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DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS p53 E pRb
EM CACARCINOMA ESCAMOCELULAR E PAPILOMAS
ORAIS PELO MÉTODO IMUNO-HISTOQUÍMICO
LEILA BRITO DE QUEIROZ
Salvador
2006
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
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2
LEILA BRITO DE QUEIROZ
AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS p53
e pRb EM CARCINOMA ESCAMOCELULAR E PAPILOMA
ORAIS
Dissertação apresentada no programa
de Pós-graduação em Imunologia o
Instituto de Ciências as Saúde (ICS),
Universidade Federal da Bahia
(UFBA), como requisito parcial para
obtenção do grau de mestre em
Imunologia: Área de Concentração:
Imunologia da Infecções virais.
Orientador (a): Prof
a
. Dr
a
. Silvia Sardi
Co-orientadores: Prof
a
. Dr
a
Conceição
M. P. Queiroz e Gúbio Soares Campos
Salvador
2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
LEILA BRITO DE QUEIROZ
AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS p53
e pRb EM CARCINOMA ESCAMOCELULAR E PAPILOMA
ORAIS
Dissertação para obtenção do grau de mestre em Imunologia
Salvador, de de 2006
Banca Examinadora
Silvia Inês Sardi ___________________________________________
Doutorado em Virologia – Universidade de Buenos Aires. Argentina
Moyses Sadigursky_____________________________________________
Pós-Doutorado - Cornell University. Estados Unidos
Silvia Regina de Almeida Reis ____________________________________
Doutorado – Universidade Livre de Berlim. Alemanha
4
“E aprendi que se depende sempre de muita
diferente gente, toda pessoa sempre é as marcas
das lições diárias de outras tantas pessoas...”.
Gonzaguinha
5
AGRADECIMENTOS
Chegou o momento de expressar os sinceros agradecimentos a todos aqueles
que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
A Deus
Por mais uma etapa finalizada. Por cada aprendizado, pela maturidade adquirida
durante esse processo, pelas novas descobertas, pelo desejo de explorar novos
horizontes e pela felicidade que sinto hoje por ter a certeza de ter escolhido o
caminho certo!
À Prof
a
Silvia Sardi a ao Prof. Gúbio Soares Campos
Agradeço pela confiança em me acolher no Laboratório de Virologia e tornar
possível a realização deste sonho. Agradeço pelo meu despertar para a área de
pesquisa, que hoje muito me fascina. Obrigada pela orientação e pelos
conhecimentos adquiridos.
À Prof
a
Conceição Queiroz
Pelo enorme esforço na realização desta dissertação, pelo aprendizado e
incentivo.
Aos meus pais, irmãos e familiares
Pelo suporte a mais uma conquista na minha vida. Vocês são minha referência,
meu porto seguro. Obrigado pela paciência e estímulo. Amo vocês!!!
À Prof
a
Mônica Beltrame
A grande responsável pelo meu ingresso na vida acadêmica. Agradeça a você por
acreditar no meu potencial, por me incentivar, por ser meu exemplo!
Ao meu namorado Ricardo Ribeiro
Que trouxe luz e brilho a minha vida, um amor especial! Agradeço a Deus por
você ter estado ao meu lado durante este processo! Pelo cuidado, pelo carinho,
pela atenção e pelas referências digitadas.
À minha amiga e colega Mônica Franca Ribeiro
Obrigada pelo exemplo, confiança, pelas noites em claro, por sempre poder contar
com você durante os momentos mais difíceis. Por ser minha referência
profissional. Te adoro!
6
Aos meus amigos,
Meu muito obrigado pela compreensão quanto ao afastamento e ausência em
momentos especiais
Ao Laboratório Silvany Studart e ao Prof. Eduardo Studart
Por colaborar com o desenvolvimento desta dissertação, cedendo as amostras,
além da enorme contribuição na leitura das lâminas de imuno-histoquímica.
As Prof
as
. Eneida Barros e
Lucila Machado
Pela compreensão e apoio neste momento difícil, por compreenderem meus
momentos de ausência.
Aos amigos e colegas desta etapa
Adriano Monteiro, Maria Clara Diniz, Andréa Padre, Márcia Cristina, Cyntia Cajado
por dividirem comigo momentos nesta rica caminhada.
À Tatiana Cheto
Pela paciência e disponibilidade em transmitir conhecimentos a cerca da técnica
de Imuno-histoquímica. Uma contribuição sem tamanho para a realização deste
trabalho.
Ao Prof. Roberto Meyer
Por sempre estar acessível e disposto a ajudar.
Aos colegas de Laboratório
Camila Brandão, Juliana Torres, Michael Freitas, Andréa Padre.
Ás colegas e Prof
as
. Dellane Tigre e Karina Serravalle
Pela enorme contribuição durante a realização do PCR
As Prof
as
. Tarsila Freitas e Gabriela Botelho, ao Prof. Marcelo Filadelfo e aos
colegas de trabalho
Pelos artigos e materiais e por sempre oferecerem ajuda durante o
desenvolvimento da dissertação.
7
Ao Prof. Manoel Tachard
Pelo carinho, pelo apoio, por me receber de braços abertos na equipe de
Microbiologia da FBDC.
À colega e Prof
a
. Soraya Trindade e à Prof
a
Lilia F. M. Costa
Pelo apoio e receptividade em um momento muito difícil
À Sra Dilcéa Oliveira, secretária do PPGIM
Pelo apoio e paciência, palavras de incentivo e pela dedicação.
Ao Prof. Márcio Campos
O grande incentivador na elaboração da dissertação.
Ao Prof. Rogério Santos e Sr. José Bouzas Araújo Filho
Pela análise estatística.
Aos Professores do PPGIM
Pelos conhecimentos adquiridos
À Prof
a
Susie Vieira
Pelo esclarecimento de algumas dúvidas e pela ajuda prestada nesta fase final.
8
SUMÁRIO
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................17
2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................................21
2.1 Marcadores moleculares do ciclo celular........................................................21
2.1.1 O ciclo celular...............................................................................................21
2.1.2 Proteínas Regulatórias do ciclo celular........................................................23
2.2 Carcinoma de Células Escamosa Oral e os processos
moleculares da Carcinogênese............................................................................28
2.3 Papiloma e lesões orais induzidas pelo HPV.................................................35
3. OBJETIVOS.....................................................................................................44
3.1 Objetivo Geral................................................................................................44
3.2 Objetivos específicos.....................................................................................44
4. MATERIAIS E MÉTODOS ..............................................................................46
4.1 Seleção das amostras...................................................................................46
4.3 Aspectos Éticos.............................................................................................46
4.3 Imuno-histoquímica para detecção da p53 e pRb.........................................47
4.3.1 Preparo das lâminas e Desparafinização...................................................47
4.3.2.Recuperação antigênica.............................................................................47
4.3.3 Bloqueio da peroxidase endógena.............................................................48
4.3.4 Detecção das proteínas p53 e pRb............................................................48
4.3.5 Revelação da reação.................................................................................49
9
4.3.6 Leitura da expressão da p53 e pRb......................................................... 49
4.4 Reação em Cadeia da Polimerase..............................................................50
4.4.1 Desparafinização dos cortes....................................................................50
4.4.2 Extração do DNA......................................................................................51
4.4.3. Amplificação do DNA viral.......................................................................52
4.4.4 Leitura do PCR.........................................................................................53
4.5 Análise Estatística.......................................................................................53
5. RESULTADO................................................................................................56
5.1 Resultado da Imuno-histoquímica..............................................................56
5.2 Resultado do PCR......................................................................................65
6. DISCUSSÃO.................................................................................................68
7. CONCLUSÃO...............................................................................................77
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................78
10
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
G1 gap 1
S Síntese
G2 gap 2
M Mitose
CDK quinase dependente de ciclina
CKI Inibidores de quinases dependentes de ciclina
D-CDK2 Complexo ciclina – quinase dependente de ciclina 2
D-CDK4 Complexo ciclina – quinase dependente de ciclina 4
D-CDK6 Complexo ciclina – quinase dependente de ciclina 6
p53 Fosfoproteína com peso molecular de 53kDa
pRb Proteína Retinoblastoma
kDa Quilodaltons
UV Ultravioleta
E2F Fator de Transcrição
PCNA Antígeno Celular de Células Proliferativas
CCEO Carcinoma Escamocelular Oral
HPV Papilomavírus Humano
LCR Região longa de controle
PCR Reação de Cadeia em Polimerase
T/A Temperatura ambiente
11
RA Recuperação antigênica
DAB Diaminobenzidina
Anti- IgG Anti Imunoglobulina isótipo G
PBS Salina Tamponada com Fosfato
rpm Rotações por minuto
µm micrômetros
V Volt
pb pares de base
Tp53 Gene codificador da proteína p53
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Perfil das amostras selecionadas
Tabela 2. Seqüência de nucleotídeos e primers
Tabela 3. Freqüência da imunoexpressão da p53 de acordo com o diagnostico
histológico.
Tabela 4. Freqüência da imunoexpressão da pRb de acordo com o diagnostico
histológico
Tabela 5. Freqüência da imunoexpressão da p53 de acordo com os escores e
com o diagnóstico histológico.
Tabela 6: Freqüência da imunoexpressão da pRb de acordo com os escores e
com o diagnóstico histológico
Tabela 7: Freqüência da imunoexpressão da p53 de acordo com o grau de
diferenciação do carcinoma
Tabela 8: Freqüência da imunoexpressão da pRb de acordo com o grau de
diferenciação do carcinoma
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: As fases do ciclo celular – Adaptação: DIAS Cancer Research, v. 65, p.
2260 – 2268, 2005.
Figura 2: O ciclo celular e o controle regulatório, – Adaptação: DIAS Cancer
Research, v. 65, p. 2260 – 2268, 2005.
Figura 3: O genoma do HPV-16 – Adaptado GUTIÉRREZ, E.I.C. ; GARZA,
C.H.L. ;
Revista Salud Publica y Nutricion, v. 2, n 2, 2001.
Figura 4: Imuno- histoquímica p53 escore 0.
Figura 5: Imuno- histoquímica p53 escore 1.
Figura 6: Imuno- histoquímica pRb escore 1
Figura 7: Imuno- histoquímica p53 escore 2
Figura 8: Imuno- histoquímica pRb escore 2.
Figura 9: Imunoexpressão da p53 de acordo com o diagnóstico histopatológico
Figura 10: Imunoexpressão da pRb de acordo com o diagnóstico histopatológico
Figura 11: Distribuição da p53 de acordo com o diagnóstico histopatológico
Figura 12: Distribuição da pRb de acordo com o diagnóstico histopatológico
Figura 13: Distribuição da expressão da p53 de acordo com o grau de
diferenciação do carcinoma.
Figura 14: Distribuição da expressão da p53 de acordo com o grau de
diferenciação do carcinoma
Figura 15: Detecção do DNA de HPV em gel de agarose a 2%
14
RESUMO
A progressão do ciclo celular é regulada por uma variedade de proteínas, como as
quinases dependentes de ciclinas, inibidores de quinases dependente de ciclinas
e proteínas supressoras de tumor, como a p53 e pRb. Alterações na expressão de
proteínas supressoras de tumor podem ser responsáveis pelo desenvolvimento de
processos neoplásicos malignos. O HPV, vírus epiteliotrópico, considerado agente
causal do câncer de colo de útero produz oncoproteínas E6 e E7 capazes de
modificar o comportamento celular das proteínas p53 e pRb, respectivamente. A
proposta deste estudo foi avaliar a expressão imuno-histoquimica das proteínas
p53 e pRb de biópsias em blocos parafinados (n=56) de carcinoma escamocelular
(n=31), papiloma orais (n=19) e tecido normal (n=6) e associar os achados à
detecção do HPV pelo método de PCR. A imunoexpressão foi avaliada de acordo
com a marcação nuclear protéica, em escores 0,1, e 2 (imunoexpressão até 10%;
entre 10% e 50% e acima de 50%, respectivamente). Nos Carcinomas, a p53
estava expressa em 61,3% dos casos, assim como para pRb. Nas 19 amostras de
papilomas, 5,3% e 26,3%% foram positivos para imunoexpressão das proteínas
p53 e pRb, respectivamente. Nos tecidos normais, em 50% houve
imunoespressão da p53 e em 16,7% da pRb. Foi estatisticamente significante a
correlação entre a detecção da proteína p53 e a natureza da neoplasia (p=0,000),
assim como para análise da proteína pRb foi estatisticamente significante a
diferença entre os ranks médios do epitélio normal e carcinoma (p=0,014) e
papilomas e carcinomas (p=0,003). De acordo com o grau de expressão, o escore
2 (superexpressão) para p53 e pRb foi associado ao desenvolvimento de
neoplasias malignas, não sendo este escore detectado nas lesões papilomatosas
ou em tecidos normais. O presente estudo não permitiu definir o associação do
HPV com a imunoexpressão das proteínas p53 e pRb em lesões malignas e
benignas na cavidade oral, em função do pequeno número de amostra com
resultados positivos.
Palavras-chave: Imuno-histoquimica, p53, pRb, HPV, PCR, Carcinoma
Escamocelular Oral
15
RESUMEN
La progresion del ciclo celular es regulada por uma variedad de proteínas, como
las kinasas dependientes de ciclinas, inhibidoras de kinasas dependiente de
ciclinas e proteínas supresoras de tumor, como la p53 y pRb. Alteraciones en la
expresion de proteínas supresoras de tumor pueden ser responsables por el
desenvolvimiento de procesos neoplásicos malignos. Papilloma virus humano
(HPV), vírus epiteliotrópico, considerado agente causal de cancer de cuello uterino
produce las oncoproteínas E6 y E7 capaces de modificar el comportamiento
celular de las proteínas p53 y pRb, respectivamente. El objetivo de este estudio
fue evaluar através de la inmunohistoquimica la expresion de las proteínas p53 y
pRb en biópsias parafinadas (n=51) de carcinoma escamocelular (n=31) y
papilomas orales (n=19) e tejido normal (n=6) y asociar los hallazgos con la
detección de HPV por el método de PCR. La inmunoexpresión fue evaluada de
acuerdo a la marcación nuclear, en “scores” 0,1, e 2 (inmunoexpresión de hasta
10%; entre 10% y 30% y arriba de 50%, respectivamente). En los carcinomas, la
p53 estaba presente en 61,3% de los casos, del mismo modo que la pRb. En las
19 amostras de papilomas, 5,3% y 26,3%% fueram positivas para
imunoexpression das proteínas p53 y pRb, respectivamente. Nos tejidos
normales, en 50% e 16,7% de las amostras tuvo imunoexpression de las p53 y
pRb, respectivamente. Fue estadísticamente significativa la correlación entre la
detección de las proteínas p53 y la naturaleza de la neoplasia (p=0,000). Del
mismo modo para análisis de la proteína pRb fue estatisticamente significativa la
la diferencia entre los ranks medianos de los tejidos normales y carcinomas
(0,014) y carcinoma e papilomas (0,003). De acuerdo con la intensidad de
expresión, el “score” 2 (superexpresión) para p53 y pRb fue asociado al
desenvolvimiento de neoplasias malignas, no siendo este índice detectado en las
lesiones papilomatosas o tejido normal. Este estudio no permitio definir una
asociación de HPV con la inmunoexpresión de las proteínas p53 y pRb en
lesiones malignas y benignas de la cavidad oral, en funçión del pequeño número
de muestras con resultados positivos.
Palabras claves: Inmunohistoquimica-HPV- etc
16
1. INTRODUÇÃO
A progressão do ciclo celular é regulada por uma variedade de proteínas,
que permitem o corretos ordenamento e ocorrência dos eventos envolvidos no
reparo, duplicação e separação cromossômica (ALBERTS et al., 2002). Dentre
essas proteínas estão as quinases dependentes de ciclinas, a p53 e a pRb, que
monitoram a integridade dos cromossomos e a execução correta das diferentes
fases do ciclo celular (CORDON-CARDO, 1995).
As quinases dependentes de ciclinas e as ciclinas formam heterodímeros e
atuam fosforilando proteínas do ciclo celular, determinando, desta forma, a parada
ou a progressão deste (ALBERTS et al, 2002). A p53 é uma proteína supressora
de tumor e age como fator de transcrição, se ligando a seqüências específicas no
DNA. A ativação da p53 induz a parada do ciclo celular frente a fatores que
danificam o material genético, permitindo o reparo do DNA antes da progressão
17
do ciclo. Em certas condições a ativação da p53 resulta na apoptose celular
(LEVINE, 1991). Apud Classon (2002); Sherr (1996); Bartek et al. 1996; Weinberg
(1995); Knudsen (1998); Chellapan et al. (1991); Kaelin et al (1992); Helin et al.
(1992); Harbour e Dean (2000); Wu et al. (2001) a pRb é também uma proteína
supressora de tumor, que na sua forma ativa está ligada ao fator de transcrição
E2F, inibindo a ação transcricional deste. A pRb atua na fase G1, controlando a
proliferação, a diferenciação e a sobrevivência da célula (GRINSTEIN, 2006).
A perda de função das proteínas regulatórias pode resultar na deficiência ou
perda do controle do ciclo celular, conduzindo a célula a um processo de
proliferação desregulada, eventualmente propiciando o desenvolvimento de uma
neoplasia de caráter maligno (LEVINE, 1991).
Segundo Sakai e Tsuchuda (1992), o gene Tp53 é frequentemente afetado
através de perda de alelos e mutações de ponto na maioria dos cânceres humano,
sendo também associado à etiologia dos carcinomas espinocelulares da cavidade
oral. Da mesma forma, a perda da função da pRb tem sido associada ao
desenvolvimento neoplasias epiteliais malignas (LOCKER, 1995, CHETTY et al.,
1997).
A proteína p53, em seu estado mutado, tem uma sobrevida maior, sendo,
desta forma, facilmente detectada pelo método de imuno-histoquímica (WONG,
1998). O método de Imuno-histoquímica também permite a detecção da
expressão da pRb em células individuais e em populações específicas de células
em secções teciduais (BENEDICT et al., 1990; GERADTS et al., 1994).
18
Apud Adams e Kaelin (1995), existem vários vírus pequenos de DNA
capazes de interferir no processo de ciclo celular, desregulando-o. As
oncoproteínas E6 e E7 produzidos pelo HPV interagem com as proteínas
supressoras de tumor p53 e pRb, respectivamente. Essas interações alteram as
funções das proteínas p53 e pRb, resultando em replicação alterada do DNA e
atividade transcricional descontrolada do E2F (Vousden, 1995 e Ke et al., 1999
apud Oliveira, Soares e Costa, 2002). O HPV é considerado agente causal
inequívoco do câncer de colo de útero, porém na cavidade oral, a relação causal
deste vírus com o desenvolvimento de neoplasias malignas ainda é controverso.
O presente estudo objetivou analisar a expressão imuno-histoquímica das
proteínas p53 e pRb em carcinomas escamocelulares e papiloma orais e associar
os achados de expressão à presença do papilomavírus humano.
19
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Marcadores moleculares do ciclo celular
2.1.1 O ciclo celular
As células se reproduzem pela duplicação de seus conteúdos e então,
dividem-se em duas. Durante o processo de produção de células-filhas
geneticamente idênticas, o material genético precisa ser fielmente replicado e
segregado em duas células. O ciclo celular compreende uma seqüência de
processos nucleares e citoplasmáticos perfeitamente coordenados, sendo a
maneira fundamental pela qual todos os seres vivos são reproduzidos (ALBERTS
et al., 2002).
O ciclo celular é composto de 4 estágios: G1, S, G2 e M. Na fase G1 (gap 1)
há um aumento de tamanho celular e a célula se prepara para a replicação do
material genético. Após essa fase, há uma primeira parada do ciclo (checkpoint
R), quando é verificada a integridade genômica. Durante este evento qualquer
anormalidade da informação genética que seja detectada, interrompe a
progressão do ciclo até que o reparo seja realizado. A replicação, propriamente
dita, ocorre na fase S (síntese) e permite que a célula duplique precisamente seus
cromossomos. Após a replicação cromossômica inicia-se a fase G2 (gap2),
durante a qual a célula se prepara para a fase M (mitose), quando a célula-mãe,
aumentada, finalmente divide-se, para produzir duas células-filhas, com igual
número de cromossomos (ALBERTS et al., 2002; KASTAN, 1997) (Figura 1).
20
Figura 1: Fases do ciclo celular. DIAS, 2005
Para que o processo de divisão ocorra, alguns eventos seqüenciados
necessitam ocorrer. O primeiro passo é a ligação de um fator de crescimento a um
receptor específico na membrana plasmática que, através de seus domínios
internos, ativa proteínas transdutoras de sinais presentes no citoplasma. A
transmissão de sinais pelas proteínas transdutoras até o núcleo ativam proteínas
regulatórias nucleares, dando início à progressão do ciclo celular. São conhecidas
aproximadamente 50 proteínas que atuam como fatores de crescimento, liberadas
por vários tipos celulares, de acordo com as necessidades do organismo. As
células que possuem o receptor específico para um determinado fator de
crescimento serão iniciadas no ciclo, enquanto as que não expressam este
21
receptor em sua superfície permanecerão inativas (ALBERTS et al, 2002; ZAHA,
FERREIRA, PASSAGLIA, 2003; COTRAN, KUVAR, ROBBINS, 2005, DIAS,
2005).
2.1.2 Proteínas Regulatórias do ciclo celular
A progressão através do ciclo celular é regulada por uma variedade de
proteínas que permitem o correto ordenamento dos eventos de reparo, duplicação
e separação cromossômica. Essas proteínas, denominadas de quinases
dependentes de ciclina (CDKs), nas formas ativas, envolvem a formação de
complexos com proteínas específicas, conhecidas como ciclinas (DIAS, 2005). O
complexo CDK/ciclina coordena os eventos do ciclo celular através da fosforilação
de proteínas, processo este que pode determinar a progressão do ciclo. A
proteína pRb, por exemplo, que no estado ativado se encontra hipofosforilada,
pode ser fosforilada pelo complexo CDK/ciclina permitido a progressão do ciclo. A
quantidade das ciclinas varia periodicamente durante o ciclo celular, sendo
sintetizadas somente em fases específicas do ciclo, de acordo com as
necessidades celulares, sendo degradadas após sua utilização. (ALBERTS, et al.,
2002, 301, BRUGAROLAS, et al., 1998, NICULESCU et al., 1998, DIAS 2005).
A regulação da formação do complexo CDK/ciclina é realizada por inibidores
de ciclinas dependentes de quinases (CKI), que através do bloqueio da atividade
das quinases, promovem a parada do ciclo celular. As CKI da família p21, como
as p21
wap1/cip1
, p27
kip1
,p57
kip2
são inespecíficas, atuando sobre diversos tipos
de complexos CDK/ciclina. Já as CKI da família INK4, como as p16
ink4a
, p18
ink4c
22
, p19
ink4d
, são específicas sobre os complexos CDK/ciclina dos tipos D-CDK4 e
D-CDK6, que atuam em G1. Outras proteínas de controle negativo do ciclo celular
são as fosfatases, que atuam na fosforilação de CDK e desfosforilação dos
complexos CDKs/ciclinas, tornando-os inativos e as proteínas do complexo
ubiquitina, que degradam as ciclinas e outras proteínas e assim, impedem a
progressão do ciclo celular (DIAS, 2005). A ação dessas proteínas repercute na
atividade de proteínas inibitórias do ciclo celular ou proteínas supressoras de
tumor, como a p53 e pRb (ALBERTS et al., 2002; DIAS, 2005; De ROBERTIS,
2001; ZAHA, FERREIRA e PASSAGLIA, 2003).
Muitas proteínas supressoras de tumor como a p53 e a pRb têm sido
estudadas. A p53, proteína intensamente avaliada, desempenha um papel
fundamental na manutenção da integridade genômica (SMITH et al, 1995; ZHANG
et al, 1993; FUNK et al, 1992)
O TP53 é um gene supressor de tumor descrito pela primeira vez em 1979 e
localiza-se no braço curto do cromossomo 17 na região 3.3 e compreende 11
exons. Codifica uma fosfoproteína nuclear nomeada por seu peso molecular de
53kDa (p53) com 393 aminoácidos, existindo na sua forma ativa como um
tetrâmero. Esta proteína tem um papel muito importante no crescimento e
proliferação das células através de ações de controle do ciclo celular (FINLAY,
HINDS e LEVINE,1989; BRENNA e SYRJÄNEN, 2003; HARRIS, 1996; WANG e
HARRIS 1997 , WHYTE, BROTON, SHILLITOE, 2002).
O TP53 é ativado em resposta a sinais de stress celular, especialmente
induzido por danos ao DNA (radiação UV, gama ou X, carcinógenos, agentes
23
alquilantes, micotoxinas, depleção de ribonucleotídeos, inibidores de
tropoisomerases), hipóxia e rompimento de adesão celular (PLUQUET e
HAINAUT, 2001). A ação da p53 promove a parada do ciclo celular na fase G1,
que pode ter duração longa ou temporária, antes da replicação do DNA (fase S),
permitindo, desta forma o reparo do DNA danificado. Alem disso, em casos nos
quais o reparo do DNA não é possível, a p53 induz a apoptose, através da
sinalização para proteínas indutoras de apoptose, como o bax, bcl-2 e c-myc,
resultando na eliminação de células com informações genéticas inapropriadas
(JUAN, SHIA e CHEN, 2000; PILLAI e NAIR, 2000; MOLL e SCHRAMM, 1998;
CADWELL e ZAMBETTI 2001; PILLAI e NAIR, 2000; LEVINE, 1997; GIACCIA,
1998; BATES e VOUSDEN, 1996).
Appella e Anderson, (2000) apud SZYMANSKA, HAINAUT, 2003, a p53 é
constitutivamente expressa em todos os tipos celulares, mas não se acumula
devido à rápida degradação por proteassomo, devido a associação com uma
ligase de ubiquitina (Mdm2). Em resposta a um estímulo, a p53 é fosforilada em
múltiplos sítios se dissociando do fator regulador Mdm2 e consequentemente,
ocorre acumulo na célula.
Após a ativação da p53 ocorre a indução da transcrição de alguns genes
inibidores de quinase dependente de ciclina, como p21
wap1/cip1
resultando na
parada do ciclo celular em G1. A importância da p21
wap1/cip1
como mediador das
funções da p53 é suportada pela observação que células deficientes em p21
wap1/cip1
apresentam defeito na parada do ciclo celular em resposta a danos no
DNA. O efeito imediato da indução da p21
wap1/cip1
é a inibição da fosforilação
24
mediada pelos complexos ciclina-CDK4 e ciclina-CDK6 e conseqüentemente da
pRb, induzindo a permanência da célula no estágio G1 (DIAS, 2005; EL DEIRY et
al., 1993; GRANA e REDDY, 1995; HUNTER e PINES, 1994; BÁLINT e
VOUSDEN, 1996; VOGELSTEIN, LANE e LEVINE, 2000)(Figura.2).
Figura 2: O ciclo celular e o processo de regulação. DIAS, 2005.
Outro gene supressor de tumor bastante estudado é a Rb, localizado no
cromossomo 13, que contem 27 exons e codifica a fosfoproteína nuclear
denominada pRb ou p105Rb. No estado ativo, a pRb se encontra hipofosforilada e
atua como repressor da progressão das células da fase G1 para a fase S do ciclo
celular. No início da fase G1 ocorre a síntese da ciclina D, que se liga as CDK4 e
CDK6, formando dois complexos. Mais tardiamente, ocorre a síntese da ciclina E,
que se liga a CDK2. Estes três complexos irão atuar na fosforilação da proteína
25
pRb (KAELIN, 1997; HERWIG e STRAUSS, 1997; ALBERTS et al, 2002; ZAHA,
FERREIRA, PASSAGLIA, 2003), Ao entrar na fase S a forma fosforilada da
proteína se torna mais abundante, o que persiste durante as fases S, G2 e M
(LUDLOW et al., 1993).
A pRb, na fase G1, encontra-se em quantidade elevada no núcleo das
células de mamíferos na forma ativa, estando ligada a uma série de proteínas
regulatórias que favorecem a progressão do ciclo, como ao fator de transcrição
E2F. Quando a célula é estimulada a se dividir, a pRb é fosforilada pelos
complexos CDKs/ciclina, torna-se inativa e libera o fator E2F. A proteína de
regulação gênica E2F é responsável pela transcrição de vários genes cujos
produtos são necessários para que a célula progrida para a fase S.
(ROSENBLATT, 2005; DIAS, 2005; CONTRAN, KUMAR e ROBBINS, 2005;
ALBERTS et al, 2002; ZAHA, FERREIRA, PASSAGLIA, 2003).
Muller et al (2001); Paramio et al (2000); Black e Azizkhan-Clifford (1999),
apud HWNAG et al., (2002), a E2F foi a primeira proteína celular identificada
ligada à pRb. Existem 6 membros da família E2F como fator de transcrição, E2F-1
a E2F-6. As proteínas E2F regulam a atividade de promotores contendo sítios de
ligação E2F e controlam diretamente a transcrição de genes envolvidos na
replicação do DNA e no controle de crescimento celular, incluindo os genes c-
myc, b-myc, cdc-2, genes codificadores das ciclinas A e E e de proteínas, como
os da DNA polimerase α, PCNA e ribonucleotideo redutase (DIAS, 2005;
ROSENBLATT, 2005; ALBERTS et al., 2002; ZAHA, FERREIRA, PASSAGLIA,
26
2003; CONTRAN, KUMAR e ROBBINS, 2005; DE GREGORI et al., 1997; HUET
et al., 1996; ZWICKER et al., 1996);
A pRb pertence a família de proteínas da qual a p107 e p130 também fazem
parte, por possuírem regiões com seqüências homólogas consideráveis. Qualquer
uma dessas proteínas está apta a se ligar a um membro da família E2F de um
modo dependente do ciclo celular e regular negativamente a transcrição mediada
por essas proteínas. A ação repressiva do E2F é sugerido em estudos nos quais
foram alterados sítios de seus promotores, como no b-myc, cdc-2 e ciclina E, que
resultou em um aumento na quiescência celular e de células na fase G1 (LI et
al.,1993; DYSON, 1998)
CKIs como a p21
wap1/cip1
, p57
kip2
e a proteína p53 exercem controle sobre a
ação da proteína pRb por bloquearem a atividade de quinase nos complexos
ciclina-CDKs, impedindo que a célula saia do estágio G1 (ALBERTS et al., 2002;
ZAHA, FERREIRA, PASSAGLIA, 2003).
2.2 Carcinoma de Células Escamosas da Cavidade Oral e os
Processos Moleculares da Carcinogênese
O Carcinoma de Células Escamosas Oral (CCEO), também denominado
Carcinoma Epidermóide ou Espinocelular representa mais de 90% de todos os
27
tumores malignos que afetam a cavidade bucal, 38% dos tumores malignos de
cabeça e pescoço, ocupando o sexto lugar entre os mais comuns em todo o
mundo (NEVILLE, 2004; PARKIN, LAARA, MUIR, 1993). Em alguns países em
desenvolvimento, o câncer oral é a forma mais comum de malignidade,
representando cerca de 40% de todos os cânceres (PISANI, PARKIN e FERLAY,
1993).
Clinicamente, o carcinoma epidermóide apresenta, nas fases iniciais, um
aspecto variado, assemelhando-se a leucoplasia, eritroplasia ou eritroleucoplasia,
sendo o lábio inferior, a borda lateral da língua e assoalho bucal os locais mais
freqüentemente acometidos (TOMMASI, 2002; NEVILLE, 2004).
Histologicamente, o carcinoma escamoso de cavidade oral tem início na
camada epitelial superficial com o aparecimento de células epiteliais malignas,
caracterizado histopatologicamente por ilhas e cordões invasivos, que se mostram
diferentes das células epiteliais normais e tem comportamento invasivo em
direção ao tecido conjuntivo subjacente (NEVILLE, 2004).
Os agentes carcinogênicos envolvidos na etiologia do câncer de boca são
principalmente o tabaco e o álcool, sendo estes incriminados como fatores
iniciantes em torno de 90% dos casos (SHAFER, 1985, FRANCESCHI et al.,
1999; MASHBERG et al., 1993; KO et al., 1995; NEVILLE, 2004; GILLISON et al.,
2000). Apud Sugerman e Shillitoe (1997), o desenvolvimento de CCEO sem
história prévia de exposição aos fatores de risco principais sugere a presença de
outros agentes indutores, como predisposição genética, dieta e fatores biológicos,
28
que podem resultar no escape dos mecanismos fisiológicos de controle da
proliferação celular (NEMES et al., 2006).
O desenvolvimento do CCEO é um evento de múltiplas etapas tanto em nível
fenotípico quanto genotípico, cuja incidência vem crescendo continuamente.
Durante este processo, há um rompimento dos padrões regulatórios normais que
regem as funções celulares básicas, como divisão, diferenciação e morte celular,
resultando em aumento do tempo de vida celular, imortalização e transformação
tumoral (CONTRAN, KUMAR e ROBBINS, 2005; DE ROBERTIS, 2001;
JEFFRIES, EELES e GOLDGAR, 1999). Esse evento se desenvolve através de
estágios sucessivos, na qual há um acúmulo de mutações genéticas através de
gerações celulares. Diferentemente de outras enfermidades, o câncer é resultante
de um processo de proliferação descontrolada de uma única linhagem celular, que
escapou do complexo sistema de controle regulatório do ciclo celular (RIVOIRE et
al., 2001; LOEB e LOEB, 2000). As proteínas envolvidas no controle do ciclo
celular são codificadas por genes específicos. Qualquer mutação nesses genes ou
alterações nas proteínas pode resultar em um descontrole do processo de
proliferação celular, culminando no desenvolvimento de uma neoplasia maligna
(LOEB e LOEB, 2000).
Duas classes de genes estão diretamente associadas ao processo de
carcinogênese: os genes supressores de tumor e os oncogenes (DE ROBERTIS,
2001). A inativação de genes supressores de tumor, através de mutações
pontuais, amplificações, rearranjos e deleções e a ativação de oncogenes por
amplificação estrutural, amplificação gênica, rearranjo cromossômico ou infecção
29
viral, são fenômenos biológicos fundamentais na transformação de uma célula
normal em uma célula neoplásica. Os oncogenes estão inativos ou são expressos
em baixas quantidades nas células normais, sendo denominados protooncogenes.
Dentre os principais oncogenes relacionados à carcinogênese oral os mais
estudados são os bcl-2, CCND, ERBB2, FGF3, HRAS e myc. (SOUSA et al.,
2004, SMITH et al., 1995; ZHANG et al., 1993, CONTRAN, KUMAR e ROBBINS,
2005).
Embora em número reduzido, os genes supressores do tumor são vistos
como os mais significativos na carcinogênese. Evidências surgiram em relação ao
papel dos genes supressores de tumor Rb e da p53 na transformação neoplásica
a partir do estudo dos vírus DNA tumorais. As proteínas transformadoras de vários
vírus DNA animais e humanos ligam-se e neutralizam as atividades inibidoras
dessas proteínas. Assim, a oncogenicidade desses vírus tumorais pode ser
parcialmente baseada na capacidade de inibir as funções das proteínas
supressores de tumor (GLEICH e SALAMONE, 2002; CONTRAN, KUMAR e
ROBBINS, 2005).
Considerado como o “guardião do genoma humano”, por ser responsável
pela manutenção da integridade genômica, o Tp53 é um dos genes de maior
importância dentre os espectros de genes envolvidos na carcinogênese humana
e, conhecimentos dos mecanismos de ação da p53 representa uma etapa
fundamental para a compreensão dos aspectos biológicos envolvidos na
progressão tumoral (SITTEL 1999; SMITH et al.,1995; ZHANG, 1993).
30
A perda da função da p53 pode ocorrer de várias maneiras: através de
associações com outras proteínas, alterações genéticas: como perdas de alelos,
degradações e mutações (OLIVIER et al., 2002; TODD, DONOFF e WONG 1997).
Mutações somáticas do gene Tp53 têm sido encontradas nas diferentes formas
dos tumores humanos em uma freqüência de 50% a 70% (MOLL e SCHRAMM,
1998; CADWELL e ZAMBETTI, 2001, RIES et al 1998; FRIEDRICH et al., 2000;
SHIMA, KOBAYASHI e SAITO, 2000; HOLLSTEIN et al., 1991) e podem ocorrer
ou através de mutações pontuais ou através de deleções que resultam em
alterações estruturais, inativando as atividades supressoras da proteína, que
culminam na redução ou perda da expressão e função protéica Quando mutada, a
p53 falha na ativação p21
wap1/cip1
, não promovendo, desta forma, a parada do ciclo
(HOLLSTEIN et al.,1991).
Segundo Hernandez-Bussard et al (1999), apud Klumb e Cavalcanti Junior,
2002 ao contrário dos outros genes supressores de tumor que são inativados por
perda alélica, o gene Tp53 distingue-se pela alta freqüência de mutações. Bertek
et al (1991), Klumb e Cavalcanti Junior, 2002, a maioria dessas mutações é do
tipo missense alterando a função normal da proteína p53. Como resultado de suas
mutações pontuais, a proteína tem sua meia-vida aumentada e se acumula em
células tumorais (BARTEK, BERTKOVA e VOJTESEK, 1991).
Células com p53 inativadas demonstram ter uma vantagem em crescimento
seletivo, pois falham na parada do ciclo celular, escapam do reparo dos danos ao
DNA e da apoptose, culminando em instabilidade genômica e acúmulo de
mutações. Alterações nos genes codificadores da p53, associada à perda de
31
função desta proteína, estão reportadas em 80% dos Carcinoma Escamocelular
Oral (PARK e KANG, 2000; LEVINE 1997; GIACCIA e KASTEN, 1998; GUILLOUF
et al., 1995; LIN et al., 1992).
Não sendo detectada na maioria dos tecidos normais, a p53 selvagem tem
uma vida média de aproximadamente 6 a 20 minutos, entretanto esse tempo pode
aumentar para 6 horas ou mais caso a proteína esteja mutada. As mutações
gênicas são freqüentemente encontradas em 4 regiões altamente conservadas da
p53, incluindo exons 5-9, tendo como conseqüência um aumento na estabilidade
protéica por interferência do seu mecanismo de degradação, manifestado através
de seus altos níveis detectados facilmente pelo método de imuno-histoquímica no
núcleo das células (FINLAY, LEVINE e MOMAND 1991; UCHIDA et al., 1995;
LOYOLA, BORRA e ARAUJO, 1995; LAZARUS et al., 1996).
A superexpressão da p53 mutada é reportada e representada em muitos
cânceres de cabeça e pescoço, incluindo o CCEO (FAN et al 2006). Estudos
detectaram que paciente com aumento de expressão da p53, ou seja, aqueles
portadores de tumores com mutação do gene p53 têm alta probabilidade de
progressão (BERNARDINI et al., 1999).
Em estudos Aguiar e Araújo (1997) apud Almeida et al., (1999) examinaram
26 amostras de carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço de
arquivos, os quais apresentavam epitélio adjacente previamente graduado para
atipia histológica. Os achados imuno-histológicos foram correlacionados com o
grau histológico, para determinar se a expressão de p53 poderia ser utilizado no
diagnóstico precoce do câncer bucal. Os autores encontraram expressão da p53
32
no epitélio adjacente à neoplasia em 96.1% das amostras. Treze das 23 amostras
eram representadas por epitélio adjacente normal e todos foram positivos para
p53, o que para os autores poderia representar cancerização de campo e
alteração genética, mostrando um risco aumentado para o desenvolvimento de
lesões múltiplas independentes, que podem se tornar malignas.
Classon e Harlow (2002), apud Grinstein et al., 2006, o gene supressor de
tumor retinoblastoma foi o primeiro gene supressor a ser identificado e codifica a
fosfoproteína pRb, que tem sido encontrada mutada ou deletada em vários tipos
de tumores malignos humanos. A proteína supressora de tumor pRb exerce
controle chave em certas funções celulares como proliferação, diferenciação e
sobrevivência (FURUKAMA et al., 1991; HOROWITZ et al., 1995)
Chellapan et al. (1991) e Kaelin et al. (1992), apud Grinstein, 2006 a
inativação ou mutação da pRb resulta em liberação e consequentemente em um
aumento funcional relevante das atividades transativacionais do E2F, o que
resulta na contínua progressão do ciclo. Este fato ocorre também quando
oncoproteínas virais se ligam ao pRb, liberando fatores indutores de proliferação
celular. Estudos indicam a que a E7 do HPV-16 (de alto risco) induz a degradação
da pRb por uma via de ubiquitina (BOYER et al., 1996).
A introdução da pRb em células tumorais induz a parada de proliferação
celular in vitro, sugerindo que a pRb age em células normais regulando o
crescimento celular e, caso a proteína esteja ausente ou as funções celulares
forem suprimidas por mutação a célula continua a divisão celular de forma
descontrolada (CONTRAN, KUMAR e ROBBINS, 2005; UZVOLGYI, CLASSON,
33
HENRIKSSON, 1991; HUANG, et al., 1988). Além do papel chave da pRb no
controle do ciclo celular, estudos recentes sugerem que a pRb também exerce
funções protetoras contra apoptose. Por exemplo, camundongos knockout de pRb
morrem durante gestação pelo excesso de indução de apoptose em certos tecidos
(LEE et al., 1992; HAAS-KOGAN et al., 1995; BERRY et al., 1996). Estudos
indicam que ausência da pRb induz a célula a apoptose e que tecidos em
diferenciação apresentam uma elevada expressão celular desta proteína,
sugerindo seu papel protetor contra apoptose durante esse processo. Estudos
recentes com ratos deficientes em pRb mostraram uma apoptose extensa e uma
ausência de diferenciação celular (HICKMAN, MORONI e HELIN, 2002)
Papadimitrakopoulou, et al (1997) apud Williams 2000, O papel da pRb no
processo carcinogênico também está relacionado com a mutação do cromossomo
9p21-22, presente em dois terços dos cânceres de cabeça e pescoço, que produz
uma p16 inativa. Mutações ou deleções neste cromossomo são encontradas em
10% a 33% dos carcinomas espinocelular de cabeça e pescoço, respectivamente.
A p16 inibe as quinases dependente de ciclina, que fosforilam a pRb.
Dentre os fatores biológicos com potencial carcinogênico, o Papiloma Vírus
Humano (HPV), tem sido objeto de estudo, pois é freqüentemente detectado nos
carcinomas de cavidade oral e de orofaringe, sendo também universalmente
aceito como agente causal do câncer de colo de útero (XAVIER, BUSSOLOTI
FILHO e LANCELLOTTI, 2005; ,zur HAUSEN, 1996).
34
2.3 Papilomas e lesões orais induzidas pelo HPV
O Papilomavírus Humano é um pequeno vírus de DNA de fita dupla circular,
não-envelopado, icosaédrico, contendo 72 capsômeros, epiteliotrópico, com cerca
de 8000 pares de bases com estrutura física e organizacional bem conhecida, da
família Papovaviridae. Os HPVs induzem lesões hiperproliferativas do epitélio
cutâneo e mucosa (zur HAUSEN, 1996; BOUDA et al., 2000; ROSENBLATT,
2005).
Devido à sua importância médica, o HPV tem sido extensivamente estudado,
estando associado a uma variedade de patologias, sendo capaz de causar lesões
em mucosas urogenitais e bucorespiratórias. A associação entre lesões malignas
e infecção pelo HPV no epitélio genital masculino e feminino já é conhecida,
sendo considerado como agente causal inequívoco do câncer de colo uterino
(XAVIER, BUSSOLOTI FILHO e LANCELLOTTI, 2005; SYRJANEN et al., 1983).
Na cavidade oral, esses vírus estão associados ao desenvolvimento de lesões
como a verruga vulgar, o papiloma, o condiloma acuminado e a hiperplasia
epitelial focal e seu interesse cresceu enormemente a partir do momento em que
foram associados a lesões malignas orais, especialmente ao carcinoma oral de
células escamosas (SHIMA et al 2000; CHANG, 1991; REGEZI e SCIUBBA,
1993).
O termo Papiloma é uma denominação genérica usada para incluir
crescimentos paplilares verrucosos benignos, formados por epitélio e pequenas
quantidades de tecido conjuntivo de sustentação. A etiologia é, na maioria dos
35
casos, desconhecida, sendo alguns de origem virótica associada ao HPV. Além
disso, pode estar associado a traumatismo crônico de baixa intensidade.
(TOMMASI, 2002; SHAFER, HINE e LEVY, 1987; REGEZI, 1993; BORAKS,
1996). Clinicamente apresenta-se com crescimento exofítico geralmente
pediculado, cuja superfície mostra projeções digitiformes ou verrucóides, que se
assemelham a couve-flor. Histologicamente, a característica essencial é a
proliferação de células espinhosas em padrão papilar, além de exibirem
coilocitose (SHAFER, HINE e LEVY, 1987; TOMMASI, 2002).
Os papilomas, apesar de serem considerados tumores benignos, e ter na
maioria dos casos um prognóstico bom, fazem parte das lesões com potencial de
malignização, principalmente nos casos de etiologia viral pelo HPV, sobretudo
quando recidivados ou quando ulcerados, independente do tamanho, volume,
localização ou idade (ZEGARELLI, 1982; LITTLE, 1988). Estudos sugerem que a
presença concomitante do HPV em lesões benignas e alteracão na p53 sejam
fatores promotores dessa transformação (BERZAL-NOWOSIELSKA, MIASKO e
CHYCZEWSKI, 2004).
Atualmente são conhecidos mais de 100 tipos de HPV, dos quais 24 foram
associados a lesões orais (HPV-1, 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 30, 31, 32, 33,
35, 45, 52, 55, 57, 59, 69, 72 e 73, 01,40,44,72,07). Quatro tipos de HPV são
particularmente importantes, os tipos 06, 11, 16 e 18. Os dois primeiros,
classificados como de baixo potencial para malignidade, estão associados a
lesões benignas da cavidade oral, como os papilomas. Já o HPV-16 e o HPV-18,
de alto potencial de malignidade, são comprovadamente carcinogênicos e estão
36
associados à produção das oncoproteínas E6 e E7 produzidas pelos mesmos
(TERAI e BURK, 2001; TERAI e TAKAGI, 2001; SNIJDERS et al.,, 1997; MILLER
et al., 1996).
O genoma do Papilomavírus é constituído por dois segmentos principais,
sendo cada um constituído por uma série de regiões ou openning reading frame
(ORFs), que codificam as proteínas virais. Este genoma pode ser dividido em três
regiões; as regiões precoces “early” (E: E1 - E7), e tardias “later” (L: L1 e L2),
responsáveis pelos processos iniciais e finais de replicação, respectivamente, e a
região LCR (região longa de controle), que compreende 10% do seu genoma (zur
HAUSEN, 1996; KIRNBAUER et al., 1993).
As regiões E são expressas logo no início da infecção, sendo responsáveis
pelos mecanismos de regulação da síntese de DNA. Essas regiões E são
expressas em células infectadas, além de células transformadas. Já as regiões L
expressas nos estágios posteriores da infecção codificam as proteínas do
capsídeo viral. As proteínas L1 e L2 são utilizadas na adesão celular entre o vírus
e as diversas células teciduais (zur HAUSEN, 1996). A LCR, ou região não
codante, varia de tamanho entre os papilomavírus, sendo esta região responsável
pelo controle da expressão genética e processos como transcrição e replicação
viral (zur HAUSEN, 1996, ROSENBLATT, 2005) (Figura 3).
O HPV é um vírus que se multiplica exclusivamente no núcleo de células
infectadas (SARRUF e DIAS, 1997; TERAI, et al 2001). A infecção pelo HPV é
iniciada quando uma partícula viral penetra em células basais e em células
indiferenciadas e em divisão do epitélio. Os receptores pelos quais os
37
papilomavirus se ligam e entram na célula ainda não foram completamente
identificados. Estudos recentes indicam que a expressão da integrina a6β1 e
a6β4, presentes na superfície de células basais seriam candidatos a receptores do
vírus do papiloma. O genoma do HPV, nas células basais e parabasais se
estabelece como epissoma, replicando-se, como acontece nas lesões benignas e
pré-invasivas em baixo padrão (De Geest et al., (1993) apud Doorbar, 2005;
ROSENBLATT et al., 2005) e apenas genes envolvidos nos processos iniciais da
infecção são transcritos, como o E5, E6 e E7. Multiplicação extensiva do DNA viral
e transcrição de todos os genes, bem como a formação do capsídeo viral (L1 e
L2) ocorre apenas nas camadas suprabasais. Partículas virais maduras estão,
portanto, ausentes nas células basais, e a replicação produtiva do DNA está
restrita às células do estrato espinhoso e granuloso (CHANG, 1991).
Figura 3: Genoma do HPV-16. GUTIERREZ e GARZA, 2001
38
As lesões causadas pelo HPV dependem do tipo do vírus, além da região da
camada epitelial em que ele permanece. Os HPV de baixo risco, geralmente
replicam-se só nas camadas inferiores do epitélio estratificado, enquanto os
ceratinócitos estão passando por divisão celular. Em contraste, os HPVs de alto
risco tem o seu genoma integrado ao DNA e se replicam nas camadas mais altas
do epitélio, quando os ceratinócitos entram completamente no processo de
diferenciação terminal. Desta forma, os tipos virais de alto risco podem estimular
as células a replicar o DNA em meios não-habituais em maiores proporções do
que os tipos de baixo risco (TOMAS, PIM, BANK,1999; ROSENBLATT et al.,
2005).
As proteínas E6 e E7 são as principais responsáveis pela transformação
celular mediada pelos HPVs de alto risco que atuam na modulação de atividades
de proteínas celulares que regulam o ciclo celular (ROSENBLATT et al., 2005;
SYRJÄNEN e SYRJÄNEN, 1999; SOUTHERN HERRINGTON, 2000). O gene L1
regula os níveis de expressão das proteínas virais E6 e E7, importantes na
tumorigênese, devido a interação e inativação das funções supressoras das
proteínas p53 e pRb (zur HAUSEN, 1996)
A propriedade de imortalização não se verifica nas infecções causadas pelo
HPV de baixo risco. Os genes E6 e E7 dos HPVs de alto risco são juntos
necessários e suficientes para imortalização de células epiteliais escamosas
primárias, enquanto que as E6 e E7 codificadas pelos HPVs de baixo risco estão
ou inativas ou fracamente ativadas na mesma amostra . Os genes E6 e E7 estão
39
invariavelmente expressos em lesões malignas cervicais HPV positivas
(FRANCIS, SCHMID e HOWLEY 2000).
O E6 é um dos principais genes expressos na infecção pelo HPV e este
possui um papel importante na imortalização celular. A atividade transformadora
da oncoproteina E6 é dependente da sua ligação com a proteína supressora de
tumor p53. A E6 liga-se, seqüestra e degrada fisiologicamente a p53 por uma via
ubiquitina-dependente. A associação de E6 com a p53 é mediada por uma
proteína celular adicional, chamada proteína associada a E6 (E6-AP). Em estudos
in vitro, esta proteína purificada se associa a p53 estimulando a ligação de E6 com
a p53 e induzindo a degradação desta última por ação dependente da primeira
(SUGERMAN e SHILLITOE, 1997; CROOK e VOUSDEN, 1994). Esse fenômeno
interfere de maneira relevante nos mecanismos de apoptose e reparo de DNA
(RAPP e CHEM, 1998).
A formação do complexo E6-p53 é fundamental para a inativação das
funções supressoras da p53. Essa parece ser uma atividade específica dos HPVs
de alto risco, pois os HPVs de baixo risco codificam E6 que não inativam a p53
pelo mesmo mecanismo (WERNESS , LEVINE e HOWLEY, 1990).
Por outro lado a E7 se liga e seqüestra a pRb, induzindo a sua degradação,
fato observado devido à redução da meia-vida desta proteína em células
expressando HPVs de alto risco. A E7 ligada a pRb, preferencialmente na forma
ativa, facilita a liberação de E2F, promovendo, desta forma, a progressão do ciclo
celular, atuando nas fases G1 e S, o que pode eventualmente propiciar o
desenvolvimento do câncer (BOYER et al., 1996).
40
A E7 também pode estar associada a outras proteínas envolvidas na
proliferação celular, como as histonas diacetilases, componentes do complexo de
transcrição AP-1 e inibidores de ciclina dependente de quinase p21
wap1/cip1
, p27
kip1
(JONES, ALANI e MUNGER, 1997; ZERFASS-THOME et al., 1996;
ROSENBLATT et al., 2005). A E7 dos HPV de baixo risco ligam-se ao pRb com
baixa afinidade enquanto aquelas dos HPV de alto risco se ligam com alta
afinidade com várias proteínas celulares do hospedeiro (LEE, RUSSO e
PAVLETICH, 1998).
A detecção direta dos genomas do HPV e seus transcritos pode ser
conseguida com procedimentos que incluem imunoperoxidase, hibridizações
Southern Blot, Nothern Blot, dot blot, captura híbrida, PCR, dentre outros (MILLER
e WHITE, 1996).
A sensibilidade e especificidade dos vários métodos de detecção do HPV
disponíveis variam amplamente. A PCR pode ser considerada a técnica
apropriada, onde pequenos segmentos de DNA são geralmente esperados, sendo
considerado um método de grande sensibilidade (YAMAGUCHI et al., 1998).
41
3.0 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
¾ Analisar a imunoexpressão das proteínas p53 e pRb em carcinomas
escamocelulares, papilomas e tecidos normais orais em associação com o
HPV.
3.2 Objetivos Específicos
¾ Determinar o grau (escores) de imunoexpressão das proteínas p53 e pRb
em carcinomas, papilomas e tecidos normais orais;
¾ Relacionar a expressão das proteínas p53 e pRb com lesões malignas e
benignas;
¾ Relacionar o grau de diferenciação das lesões de carcinomas com a
imunoexpressão das proteínas p53 e pRb;
¾ Correlacionar a imunoexpressão das proteínas p53 e pRb com a detecção
do HPV pelo método de PCR.
42
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Seleção da amostra
Foram selecionadas 56 biópsias em blocos parafinados da cavidade oral,
31 com diagnóstico confirmado de carcinomas escamocelular, 19 de papilomas e
6 amostras de tecido normal, obtidas entre julho de 2002 e julho de 2005 dos
laudos do Laboratório de anatomia patológica Silvany- Studart do Hospital
Português, para realização das técnicas de imuno-histoquÍmica e PCR. Das 31
amostras com diagnóstico de carcinoma escamocelular, 6 (10,7%) eram pouco
diferenciados, 18 (58%) eram moderadamente diferenciados e 7 (22,6%) bem
diferenciados (tabela 1). O controle positivo para p53 foi feito com tecido extraído
de neoplasia maligna de mama, enquanto para a pRb o controle positivo foi feito
com tecido extraído de amigdalas.
4.2 Aspectos Éticos
O projeto da dissertação foi analisado e aprovado pelos membros do
Comitê de Ética em Pesquisa Hospital Aristides Maltez em reunião de 25 de julho
de 2005, sendo registrado sob o n
o
. 85/05.
43
4.3 Imuno-histoquímica para detecção de p53 e pRb
4.3.1 Preparo das lâminas e desparafinização
Os blocos de parafina selecionados contendo as biópsias foram submetidos
a cortes de 5µm em micrótomo e fixados em lâminas de vidro.
Para realização da imuno-histoquímica os cortes fixados nas lâminas foram
previamente desparafinadas através de banhos com solventes apropriados.
Foram realizadas duas imersões das lâminas em Xilol absoluto por 5 minutos
cada, em recipientes diferentes, e posteriormente quatro imersões em Álcool
absoluto, por 3 minutos, seguida das imersões com álcool 70%, 50% e 30%, por 1
minuto cada, respectivamente, e por último três lavagens com água destilada
corrente para hidratação dos cortes.
4.3.2 Recuperação antigênica
A técnica de recuperação antigênica (RA), predominantemente baseada no
aquecimento dos tecidos a altas temperaturas, é utilizada como um pré-tratamento
não enzimático para a imuno-histoquímica em tecidos fixados em formol e
incluídos em parafina. A fixação em formol promove, no tecido, ligações múltiplas
entre os grupos aminos e a formação de pontes de metileno entre os vários
aminoácidos presentes nos peptídeos de uma determinada proteína e desta com
a proteína adjacente. Estas múltiplas ligações bloqueiam o acesso dos anticorpos
aos epítopos alvo, mascarando os antígenos. Esta técnica expõe os epitopos,
44
antes mascarados, utilizando o Tampão Citrato, pH 6.0, por 40min em Banho
Maria a 97ºc, após o qual é resfriado por 20min a temperatura ambiente (T/A).
Após a RA realiza-se três lavagens com água corrente e três lavagens com
água destilada.
4.3.3 Bloqueio da peroxidase endógena
A peroxidase endógena, enzima presente nos tecidos, reage com o
diaminobenzidina (DAB), o que compromete a revelação da técnica de imuno-
histoquímica e deve ser, portanto, inativada ou bloqueada. Para o Bloqueio desta
enzima, as lâminas foram imersas em solução de Metanol e Peróxido de
Hidrogênio a 3% por 20min a T/A. Posteriormente foram realizadas três lavagens
em água corrente, seguida por duas lavagens com solução de PBS durante 5 min.
4.3.4 Detecção das Proteínas p53 e pRb
Os preparos histológicos tratados, como descritos anteriormente, foram
utilizados para detecção das proteínas p53 e pRb.
As lâminas foram colocadas na câmara úmida e os cortes fixados foram
demarcados com a caneta Dako, determinando a região de ação do anticorpo
primário. Os anticorpos primários foram previamente diluídos (diluente DAKO), em
uma concentração de 1:400 tanto os Anti-human p53 protein (DAKO Clone D-O7),
como o Anti-human pRb (DAKO Clone Rb1), de acordo com as recomendações
do fabricante.
45
Os cortes foram incubados overnight a 4
o
C com anticorpos primários: Anti-
human p53 protein e Anti-human pRb protein e, então retiradas da geladeira e
colocadas durante 30 minutos a temperatura ambiente (T/A). Os cortes foram
então lavados por duas vezes durante 5 min com PBS e incubados com
Anticorpos Secundários (anti-IgG camundongo) durante 20 min a T/A e
posteriormente lavados duas vezes com PBS por 5 minutos.
4.3.5. Revelação da reação
O revelado da reação se foi realizado com o kit Streptoavidina (DAKO) por
30 min T/A. As secções teciduais foram lavadas três vezes com PBS, por 5
minutos. Após esse período foi gotejado sobre os cortes solução contendo 1 gota
de DAB para 1mL de substrato durante 1 minuto. Os cortes foram lavados em
água corrente e em seguida contra-corado em imersão com solução de
Hematoxilina de Harris por 1min. As secções foram lavadas em água corrente e
posteriormente desidratadas através imersões em solventes: 3 vezes em álcool
absoluto por 2 minutos, seguida por 2 banhos em solução xilol por 2 minutos cada.
As lâminas foram montadas com bálsamo e lamínula.
4.3.6. Leitura da Expressão das proteínas p53 e pRb
A leitura das lâminas de imuno-histoquímica para p53 e pRb, montadas
como mencionadas anteriormente, foi feita em microscópio ótico em lentes de
40X, considerando positivas as células com coloração especificamente nuclear.
Em cada lâmina foi observada a quantidade de células coradas e classificadas
46
como: escore 0 (imunoexpressão inferior a 10%), considerado negativo para
imunoexpressão; escore 1 (imunoexpressão entre 10% a 50%), escore 2
(imunoexpressão acima de 50%).
Tabela 1. Perfil das amostras selecionadas
Variáveis n = 56 %
Diagnóstico histopatológico
Epitélio normal 6 10,7
Papiloma 19 33,9
Carcinoma 31 55,4
Grau de diferenciação do Carcinoma
Pouco diferenciado 6 19,4
Moderadamente diferenciado 18 58,0
Bem diferenciado 7 22,6
n = número de população de estudo
4.4 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
4.4.1 Desparafinização dos cortes
Antes da realização do PCR propriamente dito as amostras foram
submetidas à desparafinização através de banhos sucessivos com soluções
solventes.
Para cada amostra foram obtidos 3 cortes de 5µm. Estes cortes foram
colocados em tubos do tipo Eppendorf. As amostras foram submetidas a 3 banhos
47
de Xilol durante 30 minutos em banho maria à uma temperatura de 65 ºC e após
cada banho foi centrifigado a 12000rpm por 7 minutos, descartando-se o
sobrenadante. Os cortes então foram submetidos a sucessivos banhos com álcool
em concentrações diferentes, álcool absoluto, 95%, 70%, 50% e 30%,
centrifugando-se posteriormente a 12000 rpm por 5 minutos. Após os banhos com
solventes foram submetidas a 2 banhos com água Milli-Q centrifugando-se
rapidamente no primeiro banho e por 12000 rpm durante 7 minutos no último
banho.
4.4.2 Extração do DNA
Para a extração de DNA foi realizado o kit Qiamp da Qiagem. Foram
adicionados às amostras 180 µL de Buffer ATL e 20µL de proteinase K. Os tubos
foram agitados no vórtex e posteriormente incubados em banho maria a 56
o
.C por
72 horas. Após esse tempo as amostras foram centrifugadas. Em seguida foram
adicionados 200µL de buffer AL, colocado no vórtex durante 15 segundos e
incubados a 70
o
C por 10 minutos. Foram adicionados 200µL de etanol (100%), e
as amostras foram agitadas no vórtex e centrifugadas rapidamente. As amostras
foram colocadas, juntamente com o precipitado, na coluna (cullum) sem molhar a
borda e centrifugadas a 8000 rpm por 1 minuto. A coluna Qiamp Spin foi colocada
em um tubo limpo de 2 mL. Foi adicionado 500µL de buffer AW1. As amostras
foram centrifugadas a 8000 rpm por 1 minuto. A coluna Qiamp Spin foi colocada
em um tubo limpo. Foi adicionado 500 uL de Buffer AW2 e as amotras foram
centifugadas a 12000 rpm por 5 minutos. A coluna Qiamp Spin foi colocada em
48
um tubo do tipo eppendorf e foi adicionada 200µL de buffer AL foram
centrifugadas a 8000 rpm por 1 minuto.
4.4.3 Amplificação do DNA viral
A PCR foi realizada para a amplificação do DNA-HPV, utilizando os primers
MY09-MY11 (Invitrogen) (Tabela 1), correspondentes a região L1 do genoma viral
(BAUER & MANOS, 1993 e KANESHIMA et al., 2001). Estes iniciadores se unem a
uma região de 450 pares de bases (pb) do gene L1 altamente conservado nos
diferentes tipos de HPV.
As reações de amplificação para os primers foram realizadas em um
termociclador Gene Amp OCR System 2400 (Perkin Elmer). O DNA genômico (20µL)
foi adicionado a mistura contendo: 4.0mM de MgCl
2;
200µM de cada desoxinucleotídeo
trifosfatado (dNTP); 5µL de Tampão 10X; 50pmol de cada primer (MY09 e MY11); 2.5U
de Taq DNA polimerase e H
2
O Mili-Q para um volume final da reação de 50µL . A
reação foi realizada nas seguintes condições: o primeiro ciclo da amplificação consistiu
de 5 minutos a 95ºC e 35 ciclos de 92ºC por 40 minutos (Desnaturação), 56ºC por 50
minutos (Anelação) e 72ºC por 1minuto (Extensão). A etapa final de extensão foi de
72ºC por 4 minutos.
49
Tabela 2. Seqüência de nucleotídeos e primers
Primer Seqüência (5’ – 3’)
a
MY9 downstream HPV L1 CGTCCMAARGGAWACTGATC
MY11 upstream HPV L1 GCMCAGGGWCATAAYAATGG
PCO4 downstream
β
-globina
CAACTTCATCCACGTTCACC
GH20 upstream
β
-globina
GAAGAGCCAAGGACAGGTAC
M= A OU C, R= A OU G, W= A OU T, Y= C OU T
BAUER e MANOS, 1993
4.4.4 Leitura do PCR
Após a realização do PCR os produtos da reação foram submetidos à corrida
eletroforética em cuba horizontal a 110V durante 45 minutos em 2% de gel de agarose.
O gel foi corado com brometo de etídio, e os fragmentos de DNA foram visualizados
através de um transiluminador com luz Ultra-violeta.
4.5 Análise estatística
Os dados encontrados foram submetidos à análise estatística com o auxílio do
Software SPSS (Statistical Package for Social Science), versão 9.0 para Windows. Foi
aplicado um nível de significância de 5%, assim os valores de p≤ 0,05 foram
considerados significantes.
50
O teste não paramétrico de Kruskal-Wallis foi aplicado para comparar as variáveis
e como teste de comparação múltipla foi aplicado o Dunnt T3.
51
5. RESULTADOS
5.1 Resultados da Imuno-histoquímica
A marcação das proteínas p53 e pRb foi nuclear e homogênea (figuras 4, 5,
6, 7 e 8). Das 31 amostras de carcinoma escamocelular analisadas, 12 (38,7%)
foram consideradas negativas de acordo com o cut off estabelecido para
imunoexpressão da p53 e 19 (61,3%) foram consideradas positivas, sendo que 4
(12,9%) apresentaram escore 1 e 15 (48,4%) apresentaram escore 2. Enquanto
nos papilomas escamosos de um total de 19 amostras, 18 (94,7%) foram
consideradas negativas, portanto escore 0, e em 1 amostra (5,3%) houve uma
imunoexpressão de p53 acima do cut off estabelecido, sendo o escore desta 1.
Das 6 amostras de tecido normal, em 3 (50%) não houve imunoexpressão da p53,
enquanto em 3 (50%) houve detecção da proteína. Em relação à pRb, 12
amostras de carcinoma (38,7%) apresentaram uma imunoexpressão abaixo do
cut off, portanto escore 0, enquanto 19 amostras (61,3%), apresentaram resultado
positivo, sendo que 10 (32,3%) apresentaram escore 1 enquanto 9 (29%)
apresentaram escore 2. Nas amostras de lesões papilomatosas 14 (73,7%)
apresentaram imunoexpressão abaixo do cut off, e 5 (26,3%) foram consideradas
positivas quanto a detecção protéica, sendo 1 o escore destas. Das amostras de
tecido normal, 5 (83,3%) não apresentaram detecção para pRb, enquanto 1
amostra (16,7) apresentou escore 1(tabelas 3,4,5 e 6) (figuras 9,10,11 e 12).
52
A comparação dos resultados entre os três grupos (epitélio normal,
papiloma e carcinoma) de acordo com os escores (0,1 e 2) para a p53, aplicando
o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis e o teste de comparação múltipla de
Dunnt T3, mostrou que existiu uma diferença estatisticamente significante
(p=0,000) entre os ranks médios das lesões papilomatosas e carcinomas. E de
acordo com a pRb, houve diferença estatística entre entre os ranks médios do
epitélio normal e carcinoma (p=0,014) e papilomas e carcinomas (p=0,003).
De acordo com o grau de diferenciação do carcinoma e a imunoexpressão
da p53, das 31 amostras 6 eram pouco diferenciadas, tendo 3(50%) dessas
imunoexpressão escore 1, e 3 (50%) escore 2. Nenhum dos carcinomas pouco
diferenciados apresentou escore 0. Das 18 amostras de carcinomas
moderadamente diferenciados, 9 (50%) não expressaram a p53 de acordo com o
cut-off estabelecido. Nenhum desses carcinomas apresentou escore 1 e 9 (50%)
apresentaram escore 2. 42,9% dos 7 carcinomas bem diferenciados não
apresentaram imunoexpressão, enquanto que 14,2% apresentaram escore 1 e
42,9% apresentaram escore 2 (tabela 7)(figura 13).
De acordo com a imunoexpressão da pRb e o grau de diferenciação, dos 6
carcinomas pouco diferenciados 2 (33,3%) não expressaram a proteína, enquanto
2 (33,3%) tiveram escore de imunoexpressão 1 e 33,3% escore 2. Dos
carcinomas moderadamente diferenciados, 50% não expressaram a pRb,
enquanto 33,3% expressaram escore 1 e 16,7% escore 2. Dos carcinomas bem
diferenciados 1(14,3%) não apresentou imunoexpressão, 2 (28,6%) apresentaram
escore 1 e 4 (57,1%) escore 2 (tabela 8) (figura 14).
53
Figura 4: Imuno-histoquímica p53 escore 0
Figura 5: Imuno-histoquímica p53 escore 1 Figura 6: Imuno-histoquímica pRb escore 1
Figura 7: Imuno-histoquímica p53 escore 3
Figura 8: Imuno-histoquímica pRb escore 3
54
50,0
94,7
38,7
50,0
5,3
61,3
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
Epitélio normal Papiloma Carcinoma
Diagnóstico histopatológico
Percentagem (%)
Negativa
Positiva
Tabela 3. Freqüência da imunoexpressão da p53 de acordo com o diagnóstico histológico.
Diagnóstico histopatológico
Epitélio normal Papiloma Carcinoma
Total
Imuno-histoquímica para p53
n = 6 % n = 19 % n = 31 % n = 56 %
Negativa 3 50,0 18 94,7 12 38,7 33 58,9
Positiva 3 50,0 1 5,3 19 61,3 8 14,3
Figura 9: Imunoexpressão da p53 de acordo com o diagnóstico histopatológico
55
83,3
73,7
38,7
16 , 7
26,3
61,3
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
Epitélio normal Papiloma Carcinoma
Diagnóstico histopatológico
Percentagem (%)
Negativa
Positiva
Tabela 4. Freqüência da imunoexpressão da pRb de acordo com o diagnóstico histológico
Diagnóstico histopatológico
Epitélio normal Papiloma Carcinoma
Total
Imuno-histoquímica para pRB
n = 6 % n = 19 % n = 31 % n = 56 %
Negativa 5 83,3 14 73,7 12 38,7 31 55,3
Positiva 1 16,7 5 26,3 19 61,3 16 28,6
Figura 10: Imunoexpressão da pRb de acordo com o diagnóstico histopatológico
56
50,0
94,7
38,7
50,0
5,3
12 , 9
0,0 0,0
48,4
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
Epitélio normal Papiloma Carcinoma
Diagnóstico histopatológico
Percentagem (%)
Inferior a 10,0%
Entre 30,0% a 50,0%
Acima de 50,0%
Tabela 5. Freqüência da imunoexpressão da p53 de acordo com os escores e com o diagnóstico
histológico
Figura 11: Distribuição da p53 de acordo com o diagnóstico histopatológico
Diagnóstico histopatológico
Epitélio normal Papiloma Carcinoma
Total
Imuno-histoquímica para p53
n = 6 % n = 19 % n = 31 % n = 56 %
Escore (0) Inferior a 10,0% 3 50,0 18 94,7 12 38,7 33 58,9
Escore (1) Entre 10,0% e
50,0%
3 50,0 1 5,3 4 12,9 8 14,3
Escore (2) Acima de 50% 0 --- 0 --- 15 48,4 15 26,8
57
83,3
73,7
38,7
16 , 7
26,3
32,3
0,0 0,0
29,0
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
Epitélio normal Papiloma Carcinoma
Diagnóstico histopatológico
Percentagem (%)
Inferior a 10,0%
Entre 30,0% a 50,0%
Acima de 50,0%
Tabela 6: Freqüência da imunoexpressão da pRb de acordo com os escores e com o diagnóstico
histológico
Figura 12: Distribuição da pRb de acordo com o diagnóstico histopatológico
Diagnóstico histopatológico
Epitélio normal Papiloma Carcinoma
Total
Imuno-histoquímica para pRB
n = 6 % n = 19 % n = 31 % n = 56 %
Escore (0) Inferior a 10,0% 5 83,3 14 73,7 12 38,7 31 55,3
Escore (1) Entre 10,0% e
50,0%
1 16,7 5 26,3 10 32,3 16 28,6
Escore (2) Acima de 50% 0 --- 0 --- 9 29,0 9 16,1
58
0,0
50,0
42,9
50,0
0,0
14 , 2
50,0 50,0
42,9
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
Pouco Moderadamente Bem
Grau de diferenciação do carcinoma
Percentagem (%)
Inferior a 10,0%
Entre 10,0% a 50,0%
Acima de 50,0%
Tabela 7: Freqüência da imunoexpressão da p53 de acordo com o grau de diferenciação do
carcinoma
Grau de diferenciação do carcinoma
Pouco Moderadamente Bem
Total
Imuno-histoquímica para p53
n = 6 % n = 18 % n = 7 % n = 31 %
Escore (0) Inferior a 10,0% 0 --- 9 50,0 3 42,9 12 38,7
Escore (1) Entre 10,0% e
50,0%
3 50,0 0 --- 1 14,2 4 12,9
Escore (2) Acima de 50% 3 50,0 9 50,0 3 42,9 15 48,4
Figura 13: Distribuição da expressão da p53 de acordo com o grau de
diferenciação do carcinoma
59
33,3
50,0
14 , 3
33,3 33,3
28,6
33,3
16 , 7
57,1
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
Pouco Moderadamente Bem
Grau de diferenciação do carcinoma
Percentagem (%)
Inferior a 10,0%
Entre 10,0% a 50,0%
Acima de 50,0%
Tabela 8: Freqüência da imunoexpressão da pRb de acordo com o grau de diferenciação do
carcinoma
Figura 14: Distribuição da expressão da pRb de acordo com o grau de
diferenciação do carcinoma
Grau de diferenciação do carcinoma
Pouco Moderadamente Bem
Total
Imuno-histoquímica para pRB
n = 6 % n = 18 % n = 7 % n = 31 %
Escore (0) Inferior a 10,0% 2 33,3 9 50,0 1 14,3 12 38,7
Escore (1) Entre 10,0% e
50,0%
2 33,3 6 33,3 2 28,6 10 32,3
Escore (2) Acima de 50% 2 33,3 3 16,7 4 57,1 9 29,0
60
5.2. Resultado do PCR
O DNA extraído foi corrido através da técnica de eletroforese em um gel de
agarose a 2%. Em uma amostra com diagnóstico de CCEO obtivemos o resultado
positivo para HPV com leitura da banda na região de 450pb (figura 15), assim
como para duas amostras de Papiloma. As demais amostras foram negativas para
o HPV. Entretanto a afim de detectar a integridade do DNA nas amostras
submetidas ao PCR verificou-se que em 36 amostras (75%) não foi detectada a β-
globina, enquanto que em 12 amostras (25%) foi possível a detecção desta
proteína.
5.3. Associação dos escores imuno-histoquímicos das proteínas
p53 e pRb e o PCR para HPV
Nas amostras de papiloma, nas quais o resultado do PCR foi positivo, em
uma amostra o escore tanto da proteínas p53 quanto da pRb foi 0. Na segunda
amostra com diagnóstico de papiloma e resultado do PCR positivo para HPV os
escores foram 0 e 1 para p53 e pRb, respectivamente. Na amostra com
diagnóstico de CCEO HPV positiva os índices para p53 foi 2, enquanto para pRb
foi 0. Devido à pequena quantidade de amostras HPV positivas não foi possível
associar o grau de expressão protéica, o diagnóstico e a presença do HPV.
61
.
Figura 15. Detecção do DNA de HPV em gel de agarose a 2%
62
6. DISCUSSÃO
Alterações das proteínas p53 e pRb em diferentes tipos de células têm sido
detectadas freqüentemente por técnicas como o Southern, Northern e Western
Blots. Esses métodos, porém requerem extratos teciduais de biópsias tumorais,
que incluem não somente células malignas, mas várias proporções de células
normais, como fibroblastos, células inflamatórias e células epiteliais. O método de
imuno-histoquímica permite a detecção dos marcadores celulares expressos em
células individuais e em populações específicas de células em tecido seccionado.
A importância e funcionalidade da p53 na regulação do ciclo celular está
cada vez mais estabelecida na literatura. Os avanços obtidos nas técnicas de
biologia molecular e genética têm possibilitado o estudo mais detalhado do papel
da p53 no processo de carcinogênese.
Em condições de normalidade, a meia vida da p53 selvagem é de
aproximadamente 6 a 20 minutos, entretanto quando mutada, a meia vida pode
aumentar para 6 horas ou mais. Estudos têm proposto que uma vez mutada, a
proteína p53 sofre alterações conformacionais e estruturais que a inativam e
inviabilizam as função. A inativação é acompanhada pela estabilização, que
aumenta consideravelmente a vida média e possibilita a identificação pelos
métodos imunohistoquímicos. A expressão da p53 no núcleo da célula pelo
método de imunohistoquímica representa, na grande maioria das vezes, a forma
63
mutada. Estes fatores justificam, na literatura, a ausência ou uma leve
imunoexpressão desta proteína em tecidos normais ou em neoplasia benignas,
como o papiloma, ao passo que uma alta imunoexpressão é um fato observado
em lesões malignas, denotando envolvimento ímpar da p53 no processo
oncogenético. Estes fatos são condizentes com os resultados obtidos neste
estudo em relação à expressão da p53 em lesões papilomatosas, sendo que a
proteína não estava expressa em 94,7% das amostras e na única amostra (5,3%),
na qual houve expressão protéica, esta apresentou escore 1. De acordo com a
imunoexpressão em tecidos normais, 50% das amostras não apresentaram
imunoexpressão da p53, enquanto 50% apresentaram expressão da proteína em
escore 1. A alta imunoexpressão da p53 (50%) em tecidos normais no presente
estudo, fato este inesperado, pode ser justificado pela pequena quantidade de
amostras de tecido normal ou pelo fato do anticorpo monoclonal DO7 utilizado,
detectar tanto a proteína no estado selvagem quanto no estado mutado. A
detecção da p53 em seu estado selvagem pode ocorrer pelo aumento da
transcrição em células rapidamente proliferativas, em resposta a danos
persistentes ao DNA devido à ação de carcinógenos ou pela inativação de um
fator necessário para a degradação da proteína p53 natural, como o Mdm2. Em
nenhuma das amostras de tecido normal e papiloma analisadas, esta marcação
chegou ao escore 2 imunoexpressão, ou seja, uma detecção superior a 50%, o
que pode suportar as observações de que a superexpressão (escore 2), pode ser
um indicador de transformação maligna. Porém, estudos feitos por Barzal-
Norwosielska et al., em 2004, detectaram uma superexpressão da proteína p53
64
em 55% dos papilomas analisados. Esses resultados, porém, podem não estar
sujeitos a comparações com os resultados obtidos neste estudo, devido à
subjetividade dos escores e a ausência de um cut-off padrão para definir um caso
positivo.
Os resultados deste estudo, com relação à detecção da proteína p53 em
carcinomas bucais foi de 61,3% e estão de acordo com os achados de Nogueira
et al. (2004), que detectou 55,8%. Nos carcinomas positivos para
imunoexpressão, 48,9% possuíam superexpressão (escore 2) para p53, achados
superiores aos estudos feitos por Kusama et al.,(1996), que detectaram este
índice em 33,3% das amostras e inferior aos estudos feitos por Nogueira et al em
2004, no qual a porcentagem de amostras com superexpressão foi de 78,9%.
Porém nestes dois estudos citados anteriormente o cut-off estabelecido foi de
20%, e a uma superexpressão (escore 2) da p53 foi considerada nas amostras
com imunoexpressão superior a 60%. Na literatura falta uma padronização do cut-
off e dos escores para a técnica de imuno-histoquímica, se tornando difícil a
comparação entre os achados.
A ausência de imunoexpressão detectável da p53 nos 38,7% dos casos de
carcinoma pelo método de imuno-histoquímica não necessariamente indica a
ausência de mutação. Visto que, apesar da maioria das mutações ocorrerem por
mutações pontuais, em menor freqüência, as mutações podem ser do tipo
nonsense, que podem gerar um códon de parada, ou do tipo deleções em ambos
os alelos do gen p53, inviabilizando a tradução, com a produção de proteínas
instáveis, interferindo diretamente na sua expressão e detecção, uma vez que
65
diferentes aspectos bioquímicos da proteína p53 podem estar diretamente
relacionados ao padrão e ao grau de expressão. A formação de complexos de p53
na forma selvagem com oncoproteínas virais, como a E6 dos HPV induz a
degradação, reduzindo também os níveis intracelulares. Além disso, condições
diversas de fixação do tecido também diminuem a sensibilidade da técnica, por
modificar os epítopos.
Uma vez que a expressão tecidual da p53 relaciona-se, em diversos estudos,
com grau histológico e estadio, o grau de diferenciação dos carcinomas foi
analisado de acordo com a imunoexpressão das proteínas p53 e pRb. Nos
carcinomas pouco diferenciados, em nenhuma das amostras a imunoexpressão
para p53 foi negativa, resultado esse sustentado na literatura pelo fato de existir
uma maior expressão (mutação) da p53 em lesões mais agressivas e
proliferativas. Dos carcinomas moderadamente diferenciados e bem diferenciados
50% e 42,9% não apresentaram imunoexpressão, respectivamente. O escore 2 foi
detectado em 50% dos carcinomas moderadamente diferenciados e 42,9% bem
diferenciados. No presente estudo não foi possível a detecção de diferença
estatística entre os três graus de diferenciação no carcinoma em relação à
imunoexpressão da p53, apesar do potencial de malignização, através da análise
da expressão da p53 ser fato suportado pela literatura, onde vários estudos
verificam a detecção com expressão positiva crescente da p53 de hiperplasia para
displasia e para carcinoma de células escamosas bucal, podendo ser utilizado
como recurso preditivo e de prognóstico de lesões malignizáveis e malignas.
66
A correlação entre a detecção da pRb através de estudos
imunohistoquímicos e a carcinogênese humana ainda não está muito claro na
literatura, principalmente devido à diferença nos padrões de expressão desta
proteína a depender do tipo e localização de câncer.
O método de imuno-histoquímica para avaliação da pRb não detecta o status
protéico, não distinguindo a pRb mutante da pRb selvagem, assim como também
detecta tanto a forma hipofosforilada como a hiperfosforilada da proteína.
Portanto, a detecção da pRb não indica seu estado funcional.
No presente estudo, em 83,3% das amostras de tecido normal e em 73,3%
das amostras de papiloma não houve detecção da pRb, enquanto que em 16,7%
das amostras de tecido normal esta proteína estava expressa em escore 1. Nos
papilomas esse índice foi de 26,1% para o mesmo escore. Os altos índices de
ausência de detecção da proteína não foram esperados, visto que a pRb
desempenha funções fisiológicas em tecidos normais, regulando a proliferação do
ciclo celular. Porém, nenhuma das amostras de tecido normal ou papiloma se
detectou escore 2 de imunoexpressão, enquanto que nos carcinomas detectamos
este escore em 29% das amostras, sugerindo que a superexpressão desta
proteína, assim como a p53, pode ser indicador de malignidade. Estudos sugerem
que a superexpressão da pRb é capaz de bloquear a apoptose induzida pela p53
(HAUPT et al., 1995), propiciando o desenvolvimento de neoplasias malignas. A
maior detecção da pRb em lesões malignas pode ocorrer devido ao aumento
proporcional de células proliferativas, justificável pelo fato da pRb hiperfosforilada
aumentar nas fases G2 e M. O aumento da expressão da pRb em lesões malignas
67
foi fato observado em estudos feito por zur Hausen, (1999). Mutações do Rb, fato
também associado desenvolvimento de carcinomas orais, podem resultar em
expressão nuclear da proteína, justificando os índices de expressão protéica em
neoplasias malignas no estudo realizado (61,3%).
A não detecção ou a diminuição da pRb pode ocorrer devido a mutações que
resultam na ausência da codificação da proteína, o que pode justificar os 38,7%
dos carcinomas nos quais não houve detecção protéica. Porém, a ausência de
expressão da pRb é fato encontrado em maior freqüência em diversos estudos,
como nos estudos feitos por William et al (2000) e Koontongkaew et al (2000), nos
quais a expressão da pRb estava ausente em 66% e 73,58% dos carcinomas
escamocelulares orais, respectivamente, justificados pelo fato da maioria das
mutações ou inativações do gene Rb resultar na ausência de expressão da
proteína. A associação entre detecção da pRb com o hábito de fumar mostra, na
literatura, uma diminuição da expressão desta proteína em pacientes fumantes,
fato que não foi analisado neste estudo. A infecção viral pelos HPVs de alto risco
resulta na degradação da pRb pela oncoproteína E7, o que também resulta na
diminuição quantitativa da pRb, resultando em baixos índices de expressão.
A associação entre o grau de diferenciação dos carcinomas orais e a
expressão da pRb não foi estatisticamente significante, contrastando com estudos
feitos com carcinomas escamocelulares da cérvice uterina, no qual houve
diferença estatística entre o grau de diferenciação dessas lesões e a expressão da
pRb, sendo esta maior em carcinoma bem diferenciados comparando com os
carcinomas pouco diferenciados, fato justificável pela presença da pRb ser fator
68
protetor contra apoptose, sendo fracamente detectada em tumores mais
agressivos ou pouco diferenciados.
Os resultados obtidos neste estudo em relação ao papel pRb na
carcinogênese oral são inconclusivos. Os resultados estão de acordo com alguns
achados na literatura, mas contrários a outros. Na literatura existem poucos
estudos associando pRb à carcinogênese oral e a falta de uma padronização do
cut-off e dos escores para a detecção imuno-histoquÍmica do pRb dificultam a
comparação entre os diversos estudos.
A taxa de detecção do HPV em Carcinomas orais tem sido relatada em uma
extensão de 0% a 100%, em vários trabalhos. Essa discrepância é atribuída,
principalmente, à variação da sensibilidade das técnicas e metodologias
empregadas, a fatores epidemiológicos dos grupos de pacientes examinados e ao
tamanho da amostra.
A utilização da técnica de reação de cadeia de polimerase como metodologia
no diagnóstico molecular do Papilomavírus Humano tem se mostrado como a
mais sensível na identificação do DNA viral existente nos mais diversos materiais
clínicos. Por ser um método muito sensível, é necessário controlar muito bem as
condições de ensaio, a fim de eliminar os resultados falso-positivos. O presente
estudo não permitiu definir o associação do HPV na mutação das proteínas p53 e
pRb em lesões malignas e benignas na cavidade oral, em função do pequeno
número de amostra com resultados positivos.
Apesar de ser uma técnica com grande aplicabilidade em materiais fixados e
parafinizados, segundo estudos na literatura, a utilização deste tipo de material
69
pode causar problemas devido ao tempo de fixação e o tipo de fixador usado pode
afetar consideravelmente a qualidade dos ácidos nucléicos extraídos. Neste
estudo a dificuldade de extração pode ser justificada pelo tipo de formol utilizado
(formalina a 10%), cuja concentração degrada o material genético. O formol ideal
utilizado para a preservação do material genético, possibilitando uma boa
extração, é o formol tamponado.
O fato de ter encontrado uma grande percentagem de amostras com a
ausência de DNA íntegro sugere que tenham ocorrido poucos cuidados na fixação
do tecido, porém a negatividade das amostras ao detectar o HPV pode ter sido
influenciada por aspectos mencionados anteriormente.
70
7. CONCLUSÕES
¾ A detecção da p53, assim como o grau de imunoexpressão, está
diretamente relacionada ao desenvolvimento de neoplasias malignas.
¾ A imunoexpressão da p53 está ausente ou fracamente expressa em
neoplasias benignas.
¾ A pRb está expressa em maior freqüência em carcinomas escamocelulares
oral, enquanto que em papilomas orais esta proteína está expressa em
baixa freqüência.
¾ A superexpressão (escore 2) de p53 e pRb em lesões orais está
relacionada à malignidade, não sendo encontrada em tecidos normais e
papilomas orais;
71
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