ads:
!"#$%&'$("! !)#$*$$'"'+"$,$*!
- ."$*/$%&' !, $#'0'+$ *$ $1/0*$*!
*! !*1)$ *! '#/1$#/2 )3!" *$*!
#$*/$0$/0 #$.2($"$'4#!)%&'*'
#5#/0'*!! #"!!, $#'0'+$6
.
7889
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
"!)#$*'":"$6
'."!)#$*'":"6;
!"#$%&'$("! !)#$*$$'"'+"$,$*!
- ."$*/$%&' !, $#'0'+$ *$ $1/0*$*!
*! !*1)$ *! '#/1$#/2 )3!" *$*!
#$*/$0$/0 #$.2($"$'4#!)%&'*'
#5#/0'*!! #"!6
.
7889
ads:
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À Dra. Rosa Marlene Viero, pelo carinho, compreensão, constante incentivo e
orientação, durante a realização deste trabalho.
Ao Dr. Cleverson Teixeira Soares, pela inestimável orientação e inúmeros caminhos
para a realização deste trabalho.
Aos patologistas do Instituto de Patologia de Bauru: Dr. Raul Negrão Fleury, Dra.
Andréia Aparecida Fassoni e Dr. Maurício Chierici Lopes, pela sincera amizade e
incentivo profissional.
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Gilberto Uemura (Departamento de Ginecologia da UNESP) e ao Dr. Ulisses
Frederigue Júnior (Instituto de Patologia de Bauru), pelos importantes aconselhamentos
para a finalização desse trabalho.
Aos professores do Departamento de Patologia da UNESP, em especial Dra. Maria
Aparecida Custódio Domingues e Dra. Maria Luiza Cotrim Sartor de Oliveira pelo
ombro amigo e exemplo profissional.
Aos funcionários Anderson Aparecido dos Santos, Cínthia Sanches Tojeiro, Denise
Aparecida Pavan, Fábio da Silva Rodrigues, Luiz Henrique Lopes e Rosimary Tedeschi
Seme e Silva (Instituto de Patologia de Bauru), pelo importante auxílio no
levantamento dos arquivos e etapa técnica; Rosana Aparecida Rodrigues (Instituto
“Lauro de Souza Lima”), Celene Maria Carvalho Gandin e Marcos Roberto Franchi
(Departamento de Patologia da UNESP), pela etapa da reação de imunoistoquímica;
Cícera Aparecida da Silva Brito (Departamento de Patologia da UNESP), pela atenção
e prestatividade conferidas durante o processo burocrático e Cristina Aparecida Alquati
Dorico (Departamento de Patologia da UNESP), pelos cuidados à finalização desta
impressão.
Às queridas amigas Renata Falaguera Villas Boas e Bruna Estrozi, pelo constante
incentivo ao meu trabalho.
!"#
!"#!"#
!"#
$
$$
$
%&
%&%&
%&
'()
'()'()
'()
I. Revisão de Literatura 1
Referências Bibliográficas 20
II. Receptores hormonais e her2/neu em câncer de mama. Estudo
comparativo por imunoistoquímica entre citoinclusão e
espécime cirúrgico
27
Resumo 29
Abstract 30
Introdução 31
Casuística e Métodos 33
Resultados 37
Tabelas 40
Figuras 44
Discussão 48
Referências Bibliográficas 52
III. Anexos 56
Cálculos da sensibilidade, especificidade 57
Cálculos dos valores preditivo positivo e negativo 58
Cálculos da acurácia 59
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa 60
1
*+,-./0*(,*1
*+,-./0*(,*1*+,-./0*(,*1
*+,-./0*(,*1
2
REVISÃO DE LITERATURA
Epidemiologia e Mecanismos Etiopatogênicos
O câncer de mama é a neoplasia malígna mais comum entre os cânceres
ginecológicos
1
. Representa mais de 1/5 da totalidade de casos de câncer no mundo
2
. É a
causa mais comum de morte por câncer em mulheres, no Brasil e no mundo
3
, liderando
entre as causas de morte em mulheres entre 40 e 55 anos
4
.
Nos últimos trinta anos, mundialmente, houve aumento da incidência do câncer
em mulheres. Essa evolução é atribuída ao envelhecimento global da população nos
países desenvolvidos e em desenvolvimento
2
. Outros fatores são a mudança de hábitos
adquiridos pela civilização industrializada ocidental, como sobrecarga de calorias na
alimentação, favorecendo a obesidade, gestações tardias, aumento do consumo de álcool
entre as mulheres e exposição a diversos poluentes
5
.
Estudos apontam um aumento de 33% na incidência do câncer de mama, na
última década. Estimativas mais recentes sugerem que o número de casos é maior em
países em desenvolvimento, quando o envelhecimento da população não é considerado.
O quadro se modifica quando a idade é considerada, notando-se maior número de casos
em países desenvolvidos, onde se observa maior expectativa de vida
2
. Estimaram-se, no
ano de 2005, 211.240 novos casos e 40.410 mortes pela neoplasia, somente nos Estados
Unidos
6
. Entretanto, mais da metade de novos casos de câncer de mama ocorridos no
mundo foram diagnosticados em países em desenvolvimento
2
.
A incidência do câncer de mama está associada ao nível socioeconômico e à
urbanização. É maior em mulheres de melhor nível educacional e que habitam a zona
urbana. A semelhança de hábitos, de cultura e fatores reprodutivos, como baixa
paridade, primeira gestação tardia, baixo índice de amamentação, utilização de
hormônios exógenos, maior consumo de álcool e maior acesso à mamografia,
oferecendo diagnóstico mais precoce, justificam essa afirmativa
7
.
3
A mortalidade do câncer de mama decaiu, nas últimas duas décadas, em quase
todos os países economicamente desenvolvidos, em razão de avanços no diagnóstico
precoce e tratamento do mesmo. Pelos mesmos motivos, a sobrevida nesses países,
também é maior. Por outro lado, nos países em desenvolvimento, não foi observada
uma mudança significativa da mortalidade
8
. A proporção entre as taxas de incidência e
mortalidade revela uma probabilidade 24% maior de morrer de câncer de mama em
países menos desenvolvidos
2,9
.
O câncer de mama possui uma etiologia complexa. Envolve fatores genéticos,
ambientais e hormonais, como história familiar, mutações genéticas, idade avançada,
exposição prolongada a estrógenos, etilismo e tabagismo
10
.
Os fatores hormonais têm papel fundamental, sendo a exposição endógena ou
exógena ao estrógeno e progesterona, o principal estímulo para a atividade mitótica do
tecido mamário
10
.
O papel do estrógeno na etiologia do câncer de mama é discutido através de
observações epidemiológicas e experimentais. Esses estudos revelam maior incidência
da neoplasia no sexo feminino, em portadoras de tumores estrógeno-dependentes, como
o carcinoma de endométrio, além de comprovarem o estímulo desse hormônio sobre o
crescimento de células tumorais in vitro e a menor incidência do tumor em mulheres
submetidas à ooforectomia antes dos 50 anos. Nota-se ainda, retardo de crescimento
tumoral em mulheres submetidas à suspensão da produção hormonal, através de terapia
anti-estrogênica, adrenalectomia ou ooforectomia. Outra evidência da influência do
estrógeno na etiologia do câncer de mama é a observação do tumor em homens
transsexuais que fazem uso de hormônio exógeno ou em homens acometidos por
carcinoma de próstata metastático em tratamento
4
.
Várias formas de exposição prolongada ao estrógeno têm sido relacionadas com
à susceptibilidade ao câncer de mama, incluindo situações de exposição endógena,
como a menarca precoce, menopausa e primeira gestação tardias, obesidade e
exposições exógenas, como a terapia de reposição hormonal e a utilização de
contraceptivos hormonais
10,11
.
4
O início precoce da menstruação e a menopausa tardia prolongam o período de
exposição ao estrógeno. Para cada ano de atraso do início da menstruação, o risco de
câncer de mama diminui em 5% e para cada ano de atraso da menopausa o risco
aumenta em 3%
10
.
A gestação exerce um papel protetor sobre a mama, reduzindo o risco de
neoplasias. Essa proteção aumenta quanto maior o número de gestações. Mulheres que
tiveram pelo menos uma gravidez a termo têm risco reduzido para cerca de 25%. A
proteção é maior quando a gravidez ocorre mais cedo. Um estudo revela diminuição em
30% do risco de contrair a doença em mulheres com primeira gestação viável antes dos
vinte anos em relação a mulheres com primeira gestação após a idade de 35 anos
10
.
A amamentação, provavelmente, também exerce um efeito protetor. A duração
da amamentação e a menor idade da mulher têm importância relevante
10
. Porém, outros
estudos têm associado a prolactina, hormônio envolvido na secreção do leite materno, a
modesto aumento no risco de desenvolvimento da neoplasia
11
.
A obesidade aumenta as concentrações de estrógeno. Mulheres menopausadas
obesas têm um risco 50% maior de desenvolver a doença que mulheres menopausadas
não obesas
10
.
A terapia hormonal, sob a forma de estrógeno isolado ou com progestágenos, é
associada a um pequeno aumento do risco de desenvolvimento do tumor. Esse risco é
tempo-dependente e tende a diminuir após a parada da sua utilização, havendo
divergências de opiniões quanto a influência da composição da terapia sobre esse
risco
10, 12
.
A terapia hormonal também contribui para o diagnóstico tardio da neoplasia,
pois leva à intensificação da densidade mamária, que por si só, já é um fator de risco
isolado
9, 12
.
Outros fatores discutidos, relacionados à exposição exógena do tecido mamário
ao estrógeno são o uso de contraceptivos hormonais e o tratamento para infertilidade
10
.
Os contraceptivos hormonais, assim como a terapia hormonal, conferem
pequeno risco, que diminui em 25%, após a parada do uso. O tratamento para
5
infertilidade submete o tecido mamário à exposição de diversas drogas hormonalmente
ativas e hormônios, entre eles, o hormônio liberador de gonadotrofina
10
.
Além do estrógeno, outros hormônios também têm sido relacionados ao risco do
câncer de mama. Estudos demonstram que o risco é maior com o aumento da
concentração de todos os hormônios sexuais, femininos e masculinos, entre eles,
estradiol total, estrona, androstenediona, dehydroepiandrosterona e testosterona
11
.
Com relação à alimentação, há hipóteses formuladas a respeito dos fito-
estrógenos, substâncias presentes em alguns alimentos de origem vegetal, como a soja.
Eles bloqueariam a ação dos estrógenos endógenos, reduzindo assim, o risco de câncer
de mama
10
.
A ação da progesterona é controversa. Algumas linhas de pesquisa apontam para
um efeito protetor e outras defendem a ação potencializadora desse hormônio, visto que
o pico da atividade proliferativa na mama ocorre na fase lútea, quando se observam
maiores concentrações do hormônio
4
.
A história familiar parece ter uma pequena participação no aumento do risco.
Além dos fatores herdados geneticamente, os estilos de vida são semelhantes, portanto,
fatores ambientais contribuem mais que fatores hereditários na suscetibilidade ao câncer
de mama. Essa afirmativa se confirma quando são estudadas pacientes migrantes, com
origem em países com baixo risco de câncer de mama que se destinam às localizações
onde o risco é maior
10
. Interações dos fatores genéticos com fatores ambientais e
reprodutivos potencializam esse risco. Células dos tecidos mamários com alterações
genéticas tornam-se mais suscetíveis aos efeitos produzidos por fatores ambientais
11
.
Características raciais têm sido relacionadas ao risco do câncer de mama.
Estudos apontam para um maior risco entre mulheres brancas com mais de 40 anos,
com história familiar. Em mulheres mais jovens, contraditoriamente a incidência
observada tem sido maior entre mulheres negras. Essas informações encontram
significado em um contexto de aconselhamento de mulheres com história familiar de
câncer de mama
6
.
Polimorfismos em genes que codificam enzimas envolvidas no metabolismo dos
hormônios sexuais também constituem fatores de risco, como observado no gene da
6
17 beta-hydroxysteroide dehydrogenase tipo1, enzima que catalisa a etapa final da
biossíntese do estradiol
11
.
Polimorfismos em genes relacionados ao metabolismo do estrógeno podem
causar alterações em sua função biológica e contribuir para a suscetibilidade ao câncer
de mama. Esses dados sugerem que alterações genéticas da neoplasia, estão
relacionadas a um padrão familiar nos metabolismos dos hormônios sexuais, levando a
essa suscetibilidade
11
.
Fatores de risco adicionais são o consumo de álcool, história prévia de câncer de
mama, presença de lesões proliferativas atípicas no tecido mamário e exposição à
radiação ionizante
9,10
.
Diagnóstico e Tratamento
O câncer de mama quando diagnosticado em fases avançadas tem prognóstico
ruim. Conseqüentemente, as abordagens cirúrgicas são mais agressivas, e por vezes,
mutilantes e ineficazes
13
.
Muitos avanços foram obtidos no diagnóstico e tratamento do câncer de mama
ao longo dos últimos vinte anos
14
.
A sobrevida é o melhor indicador de progresso no tratamento do câncer. A taxa
de sobrevida é medida pela proporção de pacientes vivos após um período de anos de
seguimento após o diagnóstico. Notou-se, nos últimos quarenta anos, um aumento
global da sobrevida em 5 anos, mais significativo em países desenvolvidos
2
.
A cirurgia é modalidade de tratamento de maior impacto em pacientes
portadores de vários tipos de câncer, entre eles o de mama
2
.
Em pacientes com doença metastática, a modalidade de tratamento depende de
fatores como as características biológicas do tumor, além dos sítios de envolvimento,
7
presença de metástases e condições clínicas dos pacientes e a presença de
comorbidades
9
.
A forma como a neoplasia é abordada varia em diferentes países, de acordo com
as características sócio-econômicas. Ela depende da taxa de incidência, dos recursos
disponíveis e de fatores econômicos e culturais
14
.
Nas últimas décadas, avanços consideráveis têm sido obtidos na abordagem ao
câncer de mama, devido à ênfase dada ao seu rastreamento, através da mamografia. Este
recurso permitiu a detecção de tumores menores, minimizando os procedimentos
cirúrgicos. Outro campo que trouxe progressos ao tratamento da neoplasia foram os
estudos anátomo-patológicos, através de técnicas menos invasivas, como a Punção
Aspirativa por Agulha Fina (PAAF) e a biópsia por agulha grossa, da análise do
linfonodo sentinela e da determinação de fatores prognósticos e preditivos por
imunoistoquímica (IQ)
15
.
O Impacto da Patologia sobre o Câncer de Mama
A anatomia patológica é uma especialidade de importância crítica nos avanços
relacionados ao tratamento do câncer de mama. O papel do patologista é fundamental,
para melhorar as informações diagnósticas e na caracterização do comportamento
biológico das lesões de mama. Além de fornecer o diagnóstico, o patologista estuda as
características do câncer, como tamanho, metástase linfonodal, o padrão hormonal, a
expressão de oncogenes e genes supressores tumorais e a taxa de proliferação celular,
todos eles relacionados com o prognóstico
15
. Para isso, utiliza técnicas, como a IQ,
método acurado e acessível para auxiliar no diagnóstico de lesões benignas e malignas
da mama, determinar seu comportamento biológico e fornecer informações preditivas
para o tratamento
16,17
.
As características e propriedades biológicas do tumor são de grande utilidade
para estimar a probabilidade de recorrência, a sobrevida esperada e a resposta a métodos
terapêuticos adjuvantes, como a terapia hormonal ou a quimioterapia
18
.
8
Os principais fatores preditivos e prognósticos do câncer de mama são os
oncogenes Her-2/neu, tp53, BRCA1 e 2, os receptores hormonais do estrógeno (RE) e
progesterona (RP), e o índice de proliferação celular
19
.
BRCA1, BRCA2 e outros Genes Relacionados ao Carcinoma Mamário
Os dois maiores genes associados à susceptibilidade ao câncer de mama são os
genes de susceptibilidade breast cancer 1 gene (BRCA1) e breast cancer 2 gene
(BRCA2), cujos loci estão nos cromossomos 17q e 13q, respectivamente. Mutações
sofridas por esses genes geram um risco de 60 a 85% de desenvolver câncer de mama.
Elas são observadas em aproximadamente 20% das famílias com evidência de
suscetibilidade herdada ao câncer de mama. Porém, essas mutações são observadas em
apenas 2 a 3% dos carcinomas mamários
20
.
Vários estudos têm identificado fatores associados com a probabilidade de
mutações nos genes BRCA1 e BRCA2, entre eles, a ocorrência em mulheres jovens, a
concomitância ao câncer de ovário e a história familiar. Esses fatores apontam para a
importância na investigação dessas mutações para que estratégias de prevenção sejam
realizadas, desde a mamografia anual à mastectomia profilática
20
.
A identificação de mutações nesses genes também tem sido utilizada em
pacientes portadoras de tumores positivos para RE. Estudos indicam a redução na
incidência de tumores na mama contralateral, quando essas pacientes são submetidas à
terapia neoadjuvante com tamoxifeno
20
.
Outros genes, cujas mutações, menos freqüentes também são implicadas no
risco de câncer de mama são o tp53, o PTEN, o STK11/LKB1 e o CHEK2, um
importante componente que reconhece e repara danos do DNA e ativa o BRCA1
20
.
9
Her-2/neu
O gene neu foi primeiro identificado em tumores neuroectodérmicos de ratos. O
gene Her-2/neu, também conhecido como c-erbB2
21
, é seu equivalente nos seres
humanos. É um proto-oncogene localizado no cromossomo 17q21, que codifica a
proteína de mesmo nome, também designada como p185
HER
, uma glicoproteína
transmembrana de 185KDa, membro da família Her/erbB e importante fator preditivo e
prognóstico, no câncer de mama
22,23,24
.
A ativação do gene Her-2/neu depende de fatores de transcrição, genes e
proteínas regulatórias, que osquestram, em conjunto, os sinais que desencadeiam o
crescimento e a diferenciação celulares. Quando suas funções se encontram alteradas,
desencadeia-se a carcinogênese. Os fatores de transcrição envolvidos na ativação do
gene Her-2/neu e na expressão aumentada da proteína Her-2/neu, são o PEA3 e o
Esx/Elf-3, sendo este último, detectado em carcinomas in situ. A expressão desses
fatores de transcrição, nos tumores de mama, correlaciona-se com a expressão
aumentada da proteína Her-2/neu
25
.
A família Her/erbB é constituída por 4 receptores de superfície envolvidos na
transmissão de sinais que controlam o crescimento e a diferenciação celular normais.
Apresentam-se na forma de monômeros ou dímeros. Os monômeros são representados
pelo Her-1, Her-2, Her-3 e Her-4. Quando o fator de crescimento se liga a um deles,
este se liga a outro monômero, formando um dímero. A ligação de um fator de
crescimento com um dímero gera sinalizações mais potentes que as geradas pela ligação
com um receptor monomérico, sobretudo se o heterodímero contiver o Her-2. A partir
daí, ocorre a endocitose do receptor e desencadeiam-se sinais que promovem o
crescimento celular
23
.
Usualmente, o Her-2 é o segundo monômero e não aquele que se liga ao fator de
crescimento. O heterodímero que contém o Her-2 é o mais forte, porque nesse caso, a
endocitose do receptor é mais lenta que em dímeros onde o Her-2 não está presente. À
medida em que sucede a endocitose, a sinalização vai ocorrendo e sendo
potencializada
23
. O heterodímero mais freqüentemente observado no câncer de mama é
10
formado pela conjunção entre os monômeros Her-2 e Her-3, mas o monômero Her-1
também é observado em uma porção significativa dos carcinomas mamários
26
.
Todos os quatro monômeros possuem um sítio de ligação extracelular rico em
cisteína, um domínio lipofílico transmembrana e um domínio intracelular com atividade
catalítica tirosina quinase
23
. As tirosinas quinases são proteínas que transmitem sinais
da membrana celular ao núcleo. As tirosinas quinases MAP sinalizam o processo de
proliferação celular. Quando ocorre a ligação do fator de crescimento ao sítio de ligação
extracelular, o mais provável é que desencadeiem a autofosforilação do terminal
carboxil do ligante e promovam sinais que levam à ativação do domínio intracelular das
quinases MAP e, conseqüentemente, da proliferação celular
22, 27
.
Normalmente, existem poucas moléculas de Her-2 na superfície celular,
portanto, poucos heterodímeros são formados e os sinais de crescimento são
relativamente fracos e controlados. Quando o Her-2 é expresso em excesso, um sinal de
crescimento celular descontrolado é desencadeado, favorecendo o desenvolvimento de
vários tumores, incluindo os ovarianos, do trato gastro-intestinal e os mamários. Por
isso, a expressão aumentada do Her-2 está associada aos carcinomas mamários assim
como à agressividade e à atividade metastática do tumor
23
.
No câncer de mama, 92% dos casos de expressão aumentada do monômero Her2
são atribuídos à amplificação do gene Her-2/neu, ou seja, um número aumentado de
cópias de um gene normal. Conseqüentemente, a síntese da proteína Her-2/neu
encontra-se aumentada
21
. Esse aumento pode ser 100 vezes maior nas células
cancerosas
23
.
A importância do complexo Her-2/neu, como fator prognóstico e preditivo, está
em identificar as pacientes com menor tempo de sobrevida, geralmente portadoras de
tumores invasivos
28
, que apresentam resistência a certos quimioterápicos, como a
ciclofosfamida, o metotrexate e o 5- fluorouracil
24
e sensibilidade a outros, como a
antraciclina
21. 23, 29
, embora alguns trabalhos contradigam essa última afirmação
24
. Nota-
se também correlação com tumores negativos para RE e RP, conferindo, portanto,
resistência à hormonioterapia e com tumores apresentando alto grau nuclear
22, 30
. Esses
casos, de pior prognóstico, constituem 25 a 30% de todos os casos de câncer de mama
31
.
11
Vários trabalhos estabeleceram a amplificação ou expressão aumentada do
Her-2/neu como fator prognóstico independente, em pacientes com ou sem metástase
linfonodal
21
. Alguns trabalhos, não relacionam o Her-2/neu ao tamanho do tumor, grau
de diferenciação ou potencial metastático
26
, enquanto outros estudos já o relacionam à
atividade metastática
23
.
O Her-2/neu indica, também, casos sensíveis ao tratamento com o trastuzumab
(Herceptin®), um anticorpo monoclonal contra o domínio extra–celular do Her-2/neu
que aumenta a sensibilidade à quimioterapia em pacientes com doença metastática
23
. O
trastuzumab foi desenvolvido em 1992, produzindo resposta anti-tumoral em 15 a 20%
das pacientes com metástase
32
.O anticorpo monoclonal exerce o papel de controlar o
crescimento celular e impedir o desenvolvimento tumoral, através da endocitose e
degradação lisossomal do monômero Her-2. Este é altamente específico ao anticorpo
monoclonal anti-Her-2. Ele elimina o receptor da superfície celular, diminuindo a
formação de heterodímeros, reduzindo, assim, a oncogenicidade
23
.
A localização superficial do receptor o torna alvo fácil ao anticorpo anti Her-2.
O anti- Her-2 humano recombinante monoclonal (rhuMAb-Her-2, trastuzumab,
Herceptin®) também auxilia no tratamento de carcinomas metastáticos através da
potencialização dos quimioterápicos paclitaxel, doxorrubicina, cisplatina e
ciclofosfamida
23, 32
.
As primeiras pesquisas do marcador em neoplasias mamárias eram realizadas
através de técnicas de southern blotting, para as quais se obtinha material extraído do
DNA de tumores não fixados. A amplificação do gene Her-2/neu era encontrada em 20
a 30% dos tumores. O subseqüente desenvolvimento de anticorpos monoclonais e
policlonais, possibilitou a pesquisa da proteína Her-2/neu nas células tumorais, através
do método de IQ, havendo uma boa correlação com a amplificação gênica obtida
através dos métodos anteriores
22
.
A proteína Her-2/neu pode ser pesquisada através de métodos de biologia
molecular, como reação de cadeia da polimerase, a hibridização in situ com
fluorescência e a hibridização in situ cromogênica, que detectam a amplificação gênica.
Também podem-se utilizar métodos para a detecção da proteína, como o imunoensaio
enzimático, que detecta a proteína Her-2/neu solúvel em tecido tumoral fresco ou no
12
sangue. Esta técnica pode ser utilizada para monitorar os níveis sangüíneos da proteína e
identificar possível recorrência do tumor. A técnica mais rotineiramente usada é a de
IQ
21,29,30
.
A IQ é uma técnica amplamente difundida e com a possibilidade de ser aplicada
em material fixado. Os resultados dependem de vários fatores, como a sensibilidade e a
especificidade dos anticorpos utilizados na reação, o tipo de anticorpo
28
, o período de
fixação e a eficiência dos métodos, os controles positivos e a variabilidade inter-
observador
22, 33
. Trabalhos mostram uma alta correlação com métodos considerados
mais acurados, como a hibridização in situ com fluorescência, chegando a alcançar 90%
de concordância
21,28,30
. A escala de graduação utilizada na avaliação do Her-2/neu é a
padronizada para o Herceptest (Dako, CA/USA), aprovada pela Food and Drug
Administration, para selecionar as pacientes candidatas ao tratamento com o
Herceptin®
32
. Ela gradua os tumores de 0 a 3+, de acordo com a intensidade e o padrão
da reação cromogênica
34,35
.
A hibridização in situ com fluorescência também pode ser realizada em material
fixado, tem altas sensibilidade e especificidade e necessita de uma pequena quantidade
de material, mas é um método dispendioso, de execução mais complexa e com maior
demanda de tempo para ser realizado
22
.
A hibridização in situ cromogênica apresenta 100% de concordância com a
hibridização com fluorescência, em certos trabalhos. A reação cromogênica tem maior
durabilidade e não há necessidade de equipamentos especiais para sua visualização
30
,
mas apresenta as desvantagens de custo e tempo, apresentadas pelo método anterior
29
.
As duas últimas técnicas não são utilizadas rotineiramente, devido às
dificuldades demonstradas. Só devem ser utilizadas em casos de escore 2+, pelo método
de IQ, quando a coloração demarca fracamente toda a membrana celular, visto que a
expressão aumentada de Her-2/neu observada por essas técnicas apresenta alta taxa de
correlação com a amplificação gênica
28,30, 36
.
13
Receptor de Estrógeno (RE)
A exposição prolongada ao estrógeno exerce grande influência no
desenvolvimento do câncer de mama. Os efeitos do estrógeno são, em parte, mediados
pelo RE. São conhecidos dois tipos de receptor, e , membros da família de receptores
esteróides nucleares
25,37
e são expressos nas células do estroma e das glândulas
mamárias. Também são observados no útero, ovário, próstata, epidídimo, testículo,
pituitária, rins, timo, ossos e sistema nervoso central. Eles são estruturalmente similares
em seus domínios de ligação, embora apresentem diferenças em seus efeitos globais,
nos diferentes órgãos
26
.
Na ausência de seu ligante, o RE forma um complexo inativo com a proteína
HSP 90. Quando o estrógeno se liga a seu receptor, através de seu domínio periférico,
este se dissocia dessa proteína, dimeriza e é transformado em uma forma ativa. Esta
forma ativa dá início à atividade mitótica, através da interação direta do domínio central
do receptor com os elementos de resposta ao estrógeno, localizados na região promotora
do gene alvo no DNA. Essa interação ativa co-fatores, promovendo, assim, a
proliferação celular. Dois co-fatores importantes, envolvidos nas vias de ativação da
proliferação celular são o proto-oncogene c-myc e a molécula cyclina D1
25, 37
. Outra via
utilizada para a promoção da proliferação celular é a via de sinalização através das
quinases MAP
26, 37
.
O RE- é expresso em 70-80% dos tumores de mama. São tumores de
crescimento mais lento e melhor diferenciados e por isso apresentam melhor
prognóstico
26
. A ausência de expressão do RE- é associada a tumores de fenótipo mais
agressivo
38
.
Alguns estudos indicam que o RE- atua em fases mais precoces do
desenvolvimento tumoral, porque é expresso principalmente em carcinomas in situ e
tem sua expressão diminuída em tumores mais avançados
26
. Porém, outros estudos já
mostram a expressão aumentada do RE- como evento inicial significante na
carcinogênese da mama. Outro papel do RE- seria a de modulador do RE-,
14
atenuando ou suprimindo sua função e reduzindo a proliferação celular, através de
diferentes mecanismos, já que eles são co-expressos nos tumores de mama
38
.
Os genes RE- e RE- promovem a expressão de seus respectivos receptores.
Por várias décadas, acreditou-se que havia apenas um gene até que em 1996, foi isolado
o gene RE- do DNA de um rato e posteriormente do DNA humano
26
.
Trabalhos têm mostrado que a ausência da expressão do RE está relacionada a
mutações, deleções, perda de heterozigose ou polimorfismos no gene responsável pela
sua expressão
26
.
O RE é importante indicador de resposta à endocrinoterapia, com moduladores
ou destruidores deste, que antagonizam o efeito do estrógeno sobre o aumento da massa
tumoral
26,37,38
. Esse receptor foi o primeiro passo na tentativa de uma subclassificação
por biomarcadores dos tumores de mama no intuito de auxiliar a conduta da doença, há
três décadas
39
.
Entre os anti-estrógenos não esteroidais, utilizados no tratamento do câncer de
mama, estão os moduladores seletivos do RE, sendo o tamoxifeno o representante mais
conhecido. Ele antagoniza os efeitos do estrógeno, através da competição por seus
receptores. O tamoxifeno foi introduzido para a indução da ovulação, no tratamento de
infertilidade, por exercer ação semelhante à do estrógeno em alguns órgãos, como o
ovário. Outros efeitos semelhantes aos do hormônio são a reabsorção óssea, a redução
das taxas de LDL e colesterol e um pequeno aumento na incidência de hiperplasia e
câncer de endométrio
4, 40
.
O fulvestrant é um anti-estrógeno esteroidal utilizado como terapia alternativa
aos moduladores do receptor. Ele se liga ao complexo RE, provocando sua destruição
prematura. Não tem propriedades semelhantes às do estrógeno. Uma terceira alternativa
seria a utilização de inibidores da aromatase, enzima envolvida na síntese de estrógeno.
É representado por substâncias como o anastrozol e o letrozol
40
. Aproximadamente 50%
dos tumores positivos para Her2-neu são positivos para RE. Esses tumores são
freqüentemente resistentes à hormonioterapia. Uma das hipóteses é a promoção à
expressão dos receptores de crescimento epidérmico, entre os quais o Her-2/neu está
classificado. Essa expressão aumentada de Her-2/neu é associada ao aumento de co-
15
ativadores, que estabilizam o RE e promovem a resistência. Pacientes portadoras desse
tipo de tumor devem receber terapia anti-hormonal combinada à administração do
trastuzumab
31
. Outros estudos não demonstram uma resistência absoluta, mas uma
probabilidade reduzida de resposta à hormonioterapia. Assim, não se deveria negar a
oportunidade desta modalidade de tratamento a essas pacientes
29
.
Os primeiros ensaios utilizados rotineiramente para a identificação do RE foram
os ensaios com ligantes radiomarcados. Para a realização desses ensaios, eram
utilizados fragmentos frescos de tumor, portanto, apenas coletas prospectivas podiam
ser realizadas. O método era quantitativo e o resultado expresso em fentomoles/mg de
proteína do citosol
41
.
Com o advento da ultrassonografia, a realização do diagnóstico mais precoce do
câncer de mama tornou-se viável, possibilitando a identificação de lesões muito
menores. Isso impossibilitou, em muitos casos, a obtenção de material para a
quantificação do RE por ligantes radiomarcados. Contudo, a introdução do método de
IQ possibilitou a identificação do receptor em fragmentos de tumor fixados em
formalina e incluídos em parafina. Consequentemente, a IQ substituiu gradativamente
os ensaios realizados anteriormente. Vários estudos mostram a superioridade da IQ em
determinar a positividade para o RE nos tumores de mama, além de oferecer a vantagem
de se realizar uma pesquisa retrospectiva em material já fixado
41
e de atender à
necessidade de se utilizar uma tecnologia com boa reproducibilidade e de custo mais
acessível, comparando-se com outras técnicas
39
.
Trabalhos relatam ainda, a importância do tempo de fixação para a identificação
do RE pelo método de IQ, sendo necessário, portanto, um tempo mínimo de seis a oito
horas., independente do tamanho do tumor
41
.
A IQ não é um método quantitativo, portanto, a intensidade da coloração não
tem uma relação linear direta com a quantidade de RE presente nos núcleos das células
tumorais. Um consenso estabelecido pelo Instituto Nacional de Saúde dos Estados
Unidos recomendou que, para fins terapêuticos, qualquer positividade para o RE pelo
método de IQ é o suficiente para considerar o tumor estrógeno-positivo e a paciente
candidata à endocrinoterapia. Mas para fins de estudo, se a quantificação é necessária,
outros métodos seriam mais adequados, como a reação em cadeia da polimerase
41
.
16
A pesquisa do RE, através de imunocitoquímica aplicada ao material obtido por
PAAF tem demonstrado uma correlação favorável quando comparada ao material da
peça cirúrgica
42
.
Receptor de Progesterona (RP)
O RP, assim como o RE, pertence à família de receptores esteróides nucleares.
Sem o seu hormônio ligante, reside inativo no núcleo celular, formando um complexo
latente com proteínas. São conhecidas duas isoformas do receptor, o RPA e o RPB, cuja
expressão depende de um único gene. Seus domínios são homólogos e semelhantes aos
domínios do RE, incluindo um domínio central que se liga ao DNA e um domínio C-
terminal, que se liga à progesterona e medeia a dimerização e a ativação do processo de
transcrição. Esse processo é executado através da atuação de fatores de transcrição,
como a proteína C/EBP. Assim, finalmente se desencadeia o processo de proliferação
celular.
25, 43
.
Na década de 70, o RP foi valorizado, por fornecer informações adicionais mais
precisas, junto ao RE e atuar como fator preditivo à resposta à hormonioterapia
44
.
Assim, o RP, similarmente ao RE, é indicador de boa resposta a essa modalidade de
tratamento
26
.
O RP também é um importante fator que prediz a responsividade do câncer de
mama à terapia hormonal. Aproximadamente 50% dos tumores positivos para o RE são
positivos para o RP e destes, cerca de 75% são sensíveis à terapia hormonal. Tumores
positivos para RE e negativos para RP são menos sensíveis à hormonioterapia,
sugerindo uma possível contribuição do RP em uma resposta positiva à este
tratamento
45
.
O RE é um fator de transcrição chave para a ativação do RP. Este é induzido
pelo primeiro receptor. Por isso, também, o segundo pode ser utilizado como referência
para a atividade estrogênica, confirmando, assim, sua função como fator preditivo
adicional na hormonioterapia
45
.
17
Cerca de 5% dos tumores são negativos para RE e positivos para RP. Estes
tumores demonstram uma resposta intermediária à hormonioterapia
26
.
Há diferenças entre as respostas dos tumores às diferentes modalidades de
hormonioterapia. Tumores positivos para ambos RE e RP, respondem melhor à terapia
com tamoxifeno, enquanto tumores positivos para RE e negativos para RP respondem
melhor aos inibidores da aromatase
46
.
Outro trabalho mostra que a expressão aumentada do RP, no câncer de mama,
está associada a tumores mais agressivos e à expressão aumentada da proteína Her-
2/neu. Não obstante, a positividade para RP, independente da expressão do Her2 é um
fator preditivo de risco de recorrência
47
. As concentrações de RPB estão particularmente
aumentadas no carcinoma mamário, o que diminui a razão RPA: RPB
26
.
O RP pode ser pesquisado pelas mesmas técnicas utilizadas para a pesquisa do
RE, sendo a mais usual, a de IQ. Esta técnica apresenta boa reproducibilidade e alta
correlação com métodos utilizados anteriormente, como os ensaios com ligantes
radiomarcados. Assim, como na pesquisa do RE, 1% de positividade das células
tumorais para o marcador, é suficiente para eleger a paciente como candidata à
hormonioterapia
45
. A pesquisa desse receptor através da imunocitoquímica também
apresenta uma boa correlação com a pesquisa no espécime cirúrgico e proporciona
maior agilidade na abordagem das neoplasias mamárias
48
.
A Punção Aspirativa e a Citopatologia Aplicadas à Patologia do Câncer de Mama
James Paget, em 1853, foi o primeiro a utilizar a punção aspirativa para o exame
microscópico de tumores de mama
49
.
A PAAF tem se mostrado excelente método para o diagnóstico de diversas
neoplasias, incluindo o câncer de mama. É procedimento simples, rápido, de menor
custo e pouco invasivo
50
. Apresenta importante contribuição na diminuição de
procedimentos cirúrgicos desnecessários
51
. Tem acurácia semelhante ao material obtido
18
por biópsia percutânea, quando há correlação entre os achados clínicos, de imagem e
citológicos. Isso permite maior agilidade no acompanhamento dos pacientes
52
e
diminuição do estresse experimentado no período entre a suspeita e confirmação do
diagnóstico
53
. Estudos provam que a PAAF muitas vezes, é mais sensível e oferece
diagnóstico mais rápido que as biópsias por agulha grossa
54
. Vale lembrar que o
aumento da sensibilidade dos métodos radiológicos permitiu a identificação de lesões
menores, na mama e em outras localizações, facilitando a realização desse método
18
.
Várias publicações mostram que a PAAF fornece subsídios, não apenas
morfológicos, podendo-se utilizar o material para estudo imunocitoquímico, citometria
de fluxo ou técnicas de biologia molecular
52,55
, auxiliando, assim, no diagnóstico de
lesões benignas e malignas, nos mais diversos órgãos
56, 57, 58
. Ainda possibilita a
avaliação de resposta a tratamentos quimioterápicos e da recorrência, através da
detecção de tumor residual ou metástases linfonodais
59
. O material obtido através de
punção aspirativa apresenta moderada acurácia quando utilizado na graduação dos
carcinomas da mama e comparado ao material da peça cirúrgica
42
. As amostras
citológicas podem ser rapidamente coradas e examinadas, tornando possível a avaliação
imediata da adequação da amostra e em muitos casos, um diagnóstico provisório pode
ser feito ainda na presença do paciente. Acrescenta-se, que o envolvimento do
patologista no ato da coleta, otimiza a correlação clínica e permite o manuseio
apropriado da amostra e seu encaminhamento para estudo por técnicas complementares,
como as supracitadas
54
.
A PAAF também permite a obtenção de material para a confecção das cito-
inclusões. Estas podem ser obtidas diretamente do material colhido através da PAAF ou
do material raspado de esfregaços muito espessos, que apresentam dificuldades na
interpretação das lâminas. Esse material é então fixado e processado de forma
semelhante ao cortes histológicos do espécime cirúrgico
60,61
.
Estudos demonstram a utilidade da citoinclusão na pesquisa de vários tipos de
neoplasias em diversos órgãos e efusões cavitárias, apresentando altas sensibilidade e
especificidade
62,63,64
. Sua aplicabilidade e superioridade aos esfregaços são reconhecidas
na realização da imunocitoquímica para a diferenciação entre diversos tumores,
metastáticos ou primários
58, 62
.
19
A citoinclusão tem importante papel no diagnóstico das lesões de mama,
permitindo a identificação de padrões histológicos e diminuindo o número de casos com
diagnóstico indefinido. Ela poderá ser utilizada na realização de técnicas
complementares citadas anteriormente, colorações específicas e prover excelente
material para imunocitoquímica. A imunocitoquímica aplicada à citoinclusão, na
pesquisa da patologia mamária, apresenta boa reproducibilidade
65
. O material é fácil de
ser estocado e permite a utilização de um painel amplo de anticorpos. Entre os fatores
que determinam o sucesso do método está a experiência do profissional, na obtenção de
material com celularidade suficiente.
54, 66
.
A citoinclusão oferece mais vantagens sobre os esfregaços na realização da
imunocitoquímica, porque, o procedimento é o mesmo usado para os cortes
histológicos, a interpretação apresenta menor dificuldade, as lâminas apresentam menos
artefatos e notam-se menos casos falso-positivos, além de oferecer a possibilidade da
realização de mútiplos cortes e de pesquisar vários marcadores. Ela pode ser utilizada na
pesquisa de marcadores prognósticos da mama, através do material obtido por punções
aspirativas dos tumores ou dos linfonodos
65,67,68
. Pode-se obter material representativo,
com alta celularidade, de onde podem ser extraídas informações úteis a respeito do
prognóstico para auxiliar na conduta clínica da paciente
65
.
Dessa forma, a PAAF possibilita ao patologista oferecer à equipe clínica desde
dados morfológicos, através da identificação de lesões proliferativas atípicas em
pacientes de risco até dados adicionais, relativos a fatores prognósticos e preditivos
69
.
Neste estudo, realizamos a avaliação do RE, do RP e do Her-2/neu, três
importantes fatores prognósticos e preditivos na conduta do câncer de mama. Essa
avaliação foi realizada através da técnica de IQ aplicada em material de citoinclusão,
obtido através de PAAF e em material do espécime cirúrgico
65
20
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1- Pöhls UG, Renner SP, Fasching, PA, Lux MP, Kreis H, Ackermann S, et al.
Awareness of breast cancer incidence and risk factors among healthy women. Eur J Can
Prev. 2004; 13 (4): 249-56.
2- Pecorelli S, Favalli G, Zigliani L, Odicino, F. Cancer in woman. Int J Gynaecol.
2003; 82 (3): 369-79.
3- Wunsch Filho V, Moncau JE. Cancer mortality in Brazil 1980-1995: regional patters
and trends. Rev Assoc Med Bras. 2002; 48 (3): 250-7.
4- Benshushan A, Brzezinski A. Hormonal manipulations and breast cancer. Obstet
Gynaecol Surv. 2002; 57 (5): 314-23.
5- Euhus DM. Breast cancer prevention in the 21
st
century: defining the challenge.
Breast J. 2006; 12 (2): 97-8.
6- Simon MS, Korczak JF, Yee CL, Malone KE, Ursin G, Bernstein L, et al. Breast
cancer risk estimates for relatives of white and african american women with breast
cancer in the women’s contraceptive and reproductive experiences study. J Clin Oncol.
2006; 24 (16): 2498-504.
7- Robert SA, Strombom I, Trentham-Dietz A, Hampton JM, McElroy JA, Newcomb
PA, et al. Socieconomic risk factors for breast cancer distinguishing individual and
community level effects. Epidemiology. 2004; 15 (4): 442-50.
8- Zago A, Pereira LA, Braga AL, Bousquat A. Breast cancer mortality in women of
southern Brazil, 1980-1999. Rev Saude Publica. 2005; 39 (4): 641-5.
9- Mincey BA, Perez EA. Advances in screening, diagnosis, and treatment of breast
cancer. Mayo Clin Proc. 2004; 79 (6): 810-6.
10- Key TJ, Verkasalo PK, Banks E. Epidemiology of breast cancer. Lancet Oncol.
2001; 2 (3): 133-40.
21
11- Vogel VG, Taioli E. Have we found the ultimate risk factor for breast cancer?. J
Clin Oncol. 2006; 24 (12): 1791-4.
12- Gertig DM, Fletcher AS, English DR, Macinnis RJ, Hopper JL, Giles GG. Hormone
therapy and breast cancer: what factors modify the association?. Menopause. 2006;
13 (2): 178-84.
13- Cotlar AM, Dubose JJ, Rose DM. History of surgery for breast cancer: radical to the
sublime. Curr Surg. 2003; 60 (3): 329-32.
14- Collyar DE. Breast cancer: a global perspective. J Clin Oncol. 2001; 19 (18): 101-5.
15- Masood S. The expanding role of pathologists in the diagnosis and management of
breast cancer: worldwide excellence in breast pathology program. Breast J. 2003; 9 (2):
S94-7.
16- Lerwill MF. Current practical applications of diagnostic immunohistochemistry in
breast pathology. Am J Surg Pathol. 2004; 28 (8): 1076-91.
17- Werling RW, Hwang H, Yaziji H, Gown AM. Immunohistochemical distinction of
invasive from noninvasive breast lesions: a comparative study of p63 versus calponin
and smooth muscle myosin heavy chain. Am J Surg Pathol. 2003; 27 (1): 82-90.
18- Carlson RW, Anderson BO, Chopra R, Eniu AE, Jakesz R, Love RR, et al.
Treatment of breast cancer in countries with limited resources. Breast J. 2003; 9 (2):
S67-4.
19- Domchek SM, Weber BL. Recent advances in breast cancer biology. Curr Opin
Oncol. 2002; 14 (6): 589-93.
20- Wooster R, Weber BL. Breast and ovarian cancer. N Engl J Med. 2003; 348 (23):
2339-47.
21- Masood S, Bui MM. Prognostic and predictive value of HER2/neu oncogene in
breast cancer. Microsc Res Tech. 2002; 59 (2): 102-8.
22
22- Walker RA. The significance of histological determination of HER-2 status in
breast cancer. Breast. 2000; 9 (3): 130-3.
23- Rubin I, Yarden Y. The basic biology of HER2. Ann Oncol. 2001; 12 (1): S3-8.
24- Bozzetti C, Musolino A, Camisa R, Bisagni G, Flora M, Bassano C, et al.
Evaluation of Her2/neu amplification and other biological markers as predictors of
response to neoadjuvant anthracycline based chemotherapy in primary breast cancer.
The role of anthracycline dose intensity. Am J Clin Oncol. 2006; 29 (2): 171-7.
25- Visvader JE, Lindeman GJ. Transcrptional regulators in mammary gland
development and cancer. Int J Biochem Cell Biol. 2003; 35 (7): 1034-51.
26- Keen JC, Davidson NE. The biology of breast carcinoma. Cancer. 2003; 97 (3):
825-33.
27- Craven RJ, Lightfoot H, Cance WG. A decade of tyrosine kinases: from gene
discovery to therapeutics. Surg Oncol. 2003; 12 (1): 39-50.
28- Falo C, Moreno A, Lloveras B, Figueras A, Varela M, Escobedo A .Algorithm for
the diagnosis of Her2/neu status in breast-infiltrating carcinomas. Am J Clin Oncol.
2003; 26 (5): 465-70.
29- Hayes D, Thor AD. C-erb-2 in breast cancer: development of a clinically useful
marker. Semin Oncol. 2002; 29 (3): 231-45.
30- Vera-Roman JM, Rubio-Martinez LA. Comparative assays for the Her2/neu
oncogene status in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 2004; 128 (6): 627-33.
31- Nahleh ZA, Jazieh AR. Multitargeted therapy in estrogen receptor- positive human
epidermal growth factor receptor-2 positive breast cancer. Am J Clin Oncol. 2005;
28 (6): 631-3.
32- Oliveira MA, Santos GS, Kanamura CT, Alves VAF. Immunoexpression of Her-2
protein in fine-needle aspirates of breast carcinoma:correlation with surgical specimens.
Rev Bras Ginecol Obst. 2003; 25 (1): 23-8.
23
33- Pauletti G, Danderkar S, Rong H, Ramos L, Peng, H, Seshadri R, et al. Assessment
of methods for tissue based detection of the Her2/neu alteration in human breast cancer:
comparison of fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry. J Clin
Oncol. 2000; 18 (21): 3651-64.
34- Rosai J. Breast. In: Rosai J, editor. Surgical Pathology. St Louis: Mosby; 2004. p.
1763-876.
35- Dabbs DJ. Diagnostic Immunohistochemistry of Breast. In: Dabbs DJ, editor.
Diagnostic Immunohistochemistry. New York: Churchill Livinstone; 2002. p. 536-58.
36- Field AS, Chamberlain NL, Tran D, Morey AL. Suggestions for HER-2/neu testing
in breast carcinoma, based on a comparison of immunohistochemistry and fluorescence
in situ hybridization. Pathology. 2001; 33 (3): 278-82.
37- Doisneau-Sixou SF, Sergio CM, Hui R, Musgrove EA, Sutherland RL. Estrogen
and antiestrogen regulation of cell cycle progression in breast cancer cells. Endocr Relat
Cancer. 2003; 10 (2): 179- 86.
38- Hayashi SI, Eguchi H, Tanimoto K, Yoshida T, Omoto Y, Inoue A, et al. The
expression and function of estrogen receptor and in human breast cancer and its
clinical application. Endocr Relat Cancer. 2003; 10 (2): 193-202.
39- Ellis MJ. Functional analysis of breast cancer genome. J Clin Oncol. 2006; 24 (11):
1649-50.
40- Jordan VC, Osipo C, Schafer JM, Fox JE, Cheng D, Liu H. Changing role of the
oestrogen receptor in the life and death of breast cancer cells. Breast. 2003; 12: 432-41.
41- Schnit SJ. Estrogen receptor testing of breast cancer in current clinical practice:
what’s the question?. J Clin Oncol. 2006; 24 (12): 1797-9.
42- Jayaram G, Elysayed EM. Cytologic evaluation of prognostic markers in breast
carcinoma. Acta Cytol. 2005; 49 (6): 605-10.
24
43- Man JH, Li HY, Zhang PJ, Zhou T, He K, Pan X, et al. PIAS3 induction of PRB
sumoylation represses PRB transactivation by destabilizing its retention in the nucleus.
Nucleic Acids Res. 2006; 34 (19): 1-15.
44- Bardou VJ, Arpino G, Elledge RM, Osbone CK, Clark GM. Progesterone receptor
status significantly improves outcome prediction over estrogen receptor status alone for
adjuvant endocrine therapy in two large breast cancer databases. J Clin Oncol. 2003;
21 (10): 1973-9.
45- Yamashita H, Yando Y, Nishio M, Zhang Z, Hamaguchi M, Mita K, et al.
Immunohistochemical evaluation of hormone receptor status for predicting response to
endocrine therapy in metastatic breast cancer. Breast Cancer. 2006; 13 (1): 74-83.
46- Punglia RS, Kuntz KM, Winer EP, Weeks JC, Burnstein HJ, et al. The impact of
tumor progesterone receptor status on optimal adjuvant endocrine therapy for
menopausal pacients with early-stage breast cancer: a decision analysis. Cancer. 2006;
106 (12): 2576-82.
47- Dowsett M, Houghton J, Iden C, Salter J, Farndon J, A’ Hern R, et al. Benefit from
adjuvant tamoxifen therapy in primary breast cancer patients according oestrogen
receptor, progesterone receptor, EGF receptor and HER2 status. Ann Oncol. 2006;
17 (5): 818-26.
48- Jayaram G, Elsayed EM. Cytologic evaluation of prognostic markers in breast
carcinoma. Acta Cytol. 2005; 49 (6): 605-10.
49- Bales EC. Laboratory techniques. In: Koss LG, editor. Diagnostic cytology and its
histopathologic bases. Philadelphia: Lippincott Willians & Wilkins; 2005. p. 1569-634.
50- Vargas HI, Masood S. Implementation of a minimally invasive breast biopsy
program in countries with limited resources. Breast J. 2003; 9 (2): S81-5.
51- Annema JT, Versteegh MI, Veselic M, Voight P, Rabe KF. Endoscopic ultrassound-
guided fine needle aspiration in the diagnosis and staning of lung cancer and its impact
on surgical staging. J Clin Oncol. 2005; 23 (33): 8283-5.
25
52- Schmitt FC, Soares R, Cirnes L, Seruca R. PCR amplication of DNA obtained from
archived hematoxylin-eosin- and giemsa-stained breast cancer aspirates. Diagn
Cytopathol. 1998; 19 (5): 395-7.
53- Saegrov S, Halding AG. What is it like living with the diagnosis of cancer?. Eur J
Cancer Care. 2004; 13 (2): 145-53.
54- Stewart CJ, Coldewey J, Stewart IS. Comparison of fine needle aspiration cytology
and needle core biopsy in the diagnosis of radiologically detected abdominal lesions. J
Clin Oncol. 2002; 55 (2): 93-7.
55- Mayall F, Dray M, Stanley D, Harrison B, Allen R. Immunoflow cytometry and cell
block immunohistochemistry in the FNA diagnosis of lymphoma: a review of 73
consecutive cases. J Clin Pathol. 2000; 53 (6): 451-7.
56- Fröstad B, Martinsson T, Tani E, Falkmer U, Darnfors C, Skoog L, et al. The use of
fine needle aspiration cytology in the molecular characterization of neuroblastoma in
children. Cancer. 1999; 87 (2): 60-8.
57- de Boer WB, Segal A, Frost FA, Sterrett GF. Can CD34 discriminate between
benign and malignant hepatocytic lesions in fine needle aspirates and thin core
biopsies? Cancer. 2000; 90 (5): 273-8.
58- Wu M, Szporn AH, Zhang D, Wasserman P, Gan L, Miller L, et al. Cytology
applications of p63 and TTF-1 immunostaining im differencial diagnosis of lung
cancers. Diagn Cytopathol. 2005; 33 (4): 223-7.
59- Varadarajulu S, Eloubeidi M. Can endoscopic ultrasonography-guided fine needle
aspiration predict response to chemoradiation in non-small cell lung cancer? A pilot
study. Respiration. 2006; 73 (2): 213-20.
60- Kulkarni MB, Prabhudesai NM, Desai SB, Borges AM. Scrape cell-block technique
for needle aspiration cytology smears. Cytopathology. 2000; 11 (3): 179-84.
61- Hudock JA, Hanau CA, Christen R, Bibbo M. Expression of estrogen and
progesterone receptors in cytologic specimens using various fixatives. Diag Cytopathol.
1996; 15 (1): 78-83.
26
62- Liu J, Farhood A. Immunostaining for thyroid transcription factor-1 on fine-needle
aspiration specimens of lung tumors: a comparison of direct smears and cell-block
preparations. Cancer. 2004; 102 (2): 109-14.
63- Levine PH, Joutovsky A, Cangiarella J, Yee H, Simsir A. CDX-2 expression in
pulmonary fine-needle aspiration specimens: a useful adjunt for the diagnosis of
metastatic colorectal adenocarcinoma. Diagn Cytopathol. 2006; 34 (3): 191-5.
64- Lee BH, Hecht JL, Pinkus JL, Pinkus GS. WT1, estrogen receptor, and progesterone
receptor as markers for breast or ovarian primary sites in metastatic adenocarcinoma to
body fluids. Am J Clin Pathol. 2002; 117 (5): 745-50.
65- Briffod M, Hacene K, Le Doussal V. Immunohistochemistry on cell blocks from
fine-needle cytopunctures of primary breast carcinomas and lymph node metastases.
Mod Pathol. 2000; 13 (8): 841-50.
66- Mayall F, Chang B, Darlington A. A Review of 50 consecutive cytology cell block
preparations in a large general hospital. J Clin Pathol. 1998; 50 (12): 985-90.
67- Vesoulis Z, Rajappannair L, Define L, Beach J, Schnell B, Myers S. Quantitative
image analysis of estrogen receptor in breast fine needle aspiration biopsies. Anal Quant
Cytol Histol. 2004; 26 (6): 323-30.
68- Briffod M, Le Doussal V, Spyratos F. Immunohistochemical determination of
hormonal receptors on cell-block from fine-needle cytopunctures of breast carcinoma.
Bull Cancer. 2001; 88 (10): 1028-35.
69- Masood S. Expanding role of breast cytopathology as a risk predictor. Adv Anat
Pathol. 2001; 8 (5): 255-63.
27
234
234234
2345
55
5
*
**
*
$65
$65$65
$65
28
Receptores hormonais e Her-2/neu em câncer de
mama.
Estudo comparativo por imunoistoquímica entre citoinclusão e
espécime cirúrgico*.
Solange Peron Bueno, MD
1
Rosa Marlene Viero, MD
2
Cleverson Teixeira Soares, MD
3
1- Pós-Graduanda. Curso de Pós-Graduação em Patologia- Faculdade de Medicina de
Botucatu- UNESP- Botucatu, São Paulo- Brasil.
2- Professor Assistente Doutor- Departamento de Patologia- Faculdade de Medicina de
Botucatu- UNESP- Botucatu, São Paulo- Brasil.
3- Patologista e Doutor em Patologia- Departamento de Anatomia Patológica do
“Instituto Lauro de Souza Lima” - Bauru, São Paulo-Brasil.
Palavras chave: Carcinoma mamário, Citoinclusão, Receptores Hormonais, Her-2/neu.
* Trabalho apresentado de acordo com as normas da revista Diagnostic Cytopathology
ISSN: 8755-1039
Endereço para correspondência:
Rosa M. Viero, M.D.
Departamento de Patologia - Faculdade de Medicina de Botucatu-UNESP
18.618-000- Botucatu- SP
Telefone: (14) 3811-6238
Fax: (14) 3815-2348
e-mail: viero@fmb.unesp.br
29
RESUMO
Foram selecionados 62 casos de carcinoma de mama, diagnosticados por
punção aspirativa por agulha fina (PAAF), com confirmação pelo espécime cirúrgico.
Citoinclusão e espécime cirúrgico foram submetidos à reação imunoistoquímica (IQ)
para receptor de estrógeno (RE), de progesterona (RP) e proteína Her-2/neu.
Consideraram-se positivos para RE e RP, casos com 1% ou mais de células coradas.
Positividade para Her-2/neu foi avaliada numa escala de 0 a 3+. O índice de
concordância entre citoinclusão e espécime cirúrgico variou de 90 a 94%.
Sensibilidade, especificidade, valores preditivo positivo (VPP) e negativo (VPN) e
acurácia da citoinclusão na pesquisa para os RE e RP e proteína Her-2/neu (3+) foram
respectivamente: RE (92,7%; 85,7%; 92,7%; 85,7% e 90,3%), RP (92,7%; 94,7%;
97,4%; 87,0% e 93,5%) e Her-2/neu (70,0%; 100,0%; 100,0%; 94,5% e 95,2%). A
citoinclusão apresenta excelente correlação com o espécime cirúrgico na pesquisa por
IQ dos receptores hormonais e da proteína Her-2/neu.
30
ABSTRACT
It was selected 62 cases of breast carcinoma, diagnosed by fine needle
aspiration (FNA), with confirmation by surgical specimen. Cell-block and surgical
specimen were submitted to immunohistochemistry (IHC) reaction, for estrogen
receptor (ER), progesterone receptor (PR) and Her-2/neu protein. Cases with 1% or
more cells stained were considered positive for ER and PR. Her-2/neu Positivity was
evaluated by a score from 0 to 3+.
The concordance index between cell-block and surgical specimen had a
variation of 90 to 94%. Sensibility, specificity, predictive positive and negative values
and accuracy for ER, PR and Her-2/neu protein, was respectively: ER (92,7%; 85,7%;
92,7%; 85,7% and 90,3%), PR (92,7%; 94,7%; 97,4%; 87,0% and 93,5%) and Her-
2/neu (70,0%; 100,0%; 100,0%; 94,5% and 95,2%).
Cell-block shows excellent correlation with surgical specimen in assessment of
hormonal receptors and Her-2/neu protein, by IHC.
31
INTRODUÇÃO
O câncer de mama é a causa mais freqüente de morte por neoplasia em
mulheres, principalmente entre 40 e 55 anos
1,2
. Ao longo de trinta anos houve aumento
da incidência, sendo 33% na última década. O aumento da incidência é atribuído, entre
outros fatores, ao envelhecimento global da população, em países desenvolvidos e em
desenvolvimento
3
. Sua etiologia é complexa, multifatorial e envolve fatores genéticos,
hormonais e ambientais. Os fatores hormonais têm papel fundamental, sendo a
exposição endógena ou exógena ao estrógeno e progesterona, o principal estímulo para
a atividade mitótica do parênquima mamário
4
.
Os principais fatores preditivos e prognósticos do câncer de mama, avaliados
por testes moleculares e IQ, são os oncogenes BRCA1 e 2, Her-2/neu, tp53, os
receptores de estrógeno e progesterona e o índice de proliferação celular
5
.O gene Her-
2/neu, um proto-oncogene localizado no cromossomo 17q21, é importante fator
preditivo e prognóstico, no câncer de mama
6,7,8
Em 92% dos casos, a expressão
aumentada da proteína Her-2/neu é atribuída à amplificação do gene Her-2/neu e está
associada à maior agressividade e atividade metastática da neoplasia
7,9
. A importância
da detecção do complexo Her-2/neu está em identificar as pacientes com menor tempo
de sobrevida, geralmente portadoras de tumores invasivos
10
e que apresentam
resistência a certos quimioterápicos, como a ciclofosfamida, o metotrexate e o 5 –
fluorouracil
8
. Esses casos, em geral, de pior prognóstico, constituem 25 a 30% dos
casos de câncer de mama
11
. O Her-2/neu indica, também, casos sensíveis ao
tratamento com o trastuzumab, anticorpo monoclonal contra o domínio extra–celular
do Her-2/neu, que aumenta a sensibilidade à quimioterapia em pacientes com doença
metastática
7
. A proteína do Her-2/neu pode ser pesquisada através de métodos de
biologia molecular, como reação em cadeia da polimerase ou por hibridização in situ
com fluorescência e por IQ
9,12,13
. Aproximadamente 50% dos tumores positivos para
Her2-neu são positivos para RE. Esses tumores são freqüentemente resistentes à
hormonioterapia. O RP, similarmente ao RE, é indicador de boa resposta à
endocrinoterapia
11,14
. Em geral, 50% dos tumores positivos para o RE são positivos
para o RP e destes, cerca de 75% são sensíveis à terapia hormonal
15
.
A PAAF tem se mostrado excelente método para o diagnóstico do câncer de
mama. É procedimento simples, rápido, de menor custo e pouco invasivo
16
. Apresenta
32
acurácia semelhante ao material obtido por biópsia percutânea, quando há correlação
entre os achados clínicos, exames de imagem e citológicos. O método permite maior
agilidade no acompanhamento dos pacientes
17
e diminuição do estresse experimentado
no período entre a suspeita e confirmação do diagnóstico
18
. Estudos mostram que a
PAAF é mais sensível e oferece diagnóstico mais rápido que as biópsias por agulha
grossa
19
. Várias publicações mostram que a PAAF fornece subsídios, não apenas
morfológicos, podendo-se utilizar o material para estudo por IQ, citometria de fluxo ou
técnicas de biologia molecular
17,20
. A obtenção de material para citoinclusões através
da PAAF tem importância no diagnóstico das lesões de mama, permitindo a
identificação de padrões histológicos e diminuindo o número de casos com diagnóstico
indefinido. Além disso, podem ser utilizadas na realização das técnicas
complementares. O material é fácil de ser estocado e permite a obtenção de múltiplos
cortes, podendo-se pesquisar um amplo painel de anticorpos
19,20
. A pesquisa do RE,
através de IQ em material de citoinclusão, tem demonstrado uma correlação favorável,
quando comparada ao material da peça cirúrgica
21
.
Realizamos, no presente trabalho,estudo comparativo com marcadores para RE,
RP e Her-2/neu, através de IQ, em material de citoinclusão e em espécimes cirúrgicos
de carcinoma de mama, com objetivo de identificar a confiabilidade do método.
33
CASUÍSTICA E MÉTODOS
Seleção dos Casos
Foram avaliados 126 casos com diagnóstico de carcinoma de mama por PAAF,
que possuíam citoinclusão, no período de janeiro de 1999 a janeiro de 2006. Destes,
selecionaram-se 62 casos, após a exclusão dos casos de pacientes submetidas à
quimioterapia prévia, material de citoinclusão insuficiente ou sem comprovação
histológica de carcinoma. O material foi obtido dos arquivos do Instituto de Patologia
de Bauru-SP e cedido sem dados que permitissem a identificação das pacientes. Foram
incluídos casos de lesões palpáveis e não palpáveis, com exames de mamografia e ultra-
sonografia. As lesões não-palpáveis foram puncionadas por orientação
ultrassonográfica. Todos os casos foram puncionados por patologistas, com esfregaços
corados por Giemsa e HE. Dados como sexo, idade, mama e quadrantes acometidos,
tamanho do tumor, acometimento de linfonodos e estadiamento patológico foram
obtidos através dos laudos. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Faculdade de Medicina de Botucatu-UNESP-SP (OF.563/2004-CEP).
Seleção das lâminas e blocos de parafina
Os 62 casos selecionados apresentavam esfregaços corados por HE e Giemsa, e
cortes histológicos de material de citoinclusão e do espécime cirúrgico. Foram
considerados suficientes os cortes de citoinclusão que apresentavam pelo menos dez
campos de grande aumento preenchidos por células junto a elementos do sangue
periférico. Foram selecionados, de cada caso, duas lâminas de PAAF, uma corada por
HE e outra por Giemsa, uma lâmina e um bloco do material de citoinclusão e uma
lâmina e um bloco representativos da lesão do espécime cirúrgico. Foram, então,
realizados cortes histológicos com 4m de espessura dos blocos em parafina e
procedeu-se às colorações por HE para avaliação dos dados morfológicos e IQ para
pesquisa de RE, RP e da proteína Her2/ neu (Fig. 1).
34
Preparação prévia do material de citoinclusão e dos esfregaços
As PAAF foram realizadas utilizando-se agulha de calibre 25 x 6 mm. O
material foi, em parte, colocado sobre as lâminas para realização dos esfregaços e o que
restou no bulbo da agulha e no interior da seringa, foi processado para citoinclusão. Em
nenhum caso, realizou-se o ato da PAAF para a obtenção exclusiva do material para
citoinclusão. Foram realizados,em geral, de 2 a 6 esfregaços, metade corados por HE e
metade por Giemsa. Os esfregaços para HE foram fixados em álcool 95% e para
Giemsa a seco, em temperatura ambiente. O material de citoinclusão foi fixado,
primeiramente, com aspiração de 1,0 ml de álcool 95 %, seguido, imediatamente, por
aspiração de 5,0 ml de solução de formalina 10% tamponada, permanecendo em fixação
por um período de 6 a 24 horas (Fig. 2). Posteriormente, foi submetido a processamento
histológico com cortes em parafina para colorações por HE e IQ.
Reação de Imunoistoquímica
A reação de IQ foi realizada segundo protocolos internacionais
22
, pelo método
indireto streptavidina-biotina peroxidase (LSAB – Dako, CA/USA), para pesquisa do
RE (anticorpo monoclonal anti-humano, clone 1D5, 1/200 – Dako, CA/USA), RP
(anticorpo monoclonal anti-humano, clone PgR 636, 1/300 - Dako,CA/USA) e Her-
2/neu (anticorpo policlonal, 1/300- Dako,CA/USA), utilizando-se o anticorpo isolado,
em lâminas separadas, nas diluições especificadas. As lâminas foram incubadas em três
banhos de xilol (Synth,Diadema/SP, Brasil), de cinco minutos cada. Posteriormente,
foram incubadas em solução de peróxido de hidrogênio 1,5 % em álcool metilíco
absoluto por 20 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas por 10
minutos em água destilada, sendo então, realizada a reativação antigênica, utilizando-se
tampão citrato (pH: 6,0). As amostras foram, então, resfriadas e lavadas em tampão
fosfato (pH: 7,6) por 10 minutos, em temperatura ambiente. Em seguida, os cortes
foram recobertos pelo anticorpo primário anti-estrógeno, anti-progesterona e anti-Her-
2/neu, previamente diluídos em tampão TRIS-HCL (pH:7.6). As amostras foram então
levadas para uma câmara úmida, à temperatura de 36-37
o
C, por uma hora. A seguir,
foram lavadas em tampão fosfato, dois banhos por 5 minutos. Após a lavagem, as
amostras foram incubadas com anticorpos secundários IgG/IgM biotinilado
35
(Dako,CA/USA), em câmara úmida por 25 minutos, à temperatura ambiente.
Novamente, as amostras foram lavadas por 5 minutos, em dois banhos com tampão
fosfato com pH 7,6 e incubadas com conjugado streptavidina-biotina peroxidase
(Dako,CA/USA) por 25 minutos, à temperatura ambiente. Foram novamente lavadas em
tampão fosfato, dois banhos por 5 minutos à temperatura ambiente. A revelação
colorimétrica foi realizada com diaminobenzidina e peróxido de hidrogênio como
substrato (Dako, CA/USA). As lâminas foram contra coradas com hematoxilina (Merck
KgaA, Darmstadt, Germany) e montadas com lamínulas e entelan (Merck KgaA,
Darmstadt, Germany). O controle positivo foi mama normal adjacente ao tumor na peça
cirúrgica para RE e RP e casos positivos para Her-2/neu, classificados nos escores
0,1+,2+ e 3+
23
. Controles negativos e positivos externos de material de carcinoma de
mama, conhecidamente negativos e positivos, foram realizados.
Análise Morfológica
Os casos foram analisados conjuntamente por três patologistas, sem
conhecimento prévio do diagnóstico, e os resultados anotados após consenso entre os
mesmos. A análise morfológica foi realizada através de microscópio óptico (Nikon-
eclipse-50i). Para cada lâmina, foi realizada a leitura de 10 campos em aumento de 400x
(campos de 0,152 mm
2
), tanto nos esfregaços, como nas lâminas de citoinclusão e do
espécime cirúrgico. As lâminas foram analisadas separadamente, de forma a não se
identificar a correspondência entre as lâminas de esfregaços, de citoinclusão e do
espécime cirúrgico de um mesmo caso ou entre os mesmos. Foi realizada a classificação
dos carcinomas de acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS)
24
.
Análise Imunoistoquímica
Foi realizada análise comparativa dos RE e RP na citoinclusão e no espécime
cirúrgico. Foram considerados positivos, os casos que apresentavam grau de
positividade nuclear maior que 1%, de acordo com a literatura
15
(Figs. 3 e 4). Foram
utilizados controles externos e internos, como parâmetros para a reação. Os controles
internos foram representados por glândulas mamárias não tumorais, adjacente à área
neoplásica.
36
Posteriormente, foi realizada a pesquisa para Her-2/neu na forma de anticorpo
isolado, utilizando-se a escala de graduação semiquantitativa, semelhante à padronizada
para o Herceptest (Dako, CA/USA)
25
. A reação cromogênica foi semi-quantificada de 0
a 3+: 0 = ausência de coloração ou < 10% das células tumorais; 1+ = coloração parcial
da membrana celular > 10% das células; 2+ = coloração fraca da membrana > 10% das
células; 3+ = forte coloração da membrana > 10% do tumor (Figs. 3 e 4)
23
. Foram
comparados os padrões obtidos na citoinclusão e espécime cirúrgico.
Análise Estatística
Os dados foram armazenados em um banco de dados do software Excel,
pertencente ao Windows XP®. Para a análise dos resultados da reação de IQ, foram
utilizados os cálculos para sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP),
valor preditivo negativo (VPN) e acurácia. Os cálculos foram realizados separadamente,
para RE, RP e Her-2/neu. A peça cirúrgica foi considerada como padrão-ouro. Os dados
foram expressos em percentagem.
37
RESULTADOS
Prevaleceram as pacientes do sexo feminino (98,4%) com idade variando de 38
a 85 anos (média 58,6 ± 12,7). A mama direita foi acometida em 51,6%, a esquerda em
46,8% e bilateralmente em 1,6%. O quadrante súpero-externo foi o mais acometido
(42,2%), seguido pelo súpero-interno (22,7%). A presença de neoplasia na transição dos
quadrantes ocorreu em 22,6% dos casos. As localizações menos freqüentes foram a
retroareolar (4,8%), o quadrante ínfero-externo (3,2%) e o ínfero-interno (3,2%). Em
um dos casos (1,6%), houve acometimento extenso da mama, abrangendo todos os
quadrantes.
Os carcinomas mediram em média 32,4mm. Foram classificadas de acordo com
a OMS como carcinoma ductal sem outras especificações em 72,6% dos casos, dos
quais 45,2% foram grau I, 35,5% grau II e 19,3% grau III, segundo a graduação de
Scaff-Bloom & Richardson, modificada por Elston e Ellis
24
. Dois carcinomas foram
lobulares, sendo um clássico e outro pleomórfico. Os carcinomas ductais especiais
foram 07 casos (11,3%), sendo 02 apócrinos, 01 cribriforme, 01 pleomórfico, 01 com
diferenciação neuroendócrina, 01 com células em anel de sinete e 01 com produção de
muco. Os demais foram: 03 colóides, 01 tubular, 01 medular, 01 neuroendócrino, 01
papilífero e 01 metaplásico com diferenciação condróide.
Quanto ao estadiamento patológico, 27,4% foram classificados como pT1,
54,9% como pT2, 4,8% como pT3 e 12,9% como pT4. O comprometimento dos
linfonodos caracterizou-se como pN0 em 41,9%, como pN1 em 37,1% dos casos, pN2
em 11,3% e nenhum caso como pN3 ou pN4. Observaram-se ainda, 9,7% em pNx, onde
o comprometimento linfonodal não pôde ser avaliado. Observou-se a ocorrência de
micrometástase em apenas um dos casos (pN0mi).
No material de citoinclusão, 66,1% dos casos foram positivos para receptor de
estrógeno, 62,9% para receptor de progesterona e 11,3% de casos positivos para Her-
2/neu. No espécime cirúrgico, houve positividade de 66,1% tanto para RE quanto para
RP e 16,1% para Her-2/neu. A positividade concomitante para RE e RP foi observada
em 61,3% e 62,9% das citoinclusões e espécimes cirúrgicos, respectivamente. A
positividade concomitante para RE e Her-2/neu foi de 42,9% e 40,0% pela citoinclusão
e espécime cirúrgico, respectivamente.
38
Os casos compostos por verdadeiro-positivos para RE foram 61,3%, ou seja,
ambos citoinclusão e espécime cirúrgico foram positivos. Em 29,0%, a citoinclusão e o
espécime cirúrgico foram negativos para RE, caracterizando o grupo de verdadeiro-
negativos. O grupo de falso-negativos, no qual se observaram citoinclusão negativa e
espécime cirúrgico positivo, totalizaram em 4,9%. Em 4,8% dos casos, observaram-se
citoinclusão positiva e espécime cirúrgico negativo, caracterizando os casos falso-
positivos. Em 90,3% dos casos houve concordância nas interpretações da reação de IQ
para RE, entre citoinclusão e espécime cirúrgico. Em 9,7% houve discordância, tanto da
positividade quanto da negatividade, para o RE (Tabela I).
A sensibilidade foi de 92,7%, especificidade de 85,7%, VPP de 92,7%, VPN de
85,7% e acurácia de 90,3% (Tabela II).
Na análise do RP, observaram-se 61,3% de verdadeiro-positivos, 32,3% de
verdadeiro-negativos, 4,8% de falso-negativos e 1,6% de falso-positivos. Notou-se
concordância de interpretação em um total de 93,5% dos casos e discordância em um
total de 6,5% (Tabela I). A sensibilidade de 92,7%, especificidade de 94,7%, VPP de
97,4%, VPN de 87,0% e acurácia de 93,5% (Tabela II).
A reação para o marcador Her-2/neu, considerando-se somente a marcação 3+,
revelou 83,9% de verdadeiro-negativos, 11,3% de verdadeiro-positivos, 4,8% de falso-
negativos e nenhum caso falso-positivo. Ou seja, em 95,2% houve concordância e em
4,8% houve discordância na interpretação. (Tabela I).
A sensibilidade foi de 70,0%, especificidade de 100,0%, VPP de 100,0%, VPN
de 94,5% e acurácia de 95,2% (Tabela II).
Quando consideramos a escala de positividade de 0 a 3+, observamos que a
soma dos casos de escore 2+ e 3+, resultou em 19 casos (30,7%) positivos na
citoinclusão e 15(24,2%) no espécime cirúrgico. Em relação à soma dos casos 0 e 1+ ,
foram 43 (69,3%) na citoinclusão e 47(75,8%) no espécime cirúrgico (Tabela III).
Nenhum caso com escore 0 na citoinclusão, recebeu escore 2+ ou 3+ no espécime
cirúrgico. Aqueles com escore 3+ na citoinclusão, também foram 3+ no espécime. Dos
26 casos que receberam escore 1+ na citoinclusão, 21(80,8%) receberam escore 0 ou 1+
no espécime cirúrgico. Dos 12 casos que receberam escore 2+ na citoinclusão, 9
39
(75,0%) receberam escore 0 ou 1+ e 3 (25,0%) receberam escore 2+ ou 3+ no espécime
cirúrgico (Tabela IV).
40
Tabela I. Porcentagens de verdadeiro-positivos, verdadeiro-negativos, falso-positivos e
falso-negativos entre citoinclusão e espécime cirúrgico.
Verdadeiro-positivos
Verdadeiro-negativos
Falso-positivos
Falso-negativos
RE 61,3 29,0 4,8 4,9
RP 61,3 32,3 1,6 4,8
Her-2/neu(3+)
11,3 83,9 0,0 4,8
Os valores especificados estão em porcentagem.
41
Tabela II. Valores da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor
preditivo negativo e acurácia da citoinclusão para a pesquisa de receptor de estrógeno,
receptor de progesterona e Her-2/neu (3+).
RE RP Her-2/neu(3+)
Sensibilidade 92,7 92,7 70,0
Especificidade 85,7 94,7 100,0
VPP 92,7 97,4 100,0
VPN 85,7 87,0 94,5
Acurácia 90,3 93,5 95,2
VPP, valor preditivo positivo; VPN, valor preditivo negativo; RE, receptor de
estrógeno; RP, receptor de progesterona. Os valores especificados estão em
porcentagem.
42
Tabela III. Resultados da positividade para Her-2/neu por escore de 0 a 3+ na
citoinclusão e espécime cirúrgico
Escore Citoinclusão Espécime Cirúrgico
n (%) n (%)
0 + 17 (27,4) 25 (40,3)
1 + 26 (41,9) 22 (35,5)
2 + 12 (19,4) 05 (08,1)
3 + 07 (11,3) 10 (16,1)
43
Tabela IV. Comparação dos resultados do escore 0 - 3+ para Her-2/neu, entre
citoinclusão e espécime cirúrgico.
Citoinclusão Espécime cirúrgico n (%)
0 0 11 (64,7)
1+ 6 (35,3)
2+ 0 (0)
3+ 0 (0)
1+ 0 11 (42,3)
1+ 10 (38,5)
2+ 4 (15,3)
3+ 1 (3,9)
2+ 0 3 (25,0)
1+ 6 (50,0)
2+ 1 (8,3)
3+ 2 (16,7)
3+ 0 0 (0,0)
1+ 0 (0,0)
2+ 0 (0,0)
3+ 7 (100,0)
44
126 casos
com citoinclusão
62 casos selecionados
PAAF Espécime cirúrgico
Esfregaços Citoinclusão
Fig. 1. Representação do processo de seleção dos casos, blocos e lâminas.
Quimioterapia prévia
Ausência de biópsia
Material insuficiente
Giemsa
HE HE
Bloco
HE
Bloco
RP
RE
Her 2/neu
RP
RE
Her 2/neu
45
Fig. 2. (A) Seringa contendo material obtido através de punção aspirativa por agulha fina
(PAAF). Presença de coágulo coeso após aspiração de álcool 95% seguido por formalina
tamponada 10%. (B) Detalhe do coágulo.
A
B
46
Fig. 3. Expressão de receptor de estrógeno (RE) e proteína Her-2/neu em citoinclusão e
espécime cirúrgico de carcinoma ductal grau III. (A-1) Citoinclusão (HE, X 400). (A-2)
Citoinclusão negativa para RE, com controle interno positivo (IQ, X 400). (A-3) Citoinclusão
positiva para Her-2/neu (IQ, X 400.). (B-1) Espécime cirúrgico (HE, X 200). (B-2) Espécime
cirúrgico negativo para RE (IQ, X 200). (B-3) Espécime cirúrgico positivo para Her-2/neu (IQ, X
200).
A
-
1
A
-
2
A
-
3
B
-
1
B
-
2
B
-
3
47
A1
Fig.4. Expressão de receptor de progesterona (RP) e Her-2/neu em citoinclusão e espécime
cirúrgico de carcinoma ductal grau I. (A-1) Citoinclusão (HE, X 40). (A-2) Citoinclusão positiva
para RP (IQ, X 200). (A-3) Citoinclusão negativa para Her-2/neu (IQ, X 400). (B-1) Espécime
cirúrgico (HE, X 100). (B-2) Espécime cirúrgico positivo para RP (IQ, X 400). (B-3) Espécime
cirúrgico negativo para Her-2/neu (IQ, X 400).
A
-
1
A
-
2
A
-
3
B-1 B-2
B
-
3
48
DISCUSSÃO
A PAAF tem-se revelado um método simples, rápido, de baixo custo,e de grande
utilidade no diagnóstico das neoplasias mamárias
16
. E o aumento da sensibilidade dos
métodos radiológicos têm permitido o acesso a lesões cada vez menores, facilitando a
realização do procedimento com obtenção de material adequado para análise
26
. Por
outro lado, o material citológico permite estudos complementares com IQ, citometria de
fluxo e técnicas moleculares, fundamentais para o conhecimento do comportamento
biológico da neoplasia e decisivo na conduta clinica dos pacientes
17,20
. Os receptores de
estrógeno e progesterona, e a proteína Her-2/neu, são fatores prognósticos e preditivos
importantes para a conduta do carcinoma mamário
5
.
Desta forma, a punção aspirativa guiada pelos exames de imagem, com
utilização de técnicas complementares, possibilita rapidez no diagnóstico, instituição
precoce do tratamento, evitando-se procedimentos cirúrgicos desnecessários
17,27
. Neste
sentido, é necessária uma melhor orientação dos clinicos para esta conduta mais ágil, de
menor custo e menos traumática para a paciente portadora de câncer de mama.
A IQ para pesquisa de marcadores hormonais,com resultados confiáveis, pode
ser realizada em esfregaços, citocentrifugados ou na citoinclusão, que constitue material
aspirado incluído em parafina
28
.
A realização da IQ na citoinclusão, mostra resultados superiores, quando
comparada aos esfregaços,apresentando menor quantidade de artefatos, de casos falso-
positivos e com boa correlação com os achados do espécime cirúrgico
29,30
.
A verificação da positividade para RE e RP na citoinclusão, possibilita a
realização de quimioterapia neo-adjuvante com escolha adequada dos agentes
quimioterápicos, principalmente para pacientes com tumores em estadiamento mais
avançado, facilitando, posteriormente o procedimento cirúrgico e diminuindo seus
custos. E a pesquisa positiva para Her-2/neu na citoinclusão, permite a identificação
mais precoce de tumores de pior prognóstico, que apresentam resistência a alguns
quimioterápicos
31
.
No presente estudo, a PAAF proporcionou material suficiente para a realização
dos esfregaços e da citoinclusão, permitindo o diagnóstico da neoplasia e a pesquisa dos
49
marcadores hormonais e da proteína Her-2/neu. Em nenhum caso foi realizada PAAF
adicional para a confecção da citoinclusão, o que confirma a facilidade na obtenção de
material.
A citoinclusão de material aspirado de mama, pode ser obtida por diferentes
técnicas. Inicialmente o material é submetido à ação de soluções ou materiais que
promovam agregação celular, como agar, plasma-trombina e filtros de papel.
Posteriormente, é feita fixação com Bouin, ácido pícrico, soluções alcoólicas ou
formalina tamponada
32
. Neste estudo, observamos que a fixação direta com formalina a
10%, determinava dispersão do material, dificultando a formação do coágulo, inclusão e
processamento histológico. A aspiração de pequena quantidade de álcool 95%,
antecedendo à fixação com formalina, favorece a agregação do material e preserva as
características morfológicas das células neoplásicas. Os autores desconhecem relato de
técnica semelhante na literatura.
A análise do espécime cirúrgico mostrou 66,1% de positividade tanto para RE
como para RP, resultado este semelhante ao referido na literatura
14
. A concomitância de
positividade para os dois receptores, de 62,9%, está também de acordo com a literatura,
que relata cerca de 50% de concordância
15
.A concomitância de positividade para RE e
Her-2/neu, no espécime cirúrgico, foi de 40,0%. A literatura refere aproximadamente
50% de concomitância de positividade dos dois marcadores
11
.
Na citoinclusão, 66,1% dos casos foram positivos para RE e 62,9% para RP.
Positividade concomitante para os dois receptores foi de 61,3%. A concomitância de
positividade para RE e Her-2/neu, na citoinclusão, foi de 42,9%.
O marcador Her-2/neu foi positivo em 16,1% dos espécimes cirúrgicos,
positividade inferior à relatada pela maioria dos autores, em torno de 25 a 30%
11
. Esta
discordância pode ser explicada por termos considerado positivos apenas os casos com
escore 3+. Na citoinclusão a positividade também foi baixa, em 11,3% dos casos.
Há poucos estudos mostrando a expressão dos receptores hormonais e da
proteína Her-2/neu em material de citoinclusão. Seus resultados mostraram a utilidade
do método na pesquisa desses fatores prognósticos e na orientação da conduta clínica,
no câncer de mama
28,33
.
50
Neste estudo, a análise comparativa dos resultados do espécime cirúrgico e
citoinclusão, mostrou que os casos com escore 0 e 1+, que não se correlacionam com a
superexpressão do gene Her-2/neu, apresentaram valores aproximados entre a
citoinclusão e o espécime cirúrgico, de 69,3% e 75,8%, respectivamente (Tabela III). Os
casos com escore 0 na citoinclusão foram 0 ou 1+ no espécime cirúrgico. Somente um
caso com escore 1+ na citoinclusão foi 3+ no espécime cirúrgico. Observamos em
75,0% dos casos com positividade de 2+ na citoinclusão, considerada fracamente
positiva e necessitando de comprovação da superexpressão do gene Her-2/neu, escores
de 0 e 1+ no espécime cirúrgico (Tabela IV). Na literatura, a positividade de 2+ no
espécime cirúrgico, correlaciona-se entre 25 e 50% de positividade para o gene Her-
2/neu, detectado por hibridização in situ com fluorescência
24,34
. No presente estudo, a
baixa correlação de casos 2+ na citoinclusão (25,0%) com casos 2+ e 3+ no espécime
cirúrgico, mostrou que menos de 25% dos casos na citoinclusão apresentam
superexpressão do gene Her-2/neu. Estes resultados podem ser explicados,
provavelmente por antígenos ou moléculas de peroxidase aderidas na membrana das
células tumorais, melhor observados no material de citoinclusão, onde as células
encontram-se isoladas ou formando pequenos grupamentos, envolvidos por hemácias e
plasma. Todos os casos com positividade de 3+ na citoinclusão foram confirmados no
espécime cirúrgico. A positividade 3+ é considerada forte e correlaciona-se com a
comprovação da superexpressão do gene Her-2/neu em quase 100% dos casos
9.10,12
.
Estes dados refletem o fato de que o padrão 3+ é de fácil identificação, pois a marcação
é intensa e geralmente presente na maioria das células. Também, a especificidade para a
detecção do Her-2/neu com 3+ de 100,0%, mostra a grande confiabilidade do método
para conduzir o tratamento das pacientes.
Os marcadores com maior índice de verdadeiro-positivos foram os RE e RP,
ambos totalizando 61,3%. O marcador com menor índice foi a proteína Her-2/neu com
11,3% de verdadeiro-positivos. A proteína Her-2/neu obteve o maior índice de
verdadeiro-negativos com um total de 83,9%. O RP apresentou o segundo maior índice,
totalizando 32,3% e o RE o menor índice de 29,0%. Os dados apresentam boa
correlação com a literatura, quando se constata negatividade para a proteína Her-2/neu
na maioria dos casos positivos para os RE e RP
21
.
51
O RE mostrou sensibilidade de 92,7% e especificidade de 85,7%, VPP de
92,7%, VPN de 85,7% e acurácia de 90,3%. O RP mostrou sensibilidade de 92,7%,
especificidade de 94,7%, VPP de 97,4%, VPN de 87,0% e acurácia de 93,5%. A
proteína Her-2/neu revelou sensibilidade de 70,0%, especificidade de 100,0%, VPP de
100,0%, VPN de 94,5% e acurácia de 95,2%. Portanto a citoinclusão apresentou alta
sensibilidade na pesquisa dos receptores de estrógeno e progesterona. A facilidade na
interpretação de positividade, que considera positivo se 1% ou mais dos núcleos estão
corados, poderia explicar estes altos índices. A sensibilidade da citoinclusão na pesquisa
da proteína Her-2/neu foi moderada, de 70,0% quando consideramos positivos somente
os casos de escore 3+.
Em resumo, este estudo revelou alta correlação entre a citoinclusão e o espécime
cirúrgico na pesquisa por IQ do receptor de estrógeno, receptor de progesterona e da
proteína Her-2/neu, em carcinoma de mama. O método é confiável e pode ser utilizado
para a triagem de pacientes candidatas à quimioterapia neo-adjuvante e avaliação dos
fatores preditivos e prognósticos relacionados a estes marcadores.
52
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1- Pöhls UG, Renner SP, Fasching, PA, Lux MP, Kreis H, Ackermann S, et al.
Awareness of breast cancer incidence and risk factors among healthy women. Eur J
Can Prev. 2004; 13 (4): 249-56.
2- Benshushan A, Brzezinski A. Hormonal manipulations and breast cancer.
ObstetGynaecol Surv. 2002; 57 (5): 314-23.
3- Pecorelli S, Favalli G, Zigliani L, Odicino, F. Cancer in woman. Int J Gynaecol.
2003; 82 (3): 369-79.
4- Key TJ, Verkasalo PK, Banks E. Epidemiology of breast cancer. Lancet Oncol. 2001;
2 (3): 133-40.
5- Domchek SM, Weber BL. Recent advances in breast cancer biology. Curr Opin
Oncol. 2002; 14 (6): 589-93.
6- Walker RA. The significance of histological determination of HER-2 status in breast
cancer. Breast. 2000; 9 (3): 130-3.
7- Rubin I, Yarden Y. The basic biology of HER2. Ann Oncol. 2001; 12 (1): S3-8.
8- Bozzetti C, Musolino A, Camisa R, Bisagni G, Flora M, Bassano C, et al. Evaluation
of Her2/neu amplification and other biological markers as predictors of response to
neoadjuvant anthracycline based chemotherapy in primary breast cancer. The role of
anthracycline dose intensity. Am J Clin Oncol. 2006; 29 (2): 171-7.
9- Masood S, Bui MM. Prognostic and predictive value of HER2/neu oncogene in
breast cancer. Microsc Res Tech. 2002; 59 (2): 102-8.
10- Falo C, Moreno A, Lloveras B, Figueras A, Varela M, Escobedo A .Algorithm for
the diagnosis of Her2/neu status in breast-infiltrating carcinomas. Am J Clin Oncol.
2003; 26 (5): 465-70.
53
11- Nahleh ZA, Jazieh AR. Multitargeted therapy in estrogen receptor- positive human
epidermal growth factor receptor-2 positive breast cancer. Am J Clin Oncol. 2005;
28 (6): 631-3.
12- Vera-Roman JM, Rubio-Martinez LA. Comparative assays for the Her2/neu
oncogene status in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 2004; 128 (6): 627-33.
13- Hayes D, Thor AD. C-erb-2 in breast cancer: development of a clinically useful
marker. Semin Oncol. 2002; 29 (3): 231-45.
14- Keen JC, Davidson NE. The biology of breast carcinoma. Cancer. 2003; 97 (3):
825-33.
15- Yamashita H, Yando Y, Nishio M, Zhang Z, Hamaguchi M, Mita K, et al.
Immunohistochemical evaluation of hormone receptor status for predicting response to
endocrine therapy in metastatic breast cancer. Breast Cancer. 2006; 13 (1): 74-83.
16- Vargas HI, Masood S. Implementation of a minimally invasive breast biopsy
program in countries with limited resources. Breast J. 2003; 9 (2): S81-5.
17- Schmitt FC, Soares R, Cirnes L, Seruca R. PCR amplication of DNA obtained from
archived hematoxylin-eosin- and giemsa-stained breast cancer aspirates. Diagn
Cytopathol. 1998; 19 (5): 395-7.
18- Saegrov S, Halding AG. What is it like living with the diagnosis of cancer?. Eur J
Cancer Care. 2004; 13 (2): 145-53.
19- Stewart CJ, Coldewey J, Stewart IS. Comparison of fine needle aspiration cytology
and needle core biopsy in the diagnosis of radiologically detected abdominal lesions. J
Clin Oncol. 2002; 55 (2): 93-7.
20- Mayall F, Dray M, Stanley D, Harrison B, Allen R. Immunoflow cytometry and cell
block immunohistochemistry in the FNA diagnosis of lymphoma: a review of 73
consecutive cases. J Clin Pathol. 2000; 53 (6): 451-7.
21- Jayaram G, Elysayed EM. Cytologic evaluation of prognostic markers in breast
carcinoma. Acta Cytol. 2005; 49 (6): 605-10.
54
22- Dabbs DJ. Diagnostic Immunohistochemistry of Breast. In: Dabbs DJ, editor.
Diagnostic Immunohistochemistry. New York: Churchill Livinstone; 2002. p. 536-58.
23- Rosai J. Breast. In: Rosai J, editor. Surgical Pathology. St Louis: Mosby; 2004. p.
1763-876.
24- Ellis IO, Schnitt SJ, Sastre –Garau X, Bussolati G, Tavassoli FA, Eusebi V, et al.
Tumors of the breast. In: Tavassoli FA, Devilee P, editors. Tumors of breast and female
genital organs. Lyon: IARCPress; 2003. p. 9-112.
25- Oliveira MA, Santos GS, Kanamura CT, Alves VAF. Immunoexpression of Her-2
protein in fine-needle aspirates of breast carcinoma:correlation with surgical specimens.
Rev Bras Ginecol Obst. 2003; 25 (1): 23-8.
26- Carlson RW, Anderson BO, Chopra R, Eniu AE, Jakesz R, Love RR, et al.
Treatment of breast cancer in countries with limited resources. Breast J. 2003; 9 (2):
S67-4.
27- Annema JT, Versteegh MI, Veselic M, Voight P, Rabe KF. Endoscopic ultrassound-
guided fine needle aspiration in the diagnosis and staning of lung cancer and its impact
on surgical staging. J Clin Oncol. 2005; 23 (33): 8283-5.
28- Briffod M, Hacene K, Le Doussal V. Immunohistochemistry on cell blocks from
fine-needle cytopunctures of primary breast carcinomas and lymph node metastases.
Mod Pathol. 2000; 13 (8): 841-50.
29- Wu M, Szporn AH, Zhang D, Wasserman P, Gan L, Miller L, et al. Cytology
applications of p63 and TTF-1 immunostaining im differencial diagnosis of lung
cancers. Diagn Cytopathol. 2005; 33 (4): 223-7.
30- Liu J, Farhood A. Immunostaining for thyroid transcription factor-1 on fine-needle
aspiration specimens of lung tumors: a comparison of direct smears and cell-block
preparations. Cancer. 2004; 102 (2): 109-14.
31- Varadarajulu S, Eloubeidi M. Can endoscopic ultrasonography-guided fine needle
aspiration predict response to chemoradiation in non-small cell lung cancer? A pilot
study. Respiration. 2006; 73 (2): 213-20.
55
32- Bales EC. Laboratory techniques. In: Koss LG, editor. Diagnostic cytology and its
histopathologic bases. Philadelphia: Lippincott Willians & Wilkins; 2005. p. 1569-634.
33- Briffod M, Le Doussal V, Spyratos F. Immunohistochemical determination of
hormonal receptors on cell-block from fine-needle cytopunctures of breast carcinoma.
Bull Cancer. 2001; 88 (10): 1028-35.
34- Euhus DM. Breast cancer prevention in the 21
st
century: defining the challenge.
Breast J. 2006; 12 (2): 97-8.
56
*7/-
*7/-*7/-
*7/-
57
Anexo 1 - Cálculos da sensibilidade e especificidade
ESPÉCIME
CIRÚRGICO
+ -
+
VERDADEIRO
POSITIVO
a
FALSO
POSITIVO
b
TOTAL DE
POSITIVOS
(a+b)
CITOINCLUSÃO
-
FALSO
NEGATIVO
c
VERDADEIRO
NEGATIVO
d
TOTAL DE
NEGATIVOS
(c+d)
TOTAL
PRESENÇA DE POSITIVIDADE
(a+c)
AUSÊNCIA DE POSITIVIDADE
(b+d)
TOTAL DE CASOS
(a+b+c+d)
Sensibilidade =
( )
ca
a
+
Especificidade =
( )
db
d
+
58
Anexo 2 - Cálculos dos valores preditivo positivo e negativo
ESPÉCIME
CIRÚRGICO
+ -
+
VERDADEIRO
POSITIVO
a
FALSO
POSITIVO
b
TOTAL DE
POSITIVOS
(a+b)
CITOINCLUSÃO
-
FALSO
NEGATIVO
c
VERDADEIRO
NEGATIVO
d
TOTAL DE
NEGATIVOS
(c+d)
TOTAL
PRESENÇA DE POSITIVIDADE
(a+c)
AUSÊNCIA DE POSITIVIDADE
(b+d)
TOTAL DE CASOS
(a+b+c+d)
Valor Preditivo Positivo =
( )
ba
a
+
Valor Preditivo Negativo =
)( dc
d
+
59
Anexo 3 - Cálculo da acurácia
ESPÉCIME CIRÚRGICO
+ -
+
VERDADEIRO
POSITIVO
a
FALSO
POSITIVO
b
TOTAL DE
POSITIVOS
(a+b)
CITOINCLUSÃO
-
FALSO
NEGATIVO
c
VERDADEIRO
NEGATIVO
d
TOTAL DE
NEGATIVOS
(c+d)
TOTAL
PRESENÇA DE POSITIVIDADE
(a+c)
AUSÊNCIA DE POSITIVIDADE
(b+d)
TOTAL DE CASOS
(a+b+c+d)
Acurácia =
(
)
( )
dcba
da
+++
+
60
Anexo 4 – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
