( PDF ) Alterações cromossômicas em células uroteliais esfoliadas de pacientes com história de carcinoma de cálulas transicionais

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA

CAMPUS DE BOTUCATU

ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS EM CÉLULAS UROTELIAIS

ESFOLIADAS DE PACIENTES COM HISTÓRIA DE

CARCINOMA DE CÉLULAS TRANSICIONAIS

JOÃO PAULO DE CASTRO MARCONDES

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Patologia da Faculdade de

Medicina de Botucatu, Universidade

Estadual Paulista – UNESP, para obtenção do

título de Mestre em Patologia

BOTUCATU – SP

2007

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA

CAMPUS DE BOTUCATU

ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS EM CÉLULAS UROTELIAIS

ESFOLIADAS DE PACIENTES COM HISTÓRIA DE

CARCINOMA DE CÉLULAS TRANSICIONAIS

Mestrando: João Paulo De Castro Marcondes

Orientadora: Dra. Maria Luiza Cotrim Sartor De Oliveira

Co-orientadora: Dra. Daisy Maria Favero Salvadori

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Patologia da Faculdade de

Medicina de Botucatu, Universidade

Estadual Paulista – UNESP, para obtenção do

título de Mestre em Patologia

BOTUCATU – SP

2007

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais Elisa e Joaquim por estarem sempre presentes em minha vida e por me

darem forças para enfrentar com coragem e dignidade todas as dificuldades.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

À Dra. Maria Luiza Cotrim Sartor de Oliveira pela sua orientação, paciência, incentivo,

compreensão nos momentos difíceis e principalmente pela confiança depositada.

À Dra. Daisy Maria Favero Salvadori, por contribuir com meu amadurecimento

científico e pessoal e principalmente por acreditar em meu potencial desde a iniciação

científica, ajudando-me a transpor todas as limitações.

Aos pacientes envolvidos neste estudo, pelo carinho e pela confiança depositada

AGRADECIMENTOS

Ao Lucas pelo carinho, amizade, compreensão e paciência.

À Luciana que há tempos me acompanha nessa trajetória. Muito obrigado por sua

amizade e por seu amor.

Aos amigos da faculdade: Xot’s, Vi, Tuba, Elseve, Gorran, Sabão e principalmente ao

meu irmão Júlio e ao Sombra, pela amizade e carinho.

Aos meus companheiros de mestrado Kelly M. e Alexandre CH agradeço pela grande

amizade e espero que continuemos juntos por muito tempo.

Aos colegas e amigos do Departamento de Patologia: Glenda, Elaine, Lízia, Mariana,

Priscilla, Carlota, Shadia, Renata, Rodrigo, Dani, Renato, Daniel, Eliana, Clarissa, Pati,

Marina, Tânia, Ana Paula, Meire, Mara, Paulo, Bruno, Tony, Mitscheli, Meri, João,

Marize, Andréia, Liane, Grazi, Jossimara, Camila, Carol, Juju, Laura, Rita, Silvana,

Isabel, Claudinei, Hélio, Carlão, Edna, Luciano, Denisinha, Lúcia, Cícera.Glória e PC.

As meninas da citologia Renatinha, Lili e Fabiane pela amizade e contribuição para o

desenvolvimento deste projeto.

Aos colegas da endoscopia: Edi, Claudelis, Juliana, Fátima, Fatiminha, Dona Irene,

Tereza, obrigado pelo companheirismo e pela grande contribuição.

A todos os professores do Departamento de Patologia, em especial ao Dr. João Lauro

Viana de Camargo, Dra. Maria Domingues, Dra. Denise Fecchio, Dra. Márcia

Guimarães e Dra. Maria Aparecida M. Rodrigues, por estarem sempre dispostos a

auxiliar-me.

A Dra. Sílvia Regina Rogatto e ao laboratório NeoGene, em especial à Eliane, Cássia,

Sara e Greicy, pela amizade e pelo suporte científico.

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP, pelo suporte

financeiro.

À CAPES pela bolsa de estudos concedida

Índice:

1 – Revisão da Literatura

1.1 - Fatores de risco associados ao desenvolvimento de CCT................................1

1.2 – Carcinoma de células transicionais...................................................................4

1.3 – Citologia urinária................................................................................................7

1.4 – Teste do micronúcleo..........................................................................................8

2 – Referências Bibliográficas.........................................................................................10

3 – Objetivos.....................................................................................................................15

4 – Manuscrito

Resumo..............................................................................................................................18

Abstract.............................................................................................................................19

Introdução........................................................................................................................20

Casuística e Métodos........................................................................................................21

Resultados.........................................................................................................................24

Discussão...........................................................................................................................32

Conclusão..........................................................................................................................35

Referências........................................................................................................................36

5 - Anexos

Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa.......................................................................38

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido..............................................................39

Entrevista aplicada aos sujeitos da pesquisa.................................................................42

Justificativa de alteração no título do Projeto de Pesquisa..........................................43

Índice de Tabelas:

Tabela 1 - Caracterização da população com história de carcinoma de células

transicionais (CCT) de bexiga...........................................................................................26

Tabela 2 - Caracterização da população sem história de neoplasia urotelial

(controle)............................................................................................................................27

Tabela 3 - Freqüências individuais de células uroteliais micronucleadas em indivíduos

com e sem história prévia de carcinoma de células transicionais

(CCT).................................................................................................................................28

Tabela 4 - Freqüência de células urotelias micronucleadas em pacientes com e sem

história de carcinoma de células transicionais de bexiga (CCT), distribuídos de acordo

com o hábito tabagista.......................................................................................................29

Tabela 5 - Frequência de células uroteliais micronucleadas em indivíduos com e sem

história de carcinoma de células transicionais de bexiga (CCT), distribuídos de acordo

com a exposição ocupacional a substâncias tóxicas e o hábito tabagista..........................30

Tabela 6 - Relação entre variáveis demográficas, de exposição ao tabaco e de história

de carcinoma de células transicionais de bexiga (CCT) com a incidência de CCT e a

freqüência de células uroteliais micronuclead

Revisão da Literatura

1 REVISÃO DA LITERATURA

1.1 Fatores de risco associados ao desenvolvimento de CCT

O acentuado crescimento urbano observado nas últimas décadas, e a conseqüente

necessidade de produção em larga escala, seja de produtos industriais ou agrícolas, levam a

utilização de novas tecnologias e o emprego de diversos agentes químicos com o intuito de

incrementar a produtividade de tais setores. No entanto, tal desenvolvimento vem associado

à exposição de indivíduos ou populações a agentes xenobióticos ambientais que estão

relacionados a efeitos deletérios. Dentre as conseqüências dessa exposição, destaca-se a

gênese de neoplasias quimicamente induzidas compreendendo cerca de 70% a 80% de todos

os cânceres humanos (Vennit, 1996; David & Muir, 1996; Perera, 1996).

A associação entre a industrialização e o desenvolvimento neoplásico foi

primeiramente demonstrada em 1895, por Rehn, pela observação do aumento da incidência

de câncer de bexiga em trabalhadores alemães de indústrias de corantes a base de anilina.

Mais tarde, foi observado que esta relação era devida à presença da amina aromática 2-

naftilamina nesses corantes (Johansson & Cohen, 1997). A carcinogenicidade das aminas

aromáticas (AAs) foi comprovada em estudos realizados entre o período de 1915 a 1950,

demonstrando que trabalhadores das indústrias de corantes, indústria têxtil, de borracha e de

produtos químicos, expostos a tais compostos apresentavam aumento da incidência de CCT

(Case et al., 1954). Mais recentemente, Hemstreet III et al. (2001) observando o aumento da

incidência de CCT em trabalhadores de diversas indústrias da China, expostos as AAs,

salientaram a importância da estratificação dos indivíduos expostos em grupos de alto,

moderado e baixo risco para a melhor interpretação dos resultados.

Revisão da Literatura

Por outro lado, 23% dos casos de CCT em mulheres e 50% dos casos em homens, vêm

sendo atribuídos ao tabagismo, especialmente às AAs 2-naftilamina e 4-aminobifenil

contidas no cigarro, as quais são consideradas como agentes etiológicos associados ao

aumento da proliferação e à hiperplasia do urotélio da bexiga. Outras substâncias como os

hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) e aldeídos insaturados que também são

encontrados na fumaça do cigarro parecem estar envolvidas no desenvolvimento de diversos

tipos de cânceres (Johansson & Cohen, 1997; Zeegers et al., 2004). No entanto, há pouca

evidência do envolvimento dos HAPs na etiologia do CCT, pois este composto é

metabolizado diretamente no sítio de exposição sendo excretado pela urina na forma de

metabólitos inativos (Kellen et al., 2006). Zeegers et al. (2002) observaram que a associação

entre o cigarro e o risco de desenvolvimento de CCT é atribuída ao tempo de tabagismo, mas

é não interfere nas diferenças na invasividade e morfologia do tumor. Além disso, o

abandono do hábito de fumar e a idade da primeira exposição não estão associados a este

risco quando se leva em conta o tempo total de tabagismo.

Lopez-Albente et al. (2006), avaliando a distribuição geográfica das mortes por câncer

de pulmão e de bexiga na Espanha entre os anos de 1989 e 1998, observaram aumento dessas

neoplasias em áreas de indústrias têxteis e de minério de sal, as quais estão associadas à

poluição ambiental por metais pesados e arsênico. Além disso, os autores relataram o uso de

praguicidas à base de arsênico, como o ácido cacodílico, o arsenato dissódico e o arsenato

monossódico utilizados no cultivo do algodão e cereais na região da Andalusia como

prováveis agentes carcinogênicos. Portanto, é necessário que se tenha atenção aumentada a

populações expostas tanto ocupacionalmente quanto por meio da ingestão de alimentos ou

Revisão da Literatura

água contaminada por estes compostos, visto que há possível relação entre esta exposição e o

desenvolvimento de CCT (Hopenhayn-Rich et al., 1996)

Nohynek et al. (2004), em artigo de revisão, destacaram que, embora as substâncias

contidas nas tinturas de cabelo possuam ação genotóxica in vitro (teste de Ames), a

correlação destas com a carcinogenecidade in vivo é incerta. Além disso, a maioria dos

estudos não observou associação entre a exposição, tanto dos consumidores quanto dos

profissionais, com o aumento da incidência de câncer de bexiga e de outros tipos de câncer.

Processos infecciosos urinários crônicos que geram níveis significativos de nitrosaminas

endógenas na urina podem estar associados ao desenvolvimento de tumores de bexiga. Neste

caso, pode-se citar como exemplo o desenvolvimento de carcinoma de células escamosas

devido a processo inflamatório causado pelo Schistosoma Hematobium, sendo as

nitrosaminas consideradas relevantes na etiologia deste tipo de tumor (Johansson & Cohen,

1997). Outros compostos também foram relacionados ao desenvolvimento de CCT, dentre os

quais se destacam a clornafazina, agente alquilante utilizado no tratamento de neoplasias

hematológicas e que teve seu uso descontinuado após observação de que a 2-naftilamina

seria seu principal metabólito; a fenacetina, composto presente em alguns analgésicos e com

tempo de indução de CCT semelhante ao observado em indivíduos expostos a AAs; a

ciclofosfamida, cujo metabólito acroleína é considerado cancerígeno intermediário (Cohen &

Johansson, 1992).

Essas informações demonstram que os estudos epidemiológicos desempenham papel

relevante na identificação de fatores de risco associados ao desenvolvimento de neoplasias

ou de outras doenças crônico-degenerativas e salientam a necessidade de se avaliar o efeito

combinado dos fatores de exposição ambientais e fatores genéticos.

Revisão da Literatura

1.2 Carcinoma de células transicionais

Aproximadamente 90% de todas as neoplasias de bexiga são de origem epitelial sendo

designadas como carcinoma de células uroteliais ou carcinoma de células transicionais

(CCT) (Gandour-Edwards et al., 2002; Daniely et al., 2005). No Brasil, o CCT ocupa a 7ª e

a 10ª posição entre as neoplasias que acometem o sexo masculino e feminino,

respectivamente (INCA, 1999). Segundo o Instituto Nacional do Câncer, no Brasil, em 2000,

a proporção de mortes por esta neoplasia foi de 1,73% (INCA, 2003).

Atualmente, o CCT pode ser classificado em dois subtipos genéticos: tumores

geneticamente estáveis e tumores geneticamente instáveis, correspondentes a duas entidades

morfologicamente distintas. A primeira categoria inclui os tumores papilíferos não invasivos

de baixo grau (pTa, grau 1 e grau 2). Já os geneticamente instáveis correspondem a tumores

de alto grau (pTa grau 3 e CIS) e invasivos (estádio pT1-4) (Mazzucchelli et al., 2005; Jones

et al., 2006) (Quadro 1).

Quadro 1 – Classificação das neoplasias uroteliais de bexiga (adaptado, WHO, 2004)

O CCT de bexiga tem como características principais a multifocalidade e o alto índice

de recorrência (Denzinger et al., 2006). De fato, 70% dos carcinomas superficiais,

Revisão da Literatura

especialmente as lesões pTa (tumores papilíferos não invasivos de baixo grau), são

recorrentes sendo que 10% destas progridem para a invasividade, 20% a 30% das lesões pT1

progridem para a invasão muscular e caso essas estejam associadas a lesões de alto grau ou

carcinoma in situ (CIS), a progressão pode ocorrer acima da metade dos casos (Laudadio et

al.,2005). Desta forma, as recidivas associadas aos procedimentos cirúrgicos periódicos para

a ressecção do tumor tornam o câncer de bexiga uma patologia de alta morbidade (Reznicoff

et al., 2000).

O entendimento da clonalidade dos tumores multifocais de bexiga é importante para o

estabelecimento de estratégias terapêuticas, visto que, atualmente, há uma tendência

crescente no desenvolvimento de novas terapias contra os alvos moleculares específicos

desses tumores (Denzinger et al., 2006). Nesse contexto, foram desenvolvidas duas hipóteses

na tentativa de elucidar o processo de carcinogênese urotelial. A primeira atribui uma origem

monoclonal às lesões, ou seja, os tumores multifocais ou recorrentes originar-se-iam de uma

única célula transformada que prolifera e coloniza outras regiões da bexiga, por meio da

migração intra-epitelial ou transportada pela urina. A segunda hipótese atribui uma origem

policlonal, sugerindo que as substâncias cancerígenas presentes na urina afetariam a bexiga

em múltiplos sítios, levando ao desenvolvimento de tumores multifocais de maneira

independente (Hafner et al.,2002).

A carcinogênese da bexiga, assim como a maioria dos tumores humanos, ocorre por

meio de múltiplas etapas caracterizadas por alterações genéticas que sinalizam para a

transformação maligna de uma célula inicialmente normal (Philips & Richardson, 2006).

Essas alterações podem ocorrer em regiões de microsatélites, genes supressores tumorais,

oncogenes/proto-oncogenes, e em genes reguladores do ciclo celular (Habuchi et al., 2005).

Revisão da Literatura

podendo desencadear um quadro de instabilidade genética, caracterizada por aumento

significativo na taxa de mutações, sendo, portanto, considerada um evento inicial no

processo de carcinogênese. Segundo Catto et al. (2004), a instabilidade genética pode

apresentar-se em dois níveis: o primeiro, compreende as alterações nucleotídicas de base

única (inserções/deleções) que resultam em erros de leitura e são observadas frequentemente

em regiões de microsatélites (instabilidade de microsatélites); o segundo, compreende as

alterações cromossômicas (instabilidade cromossômica) caracterizadas por perdas ou ganhos

de fragmentos ou cromossomos inteiros, e que resultam em perdas ou amplificações de

regiões de DNA que podem conter genes cruciais para o desenvolvimento neoplásico.

De fato, vários autores observaram a existência de alterações cromossômicas

numéricas em células uroteliais neoplásicas e não neoplásicas de pacientes com história de

câncer de bexiga (Kruger et al., 2003; Pycha et al., 2004; Obermann et al., 2004; Latif et al.

2004, Degtyar et al., 2004). As alterações mais freqüentemente encontradas foram a

polissomia dos cromossomos 3, 7 e 17 e a monossomia do cromossomo 9 (Kruger et al.,

2003; Obermann et al., 2004; Latif et al., 2004; Degtyar et al., 2004, Pycha et al., 2004).

Esta última, juntamente com a alta freqüência de polissomia do cromossomo 17 foi

relacionada, de maneira independente, à recorrência do CCT (Pycha et al., 2004; Kruger et

al., 2003; Degtyar et al., 2004). Ishiwata et al. (2001), também observou que 100% dos

pacientes com perdas do cromossomo 17 apresentaram recorrências, em detrimento de 23%

sem esta alteração.

Várias alterações gênicas já foram relacionadas com o desenvolvimento de CCT em seres

humanos: mutações nos genes TP53 (Malmstrom et al.,2002), mutações nos genes da família

RAS, que ocorrem em 10% dos pacientes com tumores vesicais e dobram o risco de

Revisão da Literatura

recorrências (Przybojewska et al., 2000; Johne et al., 2003) e alterações em regiões de

microssatélites no cromossomo 9, são representativas de instabilidade genômica (Turyn et

al., 2006). Além disso, Friedrich et al. (2005) observaram que a metilação dos genes SOCS-

1, STAT-1, BCL-2, DAPK, E-caderina está associada ao desenvolvimento de tumores

recorrentes, e que o silenciamento do gene TIMP3, está associado ao aumento da sobrevida

livre de recorrência.

1.3 Citologia urinária

A cistoscopia e o exame citológico são considerados procedimentos padrão no

acompanhamento dos pacientes com história de CCT e no monitoramento de indivíduos com

sintomatologias suspeitas para esta neoplasia, incluindo hematúria, dissúria e polaciúria. No

entanto, o exame endoscópico apresenta limitações na detecção de lesões microscópicas, e a

análise citológica, por ser subjetiva e dependente da experiência do citopatologista, apresenta

sensibilidade diminuída principalmente para as lesões de baixo grau (Fracasso et al., 2004).

Daniely et al. (2006) observaram que de 22 pacientes com biópsias positivas para CCT,

apenas 61% tiveram o mesmo diagnóstico pela análise citológica, em detrimento a 100% de

concordância pela análise citogenética utilizando sondas para os centrômeros dos

cromossomos 3, 7 e 17 e para o locus 9p 21. Assim, o emprego de técnicas que aumentem a

sensibilidade e especificidade para a detecção precoce da doença torna-se necessário, tanto

em pacientes submetidos à ressecção do tumor de bexiga, quanto em pacientes considerados

como grupo de risco ao desenvolvimento do CCT. Nesse contexto, o emprego de

biomarcadores - parâmetros biológicos que refletem o comportamento de determinada

entidade biológica frente às alterações ambientais ou decorrentes de alterações constitutivas

Revisão da Literatura

da mesma - para avaliação de danos citogenéticos, como a freqüência de micronúcleos, pode

ser utilizada para a avaliação de risco ao desenvolvimento de neoplasias em diferentes

tecidos.

1.4 Teste do Micronúcleo

Os micronúcleos (MN) são corpúsculos compostos por cromatina e envoltos por uma

membrana nuclear, localizados próximos ao núcleo principal. Morfologicamente apresentam

textura cromatídica semelhante ao núcleo principal, no entanto distinguem-se deste, pelo seu

tamanho reduzido. Originam-se de fragmentos cromossômicos ou cromossomos inteiros que

não foram incluídos no núcleo principal das células filhas durante a divisão celular. Portanto,

são observados em células que sofreram algum tipo de dano no DNA, sendo resultantes de

eventos mutagênicos verdadeiros, pois representam mutações cromossômicas adquiridas por

uma determinada célula e que foram transmitidas para as células filhas, após um ciclo de

divisão celular (Speit et al., 2007).

O teste do micronúcleo (MN) é um teste de mutagenicidade amplamente utilizado no

biomonitoramento de populações humanas ou sistemas biológicos que estejam expostos a

agentes químicos, físicos e biológicos (Bolognesi et al., 2004; Thierens et al., 1999). Pode

ser utilizado em diferentes tipos celulares como linfócitos e células epiteliais, tanto em

modelos animais quanto em humanos (Cavallo et al., 2006; Balakrishnan et al., 2006;

Buajeeb et al., 2007). Trata-se de um teste simples, rápido, eficiente e de baixo custo para a

detecção de danos no DNA (Natarajan, 2002; Norppa, 2003). A freqüência de micronúcleos

em células epiteliais esfoliadas é importante não apenas para a detecção de agentes

clastogênicos (que causam quebras cromossômicas) e aneugênicos (que causam perdas

Revisão da Literatura

cromossômicas) como, também, para a detecção de indivíduos com risco aumentado para o

desenvolvimento de patologias relacionadas a mutações (Majer et al., 2001). Além disso, a

quantificação de danos cromossômicos nesses tecidos permite a avaliação dos efeitos de

substâncias mutagênicas e/ou carcinogênicas no tecido alvo de ação das mesmas (Speit et al.,

2007). Deste modo, o teste do MN em células esfoliadas pode ser considerado uma

ferramenta importante para a detecção de efeitos mutagênicos tecido-específicos, sendo

importante para a identificação de substâncias com efeitos potencialmente deletérios, bem

como em estudos de avaliação de risco.

Referências Bibliográficas

2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Objetivos

3 OBJETIVOS

Com base no exposto, o presente estudo foi desenvolvido no intuito de detectar danos

citogenéticos em células uroteliais esfoliadas de pacientes com história de CCT e se existe

um perfil de danos cromossômicos que possa caracterizar a população estudada, dando

assim, base para a validação do teste do MN como biomarcador de risco para o

desenvolvimento neoplásico. Os objetivos específicos apresentam-se descritos abaixo:

● investigar a existência de possíveis danos cromossômicos, por meio do teste do

micronúcleo no epitélio macroscopicamente normal de pacientes com história prévia de

CCT com e sem história de tabagismo, mas com diagnóstico atual “negativo para

neoplasia”;

● relacionar os eventuais danos cromossômicos com as alterações citológicas e

histológicas do carcinoma de bexiga;

● avaliar a sensibilidade do teste do micronúcleo como biomarcador para avaliação de

risco ao desenvolvimento neoplásico em pacientes com história de CCT.

Manuscrito

4 - MANUSCRITO

Manuscrito

Danos citogenéticos em células uroteliais esfoliadas de pacientes com

história de carcinoma de células transicionais

João Paulo de Castro Marcondes*, Daisy Maria Favero Salvadori , Álisson

Marques de Miranda Cabral Gontijo, João Lauro Viana de Camargo, Maria

Luiza Cotrim Sartor de Oliveira

Núcleo de Avaliação de Impacto Ambiental sobre a saúde Humana – TOXICAM, Depto.

Patologia – Faculdade de Medicina – UNESP – Botucatu, Brasil

*Correspondência: Faculdade de Medicina – UNESP, Departamento de Patologia, 18618-

000, Botucatu – SP, Brasil. Tel. 55-14-3882-8255; fax: 55-14-3815-2348; e-mail:

[email protected]

Palavras-chave: carcinoma de células transicionais; células uroteliais micronucleadas;

recorrência; tabagismo

Trabalho apresentado de acordo com as normas da Revista Environmental and Molecular

Mutagenesis ISSN:0893-6692

Manuscrito

RESUMO

O carcinoma de células transicionais (CCT) da bexiga possui como principal

característica o alto índice de recorrência (70% dos carcinomas superficiais). Desta forma, é

necessário acompanhar rigorosa e periodicamente os pacientes acometidos por tal neoplasia,

bem como empregar técnicas sensíveis para a detecção precoce da doença, tanto em

pacientes submetidos à ressecção do tumor de bexiga, quanto em pacientes considerados

como grupo de risco para o desenvolvimento do CCT. O presente estudo tem por objetivo

utilizar o teste do micronúcleo como ferramenta para a avaliação de danos cromossômicos

em células uroteliais obtidas por lavado vesical de pacientes com história de CCT. A

freqüência de células uroteliais micronucleadas foi avaliada em 77 pacientes (não tabagistas,

tabagistas atuais e ex-tabagistas) sem ou com história de CCT, mas com diagnóstico atual

“negativo para neoplasia“. Foi detectado aumento significativo (P=0,003) de células

micronucleadas somente nos pacientes não fumantes e com história de CCT, quando

comparados aos indivíduos do grupo controle (não fumantes e sem história de CCT). Não

foram detectados efeitos do tabagismo na freqüência de células micronucleadas, e nem

associação desse hábito com o grau do tumor. Concluindo, indivíduos não tabagistas com

história de neoplasia urotelial apresentaram freqüência aumentada de micronúcleos em

células esfoliadas da bexiga, mesmo após a ressecção do tumor. Portanto, o epitélio

citologicamente normal da bexiga de indivíduos com história de CCT, pode apresentar

células geneticamente instáveis, que poderiam conferir um risco aumentado para

desenvolvimento neoplásico.

Manuscrito

ABSTRACT

The main feature of transitional cell carcinoma (TCC) is the high recurrences rates of

superficial carcinomas. Therefore, patients must be monitored regularly by periodic

cystoscopies. The employment of sensible techniques are important for detecting bladder

cancer and early disease in patients undergoing tumor resection and individuals with high

risk for tumor development.

To evaluate whether cytogenetic disorders can be evolved in the tumor development and

recurrences, the frequency of micronucleated cells (MNC) was established in non-

neoplastic exfoliated bladder cells from patients with history of TCC. Seventy-seven

patients with and without history of bladder cancer, either smokers or non-smokers, with

current diagnosis “negative for neoplasia” were included. The results showed a

significant increase (P < 0.01) of MNC in patients with history of TCC and non-smokers

when compared to counterpart group (without history of TCC and non-smokers).

However, the same association was not observed in patients with TCC and smokers and

in patients without history of TTC and smokers. Furthermore, was not observed

correlation between smoking habits and tumor grade.

These results suggesting that non smokers with history of urothelial tumor had an

increase of MNC even after tumor resection. Thus, the macroscopically “normal looking”

urothelium of patients of history of TCC, still could be harbored genetically instable cells

that can be related to high risk for neoplastic development de novo.

Manuscrito

INTRODUÇÃO

O carcinoma de bexiga é a neoplasia de trato geniturinário com maior incidência em

países desenvolvidos [Frau et al., 2006]. Aproximadamente 90% desses tumores são de

origem epitelial sendo designados como carcinoma de células uroteliais ou carcinoma de

células transicionais (CCT), e possuem como principais características a multifocalidade e o

alto índice de recorrência [Daniely et al., 2005; Denzinger et al., 2006]. De fato, 70% dos

carcinomas superficiais, especialmente as lesões pTa (tumores papilíferos não invasivos de

baixo grau), são recorrentes sendo que 10% destas progridem para a invasividade; 20% a

30% das lesões pT1 progridem para a invasão muscular e, se associadas a lesões de alto grau

ou carcinoma in situ (CIS), a progressão pode ocorrer acima de 50% dos casos [Laudadio et

al.,2005]. Desta forma, as recidivas, associadas aos procedimentos cirúrgicos periódicos para

a ressecção do tumor, tornam o câncer de bexiga uma patologia de alta morbidade [Reznicoff

et al., 2000].

O tabagismo é considerado um dos principais fatores associados ao desenvolvimento de

CCT, triplicando seu risco de incidência [Zeergers et al., 2004]. Alguns estudos com células

epiteliais humanas, detectaram aumento na freqüência de micronúcleos na freqüência de

micronúcleos em células urotelias [Lehutcher-Michel, 1995; Burgaz et al, 1995] e em células

esfoliadas da mucosa oral [ Wu et al., 2004], correlacionando assim, o tabagismo ao processo

carcinogêncio. No entanto, outros estudos não observaram efeito do mesmo, tanto em células

da mucosa oral quanto em linfócitos de indivíduos ocupacionalmente expostos a substâncias

tóxicas, como praguicidas e drogas anti-neoplásicas [Burgaz et al., 1999; Pastor et al., 2001,

2003; Bolognesi et al., 2002] A avaliação da freqüência de micronúcleos em células

esfoliadas é uma ferramenta importante não apenas para a detecção de agentes

Manuscrito

potencialmente mutagênicos e/ou carcinogênicos com ação tecido-específica, mas, também,

para avaliação de danos citogenéticos em lesões potencialmente cancerígenas [Speit &

Schmid, 2006; Buajeeb et al, 2007; Hamurcu et al., 2005]. Portanto, a utilização do teste do

micronúcleo, associado à cistoscopia, ao exame citológico e ao exame endoscópico pode

aumentar a sensibilidade e especificidade do diagnóstico permitindo a prevenção e melhor

acompanhamento dos pacientes com história ou risco para o desenvolvimento de CCT.

Diante do exposto, o presente estudo teve por objetivo avaliar danos citogenéticos

utilizando a freqüência de MN em células uroteliais de pacientes com e sem história de CCT,

fumantes e não fumantes na tentativa de utilizar este parâmetro na avaliação de risco para o

desenvolvimento de neoplasia urotelial.

CASUÍSTICA E MÉTODOS

Pacientes

O Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina – UNESP – Botucatu - SP

aprovou a realização deste estudo (OF.276/2005-CEP). Todos os pacientes avaliados

concordaram em participar do estudo assinando o Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido.

Foram analisadas lâminas de lavados vesicais processadas para o exame citopatológico

de 77 pacientes submetidos à cistoscopia de rotina e que apresentavam diagnóstico atual

“negativo para neoplasia”. Os pacientes foram distribuídos em dois grupos: 39 indivíduos (19

não tabagistas, 11 ex-tabagistas e 9 tabagistas atuais) com história prévia de CCT; 38

indivíduos (21 não tabagistas, cinco ex-tabagistas e 12 tabagistas atuais) sem história prévia

de CCT (controle). A história de CCT foi obtida a partir dos resultados de biópsias, citologias

Manuscrito

positivas e pela análise dos prontuários médicos. Os tumores foram classificados de acordo

com a gradação histológica, em alto e baixo grau. No momento da última cistoscopia, apenas

os indivíduos com biópsias negativas e diagnóstico citológico atual “negativo para neoplasia”

foram incluídos no grupo com história de CCT. Informações sobre os hábitos de vida

(tabagismo, consumo de álcool), exposição prévia a solventes orgânicos, quimioterápicos,

radiação e praguicidas, foram obtidas por questionários aplicados antes ou imediatamente

após a realização da cistoscopia de rotina. Os pacientes foram considerados tabagistas

quando consumiram cinco cigarros ou mais por dia, durante pelo menos cinco anos; ex-

tabagistas, quando pararam de fumar há mais de um ano. As Tabelas 1 e 2 mostram as

características das populações estudadas.

Lavado vesical

Em média, de cada paciente, foram obtidos por meio da instilação intravesical de solução

salina a 0,9% (“barbotagem”) 15 mL de lavado vesical. Esse volume foi centrifugado a 1500

rpm por 10 minutos e, após desprezado o sobrenadante, o sedimento foi citocentrifugado

(citocentrífuga Cytospin II Shandon Elliott) à 1400 rpm por 10 minutos para confecção de

duas lâminas: uma fixada com álcool 95% e outra seca ao ar, respectivamente coradas pelo

métodos de Shorr e Giemsa para avaliação citopatológica de rotina,

Manuscrito

Teste do micronúcleo

As lâminas preparadas para o exame citopatológico de rotina (coradas pelo método de

Giemsa ou Shorr), com diagnóstico atual “negativo para neoplasia” foram avaliadas para a

determinação da freqüência de células micronucleadas. O número de células analisadas por

lâmina variou entre 500 e 1000. Os critérios para a caracterização do micronúcleo foram

aqueles descritos por Lehutcher-Michel et. al. [1995], sendo todas as lâminas analisadas em

microscópio óptico de luz, com aumento de 1000X (imersão).

Fig 1 – Coloração de Giemsa – micronúcleo (seta) em célula urotelial (1.000 X)

Manuscrito

ANÁLISE ESTATÍSTICA

A distribuição do número de células uroteliais micronucleadas foi verificada pelo teste de

Shapiro-Wilks. Foram utilizados os testes não paramétricos de Mann-Whitney ou Kruskal

Wallis e o teste da Mediana, para verificar diferenças entre os grupos. Em alguns casos, para

a análise estatística, os indivíduos tabagistas e ex-tabagistas foram agrupados em uma única

categoria (com história de tabagismo). Os resultados foram considerados significativos com

p<0,05.

RESULTADOS

Dos 39 pacientes com história de neoplasia de bexiga, 32 eram do sexo masculino e 11

do sexo feminino (p<0,001), 29 apresentaram tumores recorrentes (74,3%) e 10 (25,7%) não

recorrentes (p<0,001). Dos 29 indivíduos com tumores recorrentes, 16 (55%) eram não

tabagistas e 13 (45%) apresentavam história de tabagismo (ex-tabagistas e tabagistas atuais).

Dos 10 pacientes (25,7%) com história de tumores não recorrentes, três (30%) eram não

tabagistas e sete (70%) apresentavam história de tabagismo. De todos os indivíduos com

história de CCT, 54% tiveram tumores de baixo grau e 46% de alto grau (p>0,05). Dos 21

indivíduos com tumores de baixo grau, 11 (52%) eram não tabagistas e 10 (48%)

apresentavam história de tabagismo. Por outro lado, dos 18 pacientes com tumores de alto

grau, oito (44%) eram não tabagistas e 10 (56%) apresentavam história de tabagismo. Vinte e

dois (56,4%) dos 39 indivíduos com história de CCT apresentavam história de exposição a

compostos tóxicos, principalmente a derivados do petróleo, solventes orgânicos e

praguicidas, contra apenas 10 (26,3%) dos 38 indivíduos sem história de CCT. A média de

idade dos indivíduos com história de CCT e não tabagistas foi de 70 ± 15 anos enquanto a

Manuscrito

dos indivíduos com história de tabagismo foi de 68 ± 10 anos. Os indivíduos do grupo

controle (sem história de CCT) e não tabagistas apresentaram em média de idade de 59 ± 13

anos, e os indivíduos com história de tabagismo apresentaram em média 57 ± 12 anos. A

Tabela 3 apresenta as freqüências individuais de células uroteliais micronucleadas da

população estudada.

A Tabela 4 apresenta a distribuição da freqüência de células micronucleadas (número de

células micronucleadas por 1000 células) em 77 pacientes submetidos à cistoscopia e

distribuídos de acordo com os grupos descritos anteriormente. Foi observado aumento

significativo (p=0,003) na freqüência de células uroteliais micronucleadas no grupo de

indivíduos com história de CCT e não tabagistas quando comparados aos indivíduos do

grupo controle (sem história de CCT) e também não tabagistas. Não se observou efeito do

tabagismo sobre a freqüência de MN quando os indivíduos com história de CCT ou aqueles

do grupo controle foram comparados entre si.

A freqüência de células uroteliais micronucleadas em indivíduos com e sem história de

CCT, expostos e não expostos ocupacionalmente a substâncias tóxicas é apresentada na

Tabela 5. Não foi observada diferença estatisticamente significativa (p>0,05) entre os

indivíduos expostos e não expostos tanto para o grupo com história de CCT, como para o

controle.

Na Tabela 6 é mostrada a freqüência de células com MN em grupos de indivíduos

distribuídos de acordo com as variáveis idade e intensidade e tempo de exposição ao tabaco,

e características tumorais (grau do tumor e recorrência). Nenhuma dessas variáveis

influenciou significativamente a freqüência de MN nas populações estudadas (p > 0,05).

Manuscrito

Tabela 1- Caracterização da população com história de carcinoma de células transicionais (CCT)

de bexiga.

Código do

Paciente

Sexo

Idade

(anos)

Nº

cigarros/dia

Tempo de

tabagismo

(anos)

Grau máximo

do tumor

Exposição a substâncias

tóxicas

Tempo de

exposição (anos)

SSM* M 49 20 20 Baixo Grau Solvente/tinta 19

WLC* M 71 60 39 Alto Grau Derivados do petróleo 9

ACB* M 79 20 50 Alto Grau Piretróide 5

BSRN* M 68 20 50 Baixo Grau Derivados do petróleo 21

SV* M 74 20 8 Alto Grau Derivados do petróleo 35

AB* M 73 40 34 Alto Grau Derivados do petróleo 49

JBS* M 62 29 40 Alto Grau Derivados do petróleo 30

ABL* M 77 60 30 Alto Grau - -

NA* M 82 20 10 Alto Grau - -

ACFM* M 73 60 30 Baixo Grau - -

JS* M 77 20 60 Baixo Grau - -

JJC F 72 20 40 Baixo Grau Solvente/tinta 12

AAP M 72 8 64 Alto Grau Organoclorados 10

JR M 47 20 30 Alto Grau Solvenetes/tinta 37

JMSo M 73 12 55 Baixo Grau Organoclorados 50

IOP M 57 30 41 Baixo Grau Solvente/tinta 5

SR M 80 10 71 Alto Grau - -

LV M 72 5 20 Baixo Grau - -

JF M 59 20 31 Baixo Grau - -

JCD M 51 20 36 Baixo Grau - -

EZ M 65 - - Baixo Grau Organoclorados 12

OA M 85 - - Alto Grau Sulforamidas 0.5

NPV F 78 - - Baixo Grau Piretróide 15

FA M 81 - - Baixo Grau Sulforamidas 3

CMS M 79 - - Baixo Grau Piretróide 2

JMS M 36 - - Baixo Grau Solvente/ tinta 6

IMAC F 82 - - Baixo Grau Praguicida não identificado 20

LB M 89 - - Alto Grau Derivados do petróleo 20

AAI M 38 - - Baixo Grau Organofosforado 4

OB M 56 - - Baixo Grau Organofosforado 20

ARB F 72 - - Alto Grau - -

JPR F 73 - - Alto Grau - -

RP M 77 - - Baixo Grau - -

LBA F 61 - - Baixo Grau - -

JB M 80 - - Alto Grau - -

WMB F 55 - - Alto Grau - -

LPF M 80 - - Alto Grau - -

GLS M 70 - - Alto Grau - -

BC M 77 - - Baixo Grau - -

32M; 7F 69,3 ± 12,7

25,7 ± 16,6 38 ± 16,9 17,5 ± 14,6

Média ± DP; -: não relatado; * pacientes ex-tabagistas (tempo de ex-tabagismo: 18,2 ± 10 anos)

Manuscrito

Tabela 2 - Caracterização da população sem história de neoplasia urotelial (controle)

Código do

Paciente

Sexo

Idade

(anos)

Nº

cigarros/dia

Tempo de

tabagismo

(anos)

Exposição a substâncias

tóxicas

Tempo de

exposição (anos)

AAA* M 61 10 30 Organofosforado 18

JEO* M 56 20 40 Sovente/tinta 20

RAA* M 36 10 5 Solvente/tinta 1

BAR* M 78 5 12 - -

OR* M 57 20 47 - -

CAMC F 55 20 20 Piretróide 4

LCP M 46 20 31 organofosforado 3

GG F 53 12 30 - -

AP M 44 25 30 - -

MFMB F 38 20 6 - -

LCM M 52 40 35 - -

GYC M 62 6 40 - -

ASF M 72 20 45 - -

APR M 63 5 35 - -

JPR M 51 40 30 - -

MHPM F 60 20 40 - -

CSC F 82 20 40 - -

JVF M 39 - - Derivados do petróleo 14

RDO M 58 - - Derivados do petróleo 6

RMF M 76 - - Piretróide 50

AV M 35 - - Derivados do petróleo 20

NSF F 77 - - Piretróide 50

MSJ F 74 - - - -

SGB F 37 - - - -

AG M 72 - - - -

APM M 51 - - - -

AMJ F 47 - - - -

AAS M 56 - - - -

AF F 58 - - - -

AL M 62 - - - -

ATF M 80 - - - -

BRO M 58 - - - -

DS F 58 - - - -

JRL M 65 - - - -

JDM M 62 - - - -

LA M 77 - - - -

MDS F 47 - - - -

MF F 58 - - - -

25M; 13F 58,2 ± 13

18,4 ± 10,3 30,4 ± 12,7 18,6 ± 18

Média ± DP; -: não relatado; *: pacientes ex-tabagistas (tempo de ex-tabagismo: 17 ± 21 anos)

Manuscrito

Tabela 3 - Freqüências individuais de células uroteliais micronucleadas em indivíduos

com e sem história prévia de carcinoma de células transicionais (CCT)

Indivíduos com história prévia de CCT

Indivíduos sem história prévia de CCT

Código do Paciente

‰ de células

micronucleadas

Código do Paciente

‰ de células

micronucleadas

SSM*

1,7

AAA*

3,0

WLC*

6,1

JEO*

2,0

ACB*

2,0

RAA*

BSRN*

BAR*

1,9

SV*

OR*

1,0

AB*

CAMC

9,2

JBS*

1,0

LCP

ABL*

3,2

4,2

NA*

4,4

1,6

ACFM*

MFMB

7,1

JS*

2,8

LCM

2,0

JJC

GYC

4,0

AAP

7,3

ASF

8,0

6,4

APR

JMSo

3,8

JPR

6,0

IOP

MHPM

2,0

CSC

1,0

JVF

RDO

2,2

JCD

5,0

RMF

5,2

9,3

1,0

NSF

5,0

NPV

10,0

MSJ

1,8

3,0

SGB

3,0

CMS

4,8

1,8

JMS

5,4

APM

1,9

IMAC

AMJ

0,0

9,0

AAS

AAI

4,5

1,0

3,0

2,0

ARB

4,0

ATF

JPR

2,0

BRO

1,0

LBA

1,9

JRL

3,5

JDM

WMB

3,3

1,0

LPF

3,9

MDS

2,0

GLS

1,0

3,0 ± 2,8

2,2 ± 2,4

* pacientes ex-tabagistas;

média ± desvio-padrão

Manuscrito

Tabela 4 – Freqüência de células urotelias micronucleadas em pacientes com e sem história de

carcinoma de células transicionais de bexiga (CCT), distribuídos de acordo com o hábito

tabagista.

Grupos N° de

Indivíduos

N° de células

analisadas

N° de células

micronucleadas

‰ de células

micronucleadas

CCT

39 34040 102 3,0

não tabagistas

19 17052 65 3,8*

ex-tabagistas

11 9940 16 1,6

tabagistas atuais

9 7548 21 2,8

história de tabagismo

20 16988 37 2,2

Controles

38 43249 96 2,2

não tabagistas

21 23033 36 1,7

ex-tabagistas

5 5194 10 1,9

tabagistas atuais

12 15022 50 3,3

história de tabagismo

17 20216 60 3,0

ex-tabagistas + tabagistas atuais; *p=0,003 em relação aos controles não tabagistas

Manuscrito

Tabela 5 - Freqüência de células uroteliais micronucleadas em indivíduos com e sem história de

carcinoma de células transicionais de bexiga (CCT), distribuídos de acordo com a exposição

ocupacional a substâncias tóxicas e o hábito tabagista.

Expostos Não expostos

Grupos

N° de

indivíduos

‰ de células

micronucleadas

Tempo de

exposição

(anos)

N° de

indivíduos

‰ de células

micronucleadas

CCT

22 3,5 17,5 ± 14,6 17

2,3

não tabagistas 10 4,9 10,3 ± 8,1 9

2,4

ex-tabagistas 7 1,4 24,0 ± 15,3 4

2,2

tabagistas atuais 5 3,3 22,8 ± 19,6 4

2,1

história de tabagismo

12 2,2 23,5 ± 16,4 8

2,2

Controles

10 2,9 18,6 ± 18,0 28 2,0

não tabagistas 5 3,0 28,0 ± 20,1 16 1,1

ex-tabagistas 3 2,2 13,0 ± 10,4 2 1,3

tabagistas atuais 2 4,0 3,5 ± 0,7 10 3,2

história de tabagismo

5 2,8 9,2 ± 9,0 12 3,1

ex-tabagistas + tabagistas atuais.

Manuscrito

Tabela 6 - Relação entre variáveis demográficas, de exposição ao tabaco e de história de

carcinoma de células transicionais de bexiga (CCT) com a incidência de CCT e a freqüência de

células uroteliais micronucleadas.

Fatores Grupos N° de indivíduos ‰ MN

CCT Controles CCT Controles

Idade (anos)

< 60 10 23

3,2 2,0

> 60 29 15

2,9 2,5

N° de cigarros/dia

≤ 20 14 14

2,6 3,1

≥ 30 6 3

1,4 2,6

Tempo de tabagismo (anos)

t ≤ 30 7 8

2,2 4,0

30 < t < 50 6 9

1,7 2,2

t ≥ 50 7 -

2,7 -

Grau do tumor

Baixo grau 21 -

2,8 -

Alto grau 18 -

3,2 -

Recorrência

tumores recorrentes 29 -

3,2 -

tumores não recorrentes 10 -

2,4 -

Manuscrito

DISCUSSÃO

No presente estudo não foi observado efeito das características tumorais (grau do tumor e

recorrência) na freqüência de células micronucleadas. Além disso, a idade também não

afetou a freqüência de MN tanto para os indivíduos com história de CCT, como para os

indivíduos controle (sem história de CCT). Os dados da literatura corroboram nossos

achados, já que a idade não foi um fator de interferência na freqüência de células urotelias

micronucleadas [Lehutcher-Michel et al., 1995; Burgaz et al., 1995].

A freqüência de células micronucleadas observada em pacientes não tabagistas com

história de CCT, mostra que células portadoras de alterações genéticas, responsáveis ou não

pelo desenvolvimento da neoplasia, estavam ainda presentes no epitélio da bexiga, mesmo

após a ressecção do tumor, quando o epitélio foi considerado endoscopica e citologicamente

normal. Portanto, tais pacientes teriam risco aumentado para o desenvolvimento neoplásico

de novo, mesmo quando os resultados dos exames citopatológicos são “negativos para

neoplasia”. Contrariamente, o aumento de MN não foi observado nos indivíduos do grupo

CCT, tabagistas e/ou ex-tabagistas. Cabe ressaltar, que também não foi detectado efeito do

tabagismo na freqüência de células micronucleadas nos indivíduos sem história de CCT.

Embora, nossos dados não tenham evidenciado efeito do tabaco nas populações estudadas, a

associação entre o tabagismo e o aumento da freqüência de células uroteliais micronucleadas

foi descrito por Burgaz et al. [1995] e Lehutcher-Michel et al. [1995] em indivíduos sem

história de CCT. Gontijo et al. [2001] detectaram aumento no nível de danos no DNA

relacionado ao tabagismo, quando avaliaram células esfoliadas da bexiga pelo teste do

cometa. Bonassi et al. [2003], utilizando-se de dados referentes à freqüência de MN em

linfócitos obtidos de 24 laboratórios de todo o mundo, mostraram que o efeito do tabagismo

Manuscrito

não foi evidente, sendo observado um aumento significativo apenas no grupo de indivíduos

considerados fumantes “pesados” (≥ 30 cigarros por dia).

Estudos realizados em linfócitos e células epiteliais da mucosa bucal de indivíduos

expostos ocupacionalmente a praguicidas não evidenciaram efeito do tabagismo e da

exposição a estes compostos na freqüência de MN [Pastor et al., 2001, 2003]. Porém,

Burgaz et al [1999] observaram um aumento na freqüência de MN apenas em linfócitos de

enfermeiras expostas ocupacionalmente à ciclofosfamida independente da exposição ao

tabaco. Em nosso estudo, também não foi observado efeito da exposição ocupacional na

freqüência de MN quando os indivíduos com história de CCT expostos e não expostos

ocupacionalmente são comparados, o mesmo observou-se no grupo de indivíduos sem

história de CCT. Além disso, não foi detectada diferença entre os grupos CCT e Controle,

expostos e não expostos ocupacionalmente. Cabe ressaltar que neste estudo, a exposição

ocupacional a substâncias tóxicas (solventes, praguicidas e derivados do petróleo) no grupo

CCT foi avaliada em 18 indivíduos sem história atual de exposição e em 4 indivíduos com

história atual. Entretanto, ressalta-se que os resultados referentes ao efeito do tabagismo na

freqüência de MN em populações ocupacionalmente ou ambientalmente expostas devem ser

avaliados com cautela, pois é possível que a variável exposição “mascare” o efeito do

tabagismo [Bonassi et al., 2003].

Embora não tenha sido detectada diferença dos danos citogenéticos entre indivíduos não

tabagistas e com história de tabagismo, Spruck III et al. [1993], avaliando mutações entre os

éxons 5 e 8 do gene TP53 em tumores de bexiga de indivíduos não tabagistas e ex-tabagistas

observaram que embora a exposição ao tabagismo não altere significativamente o perfil de

mutações neste gene; algumas alterações como mutações duplas foram observadas

Manuscrito

exclusivamente nas amostras de tumor dos indivíduos com história de tabagismo, podendo

contribuir no aumento da extensão dos danos no DNA das células uroteliais.

van Diemen et al. [1995], avaliando a freqüência de aberrações cromossômicas

numéricas e estruturais (cromossomos 1, 2, 3 ,4, 6, 8, 9, 15, 19 e X) em linfócitos de

fumantes e não fumantes, não observaram diferenças entre os grupos em relação as

freqüências de aberrações estáveis (translocações) e não estáveis (cromossomos dicêntricos e

em anel); muito embora tenha sido detectada um aumento significativo na freqüência de

hiperdiploidia, para todos os cromossomos estudados, no grupo de indivíduos tabagistas

quando comparado aos indivíduos não-tabagistas.

Desta forma, fica claro que a exposição ao tabaco pode ocasionar alterações no DNA por

diversas vias (mutações pontuais, aberrações cromossômicas numéricas, danos

citogenéticos), entretanto, nossos resultados indicam que a história de neoplasia urotelial por

si só está relacionado ao aumento de danos cromossômicos independente da exposição ao

tabaco. Este aumento pode ser devido a danos cromossômicos de novo, representativos da

instabilidade genômica. No entanto, não deve ser descartada a possibilidade de que células

precursoras ou transformadas ainda abriguem alterações no DNA do urotélio de pacientes

com história prévia de CCT.

Assim, o acompanhamento rigoroso e periódico dos pacientes com CCT de bexiga, após

a ressecção do tumor primário, é um procedimento importante para a detecção precoce de

recorrências e para intervenções que diminuam a morbidade e mortalidade pela doença.

Nesse contexto, a análise da presença do micronúcleo em células esfoliadas da bexiga pode

ser considerada uma ferramenta auxiliar, ao lado dos exames histopatológicos e

Manuscrito

citopatológicos de rotina, para a detecção precoce da doença ou de recorrências e para o

estabelecimento de estratégias de tratamento.

6. CONCLUSÃO

Os dados gerados neste estudo não evidenciaram efeito do tabagismo na freqüência de

micronúcleos. No entanto, os indivíduos com história de CCT não tabagistas apresentaram

freqüência aumentada de micronúcleo em células esfoliadas da bexiga, mesmo após a

ressecção do tumor. Desta forma, supõe-se que o urotélio macroscopicamente normal destes

indivíduos com história de CCT, ainda abriga células geneticamente instáveis que poderiam

conferir um risco aumentado ao desenvolvimento neoplásico de novo. Portanto, o teste de

micronúcleo pode ser considerado uma ferramenta auxiliar importante para os

citopatologistas no diagnóstico de lesões recorrentes da bexiga, principalmente naquelas de

baixo grau histológico de difícil avaliação.

Manuscrito

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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human lynphocytes: results from the HUMN Micronucleus project. Mutat Res 543: 155 –

166.

Buajeeb W, Kraivaphan P, Amornchat C, Triratana T. 2007. Frequency of

micronucleated exfoliated cells in oral lichen planus. Mutat Res 627: 191–196.

Burgaz S, İşcan A, Büyükbingöl ZK, Bozkurt A, Karakaya AE. 1995. Evaluation of

micronuclei in exfoliated urothelial cells and urinary thioether excretion of smokers.

Mutat Res 335: 163 – 169.

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hybridization, and p53 analyses. Human Pathol 37: 143-157.

Frau DV, Usai P, Dettori T, Caria P, De Lisa A, Vanni R. 2006. Fluorescence in situ

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Gontijo AMMC, Elias FN, Salvadori DMF, Oliveira MLCS, Correa LA, Goldeberg J,

Trindade JCS, De Camargo JLV. 2001. Single-cell gel (Comet) assay detects primary

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Hamurcu Z, Dönmez-Altuntas H, Borlu M, Demirtas H and Asςioslu Ö. 2005.

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Manuscrito

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for clinical practice. BJU Int 96: 1280-1285.

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between smoking, beverage consumption, diet and bladder cancer: a systematic literature

review. World J Urol 21: 392–401

Anexos

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

I. I

DENTIFICAÇÃO DO PACIENTE (VOLUNTÁRIO)

Nome:

RG:

Código (não preencher) :

Endereço:

Cidade: Bairro:

CEP: Estado: Telefone:

II. DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA

Título do Protocolo da Pesquisa: "Alterações cromossômicas em células uroteliais

esfoliadas de pacientes com história de carcinoma de células transicionais".

Pesquisadores responsáveis: Dra. Maria Luiza Cotrim Sartor de Oliveira, Dra. Daisy

Maria Favero Salvadori, João Paulo de Castro Marcondes e Dr. José Goldberg (urologista

responsável).

3- Avaliação de risco da Pesquisa:

sem risco, visto que aproveitaremos parte do lavado já

coletado pelo médico responsável, não havendo coletas adicionais unicamente para a

pesquisa.

III – REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU

REPRESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA:

1 - Justificativa e Objetivos da Pesquisa:

Os pacientes que foram submetidos à cirurgia para

retirada de tumor de bexiga apresentam risco aumentado de desenvolvê-lo novamente,

por isso são realizados lavados vesicais periódicos para controle. Desta forma, propomo-

nos avaliar possíveis alterações no DNA das células da bexiga que possam indicar,

precocemente, desenvolvimento ou reaparecimento do tumor, nos lavados de controle.

2 - Procedimentos utilizados:

utilização de parte do lavado da bexiga, já coletado pelo médico

para as avaliações de rotina. Além disso será aplicado, pelos pesquisadores responsáveis,

um questionário detalhado sobre os hábitos de vida de todos os pacientes.

3 - Desconfortos e riscos:

não haverá desconforto físico adicional, além do procedimento de

coleta de lavado que seria realizado de qualquer maneira pelo clínico.

4 - Benefícios que poderão ser obtidos:

Possível contribuição futura para o diagnóstico

precoce do tumor e melhora da qualidade de vida dos pacientes.

5- Procedimentos vantajosos para os indivíduos:

avaliação de possíveis alterações que

possam estar relacionadas ao desenvolvimento ou reaparecimento do tumor.

IV – ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS DO

SUJEITO DA PESQUISA:

1- Fui esclarecido sobre garantia de ter acesso a qualquer momento, às informações sobre

procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos relacionados com a pesquisa,

inclusive para dirimir eventuais dúvidas?

[ ] SIM [ ] NÃO

Anexos

2- Fui esclarecido que terei a liberdade de retirar meu consentimento e sair desta pesquisa a

qualquer momento, sem que isso traga prejuízo quanto à continuidade do meu tratamento.

[ ] SIM [ ] NÃO

3- Fui esclarecido de que a segurança de minha identidade será preservada, mantendo-se

todas as informações em caráter confidencial?

[ ] SIM [ ] NÃO

4- Fui esclarecido sobre a disponibilidade de assistência no HCFMUNESP por eventuais

danos à saúde, decorrentes da pesquisa?

[ ] SIM [ ] NÃO

5- Fui esclarecido sobre a viabilidade de indenização por eventuais danos à saúde

decorrentes da pesquisa?

[ ] SIM [ ] NÃO

6- Fui esclarecido que não receberei qualquer remuneração financeira por participar desta

pesquisa?

[ ] SIM [ ] NÃO

7- Fui informado de que os médicos e pesquisadores que participam deste projeto de

pesquisa estarão a minha disposição (24 horas) para esclarecimento de qualquer questão

relacionado à pesquisa?

[ ] SIM [ ] NÃO

V. C

ONSENTIMENTO PÓS-INFORMADO

Eu, ______________________________________________________ abaixo assinado,

declaro que fui esclarecido sobre o objetivo do presente estudo, sobre os eventuais desconfortos

que poderei sofrer, assim como sobre os benefícios do estudo. Concordo, portanto, em participar,

na qualidade de voluntário, do referido Projeto de Pesquisa, sob livre e espontânea vontade.

_____________________, _____ de ________________ de _______

____________________________ ou _________________________________________

Paciente Responsável

Anexos

VI - INFORMAÇOES DE NOMES, ENDEREÇOS E TELEFONES DOS

RESPONSÁVEIS PELO ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA CONTATO EM

CASO DE INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E REAÇÕES ADVERSAS:

Nome: Dra Maria Luiza Cotrim Sator de Oliveira

Endereço: Depto. de Patologia - Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP Rubião Júnior S/N,

Botucatu - SP

Telefone: (14) 3811-6238 (ramal – 215) / (14) 3882-8255

Nome: Dra. Daisy Maria Fávero Salvadori

Endereço: Depto. de Patologia - Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP Rubião Júnior S/N,

Botucatu - SP

Telefone: (14) 3882-8255

Nome: João Paulo de Castro Marcondes

Endereço: Reinaldo Senger, 155 – Vila Pinheiro – Botucatu, SP

Telefone: (14) 3814-1463 / (14) 9126-7034 / (14) 3882-8255

Nome: Dr. José Goldberg

Endereço: Depto. de Urologia - Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP Rubião Júnior S/N,

Botucatu – SP.

Telefone: (14) 3811-6271

Anexos

Entrevista aplicada aos sujeitos da pesquisa:

“Alterações cromossômicas em células uroteliais esfoliadas de pacientes com história de carcinoma

de células transicionais”.

Registro do paciente no estudo:................................................................................................

Data: .............................................................. ......................................................___/___/___

I – Identificação

1 – Nome: .............................................................. ..................................................................

2 – RGH: ................................................................................................|__|__|__|__|__|__|__|

3 – Sexo ........................................... [M] masculino [F]feminino..........................................

4 – Profissão: .............................................................. .............................................................

5 – Data de nascimento: .............................................................. ....................... ___/___/___

6 – Idade: .................. ....................... .................. ....................... .................. ...................|__|

II – Antecedentes pessoais

1 – Fuma [S] sim [N] não.................. ....................... .................. ....................... ............|__|

2 – Há quanto tempo (anos) ................................................................................................|__|

3 - Quantos cigarros/dia....................... ...............................................................................|__|

4 – Tipo [1] cachimbo [2] charuto [3] palha [4] papel c/ filtro [5] outros...................|__|

5 – Já fumou [S] sim [N] não....................... ....................................................................|__|

6 - Há quanto tempo deixou de fumar (meses) ....................... ..........................................|__|

7 – Quantos cigarros/dia....................... ..............................................................................|__|

8 – Durante quanto tempo fumou (meses) ....................... ..................................................|__|

9 – Tipo [1] [2] [3] [4] [5] ............................................................................................|__|

10 – Bebe [S] sim [N] não....................... .........................................................................|__|

11 – Há quanto tempo (meses) ............................................................................................|__|

12 – Tipo [1] cachaça [2] cerveja [3] whisky [4] vodka [5] vinho [6] outras.....................|__|

13 – Quantidade/dia – No copos /dia ...................................................................................|__|

14 – Já bebeu [S] sim [N] não...............................................................................................|__|

15 – Tipo [1] [2] [3] [4] [5] [6] .......................................................................................|__|

16 - Quantidade/dia – No copos /dia ....................................................................................|__|

17 – Há quanto tempo deixou (meses) .................................................................................|__|

18 – Contato com substâncias tóxicas [S] sim [N] não.......................................................|__|

19 – Quais________________________________________________________________

20 – Por quanto tempo...........................................................................................................|__|

21 – Período sem contato com a(s) substância(s) .................................................................|__|

22 - História de exposição à radiação [S] sim [N] não.........................................................|__|

23 – Número de RX...............................................................................................................|__|

24 – Usa habitualmente algum tipo de medicação [S] sim [N] não.....................................|__|

25 – Quais [A] antibiótico [V] vitamina [AI] antiinflamatório [X] xarope [O] outros.....|__|

26 – Freqüência/dia...............................................................................................................|__|

27 - Tipo................................................................................................................................|__|

28 – Já usou algum tipo de medicamento [S] sim [N] não....................................................|__|

29 - Quais [A] antibiótico [V] vitamina [AI] antiinflamatório [X] xarope [O] outros......|__|

30 - Freqüência/dia................................................................................................................|__|

31 - Tipo................................................................................................................................|__|

32 - Há quanto tempo deixou (meses)...................................................................................|__|

Anexos

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