ads:
Gustavo Góes Cavalcante
Aspectos clínicos e epidemiológicos das infecções por
Babesia bovis, Babesia bigemina e Anaplasma marginale em
bezerros da raça Nelore no Estado de São Paulo.
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da UNESP, Campus
de Botucatu como requisito para a obtenção
do título de Doutor em Medicina Veterinária-
Área de Clínica Veterinária.
Botucatu- SP
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Cavalcante, Gustavo Góes.
Aspectos clínicos e epidemiológicos das infecções por Babesia bovis
Babesia bigemina e Anaplasma marginale em bezerros da raça Nelore no
Estado de São Paulo / Gustavo Góes Cavalcante. -- Botucatu : [s.n.], 2007.
Tese (doutorado) –
Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2007
Orientadora: Teresa Cristina Goulart de Oliveira Sequeira
Assunto CAPES: 50502042
1. Bovino - Doenças -Epidemiologia - São Paulo 2. Babesiose em
bovino
CDD 636.20896
Palavras-chave: Anaplasma marginale; Babesia bigemina; Babesia bovis;
Boophilus microplus; Epidemiologia
ads:
Dedico essa obra a toda a minha família,
especialmente a meus pais José Carlos Cavalcante e
Heliana Góes Cavalcante, ao meu irmão Thiago G. Cavalcante e
com todo o meu amor à Déborah Costa de Oliveira.
Agradecimentos
Nesse momento muito especial, agradeço primeiramente a DEUS e a Nosso
Senhor Jesus Cristo, pela maravilhosa família que fui presenteado, pela saúde que
nunca me faltou e pela Fé que me sustentou até aqui, me consolando nas horas
difíceis e me fortalecendo quando fraquejei.
À Profª. Drª. Teresa Cristina G. de Oliveira Sequeira por quem sinto uma
grande admiração, pela atenção, amizade e dedicação dispensada nesses quatro
anos de convivência. Por ter entendido minhas dificuldades, e especialmente por me
ensinar com atitudes e palavras que a ética e a responsabilidade são características
essenciais em qualquer profissional.
À Profª. Drª. Lucia Helena O’Dywer, por quem eu tenho grande amizade,
pelas palavras dispensadas e pelas ‘dicas’ de quem tem um pouquinho mais de
experiência.
Ao Dr. Cláudio Roberto Madruga, que sempre me ajudou desde o mestrado,
pela amizade e realização dos exames sorológicos.
À Profa. Dra. Regina Takahira e à colega Andreza Inaba, pela
disponibilização da estrutura do Laboratório de Patologia Clínica da FMVZ e pela
realização dos hemogramas dos bezerros.
Aos funcionários responsáveis pelo manejo do rebanho da Fazenda São
Manoel/ UNESP, em especial ao Sr. João Ratti JR. (Chumaço), Sr. Ivo Donizette de
Brito e Sr. José Carlos Moro, pela atenção e cuidado com os animais experimentais
e a disponibilidade a mim dispensada nas inúmeras visitas à propriedade.
Ao querido casal de amigos Ary e Renata Carneiro, que pela amizade,
conselhos e idéias, foram como irmãos mais velhos na ausência dos pais.
Aos meus amigos do peito (velha-guarda), Christianne Wienkonsky e Milena
Brant, que pela amizade (logo de cara) e carinho sempre recarregaram minhas
energias quando tudo estava muito difícil.
Aos GRANDES amigos Jayme Neto, Nelson Marra e Rogério Sena (Sabão),
que juntos formamos a “The worms”, pela amizade, companheirismo, força e
inúmeros momentos de Rock n’ Roll na veia.
Aos meus amigos Carla Moraes, Cristina Haanwickel e Antonio Fialho (Bob),
que me receberam assim que cheguei em Botucatu e me proporcionaram
momentos inesquecíveis na nossa incrível convivência.
Aos meus estimados amigos pós-graduandos do Departamento de
Parasitologia, Adriano Rubini, Alberto Wagner, Aline Angella, Bianca Cechetto,
Diego Alonso, Ellen Cruz, Letícia Finks, Karina Paduan, Karina Rodrigues, Marcela
Carneiro, Marco Rossellini (xabi) e Satie Katagiri, pela amizade e intermináveis
momentos de descontração.
Aos queridos amigos que fiz na UNESP, Luis Justulin, Ana Carolina Luchinni,
Douglas e Fabiane Missuma, pela amizade e por todos os momentos de farra.
Aos Profs. Alessandro Amarante, Luciene Mascarini, Newton Madeira, Paulo
Ribolla, Reinaldo da Silva, Semíramis Guimarães, Wesley Godoy e aos funcionários
Ângela, Márcia, Nilza, Roberto (bicho) e Valdir, que fazem o Departamento de
Parasitologia do Instituto de Biociências de Botucatu.
À todos os meus colegas e professores do curso de pós-graduação em
Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu.
À Universidade Federal do Pará e ao Colegiado do Curso de Medicina
Veterinária, na pessoa do coordenador Prof. Dr. Leônidas Olegário e posteriormente
Prof. Dr. Stefano Tavares de Andrade, pela confiança dispensada durante o período
de finalização desta tese.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pela bolsa de estudos concedida.
MUITO OBRIGADO!!!
Impossível é uma palavra usada por gente fraca
que prefere viver no mundo como está
à arriscar mudá-lo. Tem medo do que vem pela frente e
desiste diante da primeira dificuldade.
Sumário
Página
Resumo............................................................................................................
12
Abstract........................................................................................................... 14
1. Introdução................................................................................................... 16
2. Revisão de Literatura................................................................................. 18
2.1 Babesioses Bovinas................................................................................... 18
2.2 Anaplasmose Bovina.................................................................................. 32
3. Objetivos..................................................................................................... 44
4. Material e Métodos..................................................................................... 45
4.1. Laboratórios..........................................................................................
45
4.2. Animais Experimentais......................................................................... 45
4.3. Exame físico e colheita de amostras.................................................... 47
4.4. Processamento das amostras de sangue ........................................... 48
4.5. Processamento das amostras de Boophilus microplus........................
49
4.6. Pesquisa de DNA de B. bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale...
49
4.6.1. Extração de DNA das amostras de sangue................................ 49
4.6.2. Extração de DNA das fêmeas de Boophilus microplus..............
51
4.6.3. Reações de PCR........................................................................ 51
4.6.4. Reações de Nested-PCR (nPCR)...............................................
53
4.7. Ensaio de imunoadsorção enzimática indireta (ELISA-I)..................... 55
5. Resultados.................................................................................................. 56
5.1. Parâmetros Clínicos e Hematológicos..................................................
56
5.1.1. Contagem de Eritrócitos..............................................................
56
5.1.2. Concentração de hemoglobina................................................... 58
5.1.3. Volume Globular......................................................................... 60
5.1.4. Contagem total de Leucócitos.................................................... 62
5.2. Freqüência de infecções por Babesia bovis.........................................
64
5.3. Freqüência de infecções por Babesia bigemina...................................
64
5.4. Freqüência de infecções por Anaplasma marginale.............................
65
5.5. Pesagem dos bezerros.........................................................................
77
5.6. População de Boophilus microplus.......................................................
78
5.7. Freqüência de infecções por Babesia bovis, B. bigemina e
Anaplasma marginale em teleóginas de Boophilus microplus............
79
6. Discussão....................................................................................................
80
7. Conclusões................................................................................................. 100
8. Referências Bibliográficas.........................................................................
102
Lista de Figuras
Figura 1
Bezerros que integram o rebanho Nelore mantido na Fazenda
São Manuel/ UNESP, localizada no município de São Manuel-
SP.................................................................................................
46
Figura 2
Merozoítas de Babesia bigemina (seta) em esfregaço de
sangue corado por Giemsa..........................................................
58
Figura 3
Corpúsculos intra-eritrocitários de Anaplasma marginale (setas)
em esfregaço de sangue corado por Giemsa..............................
58
Figura 4
Eletroforese dos produtos de amplificação de DNA de Babesia
bigemina pelas técnicas de PCR e nPCR (canaletas 1 e 2),
amostra PCR negativa (canaleta 3); amostra nPCR negativa
(canaleta 4); e controle PCR/nPCR negativo (canaletas 5 e
6)..................................................................................................
64
Figura 5
Eletroforese dos produtos de amplificação de DNA de Babesia
bovis pelas técnicas de PCR e nPCR (canaletas 3 e 4),
amostra PCR negativa (canaleta 1); amostra nPCR negativa
(canaleta 2); e controle PCR/nPCR negativo (canaletas 5 e
6)...................................................................................................
64
Figura 6
Eletroforese dos produtos de amplificação de DNA de
Anaplasma marginale pelas técnicas de PCR e nPCR
(canaletas 1 e 2), amostra negativa (canaleta 3); controle
negativo (canaleta 4)....................................................................
68
Figura 7
Evolução do peso em função da idade de bezerros da raça
Nelore criados no município de São Manuel-SP..........................
70
Figura 8
Número de bezerros Nelore parasitados por Boophilus
microplus ao longo de ano, criados no município de São
Manoel, SP...................................................................................
79
Lista de Quadros
Quadro1
Seqüências iniciadoras externas(“primers”) para amplificação
de DNA de Babesia bigemina, B. bovis e Anaplasma marginale.
52
Quadro 2
Seqüências iniciadoras internas (“primers”) para amplificação
de DNA de Babesia bigemina, B. bovis e Anaplasma marginale.
54
Lista de Tabelas
Tabela 1:
Idade mínima e máxima de 17 bezerros da raça Nelore em
função dos meses em que foram realizados os exames físicos
e as colheitas das amostras, no município de São Manuel,
SP................................................................................................
47
Tabela 2:
Detecção de DNA de Babesia bovis pelos métodos de PCR e
nPCR em amostras de sangue de 17 bezerros da raça Nelore
ao longo do primeiro ano de vida, no município de São Manuel,
SP.................................................................................................
59
Tabela 3:
Detecção de anticorpos anti- Babesia bovis pelo método de
ELISA-I em amostras de soro de 17 bezerros da raça Nelore ao
longo do primeiro ano de vida, no município de São Manuel,
SP.................................................................................................
60
Tabela 4:
Parasitemia (%) de Babesia bigemina em função da idade de
17 bezerros da raça Nelore naturalmente infectados, no
município de São Manuel, SP......................................................
57
Tabela 5:
Detecção de DNA de Babesia bigemina pelos métodos de PCR
e nPCR em amostras de sangue de 17 bezerros da raça Nelore
ao longo do primeiro ano de vida, no município de São Manuel,
SP.................................................................................................
61
Tabela 6:
Detecção de anticorpos anti- Babesia bigemina pelo método de
ELISA-I em amostras de soro de 17 bezerros da raça Nelore ao
longo do primeiro ano de vida, no município de São Manuel,
SP.................................................................................................
62
Tabela 7:
Parasitemia (%) de Anaplasma marginale em 17 bezerros da
raça Nelore, naturalmente infectados, no município de São
Manuel, SP...................................................................................
65
Tabela 8:
Detecção de DNA de Anaplasma marginale pelos métodos de
PCR e nPCR em amostras de sangue de 17 bezerros da raça
Nelore ao longo do primeiro ano de vida, no município de São
Manuel, SP...................................................................................
66
Tabela 9:
Detecção de anticorpos anti- Anaplasma marginale pelo
método de ELISA-I em amostras de soro de 17 bezerros da
raça Nelore ao longo do primeiro ano de vida, no município de
São Manuel, SP ..........................................................................
67
Tabela 10:
Valores médios e desvios-padrão do número de eritrócitos em
amostras de sangue negativas para hemoparasitas em função
da idade de 17 bezerros da raça Nelore, no município de São
Manuel, SP...................................................................................
71
Tabela 11:
Idade, contagem total de eritrócitos e parasitemia nas amostras
de sangue de bezerros da raça Nelore, criados no município de
São Manuel, SP ..........................................................................
72
Tabela 12:
Valores médios e desvios-padrão da concentração de
hemoglobina em função da idade, nas amostras de sangue
negativas para hemoparasitas de 17 bezerros da raça Nelore,
no município de São Manuel, SP.................................................
73
Tabela 13:
Idade, concentração de hemoglobina e parasitemia nas
amostras de sangue de bezerros da raça Nelore, criados no
município de São Manuel, SP.....................................................
74
Tabela 14:
Valores médios e desvios-padrão do volume globular (%) em
amostras de sangue negativas em função da idade, de 17
bezerros da raça Nelore, criados no município de São Manuel,
SP.................................................................................................
75
Tabela 15:
Idade, volume globular (%) e parasitemia nas amostras de
sangue de bezerros da raça Nelore, criados no município de
São Manuel, SP...........................................................................
76
Tabela 16:
Valores médios e desvios-padrão da contagem total de
leucócitos, de acordo com a idade de bezerros da raça Nelore,
negativos para Babesia bovis, B. bigemina e Anaplasma
marginale, criados no município de São Manuel, SP...................
77
Tabela 17:
Idade, número total de leucócitos e parasitemia em amostras
de sangue de bezerros da raça Nelore, criados no município de
São Manuel, SP...........................................................................
78
Tabela 18:
Freqüência de infecções por Babesia bovis, B. bigemina e
Anaplasma marginale em teleóginas de Boophilus microplus
colhidas de bezerros nelore criados no município de São
Manuel-SP....................................................................................
80
_____________________________________________________________________Resumo
12
RESUMO
A dinâmica das infecções naturais por Babesia bovis, Babesia bigemina e
Anaplasma marginale, foi investigada ao longo do primeiro ano de vida de bezerros
da raça Nelore criados em sistema extensivo no Estado de São Paulo, com o
propósito de se avaliar a influência da criação exclusiva e extensiva de bovinos da
raça Nelore sobre a epidemiologia desses hemoparasitas.
Amostras de sangue de 17 animais P.O. foram colhidas a cada 15 dias do
nascimento até os quatro meses, e então, a cada 30 dias até um ano. Amostras de
sangue colhidas da ponta da orelha foram utilizadas para a confecção de
esfregaços sanguíneos, e amostras de sangue da veia jugular foram utilizadas para
a determinação da contagem total de eritrócitos (RBC), concentração de
hemoglobina (HB), volume globular (VG), contagem total de leucócitos (CTL) e
extração de DNA. As teleóginas colhidas foram incubadas em estufa BOD e
posteriormente submetidas ao processo de extração de DNA.
A amplificação do DNA dos hemoparasitas foi feita pelas técnicas de PCR e
nPCR, utilizando-se respectivamente os primers BoF e BoR; BoFN e BoRN para
Babesia bovis, BiIA e BilB; BilAN e BilBN para B. bigemina e Am9 e Am10; Am11 e
Am12 para A. marginale.
Ao longo de um ano de experimento não foram observados casos clínicos de
tristeza parasitária, e os quatro animais em que parâmetros hematológicos
indicativos de anemia foram detectados concomitantemente com uma ou mais
espécies de hemoparasitas se recuperaram sem que houvesse necessidade de
tratamento.
Babesia bovis não foi detectada nos esfregaços sangüíneos corados por
Giemsa, porém merozoítas de B. bigemina foram encontrados em 5 amostras de
sangue provenientes de 4 animais. Corpúsculos intraeritrocitários de A. marginale
foram detectados em 29 amostras oriundas de 14 animais, nas quais a mais elevada
taxa de parasitemia foi de 26%.
As reações de PCR e nPCR revelaram a presença de DNA de B. bovis em
sete amostras de sangue (quatro por PCR) de três animais, um dos quais com
menos de 24 horas de nascimento.
_____________________________________________________________________Resumo
13
O DNA de B. bigemina foi detectado em 47 amostras de sangue (25 por PCR)
colhidas de 15 animais e o DNA de A. marginale em 103 amostras de sangue (83
pela PCR). Não foram detectados resultados falso-negativos nas reações de
amplificação de DNA de B. bigemina e A. marginale.
A presença de amostras de soro positivas para os agentes da TPB, tanto com
menos de 24 horas após o nascimento (82% para B. bovis; 88% para B. bigemina;
94% para A. marginale), quanto aos nove meses de idade (100% para B. bovis; 94%
para B. bigemina; 100% para A. marginale), revela a condição de estabilidade
enzoótica para os agentes da tristeza parasitária bovina na propriedade estudada,
fato ratificado pelo histórico de mais de 20 anos do rebanho estudado, onde não há
relato de surtos epidêmicos de TPB, tendo observado-se apenas relatos de casos
isolados.
A utilização da técnica de nPCR como ferramenta para se detectar infecções
por Babesia spp. e A. marginale em teleóginas de B. microplus ingurgitadas nos
bezerros, não revelou a infecção por B. bovis em nenhuma teleógina; já o DNA de B.
bigemina foi detectado em duas (7,4%) teleóginas colhidas, uma das quais
proveniente de um animal no qual foi detectado a presença do protozoário pela PCR
na mesma colheita. O DNA de A. marginale foi detectado em 18 (66,6%) teleóginas
colhidas ao longo do primeiro ano de vida dos bezerros, das quais 13 colhidas de
animais nos quais foram detectados a presença desse parasita.
A partir dos resultados obtidos no presente trabalho, observou-se que a
criação extensiva e exclusiva de bovinos da raça Nelore não foi capaz de modificar o
quadro epidemiológico dos agentes etiológicos da TPB, de uma situação de
endemia estável para instável.
14
Abstract
The dynamics of natural Babesia bovis, Babesia bigemina and Anaplasma
marginale infection was investigated along the first year of Nelore calves, raised on
extensive system in São Paulo State. The purpose was to evaluate the influence of
the exclusive and extensive breeding of Nelore bovine on the epidemiology of those
hemoparasites.
Blood samples of 17 purebred animals were harvested every 15 days
beginning on the first day of birth till four months old, and then, every 30 days till one
year old. Blood samples from the ear tip were used to made blood smears, and blood
samples were taken from the jugular vein to determine the red blood cells total count
(RBC), hemoglobin concentration (HB), haematocrite (VG), leukocytes total count
(LTC) and DNA extraction. The engorged Boophilus microplus were incubated and
submitted to the DNA extraction process.
The hemoparasite DNA amplification was made by PCR and nPCR
respectively, using the primers BoF and BoR; BoFN and BoRN for Babesia bovis,
BiIA and BilB; BilAN and BilBN for B. bigemina and Am9 and Am10; Am11 and Am12
for A. marginale.
Clinical cases of parasitic sickness were not observed along one year of
experiment. The four animals that were observed with indication of anemia
hematological parameters, detected at the same time with one or more
hemoparasites species, recovered without treatment.
Babesia bovis was not detected in the blood smears. However, B. bigemina
merozoites were found in five blood samples coming from four animals. A. marginale
was detected in 29 blood samples of 14 animals, in which the highest parasitemia
level was 26%.
The reactions of PCR and nPCR revealed the presence of B. bovis DNA in
seven blood samples (four by PCR) from three animals, one of them born in less than
24 hours.
Babesia bigemina DNA was detected in 47 blood samples (25 by PCR) from
15 animals and A. marginale DNA in 103 blood samples (83 by PCR). False-negative
results were not detected on B. bigemina and A. marginale DNA amplification
reactions.
15
The positive TPB agents serum samples, not only those with less than 24
hours after birth (82% for B. bovis; 88% for B. bigemina; 94% for A. marginale), but
also nine months old (100% for B. bovis; 94% for B. bigemina; 100% for A.
marginale), revealed the enzootic stability condition on analyzed property, fact ratified
by the report of more than 20 years of the studied herd, where is no report of TPB
outbreaks, but only the occurrence of isolated cases.
The use of the nPCR technique as a tool to detect Babesia spp. and A.
marginale infections on engorged B. microplus did not reveal B. bovis infection in any
tick. However, B. bigemina DNA was detected in two (7,4%) engorged B. microplus,
one of them from an animal in which the presence of the protozoa parasite was
detected by PCR in the same sampling procedure. A. marginale DNA was detected
in 18 (66,6%) engorged B. microplus along the first year of the calves, from which 13
were collected from animals detected with the parasite’s presence.
From the results obtained in the present work, it was observed that the
extensive and exclusive breeding of Nelore bovine was not capable of modifying the
epidemic situation of the TPB etiological agents from a stable to an unstable endemic
situation.
16
1. I
NTRODUÇÃO
O Brasil é um país com grande vocação para pecuária, tendo atualmente no
setor produtivo animal, potencial imensurável e de grande importância econômico-
social. Para tornar mais racional o aproveitamento econômico da cadeia produtiva
animal e maximizar o desenvolvimento da pecuária de modo sustentável, faz-se
necessário utilizar as novas tecnologias, especialmente nas áreas de sanidade
animal, epidemiologia e controle das enfermidades infecciosas e parasitárias que
acometem os animais de produção.
Dentre as enfermidades parasitárias se destacam as pertencentes ao
complexo chamado Tristeza Parasitária Bovina, que no Brasil são causadas por dois
protozoários do gênero Babesia Babesia bigemina e Babesia bovis e pela
rickéttsia Anaplasma marginale. Ambas as espécies de protozoários são
transmitidas exclusivamente pelo carrapato Boophilus microplus, enquanto que
Anaplasma marginale pode também ser transmitida por moscas hematófagas
(KOCAN et al., 2003).
Na pecuária brasileira, as perdas econômicas causadas pelos agentes da
TPB são consideráveis, cerca de 500 milhões de dólares anuais segundo
estimativas do Ministério da Agricultura, corrigidas por GRISI et al. (2002).
Clinicamente essas enfermidades caracterizam-se por uma síndrome
hemolítica e febril, cuja gravidade está diretamente relacionada à reação do
hospedeiro frente à infecção (McCOSKER, 1981). Com isso, são responsáveis por
perdas econômicas consideráveis decorrentes do menor ganho ou perda de peso
dos animais parasitados, decréscimo da produção de leite, infertilidade ou
subfertilidade dos touros, abortamentos, mortalidade, gastos com medicamentos e
17
serviço médico veterinário, além do estado crônico portador, que interfere no
desenvolvimento normal dos animais.
Na cadeia epidemiológica da TPB, as complexas interações que resultam na
manutenção das taxas de infecção dos bovinos, das teleóginas de carrapatos e da
transmissão transovariana das diferentes espécies do protozoário são influenciadas
por fatores relacionados ao hospedeiro vertebrado, ao hospedeiro invertebrado e ao
meio ambiente (BOCK et al., 1999ª; 1999
b
; KESSLER & SCHENK, 1998ª;
MACHADO, 1991).
O conhecimento das interações que regulam a epidemiologia dos agentes da
TPB em cada região geográfica é indispensável para o desenvolvimento e aplicação
de medidas de controle que possam interromper a cadeia epidemiológica de modo a
reduzir os prejuízos à pecuária, seja pela redução da perda de produtividade, por
morbidade ou mortalidade de animais.
18
2. R
EVISÃO DE
LITERATURA
2.1. Babesioses bovinas
As babesioses bovinas são enfermidades que ocorrem em vários países nos
quais se destaca por causar considerável perda econômica, principalmente, nas
criações de raças taurinas e seus cruzamentos (BOCK et al., 2004).
No final do século XIX, um pesquisador romeno chamado Victor Babés e sua
equipe começaram a investigar mais detidamente uma enfermidade caracterizada
por um quadro de anemia hemolítica que acometia bovinos na Europa. Essa equipe
de pesquisadores conseguiu associar essa enfermidade, chamada na época de
hemoglobinúria enzoótica bovina, com a presença de microorganismos no interior de
eritrócitos dos animais doentes. Babés então, no ano de 1888, denominou esses
microorganismos de Haematococcus bovis, por pensar que se tratava de bactérias
(UILENBERG, 2006).
Cinco anos mais tarde, dois pesquisadores americanos, Smith e Kilborne,
associaram a ocorrência de uma enfermidade que se caracterizava por apresentar
alta taxa de mortalidade e sintomas muitos semelhantes à hemoglobinúria enzoótica
bovina, à presença de microorganismos intraeritrócitários. Além de conseguirem
caracterizar o microorganismo como sendo um protozoário, Pyrosoma bigeminum,
comprovaram que este agente era transmitido por um artrópode, o carrapato bovino
da América do Norte, Boophilus annulatus. A publicação desses resultados constitui
um marco histórico por ser o primeiro relato da transmissão de um protozoário por
um artrópode (BOCK et al., 2004).
Ainda no ano de 1893, STARCOVICI verificou a similaridade entre os
organismos descritos por Babés, na Romênia, e Smith e Kilborne nos Estados
19
Unidos, e propôs a inclusão de ambos em um novo gênero chamado Babesia, em
homenagem ao pesquisador romeno (UILENBERG, 2006).
Das oito espécies do gênero Babesia que são capazes de infectar bovinos
(UILENBERG, 2006), Babesia bigemina e Babesia bovis são encontradas no Brasil
(VIDOTTO et al., 1995; GUGLIELMONE, 1995). O primeiro relato dessas
enfermidades no Brasil data de 1901, quando Francisco Fajardo diagnosticou a
presença dos protozoários ao examinar animais recém-importados e em fase de
aclimatação no Rio de Janeiro (FONSECA & BRAGA, 1924).
A ocorrência das babesioses bovinas está intimamente relacionada à
distribuição do carrapato Boophilus microplus, sendo esse artrópode considerado
como o único vetor biológico e o responsável pela difusão desses protozoários
(BOCK et al., 2004). Esse carrapato é originário da Ásia e se espalhou por diversas
regiões, acompanhando a transferência de animais, sendo encontrado na Ásia,
Austrália, México, América do Sul e África, tendo sua área de distribuição situada
entre os paralelos 40° Norte e 32º Sul (McCOSTER, 1981).
Os bovinos, hospedeiros intermediários de Babesia spp., se infectam pela
inoculação de esporozoítas presentes na glândula salivar dos carrapatos no ato do
repasto sangüíneo. A inoculação de B. bovis ocorre quando o carrapato está na fase
de larva e a de B. bigemina ocorre quando o carrapato está na fase de ninfa (RIEK,
1964, 1966).
Utilizando substâncias presentes nas organelas que formam o complexo
apical, as quais viabilizam a introdução do parasita no eritrócito, os esporozoítas
invadem os eritrócitos sem que haja o seu rompimento. Já dentro do eritrócito, os
parasitas evadem-se do vacúolo parasitóforo e se transformam em merozoítas,
quando irão se multiplicar por divisão binária dando origem a dois merozoítas; estes
20
merozoítas rompem a célula parasitada e penetram em outro eritrócito íntegro para
continuar a multiplicação (BOCK et al., 2004).
A infecção dos carrapatos por Babesia spp. ocorre durante a hematofagia das
teleóginas em animais com parasitemia. Após a ingestão de eritrócitos parasitados,
os merozoítas sofrem alterações morfo-fisiológicas adaptativas se preparando para o
inicio do ciclo sexuado (FRIEDHOFF, 1988). MACKENSTEDT et al. (1995),
identificaram no sangue dos bovinos um tipo ovóide de merozoíta de B. bigemina
que seriam as formas infectantes do protozoário para o carrapato, denominando-o
de gamonte.
As primeiras observações do ciclo sexuado de Babesia spp. se deram em
1906 por KOCH e por KLEINE. O primeiro autor observou a presença de formas
características do protozoário, e denominou-as de corpos estrelados, associando-as
a estágios de reprodução sexuada. Esses corpos estrelados seriam os gametas do
protozoário, responsáveis pela gametogonia, ou seja, a fase sexuada do ciclo
biológico. Os gametas se fundem formando zigotos (MACKENSTEDT et al.1995)
móveis que penetram nas células do epitélio intestinal do carrapato. Ao se
multiplicarem por esporogonia, dão origem aos esporocinetos, que são maiores e em
forma de arco, que são liberados na hemocele (MOSQUEDA et al., 2004).
Por serem móveis, os esporocinetos invadem vários órgãos do carrapato,
iniciando múltiplos ciclos de esporogonia, que se estendem até a morte da teleógina
(BOCK et al., 2004). Desse modo, Babesia spp. são capazes de infectar a progênie
de teleóginas, sendo essa via de infecção chamada de transovariana. Uma vez
infectados os ovos, vários ciclos de esporogonia ocorrem nos embriões e larvas,
culminando com a presença de inúmeros esporozoítas nas glândulas salivares dos
carrapatos jovens (BOCK et al., 2004).
21
Segundo KESSLER & SCHENK (1998
a
), a transmissão transovariana é
fundamental para a manutenção da endemia dessa parasitose. Aparentemente,
esse mecanismo de transmissão é a principal explicação para a sua ampla
distribuição geográfica (MEHLHORN & SCHEIN, 1984).
RIEK (1964, 1966) foi o primeiro autor a descrever a seqüência de eventos
que culminam na transmissão transovariana de B. bigemina e B. bovis. A partir
desses trabalhos, várias pesquisas foram realizadas com o intuito de se esclarecer
as interações entre as diferentes espécies de Babesia e os carrapatos (POTGIETER
& ELS, 1976; CAFRUNE & AGUIRRE, 1995; GUGLIELMONE et al., 1997,
BARREIRA et al., 2005
ª
; 2005
b
). Nessas pesquisas foram investigadas a
possibilidade de se discriminar morfologicamente formas evolutivas de B. bovis e B.
bigemina no carrapato (POTGIETER & ELS, 1976; GUGLIELMONE et al., 1996) e
também os efeitos do parasitismo por Babesia spp. sobre os hospedeiros
invertebrados (SANTOS, et al., 1998; CEN-AGUILAR et al., 1998; OLIVEIRA et al.,
2005).
Outras abordagens que se fizeram possíveis incluem os aspectos
epidemiológicos da infecção dos carrapatos. Assim, MAHONEY & MIRRE (1971),
observaram que a freqüência de infecções por B. bovis variou de 22 a 30% e de B.
bigemina de 36% em teleóginas de B. microplus colhidas de bovinos
experimentalmente infectados. Posteriormente, verificou-se que as taxas de infecção
por Babesia spp. nas teleóginas de B. microplus podem ser influenciadas por uma
série de fatores relacionados aos bovinos, como a idade (QUINTÃO-SILVA et al.,
2003; OLIVEIRA et al., 2005), parasitemia (SANTOS et al., 1998) e raça
(GULIELMONE, 1992). Outros fatores, como o tempo de incubação da teleógina,
22
também podem influenciar na detecção da infecção por Babesia spp. nos carrapatos
(GUGLIELMONE et al., 1997).
A infecção do hospedeiro vertebrado por B. bovis se dá de dois a três dias
após a fixação das larvas de B. microplus, enquanto que B. bigemina é transmitida
após oito a dez dias, quando os ixodídeos já se encontram na fase de ninfa (RIEK,
1964, 1966). De modo geral, o período pré-patente de B. bovis varia de 6 a 12 dias e
de B. bigemina de 12 a 18 dias após a fixação dos carrapatos.
No Brasil, o carrapato B. microplus incide em todo o território com intensidade
de parasitismo variando em função das condições climáticas, do manejo de
rebanhos e pastagens e da raça dos bovinos explorados (GOMES, 1998).
As raças bovinas se comportam de modo diverso frente às infestações por
carrapatos: enquanto raças européias são mais sensíveis, as raças zebuínas
apresentam uma resistência de caráter genético, muito maior (GOMES, 1998;
JONSSON et al., 2000). Essa característica é transmitida de geração para geração,
guardando uma proporção em relação ao grau de sangue resultante do cruzamento;
assim, animais da primeira geração (F1) resultante do cruzamento de taurinos com
zebuínos são ainda bastante susceptíveis ao carrapato e às doenças por ele
transmitidas (SARTOR et al., 1992; BOCK et al., 1999
b
).
Há evidências de que a raça dos bovinos também interfere na gravidade das
infecções por hemoparasitos transmitidos por carrapatos (GUGLIELMONE, 1992;
BOCK et al., 1999
a
; JONSSON et al., 2000), sendo as raças zebuínas também mais
resistentes do que as taurinas (MADRUGA et al., 1984; UILENBERG, 1995; BOCK
et al., 1997).
A susceptibilidade dos animais zebuínos às babesioses tem sido questionada,
existindo controvérsia entre autores. Para alguns, a resistência à infecção por
23
Babesia spp. poderia estar relacionada à ineficiente transmissão dos protozoários
pelo vetor, em decorrência da maior resistência dos zebuínos ao carrapato, já que,
nesses animais a maioria dos carrapatos morre precocemente (GOMES et al., 1989;
SARTOR et al., 1992). Contudo, o que se observa é que os bovinos zebuínos
também se infectam, porém, geralmente, apresentam enfermidade subclínica após a
infecção primária por Babesia spp. ( BOCK et al., 1997).
No que diz respeito à idade dos animais considera-se que os animais jovens
sejam naturalmente mais resistentes, já que com freqüência apresentam infecções
subclínicas (BROWN, et al., 2006). No entanto, MADRUGA et al. (1984) verificaram
que no período entre 28 a 56 dias após o nascimento, para B. bigemina e 84 a 112
dias, para B. bovis, os títulos de anticorpos são baixos, aumentando a probabilidade
dos animais a desenvolverem as babesioses de forma aguda. Segundo MAHONEY
& MIRRE. (1977), os efeitos da infecção por Babesia spp. são minimizados pela
exposição dos animais aos hemoprotozoários desde os primeiros meses de vida,
quando os anticorpos colostrais estão elevados.
Ao que tudo indica, outros fatores além dos anticorpos colostrais estariam
envolvidos na resistência relacionada à idade, visto que a resistência de animais
jovens excede o período de proteção dos anticorpos colostrais (BROWN et al.,
2006). Além disso, bezerros nascidos em regiões livres de Babesia spp. também
apresentam certo grau de resistência às infecções experimentais (GOFF et al.,
1982). A imunidade humoral tem importância secundária nas infecções por Babesia
spp., na qual os anticorpos teriam a função de opsoninas, facilitando a fagocitose
dos parasitas pelas células de defesa do organismo do hospedeiro (BOCK et al.,
2004).
24
Além da raça e idade dos hospedeiros vertebrados, outros fatores que
interferem no ecossistema do B. microplus podem desencadear situações em que a
superinfestação pelo carrapato aumenta o desafio, sobrepujando a resposta
imunológica dos animais aos hemoparasitas, inclusive em áreas endêmicas
(GOMES, 1998). Segundo FRIEDHOFF (1988), existe uma relação diretamente
proporcional entre o número de carrapatos ingurgitados e a taxa de inoculação do
protozoário.
A resposta imunológica dos bovinos à infecção por Babesia spp. envolve
tanto mecanismos inatos como adquiridos. A imunidade inata está relacionada a
fatores como especificidade parasita-hospedeiro, características genéticas, idade e
resposta imune celular do hospedeiro (BOCK et al., 2004). Diferentemente do que
acontece nas anaplasmoses bovinas, não existe imunidade cruzada entre B. bovis e
B. bigemina, ou seja, a infecção por uma dessas espécies não protege o animal
contra a outra (SMITH et al., 1980).
Do ponto de vista epidemiológico, as babesioses bovinas ocorrem sob dois
panoramas distintos regulados pela dinâmica das populações de carrapatos B.
microplus: estabilidade e instabilidade endêmica.
A situação de estabilidade endêmica é caracterizada pela constante
transmissão dos protozoários, de forma que a primo-infecção dos bovinos ocorre
durante o período em que os animais jovens estão protegidos pela imunidade
passiva e sob a ação da resistência inata. Essa situação é caracterizada pela
ocorrência de muitos casos subclínicos e poucos casos clínicos da enfermidade
(GUGLIELMONE, 1995; COLEMAN, et al. 2001).
25
MAHONEY et al. (1973), estimou que, quando cerca de 75% dos bovinos são
infectados por Babesia spp. entre seis e nove meses de idade, a enfermidade ocorre
em níveis baixos, caracterizando uma situação de estabilidade endêmica.
Nas áreas de instabilidade, os bezerros não se infectam por períodos
prolongados e a presença do carrapato é inconstante ou insuficiente para assegurar
taxas de inoculação de Babesia spp. capazes de manter elevado o nível de
imunidade dos bovinos (MAHONEY et al., 1981). Nessa situação existe a
possibilidade de ocorrência de um grande número de casos clínicos, geralmente de
curso agudo e com alta taxa de mortalidade (UILEMBERG, 1995).
Apesar do potencial patogênico, as infecções por Babesia spp. muitas vezes
são assintomáticas, e os animais tendem a apresentar baixa parasitemia,
originando-se assim formas subclínicas da enfermidade (RADOSTITS et al., 2000).
Os sintomas clínicos e o curso da infecção dependem também da espécie do
protozoário envolvido; no entanto, infecções por B. bigemina ou B. bovis determinam
febre, anemia, hemoglobinemia, hemoglobinúria e fraqueza, podendo evoluir para a
morte do animal (RADOSTITS et al., 2000). Segundo MAHONEY & MIRRE (1977) e
PANDEY & MISHRA (1978), existe uma correlação direta entre a elevação da
temperatura corpórea e o aumento da parasitemia.
Os registros de infecção intra-uterina por Babesia spp. em bovinos foram
feitos tendo por base a ocorrência de enfermidade clínica nos neonatos (BANNOR,
1976; DOWSETT et al., 1978; BARBOSA et al., 1994; EGELI, 1996; BRACARENSE
et al., 2001; YERUHAM et al., 2003). Com a utilização de técnicas mais sensíveis,
OSAKI et al. (2002) identificaram que esse tipo de infecção não é seguido,
necessariamente, de sintomas clínicos, e com isso, a relevância dessa via de
infecção pode estar subestimada.
26
A infecção por B. bigemina é capaz de causar danos celulares e tissulares em
decorrência da hemólise intravascular e da conseqüente hipóxia tecidual ocasionada
pela diminuição de eritrócitos circulantes, que afeta principalmente o fígado e os rins
(PANDEY & MISHRA, 1978).
A infecção por B. bovis pode causar manifestações nervosas em decorrência
da hipóxia e inflamação determinada pela presença dos parasitas nos capilares
cerebrais. Os eritrócitos parasitados por B. bovis apresentam uma alteração na
superfície da membrana citoplasmática que promovem a aderência da célula
parasitada ao endotélio vascular e a outras hemácias não parasitadas (COOKE et
al. 2005).
O aglomerado de eritrócitos formado nos capilares cerebrais interfere na
circulação local, levando a alterações hemodinâmicas que culminam com danos
tissulares. A babesiose cerebral ou nervosa é caracterizada por incoordenação
motora, convulsão, opistótono, coma e morte (RADOSTITIS et al., 2000;
RODRIGUES et al, 2005).
Dentre as principais alterações hematológicas, a anemia, que no início é
normocítica normocrômica, torna-se macrocítica normocrômica pela presença de
reticulócitos. Tal patologia é resultado direto da hemólise intravascular que é
conseqüência da reprodução e evasão dos merozoítas, causando o rompimento dos
eritrócitos parasitados. Ao mesmo tempo, ocorre a deposição de metabólitos do
parasita sobre a membrana celular de vários eritrócitos, fazendo com o que
eritrócitos normais que apresentam complexos estranhos em sua superfície, sejam
fagocitados (MURASE et al., 1996; FIGHERA, 2001). Segundo ARAGON (1976), a
anemia é diretamente proporcional à parasitemia.
27
MENDONÇA et al. (2002) observaram que entre dois e quatro dias após a
inoculação experimental de B. bigemina em bezerros Nelore, mantidos em
isolamento, ocorrem alterações na contagem total de eritrócitos, concentração de
hemoglobina e volume globular, mas que esses valores retornam a níveis próximos
aos anteriores cerca de 16 dias após a infecção. Os autores atribuem esses
achados à rusticidade racial dos animais, pois mesmo sem imunidade prévia são
capazes de debelar a infecção.
A constatação de uma leucopenia inicial seguida de uma fase mais duradoura
de leucocitose por neutrofilia foram achados comuns relatados após a inoculação de
Babesia em bezerros taurinos submetidos a premunição (KOHAYAGAWA et al.
1990) e em bezerros Nelore experimentalmente inoculados com diferentes isolados
geográficos de B. bigemina (MENDONÇA et al. 2002).
Nas babesioses, a fase aguda da enfermidade é caracterizada não só pelos
sinais de hemólise, mas também por uma parasitemia elevada (BOSE et al., 1995).
Nessa situação, o exame direto de esfregaços sangüíneos colhidos de ponta de
orelha é o principal método diagnóstico empregado, pois além da praticidade é o
método que apresenta o mais baixo custo. Porém a baixa sensibilidade dessa
técnica é um fator limitante para a aplicação em estudos epidemiológicos, em
decorrência da incapacidade de se detectar animais cronicamente infectados
convertidos ao estado de portador (BOSE et al., 1995; COSTA-JUNIOR et al., 2006).
As técnicas sorológicas para pesquisa de anticorpos específicos têm sido
freqüentemente empregadas em estudos epidemiológicos das babesioses, e com
base no status imunológico dos animais é possível definir a situação epidemiológica
das diferentes regiões de ocorrência dessas parasitoses (MAHONEY et al., 1973).
28
Muitos testes sorológicos foram desenvolvidos para a detecção de anticorpos
anti-Babesia spp., porém três técnicas são mais rotineiramente empregadas: fixação
do complemento (FC), reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e ensaio de
imunoadsorção enzimática indireta (ELISA-I).
O teste de fixação de complemento é primariamente utilizado para detecção
de anticorpos IgM, ou seja, para detecção de animais recentemente infectados
(BÖSE et al., 1995). A sensibilidade do teste diminui com o curso da infecção e sua
utilização é limitada em áreas de endemia estável para Babesia spp. (REITER &
WEILAND, 1989).
A reação de imunofluorescência indireta (RIFI) é uma técnica sorológica
amplamente empregada, tem baixo custo, porém, além de ser mais laboriosa, tem a
desvantagem da subjetividade do diagnóstico (TIZARD, 2002).
O ensaio de imunoadsorção enzimática indireta (ELISA-I) vem sendo
amplamente utilizado para o diagnóstico de Babesia spp.( MADRUGA et al., 2000
a
;
SOUZA et al., 2000; SOARES et al., 2000; MADRUGA et al., 2001; D’ANDREA et
al., 2006). No entanto, a sensibilidade e a especificidade dos exames são
grandemente influenciadas pela qualidade do antígeno utilizado. A técnica de
ELISA-I tem as vantagens de ser objetiva, de possibilitar a avaliação de um grande
número de amostras em curto intervalo de tempo, e de utilizar leitura mecanizada e
rápida, sendo por isso indicada para a realização de inquéritos epidemiológicos
(TIZARD, 2002).
Nos vários estudos soroepidemiológicos sobre babesiose bovina realizados
no Brasil, as prevalências detectadas revelam uma situação de estabilidade
endêmica na maior parte do território. No Mato Grosso do Sul a prevalência de
anticorpos anti-B. bovis foi de 83% (MADRUGA et al., 2000
a
) e de 87 a 98% para B.
29
bigemina (MADRUGA et al., 2001); no Rio de Janeiro de 90% para B. bovis
(SOARES et al., 2000) e de 69% para B. bigemina (SOUZA et al., 2000); no Paraná
de 64% para B. bovis (OSAKI et al., 2002) e na Bahia 91% para B. bovis e 95% para
B. bigemina (BARROS et al., 2005).
Apesar de apresentarem elevadas sensibilidade e especificidade, uma das
principais limitações dos métodos sorológicos é que eles apenas indicam a
exposição ao agente infeccioso, não informando sobre o curso da infecção
(WAGNER et al., 1992).
O advento das técnicas moleculares de diagnóstico propiciou a conjugação
de elevada sensibilidade e especificidade com a possibilidade de detecção do
próprio parasita, e não de anticorpos. Essa característica é particularmente
interessante, pois permite discriminar os animais infectados que apresentam baixa
parasitemia daqueles que por haverem eliminado as infecções não são fonte de
infecção para os carrapatos.
A técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR) é baseada na
amplificação de milhões de cópias de uma região específica do genoma de qualquer
organismo, utilizando-se uma enzima DNA-polimerase termoestável,
oligonucleotídeos livres e seqüências de oligonucleotídeos iniciadores (primers), em
um tampão contendo substâncias que favorecem a reação (FIGUEROA et al., 1992;
BÖSE et al., 1995; FIGUEROA et al., 1996).
A PCR apresenta sensibilidade cerca de 100 vezes maior que a técnica de
esfregaço sangüíneo, detectando cerca de 10 pg de DNA do parasita nas amostras
de sangue (BÖSE et al., 1995), sendo que essa sensibilidade pode ser aumentada
ainda mais pela utilização da técnica de nested PCR (COSTA-JUNIOR et al., 2006).
30
A nPCR é capaz de detectar quantidades tão pequenas quanto 1 fg de DNA
(BÖSE et al., 1995), e consiste na utilização de seqüências iniciadoras internas às
utilizadas na PCR, ou seja, que anelem ao fragmento amplificado pela PCR em uma
segunda bateria de amplificação, aumentando ainda mais o número de cópias da
seqüência alvo e consequentemente a sensibilidade do teste (FIGUEROA et al.,
1996).
Em virtude da alta sensibilidade do teste, podem ocorrer contaminações por
produtos da amplificação (amplicons) de amostras de uma mesma bateria, gerando
resultados falso-positivos. Todavia, uma série de medidas profiláticas como,
realização de cada fase do teste em ambientes distintos, utilização de tubos e
ponteiras estéreis, exposição e limpeza das bancadas com radiação ultravioleta e
hipoclorito de sódio à 10% são executadas a fim de se evitar a contaminação de
amostras (BARTKOWIAK, 2003).
A utilização das técnicas de PCR na investigação epidemiológica das
infecções por Babesia spp. tem produzido informações relevantes, pois permitem a
detecção desses agentes tanto nos hospedeiros vertebrados (BUENNING &
FIGUEROA, 1996; OSAKI et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2005, TEGLAS et al., 2005),
quanto nos carrapatos (SPARAGANO et al., 1999; OLIVEIRA-SEQUEIRA et al.,
2005).
No que se refere às babesioses bovinas, o emprego dessa metodologia
permitiu que se constatasse que, em área endêmica para B. bovis e B. bigemina, a
freqüência de bezerros mestiços leiteiros infectados era similar à de vacas
(OLIVEIRA-SEQUEIRA et al., 2005). No entanto, no que se refere à infecção de B.
microplus, esses autores constataram que teleóginas alimentadas em bezerros
apresentavam maior freqüência de infecções por B. bigemina e que teleóginas
31
alimentadas em vacas apresentavam freqüências similares de infecção por B. bovis
e B. bigemina.
32
2.2. Anaplasmose bovina
O gênero Anaplasma inclui duas espécies que infectam bovinos, Anaplasma
marginale (Theiler, 1910) e A. centrale (Theiler, 1911). A. marginale é a espécie mais
patogênica, e A. centrale por ser menos patogênica é utilizada como vacina viva em
bovinos de diversas regiões do mundo (de la FUENTE et al., 2005
a
).
No texto de FONSECA & BRAGA (1924), “Noções sobre a Tristeza
Parasitária dos Bovinos”, podem ser obtidos os detalhes sobre o histórico inicial do
conhecimento sobre esse hemoparasita, do qual foram extraídas as breves
informações que se seguem: Em 1910, Theiler, na África do Sul, identificou
Anaplasma marginale como sendo o agente etiológico de uma enfermidade muito
similar à febre do Texas, que era conhecida como febre biliar bovina. Antes disso,
Smith & Kilborne (1893) consideraram que as “granulações endoglobulares” ou
“peripheral coccuslike” seriam produtos da multiplicação de piroplasmas causadores
da Febre do Texas. Ao descrever a “Tristeza” na República Argentina, Lignieres
(1900) também mencionou a presença dessas granulações, sem, contudo,
classificá-las como anaplasmas. Ainda na região da Plata, Knuth (1905) considerou
que os anaplasmas eram parte do ciclo biológico de “piroplasma bigeminum”. Por
esse breve histórico é possível perceber que, a princípio, as similaridades entre as
infecções causadas por Babesia spp. e Anaplasma marginale, associadas ao fato de
suas distribuições serem coincidentes, representaram uma complicação na
caracterização individual desses hemoparasitas e explicam o seu agrupamento em
uma única síndrome denominada popularmente de “Tristeza Parasitária dos
Bovinos”.
33
Atualmente, com base em análises genéticas dos genes 16S rRNA, groELS e
de genes que codificam proteínas de superfície, A. marginale é classificado como
um organismo pertencente à Ordem Rickettsiales que inclui duas famílias:
Anaplasmataceae e Rickettsiaceae. Os membros da família Anaplasmataceae são
parasitas intracelulares obrigatórios, encontrados exclusivamente no interior de
vacúolos no citoplasma da célula hospedeira (KOCAN et al., 2002).
Dentre os agentes patogênicos transmitidos por carrapatos, Anaplasma
marginale é o que apresenta distribuição mais ampla, estando presente nas regiões
tropicais, subtropicais e temperadas do mundo, incluindo todo continente Americano,
Austrália e sudeste do continente Africano (GUGLIELMONE, 1995; KOCAN et al.,
2003). Contudo, tanto a freqüência como a incidência de infecções por essa
rickéttsia são mais elevadas em regiões em que o carrapato Boophilus microplus é
endêmico (FUTSE et al., 2003).
A transmissão de Anaplasma marginale tem sido motivo de muita polêmica,
pois ainda persistem muitas dúvidas em relação aos mecanismos de transmissão e
à importância epidemiológica de cada um dos diferentes mecanismos de
transmissão e dos possíveis vetores (GUGLIELMONE, 1995).
A transmissão biológica de A. marginale já foi demonstrada
experimentalmente em mais de 20 espécies de carrapatos ixodídeos (KOCAN et al.,
1992; STILLER & COAN, 1995; KOCAN et al., 2004), mas a relevância de cada uma
dessas espécies na transmissão, sob condições naturais, ainda não está bem
definida (GONÇALVES-RUIZ et al., 2002). No Brasil, onde o carrapato Boophilus
microplus ocorre de forma endêmica, as evidências epidemiológicas sugerem ser ele
o principal vetor de A. marginale (GUGLIELMONE, 1995, KESSLER, 2001).
34
A morfologia e o desenvolvimento das formas evolutivas de A. marginale no
intestino de B. microplus foram estudadas empregando-se microscopia óptica e
microscopia eletrônica (RIBEIRO & LIMA, 1996). Nesse estudo, os autores
descreveram detalhadamente a seqüência do desenvolvimento da rickéttsia no
intestino do carrapato, comprovando a sua replicação nesse local.
Os carrapatos podem transmitir agentes patogênicos pelas vias
transovariana, transtadial ou intrastadial (GONÇALVES-RUIZ et al., 2002). No caso
de A. marginale, a transmissão transovariana por B. microplus é contestada por
diversos autores (RIBEIRO & LIMA, 1996; GONÇALVES-RUIZ et al., 2002). No
entanto, utilizando a técnica de nPCR, MOURA et al. (2003), detectaram a presença
de DNA de Anaplasma na progênie de teleóginas de B. microplus nPCR positivas (3
de 104) e também na de teleóginas nPCR negativas (34 de 152). SHIMADA et al.
(2004) detectaram, pela reação de PCR, a presença de DNA de A. marginale tanto
em larvas coletadas de pastagens como das provenientes de teleóginas alimentadas
em bezerros portadores assintomáticos.
Os dados disponíveis até o momento, sobre a transmissão de A. marginale
para ovos e larvas de B. microplus, sugerem que este pode ser um evento se não
pouco freqüente na natureza como sugerido por (RIBEIRO et al., 1996, KOCAN et
al., 2004), pelo menos irregular, mesmo porque ainda não foi comprovada a
transmissão de A. marginale por larvas de B. microplus que tenham sido infectadas
por esta via (KOCAN et al., 2004).
Apesar de o carrapato B. microplus ser um parasita monoxeno e realizar as
ecdises sobre o hospedeiro, admite-se que a transmissão transestadial (de larvas
para ninfas e de ninfas para adultos) possa ocorrer, pois os carrapatos mudam
freqüentemente de hospedeiro ao se deslocarem do local de fixação do ínstar
35
anterior para fixar-se e reiniciar a alimentação do novo ínstar (KESSLER, 2001).
Destaca-se nesse sentido a possibilidade de bezerros lactentes se infectarem com
carrapatos provenientes de suas mães (MELO et al., 2001).
A transmissão intra-estadial de A. marginale, atribuída aos carrapatos
machos, pode ser um importante mecanismo de transmissão no caso de carrapatos
monoxenos, em virtude da sua grande movimentação e longevidade (POTGIETER,
1981). De acordo com AGUIRRE et al. (1994), tanto a transmissão transestadial
como a intra-estadial são mais prováveis nos sistemas de criação intensiva devido
ao contato físico mais freqüente entre os animais, o que facilitaria a transferência
dos carrapatos.
No caso de carrapatos de três hospedeiros, larvas, ninfas e adultos
alimentados em animais infectados adquirem e transmitem a infecção de forma
eficaz (ERICKS et al., 1993, FUTSE et al., 2003) pelas vias transtadial (ninfas e
adultos), e intrastadial (machos adultos).
No que diz respeito à transmissão biológica de A. marginale há ainda dois
aspectos que precisam ser considerados. Em primeiro lugar, a existência de isolados
de A. marginale que não infectam carrapatos (KOCAN et al., 2002). Esse fato pode
ser ilustrado pela demonstração de que isolados brasileiros de A. marginale
desprovidos de apêndice se multiplicam nas células epiteliais do intestino de B.
microplus (RIBEIRO & LIMA, 1996), enquanto que os isolados que apresentam
apêndice não o fazem (GONÇALVES-RUIZ et al., 2002). Em segundo lugar, a
observação de que níveis flutuantes de parasitemia dos bovinos alteram a proporção
de carrapatos infectados e também a intensidade de infecção dos vetores. De
acordo com ERICKS et al. (1993), existe uma correlação positiva entre a taxa média
de parasitemia nos bovinos e a taxa de infecção dos carrapatos.
36
A existência de isolados não transmissíveis por carrapatos põe em evidência
outras possíveis formas de transmissão da rickéttsia que assumiriam, assim, um
papel de destaque na epidemiologia da anaplasmose bovina (de la FUENTE et al.,
2005
b
).
A transmissão mecânica pode ser efetuada por insetos hematófagos e por
materiais como agulhas, bisturis, etc, contaminados por sangue (KOCAN et al.,
2005). Os dípteros hematófagos freqüentemente referidos como vetores mecânicos
incluem diferentes espécies de tabanídeos, Stomoxys calcitrans e algumas espécies
de mosquitos (KESSLER, 2001).
Os dados experimentais sobre a eficiência e o impacto da transmissão
mediada por insetos hematófagos são escassos. De acordo com SCOLES et al.
(2005), esse tipo de transmissão depende, fundamentalmente, do nível de
parasitemia no momento da alimentação do inseto, e dessa forma se restringe à fase
aguda da infecção dos bovinos. Por outro lado, essa forma de transmissão seria a
mais importante para a disseminação de A. marginale em regiões onde não ocorre o
carrapato vetor; em regiões em que os isolados geográficos não infectam os
carrapatos ou onde os carrapatos foram erradicados (KOCAN et al. 2003). De
acordo com GUGLIELMONE (1995), na Argentina A. marginale ocorre de forma
endêmica em regiões em que o carrapato B. microplus foi erradicado e que surtos
esporádicos de anaplasmose ocorrem nas regiões temperadas do país que são
naturalmente livres do carrapato.
A via transplacentária é outra forma referida de transmissão de A. marginale
cuja importância epidemiológica carece de melhor definição. A maioria dos relatos
de transmissão congênita refere-se a casos em que bezerros recém-nascidos
desenvolveram doença hemolítica grave (PAINE & MILLER, 1977, NORTON et al.,
37
1983; PASSOS & LIMA, 1984). No entanto, RIBEIRO et al. (1995), utilizando
métodos sorológicos de diagnóstico, detectaram a transmissão congênita de A.
marginale em 4 de 11 bezerros nascidos de vacas inoculadas e em 2 de 97 fetos
examinados em abatedouro, demonstrando que na fase aguda da infecção a
transmissão congênita seria mais freqüente.
Quanto ao significado epidemiológico da transmissão congênita e dos animais
nascidos congenitamente infectados, não existe uma clara definição. As
observações de NORTON et al. (1983) sugerem que a importância das infecções
fetais estaria relacionada à mortalidade neonatal, que seria, inclusive, maior do que
a registrada por causa das perdas neonatais não diagnosticadas. De acordo com as
conclusões de ZAUGG (1985), a infecção intrauterina seria responsável apenas pelo
estímulo antigênico que induz a resposta imune do feto. Esse autor postulou que o
material que infecta o feto permaneceria infectivo por muito pouco tempo e que, por
isso, os animais nascidos com sorologia positiva não constituiriam uma fonte de
infecção.
KOCAN et al. (2003) consideraram que a transmissão congênita de A.
marginale poderia ter importância epidemiológica em algumas regiões, referindo-se,
mais especificamente, aos dados obtidos por POTGIETER & VAN RESBURG (1987)
na África do Sul, onde constataram a ocorrência de infecção intrauterina em 15,6%
de 77 bezerros de um rebanho. Nos bovinos, A. marginale é encontrada
exclusivamente no interior dos eritrócitos onde, ao se multiplicar por fissão binária,
produz rickttsemias persistentes que são detectáveis, microscopicamente, quando o
número de eritrócitos parasitados excede a 10
7
células. Estudos de microscopia
eletrônica revelaram que A. marginale penetra nos eritrócitos sob a forma de
corpúsculo inicial, graças a uma invaginação da membrana do eritrócito (RISTIC &
38
CALDER, 1977) que dá origem a um vacúolo. Logo após a invasão, tem início a
multiplicação por fissão binária e a formação de um corpúsculo de inclusão contendo
de quatro a oito corpúsculos iniciais. Os corpúsculos formados deixam o eritrócito
sem rompê-lo e invadem outras células vermelhas, dando continuidade ao ciclo
(KOCAN et al., 2003).
Inicialmente, o número de eritrócitos parasitados aumenta exponencialmente,
quando então são fagocitados por células do sistema fagocítico mononuclear (SFM),
resultando em anemia e icterícia, sem que ocorra hemoglobinemia e hemoglobinúria
(de la FUENTE et al., 2001).
Além da alteração eritrocitária, ALFONSO et al. (1996) demonstraram que
após o segundo dia da infecção experimental por A. marginale se instala um quadro
de leucocitose que desaparece após cerca de 30-35 dias a infecção. O quadro
clínico ainda é caracterizado por febre e perda de peso, podendo levar os animais a
óbito.
Os bovinos que sobrevivem à fase inicial da infecção convertem-se em
portadores, ou seja, permanecem infectados, porém com baixos níveis de
parasitemia, o que geralmente não é suficiente para desencadear os sinais típicos
da doença (PALMER et al., 2000). Embora essa imunidade seja duradoura e impeça
novas infecções, os bovinos persistentemente infectados se portam como fonte de
infecção para os artrópodes vetores, favorecendo o trânsito da rickéttsia no rebanho
(GUGLIELMONE, 1995).
A resposta imunológica dos bovinos infectados por A. marginale envolve tanto
mecanismos de origem humoral quanto celular, tendo o baço importante função no
desenvolvimento e manutenção dessa imunidade (VIDOTTO & MARANA, 2001). A
remoção do baço deixa os bezerros totalmente susceptíveis à infecção, e a
39
anaplasmose em bezerros esplenectomizados é geralmente mais grave do que a
observada em bovinos adultos (KOCAN et al., 2004). A esplenectomia prejudica
tanto a defesa imune celular, quanto a formação de anticorpos IgM, que aparecem
após a infecção e apresentam atividade de fixação de complemento (TIZARD, 2002).
Bezerros são mais resistentes à infecção por A. marginale do que bovinos
adultos, pois quando infectados são menos propensos a desenvolver a anaplasmose
(KOCAN et al., 2004). Os bezerros nascidos em regiões endêmicas, ao se
infectarem nos primeiros dias de vida, apresentam elevada imunidade em
decorrência da ação de anticorpos colostrais e da imunidade celular (MADRUGA et
al., 1987). Na região metalúrgica de Minas Gerais, MELO et al. (2001), constataram
que bezerros nascidos na estação seca estariam sujeitos a desenvolverem doença
na estação chuvosa subseqüente, provavelmente, em virtude dos baixos níveis de
anticorpos colostrais e da escassa proteção dos anticorpos adquiridos, já que na
estação seca o desafio pelos carrapatos é baixo e insuficiente para estimular a
produção de níveis elevados de anticorpos.
Em virtude dessas características epidemiológicas, o conceito de
estabilidade/instabilidade enzoótica, proposto e aplicado por MAHONEY et al. (1973)
no estudo das babesioses bovinas, também tem sido aplicado no estudo da
anaplasmose bovina (GUGLIELMONE, 1995).
Se por um lado a resistência etária nas infecções por A. marginale seja
reconhecida consensualmente à semelhança do que se observa nas babesioses
bovinas, a susceptibilidade relacionada à raça é contestável. Em diversos estudos
realizados sob condições naturais ou experimentais (OTIM et al., 1980; BOCK et al.,
1997; BOCK et al., 1999
a
) verifica-se que quando se detecta alguma diferença em
favor dos zebuínos, ela é muito discreta. PARKER et al. (1985) relataram que as
40
manifestações da infecção por A. marginale foram apenas ligeiramente mais
brandas em novilhas zebuínas puras do que em novilhas taurinas. BOCK et al.
(1997) avaliaram as conseqüências da infecção em novilhos taurinos, zebuínos e
cruzados meio-sangue e ¼ zebu e concluíram que independentemente da raça e do
grau de sangue há risco de desenvolvimento de doença grave, quando os animais
são expostos a isolados virulentos de A. marginale.
As infecções por A. marginale assemelham-se clinicamente às babesioses
(TRUEBLOOD et al., 2001) não apresentando nenhum sinal patognomônico, o que
inviabiliza a possibilidade de diagnóstico clínico, tornando necessário o apoio
laboratorial (RADOSTITS et al., 2000).
A técnica de esfregaço sanguíneo continua sendo a de maior praticidade para
diagnóstico das infecções por A. marginale, especialmente, durante a fase aguda,
quando grande parte dos eritrócitos está parasitado (HART et al., 1992). Contudo,
trata-se de um método pouco sensível e incapaz de detectar o parasita nos casos de
baixos níveis de rickettsemia que ocorrem predominantemente durante a fase
crônica (VIDOTTO & MARANA, 2001).
Segundo TRUEBLOOD et al. (2001), o fato dos animais persistirem infectados
após se recuperam de uma primo-infecção por Anaplasma faz com que os níveis de
anticorpos se mantenham elevados, favorecendo com isso a possibilidade de
realização de diagnóstico indireto, por diferentes métodos sorológicos. No entanto,
McGUIRE et al. (1991) consideram que as técnicas sorológicas apresentam um
elevado índice de erros em função, principalmente, de resultados falso-positivos cuja
principal causa seria a contaminação dos antígenos utilizados por proteínas de
eritrócitos.
41
Considerando essas duas afirmativas anteriores, é possível afirmar que os
maiores avanços relacionados ao diagnóstico sorológico da anaplasmose bovina
têm sido obtidos pela identificação e caracterização de antígenos de A. marginale
através da clonagem de genes e da produção de proteínas recombinantes (REYNA-
BELLO et al., 1998). As análises antigênicas das proteínas de membrana de A.
marginale revelaram que seis proteínas principais de superfície ou “major surface
proteins” (MSP) são reconhecidas por anticorpos produzidos por bovinos infectados
com diferentes isolados de A. marginale (OLIVEIRA et al., 2003). As investigações
realizadas com essas seis proteínas principais têm revelado que elas estão
envolvidas em distintas atividades biológicas (KOCAN et al., 2003) do parasita, e
que as MSP 1, 2 e 4 apresentam características que as credenciam como
candidatas para a produção de vacinas e as MSP 3 e 5 como imunógenos para
utilização no diagnóstico imunológico das anaplasmoses bovinas (BARBET, 1995).
Já em 1991, McGUIRE e colaboradores consideravam que a utilização de
antígenos purificados, livres dos contaminantes de hemácias, aumentaria a
especificidade de todos os métodos sorológicos, tais como, Fixação de
Complemento (FC), Aglutinação em Cartão (CT), Aglutinação em Tubo Capilar
(CTA) reação imunoenzimática (ELISA), imunofluorescência Indireta (IFI),
Imunobloting e Radio-imuno-ensaio.
No entanto, nas últimas décadas, as técnicas baseadas em ensaios
imunoenzimáticos (ELISA) têm substituído as demais técnicas sorológicas (BARROS
et al., 2005) em função das vantagens que apresenta. Além de possibilitar a análise
de um grande número de amostras, trata-se de uma metodologia que elimina erros
da avaliação subjetiva (MADRUGA et al., 2000
b
) pela possibilidade de leitura
automatizada (SOARES, 2001).
42
Em decorrência das várias vantagens das técnicas imunoenzimáticas de
diagnóstico e da característica de possibilitar a análise de um grande número de
amostras em um curto intervalo de tempo, essas técnicas têm sido as mais utilizadas
nos estudos epidemiológicos da anaplasmose bovina, inclusive no Brasil
(MADRUGA et al., 2000
b
; VIEIRA et al., 2002; BARROS et al., 2005).
Apesar da indiscutível relevância das técnicas imunológicas, há
particularidades na epidemiologia das infecções por A. marginale cuja investigação
não pode ser assistida por essas técnicas. Um desses aspectos diz respeito à
necessidade de se definir os parâmetros quantitativos da transmissão da rickéttsia,
que dependem da detecção do parasita tanto no hospedeiro vertebrado como nos
invertebrados.
Os avanços obtidos no campo da biologia molecular tornaram possível o
desenvolvimento de novas metodologias para diagnóstico de parasitas baseadas na
detecção de DNA que, ao contrário de substâncias como proteínas, permanece
inalterado em todos os estágios do ciclo biológico do parasita (BARKER, 1990). Os
primeiros avanços científicos obtidos com a aplicação das provas baseadas na
detecção de DNA de A. marginale foram revisados por diversos autores (BARBET,
1995; FIGUEROA & BUENING, 1995; STILLER & COAN, 1995). Nessas
publicações os autores descrevem o progresso das técnicas de biologia molecular e
as conseqüentes descobertas que propiciaram em relação a essa rickettsia.
Atualmente, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), desenvolvida por
MULLIS & FALOONA (1987), tem sido a técnica molecular mais utilizada na
investigação dessa e de outros parasitas. Pela PCR, uma determinada região do
genoma de qualquer organismo pode ser multiplicada em milhões de cópias,
possibilitando o diagnóstico específico com elevada sensibilidade.
43
No que se refere aos hospedeiros vertebrados, a aplicação das técnicas
baseadas na PCR no diagnóstico das infecções por A. marginale tem como principal
vantagem a possibilidade de discriminar animais soronegativos infectados, como por
exemplo, animais em fases iniciais da infecção ou que foram infectados
congenitamente (COSSÍO-BAYÚGAR et al. 1997) e distinguir animais soropositivos
infectados de animais vacinados (GALE et al. 1996).
Quanto à infecção dos carrapatos, as investigações epidemiológicas foram,
até recentemente, bastante limitadas pelo escasso conhecimento das interações
entre os carrapatos e a própria rickéttsia, assim como, pela inexistência de métodos
diagnósticos adequados (STILLER & COAN, 1995). Essa limitação foi minimizada
pela utilização de técnicas baseadas em PCR, pois possibilitam o diagnóstico direto
pela detecção da rickéttsia nos vários estágios de desenvolvimento dos artrópodes
vetores (VIDOTTO & MARANA, 2001).
Até o momento, a maioria das pesquisas em que as técnicas de amplificação
de DNA foram empregadas para investigar as relações entre os vetores e A.
marginale contemplaram espécies de carrapatos que não ocorrem no Brasil (de la
FUENTE et al., 2001, 2005
a
; SCOLES et al., 2005;).
No que se refere a B. microplus, essas pesquisas possibilitaram a
constatação de que esse carrapato retém sua capacidade vetorial em relação a
isolados que ocorrem em áreas livres dessa espécie (FUTSE et al., 2003). No Brasil,
SHIMADA et al. (2004) pesquisaram a presença de DNA de A. marginale em larvas
de B. microplus constatando com isso que em teleóginas infectadas, a rickéttsia
pode migrar para os ovários e provocar a infecção das larvas, e que a freqüência
desse evento é influenciada pela temperatura de incubação das teleóginas.
44
3. Objetivos
O conhecimento das interações que regulam a epidemiologia dos agentes da
TPB em cada região geográfica é indispensável para o desenvolvimento e aplicação
de medidas de controle que possam reduzir os prejuízos causados à pecuária pela
redução de produtividade, morbidade ou mortalidade de animais. No entanto é
necessário que os estudos epidemiológicos sejam conduzidos empregando-se
métodos de diagnóstico que indiquem de forma segura a prevalência da infecção
tanto nos hospedeiros vertebrados como nos invertebrados.
Diante dessas considerações, o presente trabalho foi desenvolvido com o
propósito de se verificar a dinâmica das infecções por Babesia bovis, Babesia
bigemina e Anaplasma marginale ao longo do primeiro ano de vida de bezerros da
raça Nelore, utilizando parâmetros clínicos, imunológicos e técnicas moleculares de
diagnóstico para detectar a freqüência de infecções nos bovinos e nos carrapatos.
Explicitando, os objetivos propostos foram os seguintes:
1. Avaliar a dinâmica das infecções por Babesia. bovis, Babesia bigemina e
Anaplasma marginale em bezerros da raça Nelore criados em área
endêmica no Estado de São Paulo.
2. Correlacionar a freqüência de infecções por B. bovis, B. bigemina e A.
marginale com parâmetros clínico-hematológicos de bezerros Nelores ao
longo de um ano.
3. Avaliar a freqüência de infecções por B. bovis, B. bigemina e A. marginale
em teleóginas de Boophilus microplus colhidas dos bezerros.
45
4. M
ATERIAL E
M
ÉTODOS
4.1. Laboratórios
Os experimentos foram conduzidos nos laboratórios do Departamento de
Parasitologia do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista Júlio de
Mesquita Filho, Campus de Botucatu.
4.2. Animais Experimentais
Os animais utilizados no presente estudo integravam o rebanho Nelore
mantido na Fazenda São Manuel, pertencente à UNESP, localizado no município de
São Manuel. As coordenadas da região são 22°43`22`` de latitude sul e 48°34`14``
de longitude oeste.
A propriedade possui uma área total de 210 alqueires, sendo 100 alqueires
destinados à pecuária bovina, divididos em 16 piquetes e com 330 animais no total,
em uma lotação média de três UA/ alqueire.
Foram utilizados 17 bezerros da raça Nelore (Bos taurus indicus) puros de
origem, criados sob aleitamento natural (Figura 1). As vacas eram mantidas em
pasto com cobertura de Brachiaria decubens e sal mineral disponibilizado “ad
libitum” em cochos cobertos. Imediatamente após o nascimento, os bezerros eram
tratados com uma única dose de ivermectina injetável, sendo este o único
medicamento antiparasitário administrado aos animais ao longo do experimento.
Após o desmame, aos nove meses de idade, os bezerros permaneceram em regime
de pastagem sob as mesmas condições de manejo extensivo.
46
Figura 1: Bezerros que integram o rebanho Nelore mantido na Fazenda
São Manuel/ UNESP, localizada no município de São Manuel-SP.
47
4.3. Exame físico e colheita de amostras
Os exames físicos e as colheitas das amostras tiveram início no mês de
janeiro de 2004, época do nascimento dos animais, sendo esses procedimentos
realizados nas primeiras 24 horas de vida de cada animal. A partir de então, foram
realizados em 14 outras ocasiões até os animais completarem um ano de idade. Na
tabela 1 a idade mínima e máxima dos animais amostrados está apresentada em
função dos meses em que foram realizados os exames físicos e as colheitas das
amostras.
Tabela 1: Idade mínima e máxima de 17 bezerros da raça Nelore em função dos
meses em que foram realizados os exames físicos e as colheitas das amostras, no
município de São Manuel, SP.
Colheita Mês
Idade mínima-
máxima
(dias)
1 Jan/Fev/2004 <1
2 Fev 15-30
3 Mar 38-55
4 Mar 53-70
5 Abr 73-90
6 Abr 87-105
7 Mai 107-130
8 Jun 123-146
9 Jul 158-181
10 Ago 192-215
11 Set 223-246
12 Out 258-281
13 Nov 285-308
14 Dez 313-336
15 Jan/2005 343-369
48
Em cada ocasião de colheita, os animais foram submetidos a exame físico
constituído de inspeção das mucosas oculares, tomada de temperatura retal e
observação da pelagem e do comportamento. A pesagem individual dos animais foi
feita utilizando-se balança mecânica apropriada para bovinos, e o peso vivo
registrado em quilogramas (kg). A partir da terceira colheita, todos os procedimentos
eram realizados com os animais contidos em tronco de contenção.
Amostras de sangue da veia jugular foram colhidas em tubos “vacutainer”
com EDTA para realização dos exames hematológicos e para a extração de DNA e
em tubos sem anticoagulante para obtenção de soro sangüíneo para as provas
sorológicas. Amostras de sangue periférico, provenientes de vasos auriculares,
foram colhidas em lâminas histológicas para a confecção de esfregaços sangüíneos
e determinação direta da parasitemia em microscopia óptica.
Após rigorosa inspeção, todas as fêmeas ingurgitadas (teleóginas) de
Boophilus microplus, de cada bezerro, foram colhidas, contadas e acondicionadas
isoladamente em microtubos de plástico.
Todas as amostras de sangue e de carrapatos foram transportadas para o
Departamento de Parasitologia do Instituto de Biociências, da UNESP, Campus de
Botucatu, onde foram processadas.
4.4. Processamento das amostras de sangue
As amostras de sangue foram processadas a fim de se avaliar os seguintes
parâmetros hematológicos: avaliação do número total de eritrócitos, concentração
de hemoglobina, volume globular, número total de leucócitos e pesquisa de
hemoparasitas em esfregaços sangüíneos.
49
A contagem total de eritrócitos e leucócitos foi realizada em contador
eletrônico de células.
A concentração de hemoglobina foi determinada pelo método
da cianometahemoglobina sendo as leituras realizadas em espectrofotômetro
utilizando-se comprimento de onda de 540 ηm. O volume globular foi determinado
pelo método de microhematócrito.
Os esfregaços sanguíneos confeccionados com sangue colhido dos vasos
auriculares foram fixados em metanol e corados por Giemsa. A parasitemia foi
estimada pela contagem do número de eritrócitos parasitados em 1000 eritrócitos e
o resultado foi expresso em porcentagem.
4.5. Processamento das amostras de Boophilus microplus
No laboratório, os carrapatos colhidos foram identificados e as teleóginas de
Boophilus microplus colhidas de cada bezerro foram contadas, acondicionadas
individualmente em placas escavadas de polietileno e incubadas em estufa BOD à
temperatura de 27 ±1 °C e umidade superior a 70%, para realização da postura.
No décimo quinto dia após o inicio da postura, as teleóginas de B. microplus
foram examinadas individualmente para a pesquisa de esporocinetos de Babesia sp.
na hemolinfa, seccionando-se uma das patas com uma micro-tesoura para
dissecção, seguindo-se a técnica descrita por Burgdorfer (1970).
As amostras de hemolinfa foram depositadas sobre lâmina de vidro e após
serem secas ao ar foram fixadas em metanol e coradas com Giemsa. As leituras
foram feitas em microscópio óptico utilizando-se objetiva de 100x. Após a obtenção
da hemolinfa, as teleóginas foram acondicionadas individualmente e conservadas
em freezer –80ºC para a posterior extração de DNA.
50
4.6. Pesquisa de DNA de B. bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale
4.6.1. Extração de DNA das amostras de sangue
A extração de DNA das amostras de sangue foi realizada empregando-se o
kit GFX
TM
Genomic Blood DNA Purification (GE Healthcare), seguindo as
recomendações do fabricante. O seguinte protocolo foi realizado:
•
Colocar 300 µl de sangue e 900µl de solução de lise (KHCO3 10 mM; NH4Cl
155 mM; EDTA 0,1 mM), em microtubo de 1,5 ml;
•
Homogeneizar e centrifugar a 20.800 g por cinco minutos e descartar o
sobrenadante;
•
Homogeneizar e adicionar 500 µl de solução de extração;
•
Incubar por cinco minutos em temperatura ambiente e transferir o conteúdo
do tubo para a coluna de extração acoplada a um tubo coletor;
•
Centrifugar a 5.000 g por um minuto;
•
Adicionar à coluna 500 µl da solução de extração e centrifugar a 5.000 g por
um minuto;
•
Adicionar à coluna 500 µl da solução de lavagem (tampão tris-EDTA) e
centrifugar a 20.8000 g por três minutos;
•
Transferir a coluna para um tubo de 1,5 ml, limpo e livre de DNAses;
•
Adicionar 100 µl de água ultrapura, autoclavada e aquecida a 70 ºC.
•
Incubar por um minuto à temperatura ambiente e centrifugar a 5.000 g por um
minuto, obtendo-se assim a solução de DNA.
As soluções de DNA foram identificadas e mantidas estocadas em freezer –80C°
para posterior amplificação.
51
4.6.2. Extração de DNA das fêmeas de Boophilus microplus
Para a extração de DNA das teleóginas, cada exemplar previamente
congelado foi macerado individualmente em tubo de 1,5 ml ao qual foram
adicionados 10 µl de tampão lisozima pH 8,5 (TRIS 10 mM; EDTA 1 mM; Triton X-
100 5%), e incubados por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, foram
adicionados 20 µl de solução de proteinase K (20 µg/ml de em TRIS-HCl 10 mM, pH
8,0), e incubado por 4 horas a 56°C em banho-maria. Após a incubação foi realizada
a extração de DNA utilizando o kit GFX
TM
Genomic Blood DNA Purification (GE
Healthcare), adotando-se procedimento semelhante ao indicado para a extração de
DNA de amostras de sangue: ao material digerido pela proteinase K, foram
adicionados 500 µl de solução de extração, seguindo-se uma incubação à
temperatura ambiente por 15 minutos. Após esse período, os microtubos foram
centrifugados a 5.000 g por dois minutos e o sobrenadante foi transferido para a
coluna de extração acoplada a um tubo coletor. A partir desse ponto, o procedimento
foi o mesmo já descrito para a extração de DNA do sangue.
As soluções de DNA foram identificadas e mantidas estocadas em freezer –
80 C° para posterior amplificação pela técnica de PCR.
4.6.3. Reações de PCR
As reações de PCR foram realizadas utilizando as seqüências iniciadoras
(“primers”) descritas por FIGUEROA et al. (1993), cujas descrições estão
apresentadas no Quadro 1. As reações foram feitas em tubos de 0,2 ml
empregando-se volume final de 25 µl, sendo 5 µl da solução de DNA das amostras
teste e 20 µl de tampão de reação (master mix) com a seguinte composição:
2,5 µl de tampão 10 X (Tris-HCl 10 mM; KCl 500mM; MgCl2 15 mM)
52
0,3 µl de Taq-DNA-polimerase (5U/µl)
0,5 µl de solução 10mM de nucleotídeos
1µl de “primer” BilA (10µM)
1µl de “primer” BilB (10µM)
14,7 µl de água bi-destilada estéril.
Quadro 1: Seqüências iniciadoras externas (“primers”) para amplificação de
DNA de Babesia bigemina, B. bovis e Anaplasma marginale
Espécie Seqüência Oligonucleotídeos(5’-3’)
Produto
Amplificado
(pb*)
BoF CACGAGGAAGGAACTACCGATGTTGA
B .bovis
BoR CCAAGGAGCTTCACCGTACGAGGTCA
350
BilA CATCTAATTTCTCTCCATACCCCTCC
B. bigemina
BilB CCTCGGCTTCAACTCTGATGCCAAAG
278
Am9 TTGAAGGTTGAAGTGCAGGT
A. marginale
Am10 CCATATCGAATGCACCAAAC
200
*Pares de base
Uma vez aplicadas as amostras, os tubos foram submetidos a uma breve
centrifugação (“spin”) e posteriormente colocados em termociclador Mastercycler
Gradient
(Eppendorf), empregando-se a seguinte seqüência de ciclos:
1. Desnaturação inicial; 95 °C/7 min;
2. Anelamento:
a. B. bovis: 55 °C/1 min.
b. B. bigemina: 64 °C/1 min
c. A marginale: 58 °C/1 min.
3. Extensão: 73 °C/1,5 min.
53
Após o ciclo inicial seguiram-se 34 ciclos idênticos exceto pela redução da
etapa de desnaturação para 1 minuto e da ampliação do tempo da extensão final
para 5 minutos. Para controle positivo das reações foi utilizada amostra de DNA de
cepa vacinal de B. bigemina e B. bovis, diluídas a 1:1000. Para controle positivo das
reações de A. marginale foi utilizada amostra de DNA diluída a 1:100, extraída de
animal com diagnóstico positivo em esfregaço sangüíneo.
Para o controle de contaminação, em cada bateria de reações, foi utilizada
uma amostra (branco) contendo “master mix” e água bi-destilada em vez de DNA
teste.
A eletroforese dos produtos de amplificação foi realizada em gel de agarose a
1%, contendo brometo de etídio (0,5µg/ml). O comprimento dos produtos
amplificados foram estimados utilizando-se um padrão de pares de base (100 Base-
Pair-Ladder - GE Healthcare) em cada gel de corrida. A visualização dos produtos
amplificados foi realizada em transiluminador UV.
4.6.4. Reações de Nested-PCR (nPCR)
As amostras de DNA extraídas de sangue, que não apresentaram produtos
de amplificação após a PCR, foram submetidas à nPCR. As seqüências iniciadoras
internas utilizadas nessa segunda amplificação foram designadas por FIGUEROA et
al. (1993) e estão apresentadas no Quadro 2. As reações de nPCR foram feitas
utilizando 2 µl do produto da reação de PCR e 23 µl do tampão de reação com a
mesma composição anteriormente descrita para as reações de PCR, porém
utilizando as seqüências iniciadoras internas:
54
Quadro 2: Seqüências iniciadoras internas (“primers”) para amplificação de
DNA de Babesia bigemina, B. bovis e Anaplasma marginale
Espécie Seqüência Oligonucleotídeos (5’-3’)
Produto
Amplificado
(pb*)
BoFN TCAACAAGGTACTCTATATGGCTACC
B .bovis
BoRN CTACCGAGCAGAACCTTCTTCACCAT
290
BilAN CGCAAGCCCAGCACGCCCCGGTGC
B. bigemina
BilBN CCGACCTGGATAGGCTGTGTGATG
170
Am11 CACATTTCTTGGAGCTGG
A. marginale
Am12 TCTCTGCGACTTTGAACC
150
*
Pares de base
A seqüência dos ciclos de amplificação de DNA foi idêntica à descrita para a
PCR, excetuando-se a temperatura de anelamento dos primers que foi de 70
o
C
para B. bigemina, 65
o
C para B. bovis e 51 ºC para A. marginale.
Para o controle positivo das reações de nPCR, as amostras de DNA controle
utilizadas na reação de PCR foram diluídas a 1:10.000 no caso de B. bigemina e B.
bovis e a 1000, no caso de A. marginale. O controle de contaminação foi feito como
nas reações de PCR, ou seja utilizando água bidestilada autoclavada em
substituição a amostra teste.
4.7. Ensaio de imunoadsorção enzimática indireta (ELISA-I)
Os ensaios de imunoadsorção enzimática indireta para detecção de
anticorpos anti- B. bovis, anti- B. bigemina e anti- A. marginale no soro dos bovinos
foram realizados no Laboratório de Imunoparasitologia do Departamento de
Sanidade Animal, da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA)
Gado de Corte (CNPGC), localizada em Campo Grande-MS. A obtenção dos
55
antígenos utilizados e o protocolo para a execução dos testes de ELISA-I para
detecção de anticorpos anti-B. bovis, anti-B. bigemina e anti-A. marginale, foram
realizados respectivamente segundo MADRUGA et al. (2000
a
; 2000
b
; 2001).
Nos testes para diagnóstico de B. bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale
utilizou-se placas de microtitulação de 96 poços que foram sensibilizadas com
antígeno de homogeneizado total diluído a 1:500(B. bovis), 1:1000 (B. bigemina) e
1:5000 (Anaplasma marginale) em tampão carbonato/bicarbonato (Na2CO3 200
mM, NaHCO3 199 mM), pH 9,2 (100 µL/ poço), por pelo menos 12 horas a 4ºC,
sendo adicionados 100 µL/ poço dos soros controle e teste diluídos a 1:1.000 em
PBST.
Em seguida, foram adicionados 50 µL/ poço de imunoglobulina de coelho anti-
IgG bovina conjugada com fosfatase alcalina (Sigma A-0705) e diluída a 1:12.000
em PBST. O substrato p-nitrofenil fosfato (1,0 mg/mL em tampão do substrato:
dietanolamina 0,1 M, MgCl2 0,1 mM, NaCl 0,1 mM) foi adicionado em um volume de
50µL/ poço, sendo a reação parada após 20 minutos com NaOH 0,2 M (100 µL/
poço). A leitura dos resultados foi realizada em um espectrofotômetro para
microplacas, com filtro de 405 hm e o cut-off da prova foi determinado usando a
média das DOs de soros de animais livres de infecção mais dois desvios-padrão.
56
5. R
ESULTADOS
5.1. Freqüência de infecções por Babesia bovis
Merozoítas de Babesia bovis não foram detectados nos esfregaços
sangüíneos em nenhuma ocasião ao longo de todo o experimento, entretanto o DNA
dessa espécie foi detectado em sete (2,74%) amostras provenientes de três animais
(Tabela 2). Em quatro dessas amostras o DNA de B. bovis foi detectado pela técnica
da PCR e em três, pela técnica de nPCR. Um animal teve três amostras positivas e
dois animais, duas amostras positivas.
Em um animal (13) a presença de DNA de B. bovis foi detectada na primeira
colheita, com menos de 24 horas após o nascimento dos bezerros, no mês de
janeiro de 2004. Nos outros dois animais as amostras positivas foram colhidas
quando eles tinham entre 244 e 339 dias de idade.
No que diz respeito à sorologia, anticorpos anti-B. bovis foram detectados em
82,4% (14) dos bezerros com menos de 24 horas de nascimento e em 100% (17)
dos animais aos nove meses de idade (Tabela 3).
5.2. Freqüência de infecções por Babesia bigemina
Merozoítas de B.bigemina (Figura 2) foram detectados em cinco esfregaços
sangüíneos oriundos de quatro bezerros. A maior parasitemia observada foi de 1,8%
em um animal que apresentava infecção concomitante por A. marginale. A média de
parasitemia de B. bigemina nos bezerros foi de 0,72% (±0,7) (Tabela 4).
O DNA de B. bigemina (Tabela 5) foi detectado em 47 (18,43%) amostras dos
bezerros. A PCR foi capaz de detectar o DNA de B. bigemina em 25 (9,8%)
amostras e a nPCR em 22 (8,6%) amostras. Todas as amostras positivas nos
esfregaços sangüíneos foram também positivas pela técnica de PCR.
A detecção mais precoce de DNA de B. bigemina foi feita pela técnica de
nPCR em amostra colhida de um bezerro aos 51 dias de vida. Dos 17 animais
amostrados, três não apresentaram infecções detectáveis pelos testes diagnósticos
empregados ao longo de todo o experimento. O maior número de amostras positivas
foi detectado na colheita realizada no mês de setembro, quando os bezerros tinham
entre 223 e 246 dias. Nessa ocasião cinco amostras foram positivas pelo teste da
57
PCR e três pelo teste da nPCR. Na última colheita (janeiro de 2005), o DNA de B.
bigemina foi detectado em apenas três animais, todos pela técnica de nPCR.
Anticorpos anti-B. bigemina foram detectados em 88,2% (15) dos bezerros
com menos de 24 horas de nascimento e em 94,1% (16) dos animais aos nove
meses de idade (Tabela 6).
Tabela 4. Parasitemia (%) de Babesia bigemina em função da idade de 17 bezerros
da raça Nelore naturalmente infectados, no município de São Manuel, SP.
Animal Parasitemia (dias)
15 0,2 (100); 0,1(119)
18 1,8 (244)*
20 0,2 (86)
24 1,3 (339)*
* Infecção concomitante por Anaplasma marginale.
5.3. Freqüência de infecções por Anaplasma marginale
Nos exames de esfregaços sangüíneos, corpúsculos intraeritrocitários de
Anaplasma marginale (Figura 3) foram detectados em 29 (11,37%) amostras
oriundas de 14 animais (Tabela 7). A maior parasitemia de A. marginale foi de 26%.
O DNA de A. marginale (Tabela 8) foi detectado em 103 (40,3%) amostras
provenientes de 17 bezerros. Destas, 83 foram detectadas pela PCR e 21 pela
nPCR. Todas as amostras positivas no esfregaço sanguíneo foram também positivas
pela PCR.
A primeira detecção de DNA de A. marginale foi feita pela técnica de PCR em
um bezerro com menos de 24 horas de nascido. Em janeiro de 2005, na 15º
colheita, todos os bezerros apresentaram diagnóstico positivo, com a seguinte
distribuição: 11 animais pelo esfregaço sangüíneo, 16 bezerros pela técnica de PCR
e em um bezerro pela técnica de nPCR.
Anticorpos anti-A. marginale foram detectados em 94,1% (16) dos bezerros
com menos de 24 horas de nascimento e em 100% (17) dos animais aos nove
meses de idade (Tabela 9).
58
Figura 2: Merozoítas de Babesia bigemina (seta) em esfregaço de sangue corado
por Giemsa.
Figura 3: Corpúsculos intra-eritrocitários de Anaplasma marginale (setas) em
esfregaço de sangue corado por Giemsa.
59
Tabela 2. Detecção de DNA de Babesia bovis pelos métodos de PCR e nPCR em amostras de sangue de 17 bezerros da raça
Nelore ao longo do primeiro ano de vida, no município de São Manuel, SP.
Colheita
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Animal
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR nPCR
PCR
nPCR
PCR nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
11 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
12 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
13 + - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
14 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
15 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
17 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
18 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
19 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - + - + - -
20 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
21 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
22 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
23 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
24 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - + - -
25 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
31 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
32 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
33 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Total 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 2 2 0
+ Amostras positivas
- Amostras negativas
60
Tabela 3. Detecção de anticorpos anti- Babesia bovis pelo método de ELISA-I em amostras de soro de 17 bezerros da raça
Nelore ao longo do primeiro ano de vida, no município de São Manuel, SP.
Colheita
Animal
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
11
+ - - - - - - - - - - + + + -
12
+ - - - - - - - - - - + + - +
13
+ - - - - - - - - - + + + + -
14
+ - - - - - - - - - - + + + +
15
+ - - - - - - - - - - + + + +
17
+ - - - - - - - - - - + + + -
18
+ - - - - - - - + - - + + + -
19
+ - - - - - - - - - + + + + -
20
+ - - - - - - - - - - - + + +
21
+ - - - - - - - - - - + + + -
22
+ - - - - - - - + - - + + + -
23
+ - - - - - - - - - - + + + +
24
- - - - - - - - - - - - + + +
25
- - - - - - - - - - - + + + +
31
+ - - - - - - - - - - + + + -
32
+ - - - - - - - - - - + + + +
33
- - - - - - - - - - - + + - -
Total
14 0 0 0 0 0 0 0 2 0 2 15 17 15 11
+ Amostras positivas
- Amostras negativas
61
Tabela 5. Detecção de DNA de Babesia bigemina pelos métodos de PCR e nPCR em amostras de sangue de 17 bezerros da
raça Nelore ao longo do primeiro ano de vida, no município de São Manuel, SP.
Colheita
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Animal
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
11 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
12 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - + - - - -
13 - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + - - + - + - +
14 - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - -
15 - - - - - - - + + + + + - + + - - - - - - - - - -
17 - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - + + - - - - - -
18 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + - - - - - -
19 - - - - - - - - - - - - - - - + - - - - + - - + - + - +
20 - - - - - - - - + + - + - - + - - - + - - - + - - - -
21 - - - - - + - - - - - - - - - - - - - + - - + - - - - - -
22 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - + - - - - - -
23 - - - - - - - - - - + - + - + - + - - - - - + - - - - - -
24 - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - + +
- +
25 - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
31 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - -
32 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
33 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Total 0 0 1 1 4 3 4 3 3 4 8 5 5 3 3
+ Amostras positivas
- Amostras negativas
62
Tabela 6. Detecção de anticorpos anti- Babesia bigemina pelo método de ELISA-I em amostras de soro de 17 bezerros da raça
Nelore ao longo do primeiro ano de vida, no município de São Manuel, SP.
Colheita
Animal
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
11
+ + - - - + - - - - - - + + -
12
+ - - - - - - - - + - - + - -
13
+ - - - - + - - - - + + + + +
14
+ + + - + + - - - + + + + + +
15
+ - - - + + + + + + + + + + +
17
+ - - - + - - - - - + + + + +
18
+ - - - - - - - - - - + + + +
19
+ - - - - - - + - - + + + + +
20
+ - - + - - - + + + + - + + +
21
+ - - - - - - - - - + - + + +
22
+ - - + + - - - - + + + + + +
23
+ - - - - - + + + + - + + + +
24
- - - - - - + + + + + + + + +
25
- - - - - - - - - - - - - + +
31
+ - + + - - - + - - - + + - +
32
+ + + + + + - - - - - - + + +
33
+ - - - - - - - - - - - + - +
Total
15 3 3 4 5 5 3 6 4 7 9 10 16 14 15
+ Amostras positivas
- Amostras negativas
64
1 2 3 4 5 6
Figura 4: Eletroforese dos produtos de amplificação de DNA de Babesia bigemina
pelas técnicas de PCR e nPCR (canaletas 1 e 2), amostra PCR negativa (canaleta
3); amostra nPCR negativa (canaleta 4); e controle PCR e nPCR negativo (canaletas
5 e 6).
1 2 3 4 5 6
Figura 5: Eletroforese dos produtos de amplificação de DNA de Babesia bovis pelas
técnicas de PCR e nPCR (canaletas 3 e 4), amostra PCR negativa (canaleta 1);
amostra nPCR negativa (canaleta 2); e controle PCR e nPCR negativo (canaletas 5
e 6).
100kb
200kb
300kb
300 kb
200 kb
100 kb
65
Tabela 7. Parasitemia (%) de Anaplasma marginale em 17 bezerros da raça Nelore,
naturalmente infectados, no município de São Manuel, SP.
Animal Parasitemia (idade/dias)
11 3,2 (300); 4 (367)
12 3,8 (300); 3,8 (334); 4 (367)
13 2,2 (297); 3,8 (364)*
15 1,9 (297); 3,1 (331); 2,1 (364)
17 2,9 (364)
18 2,6 (244)*
19 3,2 (244)*
20 1 (229); 4,9 (331); 1,3 (361)
21 4,9 (243); 3 (270); 3,2 (363)
23 26 (200); 12 (336); 4 (369)
24 8,2 (59); 11,3 (305); 8,2 (339); 6,8
(372)*
25 7,9 (277)
32 6,8 (377)
33 3,8 (378)
* Infecção concomitante por Babesia bigemina.
66
Tabela 8. Detecção de DNA de Anaplasma marginale pelos métodos de PCR e nPCR em amostras de sangue de 17 bezerros da
raça Nelore ao longo do primeiro ano de vida, no município de São Manuel, SP.
Colheita
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Animal
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR nPCR
PCR
nPCR
PCR nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
PCR
nPCR
11
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - +
12
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + +
+
13
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + +
+
14
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - + - -
-
+
15
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + +
+
17
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + +
+
18
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + +
+
19
- - - - + + + + + + + - + + - - + +
+
20
- - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - + + +
+
+
21
- - - - - + - - - - - - - - - - - - + + + +
- -
+
22
- - - - + + + + + + + + - + - - - + +
+
23
- - - - - - - - - + - + - - - + - - + - - - - - - +
+
24
- - - - - - + - - - + - - - - - - - - - + + +
+
+
25
- - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - + + +
+
+
31
+ - + + + + + + + - - - - - - + +
- +
+
32
- - - - - - - - - + - - - - - - - - - - + - + +
+
+
33
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - +
+
+
Total
1 1 5 3 6 5 3 4 2 5 11 11 16 14 17
+ Amostras positivas
- Amostras negativas
67
Tabela 9. Detecção de anticorpos anti- Anaplasma marginale pelo método de ELISA-I em amostras de soro de 17 bezerros da
raça Nelore ao longo do primeiro ano de vida, no município de São Manuel, SP.
Colheita
Animal
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
11
+ + - - - - - - - - - + + + -
12
+ - - - - + - - - + - + + + +
13
+ - + - - + - - + - + + + + +
14
+ + - - - + + + - - - + + + +
15
+ - - - - - - - - - - + + + +
17
+ - - - - + - - - - - - + + -
18
+ - - - - + - - - + - + + + +
19
+ - - - - - - - - - - + + + +
20
+ - - - - - - - - - - - + + +
21
+ - - - - - - - - - + + + + -
22
+ - - - - + - - + + + + + + +
23
+ - - - - - + + + + - + + + +
24
+ - - + - - - - - - - - + + +
25
- - - - - - - - - - - + + + +
31
+ - - - - + + + - - + + + + -
32
+ + + - - + + + + - + - + + +
33
+ - + - - - - - - - - + + - +
Total
16 3 3 1 0 8 4 4 4 4 5 13 17 16 13
+ Amostras positivas
- Amostras negativas
68
1 2 3 4
Figura 6: Eletroforese dos produtos de amplificação de DNA de Anaplasma
marginale pelas técnicas de PCR e nPCR (canaletas 1 e 2), amostra negativa
(canaleta 3); controle negativo (canaleta 4).
69
5.4. Parâmetros Clínicos e Hematológicos
Ao longo de todo o experimento, os parâmetros clínicos avaliados no exame
físico dos bezerros, tais como comportamento, peso, temperatura, e coloração de
mucosas, não revelaram indícios de ocorrência de doença hemolítica. No entanto,
em épocas distintas, quatro animais apresentaram parâmetros hematimétricos
indicativos de doença hemolítica.
5.4.1. Pesagem dos bezerros
O peso médio dos animais ao nascimento foi de 31,8kg, variando de 25 kg até
41 kg. Ao final dos 12 meses o peso médio dos animais era de 200 kg, variando de
150 kg até 239 kg. A evolução do ganho de peso dos bezerros durante o ano do
experimento é apresentado na figura 7(A e B).
5.4.2. Contagem de Eritrócitos
A média da contagem de eritrócitos nas amostras de sangue negativas para
hemoparasitas está apresentada na tabela 10.
70
Figura 7(A e B): Evolução do peso em função da idade de bezerros da raça
Nelore criados no município de São Manuel-SP.
10
40
70
100
130
160
190
220
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Peso (kg)
11 12 13 14 15
17 18 19 20
10
40
70
100
130
160
190
220
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Colheitas
Peso (Kg)
21 22 23 24
25 31 32 33
10
40
70
100
130
160
190
220
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Peso (kg)
11 12 13 14 15
17 18 19 20
10
40
70
100
130
160
190
220
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Colheitas
Peso (Kg)
21 22 23 24
25 31 32 33
71
Tabela 10. Valores médios e desvios-padrão do número de eritrócitos em amostras
de sangue negativas para Babesia bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale em
função da idade de 17 bezerros da raça Nelore, no município de São Manuel, SP.
Idade (dias)
Eritrócitos/µ
µµ
µL
(x10
6
) ±
±±
±DP
Número
animais
<1
7,9 ± 0,9
15
15-30
9,6 ± 0,8
16
38-55
9,6 ± 0,6
12
53-70
8,7 ± 0,3
12
73-90
8,9 ± 0,8
8
87-105
9,1 ± 0,6
10
107-130
9,6 ± 0,4
10
123-146
8,0 ± 1,5
12
158-181
8,7 ± 0,9
12
192-215
9,2 ± 0,8
9
223-246
7,2 ± 0,6
3
258-281
9,5 ± 1,1
6
285-308
5,8* 1
313-336
8,5 ± 0,4
3
343-369
0
*Valor absoluto
Na tabela (11) estão relacionados os valores de contagem de eritrócitos dos
animais em cujos esfregaços foram encontrados hemoparasitas. Apenas dois
bezerros, em diferentes ocasiões, apresentaram contagens de eritrócitos abaixo dos
valores de referência. A contagem de eritrócitos do bezerro 21 foi de 4,3.10
6
eritrócitos/µl aos 243 dias e do bezerro 24, de 3,2.10
6
eritrócitos/µl aos 305 dias. Em
ambos foi detectada a presença de A. marginale sendo as parasitemias de 4,9% no
bezerro 21 e de 11,3% no bezerro 24. Neste último detectou-se também a presença
de DNA de B. bovis e B. bigemina pela PCR.
72
Tabela 11. Idade, contagem total de eritrócitos e parasitemia de Babesia bigemina e
Anaplasma marginale nas amostras de sangue de bezerros da raça Nelore, criados
no município de São Manuel, SP.
Animal
Idade (dias)
Eritrócitos
(x10
6
)
Parasitemia (%)
11 300 7,4
3,2 (A. marginale)
11 367 7,1
4,0 (A. marginale)
12 300 7,4
3,8 (A. marginale)
12 334 6,8
6,8 (A. marginale)
12 367 6,9
7,4 (A. marginale)
13 297 6,3
4,2 (A. marginale)
13 364 6,1
6,8 (A. marginale)
15 100 10,0
0,2 (B. bigemina)
15 119 10,5
0,1 (B. bigemina)
15 297 7,5
1,9 (A. marginale)
15 331 6,4
4,1 (A. marginale)
15 364 7,5
2,1 (A. marginale)
17 364 6,7
4,9 (A. marginale)
18 244 6,1
5,6 (A. marginale
);
1,4 (B. bigemina)
19 244 7,7
3,2 (A. marginale)
20 86 7,7
0,2 (B. bigemina)
20 297 7,1
1,0 (A. marginale)
20 331 5,5
4,9 (A. marginale)
20 364 6,0
1,3 (A. marginale)
21 243 4,3
4,9 (A. marginale)
21 270 7,1
3,0 (A. marginale)
21 363 6,3
3,2 (A. marginale)
23 200 5,9
26,0(A. marginale)
23 336 5,7
12,0 (A. marginale)
23 369 6,6
4,0 (A. marginale)
24 59 9,2
8,2 (A. marginale)
24 305 3,2
11,3 (A. marginale)
24 339 5,6
8,2 (A. marginale);
1,3 (B. bigemina)
24 372 5,8
6,8 (A. marginale)
25 277 5,2
11,9 (A. marginale)
32 377 6,5
9,8 (A. marginale)
33 378 7,4
3,8 (A. marginale)
5.4.3. Concentração de hemoglobina
As médias dos valores da concentração de hemoglobina nas amostras de
sangue negativas para hemoparasitas dos 17 bezerros, estão apresentadas na
tabela 12.
73
Tabela 12. Valores médios e desvios-padrão da concentração de hemoglobina em
função da idade, nas amostras de sangue negativas para hemoparasitas de 17
bezerros da raça Nelore, no município de São Manuel, SP.
Idade (dias)
Hemoglobina
g/dL ±DP
Número
animais
<1
12,3 ± 1,4
15
15-30
13,9 ± 1,4
16
38-55
12,9 ± 0,8
12
53-70
12,0 ± 1,1
12
73-90
11,9 ± 0,7
8
87-105
11,9 ± 1,1
10
107-130
12,8 ± 0,9
10
123-146
13,1 ± 1,1
12
158-181
13,5 ± 1,1
12
192-215
13,0 ± 1,0
9
223-246
11,2 ± 1,4
3
258-281
14,0 ± 1,9
6
285-308
11,3*
1
313-336
12,4 ± 0,05
3
343-369
0
* Valor absoluto
Na tabela (13) estão relacionados os valores de concentração de
hemoglobina dos animais em cujos esfregaços sanguíneos foram encontrados
hemoparasitas. Em três bezerros os valores de concentração de hemoglobina
ficaram abaixo dos valores de referência. A concentração de hemoglobina foi de 7,2
g/dL na amostra de sangue do bezerro 13, colhida antes de 24 horas após o seu
nascimento; no bezerro 21, de 7,7 g/dL na amostra colhida aos 243 dias e no
bezerro 24, de 6,6 g/dl na amostra colhida aos 305 dias. Nessas ocasiões foi
detectada a presença de corpúsculos de A. marginale nos bezerros 21 e 24 cujas
parasitemias eram de 4,9% e 11,3%, respectivamente. O DNA de B. bovis foi
detectado pela PCR nas amostras provenientes dos animais 13 e 24.
74
Tabela 13. Idade, concentração de hemoglobina e parasitemia de Babesia bigemina
e Anaplasma marginale nas amostras de sangue de bezerros da raça Nelore,
criados no município de São Manuel, SP.
Animal
Idade
(dias)
Hemoglobina
(g/dL)
Parasitemia (%)
11 300 10,0
3,2 (A. marginale)
11 367 11,5
4,0 (A. marginale)
12 300 13,3
3,8 (A. marginale)
12 334 11,5
6,8 (A. marginale)
12 367 10,8
7,4 (A. marginale)
13 297 12,6
4,2 (A. marginale)
13 364 9,8
6,8 (A. marginale)
15 100 12,7
0,2 (B. bigemina)
15 119 13,6
0,1 (B. bigemina)
15 297 12,3
1,9 (A. marginale)
15 331 12,2
4,1 (A. marginale)
15 364 11,3
2,1 (A. marginale)
17 364 10,8
4,9 (A. marginale)
18 244 10,2
5,6 (A. marginale
);
1,4 (B. bigemina)
19 244 11,2
3,2 (A. marginale)
20 86 12,4
0,2 (B. bigemina)
20 297 10,0
1,0 (A. marginale)
20 331 10,0
4,9 (A. marginale)
20 364 10,9
1,3 (A. marginale)
21 243 7,7
4,9 (A. marginale)
21 270 11,0
3,0 (A. marginale)
21 363 10,0
3,2 (A. marginale)
23 200 8,0
26,0 (A. marginale)
23 336 10,8
12,0 (A. marginale)
23 369 9,9
4,0 (A. marginale)
24 59 12,2
8,2 (A. marginale)
24 305 6,6
11,3 (A. marginale)
24 339 9,4
8,2 (A. marginale
)
1,3 (B. bigemina)
24 372 9,8
6,8 (A. marginale)
25 277 10,6
11,9 (A. marginale)
32 377 10,6
9,8 (A. marginale)
33 378 12,0
3,8 (A. marginale)
75
5.4.4. Volume Globular
As médias dos valores do volume globular (VG) das amostras de sangue
negativas para hemoparasitas dos 17 bezerros, estão apresentadas na tabela 6.
Tabela 14. Valores médios e desvios-padrão do volume globular (%) em amostras
de sangue negativas para Babesia bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale em
função da idade de 17 bezerros da raça Nelore, criados no município de São
Manuel, SP.
Idade (dias)
VG (%) ±
±±
± DP
Número de animais
<1
37,1 ± 4,5
15
15-30
40,9 ± 3,1
16
38-55
40,2 ± 2,7
12
53-70
35,0 ± 2,0
12
73-90
34,5 ± 1,9
08
87-105
36,6 ± 3,3
10
107-130
37,2 ± 2,6
10
123-146
37,8 ± 3,1
12
158-181
38,2 ± 3,1
12
192-215
37,1 ± 3,4
09
223-246
34,0 ± 4,5
03
258-281
42,3 ± 5,6
06
285-308
34,0*
01
313-336
38,0 ± 2
03
343-369
0
* Valor absoluto
Na tabela (15) estão relacionados os valores do volume globular dos animais
em cujos esfregaços sanguíneos foram encontrados hemoparasitas. Em quatro
bezerros os valores do volume globular ficaram abaixo dos valores de referência,
sendo de 20% na amostra colhida do bezerro 13 com menos de 24 horas após o
nascimento; de 23% na amostra colhida aos 200 dias do bezerro 23; de 23% na
amostra colhida aos 243 dias do bezerro 21 e de 20% na amostra colhida aos 305
dias do bezerro 24. Nas amostras de sangue dos bezerros 21 e 24 foi diagnosticada
a presença de A. marginale com parasitemia de 4,9% e 11,3%, respectivamente. O
DNA de B. bovis foi detectado pela PCR nas amostras provenientes dos animais 13
e 24, e na amostra de sangue do bezerro 23 a presença de DNA de A. marginale foi
detectada pela PCR.
76
Tabela 15. Idade, volume globular (%) e parasitemia de Babesia bigemina e
Anaplasma marginale nas amostras de sangue de bezerros da raça Nelore criados
no município de São Manuel, SP.
Animal Idade (dias)
Volume Globular (%) Parasitemia (%)
11 300 30
3,2 (A. marginale)
11 367 36
4,0 (A. marginale)
12 300 40
3,8 (A. marginale)
12 334 38
6,8 (A. marginale)
12 367 33
7,4 (A. marginale)
13 297 38
4,2 (A. marginale)
13 364 29
6,8 (A. marginale)
15 100 41
0,2 (B. bigemina)
15 119 41
0,1 (B.bigemina)
15 297 37
1,9 (A. marginale)
15 331 37
4,1 (A. marginale)
15 364 35
2,1 (A. marginale)
17 364 34
4,9 (A. marginale)
18 244 28
5,6 (A. marginale)
1,4 (B.bigemina)
19 244 33
3,2 (A. marginale)
20 86 34
0,2 (B.bigemina)
20 297 30
1,0 (A. marginale)
20 331 28
4,9 (A. marginale)
20 364 31
1,3 (A. marginale)
21 243 23
4,9 (A. marginale)
21 270 33
3,0 (A. marginale)
21 363 30
3,2 (A. marginale)
23 200 23
26,0 (A. marginale)
23 336 33
12,0 (A. marginale)
23 369 31
4,0 (A. marginale)
24 59 39
8,2 (A. marginale)
24 305 20
11,3 (A. marginale)
24 339 28
8,2 (A. marginale)
1,3 (B.bigemina)
24 372 30
6,8 (A. marginale)
25 277 32
11,9 (A. marginale)
32 377 32
9,8 (A. marginale)
33 378 35
3,8 (A. marginale)
77
5.4.5. Contagem total de Leucócitos
As médias e desvios-padrão da contagem total de leucócitos nas amostras
negativas para Babesia bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale de 17 bezerros
estão apresentadas na tabela 16.
Tabela 16. Valores médios e desvios-padrão da contagem total de leucócitos (µL),
de acordo com a idade de bezerros da raça Nelore, negativos para Babesia bovis, B.
bigemina e Anaplasma marginale, criados no município de São Manuel, SP.
Idade (dias)
Leucócitos(µL) ±
±±
± DP
Número de animais
<1
11141 ± 3858
15
15-30
11346 ± 2151
16
38-55
13291 ± 3297
12
53-70
10272 ± 2304
12
73-90
10725 ± 1799
08
87-105
12240 ± 2517
10
107-130
13505 ± 3564
10
123-146
12441 ± 2769
12
158-181
11400 ± 2706
12
192-215
10889 ± 2401
09
223-246
11062 ± 3495
03
258-281
8364 ± 2264
06
285-308
3832*
01
313-336
12932 ± 2992
03
343-369
0
* Valor absoluto
Na tabela 17 estão relacionados os valores da contagem total de leucócitos
nas amostras de sangue dos animais em cujos esfregaços sangüíneos foram
encontrados hemoparasitas. Em 66 amostras de sangue, os valores da contagem
total de leucócitos ficaram fora do intervalo dos valores de referência. Em 1 dessas
amostras foi detectada parasitemia de B. bigemina e em 10 outras, parasitemia de A.
marginale.
78
Tabela 17. Idade, número total de leucócitos e parasitemia em amostras de sangue
de bezerros da raça Nelore, criados no município de São Manuel, SP.
Animal
Idade (dias)
Leucócitos (µ
µµ
µL)
Parasitemia (%)
11 300 5250
3,2 (A. marginale)
11 367 12390
4,0 (A. marginale)
12 300 14963
3,8 (A. marginale)
12 334 14700
6,8 (A. marginale)
12 367 14385
7,4 (A. marginale)
13 297 9240
4,2 (A. marginale)
13 364 8610
6,8 (A. marginale)
15 100 12900
0,2 (B. bigemina)
15 119 10800
0,1 (B. bigemina)
15 297 8820
1,9 (A. marginale)
15 331 8033
4,1 (A. marginale)
15 364 9500
2,1 (A. marginale)
17 364 9000
4,9 (A. marginale)
18 244 5565
5,6 (A. marginale)
1,4 (B. bigemina)
19 244 12075
3,2 (A. marginale)
20 86 10100
0,2 (B. bigemina)
20 297 9922
1,0 (A. marginale)
20 331 8820
4,9 (A. marginale)
20 364 7900
1,3 (A. marginale)
21 243 10500
4,9 (A. marginale)
21 270 12757
3,0 (A. marginale)
21 363 7800
3,2 (A. marginale)
23 200 10920
26,0(A. marginale)
23 336 8400
12,0 (A. marginale)
23 369 12590
4,0 (A. marginale)
24 59 9100
8,2 (A. marginale)
24 305 3832
11,3 (A. marginale)
24 339 7350
8,2 (A. marginale)
1,3 (B. bigemina)
24
372 11600 6,8 (A. marginale)
25
277 10657 11,9 (A. marginale)
32
377 13500 9,8 (A. marginale)
33
378 16600 3,8 (A. marginale)
79
5.5. População de Boophilus microplus
Formas imaturas de carrapatos Boophilus microplus foram encontradas pela
primeira vez em março de 2004 em um bezerro com cerca de 50 dias de idade. A
partir de então, estágios imaturos desses carrapatos foram detectados nos bezerros
ao longo de todo o experimento, excetuando o mês de outubro de 2004 (Figura 8).
Nos meses de julho e setembro de 2004 todos os animais (17) encontravam-se
parasitados por carrapatos, sendo em sua maioria formas imaturas. Os carrapatos
eram encontrados predominantemente na região inguinal, úbere, saco escrotal e
períneo.
No que se refere às formas adultas, foram encontradas e colhidas 27
teleóginas de B. microplus parasitando 10 bezerros, nas seguintes ocasiões no ano
de 2004: uma em abril, duas em julho, 11 em agosto, 10 em setembro. Em janeiro
de 2005 foram colhidas as outras 3 teleóginas.
Figura 8: Número de bezerros Nelore parasitados por Boophilus microplus ao
longo de ano, criados no município de São Manoel, SP.
0
5
10
15
20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Colheitas
No de bezerros
80
5.6. Freqüência de infecções por Babesia bovis, B. bigemina e Anaplasma
marginale em teleóginas de Boophilus microplus.
Nenhuma forma evolutiva de Babesia spp. foi observada nos exames diretos
de hemolinfa, assim como não foi detectado DNA de B. bovis nas teleóginas
colhidas. O DNA de B. bigemina foi detectado em apenas duas teleóginas, ambas
colhidas no mês de setembro de 2004. O DNA de A. marginale foi detectado em 18
teleóginas colhidas nos meses de abril (1), julho (1), agosto (7) e setembro (6) de
2004 e em janeiro (3) de 2005 (Tabela 18).
Tabela 18. Freqüência de infecções por Babesia bovis, B. bigemina e Anaplasma
marginale diagnosticadas pela nPCR em teleóginas de Boophilus microplus colhidas
de bezerros Nelore criados no município de São Manuel-SP.
Infecção das teleóginas
Infecção
Animal
B. bovis B. bigemina A. marginale
B. bigemina
A. marginale
Negativo Total
B. bovis
0 0 0 0 0 0
B. bigemina
0 0 2 0 0 2
A. marginale
0 0 6 1 4 11
B. bigemina
A. marginale
0 0 5 0 1 6
B. bovis
B. bigemina
A. marginale
0 0 0 1 1 2
Negativo
0 0 3 0 3 6
Total
0 0 16 2 9 27
81
6. D
ISCUSSÃO
As técnicas moleculares de diagnóstico têm constituído uma importante
ferramenta na investigação epidemiológica, especialmente, no caso das
enfermidades parasitárias, pois possibilitam detectar infecções incipientes bem como
a identificação de portadores assintomáticos, que têm grande importância na
manutenção de endemias. A utilização dessas técnicas no estudo das infecções por
Babesia spp. e Anaplasma marginale é promissora, tanto por possibilitar a ratificação
de saberes estabelecidos, como por ampliar o entendimento sobre a dinâmica
dessas infecções, de forma a possibilitar uma abordagem mais segura para o
controle e profilaxia dessas enfermidades.
A situação epidemiológica de estabilidade endêmica, para Babesia, é gerada
quando a taxa de inoculação dos parasitas é suficiente para infectar os bezerros
antes que a resistência a esses parasitas desapareça, o que se dá entre seis e nove
meses de idade (MAHONEY et al., 1981). Por outro lado, como a taxa de inoculação
depende do número de carrapatos presentes e de sua própria taxa de infecção,
fatores que interferem na sobrevivência e na taxa de infecção de B. microplus
podem ser responsáveis pela redução da taxa de inoculação (GUGLIELMONE,
1995) e conseqüentemente, do surgimento de um quadro de instabilidade enzoótica.
Ainda de acordo com GUGLIELMONE (1995), os fatores que podem dar
origem à situação de instabilidade endêmica incluem: condições climáticas marginais
para o desenvolvimento do carrapato e controle intensivo de carrapatos. Além disso,
considera-se que em regiões favoráveis ao desenvolvimento do vetor e na ausência
de controle do vetor, situações de instabilidade poderiam, teoricamente, ocorrer em
rebanhos que apresentam elevados níveis de resistência ao carrapato.
82
São vários os autores que consideram que a raça dos bovinos pode
influenciar a ocorrência de doenças transmitidas por carrapatos (BOCK et al., 1999
b
;
JONSSON et al., 2000), com destaque, principalmente, para a elevada resistência
dos bovinos zebuínos à infestação por B. microplus.
A fazenda de origem dos animais do presente experimento foi escolhida pelo
fato de explorar exclusivamente bovinos da raça Nelore por cerca de duas décadas.
Considerando ser essa uma raça extremamente resistente ao B. microplus, os dados
obtidos com o emprego de técnicas moleculares de detecção dos parasitas da TPB
poderiam esclarecer se a maior resistência desses animais, que se manifesta tanto
em termos de dificultar o desenvolvimento dos carrapatos bem como dos agentes
por eles transmitidos (MADRUGA et al. 1984), seria suficiente para sobrepujar as
condições climáticas que nessa região são amplamente favoráveis ao
desenvolvimento dos carrapatos e em uma propriedade que não utiliza métodos de
controle de carrapatos e de hemoparasitas.
A primeira evidência de que os agentes da TPB ocorrem de forma endêmica
estável na propriedade em que esse trabalho foi realizado, foi a constatação de um
equilíbrio na relação parasita-hospedeiro, característico de regiões de estabilidade
enzoótica. Esse equilíbrio evidenciou-se inicialmente pela ausência de sinais
clínicos característicos da TPB, como apatia, prostração, perda de peso,
hemoglobinúria no caso de babesiose e icterícia no caso de anaplasmose
(KESSLER & SCHENK, 1998
b
), confirmando-se pelo fato de que ao longo de um
ano de experimento, apenas em um pequeno número de amostras de sangue foram
observadas alterações nos parâmetros hematológicos relacionados à patogenia
desses parasitas, tais como: contagem total de eritrócitos, concentração de
hemoglobina e volume globular. No entanto, mesmo nesses casos, não foi possível
83
estabelecer uma associação entre as alterações hematológicas e a presença de
hemoparasitas.
Considerando que a anemia é proporcional à parasitemia (RADOSTITIS,
2000) e ocorre em função de alterações hemodinâmicas resultantes da hemólise
intravascular disseminada e também de mecanismos como seqüestro e lise de
eritrócitos normais e parasitados (ARAGON, 1976, ALFONSO et al., 1996), é
possível que os níveis de parasitemia apresentados pelos animais avaliados
estivessem abaixo do limiar necessário para produzir doença clínica. De acordo com
COLEMAN, et al. (2001) a presença de animais com baixos níveis de parasitemia é
um dos fatores que favorecem a instalação e manutenção de um quadro de
estabilidade endêmica.
Mesmo no caso dos dois animais em que os parâmetros hematológicos
indicativos de anemia foram detectados concomitantemente com uma ou mais
espécies de hemoparasitas, os animais se recuperaram sem que houvesse
necessidade de tratamento. Embora não se possa afirmar categoricamente, essas
alterações poderiam estar associadas à infecção recente por um ou mais agentes
da TPB, pois de acordo com MENDONÇA et al. (2002), bezerros Nelore
experimentalmente infectados com B. bigemina apresentaram alterações na
contagem total de eritrócitos, concentração de hemoglobina e volume globular, dois
e quatro dias após a inoculação, porém cerca de 16 dias depois, esses valores
retornaram próximos aos níveis anteriores.
A leucocitose observada em um grande número de amostras do presente
trabalho é uma alteração freqüentemente relatada em bovinos submetidos a
infecções experimentais por B. bigemina (MENDONÇA et al. 2002), B. bigemina e
B. bovis (KOHAYAGAWA et al. 1990) e A. marginale (ALFONSO et al. 1996). No
84
entanto, não seria prudente atribuir essa leucocitose à infecção por hemoparasitas,
pois alterações nas contagens de leucócitos podem estar relacionadas a uma série
de fatores, como infecções por agentes virais, fungos, bactérias, helmintos e outros
protozoários.
Como os animais eram mantidos em pasto, sob regime de criação extensiva,
e não se observou uma associação na detecção simultânea de leucocitose e a
presença de Babesia spp. e/ou A. marginale, não é possível precisar a contribuição
dessas infecções na ocorrência de leucocitose.
De um modo geral, as manifestações clínicas de TPB são mais raras em
animais zebuínos, como o Nelore e seus cruzamentos (BOCK et al., 1997), sendo
essa resistência ainda mais evidente quando esses animais são nascidos em áreas
endêmicas para os agentes da TPB e não compartilham pastagens com animais de
origem européia (MADRUGA et al., 1984; SOARES et al., 2000; SOUZA et al.,
2000). Essa parece ser a situação da propriedade estudada, já que ao longo de um
ano de experimento, não foram observados casos clínicos de babesiose e/ou
anaplasmose nos bezerros.
No entanto, há que se destacar que nessa propriedade há registros de
ocorrência de TPB, inclusive com óbito tanto de bezerros como de bovinos adultos.
Esse fato não se contrapõe a uma situação de endemia estável, pois de acordo com
COLEMAN et al. (2001), são dois os critérios mínimos para se classificar uma
situação como sendo de endemia estável: primeiro que a enfermidade clínica é mais
provável (ou mais grave) em animais adultos que em animais jovens; segundo, que
a infecção inicial diminui a probabilidade de infecções subseqüentes ou a
probabilidade de que as infecções subseqüentes resultem em enfermidade clínica.
Portanto, considerando as avaliações clínicas dos animais ao longo do primeiro ano
85
de vida, e também o histórico da propriedade, tem-se mais uma indicação de que os
agentes da TPB se mantêm na propriedade sob a forma de endemia estável, a
despeito da resistência dos animais aos carrapatos.
No que se refere à resistência dos animais do rebanho aos carrapatos,
algumas constatações suportam a idéia de que ela se apresenta em níveis elevados.
Em primeiro lugar, há que se destacar que embora a propriedade esteja localizada
em uma região cujas condições climáticas propiciam a ocorrência de parasitismo por
carrapatos ao longo de todo o ano (FONSECA et al., 1997), não se utiliza nenhum
método de controle para B. microplus na propriedade. Esses dados indicam
fortemente que, mesmo sob condições climáticas favoráveis ao desenvolvimento dos
carrapatos, a resistência dos animais pode ser decisiva na dinâmica das infestações.
Constatações semelhantes foram feitas por WAMBURA et al. (1998), que concluíram
ser a raça dos bovinos um fator determinante do nível de infestações dos animais de
um rebanho.
De acordo com as informações disponíveis, de modo geral, sob uma mesma
condição de exposição às formas de vida livre, bovinos de raças zebuínas puras
(Bos taurus indicus) albergam apenas 10 a 20% dos carrapatos que parasitam os
taurinos puros (Bos taurus indicus) (JONSSON, 2006).
Outro dado que atesta a elevada resistência dos animais experimentais ao
carrapato é a constatação de que, embora o parasitismo tenha sido observado ao
longo da maioria dos meses do ano, predominaram nos bezerros formas imaturas de
B. microplus de forma que apenas 27 teleóginas foram encontradas nesse período.
Portanto, a estimativa dos níveis populacionais de carrapatos a partir do
parasitismo de animais jovens pode fornecer uma subestimação dessa população, já
86
que existe uma associação estreita entre idade dos bovinos e número de carrapatos
adultos que albergam.
UTECH et al. (1978) verificaram que bezerros jovens apresentam menor
susceptibilidade aos carrapatos que os animais mais velhos. Fato semelhante foi
assinalado por OLIVEIRA (2002) que ao investigar a dinâmica das infecções por B.
bigemina em bovinos mestiços leiteiros constatou que os bezerros albergavam uma
população de carrapatos significativamente inferior à das vacas de um mesmo
rebanho.
De acordo com MAHONEY et al. (1981), os bezerros respondem somente por
25% da população total de carrapatos em uma propriedade. Dessa forma, é razoável
supor que o parasitismo dos bezerros pelas formas imaturas do carrapato ao longo
da maior parte do ano tenha sido garantido pelas fêmeas que se ingurgitam nos
animais adultos do rebanho.
Tendo em vista as considerações de UILENBERG (1995), de que a elevada
resistência dos animais de origem zebuína, teoricamente, seria suficiente para
reduzir a taxa de inoculação de Babesia necessária à manutenção da estabilidade
endêmica, amostras de soro dos bezerros foram colhidas ao longo de todo o ano,
para a pesquisa de anticorpos específicos contra os agentes da TPB, já que a
probabilidade de ocorrência de surtos pode ser estimada, indiretamente, pela
avaliação da proporção de bezerros infectados através da detecção dos níveis de
anticorpos específicos na população (MAHONEY et al., 1973, FAO, 1984).
A grande maioria dos estudos epidemiológicos sobre tristeza parasitária
bovina no Brasil é baseada em testes sorológicos, sendo o ensaio de
imunoadsorção enzimático indireto (ELISA-I) uma das técnicas mais comumente
utilizadas. Além da objetividade proporcionada pela leitura automática, é uma
87
técnica que permite a análise de um grande número de amostras em um curto
intervalo de tempo (MADRUGA et al., 2001).
Ao se analisar os resultados dos exames de ELISA para os três
hemoparasitas, constata-se que anticorpos específicos foram detectados na maioria
dos animais imediatamente após o nascimento (82% para B. bovis; 88% para B.
bigemina; 94% para A. marginale). Esses anticorpos, de origem colostral, explicam
os baixos níveis de parasitemia e a ausência de enfermidade clínica nos bezerros
nos primeiros meses de vida, sendo esta uma característica clássica de região
endêmica (MAHONEY & ROSS, 1972; GUGLIELMONE, 1995).
A detecção de elevado número de animais soropositivos após os nove meses
de idade (100% para B. bovis; 94% para B. bigemina; 100% para A. marginale),
muito provavelmente é conseqüência do desenvolvimento de imunidade ativa,
indicando haver uma taxa de inoculação suficiente para manutenção da estabilidade.
Em síntese, a detecção desses anticorpos, nessas duas ocasiões críticas, constitui
uma forte evidência de que a transmissão desses parasitas ocorre em níveis
suficientes para que os anticorpos possam ser transferidos para os bezerros via
colostro e também em níveis suficientes para induzir imunidade ativa na maioria dos
animais, antes que percam a resistência etária aos agentes da TPB, por volta dos
nove meses de idade (UILENBERG, 1995).
Em grande parte do território nacional predominam áreas de estabilidade
endêmica para os agentes da TPB, nas quais a ocorrência de casos clínicos é
inesperada. Entretanto, casos de babesiose em bezerros foram atribuídos à
existência de uma “janela imunológica”, (MADRUGA et al. 1984), entre 28 e 56 dias
após o nascimento dos bezerros para B. bigemina e entre 56 e 84 dias, no caso de
B. bovis.
88
No presente trabalho, o período em que não foram detectados anticorpos no
soro dos animais foi mais longo que o obtido por esses autores, porém pode
corresponder a essa “janela imunológica”. A não ocorrência de enfermidade clínica
durante esse período em que não foram detectados anticorpos nos bezerros do
presente experimento pode ser atribuída, pelo menos em parte, ao baixo desafio
pelos carrapatos. No entanto, há autores que consideram que a resistência dos
animais jovens às infecções por B. bovis, B. bigemina (BROWN et al., 2006, ZINTL
et al., 2005) e A. marginale (UILENBERG, 1995), independe da imunidade materna.
As técnicas de diagnóstico sorológico têm sido extremamente úteis na
investigação da epidemiologia das babesioses e da anaplasmose, servindo inclusive
de base para a proposição de modelos matemáticos destinados a avaliar os riscos
de ocorrência de enfermidade e para a proposição de medidas de controle em
diferentes regiões ecológicas (SOLORIO-RIVERA et al., 1999).
Apesar da elevada sensibilidade e especificidade dos métodos sorológicos,
uma das principais limitações é que eles apenas indicam a exposição ao agente,
não informando sobre o estágio da infecção (WAGNER et al., 1992). Com isso, não
permitem identificar os animais que no início da infecção ainda não desenvolveram
resposta imune e nem distinguir os animais soropositivos que estão de fato
infectados dos que eliminaram a infecção. Do ponto de vista epidemiológico, é
importante identificar os animais verdadeiramente infectados, pois eles constituem a
principal fonte de infecção para os carrapatos.
A detecção microscópica de hemoparasitas em esfregaços de sangue é
considerada a melhor técnica diagnóstica para animais clinicamente afetados,
porque é um exame de baixo custo e que, por permitir a observação de detalhes
morfológicos do parasita, é absolutamente específico. No entanto, a execução
89
desses exames requer pessoas treinadas para determinar as espécies envolvidas,
principalmente, quando as parasitemias por B. bovis e B. bigemina são muito baixas,
dificultando a identificação específica (BÖSE et al., 1995).
No presente estudo, merozoítas de B. bovis não foram detectados em
esfregaços sangüíneos ao longo do primeiro ano de vida dos bezerros. Além da
sensibilidade intrínseca do método de esfregaço ser baixa, no caso de B. bovis tem-
se ainda o inconveniente dos baixos níveis de parasitemia comumente apresentados
por bovinos portadores da infecção (JACKSON et al. 2001). Assim sendo, a
visualização de merozoítas é mais provável em sangue de bovinos com
sintomatologia clínica (RODRIGUES et al., 2005).
Uma das explicações para as baixas parasitemias nas infecções por B. bovis
é a predileção dessa espécie pelos capilares viscerais, fazendo com que os
merozoítas ocorram em pequeno número na circulação periférica (CALDER et al.,
1996). Segundo COOKE et al. (2005), esse fenômeno de “visceralização” observado
na infecção por B. bovis é conseqüência de alterações morfológicas observadas nos
eritrócitos bovinos parasitados, nos quais observa-se a formação de protuberâncias
na membrana celular; essas estruturas foram denominadas de “stellate protusions”
por AIKAWA et al. (1985).
A maior resistência dos animais jovens, especialmente de bovinos de raças
zebuínas à infecção por B. bovis (BOCK et al., 1997), é outra causa de baixas
parasitemias, podendo ser outro fator responsável pelo fato de não terem sido
encontrados merozoítas dessa espécie no sangue dos bezerros. Essa pode ser,
inclusive, a explicação para o fato de nossos resultados serem distintos dos de
OLIVEIRA et al. (2005) que encontraram merozoítas de B. bovis em 11% (3/27) dos
90
bezerros mestiços leiteiros (Bos taurus taurus x Bos taurus indicus) criados em
região com as mesmas características climáticas, também no Estado de São Paulo.
O encontro de merozoítas de B. bigemina nos esfregaços sangüíneos de
quatro animais, corresponde a 1,96% das amostras de sangue colhidas dos 17
bezerros ao longo de um ano. Apesar de estudos conduzidos na América do Sul
haverem demonstrado que a prevalência B. bigemina é maior que a de B. bovis
(YOUNG, 1988), ao menos em termos de soroprevalência, o encontro de merozoítas
de B. bigemina em maior número de animais não deve ser interpretado como reforço
dessa afirmação, visto que no caso de B. bovis a baixa sensibilidade da técnica de
esfregaço é ainda mais significativa por causa da biologia do protozoário.
A detecção de corpúsculos intraeritrocitários de A. marginale foi feita em um
número significativo de animais (14), oito dos quais em mais de uma ocasião. A
maior eficiência desse método em detectar a presença dessa rickéttsia pode ser
atribuída ao fato de que nas infecções iniciais, 10 a 90% dos eritrócitos podem ser
parasitados. Embora na maioria das vezes os animais que se recuperam da infecção
convertam-se em portadores crônicos, nos quais o parasita persiste em níveis muito
baixos, a detecção de A. marginale em mais de uma ocasião revela que os baixos
níveis de parasitismo nem sempre se encontram abaixo do limiar de detecção
microscópica. De acordo com as considerações de KIESER et al. (1990), a
multiplicação cíclica dessa rickéttsia pode estar relacionada à geração de variantes
antigênicas.
A exceção de um animal cuja primeira detecção de Anaplasma se deu aos
dois meses de idade, na maioria dos animais os corpúsculos de A. marginale só
foram detectados a partir do mês de julho, quando os animais tinham pelo menos
seis meses de idade. Esses resultados são comparáveis aos obtidos em Minas
91
Gerais (MELO et al., 2001) onde foi detectada a infecção quando os animais tinham
seis a sete meses de idade, quando se encontravam mais vulneráveis à doença, já
que a susceptibilidade aumenta com a idade e com o fim da proteção colostral.
Uma das principais limitações das técnicas de detecção microscópica dos
agentes da TPB nos hospedeiros vertebrados é a sua baixa sensibilidade em
detectar os protozoários quando as parasitemias são baixas, como, por exemplo,
nas fases iniciais da infecção e quando os animais se convertem em portadores
(CALDER et al., 1996). Em se tratando de estudos epidemiológicos essa limitação
torna-se ainda mais drástica, pois a identificação dos animais portadores é
indispensável para quantificar as fontes de infecção para os hospedeiros
invertebrados desses agentes.
A PCR empregada no presente trabalho para detectar as infecções por
Babesia spp. e A. marginale, é considerada uma técnica capaz de detectar
parasitemias extremamente baixas, com sensibilidade 100 vezes maior que os
limites da microscopia óptica, detectando cerca de 10 pg de DNA. Além disso, a
sensibilidade poder ser ampliada ainda mais com o uso de uma segunda
amplificação pela "nested" PCR (BÖSE et al., 1995). Além dessas vantagens é uma
metodologia que também possibilita a discriminação das espécies envolvidas
(ALMERIA et al., 2001). Tais características têm sido ressaltadas em diversos
trabalhos científicos em que essas técnicas foram utilizadas na investigação de
infecções por Babesia spp. (FIGUEROA et al., 1996; ALMERIA et al., 2001;
OLIVEIRA et al., 2005; OLIVEIRA-SEQUEIRA et al., 2005; COSTA-JUNIOR et al.,
2006) e Anaplasma (FIGUEROA et al., 1996; OSAKI et al., 2002).
Utilizando a técnica de PCR, a presença de DNA de B. bovis (1 animal) e de
A. marginale (1 animal) foi detectada em animais com menos de 24 horas de
92
nascimento, evidenciando a ocorrência de transmissão congênita por esses dois
hemoparasitas. Embora a transmissão congênita de A. marginale e de diferentes
espécies de Babesia seja amplamente admitida, as poucas descrições de
transmissão vertical, tanto de Babesia (BARBOSA et al., 1994, BRACARENSE et al.,
2001, YERUHAM et al., 2003) como de Anaplasma (NORTON et al., 1983, ZAUGG,
1985, RIBEIRO et al., 1996), registradas na bibliografia, restringem-se a casos cujo
diagnóstico foi feito pela detecção dos parasitas no sangue ou em órgãos de animais
que morreram em virtude das infecções ou de animais com graves manifestações de
enfermidade hemolítica.
NORTON et al. (1983) consideraram que no caso de A. marginale a infecção
transplacentária poderia ser a causa de muitas das perdas neonatais não
diagnosticadas de bezerros. No entanto, para alguns autores a transmissão
congênita desses hemoparasitas é um evento raro (OSAKI et al., 2002), de pouca
importância epidemiológica e que no caso de Babesia provavelmente envolveria
alterações patológicas da placenta (YERUHAM et al., 2003).
Embora a utilização das técnicas moleculares de diagnóstico seja ainda
incipiente na investigação da epidemiologia das hemoparasitoses de bovinos, existe
pelo menos mais um registro de transmissão congênita de B. bovis, no Brasil
(OSAKI et al., 2002). Nos dois casos relatados por esses autores, os animais eram
assintomáticos e a detecção do parasita só foi possível pela amplificação de DNA
(nPCR). Com isso, esses registros podem ser os primeiros a consubstanciar a
hipótese de que a transmissão congênita desses hemoparasitas seja bem mais
freqüente e, consequentemente, possa ter um papel muito mais expressivo na
epidemiologia dessas parasitoses do que o atualmente admitido.
93
Além de haver propiciado a detecção de infecções congênitas, os resultados
obtidos pela amplificação de DNA indicam que o número de bezerros nelore
infectados pelas três espécies dos hemoparasitas estudados é significativamente
maior que o detectado pelo exame direto das amostras de sangue.
Apesar da alta sensibilidade e especificidade das técnicas baseadas em
amplificação do DNA (PCR/nPCR), casos de falso-negativos podem ocorrer,
principalmente em conseqüência da presença de substâncias inibidoras da
polimerase, presentes comumente em amostras de sangue e em alguns materiais
biológicos (HAYDEN, 1991).
No presente experimento, a possibilidade de ocorrência de falso-negativos foi
prevenida pela utilização de uma coluna especial para a extração das amostras de
DNA, que propicia a obtenção de amostras com baixa contaminação por
substâncias que possam inibir a reação de amplificação. No entanto, mesmo com
esses procedimentos a ocorrência de resultados falso-negativos não pode ser
excluída devido a outros fatores. No presente trabalho, os possíveis resultados
falso-negativos devem ser atribuídos ao limiar de sensibilidade de cada técnica
utilizada que se situa em torno de 0,00003% de eritrócitos parasitados nas reações
de PCR e de 0,0000003% nas reações de nPCR, respectivamente.
Uma evidência de que ocorreram resultados falso-negativos em função do
limiar de sensibilidade das técnicas de amplificação de DNA é a constatação de que
das sete amostras positivas para B. bovis, 3 necessitaram de uma segunda
amplificação pela nPCR; no caso de B. bigemina, das 47 amostras positivas, 22
foram detectadas pela técnica de nPCR.
Essa constatação indica que as parasitemias por Babesia podem ocorrer em
níveis abaixo do limiar de sensibilidade da PCR, já que quase metade das amostras
94
em que foram detectadas o DNA dos parasitas, a detecção foi realizada
exclusivamente pela técnica de nPCR. Como a reação de nPCR não apresenta
sensibilidade de 100%, não é possível descartar a possibilidade de resultados falso-
negativos também com essa técnica.
Devido à elevada sensibilidade dos testes baseados em amplificação de DNA,
a ocorrência de falso-positivos tem sido constatada e relacionada, principalmente, à
contaminação por aerossóis de DNA amplificado (amplicons). Para se evitar essa
contaminação foram adotadas medidas preventivas como execução de cada etapa
da técnica em ambientes distintos e exclusivos, a esterilização dos materiais
utilizados e estabelecimento de áreas isoladas dentro do laboratório, munidas de
lâmpadas UV para a realização dos procedimentos.
Para verificação da eficácia dessas medidas, em cada bateria de reações foi
incluída uma amostra sem DNA para controle da contaminação por amplicons.
Dessa forma, é improvável que as taxas de infecções detectadas nos hospedeiros
vertebrados possam estar sobreestimadas.
No presente estudo, o número de amostras positivas para B. bigemina foi
maior que o de B. bovis, independentemente do método utilizado. Contudo, esse
resultado não deve ser interpretado como evidência de que na propriedade a
prevalência de B. bigemina seja mais elevada, principalmente, porque, a partir de
outubro de 2004, quando os animais tinham entre 258 e 281 dias de vida, o número
de bovinos soropositivos para as duas espécies de Babesia foi semelhante. Esse
dado, além de comprovar que ambas as parasitoses ocorrem de forma endêmica
estável, demonstra a utilidade dos métodos sorológicos na investigação
epidemiológica desses hemoparasitas. Isso porque, somente pela sorologia foi
possível constatar que essas duas espécies requerem níveis distintos de exposição
95
para produzir taxas semelhantes de infecção, como freqüentemente se observa em
áreas em que as duas espécies ocorrem sob a forma de estabilidade enzoótica
(SOARES et al., 2000; SOUZA et al., 2000; BARROS et al., 2005).
Um quadro distinto desse apresentado pelas duas espécies de Babesia foi
observado em relação à detecção de infecções por A. marginale. Nesse caso, o
número de amostras sorologicamente positivas foi semelhante ao de amostras nas
quais se detectou o DNA do parasita. A detecção freqüente de corpúsculos de
Anaplasma em exames diretos de esfregaços sangüíneos, em várias ocasiões com
parasitemias elevadas, indicam que a densidade dos hemoparasitas nas amostras é
responsável pelo elevado número de amostras positivas pelas técnicas de
amplificação de DNA. Esses resultados se explicam pela própria biologia da
rickéttsia: após as infecções primárias, os parasitas persistirem no organismo dos
hospedeiros (KIESER et al., 1990), produzindo ciclos de rickettsemia a intervalos de
aproximadamente 5 semanas (ERICKS et al. 1993).
A freqüência de infecções por Babesia spp. e A. marginale, nas teleóginas de
B. microplus colhidas dos bezerros durante um ano, foi investigada utilizando a
técnica de esfregaços de hemolinfa e a de nPCR. Como na nPCR os produtos da
amplificação da PCR são submetidos a uma nova amplificação, aumenta-se o limiar
de sensibilidade, diminuindo-se a possibilidade de resultados falso-negativos de
forma a se detectar, no laboratório, resultados mais próximos da realidade (BOSE et
al., 1995; COSTA-JUNIOR et al., 2006).
No que se refere à pesquisa de infecção nos carrapato, é necessário que se
faça uma ressalva quanto ao número de teleóginas colhidas ao longo de um ano de
experimento. De acordo com as informações disponíveis sobre a dinâmica das
populações de B. microplus na Região Sudeste, o parasitismo dos bovinos ocorre
96
ao longo de todo o ano, com maiores infestações sendo observadas no período de
outubro a abril (FONSECA et al., 1997). Dessa forma, o fato de terem sido obtidas
apenas 27 teleóginas ao longo de um ano pode ser atribuído à elevada resistência
dos animais aos carrapatos. Além de se tratar de uma da raça altamente resistente
aos carrapatos, é também sabido que bovinos jovens são também mais resistentes
que os adultos. UTECH et al. (1978) verificaram que os bezerros jovens são menos
susceptíveis aos carrapatos que os animais mais velhos, o mesmo tendo sido
observado por OLIVEIRA et al (2005) ao trabalhar com bovinos leiteiros no Estado
de São Paulo.
Em função do pequeno número de carrapatos coletados, os dados relativos à
infecção dos carrapatos obtidos foram analisados com reserva já que não podem
ser comparados quantitativamente com o de outros autores que trabalharam com
número significativo de teleóginas. Apesar dessa ressalva, é provável que o fato de
não terem sido detectadas formas evolutivas de Babesia spp. no exame direto da
hemolinfa das teleóginas possa ser atribuído inicialmente à ausência de parasitemia
de B. bovis e às baixas parasitemias de B. bigemina no hospedeiro vertebrado.
Essas parasitemias, por sua vez, podem ser influenciadas por diferentes variáveis,
como idade, raça, e intensidade de controle de carrapatos. Com isso, indiretamente,
estas variáveis podem interferir na taxa de infecção por Babesia spp. em fêmeas de
Boophilus. De acordo com RIEK (1964, 1966) poucas teleóginas se infectam em
bovinos com baixa parasitemia. OLIVEIRA et al. (2005) observaram uma associação
positiva entre a parasitemia do hospedeiro vertebrado e a presença de
esporocinetos na hemolinfa de teleóginas e SANTOS et al. (1998) relataram que no
caso de B. bigemina a parasitemia no hospedeiro vertebrado também influencia a
transmissão transovariana do protozoário.
97
No que se refere à detecção de DNA de Babesia, apenas o DNA de B.
bigemina foi detectado, mesmo assim em apenas duas das 27 teleóginas colhidas.
A maioria dos autores que investigaram aspectos da transmissão de Babesia spp.
utilizaram a técnica de esfregaço de hemolinfa para detectar as infecções de
teleóginas alimentadas em animais experimentalmente infectados. Esses autores
observaram que as infecções por B. bigemina em fêmeas ingurgitadas de B.
microplus foram mais freqüentes do que as infecções por B. bovis (RIEK, 1964;
1966; MAHONEY & MIRRE, 1971; 1977), o que de certa forma também foi
observado no presente trabalho.
Além da parasitemia, OLIVEIRA-SEQUEIRA et al. (2005) observaram que as
infecções por Babesia nos carrapatos eram também influenciadas pela idade dos
animais. Estes autores constataram que a freqüência de infecções por B. bovis em
teleóginas ingurgitadas em bezerros era menor do que em teleóginas alimentadas
em vacas adultas, ocorrendo o oposto em relação a B. bigemina.
Embora as técnicas de biologia molecular venham sendo amplamente
utilizadas para investigar as interações entre carrapatos e A. marginale, poucos
estudos foram dedicados a investigar quantitativamente a freqüência de carrapatos
infectados, especialmente, em condições naturais. No presente trabalho, o DNA de
A. marginale foi detectado em 18 teleóginas (18/27) das quais 13 haviam sido
colhidas em agosto e setembro de 2004, meses em que o número de teleóginas que
parasitavam os bezerros também foi maior (11 e 10, respectivamente).
A detecção de DNA de A. marginale nessas teleóginas, na proporção
encontrada, constitui uma evidência de que o isolado que circula nos animais da
região investigada é altamente infectante para B. microplus. Entretanto, embora não
constitua evidência de que possam ser transmitidos transovarianamente para ovos e
98
larvas, a habilidade de um determinado isolado infectar os tecidos dos carrapatos é
condição determinante para que seja transmitido por estes artrópodes
(
de la
FUENTE et al., 2001
).
É importante destacar que a extração de DNA dos carrapatos foi realizada 15
dias após a colheita das teleóginas, e que, por isso, o material amplificado foi
considerado como sendo derivado do desenvolvimento do parasita nos tecidos da
teleógina e não de material presente no sangue ingerido pelo artrópode.
Considera-se que, em termos epidemiológicos, a transmissão biológica de A.
marginale é indispensável, pois assegura que bovinos portadores constituam uma
fonte constante de infecção para os carrapatos, independentemente do nível de
rickettsemia. Dessa forma, AGUIRRE et al. (1994) verificaram serem necessários
apenas três carrapatos adultos alimentados quando ninfas em bezerro com menos
de 1% de parasitemia para transmitir A. marginale para outro bezerro. De modo
semelhante, SCOLES et al. (2005) verificaram serem necessários apenas 3
exemplares de D. andersoni para transmitir A. marginale após haverem se
alimentado em animal com rickettsemia 300 vezes inferior ao utilizado sem sucesso
na tentativa de promover a transmissão mecânica por Stomoxys calcitrans.
Portanto, de acordo com estes autores, como a transmissão mecânica, por insetos
hematófagos, depende dos níveis de parasitemia, ela só seria possível durante a
fase aguda da infecção.
Por outro lado, não se pode descartar a possibilidade de ocorrência de
transmissão mecânica por insetos hematófagos na região, pois existem cepas de A.
marginale incapazes de infectar carrapatos, cuja transmissibilidade pode estar
relacionada à capacidade dessas cepas de interagir de forma distinta com os
vetores mecânicos (SCOLES et al., 2005). Por isso, como não foi realizada a
99
caracterização genotípica do DNA colhido dos bezerros e das teleóginas, os dados
do presente trabalho não possibilitam avaliar de forma precisa a real dimensão da
participação de B. microplus na epidemiologia de A. marginale nessa região.
A utilização de técnicas tradicionais de investigação epidemiológica em
associação com técnicas de diagnóstico molecular produziu, no presente trabalho,
alguns resultados que se contrapõem a alguns conceitos ou expectativas a respeito
da epidemiologia dessas parasitoses e outros que confirmam o saber estabelecido.
Em primeiro lugar, não confirmam a expectativa de que a elevada resistência de
bovinos Bos taurus indicus possa dar origem a uma situação de instabilidade
endêmica (UILEMBERG, 1995). De acordo com esse autor, a estabilidade, pelo
menos no que diz respeito às babesioses, depende da taxa de inoculação e
portanto do número de carrapatos. No entanto, recentemente GU et al. (2003)
constataram que a prevalência de infecções por Plasmodium falciparum em
comunidades africanas pode ser elevada e estável, mesmo em áreas de baixa taxa
de transmissão, onde as pessoas são expostas a poucas picadas infectantes por
ano. Segundo esses autores, a associação entre elevadas prevalências e baixa taxa
de transmissibilidade estaria relacionada aos baixos índices de recuperação, ou
seja, ao caráter crônico das infecções por esses parasitas. Não seria surpreendente
que essa pudesse ser mais uma das características comuns entre os parasitas dos
gêneros Babesia e Plasmodium.
Os vários aspectos clínicos e epidemiológicos compartilhados pelos três
agentes da denominada “Tristeza Parasitária dos Bovinos” têm levado a
generalizações que nem sempre correspondem à realidade, mesmo quando essas
generalizações se restringem às duas espécies de Babesia. No caso de A.
marginale a situação é ainda mais complexa, mesmo porque, muitos dos fatores
100
envolvidos na epidemiologia e na transmissão dessa rickéttsia não estão
estabelecidos.
No presente trabalho os resultados revelaram que as características
epidemiológicas das infecções pelos três hemoparasitas dos bovinos satisfazem os
critérios propostos por COLEMAN et al. (2001) para classificar a ocorrência como
sendo de estabilidade endêmica, porém, cada uma dessas espécies parece utilizar
diferentes estratégias para produzir uma situação que HAY (2001) classificou como
paradoxal: “nessa situação, a diminuição da freqüência de infecção pode
desencadear o aumento do número de casos de enfermidade clínica”.
101
7. Conclusões
A investigação clínico-epidemiológica das infecções por Babesia bigemina,
Babesia bovis e Anaplasma marginale (agentes da TPB) durante o primeiro ano de
vida de bezerros da raça Nelore, possibilitou as seguintes conclusões:
1.
As infecções dos bovinos ocorrem sob forma de endemia estável na
propriedade estudada, apesar da freqüência do parasitismo pelos três agentes variar
tanto nos hospedeiros vertebrados como nos carrapatos vetores.
2. A resistência dos bezerros da raça Nelore, nascidos em área endêmica, faz
com que as infecções naturais pelos agentes da TPB não produzam alterações
significativas nos parâmetros clínico-hematológicos indicativos de anemia,
dispensando com isso a instituição de tratamento específico.
3. Na propriedade investigada, a criação exclusiva de bovinos da raça Nelore,
por mais de 20 anos, não foi suficiente para alterar a característica epidemiológica
de ocorrência dos agentes da TPB na região.
4. A baixa freqüência de infecções por B. bovis e B. bigemina em teleóginas de
B. microplus que se ingurgitaram nos bezerros Nelore, associada à elevada
freqüência de animais com sorologia positiva para esses agentes, indica que os
bovinos adultos sejam os principais responsáveis pela infecção dos carrapatos em
níveis suficientes para manter o estado de endemia estável.
5. A utilização das técnicas de PCR/nPCR para o diagnóstico de infecções por
Babesia bovis e Anaplasma marginale possibilitou a detecção de infecções
102
transplacentárias por ambos os agentes, indicando que essa via possa ter uma
importância epidemiológica mais expressiva que a até então admitida.
8. Referências Bibliográficas
AGUIRRE DH, GAIDO AB, VINABAL AE, DE ECHAIDE ST, GUGLIELMONE AA.
Transmission of Anaplasma marginale with adult Boophilus microplus ticks fed as
nymphs on calves with different levels of rickettsaemia. Parasite. v.1, n.4, p.405-7,
1994.
AIKAWA M, UDEINYA IJ, RABBEGE J, DAYAN M, LEECH JH, HOWARD RJ, MILLER
LH. Structural alteration of the membrane of erythrocytes infected with Plasmodium
falciparum. J. Protozool., v.32, n.3, p.424-9, 1985.
ALFONSO, J; MEDINA, R; FAZZINO, F; CABALLERO, H. Câmbios clinicos y
hematologicos em becerros infectados com Anaplasma marginale. Acta Cien. Venez.
v.47, p.50-7, 1996.
ALMERIA, S. CASTELLA, J; FERRER, D; ORTUÑO, A; ESTRADA-PEÑA, A;
GUTIERREZ J.F. Bovine piroplasmosis in Minorca (Balearic Islands, Spain): a
comparison of PCR-based and light microscopy detection. Vet. Parasitol. v.99, p.249-
59, 2001.
ARAGON, R.S. Bovine babesiosis: a review. Vet. Bull., v.46, p.903-17, 1976.
BANNOR, T.T. Babesiosis in neonatal calves: a case report. Bull Anim Health Prod.
v.24, n.3, p.267-9, 1976.
BARBET AF. Recent developments in the molecular biology of anaplasmosis. Vet
Parasitol. v.57 n.1-3, p.43-9, 1995.
BARBOSA, M.F.R., COSTA, J.O., TAFURI, W.L. Transmissão congênita de Babesia
bovis: relato de um caso autóctone em Minas Gerais – Brasil. Arq. Bras. Med. Vet. Zoo.
v.46, p.519-526, 1994.
!"
104
BARKER, R.H; DNA probe diagnosis of parasitic infections. Exp. Parasitol. v. 70, p.494-
99, 1990.
BARREIRA, J.D; ROSSI, M.E; SILVA, G.V.O; PIRES, F.A; MASSARD, C.L.
Caracterização morfológica e aspectos biológicos das formas evolutivas de Babesia
bigemina (Smith ; Kilborne, 1983) (Protozoa:Babesiidae) em Boophilus microplus
(Canestrini, 1887). Rev. Bras. Parasitol. Vet. v.14, n.1, p.1-6, 2005.
BARREIRA, J.D; ROSSI, M.E; PIRES, F.A; SILVA, G.V.O; MASSARD, C.L. Dinâmica
da infecção de Babesia bovis (Babes, 1888, Starcovici, 1893) em fêmeas ingurgitadas
e ovos de Boophilus microplus (Canestrini, 1887). Ciên. Rur. v.35, n.5, p. 1131-5, 2005.
BARROS, S.L.; MADRUGA, C.R.; ARAÚJO, F.R.; MENK, C.F.; ALMEIDA, M.A., MELO,
E.P.S.; KESSLER, R.H.; Serological survey of Babesia bovis, Babesia bigemina e
Anaplasma marginale antibodies in cattle from the semi-arid region of Bahia, Brazil, by
enzyme linked immunosorbent assays. Mem. Inst. Osw. Cruz. v.100, n.6, p.613-617,
2005.
BARTLAKOWIAK, J. Molecular methods in the diagnosis of infectious diseases Przegl
Epidemiol.v.57, n.2, p.381-9, 2003.
BOCK, R; JACKSON, L; DE VOS, A. J; JORGENSEN, W. Babesiosis of cattle.
Parasitol. v.129, p.247-69, 2004.
BOCK, R.E; KINGSTON, T.G; DE VOS, A.J. Effect of breed on innate resistance to
infection with Anaplasma marginale transmitted by Boophilus microplus. Aust. Vet. J.
v.77, n.11, p.748-51, 1999
a
.
BOCK, R.E; KINGSTON, T.G; DE VOS, A.J. Effect of breed of cattle on transmission
rate and innate resistance to infection with Babesia bovis and Babesia bigemina
transmitted by Boophilus microplus. Aust. Vet. J. v.77, n.7, p.461-4, 1999
b
.
!"
105
BOCK, R.E; DE VOS, A.J; KINGSTON, T.G; McLELLAN, D.J. Effect of breed of cattle
on innate resistance to infection with Babesia bovis, B. bigemina and Anaplasma
marginale. Aust. Vet. J. v.75, n.5, p.337-40, 1997.
BÖSE, R; JORGENSSEN, W.K; DALGLIESH, R.J; FRIEDHOFF, K.T; de VOS, A.J.
Current state and future trends in the diagnosis of babesiosis. Vet. Parasitol. v.57, p.61-
74, 1995.
BRACARENSE, A.P.F.L., VIDOTTO, O., CRUZ, G.D. Transmissão congênita de
Babesia bovis. Arq. Bras. Med. Vet. Zoo.. v.53, n.4, P.1-3, 2001.
BROWN, W.C; NORIMINE, J; KNOWLES, D.P; GOFF, W.L. Immune control of Babesia
bovis infection. Vet. Parasitol. v. 138, n. 1-2, p. 75-87, 2006.
BUENNING, G.M. & FIGUEROA, J.V. Use of polymerase chain reaction in bovine
babesiosis research. Ann N Y Acad Sci. v.23, p. 128-132, 1996.
CALDER, J.A.M; REDDY, G.R; CHIEVES, L; COURTNEY, C.H; LITTLE, R;
LIVENGOOD, J.R; NORVAL, R.I; SMITH, C; DAME, J. Monitoring Babesia bovis
infection in cattle by using PCR-Based tests. J. Clin. Microb. V.34, n.11, p. 2748-55,
1996.
CAFRUNE, M.M.; AGUIRRE, D.H. experimental studies of the rate of infection of
Boophilus microplus eggs with Babesia bovis. Res. Vet. Science, v.58, p.284-85, 1995.
CEN-AGUILAR, J.F; RODRIGUÉZ-VOVAS, R.I; DOMINGUEZ-ALPIZAR, J.L;
WAGNER, G.G. Studies on the effect of infection by Babesia sp. on oviposition of
Boophilus microplus engorged females naturally infected in the Mexican tropics. Vet.
Parasitol. v.78, p.253-7, 1998.
COLEMAN, P.G., PERRY B.D., WOOLHOUSE M.E. Endemic stability- a veterinary
idea applied to human public health. Lancet. v.357, n.94, p.1284-6, 2001.
!"
106
COOKE, B.M.; MOHANDAS, N; COWMAN, A.F; COPPEL, R.L. Cellular adhesive
phenomena in apicomplexan parasites of red blood cells. Vet. Parasitol. v.132, p.273-
95, 2005.
COSTA-JUNIOR, L.M; RABELO, E.M.L; MARTINS-FILHO, O.A; RIBEIRO, M.F.B;
Comparison of different direct diagnostic methods to identify Babesia bovis and Babesia
bigemina in animals vaccinated with live attenuated parasites. Vet. Parasitol. v. 139, n.
1-3, p. 231-236, 2006.
COSSÍO-BAYÚGAR R, RODRIGUEZ SD, GARCIA-ORTIZ MA, GARCIA-TAPIA D,
ABOYTES-TORRES R. Bovine anaplasmosis prevalence in northern Veracruz state,
Mexico. Prev Vet Med. v.32, n. 3-4, p.165-70, 1997.
D’ANDREA, L.A.Z; SARTOR, I.F; MADRUGA, C.R; FREITAS, S.B.Z; KROLL, L.B;
KRONKA, S.N. Condição imunológica de bovinos das raças Holandesa e Nelore frente
a Babesia bovis e B. bigemina em duas regiões do estado de São Paulo. Pesq. Vet.
Bras. v.26, n.2, p.74-8, 2006.
DE LA FUENTE J, TORINA A, CARACAPPA S, TUMINO G, FURLA R, ALMAZAN C,
KOCAN KM. Serologic and molecular characterization of Anaplasma species infection
in farm animals and ticks from Sicily. Vet Parasitol, v. 133, n. 4, p.357-62, 2005 (a).
De LA FUENTE J; LEW A; LUTZ H; MELI ML; HOFMANN-LEHMANN R; SHKAP V;
MOLAD T; MANGOLD AJ; ALMAZAN C; NARANJO V; GORTAZAR C; TORINA A;
CARACAPPA S; GARCIA-PEREZ AL; BARRAL M; OPORTO B; CECI L; CARELLI G;
BLOUIN EF; KOCAN, KM. Genetic diversity of anaplasma species major surface
proteins and implications for anaplasmosis serodiagnosis and vaccine development.
Anim Health Res Rev. v.6, n.1, p.75-89, 2005 (b).
DE LA FUENTE, J., J. C. GARCIA-GARCIA, E. F. BLOUIN, AND K. M. KOCAN.
Differential adhesion of major surface proteins 1a and 1b of the ehrlichial cattle
!"
107
pathogen Anaplasma marginale to bovine erythrocytes and tick cells. Int. J. Parasitol.
v.31, p.145-153, 2001.
DOWSETT, K.F; DIMMOCK, C.K; HILL, M.W. Haemolytic disease in new born calves.
Aust Vet J.v.54, n.2, p.65-7, 1978
EGELI, A.K. Babesiosis in a six-day-old calf. Vet Rec. v.139, n.14, p.344-5, 1996.
ERIKS IS, STILLER D, PALMER GH. Impact of persistent Anaplasma marginale
rickettsemia on tick infection and transmission. J Clin Microbiol. v.31, n.8, p.2091-6,
1993.
FAO. Ticks and tick-borne diseases control. A practical field manual. v.II, Rome, p. 301-
621, 1984.
FIGHERA, R.A. Anemias hemolíticas infecciosas. IN: FIGHERA, R.A. Anemia em
Medicina Veterinária. O autor, p.65-70, 2001.
FIGUEROA, J.V; ALVAREZ, J.A, CANTO, G.J, RAMOS, J.A, MOSQUEDA, J.J,
BUENING, G.M. Comparative sensitivity of two tests for the diagnosis of multiple
hemoparasite infection of cattle. Ann. N. Y. Acad. Science, v.23, n.791, p.117-27, 1996.
FIGUEROA JV, BUENING GM. Nucleic acid probes as a diagnostic method for tick-
borne hemoparasites of veterinary importance. Vet Parasitol. v.57, n.1-3, p.75-92, 1995.
FIGUEROA, J.V; CHIEVES, L.P; JHONSON, G.S; BUENNING, G.M. Multiplex
polymerase chain reaction based assay for the detection of Babesia bigemina, B. bovis
and Anaplasma marginale DNA in bovine blood. Vet. Parasitol., v.50, p.69-81, 1993.
FIGUEROA, J.V; CHIEVES, L.P; JOHNSON, G.S; BUENING, G.M. Detection of
Babesia bigemina-ifected carriers by polymerase chain reaction amplification. J. Clin.
Microb. v.30, n.10, p. 2576-82, 1992.
!"
108
FONSECA, A.H; PEREIRA, M.J.S; MAFRA, C.L. Dinâmica populacional do carrapato
Boophilus microplus em São Miguel do Anta- MG, Brasil. Rev. Bras. Parasitol. Vet., v.6,
n.2, supl.1, p.121, 1997.
FONSECA, A., BRAGA, A. Noções sobre a tristeza parasitária dos bovinos. Rio de
Janeiro: Ministério da Agricultura, 1924, 216p.
FRIEDHOFF, K.T. Transmission of Babesia. IN: RISTIC, M Babesiosis of domestical
animals and man. Florida, p.23-52, 1988.
FUTSE JE, UETI MW, KNOWLES DP JR, PALMER GH. Transmission of Anaplasma
marginale by Boophilus microplus: retention of vector competence in the absence of
vector-pathogen interaction. J. Clin. Microbiol. v.41, n.8, p.3829-34, 2003.
GALE KR, DIMMOCK CM, GARTSIDE M, LEATCH G. Anaplasma marginale: detection
of carrier cattle by PCR-ELISA. Int. J. Parasitol. v.26, n.10, p.1103-9, 1996.
GOFF, W.L; WAGNER, G.G; CRAIG, T.M; LONG, R.F; The bovine immune response to
tick-derived Babesia bovis infection: Serologic studies of isolated immunoglobulins. Vet.
parasitol. v.11, p. 109-20, 1982.
GOMES, A. O Boophilus microplus. In: KESSLER, R.H. & SCHENK, M.A.M.
Carrapato, Tristeza Parasitária e Tripanossomose dos Bovinos. EMBRAPA. Centro
Nacional de Pesquisa Gado de Corte. p.10-46, 1998.
GOMES, A.; HONER, M.R; SCHENCK, M.A; CURVO, J.B.E; Populations of the cattle
tick (Boophilus microplus) on purebred Nellore, Ibagé and Nellore x European
crossbreds in Brazilian savanna. Trop. Ani. Health Prod. v.21, p. 20-24, 1989.
!"
109
GONÇAVES-RUIZ, P.M; PASSOS, L.M; PATARROYO, J.H; RIBEIRO, M.F. Antigenic
characterization of morphologically distinct Anaplasma marginale isolates using a panel
of monoclonal antibodies. Vet Parasitol. v.29, n.107, p.169-77, 2002.
GRISI, L; MASSARD, C.L; MOYA-BORBA, G.E; PEREIRA, J.B. Impacto econômico
das principais ectoparasitoses em bovinos no Brasil. Hora Vet. v.125, p.8-10, 2002.
GU W, KILLEEN GF, MBOGO CM, REGENS JL, GITHURE JI, BEIER JC. An
individual-based model of Plasmodium falciparum malaria transmission on the coast of
Kenya. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.. v.97, n.1, p.43-50, 2003.
GUGLIELMONE, A.A; GAIDO, A.B; AGUIRRE, D.H; CAFRUNE, M.M. Some
quantitative aspects of natural babesial infection in the haemolinph of Boophilus
microplus engorged Female ticks. Parasite. V.4, p.337-41, 1997.
GUGLIELMONE, A.A; GAIDO, A.B; MANGOLD, A.J. Light microscopy diagnosis of
Babesia bovis and Babesia bigemina kinetes in the haemolinph of artificially infected
Boophilus microplus engorged females ticks. Vet. Parasitol. v.61, p. 15-20, 1996.
GUGLIELMONE, A.A. Epidemiology of babesiosis and anaplasmosis in South and
Central America, Vet. Parasitol. v.57, p. 109-19, 1995.
GUGLIELMONE, A.A. The level of infestation with the vector of cattle babesiosis in
Argentina. Mem Inst Oswaldo Cruz. v.87,n. 3, p.133-7, 1992.
HART, L.T; MORRIS, N.G; BESSIN, R; LEPRINCE D.J; TODD, W.J; ENRIGHT, F.M;
LUTHER, D.G. Single step technique for staining Anaplasma marginale in bovine blood
smears. Am. Journal Vet. Res., v.53, n.10, p.1732-3, 1992.
HAY, S.I. The paradox of endemic stability. Trends in Parasit., v. 17, n. 7, p. 310, 2001.
!"
110
HAYDEN, J.D; HO, S.A; HAWKEY, P.M; TAYLOR, G.R; QUIRKE, P. The promises and
pitfalls of PCR. Vet. Med. Microbiol., v.2, p.129-37, 1991.
JACKSON L.A., WALDORN, S.j., WEIER H.M., NICOL, C.L., COOKE, B.M. Babesia
bovis: Culture of laboratory adapted parasite lines and clinical isolates in a chemically
defined medium. Exp. Parasitol., v.99, p.168-174, 2001.
JONSSON, N.N. The productivity effects of cattle tick (Boophilus microplus) infestation
on cattle, with particular reference to Bos indicus cattle and their crosses. Vet.
Parasitol., v.137, p.1-10, 2006.
JONSSON, N,N; MATSCHOSS, A.L; PEPPER, P.; GREEN, P.E; ANSELL, J.
Resistance of Holstein-Friesian cows to infestation by the cattle tick (Boophilus
microplus).Vet Parasitol., v.17,n.89, p.297-305, ‘’’2000.
KESSLER, R.H. Considerações sobre a transmissão de Anaplasma marginale. Pesq.
Vet. Bras., v.21, n.4, p.177-9, 2001.
KESSLER, R.H. & SCHENK, M.A.M. Tristeza parasitária dos bovinos: conceito,
Etiologia, Transmissão, Epidemiologia, Diagnóstico e Controle. In: Carrapato, Tristeza
Parasitária e Tripanossomose dos Bovinos. EMBRAPA Gado de Corte. p.47-68, 1998
a
.
KESSLER, R.H. & SCHENK, M.A.M. Diagnóstico parasitológico da tristeza parasitária
bovina. In: Carrapato, Tristeza Parasitária e Tripanossomose dos Bovinos. EMBRAPA
Gado de Corte. p.81-90, 1998
b
.
KIESER, S.T; ERIKS, I.S; PALMER, G.H. Cyclic rickettsemia during persistent
Anaplasma marginale infection of cattle. Infect Immun. v.58, n.4, p.1117-9, 1990.
KOCAN KM, YOSHIOKA J, SONENSHINE DE, DE LA FUENTE J, CERAUL SM,
BLOUIN EF, ALMAZAN C. Capillary tube feeding system for studying tick-pathogen
!"
111
interactions of Dermacentor variabilis (Acari: Ixodidae) and Anaplasma marginale
(Rickettsiales: Anaplasmataceae). J Med Entomol. v.42, n.5, p.864-74, 2005.
KOCAN, K.M; de la FUENTE, J; BLOUIN, E.F; GARCIA-GARCIA, J.C. Anaplasma
marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae): recent advances in defining host-pathogen
adaptaions of a tick-borne rickettsia. Parasitol., v.129, p.285-300, 2004.
KOCAN, K.M; de la FUENTE, J; GUGLIELMONE, A.A; MELÉNDEZ, R.D. Antigens and
alternatives for control of Anaplasma marginale infection in cattle. Clin. Micro. Reviews,
v.16, n.4, p.698-712, 2003.
KOCAN, K.M; DE LA FUENTE, J; BLOUIM E.F; GARCIA-GARCIA, J.C. Adaptations of
the tick-borne pathogen, Anaplasma marginale, for survival in cattle and ticks. Exp Appl
Acarol., v.28, n.1-4, p.9-25, 2002.
KOCAN K.M., STILLER D., GOFF W.L., CLAYPOOL P.L., EDWARDS W., EWING
S.A., MCGUIRE T.C., HAIR J.A. & BARRON S.J. Development of Anaplasma
marginale in male Dermacentor andersoni transferred from parasitemic to susceptible
cattle. Am. J. Vet. Res. v.53, n.4, p.499-507, 1992.
KOHAYAGAWA, A; KUCHEMBUCK, M.R.G; PAPA, F.O; OLIVEIRA, M.R; ALMEIRDA,
C.T; CURI, P.R. Alterações do leucograma de bovinos da raça Fleckvieh (Bos taurus)
premunidos contra Babesia spp. e Anaplasma spp. Vet. Zootec., v.2, p. 47-57, 1990
MACHADO, R. Z. Estudo da Imunidade Celular e Humoral na Babesiose Bovina.
Jaboticabal, 150 p., 1991. Dissertação (Livre docência) Faculdade de Ciências Agrárias
e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal.
MACKENSTEDT U, GAUER M, FUCHS P, ZAPF F, SCHEIN E, MEHLHORN H. DNA
measurements reveal differences in the life cycles of Babesia bigemina and B. canis,
two typical members of the genus Babesia. Parasitol Res.v.81, n.7, p. 595-604,1995.
!"
112
MADRUGA, C. R., MARQUES, A. P. C., ARAÚJO, F. R; UMAKI,A.C.S.; CROCCI, A.J.;
QUEIROZ, R.A.. Avaliação de um ELISA para detecção de anticorpos contra Babesia
bigemina em bovinos e sua aplicação em um inquérito sorológico no Brasil. Pesq. Vet.
Bras., v.21, n.2, p.72-76, 2001.
MADRUGA, C.R., MARQUES, A.P.C.; CARVALHO, C.M.E.; CUSINATO, F.Q.;
CROCCI, A.J.; KESSLER, R.H., MIGUITA, M. Desenvolvimento de uma prova de
imunoadsorção enzimática para detecção de anticorpos contra Babesia bovis. Pesq.
Vet. Bras., vol.20, no.4, p.167-170, 2000
a
.
MADRUGA, C.R., MARQUES, A.P.C.; LEAL, C.R.B; CARVALHO, C.M.E.; ARAÚJO,
F.R; KESSLER, R.H. Evaluation of a enzyme linked immunosorbent asay to detect
antibodies agaisnt Anaplasma marginale. Pesq. Vet. Bras., v.20, n.3, p. 109-112, 2000
b
.
MADRUGA, C.R.; HORNER, M.R.; SCHENK, M.A.M. Avaliação preliminar de
parâmetros epidemiológicos da tristeza parasitária bovina no Estado de Mato Grosso
do Sul. Campo Grande, MS : Centro Nacional de Pesquisa de Gado de Corte, p.1-
7,1987.
MADRUGA, C.R., AYCARDI, E., KESSLER, R.H., SCHENK, M.A.M., FIGUEIREDO,
G.R., CURVO, J.B.E. Níveis de anticorpos anti-Babesia bigemina e Babesia bovis em
bezerros da raça Nelore, Ibagé e cruzamentos de Nelore. Pesq. Agropec. Bras., v. 19,
n.9, p.1163-8, 1984.
MAHONEY, D.H; WRIGHT, I.G; GODGER, B.V; MIRRE, G.B; SUTHERST, R.W;
UTECH, K.B. The transmission of Babesia bovis in herds of European and Zebu x
European cattle infested with the tick Boophilus microplus. Aust. Vet. J., v.57, n.10,
p.461-9, 1981
MAHONEY, D.F; WRIGHT, I.G; MIRRE, G.B; Bovine babesiosis: the persistence of
immunity to Babesia argentina and B. bigemina in calves (Bos taurus) after naturally
acquired infections. Ann. Trop. Med. Parasitol., v.67, p. 197-203, 1973.
!"
113
MAHONEY, D.F; MIRRE, G.B. The selection of larvae of Boophilus microplus infected
with Babesia bovis (syn. B. argentina). Res. Vet. Science. v. 23, p.126-7, 1977.
MAHONEY, D.F; MIRRE, G.B. Bovine babesiosis: estimation of infection rates in the
tick vector Boophilus microplus (Canestrini). Ann. Trop. Med. Parasitol., v.65, n.3,
p.309-17, 1971.
MAHONEY, D.F; ROSS, D.R. Epizootiological factors in the control of bovine
babesiosis. Aust. Vet. J., v.48, p.292-8, 1972.
McCOSKER, P.J. The global importance of babesiosis. In:, RISTIC, M., KRIER, J.P.
(Eds). Babesiosis. New York: Academic Press, p.1-19, 1981.
McGUIRE TC, DAVIS WC, BRASSFIELD AL, McELWAIN TF, PALMER GH.
Identification of Anaplasma marginale long-term carrier cattle by detection of serum
antibody to isolated MSP-3. J. Clin. Microbiol. v.29, n.4, p.788-93, 1991.
MELHORN, H. & SCHEIN, E. The piroplasms: life cycle and sexual stages. Adv.
Parasitol., v.23, p.37-99, 1984.
MELO, V.S.P; PASSOS, L.M.F; FACURY-FILHO, E.J; SATURNINO, H.M; RIBEIRO,
M.F. Natural infection of calves by Anaplasma marginale in dairy herds of the
Metalúrgica Region, Minas Gerais. Pesq. Vet. Bras., v.21, n.4, p.146-50, 2001.
MENDONÇA, C.L; VIEIRA, D; KOHAYAGAWA, A; SCHENK, M.A; MADRUGA, C.R;
AFONSO, J.A. Avaliação hematológica em bezerros Nelore infectados
experimentalmente com isolados de Babesia bigemina das regiões Sudeste, Nordeste
e Norte do Brasil. Rev. Bras. Parasitol. Vet., v.11, n.2, p.99-101, 2002.
MOSQUEDA, J; FALCON A, ALVAREZ, J.A; RAMOS J; OROPEZA-HERNANDEZ L.F;
FIGUEROA J.V. Babesia bigemina sexual stages are induced in vitro and are
!"
114
specifically recognized by antibodies in the midgut of infected Boophilus microplus ticks.
Int J Parasitol., v.34, n.11, p.1229-36, 2004.
MOURA, A.; VIDOTTO, O; YAMAMURA, M.H; VIDOTTO, M.C; PEREIRA, A.B.da L.
Studies on the Anaplasma marginale THEILER, 1910 infection in Boophilus microplus
(CANESTRINI, 1887), using ‘nested” PCR. Rev. Bras. Parasitol. Vet., v.12, n.1, p.27-
32, 2003.
MULLIS, K. FALOONA, F. Specifc synthesis of DNA in vitro via polymerase catalysed
chain reaction. Methods Enzymol. v.55, p. 335-50, 1987.
MURASE, T; UEDA,T; YAMAMOTO, O; TAJIMA, M; MAEDE, Y. Oxidative damage and
enhanced erythrophagocitosis in canine erithrocytes infected by Babesia gibsoni. J. Vet.
Med. Sci., v.58, p. 259-61, 1996.
NORTON, J.H; PARKER, R.J; FORBES-FAULKNER, J.C. Neonatal anaplasmosis in a
calf. Vet. Rec. v.100, n.3, p.58, 1983.
OLIVEIRA, M.C.S; OLIVEIRA-SEQUEIRA, T.C.G; ARAÚJO Jr., J.P; AMARANTE,
A.F.T; OLIVEIRA, H.N. Babesia spp. infection in Boophilus microplus engorged females
and eggs in São Paulo State, Brazil. Vet. Parasitol. v.130, p.61-7, 2005.
OLIVEIRA JB, MADRUGA CR, SCHENK MA, KESSLER RH, MIGUITA M, ARAUJO
FR. Antigenic characterization of Brazilian isolates of Anaplasma marginale. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz. v. 98, n.3, p.395-400, 2003.
OLIVEIRA, M.C.S; Avaliação da taxa de infecção por Babesia bigemina em bovinos
mestiços leiteiros e em fêmeas e ovos de Boophilus microplus provenientes de área
endêmica do Estado de São Paulo. Botucatu. 2002. 96p. Tese (Doutorado em Medicina
veterinária) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual
Paulista.
!"
115
OLIVEIRA-SEQUEIRA, T.C.G., OLIVEIRA, M.C.S., ARAÚJO Jr., J.P., AMARANTE,
A.F.T., PCR-based detection of Babesia bovis and Babesia bigemina in their natural
host Boophilus microplus and cattle. Int. J. Parasitol., v.35, p.105-111, 2005.
OSAKI, S.C., VIDOTTO, O., MARANA, E.R.M., VIDOTTO, M.C., YOSHIHARA, E.,
PACHECO, R.C., IGARASHI, M., MINHO, A.P. Ocorrência de anticorpos anti Babesia
bovis e estudo sobre a infecção natural em bovinos da raça Nelore, na região de
Umuarama, Paraná, Brasil. Rev. Bras. Parasitol. Vet., v.11, n.2, p.77-83, 2002.
OTIM, C; WILSON, A.J; CAMPBELL, R.S. A comparative study of experimental
anaplasmosis in Bos indicus and Bos taurus cattle. Aust Vet J., v. 56, n.6, p.262-6,
1980.
PAINE GD, MILLER AS. Anaplasmosis in a newborn calf. Vet Rec. v.15 n.3. p.58, 1977.
PALMER GH, BROWN WC, RURANGIRWA FR. Antigenic variation in the persistence
and transmission of the ehrlichia Anaplasma marginale. Micro. Infect., v.2, n.2, p.167-
76, 2000.
PANDEY, N.N., MISHRA, S.S. Studies on clinical sympthons and percentage
parasitaemia on experimental Babesia bigemina infection in cow calves. Indian. Vet. J.,
v.55, p.139-143, 1978.
PARKER, R.J; SHEPHERD, R.K; TRUEMAN, K.F; JONES, G.W; KENT, A.S;
POLKINGHORNE, I.G. Susceptibility of Bos indicus and Bos taurus to Anaplasma
marginale and Babesia bigemina infections. Vet Parasitol., v.17, n.3, p.205-13, 1985.
PASSOS, L.M; LIMA, J.D. Diagnóstico de anaplasmose bovina congênita em Minas
Gerais. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. v.36, p.743-44, 1984.
!"
116
POTGIETER, F.T; VAN RENSBURG, L. The persistente of colostral Anaplasma
marginale antibodies and incidente of in utero transmisión of Anaplasma infections in
calves under laboratory conditions. Ond. J. Vet. Res., v.54, n.4, p.557-60, 1987.
POTGIETER FT, SUTHERLAND B, BIGGS HC. Attempts to transmit Anaplasma
marginale with Hippobosca rufipes and Stomoxys calcitrans. Onderstepoort J Vet Res.
v.48, n.2, p.119-122, 1981.
POTGIETER, F.T & ELS, H.J. Light electron microscopic observations on the
development of small merozoítas of Babesia bovis in Boophilus microplus larvae. Ond.
J. Vet. Res., v.43, n.3, p.123-8, 1976.
QUINTÃO-SILVA, M.G; RIBEIRO, M.F.B; Infection rate of Babesia spp. sporokinetes in
engorged Boophilus microplus from an area of enzootic stability in the State of Minas
Gerais, Brazil. Mem. Inst. Osw. Cruz., v.98, n.8, p.999-1002, 2003.
RADOSTITS, O.M., GAY,C.C., BLOOD.D.C.,, HINCHCLIFF, K.W. Veterinary Medicine.
9
th
ed. W.B. Saunders, London, 1877p., 2000.
REITER, R. & WEILAND, E. Recently developed methods for the detection of babesial
infections.Trans R Soc Trop Med Hyg., v.83, p.21-3. 1989.
REYNA-BELLO A, CLOECKAERT A, VIZCAINO N, GONZATTI MI, ASO PM, DUBRAY
G, ZYGMUNT MS. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay using
recombinant major surface protein 5 for serological diagnosis of bovine anaplasmosis in
Venezuela. Clin Diagn Lab Immunol. v.5, n.2, p.259-62, 1998.
RIBEIRO MF, PASSOS LM, GUIMARAES AM. Ultrastructure of Anaplasma marginale
with an inclusion appendage, isolated in Minas Gerais State, Brazil. Vet Parasitol. v.1,
n.4, p.271-7, 1997.
!"
117
RIBEIRO, M.F.B; LIMA, J.D. Morphology and development of Anaplasma marginale in
midgut of engorged female ticks of Boophilus microplus. Vet. Parasitol. v.61, n.1-2,
p.31-9, 1996.
RIBEIRO, M.F.B; LIMA, J.D; PATARROYO, J.H.S. Attemped transmision of Anaplasma
marginale by infected Boophilus microplus. Braz. J. Vet. Ani. Sci. v.48, p. 397-402,
1996.
RIBEIRO, M. F. B. ; LIMA, J. D. ; GUIMARAES, A. M. ; SCATAMBURLO, M. A. ;
MARTINS, N. E. . Transmissão congênita da anaplasmose bovina. Arq. Bras. de Med.
Vet. e Zootec., v. 47, n. 3, p. 297-304, 1995.
RIEK, R.F. The cycle of Babesia argentina (Lignières, 1903) (Sporozoa : Piroplasmidea)
in the tick vector Boophilus microplus (Canestrini). Aust. J. Agric. Res., v.17, p.247-54,
1966.
RIEK, R.F. The cycle of Babesia bigemina (Smith & kilborne , 1893) in the tick vector
Boophilus microplus (Canestrini). Aust. J. Agric. Res., v.15, p.802-21, 1964.
RISTIC M, CARSON CA. Methods of immunoprophylaxis against bovine anaplasmosis
with emphasis on use of the attenuated Anaplasma marginale vaccine. Adv. Exp. Med.
Biol.v.93, p.151-88, 1977.
RODRIGUES, A., RECH, R.R., BARROS, R.R., FIGHERA, R.A., BARROS, C.S.L.
Babesiose cerebral em bovinos: 20 casos. Ciên. Rur., Santa Maria, v.35 ,n.1, p.121-
125, 2005.
SANTOS, T.R.B; GONZALES, J.C; CHIES, J.M; FARIAS, N.A.R. Transmissão
transovariana de Babesia bigemina (Smith & Kilborne, 1893) por partenóginas de
Boophilus microplus (Canestrini, 1887). Rev. Bras. Parasitol. Vet. v.7, n.1, p.7-10, 1998.
!"
118
SARTOR, I.F.; FACCINI, J.L.H.; KUCHEMBUCK, M.R.G.; CURI, P.R. Estudo
comparativo da resistência ao carrapato Boophilus microplus (CANESTRINI) (ACARI)
Em bovinos das raças Gir, Holandesa e mestiços ½ Gir-Holandês. Rev. Vet. e Zoot.
UNESP, São Paulo, 4,p.25-33, 1992.
SCOLES, G.A; BROCE, A.B; LYSYK, T.J; PALMER, G.H. Relative efficiency of
biological transmission of Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) by
Dermacentor andersoni (Acari: Ixodidae) compared with mechanical transmission by
Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae). J Med Entomol., v.42, n.4, p.668-75, 2005.
SHIMADA MK, YAMAMURA MH, KAWASAKI PM, TAMEKUNI K, IGARASHI M,
VIDOTTO O, VIDOTTO MC. Detection of Anaplasma marginale DNA in larvae of
Boophilus microplus ticks by polymerase chain reaction. Ann N Y Acad Sci. v. 1026,
p.95-102, 2004.
SMITH RD, MOLINAR E, LARIOS F, MONROY J, TRIGO F, RISTIC M. Bovine
babesiosis: pathogenicity and heterologous species immunity of tick-borne Babesia
bovis and B bigemina infections. Am. J. Vet. Res. v.41, n.12, p.1957-65, 1980.
SOARES, C.O; Princípios, padronização e validações de provas sorológicas. IN:
MADRUGA, C.R; ARAÚJO, F.R; SOARES, C.O; Imunodiagnóstico em medicina
veterinária. EMBRAPA GADO DE CORTE, Campo Grande. 145-76, 2001.
SOARES, C.O; SOUZA, J.C; MADRUGA, C.R; MADUREIRA, R. C; MASSARD, C.L;
FONSECA, A.H. Soroprevalência de Babesia bovis em bovinos na mesorregião Norte
Fluminense. Pesq. Vet. Bras., v.20, n.1, p.26-30, 2000.
SOLORIO-RIVERA, J.L; RODRIGUEZ-VIVAS, R.I; PEREZ-GUTIERREZ, E; WAGNER,
G. Management factors associated with Babesia bovis seroprevalence in cattle from
eastern Yucatan, Mexico. Prev Vet Med., v.11, n.3-4, p.261-9, 1999.
!"
119
SOUZA, J. C. P.; SOARES, C. O.; SCOFIELD, A.; MADRUGA
,
C. R., CUNHA
,
N. C.;
MASSARD C. L.; FONSECA,
A. H. Soroprevalência de Babesia bigemina em bovinos
na mesorregião Norte Fluminense. Pesq. Vet. Bras., v.20, n.2, p.75-9, 2000.
SPARAGANO, O.A.E; ALLSOPP, M.T.E.P; MANK, R.A; RIJPKEMA, S.G.T;
FIGUEROA, J.V; JONGEJAN, F. Molecular detection of pathogen DNA in ticks (Acari:
Ixodidae): A Review. Exper. Appl. Acarol., v.23, p. 929-60, 1999.
STILLER, D; COAN, D.J. Recent developments in elucidating tick vector relationships
for anaplasmosis and equine piroplasmosis. Vet. Parasitol., v. 57, n.1-3, , p. 97-108,
1995.
TEGLAS M, MATERN E, LEIN S, FOLEY P, MAHAN SM, FOLEY J. Ticks and tick-
borne disease in Guatemalan cattle and horses. Vet Parasitol. v.15 n.131, p.119-27,
2005.
TIZARD, I.R. Imunologia Veterinária: Uma Introdução. 6ª Ed. ROCA. São Paulo, 2002.
548p.
TRUEBLOOD, E.S., MCGUIRE, T.C., PALMER, G.H. Detection of Anaplasma
marginale rickettsemia prior to onset of clinical signs by using an antigen capture
enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. v.29, n.7, p.1542-4, 2001.
UILENBERG, G. Babesia- A historical overview. Vet. Parasitol., v. 138, n.1-2, p. 3-10,
2006.
UILENBERG, G. International collaborative research: significance of tick-borne
hemoparasitic diseases to world animal health. Vet. Parasitol., v. 57, n.1-3 p.19-41,
1995.
!"
120
UTECH, K.B.W; SEIFERT, G.W; WHARTON, R.H. Breeding australian illawarra
shorthorn cattle for resistance to Boophilus microplus. I. Factors affecting resistance.
Aust. J. Agric. Res., v.29, p.411-22, 1978.
VIDOTTO, O. & MARANA, E.R.M. Diagnóstico em anaplasmose bovina. Ciên. Rur.,
v.31, n.2, p.361-8, 2001.
VIDOTTO O, MCELWAIN TF, MACHADO RZ, PERRYMAN LE, SUAREZ CE, PALMER
GH. Babesia bigemina: identification of B cell epitopes associated with parasitized
erythrocytes. Exp Parasitol. v. 81, n.4, p.491-500, 1995.
VIEIRA, M.I.B; LEITE, R.C; MARTINS, J.R; SACCO, A.M.S; SILVA, J.G.C. Resposta
imune humoral contra Anaplasma marginale (Theiler, 1910) em bovinos submetidos a
distintas estratégias de controle do carrapato Boophilus microplus (Canestrini, 1887).
Rev. Bras. Parasitol. Vet., v.11, n.2, p.71-6, 2002.
WAGNER, G; CRUZ, D; HOLMAN, P; WAGHELA, S. PERRONE, J; SHOMPOLE, S;
RURANGIRWA, R. Non immunologic methods of diagnosis of babesiosis. Mem. Inst.
Osw. Cruz, v.87, supl.III, p.193-9, 1992.
WAMBURA, P. N; GWAKISA, P. S; SILAYO, R. S; RUGAIMUKAMU, E. A. Breed-
associated resistance to tick infestation in Bos indicus and their crosses with Bos
taurus. Vet. Parasitol., v.77, p.63-70, 1998.
YERUHAM, I; AVIDAR, Y; AROCH, I; HADANI, A; Intra-uterine Infection with Babesia
bovis in a 2-day-old Calf. J. Vet. Med. Infect. Dis. Vet. Public. Health., v.50, n.2, p.60-2,
2003.
YOUNG, A.S; Epidemiology of babesiosis. In: RISTIC, M. Babesiosis of domestic
animals and man. Boca Raton: CRC Press, p.81-98, 1988.
!"
121
ZAUGG, J.L. Bovine anaplasmosis: Transplacental transmission as it relates to stage of
gestation. Am. J. Vet. Res., v. 46, p. 570-572, 1985.
ZINTL A, GRAY JS, SKERRETT HE, MULCAHY G. Possible mechanisms underlying
age-related resistance to bovine babesiosis. Parasite Immunol. v.27, n.4, p.115-20,
2005.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
