada. Esta é uma enzima citoplasmática que é encontrada no
sobrenadante quando há lise celular, sendo usada como indicativo de morte celular. No
ensaio utilizou-se o kit comercial Doles, modificado para uso em microplaca. O kit usa um
método que tem como princípio uma reação colorimétrica. Para tal, misturou-se 50 µl da
amostra com 100 µl da solução de alumen férrico e substrato, mantendo-a a 37 ºC por 3
min. Após, acrescentou-se 100 µl da solução de NAD e fenasina metasulfato, mantendo-a a
37 ºC por mais 9 min. A leitura foi feita no espectrofotômetro Molecular Devices (E-max,
EUA), no comprimento de onda de 490 nm. Para obtenção de lise máxima utilizou-se Triton
0,1%, e lise mínima, o sobrenadante de uma cultura de macrófagos mantida nas mesmas
condições, sem drogas.
Produção de Óxido Nítrico (NO)
A produção de NO foi estimada, indiretamente, medindo-se a concentração de nitrito.
Os macrófagos plaqueados, foram incubados com as amostras por 48 h. As células foram
mantidas a 37 °C / 5% CO2, em um volume de 500µl. Após este tempo, 100 µl dos
sobrenadantes foram misturados aos 100 µl de reagente de Griess (p-
aminobenzenosulfonamida 1% + diidrocloreto de naftiletilenodiamino 0,1% em 5% de ácido
fosfórico, Sigma Chemical Co.), recém preparado. Após 10 min, a absorbância foi medida no
comprimento de onda de 570 nm no espectrofotômetro Molecular Devices (E-max, EUA). A
concentração de nitrito no sobrenadante foi determinada usando como referência uma curva
de nitrito de sódio decrescida do valor obtido com os aditivos sem células. Foi usado como
controle positivo o estímulo com Interferon gama (IFNγ) a 10 nM.
ENSAIOS IN VIVO
Infecção
Camundongos BALB/c foram infectados na orelha esquerda com 2 x 10
6
promastigotas
de L. amazonensis GFP, em um volume final de 10 µl de PBS. O curso da infecção foi
acompanhado pelo tamanho da lesão medido com paquímetro (Mitutoyo, Brasil) a cada 3-4
dias. A lesão foi calculada pela diferença entre a orelha infectada e a não infectada. A carga
parasitária foi avaliada por fluorimetria no macerado das lesões diluído em PBS. Foi utilizado
o fluorímetro de placa BioTek no comprimento de onda de excitação de 435 nm e emissão
de 538 nm. A leitura da orelha não infectada era usada como valor de auto-fluorescência e
descontada dos resultados.
Tratamento in vivo
O esquema de tratamento se iniciou no dia 7 após infecção, utilizando a via oral de
administração, por gavagem intragástrica. Doses de 8 mg/animal/dia em 200 µl de água
destilada foram administradas no caso do grupo tratado com extrato e doses de 0,4
mg/animal/dia foram administradas aos grupos tratados com as substâncias puras. Animais
tratados com água destilada foram utilizados como grupo controle. O tratamento prosseguiu
até o dia 37 de infecção e as lesões foram acompanhadas até o dia 68 de infecção. Nesse
dia, os animais foram sacrificados e a carga parasitária quantificada por fluorimetria
conforme descrito acima.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram analisados pelo método Oneway Anova com pós teste Tukey. Os
resultados descritos como significativamente diferentes tiveram p ≤ 0,05.
FRACIONAMENTO DO EXTRATO DE K. pinnata GUIADO POR ENSAIOS
BIOLÓGICOS E POR RMN DE
1
H
Com o objetivo de conhecer as frações e substâncias responsáveis pela atividade
antileishmania de Kalanchoe pinnata, seu extrato foi submetido a um processo de
fracionamento bioguiado utilizando o modelo in vitro de macrófagos infectados por L.
amazonensis. A metodologia utilizada neste fracionamento e nos ensaios biológicos
encontra-se descrita na parte experimental deste documento.
Este tópico visa apresentar e discutir os resultados biológicos obtidos assim como
fornecer o perfil das frações de KP baseado em RMN de
1
H.
ENSAIOS BIOLÓGICOS
Avaliação da atividade antileishmania do sumo e do extrato aquoso 20% p/v
(50ºC) de KP
Os estudos anteriores relacionados a atividade antileishmania de KP utilizavam a
extração aquosa a 20% (50ºC) como forma de extração (DA-SILVA et al., 1995). Com o
objetivo de verificar se o preparado aquoso na forma de sumo seria igualmente ativo, folhas
de Kp foram coletadas em um mesmo dia e processadas utilizando essas duas metodologias
diferentes.
A Figura 13 mostra que dentre as formas de extração aquosa testadas, sumo e extrato
aquoso 20 % 50ºC, esta última é a que produz o preparado mais ativo e que possui
atividade compatível com a do controle positivo Pentostam
®
. Por este motivo, decidiu-se
utilizar o extrato aquoso 20 % 50ºC na purificação bioguiada, embora o processo de
obtenção do sumo seja mais prático (menor volume final para liofilização).
Atividade antileishmania do
extrato e sumo de KP
Controle Pentostam EA Sumo
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
***
***
**
Carga Parasitária (U.F.)
Figura 13: Inibição do crescimento de amastigotas de L. amazonensis pelo extrato aquoso 20
% - 50ºC (EA) e sumo de Kalanchoe pinnata. O medicamento comercial Pentostam® foi utilizado para
fins de comparação. As amostras foram testadas na concentração de 100 µg/mL diluídas em meio de
cultura. Cultura de macrófagos infectados e não-tratados foi utilizada como controle. A carga
parasitária foi expressa em termos de Unidades de Fluorescência específica, onde o valor de
autofluorescência da cultura de macrófagos não-infectados e não-tratados foi subtraído dos valores
das culturas tratadas. Média aritmética ± desvio padrão (n=3). Significância entre os grupos, P<0,01
(**) e P<0,001 em relação ao controle (***).
Avaliação da atividade antileishmania das frações do Extrato Aquoso de KP:
Precipitado e Sobrenadante
Como mostrado na parte experimental, o extrato aquoso foi precipitado utilizando
etanol na proporção de 1:1 originando duas frações: precipitado (PPT) e sobrenadante (SN).
As frações obtidas após a precipitação do extrato foram testadas e o sobrenadante
mostrou-se mais ativo quando comparado ao precipitado e também ao extrato que lhe deu
origem. Ambas as frações, SN e PPT, foram analisadas utilizando RMN de
1
H, mas apenas o
sobrenadante sofreu nova etapa de purificação, visando isolar as substâncias responsáveis
por sua atividade. Vale a pena ressaltar que o precipitado também apresenta atividade
biológica significativa, podendo também contribuir para a atividade total do extrato aquoso.
Atividade antileishmania do extrato e frações de KP
Controle Pentostam EA SN PPT
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
***
***
***
***
Carga Parasitária (U.F.)
Figura 14: Inibição do crescimento de amastigotas de L. amazonensis pelo extrato aquoso 20
% 50ºC (EA) de Kalanchoe pinnata e suas frações. O medicamento comercial Pentostam® foi utilizado
para fins de comparação e controle. As amostras foram testadas na concentração de 100 µg/mL
diluídas em meio de cultura. Cultura de macrófagos infectados e não-tratados foi utilizada como
controle. A carga parasitária foi expressa em termos de Unidades de Fluorescência específica, onde o
valor de autofluorescência da cultura de macrófagos não-infectados e não-tratados foi subtraído dos
valores das culturas tratadas. Média aritmética ± desvio padrão (n=3). Significância entre os grupos,
P<0,01 (**) e P<0,001 em relação ao controle (***).
Avaliação da atividade antileishmania das frações do Sobrenadante do
Extrato Aquoso de KP
Pelos motivos citados na parte experimental, o sobrenadante foi então submetido a
um processo de extração de alcalóides, seguido por uma extração com acetato de etila,
gerando quatro frações:
F1 – fração em diclorometano 1
F2 – fração em diclorometano 2
F3 – fração em acetato de etila
FA – fração aquosa final
Estas quatro frações foram testadas quanto a atividade antileishmania e quanto a
citotoxicidade em macrófagos. Estes testes foram realizados visando encontrar a fração
mais ativa e mais seletiva para a L. amazonensis, ou seja, aquela que não provoca danos às
células de mamíferos.
Atividade antileishmania das frações de KP
Meio Pentostam SN F1 F2 F3 FA
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
***
***
***
***
***
***
Carga Parasitária (U.F.)
A
Citotoxicidade das frações de KP
Triton Pentostam SN F1 F2 F3 FA
0
25
50
75
100
125
***
***
***
***
***
***
Liberação Específica (% controle)
Figura 15: Inibição do crescimento de amastigotas de L. amazonensis e Citotoxicidade das
frações do sobrenadante do extrato de Kalanchoe pinnata. O medicamento comercial Pentostam® foi
utilizado para fins de comparação e controle. As amostras foram testadas na concentração de 100
µg/mL diluídas em Meio + 0,5% DMSO. Cultura de macrófagos infectados e não-tratados foi utilizada
como controle. A) A carga parasitária foi expressa em termos de Unidades de Fluorescência específica,
onde o valor de autofluorescência da cultura de macrófagos não-infectados e não-tratados foi
subtraído dos valores das culturas tratadas. B) A citotoxicidade foi medida através do percentual de
liberação específica da enzima lactato desidrogenase. Liberação máxima (100%): DO=1,635 e
Liberação espontâea (0%): DO=0,386. Média aritmética ± desvio padrão (n=3). Significância em
relação ao controle (Meio/Triton), P<0,001 (***).
Ao analisar os resultados da Figura 15 constata-se que as três frações orgânicas do
sobrenadante são ativas mas que somente a F3 é seletiva para a Leishmania, não
apresentando citotoxicidade sobre os macrófagos. Esta citotoxicidade está expressa em
percentual de liberação de lactato-desidrogenase, uma enzima intracelular presente em
macrófagos. Esta enzima é liberada em decorrência da lise celular e então dosada no
sobrenadante da cultura de células.
Foi então escolhida a fração F3 para continuar o processo de purificação visto seu
perfil de atividade/citotoxicidade mais próximo ao sobrenadante (SN), fração que lhe deu
origem.
Nesta etapa iniciou-se a purificação utilizando colunas cromatográficas. A fração F3 foi
purificada em coluna de sílica de fase inversa RP-2, conforme parte experimental,
originando duas novas frações: F3-C1 e F3-C2. Estas foram testadas em relação a atividade
antileishmania e a citotoxicidade.
B
Atividade antileishmania das frações de F3
Meio Pentostam F3 F3-C1 F3-C2
0.00
0.50
1.00
1.50
***
***
***
***
Carga Parasitária (U.F.)
Citotoxicidade das frações de KP
Triton Pentostam F3 F3-C1 F3-C2
0
25
50
75
100
125
***
***
***
***
Liberação Específica (% controle)
Figura 16: Inibição do crescimento de amastigotas de L. amazonensis e Citotoxicidade das
frações do extrato de Kalanchoe pinnata. O medicamento comercial Pentostam® foi utilizado para fins
de comparação e controle. As amostras foram testadas na concentração de 100 µg/mL diluídas em
Meio + 0,5% DMSO. A) A carga parasitária foi expressa em termos de Unidades de Fluorescência
específica, onde o valor de autofluorescência da cultura de macrófagos não-infectados e não-tratados
foi subtraído dos valores das culturas tratadas. B) A citotoxicidade foi medida através do percentual
de liberação específica da enzima lactato desidrogenase. Liberação máxima (100%): DO=1,712 e
A
B
Liberação espontânea (0%): DO=0,402. Média aritmética ± desvio padrão (n=3). Significância em
relação ao controle (Meio/Triton), P<0,001 (***).
Ambas sub-frações de F3, F3-C1 e F3-C2, foram ativas no modelo utilizado porém,
apenas F3-C2 apresentou baixa citotoxicidade semelhante a F3, sua fração mãe. Portanto,
apenas F3-C2 foi utilizada para continuar a purificação. As frações F3-C1 e F3-C2 tiveram
seu perfil químico estudado.
As etapas subseqüentes da purificação de F3-C2 encontram-se descritas na parte
experimental. As frações intermediárias após F3-C2 não foram testadas devido aos fatores
apresentados abaixo:
• aumento do número de frações obtidas durante a purificação,
• todas as frações possuíam perfil flavonoídico,
• diminuição da massa obtida de cada fração no decorrer das purificações,
• necessidade de isolar os flavonóides principais para realizar estudo aprofundado
in vitro e também estudo in vivo.
PERFIL QUÍMICO
Análise por RMN de
1
H do extrato, sobrenadante e precipitado (Espectros 1-3)
O espectro de Ressonância Magnética Nuclear de
1
H do sobrenadante mostra a
presença de sinais (δ 3,00 - 3,70 ppm) referentes a unidades de açúcares, relacionados a
mono e polissacarídeos presentes nesta fração. Na região de sinais para hidrogênios de
núcleos aromáticos é possível observar a presença de sinais característicos (δ 6,00 a 8,00
ppm), apesar destes estarem em menor proporção quando comparados aos sinais dos
açúcares. Estes sinais provavelmente são relativos aos flavonóides presentes. O espectro de
RMN de
1
H do precipitado mostra a presença do aminoálcool kalanchosina, isolado de
Kalanchoe brasiliensis pelo nosso grupo, e do ácido málico (COSTA et al., 2006). É possível
que estas duas moléculas encontrem-se em forma de complexo, assim como foi relato em
K. brasiliensis, com o código de KMC (COSTA et al., 2006).
Como era de se esperar, o espectro de RMN de
1
H do extrato é uma mistura dos sinais
observados para o sobrenadante e para o precipitado.
Perfil químico das frações orgânicas F1, F2 e F3 (Espectros 4-6)
As frações F1, F2 e F3 foram analisadas por RMN de
1
H; permitindo conhecer a classe
química das substâncias majoritárias presentes nessas frações.
Fração Orgânica 1 (F1)
O espectro de RMN de
1
H apresenta sinais em 3,65; 3,94 e 4,24 ppm que são
característicos de hidrogênio de unidade carbinólica (-CHOH-). Um conjunto de sinais entre
0,67 e 2,40 ppm é compatível com hidrogênios de cadeia alifática.
Podemos verificar, a partir do espectro obtido, que F1 é composta majoritariamente
por substâncias lipídicas, como ácidos graxos, por exemplo.
Fração Orgânica 2 (F2)
O espectro de RMN de
1
H apresenta sinais em 7,52 e 7,70 ppm que indicam a
presença de dois tipos de hidrogênios de anéis aromáticos. Um sinal em 4,25 ppm
caracteriza hidrogênio de unidade carbinólica (-CHOH-). Um conjunto de sinais entre 0,80 e
1,30 ppm é compatível com hidrogênios de cadeia alifática.
As informações obtidas nesse espectro permitem supor que estão presentes em F2
(Dragendorff positivo) alcalóides com núcleos aromáticos, como por exemplo, alcalóides
piridínicos. Também é bastante evidente a presença de substâncias com cadeia alifática.
Fração Orgânica 3 (F3)
O espectro de RMN de
1
H permite confirmar a presença de flavonóides glicosilados em
F3 (sulfato cérico positivo). Em 12,80 ppm podemos observar sinal característico para
ligação hidrogênio intramolecular entre a hidroxila em C5 e a carbonila em C4 (numeração
tradicional para o esqueleto básico de flavonóides). Outros sinais entre 6,00 e 8,00 ppm
são característicos para hidrogênios de anéis aromáticos. Picos em 5,30 e 3,80 ppm são
devido aos hidrogênios anoméricos, dando indícios da presença de flavonóides glicosilados.
Entre 3,00 e 3,70 encontramos sinais de hidrogênios carbinólicos de açúcares.
Perfil químico de F3-C1 e F3-C2 (Espectros 7 e 8)
Com base no espectro de RMN de
1
H é possível confirmar a presença de flavonóides
glicosilados em F3-C2 (sulfato cérico positivo), com o mesmo perfil de sinais descrito para
F3. Em relação a F3-C1 observamos sinais característicos para cadeia hidrocarbônica entre
0,80 e 1,30 ppm e também sinais característicos para compostos aromáticos entre 6,00 e
8,00 ppm. Estes sinais não correspondem ao padrão esperado para flavonóides, podendo
corresponder à presença de ácidos orgânicos como por exemplo os ácidos cinâmicos e
terpenos.
Espectro 1: Espectro de RMN de
1
H do extrato aquoso de K. pinnata (400 MHz). Solvente
utilizado: D
2
O. Foi aplicada técnica watergate para supressão do sinal referente a HDO.
Parâmetros: NS 8, SW 4807 Hz, REF D
2
O, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 100
mg/mL.
Sinais referentes
ao aminoálcool e
ácido málico
Sinais
referentes
aos
a
ç
úcares
Sinais referentes aos
hidrogênios de núcleos
a
r
o
m
át
i
cos
Espectro 2: Espectro de RMN de
1
H do precipitado (KMC) do extrato aquoso de K. pinnata
(200 MHz). Solvente utilizado: D
2
O. Parâmetros: NS 320, SW 3000 Hz, REF D
2
O, TEMP
30ºC, Concentração da amostra 100 mg/mL. S=solvente.
Sinal referente ao
ácido málico
Sinal referente ao
ácido málico/
kalanchosina
(*) Sinal referente
a kalanchosina
*
*
S
Espectro 3: Espectro de RMN de
1
H do sobrenadante do extrato aquoso de K. pinnata (400
MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 8, SW 4807 Hz, REF DMSO-d
6
, TEMP
25ºC, Concentração da amostra 100 mg/mL.
Sinais referentes
provavelmente a
ácidos or
g
ânicos
Sinais
referentes
aos
a
ç
úcares
Sinais referentes aos
hidrogênios aromáticos
Sinais referentes
provavelmente a
ácidos or
g
ânicos
Sinais referentes a
cadeias alifáticas
Espectro 4: Espectro de RMN de
1
H da Fração Orgânica 1 (F1) do sobrenadante de K.
pinnata (300 MHz). Solvente utilizado: CDCl
3
. Parâmetros: NS 16, SW 4006 Hz, REF TMS,
TEMP 25ºC, Concentração da amostra 20 mg/mL. S=solvente.
Sinais
referentes a
hidrogênios
alifáticos
Sinais
referentes a
hidrogênios
carbinólicos
S
Espectro 5: Espectro de RMN de
1
H da Fração Orgânica 2 (F2) do sobrenadante de K.
pinnata (300 MHz). Solvente utilizado: CDCl
3
. Parâmetros: NS 64, SW 6009 Hz, REF TMS,
TEMP 25ºC, Concentração da amostra 20 mg/mL. S=solvente.
Sinais
referentes a
hidrogênios
alifáticos
Sinais
referentes a
hidrogênios
carbinólicos
Sinais
referentes a
hidrogênios
aromáticos
S
Espectro 6: Espectro de RMN de
1
H da Fração Orgânica 3 (F3) do sobrenadante de K.
pinnata (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 32, SW 6009 Hz, REF
DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 20 mg/mL. S=solvente.
Sinais referentes
aos hidrogênios
dos açúcares
Sinais referentes aos
hidrogênios aromáticos
Sinal característico
para ligação de
hidrogênio
intramolecular em um
flavonóide
S
Espectro 7: Espectro de RMN de
1
H da Fração F3-C1 do sobrenadante de K. pinnata (400
MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 8, SW 4807 Hz, REF TMS, TEMP 25ºC,
Concentração da amostra 20 mg/mL.
Sinais referentes aos
hidrogênios aromáticos
Sinais referentes a
cadeias alifáticas
Espectro 8: espectro de RMN de
1
H da Fração F3-C2 do sobrenadante de K. pinnata (300
MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 64, SW 5593 Hz, REF TMS, TEMP 25ºC,
Concentração da amostra 40 mg/mL. S=solvente.
Sinais referentes
aos hidrogênios
dos açúcares
Sinais referentes aos
hidrogênios aromáticos
Sinal característico
para ligação de
hidrogênio
intramolecular em um
flavonóide
S
ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DOS FLAVONÓIDES ISOLADOS
O fracionamento bioguiado da fração em acetato de etila (F3) do sobrenadante do
extrato aquoso de KP levou ao isolamento de cinco flavonóides conforme relatado na parte
experimental e no tópico de fracionamento bioguiado deste trabalho. Essas substâncias
isoladas foram codificadas como KP1, KP2, KP3, KP4 e KP5.
A elucidação estrutural destas substâncias baseou-se em técnicas de Ressonância
Magnética Nuclear (RMN) de
1
H e
13
C, mono e bidimensionais. Uma pequena descrição das
técnicas de RMN bidimensionais encontra-se logo a seguir.
Além das técnicas de RMN, dados obtidos através da técnica de Espectrometria de
Massas e Espectrometria de Massas de Alta Resolução também foram úteis para
determinação estrutural.
TÉCNICAS BIDIMENSIONAIS DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR UTILIZADAS
COSY (homonuclear COrrelation SpectroscopY) - com esta técnica pode-se estabelecer
as correlacões entre os hidrogênios que estão acoplados por
2-3
J
H,H
(acoplamentos geminais
e vicinais, mensuráveis no espectro 1D) e assim discernir a multiplicidade dos sinais
observados no espectro de RMN
1
H. Eventualmente, sinais devidos a
4-6
J
H,H
são também
visíveis (acoplamentos a longa distância, raramente mensuráveis no espectro 1D) (KAISER,
2000).
HMQC (Heteronuclear MultipleQuantum Coherence)- com este experimento pode-se
assinalar os carbonos que contém hidrogênios, caso já tenham sido assinalados todos os
hidrogênios do espectro de RMN
1
H, ou vice e versa, pois a técnica depende dos
acoplamentos
1
J
C,H
. Os espectros HMQC são editados com o eixo horizontal (dimensão F
2
)
correspondendo aos δ
H
e o eixo vertical (dimensão F
1
) correspondendo aos δ
C
(KAISER,
2000).
HMBC (Heteronuclear MultipleBond Coherence) - o espectro é apresentado como um
HMQC contudo as correlações referem-se aos acoplamentos
n
J
C,H
(n > 2). Infelizmente os
sinais devidos aos
1
J
C,H
estão invariavelmente presentes, o que torna imprescindível um
experimento HMQC prévio. As informações obtidas das correlações
n
J
C,H
são muito
importantes em uma determinação estrutural, principalmente para estabelecer a posição de
carbonos não hidrogenados. Os espectros HMBC são editados da mesma forma que os
HMQC (KAISER, 2000).
ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DO FLAVONÓIDE KP1
A substância codificada como KP1, isolada de F3 (fração em acetato de etila),
apresentou características de flavonóide quando analisada por CCD e revelada utilizando luz
ultravioleta e sulfato cérico. A proposta estrutural desta molécula foi baseada em dados de
RMN de
1
H,
13
C, DEPT, COSY, HMQC, HMBC, NOESY e 1D-TOCSY.
A fórmula molecular C
26
H
28
O
15
foi deduzida a partir do íon pseudomolecular m/z
603,1309 [M+Na]
+
(calculado para C
26
H
28
O
12
Na, 603,1326) encontrado no espectro de
massas de alta resolução (HR-MALDI).
KP1: 78,5 mg; R
f
0,55 em BAW 8:1:1; [α]
D
25
= -53 (MeOH; c 1,0)
RMN de
1
H
A análise de RMN de
1
H de KP1 foi realizada utilizando CD
3
OD como solvente. Com
base nesse espectro foi possível identificar a presença do flavonol quercetina (3,5,7,3’,4'-
pentaidroxiflavonol) como aglicona, caracterizada pelos sinais entre 6,19 e 7,36 ppm.
Nesta região foram observados cinco sinais, cada um com integração para um
hidrogênio. O sinal que se encontra em campo mais alto, situado em 6,19 ppm, é do tipo
dupleto e apresenta constante de acoplamento (J) de 2,00 Hz. O segundo sinal mais
protegido nesta região (6,19 - 7,36 ppm) também é um dupleto e está situado em 6,37
ppm e por possuir J de 2,00 Hz está acoplado com o hidrogênio em 6,19 ppm. A constante
observada é compatível com o acoplamento meta em um anel aromático.
Em 6,93 ppm é possível observar um dupleto largo com constante de acoplamento
igual a 8,32 Hz. Em campo um pouco mais baixo, 7,29 ppm, encontra-se um sinal tipo
duplo-dupleto que apresenta J de 8,32 Hz, mostrando acoplamento com o hidrogênio em
6,93 ppm e um J menor de 2,07 Hz. O quinto sinal observado, um dupleto situado em 7,36
ppm, apresenta J de 2,07, mostrando acoplamento com o hidrogênio em 7,29 ppm.
Sinais presentes na região de 6,20 - 6,40 ppm são compatíveis com os hidrogênios do
anel A da aglicona. Sendo o hidrogênio 6 do anel A aquele que aparece em 6,19 ppm e o
hidrogênio 8, deste mesmo anel, o que aparece em 6,37 ppm. Já em relação ao anel B da
aglicona, o padrão de sinais e multiplicidades observadas para os sinais 6,93; 7,29 e 7,36
ppm são compatíveis com um anel 3’, 4’-diidroxilado.
O
O
OH
OH
H OH
H
H
OH
H
HO
H
2'
3'
4'
5'
6'
5
6
7
8
3
A
B
C
Figura 17: Estrutura da aglicona quercetina
A partir do espectro de RMN de
1
H foi possível propor a presença de uma unidade de
ramnopiranose. Esta presença foi sugerida devido ao dupleto relativo a uma metila em 1,10
ppm (J=6,20 Hz) e ao simpleto largo, relativo a apenas um hidrogênio, em 5,37 ppm
(J=0,93 Hz), que corresponde ao hidrogênio anomérico. O valor apresentado pela constante
de acoplamento (1,10 Hz) para o H-1’’ sugere uma relação diequatorial com o H-2’’.
Além desta unidade de carboidrato, a região entre 4,30-3,30 ppm mostra a presença
de uma segunda molécula de açúcar. O sinal do hidrogênio anomérico deste açúcar está
situado em 4,20 ppm. Este sinal é do tipo dupleto com constante de acoplamento de 7,10
Hz. Este valor de J indica um acoplamento do tipo trans-diaxial entre o H-1’’’ e o H-2’’’. A
multiplicidade deste sinal foi comprovada pelo experimento de RMN de
1
H utilizando DMSO-
d
6
como solvente, já que no experimento em CD
3
OD este sinal se encontrava sobreposto ao
H-2’’ da ramnose. O deslocamento químico deste hidrogênio anomérico não é compatível
com uma O-glicosilação direta no anel da aglicona. Neste caso, este segundo açúcar estaria
ligado à molécula de ramnose.
A tabela 13 mostra os deslocamentos químicos de RMN de
1
H, em CD
3
OD e em
DMSOd
6
, para o flavonóide KP1.
De acordo com esses dados parciais, pode-se propor para KP1 a estrutura da
quercetina 3-O-diglicosídeo, onde o açúcar ligado diretamente ao esqueleto da aglicona é
provavelmente a ramnose.
RMN de
13
C e DEPT 135
O espectro de RMN de
13
C forneceu 26 sinais (Espectro 12). Quinze destes sinais
foram atribuídos aos carbonos da aglicona do flavonóide e os onze sinais restantes aos
carbonos das duas unidades de açúcar.
Os sinais observados entre 179,9-116,6 ppm e os sinais em 105,9, 100,1 e 95,0 ppm
correspondem aos deslocamentos químicos para os carbonos da aglicona.
Para o anel C observa-se o sinal mais desprotegido do espectro, em 179,9 ppm,
confirmando a presença de uma carbonila cetônica em C-4 α-β insaturada.
Em 158,7 ppm encontra-se o sinal atribuído ao C-2. Com base no deslocamento
observado (mais desprotegido), a posição 3 da aglicona está O-glicosilada uma vez que,
quando esta posição não está substituída, o deslocamento para C-2 fica próximo de 148
ppm (MABRY et al., 1970).
Para o anel B seis sinais são observados. Entretanto os valores relativos aos carbonos
C-2’ e C-5’ (116,9 e 116,6 ppm) e os carbonos C-1’ e C-6’ (123,0 e 122,8 ppm) são muito
próximos e puderam ser diferenciados apenas com os experimentos bidimensionais.
Os dados de RMN de
13
C referentes a aglicona do flavonóide confirmaram para KP1 a
aglicona da quercetina, sugerida com base nos dados de RMN de
1
H.
Com base nos sinais em 103,4 ppm e 17,9 ppm, atribuídos aos carbonos anomérico
(C-1’’) e metila (C-6’’), confirma-se a presença de O-glicosilação na aglicona. A confirmação
da presença de uma unidade de ramnose se apoiou nos demais sinais observados nos
experimentos bidimensionais.
Cinco sinais adicionais de
13
C foram observados em δ 108,0, 73,0, 73,9, 70,0 e 67,6
(CD
3
OD), indicando a presença de uma unidade de pentose identificada como uma
arabinopiranose a partir das constantes de acoplamento medidas em CD
3
OD e por
comparação com os dados de
13
C da literatura (FLAMINI et al., 2002). Técnicas de RMN
adicionais como DEPT, COSY, HMQC, HMBC, NOESY e 1D-TOCSY comprovaram a presença
de uma unidade de α-arabinopiranose (Tabela 13). Por ser uma pentose, o C-5’’’ é do tipo
secundário (-CH
2
) e encontra-se na fase oposta do espectro de DEPT 135 em relação aos
outros sinais de carbono, permitindo a atribuição, sem ambigüidade do valor de 67,6 ppm
para C-5’’’.
1
H -
1
H COSY
A partir da análise do COSY foi possível confirmar os deslocamentos químicos de cada
hidrogênio dos dois açúcares.
HMQC
O espectro de HMQC permitiu estabelecer a correlação direta entre os núcleos de
1
H
com os núcleos de
13
C a eles diretamente ligados. Portanto, com este espectro, foi possível
determinar todos os valores para os deslocamentos de carbonos da aglicona e dos açúcares
que possuíam um hidrogênio ligado a eles.
TOCSY 1-D
A técnica TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY) revela correlações entre hidrogênios
não necessariamente acoplados, mas que possuem um hidrogênio vizinho comum ao qual
ambos estão acoplados. É uma técnica muito útil na identificação e no assinalamento de
hidrogênios pertencentes a diferentes unidades de monossacarídeo, mesmo em regiões do
espectro com sinais muito sobrepostos. Neste estudo, este experimento possibilitou
principalmente a determinação da multiplicidade dos hidrogênios em cada um dos açúcares,
selecionando apenas sinais de um dos açúcares por vez, diminuindo assim a sobreposição
de sinais. Na técnica 1-D, uma série de espectros monodimensionais é adquirida
correspondendo a um espectro 2-D (KAISER, 2000).
A possibilidade de confirmar a multiplicidade e as constantes de acoplamento do
hidrogênio 5 da pentose (3,37 ppm) permitiu assegurar a presença de uma arabinose e
excluir a de uma xilose. O H-5 da arabinose aparece como um duplo-dupleto com duas
constantes grandes (acoplamento geminal e axial-axial), que devido a sobreposição se
assemelha a um tripleto no espectro de TOCSY-1D. Se ao invés de arabinose o açúcar fosse
uma xilose teríamos um duplo-dupleto com uma constante equatorial-equatorial e uma
axial-equatorial.
As análises de COSY, HMQC e TOCSY permitiram identificar as unidades glicosídicas:
uma α-ramnopiranose e uma α-arabinopiranose.
HMBC
A análise das correlações a longa distância
1
H–
13
C (HMBC; Espectros 16 e 17)
permitiu detectar a correlação dos núcleos de
1
H com os núcleos de
13
C com duas ou mais
ligações de distância. Sendo assim, puderam ser definidos os deslocamentos de alguns
carbonos que não possuíam hidrogênios ligados a eles.
Os dados de HMBC definiram a posição da ramnose na aglicona (quercetina) a partir
da correlação observada entre H-1” (5,37 ppm) e C-3 (136,9 ppm).
A partir de análise cuidadosa dos dados de RMN, foi possível deduzir que a unidade de
arabinopiranose está conectada a posição a 2’’ da unidade 3-O-ramnopiranosil (δ 81,1).
Esta hipótese foi confirmada com base na correlação a longa distância observada entre o
hidrogênio H-2” da ramnose (4,19 ppm) e um sinal em 108,0 ppm, correspondente ao C-1
da arabinose, indicando uma ligação interglicosídica do tipo (1→2). Esta pode ser
comprovada pelo efeito de desproteção observado para o C-2’’ (+10 ppm), quando
comparado ao sinal de C-2’’ não substituído (SLOWING et al., 1994).
A partir de todos estes dados foi possível concluir que o flavonóide KP1 é um 3-O-α-
arabinopiranosil (1→2) α-ramnopiranosídeo de quercetina.
Os dados de RMN de
1
H e
13
C para a molécula estão listados na Tabela 16.
Este flavonóide foi anteriormente isolado de Kalanchoe pinnata por ICHIKAWA et al.
(1986), mas apenas sinais de RMN de
1
H foram publicados pelos autores. A comparação dos
nossos dados de
1
H com os descritos pelos autores mostraram uma diferença substancial
para a constante de acoplamento atribuída ao H-1’’’ (CD
3
OD).
Neste presente estudo, a constante de acoplamento medida para H-1’’’ (δ 4.20) é J =
7.10 Hz, enquanto que a constante publicada anteriormente é J = 4,00 Hz no mesmo
solvente (ICHIKAWA et al., 1986). Nossos dados indicam claramente uma relação di-axial
entre H-1’’’ e H-2’’’ esperada para a unidade de açúcar α-arabinopiranosil e está de acordo
com outros dados encontrados na literatura (FLAMINI et al., 2002; MABRY et al., 1970).
A ocorrênica do flavonóide KP1 foi também descrita para Alphitonia philippinensis
(Rhamnaceae) (JOU et al., 2004) e recentemente para Kalanchoe blossfeldiana (NIELSEN et
al., 2005). Este último relato apresenta uma listagem parcial dos valores de RMN obtidos.
Os dados de RMN de
13
C obtidos para KP1 foram comparados aos desta mesma molécula
isolada de Kalanchoe blossfeldiana (NIELSEN et al., 2005) – TABELA 17. Nenhuma
discrepância entre os valores listados foi observada.
Considerando o alto potencial fitoterapêutico da espécie Kalanchoe pinnata para a qual
foram descritas várias atividades dentre as quais antiinflamatória (PAL & CHAUDHURI,
1990), antiúlcera (PAL & CHAUDHURI, 1991), hepatoprotetora (YADAV & DIXIT, 2003),
antileishmania (DA SILVA et al., 1995) e imunomoduladora (ROSSI-BERGMANN et al.,
1994); e a necessidade de se obedecer a critérios de controle de qualidade quando se visa
um novo fitoterápico, propõe-se neste trabalho que KP1 seja utilizado como um marcador
químico específico para esta espécie medicinal. Esta proposta se apóia no fato de KP1 ser
uma molécula pouco comum e representar o flavonóide majoritário na espécie em questão
(ver dados de CLAE-EM mais adiante).
Figura 18: Estrutura de KP1 (3-O-α-arabinopiranosil (1→2) α-ramnopiranosídeo de
quercetina)
O
HO
OH O
OH
O
O
HO
HO
OH
O
O
OH
HO
HO
TABELA 16: Dados de
13
C (75 MHz) e
1
H (300 MHz) para 3-O- α-arabinopiranosil (1→2) α-
ramnopiranosídeo de quercetina – KP1 (CD
3
OD e DMSO-d
6
).
δ
C
δ
H
[mult., J (Hz)] δ
H
[mult., J (Hz)]
CD
3
OD DMSO-d
6
CD
3
OD
QUERCETINA
2 158,7 - -
3 136,9 - -
4 179,9 - -
5 159,3 - -
6 100,1 6,16 br s 6,19 d (2,00)
7 166,4 - -
8 95,0 6,37 br s 6,37 d (2,00)
9 163,3 - -
10 105,9 - -
1’ 122,8
- -
2’ 116,9
7,33 br s 7,36 d (2,07)
3’ 146,6 - -
4’ 150,0 - -
5’ 116,6 6,88 d (8,35) 6,93 d (8,32)
6’ 123,0
7,26 br d (8,35) 7,29 dd (2,07; 8,32)
ramnopiranose
1” 103,4 5,30 br s 5,37 d (0,93)
2” 82,9 4,02 m
b
4,19 m
b
3” 71,9 a 3,89 dd (3,70; 9,70)
4” 73,9 a 3,35 dd
b
(9,70; 9,70)
5” 72,1 a 3,87 dq
b
(9,70; 6,20)
6” 17,9 0,90 d (6,10) 1,10 d (6,20)
arabinopiranose
1”’ 108,0 4,09 d (6,37) 4,20 d (7,10)
2”’ 73,0 a 3,54 dd (7,10; 9,28)
3”’ 74,4 a 3,47 dd (3,25; 9,28)
4”’ 70,0 a 3,72 m
b
5”’ 67,6 a
3,65 dd
b
(12,45;
2,27)
3,37 br d
b
(12,45)
b
Acoplamentos não bem definidos, a – sinais encobertos pelo sinal da água presente no DMSO
TABELA 17: Dados de
13
C para 3-O- α-arabinopiranosil (1→2) α-ramnopiranosídeo de
quercetina – KP1 e deste mesmo flavonóide isolado de Kalanchoe blossfeldiana (Nielsen et
al., 2005).
δ
C
δ
C
KP1 (CD
3
OD) Literatura (CD
3
OD)
QUERCETINA
2 158,7 nd
3 136,9 137,0
4 179,9 nd
5 159,3 nd
6 100,1 99,9
7 166,4 165,9
8 95,0 94,8
9 163,3 nd
10 105,9 nd
1’ 122,8
123,0
2’ 116,9
116,9
3’ 146,6 146,6
4’ 150,0 nd
5’ 116,6 116,5
6’ 123,0
122,7
ramnopiranose
1” 103,4 103,5
2” 82,9 82,8
3” 71,9 72,0
4” 73,9 73,8
5” 72,1 72,1
6” 17,9 17,8
arabinopiranose
1”’ 108,0 108,1
2”’ 73,0 73,1
3”’ 74,4 74,2
4”’ 70,0 70,0
5”’ 67,6 67,6
nd = não detectado por motivos de sensibilidade
Espectro 9: Espectro de RMN de
1
H de KP1 (300 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD.
Parâmetros: NS 32, SW 6188 Hz, REF CD
3
OD, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 20
mg/mL.
H-2’
H-6
H-8
H-5’
H-6’
H-1’’
H-1’’’e H-2’’
H-6’’
S
Espectro 10: Espectro de RMN de
1
H de KP1 (300 MHz). Ampliação da região entre 3,00 e
7,50 ppm. Solvente utilizado: CD
3
OD. Parâmetros: NS 32, SW 6188 Hz, REF CD
3
OD, TEMP
25ºC, Concentração da amostra 20 mg/mL.
H-2’
H-6
H-8
H-5’
H-6’
H-1’’
H-1’’’e H-2’’
S
H-3’’e H-5’’
H-4’’’
H-5’’’
H-2’’’
H-3’’’
H-4’’e H-5’’’
Espectro 11: Espectro de RMN de
1
H de KP1 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
.
Parâmetros: NS 16, SW 6009 Hz, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 20
mg/mL.
OH-5
H-2’
H-6
H-8
H-5’
H-6’
H-1’’
H-1’’’
H-2’’
H-6’’
S
Espectro 12: Espectro de RMN de
13
C de KP1 (75 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD.
Parâmetros: NS 8155, SW 19685 Hz, REF CD
3
OD, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 20
mg/mL.
C-2’
C-1’
C-3’
C-3
C-1”
C-8
C-4
C-7
C-4'
C-1’”
C-6
C-10
C-9
C-2
C-5
C-6’
C-5’
C-2”
C-5’”
C-6”
C-4”
C-3’”
C-2”’
C-5”
C-3”
C-4’”
Espectro 13: Espectro de RMN de
13
C – DEPT 135 de KP1 (75 MHz). Solvente utilizado:
CD
3
OD. Parâmetros: NS 3072, SW 19685 Hz, REF CD
3
OD, TEMP 25ºC, Concentração da
amostra 20 mg/mL.
C-5’”
Espectro 14: Espectro de RMN 2D – COSY 90 de KP1 (300 MHz). Solvente utilizado:
CD
3
OD. Parâmetros: NS 16, SW 3004 Hz, REF CD
3
OD, TEMP 25ºC, Concentração da
amostra 20 mg/mL.
H-5’→ H-6’
H-6→ H-8
H-1’’→ H-2’’
H-5’’→ H-6’’
H-1’’’→ H-2’’’
H-2’’→ H-3’’
H-3’’ e H-5’’→ H-2’’’
Espectro 15: Espectro de RMN 2D – HMQC de KP1 (300 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD.
Parâmetros: NS 48, SW 3004 Hz, REF CD
3
OD, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 20
mg/mL.
H-6’’→ C-6’’
H-2’’→ H-2’’
H-5’’’→ C-5’’’
H-1’’→ C-1’’
H-8→ C-8
H-6→ C-6
H-5’→ C-5’
H-6’→ C-6’
H-2’→ C-2’
H-3’’’→ C-3’’’
H-1’’’→ C-1’’’
H-4’’→ H-4’’
H-3’’→ H-3’’
H-
5
’
’
→
H-
5
’
’
H-4’’’→ C-4’’’
H-2’’’→ C-2’’’
Espectro 16: Espectro de RMN 2D – HMBC de KP1 (300 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD.
Parâmetros: NS 96, SW 3004 Hz, REF CD
3
OD, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 20
mg/mL.
H-1’’→ C-3
H-2’’→ C-1’’’
H-1’’’→ C-2’’
Espectro 17: Espectro de RMN 2D – HMBC de KP1 (300 MHz). Ampliação da região entre
5,50-7,50 ppm (
1
H) e 110,0-180,0 ppm (
13
C). Solvente utilizado: CD
3
OD. Parâmetros: NS
96, SW 3004 Hz, REF CD
3
OD, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 20 mg/mL.
H-1’’→ C-3
Espectro 18: RMN 1D – TOCSY seletivo de KP1 (300 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD.
Parâmetros: NS 16, SW 6009 Hz, REF CD
3
OD, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 20
mg/mL. Seleção: 3,88 ppm; 4,19 ppm; 1,02 ppm.
H-5”’
H-2”’
H-3” e H-5”
H-3”’
H-4”’
H-4” e H-5”’
H-1”’ e H-2”
H-4”
H-3” e H-5”
H-4”
H-3” e H-5”
H-2”
H-2”’
H-3”’
H-3”
H-1”’ e H-2”
sel.: 1,02 ppm
sel.: 4,19 ppm
sel.: 3,88 ppm
ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE KP2
A substância codificada como KP2, isolada de F3 (fração em acetato de etila),
apresentou características de flavonóide quando analisada por CCD e revelada utilizando luz
ultravioleta e sulfato cérico. Sua proposta estrutural foi baseada em dados de RMN de
1
H,
13
C e DEPT (CD
3
OD).
A fórmula molecular C
21
H
20
O
11
foi deduzida a partir do íon pseudomolecular m/z
471,097 [M+Na]
+
(calculado para C
21
H
20
O
11
Na, 471,091) encontrado no espectro de massas
(MALDI).
KP2:10,0 mg; R
f
0,83 em BAW 8:1:1; [α]
D
25
= -116 (MeOH; c 1,0)
RMN de
1
H
O espectro de RMN de
1
H para KP2 apresentou o mesmo padrão de aglicona
apresentado pelo flavonóide KP1, sendo o sinal em 6,20 ppm (d; J
meta
= 1,85 Hz) atribuído
ao hidrogênio 6 do anel A e o sinal que aparece em 6,37 ppm (d; J
meta
= 1,85 Hz) ao
hidrogênio 8, deste mesmo anel. Já em relação ao anel B da aglicona, o padrão de sinais e
multiplicidades observadas para os sinais 6,91 ppm (d; J
orto
= 8,30 Hz), 7,29 ppm (dd; J
orto
=
8,30 Hz e J
meta
= 1,90 Hz) e 7,33 ppm (d; J
meta
= 1,90 Hz) são compatíveis com um anel 3’,
4’-diidroxilado.
A análise dos dados de RMN de
1
H nos mostrou a presença de uma unidade de
ramnopiranose, assim como observado para KP1. Esta unidade glicosídica apresentou sinal
dupleto característico de metila em 1,28 ppm (J=5,90 Hz) e simpleto largo, relativo a
apenas um hidrogênio, em 5,34 ppm (J=1,20 Hz), que corresponde ao hidrogênio
anomérico. Assim como observado para KP1, o valor pequeno de constante de acoplamento
(1,20 Hz) para o H-1’’ sugere uma relação diequatorial com o H-2’’. O deslocamento
químico deste anomérico é compatível com uma O-glicosilação direta no anel da aglicona.
Não foram observados no espectro de RMN de
1
H de KP2 sinais referentes a uma
segunda unidade glicosídica, como anteriormente para KP1.
A Tabela 18 mostra os deslocamentos químicos de RMN de
1
H, em CD
3
OD para o
flavonóide KP2.
RMN de
13
C
O espectro de RMN de
13
C forneceu 21 sinais (Espectro 20). Quinze destes sinais
foram atribuídos aos carbonos da aglicona do flavonóide e os seis sinais restantes aos
carbonos da unidade de açúcar. Os sinais observados entre 179,6-105,9 ppm e os sinais em
99,8 e 94,7 ppm correspondem aos deslocamentos químicos para os carbonos da aglicona.
Estes valores permitiram confirmar a aglicona da quercetina para KP2, conforme sugerido
através dos dados de RMN de
1
H.
Assim como observado para o flavonóide KP1, o deslocamento químico observado
para o carbono C-2 (158,5 ppm) de KP2 é característico de O-glicosilação na posição 3 da
aglicona.
Os outros sinais referentes a unidade de ramnopiranose (103,4; 71,9; 72,1; 73,2;
72,0; 17,9 ppm) foram identificados baseado em comparação com dados da literatura
(SLOWING et al., 1994) e com os dados obtidos para o flavonóide KP1.
A partir de todos estes dados foi possível concluir que o flavonóide KP2 é um 3-O-α-
ramnopiranosídeo de quercetina, conhecido como quercitrina. Os dados de RMN de
1
H e
13
C
para a molécula estão listados na Tabela 19.
Os dados de RMN de
13
C obtidos para KP2 foram comparados aos desta mesma
molécula isolada de Eugenia jambos (SLOWING et al., 1994) – TABELA 18. Nenhuma
discrepância entre os valores listados foi observada.
Algumas atividades biológicas foram descritas para a quercitrina. Esse flavonóide
apresentou atividade antiinflamatória em colite experimental (DE MEDINA et al., 2002; DE
MEDINA et al., 1996) associada a atividade antidiarréica (GALVEZ et al., 1993). Também
foram descritas atividades anticomplemento (MIN et al., 2003), sedativa (KANG et al.,
2000) e antiipertensiva (HANSEN et al., 1996).
Figura 19: Estrutura de KP2 (3-O-α-ramnopiranosídeo de quercetina (quercitrina))
O
HO
OH O
OH
O
O
HO
HO
OH
OH
TABELA 18: Dados de
13
C (75 MHz) e
1
H (300 MHz) para 3-O-α-ramnopiranosídeo de
quercetina (quercitrina) – KP2 (CD
3
OD).
δ
C
δ
H
Multiplicidade
QUERCETINA
2 158,5 - -
3 136,2 - -
4 179,6 - -
5 159,3 - -
6 99,8 6,20 d (1,90)
7 165,9 - -
8 94,7 6,37 d (1,80)
9 163,2 - -
10 105,9 - -
1’ 122,9
a
- -
2’ 116,9
b
7,33 d(1,80)
3’ 146,4 -
4’ 149,8 - -
5’ 116,4
b
6,91 d (8,30)
6’ 122,9
a
7,29 dd (2,00; 8,30)
ramnopiranose
1” 103,5 5,34 d (1,20)
2” 71,9 4,22 dd *
3” 72,1 3,75 dd (3,20; 9,10)
4” 73,2 3,35 m
5” 72,0 3,40 m
6” 17,6 1,28 d (5,90)
* Acoplamentos não bem definidos,
a, b
sinais interconversíveis
TABELA 19: Dados de
13
C entre 3-O-α-ramnopiranosídeo de quercetina (quercitrina) – KP2
e deste mesmo flavonóide isolado de Eugenia jambos (SLOWING et al., 1994). Ambos os
espectros foram realizados utilizando CD
3
OD como solvente.
δ
C
K
K
P
P
2
2
δ
C
Literatura
QUERCETINA
2 158,5 158,5
3 136,2 136,2
4 179,6 179,7
5 159,3 159,3
6 99,8 99,8
7 165,9 165,9
8 94,7 94,7
9 163,2 163,2
10 105,9 105,9
1’ 122,9
a
122,9
2’ 116,9
b
116,9
3’ 146,4 146,4
4’ 149,8 149,8
5’ 116,4
b
116,3
6’ 122,9
a
122,8
ramnopiranose
1” 103,5 103,5
2” 71,9 71,9
3” 72,1 72,1
4” 73,2 73,2
5” 72,0 72,0
6” 17,6 17,7
a, b
sinais interconversíveis
Espectro 19: Espectro de RMN de
1
H de KP2 (300 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD.
Parâmetros: NS 16, SW 6188 Hz, REF CD
3
OD, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 20
mg/mL.
H-2’
H-6
H-8
H-5’
H-6’
H-1’’
H-6’’
S
H-2’’
H-3’’
H-4’’ e H-5’’
Espectro 20: Espectro de RMN de
13
C de KP2 (75 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD.
Parâmetros: NS 14336, SW 19685 Hz, REF CD
3
OD, TEMP 25ºC, Concentração da amostra
20 mg/mL.
C-2’
C-1’
C-3
C-1”
C-8
C-4
C-7
C-4'
C-6
C-10
C-9
C-2
C-5
C-6’
C-5’
C-6”
C-4”
C-3’’
C-5”
C-2”
ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DO FLAVONÓIDE KP3
O flavonóide codificado como KP3, isolado a partir da fração em acetato de etila (F3),
apresentou-se sob a forma de pó amorfo amarelo-pálido, com uma massa total de 5,2 mg.
A proposta estrutural para o flavonóide KP3 foi baseada nos dados de RMN de
1
H e
13
C, HMQC, HMBC e COSY obtidos em DMSO-d
6
(400 MHz), assim como em dados de HR-
MALDI.
A fórmula molecular C
26
H
28
O
14
foi deduzida a partir do íon pseudomolecular m/z
587,1358 [M+Na]
+
(calculado para C
26
H
28
O
14
Na, 587,1376) encontrado no espectro de
massas de alta resolução (HR-MALDI).
KP3: 5,2 mg; R
f
0,61 em BAW 8:1:1; [α]
D
25
= -94 (MeOH; c 1,0)
RMN de
1
H
A análise de RMN de
1
H de KP3 foi realizada utilizando DMSO-d
6
(400 MHz) e CD
3
OD
(300 MHz) como solvente. Devido a melhor resolução dos sinais em CD
3
OD, este espectro
será utilizado para a discussão dos dados de RMN de
1
H.
A região característica dos hidrogênios de anéis aromáticos (Espectro 22) apresentou
sinais duplos (dupletos) em 6,94 ppm (J= 8,70 Hz) e 7,79 ppm (J= 8,68 Hz), com
integração para dois hidrogênios cada um. As constantes de acoplamento medidas (8-9 Hz)
indicam uma correlação orto entre esses hidrogênios. Esses sinais foram atribuídos aos
hidrogênios H-3’,5’ e H-2’,6’ do anel B respectivamente, característicos de um anel
aromático substituído na posição 4’ (padrão 4’-OH). Isso ocorre devido à simetria
apresentada por este anel, fazendo com que os hidrogênios das posições 2’ e 3’ apresentem
equivalência em deslocamento químico com os hidrogênios das posições 6’ e 5’,
respectivamente.
Para o anel A foram observados dupletos em 6,20 ppm (H-6, J= 1,87 Hz) e 6,38 ppm
(H-8, J= 1,87 Hz). A constante de acoplamento observada, aproximadamente 2 Hz,
confirma um acoplamento meta entre esses hidrogênios.
De acordo com esses dados foi possível propor para a aglicona deste flavonóide a
estrutura do kaempferol (3,5,7,4'-tetraidroxiflavonol).
O
O
OH
H
H OH
H
H
OH
H
HO
H
2'
3'
4'
5'
6'
5
6
7
8
3
A
B
C
Figura 20: Estrutura da aglicona kaempferol
Assim como visto para KP1 e KP2, os dados de RMN de
1
H obtidos para KP3 sugerem
a presença de uma unidade de ramnopiranose, caracterizada pelo dupleto relativo a uma
metila em 0,98 ppm (J=6,17 Hz) e pelo dupleto, relativo a apenas um hidrogênio, em 5,47
ppm (J=1,37 Hz), que corresponde ao hidrogênio anomérico.
A região entre 4,30-3,40 ppm mostra a presença da segunda molécula de açúcar.
Como observado para o flavonóide KP1, o hidrogênio anomérico desta segunda unidade de
açúcar está situado em 4,25 ppm (dupleto; J = 7,15 Hz). Esta constante de acoplamento
indica uma relação trans-diaxial entre o H-1’’’ e o H-2’’’. O deslocamento químico deste
hidrogênio anomérico é compatível com uma segunda unidade de açúcar ligada à molécula
de ramnose através de ligação interglicosídica.
O padrão de sinais observado para a região de hidrogênios glicosídicos do flavonóide
KP3 é similar àquele observado para o flavonóide KP1. Esta semelhança sugere que ambos
os flavonóides, KP1 e KP3, possuem a mesma unidade dissacarídica ligada à posição 3 da
aglicona, que neste caso seria a única diferença estrutural entre essas duas moléculas.
A Tabela 20 mostra os deslocamentos químicos de RMN de
1
H, em CD
3
OD e em
DMSO-d
6
, para o flavonóide KP3. As atribuições dos sinais foram confirmadas com a técnica
de RMN bidimensional COSY.
De acordo com esses dados parciais, pode-se propor para KP3 a estrutura do
kaempferol 3-O-diglicosídeo, onde o açúcar ligado diretamente ao esqueleto da aglicona
corresponde provavelmente a uma ramnose e, por semelhança à KP1, o segundo açúcar
corresponde provavelmente a uma arabinose.
RMN de
13
C
O espectro de RMN de
13
C forneceu 24 sinais (Espectro 24). Treze destes sinais foram
atribuídos aos carbonos da aglicona do flavonóide e os onze sinais restantes aos carbonos
das duas unidades de açúcar.
Os sinais observados entre 178,3-106,8 ppm e os sinais em 100,6 e 95,0 ppm
correspondem aos deslocamentos químicos para os carbonos da aglicona.
Em 157,8 ppm encontra-se o sinal atribuído ao C-2. Com base no deslocamento
observado (mais desprotegido), a posição 3 da aglicona está O-glicosilada uma vez que,
quando esta posição não está substituída, o deslocamento para C-2 fica próximo de 148
ppm (Mabry et al., 1970).
Para o anel B, devido a sua simetria, apenas quatro sinais são observados. Isto ocorre
pois os carbonos C-3’ e C-5’ (116,4 ppm) e os carbonos C-2’ e C-6’ (131,4 ppm)
apresentam equivalência em deslocamento químico.
Esses dados confirmam para KP3 a aglicona do kaempferol.
Os sinais referentes à unidade de ramnopiranose (δ 101,6; 81,2; 71,8; 73,1; 70,9;
18,1 ppm) foram identificados baseado em comparação com os dados obtidos para o
flavonóide KP1. Essas atribuições foram confirmadas com a técnica de RMN bidimensional
HMQC. Os dados de RMN de
13
C (δ 104,3, 72,4, 71,2, 68,5 e 66,6 ppm) confirmaram a
presença da pentose arabinopiranose como segunda unidade de açúcar presente em KP3. A
identificação desta pentose foi baseada nos valores das constantes de acoplamento medidas
em CD
3
OD e na comparação com os dados de
13
C da literatura (FLAMINI et al., 2002).
Técnicas de RMN adicionais como COSY, HMQC e HMBC comprovaram a presença de
uma unidade de α-arabinopiranose (Tabela 20).
COSY, HMQC e HMBC
A partir da análise do COSY (Espectro 25) e do HMQC (Espectro 26) foi possível
estabelecer todos os sinais de hidrogênio e carbono para KP3 e identificar as moléculas de
açúcar: α-ramnopiranose e α-arabinopiranose.
Os dados de HMBC definiram a posição da ramnose na aglicona a partir da correlação
observada entre H-1” (5,34 ppm) e C-3 (135,0 ppm).
A partir de análise cuidadosa dos dados de RMN, foi possível deduzir que a unidade de
arabinopiranose está conectada a posição a 2’’ da unidade 3-O-ramnopiranosil (δ 81,2).
Esse padrão de substituição pode ser comprovado pelo efeito de desblindagem observado
para o C-2’’ (+10 ppm), quando comparado ao sinal de C-2’’ não substituído (SLOWING et
al., 1994).
A partir destes dados foi possível concluir que o flavonóide KP3 é um 3-O-α-
arabinopiranosil (1→2) α-ramnopiranosídeo de kaempferol. Por se tratar de uma substância
inédita foi proposto o nome de kapinnatosídeo para este flavonóide.
Os dados de RMN de
1
H e
13
C para a molécula estão listados na Tabela 17.
Figura 21: Estrutura de KP3 (3-O-α-arabinopiranosil (1→2) α-ramnopiranosídeo de
kaempferol (kapinnatosídeo))
O
HO
OH O
OH
O
O
HO
HO
O
O
OH
HO
HO
TABELA 20: Dados de
13
C e
1
H para 3-O-α-arabinopiranosil (1→2) α-ramnopiranosídeo de
kaempferol (kapinnatosídeo). RMN em
CD
3
OD (300 MHz), RMN em DMSO-d
6
(400 MHZ).
δ
C
δ
H
[mult., J (Hz)] δ
H
[mult., J (Hz)]
DMSO-d
6
DMSO-d
6
CD
3
OD
KAEMPFEROL
2 157,8 - -
3 135,0 - -
4 178,3 - -
5 161,9 - -
6 100,1 6,14 s 6,20 d (1,87)
7 161,9 - -
8 95,0 6,34 s 6,38 d (1,87)
9 157,5 - -
10 106,8 - -
1’ 121,3 - -
2’ 131,4
7,72 d (8,07) 7,78 d (8,68)
3’ 116,4
6,90 d (8,20) 6,94 d (8,70)
4’ 160,8 - -
5’ 116,4 6,90 d (8,20) 6,94 d (8,70)
6’ 131,4
7,72 d (8,07) 7,78 d (8,68)
ramnopiranose
1” 101,6 5,34 s 5,47 d (1,37)
2” 81,2 a 4,20 m
b
3” 71,8 a 3,82 dd (3,42; 9,66)
4” 73,1 3,13 dd (9,29; 9,27) 3,32 dd
b
(9,62; 9,62)
5” 70,9 a 3,73 m
b
6” 18,1 0,84 d (5,02) 0,98 d (6,17)
arabinopiranose
1”’ 104,3 4,10
a
4,25 d (7,15)
2”’ 72,4 3,39 dd (7,72; 8,10) 3,55 dd (7,38; 9,56)
3”’ 71,2 3,31 m 3,47 dd (3,25; 9,15)
4”’ 68,5 3,57 sl 3,73 m
b
5”’ 66,6
3,48 dd
b
(11,80)
3,24 dl
b
(11,80)
3,68 m
b
3,42 dl
b
(12,65)
Acoplamentos não bem definidos,
a, b
sinais interconversíveis, c – sinais encobertos pelo sinal da água presente
no DMSO
Espectro 21: Espectro de RMN de
1
H de KP3 (400 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
.
Parâmetros: NS 16, SW 5208 Hz, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 10
mg/mL.
Espectro 22: Espectro de RMN de
1
H de KP3 (400 MHz). Ampliação da região entre 5,20 e
7,80 ppm. Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 16, SW 5208 Hz, REF DMSO-d
6
,
TEMP 25ºC, Concentração da amostra 10 mg/mL.
H-2’-6’
H-6
H-8
H-3’-5’
H-6’’
S
H-1”
H-2’-6’
H-6
H-8
H-3’-5’
H-1”
H-1”’
Espectro 23: Espectro de RMN de
1
H de KP3 (300 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD.
Parâmetros: NS 64, SW 7788 Hz, REF CD
3
OD, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 10
mg/mL.
H-2’-6’
H-6
H-8
H-3’-5’
H-6’’
S
H-1”
H-1”’
Espectro 24: Espectro de RMN de
13
C de KP3 (100 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
.
Parâmetros: NS 35840, SW 25062 Hz, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra
10 mg/mL.
C-2’,6’
C-1’
C-3’,5’
C-3
C-4
C-10
C-2 e C-9
C-5 e C-7
C-6’’
C-4’
C-1’’’
C-1’’
C-6
C-8
C-2’’
C-4’’
C-2’’’
C-3’’
C-3’’’
C-5’’
C-5’’’
C-4’’’
Espectro 25: Espectro de RMN 2D – COSY 90 de KP3 (400 MHz). Solvente utilizado:
DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 16, SW 4006 Hz, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da
amostra 10 mg/mL.
H-2’ e 6’→ H-3’ e 5’
H-6→ H-8
H-5’’→ H-6’’
Espectro 26: Espectro de RMN 2D – HMQC de KP3 (400 MHz). Solvente utilizado: DMSO-
d
6
. Parâmetros: NS 32, SW 4006 Hz, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra
10 mg/mL.
H-1’’→ C-1’’
H-8→ C-8
H-6→ C-6
H-6’’→ C-6’’
H-2’ e 6’→ C-2’ e 6’
H-3’ e 5’→ C-3’ e 5’
H-4’’→ C-4’’
H-5’’’→ C-5’’’
Espectro 27: Espectro de RMN 2D – HMBC de KP3 (400 MHz). Solvente utilizado: DMSO-
d
6
. Parâmetros: NS 80, SW 4006 Hz, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra
10 mg/mL.
H-1’’→ C-3
H-6’’→ C-5’’
ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DO FLAVONÓIDE KP4
O flavonóide codificado como KP4, isolado a partir da fração em acetato de etila (F3),
apresentou-se sob a forma de pó amorfo amarelo-pálido, com uma massa total de 3,4 mg.
A proposta estrutural para o flavonóide KP4 foi baseada nos dados de RMN de
1
H e
COSY obtidos em CD
3
OD (200 MHz).
KP4: 3,4 mg; R
f
0,57 em AAAA 30:3:1:1; [α]
D
25
= -87 (MeOH; c 1,0); m/z 431,0 [M-
H]
-
no espectro de massas (ESI/MS).
RMN de
1
H
O espectro de RMN de
1
H para KP4 (Espectro 28) apresentou sinais em 6,93 ppm
(2H; d; J
orto
= 8,76 Hz) e 7,77 ppm (2H; d; J
orto
= 8,76 Hz), que foram atribuídos aos
hidrogênios H-3’,5’ e H-2’,6’ do anel B, respectivamente, e sinais em 6,20 ppm (H-6, d,
J
meta
= 1,65 Hz) e 6,38 ppm (H-8, d, J
meta
= 1,65 Hz), atribuídos aos hidrogênios do anel A do
flavonóide. Esses sinais são compatíveis com a aglicona do kaempferol.
Assim como observado para KP2, a região glicosídica apresenta apenas um sinal de
hidrogênio anomérico (H-1”: 5,37 ppm), sendo este compatível com O-glicosilação
diretamente no anel da aglicona. A constante de acoplamento para este hidrogênio (J=
1,64 Hz) indica uma relação trans-diequatorial entre H-1” e H-2”.
Em 0,92 ppm observa-se um dupleto (3H; J = 5,68 Hz) correspondente à metila
terminal do açúcar. Como já discutido para os outros flavonóides, a presença desta metila
somada à presença de um hidrogênio anomérico com J pequeno sugerem que este
glicosídeo seja uma ramnose.
A glicosilação na posição 7 desloca os hidrogênios 6 e 8 para campo mais baixo (6,30
e 6,60 ppm, respectivamente). Já quando a hidroxila desta posição encontra-se livre, os
sinais para H-6 e H-8 apresentam-se em campo mais alto (6,20 e 6,40 ppm,
respectivamente) (MABRY et al., 1970). Portanto, a ramnnose de KP4 encontra-se ligada
ao carbono 3 da aglicona, de acordo com o padrão de glicosilação observado em KP1, KP2 e
KP3.
De acordo com esses dados, propõe-se para KP4 a estrutura do kaempferol mono
glicosilado na posição 3 por uma unidade de ramnose.
Os dados de
1
H -
1
H COSY confirmaram a estrutura do kaempferol-3-O-α-
ramnopiranosídeo, também conhecido como afzelina, proposta para KP4.
Os dados de RMN de
1
H para a molécula estão listados na Tabela 21.
Este flavonóide foi isolado anteriormente a partir de outras espécies, dentre elas
Persea americana (Lauraceae). Neste estudo, a afzelina foi descrita como um dos
responsáveis pela atividade antiviral do infuso de P. americana (MIRANDA et al., 1997).
Figura 22: Estrutura de KP4 (kaempferol-3-O-α-ramnopiranosídeo) – afzelina
OHO
OH O
OH
O
O
HO
HO
OH
TABELA 21: Dados de
13
C (100 MHz) e
1
H (300 MHz) para 3-O-α-arabinopiranosil (1→2) α-
ramnopiranosídeo de kaempferol (afzelina) – KP4 (CD
3
OD).
δ
H
Multiplicidade
KAEMPFEROL
2 - -
3 - -
4 - -
5 - -
6 6,20 d (1,65)
7 - -
8 6,38 d (1,65)
9 - -
10 - -
1’ - -
2’ 7,77 d (8,75)
3’ 6,93 d (8,75)
4’ - -
5’ 6,93 d (8,75)
6’ 7,77 d (8,75)
R
R
A
A
M
M
N
N
O
O
P
P
I
I
R
R
A
A
N
N
O
O
S
S
E
E
1” 5,37 d (1,64)
2” 4,20 dd (1,64; 3,21)
3” 3,70 dd (3,21; 9,18)
4” 3,28-3,38 c
5” 3,28-3,38 c
6” 0,92 d (5,68)
Acoplamentos não bem definidos,
a, b
sinais interconversíveis,
c – sinais encobertos pelo sinal do solvente.
Espectro 28: Espectro de RMN de
1
H de KP4 (300 MHz). Solvente utilizado: CD
3
OD.
Parâmetros: NS 128, SW 5592 Hz, TD 32768, REF TMS, TEMP 25ºC, Concentração da
amostra 7 mg/mL.
H-2’-6’
H-6
H-8
H-3’-5’
H-6’’
S
H-1”
H-2’’
H-3’’
Espectro 29: Espectro de RMN 2D – COSY 90 de KP4 (300 MHz). Solvente utilizado:
CD
3
OD. Parâmetros: NS 8, SW 2003 Hz, TD 2048, REF TMS, TEMP 25ºC, Concentração da
amostra 7 mg/mL.
ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DO FLAVONÓIDE KP5
H-2’ e 6’→ H-3’ e 5’
H-6→ H-8
H-5’’→ H-6’’
H-1’’→ H-2’’
O flavonóide codificado como KP5, isolado a partir da fração em acetato de etila (F3),
apresentou-se sob a forma de pó amorfo amarelo-pálido, com uma massa total de 5,2 mg.
A proposta estrutural para o flavonóide KP5 foi baseada nos dados de RMN de
1
H e
13
C, HMQC, HMBC, COSY e NOE Sel 1D obtidos em DMSO-d
6
(300 MHz).
KP5: 4,0 mg; R
f
0,70 em BAW 8:1:1; [α]
D
25
= -380 (MeOH; c 1,0); m/z 491,0 [M-H]
-
no espectro de massas (ESI/MS).
RMN de
1
H
A análise cuidadosa desse espectro permitiu verificar um padrão de sinais diverso
daqueles observados para os outros flavonóides isolados. O sinal em 6,87 ppm referente a
um simpleto sugeriu a estrutura de uma flavona. Na região de aromáticos foram
observados, além desse simpleto, um outro em 6,59 ppm referente a apenas um hidrogênio
do anel A, estando todas as outras posições deste anel substituídas.
O padrão de sinais observado para o anel B sugere um anel 3’, 4’ – dissubistituído. O
dupleto largo em 7,55 ppm (J=8,48 Hz) corresponde ao H-6’ deste anel. Em 7,51 ppm pode
ser observado um simpleto largo referente ao H-2’ (J muito pequeno - acoplamento meta
com H-6’). O último sinal correspondente a esse anel é um dupleto em 6,98 ppm (J=8,48
Hz) referente ao H-5’, mostrando acoplamento em orto com o H-6’.
O sinal observado em 12,56 ppm mostra a presença de uma hidroxila não substituída
na posição 5 do anel A, comprovada pela ligação de hidrogênio intramolecular entre o H
desta –OH e o O da carbonila em C-4.
A presença de uma unidade de açúcar ligada ao esqueleto da aglicona foi sugerida
pelo dupleto observado em 5,02 ppm (J = 6,55 Hz; 1H) referente ao hidrogênio anomérico
deste açúcar. Este deslocamento químico é compatível com uma O-glicosilação.
O espectro 30 possui um sinal largo referente à água presente no DMSO-d
6
, o que
dificulta a visualização dos sinais nesta região. Por este motivo, o espectro de RMN de
1
H foi
refeito, desta vez utilizando DMSO-d
6
anidro, espectro 32. Neste novo espectro, além dos
sinais observados anteriormente, é possível observar um simpleto intenso em 3,94 ppm
(integração=6H) compatível com a presença de dois grupos metoxila. Outro sinal observado
neste espectro é o hidrogênio da hidroxila presente no anel B (10,07 ppm).
A tabela 21 mostra os deslocamentos químicos de RMN de
1
H, em DMSO-d
6
, para o
flavonóide KP5.
De acordo com esses dados parciais, pode-se propor para KP5 a estrutura da dimetoxi
– diidroxiflavona mono-O-glicosilada.
RMN de
13
C
O espectro de RMN de
13
C forneceu 23 sinais (Espectro 33). Dezessete destes sinais
foram atribuídos aos carbonos da aglicona do flavonóide e os seis sinais restantes aos
carbonos da unidade de açúcar.
Os sinais de RMN de
13
C para KP5 confirmam a estrutura da aglicona e a presença dos
grupos metoxila (56,2 ppm e 62,5 ppm).
O deslocamento atribuído ao carbono anomérico (101,3) confirma a presença de O-
glicosilação, o que já havia sido evidenciado no espectro de
1
H. Os demais valores de RMN
de
13
C confirmam a estrutura da glicopiranose.
COSY, HMQC e HMBC
A partir da análise do COSY (Espectro 34) e do HMQC (Espectro 35) foi possível
atribuir todos os sinais de hidrogênio e carbono para KP5 e confirmam a unidade da β-
glicopiranose.
A análise dos dados de HMBC (Espectro 36) permitiu definir a posição das metoxilas
na aglicona a partir das correlações observadas. A metoxila em 62,5 ppm está ligada à
posição 8 do anel A e a metoxila em 56,2 ppm à posição 3’ do anel B. Os dados importantes
para definir a posição das duas metoxilas encontram-se assinalados na estrutura de KP5
mostrada abaixo em azul. As correlações observadas neste espectro permitiram também a
confirmação das atribuições dos sinais feitas nos espectros de
1
H e
13
C.
O
O
OCH
3
OH
OCH
3
OH
Gli-O
H
H
H
HH
12,56 ppm
6,59 ppm
10,07 ppm
3,94 ppm
3,95 ppm
F
F
I
I
G
G
U
U
R
R
A
A
2
2
3
3
:
:
A
A
L
L
G
G
U
U
M
M
A
A
S
S
C
C
O
O
R
R
R
R
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Ç
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Õ
Õ
E
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O
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B
B
S
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V
V
A
A
D
D
A
A
S
S
P
P
A
A
R
R
A
A
K
K
P
P
5
5
U
U
T
T
I
I
L
L
I
I
Z
Z
A
A
N
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D
O
O
A
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C
C
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C
C
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E
H
H
M
M
B
B
C
C
N
N
O
O
E
E
S
S
E
E
L
L
1
1
D
D
(
(
N
N
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C
C
L
L
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E
A
A
R
R
O
O
V
V
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E
R
R
H
H
A
A
U
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S
S
E
E
R
R
E
E
N
N
H
H
A
A
N
N
C
C
E
E
M
M
E
E
N
N
T
T
)
)
A técnica do NOE Sel 1D permite observar correlações que envolvem interações entre
hidrogênios que estão espacialmente próximos (em geral, menor do que
4 Å) (KAISER,
2000).
Neste experimento (Espectro 37), foi observado efeito NOE entre o hidrogênio
anomérico da glicose H-1’’ (5,02 ppm) e o H-6 (6,59 ppm). Considerando que a hidroxila
em C-5 encontra-se livre (comprovado pelo sinal em 12,7 ppm relativo a ligação de
hidrogênio com a carbonila em C-4), o efeito NOE observado permite concluir que a glicose
encontra-se ligada à posição 7 do anel A.
A partir destes dados foi possível concluir que o flavonóide KP5 é uma 8,3’-dimetoxi-
5,4’-diidroxiflavona 7-O-β-glicopiranosídeo. Este é o segundo relato deste flavonóide que foi
descrito pela primeira vez em Setaria italica (Poaceae) com base em dados de RMN de
1
H e
de espectrometria de massas do seu derivado hexa-acetato (JAIN et al., 1991).
Os dados de RMN de
1
H e
13
C para a molécula KP5 estão listados na Tabela 22.
Figura 24: Estrutura de KP5 (8,3’-dimetoxi-5,4’-diidroxiflavona 7-O-β-
glicopiranosídeo)
O
O
OCH
3
OH
OCH
3
OH
O
HO
HO
OH
O
OH
TABELA 22: Dados de
13
C (75 MHz) e
1
H (300 MHz) para 8,3’-dimetoxi-5,4’-diidroxiflavona
7-O-β-glicopiranosídeo
δ
C
δ
H
[mult., J (Hz)]
DMSO-d
6
DMSO-d
6
AGLICONA
2 165,3 -
3 104,3 6,87 s
4 183,4 -
5 157,2 -
6 99,8 6,59 s
7 157,1 -
8 130,2 -
9 150,1 -
10 106,1 -
1’ 122,6 -
2’ 110,9 7,51 br s
3’ 149,2 -
4’ 152,0 -
5’ 117,1 6,98 d (8,48)
6’ 122,6 7,55 br d (8,48)
3’- OMe 56,2 3,95 s
8 - OMe 62,5 3,94 s
glicopiranose
1” 101,3 5,02 d (6,55)
2” 74,2 3,33
a
m
b
3” 77,5 3,17 m
b
4” 70,7 3,33
a
m
b
5” 78,1 3,43
a
m
b
6” 61,7 3,43
a
m
b
; 3,71 m
b
a
Sinais encobertos pelo sinal da água presente no solvente,
b
Acoplamentos não bem definidos
Espectro 30: Espectro de RMN de
1
H de KP5 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
.
Parâmetros: NS 16, SW 7788 Hz, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 8
mg/mL.
H-2’
H-6
H-5’
H-6’
H-1’’
S
H-3
OH-5
Hidroxilas do
açúcar
Espectro 31: Espectro de RMN de
1
H de KP5 (300 MHz). Ampliação da região entre 8,00 e
4,80 ppm. Solvente utilizado: DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 16, SW 7788 Hz, REF DMSO-d
6
,
TEMP 25ºC, Concentração da amostra 8 mg/mL.
H-2’
H-5’
H-6’
H-1’’
H-3
H-6
Espectro 32: Espectro de RMN de
1
H de KP5 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
anidro. Parâmetros: NS 8, SW 7788 Hz, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da
amostra 8 mg/mL.
3’-Me e 8-Me
OH-4’
OH-5
H-2’ e 6’
H-5’ e H-3
H-1’’
H-6
Espectro 33: Espectro de RMN de
13
C de KP5 (75 MHz). Solvente utilizado: DMSO-d
6
.
Parâmetros: NS 45803, SW 21186 Hz, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra
8 mg/mL.
C-1’
C-1’
C-3’’,5’’
C-3
C-1”
C-8
C-4
8-Me
C-4'
C-6
C-10
C-9
C-2
C-5 e 7
C-4”
C-5”
C-3’
C-6’
C-5’
C-2’
C-2’’
3’-Me
Espectro 34: Espectro de RMN 2D – COSY 90 de KP5 (300 MHz). Solvente utilizado:
DMSO-d
6
. Parâmetros: NS 8, SW 5387Hz, REF DMSOd
6
, TEMP 25ºC, Concentração da
amostra 8 mg/mL.
H-5’→ H-6’
H-1’’→ H-2’’
H-6a’’→ H-6b’’
H-4’’→ H-5’’
Espectro 35: Espectro de RMN 2D – HMQC de KP5 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-
d
6
. Parâmetros: NS 64, SW 5387 Hz, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra 8
mg/mL.
H-3’-OMe → C-3’-OMe
H-1’’→ C-1’’ H-3→ C-3
H-6→ C-6
H-5’→ C-5’
H-6’→ C-6’
H-2’→ C-2’
H-8-OMe → C-8-OMe
H-4’’→ C-4’’
H-2’’→ C-2’
H-3’’→ C-3’’
H-5’’→ C-5’’
H-6’’→ C-6’’
Espectro 36: Espectro de RMN 2D – HMBC de KP5 (300 MHz). Solvente utilizado: DMSO-
d
6
. Parâmetros: NS 128, SW 5387 Hz, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC, Concentração da amostra
8 mg/mL.
H-3’-OMe → C-3’
H-8-OMe → C-8-Me
H-6 → C-10
H-6 → C-8
H-6 → C-5/C-7
H-3 → C-10
H-3 → C-1’
H-3 → C-2
H-3 → C-4
OH-5 → C-10
OH-5 → C-5
Espectro 37: Espectro de RMN de
1
H - NOE 1D seletivo de KP5 (300 MHz). Solvente
utilizado: DMSO-d
6
anidro. Parâmetros: NS 8, SW 7788 Hz, REF DMSO-d
6
, TEMP 25ºC,
Concentração da amostra 8 mg/mL. Irr.: 3,88 ppm; 6,65 ppm;12,67 ppm.
H-1’
’
H-6
NOE
ATIVIDADE ANTILEISHMANIA E CITOTOXIDEZ DOS FLAVONÓIDES
ISOLADOS DO EXTRATO AQUOSO DE K. pinnata
Com o objetivo de facilitar a compreensão dos resultados mostrados, este tópico foi
iniciado com uma tabela que mostra o nome e as estruturas dos flavonóides isolados da
fração em acetato de etila (F3) do extrato aquoso de K. pinnata.
Tabela 23: Flavonóides isolados de K. pinnata
Flavonóide Nome Estrutura
KP1
quercetina-3-O-α-L-arabinopiranosil
(1→2) α-L-ramnopiranosídeo
O
HO
OH O
OH
O
O
HO
HO
OH
O
O
OH
HO
HO
KP2
quercetina 3-O-α-L-
ramnopiranosídeo (quercitrina)
O
HO
OH O
OH
O
O
HO
HO
OH
OH
KP3
kaempferol-3-O-α-L-arabinopiranosil
(1→2) α-L-ramnopiranosídeo
(kapinnatosídeo)
O
HO
OH O
OH
O
O
HO
HO
O
O
OH
HO
HO
KP4
kaempferol3-O-α-L-
ramnopiranosídeo (afzelina)
OHO
OH O
OH
O
O
HO
HO
OH
KP5
4’,5-diidroxi-3’,8-dimetoxiflavona-7-
O-β-D-glicopiranosídeo
O
O
OCH
3
OH
OCH
3
OH
O
HO
HO
OH
O
OH
RESULTADOS IN VITRO
Com o objetivo de avaliar a atividade antileishmania dos cinco flavonóides isolados de
KP, os flavonóides KP1 a KP5 foram testados em amastigotas intracelulares de Leishmania
amazonensis em três diferentes concentrações (Figura 25). O medicamento Pentostam® foi
utilizado para fins de comparação de atividade, como controle positivo.
Como pode ser observado na Figura 25, KP2 (quercitrina) apresentou a maior
atividade antileishmania quando comparado com os outros flavonóides testados e também
com o Pentostam®, apesar de todos os flavonóides terem apresentado certa atividade. Essa
diferença de atividade pode ser vista mais claramente na concentração de 100 µg/mL, onde
o flavonóide KP2 inibe 82 % o crescimento das amastigotas, Pentostam 70 %, KP1 60 %,
KP4 58,6 %, KP3 e KP5, 39,2 % e 34,9 %, respectivamente. Este flavonóide foi mais ativo
do que a droga comercial Pentostam® em praticamente todas as concentrações testadas.
Atividade antileishmania dos flavonóides de KP
0
20
40
60
80
100
0 1 10 100
Concentração (µ g/mL)
Inibição (% controle)
KP1
KP2
KP3
KP4
KP5
Pentostam
Figura 25: Inibição do crescimento de amastigotas de L. amazonensis pelos flavonóides
isolados de Kalanchoe pinnata. O medicamento comercial Pentostam® foi utilizado como controle
positivo. Macrófagos infectados e não tratados (controle negativo – 0 % de inibição) = 29398 UF. A
carga parasitária foi considerada em termos de unidades de fluorescência (UF) específica onde o valor
de autofluorescência da cultura de macrófagos não infectados e não tratados (4428 UF) foi subtraído
dos valores das culturas tratadas. Média aritmética ± desvio padrão (n=3). Significância em relação ao
controle, P<0,05 (*).
A atividade dos flavonóides testados encontra-se resumida na Tabela 24. Esta tabela
mostra a concentração de cada substância capaz de inibir em 50% o crescimento das
amastigotas intracelulares (IC
50
). Para permitir uma comparação mais direta entre estas
substâncias, KP 1-5, foi calculado o IC
50
aproximado para cada uma delas em µg/mL e µM.
Esta última medida elimina as variações decorrentes do peso molecular. Não é possível
calcular a IC
50
para o Pentostam devido à sua variação de peso molecular.
*
*
Tabela 24: IC
50
aproximado para KP 1-5 em µg/mL e µM
IC
50
(µg/mL) IC
50
(µM)
KP1 40 80
KP2* 4 10
KP3 > 100 > 180
KP4 70 160
KP5 > 100 > 205
Pentostam 20 -
* média de dois experimentos independentes
Os dois flavonóides mais ativos KP1 e KP2 (Figura 25 e Tabela 24) possuem a
quercetina como aglicona, mostrando a importância desta característica estrutural para a
atividade antileishmania destes compostos. Esse fato pode ser confirmado pela diferença de
atividade observada entre KP2 (quercitrina) e KP4 (afzelina) e entre KP1 e KP3 que
possuem como única diferença entre eles a aglicona (KP2 e KP1 possuem quercetina como
aglicona enquanto que KP4 e KP3 possuem kaempferol). Essas duas agliconas, quercetina
e kaempferol, diferem apenas na presença de uma hidroxila a mais na posição 3’, no caso
da quercetina.
Ao comparar as atividades de KP1 e KP2, ambos contendo quercetina como aglicona,
vemos que a diferença de atividade pode ser justificada apenas pela presença de uma
unidade de arabinose ligada ao C-2’’ da ramnose em C-3. Sendo assim, a adição de um
açúcar externo ligado a ramnose na posição 3 leva a uma redução na atividade biológica do
flavonóide. Esta redução pode estar associada à absorção deste flavonóide pelo macrófago.
Um trabalho recente mostra o papel importante da ramnose no processo de interação
com a membrana externa do macrófago, facilitando a internalização de esporos de uma
cepa virulenta de
Bacillus anthracis (BONZUE et al., 2005). Neste estudo, os autores
construíram uma cepa de Bacillus anthracis mutante que não possui ramnose na membrana
externa dos seus esporos. Esses esporos não foram capazes de se ligar eficientemente à
membrana de macrófagos, reduzindo sua internalização (BONZUE et al., 2005). A
importância de alguns açúcares para adesão e posterior internalização pelos macrófagos, foi
também descrita para alguns tipos de lipossomas que possuem unidades sacarídicas
expostas. Em estudo realizado em L. major, a presença do açúcar manose na composição
dos lipossomas aumenta o efeito do fármaco (MEDDA et al., 1993). Este fato poderia estar
relacionado com a maior atividade observada para o flavonóide KP2, quando comparado ao
flavonóide KP1.
A partir da análise desses resultados podemos concluir que para a atividade
antileishmania in vitro é importante a presença da ramnose na posição 3, não substituída, e
do padrão de hidroxilação do anel B, 3’,4’-diidroxilado, conhecido como porção catecol
(características ressaltadas em rosa na estrutura de KP2 mostrada abaixo).
O
HO
OH O
OH
O
O
HO
HO
OH
OH
Figura 26: Estrutura de KP2 (quercetina 3-O-α-L-ramnopiranosídeo)-quercitrina
Nenhum dos flavonóides testados apresentou citotoxidez significativa (Figura 27). O
ensaio de liberação da enzima intracelular lactato-desidrogenase (LDH) é um teste bastante
sensível de citotoxidez e valores baixos, como 30 % de liberação em 72 horas não são
considerados como tóxicos. Desta forma, a atividade antileishmania de KP2 observada é
seletiva à Leishmania e não está relacionada à morte de macrófagos.
Citotoxicidade dos flavonóides de KP
0
20
40
60
80
100
0 1 10 100
Concentração (
µ
g/mL)
Liberação Específica
(% controle)
KP1
KP2
KP3
KP4
KP5
Pentostam
Figura 27: Atividade citotóxica dos flavonóides isolados de Kalanchoe pinnata. A citotoxicidade
foi medida através do percentual de liberação específica da enzima lactato desidrogenase. Liberação
máxima com Triton (100%): DO=1,785 e Liberação espontânea (0%):DO=0,412. Média aritmética ±
desvio padrão (n=3).
O flavonóide mais ativo in vitro, quercitrina (KP2), foi submetido a um novo teste,
desta vez para comparação de sua atividade com a da aglicona quercetina, visando
confirmar a importância da ramnose não substituída na posição 3 não para sua atividade
antileishmania in vitro (Figura 28). Neste experimento foi observado que a quercetina (IC
50
> 100 µg/mL) é muito menos ativa do que a quercitrina (KP2) – IC
50
≈ 1 µg/mL,
confirmando a importância da ramnose para que haja uma atividade biológica significativa
in vitro.
Avaliação comparativa da atividade
antileishmania de KP2
0
20
40
60
80
100
120
0 0,01 0,1 1 10 100
Concentração (µ g/mL)
Inibição (% controle)
KP2
Pentostam
quercetina
Figura 28: Inibição do crescimento de amastigotas de L. amazonensis pelos flavonóides KP2
(quercitrina) e quercetina. O medicamento comercial Pentostam® foi utilizado como controle positivo.
Cultura de macrófagos infectados e não tratados (controle negativo – 0 % de inibição) = 2,067 UF foi
utilizada como controle. A carga parasitária foi considerada em termos de unidades de fluorescência
específica onde o valor de autofluorescência da cultura de macrófagos não infectados e não tratados
(0,323 UF) foi subtraído dos valores das culturas tratadas. Média aritmética ± desvio padrão (n=3).
Significância em relação ao controle, P<0,05 (*).
RESULTADOS IN VIVO
Muitos estudos in vitro foram feitos para determinar a atividade biológica de
flavonóides, porém estes resultados não podem ser facilmente extrapolados para sistemas
in vivo. Isso se deve ao fato de que os flavonóides passam por processos de metabolização
*
*
durante a absorção intestinal e durante sua distribuição, até acumulação em tecidos
específicos (PRASAIN et al., 2004).
Anteriormente, o extrato aquoso das folhas de KP foi avaliado num modelo murino de
leishmaniose cutânea onde foi observado que KP protege camundongos contra uma infecção
progressiva por Leishmania amazonensis e que a via oral é tão eficaz quanto o tratamento
parenteral com Glucantime (ROSSI-BERGMANN e cols, 1995).
Devido à capacidade do extrato de KP atuar in vivo e também devido ao fato de que
uma substância pode sofrer modificações estruturais através da metabolização, tornou-se
importante avaliar a atividade dos flavonóides isolados de KP também in vivo. Para tal, foi
utilizado modelo de camundongos BALB/c infectados por L. amazonensis na orelha esquerda
(Figura 29), conforme descrito na parte experimental. É importante esclarecer que apenas a
atividade dos flavonóides KP1 e KP2 (quercitrina) foi avaliada in vivo, visto que os demais
flavonóides foram isolados em pequena quantidade. A atividade destes flavonóides foi
comparada à do extrato aquoso de K. pinnata e à da aglicona comercial quercetina nos
ensaios realizados neste estudo.
Quando avaliados in vivo em doses orais diárias de 0,4 mg durante 30 dias, ambos os
flavonóides (KP1 e KP2) foram ativos, sendo capazes de controlar a lesão na orelha
infectada dos camundongos mesmo 28 dias após a interrupção do tratamento oral (Figura
30). O mesmo foi observado para o extrato aquoso de K. pinnata e para a aglicona
comercial quercetina. Esta equivalência de atividade pode estar relacionada ao metabolismo
in vivo dessas substâncias, que pode estar levando a metabólitos ativos idênticos e portanto
a uma atividade in vivo bastante semelhante (o metabolismo destas substâncias em
camundongos foi estudado e encontra-se discutido mais adiante). A diferença entre o
tamanho da lesão dos animais tratados e não tratados foi significativa, com P< 0,01 para
EA, KP1 e quercetina e P<0,001 para KP2, no 68º dia de infecção.
Estes resultados in vivo sugerem que os flavonóides de K. pinnata podem estar
estreitamente envolvidos na atividade antileishmania do extrato. Mas este fato não exclui a
possibilidade de que outras substâncias estejam contribuindo em igual ou em maior
proporção para a atividade do extrato aquoso de K. pinnata
Foto cedida por Camila Falcão
Figura 29: Fotografia da lesão na orelha esquerda dos camundongos do grupo
controle 20 dias após a infecção.
Acompanhamento do tamanho da lesão durante
tratamento oral com extrato e flavonóides de Kp
(Infecção na orelha esquerda com 2 x 10
6
prom. de La)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 10203040506070
Dias de infecção
Tamanho da Lesão (mm x 10
2
)
Água destilada
EA
KP2
KP1
Quercetina
Tratamento oral
Figura 30: Eficácia do tratamento oral utilizando os flavonóides de Kalanchoe pinnata, KP1 e
KP2, em comparação com o extrato aquoso (EA) e com a aglicona comercial quercetina. Os animais
foram tratados a partir do dia 7 de infecção com doses diárias de 0,4 mg de KP1, KP2 ou quercetina
ou com doses diárias 8 mg de extrato aquoso (controle positivo). O tratamento foi interrompido no dia
37 e as medidas das lesões acompanhadas por mais 30 dias. As lesões foram medidas nos dias
indicados utilizando paquímetro analógico. Média aritmética ± desvio padrão (n=5). Significância em
relação ao controle, P<0,01 (**).
A carga parasitária nas orelhas destes animais foi medida (Figura 31) e mostrou-se compatível
com o tamanho das lesões (Figura 30). KP1, KP2, EA e quercetina foram capazes de reduzir a carga
parasitária na lesão dos animais, o que pode ser observado no gráfico abaixo ao comparar os grupos
tratados, com o extrato e substâncias, com o grupo controle, tratado com água destilada.
A carga parasitária nas orelhas dos animais foi medida no 68º dia de infecção, 28 dias
após o final do tratamento. Este fato valoriza ainda mais o resultado de baixa carga
parasitária obtido. Ou seja, no 37º dia os parasitas que não morreram durante o
tratamento, se multiplicaram até o 68º dia e é esta situação final que foi medida. Talvez, a
carga parasitária tivesse sido ainda menor se tivesse sido medida no 37º dia, ao término do
tratamento. Porém este procedimento não foi adotado com o objetivo de observar se as
lesões voltariam a crescer após o término do tratamento, o que não aconteceu (Figura 30).
A medida da carga parasitária foi realizada em fluorímetro individualmente, ou seja, na
orelha infectada de cada animal. Este procedimento permitiu o cálculo do desvio padrão
**
para cada grupo. A fluorescência da orelha direita não infectada de cada animal foi utilizada
como zero na medida. Não foi utilizado Pentostam como controle positivo devido à sua
inatividade por via oral (DEMICHELI et al., 2004).
Carga Parasitária nas Lesões
água destilada EA KP1 KP2 quercetina
0
2500
5000
7500
10000
12500
Unidades de Fluorescência
Figura 31: Inibição do crescimento do parasita no local da lesão pelos flavonóides de Kalanchoe
pinnata, KP1 e KP2, pela aglicona comercial quercetina e pelo extrato de KP. As orelhas esquerdas
dos animais foram removidas após o término do experimento referente a Figura 30 e os parasitas
quantificados através de método fluorimétrico (animais infectados com Leishmania amazonensis
fluorescente). A carga parasitária foi considerada em termos de unidades de fluorescência específica
onde o valor de autofluorescência da orelha direita, não infectada, de cada animal foi utilizado como
zero na medida. Média aritmética ± desvio padrão (n=5). Significância em relação ao controle, P<0,01
(**) e P<0,001 (***).
ESTUDO DO MODO DE AÇÃO DE KP2
Alguns experimentos foram conduzidos com o objetivo de compreender como estes
flavonóides exercem sua atividade antileishmania. Para tal, foi utilizado o flavonóide mais
ativo in vitro e que também é ativo in vivo, KP2, conhecido como quercitrina.
Inicialmente foi avaliada a atividade de KP2 em promastigotas de L. amazonensis,
(forma extracelular). Como pode ser observado na Figura 32, a quercitrina, assim como o
extrato aquoso de KP (DA SILVA et al., 1999), não exerce efeito inibitório no crescimento
de promastigotas.
Este resultado sugere que a ação da quercitrina não ocorre diretamente no parasita,
mas nos mecanismos de defesa do macrófago infectado (como a produção de NO) ou que
esta substância necessite de um metabolismo inicial pelo próprio macrófago para poder
exercer sua atividade. Este fato pode ser exemplificado pelos antimoniais pentavalentes,
drogas que agem em amastigotas intracelulares, mas que são inativas em promastigotas
**
***
***
***
extracelulares. Isto ocorre porque o macrófago transforma Sb
V
em Sb
III
e este então é
responsável pelos efeitos do fármaco (OUELLETTE et al., 2004).
Efeito da quercitrina em promastigotas de L.
amazonensis
0
5000
10000
15000
20000
0 0,01 0,1 1 10 100
Concentração (
µ
g/mL)
Unidades de
Fluorescência
Figura 32: Efeito de KP2 (quercitrina) no crescimento de promastigotas de L. amazonensis.
Média aritmética ± desvio padrão (n=3).
Ó
Ó
X
X
I
I
D
D
O
O
N
N
Í
Í
T
T
R
R
I
I
C
C
O
O
(
(
N
N
O
O
)
)
:
:
S
S
Í
Í
N
N
T
T
E
E
S
S
E
E
E
E
F
F
U
U
N
N
Ç
Ç
Õ
Õ
E
E
S
S
O óxido nítrico é uma molécula gasosa simples, habitualmente encontrada no ar
atmosférico em pequenas quantidades, altamente tóxica devido à presença de radical livre
que a torna um agente químico altamente reativo. Quando diluído, o NO tem uma meia vida
de menos de 10 segundos devido à sua rápida oxidação a nitrito e nitrato (FLORA-FILHO &
ZILBERSTEIN et al., 2000). Até meados da década de 1980, o NO era considerado apenas
membro de uma família de poluentes ambientais indesejáveis e carcinógenos potenciais.
Atualmente, o NO constitui um dos mais importantes mediadores de processos intra e
extracelulares. Este radical é produzido a partir da L-arginina, por uma reação mediada pela
enzima NO-sintase constitutiva (c-NOS) e induzível (i-NOS) (DUSSE et al., 2003).
O NO resultante da ativação da i-NOS de macrófagos e neutrófilos possui ação
citotóxica e citostática, promovendo a destruição de microrganismos, parasitas e células
tumorais. A citotoxidade do NO resulta da sua ação direta ou da sua reação com outros
compostos liberados durante o processo inflamatório. A base bioquímica para a ação direta
do NO consiste na sua reação com metais (especialmente o ferro) presentes nas enzimas do
seu alvo. Desta forma, são inativadas enzimas cruciais para o ciclo de Krebs, para a cadeia
de transporte de elétrons, para a síntese de DNA e para o mecanismo de proliferação celular
(DUSSE et al., 2003).
Todas as isoformas de NOS podem ser inibidas por análogos da arginina N-
substituídos, como a N
G
-monometil-L-arginina (L-NMMA), N-imino-etil-L-ornitina (L-NIO),
N
G
-amino-L-arginina (L-NAA), N
G
-nitro- L-arginina (L-NA) e o metil éster correspondente, o
N
G
-nitro-L-arginina-metil-éster (L-Name). Estes análogos competem com a L-arginina e
agem como inibidores específicos da NOS (FLORA-FILHO & ZILBERSTEIN et al., 2000).
INDUÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO POR KP2
Um mecanismo de ação proposto para o extrato de K. pinnata baseia-se na sua
capacidade de estimular a produção de óxido nítrico pelos macrófagos e esta espécie reativa
é então capaz de matar as amastigotas intracelulares (DA SILVA et al., 1999). A influência
de KP2 na produção de óxido nítrico (NO) foi avaliada. A título de comparação o extrato foi
também testado (Figura 33).
Observando o gráfico apresentado na Figura 33 pode-se notar que KP2 e o extrato
de KP (EA) são capazes de estimular a produção de NO em macrófagos não infectados.
As diferenças na concentração de NO observadas no gráfico em relação ao controle
(meio) foram significativas quando avaliadas estatisticamente (P<0,01). Vale ressaltar que
devido ao efeito antioxidante ocasionado pela presença de substâncias polifenólicas no
extrato e pela natureza polifenólica de KP2 a dosagem de NO no meio extracelular
encontra-se dificultada.
Para confirmar a ação de KP2 na produção de NO pelos macrófagos e mais
especificamente em relação a uma possível ativação da enzima óxido nítrico sintase (NOS),
a atividade antileishmania in vitro de KP2 e do extrato de KP (EA) foram avaliadas na
presença e na ausência de NMMA (N-metil-monoarginina), um inibidor irreversível da NOS
(Figura 34).
Como pode ser observado na Figura 34, tanto o extrato (EA) como KP2 perdem a
capacidade de exercer seu efeito em presença de NMMA, sugerindo que este efeito está
envolvido com a ativação da NOS no macrófago. Este fato foi comprovado
anteriormente
para o extrato de K. pinnata in vitro e in vivo (DA SILVA et al., 1999).
Podem ser encontrados alguns relatos na literatura relativos a extratos e substâncias
de origem vegetal capazes de ativar a produção de NO e por conseguinte aumentar a
defesa celular contra o parasita. Por exemplo, o extrato de Allium sativum foi capaz de
atuar contra a infecção de Leishmania major através do aumento da fagocitose pelos
macrófagos e pelo amento na produção de NO por estas células (GHAZANFARI et al., 2006).
Outra espécie vegetal que teve sua atividade antileishmania relacionada ao aumento da
produção de NO foi Cocos nucifera (Palmae) (MENDONÇA-FILHO et al., 2004).
Adicionalmente, o extrato aquoso de Rhodiola sachalinensis (Crassulaceae) mostrou-se
capaz e aumentar a expressão da enzima iNOS e da produção de NO por macrófagos RAW
264.7. Neste caso, a atividade na iNOS foi comprovada utilizando o inibidor N
G
-monometil-
L-arginina (L-NMMA), o que resultou em perda da capacidade de ativação da produção de
NO por este extrato, comprovando o mecanismo de ação proposto (SEO et al., 2001).
Algumas substâncias isoladas tiveram sua atividade ativadora da produção de NO
descrita, como a oleuropeina, uma substância lipídica presente no óleo de oliva (VISIOLI et
al., 1998). Porém, a maior parte dos estudos encontrados é direcionada para a inibição da
produção de NO e a inflamação (MATSUDA et al., 2003). Neste estudo onde 73 flavonóides
foram avaliados, glicosídeos de quercetina, como a isoquercitrina e a rutina, não
apresentaram atividade inibitória significativa da produção de NO (IC
50
>100 µM) (MATSUDA
et al., 2003).
Produção de NO por macrófagos
Meio KP2 EA
0
1
2
3
**
**
[NO]
µ
M
Figura 33: Efeito do extrato aquoso de Kalanchoe pinnata (EA), de sua fração F3 e do
flavonóide KP2 na produção de óxido nítrico (NO) em macrófagos não infectados. Média aritmética ±
desvio padrão (n=3). Significância em relação ao controle, P<0,01 (**).
Efeito do NMMA na atividade do extrato e
flavonóide de KP
0
400
800
1200
1600
2000
KP2 KP2+NMMA EA EA+NMMA
Unidades de Fluorescência
Figura 34: Efeito do inibidor da NOS, N-metil-monoarginina (NMMA), na atividade
antileishmania de KP2 (quercitrina) e do extrato aquoso de KP (EA) in vitro. Controle: macrófagos
infectados e não tratados. Macrófagos infectados e não tratados (controle negativo – 0 % de inibição)
= 4060,3 UF e macrófagos não infectados e não tratados (controle positivo - 100% de inibição) =
3021,0 UF. Todas as barras foram diminuídas da fluorescência dos macrófagos não infectados. Média
aritmética ± desvio padrão (n=2). Significância em relação ao controle, P<0,05 (*).
F
F
L
L
A
A
V
V
O
O
N
N
Ó
Ó
I
I
D
D
E
E
S
S
Os flavonóides constituem uma importante classe de polifenóis, presentes em relativa
abundância entre os metabólitos secundários de vegetais. O termo fenólico ou polifenol
pode ser definido como sendo uma substância que tem um ou mais núcleos aromáticos
contendo substituintes hidroxilados e/ou seus derivados funcionais (ésteres, metoxilas,
glicosídeos e outros) (HARBORNE & MABRY, 1982).
Na classe dos flavonóides, os nomes triviais são empregados freqüentemente e possuem,
na grande maioria dos casos, relação com a planta na qual foram identificadas pela primeira
vez. Por exemplo: tricina foi isolada de Triticum sp., robinetina de Robinia sp., vitexina de
Vitex sp. e quercetina de Quercus sp (HARBORNE & MABRY, 1982).
Podem-se encontrar flavonóides em diversas formas estruturais. Entretanto, a maioria dos
representantes dessa classe possui 15 átomos de carbono em seu núcleo fundamental,
constituído de duas fenilas ligadas por uma cadeia de três carbonos entre elas. Os
flavonóides de origem natural apresentam-se freqüentemente oxigenados e um grande
número ocorre conjugado com açúcares. Esta forma, chamada conjugada, também é
conhecida como heterosídeo. Quando o flavonóide encontra-se sem o açúcar, é chamado de
aglicona, sendo freqüentemente denominada de forma livre (MIDDLETON et al., 2000).
*
*
Diversas funções são atribuídas aos flavonóides nas plantas. Entre elas
podemos citar (WOO et al., 2005):
• Proteção dos vegetais contra incidência de raios ultravioleta e visível
• Proteção contra insetos, fungos, vírus e bactérias
• Atraentes de animais com finalidade de polinização
• Antioxidantes
• Controle da ação de hormônios vegetais
• Inibição de enzimas
O interesse econômico dos flavonóides é decorrente de suas diferentes propriedades, como,
por exemplo, as cores que esses pigmentos possuem, sua importância no processo de
tanagem do couro, na fermentação do chá-da-índia, na manufatura do cacau e suas
contribuições em nutrição e sabor dos alimentos. Além disso, esses compostos possuem
também importância farmacológica, resultado de algumas propriedades importantes
atribuídas a alguns representantes da classe, como por exemplo: anticarcinogênico,
antiinflamatório, antialérgico, antiulcerogênico, antivirais, entre outros (MIDDLETON et al.,
2000; HAVSTEEN, 2002).
F
F
L
L
A
A
V
V
O
O
N
N
Ó
Ó
I
I
D
D
E
E
S
S
E
E
A
A
T
T
I
I
V
V
I
I
D
D
A
A
D
D
E
E
A
A
N
N
T
T
I
I
L
L
E
E
I
I
S
S
H
H
M
M
A
A
N
N
I
I
A
A
Produtos naturais com atividade antileishmania como naftoquinonas, lignanas,
neolignanas, alcalóides e triterpenos tem sido relatados na literatura (CHAN-BACAB & PEÑA-
RODRIGUEZ, 2001). Entretanto, existem poucos estudos relacionados a atividade
antileishmania dos flavonóides. Atualmente, este interesse vem crescendo e trabalhos
bastante recentes estão contribuindo para a compreensão do perfil de atividade desta classe
de polifenóis (ver adiante).
Luteolina, uma flavona comum na dieta humana mostrou-se ativa contra
promastigotas e amastigotas intracelulares de Leishmania donovani, agente etiológico da
leishmaniose visceral. Além da luteolina, foi também descrita atividade similar, porém um
pouco menor, para o flavonol quercetina (MITTRA et al., 2000). Posteriormente, a atividade
da quercetina nanoencapsulada foi demonstrada em Leishmania donovani, com redução
substancial da toxidez hepática e renal. Uma relação inversa entre eficácia e tamanho das
partículas foi estabelecida (SARKAR et al., 2002). Mais recentemente foi demonstrado que a
atuação da quercetina na leishmaniose visceral não está apenas envolvida no controle da
infecção, mas também no controle da anemia associada e este tipo de doença (SEN et al.,
2005).
Foi demonstrado que a atividade dos flavonóides luteolina e quercetina encontra-se
relacionada com a capacidade desta flavona e deste flavonol em induzir a apoptose do
parasita. Esta indução de apoptose ocorre porque estes flavonóides são capazes de interagir
e interferir na estabilidade do complexo Topoisomerase II - DNA (MITTRA et al., 2000).
Recentemente, outros autores mostraram a capacidade de algumas substâncias em inibir a
atividade da topoisomerase do parasita seletivamente ou não, quando comparado à
atividade na topoisomerase da célula hospedeira. Neste estudo, a quercetina mostrou-se
capaz de inibir ambas as topoisomerases, apresentando pequena seletividade em relação à
enzima do parasita. Este fato justifica a citotoxicidade apresentada por este flavonol (JEAN-
MORENO et al., 2006).
Proantocianidinas apresentaram atividade antileishmania em L. donovani intracelular,
mas nenhuma atividade foi detectada em promastigotas. Esta atividade em amastigotas foi
justificada pela capacidade destas moléculas em aumentar a produção de óxido nítrico em
células RAW 264.7, além de apresentar efeitos modulatórios na liberação de TNF-α
(KIDERLEN et al., 2001). A incapacidade de alguns flavonóides em atuar na forma
promastigota de Leishmania amazonensis também foi demonstrada. Uma flavona
metoxilada e cinco flavonóis metoxilados isolados de Chromolaena hirsuta (Asteraceae)
mostraram-se inativos ou pouco ativos neste modelo extracelular de experimento e ativos
em amastigotas intracelulares (TALEB-CONTINI et al., 2004).
Uma metoxichalcona isolada das inflorescências de Piper anduncum (Piperaceae),
2’,6’-diidroxi-4’-metoxichalcona, mostrou atividade antileishmania em promastigotas e
amastigotas intracelulares de L. amazonensis. Foi demonstrada alteração na estrutura das
mitocôndrias do parasita em presença desta substância (TORRES-SANTOS et al., 1999).
Outra classe de flavonóides apresentou atividade antileishmania, desta vez em
amastigotas axênicas de Leishmania donovani. Isoflavonas isoladas de Psorothamnus
arborescens (Fabaceae) mostraram-se ativas e seletivas, não apresentando citotoxicidade
em células VERO (SALEM et al., 2006).
Outro fator que torna esta classe química promissora para o tratamento da leishmaniose é o
fato de que alguns flavonóides mostraram-se capazes de se ligar aos transportadores mediados por
glicoproteína-P levando a uma diminuição da resistência da leishmania a múltiplas drogas (DI PIETRO
et al., 2002; PEREZ-VICTORIA et al., 2001). A resistência a antimoniais tem sido um problema
significativo no tratamento das leishmanioses (GROGL et al., 1992; SUNDAR et al., 2000). Desta
forma, parece que no caso de termos um flavonóide sendo utilizado no tratamento clínico da
leishmaniose, a chance do parasita desenvolver resistência a essa nova droga torna-se reduzida.
Devido ao crescente interesse no estudo da atividade antileishmania de flavonóides,
foi desenvolvido um estudo de relação estrutura-atividade com 105 flavonóides ou
derivados destes em amastigotas axênicas (amastigotas extracelulares) de Leishmania
donovani. Neste estudo os autores observaram que os flavonóis pertencem à classe mais
ativa de compostos testados. Vale ressaltar que representantes das classes das flavonas,
biflavonas, flavanonas, isoflavonas, cumarinas e ácidos cinâmicos foram avaliados. Neste
estudo não foram pesquisados possíveis mecanismos de ação para estas moléculas
(TASDEMIR et al., 2006).
O estudo desenvolvido nesta tese de doutorado tem a vantagem de ter sido
desenvolvido em amastigotas intracelulares em ensaios que portanto envolviam a célula
hospedeira, ao contrário das amastigotas axênicas. Além disto, a atividade antileishmania
observada in vitro pode ser comprovada em experimento in vivo.
VARIAÇÕES SAZONAIS E DE CONDIÇÕES DE CULTIVO SOBRE O PERFIL
QUÍMICO DO EXTRATO DE Kalanchoe pinnata
A atividade antileishmania de KP está bem estabelecida, através de experimentos in
vitro (DA-SILVA et al., 1999), in vivo (DA-SILVA et al., 1995) e em um único caso clínico
humano (TORRES-SANTOS et al., 2003). Seu mecanismo de ação foi também determinado
(DA-SILVA et al., 1999) e, além disso, os constituintes ativos foram identificados
(MUZITANO et al., 2005). A toxidez do extrato de KP foi verificada também por nosso grupo
em camundongos e em humano e nenhuma reação adversa ou toxidez foi observada. Os
níveis séricos de alanina-aminotransferase, de aspartato-aminotransferase, de uréia e de
fosfatase alcalina eram inalterados indicando ausência de toxidez crônica ao fígado, ao
coração e aos rins (TORRES-SANTOS et al., 2003).
A etapa seguinte no estudo da atividade antileishmania de KP é desenvolver um ensaio
clínico com um número significativo de pacientes. Neste caso, a garantia de qualidade do
fitoterápico é essencial para a credibilidade do ensaio a ser realizado.
De acordo com as normas sugeridas pelo United States Food and Drug Administration
e pela The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, várias análises devem
ser executadas com a finalidade de certificação das drogas botânicas e de preparações
fitoterápicas (ENG SHI ONG, 2004). A Agência Nacional de Vigilância Sanitária exige para
fins de registro como medicamento fitoterápico análise qualitativa e quantitativa dos
princípios ativos e/ou marcadores característicos da espécie vegetal em questão (ANVISA,
2004).
A padronização é um pré-requisito básico para a consistente eficácia de um produto
fitoterápico. Em contraste às substâncias quimicamente definidas, as plantas medicinais e,
portanto os fitoterápicos são regularmente sujeitos a variações naturais consideráveis.
Assim, a composição qualitativa e quantitativa dos constituintes farmacologicamente
relevantes pode variar consideravelmente (GALDCKE et al., 2003).
Um pré-requisito muito importante para a padronização bem sucedida é a
disponibilidade de procedimentos analíticos seletivos e reprodutíveis, apropriados para a
determinação dos constituintes importantes (análise quantitativa e “fingerprint” qualitativa)
(GALDCKE et al., 2003).
No caso de KP, os constituintes importantes são aqueles que contribuem para a
eficácia terapêutica, como os flavonóides presentes na fração ativa, especialmente a
quercitrina.
O objetivo desta parte da tese é identificar um método analítico para o controle de
qualidade do extrato de KP e verificar a variação dos constituintes químicos devido à
colheita em diferentes estações do ano, presença ou ausência de luz solar, idade das folhas
e tipo de extração aquosa. Em uma segunda etapa procedeu-se à avaliação dos extratos
obtidos a partir da espécie monoclonal de KP, desenvolvida com o objetivo de minimizar as
variações individuais da planta e otimizar a produção de extrato ativo.
Visando este objetivo, amostras de extratos, frações e substâncias isoladas de K.
pinnata foram analisados utilizando CLAE-UV-EM (ionização por elétron-spray). Vários
métodos cromatográficos e de ionização foram testados e os resultados apresentados nesta
tese foram obtidos utilizando o melhor método encontrado, neste caso aquele que separa
melhor os picos presentes no cromatograma e que permite verificar o íon molecular
correspondente a cada pico (ionização branda). As condições ótimas de análise encontradas
estão descritas na parte experimental. Os cromatogramas obtidos no processo de estudo do
melhor método, por motivos de síntese e objetividade, não se encontram apresentados
nesta tese.
R
ESUMO SOBRE A TÉCNICA DE IONIZAÇÃO POR ELÉTRON-SPRAY
(PRASAIN ET AL., 2004):
Essa técnica consiste na formação de uma névoa de partículas carregadas obtidas
mediante ação de um campo elétrico sobre um efluente líquido (amostra proveniente do
CLAE) dentro de um capilar mantido a um alto potencial (4-6 kV).
A fonte ESI utiliza sempre um gás de auxílio à nebulização e é capaz de suportar fluxo
de até 1 ml/min, o que permite o acoplamento direto com colunas de HPLC analíticas.
Cada gota de líquido presente na névoa obtida contém um certo número de íons, ou
seja, de partículas carregadas, com prevalência de um tipo de carga, positiva ou negativa. A
evaporação do solvente provoca uma contração das gotas com redução da superfície
externa e com conseqüente aumento do campo elétrico. Atingindo um valor crítico, as
partículas carregadas não conseguem mais permanecer na superfície e são desprendidas
como íons em fase gasosa mais ou menos solvatados. Esses íons são guiados por um
campo elétrico dentro do analisador, onde são separados e revelados. No modo negativo de
ionização podemos encontrar além do [M-H]
-
, os íons [M+Cl]
-
e [M+HCOO]
-
.
Amostrador CLAE Fonte de Ionização Espectrômetro de Massas
Computador
ANÁLISE QUALITATIVA DOS FLAVONÓIDES PRESENTES NO EXTRATO
POR CLAE
A identificação dos flavonóides isolados no cromatograma do extrato de KP foi feita
com base no tempo de retenção de padrões e confirmada pelos dados do espectro de
massas.
A Figura 35 mostra o perfil cromatográfico do Extrato Aquoso de KP utilizando o
detector de Ultravioleta a 254 nm (primeiro cromatograma) e o detector de massas. Neste
último caso, após detecção por ultravioleta, uma alíquota do efluente líquido é encaminhada
para o Espectrômetro de Massas e o sinal gerado da corrente iônica total (TIC) fornece um
segundo cromatograma. O aparelho de CLAE-UV-EM permite obter um espectro de
Ultravioleta para cada pico presente no cromatograma que utilizou este detector e um
espectro de massas para cada pico presente no cromatograma obtido através do detector
de massas. Vale a pena observar que os tempos de retenção do cromatograma referente ao
detector de massas são ligeiramente maiores devido ao tempo necessário para a interface
entre o módulo de CLAE e o módulo de EM.
Na figura 35 foram destacados os picos referentes ao flavonóides KP1-KP5. Os
Espectros de Ultravioleta e Massas para essas moléculas estão apresentados mais adiante.
O flavonóide KP4 por ser minoritário no extrato aquoso de KP não pode ser visualizado nos
cromatogramas. Sua presença foi detectada utilizando a ferramenta disponível de Corrente
Iônica Específica (EIC), onde foi possível selecionar a massa do íon pseudomolecular de
KP4 (m/z 491). No entanto, não foi possível obter um espectro de ultravioleta para esta
substância. Além dos flavonóides KP 1-5 identificados no cromatograma, os outros picos
que são observados entre 18 e 33 minutos apresentaram espectro de UV característico
para flavonóides.
min
0 10 20 30 40
mAU
0
50
100
150
200
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM32.D)
3.235
4.007
6.496
7.394
8.367
8.904
9.511
13.226
14.165
18.382
18.980
19.744
21.737
22.745
23.819
24.373
28.494
29.066
31.045
43.900
46.875
48.495
min
0 10 20 30 40
0
50000
100000
150000
200000
250000
MSD1 TIC, MS File (D:\MICHELLE\MFM32.D) API-ES, Neg, Scan, 120
2.044
2.158
2.857
6.535
7.618
9.211
16.483
18.431
19.037
21.766
22.763
23.878
24.389
28.580
29.156
46.951
47.872
Figura 35: Cromatograma obtido para o extrato ativo de KP (preparado com folhas
coletadas no verão) a 254 nm e utilizando como detector o espectrômetro de massas.
Espectros de Ultravioleta obtidos a partir do cromatograma apresentado na
figura acima:
nm
250 300 350 400 450
Norm.
0
50
100
150
200
250
300
350
*DAD1, 31.019 (2.1 mAU, - ) Ref=30.699 & 31.525 of MFM32.D
*DAD1, 28.485 (21.3 mAU, - ) Ref=28.192 & 29.605 of MFM32.D
*DAD1, 24.379 (51.5 mAU,Apx) Ref=23.499 & 24.992 of MFM32.D
*DAD1, 22.779 (387 mAU, - ) Ref=22.245 & 23.472 of MFM32.D
Espectro 38: Espectros de Ultravioleta dos picos de tempo de retenção (T
r
) igual a
22,763 min, correspondente ao flavonóide KP1 (Rosa); 24,389 min, correspondente ao
flavonóide KP2 (Verde); 28,580 min, correspondente ao flavonóide KP3 (Vermelho) e
31,075 min, correspondente ao flavonóide KP4 (Azul).
1
2
3
4
5
Detector UV – 254 nm
Detector EM – TIC
Espectros de massas obtidos a partir do cromatograma apresentado na figura
acima:
m/z
200 400 600
0
20
40
60
80
100
*MSD1 SPC, time=22.837 of D:\MICHELLE\MFM32.D API-ES, Neg, Scan, 120
Max: 182400
579.0
580.2
581.2
Espectro 39: Espectro de Massas do pico de tempo de retenção (T
r
) igual a 22,763
min, correspondente ao flavonóide KP1 (C
26
H
28
O
15
; MM 580)
.
m/z
200 400 600
0
20
40
60
80
100
*MSD1 SPC, time=24.398 of D:\MICHELLE\MFM32.D API-ES, Neg, Scan, 120
Max: 48440
447.0
448.0
300.0
449.0
Espectro 40: Espectro de Massas do pico de tempo de retenção (T
r
) igual a 24,389
min, correspondente ao flavonóide KP2 (C
21
H
20
O
11
; MM 448).
O
O
OH
OH
OH
HO
O-ramnose
O
O
OH
OH
O
H
HO
O-ramnose-arabinose
[M-H]
-
[M-H]
-
[(M-H)-Ara-Ram]
-
[(M-H)-Ram]
-
m/z
200 400 600
0
20
40
60
80
100
*MSD1 SPC, time=28.562 of D:\MICHELLE\MFM32.D API-ES, Neg, Scan, 120
Max: 40544
563.0
564.2
661.0
565.0
Espectro 41: Espectro de Massas do pico de tempo de retenção (T
r
) igual a 28,580
min, correspondente ao flavonóide KP3 (C
26
H
28
O
14
; MM 564).
m/z
200 400 600
0
20
40
60
80
100
*MSD1 SPC, time=31.075 of D:\MICHELLE\MFM32.D API-ES, Neg, Scan, 120
Max: 4002
431.0
432.1
284.7
208.9
318.9
488.7
706.5
380.6
439.0
173.1
674.7
592.7
752.8
528.8
Espectro 42: Espectro de Massas do pico de tempo de retenção (T
r
) igual a 31,075
min, correspondente ao flavonóide KP4 (C
21
H
20
O
10
; 432).
O
O
OH
OH
HO
O-ramnose-arabinose
O
O
OH
OH
HO
O-ramnose
[M-H]
-
[M-H]
-
[(M-H)-Ram]
-
m/z
200 400 600
20
40
60
80
100
*MSD1 SPC, time=27.324 of D:\MICHELLE\MFM32.D API-ES, Neg, Scan, 120
Max: 1828
491.0
492.1
216.8
577.0
446.9
620.5
341.0
752.8
99.9
298.9
501.0
706.3
785.0
232.9
378.9
Espectro 43: Espectro de Massas do pico de tempo de retenção (Tr) igual a 27,324
min, correspondente ao flavonóide KP5 (C
23
H
24
O
12
; MM 492).
Injeção dos padrões dos flavonóides majoritários isolados: KP1 e KP2
Com o objetivo de corroborar com os resultados obtidos na análise do extrato de KP
através da técnica CLAE-EM, padrões dos flavonóides isolados em maior quantidade, KP1 e
KP2, foram analisados. A partir desta análise foi possível confirmar a identidade dos picos
atribuídos à esses flavonóides no cromatograma do extrato aquoso. Essa confirmação foi
baseada nos tempos de retenção, nos espectros de ultravioleta e nos espectros de massas.
Além de permitir esta confirmação, a análise dessas substâncias isoladas nos permitiu
conferir seu grau de pureza. A Figura 36 mostra os cromatogramas obtidos para KP1 e KP2
utilizando o detector UV a 254 nm.
min
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\QINEW.D)
21.585
24.290
48.724
min
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
mAU
0
100
200
300
400
500
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM57.D)
15.195
16.702
21.766
23.006
44.636
Figura 36: Cromatograma obtido para os flavonóides KP1 e KP2 a 254 nm.
O
O
OH
O
H
glucose-O
H
OMe
OMe
KP1
KP2
[M-H]
-
ANÁLISE
QUANTITATIVA DOS FLAVONÓIDES PRESENTES
NO EXTRATO POR CLAE
Os flavonóides foram quantificados através de uma curva Área x Massa (µg) preparada
utilizando padrão do flavonóide diglicosídico rutina comercial. A curva obtida e a equação da
reta utilizada nos cálculos se encontram abaixo. Os valores obtidos na quantificação dos
flavonóides (expressos em termos de rutina) foram corrigidos utilizando fator de correção
de massa molecular (fator de correção = MM flavonóide / MM rutina). Desta forma, os
resultados foram expressos nos gráficos em relação a cada flavonóide em específico.
A rutina foi escolhida como padrão por ser um glicosídeo de quercetina como os
flavonóides majoritários presentes no extrato e por haver um padrão de rutina específico
para CLAE disponível no laboratório.
Tabela 25: Áreas obtidas a 254 nm utilizando padrão de rutina e injeção de diferentes
massas
Massa (µg) injetada de rutina Área calculada para o pico
2 3766
4 7347
6 11136
8 14763
10 18331
Massa injetada de rutina (10 vezes menor)
0,2 329
0,4 654
0,6 975
0,8 1295
1 1617
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU2.D)
17.821
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU4.D)
17.897
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU6.D)
17.862
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU8.D)
17.725
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU10.D)
17.736
Figura 37: Cromatogramas obtidos para os padrões de rutina (2-10
µg) a 254 nm.
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU2D.D)
17.772
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU4D.D)
17.762
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU6D.D)
17.798
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU8D.D)
17.775
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\RU10D.D)
17.743
Figura 38: Cromatogramas obtidos para os padrões de rutina (0,2-1,0
µg) a 254 nm.
Rutina 2
µ
g
Rutina 4
µ
g
Rutina 6
µ
g
Rutina 8
µ
g
Rutina 10
µ
g
Rutina 0,2
µ
g
Rutina 0,4
µ
g
Rutina 0,6
µ
g
Rutina 0,8
µ
g
Rutina 1
µ
g
Mesmo utilizando concentrações bastante baixas, a relação área x quantidade
permaneceu linear, como mostrado no gráfico abaixo.
y = 0,0006x
R
2
= 0,999
9
0
2
4
6
8
10
12
0 5000 10000 15000 20000
A
rea 254 n
m
µ
g
Figura 39: Curva de calibração da rutina
Depois de calculada a concentração de cada flavonóide na amostra injetada utilizando
a curva da rutina (Massa µg x Área 254 nm), foi calculada a concentração destes no extrato
liofilizado, visto que eram conhecidas a concentração da amostra inicial preparada e a
massa injetada na coluna. A Figura 44 mostra os dados obtidos em termos de % p/p no
extrato liofilizado.
2,16
0,236
0,127
0,015
0,0063
0
0,5
1
1,5
2
2,5
KP1 KP2 KP3 KP4 KP5
Flavonóides isolados
Porcentagem
Figura 40: proporção dos flavonóides KP 1-5 no extrato bruto de Kalanchoe pinnata
expressa em porcentagem.
ANÁLISE
QUANTITATIVA E QUALITATIVA DA FRAÇÃO
FLAVONOÍDICA ATIVA – F3
A fração ativa de KP foi analisada de forma a conhecer a proporção dos cinco
flavonóides isolados desta fração, assim como compreender qual seria a contribuição da
quercitrina (KP2) para a atividade da F3.
A partir das análises realizadas foi possível observar que a quercitrina, flavonóide mais
ativo in vitro, isolado desta fração, representa 14% da mesma. O flavonóide mais
abundante (KP1), presente em 32%, também apresenta atividade antileishmania, porém
moderada in vitro. Desta forma, a quercitrina deve contribuir muito para a atividade da
fração F3 in vitro, mas também o flavonóide KP1, por estar presente em grande quantidade.
Após a primeira etapa da purificação de F3 no laboratório, duas frações foram obtidas:
uma flavonoídica e outra não. A fração não flavonoídica apresentou alta citotoxidez,
conforme foi observado no ensaio de liberação de LDH a 100 µg/ml. A fração flavonoídica
apresentou percentual de liberação semelhante a da fração mãe, F3.
32,112
14,077
4,225
0,7390,754
0
5
10
15
20
25
30
35
KP-F3
Porcentagem
1
2
3
4
5
Figura 41: Percentual dos flavonóides KP 1-5 na fração F3 liofilizada, segundo as
análises quantitativas por CLAE.
min
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
500
1000
1500
2000
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM55.D)
3.203
5.592
9.371
12.111
15.606
19.164
19.899
21.195
21.890
22.857
24.065
24.556
27.445
28.804
29.309
31.431
34.713
35.820
40 010
1
5
1
2
3
4
min
0 5 10 15 20 25 30 35
0
100000
200000
300000
400000
MSD1 TIC, MS File (D:\MICHELLE\MFM55.D) API-ES, Neg, Scan, 120
1.734
7.941
9.405
10.660
11.080
11.569
12.129
13.340
14.166
15.029
15.660
16.564
18.092
18.612
19.224
19.966
21.207
21.527
21.939
22.888
24.128
24.579
25.374
26.919
27.537
28.225
28.829
29.356
30.075
31.508
34.804
35.965
37.837
Figura 42: Cromatogramas obtidos para a fração ativa de KP (F3), a 254 nm e utilizando o
detector de massas.
AVALIAÇÃO DOS FATORES QUE PODERIAM INTERFERIR NO PERFIL
QUÍMICO DO EXTRATO DE KALANCHOE PINNATA
Espécimes de KP foram cultivados em um jardim na Universidade Federais do Rio de
Janeiro para realização desta pesquisa, foram expostos ou não a luz solar. As folhas de
espécimes de KP cultivados à sombra de uma árvore foram coletadas em diferentes
períodos de um ano: Janeiro 2001 (verão), maio 2001 (outono), agosto 2001 (inverno) e
outubro 2001 (primavera). As folhas de espécimes de KP cultivados sob a luz do sol foram
coletadas em maio 2001 (outono), fora da estação de floração para comparação.
Com o objetivo de verificar se a temperatura utilizada na extração aquosa é um fator
importante na obtenção dos compostos ativos, as folhas foram coletadas em agosto 2001 e
trituradas sem aquecimento para obtenção de um sumo de KP. Este sumo foi comparado
com o extrato aquoso à quente preparado com as folhas coletadas no mesmo mês (agosto
2001). As figuras 6-8 mostram os resultados obtidos após a análise destas seis amostras:
1- KP extrato aquoso 20% 50ºC inverno
2- KP extrato aquoso 20% 50ºC outono
3- KP extrato aquoso 20% 50ºC verão
4- KP extrato aquoso 20% 50ºC primavera
1
2
3
4
5
Detector UV – 254 nm
Detector EM – TIC
5- KP extrato aquoso 20% 50ºC outono sob luz solar
6- KP sumo inverno
O método de análise utilizado para as análises de CLAE encontra-se descrito na parte
experimental. Os dados são expressos como porcentagem dos flavonóides KP1, KP2, KP3
(relativo ao extrato liofilizado).
A identificação de todos os constituintes foi feita com base nas análises por CLAE-UV-
EM e comparando o tempo de retenção e os espectros dos picos nos extratos com aqueles
das amostras de referência.
Efeito da incidência de luz solar na composição flavonoídica do extrato de KP:
Inicialmente foi verificado que qualitativamente os dois extratos, KP extrato aquoso
outono sombra e KP extrato aquoso outono sol, possuem o mesmo perfil químico. Esta
constatação foi feita através da comparação do perfil cromatográfico e dos espectros de
massas obtidos para cada pico nos respectivos cromatogramas (Figura 43). Porém, ao
avaliar quantitativamente os extratos foi possível observar, como demonstrado na figura
40, que o teor dos flavonóides aumenta significativamente na planta cultivada sob a luz do
sol. Por exemplo, o flavonóide ativo KP2, quercitrina, que representava 0,020 % do extrato
seco quando KP é cultivado à sombra, passa a 0,148 % quando cultivado sob a luz solar, o
que representa um aumento de 7,5 vezes.
Estudos realizados em Cistus creticus (Cistaceae) mostraram que esta espécie produz
mais compostos capazes de absorverem radiações UV-B, como os flavonóides, quando
cultivado diretamente ao sol, em relação à planta cultivada sob sombra de uma grande
árvore (STEPHANOU et al., 1997).
Os flavonóides, nas plantas, podem realizar funções antioxidantes em resposta à luz
excessiva. Por esta razão, a produção de flavonóides aumenta sensivelmente em resposta a
radiação solar (TATTINI et al., 2004). O aumento da produção de flavonóides em resposta a
radiação solar foi também comprovado pelo aumento da expressão de genes envolvidos na
biossíntese desta classe de compostos em Vaccinium myrtillus (Ericaceae) (JAAKOLA et al.,
2004).
min
10 20 30 40
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
*DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM16.D)
*DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM15.D)
Figura 43: Cromatogramas obtidos para os extratos aquosos de KP coletado no outono,
cultivo ao sol e à sombra, a 254 nm.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Sombra Sol
% relativo ao extrato liofizado
KP1
KP2
KP3
F
F
I
I
G
G
U
U
R
R
A
A
4
4
4
4
:
:
Q
Q
U
U
A
A
N
N
T
T
I
I
F
F
I
I
C
C
A
A
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S
S
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L
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I
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K
K
P
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X
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P
P
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P
P
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D
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C
C
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M
M
F
F
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H
H
A
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S
S
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F
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S
S
C
C
A
A
S
S
,
,
C
C
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,
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O
O
À
À
L
L
U
U
Z
Z
S
S
O
O
L
L
A
A
R
R
.
.
Efeito das diferentes estações do ano na composição flavonoídica do extrato
de KP:
As Figuras 41 e 42 mostram que o teor dos flavonóides é mais elevado em estações
onde é maior a incidência solar (verão e primavera) e que, qualitativamente, os extratos
permanecem idênticos em todas as estações do ano.
KP outono sol
KP outono sombra
Mecanismos que induzem variações sazonais podem incluir uma ou todas as três das
seguintes circunstâncias ambientais: duração do dia, luz solar, e/ou temperatura, que
variam marcadamente através das estações (YAO et al., 2005). Variações acompanhando
esta tendência são bastante comuns e descritas para várias espécies vegetais (YAO et al.,
2005; IOKU et al., 2005; STEPHANOU et al., 1997).
min
0 10 20 30 40
mAU
0
50
100
150
200
250
300
*DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM16.D)
*DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM11.D)
*DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM12.D)
*DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM32.D)
Figura 45: Cromatogramas obtidos para os extratos aquosos de KP coletado no outono,
inverno, primavera e verão (cultivo à sombra), a 254 nm.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Outono Inverno Primavera Verao
% relativo ao extrato liofizado
KP1
KP2
KP3
KP outono
KP
p
rimavera
KP inverno
KP verão
F
F
I
I
G
G
U
U
R
R
A
A
4
4
6
6
:
:
Q
Q
U
U
A
A
N
N
T
T
I
I
F
F
I
I
C
C
A
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,
C
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D
D
O
O
S
S
À
À
S
S
O
O
M
M
B
B
R
R
A
A
.
.
Efeito das diferentes formas de preparo na composição flavonoídica do
extrato de KP:
As Figuras 43 e 44 mostram que o aquecimento e a adição de água durante o processo
de extração aumentam o teor dos flavonóides no extrato. Além disso, essa análise
demonstrou que o sumo difere do extrato aquoso 20 % - 50ºC apenas no aspecto
quantitativo, apresentando as mesmas características qualitativas.
min
0 10 20 30 40
mAU
0
20
40
60
80
100
120
*DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM07.D)
*DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM11.D)
Figura 47: Cromatograma obtido para o extrato aquoso preparado a 50ºC e para o sumo
de KP, a 254 nm.
KP extrato
KP sumo
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Sumo Extrato aquoso 20% -
50ºC
% relativo ao extrato liofizado
KP1
KP2
KP3
F
F
I
I
G
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A
4
4
8
8
:
:
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À
S
S
O
O
M
M
B
B
R
R
A
A
.
.
ESTUDO
DAS MUDAS OBTIDAS A PARTIR DE ESPÉCIMES
MONOCLONAIS DE KP ATIVO PRODUZIDOS IN VITRO
Devido ao avançado estudo sobre a atividade antileishmania de KP, tornou-se
necessário obter espécimes de atividade garantida. Com este objetivo, um indivíduo ativo
de KP foi micropropagado in vitro, obtendo-s espécimes monoclonais. As folhas destas
plântulas, cultivadas in vitro, foram usadas para preparar um extrato aquoso 50ºC de forma
a verificar sua composição química. Após as análises, foi visto que este KP cultivado in vitro
e em estágio de plântula produz pequenas quantidades de flavonóides. Este fato foi
confirmado por análises de
1
H-RMN (Espectro 50), que mostraram principalmente a
presença de metabólitos primários, como açúcares.
O perfil pobre em flavonóides pode ser explicado pelas condições não-estressantes de
crescimento destas plantas in vitro, como oferta adequada de nutrientes, luminosidade
controlada, ausência de microorganismos e predadores. Este mesmo fato foi observado para
Artemisia judaica (Asteraceae), uma espécie medicinal egípcia utilizada no tratamento de
desordens gastro-intestinais (LIU et al., 2004) e Fabiana imbricata (Solanaceae), uma
espécie medicinal dos Andes utilizada como diurético, digestivo e no tratamento de
problemas renais (SCHMEDA-HIRSCHMANN et al., 2004).
Cinco meses depois que espécimes de KP monoclonal in vitro foram transplantados
para um vaso com terra, suas folhas foram coletadas e o extrato aquoso preparado. A
análise deste extrato mostrou uma produção mais elevada dos flavonóides quando
comparada com a planta in vitro. Entretanto, esta quantidade ainda é reduzida quando
comparada com o espécime ativo de KP que originou os espécimes monoclonais.
Foi verificado também que o padrão de picos observado nos cromatogramas destas
mudas de KP até um tempo da retenção de 10 minutos é mais similar àquele da planta
cultivada in vitro. Será necessário analisar estas mudas monoclonais de KP, cultivadas a
terra, após idade de 1 ano de idade para verificar se seu perfil químico sofrerá ainda
variações.
Foto: Michelle F. Muzitano
Figura 49: Foto de KP monoclonal in vitro
min
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
20
40
60
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM18.D)
2.251
4.023
5.283
6.470
7.378
8.271
8.638
9.941
10.755
12.115
13.777
17.118
28.615
min
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
20
40
60
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM74.D)
2.275
3.656
5.434
6.422
7.441
8.301
8.481
9.508
13.998
15.103
19.612
21.165
23.041
24.111
24.736
26.736
27.504
28.857
29.356
35.087
min
0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
50
100
150
200
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM32.D)
3.235
4.007
6.496
7.394
13.226
18.382
18.980
19.744
21.737
22.745
23.819
24.373
28.494
29.066
31.045
1
2
3
Figura 50: Perfil cromatográfico dos extratos de KP monoclonal in vitro (1); das
mudas de KP monoclonal após cinco meses em vaso contendo terra (2) e do espécime de
KP utilizado para propagação in vitro (3).
0,480
0,022
0,089
0,010
0,030
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
KP monoclonal
Porcentagem
1
2
3
4
5
Figura 51: Percentual dos flavonóides KP 1-5 presentes no extrato liofilizado das
folhas de mudas de KP monoclonal (5 meses de idade).
Espectro 44: Espectro de RMN de
1
H do extrato aquoso de K. pinnata monoclonal in
vitro (400 MHz). Solvente utilizado: D
2
O. Foi aplicada técnica de supressão do sinal
referente a H
2
O. Parâmetros: NS 8, SW 4807 Hz, REF D
2
O, TEMP 25ºC, Concentração da
amostra 100 mg/mL.
Metabólitos primários
ppm
A tabela abaixo resume os resultados obtidos n as análises. Os dados na tabela estão
expressos em relação a conteúdo de KP2 (quercitrina), flavonóide mais ativo, e em relação
ao conteúdo de KP1, flavonóide majoritário.
Tabela 26: Percentual de quercitrina (KP2) e KP1 em amostras de KP
KP2 (quercitrina) KP1
Amostra
Área (CLAE) % na amostra Área (CLAE)
% na
amostra
Extrato Aquoso Inverno 163,6 0,0721 1763,4 1,0062
Outono Sombra 45,8 0,0202 1032,9 0,5893
Outono Sol 337,2 0,1485 2459,8 1,4035
Verão 536,9 0,2364 3775,9 2,1545
Primavera 148,5 0,0654 2417,9 1,3796
Planta in vitro 0 0 10,7 0,0061
Mudas monoclonais 50,5 0,0222 842,1 0,4802
Sumo Inverno 60,4 0,0266 1034,9 0,5905
Resumo dos resultados obtidos:
¾ Os resultados mostraram que o momento apropriado para a colheita de folhas de KP
é em estações quentes, que as folhas de KP cultivado sob a luz solar são mais ricas em
flavonóides e que o extrato aquoso á quente é a melhor maneira de extração. Estas
conclusões foram obtidas baseadas no teor dos constituintes ativos do extrato de KP.
¾ A análise do extrato de mudas de KP monoclonal que cresciam em vasos com terra
há cinco meses mostrou uma produção mais elevada de flavonóides quando comparado
com a planta in vitro. Mas esta quantidade era mais baixa quando comparada com o
espécime ativo de KP que a originou. Foi verificado também que o perfil de fenólicos
observado até tempo de retenção de 10 minutos é mais similar àquele do KP cultivado in
vitro.
ABSORÇÃO E METABOLISMO DE FLAVONÓIDES
Os flavonóides são importantes constituintes da dieta humana e são encontrados por
exemplo nas frutas, no chá e no café. Estima-se a ingestão de aproximadamente 1 g de
flavonóide por dia (DI CARLO et al., 1999). Em frutas cítricas, estes compostos podem
representar de 0,5% a 1,0% do material fresco (BERG & DANIEL, 1988).
Para explorar e compreender os potenciais efeitos benéficos destes compostos na
prevenção e cura de doenças, torna-se importante perceber os mecanismos de ativação e
bioatividade dos mesmos in vivo, os fatores que influenciam a sua biodisponibilidade, e
excreção, bem como aqueles que determinam o seu grau de absorção e as possíveis
alterações.
ABSORÇÃO
Para a absorção intestinal, a solubilização dos flavonóides é considerada um pré-
requisito, e os derivados glicosídicos devem ser primeiro hidrolisados. Entretanto, a
velocidade da hidrólise dos açúcares irá depender da estrutura do flavonóide e da posição
da aglicona em que o carboidrato encontra-se ligado (DAY et al., 1998).
As enzimas presentes no intestino delgado capazes de hidrolisar flavonóides
glicosídeos são as lactase-florizina hidrolases, também chamadas lactases e outra menos
bem caracterizada chamada β-glicosidase, que possui menor especificidade de substrato
(DAY et al., 2003; WALLE, 2004). In vitro, lactases têm sido capazes de hidrolisar
quercetina 4’-glicosídeo, 3-glicosídeo, 3,4’-diglicosídeo, 3’-metil quercetina 3-glicosídeo,
genisteína 7-glicosídeo e daidzeína 7-glicosídeo. Quercetina 3-ramnoglicosídeo (rutina) e
narigenina 7-ramnoglicosídeo (naringina) não são substratos para esta enzima. Quando
utilizado lisado de intestino delgado humano livre de células, contendo esta última enzima,
observou-se que apenas açúcares nas posições 4’-OH e 7-OH eram clivados. Compostos
como quercetina 3-glicosídeo não foram hidrolisados neste experimento (WALLE, 2004).
As enzimas presentes no intestino grosso capazes de clivar flavonóides ainda são
desconhecidas. Porém, enzimas (β-glicosidases e α-ramnosidases) produzidas por bactérias
gastrointestinais, como Bacteróides JY-6, Streptococcus faecium VGH-1, Streptococcus sp.
Cepa FRP-17 e Escherichia coli HGH21 e HGH, são capazes de clivar a porção glicosídica de
alguns flavonóides. Enzimas de Eubacterium ramulus e Clostridium orbiscindens são
também capazes de clivar os anéis do esqueleto flavonoídico, gerando ácidos
hidroxifenólicos e ácidos hidroxifenilpropiônicos. Alguns desses produtos de clivagem são
absorvidos e podem executar efeito sistêmico (ERLUND, 2004).
Inicialmente acreditava-se que todo flavonóide glicosídico era desglicosilado a
agliconas por enzimas de bactérias presentes no intestino grosso. E que as agliconas
poderiam ser parcialmente absorvidas ou sofrerem novas biotransformações por estas
bactérias (WALLE, 2004).
Sabe-se hoje que os flavonóides glicosídeos podem ser absorvidos intactos no
intestino delgado, usando os transportadores de glicose sódio dependentes 1 (SGLT1).
Porém, a eficiência deste sistema é suprimida pelo efluxo de pelo menos alguns flavonóides
glicosídeos pelo transportador apical de resistência a múltiplas drogas proteína 2-associado
(MPR2).
METABOLISMO
Ao entrar nas células epiteliais intestinais (enterócitos), os flavonóides glicosídeos, que
foram absorvidos intactos, podem ser hidrolisados por uma enzima β-glicosidase presente
nestas células BS βG (broad-specific β−glicosidase) (WALLE, 2004).
As agliconas produzidas por hidrólise na luz intestinal são então absorvidas pelas
células intestinais por transporte passivo. Dentro destas células as agliconas sofrem
conjugação com ácido glicurônico ou com grupos sulfatos através da ação das enzimas de
fase II: UDP-glucuronil transferases e sulfotransferases. Algumas moléculas que escapam
dessa metabolização inicial e passam para a circulação são conjugadas por enzimas,
principalmente no fígado.
Os metabólitos de fase II são encaminhados ao fígado e excretados na bile, sendo
então transportados de volta aos intestinos. Glucuronidases e sulfatases liberam as
agliconas, que podem ser reabsorvidas ou clivadas novamente por bactérias intestinais.
Parte destes metabólitos é excretada nas fezes. A excreção renal também é importante
quando se trata de metabólitos conjugados, como os glicuronídeo (PRAISAN, 2004).
Além da glucuronização e sulfatação, os flavonóides sofrem em menor escala
processos de oxidação através da ação do citocromo P450 e de espécies reativas de
oxigênio (ROS).
Pode também ocorrer, devido à semelhança ao catecol, processos de O-metilação pela
enzima catecol-O-metil transferase (COMT). Essa reação foi bastante estudada para a
quercetina in vivo e in vitro (WALLE, 2004).
A formação de conjugados de ácido glicurônico e flavonóides é bastante comum tanto
em humanos como em animais experimentais (WALLE, 2004). Estudos mostraram que os
principais sítios de glicuronização da aglicona quercetina são as posições 7-OH e 3-OH,
seguidas das posições 4’-OH e 3’-OH. A posição 5-OH parece não ser um sítio de
conjugação (DAY et al., 2000; DAY et al., 2003).
Muitos trabalhos têm sido desenvolvidos buscando compreender o metabolismo e a
absorção de flavonóides. Principalmente no que diz respeito aos glicosídeos de quercetina,
visto que estes representam o tipo de flavonóide mais abundante em alimentos (WANG &
MORRIS, 2005).
Na espécie medicinal em estudo, Kalanchoe pinnata, flavonóides derivados de
quercetina são os principais constituintes da fração ativa do extrato. E considerando o uso
do extrato de KP por via oral, torna-se fundamental o conhecimento dos mecanismos de
absorção e do metabolismo dessas substâncias.
Apesar de inúmeros estudos relacionados aos glicosídeos de quercetina, nenhum foi
então realizado em camundongos. Sendo assim, no intuito de conhecer os metabólitos
destes flavonóides na corrente sanguínea dos camundongos BALB/c tratados com estas
substâncias ativas, foram realizados dois experimentos.
Ada
p
tado de WALLE, 2004 e SPENCER et al., 2004
METABOLISMO DE EXTRATO E DE FLAVONÓIDES DE Kalanchoe pinnata
EXPERIMENTO 1
Neste estudo, a técnica CLAE-UV-EM foi usada para a determinação de metabólitos de
flavonóides em amostras de plasma de camundongos BALB/c. Primeiramente, grupos de
dois animais foram tratados com os flavonóides ativos de KP, extrato de KP e quercetina.
Um grupo não recebeu o tratamento e foi usado como controle negativo. Os animais foram
tratados com 2 mg de composto puro ou 8 mg de extrato bruto por via oral e em dose
única. Após duas horas o sangue foi coletado e o plasma foi obtido após centrifugação.
Grupo 1: camundongos tratados com quercetina (comercial)
Grupo 2: camundongos tratados com quercitrina (Flavonóide KP2)
Grupo 3: camundongos tratados com diglicosídeo de quercetina (Flavonóide KP1)
Grupo 4: camundongos tratados com o extrato aquoso de KP
Grupo 5: camundongos não tratados
As amostras de plasma recolhidas foram preparadas (conforme descrito na Parte
Experimental) e depois analisadas utilizando CLAE-UV-EM.
Quercetina e seu conjugado com ácido glicurônico foram detectados no plasma dos
camundongos tratados com quercetina. Os cromatogramas e o espectro de massas/UV da
quercetina e do seu glicuronídeo estão mostrados abaixo. As informações contidas nestes
espectros, íon molecular e fragmentações no caso do espectro de massas e o perfil de
bandas no caso do espectro de ultravioleta (ver espectros de ultravioleta para flavonóides
no tópico de CLAE-UV-EM), confirmam a presença desses metabólitos no plasma analisado.
Todos os grupos restantes mostraram perfil cromatográfico similar ao do grupo sem
tratamento (Grupo 5).
A não detecção de metabólitos após administração nos grupos 2-4 poderia ser
explicada devido às diferenças farmacocinéticas existentes entre a quercetina e os seus
glicosídeos, como demonstrado, por exemplo, por ERLUND et al. (2000). Esses autores
mostraram que a concentração dos conjugados de quercetina no plasma após a
administração de quercetina e de rutina era similar em magnitude, mas não em tempo de
aparecimento. Assim, o tempo de aparecimento no plasma foi atrasado após a
administração de rutina, consistente com o tempo necessário para hidrólise do glicosídeo no
intestino delgado (ERLUND et al., 2000).
min
26 27 28 29
mAU
0
2
4
6
8
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\PLA28C2.D)
quercetina monoglucuronídeo
27.662
30 131
querce
ti
na
min
26 27 28 29
5000
10000
15000
20000
MSD1 TIC, MS File (D:\MICHELLE\PLA28C2.D) API-ES, Neg, Scan, 120
min
26 27 28 29
0
1000
2000
3000
27.723
MSD1 301, EIC=300.7:301.7 (D:\MICHELLE\PLA28C2.D) API-ES, Neg, Scan, 120
quercetina monoglucuronídeo
quercetina
Figura 52: Ampliação do cromatograma do plasma dos animais tratados com
quercetina entre 25 e 30 minutos (1: 254 nm, 2: Massas TIC, 3: Massas EIC=301).
nm
250 300 350 400 450 500 550
Norm.
0
1
2
3
4
5
*DAD1, 27.664 (6.0 mAU, - ) Ref=27.371 & 28.064 of PLA28C2.D
*DAD1, 27.877 (2.9 mAU, - ) Ref=27.371 & 28.064 of PLA28C2.D
Espectro 45: Espectro de ultravioleta dos picos correspondentes a quercetina (27,664
min) e ao glicuronídeo de quercetina (27,877 min).
1
2
3
monoglicuronídeo de quercetina
monoglicuronídeo de quercetina
quercetina
quercetina
Detector UV – 254 nm
Detector EM
–
EIC m/z 301
Detector EM
–
TIC
m/z
100 200 300 400 500 600 700
0
20
40
60
80
100
Max: 3189
quercetina
301.0
150.9
178.9
271.0
301.9
333.3
409.2
385.4
477.0
365.0
449.0
201.1
596.3
156.9
254.9
134.9
507.0
783.0
575.0
m/z
100 200 300 400 500 600 700
4
6
8
10
12
14
16
18
Max: 631
quercetina monoglucuronídeo
301.0
477.0
348.0
178.9
417.1
478.4
349.1
120.8
150.9
234.9
385.1
333.0
638.3
263.0
203.1
610.5
791.5
439.0
299.3
529.2
707.2
459.1
477.9
510.1
560.7
355.0
160.8
Espectros 46 e 47: Espectros de massas dos picos correspondentes a quercetina
(27,708 min) e ao glicuronídeo de quercetina (27,924 min).
Para obter maior confiabilidade nos dados encontrados, o plasma dos animais não
tratados foi analisado criteriosamente e esses picos assinalados anteriormente para a
amostra referente ao Grupo 1 não foram encontrados para o Grupo 5.
Adicionalmente, um padrão de quercetina foi analisado utilizando este mesmo método
para comparação do tempo de retenção. O cromatograma obtido encontra-se na figura 49.
A partir desta comparação foi possível confirmar que o pico em 27,662 min observado no
cromatograma da amostra do plasma do Grupo 1 é realmente referente a presença de
quercetina.
mi
n
0 10 20 30 40 50
mAU
0
500
1000
1500
2000
2500
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\PLASMQUE.D)
3.483
12.119
27.523
30.872
33.478
45.624
45.958
54.206
Figura 53: Cromatograma obtido com o padrão de quercetina (254 nm).
[M-H]
-
[(M-H)-AGlic]
-
[M-H]
-
monoglicuronídeo de quercetina
quercetina
EXPERIMENTO 2
Este segundo experimento foi realizado no intuito de melhorar a metodologia utilizada
no experimento 1, de forma que possibilite a detecção de outros metabólitos, fornecendo
um maior número de informações.
O método de análise cromatográfica foi modificado de forma a separar melhor os picos
na região de 27 minutos e o sangue dos animais foi coletado 4 horas após o último
tratamento ao invés de 2 horas após (experimento 1). Foram feitos grupos com tratamento
único e grupos com 2 dias consecutivos de tratamento, conforme mostrado abaixo. As
doses utilizadas foram aumentadas para 5 mg/animal/dose.
Ao plasma de cada grupo, antes da extração, foram adicionados 25 µL de uma solução
a 30 µg/mL de kampferol; com o objetivo de verificar a eficiência da extração de
flavonóides em cada amostra.
Grupo 1: camundongos tratados com quercetina (comercial) - 1 vez
Grupo 2: camundongos tratados com quercitrina, KP2 (comercial) - 1 vez
Grupo 3: camundongos tratados com diglicosídeo de quercetina (KP1) - 1 vez
Grupo 4: camundongos tratados com quercetina (comercial) - 2 vezes
Grupo 5: camundongos tratados com quercitrina, KP2 (comercial) - 2 vezes
Grupo 6: camundongos tratados com diglicosídeo de quercetina (KP1) - 2 vezes
Grupo 7: camundongos não tratados
As amostras de plasma recolhidas foram preparadas (conforme descrito na Parte
Experimental) e depois analisadas utilizando CLAE-UV-EM.
EFICIÊNCIA DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DO PLASMA:
Amostra: plasma de animais tratados com 5 mg de quercitrina 1 vez
Padrão interno adicionado a amostra: 25 µL de uma solução a 30 µg/mL de kampferol
= 0,75 µg
Quantidade teórica de padrão interno injetado junto com os 70 µL de amostra: 0,10 µg
Quantidade dosada utilizando o cromatograma: 0,05 µg
Rendimento da extração: 50%
min
25 25.5 26 26.5 27 27.5 28 28.5
mAU
-1
0
1
2
3
4
5
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM82.D)
k
amp
f
ero
l
26.317
26.927
min
25 25.5 26 26.5 27 27.5 28 28.5
5000
10000
15000
20000
25000
30000
MSD1 TIC, MS File (D:\MICHELLE\MFM82.D) API-ES, Neg, Scan, 120
26.953
Figura 54: Ampliação do cromatograma do plasma dos animais tratados com o
quercitrina 1 vez, entre 25 e 29 minutos. Identificação do padrão interno adicionado na
amostra de plasma (1: 254 nm, 2: Massas TIC).
nm
200 250 300 350 400 450
mAU
0
10
20
30
40
50
60
DAD1, 26.930 (78.4 mAU,Apx) of MFM
8
m/z
250 500
0
20
40
60
80
100
*MSD1 SPC, time=26.965 of D:\MICH
E
Max: 17664
285.0
286.0
508.4
Espectros 48 e 49: Espectros de ultravioleta e massas do pico correspondente ao
kampferol (padrão interno).
Detecção de Metabólitos nas amostras de plasma:
O conjugado de quercetina com dois ácidos glicurônicos foi recuperado no plasma dos
camundongos tratados com quercetina 2 dias consecutivos (Grupo 4). Cálculos
quantitativos determinaram que este metabólito se encontra na concentração de 0,736
µg/mL na amostra injetada e 0,613 µg/mL no plasma coletado.
Para o Grupo 6, camundongos tratados com o diglicosídeo de quercetina (Flavonóide
KP1), foi possível detectar traços desta molécula intacta. Nenhum outro metabólito foi
identificado para esta amostra. Todos os grupos restantes mostraram perfil cromatográfico
1
2
Detector UV – 254 nm
Detector EM
–
TIC
kaempferol
similar ao grupo sem tratamento, não tendo sido possível identificar os metabólitos
presentes nestas amostras.
Os cromatogramas e o espectro de massas/UV do diglicuronídeo de quercetina e do
diglicosídeo de quercetina (Flavonóide KP1) estão mostrados abaixo.
min
16 16.5 17 17.5 18 18.5 19 19.5 20
mAU
0
5
10
15
20
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM81.D)
16.609
16.858
17.840
18.233
19.478
19.826
20.053
min
16 16.5 17 17.5 18 18.5 19 19.5 20
0
10000
20000
30000
MSD1 TIC, MS File (D:\MICHELLE\MFM81.D) API-ES, Neg, Scan, 120
19.863
min
16 16.5 17 17.5 18 18.5 19 19.5 20
0
500
1000
1500
MSD1 579, EIC=578.7:579.7 (D:\MICHELLE\MFM81.D) API-ES, Neg, Scan, 120
diglicosídeo de quercetina (flavonóide 3)
18.042
Figura 55: Ampliação do cromatograma do plasma dos animais tratados com o
flavonóide KP1, 2 doses – Grupo 6, entre 16 e 20 minutos (1: 254 nm, 2: Massas TIC, 3:
Massas EIC=579).
m/
z
200 400 600
20
40
60
80
100
*MSD1 SPC, time=18.047 of D:\MICHELLE\MFM81.D API-ES, Neg,
S
Max: 1894
579.0
580.0
119.1
732.3
299.8
173.1
430.0
200.8
548.7
477.0
394.9
Espectro 50: Espectro de massas do pico correspondente ao diglicosídeo de
quercetina – flavonóide KP1 (18,047 min).
KP1
[M-H]
-
1
2
3
Detector UV – 254 nm
Detector EM
–
EIC m/z 579
Detector EM
–
TIC
min
23 24 25 26 27 28
mAU
0
1
2
3
4
5
6
7
DAD1 B, Sig=254,8 Ref=598,8 (D:\MICHELLE\MFM85.D)
diglucuronídeo de quercetina
22
.
629
23.539
23.883
24.355
24.662
25.902
26.303
26.802
28.608
28.955
min
23 24 25 26 27 28
10000
20000
30000
40000
50000
60000
MSD1 TIC, MS File (D:\MICHELLE\MFM85.D) API-ES, Neg, Scan, 120
23.938
25.929
28.654
Figura 56: Ampliação do cromatograma do plasma dos animais tratados com
quercetina 2 vezes – grupo 4, entre 23 e 29 miutos (1: 254 nm, 2: Massas TIC).
nm
250 300 350 400 450 500 550
mAU
0
2
4
6
8
10
*DAD1, 25.920 (11.8 mAU, - ) Ref=24.960 & 26.613 of MFM85.D
Espectro 51: Espectro de ultravioleta do pico correspondente ao diglicuronídeo de
quercetina (25,920 min).
1
2
diglicuronídeo de quercetina
Detector UV – 254 nm
Detector EM
–
TIC
m/z
200 400 600
0
20
40
60
80
100
*MSD1 SPC, time=25.930 of D:\MICHELLE\MFM85.D API-ES, Neg, Scan, 120
Max: 13211
653.0
329.0
507.1
653.8
476.9
674.7
331.0
536.2
508.0
210.9
300.7
596.3
648.2
Espectro 52: Espectro de massas do pico correspondente ao diglicuronídeo de
quercetina (25,930 min).
Os trabalhos existentes na literatura relacionados ao metabolismo e a farmacocinética
de flavonóides e seus glicosídeos foram feitos principalmente em humanos, e nenhum foi
feito usando modelo de camundongos, com base nas buscas bibliográficas realizadas. Este
fato dificultou estabelecer os parâmetros para a determinação do tempo de coleta do
plasma em nossos experimentos, sendo possível verificar nos experimentos 1 e 2 a
presença dos metabólitos quando administrada a aglicona quercetina, mas não seus
glicosídeos.
No experimento 2, quando o tempo de coleta passou a ser 4 horas após o último
tratamento, encontramos o diglicuronídeo; enquanto que no experimento 1, após 2 horas,
encontramos o monoglicuronídeo e ainda a própria aglicona. Este fato é coerente visto que
um maior tempo torna mais viável a glicuronização também pelo fígado.
A farmacocinética é bastante complexa e varia de acordo com o modelo usado no
estudo, com a substância e com a dose. Por exemplo, ERLUND et al. (2000) testaram
quercetina e rutina em doses de 8, 20 e 50 mg em humanos. Nesse estudo verificou-se que
o tempo de concentração plasmática máxima era de 1,9; 2,7 e 4,8 h para a quercetina
versus 6,5; 7,4 e 7,5 h para a rutina; para as doses 1, 2 e 3 respectivamente. Estes dados
mostram o quanto pode variar o tempo para detecção no plasma da aglicona quercetina e
de seu glicosídeo.
Os dados por nós obtidos e as informações encontradas na literatura nos levam a crer
que o tempo para coleta do plasma dos camundongos tratados com os glicosídeos foi ainda
insuficiente. Seria necessário desenvolver um estudo farmacocinético, porém este é pouco
viável em camundongos devido ao pequeno volume de sangue característico do porte deste
animal.
[M-H]
-
[(M-H)-AGlic-AGlic]
-
[(M-H)-AGlic]
-
A detecção de glicuronídeos de quercetina no plasma de humanos e animais tratados
com quercetina e seus glicosídeos encontra-se consolidada na literatura (WALLE, 2004;
ERLUND, 2004; DAY et al., 2000; SPENCER et al., 2004; WANG & MORRIS, 2005). Portanto,
espera-se que no caso dos flavonóides de KP, KP1 e KP2, possamos detectar, no plasma
de humanos e animais, glicuronídeos de quercetina e que variações possam ocorrer
relacionadas à taxa de absorção e à farmacocinética de cada glicosídeo. Outros possíveis
metabólitos seriam os derivados de reações de sulfatação e O-metilação, assim com a
própria aglicona. A atividade da aglicona quercetina na leishmaniose encontra-se
comprovada na literatura (MITTRA et al., 2000; SARKAR et al., 2002; TASDEMIR et al.,
2006), porém a atividade antileishmania de glicuronídeos de quercetina e seus metabólitos
sulfatados e O-metilados ainda não foi estudada.
Resumo dos resultados obtidos nos Experimentos 1 e 2:
¾ Quercetina e o seu conjugado com ácido glicurônico foram recuperados no plasma
dos camundongos tratados com quercetina em dose única de 2 mg. Apenas um
diglicuronídeo de quercetina foi identificado no plasma dos camundongos tratados com
quercetina por dois dias consecutivos com dose de 5 mg, mostrando maior nível de
metabolização. É possível supor uma maior participação de glucuronização hepática.
¾ Para o grupo tratado com o flavonóide KP1 (diglicosídeo de quercetina) em dose
única de 5 mg e coleta do sangue após 4 horas, foi possível detectar traços deste flavonóide
intacto no plasma.
¾ Todos os grupos restantes mostraram perfil cromatográfico similar ao grupo sem
tratamento. Estes resultados mostram a necessidade de conhecer a farmacocinética para
poder determinar o tempo ótimo para coleta do sangue. Neste caso, seriam necessários
grupos de vários animais onde estes seriam sacrificados em momentos diferentes para
coleta do sangue e posterior análise.
¾ Devido ao pequeno porte do camundongo e a necessidade de coletar o sangue em
momentos diferentes após um único tratamento, seria mais aconselhável repetir esses
experimentos em humanos ou em animais de maior porte como coelhos. Porém, como os
estudos em humanos estão bastante avançados, é possível prever os resultados a serem
obtidos neste tipo de experimento.
¾ Apesar de parcial, os resultados obtidos durante os experimentos 1 e 2 são inéditos
e interessantes, pois não eram conhecidos os metabólitos de flavonóides em camundongos.
Além do mais, o estudo em camundongos é justificado considerando que a atividade
antileishmania desses flavonóides de KP foi comprovada em modelo in vivo utilizando estes
animais. Vale ressaltar que são poucos os estudos encontrados na literatura relacionados ao
metabolismo de princípios ativos de plantas medicinais. A grande parte dos estudos,
principalmente relacionados ao metabolismo de flavonóides, está relacionado a fontes
alimentares, como chá verde, cebolas, maçãs e vinho tinto.
Figura 57: Esquema proposto para o possível metabolismo da aglicona quercetina
e dos flavonóides de KP
OHO
OH O
OH
O
OH
O
HO
HO
OH
OHO
OH O
OH
OH
OH
O
O
OH O
OH
OH
O
OH
HO
HOOC
OH
HO
O
O
OH O
OH
OH
O
OH
HO
HOOC
O
O
HO
OH
COOH
OH
HO
Hidrólise da
porção glicosídica
Primeira etapa de
glicuronização
Segunda etapa de
glucuronização
Possível
monoglicuronídeo
de quercetina
Possível
diglicuronídeo de
quercetina
CONCLUSÕES
1. O fracionamento bioguiado de KP levou a uma fração flavonoídica altamente ativa
na leishmaniose e permitiu o isolamento de um flavonóide com considerável atividade
antileishmania: quercitrina (quercetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo). Nenhuma citotoxicidade
foi observada usando concentrações abaixo de 10 µg/ml de quercitrina.
2. Outros quatro flavonóides foram isolados desta fração ativa, quercetina-3-O-α-L-
arabinopiranosil (1→2) α-L-ramnopiranosídeo, kaempferol-3-O-α-L-arabinopiranosil (1→2)
α-L-ramnopiranosídeo, kaempferol-3-O-α-L- ramnopiranosídeo e 4’,5-diidroxi-3’,8-
dimetoxiflavona-7-O-β-D-glicopiranosídeo, mas nenhum deles foi mais ativo do que a
quercitrina no ensaio de atividade antileishmania in vitro.
3. É a primeira vez que o flavonóide kaempferol-3-O-α-L-arabinopiranosil (1→2) α-
L-ramnopiranosídeo está sendo relatado na literatura. Por se tratar de uma molécula inédita
foi proposto o nome de kapinnatosídeo para este flavonóide.
4. A partir da análise das curvas dose-resposta foi possível traçar uma relação
estrutura-atividade para estes flavonóides. A presença da ramnose na posição 3, sem a
presença de outro açúcar ligado a ela, e da hidroxila livre na posição 3' são fatores
importantes para a atividade in vitro desta classe de compostos.
5. Experimentos em camundongos infectados por Leishmania amazonensis
mostraram que a quercitrina (KP2) é também capaz de exercer atividade antileishmania in
vivo, sendo tão ativa quanto o extrato aquoso de KP, ambos administrados por via oral.
6. A partir das análises de CLAE-UV-EM foi possível observar que a quercitrina,
flavonóide mais ativo in vitro, representa 14 % da fração flavonoídica e 0,236 % do extrato
seco. A quercitrina contribui para a atividade da fração e do extrato, mas os outros
flavonóides também podem estar contribuindo para a atividade total observada.
7.
Os resultados mostraram que o momento apropriado para a colheita é em
estações quentes, que é melhor colher as folhas de KP cultivado ao sol e que o extrato
aquoso à quente (50ºC) é a melhor maneira de extração. Estas conclusões foram obtidas
baseadas nos teores dos constituintes ativos do extrato de KP.
8. Foi verificado que a propagação de Kalanchoe pinnata a partir de espécimes
monoclonais produzidos in vitro leva a mudas capazes de produzir os flavonóides ativos.
9. O estudo do metabolismo dos flavonóides de KP em plasma de camundongos
tratados com estas moléculas, associado à pesquisa bibliográfica, sugere que os
glicuronídeos são os principais metabólitos in vivo desses compostos.
10. A alta atividade do extrato aquoso de Kalanchoe pinnata no tratamento oral da
leishmaniose, a identificação das substâncias que contribuem para esta atividade e o
estabelecimento das condições que garantem a qualidade do extrato ativo, tornam esta
espécie medicinal um alvo promissor para o desenvolvimento de um novo fitoterápico.
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