( PDF ) Avaliação do perfil de quimiocinas e sua correlação com a intensidade do processo inflamatório nas retinocoroidites supostamente toxoplásmicas

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Roberto Martins Gonçalves

Avaliação do perfil de quimiocinas e sua correlação

com a intensidade do processo inflamatório nas

retinocoroidites supostamente toxoplásmicas.

Belo Horizonte

Faculdade de Medicina da UFMG

2006

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Roberto Martins Gonçalves

Avaliação do perfil de quimiocinas e sua correlação

com a intensidade do processo inflamatório nas

retinocoroidites supostamente toxoplásmicas.

Tese apresentada ao Curso de Doutorado da

Faculdade de Medicina da Universidade

Federal de Minas Gerais, como requisito

parcial à obtenção do título de Doutor em

Medicina.

Área de concentração: Oftalmologia.

Orientador: Prof. Dr. Fernando Oréfice.

Co-orientador: Prof. Dr. Antônio Lúcio Teixeira.

Universidade Federal de Minas Gerais.

Faculdade de Medicina da UFMG

Belo Horizonte – Minas Gerais – Brasil

2006

Universidade Federal de Minas Gerais

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Gonçalves, Roberto Martins

G635a Avaliação do perfil de quimiocinas e sua correlação com a

intensidade do processo inflamatório nas retinocoroidites

supostamente toxoplásmicas/Roberto Martins Gonçalves. Belo

Horizonte, 2006.

122f., il.

Tese.(doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais.

Faculdade de Medicina.

Área de concentração: Oftalmologia

Orientador: Fernando Oréfice

Co-orientador: Antônio Lúcio Teixeira

1.Toxoplasmose ocular/complicações 2.Uveíte posterior/etiologia

3.Coriorretinite/etiologia 4.Quimiocinas CXC/sangue 5.Retina/

imunologia I.Título

NLM: WW 140

CDU: 617.721.6

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

Magnífico Reitor

Prof. Ronaldo Tadêu Pena

Pró-Reitor de Pós-Graduação

Prof. Jaime Arturo Ramirez

Pró-Reitor de Pesquisa

Prof. Carlos Alberto Pereira Tavares

Diretor da Faculdade de Medicina

Prof. Francisco José Penna

Diretora do Hospital das Clínicas

Prof

. Tânia Mara Assis Lima

Coordenador do Centro de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina

Prof. Carlos Faria Santos Amaral

Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Oftalmologia

Prof. Joel Edmur Boteon

Chefe do Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e

Fonoaudiologia

Prof

. Ana Rosa Pimentel de Figueiredo

Membros do Colegiado do Curso de Pós-Graduação em Oftalmologia

Prof. Joel Edmur Boteon

Prof. Márcio Bittar Nehemy

Prof. Marco Aurélio Lana Peixoto

Prof. Sebastião Cronemberger Sobrinho

Prof. Evaldo Nascimento

Prof. Fernando Oréfice

Prof. Henderson Celestino de Almeida

Prof. Homero Gusmão de Almeida

Representante discente: Leonardo Rodrigues Pereira

A Comissão Examinadora que assina abaixo ______________________ a tese

intitulada “AVALIAÇÃO DO PERFIL DE QUIMIOCINAS E SUA CORRELAÇÃO

COM A INTENSIDADE DO PROCESSO INFLAMATÓRIO NAS

RETINOCOROIDITES SUPOSTAMENTE TOXOPLÁSMICAS”, apresentada e

defendida, em sessão pública, por ROBERTO MARTINS GONÇALVES, para a

obtenção do Grau de Doutor em Medicina, pelo programa de Pós-Graduação

em Oftalmologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas

Gerais.

___________________________________

Prof. Fernando Oréfice

Orientador

Universidade Federal de Minas Gerais

___________________________________

Prof. Antônio Lúcio Teixeira

Co-orientador

Universidade Federal de Minas Gerais

___________________________________

Prof. Wesley Ribeiro Campos

Universidade Federal de Minas Gerais

___________________________________

Dr. Décio Costa Lima Júnior

___________________________________

Prof. André Luiz Land Curi

FIOCRUZ

___________________________________

Prof. Francisco Max Damico

Universidade de São Paulo

Suplentes:

___________________________________

Prof. Joel Edmur Boteon

Universidade Federal de Minas Gerais

___________________________________

Prof. Carlos Eduardo Hirata

Universidade de São Paulo

Belo Horizonte, 15 de dezembro de 2006.

Aos meus queridos pais:

exemplos de amor, dedicação,

humildade, perseverança e

cumplicidade com os filhos. Nos

quais procuro me espelhar em

todos os momentos da minha

vida.

À minha esposa Alinne,

companheira que me motiva

sempre e que compreendeu bem

os esforços exigidos para a

concretização deste sonho.

A Rodrigo, Rogério e Rachel,

pelo estímulo e companheirismo.

A Deus, por ter colocado as

pessoas certas na minha vida e

por dar sentido a tudo.

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Dr. Fernando Oréfice, Titular do Departamento de Oftalmologia

da Faculdade de Medicina de Minas Gerais, pela disponibilidade e dedicação

dispensadas à orientação deste trabalho; pelo carinho e orientação

indispensáveis à minha formação médica. Exemplo de profissional dedicado ao

estudo das Uveítes e ao ensino da Oftalmologia.

Ao Professor Dr. Antônio Lúcio Teixeira Júnior, co-orientador deste trabalho,

pela valiosa ajuda e orientação na difícil área da Imunologia. Tornei-me um

admirador da sua imensa capacidade científica e sabedoria na área médica.

Ao Professor Dr. Wesley Ribeiro Campos, Chefe do Serviço de Uveítes do

Hospital São Geraldo, pelos ensinamentos muitas vezes despretensiosos, mas

sempre profundos, que é peculiar ao seu jeito de transmitir conhecimento.

Exemplo de sabedoria abrangente em Oftalmologia.

Ao Professor Dr. Mauro Martins Teixeira, Chefe do Laboratório de

Imunofarmacologia, Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, pela

disponibilização de toda infra-estrutura necessária para a realização da parte

laboratorial deste trabalho.

À Bernadete e Adriana, funcionárias do Serviço de Uveítes do Hospital São

Geraldo, pela intensa colaboração no acompanhamento dos pacientes

envolvidos no estudo e na coleta de sangue para análise das quimiocinas.

Ao Antônio Lúcio França, Rosélia Maria, Inayana Barbosa, Eluzia Castro,

funcionários do Laboratório Imunolab, que me receberam com o maior carinho

nos seus ambientes de trabalho, orientando-me na preparação do soro para

análise das quimiocinas e colocando toda a estrutura do laboratório à minha

disposição.

Aos colegas, residentes e estagiários do Serviço de Uveítes do Hospital São

Geraldo, pela ajuda na seleção, avaliação e acompanhamento dos pacientes

participantes do estudo.

RESUMO

Introdução: As quimiocinas representam um grupo específico de citocinas que

exercem um papel fundamental na modulação da angiogênese e na migração

de leucócitos para os tecidos oculares durante os quadros de inflamação intra-

ocular.

Objetivo: Avaliar as concentrações séricas das quimiocinas CCL2, CCL11,

CXCL8, CXCL9 e CXCL10 nos pacientes com retinocoroidite de etiologia

supostamente toxoplásmica (RCST) comparado-as ao grupo de pacientes sem

história de uveíte e correlacionando-as aos achados oftalmológicos.

Metodologia: Cinqüenta e cinco pacientes com RCST (Grupo Uveíte) e 40

pacientes sem uveíte (Grupo Controle) foram incluídos neste estudo. Avaliação

oftalmológica foi realizada em todos os indivíduos, incluindo: medida da

acuidade visual (LogMAR), biomicroscopia do segmento anterior, oftalmoscopia

binocular indireta ou direta e medida da pressão ocular. Coleta de sangue foi

realizada após o exame oftalmológico. Os pacientes do Grupo Uveíte

receberam tratamento específico e, após a resolução do processo inflamatório,

nova coleta de sangue foi realizada em 18 sujeitos. Para a análise das

concentrações séricas das quimiocinas, foi utilizado o ensaio imunoenzimático

ELISA.

Resultados: A concentração sérica da quimiocina CXCL8 foi maior no Grupo

Uveíte quando comparado ao Grupo Controle. Vasculite retiniana ocorreu em

43,6% dos pacientes do Grupo Uveíte e esteve relacionada a uma maior

concentração sérica da CXCL8. Não houve correlação entre a intensidade das

opacidades vítreas e as concentrações séricas das quimiocinas estudadas. Os

pacientes com lesões agudas de retinocoroidite maiores do que 2 diâmetros de

disco óptico apresentaram níveis mais elevados de CXCL8. Houve também

correlação positiva entre o tamanho da lesão e os níveis de CXCL9. Houve

uma queda estatisticamente significativa dos níveis de CXCL8 após o

tratamento específico e a cicatrização da lesão de retinocoroidite.

Conclusões: Os níveis séricos da quimiocina CXCL8 estão aumentados nos

pacientes com RCST ativa, correlacionando-se com a presença de vasculite

retiniana e lesões de maiores dimensões. Os níveis de CXCL8 diminuem com o

tratamento específico, podendo ser úteis para o seguimento dos pacientes.

ABSTRACT

Introduction: chemokines are a specific group of cytokines that has an

important role in the angiogenesis and in leucocyte migration into the eye during

intraocular inflammation.

Purpose: to evaluate serum levels of the chemokines CCL2, CCL11, CXCL8,

CXCL9 and CXCL10 in patients with presumed acute toxoplasmic

retinochoroiditis, compare them to the patients without history of uveitis and to

correlate them to ophthalmic findings.

Methods: 55 patients with presumed toxoplasmic retinochoroiditis (Uveitis

Group) and 40 patients without history of uveitis (Control Group) were selected

to this study. Ophthalmic evaluation was made in all patients and included:

visual acuity measure (LogMAR), anterior segment biomicroscopy, direct or

indirect binocular opthalmoscopy and ocular pressure measure. Blood sample

was collected in all patients after the ophthalmic evaluation. The patients of

Uveitis Group received specific treatment and after resolution of the

inflammatory process, new blood sample was collected in 18 subjects. To

evaluate serum concentrations of the chemokines was used ELISA

immunoassay.

Results: the serum concentration of the CXCL8 chemokine was higher in the

Uveitis Group when compared to the Control Group. The presence of retinal

vasculitis was one finding in 43.6% to patients of the Uveitis Group and was

correlated with a higher serum concentration of CXCL8. There was not

correlation between intensity of vitreous opacities and serum concentrations of

the chemokines studied. The patients with acute lesions of retinochoroiditis

bigger than 2 diameters of optic disc had statistically higher levels of CXCL8.

There was one positive correlation between the size of lesion and the levels of

CXCL9. There was statistically decrease in the serum levels of CXCL8 after

treatment and healing of active retinochoroiditis.

Conclusions: levels of CXCL8 are increased in serum of patients with

presumed acute toxoplasmic retinochoroiditis and correlates with the presence

of retinal vasculitis and major ocular lesions. Levels of CXCL8 decrease with

treatment and may be useful for patient follow up.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Retinografia de paciente do Grupo Uveíte evidenciando lesão de

retinocoroidite em atividade e opacidade vítrea classificada como

1+/4+ .......................................................................................... 63

Figura 2 – Retinografia de paciente do Grupo Uveíte evidenciando lesão de

retinocoroidite em atividade e opacidade vítrea classificada como

2+/4+........................................................................................... 64

Figura 3 – Retinografia de paciente do Grupo Uveíte evidenciando lesão de

retinocoroidite em atividade e opacidade vítrea classificada como

3+/4+........................................................................................... 64

Figura 4 – Retinografia de paciente do Grupo Uveíte evidenciando lesão de

retinocoroidite em atividade e opacidade vítrea classificada como

4+/4+........................................................................................... 65

Figura 5 – Retinografia de paciente do Grupo Uveíte evidenciando presença

de vasculite retiniana................................................................... 65

Gráfico 1 – Representação em box-plot dos níveis séricos (pg/ml) de todas as

quimiocinas estudadas, tanto no Grupo Uveíte quanto no Grupo

Controle....................................................................................... 74

Gráfico 2 – Níveis séricos de CXCL8 (pg/ml) nos pacientes do Grupo

Controle e nos pacientes que apresentavam ou não vasculite

retiniana no Grupo Uveíte........................................................... 77

Gráfico 3 – Representação em box-plot dos níveis séricos (pg/ml) de CXCL8

de acordo com o tamanho da lesão de RCST em atividade....... 80

Gráfico 4 – Representação em box-plot dos níveis séricos (pg/ml) de CXCL9

de acordo com o tamanho da lesão de RCST em atividade....... 80

Gráfico 5 – Níveis séricos da quimiocina CXCL8 de 18 pacientes com RCST

(Grupo Uveíte) antes e após o tratamento.................................. 82

LISTA DE TABELAS

Tabela1 – Quimiocinas humanas identificadas............................................ 44

Tabela 2 – Características quanto à idade, gênero e acuidade visual dos

pacientes envolvidos no estudo.................................................. 71

Tabela 3 – Características do primeiro exame oftalmológico nos pacientes

com RCST aguda (Grupo Uveíte)............................................... 72

Tabela 4 – Níveis séricos (pg/ml) das quimiocinas estudadas nos dois

grupos.......................................................................................... 73

Tabela 5 – Coeficiente de correlação de Pearson para avaliar a influência da

idade nas concentrações séricas das quimiocinas estudadas.... 75

Tabela 6 – Coeficiente de correlação de Pearson para avaliar a influência do

sexo dos pacientes nas concentrações séricas das quimiocinas

estudadas.................................................................................... 75

Tabela 7 – Níveis séricos (pg/ml) das quimiocinas divididas de acordo com o

intervalo de tempo entre os primeiros sintomas relatados pelos

pacientes do Grupo Uveíte e a primeira coleta de sangue......... 76

Tabela 8 – Níveis séricos (pg/ml) das quimiocinas nos pacientes que

apresentavam ou não vasculite retiniana associada ao quadro de

RCST ativa (Grupo Uveíte) e no Grupo Controle........................ 78

Tabela 9 – Níveis séricos (pg/ml) das quimiocinas de acordo com a

intensidade das opacidades vítreas no Grupo Uveíte................. 79

Tabela 10 – Níveis séricos (pg/ml) das quimiocinas divididos de acordo com a

localização da lesão de RCST em atividade............................... 81

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

APC Antigen-presenting cell – célula apresentadora de antígenos

CC família de quimiocinas com resíduo de cisteína adjacente

CCR,

CXCR,

CR,

XCR receptores de quimiocinas

COEP Comitê de Ética em Pesquisa

CTL Células T CD8+ efetoras citotóxicas ou citolíticas

C família de quimiocina com resíduos de quimiocinas separadas por

três aminoácidos

CXC família de quimiocinas com resíduos de quimiocinas separadas

por um aminoácido

DD diâmetro do disco óptico

ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay – Ensaio Enzimático de

Imunoabsorção

EPR estrato pigmentoso da retina

G-CSF granulocyte-colony-stimulating factor – fator estimulador de

colônia de granulócitos

GM-CSF granulocyte-monocyte-colony-stimulating factor – fator estimulador

de colônia de granulócitos-macrófagos

HLA Human leucocyte antigens – antígenos leucocitários humanos

ICB Instituto de Ciências Biológicas

Ig imunoglobulina

IL interleucina

INF-γ interferon-gama

iNOS enzima óxido nítrico sintetase

kDa quilodaltons

Kg quilograma

LogMAR logarítmo do mínimo ângulo de resolução

M molar

M-CSF macrophage-colony-stimulating factor – fator estimulador de

colônia de monócitos-macrófagos

mg miligrama

ml mililitros

NK natural-killer cells – células natural killers

C grau centígrado

RCST retinocoroidite supostamente toxoplásmica

RNAm ácido ribonucléico mensageiro

RPM rotações por minuto

TCR T Cell Receptor – Receptor de células T

Th Linfócitos T auxiliares (helper), ou padrão de resposta imunológica

TNF-α Tumor Necrosis Factor-α – fator de necrose tumoral alfa

UEA uveíte experimental auto-imune

UFMG Universidade Federal de Minas Gerais

VEGF vascular-endothelial growth factor – fator de crescimento do

endotélio vascular

XCL família de quimiocina com apenas um resíduo de cisteína

µm micrômetro

Observação: Neste trabalho, os termos utilizados estão de acordo com a 1ª

edição brasileira da Nômina Anatômica (afiliada à Federative Committee on

Anatomical Terminology). Referência nacional: Abib e Oréfice, 2005.

SUMÁRIO

1 – INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA..................................................................... 18

2 – REVISÃO DA LITERATURA............................................................................... 21

2.1 – Agente etiológico da toxoplasmose e histórico .................................... 22

2.2 – Manifestações oculares da toxoplasmose ........................................... 24

2.2.1 – Prevalência e manifestações ........................................................ 24

2.2.2 – Patogênese ................................................................................... 29

2.2.3 – Toxoplasmose ocular congênita ou adquirida ............................... 30

2.3 – Resposta imune ao Toxoplasma gondii............................................... 31

2.3.1 – Imunidade inespecífica.................................................................. 31

2.3.2 – Imunidade específica ao T. gondii................................................. 33

2.3.3 – Rede de citocinas na infecção por T. gondii.................................. 38

2.4 – Quimiocinas ......................................................................................... 42

2.4.1 – Estrutura e função......................................................................... 42

2.4.2 – O papel das quimiocinas nas doenças oculares ........................... 48

2.5 – O papel das quimiocinas nas uveítes .................................................. 50

2.5.1 – Estudos experimentais .................................................................. 50

2.5.2 – Estudos em humanos.................................................................... 51

3 – OBJETIVOS........................................................................................................... 57

4 – MATERIAL E MÉTODO....................................................................................... 59

4.1 – Seleção dos pacientes......................................................................... 60

4.2 – Avaliação dos pacientes participantes ................................................. 61

4.3 – Processamento do soro para a análise das quimiocinas ..................... 66

4.4 – Escolha das quimiocinas a serem avaliadas ....................................... 66

4.5 – Análise estatística................................................................................ 68

5 – RESULTADOS ...................................................................................................... 70

6 – DISCUSSÃO.......................................................................................................... 83

7 – CONCLUSÕES ..................................................................................................... 96

8 – REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS..................................................................... 98

9 – ANEXOS............................................................................................................... 116

9.1 – Parecer do COEP referente ao Projeto.............................................. 117

9.2 – Tabelas com os dados dos pacientes envolvidos no estudo. ............ 118

1 – INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

______________________________________________________________________

As quimiocinas pertencem a um restrito grupo de citocinas de 8 a 12

kDa, que foram inicialmente identificadas devido à sua habilidade em atrair

leucócitos. Essas moléculas protéicas induzem migração celular contra

gradientes de concentração, exercendo papel fundamental no acúmulo de

leucócitos nos tecidos inflamados e na interação com as células residentes do

tecido envolvido (WALLACE et al., 2004).

As quimiocinas e seus receptores têm sido amplamente estudados nas

doenças oculares. Observou-se que estas substâncias possuem um papel na

homeostase do tecido ocular, não estando envolvidos apenas em processos

inflamatórios (FOXMAN et al., 2002). Estudos em modelos animais e em

humanos têm identificado várias quimiocinas em diferentes formas de uveítes,

sendo produzidas tanto por células residentes quanto por células inflamatórias,

o que sugere um papel importante dessas proteínas e seus receptores na

patogênese das mesmas. Além disso, a compreensão das vias envolvidas na

atuação das quimiocinas e seus receptores nas doenças oculares pode criar

uma nova possibilidade terapêutica, atuando de forma específica nestes

mecanismos que envolvem a migração, ativação e retenção de células

inflamatórias nos tecidos oculares.

Estudos mostram que algumas quimiocinas são expressas

abundantemente nos tecidos oculares durante o pico do processo inflamatório

da uveíte experimental auto-imune (UEA) (CRANE et al., 2001) e que a

neutralização de determinadas quimiocinas através de anticorpos específicos

poderia exacerbar o processo inflamatório (SONODA et al., 2003). Em outro

trabalho, a administração destes anticorpos foi capaz de suprimir o

desenvolvimento da uveíte anterior recorrente (MANCZAK et al., 2002).

Nas uveítes em humanos, vários estudos têm realçado a importância

das quimiocinas nas uveítes de etiologia não-infecciosa (WALLACE et al.,

2004). Por outro lado, o perfil dessas proteínas e dos seus receptores nas

uveítes infecciosas é pouco estudado. O perfil das quimiocinas na infecção

pelo Toxoplasma gondii é relatado na doença sistêmica ou em estudos

experimentais (DENNEY et al., 1999), mas sem abordar as características do

perfil dessas proteínas na retinocoroidite supostamente toxoplásmica (RCST).

Como a coleta do humor aquoso não é um procedimento realizado de

rotina na avaliação dos pacientes com uveíte, este estudo foi realizado com os

objetivos de avaliar se há alteração no perfil das quimiocinas séricas na RCST.

Avaliou-se, também, se houve correlação entre os níveis séricos das

quimiocinas com as características do quadro de uveíte nos pacientes

acometidos, entre elas a presença de vasculite retiniana, tamanho da lesão de

retinocoroidite em atividade e a intensidade das opacidades vítreas. As

quimiocinas avaliadas neste trabalho foram: CCL2, CCL11, CXCL8, CXCL9 e

CXCL10. Esse é o primeiro trabalho a investigar o perfil sérico das quimiocinas

na RCST aguda.

2 – REVISÃO DA LITERATURA

______________________________________________________________________

2.1 – Agente etiológico da toxoplasmose e histórico

Reino: protista; Subreino: Protozoa; Filo: Apicomplexa; Classe:

Sporozoea (Sporozoa); Subclasse: Coccidia; Ordem: Eucoccidiida;

Subordem: Eimeriidae; Família: Sarcocystidae: Gênero: Toxoplasma;

Espécie: Toxoplasma gondii.

Os organismos hoje pertencentes ao gênero Toxoplasma foram

descritos independentemente, em 1908, por SPLENDORE (Brasil), em coelhos

e por NICOLLE E MANCUEAX, no “gondi” (Ctenodactylus gondi), roedor norte-

africano. No ano seguinte, NICOLLE E MANCUEAX (1909), criaram o novo

gênero Toxoplasma, com a espécie Toxoplasma gondii.

A primeira descrição de toxoplasmose em humanos foi feita pelo

oftalmologista Janku, em 1923, na cidade de Praga, e tratava-se de um caso

de toxoplasmose congênita. Ao realizar a necrópsia de uma criança de 11

meses de idade que foi ao óbito em decorrência de uma doença disseminada e

grave (hidrocefalia, microftalmia e coloboma na região macular), notou que o

organismo que estava presente no bulbo ocular constituindo um cisto

parasitário era, possivelmente, o Toxoplasma gondii (JANKU, 1923). No Brasil,

o primeiro caso de toxoplasmose foi diagnosticado em 1926 por Margarino

Torres, em um recém-nascido (ORÉFICE & BAHIA-OLIVEIRA, 2005).

Porém, somente após 1937, com os estudos de WOLF & COWEN

(1939), a toxoplasmose passou a ser reconhecida por sua importância médica.

Esses autores descreveram nos Estados Unidos da América, um caso fatal de

encefalite granulomatosa infantil. A forma adquirida desta parasitose foi

inicialmente descrita por PINKERTON & WEINMAN (1940) em um adulto jovem

com doença generalizada e fatal. Em 1941, PINKERTON & HENDERSON

descreveram dois casos fatais de uma doença exantemática febril em adultos

e, no mesmo ano, Sabin relatou casos de encefalite pelo Toxoplasma gondii

em crianças (SABIN, 1941).

A introdução do teste do corante (Reação de Sabin e Feldman ou “dye-

test”), em 1948, facilitou o diagnóstico e possibilitou a realização de

investigações epidemiológicas (SABIN & FELDMAN, 1948).

O gênero Toxoplasma gondii é membro da família Sarcocystidae, que

tem com hospedeiro definitivo membros da família Felidae, sendo o gato

doméstico (Felis catus) o de maior importância epidemiológica (KAWAZOE,

1995). Tem como hospedeiros intermediários animais homeotérmicos incluindo

o homem. Por ser um parasita obrigatoriamente intracelular, o T. gondii pode

ser encontrado em vários tecidos, células (exceto hemácias) e líquidos

orgânicos, tais como a saliva, o leite, o esperma e o líquido peritoneal

(FRENKEL, 1971) Apresenta morfologias múltiplas dependendo do habitat e do

estado evolutivo. As principais formas que pode apresentar durante o seu ciclo

evolutivo são:

Taquizoíto (endozoíto): foi a primeira forma descrita e o seu aspecto

morfológico, ou seja, em forma de arco (toxon = arco), deu o nome ao gênero.

Quando corado pelo Giemsa, apresenta-se com o citoplasma azulado e o

núcleo vermelho. É um estágio de rápida multiplicação do parasita, com

capacidade para invadir ativamente uma célula e se multiplicar em vacúolos

citoplasmáticos, denominados vacúolos parasitófagos. A proliferação

exacerbada conduz ao rompimento da célula hospedeira liberando os múltiplos

taquizoítos que, livres, penetram em células contíguas ou caem na circulação.

É a principal forma encontrada na fase aguda da doença.

Bradizoítos (cistozoítos): forma parasitária com multiplicação lenta

encontrada no interior das células do hospedeiro e que resulta na formação dos

cistos teciduais. É a principal forma encontrada na fase crônica da doença.

Esporozoítos: forma do T. gondii presente nos oocistos maduros, os

quais são produzidos no intestino de felinos e eliminados em suas fezes. Os

oocistos apresentam no seu interior dois esporocistos, cada qual formado por

quatro esporozoítos. Em contato com o ambiente, os oocistos passam a ser

infectantes.

2.2 – Manifestações oculares da toxoplasmose

2.2.1 – Prevalência e manifestações

Estima-se que o parasita T. gondii infecte aproximadamente 13% a 50%

da população mundial (JONES et al., 2001). Em 1972, estimava-se que

aproximadamente 500 milhões de pessoas no mundo estariam infectadas pelo

T.gondii, representando cerca de 1/8 da população mundial (HOLLAND, 2003).

A prevalência da sorologia positiva para a toxoplasmose varia amplamente no

mundo e depende de fatores como hábitos alimentares, higiene e clima

(ROTHOVA, 2003). O estudo mais confiável sobre a prevalência da sorologia

positiva nos Estados Unidos foi derivado do terceiro National Health and

Nutrition Examination Survey, que foi realizado entre 1988-1994, no qual a

dosagem de IgG anti-toxoplasma foi positiva em 23% das amostras séricas de

17.658 pacientes (ROTHOVA, 2003). Em algumas áreas da região sul do Brasil

a prevalência da sorologia positiva para toxoplasmose entre crianças de 10-15

anos é muito alta, chegando a atingir 98% dessa população estudada

(SILVEIRA et al., 1988)

Em relação ao envolvimento ocular, sabe-se que a RCST é a

causa mais comum de uveíte posterior em várias partes do mundo, incluindo a

América do Norte, América do Sul e regiões da Europa (HOLLAND, 2003). A

prevalência da doença ocular em pacientes infectados pelo T. gondii é ainda

incerta; sendo que, o envolvimento é mais comum e mais grave nos pacientes

com sistema imune deficiente ou comprometido, ou seja, neonatos ou adultos

imunocomprometidos (BOSCH-DRIESSEN et al., 2002; SMITH &

CUNNINGHAM, 2002; HOVAKIMYAN & CUNNINGHAM, 2002). O

envolvimento ocular na toxoplasmose congênita pode alcançar até 80% dos

pacientes com acompanhamento superior a 20 anos. Por outro lado, a

prevalência do envolvimento ocular na toxoplasmose adquirida ainda não é

bem estabelecida (WILSON et al., 1980; KOPPE & ROTHOVA, 1989). Dois

estudos de prevalência da toxoplasmose ocular realizados nos Estados Unidos

da América encontraram resultados semelhantes (0,6%) (SMITH & GANLEY,

1972; MAETZ et al., 1987). Baseado na prevalência sorológica da época

desses estudos, a proporção de pacientes infectados pelo T. gondii com

envolvimento ocular seria aproximadamente de 2% (HOLLAND, 2003). Estudo

realizado no Brasil avaliou um total de 1042 pessoas, observando a presença

de lesões de RCST em 17,7% dos indivíduos examinados (GLASNER et al.,

1992).

Poucos estudos abordam a incidência da toxoplasmose ocular. A

estimativa de incidência de retinocoroidite aguda sintomática para todas as

pessoas nascidas no Reino Unido era de 0,4/100.000/ano, e para negros

nascidos no oeste da África foi de 57/100.000/ano (GILBERT et al., 1995).

A RCST ocorre em 70-90% dos casos de infecção congênita. O

acometimento ocular é mais freqüente em associação apenas à doença

neurológica (95%) do que à doença disseminada (66%). Como única

manifestação da toxoplasmose congênita, o acometimento ocular ocorre em

10% dos casos. A RCST em pacientes com infecção adquirida pelo T. gondii

apresenta índices variando de 2% a 30% (GILBERT & STANFORDT, 2000).

Estudo nacional observou que de um total de 7.680 casos de uveítes

avaliados, 43,1% foram diagnosticados como RCST, e de um total de 1.955

uveítes posteriores, 72,9% foram diagnosticadas como RCST (FERNANDES &

ORÉFICE, 1996). Esse estudo confirmou a toxoplasmose como a principal

causa de uveíte posterior no nosso meio.

A manifestação ocular típica da toxoplasmose consiste em uma

retinocoroidite focal necrosante acompanhada de reação vítrea,

freqüentemente associada com uma lesão cicatrizada satélite indicativa de

ataque recorrente. Em uma série de 154 pacientes, as lesões satélites

ocorreram em 80% dos pacientes comparada com 20% de lesões únicas

(BOSCH-DRIESSEN et al., 2002).

Gravidade da toxoplasmose ocular parece ser influenciada por uma

combinação de diversos fatores; muitas vezes, sem nenhuma correlação entre

eles. Isto tem dificultado retirar conclusões a respeito desses fatores na

literatura médica existente devido ao fato de muitos estudos serem realizados

de forma não-controlada e a gravidade da doença não ser definida de forma

consistente e de maneira quantitativa (HOLLAND, 2004). A avaliação da

gravidade da doença é feita de forma heterogênea pelos diversos trabalhos,

sendo que, alguns autores a avaliam pela presença de complicações, outros

pela piora da acuidade visual, tamanho da lesão em atividade ou cicatrizada,

intensidade da reação inflamatória na câmara anterior ou no corpo vítreo,

envolvimento da retina macular ou periférica, número de recorrências

(HOLLAND, 2003, 2004; VALLOCHI et al., 2005).

O tamanho da lesão varia de 1/10 de diâmetro de disco óptico (DD) até

dois quadrantes da retina. ASSIS et al. (1997) obervaram que, em 52 pacientes

avaliados, as lesões eram menores ou iguais a 1 DD em 69% dos casos na

fase inicial e em 80% dos casos na fase final, e maiores que 1 DD em 31% na

fase inicial e 20% na fase final. Alguns estudos observaram uma relação

positiva entre o tamanho da lesão, o risco aumentado de complicações e um

maior tempo de duração da doença ativa (HOLLAND, 2004).

O acometimento do corpo vítreo é constante na toxoplasmose ocular e

responsável por seqüelas importantes da doença. Ocorrem opacidades difusas

ou localizadas, hemorragias, pigmentos e zonas de rarefação. A opacificação

vítrea tem resolução lenta, podendo, nos casos graves, demorar, às vezes,

mais de um ano após total cicatrização da lesão. Pode haver contração e

descolamento do corpo vítreo posterior (ORÉFICE & BAHIA-OLIVEIRA, 2005).

Manifestações atípicas compreendem lesões largas, eventualmente

múltiplas e/ou bilaterais; forma punctata externa; neurorretinite; neurite; forma

pseudomúltipla; esclerite; reação vítrea intensa sem lesão focal em atividade

(ORÉFICE & BAHIA-OLIVEIRA, 2005; BOSCH-DRIESSEN et al., 2002; SMITH

& CUNNINGHAM, 2002; HOVAKIMYAN & CUNNINGHAM, 2002; FARDUEA et

al., 2002; LABALLETTE et al., 2002). Complicações como irite granulomatosa,

pressão intra-ocular elevada, vasculite retiniana, oclusões vasculares,

descolamento de retina seroso ou regmatogênico, entre outras, podem

dificultar o diagnóstico correto da toxoplasmose ocular (FARDUEA et al., 2002;

ROTHOVA, 2003).

A vasculite retiniana é comum em pacientes com toxoplasmose ocular e

pode ocorrer na vizinhança ou distante do foco ativo de retinocoroidite

(THEODOSSIADIS et al., 1995). Esse achado usualmente se apresenta como

um embainhamento perivascular difuso ou segmentar. Em alguns casos, a

oclusão de ramos arteriais ou venosos pode ocorrer, resultando em infartos

retinianos com conseqüente perda de campo visual. A neovascularização

retiniana ou sub-retiniana já foram relatadas como uma complicação possível

da toxoplasmose ocular (SMITH & CUNNINGHAM, 2002).

A redução da acuidade visual na RCST ativa pode resultar da turvação

ou opacificação dos meios e do acometimento foveal diretamente causado pela

lesão ou conseqüente ao edema retiniano secundário às lesões retinianas

distantes da região macular (ORÉFICE & BAHIA-OLIVEIRA, 2005).

O processo evolutivo da RCST revela que a cicatrização da lesão ocorre

da periferia para o centro, ou seja, de maneira centrípeta. Nesses casos,

observa-se que, progressivamente, as margens da lesão vão ficando mais

nítidas, o exsudato e a vitreíte diminuem, até que resta uma zona central

amorfa, elevada, de cor cinza ou marrom. Depois de um período variável de

tempo, ocorre a pigmentação, sobretudo nas margens da lesão (ORÉFICE &

BAHIA-OLIVEIRA, 2005). A intensidade da pigmentação dentro ou ao redor da

lesão pode refletir a extensão do dano ao estrato pigmentoso da retina (EPR)

durante a forma ativa da doença (HOLLAND, 2004). Lesões cicatriciais com

pouca pigmentação podem estar associadas a lesões com pouca reação

inflamatória na fase ativa (MATTHEWS & WEITHER, 1988).

2.2.2 – Patogênese

A aquisição da infecção em humanos ocorre principalmente por três

vias: (1) ingestão de oocistos liberados juntamente com as fezes dos felídeos;

(2) ingestão de cistos teciduais presentes em carne crua ou mal cozidas; (3)

infecção transplacentária.

A transmissão dos oocistos pela água tem sido evidenciada, mostrando

ser esta uma importante forma de transmissão da doença (BAHIA-OLIVEIRA et

al., 2003). Outras vias de infecção foram descritas, como, através de leite ou

saliva contaminada, perdigotos ou lambedura, acidentes de laboratório, pós-

transplante de órgãos (ORÉFICE & BAHIA-OLIVEIRA, 2005).

Durante o estágio agudo da doença, o parasita atravessa a parede

intestinal e cai na circulação sanguínea levando a uma parasitemia. O T. gondii

atinge o olho através do sangue como parasitas livres ou dentro de leucócitos

circulantes. Os ataques recorrentes são decorrentes de uma multiplicação dos

parasitas e sua liberação dos cistos retinianos (ROBERTS et al., 2001).

A RCST é uma doença de caráter recidivante. Alguns pesquisadores

observaram que o risco de recorrência foi maior no primeiro ano após o

episódio de atividade do que nos anos subseqüentes (HOLLAND, 2003).

Recente estudo observou que 79% dos pacientes com um acompanhamento

superior a cinco anos tiveram recorrência da doença, e tal recorrência ocorreu

predominantemente no olho acometido previamente (BOSCH-DRIESSEN et

al., 2002). Vários fatores relacionados tanto com o hospedeiro, quanto com o

parasita já foram propostos para explicar as causas de recorrência da

retinocoroidite toxoplásmica, mas nenhum tem sido amplamente aceito

(ROTHOVA, 2003). Reinfecções com outras cepas do parasita podem ocorrer,

mas a importância clínica desse fato ainda não foi bem estabelecida

(ASPINALL et al., 2003), apesar de alguns autores sugerirem que a

variabilidade das manifestações clínicas pode estar relacionada à cepa do

parasita que causa a infecção (BOOTHROYD & GRIGG, 2002).

2.2.3 – Toxoplasmose ocular congênita ou adquirida

A RCST pode ser dividida em congênita ou adquirida. A exata

contribuição de cada uma dessas formas na prevalência da doença não é bem

estabelecida. BURNETT et al. (1998) relataram a primeira série de casos de

RCST ocorrida durante uma epidemia de infecção no Canadá. Outro estudo

envolvendo uma série de casos consecutivos de RCST observou que 8% dos

casos foram de toxoplasmose congênita e 11% de toxoplasmose adquirida;

para a maioria dos casos (81%) o exato momento da infecção não foi possível

ser determinado (BOSCH-DRIESSEN et al., 2002). Muitos estudos recentes

têm discutido que a infecção adquirida pode ser uma importante causa de

RCST (BAHIA-OLIVEIRA et al., 2003; BOWIE et al., 1997; ROSS et al., 2001;

SILVEIRA et al., 2001; BURNETT et al., 1998). Diferenças na apresentação da

RCST nas formas congênita ou adquirida não são bem definidas. Em estudo já

citado, a lesão macular e desenvolvimento de cegueira foram mais freqüentes

nas formas congênitas da doença (BOSCH-DRIESSEN et al., 2002). Na

infecção adquirida, uma inflamação intra-ocular transitória sem sinais de retinite

na fase aguda foi relatada e pode representar a infestação intra-ocular inicial do

parasita, que pode ser acompanhada posteriormente de acometimento

retiniano (HOLLAND et al., 1999). As taxas de recorrência da RCST congênita

ou adquirida parecem ser similares (BOSCH-DRIESSEN et al., 2002; BOSCH-

DRIESSEN & ROTHOVA, 1999)

2.3 – Resposta imune ao Toxoplasma gondii

2.3.1 – Imunidade inespecífica

As respostas imunes de um hospedeiro ao T. gondii são complexas e

envolvem precocemente a ativação de mecanismos da imunidade inespecífica.

Estudos em camundongos sugerem que o controle da infecção aguda causada

pelo Toxoplasma, deflagra inicialmente uma resposta inata, seguida por uma

resposta adquirida antígeno-específica, que é particularmente crítica para a

resolução da infecção por taquizoítos (JOHNSON & SAYLES, 1997;

ALEXANDER & HUNTER, 1998).

As células dendríticas, derivadas de células da medula óssea, são as

mais eficientes células apresentadoras de antígenos (APC: “Antigen-presenting

cell”), etapa fundamental para a ativação da imunidade específica (HART,

1997). Para tal, expressam moléculas dos antígenos leucocitários humanos

(HLA: “Human leucocyte antigens”) tanto de classe I, quanto de classe II. As

células dendríticas se encontram nos epitélios superficiais e, uma vez captado

o antígeno, se movem em direção aos órgãos linfóides regionais de forma a

entrar em contato com células capazes de reconhecerem o antígeno que

transportam (HART, 1997).

Os macrófagos humanos, por sua vez, são fagócitos com função, não só

de apresentação de antígenos, através do HLA classe II, mas também de

secretar mediadores pró-inflamatórios como o interferon-gama (INF-γ), o fator

de necrose tumoral alfa (TNF-α, “Tumor Necrosis Factor-α”), o fator estimulador

de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF “granulocyte-monocyte-

colony-stimulating factor”), a interleucina-12 (IL-12) e a interleucina-15 (IL-15).

Já as células “natural-killer” (NK) representam um subconjunto de

células derivadas da linhagem linfocitária com função citotóxica que secretam

citocinas, principalmente o INF-γ, sendo de grande importância na defesa

contra vírus e outros patógenos intracelulares. A ativação inicial das células NK

e dos macrófagos pelo T. gondii é importante para o estabelecimento da

resistência inespecífica que atuará rapidamente no sentido de reduzir o número

de taquizoítos, mesmo antes do desenvolvimento da resposta imune

específica. Ao mesmo tempo, a ativação das células NK une a atividade dos

mecanismos imunes inatos com os mecanismos anígeno-específicos (BLISS et

al., 1999), pelo estabelecimento de uma rede de citocinas necessárias para

responder à infecção pelo T. gondii associada à ação de apresentação de

antígenos, a ser realizada pelas células dendríticas, macrófagos e células

hospedeiras infectadas (LEWIS & WILSON, 2001).

2.3.2 – Imunidade específica ao T. gondii

Tem sido demonstrado que os mecanismos específicos imunes

mediados por células desempenham um papel de destaque na resistência à

infecção pelo T. gondii (REYES & FRENKEL, 1987). Assim, a transferência de

soro de camundongos cronicamente infectados pelo T. gondii não protege

outros camundongos não infectados de uma infecção primária, enquanto que,

camundongos com supressão na produção de linfócitos B responsáveis pela

imunidade humoral conseguem controlar a infecção primária pelo T. gondii

(REYES & FRENKEL, 1987). Por outro lado, camundongos atímicos são muito

susceptíveis à infecção pelo T. gondii (LINDBERG & FRENKEL, 1977). Essas

observações têm sugerido que, na imunidade específica, a imunidade celular

tem um papel preponderante no controle da infecção pelo T. gondii

(GAZZINELLI et al., 1993a).

Sob ação da imunidade celular, os T. gondii, que na fase aguda da

toxoplasmose se encontram principalmente na forma de taquizoítos, são

destruídos, enquanto outros, na forma de bradizoítos, formam os cistos

teciduais. Nesses cistos localizados dentro das células hospedeiras ficam

protegidos da ação do sistema imune durante a fase crônica da doença

(LEWIS & WILSON, 2001). Quando deixam esses locais, os parasitas são

prontamente eliminados pela imunidade do hospedeiro (GAZZINELLI et al.,

1993a). A elucidação dos mecanismos pelos quais os hospedeiros

imunocompetentes resolvem uma infecção aguda causada pelo Toxoplasma

gondii e controlam a infecção crônica é fundamental para o entendimento da

patogenia da toxoplasmose.

2.3.2.1 – Imunidade celular

A imunidade mediada por células ou imunidade específica é

desenvolvida pelos linfócitos T originados no timo, responsáveis principalmente

pela defesa contra patógenos intracelulares obrigatórios, com função de

promover a sua destruição ou a lise das células infectadas (HAYNES &

HEINLY, 1995). Essas ações são exercidas tanto por ação direta, quanto

indiretamente através da secreção de citocinas. Para tal, os linfócitos T

reconhecem antígenos peptídeos restritos às moléculas de HLA, através de

seu complexo TCR (T Cell Receptor – Receptor de células T). Pela natureza

das cadeias protéicas da molécula de TCR, os linfócitos T se subdividem em

linfócito T alfa-beta (Tαβ – cadeia α associada à cadeia β) e linfócitos T gama-

delta (Tγδ – cadeia γ associada à cadeia δ) (ROBEY & FOWLKES, 1998).

Os linfócitos Tαβ são os mais numerosos, representando cerca de 95%

do total de linfócitos e seus receptores estão envolvidos no reconhecimento

dos antígenos (TANCHOT et al., 1997). Para a sua ativação, outros sinais são

requeridos, envolvendo as moléculas acessórias que facilitam as interações

com as APCs ou com as células alvo. Duas dessas moléculas se associam

intrinsecamente à função do TCR e por isso são denominadas de co-

receptoras, sendo elas o CD4 e o CD8, que subdividem, respectivamente, os

linfócitos T em dois conjuntos: as células T CD4+ que representam 65% dos

linfócitos Tαβ; e as células T CD8+, que representam 35% dos linfócitos Tαβ

(TANCHOT et al., 1997).

Ambos os linfócitos Tαβ CD4+ e Tαβ CD8+ participam de forma

associativa e complementar na imunidade celular específica contra os

patógenos intracelulares incluindo o T. gondii e outros (DE PAOLI et al., 1992).

Células T CD8+ efetoras citotóxicas (CTL) são capazes de lisar células alvo

infectadas, mas, para a geração destas células T CD8+ efetoras é requerida a

participação da sub-população de células T CD4+ h (auxiliares ou “helper”)

(GAZZINELLI et al., 1991). Dessa reação específica, formam-se células de

memórias, tanto para células T CD4+, quanto para as células T CD8+.

De acordo com o ambiente propiciado por citocinas produzidas logo

após o contato com o antígeno, os linfócitos T CD4+ ainda não estimulados

são influenciados pelas citocinas, diferenciando-se em células Th1 (T “helper”-

1) ou em células Th2 (T “helper”-2), com cada subconjunto passando a produzir

um perfil diferente de citocinas (MOSMANN et al., 1986). A IL-12 estimula a

diferenciação de linfócitos T CD4+ em linfócitos T CD4+ Th1 (TRINCHIERI,

1993). Além disso, foi observado que o IFN-γ é um potente inibidor da

diferenciação de linfócitos T CD4+ em linfócitos T CD4+ Th2 (GAJEWSKI &

FITCH, 1988). Dessa forma, os patógenos, como o T. gondii, que estimulam os

macrófagos e células NK a produzirem IFN-γ induzem respostas dominadas

pelos linfócitos T CD4+ Th1 tendendo, portanto, para uma imunidade

predominantemente do tipo celular. Ao contrário, as citocinas IL-4 e IL-10

estimulam a diferenciação em direção aos linfócitos T CD4+ Th2 e, portanto,

para a imunidade predominantemente do tipo humoral (MOSMANN, 1991).

Cada subconjunto de linfócitos T CD4+ Th1 ou T CD4+ Th2, através da

produção de citocinas é capaz de inibir reciprocamente a diferenciação e o

crescimento das células e da produção de citocinas específicas do outro

subconjunto. Essa regulação cruzada provê a base para o entendimento das

inter-relações entre resposta imune celular e resposta imune humoral

(GAZZINELLI et al., 1993a; TRINCHIERI, 1993).

Os linfócitos T CD4+ Th1 induzem a imunidade celular protetora contra

patógenos intracelulares e produzem principalmente as citocinas IL-12 e IFN-γ,

importantes para a diferenciação e proliferação de macrófagos e células NK,

mas também para estimular o aumento da produção das imunoglobulinas

IgG2a/IgG em camundongos. Os linfócitos T CD4+ Th2 são mais eficientes em

induzir a imunidade humoral (MOSMANN, 1991) e produzem principalmente as

citocinas IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10, que irão coordenar funções como a regulação

da produção de Ig E, da eosinofilia e da mastocitose (TOELLNER et al., 1998;

LEWIS & WILSON, 2001).

Os 5% restantes do total de linfócitos T no organismo são representados

pelos linfócitos Tγδ que são encontrados em maior concentração em algumas

regiões específicas, como a mucosa intestinal e placenta (SCALISE et al.,

1992). Uma hipótese bem fundamentada para a ação dos linfócitos Tγδ propõe

que eles poderiam reconhecer os antígenos encontrados nos limites epiteliais,

entre o hospedeiro e o ambiente externo. Nesse caso, eles iniciariam uma

primeira linha de defesa contra alguns patógenos invasores, antes mesmo do

recrutamento dos linfócitos Tαβ mais específicos. A resposta das células Tγδ,

observadas em certas infecções, inclusive as desenvolvidas contra patógenos

intracelulares, como o T. gondii, em humanos e em camundongos poderiam

acontecer independentemente do reconhecimento dos patógenos (LEWIS &

WILSON, 2001).

2.3.2.2 – Imunidade humoral

Para as células B serem ativadas para a produção de anticorpos contra

antígenos protéicos é necessária a participação das células T CD4+ Th2

através da produção de citocinas tais como IL-4. São necessários ainda, sinais

acessórios de moléculas de superfície, como o ligante CD40 expresso nas

células T, o qual se liga ao CD40 constitutivamente expresso pelas células B.

Este caminho também é importante na sinalização da troca isotípica para a

produção de anticorpos (revisado por LEWIS & WILSON, 2001).

Células B humanas produzem cinco isotipos de anticorpos: IgM, IgD,

IgG, IgA e IgE. O IgG e o IgA podem ser subdivididos em subclassses: IgG1,

IgG2, IgG3 e IgG4, IgA1 e IgA2. Todas as classes, com exceção de IgG4,

podem ativar a via clássica do complemento.

Os anticorpos são a primeira linha de defesa contra o T. gondii. Eles

atuam nos taquizoítos extracelulares que são liberados após a lise de uma

célula infectada. Eles limitam a multiplicação dos toxoplasmas através da lise

do parasita após a ativação da via do complemento. Atuam também via

opsonização dos parasitas ou aumentando a ação fagocitária dos macrófagos

(FILISETTI & CANDOLFI, 2004).

2.3.3 – Rede de citocinas na infecção por T. gondii

Na fase inicial da toxoplasmose aguda sitêmica são necessários uma

resposta imune inata e o início do estabelecimento de uma rede de citocinas

com a função de fazer a ligação com a imunidade específica que é importante

para o controle da toxoplasmose aguda e crônica (JOHNSON E SAYLES,

1997; ALEXANDER & HUNTER, 1998).

Na fase inicial da infecção, com a entrada do T. gondii, os parasitas

ainda livres, seus antígenos e seus produtos de secreção induzem as células

dendríticas e macrófagos a produzirem citocinas, tais como a IL-1, IL-12, o

TNF-α (GAZZINELLI et al., 1993b, 1994; PELOUX et al., 1996) e,

possivelmente, IL-15 (KHAN & KASPER, 1996). Essas citocinas e os produtos

derivados dos T. gondii ativam diretamente as células NK que passam a

destruir as células infectadas com o T.gondii (ALEXANDER & HUNTER, 1998).

Ao mesmo tempo, passam a produzir grande quantidade de INF-γ para

intensificar a ativação dos macrófagos infectados (GAZZINELLI et al., 1993a,

1996). Essa ativação estimulada pelo INF-γ aumenta o metabolismo oxidativo

do macrófago, com conseqüente produção da enzima induzível óxido nítrico

sintetase (iNOS – “inducible Nitric Oxide Sintetase”) e do peróxido de

hidrogênio, em níveis quatro vezes maiores do que em macrófagos infectados

mas não estimulados (MURRAY & COHN, 1979). Isso inibe a replicação e

causa a destruição dos taquizoítos fagocitados, reafirmando o efeito

parasiticida do peróxido de hidrogênio produzido por macrófagos (MURRAY et

al., 1985).

A ligação da imunidade inespecífica com a resposta imune específica é

feita pelo IFN-γ e IL-12 que passam a favorecer a diferenciação das células Tαβ

CD4+ não estimuladas, em uma população efetora do tipo T CD4+ Th1 que,

por sua vez, passa a produzir altos níveis de IFN-γ (ALEXANDER & HUNTER,

1998). Essa é a fonte de IFN-γ capaz de conter o parasita durante a fase inicial

da infecção aguda e que ajuda a limitar a disseminação da infecção para

tecidos onde poderiam formar cistos reativos de taquizoítos.

Uma grande variedade de citocinas participa dessa rede de ativação e é

produzida em conseqüência da resposta imune específica do hospedeiro

contra o T. gondii. Assim, a IL-12 produzida pelas células T CD4+ Th1 ativadas

age como um potente fator de crescimento autócrino para o aumento da

ativação das células T CD4+ Th1 e como um ativador parácrino, ativando e

aumentando a função tanto de células NK, como de células T CD8+ efetoras

em seus efeitos citotóxicos (CARSON et al., 1994). Em contraste, a citocina IL-

5 é predominantemente produzida por células T CD4+ Th2 ativadas e tem

alguns efeitos sobre linfócitos B, tais como aumentar a expressão de

receptores de IL-2 e promover a proliferação e diferenciação destas células.

Por outro lado, a IL-6, uma citocina produzida por macrófagos, parece

participar do equilíbrio na resposta pró-inflamatória estimulada por IFN-γ

(CHAO et al., 1994).

A regulação da resposta imune é um processo complexo e necessário

para que a resposta inflamatória seja restrita à área de infecção. Para tal se

desenvolve um mecanismo de controle, positivo e negativo, envolvendo,

respectivamente, o estímulo ou a inibição da produção das citocinas. Por

exemplo, TNF-α e IL-1 induzem diretamente a produção pelos macrófagos e

células endoteliais de mais TNF-α e IL-1, mas também de IL-6, GM-CSF,

M-CSF e G-CSF. Para a modulação, outros macrófagos passam a produzir

citocinas que atenuam a produção das citocinas pró-inflamatórias e do tipo

Th1. Essas citocinas moduladoras, denominadas antiinflamatórias, incluem a

IL-10 (MOSMANN, 1994), TGF-β (LETTERIO & ROBERTS, 1998) e

antagonista do receptor de IL-1 (IL-1ra) (DINARELLO, 1994). A IL-6, IL-10 e a

IL-1ra são expressas poucas horas após o TNF-α e a IL-1 serem produzidos,

inibindo a produção do TNF-α e IL-1 (DINARELLO, 1991). Por sua vez,

citocinas produzidas por células Th1, principalmente IFN-γ, atenuam a

produção de IL-10 (CHOMARAT et al., 1993). A produção dessas citocinas

antiinflamatórias é também incrementada pela exposição dos macrófagos a

citocinas produzidas por células Th2 incluindo IL-4, IL-10, IL-13 e TGF-β

(CHOMARAT et al., 1993).

A IL-10 é outra importante citocina moduladora deste sistema de

regulação, pois além de inibir a produção de IL-1 β, IL-12 e TNF-α por

macrófagos, bloqueia ainda a produção de IFN-γ por células NK (FIORENTINO

et al., 1991a, b). A IL-10 também diminui a expressão de antígenos do MHC de

classe II e de moléculas B7, ambos na superfície dos macrófagos, impedindo a

apresentação de antígenos e o desenvolvimento das funções co-estimulatórias

dessas células. Ainda mais, no contexto da infecção, a IL-10 inibe a produção

de óxido nítrico nos macrófagos, incapacitando-os de destruir os organismos

intracelulares como o T. gondii (NEYER et al., 1997). Uma função fundamental

da IL-10 na infecção pelo T. gondii é diminuir a produção de citocinas pelas

células NK, linfócitos e macrófagos, especialmente a IL-12, por este último

(FIORENTINO et al., 1991b). A produção da IL-10 pelos macrófagos, ao menos

em helmintos, favorece o estabelecimento da fase crônica no hospedeiro

(SHER et al., 1991).

O IFN-γ produzido pelas células NK na presença das frações antigênicas

do T.gondii (GAZZINELLI et al., 1998) aumenta a síntese de IL-12 pelos

macrófagos. Além disso, foram demonstrados os efeitos do TNF-α, IL-1 e IL-15

sobre a IL-12 potencializando sua ação indutora da produção de IFN-γ pelas

células NK (SHER et al., 1993). Assim também ocorre com o efeito inibidor da

IL-10 e do óxido nítrico sobre a síntese de IFN-γ pelas células T CD4+. Ao

mesmo tempo em que os macrófagos induzem a imunidade mediada por

células, regulam também a resposta imune pela produção da IL-10 e do óxido

nítrico (GAZZINELLI et al., 1996).

Estudo realizado em pacientes com RCST observou que aqueles que

possuíam altos níveis séricos de IL-13 e IFN-γ possuíam lesões de

retinocoroidite com um menor grau de destruição tecidual. Esse dado sugere

que essas citocinas possam estar atuando em conjunto na eliminação dos

parasitas e, ao mesmo tempo, na diminuição da resposta inflamatória na retina

(AZEVEDO-SILVA, 2001)

2.4 – Quimiocinas

2.4.1 – Estrutura e função

As quimiocinas constituem uma grande família de citocinas

estruturalmente homólogas responsáveis pela movimentação dos leucócitos,

incluindo sua migração para locais de inflamação tecidual a partir do sangue.

As quimiocinas são pequenos polipeptídeos de 8 a 12 kDa que contêm

duas alças dissulfeto internas. Cerca de 50 quimiocinas diferentes já foram

identificadas, sendo classificadas em famílias com base no número e na

localização dos resíduos de cisteína N-terminais (ROLLINS, 1997). As duas

principais famílias são a das quimiocinas CC, nas quais resíduos de cisteína

são adjacentes, e a família CXC, na qual esses resíduos são separados por um

aminoácido. Uma terceira família tem como única representante a fractalkina

(CX

CL1), em que a característica estrutural é a presença de duas cisteínas

separadas por três aminoácidos (CX

C). Finalmente, a quarta família, que

também possui apenas um representante, a linfotactina (XCL1), possui uma

única cisteína (família C). A nomenclatura das quimiocinas e seus receptores

foi recentemente revisada com o objetivo de uniformizar o modo como eram

citadas (IUIS/WHO, 2003) (Tabela 1).

Essas proteínas, as quimiocinas, podem ainda ser separadas em duas

categorias dependendo da forma como são expressas: 1) constitutivas ou, 2)

induzidas. As quimiocinas constitutivas são produzidas normalmente em vários

tecidos e recrutam leucócitos, principalmente linfócitos, para esses tecidos na

ausência de inflamação. As quimiocinas induzidas (ou inflamatórias) são

produzidas por várias células em resposta a estímulos inflamatórios e recrutam

leucócitos para locais de inflamação (MOSER & LOETSCHER, 2001).

Quimiocinas atuam através de receptores trans-membranas de alta

afinidade expostas na superfície de células circulantes. Onze receptores

diferentes para quimiocinas CC (chamadas CCR1 a CCR11) e seis para

quimiocinas CXC (chamadas CXCR1 a CXCR6) já foram identificados

(MURPHY ET AL., 2000; MURPHY, 2002). Os receptores de quimiocinas

possuem sítios de ligação que podem ser específicos (CCR9, CXCR6), mas,

comumente, o mesmo receptor pode ser alvo de ligação de várias quimiocinas

do mesmo grupo (Tabela 1). Os receptores de quimiocinas são expressos em

leucócitos, com o maior número de receptores diferentes vistos em linfócitos T.

A expressão dos receptores de quimiocinas pode definir subtipos de linfócitos

T. Além disso, linfócitos T periféricos maduros expressam diferentes receptores

de quimiocinas dependendo do seu fenótipo funcional. Por exemplo, células T

helper 1 (Th1), que sintetizam IL-2 e IFN-γ, e mediam a ativação de fagócitos,

expressam CXCR3, CCR2 e CCR5. Linfócitos T helper 2 (Th2), que produzem

IL-4, IL-5 e são mediadores da produção de anticorpos pelos linfócitos B,

expressam CCR3, CCR4 e CCR2 Estas diferenças determinam, em parte, o

tipo de resposta imune que irá se desenvolver em um sítio de inflamação

(SALLUSTO et al., 1998; WALLACE et al., 2004).

Tabela1 – Quimiocinas humanas identificadas.

Família Quimiocina Nome original Receptores Localização

do gene

CXCL1 GROα/MIP-2 CXCR2 24q21

CXCL2 GROβ CXCR2 4q21

CXCL3 GROγ CXCR2 4q21

CXCL4 PF-4 ? 4q21

CXCL5 ENA-78 CXCR2 4q21

CXCL6 GCP-2 CXCR2 24q21

CXCL7 NAP-2 CXCR2 4q21

CXCL8 IL-8 CXCR2, CXCR1 24q21

CXCL9 MIG CXCR3 4q21

CXCL10 IP-10 CXCR3 4q21

CXCL11 I-TAC CXCR3 4q21

CXCL12 SDF-1 CXCR4 10q11.21

CXCL13 BCA-1 CXCR5 4q21

CXCL14 BRAK ? 5q31.1

CXCL15 Lungkine ? ?

CXCL16 CXCL16 CXCR6 17p13

CXC

CCL1 I-309 CCR8 17q11

CCL2 MCP-1 CCR2 17q12

CCL3 MIP-1α CCR1, CCR5 17q12

CCL4 MIP-1β CCR5 17q12

CCL5 RANTES CCR5 ?

CCL6 C10 ? ?

CCL7 MCP-3 CCR1, CCR2, CCR3 17q11

CCL8 MCP-2 CCR3, CCR5 17q11

CCL9 MIP-1γ ? ?

CCL10 CCL10 ? ?

CCL11 Eotaxin CCR3 17q11

CCL12 MCP-5 CCR2 ?

CCL13 MCP-4 CCR2, CCR3 17q11

CCL14 HCC-1 CCR1, CCR5 17q12

CCL15 HCC-2/MIP-

1δ/Leukotactin-1

CCR1, CCR3 17q12

CCL16 HCC-4/LEC CCR1, CCR2 17q12

CCL17 TARC CCR4 16q13

CCL18 PARC/DC-CK1 ? 17q12

CCL19 MIP-3β/ELC CCR7 9p13.3

CCL20 LARC/MIP-3α CCR6 2q36.3

CCL21 SLC/6Ckine CCR7 9p13.3

CCL22 MDC CCR4 16q13

CCL23 MPIF-1 CCR1 17q12

CCL24 Eotaxin-2/MPIF-2 CCR3, CCR5 7q11

CCL25 TECK CCR9 19q13.3

CCL26 Eotaxin-3 CCR3 7q11

CCL27 ESkine/MCC/Ctack CCR10 9p13.3

CCL28 MEC CCR3, CCR10 5p12

XCL1 Lymphotactin α XCR1 1q24

XCL2 Lymphotactin β XCR1 1q24

CL1 Fractalkine CX

CR1 16q13

Originalmente as quimiocinas foram estudadas devido ao seu importante

papel nos processos inflamatórios; mas atualmente, sabe-se do papel crucial

exercida por essas moléculas na estimulação do movimento das células

mononucleares pelo corpo e na migração destas do sangue periférico para os

tecidos, contribuindo na resposta imune adaptativa e/ou na patogênese de

várias doenças (CHARO & RANSOHOFF, 2006).

Além das funções como agente quimiotático de linfócitos, os estudos

com as quimiocinas e seus receptores estão revelando outros importantes

papéis para essas moléculas. Alguns receptores de quimiocinas, entre eles o

CCR5, são os principais co-receptores para certas cepas do vírus da

imunodeficiência humana (HIV) (CHOE et al., 1996; DRAGIC et al., 1996).

Estudos recentes têm identificado polimorfismos em genes que codificam as

quimiocinas, o que poderia interferir na sua função. Os estudos mais

aprofundados abordam a deleção do CCR5∆32 e a infecção pelo HIV.

Pacientes com essa mutação são protegidos da infecção pelo vírus (O’BRIEN

& MOORE, 2000).

Algumas quimiocinas estão envolvidas na angiogênese por exercerem

efeito quimiotático em células endoteliais (por exemplo, CXCL8, CXCL5,

CXCL6, CXCL1, CXCL2, CXCL3), enquanto outras podem exercer um efeito

antiangiogênico (CXCL4, CXCL10 e CXCL9) (ROLLINS, 1997). Outro efeito

atribuído às quimiocinas é a sua interferência, tanto estimulando quanto

inibindo, a hematopoiese. Esses efeitos na hematopoiese vão depender da

maturidade das células progenitoras envolvidas (ROLLINS, 1997).

Quimiocinas têm sido relacionadas a metástases tumorais e,

contraditoriamente, a inibição do crescimento de células tumorais; infecções e

doenças auto-imunes, como a artrite reumatóide e a esclerose múltipla (WANG

et al., 1996; RANSOHOFF, 2002; VICARI & CAUX, 2002; DONG et al., 2003;

LOETSCHER & MOSER, 2002). Níveis elevados de CCL2, CCL3, CCL4, CCL5

e CXCL10 têm sido encontrados no sistema nervoso central de pacientes com

esclerose múltipla e em modelos experimentais dessa doença (BAGGIOLINI et

al., 1997; SORENSON et al., 1999). Em um trabalho recente, pacientes com

esclerose múltipla ativa apresentaram níveis elevados de CXCL10 no líquor,

enquanto que os níveis de CCL2 foram significativamente menores quando

comparados a controles assintomáticos (MOREIRA et al., 2006). Em pacientes

com a forma aguda da coréia de Sydenham, observou-se elevação dos níveis

séricos de CXCL9 e CXCL10 (TEIXEIRA-JR et al., 2004). Níveis elevados de

CXCL8 têm sido relatados em várias doenças inflamatórias sistêmicas como na

sarcoidose e na sepse (HACK et al., 1992; YOKOYAMA et al., 1995). Níveis

teciduais aumentados de CXCL8 e anticorpos séricos contra essa quimiocina

parecem estar elevados na colite ulcerativa em atividade (MAHIDA et al.,

1992).

Vários estudos realçam a importância das quimiocinas na patogênese

das doenças pulmonares obstrutivas crônicas e o papel dos antagonistas dos

receptores de quimiocinas como uma possibilidade terapêutica possível

(TRAVES et al., 2002). No diabetes mellitus, estudos revelaram que as

quimiocinas podem interferir no acúmulo de células adiposas, aumentado

assim a resistência periférica à insulina (GERHARDT et al., 2001). Estudo

experimental mostrou que animais geneticamente modificados, que não

expressam a quimiocina CCL2 e o receptor CCR2, possuem a gravidade

atenuada da aterosclerose induzida por dieta (GU et al., 1998). Trabalhos

revelaram que a produção de quimiocinas pelas células do tecido renal estaria

envolvida tanto na homeostase do órgão, quanto na gênese de doenças

inflamatórias glomerulares ou túbulo-intersticiais (SCHLONDORFF et al., 1997;

SEGERER et al., 2000). Portanto, as quimiocinas estão envolvidas em vários

processos fisiológicos e patológicos do organismo.

As citocinas e quimiocinas são expressas no olho não apenas durante

os períodos de inflamação. Olhos não inflamados expressam quimocinas e

citocinas que exercem funções regulatórias e constitutivas. O fator de

transformação e crescimento β (TGFβ) está envolvido na regulação da resposta

imune e na reparação tecidual. O humor aquoso de olhos normais contém altos

níveis de TGFβ2 na forma ativa, sendo que esta citocina está envolvida na

manutenção de um micro-ambiente de imunossupressão dentro do olho,

prevenindo quadros de inflamação indesejáveis (CURNOW & MURRAY, 2006).

Poucos estudos têm sido feitos para avaliar a expressão constitutiva das

quimiocinas dentro do olho. CCL2 está presente em níveis significativos e pode

ser responsável pelo recrutamento de monócitos para os tecidos oculares para

formar a população residente de células apresentadoras de antígenos

(CURNOW & MURRAY, 2006). Parece haver uma alta expressão de CX

CL1

nos tecidos oculares, embora a significância desse achado necessite ainda ser

compreendida (FANG et al., 2005; SILVERMAN et al., 2003).

Células do EPR humano têm mostrado, in vitro, uma produção de várias

quimiocinas, incluindo CXCL8, CCL2 e CCL5 em resposta à citocinas pró-

inflamatórias, como o TNF e o IFN-γ (CRANE et al., 1998). A produção in vitro

de CXCL8 e CCL2 pelas células do EPR humano tem sido inibida pela

dexametasona e ciclosporina, que são drogas comumente utilizadas no

tratamento das uveítes (KURTZ et al., 1997). Além disso, a CCL2 tem se

mostrado capaz de induzir migração de células do EPR, um mecanismo que é

inibido pela dexametasona (HAN et al., 2001). Ácido ribonucléico mensageiro

(RNAm) da quimiocina CXCL12 tem sido expressa de forma constitutiva pelas

células do EPR humano (WALLACE et al,, 2004). Estes dados realçam o

importante papel das quimiocinas não apenas nos quadros inflamatórios, mas

também na manutenção da homeostase dos tecidos oculares.

2.4.2 – O papel das quimiocinas nas doenças oculares

As quimiocinas estão envolvidas em várias doenças oculares, tanto

inflamatórias, quanto proliferativas e degenerativas. Embora essas categorias

de doenças oculares sejam diferentes, muitos dos mecanismos e das

quimiocinas envolvidas são semelhantes (WALLACE et al., 2004).

Na síndrome do olho seco, recente trabalho observou, através da

citometria de fluxo de células coletadas em amostras conjuntivais, um aumento

de expressão de receptores CCR5 tanto nos casos de olho seco evaporativo

quanto nas formas hipossecretoras (GULATI et al., 2006).

Em biópsias conjuntivais de pacientes com ceratoconjuntivite vernal,

CCL5 e CCL11 foram fortemente expressas no epitélio e endotélio, e ocorreu

um aumento do número de células positivas para CCL2, CCL5, CCL7 e CCL11.

A maioria destas células eram macrófagos (EL-ASRAR et al., 2000). Além

disso, essas células expressaram CCL1, CCL18 e CCL22, que são potentes

agentes quimiotáticos para células T, o que poderia explicar a grande

quantidade de linfócitos na ceratoconjuntivite vernal (EL-ASRAR et al., 2002). A

análise dos receptores de quimiocinas na conjuntivite alérgica mostrou que o

CXCR3 foi expresso numa maior quantidade nos linfócitos T da conjuntiva

quando comparado com tecidos normais (EL-ASRAR et al., 2001). Além dos

linfócitos e dos macrófagos, os eosinófilos têm sido implicados na patogênese

das doenças alérgicas oculares. Altos níveis de CCL11 e CCL24, ambos

potentes agentes quimiotáticos para eosinófilos, foram encontrados no muco e

nas lágrimas dos pacientes com ceratoconjuntivite vernal e ceratocojuntivite

atópica (LEONARDI et al., 2003).

Como as quimiocinas possuem um importante papel na angiogênese em

diversos órgãos, alguns estudos verificaram o seu papel na retinopatia

diabética. CXCL8 e CXCL10 foram encontrados em níveis elevados no corpo

vítreo de pacientes com retinopatia diabética quando comparado a indivíduos

com buraco macular (ELNER et al., 1995). Interessantemente, os níveis de

CXCL8 foram maiores nos pacientes com a forma ativa da doença, enquanto

os níveis de CXCL10 foram maiores nos pacientes com a forma controlada da

doença (ELNER et al., 1998; YUUKI et al., 2001). Na vasculite retiniana de

causa idiopática foi observada correlação entre atividade da doença e os níveis

de CCL4 e CCL2 no soro (WALLACE et al., 2003).

A principal causa de cegueira em pacientes com degeneração macular

relacionada à idade é a formação de membrana neovascular sub-retiniana. As

células do EPR têm mostrado serem capazes de produzir quimiocinas, in vitro,

incluindo CXCL8, CCL2 e CCL5 em resposta ao estímulo de citocinas pró-

inflamatórias como o TNF-α e o IFN-γ (CRANE et al., 1998; ELNER et al.,

1997). Recente estudo demonstrou que células do EPR presentes nas

membranas neovasculares coroidianas expressam CCL2, podendo essa

quimiocina estar envolvida na formação das membranas juntamente com

outros fatores, como o VEGF (vascular endothelial growth factor) e o fator

tecidual derivado de macrófagos (GROSSNIKLAUS et al., 2002).

2.5 – O papel das quimiocinas nas uveítes

2.5.1 – Estudos experimentais

A uveíte experimental auto-imune (UEA) é considerada um modelo

representativo de diversas doenças inflamatórias oculares humanas de

presumível origem auto-imune, sendo útil, portanto, para o estudo

histopatológico e imunológico dessas entidades (FAURE, 1980; GERY et al.,

1986).

Estudo em UEA mostrou que CCL2, CCL3 e CCL5, detectados através

do ensaio enzimático de imunoabsorção (ELISA), foram expressos

abundantemente nos tecidos retinianos durante o pico do processo

inflamatório. CCL3 foi produzido por células do tecido retiniano, sendo

detectado em células da coróide antes do início da doença, sugerindo que a

sua presença está muito relacionada com o desenvolvimento da UEA (CRANE

et al., 2001). Interessantemente, a neutralização da quimiocina CCL5 através

de anticorpo específico faz com que ocorra uma exacerbação da UEA,

mediada por um aumento na infiltração de linfócitos CD4

. Portanto, CCL5

poderia suprimir UEA através da alteração na migração de subtipos de

linfócitos para o olho durante o processo inflamatório (SONODA et al., 2003).

Outro estudo experimental evidenciou a expressão de RNAm das

quimiocinas CCL5, CXCL10 e CCL2 no extrato de partes do segmento

posterior de olhos com UEA após 14 dias da imunização. Os receptores CCR2,

CCR5 e CXCR3 também foram expressos nestes olhos. Os dados desse

trabalho sugerem que essas quimiocinas podem contribuir para o recrutamento

de linfócitos Th1 na UEA (KEINO et al., 2003).

CCL2 mostrou-se importante na uveíte anterior recorrente que se

desenvolveu após a injeção de proteína básica de mielina em ratos Lewis. A

expressão de RNAm de CCL2 estava aumentada na íris e no corpo ciliar de

ratos na fase pré-clínica da recorrência da uveíte anterior. O RNAm das CCL4

e CCL5 também foram detectados durante o curso da uveíte anterior

recorrente. O pico da CCL4 ocorreu na fase pré-clínica, enquanto a CCL5 era

mais alta durante a fase clínica da doença. RNAm da CCL3 foi observado no

início da doença e seus níveis foram decrescendo durante o pico da doença. O

emprego de imunoglobulinas anti-CCL4, anti-CCL5 e, particulamente, anti-

CCL3 foi capaz de suprimir o desenvolvimento da uveíte anterior recorrente

(MANCZAK et al., 2002). Portanto, os estudos experimentais envolvendo

quimiocinas têm mostrado o relevante papel dessas proteínas nos processos

inflamatórios intra-oculares.

2.5.2 – Estudos em humanos

2.5.2.1 – Uveítes não-infecciosas

Diversos trabalhos estudam o papel das quimiocinas nos processos

inflamatórios que ocorrem nas uveítes de etiologia auto-imune em humanos.

Uma das nosologias oculares mais estudadas em relação ao papel das

quimiocinas e seus receptores é a doença de Behçet. Nesses pacientes a

hiper-reatividade dos neutrófilos têm sido documentada de forma consistente

(EKSIOGLU-DEMIRALP et al., 2001; SAHIN et al., 1996). A quimiocina CXCL8,

que é capaz de induzir a migração e ativação dos neutrófilos e a sua interação

com as células endoteliais vasculares, tem sido encontrada em níveis elevados

no soro de pacientes com doença de Behçet (WANG et al., 1997; MANTAS et

al., 2000). Essa alteração nas células endoteliais vasculares tem sido sugerida

como o primeiro sinal patológico na doença de Behçet (SAHIN et al., 1996;

RIZZI et al., 1997). Níveis séricos de CXCL8 encontravam-se aumentados em

pacientes com a forma ativa da doença, especialmente, aqueles com

manifestações orais e neurológicas (ZOUBOULIS et al., 2000). Outro estudo

mostrou aumento dos níveis de CXCL8 nos pacientes com a forma ativa da

doença de Behçet, apesar de não citar especificamente o envolvimento ocular

(KATSANTONIS et al., 2000). Nesse mesmo estudo, postulou-se que a

quimiocina CXCL8 poderia ser usada como um marcador da atividade da

doença de forma mais confiável do que a proteína C reativa e a velocidade de

hemossedimentação. De nota, níveis ainda mais elevados de CXCL8 foram

detectados nos pacientes que tiveram uma forma grave da doença, como

envolvimento do sistema nervoso central e trombose da veia cava (FREIRE et

al., 2004). Em relação aos receptores de quimiocinas, estudo recente levantou

a hipótese de que o principal receptor de quimiocina inflamatória envolvido na

doença de Behçet seria o CXCR

, especialmente durante os quadros com

manifestações pulmonares e do sistema nervoso central (HOUMAN et al.,

2004).

CURNOW et al. (2005) avaliaram o humor aquoso de pacientes com

uveítes de diversas etiologias, entre elas, idiopática, ciclite heterocrômica de

Fuchs, por herpes vírus e doença de Behçet. Nos pacientes com uveíte

idiopática foram detectados altos níveis de CXCL8 e CCL2, além de IFN-γ e

IL-6. Em relação aos níveis de CXCL8 havia uma correlação proporcional entre

o número de neutrófilos presentes. Os níveis de CXCL12 estavam diminuídos

no grupo com uveíte idiopática quando comparado ao grupo controle.

A fonte celular das quimiocinas e citocinas envolvidas nas uveítes ainda

necessita ser compreendida. Células residentes do estroma e macrófagos

podem ser uma importante fonte destas proteínas (TAKASE et al., 2006), além

dos linfócitos T (HILL et al., 2005). DAMICO et al. (2005) observaram que o

infiltrado de células T pode ser estimulado por peptídeos derivados de

melanócitos e induzir uma resposta inflamatória do tipo Th1 em pacientes com

a síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, através da produção de citocinas. O

reconhecimento e estímulo dos linfócitos foi maior em indivíduos com HLA-

DRB1*0405 positivo.

Em estudo envolvendo pacientes com uveíte anterior idiopática, os

pesquisadores coletaram humor aquoso e encontraram níveis elevados de

CXCL8 em 50% das amostras de pacientes com uveíte em atividade, enquanto

que em pacientes na forma quiescente da doença não foram encontradas

alterações dessa quimiocina (VERMA et al., 1997). Os níveis de CXCL10 foram

significativamente maiores nos pacientes com uveíte em atividade quando

comparados com os pacientes com a forma inativa, enquanto que os níveis de

CCL2 eram indetectáveis nos pacientes na forma inativa. Entretanto, as

quimiocinas CCL4 e CCL5 foram encontradas em níveis baixos, mas

estatisticamente maiores do que no grupo controle. Em outro estudo, níveis

elevados de CXCL8 foram encontrados no sangue de pacientes com uveíte

anterior (HLA-B27+), quando comparados com pacientes sem uveíte (KLOK et

al., 1998).

Estudo recente, no qual foi realizada a dosagem de quimiocinas pelo

método ELISA no humor aquoso de pacientes com uveíte em atividade,

mostrou níveis elevados de CXCL10 em todos os pacientes quando comparado

com o grupo controle (EL-ASRAR et al., 2004). Os níveis dessa quimiocina

foram maiores no humor aquoso do que no sangre circulante. Houve diferença

estatisticamente significante nos níveis de CXCL10 nos pacientes com doença

de Behçet, quando comparado com os pacientes com a síndrome de Vogt-

Koyanagi-Harada. Já os níveis de CXCL8 foram maiores no sangue periférico

do que no humor aquoso.

Portanto, algumas quimiocinas mostraram-se frequentemente elevadas

em pacientes com uveíte, destacando-se a CXCL8 e a CXCL10, sendo que,

em alguns casos, correlacionavam-se com gravidade do quadro inflamatório.

Estabelece-se, assim, uma perspectiva para novos marcadores da atividade

inflamatória da doença ou até mesmo, de prognóstico, já que o prognóstico

visual das uveítes está essencialmente relacionado ao número de recorrências

do processo inflamatório.

A uveíte intermediária é caracterizada por um curso variável, variando de

processos auto-limitados à doença crônica com períodos de remissão e

exacerbação da doença. A etiologia da uveíte intermediária ainda é

desconhecida, apesar de alguns pacientes possuírem uma doença sistêmica

associada, como acontece na sarcoidose e na esclerose múltipla (ZIERHUT &

FOSTER, 1992). O papel das quimiocinas na uveíte intermediária tem sido

objeto de alguns estudos. Níveis elevados de CXCL8 foram detectados no

sangue de pacientes com uveíte intermediária quando comparado com

pacientes sem história de uveíte (KLOK et al., 1998). Investigando a relação

entre atividade da doença e os níveis de CXCL8, observou-se que exsudatos

vítreos e periflebite eram mais frequentemente observados nos pacientes com

níveis detectáveis de CXCL8 (KLOK et al., 1998).

2.5.2.2 – Uveítes infecciosas

Nas uveítes de etiologia infecciosa, vários trabalhos estudaram o papel

das citocinas no processo inflamatório ocular em humanos (VALLOCHI et al.,

2002 e 2005), mas nenhum abordou as quimiocinas de forma especifica.

Alguns estudos mostram o papel das quimiocinas na toxoplasmose

sistêmica, sem, contudo, enfatizar a RCST. Em modelos experimentais, o T.

gondii é um potente indutor da expressão das quimiocinas CXCL9 e CXCL10

(BRENIER-PINCHART et al., 2001). A neutralização da ação da CXCL10 em

camundongos infectados com T. gondii inibe o fluxo de células T para os

tecidos e modifica a função destas células nos sítios de inflamação

predominantemente do tipo Th1 (KHAN et al., 2000). Estes trabalhos realçam

que a liberação de quimiocinas pode contribuir na formação do infiltrado

inflamatório que acompanha o quadro de toxoplasmose. CXCL8 e CXCL1

acumulam-se nos sítios de infecção aguda pelo T. gondii (NAVIA et al., 1986).

A secreção da quimiocina CXCL8 é dependente da invasão de taquizóitos e da

subseqüente lise celular das células infectadas (DENNEY et al., 1999). Esses

estudos, além de serem todos experimentais, não abordam o comportamento

das quimiocinas na uveíte de etiologia toxoplásmica.

Os estudos em humanos corroboraram os principais achados dos

estudos experimentais no que diz respeito à possibilidade da utilização das

quimiocinas como marcadores da atividade inflamatória em determinadas

uveítes; utilização como um novo dado que poderia ser incluído no raciocínio

clínico; possibilidade de abordagem terapêutica diferenciada, atuando de

maneira específica nas quimiocinas ou seus receptores envolvidos. Trabalhos

sobre quimiocinas nas uveítes infecciosas em humanos são escassos,

necessitando, portanto, de estudos adicionais para que possamos criar ou

rejeitar novas hipóteses no raciocínio diagnóstico, clínico e terapêutico destas

nosologias.

3 – OBJETIVOS

______________________________________________________________________

1 – Avaliar e comparar os níveis séricos das quimiocinas CCL2, CCL11,

CXCL8, CXCL9 e CXCL10, nos pacientes com RCST ativa e no Grupo

Controle;

2 – Avaliar os níveis séricos das quimiocinas CCL2, CCL11, CXCL8, CXCL9 e

CXCL10, antes e após o tratamento nos pacientes com RCST ativa;

3 – Avaliar se há correlação entre os níveis séricos das quimiocinas CCL2,

CCL11, CXCL8, CXCL9 e CXCL10 com os achados oftalmológicos observados

nos pacientes com RCST ativa, entre eles:

a) presença de vasculite retiniana;

b) intensidade das opacidades vítreas;

c) tamanho da lesão de retinocoroidite em atividade.

4 – MATERIAL E MÉTODO

______________________________________________________________________

4.1 – Seleção dos pacientes

Os pacientes que participaram do estudo foram selecionados no

ambulatório do Serviço de Uveíte do Hospital São Geraldo, Hospital das

Clínicas, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). 95 (noventa e cinco)

pacientes participaram do estudo, sendo que 55 (cinqüenta e cinco)

pertenceram ao Grupo Uveíte e 40 (quarenta) pertenceram ao Grupo Controle.

Consentimento informado foi fornecido e assinado por todos os pacientes

envolvidos na pesquisa.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG –

COEP, sob o parecer n

ETIC 0117/06 (Anexo I).

Os seguintes critérios foram estabelecidos para a seleção dos pacientes:

Critérios de inclusão:

1) maior de 18 anos;

2) lesão aguda característica de RCST (retinocoroidite focal necrosante,

com lesão de retinocoroidite cicatrizada em um dos olhos e sorologia

positiva para toxoplasmose – IgG);

3) não ter iniciado tratamento sistêmico para toxoplasmose no momento da

primeira consulta;

4) pacientes sem história prévia de uveíte de qualquer etiologia foram

selecionados para o Grupo Controle.

Critérios de exclusão:

1) história de qualquer doença sistêmica ou infecciosa em atividade;

2) paciente com sorologia IgM+ para toxoplasmose, ou com sinais de

toxoplasmose sistêmica;

3) paciente em uso de qualquer medicação de forma regular;

4) detecção de qualquer outra doença pelos exames clínicos e laboratoriais

realizados durante a avaliação inicial do paciente.

Pacientes com RCST aguda receberam prescrição médica específica

para tratamento da infecção. As drogas utilizadas foram: 1) sulfadiazina, 1 g de

6/6 horas; 2) pirimetamina, 75 mg (dose de ataque) seguido de 25 mg/dia; 3)

ácido folínico, 7,5 mg/dia; 4) prednisona, aproximadamente 1 mg/kg/dia com

redução gradual e; 5) tratamento tópico com midriático e corticóide. O

tratamento era prescrito por 35 dias, mas era prorrogado, se necessário, até a

resolução do quadro inflamatório intra-ocular. Acompanhamentos periódicos

regulares foram realizados até a cicatrização da lesão de retinocoroidite.

4.2 – Avaliação dos pacientes participantes

Os pacientes com RCST aguda (Grupo Uveíte) e do Grupo Controle

foram submetidos à avaliação oftalmológica que incluiu: medida da acuidade

visual em LogMAR (logarítmo do mínimo ângulo de resolução); medida da

pressão ocular; biomicroscopia do segmento anterior; biomicroscopia do

segmento posterior; oftalmoscopia binocular indireta.

Durante a avaliação biomicroscópica a intensidade do processo

inflamatório era avaliada através da intensidade das opacidades vítreas,

tamanho da lesão de RCST ativa e presença de vasculite retiniana secundária.

A intensidade das opacidades do corpo vítreo foi classificada da

seguinte forma (KIMURA, THYGESON & HOGAN, 1959):

0 = nenhuma opacidade;

+ = poucas opacidades; nítida visualização do fundo ocular (Figura 1);

++ = poucas opacidades; leve borramento visual dos detalhes do fundo

ocular (Figura 2);

+++ = muitas opacidades; marcada dificuldade de visualização dos detalhes

do fundo ocular, mas ainda permitindo distinção das estruturas oculares (Figura

3);

++++ = opacidades densas que impedem a visualização do fundo ocular

(Figura 4).

A detecção de vasculite retiniana (Figura 5) associada ao processo

inflamatório foi avaliada de forma clínica, apenas pela biomicroscopia ou

oftalmolscopia binocular indireta; não sendo utilizada a angiografia

fluoresceínica (HUGUES & DICK, 2003). O tamanho da lesão era avaliado e

comparado ao diâmetro do disco óptico (DD). A localização da lesão era

definida da seguinte forma (HOLLAND et al., 1989):

Zona 1: correspondente a uma área de aproximadamente 3000 µm (2 DD) a

partir da fóvea (corresponde aproximadamente à área compreendida entre as

grandes arcadas vasculares temporais) ou 1500 µm das margens do disco

óptico;

Zona 2: anterior à zona 1 até o equador do globo ocular, que é identificado pela

borda anterior das ampolas das veias vorticosas;

Zona 3: estendendo-se anterior à zona 2 até a ora serrata.

Após avaliação oftalmológica inicial dos pacientes, tanto do Grupo

Uveíte quanto do Grupo Controle, foram coletados 10 ml de sangue através de

punção venosa na fossa antecubital.

Quando a lesão de RCST estava cicatrizada a medicação específica era

suspensa. A presença ou não da atividade do processo inflamatório era

determinada pela avaliação do autor responsável por este trabalho e pelo seu

orientador. Após a suspensão do tratamento, era solicitado ao participante do

estudo que retornasse dentro de 7 dias para nova coleta de sangue.

O sangue coletado era centrifugado para retirada do soro, que foi

estocado a -70

C até a data da análise do material.

Figura 1 – Retinografia de paciente do Grupo Uveíte evidenciando lesão de

retinocoroidite em atividade e opacidade vítrea classificada como 1+/4+.

Figura 2 – Retinografia de paciente do Grupo Uveíte evidenciando lesão de

retinocoroidite em atividade e opacidade vítrea classificada como 2+/4+.

Figura 3 – Retinografia de paciente do Grupo Uveíte evidenciando lesão de

retinocoroidite em atividade e opacidade vítrea classificada como 3+/4+.

Figura 4 – Retinografia de paciente do Grupo Uveíte evidenciando lesão de

retinocoroidite em atividade e opacidade vítrea classificada como 4+/4+.

Figura 5 – Retinografia de paciente do Grupo Uveíte evidenciando presença de

vasculite retiniana.

4.3 – Processamento do soro para a análise das quimiocinas

Todo o processo de preparação e análise do soro dos pacientes

participantes do estudo foi realizado no Laboratório de Imunofarmacologia do

Instituto de Ciências Biológicas (ICB) – UFMG. Para a análise, o soro foi

descongelado e o excesso de proteínas foi removido através do processo de

precipitação ácido/sal que é realizado de rotina neste laboratório (FALCÃO et

al., 2002; MOREIRA et al., 2006; SOUSA-PEREIRA et al., 2006). Volume igual

de 1,2% de ácido tricloroacético 1,35 M (molar) foi misturado ao soro e deixado

em temperatura ambiente por 10 minutos. Posteriormente, as amostras foram

centrifugadas por 5 minutos a 10.000 rpm. Então, o sobrenadante foi ajustado

para o conteúdo de sais adequados (0,14 M de cloreto de sódio e 0,01 M de

fosfato de sódio) e para o pH (7,4) para posterior determinação das

concentrações das quimiocinas.

A concentração das quimiocinas no soro dos pacientes e do grupo

controle foram medidas através da técnica de ELISA sandwich com pares

combinados de anticorpos para as quimiocinas CCL2, CCL11, CXCL8, CXCL9

e CXCL10 (R&D Systems).

Os limites de detecção para essas proteínas foram de 3 pg/ml para

todas as quimiocinas estudadas (CCL2, CCL11, CXCL8, CXCL9 e CXCL10).

4.4 – Escolha das quimiocinas a serem avaliadas

As quimiocinas escolhidas para avaliação no presente estudo

foram as seguintes: CCL2, CCL11, CXCL8, CXCL9 e CXCL10. Algumas

características dessas proteínas influenciaram na sua escolha para o presente

estudo:

- CCL2: essa proteína recruta monócitos para os sítios de infecção,

trauma e isquemia (CHARO & RANSOHOFF, 2006). Estudos experimentais

com camundongos têm mostrado que ratos com deficiência de receptores

dessa quimiocina, possuem um defeito na produção de IFN-γ, que é uma

citocina que exerce um importante papel nas infecções pelo T. gondii. CCL2

mostrou-se importante em diversos estudos envolvendo inflamações intra-

oculares (CRANE et al., 2001; SONODA et al., 2003; KEINO et al., 2003);

- CCL11: essa quimiocina está envolvida no recrutamento dos

eosinófilos. Muito relacionada aos processos alérgicos pulmonares. Os

eosinófilos estão pouco envolvidos na toxoplasmose. Nenhum trabalho

relaciona a uveíte com a CCL11. Na oftalmologia, apresenta níveis elevados

nos processos alérgicos oculares, como na ceratoconjuntivite vernal (EL-

ASRAR et al., 2002).

- CXCL8: é considerada o protótipo da família das quimiocinas CXC.

Essa quimiocina é capaz de induzir a migração e ativação dos neutrófilos. Têm

sido amplamente estudada nas uveítes, principalmente de etiologia não-

infecciosa, sendo até mesmo sugerida a sua utilização como marcador de

atividade da doença de Behçet (KATSANTONIS et al., 2000).

- CXCL9: esse tipo de quimiocina atrai linfócitos e monócitos, mas

possuem pouca habilidade quimiotáxica para neutrófilos (LAING &

SECOMBES, 2004). Relatos têm sido feitos a respeito do importante papel

dessa quimiocina nas doenças inflamatórias ou auto-imunes onde ocorre a

indução e o recrutamento de células do tipo Th1 (GERARD & ROLLINS, 2001).

Estudo recente demonstrou que níveis elevados desta proteína foram

detectados em pacientes com sarcoidose ocular (TAKEUCHI et al., 2006).

- CXCL10: bastante similar à CXCL9 tanto estruturalmente quanto

funcionalmente, estando envolvida no recrutamento seletivo de linfócitos. Os

receptores dessa quimiocina estão expressos predominantemente em células T

ativadas ou de memória, especialmente do tipo Th1 (GERARD & ROLLINS,

2001). Vários estudos mostram a importância desta quimiocina no estudo das

uveítes (KEINO et al., 2003; TAKEUCHI et al., 2006).

4.5 – Análise estatística

Na análise descritiva dos dados, foram construídas tabelas de

freqüências para as variáveis qualitativas: grupo, sexo, tempo de início dos

sintomas, opacidade no corpo vítreo, localização da lesão (zona), tamanho da

lesão em atividade e vasculite retiniana associada para o Grupo Uveíte.

Foram calculadas também medidas de tendência central e dispersão

(média, mediana, erro-padrão, desvio-padrão e quartis) para as variáveis

quantitativas (idade, visão em LogMAR e dosagens das quimiocinas CCL2,

CCL11, CXCL8, CXCL9 e CXCL10).

Antes da realização dos testes de comparação de grupos, foram

realizados testes para verificação de normalidade das variáveis. Os resultados

indicaram que apenas a variável idade segue uma distribuição Normal.

Portanto, para a comparação das variáveis contínuas foram realizados testes

não-paramétricos para comparação dos grupos. Para a comparação de dois

grupos independentes, foi realizado o teste de Mann-Whitney. Para

comparação de mais de dois grupos independentes, foi realizado o teste de

Kruskall-Wallis. Para a comparação das medidas iniciais e finais de 18

pacientes foi utilizado o teste de postos com sinais de Wilcoxon. Para avaliar a

existência de correlação entre as dosagens das quimiocinas, a idade e o sexo

do paciente, foi utilizado o coeficiente de correlação de Pearson, que tem o

símbolo r, e fornece uma medida da força de relacionamento linear entre duas

variáveis contínuas e varia de –1 a +1 passando pelo zero. Para todos os

testes, foi utilizado um nível de significância de 5%. Todas as análises foram

realizadas usando o software estatístico SPSS 12.0 (Statistical Package for the

Social Sciences).

5 – RESULTADOS

______________________________________________________________________

Durante o período de estudo, 95 (noventa e cinco) pacientes

participaram do projeto, sendo que 40 (quarenta) pertenceram ao Grupo

Controle e 55 (cinqüenta e cinco) ao Grupo Uveíte. Os dados dos pacientes

envolvidos no estudo estão sumarizados no Anexo II.

Do total de pacientes participantes, 46 (48,4%) eram do sexo masculino

e 49 (51,6%) do sexo feminino, sendo que, no Grupo Controle, o sexo

masculino representou 45% dos casos; no Grupo Uveíte, 50,9% dos pacientes

eram do sexo masculino. A média de idade do Grupo Uveíte foi de 27,1 ± 8,3

anos e a do Grupo Controle foi de 28,8 ± 7,7 anos. Não houve diferença

estatisticamente significativa entre o sexo (p=0,72) e a idade (p=0,21) entre os

dois grupos. A acuidade visual inicial era estatisticamente pior no pacientes do

Grupo Uveíte quando comparado ao Grupo Controle (p<0,001) (Tabela 2).

Tabela 2 – Características quanto à idade, gênero e acuidade visual dos

pacientes envolvidos no estudo.

Grupo

Uveíte Controle p

n % n %

Gênero

Masculino

28 50,9 18 45,0 0,72

Feminino

27 49,1 22 55,0

Média ± DP

Idade (anos)

27,1 ± 8,3 28,8 ± 7,7 0,21

Acuidade visual

(LogMAR)

1,07 ± 0,92 0,42 ± 0,78 <0,001

*DP= desvio-padrão; LogMAR = logarítmo do mínimo ângulo de resolução.

O valor de p refere-se ao teste χ

com correção de Yates na análise das

variáveis categóricas e ao teste de Mann-Whitney para as variáveis contínuas.

As principais características observadas no exame inicial dos pacientes

do Grupo Uveíte estão sumarizadas na Tabela 3. Todos os pacientes do Grupo

Uveíte apresentaram quadro de RCST com apenas uma lesão em atividade no

momento da avaliação. Nesta série de pacientes não foi observada a presença

de lesões múltiplas, bilaterais ou da forma punctata externa.

Tabela 3 – Características do primeiro exame oftalmológico nos pacientes com

RCST aguda (Grupo Uveíte).

n %

Tempo de apresentação dos sintomas

≤ 7 dias 24 43,6

> 7 dias 31 56,4

Opacidade vítrea*

0 7 12,7

1+ 23 41,8

2+ 15 27,3

3+ 7 12,7

4+ 3 5,5

Tamanho da lesão em atividade

< 1 DD** 19 34,5

1-2 DD 21 38,2

> 2 DD 15 27,3

Localização da lesão em atividade

Zona 1 19 34,5

Zona 2 28 51,0

Zona 3 8 14,5

Olho inflamado

Direito 29 52,7

Esquerdo 26 47,3

Bilateral 0 0

Vasculite retiniana***

Sim 24 43,6

Não 28 50,9

*Classificação de opacidade vítrea de acordo com KIMURA et al (1959);

**DD = diâmetro de disco óptico.

*** Foram desconsiderados os pacientes (n=3) que possuíam 4+/4+ de opacidades

vítreas, pela impossibilidade de determinar a presença de vasculite retiniana.

Os níveis séricos das quimiocinas estudadas no Grupo Uveíte foram

semelhantes aos níveis do Grupo Controle, com exceção da CXCL8 que

apresentou uma elevação estatisticamente significativa no grupo de pacientes

com uveíte em atividade (p=0,017) (Tabela 4) (Gráfico 1).

Tabela 4 – Níveis séricos (pg/ml) das quimiocinas estudadas nos dois grupos,

antes do tratamento.

Uveíte Controle

Média ± EP

Mediana

(25-75%)

Média ± EP

Mediana

(25-75%)

CCL2

236,3 ± 8,2

218,2

(190,1-270,2)

234,2 ± 13,9

223,9

(179,5-266,8)

0,48

CCL11

126,4 ± 13,3

96,1

(57,8-175,5)

111,9 ± 15,7

89,7

(49,2-143,4)

0,51

CXCL9

1890,6 ± 357,8

1273,0

(434,0-2169,9)

2212,0 ± 1139,7

915,0

(22,1-1800,4)

0,11

CXCL10

281,4 ± 23,1

262,8

(178,3-334,5)

274,1 ± 29,7

263,1

(167,8-303,6)

0,83

CXCL8

29,1 ± 3,4

22,5

(18,3-38,3)

16,0 ± 2,3

19,5

(0,0-27,2)

0,017

EP= erro padrão; 25-75%= quartis 25 e 75.

*O valor de p refere-se ao teste de Mann-Whitney.

Na Tabela 5 observa-se que não houve correlação entre a idade e os

níveis séricos das quimiocinas nos pacientes do Grupo Uveíte, isto é, a idade

não interferiu na concentração sérica das quimiocinas nos pacientes com

RCST ativa. Também não houve diferença entre os níveis séricos das

quimiocinas estudadas de acordo com o sexo dos pacientes avaliados (Tabela

Gráfico 1 – Representação em box-plot dos níveis séricos (pg/ml) de todas as

quimiocinas estudadas, tanto no Grupo Uveíte quanto no Grupo Controle.

Os valores de p estão descritos nos gráficos (teste de Mann-Whitney).

Obs: a linha horizontal dentro da caixa representa o percentil 50 (mediana); a

linha inferior da caixa representa o percentil 25 e a linha superior o percentil 75.

As linhas finas inferiores representam o percentil 10 e as superiores o percentil

90.

Uveíte Controle

100

200

300

CCL11 (pg/ml)

p=0,51

Uveíte Controle

100

200

300

400

CCL2 (pg/ml)

p=0,48

Uveíte Controle

1000

2000

3000

4000

CXCL9 (pg/ml)

p=0,11

Uveíte Controle

100

200

300

400

500

600

CXCL10 (pg/ml)

p=0,83

Uveíte Controle

CXCL8 (pg/ml)

p=0,017

Tabela 5 – Coeficiente de correlação de Pearson para avaliar a influência da

idade nas concentrações séricas das quimiocinas estudadas.

Quimiocina r Valor-p

CCL2

0,125 0,361

CCL11

0,219 0,108

CXCL9

0,125 0,361

CXCL10

-0,018 0,898

CXCL8

0,175 0,201

Tabela 6 – Coeficiente de correlação de Pearson para avaliar a influência do

sexo dos pacientes nas concentrações séricas das quimiocinas estudadas.

Quimiocina r Valor-p

CCL2

0,091 0,510

CCL11

0,153 0,265

CXCL9

-0,041 0,764

CXCL10

0,117 0,396

CXCL8

-0,066 0,634

Quando se comparou a dosagem sérica das quimiocinas em relação ao

tempo de evolução da RCST em atividade, observou-se que os níveis de

CCL11 foram significativamente maiores naqueles pacientes que

apresentavam um tempo de evolução da uveíte maior do que 7 dias (p=0,038).

Em relação às outras quimiocinas estudadas, o tempo decorrido do início dos

sintomas relatados pelo paciente e a primeira dosagem das quimiocinas não

interferiu de forma significativa nas concentrações séricas dessas proteínas

(Tabela 7).

Tabela 7 – Níveis séricos (pg/ml) das quimiocinas divididas de acordo com o

intervalo de tempo entre os primeiros sintomas relatados pelos pacientes do

Grupo Uveíte e a primeira coleta de sangue.

≤ 7 dias > 7 dias

Média ± EP

Mediana

(25-75%)

Média ± EP

Mediana

(25-75%)

CCL2

223,6 ± 10,7

206,8

(184,7-260,1)

246,1 ± 11,8

228,8

(193,6-280,3)

0,18

CCL11

98,7 ± 16,1

75,7

(53,2-124,1)

147,8 ± 19,5

109,3

(65,4-215,3)

0,038

CXCL9

1151,4 ± 206,5

840,6

(355,7-1829,1)

2462,9 ± 598,8

1418,8

(615,2-2294,1)

0,10

CXCL10

268,2 ± 22,4

269,1

(184,8-335,7)

291,6 ± 37,3

241,1

(171,8-334,5)

0,62

CXCL8

28,1 ± 4,1

22,5

(17,4-45,3)

29,8 ± 5,2

22,9

(18,3-32,3)

0,97

EP= erro padrão; 25-75%= quartis 25 e 75.

O valor de p refere-se ao teste de Mann-Whitney.

A vasculite retiniana esteve presente em 43,6% dos pacientes do Grupo

Uveíte. Três pacientes apresentaram 4+/4+ de opacidades vítreas, o que

impossibilitou a determinação da presença de vasculite retiniana. Por isso,

esses pacientes foram excluídos da análise estatística quando a variável

vasculite retiniana era avaliada. A presença de vasculite retiniana nos

pacientes do Grupo Uveíte correlacionou-se com maiores níveis de CXCL8

(Gráfico 2), enquanto que, nas outras quimiocinas estudadas, não interferiu de

forma significativa nos níveis séricos dessas proteínas (Tabela 8).

Gráfico 2 – Níveis séricos de CXCL8 (pg/ml) nos pacientes do Grupo Controle

e nos pacientes que apresentavam ou não vasculite retiniana no Grupo Uveíte.

* Os valores de p na comparação entre dois grupos estão indicados no gráfico

(teste de Mann-Whitney).

Grupo Controle Vasculite Sem vasculite

100

120

CXCL8 (pg/ml) - 1a. coleta

p=0,23

p=0,01

p=0,10

____________________

Grupo Uveíte

Tabela 8 – Níveis séricos (pg/ml) das quimiocinas nos pacientes que

apresentavam ou não vasculite retiniana associada ao quadro de RCST ativa

(Grupo Uveíte) e no Grupo Controle.

Controle Com Vasculite

Sem Vasculite

Média ± EP

Mediana

(25-75%)

Média ± EP

Mediana

(25-75%)

Média ± EP

Mediana

(25-75%)

CCL2

234,2 ± 13,9

223,9

(179,5-266,8)

223,7 ± 13,4

207,7

(184,7-248,5)

246,0 ± 10,0

256,7

(200,6-274,8)

0,15

CCL11

111,9 ± 15,7

89,7

(49,2-143,4)

107,2 ± 21,6

87,3

(41,3-122,4)

141,2 ± 16,6

109,3

(63,2-215,4)

0,15

CXCL9

2212,0 ±

1139,7

915,0

(22,1-1800,4)

2197,9 ±

689,5

1355,7

(386,4-

2288,8)

1652,7 ±

349,9

1231,7

(533,5-

2021,4)

0,28

CXCL10

274,1 ± 29,7

263,1

(167,8-303,6)

289,5 ± 31,3

280,3

(214,8-302,5)

275,1 ± 33,4

211,9

(146,0-344,3)

0,62

CXCL8

16,0 ± 2,3

19,5

(0,0-27,2)

35,1 ± 6,5

23,6

(19,1-51,9)

24,4 ± 3,2

22,5

(16,8-31,3)

0,03

EP= erro padrão; 25-75%= quartis 25 e 75.

O valor de p refere-se ao teste de Kruskall-Wallis

A atividade inflamatória intra-ocular nos pacientes do Grupo Uveíte foi

classificada de acordo com a intensidade das opacidades vítreas. Após

classificação inicial, apenas 3 pacientes apresentaram 4+ de opacidades

vítreas. Estes pacientes foram agrupados juntamente com aqueles que

apresentavam 3+. Desta forma, foi realizada a análise estatística, que não

evidenciou nenhuma relação estatisticamente significativa entre a intensidade

das opacidades vítreas e os níveis séricos das quimiocinas estudadas (Tabela

9).

Tabela 9 – Níveis séricos (pg/ml) das quimiocinas de acordo com a intensidade

das opacidades vítreas no Grupo Uveíte.

Opacidade

vítrea

0 1+ 2+ 3+ e 4+

Média ± EP

(mediana)

Média ± EP

(mediana)

Média ± EP

(mediana)

Média ± EP

(mediana)

CCL2

224,1 ± 28,8

(199,6)

246,9 ± 14,7

(234,1)

224,3 ± 11,9

(211,3)

238,5 ± 14,5

(239,9)

0,69

CCL11

100,5 ± 30,6

(97,1)

134,4 ± 23,2

(95,3)

128,2 ± 25,3

(96,1)

123,3 ± 29,0

(92,8)

0,89

CXCL9

980,7 ± 291,9

(1343,9)

2266,4 ± 516,9

(1397,1)

2384,2 ± 1007,3

(1542,3)

922,9 ± 265,1

(758,7)

0,30

CXCL10

252,9 ± 31,5

(290,1)

333,6 ± 47,1

(275,4)

275,2 ± 30,9

(265,6)

190,6 ± 26,7

(173,5)

0,13

CXCL8

28,5 ± 6,3

(22,9)

27,1 ± 4,8

(20,6)

32,4 ± 9,7

(21,7)

29,0 ± 3,8

(23,8)

0,56

EP= erro padrão;

Valor de p referente ao teste de Kruskall-Wallis.

O tamanho da maior lesão em atividade foi medida em áreas

correspondentes ao diâmetro do disco óptico. Os níveis de CXCL8 foram

significativamente maiores nas lesões >2 DD quando comparadas às lesões

menores que 1 DD (p=0,012) (Gráfico 3). Os níveis de CXCL9 também foram

maiores nos pacientes com lesões entre 1-2 DD quando comparados aos

pacientes com lesões menores do que 1DD (p<0,01) (Gráfico 4). Os níveis das

outras quimiocinas estudadas não se correlacionaram com o tamanho das

lesões de retinocoroidite em atividade (CCL2, p=0,23; CCL11, p=0,16;

CXCL10, p=0,11) valor de p referente ao teste de Kruskall-Wallis].

Gráfico 3 – Representação em box-plot dos níveis séricos (pg/ml) de CXCL8 de

acordo com o tamanho da lesão de RCST em atividade.

O valor de p=0,04 para o gráfico (teste de Kruskal-Wallis). Na análise entre dois

grupos foi realizado o teste de Mann-Whitney e o valor de p está descrito no gráfico.

Gráfico 4 – Representação em box-plot dos níveis séricos (pg/ml) de CXCL9 de

acordo com o tamanho da lesão de RCST em atividade.

O valor de p=0,02 para o gráfico (teste de Kruskal-Wallis). Na análise entre dois

grupos foi realizado o teste de Mann-Whitney e o valor de p está descrito no gráfico.

<1 DD 1-2 DD >2 DD

Tamanho da lesão em atividade

100

120

CXCL8 (pg/ml)

012

328

113

<1 DD 1-2 DD > 2 DD

Tamanho da lesão em atividade

2500

5000

7500

10000

CXCL9 (pg/ml)

p=0,55

p=0,20

p<0,01

51% das lesões de RCST foram localizadas na Zona 2; 34,5% na Zona1

e o restante (14,5%) na Zona3. Não houve relação entre a localização da lesão

de RCST ativa e os níveis séricos de todas as quimiocinas estudadas (Tabela

10).

Tabela 10 – Média dos níveis séricos (pg/ml) das quimiocinas divididos de

acordo com a localização da lesão de RCST em atividade.

Local

(zona)

1 2 3

Média ± EP

Mediana

(25-75%)

Média ± EP

Mediana

(25-75%)

Média ± EP

Mediana

(25-75%)

CCL2

233,2 ± 16,4

204,2

(183,1-289,0)

238,1 ± 11,1

222,4

(202,9-264,0)

237,3 ± 15,8

255,1

(189,6-268,9)

0,71

CCL11

115,1 ± 24,2

77,5

(33,0-140,1)

139,7 ± 19,6

104,9

(67,5-205,4)

106,5 ± 21,6

91,4

(56,2-166,7)

0,33

CXCL9

1747,8 ± 455,6

1343,9

(329,6-2272,8)

2188,8 ± 625,3

1293,7

(564,1-2143,3)

1185,9 ±

349,7

916,2

(431,7-2029,6)

0,82

CXCL10

316,9 ± 34,0

295,0

(197,7-344,4)

266,6 ± 38,0

224,3

(133,9-285,8)

248,5 ± 31,8

254,4

(177,5-328,3)

0,09

CXCL8

25,3 ± 4,3

22,5

(8,5-39,3)

31,1 ± 5,6

22,5

(19,5-36,8)

30,7 ± 8,3

23,4

(20,6-50,7)

0,73

EP= erro padrão; 25-75%= quartis 25 e 75.

Valor de p referente ao teste de Kruskall-Wallis.

Após a resolução do processo inflamatório intra-ocular, nova coleta de

sangue para análise das quimiocinas foi realizada em 18 (32,7%) pacientes. As

causas para a não realização do procedimento foram várias, entre elas: não

comparecimento do paciente na data marcada; paciente não gostaria mais de

colaborar com o estudo; acreditava que não teria mais benefícios com o

estudo. A quimiocina CXCL8, que apresentou níveis elevados antes do

tratamento quando comparada ao Grupo Controle, sofreu uma redução

estatisticamente significativa após o tratamento (p=0,02) (Gráfico 5). Esta

diferença não sofreu influência pela presença ou não de vasculite retiniana

(p=0,55).

Gráfico 5 – Níveis séricos da quimiocina CXCL8 de 18 pacientes com RCST

(Grupo Uveíte) antes e após o tratamento.

* p=0,002; teste de Wilcoxon.

Após o término do tratamento, quando a lesão de RCST era considerada

cicatrizada, a média da acuidade visual mensurada foi de 0,78 ± 0,76 LogMAR,

o que representou uma melhora estatisticamente significativa quando

comparada à acuidade visual mensurada no pré-tratamento (1,07 ± 0,92

LogMAR) (p<0,001).

Antes do tratamento Após o tratamento

CXCL8 (pg/ml)

002

6 – DISCUSSÃO

______________________________________________________________________

De acordo com a revisão da literatura científica, este foi o primeiro

estudo a correlacionar os níveis séricos das quimiocinas CCL2, CCL11,

CXCL8, CXCL9 e CXCL10 com os achados oftalmológicos em pacientes com

RCST.

As manifestações da toxoplasmose ocular podem variar amplamente

entre os indivíduos, sendo que o diagnóstico de certeza só poderia ser

realizado pelo isolamento do T. gondii nos tecidos oculares ou através da

técnica de PCR para identificação de antígenos do parasita. Portanto, o

diagnóstico de toxoplasmose ocular é presumível (LYNCH et al., 2004, ASSIS

et al., 1997).

Com exceção da reação inflamatória transitória que pode ocorrer na

ocasião da infecção pelo T. gondii (HOLLAND et al., 1999), a inflamação intra-

ocular não ocorre sem a presença de lesão ocular. O tipo de lesão ocular

descrita como típica da toxoplasmose é aquela que consiste de uma

retinocoroidite focal necrosante com lesão antiga cicatrizada (HOLLAND,

2004). Esse tipo de lesão característica associada à sorologia positiva para

toxoplasmose e ausência de outras doenças detectadas ao exame clínico ou

laboratorial, foi o critério utilizado no diagnóstico de toxoplasmose ocular no

presente estudo, denominando os casos como retinocoroidite supostamente

toxoplásmica (RCST), para que pudéssemos minimizar a possibilidade de erro

diagnóstico.

A análise da população envolvida no estudo mostra que não houve

diferença estatística entre o percentual de pacientes do sexo masculino e

feminino. Esse dado é importante para que possamos afastar qualquer

interferência possível na concentração sérica das quimiocinas estudadas, já

que esse dado é controverso na literatura científica. Alguns estudos

encontraram uma influência do sexo e da idade nos níveis séricos das

quimiocinas estudadas (TARGOWSKY et al., 2005), enquanto outros não

observaram esta correlação (ARAKELYAN et al., 2005). Além de os pacientes

terem sido semelhantes quanto à distribuição de gêneros, a utilização de teste

de correlação nos nossos dados evidenciou que a idade e o sexo não

interferiram na concentração sérica das quimiocinas estudadas.

Alguns estudos observaram a importância da idade no curso clínico da

RCST. São pacientes entre a segunda e quarta décadas de vida que

constituem a grande parte dos episódios de RCST (HOLLAND, 2004). Estudo

de FRIEDMANN & KNOX (1969) relata que os episódios iniciais de RCST eram

observados nos pacientes com idade média de 25,3 anos (mediana no grupo

entre 20 e 24 anos; moda no grupo entre 10 e 14 anos). GILBERT et al. (1999)

encontraram uma média de idade de 26,5 anos no primeiro episódio de RCST

sintomática entre uma série de pacientes estudada na Inglaterra. Em um

estudo mais recente, observou-se que a média de idade dos pacientes no

primeiro episódio de RCST foi de 29,5 anos (mediana de 26 anos, com

variação entre 5-89 anos) (BOSCH-DRIESSEN et al., 2002). Diferenças na

metodologia dos trabalhos dificultam uma comparação direta entre esses

resultados, mas os dados sugerem que há uma relação entre os episódios de

doença ativa ocular e uma idade mais jovem dos pacientes. Alguns estudos

também observaram que a idade estava relacionada a uma maior gravidade da

RCST, sugerindo que, nos pacientes mais idosos, a doença seria mais grave

(FRIEDMANN & KNOX, 1969; JOHNSON et al., 1997; LABALETTE et al.,

2002). No presente estudo, esse tipo de correlação fica difícil de ser

estabelecida devido ao fato que pacientes abaixo de 18 anos não foram

incluídos nos grupos investigados.

Para as medidas das quimiocinas foi utilizado o ensaio imunoenzimático

ELISA. Esse método é considerado a técnica padrão-ouro para esse tipo de

análise (CURNOW & MURRAY, 2006). A técnica de ELISA necessita cerca de

50-100 µl de fluido tecidual para cada molécula estudada. Esta é uma limitação

da técnica, principalmente quando se quer avaliar grande número de proteínas

e a quantidade de amostras é restrita. Esse foi um dos motivos para

estudarmos as quimiocinas no soro dos pacientes, além de o humor aquoso

não ser analisado de forma rotineira nos pacientes com uveítes.

Vários estudos avaliaram os níveis das quimiocinas e seus receptores

nas doenças oculares, incluindo as uveítes (revisado por WALLACE et al.,

2004). No nosso estudo, observamos um aumento dos níveis de CXCL8 nos

pacientes do Grupo Uveíte quando comparados ao Grupo Controle. Algumas

quimiocinas da família CXC, da qual a CXCL8 é considerada o protótipo,

atraem leucócitos polimorfonucleares para os sítios de inflamação aguda.

CXCL8 também ativa monócitos e pode direcionar o recrutamento destas

células para os locais de lesão tecidual (CHARO & RANSOHOFF, 2006).

Mediadores da inflamação, entre eles, a IL-1 e o TNF-α, que estão elevados na

fase inicial da infecção pelo T. gondii (GAZZINELLI et al., 1993b, 1994;

PELOUX et al., 1996), são estímulos para a produção de CXCL8 (CHARO &

RANSOHOFF, 2006).

Níveis elevados de CXCL8 foram encontrados no soro de pacientes com

manifestações sistêmicas da doença de Behçet (WANG et al., 1997; MANTAS

et al., 2000), especialmente naqueles com manifestações orais e neurológicas

(ZOUBOULIS et al., 2000). Os estudos na doença de Behçet não abordam de

forma específica a presença de uveíte e a sua relação com os níveis das

quimiocinas estudadas. Na uveíte anterior idiopática, níveis elevados de

CXCL8 foram observados tanto no humor aquoso de pacientes com uveíte em

atividade (VERMA et al., 1997), quanto no soro (KLOK et al., 1998). Um estudo

envolvendo pacientes com uveítes de diversas etiologias observou que os

níveis de CXCL8 no humor aquoso foram mais elevados nos pacientes com

doença de Behçet, do que naqueles com diagnóstico de síndrome de Vogt-

Koyanagi-Harada, apesar de a diferença não ser estatisticamente significativa

(EL-ASRAR et al., 2004). Na uveíte intermediária, também foi observada uma

correlação positiva entre níveis elevados de CXCL8 e a presença de exsudatos

vítreos e periflebite (KLOK et al., 1998).

Recente estudo de CURNOW et al. (2005) avaliou o perfil das

quimiocinas e citocinas no humor aquoso de 37 pacientes com uveítes de

diversas etiologias, incluindo as herpéticas, doença de Behçet e de origem

idiopáticas. Eles utilizaram o ensaio imunoenzimático de múltiplos pontos (ou o

multiplex-bead-based imunoassay), que permite a identificação de uma grande

quantidade de peptídeos ou proteínas em pequenos volumes de amostras.

Nesse estudo, foram observados altos níveis de CXCL8 e CCL2 no pacientes

com uveíte, quando comparado aos indivíduos assintomáticos. Os níveis

dessas quimiocinas correlacionaram-se entre elas e com os níveis das

citocinas IL-6 e IFN-γ. Além disso, as concentrações de CXCL8 foram

proporcionais ao número de neutrófilos presentes no humor aquoso. Esse

achado é concordante com o papel da CXCL8 como uma quimiocina envolvida

no recrutamento de neutrófilos para os sítios de inflamação aguda. A

observação de níveis elevados de CXCL8 nas uveítes, que também foram

detectados no soro dos pacientes com RCST aguda do nosso estudo, abre um

amplo campo de pesquisa para a determinação do papel dessas quimiocinas

nas uveítes. Trabalhos em uveíte experimental auto-imune (UEA) mostraram

que, em camundongos tratados com anticorpos anti-CXCL8 ou deficientes

(knock-out) nos receptores para essa quimiocina, o número de células que

infiltram os tecidos oculares é significativamente reduzido. Portanto, o bloqueio

da ação da CXCL8 pode prevenir a entrada de células inflamatórias nos tecidos

oculares através das barreiras hemato-oculares (BECKER et al., 2000; VERMA

et al., 1999).

Em relação à toxoplasmose, estudos experimentais mostram que

CXCL8 acumula-se nos sítios de infecção pelo parasita (NAVIA et al., 1986).

Trabalho de DENNEY et al. (1999) observou ainda que a secreção de CXCL8 é

dependente da invasão de taquizóitos e da subseqüente lise celular das células

infectadas.

Alguns trabalhos realçam a importância, nas doenças oculares, das

outras quimiocinas avaliadas (CCL2, CCL11, CXCL9 e CXCL10) e que não

apresentaram diferenças quando comparadas ao Grupo Controle. Por exemplo,

estudos em UEA mostram elevação dos níveis de CCL2 e CXCL10 nos tecidos

retinianos durante o pico do processo inflamatório (CRANE et al., 2001, KEINO

et al., 2003). Estudos em humanos também observaram níveis

significativamente elevados de CXCL10 nos pacientes com uveíte ativa,

quando comparados com os pacientes com uveíte inativa (VERMA et al.,

1997). Essa quimiocina está envolvida no recrutamento de células do tipo Th1

(TAKEUSHI et al., 2006) e, consequentemente, na etiopatogênese de doenças

auto-imunes Th1 dependentes (MURDOCH & FINN, 2000). CXCL9, que é uma

quimiocina estrutural e funcionalmente homóloga à CXCL10, está envolvida no

recrutamento de linfócitos Th1 (TAKEUSHI et al., 2006). Importante papel na

etiopatogênese de doenças inflamatórias auto-imunes também tem sido

atribuído à CXCL9 (MURDOCH & FINN, 2000; TEIXEIRA et al., 2004). Nesse

sentido, altas concentrações de CXCL9 foram encontradas em pacientes com

sarcoidose ocular e os níveis tiveram correlação com a atividade da doença

(TAKEUSCHI et al., 2006).

O trabalho de FEROM et al. (2003) mostrou que a maioria das células

inflamatórias nos tecidos oculares durante a toxoplasmose ocular produz um

perfil de citocinas do tipo Th2. Dessa forma, não deveríamos esperar altos

níveis de CXCL9 e CXCL10 nos pacientes com RCST ativa, o que está em

concordância com os achados do nosso estudo.

Uma correlação entre a atividade da doença e os níveis séricos de CCL2

tem sido demonstrada em pacientes com diagnóstico de vasculite retiniana

idiopática (WALLACE et al., 2003). Altos níveis de CCL2 foram observados no

humor aquoso de pacientes com uveítes de diversas etiologias (CURNOW et

al., 2005). No nosso estudo, não foram detectadas diferenças nas

concentrações séricas dessa quimiocina entre os grupos estudados. A síntese

da quimiocina CCL2 é amplamente influenciada por polimorfismos dos genes

que a codificam (WEGSCHEIDER et al., 2005). Pacientes homozigotos ou

heterozigotos para o alelo 2518G apresentaram uma maior produção celular de

CCL2 do que indivíduos que apresentaram o genótipo 2518A (ROVIN et al.,

1999). Uma diferença entre esses genótipos tem sido implicada como um fator

de gravidade em várias doenças, como a doença de Crohn, vasculite cutânea e

lúpus eritematoso sistêmico (HERFARTH et al., 2003; AGUILAR et al., 2001;

YE et al., 2005). Essa variação genotípica poderia explicar as diferenças

encontradas entre nosso estudo, envolvendo pacientes com RCST, e os da

literatura.

CCL11 tem sido implicada na etiopatogênese de doenças crônicas

oculares, como na ceratoconjuntivite vernal e atópica (LEONARDI et al., 2003).

Altos níveis de CCL11 são encontrados em infecções parasitárias por

helmintos, mediando uma resposta predominantemente do tipo Th2 (FALCÃO

et al., 2002). Na mieolopatia associada ao vírus linfotrófico T humano tipo 1

(HTLV-1), que é uma doença com resposta imune predominantemente do tipo

Th1, observou-se até uma redução significativa dos níveis de CCL11

(GUERREIRO et al., 2006). Nenhum estudo prévio avaliou os níveis séricos da

CCL11 nas uveítes. Como a principal função dessa quimiocina é o

recrutamento de eosinófilos, uma célula que não exerce um importante papel

na resposta imune face à infecção pelo T. gondii, a observação de que não

houve alteração dos níveis séricos dessa quimiocina nos nossos pacientes com

RCST aguda poderia ser esperada.

A gravidade da RCST parece ser influenciada por uma combinação de

diversos fatores; muitas vezes, sem nenhuma correlação entre eles. Isso tem

dificultado retirar conclusões a respeito na literatura médica devido ao fato de

muitos estudos serem realizados de forma não-controlada e a gravidade da

doença não ser definida de forma consistente e de maneira quantitativa

(HOLLAND, 2004). A avaliação da gravidade da doença é feita de forma

heterogênea pelos diversos trabalhos, sendo que, alguns autores a avaliam

pela presença de complicações, outros pela piora da acuidade visual, pelo

tamanho da lesão em atividade ou cicatrizada, pela intensidade da reação

inflamatória na câmara anterior ou no corpo vítreo, pelo envolvimento da retina

macular ou periférica, pelo número de recorrências (HOLLAND, 2003, 2004;

VALLOCHI et al., 2005). No nosso trabalho avaliamos a intensidade do

processo inflamatório pela presença de vasculite retiniana secundária, pela

intensidade das opacidades vítreas e pelo tamanho da lesão de retinocoroidite

em atividade.

A vasculite retiniana foi uma característica freqüentemente observada

nos pacientes do Grupo Uveíte (43,6%). Embora o diagnóstico de vasculite

retiniana possa ocorrer de forma isolada, o diagnóstico é geralmente associado

a outras doenças sistêmicas ou infecciosas, entre elas a toxoplasmose

(HUGUES & DICK, 2003). A observação da retina através da oftalmoscopia é

suficiente para o diagnóstico de vasculite retiniana (WALLACE et al. 2003;

HUGUES & DICK, 2003), apesar de, a angiografia fluoresceínica ser um

excelente método diagnóstico para os casos mais sutis.

No nosso estudo, a presença de vasculite retiniana mostrou correlação

com os níveis elevados da CXCL8 nos pacientes com RCST ativa.

Interessantemente, níveis séricos elevados de CXCL8 têm sido observados em

várias doenças sistêmicas em que a vasculite é o principal mecanismo

etiopatogênico, como na doença de Behçet, poliarterite nodosa e colite

ulcerativa (HACK et al., 1992; YOKOYAMA et al., 1995; MAHIDA et al., 1992,

FREIRE et al., 2004).

CXCL8 é considerada como um fator angiogênico e possui uma

expressividade elevada nas células endoteliais vasculares durante os

processos inflamatórios (WALLACE et al., 2004). Este fato poderia explicar a

elevação dos níveis de CXCL8 observada nos nossos pacientes e a sua

correlação com a presença de vasculite retiniana. Na retinopatia diabética

proliferativa, que é uma doença caracterizada pela perda dos pericitos da

microvasculatura retiniana e de células endoteliais, observam-se níveis

elevados de CXCL8 no corpo vítreo, quando comparado a indivíduos com

buraco macular idiopático ou em olhos de cadáver (ELNER et al., 1995;

AKSUNGER et al., 1999). Um estudo sobre quimiocinas nas vasculites

retinianas idiopáticas observou correlação entre as concentrações séricas de

CCL2 e a atividade da doença, apesar de não ter ocorrido diferença

estatisticamente significativa entre os níveis dessa quimiocina quando

comparada ao grupo controle (WALLACE et al., 2003). Nossos dados também

não detectaram concentrações séricas estatisticamente diferentes de CCL2

quando comparado o Grupo Uveíte com o Grupo Controle, além da falta de

correlação entre a presença de vasculite retiniana e níveis elevados de CCL2.

A intensidade das opacidades vítreas não teve correlação com os níveis

séricos das diversas quimiocinas estudadas. Nenhum trabalho na literatura

realizara essa correlação previamente, o que nos impede de compararmos os

resultados obtidos. Entretanto, na análise entre o tamanho das lesões de RCST

em atividade, observamos que as lesões maiores que 2 DD apresentaram

níveis elevados de CXCL8 quando comparadas às lesões < 1DD. Da mesma

forma, os níveis de CXCL9 foram maiores nas lesões entre 1-2 DD. Com o

aumento das lesões, maior quantidade de EPR é envolvida no quadro

inflamatório ocular. As células do EPR têm mostrado, in vitro, uma produção de

várias quimiocinas, incluindo CXCL8, CCL2 e CCL5, em resposta a algumas

citocinas pró-inflamatórias como o TNF-α e o IFN-γ (CRANE et al., 1998;

WALLACE et al., 2004). Um possível papel para as quimiocinas produzidas

pelo EPR foi sugerido por recente estudo envolvendo cultura de células

humanas do EPR. Como 80% da secreção de CXCL8 e CCL2 foi direcionada

para a superfície basal ao invés da apical dessas células, isto é, em direção

aos vasos sanguíneos da coróide, é possível que as quimiocinas produzidas

pelo EPR atuem retendo os leucócitos na coriocapilar (HOLTKAMP et al.,

1999). Portanto, as quimiocinas poderiam exercer um mecanismo protetor, que

iria inibir a entrada de células inflamatórias no tecido retiniano e,

conseqüentemente, atenuando ou impedindo o dano tecidual ocular

(WALLACE et al., 2004).

Alguns trabalhos relacionam o tamanho das lesões de RCST com uma

maior chance de complicações. FRIEDMANN & KNOX (1969) mostraram que

lesões agudas maiores que 1 DD persistem por um período maior e possuem

um risco maior de complicações (como descolamento de retina, catarata,

edema macular cistóide e glaucoma) e uma maior perda de acuidade visual do

que lesões menores. ROTHOVA et al. (1993) também relataram uma relação

positiva significativa entre o tamanho da lesão retiniana e a duração da doença

ocular ativa.

No nosso trabalho, a localização da lesão de retinocoroidite em atividade

não interferiu nas concentrações das quimiocinas séricas estudadas.

Avaliações semelhantes não são encontradas na literatura para que

pudéssemos comparar os resultados. Há na literatura alguns dados que

sugerem que a localização das lesões na retina não ocorre ao acaso (METS et

al., 1996; BOSCH-DRIESSEN et al., 2002; HOGAN et al., 1964; FRIEDMANN

& KNOX, 1969). METS et al. (1996) mostraram que 52 (58%) crianças recém-

nascidas com toxoplasmose ocular congênita apresentavam lesão macular; um

número que foi substancialmente maior do que poderia se esperar se as lesões

fossem distribuídas aleatoriamente, considerando o fato que a mácula

anatômica compreende apenas cerca de 5% de toda a retina.

Após a resolução do processo inflamatório agudo intra-ocular, novas

coletas de sangue foram propostas para comparação dos níveis das

quimiocinas séricas. Apenas 18 pacientes concordaram e/ou compareceram

para essa nova coleta. Mesmo considerando a diminuição do número de

pacientes, pôde-se observar uma redução dos níveis séricos da CXCL8 após o

tratamento, quando comparado aos níveis séricos da primeira coleta.

Interessantemente, a produção de CXCL8 pelas células do EPR humano é

inibida, in vitro, pela dexametasona (KURTZ et al., 1997). Tanto a resolução do

processo inflamatório, como o uso de corticosteróide e antibiótico poderia

explicar essa queda dos níveis séricos da CXCL8 observada na segunda

coleta. Consistentemente com nossa observação, vários trabalhos na literatura

evidenciaram normalização dos níveis de quimiocinas com o tratamento

específico de doenças de natureza inflamatória. Por exemplo, ALESSANDRI et

al. (2006) relataram que os níveis séricos elevados de CXCL8 e CXCL9 que

foram observados nos pacientes com tuberculose pulmonar retornaram aos

níveis normais após o tratamento específico da doença.

O nosso trabalho evidenciou uma melhora significativa da acuidade

visual logo após o término do tratamento. Esse dado foi observado sem

considerar o tamanho e a localização da lesão, muito menos a intensidade das

opacidades vítreas. Não foi o objetivo deste trabalho avaliar as complicações

da RCST, já que grande parte delas ocorre tardiamente. Ressalta-se que várias

complicações têm sido descritas, incluindo descolamento de retina

regmatogênico (BOSCH-DRIESSEN et al., 2000), neovascularização sub-

retiniana, oclusões vasculares retinianas (GENTILE et al., 1997), membrana

epirretiniana, edema macular (SCHLAEGEL & WEBER, 1984), catarata e

outros (HOLLAND, 2004). Descolamento de retina regmatogênico tem sido

relacionado à gravidade do quadro inflamatório (BOSCH-DRIESSEN et al.,

2000).

Os achados desse estudo reforçam o papel da CXCL8 nas uveítes e,

pela primeira vez, nas de origem toxoplásmica. Como essa quimiocina declina

após o tratamento efetivo da infecção, poderia eventualmente ser usada como

um marcador de atividade da doença, apesar de não ser específica para a

toxoplasmose ocular. Além disso, abrem-se novas perspectivas no tratamento

das uveítes através do bloqueio da ação das quimiocinas ou dos seus

receptores.

7 – CONCLUSÕES

______________________________________________________________________

1 – Os níveis séricos de CXCL8 estavam estatisticamente aumentados nos

pacientes do Grupo Uveíte em comparação ao Grupo Controle. Os níveis

séricos das quimiocinas CCL2, CCL11, CXCL9 e CXCL10 não foram diferentes

entre os dois Grupos.

2 – Após a cicatrização da lesão de retinocoroidite e o término do tratamento,

houve uma redução estatística dos níveis séricos de CXCL8 quando

comparado ao período pré-tratamento.

3a – A presença de vasculite retiniana correlacionou-se estatisticamente com

altos níveis séricos de CXCL8.

3b – Não houve correlação estatisticamente significativa entre a intensidade

das opacidades vítreas e os níveis séricos das quimiocinas CCL2, CCL11,

CXCL8, CXCL9, CXCL10.

3c – Os pacientes com lesões de RCST maiores do que 2 DD apresentaram

altos níveis séricos de CXCL8 quando comparados aos pacientes com lesões

menores do que 1 DD. Houve, também, uma correlação positiva entre o

tamanho da lesão de RCST em atividade e os níveis séricos de CXCL9.

8 – REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS

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9 – ANEXOS

______________________________________________________________________

117

9.1 – Parecer do COEP referente ao Projeto.

118

9.2 – Tabelas com os dados dos pacientes envolvidos no

estudo.

GRUPO CONTROLE

Sexo Idade

Ac.

Visual

CCL2 CCL11 CXCL9 CXCL10 CXCL8

1 F 21 0 253,6 70,36 3111 324,6 22,41

2 F 48 0,3 197,1 106,1 10 290,1 0

3 F 34 0,8 151,5 27,66 10 275,4 0

4 M 32 0,3 243 38,31 195,4 299,9 0

5 F 32 2 328,2 109,7 2268 319,7 19,1

6 M 32 1 179,6 84,63 2564 304,9 13,3

7 M 31 0 334,6 195,4 451,9 165,4 0

8 M 32 0 179,6 24,11 1633 275,4 20

9 F 27 2 321 152,7 1005 535,2 27,3

10 M 26 1 250,1 84,63 1584 339,4 11,18

11 F 33 0,8 200,7 63,23 3161 285,2 13,98

12 F 28 0 198,9 36,54 10 246 0

13 F 32 0 163,8 8,144 220 255,8 0

14 F 33 0,1 174,3 41,87 10 270,5 9,1

15 F 42 0,1 280,3 21,69 1129 217,2 0

16 M 28 3 179,6 48,98 10 299,9 32,29

17 F 36 0 163,8 8,144 601,6 241,2 25,22

18 M 31 0 266,8 107,1 1856 210,7 36

19 M 23 0 192,9 63,23 431,6 139,6 27,3

20 F 20 0 270,2 50,1 861,6 188,1 30,2

21 M 32 0 568,1 580,9 5472 1011 58,6

22 F 37 0 221,4 149 46085 279,3 0

23 F 37 0 255 315,7 1295 494,4 28,4

24 M 31 0 192,9 30,43 10 162,2 23,1

25 M 18 0 157,1 139,8 10 5 0

26 M 21 0 270,2 65,43 2483 371,2 26,7

27 M 45 0,3 226,5 78,58 1088 175,1 29,6

28 M 20 0 80,82 175 10 5 0

29 F 19 0 118,9 210,2 10 5 0

30 F 28 3 246,6 82,97 946,3 162,2 26,9

31 M 25 0,3 194,6 138 883,8 181,6 27,3

32 M 27 1 266,8 177,7 1399 249,8 40,9

33 M 18 0 253,2 179,8 22,1 5 0

34 F 18 0 237,2 129,8 380,1 621,9 0

35 F 40 0,1 233,2 107,1 1942 165,4 22,1

36 F 20 0 187,9 82,97 2107 197,8 21

37 M 19 0 488 129,8 852,8 682,7 0

38 F 27 0,7 206,3 144,6 1026 275,9 24,6

39 F 29 0 271,9 120,3 1316 146,1 22,5

40 F 18 0 160,3 94,82 22,1 283 0

M= Masculino; F= Feminino;

Ac. Visual = acuidade visual em LogMar;

Concentrações das quimiocinas em pg/ml.

119

GRUPO UVEÍTE – DADOS DO 1

EXAME

Sexo Idade Tempo Olho

Ac.

Visual

(Inicial)

Opac.

Vítreo

Tamanho

(DD)

Local

(Zona)

Vasc. CCL2 CCL11 CXCL9 CXCL10 CXCL8

1 M 33 >7 dias OD 1 2+ 1-2 2 Sim 221,8 86,42 2051 287,7 146,3

2 F 34 ≤7 dias OD 0,8 1+ 1-2 2 Não 169 24,11 3111 280,3 0

3 F 38 ≤7 dias OE 0,5 1+ 1-2 2 Sim 264,2 95,35 2170 275,4 64,7

4 F 28 >7 dias OD 2 2+ 1-2 2 Não 193,6 57,88 1542 202,2 0

5 M 22 >7 dias OD 0,1 1+ 1-2 2 Sim 234,2 122,2 2294 275,4 5

6 M 28 >7 dias OD 2 0 1-2 1 Sim 190,1 97,15 1419 290,2 8,5

7 M 26 >7 dias OD 0,2 1+ < 1 3 Sim 177,8 75,71 1053 285,2 0

8 M 25 >7 dias OD 0,48 2+ > 2 2 Sim 207,7 223,1 16008 265,6 40,7

9 M 42 >7 dias OE 2 1+ > 2 2 Sim 228,9 88,21 10 211,9 53,4

10 M 27 >7 dias OD 3 4+ 1-2 3 Não 296,1 210,4 1487 334,5 59,08

11 F 18 ≤7 dias OD 2 2+ < 1 1 Sim 155 27,66 10 586,3 5

12 F 33 >7 dias OE 2 2+ < 1 2 Não 190,1 138,4 101 241,1 0

13 F 18 ≤7 dias OE 0,1 1+ < 1 1 Não 200,7 77,49 1053 260,7 0

14 F 23 ≤7 dias OE 0 2+ < 1 2 Não 218,3 73,92 10 211,9 50,6

15 F 62 >7 dias OD 0,6 3+ > 2 1 Sim 310,4 312,3 2912 334,5 39,3

16 M 25 ≤7 dias OD 0,5 0 1-2 1 Não 204,2 127,6 1876 344,4 16,8

17 M 23 ≤7 dias OD 0,8 0 < 1 1 Sim 146,2 24,11 195,4 304,9 54,8

18 F 22 >7 dias OD 0,48 1+ 1-2 2 Não 274,9 131,2 9437 494,7 32,3

19 M 25 >7 dias OE 0,1 1+ < 1 2 Não 162 63,25 361,2 954 8,4

20 F 19 ≤7 dias OE 0 2+ < 1 1 Não 205,9 56,1 647 384,1 4,3

21 F 22 >7 dias OD 2 2+ > 2 1 Sim 169 6,372 3161 339,4 8,4

22 F 33 >7 dias OE 2 1+ > 2 1 Não 289 297,7 6527 747,2 63,8

23 F 19 ≤7 dias OE 0,3 1+ > 2 1 Sim 207,7 32,98 434 295 56,38

24 M 24 ≤7 dias OD 0 2+ > 2 3 Não 250,1 56,1 2961 309,8 73,3

25 F 19 ≤7 dias OE 3 0 1-2 1 Sim 183,1 24,11 53,81 295 47,7

26 M 32 ≤7 dias OD 1 2+ 1-2 2 Não 270,2 175,5 2021 367,9 38,3

27 F 25 ≤7 dias OE 0,1 0 < 1 1 Sim 199,6 61,04 1688 262,8 27,5

28 F 28 >7 dias OE 0,3 3+ > 2 2 Não 260,1 215,4 1273 171,9 32,1

29 F 31 >7 dias OE 0,5 0 < 1 1 Não 375,4 109,3 288,9 146,1 22,9

30 M 47 >7 dias OE 2 1+ 1-2 1 Sim 189,6 47,91 6944 334,9 23,2

31 M 35 >7 dias OE 2 2+ < 1 2 Sim 211,3 122,5 678,4 101,1 21,7

32 M 18 ≤7 dias OD 0 1+ < 1 2 Não 204,6 85,16 3397 130 20,2

33 F 33 >7 dias OD 2 4+ > 2 2 Não 196,3 109,3 902,2 123,5 19,6

34 M 21 >7 dias OD 0,7 1+ > 2 2 Não 280,3 217,6 1626 113,9 20

35 F 18 ≤7 dias OD 0,7 1+ 1-2 1 Não 378,8 335,9 1439 407,6 16,8

36 M 29 >7 dias OD 2 3+ > 2 3 Sim 265,2 107,1 370,6 175,1 25,7

37 F 27 ≤7 dias OE 0,4 1+ 1-2 2 Não 300,6 224,3

533,5

188 22,5

Continua na

próxima página.

120

Sexo Idade Tempo Olho

Ac.

Visual

(Inicial)

Opac.

Vítreo

Tamanho

(DD)

Local

(Zona)

Vasc. CCL2 CCL11 CXCL9 CXCL10 CXCL8

38 M 34 >7 dias OE 2 3+ > 2 2 Sim 211,3 39,16 65,71 117,1 21,5

39 M 25 >7 dias OE 2 2+ > 2 3 Não 270,2 184,3 2210 107,5 20,6

40 M 37 >7 dias OD 2 2+ < 1 2 Não 334,5 242,1 2063 295,5 18,3

41 F 19 ≤7 dias OE 2 0 1-2 1 Não 270,2 260,1 1344 126,7 21,3

42 F 24 ≤7 dias OE 2 3+ < 1 2 Não 223,1 52,29 902,2 146,1 22,5

43 M 23 >7 dias OD 0,5 1+ 1-2 1 Sim 321 140,2 2273 197,8 19,1

44 M 24 >7 dias OE 2 2+ < 1 2 Não 263,5 96,14 1067 236,7 27,8

45 F 18 ≤7 dias OD 2 1+ < 1 1 Não 260,1 69,81 329,6 178,3 22,5

46 M 21 >7 dias OD 0,2 3+ > 2 3 Sim 189,6 47,91 615,3 223,7 24

47 F 25 >7 dias OE 0,18 1+ 1-2 2 Sim 454,1 489,5 4978 849,3 89

48 F 22 ≤7 dias OE 0 1+ < 1 2 Sim 176,2 100,5 656,2 107,5 19,4

49 M 22 ≤7 dias OD 0,18 1+ < 1 3 Não 260,1 113,7 779,1 184,8 20,6

50 F 23 >7 dias OD 0,4 1+ < 1 2 Sim 203 65,42 1314 295,5 19,8

51 F 32 >7 dias OE 0,7 2+ 1-2 2 Não 203 376,3 1232 191,3 31,3

52 M 20 >7 dias OD 3 4+ > 2 2 Não 256,7 61,04 85,83 94,64 23,6

53 M 30 ≤7 dias OE 2 3+ 1-2 1 Não 176,2 78,58 615,3 184,8 23,2

54 M 39 ≤7 dias OE 0,3 1+ 1-2 2 Sim 253,4 135,7 1397 236,7 22,5

55 M 18 ≤7 dias OD 0,2 1+ 1-2 3 Não 189,6 56,66 10 367,9 22,9

M= Masculino; F= Feminino;

Tempo = tempo de início dos sintomas até a primeira avaliação oftalmológica;

Ac. Visual (Inicial): acuidade visual inicial em LogMAR;

DD = diâmetro de disco óptico;

Local (Zona) = localização da lesão de RCST em atividade;

Vasc. = vasculite retiniana;

Concentrações das quimiocinas em pg/ml.

121

GRUPO UVEÍTE – DADOS DO 2

EXAME (FINAL)

Ac. Visual

(final)

CCL2 CCL11 CXCL9 CXCL10 CXCL8

1 0,8 . . . . .

2 0,5 211,2 48,98 479,8 290,1 0

3 0,2 289 145,5 957,2 290,1 19,5

4 1 . . . . .

5 0 . . . . .

6 1 . . . . .

7 0,2 . . . . .

8 0,48 . . . . .

9 2 285,5 167,1 479,8 202,2 5

10 2 . . . . .

11 1 204,2 77,49 10 429,1 0

12 2 221,8 109,7 10 349,3 0

13 0 313,9 239,4 101 374,2 0

14 0 207,7 81,06 1487 295 13,9

15 0,6 278,4 214,1 10 329,5 8,4

16 0,5 183,1 106,1 10 334,5 8,4

17 0,6 . . . . .

18 0,6 . . . . .

19 0,1 . . . . .

20 0 . . . . .

21 2 123,5 0 2614 299,9 0

22 1 250,1 235,8 7667 643 41,8

23 0,3 . . . . 39,3

24 0 296,1 91,78 2367 414,1 36,5

25 2 179,6 13,46 195,4 324,6 .

26 0,8 . . . . .

27 0 . . . . .

28 0,3 . . . . .

29 0,48 378,8 175,5 1356 139,6 21,3

30 2 209,7 43,54 615,3 210,7 21,3

31 2 . . . . .

32 0 . . . . .

33 2 . . . . .

34 0,3 . . . . .

35 0,1 389 318 1439 348,1 10,5

36 1 . . . . .

37 0,3 . . . . .

38 2 . . . .

Continua na

próxima página.

122

Ac. Visual

(final)

CCL2 CCL11 CXCL9 CXCL10 CXCL8

39 2 . . . . .

40 0,5 331,1 215,4 779,1 171,9 24,4

41 1 . . . . .

42 2 . . . . .

43 0,5 . . . . .

44 0,7 229,8 100,5 288,9 165,4 24,4

45 0,7 . . . . .

46 0,2 . . . . .

47 0,18 . . . . .

48 0 . . . . .

49 0,1 . . . . .

50 0,2 . . . . .

51 0,3 . . . . .

52 3 . . . . .

53 1 . . . . .

54 0,3 . . . . .

55 0,2 . . . . .

Ac. Visual (final): acuidade visual final em LogMAR;

Concentrações das quimiocinas em pg/ml.

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