( PDF ) Caracterização fenotípica e genotípica de staphylococcus sppp. isolados de queijos de coalho e leite de vacas com mastite no estado de Pernambuco, Brasil

Download PDF

ads:

MANUELA FIGUEIROA LYRA DE FREITAS

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE

STAPHYLOCOCCUS SPP. ISOLADOS DE QUEIJOS DE COALHO E

LEITE DE VACAS COM MASTITE NO ESTADO DE PERNAMBUCO,

BRASIL

RECIFE – 2006

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE NUTRIÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO

Manuela Figueiroa Lyra de Freitas

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE

STAPHYLOCOCCUS SPP. ISOLADOS DE QUEIJOS DE COALHO E

LEITE DE VACAS COM MASTITE NO ESTADO DE PERNAMBUCO,

BRASIL

Tese de Doutorado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Nutrição do Centro de Ciências da

Saúde da Universidade Federal de

Pernambuco, como pré-requisito para a

obtenção do título de Doutor em

Nutrição.

RECIFE - 2006

ads:

Freitas, Manuela Figueiroa Lyra de

Caracterização fenotípica e genotípica de

Staphylococcus spp. isolados de queijo de coalho e

leite de vacas com mastite no Estado de

Pernambuco, Brasil / Manuela Figueiroa Lyra de

Freitas. – Recife : O Autor, 2006.

ix, 209 folhas ; il., fig., tab.

Tese (doutorado) – Universidade Federal de

Pernambuco. CCS. Nutrição, 2006.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Ciência dos alimentos – Microbiologia. 2.

Staphylococcus spp. – Caracterização fenotípica e

genotípica – Isolados de queijo coalho e leite de

vacas com mastite. 3. Toxinas estafilocócicas –

Utilização da técnica de PCR (Reação em Cadeia da

Polimerase). 4. Estafilococos e antibióticos –

Resistência microbiana. 5. Mastite bovina –

Staphylococcus aureus – Biologia molecular. I.

Título.

612.39 CDU (2.ed.) UFPE

612.3 CDD (22.ed.) BC2006-117

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE NUTRIÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE

STAPHYLOCOCCUS SPP. ISOLADOS DE QUEIJOS DE COALHO E

LEITE DE VACAS COM MASTITE NO ESTADO DE PERNAMBUCO,

BRASIL

Doutoranda: Manuela Figueiroa Lyra de Freitas

Orientadora: Dra. Tânia Lúcia Montenegro Stamford

Co-Orientadora: Dra. Tereza Cristina Leal Balbino

Recife - 2006

III

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE

STAPHYLOCOCCUS SPP. ISOLADOS DE QUEIJOS DE COALHO E

LEITE DE VACAS COM MASTITE NO ESTADO DE PERNAMBUCO,

BRASIL

MANUELA FIGUEIROA LYRA DE FREITAS

Examinadores:

_________________________________________

Profa. Dra. Alzira Maria Paiva de Almeida

_________________________________________________

Profa. Dra. Nonete Barbosa Guerra

_________________________________________________

Prof. Dr. Rinaldo Aparecido Mota

__________________________________________________

Profa. Dra. Maria do Carmo Catanho Pereira de Lyra

__________________________________________________

Profa. Dra. Maria José de Sena

Dedico esta tese aos meus pais Eluzino e

Fernanda, o início de tudo. Ao meu marido

Djalma Jr. e ao nosso filho Daniel, bem como

aos meus sogros Djalma e Edileusa.

AGRADECIMENTOS

A Deus, ser supremo, que sempre está do nosso lado, nos abençoando;

Aos meus pais que nunca me deixaram faltar nada principalmente com relação ao

amor e a educação;

Ao meu marido Djalma Alves de Freitas Júnior que sempre esteve ao meu lado me

apoiando e incentivando nos momentos mais difíceis;

Aos meus sogros que também são como pais para mim, pelo apoio e admiração;

À professora Tânia Lúcia Montenegro Stamford por ter me recebido como aluna de

doutorado e pelo convívio e aprendizagem;

À pesquisadora Tereza Cristina Leal Balbino pelo apoio, palavras de conforto e

pelos ensinamentos de vida e de biologia molecular;

Ao professor Rinaldo Aparecido Mota, meu grande e admirável amigo, obrigada por

tudo;

À professora Maria José de Sena pelo apoio e confiança;

Aos alunos de Iniciação Científica José Wilton Pinheiro Júnior e Isabelle da Silva

Luz, que tanto me ajudaram na realização dos experimentos, agradeço demais a vocês;

Aos meus amigos Dalila, Aldemir e Ana Mércia do laboratório de microbiologia do

Ministério de Agricultura, pela amizade, apoio e por ter cedido gentilmente as cepas de

Staphylococcus spp. isoladas de queijos coalho;

A Sineide, Silvana Suely, Leonildo, Sérgio, Davi, Paulo César, Soraide, Andréa

Paiva do Laboratório de Bacteriose da UFRPE;

Aos meus colegas de doutorado, em especial, Karla, Celiane, Sâmara e Erilane;

À Professora Nara Suzy e Maria de Carmo pela receptividade no Laboratório do

Projeto Genoma da UFRPE;

A todos os professores do Programa de Pós Graduação em Nutrição;

A Fabiana (o máximo) por receber a todos os novos estagiários de forma cordial,

simpática e prestativa;

A Joseane, Thiers, Carina, Franklin Bispo, Wellington, Gerlane, Pollyanna, Mariana

Marques, Eden, Cariri, Wagner pela amizade e apoio;

A Rodrigo Menezes, Tamara e Vladimir pela ajuda com os programas para as

enzimas de restrição;

A Betânia, Mirele, Danielle, Tamara, Franklin Magalhães e Christiam pela amizade

e ajuda nas etapas de purificação e seqüenciamento;

Aos funcionários do Laboratório de Microbiologia do CPqAM, em especial,

Silvana, Yara, Isaac e Lucas que sempre estão prontos para ajudar;

Aos funcionários da esterilização do CPqAM: Edson, Nelson e Rita;

A Duschinka, Marcelo e Plínio do Departamento de Entomologia do CPqAM;

A Dr. Valdir pela análise das seqüências;

A Dra. Nilma, Dr. Oswaldo, Dra. Alzira e Dra. Marise pelo apoio;

A Fernanda, secretária do Departamento de Microbiologia do CPqAM;

A Neci Maria Santos do Nascimento, secretária da Pós-Graduação em Nutrição, por

sua dedicação e por sempre nos receber com sua alegria e boa vontade;

Aos bibliotecários do CPqAM, UFRPE e da UFPE;

À Coordenação de Pós-Graduação em Nutrição;

Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães CPqAM/ FIOCRUZ-PE, pela realização

dos experimentos em suas instalações;

VII

Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Densenvolvimento CNPq pela bolsa de

doutorado concedida;

Ao Banco do Nordeste do Brasil pelo financiamento do projeto;

Ao Laboratório de Enterotoxinas Estafilocócicas da Fundação Ezequiel Dias

(FUNED-MG) e ao Dr. Luiz Simeão do Carmo por ter cedido as cepas padrões FRI (Food

Research Institute Madison, Wiscosin, EUA);

A todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste

trabalho.

VIII

Ao acordar contemple a vida de forma

melhor. Olhe para o sol e deixe o mesmo iluminar

o seu coração e aquecer sua alma. Olhe para as

flores e sinta o seu perfume, deixe este perfume

inebriar você e lhe trazer calma. Olhe para os

pássaros que por aí voam leves e soltos e escute os

seus cantos. Deixe esta melodia lhe alegrar o

espírito e a simplicidade e a liberdade lhe

alcançarem. E ao chegar a noite não deixe de

contemplar a lua e as estrelas que a escuridão

vieram clarear. Ilumine as idéias e pensamentos,

reflita sobre o que fez e o que passou, não guarde

rancores, nem desamores, pois a lua e as estrelas

estão no céu. No céu de sua vida e para fazerem

você brilhar.

Manuela Figueiroa Lyra de Freitas

SUMÁRIO

Página

LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. LEITE

2.2. QUEIJO DE COALHO

2.3. MASTITE BOVINA

2.3.1. Conceito e Classificação

2.3.2. Etiologia

2.3.3. Diagnóstico

2.3.4. Perdas Econômicas

2.4. USO DE ANTIMICROBIANOS

2.5. EXOTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS

2.6. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GERAL

Página

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. ARTIGO CIENTÍFICO 1: PERFIL DE SENSIBILIDADE

ANTIMICROBIANA IN VITRO DE STAPHYLOCOCCUS COAGULASE

POSITIVOS ISOLADOS DE LEITE DE VACAS COM MASTITE

SUBCLÍNICA NO AGRESTE DO ESTADO DE PERNAMBUCO

5.2. ARTIGO CIENTÍFICO 2: ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO

MOLECULAR DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS ASSOCIADOS À

MASTITE BOVINA PROVENIENTES DO ESTADO DE

PERNAMBUCO, BRASIL

113

5.3. ARTIGO CIENTÍFICO 3: INVESTIGAÇÃO DOS GENES PARA AS

TOXINAS ESTAFILOCÓCICAS EM ISOLADOS DE LEITE DE VACAS

COM MASTITE SUBCLÍNICA NA REGIÃO AGRESTE DO ESTADO

DE PERNAMBUCO, BRASIL

135

5.4. ARTIGO CIENTÍFICO 4: PERFIL DE SENSIBILIDADE

ANTIMICROBIANA E DETECÇÃO DE GENES TOXIGÊNICOS EM

CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS SPP. ISOLADAS DE AMOSTRAS DE

QUEIJOS DE COALHO NO ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL

163

6. CONCLUSÕES

192

7. ANEXOS

194

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

SEs Staphylococcal Enterotoxins

SEA Staphylococcal Enterotoxin A

SEB Staphylococcal Enterotoxin B

SEC Staphylococcal Enterotoxin C

SED Staphylococcal Enterotoxin D

SEE Staphylococcal Enterotoxin E

SEF Staphylococcal Enterotoxin F

SEG Staphylococcal Enterotoxin G

SEH Staphylococcal Enterotoxin H

SEI Staphylococcal Enterotoxin I

SEJ Staphylococcal Enterotoxin J

SEL Staphylococcal Enterotoxin L

SEM Staphylococcal Enterotoxin M

SEN Staphylococcal Enterotoxin N

SEO Staphylococcal Enterotoxin O

SEP Staphylococcal Enterotoxin P

SEQ Staphylococcal Enterotoxin Q

SER Staphylococcal Enterotoxin R

SEU Staphylococcal Enterotoxin U

PCR Polimerase Chain Reaction

coa

Gene da coagulase

UFC Unidades Formadoras de Colônias

mL Mililitros

Kg Quilo

CCS Contagem de Células Somáticas

CMT California Mastitis Test

CECS Contagem Eletrônica de Células Somáticas

ET Exfoliative Toxin

TSST-1 Toxic Shock Syndrome Toxin 1

RIA Radioimunoensaio

ELISA Enzyme-Linked Immnusorbent Assay

PT Toxinas Pirogênicas

SPE Exotoxinas Pirogênicas Estreptocócicas

SSSS Staphylococcal Scalded Skin Syndrome

ETA Toxina Esfoliativa A

ETB Toxina Esfoliativa B

ETC Toxina Esfoliativa C

ETD Toxina Esfoliativa D

Kda Quilodalton

se/ / ent Gene para enterotoxinas estafilocócicas

sea

Gene para enterotoxinas estafilocócicas A

seb

Gene para enterotoxinas estafilocócicas B

sec

Gene para enterotoxinas estafilocócicas C

sed

Gene para enterotoxinas estafilocócicas D

see

Gene para enterotoxinas estafilocócicas E

seg

Gene para enterotoxinas estafilocócicas G

seh

Gene para enterotoxinas estafilocócicas H

sei

Gene para enterotoxinas estafilocócicas I

sej

Gene para enterotoxinas estafilocócicas J

sel

Gene para enterotoxinas estafilocócicas L

sem

Gene para enterotoxinas estafilocócicas M

sen

Gene para enterotoxinas estafilocócicas N

seo

Gene para enterotoxinas estafilocócicas O

sep

Gene para enterotoxinas estafilocócicas P

seq

Gene para enterotoxinas estafilocócicas Q

ser

Gene para enterotoxinas estafilocócicas R

seu

Gene para enterotoxinas estafilocócicas U

pb Pares de bases

ng Nanograma

Kb quilobases

ORF Open Reading Frame (Fase Aberta de Leitura)

egc

Enterotoxin gene cluster

RPLA Reversed Passive Látex Aglutination

pH Concentração de Hidrogênio

MgCl

Cloreto de magnésio

dNTPs Desorribonucleotídeos trifosfato

SCP Staphylococcus Coagulase Positiva

SCN Staphylococcus Coagulase Negativa

GL Graus Gay Lussac

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

TSI Tríplice Sugar Iron

VM Vermelho de Metila

SIM Ácido sulfídrico, Indol e Motilidade

µg Micrograma

U.I Unidades Internacionais

mM Milimolar

Tris-HCl Tris (hydroxymethyl) aminomethane Hydrochloride

KCl Cloreto de potássio

HaeIII Enzima de restrição, extraída de Arthrobacter luteus

AluI Enzima de restrição, extraída de Haemophilus aegyptius

UV Luz Ultra Violeta

ATCC The American Type Culture Collection

ER Enzima de restrição

RsaI Enzima de restrição, extraída de Rhodopseudomonas sphaeroides

DraI Enzima de restrição, extraída de Deinococcus radiophilus

RFLP Polimorfismo do Comprimento do Fragmento de Restrição

mec

Gene de resistência para a meticilina

femB

Gene de especificidade para a espécie S. aureus

MRSA Methicillin Resistant S. aureus

FRI Food Research Institute

PFGE Pulsed-Field Gel Eletrophoresis

OSP Sensibilidade Ótima em Placa

LISTA DE FIGURAS

REVISÃO DE LITERATURA Página

Figura 1

Infecção da glândula mamária por Staphylococcus spp. 24

Figura 2

Esquema demonstrando proporção entre animais de um

rebanho com mastite clínica, subclínica e sadios

Figura 3

Reação em Cadeia da Polimerase. Preparo da reação em tubo

de ensaio antes da colocação em termociclador

Figura 4

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 65

ARTIGO 1

Figura 1

Comparação da resistência antimicrobiana de cepas de

estafilococos coagulase positivo por antibióticos e municípios

estudados (A, B, C e D) no Agreste do Estado de Pernambuco,

2005

103

Figura 2

Perfil de resistência múltipla de Staphylococcus coagulase

positivos isolados de leite de vacas com mastite nos

(Municípios A, B, C e D) do Agreste do Estado de

Pernambuco, 2005

105

ARTIGO 2

Figura 1

Produtos de PCR do gene coa de S. aureus isolados do

município de São Bento do Una, Pernambuco, Brasil.

Marcador de peso molecular, linha M (100pb DNA ladder).

Controle positivo, linha 1 (S. aureus ATCC 25923).

Propriedade A, linhas 2 a 6. Propriedade B, linhas 7 a 28

127

Figura 2

Produtos de PCR do gene coa digeridos com AluI de S. aureus

isolados do município de São Bento do Una, Pernambuco,

Brasil. Marcador de peso molecular, linha M (100pb DNA

ladder). Controle positivo, linha 1 (S. aureus ATCC 25923).

Propriedade A, linhas 2 a 6. Propriedade B, linhas 7 a 28

128

Página

Figura 3

Produtos de PCR do gene coa de 750pb digeridos com AluI e

HaeIII de isolados de S. aureus do município de São Bento do

Una, Pernambuco, Brasil. M (100pb DNA ladder). Linhas 2

(PCR); 2Alu (RFLP AluI); 2Hae (RFLP HaeIII); 3 (PCR);

3Alu (RFLP AluI); 3Hae (RFLP HaeIII); 5 (PCR); 5Alu

(RFLP AluI); 5Hae (RFLP HaeIII); 6 (PCR); 6Alu (RFLP

AluI); 6Hae (RFLP HaeIII)

129

Figura 4

Teste de sensibilidade in vitro (A) e perfil de multiresistência

in vitro (B) de 27 isolados de S. aureus associados à mastite

subclínica no município de São Bento do Una

130

ARTIGO 3

Figura 1

Detecção dos genes sea, seb, sec, sed e tst nas cepas padrões

de S. aureus FRI através de PCR-Multiplex

152

Figura 2

Produto de amplificação da PCR dos genes sej, sei, seg e seh

(A, B, C e D, linhas: 1, 3 e 5) e seus padrões de restrição com

as enzimas RsaI: A, B e C e DraI: D, linhas: 2, 4, 6

153

ARTIGO 4

Figura 2

Produto de amplificação da PCR dos genes sed, sej, sei, tst,

sec, seh e seg (A, linhas: 1 e 3, gene sed; A, linhas: 6 e 8, gene

sej; B, linhas: 1 e 3, gene sei; C, linhas: 1 e 3, gene tst; C,

linhas: 5 e 7, gene sec; C, linha 9, gene seh e D, linhas: 1 e3,

gene seg) e seus padrões de restrição com as enzimas RsaI (A,

linhas: 7 e 9, gene sej; B, linhas: 2 e 4, gene sei; C, linhas: 6 e

8, gene sec; D, linhas: 2 e 4, gene seg) e DraI (C, linhas: 2 e 4,

gene tst; C, linha: 10, gene seh)

182

LISTA DE TABELAS

Página

ARTIGO 1

Tabela 1

Microrganismos isolados de leite de vacas com mastite em

municípios do Agreste do Estado de Pernambuco, 2005

100

Tabela 2

Análise geral do perfil de sensibilidade antimicrobiana de 59

cepas de estafilococos coagulase positivas isoladas de

amostras de leite de vacas com mastite no Agreste do Estado

de Pernambuco, 2005

102

ARTIGO 2

Tabela 1

Resultados da PCR-RFLP do gene coa de isolados de S.

aureus associados à mastite bovina em duas propriedades do

município de São Bento do Una, Pernambuco, Brasil

126

ARTIGO 3

Tabela 1

Primers usados na análise da PCR para a detecção dos genes

sea-see, seg-sej, tst, eta e etb em cepas de Staphylococcus spp.

isoladas de amostras de leite de vacas com mastite subclínica

na região Agreste do Estado de Pernambuco, Brasil

149

Tabela 2

Endonucleases de restrição usadas para a confirmação da

identidade dos fragmentos dos genes seg, seh, sei e sej e

padrão de restrição esperado

150

Tabela 3

Distribuição dos genes para as toxinas SEG, SEH, SEI e SEJ

nas cepas de Staphylococcus spp. isoladas de leite de vacas

com mastite subclínica em quatro municípios localizados na

região Agreste do Estado de Pernambuco, Brasil

151

Página

ARTIGO 4

Tabela 1

Contagem de Staphylococcus coagulase positiva em amostras

de queijos de coalho no estado de Pernambuco, Brasil

178

Tabela 2

Primers usados para a detecção por PCR dos genes sea-see,

seg-sej, tst, eta e etb em cepas de Staphylococcus spp. isoladas

de amostras de queijos de coalho no Estado de Pernambuco,

Brasil

179

Tabela 3

Enzimas de restrição usadas para confirmação da identidade

dos fragmentos dos genes seg, seh, sei, sej, sec, sed e tst e

padrão de restrição esperado

180

Tabela 4

Perfil de sensibilidade de cepas de Staphylococcus spp.

isoladas de amostras de queijos de coalho no Estado de

Pernambuco, frente aos antibióticos testados

181

RESUMO

A mastite bovina, inflamação da glândula mamária, é uma das principais doenças

que acomete o rebanho leiteiro em todo o mundo. O principal agente infeccioso responsável

por esta enfermidade é o Staphylococcus aureus (S. aureus), bactéria de interesse na

microbiologia dos alimentos como agente causador de intoxicações alimentares. Outro

importante fato que envolve este microrganismo é a resistência aos antibióticos usados na

terapêutica humana e veterinária. Como o leite e derivados são amplamente consumidos e

podem conter S. aureus enterotoxigênicos e resistentes, objetivou-se com este estudo

caracterizar feno e genotipicamente Staphylococcus spp. isolados de amostras de leite de

vacas com mastite e queijos de coalho no Estado de Pernambuco. Para o diagnóstico da

mastite bovina foram realizados os testes da caneca telada e o California Mastitis Test. As

amostras de queijos de coalho foram submetidas ao isolamento e contagem de

Staphylococcus coagulase positiva (SCP) em Ágar Baird-Parker. As cepas de

Staphylococcus spp. obtidas tanto do leite quanto dos queijos foram caracterizadas

fenotipicamente em S. aureus, SCP e Staphylococcus coagulase negativa (SCN), através da

técnica de coloração de gram, características morfo-tintoriais das colônias e produção de

hemólise em Ágar sangue, além de provas bioquímicas como fermentação da glicose em

anaerobiose, fermentação do manitol em aerobiose e anaerobiose, produção de

termonuclease, acetoína e coagulase. A caracterização genotípica foi realizada através da

utilização da técnica de PCR-RFLP do gene coa, PCR-Uniplex e Multiplex para

investigação dos genes toxigênicos, além de clivagem e seqüenciamento para confirmação

da presença dos genes se. Para traçar o perfil de resistência dos isolados, foi empregada a

técnica de difusão em ágar, utilizando diferentes antibióticos. Foram analisados 246

animais, totalizando 984 quartos mamários, dos quais, 562 (57,1%) apresentaram mastite

subclínica, sendo os microrganismos mais prevalentes Staphylococcus spp. (36%),

Corynebacterium spp. (34,8%) e S. aureus (13,6%). O perfil de sensibilidade

antimicrobiana demonstrou que das 59 cepas de SCP isoladas de leite, 28,5% foram

resistentes, sendo os antibióticos menos eficazes a penicilina e a amoxicilina. A

caracterização das cepas de S. aureus de casos de mastite bovina pela técnica de PCR-

RFLP revelou a presença de dois perfis genotípicos, P1=750pb e P2=1000pb. Das 81 cepas

de Staphylococcus spp. isoladas de leite de vacas com mastite, 65 (80,2%) comportavam

genes toxigênicos, sendo os genes se encontrados (seg, seh, sei e sej). Com relação aos

queijos de coalho, das 10 amostras avaliadas, 90% estavam fora dos padrões permitidos

pela legislação para SCP. 18/20 das cepas de Staphylococcus spp. apresentaram os genes

tst, sec, sed, seg, seh, sei e sej. O percentual de resistência entre as cepas isoladas de queijo

foi baixo. A análise de restrição e o seqüenciamento confirmaram a presença dos genes se

nos isolados de leite e queijo. A tipagem molecular permitiu compreender o padrão de

dispersão dos S. aureus nas propriedades estudadas. A presença de cepas de Staphylococcus

spp. resistentes a antibióticos e portadoras de genes toxigênicos isoladas de amostras de

leite de vacas com mastite e queijos de coalho no Estado de Pernambuco, é preocupante

para a saúde do consumidor, por tornarem estes alimentos possíveis veículos de

intoxicações alimentares.

ABSTRACT

Bovine mastitis, characterized by the inflammation of the mamary gland, is one of

the most important diseases affecting dairy cattle worldwide. The main infectious agent

implicated in causing the disease is Staphylococcus aureus (S. aureus), a microorganism

also widely known to cause food poisoning. Another important aspect of this pathogen is its

resistance to antibiotics frequently used in veterinary and medicine practices. Since milk

and its derivatives are extensively consumed and could contain both enterotoxigenic and

resitant S. aureus, the main goal of this work is to characterize pheno- and genotypically

Staphylococcus spp. isolated from both, mastitis-affected cow’s milk, and curd cheese

from Pernambuco, Brazil. To diagnose bovine mastitis two tests were used, the “dark

bottom mug” test and the California Mastitis Test. The curd cheese samples were submitted

to microorganism isolation and counting of Coagulase Positive Sthapyloccoci (CPS) in

Baird-Parker agar medium. The Staphylococcus spp. strains isolated from both milk and

cheese samples were phenotypically characterized as S. aureus, CPS, and Coagulase

Negative Staphylococci (CNS), using Gram staining techniques, colony

morphology/staining characteristics and haemolysis in blood agar, additionally,

biochemical tests such as anaerobic glucose fermentation, aerobic and anaerobic mannitol

fermentation, and, thermonuclease, acetoin and coagulase production. The genotypic

characterization was performed using a PCR-RFLP based technique of the coa gene.

Uniplex and multiplex PCR were used to investigate the toxigenic genes, whereas cleavage

and sequencing were performed to confirm the presence of se genes. To determine the

antimicrobial resistance profile of different Staphylococcus strains, the agar diffusion assay

was employed, testing different antibiotics. In this study, were analyzed 246 animals, in a

total of 984 udders, from which 562 (57,1%) presented subclinical mastitis, with

Staphylococcus spp. (36%), Corynebacterium spp. (34,8%) e S. aureus (13,6%) being the

predominant microorganisms. The antimicrobial sensitivity profile showed that from 59

CPS strains isolated from milk, 28,5% showed resistance, and penicillin and amoxicillin

were the least efficient antimicrobials amongst the ones tested. The characterization of S.

aureus strains obtained from bovine mastitis using the PCR-RFLP technique showed two

distinct genotypic profiles, P1=750pb e P2=1000pb. Amongst the 81 different strains of

Staphylococcus spp. isolated from mastitis-affected cow’s milk, 65 (80,2%) presented

toxigenic genes, where the se genes were found (seg, seh, sei and sej). From the 10 samples

or curd cheese tested, 90% were out of the food safety regulatory standards considered for

CPS, moreover, 18/20 Staphylococcus spp. strains presented genes tst, sec, sed, seg, seh, sei

and sej. The antibiotic resistance profile among the strains isolated from curd cheese was

considered low. The restriction analysis and the sequencing were able to confirm the

presence of the se genes in the Staphylococcus spp. strains isolated from milk and cheese.

In conclusion, the molecular typing allowed understanding the standard of dispersion on the

S. aureus in the studied properties. Antibiotic resistant strains and strains presenting

toxigenic genes isolated from milk obtained from mastitis-affected cows and curd cheese

samples from the state of Pernambuco is considered a health-threatening situation for

potential consumers, due to the strong possibility of causing foodborne intoxications.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

1- INTRODUÇÃO

O leite é um alimento protéico e de grande importância para a alimentação humana,

devendo ser um produto seguro e de boa qualidade. A produção leiteira em Pernambuco

constitui-se numa das principais atividades econômicas, concentrando-se principalmente na

Região do Agreste Pernambucano, que é responsável por grande parte da produção

estadual, abastecendo as cidades locais e a Região Metropolitana do Recife.

Entre os derivados do leite destacam-se os queijos e no caso da Região Nordeste o

queijo de coalho, que é obtido por coagulação do leite por meio de coalho ou de outras

enzimas coagulantes, sendo comercializado com até dez dias de fabricação (BRASIL,

1996).

Para que o leite pasteurizado, esterilizado, queijos e outros produtos derivados

sejam consumidos pela população sem riscos à saúde é necessário que a matéria prima, no

caso, o leite cru, esteja livre de agentes nocivos para a saúde do homem. Desta forma, é

importante que haja todo um controle na cadeia de produção leiteira a começar pelo

rebanho bovino que deve estar livre de enfermidades que podem ser responsáveis pela

veiculação de agentes infecciosos.

A mastite bovina, inflamação da glândula mamária, causa grandes perdas

econômicas na criação do gado leiteiro (CREMONESI et al., 2006). O leite e derivados têm

sido implicados em surtos de toxinfecções alimentares (BUYSER et al., 2001; VERAS et

al., 2003) podendo estar associados a doenças dos animais de produção, como a mastite que

tem como principais agentes etiológicos, bactérias, principalmente, do gênero

Staphylococcus (FUEYO et al., 2005).

O Staphylococcus aureus (S. aureus), é um dos mais importantes microrganismos

causadores de intoxicações alimentares, assumindo relevância para a Saúde Pública, em

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

virtude do risco potencial de sua veiculação ao homem através do leite e derivados, que

podem conter enterotoxinas termoestáveis pré-formadas nestes alimentos (SENA, 2000).

A intoxicação alimentar estafilocócica é caracterizada por náuseas, vômito, mal-

estar e debilidade geral, diarréia aquosa não sangüinolenta e dor abdominal. Pode ocorrer

desidratação resultante de significativa perda de líquido, sudorese e cefaléia, mas não se

observa febre elevada. Os sintomas começam a manifestar-se aproximadamente quatro

horas após o consumo do alimento contaminado (MURRAY et al., 1992).

Cinco tipos antigênicos “clássicos” de enterotoxinas estafilocócicas (SEs) foram

relatados (SEA, SEB, SEC, SED e SEE) (DINGES et al., 2000). Na década de noventa

“novas” SEs (SEG, SEH, SEI e SEJ) foram descritas, bem como seus respectivos genes

(REN et al., 1994; MUNSON et al., 1998; ZHANG et al., 1998). Recentemente, após a

análise parcial ou total do genoma do Staphylococcus, o “alfabeto” das SEs aumentou com

a identificação de novos genes que codificam para as enterotoxinas SEK, SEL, SEM, SEN,

SEO, SEP, SEQ, SER e SEU (FITZGERALD et al., 2001; JAURRAD et al., 2001;

KURODA et al., 2001; ORWIN et al., 2001, 2002, 2003; LETERTRE et al., 2003; OMOE

et al., 2003).

A caracterização sorológica das enterotoxinas pode ser dificultada por causa dos

baixos níveis de produção, dificuldade associada com a purificação e a falta de métodos

simples e rápidos para detecção (SU e WONG, 1995). Com a disponibilidade da

informações sobre a sequência de DNA das SEs (REN et al., 1994; SU e WONG, 1995,

1997; MCLAUCHLIN et al., 2000), a PCR tornou-se um método alternativo para a

detecção dos genes destas toxinas (BECKER et al., 1998).

Um dos principais indicadores de enterotoxigenicidade é o teste da coagulase,

porém alguns estafilococos coagulase negativa enterotoxigênicos foram encontrados (UDO

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

et al., 1999; RAPINI et al., 2003), sendo estes achados importantes para a Saúde Pública, já

que a legislação brasileira não especifica padrões para estes microrganismos, restringindo-

se apenas, a descrever valores para espécies coagulase positivas (SENA, 2000).

A produção da enzima coagulase é um dos critérios usados para identificação de S.

aureus. Embora o teste da coagulase em tubo seja o teste padrão, várias cepas não são

tipadas por essa técnica (AARESTRUP et al.,1995). Em vista disso, análises moleculares

do gene da coagulase estão sendo empregadas como teste de caráter definitivo (VIEIRA-

DA-MOTA et al., 2001).

A análise do gene da coagulase (coa) através da PCR tem sido aplicada para

subdividir as amostras de S. aureus baseada no polimorfismo do gene coa, utilizando

iniciadores específicos que geram fragmentos de diferentes tamanhos dependendo da

amostra (VIEIRA-DA-MOTA, 2001).

Outro aspecto importante é a presença de resíduos de antibióticos que pode

interferir diretamente na qualidade do leite e nos processos industriais, inibindo culturas

sensíveis, utilizadas na fabricação de iogurtes. Além disso, pode constituir um problema de

saúde pública, levando ao aumento de bactérias resistentes a tratamentos por antibióticos.

A contaminação é decorrente do tratamento de vacas em lactação acometidas por

mastite, metrite ou outra doença infecciosa (CARRARO et al., 2003). Além de haver

evidências de que o tratamento indiscriminado de animais com antibióticos torne seus

produtos e derivados, fontes para resistência aos antibióticos na espécie humana

(OLIVEIRA et al., 2002).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Desta forma, este estudo teve como finalidade verificar a qualidade do leite de vacas

com mastite subclínica e de queijos de coalho produzidos no Estado de Pernambuco,

quanto à presença de Staphylococcus spp. portadores de genes toxigênicos e resistentes a

antibióticos.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

2-REVISÃO DE LITERATURA

2.1 LEITE

Segundo o regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem

Animal-RIISPOA, artigo 475, “entende-se por leite, sem outra especificação, o produto

oriundo da ordenha completa e ininterrupta, em condições de higiene, de vacas sadias, bem

alimentadas e descansadas” (BRASIL, 1997).

É importante assinalar que o leite de vaca, depois do leite materno, é o alimento

mais equilibrado e completo de que dispõe o ser humano (BLANC, 1974).

Basicamente, o leite, para ser caracterizado como de boa qualidade deve apresentar

algumas características organolépticas, nutricionais, físico-químicas e microbiológicas

como: sabor agradável, alto valor nutritivo, ausência de agentes patogênicos e

contaminantes (antibióticos, pesticidas, adição de água e sujidades), reduzida contagem de

células somáticas e baixa carga microbiana (FONSECA e SANTOS, 2001).

O leite apresenta um grande valor econômico e um valor alimentar inestimável na

nutrição humana (FERREIRO et al., 1980). Está presente na alimentação de indivíduos de

todas as idades e classes sociais destacando-se, principalmente, na dieta de crianças e

idosos (FRANCO et al., 2000).

Devido a sua constituição, o leite torna-se um excelente meio para o

desenvolvimento de microrganismos deteriorantes e patogênicos (CHEN e HOTCHKESS,

1993). Estes microrganismos podem contaminar o leite durante ou após a ordenha e

conseqüentemente os derivados de leite, os quais podem ainda sofrer contaminação durante

processamento e estocagem, principalmente nos casos em que há grande manipulação do

produto (NOUT, 1994).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

O leite ao ser secretado no interior da glândula mamária é praticamente estéril,

porém, contamina-se durante seu percurso em direção ao exterior do úbere com

microrganismos saprófitas componentes da microbiota normal do animal (LERCHE, 1969).

Podendo apresentar uma variedade de microrganismos patogênicos em decorrência de

processos inflamatórios do úbere ou de enfermidades no rebanho.

Os microrganismos contaminantes do leite após a ordenha, provenientes de

equipamentos e utensílios, do meio ambiente e mesmo do pessoal responsável pela

obtenção e manipulação do leite, são os mais importantes sob o ponto de vista tecnológico,

pois podem causar alterações indesejáveis, comprometendo sua qualidade e de seus

derivados, podendo, inclusive chegar a torná-los inaproveitáveis para o consumo humano

(OLIVEIRA, 1986).

Entre os microrganismos que podem contaminar o leite e seus derivados, o

Staphylococcus spp. tem sido considerado um dos mais freqüentemente envolvidos em

surtos de intoxicação alimentar, juntamente com Salmonella spp. e Escherichia coli

(DAVIS e WILBEY, 1990; BUYSER et al., 2001). É considerada uma das mais

importantes bactérias causadoras de doenças de origem alimentar (GENIGEORGIS, 1989;

VERAS et al., 2003).

O leite e seus derivados são amplamente consumidos no Brasil. Podem causar

doenças de origem alimentar quando contaminados por amostras enterotoxigênicas de S.

aureus, Staphylococcus coagulase positiva (CARMO et al., 1995, 1996) ou Staphylococcus

coagulase negativa (SENA, 2000; VERAS et al., 2003).

Surtos de intoxicação estafilocócicas associados ao leite e produtos lácteos têm sido

relatados tanto em países desenvolvidos como em países em desenvolvimento. No Brasil,

no Estado de Minas Gerais, no período de 1997 a 2002 leite e derivados foram envolvidos

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

em surtos de toxinfecção alimentar sendo Staphylococcus o principal agente envolvido

(VERAS et al., 2003). No Reino Unido, Wieneke et al. (1993) relataram a ocorrência de

359 casos de intoxicação alimentar devido a enterotoxina estafilocócica no período de 1969

a 1990. Do total de casos, 8% ocorreram devido à ingestão de leite e derivados

contaminados.

Alguns estudos realizados no Brasil têm demonstrado alta contaminação de leite e

derivados por S. aureus (CARMO et al., 1994; CERQUEIRA et al., 1994; SANTOS et al.,

1995; SENA et al., 1998; SENA, 2000). Araújo (1984) ao analisar 100 amostras de leite cru

no município de Niterói, verificou que 50% apresentaram-se positivas para S. aureus, sendo

que 48% das amostras positivas apresentaram contagens variando de 10

a valores

superiores a 10

UFC/mL. Santos et al. (1981) ao analisarem 78 amostras de leite cru em

Minas Gerais, observaram que 46,9% estavam contaminados por este agente em contagens

variando de 3,0 x 10

a 9,8 x 10

UFC/mL e em Goiânia, Mesquita (1988) detectou este

microrganismo em 71,4% das amostras de leite cru examinadas.

A contaminação do leite inicia-se nas fazendas, durante ou após a ordenha, sendo

resultado de deficiências da higienização do meio ambiente e dos utensílios, doenças do

rebanho e do homem. As dificuldades de transporte e as falhas durante os processos de

beneficiamento e estocagem do leite também podem interferir na sua qualidade (BORGES

et al., 1978). O controle deficiente em qualquer uma destas etapas pode causar sérios

problemas.

A garantia da qualidade do leite, principalmente para evitar veiculação de agentes

infecciosos ao homem, se inicia com o atestado sanitário da vaca, do ordenhador, das

condições sanitárias do ambiente em que as vacas são ordenhadas, do equipamento usado

na coleta e transporte do leite. Depende ainda, das condições higiênico-sanitárias durante a

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

produção, do tratamento térmico, da temperatura de armazenamento do leite na

propriedade, durante o transporte até a indústria, assim como os cuidados na rede de

distribuição e no consumo (SANTOS et al., 1981).

2.2 QUEIJO DE COALHO

A qualidade do leite é de fundamental importância para a produção de queijos e os

processos de fabricação compreendem métodos que transformam grande parte dos

componentes do leite num produto de fácil conservação, com menor quantidade de água,

grande valor nutritivo, sabor agradável e de fácil digestão (AQUINO, 1983; CABRAL,

1993).

A produção de queijo de coalho no Brasil, acontece principalmente na região

Nordeste, nos estados da Paraíba, Ceará, Rio Grande do Norte e Pernambuco, onde o

produto é tradicional e portanto bastante consumido (LEITE JÚNIOR et al., 2000).

Segundo o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade deste produto, seu

processamento consiste na coagulação do leite por meio do coalho ou outras enzimas

coagulantes apropriadas, complementadas ou não pela ação de bactérias lácteas

selecionadas (BRASIL, 2001). No entanto, este produto por vezes é processado de modo

artesanal, não possuindo padrão (PINHEIRO et al., 2004).

O queijo de coalho produzido em Pernambuco artesanalmente, de acordo com

Morais (1995), tem como processamento a recepção do leite integral cru, filtração, adição

do coalho, coagulação, quebra da coalhada, dessoragem parcial, enformagem, prensagem

manual, prensagem mecânica, salga seca, desenformagem, lavagem do produto e consumo.

Produzido a partir de leite cru integral, o queijo de coalho tipo B, é obtido de vacas

sãs, ordenhadas em local próximo da fabricação, de produção leiteira do próprio

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

estabelecimento, com produção diária inferior a 10kg, não devendo ser transportado a

distâncias superiores a 500 metros. O queijo de coalho tipo A, é definido como aquele

produzido com leite integral ou desnatado, pasteurizado, massa crua prensada,

suficientemente dessorada, salgada e maturada (PERNAMBUCO, 1992).

O segmento de laticínios tem grande relevância para a economia do país porque

contribui com cerca de 10% do faturamento global da indústria brasileira de alimentos.

Entretanto, toda esta grandeza é fortemente ameaçada pelo mercado informal ou

clandestino que não passa por fiscalização oficial e é hoje sustentado por quase a metade

dos 21 bilhões de litros/ano produzidos em nosso país (MORENO et al., 2004).

O queijo de coalho, por ser elaborado, em quantidade considerável, a partir de leite

cru e sem os devidos cuidados de higiene, em pequenas propriedades rurais ou em

pequenas indústrias que não adotam as Boas Práticas de Fabricação, não apresenta

segurança microbiológica e padronização da qualidade (FEITOSA et al., 2003), podendo

causar intoxicações alimentares (RITTER et al., 2001).

A pasteurização do leite tanto para consumo in natura como para a produção de

creme e queijos reduz os riscos de toxinfecções alimentares, entretanto, falhas durante o

processamento e comercialização do queijo podem favorecer a incorporação de matérias

estranhas (sujidades) de origem biológica ou não. A contaminação microbiana de queijos

assume destacada relevância em Saúde Pública ao se considerar que bactérias

enterotoxigênicas e patogênicas como S. aureus e Salmonella são comumente encontradas

em derivados lácteos (PERESI et al., 2001).

Alguns estudos realizados (SANTOS et al., 1995; PAIVA e CARDONHA, 1999;

NASSU et al., 2000) sobre a qualidade microbiológica do queijo de coalho relataram

ocorrência de microrganismos patogênicos e contagens de microrganismos deteriorantes

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

em números que excedem, às vezes, os limites estabelecidos pela legislação (BRASIL,

1996; BRASIL, 2001) e as bactérias patogênicas detectadas com maior freqüência eram

Staphylococcus aureus, Salmonella e Listeria monocytogenes.

2.3 MASTITE BOVINA

2.3.1 Conceito e Classificação

A inflamação da glândula mamária recebe a denominação de mamite (do latim

Mamma = mama) ou de mastite (do grego Mástos = mama) (SANTOS, 1986). Foi descrita

pela primeira vez por Baby du Brassac em 1814 (COSTA, 1991). É uma doença complexa

havendo diferentes causas e graus de intensidade (SCHALM et al., 1971).

A mastite pode ser de etiologia traumática, tóxica, alérgica, metabólica e infecciosa

(COSTA, 1991), sendo as inflamações infecciosas as principais, dentre as quais destacam-

se as de origem bacteriana (SANTOS, 1986), como as causadas por estafilococos que

podem atravessar o canal do teto, colonizar o sistema de ductos, os alvéolos e causar uma

resposta inflamatória (OTERO e CRUZ, 1992; RAINARD, 2005) (Figura 1).

A mastite se constitui num processo inflamatório da glândula mamária, de evolução

aguda ou crônica. Pode se apresentar na forma clínica ou subclínica, conforme se evidencie

ou não sinais de inflamação (CENTORBI et al., 1992).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Figura 1- Infecção da glândula mamária por Staphylococcus spp. Fonte: Rainard, 2005.

A mastite pode ser dividida em dois grupos, quanto a sua forma de manifestação.

Denomina-se mastite clínica, os casos da doença em que existem sinais clínicos evidentes

como: edema, aumento da temperatura, endurecimento e dor na glândula mamária e ou

aparecimento de grumos, pus ou qualquer outra alteração das características do leite. Outra

forma de manifestação da doença é chamada mastite subclínica, que se caracteriza por

alterações na composição do leite, tais como aumento na Contagem de Células Somáticas

(CCS), aumento nos teores de Cl, Na

e proteínas séricas, e diminuição nos teores de

caseína, lactose e gordura do leite. É importante frisar que, nesse tipo de mastite, não

existem sinais clínicos evidentes da doença, portanto, não é possível diagnosticá-la sem a

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

utilização de testes auxiliares. Dessa forma, o sinal clássico da mastite subclínica é a

elevação da CCS, que pode ser detectado com o auxílio de testes de diagnóstico como o

California Mastitis Test (CMT) e a Contagem Eletrônica de Células somáticas (CECS)

(FONSECA e SANTOS, 2001).

Ressalta-se que a mastite subclínica apresenta prevalência muito maior que a clínica

(Figura 2) e que no Brasil, a maioria dos casos de mastite que afetam quartos mamários dos

bovinos leiteiros são da forma subclínica (BRABES et al., 1999; SANTOS et al., 2003;

FREITAS et al., 2005).

Figura 2- Esquema demonstrando proporção entre animais de um rebanho com mastite

clínica, subclínica e sadios. Fonte: Fonseca e Santos (2001)

A forma subclínica apresenta uma maior importância epidemiológica, pois pode

disseminar-se silenciosamente pelo rebanho sem que sejam percebidas alterações

macroscópicas à inspeção do úbere ou do leite (BLOOD e RADOSTITIS, 1991). Tem

grande importância devido à ação prejudicial sobre a quantidade e qualidade do leite

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

produzido pelos quartos infectados, além da dificuldade na sua detecção (VIANNI et al.,

1992).

Existe uma outra grande divisão conceitual da mastite. Esta se refere ao tipo de

agente causador, que pode ser ambiental ou contagioso. Dessa forma, a mastite pode ser

contagiosa e ambiental (RADOSTITS et al., 2002).

A mastite contagiosa caracteriza-se por apresentar baixa incidência de casos clínicos

e alta incidência de casos subclínicos, geralmente de longa duração ou crônicos e

apresentando alta contagem de células somáticas (CCS). Esse tipo de mastite é causada por

patógenos cujo habitat preferencial é o interior da glândula mamária e a superfície da pele

dos tetos e é transmitida principalmente durante a ordenha. A mastite ambiental é causada

por agentes que vivem preferencialmente no habitat da vaca, em locais que apresentam

esterco, urina, barro e camas orgânicas. A mastite ambiental caracteriza-se por alta

incidência de casos clínicos, geralmente de curta duração (FONSECA e SANTOS, 2001).

A mastite contagiosa é transmitida quase exclusivamente durante a ordenha e para

que haja a transmissão é necessário que exista um elemento de ligação entre um quarto

infectado e um sadio. Segundo Amaral et al. (2004) a ordenhadeira mecânica, a mão do

ordenhador, práticas de higiene e lesões nos tetos são fatores importantes que expõem a

superfície dos tetos aos microrganismos patogênicos contagiosos sendo esses

microrganismos transmitidos de animais infectados para não infectados durante o processo

de ordenha.

A forma subclínica é importante devido a uma maior prevalência nos rebanhos,

ocorrendo 15 a 40 vezes mais que a forma clínica, é de difícil detecção e longa duração,

tornando-se os animais reservatórios de microrganismos para o rebanho (DE SÁ et al.,

2000).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

A mastite causada por patógenos ambientais, apesar de menor ocorrência, é muito

importante por ser de difícil tratamento podendo ocorrer morte do animal, como resultado

de septicemia ou toxemia (BARTLETT et al., 1992). O reservatório primário destes

patógenos ambientais é o ambiente da vaca leiteira, enquanto o reservatório primário dos

patógenos contagiosos é a glândula mamária infectada (GARINO JÚNIOR et al., 2000).

2.3.2 Etiologia

Diversos microrganismos podem estar envolvidos como bactérias, vírus, fungos

filamentosos, leveduras e algas. Dentre os agentes etiológicos, as bactérias têm maior

incidência, constituindo cerca de 80% a 90% dos casos, dentre as quais as mais comuns

são: S. aureus, Staphylococcus spp., Streptococcus agalactie, Streptococcus dysgalactie e

Streptococcus uberis, Corynebacterium spp., Escherichia coli, Nocardia spp. entre outras

(BRABES et al., 1999).

Brito et al. (1997), relataram que 135 diferentes espécies, subespécies e sorotipos de

microrganismos podem ser isolados do leite de vacas com mastite, sendo que a maioria das

infecções é de origem bacteriana e cerca de 90% de todos os casos ocorrem devido a um

reduzido número de espécies, destacando-se aquelas dos gêneros Streptococcus spp.,

Staphylococcus spp. e Corynebacterium spp. (FONSECA e SANTOS, 2001).

A plurietiologia da mastite é um fator complicador para o seu controle e tratamento

(LANGONI et al., 1998). Os agentes mais envolvidos na gênese desta doença, tanto no

Brasil como em outros países, são os estafilococos e estreptococos (DA SILVA et al., 1983;

LANGENEGGER et al., 1986; LANGONI et al., 1991; QUIN et al., 1994; FREITAS et al.,

2005).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Microrganismos que causam mastite são geralmente classificados como contagiosos

e ambientais baseados em seus reservatórios primários e modo de transmissão. S. aureus e

Streptococcus agalactiae são patógenos contagiosos e são comumente transmitidos entre as

vacas por contato com leite infectado. Os patógenos ambientais incluem dois grandes

grupos de bactérias: os coliformes, onde as pricipais espécies são Escherichia coli e

Klebsiella e o grupo dos estreptococos, exceto a espécie S. agalactiae. Estas bactérias

ambientais provêm do ambiente onde a vaca vive, alcançando o úbere entre as ordenhas,

quando os tetos são expostos à lama, esterco e outros materiais contaminados

(CREMONESI et al., 2006).

Entre os patógenos que causam mastite, o S.aureus é um dos três principais

microrganismos, sendo responsável por casos de difícil tratamento através da utilização de

antibióticos (RAINARD, 2005).

2.3.3 Diagnóstico

O exame físico do úbere deve ser feito por palpação da glândula mamária, e o

momento mais adequado para esse procedimento é imediatamente após a ordenha, com o

úbere vazio (FONSECA e SANTOS, 2001).

A avaliação das caracterísitcas físicas do leite deve ser realizada imediatamente

antes da ordenha, sendo vulgarmente conhecido como teste da caneca de fundo preto. Esse

teste consiste na retirada dos 3 a 4 primeiros jatos de leite, contrastando-os com uma

superfície de fundo preto, com a finalidade de observar a presença de alterações no leite,

tais como grumos ou coágulos, pus, sangue ou leite aquoso, servindo para o diagnóstico da

mastite clínica (FONSECA e SANTOS, 2001).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Para o diagnóstico da mastite subclínica o California Mastitis Test (CMT),

desenvolvido por Schalm e Noorlander (1957) é um dos testes mais populares e práticos.

Seu princípio baseia-se na estimativa da contagem de células somáticas no leite. Para tal,

utiliza-se um detergente aniônico neutro que atua rompendo a membrana das células

presentes na amostra de leite e liberando o material nucléico (DNA), o qual apresenta

viscosidade. Desta forma, o resultado do teste é avaliado em função do grau de

gelatinização ou viscosidade da mistura de partes iguais leite e reagente, sendo o teste

realizado em bandeja apropriada.

A análise microbiológica do leite permite um diagnóstico preciso das mastites. Não

é praticado rotineiramente por ser oneroso, porém, é o único método que revela o agente

etiológico específico , permitindo escolher a terapêutica e profilaxia adequada após testes

de sensibilidade antimicrobiana (CORRÊA e CORRÊA, 1992).

2.3.4 Perdas Econômicas

A mastite é considerada a principal doença que afeta os rebanhos leiteiros no

mundo. Estima-se que as perdas anuais sejam de cerca de US$ 184, por vaca

(CREMONESI et al., 2006). Já no Brasil, pode-se deduzir que, em função da alta

prevalência de mastites nos rebanhos, possa ocorrer perda de produção entre 12% e 15%, o

que significa um total de 2,8 bilhões de litros/ano em relação à produção anual de 21

bilhões de litros. Desse total, 70% são atribuídos à mastite subclínica, enquanto os 30%

restantes são relativos à mastite clínica. Nesse total, estão incluídas as perdas devido à

diminuição na produção de leite, que é responsável por 66% do total das perdas, visto que

há uma diminuição da ordem de 15% na produção de leite das vacas infectadas, gastos com

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

medicamentos, leite descartado, serviços veterinários, descarte prematuro de animais e

diminuição no valor comercial destes (FONSECA e SANTOS, 2001).

Esta afecção reduz a quantidade e a qualidade do leite, diminuindo os teores de

lactose, cálcio, fósforo, caseína, gordura e sólidos, enquanto aumenta proteínas plasmáticas,

cloretos, sódio, ácidos graxos livres e células somáticas. Além disso, a mastite clínica,

principalmente, aumenta o risco de resíduos de antimicrobianos no leite, pela necessidade

de estabelecer-se tratamento imediato, mesmo dos animais em lactação. Portanto, além do

prejuízo diretamente relacionado ao processo inflamatório, acrescentam-se o custo com

medicamentos, aumento do labor da mão-de-obra e tempo de descarte do leite após

tratamento, até a total eliminação dos resíduos de antibióticos utilizados (COSTA, 1999).

2.4 USO DE ANTIMICROBIANOS

A resistência a antibióticos e outras drogas antimicrobianas continua a ser um dos

grandes problemas da medicina atual. Hoje, o desenvolvimento de resistência por certas

bactérias patogênicas é mais rápido que a capacidade da indústria para produzir novas

drogas. Entre as bactérias que voltam a se tornar perigosas destaca-se o Staphylococcus

aureus, um poderoso agente de infecção hospitalar (SOUZA, 1998).

O uso de antimicrobianos na prática veterinária para tratamento e profilaxia de

agentes infecciosos em adição ao uso de antimicrobianos como promotores de crescimento,

influenciam grandemente a prevalência de bactérias resistentes em animais contribuindo

para o risco da emergência de resistência em patógenos humanos (SHAH et al., 1993;

BARBER, 2001; MCDERMOTT et al., 2002).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Evidências diretas indicam que o uso de antimicrobianos em animais seleciona

bactérias resistentes que podem ser transferidas para humanos através dos alimentos ou

contato direto com os animais (AARESTRUP, 1999). Segundo Rajala-Schultz et al. (2004)

as bactérias resistentes que são encontradas em animais produtores de alimentos, podem

contaminar os produtos alimentícios e serem transferidas para humanos através da cadeia

alimentar.

O S. aureus além de ser considerado um poderoso agente de infecção hospitalar

vem apresentando resistência a vários antibióticos, por isso, é importante a realização de

testes de sensibilidade antimicrobiana para cepas isoladas de leite de vaca, pois de acordo

Sena (2000) na bovinocultura de leite a utilização de medicamentos, principalmente no

tratamento de doenças como a mastite está muito difundida.

No Brasil, é comum o uso indiscriminado de medicamentos sem a realização de

testes preliminares de sensibilidade in vitro e às vezes, até subdosagens, sujeitando-se a

glândula mamária a tratamentos inadequados que podem ocasionar agravamento do

processo, perdas econômicas e propiciar o desenvolvimento de resistência microbiana

(CULLOR, 1993).

A produção leiteira vem baseando-se principalmente na terapêutica alopática, e o

aumento do uso de antibióticos ocorre em função da persistência de certos microrganismos

resistentes. Dentre eles o S. aureus é um dos mais patogênicos e causa uma infecção

geralmente crônica diminuindo gradativamente a produção leiteira, sendo de difícil controle

uma vez que apresenta geralmente resistência à penicilina e outros antibióticos

(LANGENEGGER et al., 1981; COSTA et al., 2000; BENITES et al., 2002).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

A utilização de antimicrobianos para o tratamento da mastite clínica ou da mastite

subclínica no início do período seco é um componente importante dos programas de

controle (BRAMLEY et al., 1996). A seleção do antimicrobiano apropriado é essencial,

tanto do ponto de vista da saúde do animal, quanto da produtividade da glândula mamária.

Os resultados dos testes de sensibilidade antimicrobiana ajudam o veterinário clínico na

escolha do medicamento apropriado (FRANCIS, 1989; SUMANO e OCAMPO, 1992;

FREITAS et al., 2005), além de reduzir os riscos do aparecimento de bactérias resistentes.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

2.5 EXOTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS

Artigo publicado na revista Ciência Veterinária nos Trópicos, Recife-PE, v.7, n. 2 e

3, p. 63-74, maio/dezembro de 2004

RESUMO

Staphylococcus aureus produz uma grande variedade de exotoxinas: as

Enterototoxinas Estafilocócicas (SEs) que causam intoxicação alimentar estafilocócica,

resultante do consumo de alimentos contendo SEs pré-formadas, Toxina Esfoliativa (ET)

causadora da síndrome da pele escaldada, principalmente em crianças, e a Toxina-1 da

Síndrome do Choque Tóxico (TSST-1), caracterizada por febre, hipotensão, envolvimento

multiorgânico e descamação da pele. Devido à importância desta bactéria para a saúde

pública objetivou-se com este trabalho revisar os principais aspectos das exotoxinas

estafilocócicas, dando ênfase à caracterização bioquímica, genética e aos métodos de

detecção destas toxinas.

Termos de Indexação: Staphylococcus aureus; Exotoxinas; Saúde Pública

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

STAPHYLOCOCCAL EXOTOXINS

ABSTRACT

Staphylococcus aureus produces a large variety of exotoxins: staphylococcal

enterotoxins (SEs) which cause staphylococcal food poisoning, resulting from the

consumption of food containing preformed SEs, Exfoliative Toxin (ET) responsible for the

staphylococcal scalded-skin syndrome, mainly in children, and the Toxic Shock Syndrome

Toxin 1 (TSST-1) characterized by high fever, hypotension, multiorgan involvement and

desquamation of the skin. Because of the importance of this microorganism for the public

health, the aim of this study was to review the mainly aspects about staphylococcal

exotoxins, including biochemical, genetics and diagnostic characterization.

Index Terms: Staphylococcus aureus; Exotoxins; Public Health

INTRODUÇÃO

Na medicina humana e medicina veterinária o Staphylococcus aureus é responsável

por várias afecções que acometem desde tecido cutâneo até infecções sistêmicas, com

destaque nos animais para a infecção da glândula mamária. Assume grande importância na

microbiologia de alimentos como agente de intoxicações alimentares devido à produção de

enterotoxinas termoestáveis, servindo como indicador higiênico-sanitário na indústria

alimentícia, visto que o manipulador de alimentos é a principal fonte e veículo deste

microrganismo.

Toxinas são comumente substâncias de origem protéica produzidas por alguns

microrganismos e que contribuem para sua patogenicidade. São classificadas em exo e

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

endotoxinas (KONEMAN et al., 2001). As exotoxinas são proteínas ou enzimas produzidas

no interior de algumas bactérias Gram-positivas, decorrentes da multiplicação e

metabolismo, dos microrganismos. Classicamente são agrupadas em três tipos, de acordo

com seu modo de ação: citotoxinas, que destroem as células do hospedeiro ou afetam suas

funções; neurotoxinas, que interferem com a transmissão normal de impulsos nervosos; e

enterotoxinas, que afetam as células que revestem o trato gastrintestinal. As endotoxinas

correspondem a porção externa da parede celular (lipopolissacarídeos) das bactérias Gram-

negativas, que são liberadas após a morte bacteriana ou mesmo a lise da parede celular

(TORTORA et al., 2002).

As principais exotoxinas produzidas pelos estafilococos são: as enterotoxinas,

sorologicamente identificadas como SEA, SEB, SEC1-3, SED, SEE, SEG, SEH, SEI, SEJ

(CARMO et al., 2002), SEK (ORWIN et al., 2001) e, recentemente SEL (ORWIN et al.,

2003), SEM, SEN, SEO (LOIR et al., 2003) e SEU (LETERTRE et al., 2003); a Toxina-1

da Síndrome do Choque Tóxico (BERGDOLL et al., 1981) e a Toxina Esfoliativa dos tipos

A, B (LEE et al., 1987) C (SATO et al., 1994) e D (YAMAGUCHI et al., 2002).

As enterotoxinas estafilocócicas (SEs) podem ser detectadas in vitro ou pelas suas

atividades biológicas in vivo. No entanto, por motivos práticos, a detecção de rotina é

realizada por métodos imunológicos como imunodifusão, radioimunoensaio (RIA),

aglutinação em látex, imunobloting e ensaios imunoenzimáticos (ELISA - Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay). Um método alternativo para verificar a capacidade

enterotoxigênica de linhagens de estafilococos é a detecção específica de genes de toxinas

através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR - Polimerase Chain Reaction). Porém,

segundo Mclauchlin et al. (2000), apenas a presença desses genes não indica,

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

necessariamente, a capacidade do microrganismo de produzir toxina biologicamente ativa

suficiente para induzir manifestações clínicas de doença.

O GÊNERO Staphylococcus

De acordo com Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (1986) a família

Micrococacceae inclui quatro gêneros: Planococcus, Micrococcus, Stomatococcus e

Staphylococcus. Na atualidade, segundo Koneman et al. (2001), o gênero Staphylococcus é

composto por 33 espécies.

No homem, a espécie Staphylococcus aureus (S. aureus) é causadora de infecções

cutâneas como furunculoses, impetigo e abscessos (MURRAY et al., 1992), infecções

orgânicas incluindo osteomielite, endocardite e artrites (SPICER, 2002), intoxicações

alimentares (VERAS et al., 2003), síndrome da pele escaldada (LADHANI et al., 1999) e

síndrome do choque tóxico (DINGES et al., 2000).

Os estafilococos também secretam um grupo de enzimas e citotoxinas que incluem

quatro hemolisinas (alfa, beta, gama e delta), nucleases, proteases, lipases, hialuronidase e

colagenase (DINGES et al., 2000), além de outras enzimas como catalase, fibrinolisina,

coagulase e beta-lactamase (SPICER, 2002). A produção destas enzimas e citotoxinas é

regulada por elementos genéticos como plasmídios, transposons e profagos, considerados

importantes fatores de virulência nas infecções estafilocócicas no homem e nos animais

(NOVICK et al., 2001).

INTOXICAÇÃO ALIMENTAR ESTAFILOCÓCICA

As enterotoxinas produzidas e liberadas pelos estafilococos durante sua

multiplicação nos alimentos são termoestáveis (SILVA JÚNIOR, 1997), o que indica que a

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

temperatura de cozimento dos alimentos não interfere na atividade biológica das SEs,

possibilitando a instalação de quadros de intoxicação alimentar no homem. Giletto e Fyffe

(1998) assinalam que as intoxicações estafilocócicas afetam 1,2 milhões de pessoas

anualmente, resultando numa perda econômica de 1,5 bilhões de dólares.

A intoxicação alimentar estafilocócica é caracterizada clinicamente por náuseas,

vômito, mal-estar, debilidade geral, diarréia aquosa não sanguinolenta e dor abdominal.

Pode resultar em desidratação decorrente da perda significativa de líquido, sudorese e

cefaléia, geralmente não acompanhada de estado febril. Os sintomas começam a

manifestar-se aproximadamente quatro horas após o consumo do alimento contaminado

(MURRAY et al., 1992). A pele e a mucosa do homem atuam como reservatórios de

estafilococos, resultando em importante fonte de veiculação destes microrganismos para os

alimentos (RAPINI et al., 2004). Nos animais domésticos, S. aureus é considerado o

principal agente das infecções em glândula mamária (LIM et al., 2004).

A gastroenterite estafilocócica é causada pela ingestão de alimentos contendo uma

ou mais enterotoxinas. Estima-se que de 100ng a 1µg são eficientes para produzir a doença

em indivíduos susceptíveis (BERGDOLL, 1990). Para que ocorra a produção mínima de

enterotoxina estafilocócica no alimento é necessário que haja condições adequadas de

temperatura e pH para a multiplicação dos estafilococos, até contagens de 10

UFC/g de

alimento (MOSSEL e GARCIA, 1975). No entanto, Carmo e Bergdoll (1990) e Cunha

Neto et al. (1999) detectaram enterotoxinas estafilocócicas em alimentos com níveis de

contaminação estafilocócica entre 10

a 10

UFC/g e 10

a 10

UFC/g, respectivamente.

Em surtos de Enfermidades Transmitidas por Alimentos (ETAs) investigados pelos

laboratórios de saúde pública do Estado de São Paulo, entre 1994 e 1998, Gelli et al. (1999)

verificaram que das amostras analisadas em 776 surtos o agente causal foi identificado em

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

400 deles, dos quais S. aureus foi o mais prevalente (43,7%), demonstrando sua

importância para a saúde pública.

Estudos epidemiológicos sobre toxinfecções alimentares envolvendo leite e

derivados no Estado de Minas Gerais, no período entre 1997 e 2002, revelaram que dentre

os produtos lácteos envolvidos nos surtos, o queijo ocupava lugar de destaque e S. aureus,

S. epidermidis, S. cohii, S. sciuri e S. lugdunensis foram as espécies de Staphylococcus

mais prevalentes, das quais foram detectadas as enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e

TSST-1 (VERAS et al., 2003).

Um dos principais indicadores de enterotoxigenicidade de estafilococos é o teste da

coagulase. Contudo, alguns autores isolaram estafilococos coagulase negativa

enterotoxigênicos das mãos de manipuladores de alimentos, leite e derivados (UDO et al.,

1999; SENA, 2000). Estes resultados trazem reflexos importantes para a saúde pública,

visto que a legislação brasileira não especifica padrões para estes microrganismos,

restringindo-se apenas, a descrever valores para espécies coagulase positivas (SENA,

2000).

ENTEROTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS (SEs)

As enterotoxinas são produzidas predominantemente por S. aureus. No entanto,

outras espécies coagulase-positivas, incluindo Staphylococcus intermedius e

Staphylococcus hyicus, têm sido apontadas como enterotoxigênicas (SENA, 2000), bem

como espécies coagulase negativas (RAPINI et al., 2003). Estas toxinas são resistentes à

hidrólise pelas enzimas gástricas e jejunais. A termo-estabilidade é observada pela

viabilidade após aquecimento à 100

C durante 30 minutos (MURRAY et al., 1992) e as

temperaturas de pasteurização lenta e rápida (FRANCO e LANDGRAFF, 2000). Isto

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

pressupõe que as atividades biológicas das enterotoxinas estafilocócicas permanecem

inalteradas, mesmo após o processamento térmico usual dos alimentos (HOLECKOVÁ et

al., 2002).

As enterotoxinas estafilocócicas pertencem à família denominada de toxinas

pirogênicas (PT), originada de espécies de estafilococos e estreptococos. Nesta família

também são incluídas a TSST-1, a toxina esfoliativa tipos (A e B) e as exotoxinas

pirogênicas estreptocócicas (SPE) que apresentam determinadas estruturas, funções e

seqüências de nucleotídeos similares (BALABAN e RASOOLY, 2000). Causam

imunossupressão e a proliferação inespecífica de células T que são atividades atribuídas aos

superantígenos (LOIR et al., 2003). Porém, entre estes, apenas SEs têm atividade emética

(DINGES et al., 2000).

As enterotoxinas têm sido classificadas em cinco tipos sorológicos SEA, SEB, SEC,

SED e SEE. Porém novas enterotoxinas já foram descritas na literatura, incluindo SEG,

SEH, SEI, SEJ, SEL, SEM, SEN, SEO, SEU (REN et al., 1994; SU e WONG, 1995;

MUNSON et al., 1998; ZHANG et al., 1998; JAURRAD et al., 2001; ORWIN et al., 2001,

2003; LETERTRE et al., 2003). A relação entre essas novas enterotoxinas e intoxicações

alimentares ainda não está totalmente esclarecida (OMOE et al., 2002), exceto para SEG,

SEH e SEI (MCLAUCHLIN et al., 2000).

SÍNDROME ESTAFILOCÓCICA DA PELE ESCALDADA

A síndrome estafilocócica da pele escaldada (Staphylococcal Scalded Skin

Syndrome - SSSS) é o termo utilizado para uma coleção de doenças bolhosas da pele,

induzida por toxinas esfoliativas (ETs) de S. aureus. Primariamente, afeta neonatos e

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

crianças, embora adultos com infecções latentes também sejam susceptíveis (LADHANI et

al., 2001).

Clinicamente apresenta-se de forma abrupta, com febre, sensibilidade da pele,

eritema e descamação da epiderme (YAMAGUCHI et al., 2002), revelando uma superfície

úmida e brilhante com aparência semelhante à pele escaldada (ARBUTHNOTT et al.,

1990).

Sorologicamente, dois tipos da toxina denominadas ETA e ETB eram reconhecidas

(JOHNSON et al., 1991). A toxina ETA codificada por gene cromossomal e ETB por gene

plasmidial (LEE et al., 1987). Posteriormente, Sato et al. (1994) verificaram um novo tipo

de toxina esfoliativa, denominada ETC, a partir de estirpes de S. aureus isolados de cavalo

com infecções cutâneas. Recentemente, Yamaguchi et al. (2002) identificaram numa ilha de

patogenicidade em isolados clínicos de S. aureus a seqüência do gene de uma nova toxina

esfoliativa, a ETD.

As toxinas esfoliativas apresentam os seguintes pesos moleculares: ETA 26,9 KDa,

ETB 27,2 KDa (LEE et al., 1987; SATO et al., 1994), ETC 27,0 KDa (SATO et al., 1994) e

ETD 27,2 KDa (YAMAGUCHI et al., 2002). A atividade da ETA é estável, mesmo após

aquecimento a 100ºC por 20 minutos, ao contrário da ETB e ETC, que são sensíveis ao

aquecimento de 60ºC por 15 a 30 minutos (SATO et al., 1994). A elevada termo-resistência

da ETA gera reflexos em saúde pública, visto que esta toxina poderia induzir afecções

cutâneas no homem, mesmo após tratamento convencionais dos alimentos.

Além da toxina esfoliativa estar relacionada a lesões na pele, e sua produção ser

legada a linhagens de S. aureus isoladas de humanos clinicamente acometidos

(MEHROTRA et al., 2000), sua presença em amostras de leite já foi demonstrada por Endo

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

et al. (2003) que detectaram o gene eta e a toxina ETA de isolados de leite de vacas com

mastite.

SÍNDROME DO CHOQUE TÓXICO ESTAFILOCÓCICO

A síndrome do Choque Tóxico (TSS) é uma doença aguda mediada por toxinas

(HERZER et al., 2001). Clinicamente é caracterizada por febre, rachaduras cutâneas,

descamação particularmente dos pés e palmas das mãos, hipotensão e envolvimento

multiorgânico (DINGES et al., 2000). A maior ocorrência da doença está relacionada a

mulheres jovens em período menstrual. Porém, quando começaram a surgir casos em

mulheres não menstruadas e homens, tornou-se evidente que esta síndrome poderia atingir

qualquer grupo da população. Para que ocorra TSS é necessário que o paciente esteja

infectado por S. aureus e que esta linhagem produza TSST-1 e consiga atingir a circulação

(HERZER et al., 2001).

A proteína TSST-1 foi estudada por Bergdoll et al. (1981) como uma enterotoxina

(denominada inicialmente de SEF), considerada originalmente como um problema em

alimentos. No entanto, Thompson et al. (1986) relataram que não havia evidências para

fundamentar esta possibilidade. Posteriormente, outros autores observaram a presença de

TSST-1 em alimentos e isolados de leite de animais com mastite geralmente associada a

SEs, principalmente SEA, SEC e SED (HO et al., 1989; CARDOSO et al., 2000).

TOXINAS ESTAFILOCÓCICAS E A GLÂNDULA MAMÁRIA

Nos animais domésticos, o S. aureus é considerado o principal agente de infecções

da glândula mamária (LIM et al., 2004). No Brasil, Silva et al. (2005) analisando 36

estirpes de S. aureus isoladas de casos de mastite caprina e 64 de mastite bovina

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

verificaram a presença de genes das SEs em 37 (37%) dos isolados, dos quais seis eram de

origem bovina e 31 de origem caprina, concluindo que os isolados de mastite caprina têm

maior poder de enterotoxigenicidade e que a presença do gene sec na maioria dos isolados

sugere um possível envolvimento da SEC na patogênese das mastites caprinas.

Entre as enterotoxinas clássicas SEA-SEE e a TSST-1, tem relevância nos casos de

mastite bovina as linhagens de S. aureus que apresentam os genes para as toxinas SEC e

TSST-1, pois estas são as estirpes associadas com severos casos de mastite clínica ou casos

que não respondem à terapia com antibióticos (ZSCHÖCK et al., 2004).

A associação dos genes sec e tst em linhagens de S. aureus isoladas de casos de

mastite bovina também foi observada por Salasia et al. (2004) na Alemanha havendo,

segundo estes autores, uma variação geográfica de linhagens de S. aureus

enterotoxigênicos.

Em amostras de leite de vacas com mastite o genótipo mais freqüente é aquele

portador dos genes seg e sei (OMOE et al., 2002; LONCAREVICK et al., 2005).

Cabral et al. (2004) pesquisaram a presença de genes para as SEs em 87 linhagens

de S. aureus provenientes do Brasil e obtidas de leite de vacas com mastite, porém não

encontraram os genes para as toxinas clássicas SEA-SEE, detectando apenas a presença dos

genes para as toxinas SEG, SEH e SEI que são mais recentes. Segundo os mesmos autores,

a presença de genes para estas novas toxinas não é importante no estabelecimento e

disseminação das mastites. No entanto, segundo Katsuda et al. (2005), o papel dessas novas

toxinas na patogenicidade dos isolados de S. aureus em afetar a glândula mamária não está

elucidada. Porém, o predomínio destas estirpes portadoras de genes para novas SEs

fortalece a teoria de que essas toxinas superantigênicas são importantes nas afecções da

glândula mamária.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

ENTEROTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS: ASPECTOS GENÉTICOS E

DETECÇÃO

Diferentes genes codificadores de enterotoxinas já foram estudados e suas

denominações iniciam com as letras se (de enterotoxina estafilocócica) ou ent (de

enterotoxina), das quais a primeira forma é a mais utilizada na atualidade. Estes genes são

carreados por plasmídeos - sed e sej (BAYLES e IANDOLO, 1989; ZHANG et al., 1998),

por fagos - sea e see (BETLEY e MEKALANOS, 1985), ou por cromossomos - seb, sec,

seg, seh, sei, sek, sel, sem, sen, seo, sep e seq (LETERTRE et al., 2003).

A SEA é expressa na metade da fase exponencial da multiplicação dos estafilococos

(TREMAINE et al., 1993). A detecção do gene sea em linhagens de S. aureus é importante

visto que a SEA é tóxica em baixas concentrações (EVENSON et al., 1988). O gene sea é

composto por 771 pb e codifica proteína precursora da SEA com 257 resíduos de

aminoácidos e peso molecular de 27,1 KDa (BETLEY e MEKALANOS, 1988).

De acordo com Holecková et al. (2002), SEB foi a principal enterotoxina produzida

por Staphylococcus sp isolados de queijos fabricados com leite de ovelha. O gene (seb)

consiste de 798 nucleotídeos que codifica uma proteína com 266 aminoácidos e peso

molecular de 31,4 KDa (JOHNS e KHAN, 1988).

De um total de 39 SECs produzidas por estirpes de S. aureus responsáveis por 20

surtos de intoxicação alimentar no centro de Taiwan, 12 SECs pertenciam ao subtipo SEC2

e 13 ao subtipo SEC3. Apenas uma linhagem pertencia ao subtipo SEC1 e 13 a outros

subtipos de SECs. Isso demonstra que SEC2 e SEC3 são os subtipos de SECs mais

freqüentes em surtos de intoxicação alimentar (CHEN et al., 2001).

Estudando 100 estirpes de S. aureus isoladas de casos de mastite nos estados do Ceará

e Rio de Janeiro, das quais 36 de origem bovina e 64 de origem caprina, Silva et al. (2005)

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

observaram a presença do gene sec em 2 (3,1%) dos isolados bovinos e em 31 (86%) dos

isolados caprinos. Segundo Wilson et al. (1991), as SECs estão comumente associadas ao

leite e produtos derivados provenientes de bovinos, ovinos e caprinos.

O gene sec1 contém 801 pb e codifica uma proteína madura com 239 aminoácidos e

27,4 KDa (BOHACH e SCHLIEVERT, 1987). O gene sec2 contém 801 pb e codifica

proteína madura com 239 aminoácidos e 26,0 KDa (BOHACH e SCHLIEVERT, 1989). O

gene sec3 contém 798 bp e codifica uma proteína madura com 238 aa e 27,4 KDa (COUCH

e BETLEY, 1989).

De acordo com Casman et al. (1967), SED é comumente produzida por estirpes de

Staphylococcus isoladas de leite e alimentos congelados, enquadrando-se como a segunda

SEs mais encontrada, depois de SEA, em intoxicações alimentares. A baixa produção de

SED é significante, pois pouca quantidade de enterotoxina (100 a 200 ng) é necessária para

causar doença, especialmente em crianças e idosos (KOKAN e BERGDOLL, 1987). O

gene sed foi localizado no plasmídio da penicilinase de 27,6 kb e codifica uma proteína

madura com 228 aminoácidos, com peso molecular de 26,3 KDa (BAYLES e IANDOLO,

1989).

O gene para SEE (see) codifica uma proteína de 29 KDa (COUCH et al., 1988) que

apresenta homologia com SEA e SED (BALABAN e RASOOLY, 2000).

Dois novos genes de enterotoxinas estafilocócicas foram identificados e designados

seg e sei, codificando proteínas precursoras de 258 aminoácidos (SEG) e 242 aminoácidos

(SEI) e proteínas maduras de 27,0 KDa (SEG) e 24,9 KDa (SEI), ambas com a propriedade

de proliferação de células T e ação emética (MUNSON et al., 1998). Os genes seg e sei

estão presentes em S. aureus em um mesmo fragmento de DNA com 3,2 Kb, orientados em

tandem (JAURRAD et al., 1999). No mesmo estudo foi verificado que em 12 linhagens de

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

S. aureus isoladas de pacientes com TSS e SSSS, não foram observadas a produção de

TSST-1, SEA-SEE, ETA ou ETB. Porém, utilizando primers específicos para seg e sei,

ambos os genes foram detectados em todas as amostras, demonstrando que SEG e SEI

estão associadas com as síndromes do choque tóxico e a da pele escaldada.

Omoe et al. (2002) pesquisaram a presença de genes das enterotoxinas

estafilocócicas (sea a sei) em 146 estirpes de S. aureus, 71 destas provenientes de humanos

envolvidos em 25 surtos de intoxicações alimentares, 18 de humanos sadios, 21 de vacas

com mastite e 36 de leite de vaca. Verificaram também que 113 (77,4%) dos isolados foram

positivos para um ou mais genes de SEs, e 35 linhagens portavam seg e 32 sei.

Ren et al. (1994) purificaram SEH de uma estirpe clínica de S. aureus de um

paciente com TSS não associada ao período menstrual que foi negativa para TSST-1. Su e

Wong (1996) desenvolveram um ELISA para SEH e observaram que uma amostra

envolvida em intoxicação alimentar produziu SEH, demonstrando que esta toxina é capaz

de causar intoxicação alimentar e sintomas de TSS. Seu peso molecular é de 27,3 KDa e

seu ponto isoelétrico de 5,7 que é considerado ácido, diferentemente das demais SEs

conhecidas que possuem pH neutro ou básico com pontos isoelétricos variando de 7,0 a 8,6

(SU e WONG, 1995).

A caracterização do plasmídio portando o gene responsável pela codificação da

enterotoxina D revelou a presença de uma ORF (Open Reading Frame – seqüência aberta

de leitura) a qual codifica uma enterotoxina com 268 aminoácidos e 31,2 KDa previamente

não identificada, designada enterotoxina estafilocócica J (SEJ). As ORF de sed e sej são

orientadas em direções opostas no plasmídio (pBI485) e são separadas por 895 nucleotídeos

(ZHANG et al., 1998).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

A SEK tem um peso molecular de 26,0 KDa e é codificada pelo gene sek contido

em uma ilha de patogenicidade estafilocócica (SaPI), que também contém o gene seb para a

SEB (ORWIN et al., 2001).

O gene responsável pelas SEM, SEN e SEO pode ser carreado pelos isolados de S.

aureus portando os genes seg e sei. No entanto, SEL, SEM, SEN e SEO não têm

demonstrado atividades eméticas em modelos animais, mas em caso de elevada produção

de SEG e SEI poderiam causar intoxicações (OMOE et al., 2002).

A presença do gene seu codificador da enterotoxina estafilocócica denominada SEU

foi descrita por LETERTRE et al. (2003) em um cluster egc de Staphylococcus aureus.

O desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis e eficazes para a detecção de

patógenos de origem alimentar tem recebido maior atenção nos últimos anos devido a

preocupação com a saúde pública e maior conscientização dos riscos de contaminação

microbiológica de alimentos (RAMESH et al. 2002).

A caracterização das SEs tem sido dificultada por fatores como baixos níveis de

produção da toxina, dificuldades associadas com a purificação e a falta de métodos simples

e rápidos para suas detecções (SU e WONG, 1995).

Devido às informações sobre a sequência de DNA das SEs (REN et al., 1994; SU e

WONG, 1995, 1997; MCLAUCHLIN et al., 2000), a PCR torna-se um método alternativo

para a detecção dos genes destas toxinas (BECKER et al., 1998), mostrando-se uma técnica

simples e reprodutível, funcionando como uma ferramenta genética para estudos

epidemiológicos.

De um total de 176 estirpes de Staphylococcus isoladas de alimentos em Taiwan, 64

foram positivas para enterotoxinas através do Kit SET-RPLA e 72 pela PCR (TSEN et al.,

1995), demonstrando a alta eficiência da técnica molecular. No mesmo estudo foi

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

observado que a PCR permite a detecção específica do gene de algumas toxinas, como o

da toxina E que não é detectada pela RPLA (Reversed Passive Latex Aglutination).

A utilização da PCR na identificação de genes de SEs em isolados de S. aureus é uma

alternativa de baixo custo em relação a alguns métodos imunológicos (JOHNSON et al.,

1991; MCLAUCHLIN et al., 2000).

Entre os testes imunológicos o ELISA é tão eficiente e sensível quanto RIA e não

necessita do uso de material radioativo (MORISSETTE et al., 1991). Gómez-Lucía et al.

(1989) verificaram que a imunodifusão não é um bom método para a determinação de

enterotoxinas em alimentos, pois os diferentes componentes podem inibir ou realçar sua

síntese. Outros estudos relatam ótima concordância entre métodos genéticos (hibridização,

PCR) e métodos imunológicos (RIA, Imunodifusão em gel, ELISA, RPLA) na detecção de

exotoxinas estafilocócicas (MCLAUCHLIN et al., 2000; HOLECKOVÁ et al., 2002).

Atualmente, em laboratórios de referência, os métodos mais utilizados são o ELISA

na indústria de alimentos e o PCR em estudos epidemiológicos.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

É notória a importância do Staphylococcus aureus para a Saúde Pública,

principalmente no que se refere às suas exotoxinas. Muito já foi estudado sobre este

microrganismo e seus fatores de patogenicidade, porém mais pesquisas ainda devem ser

realizadas para se compreender melhor o envolvimento desta bactéria na etiologia de várias

doenças, para a prevenção das intoxicações alimentares e incremento no diagnóstico das

exotoxinas reconhecidas e de outras toxinas do agente, otimizando o uso da biologia

molecular que nos últimos anos tem trazido grande contribuição ao estudo deste

microrganismo.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ARBUTHNOTT, J.P.; COLEMAN, D.C.; DE AZEVEDO, J.S. Staphylococcal toxins in

human disease. In: The Staphylococci: an introduction. The Journal of Applied

Bacteriololy, Oxford, v. 69, n.19, p.101-107, 1990.

BALABAN, N.; RASOOLY, A. Staphylococcal Enterotoxins. International Journal of

Food Microbiology, Amsterdam, v. 61, p. 01-10, 2000.

BAYLES, K.W.; IANDOLO, J.J. Genetic and molecular analices of the gene encoding

staphylococcal enterotoxin D. Journal of Bacteriology, Washington, v. 171, p. 4799-4806,

1989.

BECKER, K.; ROTH, R.; PETERS, G. Rapid and specific detection of toxigenic

Staphylococcus aureus: use of two multiplex PCR enzyme immunoassays for amplification

and hybridization of staphylococcal enterotoxin genes, exfoliative toxin genes, and toxic

shock syndrome toxin 1 gene. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v.36, p.

2548-2553, 1998.

BERGDOLL, M.S.; CRASS, B.A.; REISER, R.F. et al. A new staphylococcal enterotoxin,

enterotoxin F, associated with the toxic shock syndrome Staphylococcus aureus isolates.

Lancet, Oxford, p. 1017-1021, 1981.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

BERGDOLL, B.M. Analytical methods for Staphylococcus aureus. International Journal

of Food Microbiology, Amsterdam, v. 10, p. 91-100, 1990.

BETLEY, M.J.; MEKALANOS, J. J. Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phage.

Science, Washington, v. 229, p. 185-187, 1985.

BETLEY, M.J.; MEKALANOS, J.J. Nucleotide sequence of the type A staphylococcal

enterotoxin gene. Journal of Bacteriology, Washington, v.170, p. 34-41, 1988.

BOHACH, G.A.; SCHLIEVERT, P.M. Nucleotide sequence of the staphylococcal

enterotoxin C1 gene and relatedness to other pyrogenic toxins. Molecular and General

Genetics, Oakland, v. 209, p. 15-20, 1987.

BOHACH, G.A.; SCHLIEVERT, P.M. Conservation of the Biologically Active Portions of

Staphylococcal Enterotoxins C1 and C2. Infection and immunity, Washington, v. 57, n. 7,

p. 2249-2252, 1989.

CABRAL, K. G.; LÄMMLER, C.; ZSCHÖCK, M. et al. Pheno and genotyping

Staphylococcus aureus, isolated from bovine milk samples from São Paulo State, Brazil.

Canadian Journal of Microbiology, Canada, v. 50, p. 901-909, 2004.

CARMO, L.S.; BERGDOLL, M.S. Staphylococcal food poisoning in Belo Horizonte

(Brazil). Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 21, n. 4, p. 320-323, 1990.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

CARMO, L.S.; DIAS, R.S.; LINARDI, V.R. et al. Food poisoning due to enterotoxigenic

strains os Staphylococcus present in minas cheese and raw milk in Brazil. Food

Microbiology, London, v. 14, p. 09-14, 2002

CARDOSO, H.F.T.; CARMO, L.S.; SILVA, N.A. Detecção da toxina-1 da síndrome do

choque tóxico em amostras de Staphylococcus aureus isoladas de mastite bovina. Arquivo

Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 52, p. 7-10, 2000.

CASMAN, E.P.; BENNETT, E.P.; DORSEY, A.E. et al. Identification of a fourth

staphylococcal enterotoxin, enterotoxin D. Journal of Bacteriology, Washington, v. 94, n.

6, p.1875-1882, 1967.

CHEN, T.R.; HSIAO, M.H.; CHIOU, C.S. et al. Development and use of PCR primers for

the investigation of C1, C2 and C3 enterotoxin types of Staphylococcus aureus strains

isolated from food-borne outbreaks. International Journal of Food Microbiology,

Amsterdam, v. 71, p. 63-70, 2001.

COUCH, J.L.; SOLTIS, M.T.; BETLEY, M.J. Cloning and nucleotide sequence of the type

E staphylococcal enterotoxin gene. Journal of Bacteriology, Washington, v. 170, p. 2954-

2960, 1988.

COUCH, J.L.; BETLEY, M.J. Nucleotide sequence of the type C3 staphylococcal

enterotoxin gene suggests that intergenic recombination causes antigenic variation. Journal

of Bacteriology, Washington, v. 171, p. 4507-4510, 1989.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

CUNHA NETO, A. Enterotoxigenicidade de Staphylococcus spp. isolados de alimentos.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Pernambuco. Departamento de Nutrição,

1999. 65p.

DINGES, M.M.; ORWIN, P.M.; SCHLIEVERT, P.M. Exotoxins of Staphylococcus

aureus. Clinical Microbiology Reviews, Washington, v. 13, n. 1, p. 16-34, 2000.

ENDO, Y.; YAMADA, T.; MATSUNAGA, K. et al. Phage conversión of exfoliative toxin

A in Staphylococcus aureus isolated from cows with mastitis. Veterinary Microbiology,

Amsterdam, v. 96, p. 81-90, 2003.

EVENSON, M.L.; HINDS, M. W.; BERNSTEIN, R.S. et al. Estimation of human dose of

Staphylococcal enterotoxin A from a large outbreak of staphylococcal food poisoning

involving chocolate milk. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v. 7,

p. 311-316, 1988.

FRANCO, B.D.G.M.; LANDGRAFF, M. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo:

Atheneu, 2000, 182p.

GELLI, D.S.; JACABI, M.; SAKUMA, H. et al. Surtos de enfermidades transmitidas por

alimentos (ETAs) investigados pelos laboratórios de Saúde Pública do Estado de São

Paulo, no período de 1994 a 1998. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE

MICROBIOLOGIA, 20., Salvador. Anais…Salvador: [s. n. ], 1999. p. 126.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

GILETTO, A.; FYFFE, J. G. A novel ELISA format for the rapid and sensitive detection of

Staphylococcal enterotoxin A. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, Bunkyo-ku,

v. 62, n. 11, p. 2217-2222, 1998.

GOMEZ-LUCÍA, E.; GOYACHE, J.; ORDEN, J.A. et al. Production of enterotoxin A by

supposedly nonenterotoxigenic Staphylococcus aureus strains. Applied and

Environmental Microbiology, Washington, v. 55, n. 6, p. 1447-1451, 1989.

HERZER, C.M. Toxic Shock Syndrome: Broadening the Differential Diagnosis. The

Journal of American Board of Family Practice, Lexington, v.14, n. 2, p. 131-136, 2001.

HO, G.; CAMPBELL, W.H.; BERGDOLL, M.S. et al. Production of toxic shock syndrome

toxin variant by Staphylococcus aureus associated with sheep, goats, and cows. Journal of

Clinical Microbiology, Washington, v.27, n. 9, p. 1946-1948, 1989.

HOLECKOVÁ, B.; HOLODA, E.; FOTTA, M. et al. Ocurrence of enterotoxigenic

Staphylococcus aureus in food. Annals of Agricultural and Environmental Medicine,

Lublin, v. 9, p. 179-182, 2002.

JAURRAD, S; COZON, G.; VANDENESCH, F.. et al. Involvement of enterotoxins G and

I in staphylococcal toxic shock syndrome and staphylococcal scarlet fever. Journal of

Clinical Microbiology, Washington, v. 37, p. 2446-2449, 1999.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

JAURRAD, S.; PEYRAT, M.A.; LIM, A. et al. egc a highly prevalent operon of

enterotoxin gene, forms a putative nursey of superantigens in Staphylococcus aureus.

Journal of Immunology, Rockville Pike, v. 166, p. 669-677, 2001.

JOHNS JR., M.B.; KHAN, A. Staphylococcal enterotoxin B gene is associated with

discrete genetic element. Journal of Bacteriology, Washington, v. 170, p. 4033-4039,

1988.

JOHNSON, W.M.S.; TYLER, S.D.; EWAN, E.P. et al. Detection of genes for enterotoxins,

exfoliative toxins, and toxic shock syndrome toxin 1 in Staphylococcus aureus by the

polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v. 29, n. 3, p.

426-430, 1991.

KATSUDA, K.; HATA, E.; KOBAYASHI, H. et al. Molecular typing of Staphylococcus

aureus isolated from bovine mastitic milk on the basis of toxin genes and coagulase gene

polymorphisms. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v. 105, p. 301-305, 2005.

KOKAN, N.P.; BERGDOLL, M.S.. Detection of low-enterotoxin-producing

Staphylococcus aureus strains. Applied and Environmental Microbiology, Washington,

v. 53, n. 11, p. 2675-2676, 1987.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

KONEMAN, F.W.; ALLEN S.D.; JANDA, S.P.C. et al. Cocos Gram-Positivos: Parte I:

Estafilococos e Microrganismos Relacionados, pp.551-588. In: KONEMAN, F.W.;

ALLEN, S.D.; JANDA, P.C. et al. Diagnóstico Microbiológico – Texto e Atlas Colorido.

5º Edição. Rio de Janeiro: Medsi, 2001, 1465p.

LADHANI, S.; JOANNOU, C. L.; LOCHRIE, D.P. et al. Clinical, microbial, and

biochemical aspects of the exfoliative toxins causing staphylococcal scalded-skin

syndrome. Clinical Microbiology Reviews, Washington, v. 12, n. 2, p. 224-242, 1999.

LADHANI, S.; ROBBIE, S.; GARRATT, R.C. et al. Development and evaluation of

detection system for staphylococcal exfoliative toxin A responsible for scalded-skin

syndrome. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v. 39, n. 6, p.: 2050-2054,

2001.

LEE, C.Y.; SCHMIDT, J.J.; JOHNSON-WINEGAR, A.D. et al. Sequence determination

and comparison of exfoliative toxin A and B genes from Staphylococcus aureus. Journal

of Bacteriology, Washington, v. 169, p. 3901-3909, 1987.

LETERTRE, C.; PERELLE, S.; DILASSER, F. et al. Identification of a new putative

enterotoxin SEU encoded by egc cluster of Staphylococcus aureus. Journal of Applied

Microbiology, Oxford, v. 2, p. 63-76, 2003.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

LIM, S.K.; JOO, Y.; MOON, J. et al. Molecular typing of enterotoxigenic Staphylococcus

aureus isolated from bovine mastitis in Korea. Journal of Veterinary Medical Science,

Tokyo, v. 66, n. 5, p. 581-584, 2004.

LOIR, Y.L.; BARON, F.; GAUTIER, M. Staphylococcus aureus and Food Poisoning.

Genetics and Molecular Research, Ribeirão Preto, v. 2, p. 63-76, 2003.

LONCAREVIC, S.; JORGENSEN, H. J.; LOVSETH, A. et al. Diversity of Staphylococcus

aureus enterotoxin types within single samples of raw milk and raw milk products. Journal

of Applied Microbiology, United Kingdom, v. 98, p. 344-350, 2005.

MCLAUCHLIN, J.; NARAYANAN, G.L.; MITHANI, V. et al. The detection of

enterotoxins and toxic shock síndrome toxin genes in Staphylococcus aureus by

polymerase chain reaction. Journal of Food Protection, Des Moines, v. 63, p. 479-488,

2000.

MEHOTRA, M.; WANG, G.; JOHNSON, W. M. Multiplex PCR for detection of genes for

Staphylococcus aureus enterotoxins, exfoliative toxins, toxic methicillin resistance.

Journal of Clininical Microbiology, Washington, v. 38, n. 3, p. 1032-1035, 2000.

MORISSETTE, C.; GOULET, J.; LAMOUREX, G. Rapid and sensitive sandwich enzyme-

linked immunosorbent assay for detection of staphylococcal enterotoxin B in cheese.

Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 57, n. 3, p. 836-842, 1991.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

MOSSEL, D.A.A.; GARCIA, M.B. Microbiologia de los Alimentos. Fundamentos

ecológicos para garantizar y comprobar la inocuidad y la calidad de los alimentos. 1º

Edição. Zaragoza: Acribia, 1975, 375p.

MURRAY, P.R.; DREW, W.L.; KOBAYASHI, G. et al. Microbiologia Médica. 3º

Edição. Rio de Janeiro: Guanabara koogan, 1992, 513p.

MUSON, S.H.; TREIMANE, M.T.; BETELEY, M.J. et al. Identification and

characterization of Staphylococcus enterotoxin type G and I from Staphylococcus aureus.

Infection and Immunity, Washington, v. 66, p. 3337-3348, 1998.

NOVICK, R.P.; SCHLIEVERT, P.; RUZIN, A. Pathogenicity and Resistance Islands of

Staphylococci. Microbes and Infection, Amsterdam, v. 3, p. 585-94, 2001.

OMOE, K.; ISHIKAWA, M.; SHIMODA, Y. et al. Detection of seg, seh and sei genes in

Staphylococcus aureus isolates and determination of the enterotoxin productivities of S.

aureus isolates harboring seg, seh ou sei genes. Journal of Clinical Microbiology,

Washington, v. 40, n.3, p. 857-862, 2002.

ORWIN, P.M.; LEUNG, D.Y.M.; HEATHER, L.D. et al. Biochemical and Biological

Properties of Staphylococcal Enterotoxin K. Infection and Immunity, Amsterdam, v. 69,

n. 1, p. 360-366, 2001.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

ORWIN, P.M; FITZGERALD, J.R.; LEUNG, D.Y.M.. et al. Characterization of

Staphylococcus aureus Enterotoxin L. Infection and Immunity, Amsterdam, v. 71, n. 5, p.

2916-2919, 2003.

RAMESH, A.; PADMAPRIYA, B.P.; CHANDRASHEKAR, A. et al. Application of

convenient DNA extraction method and multiplex PCR for the direct detection of

Staphylococcus aureus and Yersinia enterocolitica in milk samples. Molecular and

Cellular Probes, Oxford, v. 16, p. 307-14, 2002.

RAPINI, L.S.; TEIXEIRA, J.P.; MARTINS, N.E. et al. Resistência antimicrobiana de

cepas de Staphylococcus sp. enterotoxigênicos isoladas de queijo tipo coalho. Higiene

Alimentar, São Paulo, v. 17, n. 104-105, p.161, 2003.

RAPINI, L.S.; TEIXEIRA, J.P.; MARTINS, N.E. et al. Perfil de resistência antimicrobiana

de cepas de Staphylococcus sp. isoladas de queijo tipo coalho. Arquivo Brasileiro de

Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 56, n. 1, p. 130-133, 2004.

REN, K; BANNAN, J.D.; PANCHOLI, V. et al. Characterization and biological properties

of a new staphylococcal enterotoxin. Journal of Experimental Medicine, New York, v.

180, p. 1675-1683, 1994.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

SALASIA, S. I. O.; KHUSNAN, Z.; LÄMMLER, C. et al. Comparative studies on pheno-

and genotypic properties of Staphylococcus aureus isolated from bovine subclinical

mastitis in central Java in Indonesia and Hesse en Germany. Journal of Veterinary

Science, Korea, v. 5, n. 2, p. 103-109, 2004.

SATO, H.; MATSUMORI, Y.; TANABE, T. et al. A new type of staphylococcal

exfoliative toxin from a Staphylococcus aureus strain isolated from a horse with phlegmon.

Infection and Immmunity, Amsterdam, v. 62, n. 9, p. 3780-3785, 1994.

SENA, M.J. Perfil epidemiológico, resistência a antibióticos e aos conservantes nisina e

sistema lactoperoxidase de Staphylococcus sp. isolados de queijos coalho

comercializados em Recife-PE. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Minas

Gerais, Belo Horizonte, 2000, 75p.

SILVA JR. E.A. Manual de Controle Higiênico-Sanitário em Alimentos. São Paulo:

Varela, 1997, 385p.

SILVA, E. R.; CARMO, L. S.; SILVA, N. Detection of the enterotoxins A, B, and C genes

in Staphylococcus aureus from goat and bovine mastitis in Brazilian dairy herds.

Veterinary Microbiology, Amsterdam, v. 106, p. 103-107, 2005.

SPICER W.J. Bacteriologia, Micologia e Parasitologia Clínica. 1º Edição. Rio de

Janeiro: Guanabara koogan, 2002, 224p.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

SU, Y.C.; WONG, A.C.L. Identification and purification of a new staphylococcal

enterotoxin, H. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 61, p. 1438-

1443, 1995.

SU, Y.C.; WONG, A.C.L. Detection of staphylococcal enterotoxin H by an Enzyme-

Linked Immunosorbent Assay. Journal of Food Protection, Des Moines, v. 59, n. 3, p.

327-330, 1996.

SU, Y.C.; WONG, A.C.L. Current Perspectives on Detection of Staphylococcal

Enterotoxins. Journal of Food Protection, Des Moines, v. 60, p. 195-202, 1997.

THOMPSON, N.E.; GOMEZ-LUCIA, E.; BERGDOLL, M.S. Incidente of antibodies

reactive with toxic shock síndrome toxin 1 in bovine milk. Applied and Environmental

Microbiology, Washington, v. 51, n. 4, p. 865-867, 1986.

TORTORA, J.G.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia. 6º Edição. São Paulo:

Artmed, 2002, 827p.

TREIMANE, M.T.; BROCKMAN, D.K.; BETLEY, M.J. Staphylococcal enterotoxin A

gene (sea) expression is not affected by the accessory gene (agr). Infection and Immunity,

Washington, v. 61, p. 356-359, 1993.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

TSEN, H.; YU, G.; LIN, I. Plasmid profiles and pulsed-field gel electrophoresis for type A

enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from foods. Journal of Food Protection,

Des Moines, v. 58, n. 2, p. 147-153, 1995.

UDO, E.E.; AL-BUSTAN, M.A.; JACOB, L.E. et al. Enterotoxin production by coagulase-

negative staphylococci in restaurant workers from Kuwait City may be a potencial cause of

food poisoning. Journal of Medical Microbiology, Spencers woods, v. 48, p. 819-823,

1999.

VERAS, J.F.; SANTOS, D.A.; CARMO, L.S. et al. Levantamento de surtos de toxinfecção

alimentar envolvendo leite e produtos derivados no estado de Minas Gerais, Brasil. Higiene

Alimentar, São Paulo, v. 17, p. 218, 2003.

WILSON, I.G.; COOPER, J.E.; GILMOUR, A. Detection of enterotoxigenic

Staphylococcus aureus in dried skimmed milk: use of polymerase chain reaction for

amplification and detection of staphylococcal enterotoxin genes entB and entC1 and

thermonuclease gene nuc. Applied of Environmental Microbiology, Washington, v. 57,

n.6, p. 1793-1798, 1991.

YAMAGUCHI, T.; NISHIFUJI, K.; SASAKI, M. et al. Identification of the

Staphylococcus aureus etd pathogenicity island which encodes a novel exfoliative toxin,

ETD, and EDIN-B. Infection and Immunity, Washington, v. 70, n. 10, p. 5835-5845,

2002.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

ZSCHÖCK, M.; RIBE, K.; SOMMERHÄUSER, J. Ocurrence and clonal relatedness of

sec/tst-gene positive Staphylococcus aureus isolated of quartermilk samples of cows

suffering from mastitis. Letters in Applied Microbiology, United Kingdon, v. 38, p. 493-

498, 2004.

ZHANG, S.; IANDOLO, J.J.; STEWART, G.C. The enterotoxin D plasmid of

Staphylococcus aureus encodes a second enterotoxin determinant (sej). FEMS

Microbiology Letters, Amsterdam, v. 168, p. 227-233, 1998.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

2.6 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica muito sensível, permitindo

a detecção de baixas concentrações de microrganismos, além de ser mais específica e

rápida em relação às técnicas convencionais comumente empregadas para o isolamento de

microrganismos (WILSON et al., 1994; TAMARAPU et al., 2001; GILLESPIE e OLIVER,

2005; CREMONESI et al., 2005). Além do mais, tal técnica tem a vantagem de poder

detectar microrganismos vivos, danificados e mortos, que são freqüentemente encontrados

em alimentos que foram submetidos a processos térmicos (NÁJARA-SÁNCHEZ et al.,

2003).

As principais vantagens da técnica de PCR são: requerer quantidades muito

pequenas de DNA, ser extremamente sensível e de simples execução, quando se tem a

condição de reação padronizada, como reagentes, ciclos térmicos, amostras de DNA e pH

da reação (FARAH, 1997; MATIOLI e PASSOS-BUENO, 2002). Desta forma, a obtenção

de DNA genômico de boa qualidade e quantidade para amplificação pela reação em cadeia

da polimerase torna-se um fator crucial para a pesquisa e diagnóstico laboratorial

(NOGUEIRA et al., 2004).

A técnica da PCR para amplificação de uma seqüência específica foi descrita por

Kary Mullis no final dos anos 80 e tem como objetivo replicar seletivamente e rapidamente

in vitro, grandes quantidades de uma seqüência específica de DNA. A única exigência é

que as seqüências nas bordas da região selecionada sejam conhecidas, de modo que dois

oligonucleotídeos iniciadores primers, geralmente de 20pb, se associem à molécula de

DNA-alvo possibilitando o início da síntese pela DNA-polimerase na região desejada

(BROWN, 1999).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

A PCR é a amplificação enzimática de uma seqüência específica de DNA, visando a

produção de milhões de cópias desta seqüência em um tubo de ensaio. Uma fita simples de

DNA é usada como molde para a síntese de novas cadeias complementares sob a ação da

enzima DNA-polimerase, capaz de adicionar os nucleotídeos presentes na reação, segundo

fita molde. A DNA-polimerase requer, entretanto, um “ponto de início” ligado à fita molde

que servirá de apoio para que nucleotídeos subseqüentes sejam adicionados. Esse ponto de

início da síntese é fornecido por um oligonucleotídeo que se hibridiza (se anela) à fita

molde simples, o qual é denominado de primer (FARAH, 1997; STRACHAN e READ,

2002; TURNER et al., 2004).

Na prática, o que se faz numa reação de PCR é adicionar em um tubo de ensaio uma

quantidade muito pequena de DNA genômico, desoxirribonucleotídeos (dNTPs), tampão de

reação, MgCl

em concentração adequada, uma DNA-polimerase termoestável e os

oligonucleotídeos que servirão de primers (iniciadores), esses componentes são então

misturados e a amostra é colocada em um termociclador (ZAHA et al., 2003) (Figura 3).

Figura 3 – Reação em Cadeia da Polimerase. Preparo da reação em tubo de ensaio antes da

colocação em termociclador.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

No termociclador, o tubo de ensaio contendo a amostra é submetido a uma alta

temperatura, geralmente 94

C, para provocar o rompimento das pontes de hidrogênio entre

ambas as cadeias de DNA, causando a desnaturação da molécula. A temperatura é

diminuída a 65

C quando então, os primers têm a oportunidade de se anelarem às suas

seqüências complementares no DNA genômico. Finalmente, a temperatura é colocada em

torno de 72

C, temperatura ideal para que a DNA-polimerase utilizada na reação atue,

dirigindo a síntese de novas cadeias (FARAH, 1997). Repetindo-se esses três tipos de

passos, desnaturação, anelamento e síntese, por cerca de 30 ciclos permite-se a

amplificação do DNA molde de forma exponencial (FARAH, 1997; TORTORA et al.

2000; ZAHA et al., 2003) (Figura 4).

As SEs são rotineiramente detectadas por ELISA, imunodifusão, radioimunoensaio,

aglutinação em latex, mas a exeqüibilidade destes métodos é usualmente limitada a testes

comerciais para SEA, SEB, SEC, SED e SEE (LETERTRE et al., 2003; CREMONESI et

al., 2005). Além disso, a sensibilidade e especificidade desses métodos sempre dependem

da obtenção de quantidades detectáveis de toxinas e podem variar significantemente com a

pureza dos reagentes. Além do mais, esses testes levam de 3 a 24 horas para cada detecção,

com sensibilidade de 0,25-1,0ng/mL ainda havendo a possibilidade de resultados falso-

positivos (CHEN et al., 2001).

O seqüenciamento dos genes codificadores de todas as SEs identificadas têm dado a

oportunidade para a detecção e diferenciação de todos os genes se pela técnica de PCR. A

contínua identificação de novas SEs e o requerimento de métodos rápidos na investigação

de intoxicações alimentares, tem levado ao desenvolvimento de métodos para a detecção

simultânea de todos os genes se, como a técnica de PCR-Multiplex (MONDAY e

BOHACH, 1999).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Figura 4 – Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Fonte: (TORTORA et al., 2000).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

A PCR-Multiplex é uma variação da técnica de PCR, onde há a utilização de vários

pares de primers, específicos para diferentes seqüências-alvo, numa mesma reação de

amplificação. Este procedimento permite que várias seqüências de uma mesma molécula de

DNA sejam lidas, ou ainda, que múltiplos fatores de virulência de um mesmo patógeno

sejam pesquisados (SCHOSKE et al., 2003; MARTINEZ e TADDEI, 2004).

Desde que foi primeiramente descrita em 1988, a PCR-Multiplex tem sido amplamente

aplicada em várias áreas que trabalham com testes de DNA (CHAMBERLAIN et al., 1988;

SHUBER et al., 1993; HENEGARIU et al., 1994; SCHOSKE et al., 2003; OMOE et al.,

2005).

Com relação à detecção de genes se Omoe et al. (2005) utilizaram a técnica de PCR-

Multiplex para detectar 18 tipos de genes toxigênicos. Esta versatilidade permitiu que

vários outros trabalhos também utilizassem este tipo de técnica, pois a mesma permite a

detecção rápida e real de cepas de S. aureus portadoras de genes se que foram isoladas de

amostras de leite e derivados (SHARMA et al., 2000; ROSEC e GIGAUD, 2002;

NÁJERA-SÁNCHEZ et al., 2003; LONCAREVIC et al., 2005; CREMONESI et al., 2005;

JORGENSEN et al., 2005a, 2005b) economizando tempo e gastos com materiais.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

3-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AARESTRUP, F.M.; DANGLER, C.A.; SORDILLO, L.M. Prevalence of coagulase gene

polymorphism in Staphylococcus aureus isolates causing bovine mastitis. Canadian

Journal of Veterinary Research. v.2, n.59, p. 124-128, 1995.

AARESTRUP, F. M. Association between the consumption of antimicrobial agents in

animal husbandry and the occurrence of resistant bacteria among food animals.

International Journal of Antimicrobial Agents. v. 12, p. 279-285, 1999.

AMARAL, L. A.; ISA, H.; DIAS, L. T.; ROSSI, O. D.; NADER FILHO, A. N. Avaliação

de eficiência da desinfecção de teteiras e dos tetos no processo de ordenha mecânica de

vacas. Pesquisa Veterinária Brasileira. v. 24, n. 4, p. 173-177, 2004.

AQUINO, F. T. M. (1983). Produção de queijo de coalho na Paraíba:

acompanhamento das características físico-químicas do processamento. 1983. 88p.

Dissertação (Mestrado). Centro de Tecnologia. Universidade Federal da Paraíba, João

Pessoa, 1983.

ARAÚJO, W. P. (1984). Staphylococcus aureus em leite cru. Produção de enterotoxina,

caracterização da origem provável, humana ou bovina, a partir de cepas isoladas.

1984. 127p. Tese (Livre Docência). Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, São

Paulo, 1984.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

BARBER, D. A.; New perspectives on transmission of food-borne pathogens and

antimicrobial resistance. American Veterinary Medical Association. v. 218, p. 1559-

1561, 2001.

BARTLETT, P. C.; MILLER, G. Y.; LANCE, S. E.; HEIDER, L. E. Managerial

determinants of intramammary coliform and environmental streptococci infections in Ohio

dairy herds. Journal of Dairy Science. v. 75, p. 1241-1252, 1992.

BECKER, K.; ROTH, R.; PETERS, G. Rapid and specific detection of toxigenic

Staphylococcus aureus: use of two multiplex PCR enzyme immunoassays for amplification

and hybridization of staphylococcal enterotoxin genes, exfoliative toxin genes, and toxic

shock syndrome toxin 1 gene. Journal of Clinical Microbiology. v. 36, p. 2548-2553,

1998.

BENITES, N. R.; GUERRA, J. L.; MELVILLE, P. A.; COSTA, E. O. Aetiology and

histopathology of bovine mastitis of expontaneous ocurrente. Journal of Veterinary

Medicine. v. 49, p. 366-370, 2002.

BLANC, B. O leite, fator essencial do equilíbrio vital. Revista do Instituto de Laticínios

Cândido Tostes. v. 29, n. 172, p. 9-10, 1974.

BLOOD, D. C.; RADOSTITIS, O. M. Clínica Veterinária. 7ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 1991, p. 424-463.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

BORGES, M. S.; RODRIGUES, R.; RUBINICH, J. et al. Comparison of the quality of two

types of milk at two sources in Belo Horizonte, Brazil market. Journal of Food

Protection. v. 41, n. 9, p. 739-742, 1978.

BRABES, K. C. S.; CARVALHO, E. P.; DIONÍSIO, F. L.; PEREIRA, M. L.; GARINO

JR, F.; COSTA, E. O. Participação de espécies coagulase positivas e negativas produtoras

de enterotoxinas do gênero Staphylococcus na etiologia de casos de mastite bovina em

propriedades de produção leiteira dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Revista

NAPGAMA. v. 2, n. 3, p. 4-5, 1999.

BRAMLEY, A. J.; CULLOR, J. S.; ERSKINE, R. J.; FOX, L. K.; HARMON, R. J.;

HOGAN, J. S.; NICKERSON, S. C.; OLIVER, S. P.; SMITH, K. L.; SORDILHO, L. M.

Current concepsts of bovine mastitis. 4 ed. Madison: Nacional Mastitis Council, 1996.

64p.

BRASIL. Ministério da Agricultura, Departamento de Inspeção de Produtos de Origem

Animal. Portaria nº 146 de 07 de março de 1996. Regulamentos Técnicos de Identidade e

Qualidade dos Produtos Lácteos. Diário Oficial da União, Brasília, 11 de março de 1996.

Secção 1. p. 3977.

BRASIL. Ministério da Agricultura. Departamento Nacional de Inspeção de Produtos de

Origem Animal. Decreto nº 30691 de 29 de março de 1952. Regulamento de Inspeção

Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal. Diário Oficial da União, Brasília,

7 de julho de 1952. Secção 1. p. 10785.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

BRASIL. Ministério da agricultura Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa nº 30

de 26 de junho de 2001. Regulamentos Técnicos de Identidade e Qualidade de

Manteiga da Terra ou Manteiga de Garrafa, Queijo de Coalho e Queijo de Manteiga.

Diário Oficial da União, Brasília, 16 de julho de 2001. Secção 1. p. 13.

BRITO, J. R.F.; CALDEIRA, G. A. V.; VERNE QUE, R. S.; BRITO, M. A. V. P.

Sensibilidade e especificidade do California Mastitis Test como recurso diagnóstico da

mastite subclínica em relação à contagem de células somáticas. Pesquisa Veterinária

Brasileira. v. 2, n. 17, p. 49-53, 1997.

BROW, T. A. Genética, um enfoque molecular: Estudo de genes clonados. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan, 1999, p. 278-296.

BUYSER, M. L. D.; DUFOUR, B.; MAIRE, M.; LAFARGE, V. Implication of milk and

milk products in foo-borne diseases in France and in different industrialised countries.

International Journal of Food Microbiology. v. 67, p. 1-17, 2001.

CABRAL, T. M. A. (1993). Coliformes totais e fecais e Staphylococcus aureus

enteropatogênicos em queijos de coalho comercializados no município de João Pessoa-

PB. 1993. 88p. Dissertação (Mestrado). Centro de Tecnologia. Universidade Federal da

Paraíba, Jão Pessoa, 1993.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

CARMO, L. S.; DIAS, R. S.; ANUNCIAÇÃO, L. L. C. et al. Staphylococcal food

poisoning in Minas Gerais State, Brazil. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e

Zootecnia. v. 47, n. 2, p. 113-122, 1994.

CARMO, L. S.; DIAS, R, S.; ANUNCIAÇÃO, L. L. C.; BERGDOLL, M. S.

Staphylococcal food poisoning in Minas Gerais State (Brazil). Arquivo Brasileiro de

Medicina Veterinária e Zootecnia. v. 47, p. 113-122, 1995.

CARMO, L. S.; VIEIRA, C.; REIS, J.; DARC, P. Staphylococcus aureus and Salmonella

enteritidis present em food implicated em food poisoning. Revista de Microbiologia. v.

227, p. 122-125, 1996.

CHAMBERLAIN, J. S.; GIBBS, R. A.; RANIER, J. E.; NGUYEN, P. N.; CASKEY, C. T.

Deletion screening if the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA

amplification. Nucleic Acids Research. v. 16, p. 11141-11156, 1988.

CHEN, T. R.; HSIAO, M. H.; CHIOU, C. S.; TSEN, H. Y. Developmente and use of PCR

primers for the investigation of C1, C2 and C3 enterotoxin types of Staphylococcus aureus

strains isolated from food-borne outbreaks. International Journal of Food Microbiology.

v. 71, p. 63-70, 2001.

CARRARO, C. N. M.; LEITE, L.C.; SOSSELA, R.J.F. Resíduos de antibióticos no leite

provenientes de quartos tratados e não tratados de vacas leiteiras. Higiene Alimentar, v.17,

p.36, 2003.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

CENTORBI, O.N. P.; CUADRADO, A. M. A.; ALCARAZ, L. E.; LACIAR, M. C.;

MILAN, M. C. Prevalência de S. aureus aislados de masittis subclínica bovina en tambos

de la cuenca lechera de la ciudad de San Luis. Revista Argentina de Microbiologia. v. 24,

p. 73-80, 1992.

CERQUEIRA, M. M. O. P.; LEITE, M. O.; FONSECA, L. M. et al. Freqüência de Listeria

sp e de Staphylococcus aureus em queijo Minas produzido artesanalmente. In:

CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA. 1994. Olinda.

Anais...Olinda, p. 507.

CHEN, J. H.; HOTCHKISS, J. H. Growth of Listeria monocytogenes and Clostridium

sporogenes in cottage cheese in modified atmosphere packaging. Journal of Dairy

Science. v. 79, n. 6, p. 972-977, 1993.

CÔRREA, W. M.; CÔRREA, C. N. M. Enfermidades Infecciosas dos Mamíferos

Domésticos. Rio de janeiro: Médica e Científica Ltda., 1992, 843p.

COSTA, E. O. Importânica econômica da mastite infecciosa bovina. Comunidade

Científica da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São

Paulo. v. 15, n. 1, p. 21-26, 1991.

COSTA, E. O.; SÁ, R.; PONCE, H.; WATANABE, E. T.; VALLE, C. R. Avaliação da

terapia de mastite clínica: eficácia terapêutica medida em números de dias de tratamento.

Revista NAPGAMA. v. 2, n. 2, p. 10-14, 1999.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

COSTA, E. O.; BENITES, N. R.; THIERS, F. O.; RIBEIRO, A. R.; GARINO JR, F.;

SILVA, J. A. B. Escore de CMT em relação ao nível de células somáticas em leite do

tanque de refrigeração e percentual de mastite subclínica em propriedades leiteiras de São

Paulo e Minas Gerais. Revista NAPGAMA. v. 3, n. 2, p. 14-18, 2000.

CULLOR, J.S. The control, treatment, and prevention of the various types of bovine

mastitis. Veterinary Medicine. v.88, p.571-579, 1993

CREMONESI, P.; LUZZANA, M.; BRASCA, M.; MORANDI, S.; LODI, R.;

VIMERCATI, C.; AGNELLINI, D.; CARAMENTI, G.; MORONI, P.; CASTIGLIONI, B.

Development of multiplex PCR assay for the identification of Staphylococcus aureus

enterotoxigenic strains isolated from milk and dairy products. Molecular and Cellular

Probes. v. 19, n. 5, p. 299-305, 2005.

CREMONESI, P.; CASTIGLIONI, B.; MALFERRARI, G.; BIUNNO, I.; VIMERCATI,

C.; MORONI, P.; MORANDI, S.; LUZZANA, M. Technical note: improved method for

rapad DNA extraction of mastitis pathogens directly from milk. Journal of Dairy Science.

v. 89, p. 163-169, 2006.

DA SILVA, N.; FIGUEIREDO, J. B.; OLIVEIRA, M. Mamite no rebanho bovino da

Escola Média de Agricultura de Florestal UFVMC. Parte II. Freqüência etiologia. Arquivo

Brasileiro Medicina Veterinária e Zootecnia. v. 35, p. 471-478, 1983.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

DAVIS, J. C.; WILBEY, R. A. Microbiology of cream and dairy desserts In: Robinson, R.

K. (ed). Dairy Microbiology: The Microbiology of Milk Products. 2ed. London:

Elsevier, 1990. v. 2, p.41-108.

DE SÁ, M. E. P.; MOTA, R. A.; SOUZA, M. I.; OLIVEIRA, A. A. F. Etiologia da mastite

subclínica em bovinos leiteiros do agreste meridional do Estado de Pernambuco. Revista

Brasileira de Ciência Veterinária. v. 7, n. 2, p. 100-103, 2000.

DINGES, M.M.; ORWIN, P.M.; SCHLIEVERT, P.M. Exotoxins of Staphylococcus

aureus. Clinical Microbiology Reviews. v. 13, n. 1, p. 16-34, 2000.

FARAH, S. B. DNA Segredos e Mistérios. São Paulo: Sarvier. 1997, 276p.

FEITOSA, T.; BORGES, M. F.; NASSU, R. T.; AZEVEDO, E. H. F.; MUNIZ, C. R.

Pesquisa de Salmonella sp., Listeria sp. e microrganismos indicadores higiênico-sanitário

em queijo de coalho produzido no estado do Rio Grande do Norte. Ciência e Tecnologia

de Alimentos. v. 23, p. 162-165, 2003.

FERREIRO, L.; SOUZA, H. M.; HEINECK, L. A. Influence of subclinical mastitis on the

milk composition of the cross bred dairy cattle. Revista do Instituto de Laticínios

Candido Tostes. v. 35, p. 19-24, 1980.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

FITZGERALD, J. R.; MONDAY, S. R.; FOSTER, T. J.; BOHACH, G. A.; HARTIGAN,

P. J.; MEANEY, W. J.; SMYTH, C. J. Characterisation of putative pathogenicity island

from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens. Journal of

Bacteriology. v. 183, p. 63-70, 2001.

FONSECA, L.F.L.; SANTOS, M. V. Qualidade do leite e controle de mastite. São Paulo:

Lemos Editorial & Gráficos Ltda. 2001, 175pp.

FRANCIS, P. G. Mastitis therapy. Brasilian Veterinary Journal. v. 145, p. 302-311,

1989.

FRANCO, R. M.; CAVALCANTI, R. M.; WOOD, P. C. B.; LORETTI, V. P.;

GONÇALVES, P. M. R.; OLIVERIA, L. A. T. Avaliação da qualidade higiênico-sanitário

de leite e derivados. Higiene Alimentar. v. 14, n. 68-69, p. 70-77, 2000.

FREITAS, M. F. L.; PINHEIRO JÚNIOR, J. W.; STAMFORD, T. L. M.; RABELO, S. S.

A.; SILVA, D. R.; SILVEIRA FILHO, V. M. S.; SANTOS, F. G. B.; SENA, M. J.; MOTA,

R. A. Perfil de sensibilidade antimicrobiana in vitro de Staphylococcus coagulase positivos

isolados de leite de vacas com mastite no agreste do estado de Pernambuco. Arquivos do

Instituto Biológico. v. 72, n. 2, p. 171-177, 2005.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

FUEYO, J. M.; MENDOZA, M. C.; RODICIO, M. R.; MUÑIZ, J.; ALVAREZ, M. A.;

MARTÍN, M. C. Cytotoxin and pyrogenic toxin superantigen gene profiles of

Staphylococcus aureus associated with macrorestriction genomic profiles. Journal of

Clinical Microbioogy. v. 43, n. 3, p. 1278-1284, 2005.

GARINO JR, F.; RIBEIRO, A. R.; SILVA, J. A. B.; RIBEIRO, M. G.; COSTA, E. O.

Avaliação da susceptibilidade “in vitro” aos antimicrobianos e pesquisa de produção de b-

lactamase de cepas de E. coli, isoladas de mastite bovina. Revista NAPGAMA. v. 3, n. 2,

p. 19-22, 2000.

GENIGEORGIS, C. A. Present state of knowledge on Staphylococcal intoxication.

International Journal of Food Microbiology. v. 9, n. 4, p. 327-360, 1989.

GILLESPIE, B. E.; OLIVER, S. P. Simultaneous detection of mastitis pathogens,

Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, and Streptococcus agalactiae by multiplex

real-time polymerase chain reaction. Journal of Dairy Science. v. 88, p. 3510-3518, 2005.

HENEGARIU, O.; HIRSCHMANN, P.; KILIAN, K.; KIRSCH, S.; LENGAUER, C.;

MAIWALD, R.; MIELKE, K.; VOGT, P. Rapid screening of the Y chromosome in

idiopathic steriline men, diagnostic for deletions in AZF, a genetic Y factor expressed

during spermatogenesis. Andrologia. v. 26, p. 97-106, 1994.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

JAURRAD, S.; PEYRAT, M.A.; LIM, A.; TRISTAN, A.; BES, M.; MOUGEI, C.;

ETIENNE, J.; VANDENESCH, F.; BONNEVILLE, M.; LINA, G. L. egc a highly

prevalent operon of enterotoxin gene, forms a putative nursey of superantigens in

Staphylococcus aureus. The Journal of Immunology. v. 166, p. 669-677, 2001.

JORGENSEN, H. J.; MORK, T.; RORVIK, L. M. The ocurrence of Staphylococcus aureus

on farm with small-scale production of raw milk cheese. Journal of Dairy Science. v. 88,

p. 3810-3817, 2005a.

JORGENSEN, H. J.; MORK, T.; HOGASEN, H. R.; RORVIK, L. M. Enterotoxigenic

Staphylococcus aureus in bulk milk in Norway. Journal of Applied Microbiology. v. 99,

p. 158-166, 2005b.

KURODA, M. O.; OHTA, T.; UCHIYAMA, I.; BABA, T.; YUZAWA, H.; KOBAYASHI,

I.; CUI, L.; OGUCHI, A.; AOKI, K.; NAGAI, Y.; LIAN, J.; ITO, T.; KANAMORI, M.;

MATSUMARU, H.; MARUYAMA, A.; MURAKAMI, H.; HOSOYAMA, A.;

MIZUTANI-UI, Y.; TAKAHASHI, N. K.; SAWANO, T.; INOUE, R.; KAITO, C.;

SEKIMIZU, K.; HIRAKAWA, H.; KUHARA, S.; GOTO, S.; YABUZAKI, J.;

KANEHISA, M.; YAMASHITA, A.; OSHIMA, K.; FURUYA, K.; YOSHINO, C.;

SHIBA, T.; HATTORI, M.; OGASAWARA, N.; HAYASHI, H.; HIRAMATSU, K. Whole

genome sequencing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. v.357, p.1225-

1240, 2001.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

LANGENEGGER, J.; ESTELITA, M. C.; BAHIA, M. G. Efeito do agente etiológico da

mastite subclínica sobre a produção de leite. Pesquisa Veterinária Brasileira. v. 1, n. 2, p.

47-57, 1981.

LANGENEGGER, J.; FIGUEIREDO, M. P.; FERREIRA, E. R. Eficácia da combinação

antibiótica de sulfato de gentamicina + penicilina G procaína no tratamento da mastite

bovina. Hora Veterinária. v. 30, p. 447, 1986.

LANGONI, H.; PINTO, M. P.; DOMINGUES, P. E.; et al. Etiologia e sensibilidade

bacteriana da mastite bovina subclínica. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e

Zootecnia. v. 43, p. 507-515, 1991.

LANGONI, H.; DA SILVA, A. V.; CABRAL, K. G.; DOMINGUES, P. F. Aspectos

etiológicos na mastite bovina: flora bacteriana aeróbica. Revista Brasileira de Medicina

Veterinária. v. 20, p. 204-209, 1998.

LEITE JÚNIOR, A. F. S.; FLORENTINO, E. R.; OLIVEIRA, E. B.; SÁ, S. N.;

TORRANO, A. D. M. Qualidade microbiológica do queijo de coalho comercializado à

temperatura ambiente ou sob refrigeração, em Campina Grande-PB. Higiene Alimentar. v.

14, n. 74, p. 53-59, 2000.

LERCHE, M. Inspección veterinária de la leche. Zaragoza: Acribia, 1969. 375p.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

LETERTRE, C.; PERELLE, S.; DILASSER, F.; FACH, P. Identification of a new putative

enterotoxin SEU encoded by egc cluster of Staphylococcus aureus. Journal of Applied

Microbiology, v. 2, p.63-76, 2003.

LONCAREVIC, S.; JORGENSEN, H. J.; LOVSETH, A.; MATHISEN, T.; RORVIK, L.

M. Diversity of Staphylococcus aureus enterotoxin types within single samples of raw milk

and raw milk products. Journal of Applied Microbiology. v. 98, p. 344-350, 2005.

MARTINEZ, M. B.; TADDEI, C. R. Métodos de Diagnóstico. In: TRABULSI, L. R.;

ALTERTHUM, F. (Ed.), Microbiologia. 4 Ed. São Paulo: Atheneu, 2004, p. 117-125.

MATIOLI, S. R.; PASSOS-BUENO, M. R. S. Métodos baseados em PCR para análise de

polimorfismos de ácidos nucléicos. In: MATIOLI, S. R. (Ed.), Biologia Molecular e

Evolução. Ribeirão Preto: Holos, p.153-161, 2002.

MCDERMOTT, P. F.; ZHAO, S.; WAGNER, D. D.; SIMJEE, S.; WALKER, R. D.;

WHITE, D. G.; The food safety perspective of antibiotic resistance. Animal

Biotechnology. v. 13, p. 71-84, 2002.

MCLAUCHLIN, J.; NARAYANAN, G.L.; MITHANI, V.; O’NEILL, G. The detection of

enterotoxins and toxic shock syndrome toxin genes in Staphylococcus aureus by

polymerase chain reaction. Journal of Food Protection. v. 63, p. 479-488, 2000.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

MESQUITA, A. J. Enumeração de Staphylococcus em leite cru. Anais das Escolas de

Agronomia e Veterinária da UFG. v. 18, n. 1, p. 5-11, 1988.

MONDAY, S. R.; BOHACH, G. A. Use of multiplex PCR to detect classical and newly

described pyrogenic toxin genes in staphylococcal isolates. Journal of Clinical

Microbiology. v. 37, 3411-3414, 1999.

MORAIS, C. M (1995). Processamento artesanal do queijo de coalho de Pernambuco,

uma análise de perigos. 1995. 91f. Dissertação (Mestrado). Universidade Federal de

Pernambuco, Recife, 1995.

MURRAY, P. R.; DREW, W. L.; KOBAYASHI, G. S.; THOMPSON JR., J.H.

Microbiologia Médica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,. 1992, 513p.

MUSON, S. H.; TREIMANE, M. T.; BETELEY, M. J.; WELCH, R. A. Identification and

characterization of Staphylococcus enterotoxin type G and I from Staphylococcus aureus.

Infection and Immunity. v. 66, p. 3337-3348, 1998.

NÁJERA-SÁNCHEZ, G.; MALDONADO-RODRÍGUEZ, R.; OLVERA, P. R.; GARZA,

L. M. Development of two multiplex polymerase chain reactions for the detection of

enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus isolated from foods. Journal of Food

Protection. v. 66, p. 1055-1062, 2003.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

NASSU, R. T.; MOREIRA, C. G.; ROCHA, R. G. A.; FEITOSA, T.; BORGES, M. F.;

MACEDO, A. A. M. Diagnóstico das condições de processamento e qualidade

microbiológica de produtos regionais derivados do leite produzidos no estado do Rio

Grande do Norte. Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes. v. 55, p. 121-126,

2000.

MORENO, V. A.; LERAYER, A. L. S.; BARBIERI, M. K.; GRAEL, M. E. T.; SOUZA, F.

K. H.; MARTINI, M. Caracterização microbiológica e microscópica de leite e queijos

comercializados informalmente no estado de São Paulo. In: XIX Congresso Brasileiro de

Ciência e Tecnologia dos Alimentos-CBCTA, 2004, Recife, Pernambuco. XIX CBCTA

Ciência e Tecnologia dos Alimentos: estratégias para o desenvolvimento. Sociedade

Brasileira de Ciência e Tecnologia dos Alimentos-SBCTA, 2004. 1 CD-ROM.

NOGUEIRA, C. A. M.; MOMESSO, C. A. S.; MACHADO, R. L. D.; DE ALMEIDA, M.

T. G.; ROSSIT, A. R. B. Desmpenho de kits comerciais e protocolos laboratoriais para a

extração de DNA genômico bacteriano. Revista Panamericana de Infectologia. v. 6, n. 2,

p. 35-38, 2004.

NOUT, M. J. R. Fermented foods and food safety. Food Ressearch International. v. 27, n.

7, p. 291-298, 1994.

OLIVEIRA, J. S. Queijos: Fundamentos tecnológicos. São Paulo: Ícone, 1986. 146p.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

OLIVEIRA, A.A.F.; MOTA, R.A.; SOUZA, M.I. Perfil de sensibilidade antimicrobiana in

vitro frente a amostra de Staphylococcus spp. isoladas de mastite subclínica bovina, no

agreste meridional de Pernambuco. A Hora Veterinária. v. 22, n. 127, p.8-10, 2002.

OMOE, K.; HU, D. L.; OMOE, T. H.; NAKANE, A.; SHINAGAWA, K. Identification and

characterization of a new staphylococcal enterotoxin-related putative toxin encoded by two

kinds of plasmids. Infection and Immunity. v. 71, p. 6088-6094, 2003.

OMOE, K.; HU, D. L.; OMOE, H. T.; NAKANE, A.; SHINAGAWA, K. Comprehensive

analysis of classical and newly described staphylococcal superantigenic toxin genes in

Staphylococcus aureus isolates. FEMS Microbiology Letters. v.246, p. 191-198, 2005.

ORWIN, P. M.; LEUNG, D.Y.M; HEATHER, L.D.; et al. Biochemical and Biological

Properties of Staphylococcal Enterotoxin K. Infection and Immunity, v. 69, n. 1, p. 360-

366, 2001.

ORWIN, P.; LEUNG, D. Y. M.; TRIPP, T. J.; BOHACH, G. A.; EARHART, C. A.;

OHLENDORF, D. H.; SCHLIEVERT, P. M. Characterisation of noval staphylococcal

enterotoxin-like superantigen, a member of the Group V subfamily of pyrogenic toxins.

Biochemistry. v. 41, p. 14033-14040, 2002.

ORWIN, P. M.; FITZGERALD, J. R.; LEUNG, D. Y.; GUTIERREZ, J. A.; BOHACH, G.

A.; SCHLIEVERT, P. M. Characterization of Staphylococcus aureus Enterotoxin L.

Infection and Immunity. v. 71, n. 5, p. 2916-2919, 2003.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

OTERO, F. D.; CRUZ, J. R. S. Mecanismos de defesa de la glândula mamaria bovina em

lãs fases de involución y lactación. Veterinaria México. v. 23, n. 4, p. 357-365, 1992.

PAIVA, M. S. D.; CARDONHA, A. M. S. Queijo de coalho artesanal e industrializado

produzidos no Rio Grande do Norte: estudo comparativo da qualidade microbiológica.

Higiene Alimentar. v. 13, n. 61, p. 33, 1999.

PERNAMBUCO. Legislação sobre Inspeção e Fiscalização Agropecuária do Estado de

Pernambuco. Artigo 681, Capítulo 4. Diário Oficial [do] Estado de Pernambuco, Poder

Executivo, Recife, 16 de junho 1992. p. 93.

PERESI, J. T. M.; GRACIANO, A. S.; ALMEIDA, I. A. Z. C.; LIMA, S. J.; RIBEIRO, A.

K.; CARVALHO, I. S.; LIMA, M.. Queijo minas tipo frescal artesanal e industrial:

qualidade microscópica, microbiológica e teste de sensibilidade aos agentes

antimicrobianos. Higiene Alimentar. v. 15, n. 83, p. 63-70, 2001.

PINHEIRO, E. S.; NASSU, R. T.; ANDRADE, A. A.; MORAIS, R. P. Contribuição ao

conhecimento do queijo de coalho comercializado na cidade de Fortaleza, Ceará. In: XIX

Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia dos Alimentos-CBCTA, 2004, Recife,

Pernambuco. XIX CBCTA Ciência e Tecnologia dos Alimentos: estratégias para o

desenvolvimento. Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia dos Alimentos-SBCTA,

2004. 1 CD-ROM.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

QUINN, P. J.; CARTER, M. E.; MARKEY, B.; CARTER, G. R. Clinical Veterinary

Microbiology. London: Wolfe, 1994. 648pp.

RADOSTITS, O. M.; GAY, C. C.; BLOOD, D. C.; HINCHCLIFF, K. W. Clínica

Veterinária. Um tratado de doenças dos bovinos, ovinos, caprinos e eqüinos. 9 Ed. Rio

de Janeiro: Guanabara Koogan. 2002, 1737p.

RAINARD, P. Tackling mastitis in dairy cows. Nature Biotechnology. v. 23, n. 4, p. 430-

432, 2005.

RAJALA-SCHULTZ, P. J.; SMITH, K. L.; HOGAN, J. S.; LOVE, B. C. Antimicrobial

susceptibility of mastitis pathogens from first lactation and older cows. Veterinary

Microbiology. v. 102, p. 33-42, 2004.

RAPINI, L. S.; TEIXEIRA, J. P.; MARTINS, N. E.; GUIMARÃES, M. P. S. L. M. P.;

CERQUEIRA, M. M. O. P. Perfil antimicrobiano de cepas de Staphylococcus sp. isoladas

do leite cru de cabra, queijo e manipuladores. Higiene Alimentar. v. 17, p. 162, 2003.

REN, K. et al. Characterization and biological properties of a new staphylococcal

enterotoxin. Journal of Experimental Medicine. v. 180, p. 1675-1683, 1994.

RITTER, R.; SANTOS, D.; BERGMANN, G.P. Análise da qualidade microbiológica de

queijo colonial, não pasteurizado, produzido e comercializado por pequenos produtores, no

Rio Grande do Sul. Higiene Alimentar. v. 15, n. 87, p. 51-55, 2001.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

ROSEC, J. P.; GIGAUD, O. Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types

detected by PCR in France. International Journal of Food Microbiology. v. 77, p. 61-70,

2002.

SANTOS, E. C.; GENIGEORGES, C.; FARVER, T. B. Prevalence of Staphylococcus

aureus in raw and pasteurized milk used for commercial manufactured Brazilian Minas

cheese. Journal of Food Protection. v. 44, n. 3, p. 177-184, 1981.

SANTOS, J. A. Patologia especial dos animais domésticos (mamíferos e aves). 2 Ed.

Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1986. p. 154-159.

SANTOS, F. A.; NOGUEIRA, N. A. P.; CUNHA, G. M. A. Aspectos microbiológicos do

queijo tipo “coalho” comercializado em Forataleza, CE. Boletim do Centro de Pesquisa e

Processamento de Alimentos. v. 13, n. 1, p. 31-36, 1995.

SANTOS, F.G.B.; MOTA, R.A.; SILVEIRA-FILHO, V.M.; SOUZA, H.M.; OLIVEIRA,

M.B.M.; JOHNER, J.M.Q.; LEAL N.C.; ALMEIDA, A.M.P.; LEAL-BALBINO, T.C.

Tipagem molecular de Staphylococcus aureus isolados do leite de vacas com mastite

subclínica e equipamentos de ordenha procedentes do estado de Pernambuco. Revista

NAPGAMA. v. 6, n. 1, p. 19-23, 2003.

SCHALM, O. W. CARROLL, C. J.; JAIN, N. C. Bovine mastitis. Philadelphia: Lea e

Febiger, 1971. 369p.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

SCHALM, O. W.; NOORLANDER, D. O. Experimental and observations leading to

development of the California Mastitis Test. Journal of the American Veterinary

Medical Association. v. 130, n. 5, p.199-207, 1957.

SCHOSKE, R.; VALLONE, P. M.; RUITBERG, C. M. BUTTER, J. M. Multiplex PCR

design strategy used for the simultaneous amplification of 10Y chromosome short tandem

repeat (STR) loci. Analytical and Bioanalytical Chemistry. v. 375, p. 333-343, 2003.

SENA, M. J.; CERQUEIRA, M. M. O. P.; CARMO, L. S.; SENA, M. C.; SILVA, J. F. M.

Characterization of the pathogenic microorganisms in White cheese sold in Recife (PE). In:

PROCEEDINGS OF THE PANAMERICAN CONGRESS ON MASTITIS CONTROL

AND MILK QUALITY, 1, 1998. Merida, Proceedings…Meridas: UNAM, 1998. p. 524-

533.

SENA, M. J. (2000). Perfil epidemiológico, resistência a antibióticos e aos conservantes

nisina e sistema lactoperoxidase de Staphylococcus sp. isolados de queijos coalho

comercializados em Recife-PE. 2000. 75p Tese (Doutorado). Escola Veterinária:

Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2000.

SHAH, P. M.; SCHAFER, V.; KNOTHE, H. Medical and Veterinary use of antimicrobial

agents: implications for public health: a clinical view on antimicrobial resistence.

Veterinary Microbiology. v. 35, p. 269-274, 1993.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

SHARMA, N. K.; CATHERINE, E. D. R.; DODD, C. E. R. Development of a single-

reaction multiplex PCR toxin typing assay for Staphylococcus aureus strains. Applied and

Environmental Microbiology. v. 66, n. 4, p. 1347-1353, 2000.

SHUBER, A. P.; SKOLETSKY, J.; STERN, R.; HANDELIN, B. L. Efficient 12-mutation

testing in the CFTR gene: a general model for complex mutation analysis. Human

Molecular Genetics. v. 2, p. 153-158, 1993.

SOUZA, C. S. Uma guerra quase perdida. Revista Ciência Hoje. v. 23, n. 138, p. 27-35,

1998.

STRACHAN, T.; READ, A. P. Genética Molecular Humana. 2 Ed. Porto Alegre:

Artmed, 2002. 576p.

SU, Y. C.; WONG, A. C. L. Identification and purification of a new staphylococcal

enterotoxin H. Applied and Environmental Mirobiology. v. 61, p. 1438-1443, 1995.

SU, Y. C.; WONG, A. C. L. Current Perspectives on Detection of Staphylococcal

Enterotoxins. Journal of Food Protection. v. 60, p. 195-202, 1997.

SUMANO, H.; OCAMPO, L. The pharmacological basis for the treatment of bovine

mastitis – a review. Israel Journal of Veterinary Medicine. v. 47, p. 127-135, 1992.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

TAMARAPU, S.; MCKILLIP, J. L.; DRAKE, M. Development of a multiplex polymerase

chain reaction assay for detection and differentiation of Staphylococcus aureus in dairy

products. Journal of Food Protection. v. 64, n. 5, p. 664-668, 2001.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 6 Ed. Porto Alegre:

Artmed, 2000. 827p.

TURNER, P. C.; MCLENNAN, A. G.; BATES, A. D.; WHITE, M. R. H. Biologia

Molecular. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004, 287p.

UDO, E. E; AL-BUSTAN, M.A; JACOB, L.E; et al. Enterotoxin production by coagulase-

negative staphylococci in restaurant workers from Kuwait City may be a potencial cause of

food poisoning. Journal of Medical Microbiology, 48: 819-823, 1999.

VERAS, J. F.; SANTOS, D. A.; CARMO, L. S.; FERNANDES, T. M. G.; AZALI, C.;

SILVA, M. C. C.; MARTINS, R. T.; CERQUEIRA, M. M. O. P. Levantamento de surtos

de toxinfecção alimentar envolvendo leite e produtos derivados no estado de Minas Gerais,

Brasil. Higiene Alimentar. v. 17, p. 218, 2003.

VIANNI, M. C. E.; NADER FILHO, A.; LANGENEGGER, J. Freqüência de isolamento

de Staphylococcus coagulase –positiva e coagulase negativa na mastite subclínica em

bovinos e sua influência na produção Láctea. Arquivos da Universidade Federal Rural

do Rio de Janeiro. v. 15, n. 2, p. 187-192, 1992.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

VIEIRA-DA-MOTA, O.; FOLLY, M.M.; SAKYIAMA, C.C.H. Detection of different

staphylococcus aureus strains bovine milk using PCR and routine tecnhiques. Brazilian

Journal of Microbiology, v.32, p.27-31, 2001.

WIENEKE, A. A.; ROBERTS, D.; GILBERT, R. J. Staphylococcal food poisoning in the

United Kingdom, 1969-1990. Epidemiology and Infection. v. 110, n. 3, p. 519-531, 1993.

WILSON, I. G. ; COOPER, J. E.; GILMOUR, A. Some factors inhibiting amplification of

the Staphylococcus aureus enterotoxin C1 gene (sec) by PCR. International Journal of

Food Microbiology. v. 22, p. 55-62, 1994.

ZAHA, A.; SCHRANK, A.; LORETO, E. L. S.; FERREIRA, H. B. F.; SCHRANK, I. S.;

RODDRIGUES, J. J. S.; REGNER, L. P.; PASSAGLIA, L. M. P.; ROSSETTI, M. L. R.;

VAINSTEIN, M. H.; SILVA, S. C.; GAIESKY, V. L. S. V. Biologia Molecular Básica. 3

Ed. Porto Alegre: Mercado Aberto, 2003. 424p.

ZHANG, S.; IANDOLO, J.J.; STEWART, G.C., 1998. The enterotoxin D plasmid of

Staphylococcus aureus encodes a second enterotoxin determinant (sej). FEMS

Microbiology Letters. v. 168, p. 227-233, 1998.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

4-OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GERAL

Caracterizar feno e genotipicamente as amostras de Staphylococcus spp. isoladas de

queijos de coalho e leite de vacas com mastite no Estado de Pernambuco.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Verificar a prevalência do S. aureus como agente causador de mastite bovina na

região Agreste do Estado de Pernambuco;

• Avaliar a qualidade microbiológica dos queijos de coalho comercializados em

Pernambuco com relação à contagem de Staphylococcus coagulase positiva;

• Isolar e identificar fenotipicamente os Staphylococcus spp. a partir de queijos de

coalho e leite de vacas com mastite;

• Traçar o perfil de sensibilidade antimicrobiana dos Staphylococcus coagulase

positivos isolados de queijos de coalho e de leite de vacas com mastite frente aos

antibióticos mais utilizados na clínica médica veterinária e humana;

• Realizar a tipagem molecular das cepas de Staphylococcus aureus isoladas de

mastite bovina;

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

• Investigar a presença de genes para as toxinas SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG,

SEH, SEI SEJ, TSST-1, ETA e ETB em cepas de Staphylococcus spp. isoladas de

queijos de coalho e leite de vacas com mastite;

• Confirmar a presença dos fragmentos dos genes para as toxinas estafilocócicas que

foram detectados em isolados de Staphylococcus spp. de queijos de coalho e leite de

vacas com mastite.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 ARTIGO CIENTÍFICO 1: PERFIL DE SENSIBILIDADE ANTIMICROBIANA IN

VITRO DE STAPHYLOCOCCUS COAGULASE POSITIVOS ISOLADOS DE LEITE DE

VACAS COM MASTITE NO AGRESTE DO ESTADO DE PERNAMBUCO

Este trabalho foi publicado na revista Arquivos do Instituto Biológico v. 72, n. 2, p.

171-177, abril/junho de 2005.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

RESUMO

A mastite, inflamação da glândula mamária, é uma das principais doenças da

bovinocultura de leite tendo como principal agente infeccioso bactérias do gênero

Staphylococcus spp. que comumente apresentam resistência aos antibióticos utilizados no

tratamento da mastite. Desta forma, objetivou-se com este estudo traçar o perfil de

sensibilidade antimicrobiana de 59 cepas de estafilococos coagulase positivo, isolados de

amostras de leite de vaca com mastite. Os testes de sensibilidade antimicrobiana foram

realizados através da técnica de difusão com discos para 13 antibióticos, verificando-se que

os mais eficazes foram a vancomicina com 100% de sensibilidade e a norfloxacina com

96%. O menos eficaz foi a penicilina com 20% de sensibilidade. Em alguns municípios

estudados as cepas de estafilococos apresentaram resistência múltipla para 6 a 9

antibióticos simultaneamente. Conclui-se que a análise da sensibilidade antimicrobiana in

vitro deve ser considerada pelos proprietários antes da tomada de decisões para a escolha

do tratamento adequado para reduzir perdas na produção de leite e em programas de

controle da doença em questão.

PALAVRAS-CHAVES: Staphylococcus spp., sensibilidade antimicrobiana, mastite

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

ABSTRACT

Mastitis, inflammation of the mammary gland, is one of the main diseases of the

milk cattle breeding, having, as main infectious agent the Staphylococcus spp. bacteria,

which commonly presents resistance to the antibiotics used in the treatment of mastitis. For

this reason, this study is aimed at drawing the profile of anti-microbial sensibility of 59

stumps of coagulase-positive staphylococcus, isolated from samples of cow milk with

mastitis. The tests of anti-microbial sensibility were accomplished through a diffusion

technique with disks for 13 antibiotics, being verified that the most effective were

vancomycin with 100% of sensibility and norfloxacin with 96%. The least effective was

penicillin with 20% of sensibility. In some of the studied municipal districts the

staphylococcus stumps presented multiple resistance to from 6 to 9 antibiotics

simultaneously. The conclusion is that the analysis of the anti-microbial sensibility in vitro

should be considered by the proprietors before taking decisions about the choice of the

appropriate treatment in order to reduce losses in the production of milk and in control

programs of the disease in subject.

KEYWORDS: Staphylococcus spp., Antimicrobial Susceptibility, Bovine, Mastitis

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

INTRODUÇÃO

Mastite é a denominação do processo inflamatório da glândula mamária. Sua

etiologia pode ser de origem tóxica, traumática, alérgica, metabólica e infecciosa, sendo as

causas infecciosas as principais, destacando-se as de origem bacteriana. Os patógenos

causadores de mastite têm sido classificados em dois grupos diferentes: contagiosos e

ambientais. Os chamados contagiosos necessitam do animal para a sobrevivência,

multiplicam-se na glândula mamária, canal do teto ou sobre a pele, são transmitidos de uma

vaca infectada ou quarto mamário infectado para uma vaca sadia ou quarto sadio,

principalmente durante a ordenha. Os patógenos ambientais são oportunistas, estão

presentes no ambiente em que o animal vive e a infecção pode ocorrer no período entre ou

durante a ordenha (COSTA, 1998).

Os microrganismos mais comuns em casos de mastite bovina são Staphylococcus

aureus, Staphylococcus spp., Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis,

Corynebacterium spp., Escherichia coli, Nocardia spp. e Prototheca zopffi (BRABES et al.,

1999).

Dentre os patógenos contagiosos, o Staphylococcus aureus (S. aureus) é o mais

freqüente nos casos de mastite bovina (Z

SCHÖCK et al., 2000). Possui vários fatores de

virulência que contribui para sua persistência no tecido mamário e, embora medidas

preventivas que visam o controle das mastites sejam amplamente praticadas, as mastites

causadas por este patógeno ainda são bastante comuns (P

HILPOT, 1984; SANTOS et al.,

2003).

O S. aureus é mundialmente conhecido como agente causador de várias doenças

purulentas tanto em humanos como em animais (B

EAN & GRIFFIN, 1990) sendo também,

uma das causas mais importantes de intoxicação alimentar (P

ENNA et al., 1998), devido a

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

produção de várias enterotoxinas (OMOE et al., 2002). Desta forma, o leite e produtos

derivados são importantes veículos de S. aureus e comumente estão envolvidos em surtos

de intoxicação alimentar (BERGDOLL, 1989).

As infecções intramamárias são freqüentes e importantes em bovinos leiteiros,

sendo responsáveis por grandes prejuízos à pecuária leiteira pois ocasionam redução na

produção de leite, gastos com medicamentos e assistência veterinária, descarte de leite

contaminado após tratamento e descarte precoce de animais doentes (COSTA et al., 1999).

Além disso, as mastites adquirem importância para a Saúde Pública pela possibilidade de

veiculação de microrganismos, toxinas e resíduos de antimicrobianos no leite (COSTA,

1998).

O S. aureus além de ser responsável por grandes prejuízos à pecuária leiteira,

apresenta resistência a diversos antibióticos utilizados rotineiramente no tratamento desta

doença. Desta forma, é de grande importância o isolamento e identificação desse agente em

laboratórios e a análise in vitro da sensibilidade antimicrobiana para um melhor controle

através de terapêutica adequada. Segundo BRITO et al. (2001), diversos estudos que tratam

da susceptibilidade a antimicrobianos de patógenos da mastite bovina no Brasil apontam

para um aumento crescente no padrão de resistência, principalmente para S. aureus, o

agente mais freqüentemente isolado.

Os resíduos de antibióticos no leite podem aparecer devido ao tratamento parenteral

e ou intramamário de animais em lactação e representam o principal ponto crítico de

controle de contaminação química no leite. Os riscos à saúde do consumidor são

apresentados principalmente pelo desencadeamento de fenômenos alérgicos em indivíduos

sensíveis, pelos efeitos tóxicos e carcinogênicos, por alterações no equilíbrio da microbiota

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

intestinal e pela seleção de bactérias resistentes no trato digestivo dos consumidores

(MANSUR et al., 2003).

Diante do exposto, este trabalho teve como finalidade verificar quais são os

microrganismos mais freqüentes em casos de mastite bovina e avaliar a sensibilidade

antimicrobiana in vitro de amostras de Staphylococcus coagulase positivo para contribuir

com os estudos de etiologia, tratamento e controle desta doença em diferentes municípios

da região do Agreste do Estado de Pernambuco.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram analisados 246 animais procedentes de onze propriedades de exploração

leiteira dos municípios de Angelim (município A), São Bento do Una (município B),

Caetés (município C) e Correntes (município D), localizados no Agreste do Estado de

Pernambuco.

Nos rebanhos estudados o sistema de criação era semi-intensivo, sendo os animais

alimentados à base de concentrado e volumoso e recebendo água procedente de poços e

açudes, com produção média diária de 7,5 litros de leite por animal. Os animais eram

ordenhados uma ou duas vezes ao dia, pelo sistema de ordenha manual ou mecânica

(municípios A e B) ou apenas manual (Município C e D). A raça predominante nos

rebanhos leiteiros estudados era holandesa, porém em algumas propriedades observou-se a

utilização de animais da raça girolanda, guzerá leiteiro e seus mestiços.

Após prévia lavagem do úbere com água e sabão, secagem com papel toalha e anti-

sepsia do óstio da teta com álcool a 70ºGL as amostras de leite foram colhidas dos quartos

mamários com mastite clínica, positivos ao teste da caneca telada, e daquelas com mastite

subclínica, positivos ao California Mastitis Test (CMT) (SCHALM & NOORLANDER, 1957).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Colheu-se aproximadamente 5 mL de leite, em frascos com tampa rosqueável, estéreis e

previamente identificados com o nome ou número do animal e do quarto mamário, sendo

enviadas sob refrigeração ao Laboratório de Doenças Infecto-Contagiosas da Universidade

Federal Rural de Pernambuco, para serem devidamente processadas.

A lactocultura foi realizada em placas contendo Ágar Base (DIAGNOLAB®),

acrescido de 8% (v/v) de sangue ovino desfibrinado e em Ágar Levine (OXOID®). As

placas foram incubadas em aerobiose a 37ºC por 72 horas, sendo analisadas a cada 24

horas.

Observaram-se características de crescimento das colônias em placa, como

produção de hemólise, pigmento e características morfo-tintoriais utilizando o método de

coloração pela técnica de Gram. Para a identificação de Staphylococcus aureus todas as

cepas de estafilococos foram submetidas aos testes de produção de coagulase livre (Plasma

Coagulase EDTA, Coagu-Plasma LB – Laborclin, Brasil), termonuclease (Tnase – Ágar

Azul de Orto-toluidina-DNA) e catalase, segundo SILVA et al. (1997). As provas de

produção de acetoína, fermentação da glicose (aerobiose) e do manitol (aerobiose e

anaerobiose) foram realizadas segundo MAC FADDIN (1980). Sendo os isolados

classificados de acordo com B

AIRD-PARKER (1990).

A identificação de outras bactérias Gram-positivas foi realizada segundo QUINN et

al. (1994) e para as enterobactérias foram utilizadas as seguintes provas bioquímicas:

produção de urease, reação em Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI) (B

IOBRÁS®), teste de

VM/VP (VM - reação de Vermelho de Metila; VP - reação de Voges-Proskauer), teste em

Ágar SIM (S - produção de H

S; I - produção de Indol; M - motilidade) (MERCK®) e teste

em Ágar Citrato (utilização do carbono do citrato) (MERCK®), sendo identificadas de

acordo com C

ARTER (1988).

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Os testes de sensibilidade antimicrobiana in vitro dos isolados de S. aureus e outros

estafilococos coagulase positivos foram realizados utilizando a técnica de difusão em ágar

segundo BAUER et al. (1966) em Ágar Müeller Hinton (MERCK®), utilizando os seguintes

discos impregnados de antibióticos: amoxicilina (10 µg), bacitracina (10 U.I.),

cloranfenicol (30 µg), eritromicina (15 µg), enrofloxacina (5 µg), gentamicina (10 µg),

lincomicina (2 µg), norfloxacina (10 µg), novobiocina (30 µg), oxacilina (1 µg), penicilina

(10 U.I.), sulfa (25 µg) + trimetoprim (5 µg), tetraciclina (30 µg) e vancomicina (30 µg)

(CECON® / LABORCLIN®).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram analisados 246 animais, totalizando 984 quartos mamários. Destes, 10

(1,0%) apresentaram mastite clínica, 562 (57,1%) mastite subclínica e 412 (41,9%) foram

negativos.

Correlacionando o teste do CMT com o exame microbiológico, verificou-se que dos

562 quartos mamários com mastite subclínica, ou seja, reagentes ao CMT, 356 (63,3%)

foram positivos ao exame microbiológico e 206 (36,7%) foram negativos. Os resultados

positivos no CMT, mas negativos no exame microbiológico, pode indicar um processo

inflamatório de etiologia não bacteriana, pois segundo C

OSTA et al. (1996), o CMT é um

método auxiliar de boa correlação com o exame microbiológico, porém o processo

inflamatório pode não ser de origem infeciosa.

Mesmo apresentando alguns resultados positivos no CMT mas que não indique

processo infeccioso, este teste deve ser rotineiramente executado para que medidas no

manejo dos animais e na linha de ordenha sejam adotadas para garantir máxima produção e

qualidade do leite.

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Os microrganismos isolados das 572 amostras de leite de vaca com mastite

encontram-se na Tabela 1, verificando-se que os agentes mais prevalentes nos casos de

mastite bovina no Agreste do Estado de Pernambuco foram Staphylococcus coagulase

negativa 36%, Corynebacterium spp. 34,8% e Staphylococcus aureus 13,6%, corroborando

com achados de PITKÄLÄ et al. (2004) que observaram que o agente etiológico mais

prevalente nos casos de mastite bovina na Finlândia foi Staphylococcus coagulase negativa

(49,6%) seguido por Corynebacterium bovis (34,4%).

Tabela 1 – Microrganismos isolados de leite de vacas com mastite em municípios do

Agreste do Estado de Pernambuco, 2005

MICRORGANISMOS FA FR

Staphylococcus Coagulase Negativa 172 36,0%

Corynebacterium spp. 166 34,8%

Staphylococcus aureus

65 13,6%

Bacillus spp. 25 5,30%

Micrococcus spp. 19 4,00%

Streptococcus spp. 18 3,80%

Staphylococcus Coagulase Positiva 7 1,50%

Enterobacter spp. 3 0,60%

Escherichia coli

2 0,40%

TOTAL 477 100,0%

FA – Freqüência Absoluta

FR – Freqüência Relativa

Segundo GENTILINI et al. (2002) atualmente os estafilococos coagulase negativo

têm recebido maior importância como agentes causadores de infecções intramamárias em

bovinos leiteiros em todo o mundo.

OSTA et al. (1995) observaram que o agente etiológico mais prevalente nos casos

de mastite bovina em propriedades nos estados de São Paulo e Minas Gerais foi

Staphylococcus spp. (34,09%), porém

BRITO et al. (1999) verificaram maior prevalência

100

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

para Corynebacterium spp. (55,2%) como agente etiológico de mastite bovina em rebanhos

localizados na Zona da Mata e Campo das Vertentes do Estado de Minas Gerais.

Na mesma região avaliada neste estudo, ou seja, Agreste do Estado de Pernambuco,

PINHEIRO DE SÁ et al. (2000) verificaram que os microrganismos mais comuns em casos de

mastite bovina foram Staphylococcus spp. (32,6%) e Corynebacterium spp. (13,2%),

porém, entre os estafilococos isolados, a espécie S.aureus apresentou maior prevalência

(66,4%). No entanto, apesar de se tratar da mesma região os resultados foram divergentes

aos obtidos neste estudo, pois os estafilococos coagulase negativa foram mais prevalentes

que o S.aureus. O gênero Corynebacterium spp. apresentou maior percentual de isolamento

(34,7%) em relação ao observado por PINHEIRO DE SÁ et al. (2000).

O perfil de sensibilidade antimicrobiana de 59 amostras de estafilococos analisadas

encontra-se na Tabela 2, das quais 52 amostras eram de S. aureus e 07 amostras de

Staphylococcus coagulase positiva. Os percentuais gerais de sensibilidade, resistência e

sensibilidade intermediária foram de 64,5%, 28,5% e 7,0%, respectivamente. Os

antibióticos mais eficazes foram a vancomicina com 100% de eficácia e a norfloxacina com

96% e os menos eficazes penicilina com apenas 20% de sensibilidade e amoxicilina com

25% (Tabela 2).

Resultados semelhantes foram obtidos por B

RITO et al. (2001) que observaram que

a norfloxacina apresentou 100% de eficácia para cepas de estafilococos isoladas de mastite

bovina na Zona da Mata do Estado de Minas Gerais. A alta eficácia da vancomicina deve-

se, possivelmente, ao pouco uso deste antibiótico em medicina veterinária, pois em

nenhuma das propriedades estudadas este medicamento era utilizado.

101

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Tabela 2- Análise geral do perfil de sensibilidade antimicrobiana de 59 cepas de

estafilococos coagulase positivas isoladas de amostras de leite de vacas com

mastite no Agreste do Estado de Pernambuco, 2005

Antibióticos Sensível Intermediário Resistente

Amoxicilina 25% 0% 75%

Penicilina 20% 0% 80%

Oxacilina 65% 20% 15%

Vancomicina 100% 0% 0%

Gentamicina 42% 7% 51%

Lincomicina 32% 12% 56%

Norfloxacina 96% 2% 2%

Enrofloxacina 88% 3% 9%

Tetraciclina 71% 3% 26%

Novobiocina 71% 14% 15%

Cloranfenicol 83% 10% 7%

Sulfa+Trimetoprim 95% 5% 0%

Bacitracina 48% 15% 37%

Os resultados apresentados revelaram altos índices de resistência tanto para a

amoxicilina quanto para a penicilina. A amoxicilina pertence ao mesmo grupo de

antibióticos beta-lactâmicos e geralmente os estafilococos mostram elevada resistência

(acima de 70%) à penicilina G, bem como, ampicilina, amoxicilina e carbenicilina

(TAVARES, 2000). Os estafilococos isolados de leite de vacas com mastite quase sempre

apresentam altos índices de resistência à penicilina (ANDRADE et al., 2000; COSTA et al.,

2000; BYARUGABA et al., 2004). Porém, através de testes de sensibilidade in vitro, é

possível detectar cepas de estafilococos sensíveis e sugerir a utilização da penicilina no

tratamento in vivo, ao invés, de um medicamento de última geração. Devendo lembrar que

muitas vezes um antibiótico apresenta-se sensível no teste in vitro, mas não tem boa

eficácia in vivo.

Analisando individualmente os resultados de resistência das amostras de

estafilococos isoladas de leite de vacas com mastite por município estudado e por

antibiótico testado (Figura 1), observou-se que a amoxicilina apresenta baixa eficácia em

102

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

todos os municípios, a penicilina poderia ser indicada para tratamento de mastite no

município D e a norfloxacina em todos os municípios exceto o B. A gentamicina foi 100%

eficaz apenas para isolados do município C (Figura 1).

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

90,0%

100,0%

Lin

Município A

Município B

Município C

Município D

Figura 1- Comparação da resistência antimicrobiana de cepas de estafilococos coagulase

positivo por antibióticos e municípios estudados (A, B, C e D) no Agreste do

Estado de Pernambuco, 2005

Na Figura 1, observa-se que a gentamicina e a lincomicina apresentaram maior

resistência no município B, a sulfa+trimetoprim no A e que a vancomicina foi 100% eficaz

em todos os municípios estudados.

Segundo L

ANGONI et al. (2000) a gentamicina continua sendo um antibiótico eficaz

para o tratamento das mastites bovinas de origem bacteriana da mesma forma que vários

autores verificaram altos índices de sensibilidade de estafilococos isolados de casos de

mastite a este antibiótico (C

OSTA et al., 2000; BRITO et al., 2001; WATANABE et al., 2001;

YARUGABA, 2004). No entanto, no presente estudo verificou-se alto nível de resistência a

103

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

este antibiótico, principalmente no Município B, onde este antibiótico era mais

freqüentemente utilizado para tratar os animais com mastite.

No Agreste do Estado de Pernambuco, OLIVEIRA et al. (2002) observaram que as

amostras de estafilococos isoladas de casos de mastite bovina foram 100% sensíveis a

gentamicina, não corroborando com os resultados desta atual pesquisa, onde valores

elevados de resistência dos estafilococos foram encontrados, principalmente no município

onde este era o antibiótico de eleição no tratamento das mastites. Este fato reflete ainda

mais a importância dos exames laboratoriais e como o uso indiscriminado de um

determinado antibiótico seleciona bactérias resistentes.

A alta resistência para a sulfa+trimetoprim em apenas um dos municípios estudados

(Município A, Figura 1) pode estar associada ao uso deste quimioterápico para tratar

mastites, uma vez que as sulfas são principalmente utilizadas no tratamento preventivo de

septicemias em animais com mastites por coliformes (OLIVEIRA et al., 2000), ou ainda pelo

uso de sulfa no tratamento de parasitoses como a coccidiose bovina.

Ao analisar as amostras de estafilococos resistentes, verificou-se que no município

A mais de 60% das amostras foram resistentes para 6 a 9 antibióticos simultaneamente. No

município B esta multirresistência foi maior para 4 a 5 antibióticos. No C para 2 a 3 e no D

todas as amostras apresentaram-se resistentes para 2 a 3 antibióticos (Figura 2).

O alto percentual de multirresistência revelado pelos isolados de S. aureus nos

municípios estudados é preocupante, pois muitos dos antibióticos disponíveis no mercado

não teriam efeito sobre esta bactéria dificultando ou impossibilitando o tratamento dos

animais com mastite e trazendo maiores gastos e prejuízos para os proprietários.

104

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

90,0%

100,0%

Resistente para

2 a 3

Antibióticos

Resistente para

4 a 5

Antibióticos

Resistente para

6 a 9

Antibióticos

Município A

Município B

Município C

Município D

Figura 2 - Perfil de resistência múltipla de Staphylococcus coagulase positivos isolados de

leite de vacas com mastite nos (Município A, B, C e D) do Agreste do Estado de

Pernambuco, 2005

Nas propriedades dos municípios A e B de ordenha manual e mecânica verificou-se

maiores índices de resistência em relação às propriedades dos municípios C e D onde a

ordenha era exclusivamente manual. Outro aspecto interessante é que nas propriedades dos

municípios C e D os proprietários dificilmente tratavam os animais com mastite, preferiam

retirá-los do plantel. Talvez a pouca utilização de antibióticos tenha contribuído para a

baixa resistência apresentada pelos isolados dos municípios C e D.

Devido ao alto custo para a realização da cultura do leite mastítico, isolamento e

identificação dos agentes infecciosos e testes de sensibilidade antimicrobiana, muitas

propriedades terminam gastando muito mais com antibióticos que já não apresentam

eficácia, aumentando o número de bactérias resistentes, além de muitas vezes aumentar a

dosagem destes produtos na tentativa de melhorar sua eficiência contribuindo, muitas vezes

para riscos como presença de resíduos medicamentosos acima dos limites permitidos no

leite consumido pela população.

105

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Os resultados obtidos neste estudo ressaltam a importância da avaliação da

sensibilidade antimicrobiana in vitro para cepas de Staphylococcus spp. isoladas de casos

de mastite bovina antes da indicação do tratamento para os animais. Pois, antibióticos como

a gentamicina que geralmente apresenta alta eficácia pode apresentar-se ineficaz,

principalmente naquelas propriedades onde seu uso é freqüente e inadequado, aumentando

os custos da produção. A penicilina, que mesmo sendo um antibiótico de baixa eficácia

também pode ser indicado para tratamento, após prévia análise laboratorial, antes da

indicação de antibióticos mais recentes, de última geração que devem ser utilizados em

último caso para evitar resistência e servir como mais uma ferramenta no controle das

mastites. Estes dados também demonstram que muitas vezes por não quererem ter custos a

mais realizando testes laboratoriais para propor um adequado tratamento e melhores

medidas de controle, os proprietários terminam tendo mais gastos com a utilização de

antibióticos ineficazes que não estariam atuando sobre um dos principais agentes

responsáveis pela mastite bovina resultando em perda na produção de leite.

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos oferecem subsídios aos criadores quanto ao perfil de

sensibilidade aos antimicrobianos, contribuindo dessa forma para o tratamento e controle

das mastites causadas por estafilococos coagulase positivos nos rebanhos estudados. A

presença de cepas de estafilococos multirresistentes é preocupante para a clínica veterinária

e para a Saúde Pública, pois o leite é fonte de renda para criadores de bovinos e também é

um alimento indispensável na dieta de pessoas de várias faixas etárias.

106

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Andrade, M. A.; Dias Filho, F. C.; Mesquita, A. J.; Rocha, P. T. Sensibilidade in vitro de

Staphylococcus aureus isolados de amostras de leite de vacas com mastite subclínica.

Ciência Animal Bras., v. 1, n. 1, p. 53-57, 2000.

Baird-Parker, A.C. The Staphylococci: an introduction. J. Appl. Bacteriol., Supp. v.19, p.

15-85, 1990.

Bauer, A. W.; Kirby, W. M. M.; Sherrris, J. C.; Turck, M. Antibiotic susceptibility testing

by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol., v. 45, n. 4, p. 493-496, 1966.

Bean, N. H. & Griffin, P. M. Foodborne disease outbreaks in the United States, 1973-1987:

pathogens, vehicles, and trends. J. Food Protec., v. 53, n. 9, p. 804-817, 1990.

Bergdoll, M.S. Staphylococcus aureus. In: Foodborne Bacterial Pathogens. New York:

Marcell Dekker, 1989, p. 463-523.

Brabes, K. C. S.; Carvalho, E. P.; Dionísio, F. L.; Pereira, M. L.; Garino, F.; Costa, E. O.

Participação de espécies coagulase positivas e negativas produtoras de enterotoxinas do

gênero Staphylococcus na etiologia de casos de mastite bovina em propriedades de

produção leiteira dos Estados de São Paulo e Minas Gerais. NAPGAMA, v. 2, n.3, p. 4-11,

1999.

107

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Brito, M. A. V. P.; Brito, J. R. F.; Ribeiro, M. T.; Veiga, V. M. O. Padrão de infecção

intramamária em rebanhos leiteiros: exame de todos os quartos mamários de vacas em

lactação. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v. 51, n. 2, p. 129-135, 1999.

Brito, M.A.V.P.; Brito, J.R.F.; Silva, M.A.S.; Carmo, R.A. Concentração mínima inibitória

de dez antimicrobianos para amostras de S. aureus isoladas de infecção intramamária

bovina. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.53, n.5, p. 10-17, 2001.

Byarugaba, D. K. A view on antimicrobial resistance in developing countries and

responsible risk factors. Int. J. Antimicrob. Agents., v. 24, p. 105-110, 2004.

Carter, G. R. Fundamentos da Bacteriologia e Micologia Veterinária. São Paulo: Roca.,

1988. 249p.

Costa, E.O.; Carciofi, A.C.; Melville, P.A.; Prada, M. S.; Schalch, U. Estudo etiológico da

mastite clínica bovina. Rev. Bras. Med. Vet., v.17, p. 156-159, 1995.

Costa, E. O.; Mielville, P. A.; Ribeiro, A. R.; Viani, F. C.; Mascolli, R.; Liveira, P. J.

Mastite bovina: CMT versus microbiológico. A Hora Vet., v. 15, n. 89, p. 53-54, 1996.

Costa, E.O. Importância da mastite na produção leiteira do Brasil. Revista de Educação

Continuada do CRMV-SP., v. 1, p. 3-9, 1998.

108

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Costa, E. O.; Sá, R.; Ponce, H.; Watanabe, E. T.; Valle, C. R. Avalização da terapia de

mastite clínica: eficácia terapêutica medida em número de dias em tratamento. NAPGAMA,

v. 2, n. 2, p. 10-14, 1999.

Costa, E. O.; Benitis, N. R.; Guerra, J. L.; Guerra, J. L.; Melville, P. A. Antimicrobial

susceptibility of Staphylococcus spp. Isolated from mammary parenchymas of slaughtered

dairy cows. J. Vet. Med B., v. 47, p. 99-103, 2000.

Gentilini, E.; Denamiel, G.; Betancor, A. Antimicrobial susceptibility of coagulase-

negative staphylococci isolated from bovine mastitis in Argentina. J. Dairy Sci., v. 85, p.

1913-1917, 2002.

Langoni, H.; Mendonça, A. O.; Develley, A. Avaliação do uso da associação da bromexina

com gentamicina no tratamento da mastite subclínica bovina. NAPGAMA, n. 1, p. 4-7,

2000.

Mansur, P. U.; Folly, M. M.; Carlos, L. A.; Araújo, F. M.; Gai, Z. T.; Teixeira, G. N.

Avaliação do período de persistência do antibiótico cloxacilina no leite de vacas com

mastite subclínica. Rev. Hig. Alim., v. 17, n. 104/105, p. 106, 2003.

Mac Faddin, J.F. Biochemical test for identification of medical bacteria. 2ed. Baltimore:

Williams & Wilkins, 1980. 527p.

109

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Oliveria, A. P.; Watts, J. L.; Salmont, S. A. Antimicrobial susceptibility of Staphylococcus

aureus isolated from bovine mastitis in Europe and United States. J. Dairy Sci., v. 88, p.

855-862, 2000.

Oliveira, A. A. F.; Mota, R. A.; Souza, M. I.; Sá, M. E. P. Perfil de Sensibilidade

Antimicrobiana in vitro frente a amostras de Staphylococcus spp isoladas de mastite

subclínica bovina, no Agreste meridional de Pernambuco. Hora Vet. v. 22, n. 127, p. 8-10,

2002.

Omoe, K.; Ishikawa, M.; Shimoda, Y. Hu, D.; Ueda, S.; Shinagawa, K. Detection of seg,

she, and sei genes in Staphylococcus aureus isolates and determination of the enterotoxin

productivities of Staphylococcus aureus isolates harborin seg, seh, or sei genes. J. Clin.

Microbiol. v.40, n. 3, p.857-862, 2002.

Penna, T.C.V.; Colombo, A.J.; Abe, L.E.; Machoshvili, S.A. Parâmetros de resistência

térmica de cepas de Staphylococcus aureus enterotoxigênicos no leite. Rev. Farm. Bioq.,

v.24, p.113-117, 1998.

Philpot, W. N. Control of mastitis by hygiene and therapy. Vet Clin North Am Large Anim

Pract., v. 6, p. 233-245, 1984.

Pinheiro de Sá, M. E.; Mota, R. A.; Souza, M. I.; Oliveira, A. A. F. Etiologia da mastite

subclínica em bovinos leiteiros do agreste meridional do Estado de Pernambuco. R. Bras.

Ci. Vet., v. 7, n. 2, p. 100-1003, 2000.

110

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Pitkälä, A.; Haveri, M.; Pyörälä, S.; Myllys, V.; Honkanen-Buzalski, T. Bovine Mastitis in

Finland 2001 – prevalence, distribution of bacteria, and antimicrobial resistance. J. Dairy

Sci., v. 87, p. 2433-2441, 2004.

Quinn, P. J.; Carter, M.E.; Markey, B.; Carter, G. R. Clinical Veterinary Microbiology,

London: Wolfe, 1994. 648p.

Santos, F. G. B.; Mota, R. A.; Silveira-Filho, V. M.; Souza, H. M.; Oliveira, M. B. M.;

Johner, J. M. Q.; Leal, N. C.; Almeida, A. M. P.; Leal-Balbino, T. C. Tipagem molecular

de Staphylococcus aureus isolados do leite de vacas com mastite subclínica e equipamentos

de ordenha procedentes do estado de Pernambuco. NAPGAMA, v. 6, n. 1, p. 19-23, 2003.

Schalm, O. W. & Noorlander, D. O. Experiments and observations leading to development

of the California Mastitis Test. J. Am. Vet. Med. Assoc., v. 130, n. 5, p. 199-207, 1957.

Silva, N.; Junqueira, V. C. A.; Silveira, N. F. A. Manual de métodos de análise

microbiológica de alimentos. São Paulo: Varela, 1997. 295p.

Tavares, W. Bactérias gram positivas: resistência do estafilococo, do enterococo e do

pneumococo aos antimicrobianos. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., v. 33, n. 3, p. 281-301, 2000.

Watanabe, E. T.; Ribeiro, A. R.; Silva, J. B.; Garino Jr., F.; Costa, E. O. A valiação in vitro

e in vivo da eficiência dos antimicrobianos no tratamento de casos de mastite clínica

bovina. NAPGAMA, v. 4, n. 1, p. 9-14, 2001.

111

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Zschöck, M.; Botzler, D.; Blöcher, S.; Sommerhäusen, J.; Hamann, H. P. Detection of

genes for enterotoxins (ent) and toxic shock syndrome toxin-1 (tst) in mammary isolates of

Staphylococcus aureus by polymerase-chain-reaction. Int. Dairy J., v. 10, p. 569-574, 2000.

112

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

5.2 ARTIGO CIENTÍFICO 2: ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO MOLECULAR DE

STAPHYLOCOCCUS AUREUS ASSOCIADOS A MASTITE BOVINA PROVENIENTES

DO ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL

Este trabalho foi aceito para publicação na Revista Napgama (Anexo 1).

113

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

RESUMO

Para melhor compreender a complexidade etiológica do S. aureus como agente

causador da mastite bovina, foi analisada uma amostra casual aleatória constituída de duas

fazendas de exploração leiteira no estado de Pernambuco. Foram coletadas 126 amostras de

leite mastítico provenientes de 63 vacas, além de 27 swabs de conjuntos de ordenhadeiras,

pele do úbere e mãos de ordenhadores. Foram isolados 27 S. aureus de amostras de leite de

vacas com mastite subclínica e equipamento de ordenha mecânica. Os isolados de S. aureus

foram caracterizados pela técnica de PCR-RFLP do gene da coagulase em dois perfis

genotípicos, provavelmente, em virtude da manutenção constante dos plantéis e

predominância de clones específicos de S. aureus na região. Foi identificado o mesmo

perfil genotípico entre um isolado de S. aureus procedente do equipamento de ordenha e de

animais com infecção subclínica, sugerindo a ausência dos princípios adequados de limpeza

e desinfecção dos equipamentos de ordenha mecânica. Todos os isolados submetidos ao

teste de sensibilidade antimicrobiana foram resistentes à gentamicina e sensíveis à

vancomicina, independente do coagulotipo considerado. Entretanto, foi constatada uma

variação quanto à distribuição dos clones nas propriedades em estudo, sugerindo uma

possível correlação entre a presença dos diferentes clones, o manejo-higiênico sanitário e o

sistema de criação adotado nas propriedades analisadas, mostrando que as técnicas

moleculares utilizadas constituem ferramenta útil em investigações epidemiológico das

mastites bovinas causadas por S. aureus.

Unitermos: Mastite bovina, S. aureus, gene da coagulase, PCR-RFLP, sensibilidade in

vitro, antimicrobianos

114

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

ABSTRACT

Staphylococcus aureus is considered the most frequently occurring major patogen

of cow´s mammary gland. In order to find out the etiological complexity of the S. aureus as

causing agent of the bovine mastitis, a random casual sample of two dairy farms of milk

exploration in the state of Pernambuco was analyzed, where 126 mastitic milk bovine had

been collected proceeding from 63 cows, beyond 27 swabs sets of milking equipment,

udder’s skin and dairy workers’ hands. Had been isolated 27 S. aureus from bovine mastitic

milk with subclinical mastitis and equipment of milks mechanics. S. aureus isolated strains

had been characterized by the technique of PCR-RFLP of the gene of coagulase in two

genotype profiles, probably, in virtue of the constant maintenance of the breeding and

specific predominance of clones of S. aureus in the region. Genotype profile similarity was

identified enters an isolated of S. aureus originating the equipment of milks and of animals

with subclinical infection, suggesting the absence of the adequate principles of cleanliness

and disinfection of sets of milking equipment. All the isolated submitted to the test of

antimicrobiana sensitivity had been resistant to the gentamicin and sensible to the

vancomycin, independent of coagulotype considered. However, a variation was verified

around clones distribution in the farms analised, sugesting a probable relationship among

the presence of different clones, the sanitary management and the system of creation

adopted, showing that the used molecular techniques constitute a useful tool in inquiries

epidemiologist of the bovine mastites caused by S. aureus.

Keywords: bovine mastitis, S. aureus, coagulase gene, PCR-RFLP, in vitro sensitivity,

antimicrobials

115

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

INTRODUÇÃO

A mastite é um processo inflamatório da glândula mamária, apresentando-se sob a

forma clínica ou subclínica de acordo com a intensidade da inflamação. A forma subclínica

é a mais importante devido a maior prevalência nos rebanhos, difícil detecção e longa

duração

Staphylococcus aureus destaca-se entre os agentes etiológicos da mastite bovina. As

infecções causadas por S. aureus respondem pobremente à terapia antimicrobiana, até

mesmo as administradas parenteralmente ou por via intramamária, pois este microrganismo

invade o tecido glandular onde pode e determina a formação de abscessos, a parede do

tecido conjuntivo formado dificulta o acesso dos agentes antimicrobianos no foco da

infecção, até mesmo quando estes atingem o órgão em concentrações terapêuticas

As estratégias de controle das mastites baseiam-se em medidas preventivas, tratamento

imediato dos casos clínicos e tratamento no período seco de casos subclínicos, sendo o

portador um elemento que não é considerado

. Contudo, estratégias de controle da mastite

têm apresentado sucesso relativamente limitado. O conhecimento da cadeia epidemiológica

de qualquer enfermidade é passo fundamental para que sejam aplicadas medidas ideais de

profilaxia e controle de uma doença

. Técnicas moleculares têm sido utilizadas na

identificação e comparação de cepas de S. aureus em estudos epidemiológicos

20,26

A técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é utilizada para estabelecer a

relação clonal em estudos epidemiológico-moleculares e permite subdividir as cepas de S.

aureus baseando-se no polimorfismo do gene da coagulase (coa). A região 3’–terminal do

gene coa contém uma seqüência de pequenas repetições em tandem de 81 pb que permitem,

pela análise do polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (PCR-RFLP),

116

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

diferenciar isolados de S. aureus pelo número das seqüências repetidas e pela localização

de sítios de restrição

O conhecimento do perfil molecular dos clones de S. aureus possibilita estudos

epidemiológicos para compreensão do padrão de dispersão deste patógeno em propriedades

rurais, oferecendo subsídios para elaboração de estratégias de profilaxia e controle das

mastites estafilocócicas no rebanho

. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo

realizar estudo epidemiológico-molecular de S. aureus associados à mastite bovina em

propriedades de exploração leiteira localizadas no município de São Bento do Una

(Pernambuco), a fim de oferecer subsídios para elaboração de protocolos para profilaxia e

controle desta afecção.

MATERIAL E MÉTODOS

Foi analisada uma amostra casual aleatória constituída de duas fazendas de

exploração leiteira localizadas no município de São Bento do Una, no Agreste de

Pernambuco, uma propriedade de ordenha manual (Propriedade A) e outra propriedade de

ordenha mecânica (Propriedade B). Os animais e equipamentos de ordenha também foram

selecionados aleatoriamente. As amostras de leite foram colhidas por ocasião da ordenha

matinal, realizando-se a lavagem do úbere com água e sabão, seguida de secagem com

toalha de papel descartável. Foi realizado como provas de triagem o exame de Tamis

(caneca telada) para diagnóstico de mastite clínica e o CMT (California Mastitis Test), para

diagnóstico da mastite subclínica, segundo Schalm; Noorlander

Foram coletadas 126 amostras de secreção láctea provenientes de 63 vacas cujos

quartos mamários foram diagnosticados com mastite clínica ou subclínica (2+ e 3+) nos

117

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

testes de triagem, no volume de 5 mL, em frascos estéreis antecedido pela anti-sepsia do

óstio do teto com álcool 70ºGL. Foram coletados 27 swabs dos conjuntos de ordenhadeiras

mecânicas, pele do úbere e mãos de ordenhadores nos intervalos entre as ordenhas e

acondicionados em tubos de ensaio estéreis contendo 2 mL de solução salina 0,85% (m/v).

Todo o material biológico foi transportado sob refrigeração em caixas isotérmicas para

análise microbiológica.

As lactoculturas foram realizadas em placas de ágar sangue acrescido 8% (v/v) de

sangue ovino desfibrinado e os swabs cultivados em meios seletivos ágar Levine e

Mannitol Salt Agar, incubados a 37ºC e analisados por 24 e 48 horas. Foram observadas as

características das colônias em placa, produção de hemólise e caracteres morfo-tintoriais

utilizando a coloração de Gram. A caracterização microbiológica de S. aureus foi realizada

pelas provas da produção de coagulase livre (Coagulo-Plasma LB-Larboclin-Brasil),

termonuclease, catalase, DNAse, manitol em aerobiose e fermentação dos açúcares glicose

e manitol. Os testes de sensibilidade in vitro dos isolados de S. aureus foram realizados em

ágar Müeller Hinton utilizando discos impregnados com antibióticos utilizados

rotineiramente na medicina humana e veterinária. O crescimento das zonas de inibição

foram avaliados após 24 horas de incubação a 37ºC de acordo com os padrões do National

Committee for Clinical Laboratory Standards

O DNA genômico dos isolados de S. aureus foi extraído segundo o método de

Maniatis et al.

. A amplificação do gene coa foi realizada utilizando os seguintes primers

específicos: COAG2 (5’ ACC ACA AGG TAC TGA ATC AAC G 3’) e COAG3 (5’ TGC

TTT CGA TTG TTC GAT GC 3’)1. As reações de amplificação foram preparadas

contendo 20 ng do DNA genômico, tampão PCR 10x (10 mM Tris-HCl, pH 9,0; 50 mM de

118

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

KCl), 1,5 mM de MgCl2, 1 uM de cada primer, 200 uM de desoxinucleotídeos trifosfato

(dNTP’s) e 1 U de Taq Polimerase (Invitrogen, Brasil), completando-se com água

deionizada estéril para um volume final de 50 uL. Nesse experimento foi utilizado como

controle positivo a cepa de S. aureus ATCC nº 25923. As amostras foram submetidas a 40

ciclos térmicos, cada um consistindo de 30 segundos a 95ºC, 2 minutos a 62ºC e 4 minutos

a 72ºC. Os produtos de PCR (amplicons) foram digeridos com as enzimas de restrição AluI

(BioLabs, New England) e HaeIII (Invitrogen, Brasil), após purificação com o QIAquick

PCR Purification Kit (Qiagen). Os fragmentos obtidos foram separados por eletroforese em

gel de agarose a 1,5%, corados com brometo de etídeo (15 mg/mL), visualizados e

fotografados em transiluminador de UV. Foi utilizado um marcador de peso molecular de

100 pb DNA ladder para estimar o tamanho dos amplicons e dos fragmentos de restrição.

RESULTADOS

Nos 252 quartos mamários analisados, pertencentes a 63 fêmeas bovinas em

diferentes estágios de lactação, 126 apresentavam mastite, sendo que 97,62% (123/126)

foram diagnosticadas como mastite subclínica, positivas (3+) ao CMT, enquanto que 2,38%

(3/126) foram diagnosticadas como mastite clínica positiva ao teste de Tamis. Entre as

amostras analisadas positivas para mastite, em 108 agentes infecciosos foram isolados, 64

do gênero Staphylococcus (48,85%), dos quais 26 (40,62%) foram S. aureus provenientes

exclusivamente de mastite subclínica. A partir da cultura dos 27 swabs coletados, uma

amostra de S. aureus foi obtida dos equipamentos de ordenha. Todos os 27 isolados de S.

aureus apresentaram b-hemólise em ágar sangue e foram positivos a todos os testes

bioquímicos.

119

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Todos os isolados caracterizados pelos métodos microbiológicos citados como S.

aureus amplificaram o gene coa na reação de PCR. A amplificação por PCR do gene coa

dos S. aureus isolados de vacas com mastite subclínica e de equipamento de ordenha

produziu dois perfis genotípicos. Dessa forma, os isolados foram distribuídos em dois

coagulotipos, de acordo com o tamanho do segmento amplificado (P1=750 pb e P2=1000

pb) (Figura 1). A cepa utilizada como controle positivo (S. aureus ATCC 25923)

amplificou um fragmento de 800 pb (Figura 1, linha 1).

A maioria dos isolados (85,18%) amplificou um fragmento de 1000 pb (P2). Este

perfil foi encontrado nas duas propriedades analisadas (Figura 1). O perfil P1 foi observado

em apenas quatro isolados (14,82%) (Figura 1, linhas: 2, 3, 5 e 6). As cinco amostras da

propriedade A apresentaram dois perfis diferentes (coagulotipos), com predominância do

fragmento de 750 pb (P1) presente em 80% dos isolados (Figura 1, linhas: 2, 3, 5 e 6). O

segundo coagulotipo (P2) foi encontrado em apenas 20% dos isolados (Figura1, linha 4).

Todos os 22 isolados da propriedade B (Figura 1, linhas: 7 a 27), inclusive o procedente do

equipamento de ordenha (Figura 1, linha 28) apresentaram o mesmo perfil de amplificação

(P2=1000 pb).

A digestão dos amplicons com as enzimas de restrição (ER) confirmou a presença

de dois clones na propriedade A e a presença de um clone na propriedade B (Figura 2;

Tabela 1). As amostras de 750 pb não foram digeridas com a ER AluI (Figura 2, linhas: 2, 3

5, e 6), e por isso foram também submetidas a digestão com a ER HaeIII que confirmou a

homogeneidade genotípica destas amostras (Figura 3, linhas: 2Hae, 3Hae, 5Hae e 6Hae). O

tamanho dos fragmentos de restrição (RFLP) estão descritos na Tabela 1.

120

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

O teste de sensibilidade antimicrobiano in vitro dos 2 isolados de S. aureus

demonstraram alto índice de resistência frente aos antimicrobianos: gentamicina (100%),

lincomicina (96,29%), penicilina G (85,18%) e amoxicilina (74,07%). Por outro lado,

foram observados altos índices de sensibilidade das amostras frente aos antimicrobianos:

norfloxacina (77,78%), enrofloxacina (85,18%), sulfa+trimetoprim (96,29%) e

vancomicina (100%) (Figura 4A). Adicionalmente foi observado perfil de multirresistência

entre os isolados de S. aureus de São Bento do Una predominando 6-7 antibióticos

simultaneamente (Figura 4B).

DISCUSSÃO

A produção leiteira em Pernambuco constitui-se numa das principais atividades

econômicas, concentrando-se principalmente na Região do Agreste Pernambucano, que é

responsável por mais da metade da produção estadual. O leite e seus derivados produzidos

nesta região abastecem as cidades locais e a Região Metropolitana do Recife, atingindo

grande contingente populacional

. Apesar do Estado de Pernambuco ter capacidade

potencial para a produção de leite, seu rebanho produtor não é alvo de medidas de controle

das mastites.

A mastite bovina é considerada uma enfermidade de alta prevalência e de grande

importância na pecuária leiteira, sendo discutida desde o século passado, devido aos

prejuízos causados pela redução na produção de leite, ao leite descartado, ao custo de

reposição de animais, à mão-de-obra extra, ao tratamento e serviços veterinários

As infecções causadas por S. aureus geralmente resultam em mastites subclínicas

que podem progredir para manifestações clínicas e, embora medidas preventivas visando o

121

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

controle da transmissão sejam amplamente praticadas, as mastites causadas por esse

patógeno ainda são bastante comuns3.

Staphylococcus spp são os microrganismos mais freqüentemente isolados em

amostras de leite provenientes de animais com mastite, sendo o S. aureus a espécie de

maior importância econômica para a indústria leiteira e para a saúde pública.

No presente trabalho foi diagnosticada mastite subclínica em 48,8% dos quartos

mamários e S. aureus foi isolado em 24% das amostras de leite de vacas com mastite

subclínica. Santos et al.

obtiveram resultados similares estudando amostras de leite da

região da Zona da Mata de Pernambuco, onde foi diagnosticada mastite subclínica em

52,2% dos quartos mamários e S. aureus foi isolado em 20,74% das amostras de leite de

vacas com mastite subclínica.

A resistência bacteriana aos antibióticos é outro sério problema para a Saúde

Pública, pois há evidências que o tratamento indiscriminado de animais com antibióticos

torne seus produtos e derivados, fontes para resistência aos antibióticos na espécie

humana

. Além disso, resíduos de antibióticos causam diminuição no rendimento

industrial na fabricação de derivados lácteos, uma vez que inibem a ação de bactérias

fermentadoras

No Brasil, desde a década de 80, a gentamicina é largamente utilizada no tratamento

de mastite bovina causada por bactérias Gram-positivas

. Ainda hoje, observam-se

inúmeros resultados positivos no emprego deste antibiótico para tratamento das mastites

estafilocócicas em ruminantes

. Entretanto, por se tratar do antibiótico de eleição na

atualidade, o uso contínuo e indiscriminado deste aminoglicosídeo, justifica a alta

resistência dos isolados de S. aureus à gentamicina nas propriedades estudadas. Por outro

lado, destacou-se a vancomicina com 100% de eficácia no teste de sensibilidade in vitro.

122

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Esta alta sensibilidade a vancomicina se explica devido ao raríssimo uso na medicina

veterinária, desta forma, como descrito por Howe et al.

, torna-se o antimicrobiano de

eleição em casos de infecções por cepas de S. aureus multirresistentes.

Cerca de 63% dos isolados estudados apresentaram resistência á oxacilina

(meticilina), no entanto, estudos mais detalhados do perfil de resistência dessas cepas,

seriam necessários para classificá-las em S. aureus meticilina resistentes (MRSA). A

presença dos genes mec e femB envolvidos na resistência á meticilina foram pesquisados

pela PCR em cepas de S. aureus resistentes a meticilina pelo teste de sensibilidadade “in

vitro”. A resistência desses isolados foi atribuída a hiperprodução da beta-lactamase e

presença do gene femB (resultados apresentados em outro trabalho). Os mecanismos de

resistência aos antimicrobianos são complexos e envolvem mudanças no conteúdo e

composição da parede celular bacteriana.

A caracterização da diversidade genética dos S. aureus isolados de rebanhos

leiteiros é fundamental para uma melhor compreensão do padrão de dispersão desse

patógeno nas propriedades rurais. Tais informações poderão auxiliar na elaboração de

estratégias mais eficientes para a redução da infecção, uma vez que a partir dos perfis

moleculares podem-se inferir relações genéticas existentes entre os diferentes clones,

detectar o fluxo gênico e traçar rotas de dispersão da infecção no rebanho

Estudos epidemiológico-moleculares sobre S. aureus de origem bovina foram

conduzidos na Europa

23,26

, América do Norte

, Ásia

e Oceania

. Nos últimos anos alguns

grupos implementaram a análise molecular do gene da coagulase como um teste de

exatidão para o diagnóstico e genotipagem de S. aureus

15,19,22

. Segundo Goh et al.

, a

presença de formas alélicas múltiplas é mostrada pelas variações no tamanho dos

fragmentos amplificados, baseados na inclusão ou exclusão das seqüências repetidas de 81

123

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

pb que compõem o gene coa. A análise do gene coa pela técnica do PCR-RFLP em

isolados de S. aureus procedentes do Rio Grande do Sul, Austrália e República Tcheca

permitiu maior diferenciação dos genótipos

13,19,22

, uma vez que essa técnica apresenta

maior poder discriminatório devido à digestão dos fragmentos de PCR por enzimas de

restrição

A genotipagem por PCR-RFLP do gene coa dos 27 isolados de S. aureus

demonstrou a importância do estudo epidemiológico molecular através da compreensão do

padrão de dispersão do S. aureus nas propriedades estudadas a partir da inferência do perfil

genético destes patógenos. Neste estudo foi observada a presença de dois perfis genotípicos

obtidos a partir dos 27 isolados de S. aureus analisados, provenientes de casos de mastite

subclínica e dos equipamentos de ordenha, tendo sido determinado a presença de dois

clones numa mesma propriedade, um mesmo clone nas duas propriedades e um mesmo

clone procedente do equipamento de ordenha.

As linhas de ordenha são locais de intenso manejo que podem servir como via de

transmissão entre o patógeno e a glândula mamária, especialmente. A identificação do

mesmo perfil genotípico entre um isolado de S. aureus procedente do equipamento de

ordenha e dos animais com infecção subclínica na propriedade B sugere a ausência dos

princípios adequados de limpeza e desinfecção dos equipamentos de ordenha mecânica.

Independente do coagulotipo encontrado entre os isolados de S. aureus das

propriedades estudadas todos apresentaram resistência à gentamicina e sensibilidade à

vancomicina. Adicionalmente, 69,23% dos isolados coagulotipo P1 mostraram-se sensíveis

aos antimicrobianos utilizados nos testes de sensibilidade in vitro e 49,78% dos isolados

coagulotipo P2 foram sensíveis aos antimicrobianos. O índice de susceptibilidade à

124

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

penicilina G e amoxilina nas amostras de S. aureus coagulotipo P1 foi de 75% e 100%,

respectivamente, enquanto que nos coagulotipos P2 foi de apenas 4,3% e 13%.

Os resultados obtidos neste estudo sugerem a existência de relação entre a presença

dos diferentes clones, o manejo-higiênico sanitário e o sistema de criação adotado nas

propriedades analisadas. A presença de dois perfis genotípicos na propriedade A indica

para casos alóctones de mastite por aquisição de vacas leiteiras infectadas provenientes de

outras localidades. Por outro lado, a presença de um perfil genotípico na propriedade B,

poderia ser devido aos casos de mastite autóctone, causada por apenas um clone. Além

disso, a observação de um perfil genotípico idêntico nas duas propriedades (P2=1000pb)

estudadas sugere a presença de um mesmo clone de S. aureus nesta região do estado de

Pernambuco.

CONCLUSÕES

Métodos genotípicos possibilitam a detecção das principais fontes e reservatórios de

S. aureus envolvidos na mastite bovina e na elaboração de estratégias de profilaxia em

propriedades de exploração leiteira. A implementação dessas estratégias, aliada à educação

higiênico-sanitária de todos os indivíduos envolvidos na cadeia produtiva, resultará no

aumento da produção, melhoria da qualidade microbiológica do leite e redução do ônus

gerado pelo descarte precoce de animais cronicamente infectados, por antibioticoterapia

inadequada e honorários médico-veterinários. A técnica de PCR-RFLP mostrou-se

reprodutível, específica e discriminatória para estudo do polimorfismo do gene coa de S.

aureus, representando ferramenta promissora para estudos epidemiológicos-moleculares em

propriedades com mastite causada por este patógeno.

125

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Tabela 1: Resultados do PCR-RFLP do gene coa de isolados de S. aureus associados à

mastite bovina em duas propriedades leiteiras do município de São Bento do Una,

Pernambuco, Brasil

Coagulotipo

Nº de

isolados

Propriedade

Produto

de PCRa

Fragmentos de

RFLP – AluIa

Fragmentos de

RFLP – HaeIIIa

Perfil 1 4 A 750 750 150 – 600

Perfil 2 23 A e B 1000

200 – 310 – 450 –

550

S. aureus

ATCC 25923

1 - 800 250 – 310 – 510

(a) – número aproximado em pb

(b) – não foi submetida à clivagem

126

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Figura 1: Produtos de PCR do gene coa de S. aureus isolados do município de São Bento do

Una, Pernambuco, Brasil. Marcador de peso molecular, linha M (100 pb DNA ladder).

Controle positivo, linha 1 (S. aureus ATCC 25923). Propriedade A, linhas 2 a 6. Propriedade

B, linhas 7 a 28.

127

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Figura 2: Produtos de PCR do gene coa digeridos com AluI de S. aureus isolados do

município de São Bento do Una, Pernambuco, Brasil. Marcador de peso molecular, linha M

(100 pb DNA ladder). Controle positivo, linha 1 (S. aureus ATCC 25923). Propriedade A,

linhas 2 a 6. Propriedade B, linhas 7 a 28.

128

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Figura 3: Produtos de PCR do gene coa de 750pb digeridos com AluI e HaeIII de isolados

de S. aureus do município de São Bento do Una, Pernambuco, Brasil. Marcador de peso

molecular, linha M (100 pb DNA ladder). Linhas 2 (PCR); 2Alu (RFLP AluI); 2Hae

(RFLP HaeIII); 3 (PCR); 3Alu (RFLP AluI); 3Hae (RFLP HaeIII); 5 (PCR); 5Alu (RFLP

AluI); 5Hae (RFLP HaeIII); 6 (PCR); 6Alu (RFLP AluI); 6Hae (RFLP HaeIII).

129

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Figura 4: Teste de sensibilidade in vitro (A) e Perfil de multirresistência in vitro (B) de 27

isolados de S. aureus associados à mastite subclínica no município de São Bento do Una

(PE).

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Amoxi

cin

Cloranfenicol

Enrofl

ami

Lincomicin

Norfloxacina

vobio

cin

cil

Penicilina

Sulfa

otrim

Tetrac

clin

Van

comi

Re sistente Intermediário Sensível

(A) (B)

22%

49%

22%

Resistente a 2-3

antibióticos

Resistente a 4-5

antibióticos

Resistente a 6-7

antibióticos

Resistente a 8-9

antibióticos

130

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. AARESTRUP, F.M.; DANGLER, C.A.; SORDILLO, L.M. Prevalence of

coagulase gene polymorphism in Staphylococcus aureus isolates causing bovine

mastitis. Canadian Journal of Veterinary Research, v. 2, n. 59, p. 124-128, 1995.

2. AMARAL, L.A. Aspectos epidemiológicos da mastite bovina. In: ENCONTRO DE

PESQUISADORES EM MASTITES, 3., 1999, Botucatu. Anais. FMVZ-UNESP,

1999, p. 19-26.

3. BRADLEY, A.J. Bovine mastitis: an evolving disease. Veterinary Journal, v. 164,

p.116-128, 2002.

4. BYARUGABA, D.K. A view on antimicrobial resistance in developing countries

and responsible risk factors. International Journal of Antimicrobial Agents, v.

24, p. 105-10, 2004.

5. COSTA, E.O.; CARVALHO, V.M.; COUTINHO, S.D.; CASTILHO, W.;

CARAMORI, L.F.L. Corynebacterium bovis e sua importância na etiologia da

mastite bovina no estado de São Paulo. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 5, p.

117-120, 1985.

6. COSTA, E.O.; VIANI, F.C.; WHITE, C.R.; ABE, S.; LOPES, V.C.A. Importância

do portador na dinâmica da infecção intramamária. In: CONGRESSO

BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA, 23., 1994, Olinda. Anais. SBMV,

1994, p. 239.

131

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

7. COSTA, E.O.; RIBEIRO, A.R.; WATANABE, E.T.; SILVA, J.A.B.; GARINO-

JUNIOR, F.; BENITES, N.R.; HORIUTI, A.M. Mastite subclínica: prejuízos

causados e os custos de prevenção em propriedades leiteiras. NAPGAMA, n. 2, p.

16-20, 1999.

8. FITZGERALD, J.R.; MEANEY, W.J.; HARTIGAN, P.J.; SMYTH, C.J.; KAPUR

V. Fine structure molecular epidemiological analysis of Staphylococcus aureus

recovered from cows. Epidemiol. Infect., v. 119, p. 261-269, 1997.

9. GOH, S.W.; BYRNE, S.K.; ZHANG, J.L.; CHOW, A.W. Molecular typing of

Staphylococcus aureus on the basis of coagulase gene polymorphisms. Journal of

Clinical Microbiology, v. 30, n. 7, p. 1642-1645, 1992.

10. HOWE, R.A. Vancomycin susceptibility within methicillin-resistant

Staphylococcus aureus lineages. Emerging Infectious Diseases, n. 5, v. 10, p. 855-

857, 2004.

11. IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (2004) [on line] Disponível na

Internet via WWW. URL: <http://www.ibge.gov.br/>. Acesso em: dezembro de

2004.

12. KAPUR, V.; SISCHO, W.M.; GREER, R.S.; WITTAM, T.S.; MUSSER, J.M.

Molecular population genetic analysis of Staphylococcus aureus recovered from

cows. Journal of Clinical Microbiology, n. 33, p. 376-380, 1995.

13. LANGE, C.; CARDOSO, M.; SENCZEK, D.; SCHWARZ, S. Molecular subtyping

of Staphylococcus aureus isolates from cases of bovine mastitis in Brazil.

Veterinary Microbiology, n. 67, p. 127-141, 1999.

14. MANIATIS, T.; FRISCH, E.; SAMBROOK, J. Molecular cloning: A Laboratory

Manual. 2. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

132

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

15. MONTESINOS, I.; SALIDO, E.; DELGADO, T.; CUERVO, M.; SIERRA A.

Epidemiologic genotyping of meticillin-resistant Staphylococcus aureus by pulsed-

field gel electroporesis at a university hospital and comparison with antibiotyping

and protein A and coagulase gene polymorpism. Journal of Clinical

Microbiology, n. 6, v. 40, p. 2119-2125, 2002.

16. NAGASE, N.; SHIMIZU, A.; KAWANO, J.; YAMASHITA, K.; YOSHIMURA,

H.; ISHIMARU, M.; KOJIMA, A. Characterization of Staphylococcus aureus

strains isolated from bovine mastitis in Japan. Journal of Veterinary Medical

Science, v. 64, p. 1169-1172, 2002.

17. OLIVEIRA, A.A.F.; MOTA, R.A.; SOUZA, M.I.; SÁ, M.E.P. Perfil de

sensibilidade antimicrobiana in vitro frente a amostra de Staphylococcus spp.

isoladas de mastite subclínica bovina, no agreste meridional de Pernambuco. A

Hora Veterinária, n. 127, p. 8-10, 2002.

18. PHILPOT, W.N.; NICKERSON, S.C. Mastitis: counter attack. In: _____.

Experiment station. Babson Bros. Co., 1991, p. 3-7.

19. RAIMUNDO, O.; DEIGTON, M.; CAPSTICK, J.; GERRATY, N. Molecular

typing of Staphylococcus aureus of bovine origin by polymorphisms of the

coagulase gene. Veterinary Microbiology, n. 66, p. 275-284, 1999.

20. SANTOS, F.G.B.; MOTA, R.A.; SILVEIRA-FILHO, V.M.; SOUZA, H.M.;

OLIVEIRA, M.B.M.; JOHNER, J.M.Q.; LEAL N.C.; ALMEIDA, A.M.P.; LEAL-

BALBINO, T.C. Tipagem molecular de Staphylococcus aureus isolados do leite de

vacas com mastite subclínica e equipamentos de ordenha procedentes do estado de

Pernambuco. NAPGAMA, n. 1, v. 6, p. 19-23, 2003.

133

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

21. SCHALM, O.W.; NOORLANDER, B.S. Experiments and observations leading to

development of the California Mastitis Test. Journal of the American Veterinary

Medical Association, n. 5, v. 130, p. 199-207, 1957.

22. SCHLEGELOVÁ, J.; DENDIS, M.; BENEDÍK, J.; BABÁK, V.; RYSÁNEK, D.

Staphylococcus aureus isolates from dairy cows and humans on a farm differ in

coagulase genotype. Veterinary Microbiology, n. 92, p. 327-334, 2003.

23. SOMMERÄUSER, J.; KLOPPERT, B.; WOLTER, W.; ZSCHÖCK, M.; SOBIRAJ,

A.; FAILING, K. The epidemiology of Staphylococcus aureus infections from

subclinical mastitis in dairy cows during a control programme. Veterinary

Microbiology, v. 96, p. 91-102, 2003.

24. SUTRA, L.; POUTREL, B. Detection of capsular polysaccharide in milk of cows

with natural intramammary infection caused by Staphylococcus aureus. American

Journal of Veterinary Research, n. 11, v. 51, p. 1857-1859, 1990.

25. WOODS, G.L.; WASHINGTON, J.A. Antibacterial susceptibility tests: dilution

and disk diffusion methods. In: MURRAY, P.R.; BARIN, E.J.; PFALLER, M.A.;

TENOVER, F.C.; YOLKEN, R.H. Manual of Clinical Microbiology. 6. ed.,

Washington: ASM, 1995. p. 1327-1341.

26. ZADOKS, R.N.; VAN LEEUWEN, W.B.; KREFT D.; FOX, L.K.; BARKEMA,

H.W.; SCHUKKEN, Y.H.; VAN BELKUM, A. Comparison of Staphylococcus

aureus isolates from bovine and human skin, milking equipment and bovine milk by

phage typing, pulse-field gel electrophoresis and binary typing. Journal of Clinical

Microbiology, v. 11, n. 40, p. 3894-3902, 2002.

134

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

5.3 ARTIGO CIENTÍFICO 3: INVESTIGAÇÃO DOS GENES PARA AS TOXINAS

ESTAFILOCÓCICAS EM ISOLADOS DE LEITE DE VACAS COM MASTITE

SUBCLÍNICA NA REGIÃO AGRESTE DO ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL

Este trabalho será enviado para publicação na Revista Veterinary Microbiology

(Anexo 2).

135

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

RESUMO

Para investigar a presença e distribuição dos genes para as toxinas estafilocócicas

SEA, -SEE, SEG-SEJ, TSST-1, ETA e ETB foram analisadas 81 cepas de Staphylococcus

spp. isoladas de amostras de leite de 246 vacas de 11 propriedades leiteiras de quatro

municípios (Angelim, São Bento do Una, Caetés e Correntes), localizados na região do

Agreste do Estado de Pernambuco-Brasil, sendo utilizadas duas reações de PCR-Multiplex

e quatro reações de PCR-Uniplex. Nenhuma das cepas apresentou os genes sea-see, tst, eta

e etb que são responsáveis pelas toxinas clássicas, no entanto, para as novas toxinas SEG-

SEJ verificou-se que 65/81 (80,2%) das cepas comportavam um a três genes toxigênicos.

Os genótipos encontrados entre os isolados de estafilococos de casos de mastite subclínica

foram seg, seh, sei, isoladamente, ou associações, seg + sei, seg + sej, seg + seh, seh + sei,

sei + sej, seg + seh + sei, seg + sei + sej. No município de Angelim só foi encontrado o

gene sei, no município de São Bento do Una os genes seg e sej, no município de Caetés os

genes seg, seh, sei e sej e no município de Correntes os genes seh e sei. O gene seh, que

raramente é observado em outras regiões do Brasil e também no mundo, foi verificado

isoladamente ou em associação com outro gene se, apenas nos municípios de Caetés e

Correntes. Os resultados obtidos sugerem a existência de uma distribuição geográfica das

cepas de estafilococos portadoras de genes se. A presença dessas cepas em leite de vacas

com mastite subclínica é preocupante pois podem causar intoxicações alimentares.

Palavras-Chave: Toxinas Estafilocócicas; PCR-Multiplex; PCR-Uniplex

136

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

1- Introdução

Staphylococcus aureus é responsável por várias enfermidades no homem e nos

animais. Nos bovinos é conhecido como o mais freqüente agente causador de mastite

(Cardoso et al., 1999), processo inflamatório da glândula mamária, apresentando-se sob a

forma clínica ou subclínica de acordo com a intensidade da inflamação, sendo a forma

subclínica a mais importante devido a maior prevalência nos rebanhos, difícil detecção e

longa duração (Bradley et al., 2002).

A habilidade do S.aureus em causar uma ampla variedade de doenças pode estar

associada a um grande número de toxinas extracelulares, além de outros fatores de

virulência (Zschöck et al., 2005). Dentre estas toxinas destacam-se as enterotoxinas, a

toxina 1 da síndrome do choque tóxico e as toxinas esfoliativas (Dinges et al., 2000).

As enterotoxinas são exoproteínas estáveis a altas temperaturas e que induzem

gastrenterite em humanos após ingestão de alimentos contaminados (Klotz et al., 2003). A

intoxicação estafilocócica é caracterizada por náuseas, dores abdominais, vômito e diarréia

(Balaban e Rasooly, 2000; Scherrer et al., 2004).

Além dos cinco tipos antigênicos de enterotoxinas estafilocócicas clássicas (SEs)

(SEA, SEB, SEC, SED, SEE) (Dinges et al., 2000), quatro SEs adicionais (SEG, SEH, SEI

e SEJ) foram descritas e os genes correspondentes identificados (Ren et al., 1994; Muson et

al., 1998; Zhang et al., 1998). Recentemente, a listagem da família de enterotoxinas

estafilocócicas se expandiu através da detecção dos genes que codificam as enterotoxinas

SEK, SEL, SEM, SEN, SEO, SEP, SEQ, SER e SEU (Jaurrad et al., 2001; Kuroda et al.,

2001; Orwin et al., 2001; Letertre et al., 2003; Omoe et al., 2003).

137

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

A toxina 1 da síndrome do choque tóxico (TSST-1) é responsável pela síndrome do

choque tóxico em humanos (Cardoso et al., 1999), caracterizando-se por febre, hipotensão,

congestão em vários órgãos e choque letal (Silva et al., 1999).

A toxina esfoliativa é causadora da síndrome da pele escaldada (SSSS) em crianças

e neonatos (Endo et al., 2003), provoca sintomas como febre, sensibilidade da pele, eritema

e descamação da epiderme (Yamaguchi et al., 2002), que revela uma superfície úmida e

brilhante com aparência semelhante à pele escaldada (Arbuthnott et al., 1990).

A ocorrência de genes para as toxinas estafilocócicas ou a produção destas toxinas

por cepas de S. aureus isoladas de leite de vacas com mastite e produtos derivados do leite

foi relatada por diversos autores Cardoso et al. (1999), Endo et al. (2003), Cabral et al.

(2004), Ercolini et al. (2004), Salasaia et al. (2004), Zschöck et al. (2004), Loncarevic et al.

(2005) e Silva et al. (2005).

O S. aureus pode ter acesso ao leite por excreção direta do úbere com mastite clínica

e subclínica (Scherrer et al., 2004). Este fato é importante, pois o leite estando contaminado

por S. aureus pode comprometer a qualidade dos queijos e de outros produtos

representando um risco para o consumidor (Ercolini et al., 2004). Se o leite for ingerido cru

torna-se uma fonte potencial para intoxicações alimentares, devido à presença das toxinas

estafilocócicas (Lim et al., 2004).

Diante do exposto e da carência de dados no Brasil referente às toxinas

estafilocócicas, principalmente as mais recentemente identificadas, objetivou-se com este

trabalho investigar a presença e a distribuição de genes para as toxinas SEA-SEE, SEG-

SEJ, TSST-1, ETA e ETB em cepas de Staphylococcus spp. isoladas de amostras de leite de

vacas com mastite subclínica em municípios da região Agreste do Estado de Pernambuco.

138

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

2- Material e Métodos

2.1 Cepas Bacterianas

Foram analisadas 81 cepas de Staphylococcus spp. isoladas de amostras de leite de

246 vacas de 11 propriedades leiteiras de quatro municípios (A: Angelim, B: São Bento do

Una, C: Caetés e D: Correntes), localizados na região do Agreste do Estado de

Pernambuco, Brasil. Como controle da especificidade das reações de PCR foram utilizadas

as cepas padrão de S. aureus FRI (Food Research Institute Madison, Wiscosin, EUA) FRI

MN8 portadora do gene tst, FRI 722 portadora do gene sea, FRI S6 gene seb, FRI 361

genes sec, sed, seg, sei e sej e FRI 1151 gene sed, cedidas gentilmente pelo Laboratório de

Enterotoxinas Estafilocócicas da Fundação Ezequiel Dias (FUNED-MG).

2.2 Coleta e Identificação das Amostras

Nas propriedades estudadas o sistema de criação era semi-intensivo e os animais

eram ordenhados uma ou duas vezes ao dia, pelo sistema de ordenha manual ou mecânica

(Municípios A e B) ou apenas manual (Municípios C e D).

Para coleta das amostras de leite, o teto foi previamente lavado com água e sabão,

secado com papel toalha e realizada anti-sepsia do óstio da teta com álcool a 70ºGL. As

amostras de leite foram colhidas dos quartos mamários com mastite clínica, positivos ao

teste da caneca telada, e daquelas com mastite subclínica, positivos ao California Mastitis

Test (CMT) (Schalm e Noorlander, 1957).

Para a identificação dos isolados de Staphylococcus spp., foram observadas

características como produção de hemólise e pigmento em Ágar Base acrescido de 8% de

sangue desfibrinado de ovino e características morfo-tintoriais, utilizando o método de

coloração de Gram, além de provas bioquímicas como produção de coagulase livre,

139

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

termonuclease e catalase, segundo Silva et al. (1997). As provas de produção de acetoína,

fermentação da glicose (anaerobiose) e do manitol (aerobiose e anaerobiose) foram

realizadas de acordo com Mac Faddin (1980), sendo os isolados de S. aureus classificados

segundo Baird-Parker (1990).

2.3 Extração do DNA Genômico

O DNA genômico das cepas de Staphylococcus spp. foi extraído de acordo com

Maniatis et al. (1989) e quantificado através do programa 1D Image Analysis Software,

version 3.5 da Kodak Digital Science, DC 120 zoom Digital Câmera, após eletroforese em

gel de agarose a 1%, usando-se o DNA do bacteriófago λ clivado com a enzima de restrição

HindШ.

2.4 Detecção dos Genes Toxigênicos por PCR

2.4.1 PCR - Multiplex

Foram realizadas duas reações de PCR-Multiplex, sendo uma para pesquisa dos

genes sea, seb, sec, sed, see e outra para pesquisa dos genes eta, etb e tst.

As reações foram preparadas para um volume final de 25µL contendo 20pmol de

cada primer, 10mM Tris-HCl pH 9.0, 50mM de KCl, 160µM de cada dNTP, 3mM de

MgCl

, 20ng de DNA genômico e 1,2U da Taq DNA polimerase (Invitrogen, Brasil). As

amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra) programado para 30 ciclos

térmicos, cada um consistindo de 95

C por 1 min. (desnaturação), 55

C por 1 min.

(anelamento) e 72

C por 2 min. (extensão). A seqüência dos primers utilizados nas reações

e tamanho dos segmentos esperados são mostrados na Tabela 1. Foram usadas como

140

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

controle as cepas padrão de S. aureus FRI (Food Research Institute Madison, Wiscosin,

EUA) portadoras dos genes tst, sec e sed.

Os produtos de amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose

1,5% (m/v), corados com brometo de etídeo (10mg/mL) por 15 min., visualizados e

fotografados em transiluminador de UV.

2.4.2 PCR-Uniplex

As reações de PCR-Uniplex para a pesquisa dos genes seg, seh, sei e sej

separadamente, consistiu de uma mistura de 20pmol de cada primer, 160 µM de cada

dNTP, 1,5mM do MgCl

, 10mM do Tris-HCl pH 9.0, 50mM de KCl, 20ng do DNA

genômico e 1U da Taq DNA polimerase (Invitrogen, Brasil) em um volume final de 25µL.

As amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra) programado para 30 ciclos

térmicos, cada um consistindo de 94

C por 3 min., 94

C por 30 seg., 60

C por 30 seg. e

C por 30 seg para os genes seg, seh e sej. Para o gene sei o ciclo foi programada para

C por 30 seg., 60

C por 30 seg. e 72

C por 60 seg. A seqüência dos primers utilizados

nas reações e tamanho dos segmentos esperados são mostrados na Tabela 1. Foi usada para

controle a cepa padrão de S. aureus FRI (Food Research Institute Madison, Wiscosin,

EUA) portadoras dos genes seg, sei e sej. Os produtos de amplificação foram analisados

como descrito anteriormente.

2.4.3 Análise de Restrição e Seqüenciamento

Para confirmar a identidade dos fragmentos amplificados pela PCR dos genes seg,

seh, sei e sej foi analisado o padrão de restrição dos fragmentos obtidos. A endonuclease de

restrição DraI foi escolhida para digestão do fragmento amplificado pela PCR do gene seh

141

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

e a enzima RsaI para os genes seg e sej como descrito por Rosec e Gigaud (2002). A

enzima RsaI também foi selecionada para digestão do fragmento amplificado pela PCR do

gene sei segundo sítios de restrição obtidos através do programa Generunner DNA

Sequence Analyses software, versão 3.05, disponível gratuitamente na rede (Tabela 2). O

tamanho dos fragmentos obtidos após digestão foi analisado após eletroforese em gel de

agarose 1,8%.

Para confirmar que os segmentos amplificados pela PCR faziam parte dos genes

seg, seh, sei e sej, os fragmentos foram purificados com o kit PureLink PCR Purification

(Invitrogen, Brasil) e analisados através do seqüenciador automático ABI 3100 (Applied

Biosystem, USA). As sequências dos nucleotídeos obtidas foram analisadas pelos

programas: Agrupamento das seqüências de S. aureus - forward e reverse (Huang e Madan,

1999) e comparadas com seqüências depositadas no GenBank: versão 2.2.12 do programa

Blast (Altschul et al.1990).

3- Resultados

Dos 984 quartos mamários estudados, 10 (1,0%) apresentaram mastite clínica, 562

(57,1%) mastite subclínica e 412 (41,9%) foram negativos. Dos casos de mastite clínica não

foi isolado estafilococos, sendo estes causados por outros microrganismos, isolando-se

estafilococos apenas de casos de mastite subclínica.

Das 81 cepas de Staphylococcus spp. isoladas de leite de vaca com mastite

subclínica, 53/81 (65%) foram identificados como S. aureus, 16/81 (20%) Staphylococcus

coagulase positiva e 12/81 (15%) Staphylococcus coagulase negativa.

Nenhuma das 81 cepas de Staphylococcus spp. possuiam os genes sea, seb, sec, sed,

see, tst, eta e etb. Houve apenas a amplificação dos segmentos de tamanho esperado apenas

142

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

para os genes tst, sea, seb, sec e sed nas cepas de referência (FRI) usadas como controle

positivo (Figura 1).

As análises para pesquisa dos genes responsáveis pela produção das toxinas SEG,

SEH, SEI e SEJ identificou os segmentos de tamanho esperado em 65/81 (80,2%) das

cepas de estafilococos isoladas de leite de vacas com mastite subclínica (Figura 2 A-D) e

16/81 (19,8%) não amplificaram para nenhum dos genes toxigênicos seg, seh, sei e sej.

Entre as 65 cepas de Staphylococcus spp. que amplificaram segmentos para a

presença dos genes seg, seh, sei e sej, 39/65 (60%) amplificaram apenas para um gene,

21/65 (32%) amplificaram para dois genes e 5/65 (8%) amplificaram para três genes.

Das 65 cepas positivas para os genes toxigênicos seg, seh, sei e sej, 23/65 (35%)

comportavam apenas o gene seg, 10/65 (16%) o gene seh, 6/65 (9%) o gene sei, 2/65 (3%)

o genótipo seh + sei, 6/65 (9%) o genótipo seg + sei, 8/65 (12%) o genótipo seg + sej, 5/65

(8%) o genótipo seg + seh, 4/65 (6%) o genótipo seg + seh + sei e 1/65 (2%) o genótipo

seg + sei + sej.

No município A foi encontrado apenas o genótipo sei (6/9), no município B os

genótipos seg (16/33) e seg + sej (6/33), no município C os genótipos seg (7/26), seg + sei

(6/26), seg + sej (2/26), seg + seh (5/26), seg + sei + sej (1/26) e seg + seh + sei (4/26) e

no município D os genótipos seh (10/13) e seh + sei (2/13) (Tabela 3, Figura 2).

Neste estudo foi alta a ocorrência do gene seh nas cepas estudadas. No município C

o gene seh estava presente em (9/26) das cepas de Staphylococcus spp., contudo em

associação com o gene seg (5/26) ou com os genes seg + sei (4/26). No município D o gene

seh predominou, sendo detectado em (12/13) das cepas analizadas, entretanto em (10/13)

das cepas o gene seh foi observado isoladamente e em (2/13) das cepas em associação com

o gene sei (Tabela 3. Figura 2).

143

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

As 12 cepas de Staphylococcus coagulase negativa comportavam um ou mais genes

toxigênicos para as toxinas SEG, SEH e SEI, sendo que 4/12 (33%) comportavam o gene

seh, 2/12 (17%) apenas o gene seg, 3/12 (25%) o genótipo seg+seh e 3/12 (25%) o

genótipo seg+seh+sei (Tabela 3).

A análise dos resultados com o programa Blast revelou alta homologia entre os

genes seg, seh, sei e sej nas cepas estudadas quando comparadas com seqüências

depositadas no GenBank: 98%, 99%, 99% e 95%, respectivamente. A comparação dos

fragmentos por eletroforese em gel de agarose dos genes seg, seh, sei e sej amplificados nas

diferentes cepas e digeridos com RsaI e DraI, revelou um padrão de restrição esperado e

idêntico entre as cepas para cada gene estudado (Tabela 2, Figura 2). Estes resultados

confirmam a presença dos genes seg, seh, sei e sej nas cepas analisadas.

4- Discussão

Apesar de nenhuma das cepas de Staphylococcus spp. isoladas de leite de vacas com

mastite subclínica que amplificaram os genes para as toxinas clássicas SEA, SEB, SEC,

SED, SEE, TSST-1, ETA e ETB, a incidência de cepas comportando os genes que

codificam as toxinas mais recentemente descritas SEG, SEH, SEI e SEJ foi muito alta

(80,2%). Estudos anteriores realizados em São Paulo e na Alemanha com cepas de S.

aureus de origem bovina também não detectaram a presença destes genes ou detectaram em

baixo percentual, apenas detectando os genes para as novas toxinas (Cabral et al., 2004;

Salasia et al., 2004).

A ausência de genes para as toxinas clássicas e presença dos genes das novas

toxinas descritas nos municípios estudados indica uma distribuição geográfica das cepas

toxigênicas. Em vários locais são observados diferentes percentuais para os genes

144

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

toxigênicos. Silva et al. (2005) relataram um baixo percentual de isolados contendo os

genes sea, seb e sec de casos de mastite bovina no Estado de Minas Gerais. Omoe et al.

(2002) ao analisarem 21 isolados de leite de vacas com mastite no Japão observaram que

oito comportavam os genes sec, seg e sei e sete os genes seg e sei não tendo sido observada

a presença dos genes sea, seb, sed e see.

Alta prevalência de cepas de S. aureus enterotoxigênicas foi observada por Lim et

al. (2004) que trabalhando com 166 isolados de S. aureus de mastite bovina na Korea,

verificaram que 32 dos isolados continham o gene sea, três o gene seb, um o gene sec e

outro os genes sea e tst e que estes isolados ao serem caracterizados através de eletroforese

em campo pulsado (PFGE) pertenciam ao mesmo perfil genotípico que prevalecia nas

fazendas analisadas. Katsuda et al. (2005) ao analisarem 270 cepas de S. aureus, isoladas de

leite de vacas com mastite no Japão também verificaram alta prevalência de cepas

enterotoxigênicas 181/270 (67%), sendo o genótipo mais encontrado o que comportava

simultaneamente os genes sec, seg, sei e tst.

Jorgensen et al. (2005a) ao analisarem S.aureus isolados de amostras de leite bovino

e caprino em sete regiões da Noruega, constataram que na maioria das regiões era

encontrado um único tipo de gene toxigênico e apenas uma das sete regiões apresentou

grande diversidade de genes toxigênicos. Estes relatos sugerem que existe uma distribuição

regional na prevalência de algumas SEs e seus genes, indicando uma dispersão das cepas de

S. aureus em áreas geográficas específicas. Diferentes autores relataram esta distribuição

geográfica das cepas de S. aureus enterotoxigênicas isoladas de leite de vacas com mastite

(Lopes et al., 1990; Fitzgerald et al., 1997; Larsen et al., 2000; Stephan et al., 2001).

O papel destas SEs recentemente descritas na intoxicação alimentar estafilocócica,

ainda permanece indeterminado (Rosec e Gigaud, 2002), no entanto, MacLauchlin et al.

145

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

(2000) ao analisarem 23 cepas de estafilococos envolvidas em casos de intoxicação

alimentar não observaram a produção das toxinas SEA, SEB, SEC, SED ou SEE, mas

detectaram a presença dos genes toxigênicos seg, seh, sei e sej, indicando que estas novas

SEs podem ser responsáveis por tais surtos de intoxicação alimentar.

Na análise das cepas estudadas de Staphylococccus spp. dos quatro municípios da

região Agreste do estado de Pernambuco o gene seg predominou de forma isolada (23/65).

Abe et al. (2000) também sugerem que SEG foi uma das mais freqüentes toxinas

produzidas por S. aureus.

O genótipo seg + sei como o mais prevalente em isolados de estafilococos de casos

de mastite bovina (Cabral et al., 2004; Katzuda et al., 2005; Zschöck et al., 2005), por estes

genes estarem interligados em tandem (Munson et al., 1998; Maclauchlin et al., 2000).

Neste estudo a associação seg + sei predominou em 6/65 (9%), sendo a segunda

associação que mais ocorreu, porém, com um baixo percentual. Omoe et al. (2002)

relataram que há uma alta incidência de linhagens de S. aureus positivas para os genes seg

+ sei isoladas de leite de vacas com mastite. No entanto, Jorgensen et al. (2005a) ao

analisarem 101 isolados de tanques de leite bovino, verificaram baixa incidência da

associação seg + sei 2/53. Estes resultados sugerem que os genes seg e sei nem sempre

coexistem na mesma cepa e parece também existir uma distribuição geográfica destas

associações.

O gene seh foi detectado em 21/65 (32%) das cepas de Staphylococcus spp.

isoladamente ou em associação com genes para outras toxinas, sendo estes resultados

divergentes dos descritos por outros autores, pois baixos percentuais, (inferiores a 16%) ou

a não detecção do gene seh foi relatada (Omoe et al., 2002; Salasaia et al., 2004; Cabral et

al., 2004; Cremonesi et al., 2005; Jorgensen et al., 2005a; Katsuda et al., 2005; Zschöck et

146

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

al., 2005). O gene seh foi observado apenas nos municípios C e D, provavelmente por

serem próximos, com as mesmas características geográficas, além de as propriedades

analisadas apresentarem o mesmo tipo de manejo animal.

O percentual de 32% encontrado é considerado elevado em relação aos encontrados

em outros locais, reforçando a evidência da distribuição geográfica entre as cepas

toxigênicas de estafilococos.

Em um massivo surto de intoxicação alimentar envolvendo 10000 casos, causados

pela ingestão de leite reconstituído que tinha como matéria prima leite desnatado em pó em

Osaka, Japão, verificou-se que a toxina envolvida era a SEA, mas segundo Ikeda et al.

(2005) a quantidade detectada (80 ng) seria insuficiente para causar um surto com tamanha

extensão, desta forma, estes autores se propuseram a investigar dez lotes do leite em pó

desnatado envolvido em tal surto com relação à presença de outras toxinas além da SEA,

utilizando para tal a técnica de PCR. Verificaram a presença de sea e seh genes em 10

amostras, realizaram a quantificação da SEH por ELISA e concluíram que o referido surto

foi causado por pequenas quantidades de SEA e SEH, pois estas toxinas estavam presentes

nas mesmas quantidades em todas as amostras analisadas e que 30µg de SEH causa

resposta emética em macacos após 1,5 a 3 horas da administração (Su e Wong,1995).

Um surto de intoxicação alimentar causado por purê de batata feito com leite cru,

observou-se a presença de cepas de S. aureus portadoras apenas do gene seh. E a pesquisa

para as enterotoxinas clássicas SEA-SEE foi negativa (Jorgensen et al. 2005b). Os isolados

testados produziram quantidades significantes (98 a 108 ng) de SEH. O que significa que

cepas de Staphylococcus aureus portadoras do gene seh podem produzir quantidade de

SEH suficiente para causar intoxicação.

147

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Foi alta a prevalência entre as cepas de SCN (100%) que comportavam genes se.

Cada cepa apresentou um dos genes seg, seh ou as associações seg + seh e seg + seh + sei.

A síntese das enterotoxinas estafilocócicas clássicas em SCN foi bastante estudada

no passado (Vernozy-Rozand et al., 1996, Jaulhac et al., 1992, Rosec et al., 1997, Udo et

al., 1999) e os resultados sugerem que os SCN podem estar envolvidos em surtos de

intoxicação alimentar associados às enterotoxinas clássicas. Entretanto existe ainda a

necessidade de investigar os SCN para síntese de todas as enterotoxinas já descritas,

principalmente as mais recentes.

5- Conclusão

Neste estudo foi observada apenas a presença dos genes seg, seh, sei e sej, sendo o

gene seg o mais freqüente entre cepas de Staphylococcus spp. estudadas, representando

potencial risco para a Saúde Pública. A presença do gene seh, com alto percentual, em

apenas dois dos quatro municípios analisados é um achado que reafirma a existência de

uma distribuição geográfica de algumas cepas toxigênicas, não só em relação a países e

estados diferentes, mas também, municípios de uma mesma região.

6- Agradecimentos

Ao Banco do Nordeste do Brasil pelo financiamento do projeto e ao Conselho

Nacional de Pesquisa (CNPq) pela bolsa concedida ao primeiro autor. Agradecem também

ao Laboratório de Enterotoxinas Estafilocócicas da Fundação Ezequiel Dias (FUNED-MG)

e ao Dr. Luiz Simeão do Carmo por ter cedido as cepas padrão FRI (Food Research

Institute Madison, Wiscosin, EUA).

148

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Tabela 1 – Primers usados na análise da PCR para a detecção dos genes sea-see, seg-sej,

tst, eta e etb em cepas de Staphylococcus spp. isoladas de amostras de leite de vacas com

mastite subclínica na região Agreste do estado de Pernambuco, Brasil

Gene Primer Seqüência de Oligonucleotídeos

(5’→ 3’)

Tamanho do

Fragmento (pb)

*sea

SEA-3b CCT TTG GAA ACG GTT AAA ACG 127

SEA-4b TCT GAA CCT TCC CAT CAA AAA C

*seb

SEB-1c TCG CAT CAA ACT GAC AAA CG 477

SEB-4b GCA GGT ACT CTA TAA GTG CCT GC

*sec

SEC-3b CTC AAG AAC TAG ACA TAA AAG CTA GG 271

SEC-4b TCA AAA TCG GAT TAA CAT TAT CC

*sed

SED-3b CTA GTT TGG TAA TAT CTC CTT TAA ACG 319

SED-4b TTA ATG CTA TAT CTT ATA GGG TAA ACA TC

*see

SEE-3b CAG TAC CTA TAG ATA AAG TTA AAA CAA GC 178

SEE-2c TAA CTT ACC GTG GAC CCT TC

*tst

TST-3 AAGCCCTTTGTTGCTTGCG 445

TST-6 ATCGAACTTTGGCCCATACTTT

*eta

ETA-3b CTAGTGCATTTGTTATTCAAGACG 119

ETA-4b TGCATTGACACCATAGTACTTATTC

*etb

ETB-3b ACG GCT ATA TAC ATT CAA TTC AAT G 262

ETB-4b AAA GTT ATT CAT TTA ATG CAC TGT CTC

**seg

SEG-1 ACGTCTCCACCTGTTGAAGG 400

SEG-2 TGAGCCAGTGTCTTGCTTTG

**seh

SEH-1 TCACATCATATGCGAAAGCAG 357

SHE-2 TAGCACCAATCACCCTTTCC

***sei

SEI-1 GGTGATATTGGTGTAGGTAAC 454

SEI-2 ATCCATATTCTTTGCCTTTACCAG

**sej

SEJ-1 CAGCGATAGCAAAAATGAAACA 426

SEJ-2 TCTAGCGGAACAACAGTTCTGA

*Becker et al., 1998, **Rosec e Gigaud, 2002 e ***Omoe et al., 2002

149

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Tabela 2– Endonucleases de restrição usadas para confirmação da identidade dos

fragmentos dos genes seg, seh, sei, sej e padrão de restrição esperado

Gene Tamanho do Produto Amplificado Enzimas Padrão de Restrição

(tamanho das bandas)

seg

400 pb Rsa I 296 pb + 104 pb

seh

357 pb Dra I 218 pb + 139 pb

sei

454 pb Rsa I 345pb + 109 pb

sej

426 pb Rsa I 210 pb + 216 pb

150

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Tabela 3 – Distribuição dos genes para as toxinas SEG, SEH, SEI e SEJ nas cepas de

Staphylococcus spp. isoladas de leite de vacas com mastite subclínica em quatro municípios

localizados na região Agreste do Estado de Pernambuco, Brasil

MUNICÍPIOS ANALISADOS

A B C D

GENÓTIPO

S.A S.A SCP SCN S.A SCP SCN S.A SCP SCN

seg - 10 4 2 3 4 - - - -

seh - - - - - - - 4 2 4

sei 6 - - - - - - - - -

seg+sej - 6 - - 2 - - - - -

seg+seh - - - - 2 - 3 - - -

seg+sei - - - - 4 2 - - - -

seh+sei - - - - - - - 1 1 -

seg+sei+sej - - - - 1 - - - - -

seg+seh+sei - - - - 1 - 3 - - -

Cepas negativas 3 9 2 - - 1 - 1 - -

Total de cepas 9 25 6 2 13 7 6 6 3 4

S.A. – Staphylococcus aureus, SCP – Staphylococcus coagulase positiva, SCN –

Staphylococcus coagulase negativa, A (Município de Angelim), B (Município de São Bento

do Una), C (Município de Caetés), D (Município de Correntes)

151

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Figura 1 - Detecção dos genes sea, seb, sec, sed e tst nas cepas padrões de S. aureus FRI

através da PCR-Multiplex. Linhas - M: DNA ladder 100 pb, 1: FRI S6, 2: FRI 361, 3: FRI

1151, 4: FRI MN8.

152

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Figura 2 - Produto de amplificação da PCR dos genes sej, sei, seg e seh (A, B, C e D,

linhas: 1, 3 ,5) e seus padrões de restrição com as enzimas, RsaI: A, B e C e DraI: D,

linhas: 2, 4, 6).

153

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

7- Referências Bibliográficas

Abe, J., Ito, Y.,Onimaru, M., Kohsaka, T., Takeda, T., 2000. Characterization and

distribution of a new enterotoxin-related superantigen produced by Staphylococcus aureus.

Microbiol. Immunol. 44, 79-88.

Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myres, E.W., Lipman, D.J., 1990. Basic local

alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410.

Arbuthnott, J.P., Coleman, D.C., De Azevedo, J.S., 1990. Staphylococcal toxins in human

disease. In: The Staphylococci: an introduction. J. Appl. Bacteriol. 69, 101-107.

Balaban, N., Rasooly, A., 2000. Staphylococcal Enterotoxins. Int. J. Food Microbiol. 61,

01-10.

Baird-Parker, A.C., 1990. The Staphylococci: an introduction. J. Appl. Bacteriol. 19, 15-85.

Bradley, A.J., 2002. Bovine mastitis: an evolving disease. Vet J. 164,116-128.

Becker, K., Roth, R., Peters, G., 1998. Rapid and specific detection of toxigenic

Staphylococcus aureus: Use of two multiplex PCR enzyme immunoassay for amplification

and hybridization of staphylococcal enterotoxin genes,exfoliative toxin genes, and toxic

shock syndrome toxin 1 gene. J. Clin. Microbiol. 36, 2548-2553.

154

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Cabral, K.G., Lämmler, C., Zschöck, M., Langoni, H., Sá M.E.P., Victória, C., Da Silva,

A.V., 2004. Pheno and genotyping Staphylococcus aureus, isolated from bovine milk

samples from São Paulo State, Brazil. Can. J. Microbiol. 50, 901-909.

Cardoso, H.F.T., Silva, N., Sena, M.J., Carmo, L.S., 1999 Production of enterotoxin and

toxic shock syndrome toxin by Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in

Brazil. Lett. Appl. Microbiol. 29, 347-349.

Cremonesi, P., Luzzana, M., Brasca, M., Morandi, S., Lodi, R., Vimercati, C., Agnellini,

D., Caramente, G., Moroni, P., Castiglioni, B., 2005. Development of multiplex PCR assay

for the identification of Staphylococcus aureus enterotoxigenic strains isoalated from milk

and dairy products. Mol. Cell. Probes. 19,299-305.

Dinges, M.M., Orwin, P.M., Schlievert, P.M., 2000. Exotoxins of Staphylococcus aureus.

Clin. Microbiol.Rev. 13, 16-34.

Endo, Y., Yamada, T., Matsunaga, K., Hayakawa, Y., Kaidoh, T., Takeuchi, S., 2003.

Phage conversión of exfoliative toxin A in Staphylococcus aureus isolated from cows with

mastitis. Vet. Microbiol. 96, 81-90.

Ercolini, D., Blaiotta, G., Fusco, V., Coppola, S., 2004. PCR-based detection of enterotoxin

Staphylococcus aureus in the early stages of raw milk cheese making. J. Appl. Microbiol.

96, 1090-1096.

155

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Fitzgerald, J.R., Meaney, W.J., Hartigan, P.J., Smyth, C.J., Kapur, V., 1997. Fine structure

molecular epidemiology analysis of Staphylococcus aureus recoverd from cows.

Epidemiol. Infect. 119, 261-269.

Huang, X., Madan, A., 1999. Cap3: a DNA sequence assembly program. Genome Res.9,

868-877.

Ikeda, T., Tamate, N., Yamaguchi, K., Makino, S.I., 2005. Mass outbreak of food

poisoning disease caused by small amounts of staphylococcal enterotoxin A e H. Appl.

Env. Microbiol. 71, 2793-2795.

Jaulhac, B., Bes, M., Bornstein, N., Piemont, Y., Brun, Y., Fleurette, J., 1992. Synthetic

DNA probes for detection of genes for enterotoxins A, B, C, D, E and TSST-1 in

staphylococcal strains. J Appl Microbiol. 72,386-392.

Jaurrad, S., Peyrat, M.A., Lim, A., Tristan, A., Bes, M., Mougei, C., Etienne, J.,

Vandenesch, F., Bonneville, M., Lina, G.L., 2001. egc a highly prevalent operon of

enterotoxin gene, forms a putative nursey of superantigens in Staphylococcus aureus. J.

Immun. 166, 669-677.

Jorgensen, H.J., Mork, T., Hogasen, H.R., Rorvik, L.M., 2005a. Enterotoxigenic

Staphylococcus aureus in bulk milk in Norway. J. Appl. Microbiol. 99, 158-166.

156

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Jorgensen, H., Mathisen, T., Lovseth, A., Omoe, K., Qvale, K.S., Loncarevic, S., 2005b.

An outbreak of staphylococcal food poisoning causef by enterotoxin H in mashed potato

made with raw milk. FEMS Microbiol. Lett. 252, 267-272.

Katsuda, K., Hata, E., Kobayashi, H., Kohmoto, M., Kawashima, K., Tsunemitsu, H.,

Eguchi, M., 2005. Molecular typing of Staphylococcus aureus isolated from bovine

mastitic milk on the basis of toxin genes and coagulase gene polymorphisms. Vet.

Microbiol. 105, 301-305.

Klotz, M., Opper, S., Heeg, K., Zimmermann, S., 2003. Detection of Staphylococcus

aureus enterotoxins A to D by real-time fluorescence PCR assay. J. Clin. Microbiol. 41,

4683-4687.

Kuroda, M.O., Ohta, T., Uchiyama, I., Baba, T., Yuzawa, H., Kobayashi, I., Cui, L.,

Oguchi, A., Aoki, K., Nagai, Y., Lian, J., Ito, T., Kanamori, M., Matsumaru, H.,

Maruyama, A., Murakami, H., Hosoyama, A., Mizutani-Ui, Y., Takahashi, N.K., Sawano,

T., Inoue, R., Kaito, C., Sekimizu, K., Hirakawa, H., Kuhara, S., Goto, S., Yabuzaki, J.,

Kanehisa, M., Yamashita, A., Oshima, K., Furuya, K., Yoshino, C., Shiba, T., Hattori, M.,

Ogasawara, N., Hayashi, H., Hiramatsu, K., 2001. Whole genome sequencing of

methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240.

Larsen, H.D., Huda, A., Eriksen, N.H.R., Jensen, N.E., 2000. Differences between Danish

bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens.Vet.

Microbiol. 76, 153-162.

157

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Letertre, C., Perelle, S., Dilasser, F., Fach, P., 2003. Identification of a new putative

enterotoxin SEU encoded by egc cluster of Staphylococcus aureus. J. Appl. Microbiol. 2,

63-76.

Lim, S.K., Joo, Y., Moon, J., Lee, A., Nam, H., Wee, S., Koh, H., 2004. Molecular typing

of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Korea. J. Vet.

Med. Sci. 66, 581-584.

Loncarevic, S., Jorgensen, H.J., Lovseth, A., Mathisen, T., Rorvik, L.M., 2005. Diversity of

Staphylococcus aureus enterotoxin types within single samples of raw milk and raw milk

products. J. Appl. Microbiol. 98, 344-350.

Lopes, C.A.M., Moreno, G., Curi, P.R., Gottschak, J.R., Modolo, J.R., Correa, A., Pavan,

C., 1990. Characteristics of Staphylococcus aureus from subclinical bovine mastitis in

Brazil. Br. Vet. J. 146, 443-448.

Mac Faddin, J.F., 1980. Biochemical test for identification of medical bacteria. 2ed.

Baltimore: Williams e Wilkins. 527p.

Mclauchlin, J., Narayanan, G.L., Mithani, V., O’neil, G., 2000. The detection of

enterotoxins and toxic shock síndrome toxin genes in Staphylococcus aureus by

polymerase chain reaction. J. Food Prot. 63, 479-488.

158

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Maniatis, T., Frisch, E., Sambrook, J., 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold

Spring Harbor Laboratory, NY.

Muson, S.H., Treimane, M.T., Beteley, M.J., Welch, R.A., 1998. Identification and

characterization of Staphylococcus enterotoxin type G and I from Staphylococcus aureus.

Infect. Immun. 66, 3337-3348.

Omoe, K., Ishikawa, M., Shimoda, Y., Hu, D.L., Ueda, S., Shinagawa, K., 2002. Detection

of seg, seh and sei genes in Staphylococcus aureus isolates and determination of the

enterotoxin productivities of S. aureus isolates harboring seg, seh or sei genes. J. Clin.

Microbiol. 40, 857-862.

Omoe, K., Hu, D.L., Omoe, T.H., Nakane, A., Shinagawa, K., 2003 Identification and

characterization of a new staphylococcal enterotoxin-related putative toxin encoded by two

kinds of plasmids. Infec. Immun. 71, 6088-6094.

Orwin, P.M., Leung, D.Y.M., Heather, L.D., Schlievert, P.M., 2001. Biochemical and

Biological Properties of Staphylococcal Enterotoxin K. Infec. Immun. 69, 360-366.

Ren, K; Bannan, J.D., Pancholi, V., Cheung, A.L., Robbins, J.C., Fischetti, V.A., Zabriskie,

B., 1994. Characterization and biological properties of a new staphylococcal enterotoxin. J.

Exp. Med. 180, 1675-1683.

159

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Rosec, J.P., Guiraud, J.P., Dalet, C., Richard, N., 1997. Enterotoxin production by

staphylococci isolated from foods in France. Int Food Microbiol. 35,213-221.

Rosec, J.P., Gigaud, O., 2002. Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types

detected by PCR in France. Int J Food Microbiol. 25,61-67.

Salasaia, S.I.O., Khusnan, Z., Lämmler, C., Zschöck, M., 2004. Comparative studies on

pheno- and genotypic properties of Staphylococcus aureus isolated from bovine subclinical

mastitis in central Java in Indonesia and Hesse en Germany. J. Vet. Sci. 5, 103-109.

Schalm, O.W., Noorlander, B.S., 1957. Experiments and observations leading to

development of the California Mastitis Test. J. Am. Vet. Med. Assoc. 130, 199-207.

Scherrer, D., Corti, S., Muehlherr, J.E., Zweifel, C., Stephan, R., 2004. Phenotypic and

genotypic characteristics of Staphylococcus aureus isolated from raw bulk-tank milk

samples of goats and sheep. Vet. Microbiol. 101, 101-107.

Silva, N., Junqueira, V.C.A., Silveira, N.F.A., 1997. Manual de métodos de análise

microbiológica de alimentos. São Paulo: Varela, 295p.

Silva, N., Cardoso, H.F.T., Sena, M.J., Carmo, L.S., 1999. Produção da toxina-1 da

síndrome do choque tóxico por Staphylococcus aureus isolados de leite bovino em Minas

Gerais. NAPGAMA. 2, 12-14.

160

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Silva, E.R., Carmo, L.S., Silva, N., 2005. Detection of the enterotoxin A, B, and C genes in

Staphylococcus aureus from goat and bovine mastitis in Brazilian dairy herds. Vet.

Microbiol. 106, 103-107.

Stephan, R., Annemüller, C., Hassan, A.A.; Lämmler, C.H., 2001 Characterization of

enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in north-east

Switzerland. Vet. Microbiol. 78, 373-382.

Su, Y.C., Wong, A.C.L., 1995. Identification and purification of a new staphylococcal

enterotoxin, H. Appli. Environ. Microbiol. 61, 1438-1443.

Udo, E.E., Al-Bustan, M.A., Jacob, L.E., Chugh, T. D., 1999. Enterotoxin production by

coagulase-negative staphylococci in restaurant workers from kuwait city may be a potencial

cause of food poisoning. J. Med. Microbiol. 48, 819-823.

Vernozy-Rozand, C., Mazuy, C., Prevost, G., Lapeyre, C., Bes, M., Brun, Y., Fleurette, J.,

1996. Enterotoxin production by coagulase-negative staphylococci isolated from goat’s

milk and cheese. Int. J. Food Microbiol. 30, 271-280.

Yamaguchi, T., Nishifuji, K., Sasaki, M., Fudaba, Y., Aepfelbacher, M., Takata, T., Ohara,

M.; Komatsuzawa, H., Amagai, M., Sugai, M., 2002. Identification of the Staphylococcus

aureus etd pathogenicity island which encodes a novel exfoliative toxin, ETD, and EDIN-

B. Infec. Immun. 70, 5835-5845.

161

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Zhang, S., Iandolo, J.J., Stewart, G.C., 1998. The enterotoxin D plasmid of Staphylococcus

aureus encodes a second enterotoxin determinant (sej). FEMS Microbiol. Lett. 168, 227-

233.

Zschöck, M., Ribe, K., Sommerhäuser, J., 2004. Ocurrence and clonal relatedness of

sec/tst-gene positive Staphylococcus aureus isolated of quartermilk samples of cows

suffering from mastitis. Lett. Appl. Microbiol. 38, 493-498.

Zschöck, M., Kloppert,B., Wolter, W., Hamann, H.P., Lämmler, C., 2005. Pattern of

enterotoxin genes seg, seh, sei and sej positive Staphylococcus aureus isolated from bovine

mastitis. Vet. Microbiol. 108, 243-249.

162

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

5.4 ARTIGO CIENTÍFICO 4: PERFIL DE SENSIBILIDADE ANTIMICROBIANA E

DETECÇÃO DE GENES TOXIGÊNICOS EM CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS SPP.

ISOLADAS DE QUEIJOS DE COALHO NO ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL

Este trabalho será enviado para a Revista Memórias do Instituto Oswaldo Cruz

(Anexo 3).

163

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Resumo

Para avaliar a qualidade microbiológica de queijos de coalho comercializados no

Estado de Pernambuco com relação a Staphylococcus coagulase positiva (SCP), realizou-se

o isolamento, contagem e identificação deste microrganismo, utilizando-se o Ágar Baird-

Parker. A presença de genes toxigênicos responsáveis pela produção das toxinas SEA-SEE,

SEG-SEJ, TSST-1, ETA e ETB nas cepas de Staphylococcus coagulase positiva e negativa

isoladas das amostras de queijos de coalho foi investigada por PCR. Estas cepas também

foram submetidas a testes de sensibilidade antimicrobiana in vitro, através da técnica de

difusão em disco. Os resultados revelaram contagens de SCP variando de 10

a 10

UFC/g

e que 9/10 das amostras de queijos de coalho estavam fora dos padrões estabelecidos pela

legislação vigente. A presença de genes toxigênicos tst, sec, sed, seg, seh, sei e sej foi

encontrada em 18/20 das cepas com os seguintes percentuais 5%, 11%, 9%, 20%, 16%,

25%, 14%, respectivamente. Com relação ao perfil de sensibilidade antimicrobiana foi

constatado que os antibióticos mais eficazes foram: sulfa+trimetoprim e vancomicina com

100% de eficácia. Estes resultados são preocupantes para a saúde do consumidor

nordestino, pois o queijo de coalho é amplamente consumido nesta região.

Palavras-chave: PCR, Staphylococcus spp., Queijo de Coalho, Resistência Antimicrobiana

164

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

1- Introdução

Os alimentos destinados ao consumo humano estão expostos a contaminações desde

sua origem até a mesa do consumidor. Leite e produtos derivados apesar de nutritivos para

o homem, constituem-se em excelentes meios para o desenvolvimento de microrganismos

deteriorantes e patogênicos, podendo desencadear surtos de toxinfecção alimentar, os quais

têm sido amplamente relatados na literatura, verificando-se a necessidade de melhoria nas

condições higiênico-sanitárias na cadeia produtiva do leite (Veras et al. 2003).

O queijo de coalho é um dos mais tradicionais queijos produzidos no Nordeste

brasileiro e devido à simplicidade de sua tecnologia, é amplamente fabricado nesta região.

É também um importante derivado do leite, apreciado tanto pelo seu valor nutritivo como

pelo seu sabor que atende aos mais exigentes paladares. No entanto, as condições de

processamento, armazenamento e comercialização podem comprometer suas características

organolépticas, bem como, torná-lo impróprio para consumo, em virtude da contaminação

por microrganismos responsáveis por toxinfecções alimentares (Ribeiro de Sá et al. 2003).

A qualidade e a durabilidade de um produto dependem da qualidade da matéria-

prima utilizada na sua fabricação. Dessa forma, a qualidade do leite é de fundamental

importância para a produção de queijos.

A contaminação microbiana de queijos assume destacada relevância em saúde

pública ao se considerar que bactérias enterotoxigênicas e patogênicas como

Staphylococcus aureus (S. aureus), Listeria sp. e Salmonella sp. são comumente

encontradas (Sena et al. 1999; Ercolini et al. 2004).

Elevados índices de Staphylococcus aureus ocorrem em queijos tanto no Brasil

(Santos et al. 1995; Ritter et al., 2001; Benevides & Telles 2002; Hoffmann et al. 2002;

Barbosa et al. 2004) como em outros países do mundo (Holecková et al. 2002; Normanno

165

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

et al. 2005), incluindo cepas de estafilococos enterotoxigênicas. Por isso, o queijo ocupa

lugar de destaque entre os produtos lácteos envolvidos em surtos de doenças de origem

alimentar, veiculando principalmente Staphylococcus (Veras et al. 2003).

Segundo Carmo et al. (2002), 378 pessoas estavam envolvidas em um surto de

intoxicação alimentar estafilocócica em Minas Gerais após a ingestão de queijo Minas e de

acordo com levantamentos anuais sobre doenças de origem alimentar realizados em sete

países, o leite e derivados são responsáveis por 1 a 5% dos surtos causados por bactérias,

sendo o leite responsável por 39,1% dos casos, os queijos por 53,1% e outros produtos

derivados por 7,8% (Buyser et al. 2001). No Brasil, também foram diagnosticados sete

casos de intoxicações estafilocócicas onde o alimento envolvido foi o queijo e a toxina

responsável a SEH (Pereira et al., 1996).

O S. aureus e os Staphylococcus coagulase positiva e negativa podem produzir

enterotoxinas e, assim, representarem risco quando presentes em alimentos (Pereira &

Pereira, 2005).

Outro problema de destaque na área de saúde em relação aos estafilococos é a

resistência antimicrobiana, pois bactérias resistentes a antibióticos preocupam uma vez que

podem ser transmitidas ao homem pela ingestão de alimentos contaminados. No trato

gastrintestinal, elas podem transferir genes que conferem resistência antimicrobiana a

outras bactérias (Wite 2000).

A seleção de populações microbianas resistentes a antibióticos ocorre como

conseqüência do impacto combinado do uso da droga no homem, animais, e plantas (Rapini

et al. 2003).

Sendo o queijo de coalho um alimento bastante consumido no Estado de

Pernambuco, este trabalho teve como objetivo realizar o isolamento e quantificação de

166

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Staphylococcus spp., bem como testar a sensibilidade antimicrobiana das cepas isoladas,

frente a alguns antibióticos utilizados na medicina veterinária e humana e investigar a

presença de genes toxigênicos utilizando a técnica de PCR.

2- Material e Métodos

2.1 Cepas de Staphylococcus spp.

Foram analisadas 20 cepas de Staphylococcus spp. isoladas de 10 amostras de

queijos de coalho comercializadas no estado de Pernambuco (Tabela1).

As amostras de queijos foram submetidas ao isolamento, contagem e identificação

de Staphylococcus coagulase positiva no Setor de Microbiologia do Laboratório Nacional

Agropecuário em Pernambuco (LANAGRO) do Ministério da Agricultura Pecuária e

Abastecimento.

Para a contagem de Staphylococcus coagulase positiva as amostras de queijos foram

pesadas em alíquotas de 25 +/- 0,2g, em sacos de stomacher previamente identificados e

mantidas sob refrigeração até o início das análises.

As amostras de queijos de coalho foram analisadas seguindo-se a metodologia

oficial, preconizada pela Coordenação de Laboratório Animal (CLA) do Ministério da

Agricultura Pecuária e Abastecimento – MAPA (Brasil 2003), utilizando como meio de

cultura o Ágar Baird-Parker enriquecido com emulsão de gema de ovo em solução salina

0,85% (1:1) e solução de telurito de potássio (1%). O cálculo para contagem das unidades

formadoras de colônias (UFC/g) foi realizado em função do número de colônias típicas e

atípicas contadas, diluição inoculada e percentual de colônias confirmadas (Brasil 2003).

167

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

2.2 Identificação das Cepas de Staphylococcus spp.

Para a identificação das cepas de estafilococos foram verificadas características

morfotintoriais das colônias através de seu crescimento em Ágar Base, acrescido de 8% de

sangue desfibrinado de carneiro e pela coloração através da técnica de Gram, produção de

hemólise e provas bioquímicas como catalase, coagulase, termonuclease, fermentação da

glicose em anaerobiose, fermentação do manitol em aerobiose e anaerobiose e produção de

acetoína. Após a realização dos testes, as cepas foram classificadas em Staphylococcus

aureus (S. aureus), quando positiva em todos os testes, Staphylococcus coagulase positiva

(SCP), quando positiva para a produção da coagulase, fermentação da glicose em

anaerobiose e catalase, mas negativa em algum dos outros testes. Em Staphylococcus

coagulase negativa (SCN), quando a cepa não coagulava o plasma de coelho, apresentava

características de estafilococos na técnica de coloração de Gram, fermentava a glicose em

anaerobiose e produzia a catalase.

2.3 Testes de Sensibilidade Antimicrobiana

Os testes de sensibilidade antimicrobiana in vitro dos isolados de Staphylococcus

spp. foram realizados utilizando a técnica de difusão em Ágar segundo Bauer et al. (1966)

em Ágar Müeller Hinton, utilizando os seguintes discos impregnados de antibióticos:

amoxicilina (10 µg), bacitracina (10 U.I.), cefalexina (10 µg), clindamicina (2µg),

cloranfenicol (30 µg), eritromicina (15 µg), enrofloxacina (5 µg), estreptomicina (10 µg ),

gentamicina (10 µg), neomicina (30 µg), norfloxacina (10 µg), oxacilina (1 µg), penicilina

(10 U.I.), sulfa (25 µg) + trimetoprim (5 µg), e vancomicina (30 µg).

168

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

2.4 Extração do DNA Genômico

O DNA genômico das cepas de Staphylococcus spp. foi extraído de acordo com

Maniatis et al. (1989) e quantificado através do programa 1D Image Analysis Software,

version 3.5 da Kodak Digital Science, DC 120 zoom Digital Câmera, após eletroforese em

gel de agarose a 1%, usando-se o DNA do fago λ clivado com a enzima HindШ.

2.5 Detecção dos Genes Toxigênicos por PCR

2.5.1 PCR - Multiplex

Duas reações de PCR-Multiplex foram realizadas, uma para pesquisa dos genes sea,

seb, sec, sed, see e outra para pesquisa dos genes eta, etb e tst.

As reações foram preparadas para um volume final de 25µL contendo 20pmol de

cada primer, 10mM Tris-HCl pH 9.0, 50mM de KCl, 160µM de cada dNTP, 3mM de

MgCl

, 20ng de DNA genômico e 1,2U da Taq DNA polimerase (Invitrogen, Brasil). As

amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra) programado para 30 ciclos

térmicos, cada um consistindo de 95

C por 1 min. (desnaturação), 55

C por 1 min.

(anelamento) e 72

C por 2 min. (extensão). A seqüência dos primers utilizados nas reações

e tamanho dos segmentos esperados são mostrados na Tabela 2. Foram usados como

controle as cepas padrão de S. aureus FRI (Food Research Institute Madison, Wiscosin,

EUA) MN 8 portadoras do gene tst e FRI 361 portadora dos genes sec e sed.

Os produtos de amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose

1,5% (m/v), corados com brometo de etídeo (10mg/mL) por 15 min., visualizados e

fotografados em transiluminador de UV.

169

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

2.5.2 PCR-Uniplex

As reações de PCR-Uniplex para a pesquisa dos genes seg, seh, sei e sej

separadamente, consistiu de uma mistura de 20pmol de cada primer, 160 µM de cada

dNTP, 1,5mM do MgCl

, 10mM do Tris-HCl pH 9.0, 50mM de KCl, 20ng do DNA

genômico e 1U da Taq DNA polimerase (Invitrogen, Brasil) em um volume final de 25µL.

As amplificações para os genes seg, seh e sej foram realizadas em termociclador (Biometra)

programado para 30 ciclos térmicos, cada um consistindo de 94

C por 3 min., 94

C por 30

seg., 60

C por 30 seg. e 72

C por 30 seg. A amplificação do fragmento para o gene sei foi

programada para 94

C por 30 seg., 60

C por 30 seg. e 72

C por 60 seg. Foi usada para

controle a cepa padrão de S. aureus FRI 361 portadora dos genes seg, sei e sej.

A seqüência dos primers utilizados nas reações e tamanho dos segmentos esperados

são mostrados na Tabela 2.

2.5.3 Análise de restrição e sequenciamento

Para confirmar se os segmentos amplificados pela PCR faziam parte dos genes tst,

sec, sed, seg, seh, sei e sej o padrão de restrição dos fragmentos foi obtido. A enzima RsaI

foi selecionada para a digestão dos fragmentos amplificados pela PCR dos genes seg e sej e

a enzima DraI para o gene seh, de acordo com Rosec & Gigaud (2002). Avaliando-se os

sítios de restrição através do programa Generunner DNA Sequence Analyses software,

versão 3.05, disponível gratuitamente na rede a ezima RsaI foi utilizada para a digestão dos

fragmentos amplificados pela PCR dos genes sec, sed e sei e a DraI para o gene tst (Tabela

3). O tamanho dos fragmentos obtidos após restrição foi analisado após eletroforese em gel

de agarose 1,8%.

170

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Para confirmar que o segmento amplificado era parte dos genes tst, sec, sed, seg,

seh, sei e sej os segmentos foram purificados com o kit PureLink PCR Purification

(Invitrogen, Brasil) e analisados através do seqüenciador automático ABI 3100 (Applied

Biosystem, USA). As sequências dos nucleotídeos obtidas foram analisadas pelos

programas: agrupamento das seqüências de S. aureus - forward e reverse (Huang & Madan,

1999) e comparadas com seqüências depositadas no GenBank: versão 2.2.12 do programa

Blast (Altschul et al. 1990).

3- Resultados

Das 20 cepas de Staphylococcus spp. estudadas, (55%) foram identificadas como S.

aureus, (30%) como SCP e (15%) como SCN.

As contagens de Staphylococcus coagulase positiva em Ágar Baird-Parker nas 10

amostras de queijos de coalho variaram de 10

a 10

UFC/g (Tabela 1), com a seguinte

distribuição (50%) das amostras apresentaram contagens de 10

UFC/g, (20%)

apresentaram contagens de 10

e (10%) apresentou contagem de 10

, de 10

e 10

De acordo com a resolução RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001)

para os queijos de quartirolo, cremoso, criollo, mussarela e similares, com umidade entre

46% e 55%, exceção de minas frescal e incluído o queijo de coalho com umidade

correspondente, o limite padrão para a contagem de Staphylococcus coagulase positiva é de

5 x 10

UFC/g. Desta forma, das 10 amostras de queijos de coalho analisadas, (90%)

estavam fora do padrão estabelecido para Staphylococcus coagulase positiva.

No que se refere à pesquisa de genes toxigênicos através da técnica de PCR

constatou-se que (10%) das cepas avaliadas não apresentaram nenhum dos genes

171

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

toxigênicos sea-see, seg, seh, sei, sej, tst, eta e etb e (90%) foram positivas para um ou mais

genes toxigênicos.

A prevalência dos genes toxigênicos nas cepas de Staphylococcus spp. foi seg

(20%), seh (16%), sei (25%), sej (14%), sec (11%), sed (9%) e tst (5%). No entanto, não foi

diagnosticada a presença de genes para as toxinas estafilocócicas SEA, SEB, SEE, ETA e

ETB em nenhuma das vinte cepas de Staphylococcus spp. estudadas.

Das 18 cepas que apresentaram genes toxigênicos (11%) portavam apenas um gene,

(11%) dois genes, (45%) três genes, (11%) cinco genes e (22%) seis genes, tendo sido

verificado os seguintes genótipos: tst 1/18 isoladamente, sei 1/18 isoladamente, a

associação (seh + sei) 2/18 e as associações (seg + sei + sej) 5/18, (tst + seg + seh) 1/18,

(sec + sed + sei) 1/18, (seg + seh + sei) 1/18, (sec + tst + seg + seh + sei) 1/18, (sec +sed

+ seg + seh + sei) 1/18, (sec + sed + seg + seh + sei + sej) 4/18.

Das três cepas de Staphylococcus coagulase negativa, uma cepa apresentou o

genótipo (seh + sei) e duas o genótipo (sec + sed + seg + seh + sei + sej).

A análise dos resultados feita com o programa Blast revelou homologia superior a

90% entre os genes tst, sec, sed, seg, seh, sei e sej nas cepas estudadas quando comparadas

com seqüências depositadas no GenBank. A comparação dos fragmentos por eletroforese

em gel de agarose dos genes tst, sec, sed, seg, seh, sei e sej amplificados nas diferentes

cepas e digeridos com RsaI e DraI, revelou um padrão de restrição esperado e idêntico

entre as cepas para cada gene estudado (Tabela 3, Figura 1). Estes resultados confirmam a

presença dos genes tst, sec, sed, seg, seh, sei e sej em cepas de Staphylococcus coagulase

positiva e negativa isoladas de amostras de queijos de coalho no Estado de Pernambuco.

Com relação à sensibilidade antimicrobiana (80%) das cepas de Staphylococcus spp.

analisadas apresentaram-se sensíveis aos antibióticos utilizados no teste de sensibilidade

172

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

antimicrobiana in vitro, (4%) apresentaram sensibilidade intermediária e (16%) foram

resistentes. O Perfil de sensibilidade antimicrobiana para cada antibiótico testado, encontra-

se na Tabela 4, onde também verifica-se que os antibióticos mais eficazes, com 100% de

sensibilidade foram sulfa + trimetoprim e vancomicina e os menos eficazes, com maiores

percentuais de resistência foram estreptomicina 65% e penicilina 65%.

Ao se analisar a característica de multiresistência, verificou-se que 60% das cepas

foram resistentes para 0 a 2 antibióticos, 30% para 3 a 5 antibióticos e 10% para 6 a 8

antibióticos, simultaneamente.

4- Discussão

Os resultados referentes às contagens de SCP são semelhantes aos encontrados por

outros autores que também avaliaram os índices de SCP em queijos comercializados em

algumas regiões do país, como por exemplo, Sena (2000) que verificou contagens variando

de 10

a 10

UFC/g em queijos de coalho em Recife, Peresi et al. (2001) que relataram

contagens de 10

a 10

em queijos Minas frescal em São José do Rio Preto e Barbosa et al.

(2004) que encontraram contagens de 10

a 10

UFC/g em queijos de coalho

comercializados em Teresina.

Com relação à legislação vigente (BRASIL, 2001) os resultados obtidos para as

amostras de queijos de coalho analisadas neste estudo encontram-se fora dos padrões. Estes

achados corroboram com os de Loguercio & Aleixo (2001) que ao analisarem amostras de

queijo Minas frescal, verificaram que (96%) das amostra estavam em desacordo com o

padrão legal. Da mesma forma, Hoffmann et al. (2002) também constataram que (100%)

das amostras estavam fora dos padrões permitidos, assim como, Benevides & Telles (2002)

constataram que 45% das amostras de queijos de coalho estavam impróprias para consumo

173

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

humano com relação a S. aureus. Cardoso & Araújo (2003) e Ribeiro de Sá (2003) também

encontraram elevados índices de amostras de queijos fora dos padrões, demonstrando que

geralmente o queijo de coalho apresenta-se impróprio para consumo.

O S. aureus é um patógeno responsável por intoxicações que resulta da ingestão de

alimentos contaminados por enterotoxinas termoestáveis e pré-formadas (Su & Wong,

1997) e representa um risco sanitário quando níveis desta bactéria atingem contagens em

torno de 10

a 10

UFC/g ou mL do alimento (Gelli et al. 1986; Jablonski & Bohach 1997).

Neste estudo, (60%) das amostras de queijos de coalho apresentaram contagens de SCP de

a 10

UFC/g o que indica que estes produtos poderiam conter toxinas pré-formadas e

serem veículos de intoxicações alimentares, principalmente por estas cepas de estafilococos

terem apresentado em seu genoma genes toxigênicos.

Através das técnicas de Sensibilidade Ótima em Placa (OSP) e ELISA (Sandwich

Enzyme-linked Immunosorbent Assay), Sena (2000) constatou a produção das toxinas

SEA, SEB, SEC, SED e TSST-1 em cepas de Staphylococcus spp. isoladas de amostras de

queijos de coalho em Recife, Pernambuco. Em Minas Gerais, usando as mesmas técnicas,

Carmo et al. (2002) encontratram as toxinas SEA, SEB e SEC em cepas de S. aureus

isoladas de amostras de queijos suspeitas de envolvimento em casos de intoxicação

alimentar, da mesma forma que Veras et al. (2003), só que em isolados de amostras de leite

e derivados.

Não só no Brasil, mas principalmente em outros países do mundo a presença das

toxinas estafilocócicas clássicas já foi relatada, como por exemplo, Jorgensen et al. (2005) e

Loncarevic et al. (2005) que através da técnica de RPLA (Reversed Passive Látex

Aglutination) detectaram a presença das toxinas (SEA, SEB e SEC) e (SEC e SED),

respectivamente, em cepas de S. aureus de leite e derivados na Noruega e Normanno et al.

174

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

(2005) que utilizaram a mesma técnica e observaram as toxinas SEB, SEC e SED em cepas

de S. aureus isoladas de queijos na Itália.

Como visto anteriormente, no Brasil, as principais técnicas empregadas no

diagnóstico das toxinas estafilocócicas são os métodos de OSP e ELISA. Em outros países

além destas técnicas e da técnica de RPLA, que são aplicadas na detecção das toxinas

clássicas, a técnica de PCR tem sido uma valiosa ferramenta no diagnóstico de cepas de S.

aureus portadoras de genes toxigênicos em alimentos (Nájera-Sánchez et al. 2003; Ercolini

et al. 2004; Blaiotta et al. 2004; Cremonesi et al. 2005), casos de mastite (Omoe et al. 2002;

Cabral et al. 2004; Silva et al. 2005) e surtos de doenças de origem alimentar (Asao et al.

2003; Chen et al. 2004; Martín et al. 2004; Omoe et al. 2005), permitindo a estes e outros

pesquisadores detectarem genes para as toxinas TSST-1, ETA, ETB, genes para as toxinas

clássicas SEA a SEE, assim como, genes para as toxinas recentemente descritas como SEG,

SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM, SEN, SEO, SEP, SER e SEU e genes para outras toxinas

que ainda podem ser descobertas.

Ao utilizar-se a técnica de PCR neste estudo verificou-se que (90%) das cepas de

Staphylococcus spp. isoladas de queijos de coalho comercializados em Pernambuco,

portavam genes toxigênicos que codificam para as toxinas TSST-1, SEC, SED, SEG, SEH,

SEI e SEJ. Estes achados demonstram que tais resultados apresentam-se semelhantes aos

encontrados no Brasil com relação às toxinas clássicas, pois foi verificada a presença de

cepas de Staphylococcus spp. que portavam os genes sec, sed e tst que teriam todo o

material genético para a produção de tais toxinas in vitro.

Com relação aos genes para as toxinas clássicas, observou-se a presença dos genes

sec e sed entre as cepas de Staphylococcus isoladas de queijos de coalho. Alguns estudos

vêm demonstrando que SEC e SED estão associadas com contaminação animal, enquanto

175

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

SEA e SEB com contaminação humana (Bergdoll 1990; Rodrigues et al. 1993; Vernozy-

Rozand et al. 1996; Un Lee et al. 1998).

Jorgensen et al. (2005) constataram que (69%) das cepas de S.aureus portavam os

genes toxigênicos tst, sea, sec, seg, seh e sei e Loncarevic et al. (2005) que (34%) das cepas

continham os genes seb, sec, sed, seg, seh, sei e sej, sendo estes resultados condizentes aos

encontrados neste estudo, exceto pela ausência dos genes sea e seb. E a presença do gene

see não foi encontrada neste estudo e nem pelos autores acima citados.

Ao avaliar-se a presença dos genes seg, seh, sei e sej para as novas toxinas nos

isolados de queijos de coalho, verifica-se que os genes mais prevalentes são seg e sei. Estes

achados são similares aos de Loncarevic et al. (2005). Este fato é importante, pois tais

cepas podem produzir as toxinas SEG e SEI e causarem intoxicação alimentar. Pois, ao

utilizar a técnica de PCR para estudar os genes seg, seh e sei em cepas de S. aureus de

indivíduos envolvidos em casos de doenças de origem alimentar, Chen et al. (2004)

verificaram que em um dos pacientes a cepa de S. aureus isolada, apenas portava o gene

seg, enquanto em outro paciente, a cepa portava apenas o gene sei, sendo ambas as cepas

negativas para a produção das toxinas clássicas SEA-SEE e não portadoras dos genes sea-

see. Este fato demonstra que as toxinas mais recentes descobertas como SEG e SEI podem

ser responsáveis por casos de intoxicação alimentar, só que com menor freqüência.

A resistência antimicrobiana apresentada por microrganismos isolados de alimentos

também é outro fator preocupante para a saúde pública. No presente estudo foi encontrado

um baixo percentual de resistência entre as cepas de Staphylococcus spp. avaliadas., no

entanto, as cepas que foram resistentes apresentaram multiresistência elevada e os

antibióticos menos eficazes foram a estreptomicina e a penicilina. Trabalhos realizados por

Sena (2000), Peresi et al. (2001) e Rapini et al. (2003, 2004) com cepas de Staphylococcus

176

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

spp. isoladas de queijos verificaram altos índices de resistência à penicilina e também de

multiresistência A resistência à estreptomicina e à penicilina, pode ter ocorrido devido ao

uso da associação penicilina+estreptomicina no tratamento de animais produtores de leite

com infecções por microrganismos sensíveis a estes antibióticos.

5. Conclusão

Através deste estudo, observou-se que os genes se mais freqüentes em cepas de

Staphylococcus coagulase positiva e negativa, isoladas de amostras de queijos de coalho

foram sei e seg. A presença de alto percentual de cepas contendo seis diferentes genes

toxigênicos, isoladas de amostras de queijos de coalho, que apresentaram contagens

elevadas de estafilococos, é preocupante para a saúde do consumidor, pela possibilidade de

produzirem toxinas responsáveis por intoxicações alimentares. A presença de cepas de

Staphylococcus coagulase negativa portadoras de grande diversidade genética para os genes

se é outro importante fato, uma vez que no Brasil não há portarias que determinem limites

para Staphylococcus coagulase negativa em alimentos.

6- Agradecimentos

Ao Banco do Nordeste do Brasil pelo financiamento do projeto e ao Conselho

Nacional de Pesquisa (CNPq) pela bolsa concedida ao primeiro autor. Agradecem também

ao Laboratório de Enterotoxinas Estafilocócicas da Fundação Ezequiel Dias (FUNED-MG)

e ao Dr. Luiz Simeão do Carmo por ter cedido as cepas padrões FRI (Food Research

Institute Madison, Wiscosin, EUA).

177

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Tabela 1 – Contagem de Staphylococcus coagulase positiva em amostras de queijos de

coalho no Estado de Pernambuco, Brasil

I Procedência Contagem

UFC/g

D Característica

das Colônias

Q01 -4 Típica

Q02

São Bento do Una 1,7x10

-4 Atípica

Q03 -4 Típica

Q04

Venturosa 3,1x10

-4 Atípica

Q05 -4 Atípica

Q06

Venturosa 2,3x10

-4 Típica

Q07 Venturosa 2,1x10

-3 Atípica

Q08 -2 Típica

Q09

Cabo de Santo Agostinho

8,3x10

-2 Típica

Q10 -3 Típica

Q11 -3 Típica

Q12

Pombos

2,1x10

-3 Atípica

Q13 -4 Típica

Q14

Igarassu

6,8x10

-4 Típica

Q15 -3 Típica

Q16

Camaragibe

1,1x10

-3 Típica

Q17 -2 Típica

Q18

Arruda

5,4x10

-3 Típica

Q19 -2 Típica

Q20

Alagoinha

6,0x10

-3 Típica

D – Diluição utilizada; I – Identificação das cepas de Staphylococcus spp.

178

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Tabela 2 – Primers usados para a detecção por PCR dos genes sea-see, seg-sej, tst, eta e

etb em cepas de Staphylococcus spp. isoladas de amostras de queijos de coalho no Estado

de Pernambuco, Brasil

Gene Primer Seqüência de Oligonucleotídeos

(5’→ 3’)

Tamanho do

Fragmento (pb)

*sea

SEA-3b CCT TTG GAA ACG GTT AAA ACG 127

SEA-4b TCT GAA CCT TCC CAT CAA AAA C

*seb

SEB-1c TCG CAT CAA ACT GAC AAA CG 477

SEB-4b GCA GGT ACT CTA TAA GTG CCT GC

*sec

SEC-3b CTC AAG AAC TAG ACA TAA AAG CTA GG 271

SEC-4b TCA AAA TCG GAT TAA CAT TAT CC

*sed

SED-3b CTA GTT TGG TAA TAT CTC CTT TAA ACG 319

SED-4b TTA ATG CTA TAT CTT ATA GGG TAA ACA TC

*see

SEE-3b CAG TAC CTA TAG ATA AAG TTA AAA CAA GC 178

SEE-2c TAA CTT ACC GTG GAC CCT TC

*tst

TST-3 AAGCCCTTTGTTGCTTGCG 445

TST-6 ATCGAACTTTGGCCCATACTTT

*eta

ETA-3b CTAGTGCATTTGTTATTCAAGACG 119

ETA-4b TGCATTGACACCATAGTACTTATTC

*etb

ETB-3b ACG GCT ATA TAC ATT CAA TTC AAT G 262

ETB-4b AAA GTT ATT CAT TTA ATG CAC TGT CTC

**seg

SEG-1 ACGTCTCCACCTGTTGAAGG 400

SEG-2 TGAGCCAGTGTCTTGCTTTG

**seh

SEH-1 TCACATCATATGCGAAAGCAG 357

SHE-2 TAGCACCAATCACCCTTTCC

***sei

SEI-1 GGTGATATTGGTGTAGGTAAC 454

SEI-2 ATCCATATTCTTTGCCTTTACCAG

**sej

SEJ-1 CAGCGATAGCAAAAATGAAACA 426

SEJ-2 TCTAGCGGAACAACAGTTCTGA

*Becker et al. 1998, **Rosec & Gigaud 2002 e ***Omoe et al. 2002

179

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Tabela 3– Enzimas de restrição usadas para confirmação da identidade dos fragmentos dos

genes seg, seh, sei, sej, sec, sed e tst e padrão de restrição esperado

Gene Tamanho do Produto Amplificado Enzimas Padrão de Restrição

(tamanho das bandas)

seg

400 pb Rsa I 296 pb + 104 pb

seh

357 pb Dra I 218 pb + 139 pb

sei

454 pb Rsa I 345pb + 109 pb

sej

426 pb Rsa I 210 pb + 216 pb

tst

445 pb Dra I 390 pb + 55 pb

sec

271 pb Rsa I 198 pb + 73 pb

sed

319 pb Rsa I 66 pb + 95 pb + 158 pb

pb – Pares de Bases

180

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Tabela 4– Perfil de sensibilidade de cepas de Staphylococcus spp. isoladas de amostras de

queijos de coalho no Estado de Pernambuco, frente aos antibióticos testados

Antibiótico S I R

Amoxicilina 50% 10% 40%

Enrofloxacina 95% 5% 0%

Estreptomicina 15% 20% 65%

Cloranfenicol 95% 0% 5%

Sulfa+Trimetoprim 100% 0% 0%

Cefalexina 95% 0% 5%

Norfloxacina 90% 5% 5%

Vancomicina 100% 0% 0%

Eritromicina 85% 10% 5%

Penicilina 35% 0% 65%

Oxacilina 90% 0% 10%

Neomicina 80% 10% 10%

Gentamicina 90% 0% 10%

Clindamicina 85% 5% 10%

Bacitracina 85% 0% 15%

S – Sensível, I – Intermediário, R – Resistente

181

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Figura 1 – Produto de amplificação da PCR dos genes sed, sej, sei, tst, sec, seh e seg (A,

linhas: 1 e 3, gene sed; A, linhas: 6 e 8, gene sej; B, linhas: 1 e 3, gene sei; C, linhas: 1 e 3,

gene tst; C, linhas: 5 e 7, gene sec; C, linha: 9, gene seh; D, linhas: 1 e 3, gene seg) e seus

padrões de restrição com as enzimas, RsaI (A, linhas: 2 e 4, gene sed; A, linhas: 7 e 9, gene

sej; B, linhas: 2 e 4, gene sei; C, linhas: 6 e 8, gene sec; D, linhas: 2 e 4, gene seg) e DraI

(C, linhas: 2 e 4, gene tst; C, linha: 10, gene seh)

182

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

7- Referências Bibliográficas

Altschul SF, Gish W, Miller W, Myres EW, Lipman DJ 1990. Basic local alignment search

tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410.

Asao T, Kumeda Y, Kawai T, Shibata T, Oda H, Haruki K, Nakazawa H, Kozaki S 2003.

An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan:

estimation of enterotoxin A in the incriminated milk and powdered skim milk. Epidemiol.

Infect. 130, 33-40.

Barbosa SS, Trajano HMR, Santos HS, Muratori MCS, Lima FL 2004. Detecção de

Staphylococcus sp em queijos de coalho adquiridos em Teresina-Piauí. In: XIX Congresso

Brasileiro de Ciência e Tecnologia dos Alimentos-CBCTA, 2004, Recife, Pernambuco. XIX

CBCTA Ciência e Tecnologia dos Alimentos: estratégias para o desenvolvimento.

Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia dos Alimentos-SBCTA, 2004. 1 CD-ROM.

Bauer MD, Kirby WMM, Sherris JC, Turck M 1966. Antibiotic susceptibility testing by a

standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45, 493-496.

Benevides SD, Telles FJS 2002. Características microbiológicas, de armazenamento e de

embalagem de queijos tipo “coalho” comercializados na cidade de Fortaleza, CE. Higiene

Alimentar. 16, 44-47.

Bergdoll MS 1990. Staphylococcal food posioning. In H. Riemman and F. L. Bryan.

Foodborne infections and intoxications. Academic Press, New York. p. 85-106.

183

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Blaiotta G, Ercolini D, Pennacchia C,; Fusco V, Casaburi A, Pepe O, Villani F 2004. PCR

detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus spp. strains isolated from

meat and dairy products. Evidence for new variants of seG and seI in S. aureus AB-8802. J.

Appl. Microbiol. 97, 719-730.

Brasil 2001. Ministério da Saúde. Regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para

alimentos. Resolução-RDC, nº 12 de 2 de janeiro de 2001. Diário Oficial [da] República

Federativa do Brasil, Poder Executivo, Brasília, 2 de janeiro de 2001. Secção I, p. 45-53.

Brasil 2003. Ministério da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrária. Métodos

analíticos oficiais para análises microbiológicas para o controle de produtos de origem

animal e água. Instrução Normativa 62, de 26 de agosto de 2003. Diário Oficial [da]

República Federativa do Brasil, Poder Executivo, Brasília, 18 de setembro 2003. Seção I, p.

21-32; 40-43;51-67.

Buyser MLD, Dufour B, Maire M, Lafarge V 2001. Implication of milk and milk products

in foo-borne diseases in France and in different industrialised countries. Int. J. Food

Microbiol. 67, 1-17.

Cabral KG, Lämmler C, Zschöck M,; Langoni H, De Sá MEP, Victória C, Da Silva AV

2004. Pheno and genotyping of Staphylococcus aureus, isolated from bovine milk samples

from São Paulo state, Brazil. Can. J. Microbiol. 50, 901-909.

184

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Carmo LS, Dias RS, Linardi VR, Sena MJ, Santos DA, Faria ME, Pena AEC, Jett M,

Heneine LG 2002. Food poisoning due to enterotoxigenic strains os Staphylococcus present

in minas cheese and raw milk in Brazil. Food Microbiol. 14, 9-14.

Cardoso L, Araújo WMC 2003. Parâmetros de qualidade em queijos comercializados no

Distrito Federal no período de 1997-2001. Higiene Alimentar. 17, 32.

Chen TR, Chiou CS, Tsen HY 2004. Use of novel PCR primers specif to the genes of

staphylococcal enterotoxin G, H, I for the survey of Staphylococcus aureus strains isolated

from food-poisoning cases and food samples in Taiwan. Int. J. Food Microbiol. 92, 189-

197.

Cremonesi P, Luzzana M, Brasca M, Morandi S, Lodi R, Vimercati C, Agnellini D,

Caramente G, Moroni P, Castiglioni B 2005. Development of multiplex PCR assay for the

identification of Staphylococcus aureus enterotoxigenic strains isoalated from milk and

dairy products. Mol. Cell. Probes. 19, 299-305.

Ercolini D, Blaiotta G, Fusco V, Coppola S 2004. PCR-based detection of enterotoxin

Staphylococcus aureus in the early stages of raw milk cheese making. J. Appl. Microbiol.

96, 1090-1096.

Gelli DS, Martins MC 1986. Staphylococcus aureus produtor de termonuclease em

alimentos. Rev. Inst. Adolfo Lutz. 46, 103-109.

185

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Hoffmann FL, Silva JV, Vinturim TM 2002. Qualidade microbiológica de queijos tipo

“Minas Frescal”, vendidos em feiras livres na região de São José do Rio Preto, SP. Higiene

Alimentar. 16, 69-76.

Holecková B, Holoda E, Fotta M, Kalinacová V, Gondol J, Grolmus J 2002. Ocurrence of

enterotoxigenic Staphylococcus aureus in food. Ann. Agric. Environ. Med. 9, 179-182.

Huang X, Maddan A 1999. Cap3: a DNA sequence assembly program. Genome Res. 9, 68-

877.

Jablonski LM, Bohach GA 1997. Staphylococcus aureus. In Doyle MP, Beuchat LR,

Montville TJ, Food Microbiology Fundamentals and Frontiers. American Society of

Microbiology Press, Washington. p. 353-375.

Jorgensen HJ, Mork T, Hogasen HR, Rorvik LM 2005. Enterotoxigenic Staphylococcus

aureus in bulk milk in Norway. J. Appl. Microbiol. 99, 158-166.

Loguercio AP, Aleixo JAG 2001. Microbiologia de queijo tipo minas frescal produzido

artesanalemnte. Cienc. Rural. 31, 1063-1067.

Loncarevic S, Jorgensen HJ, Lovseth A, Mathisen T, Rorvik LM 2005. Diversity of

Staphylococcus aureus enterotoxin types within single samples of raw milk and raw milk

products. J. Appl. Microbiol. 98, 344-350.

186

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Maniatis T, Frisch E, Sambrook J 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold

Spring Harbor Laboratory, NY.

Martín MC, Fueyo JM, González-Hevia MA, Mendoza MC 2004. Genetic procedures for

identification of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus from three food

poisoning outbreaks. Int. J. Food Microbiol. 94, 279-286.

Nájera-Sánchez G, Maldonado-Rodríguez R, Olvera PR, Garza LM 2003. Development of

two multiplex polymerase chain reactions for the detection of enterotoxigenic strains of

Staphylococcus aureus isolated from foods. J. Food Prot. 66, 1055-1062.

Normanno G, Firinu A, Virgilio S, Mula G, Dambrosio A, Poggiu A, Decastelli L, Mioni

R, Scuota S, Bolzoni G, Di Giannatale E, Salinetti AP, LaSalandra G, Bartoli M, Zucconi

F, Pirino T, Sias S, Parisi A, Quaglia NC, Celano GV 2005. Coagulase-positive

staphylococci and Staphylococcus aureus in food products marketed in Italy. Int. J. Food

Microbiol. 98, 73-79.

Omoe K, Ishikawa M, Shimoda Y, Hu DL, Ueda S, Shinagawa K 2002. Detection of seg,

seh and sei genes in Staphylococcus aureus isolates and determination of the enterotoxin

productivities of S. aureus isolates harboring seg, seh or sei genes. J. Clin. Microbiol. 40,

857-862.

187

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Omoe K, Hu DL, Omoe HT, Nakane A, Shinagawa K 2005. Comprehensive analysis of

classical and newly described staphylococcal superantigenic toxin genes in Staphylococcus

aureus isolates. FEMS Microbiol. Lett. 246, 191-198.

Pereira ML, Do Carmo LS, Dos Santos EJ, Pereira JL, Bergdoll, MS 1996. Enterotoxin H

in staphylococcal food poisoning. J. Food Prot. 59, 559-561.

Pereira KS, Pereira JL 2005. Estafilococos coagulase negativa: potenciais patógenos em

alimentos. Higiene Alimentar. 19, 32-34.

Peresi JTM, Graciano RAS, Almeida IAZC, Lima SI, Ribeiro AK, Carvalho IS 2001.

Queijo minas tipo frescal artesanal e industrial: qualidade microscópica, microbiológica e

teste de sensibilidade aos agentes antimicrobianos. Higiene Alimentar. 15, 63-70.

Rapini LS, Teixeira JP, Martins NE, Guimarães MPSLMP, Cerqueira MMOP 2003. Perfil

antimicrobiano de cepas de Staphylococcus sp. isoladas do leite cru de cabra, queijo e

manipuladores. Higiene Alimentar. 17, 162.

Rapini LS, Teixeira JP, Martins NE, Cerqueira MM, Souza MR, Penna CFAM. 2004. Perfil

de resistência antimicrobiana de cepas de Staphylococcus sp. isoladas de queijo tipo coalho.

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 56, 130-133.

188

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Ribeiro De Sá MA, Silveira EA, Lagares DPB, Santos SE 2003. Perfil microbiológico do

queijo minas frescal comercializado no município de Uberlância-MG. Higiene Alimentar.

17, 169.

Ritter R, Santos D, Bergmann GP 2001. Análise da qualidade microbiológica de queijo

colonial, não pasteurizado, produzido e comercializado por pequenos produtores, no Rio

Grande do Sul. Higiene Alimentar. 15, 51-55.

Rodrigues LA, Solino L, Diaz M, Bergdoll MS 1993. Selective enterotoxin production in

foods by Staphylococcus aureus strains that produce more tham one enterotoxin. J. Food

Prot. 56, 538-540.

Rosec JP, Gigaud O 2002. Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types

detected by PCR in France. Int. J. Food Microbiol. 77, 61-70.

Santos EC, Nogueira NAP, Cunha GMA 1995. Aspectos microbiológicos do queijo tipo

coalho comercializado em Fortaleza, CE. Boletim CEPPA. 13, 31-36.

Sena MJ, Cerqueira MMOP, Santos DA, Leocradio Filho G, Dias RS 1999. Salmonelas

isoladas de queijos tipo coalho: caracterização sorológica e resistência a agentes

antimicrobianos. Rev. Inst. Adolfo Lutz. 58, 13-17.

189

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Sena MJ 2000. Perfil epidemiológico, resistência a antibióticos e aos conservantes nisina e

sistema lactoperoxidase de Staphylococcus sp. isolados de queijos coalho comercializados

em Recife-PE. 75p Tese de Doutorado. Escola Veterinária: Universidade Federal de Minas

Gerais Belo Horizonte, 2000.

Silva ER, Carmo LS, Silva N 2005. Detection of the enterotoxin A, B, and C genes in

Staphylococcus aureus from goat and bovine mastitis in Brazilian dairy herds. Vet.

Microbiol. 106, 103-107.

Su YC, Wong ACL 1997. Current Perspectives on Detection of Staphylococcal

Enterotoxins. J. Food Prot. 60, 195-202.

Un Lee S, Quesnell M, Fox LK, Won Yoon J, Ho Park Y, Davis WC, Flak D, Deobald CF,

Boahch GA 1998. Characterization of staphylococcal bovine mastitis isolates using the

polymerase chain reaction. J. Food Prot. 61, 1384-1386.

Veras JF, Santos DA, Carmo LS, Fernandes TMG, Azali C, Silva MCC, Martins RT,

Cerqueira MMOP 2003. Levantamento de surtos de toxinfecção alimentar envolvendo leite

e produtos derivados no estado de Minas Gerais, Brasil. Higiene Alimentar. 17, 218.

Vernozy-Rozand C, Mazuy C, Prevost G, Lapeyre C, Bes M, Brun Y, Fleurette J 1996.

Enterotoxin production by coagulase – negative staphylococci isolated from goat’s milk

and cheese. Int. J. Food Microbiol. 30, 271-280.

190

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Witte W 2000. Ecological impact of antibiotic use in animals on different complex

microflora: environment. Int. J. Antimicrobiol. Agents. 14, 321-325.

191

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

6 – CONCLUSÕES GERAIS

A mastite subclínica foi mais prevalente nos rebanhos leiteiros da região Agreste do

Estado de Pernambuco em relação à mastite clínica;

Staphylococcus spp. e Corynebacterium spp. foram os microrganismos mais

prevalentes isolados de amostras de leite de vacas com mastite clínica e subclínica na

região Agreste do Estado de Pernambuco;

Os antibióticos mais eficazes para as cepas de Staphylococcus coagulase positiva

isoladas de amostras de leite de vacas com mastite clínica e subclínica foram vancomicina e

enrofloxacina e o menos eficaz foi a penicilina;

Houve alto índice de multiresistência entre as cepas de Staphylococcus coagulase

positiva isoladas de amostras de leite de vacas com mastite clínica e subclínica na região

Agreste do Estado de Pernambuco;

Foram encontrados dois perfis genotípicos através da técnica de PCR-RFLP entre as

cepas de S. aureus isoladas de casos de mastite bovina subclínica na região Agreste do

Estado de Pernambuco;

A tipagem molecular permitiu compreender o padrão de dispersão dos S. aureus

isolados de casos de mastite bovina;

192

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Um alto percentual de amostras de queijos de coalho, comercializadas no Estado de

Pernambuco, estavam fora dos padrões estabelecidos pela legislação vigente em relação à

contagem de Staphylococcus coagulase positiva.

As cepas de Staphylococcus spp. isoladas de amostras de queijos de coalho

comercializadas no Estado de Pernambuco apresentaram baixo percentual de resistência aos

antibióticos, porém alta multiresistência;

A presença dos genes sec, sed, tst, seg, sei e sej foi detectada em cepas de

Staphylococcus spp. isoladas de amostras de queijos de coalho comercializadas no Estado

de Pernambuco;

193

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

7 – ANEXOS

ANEXO 1

Original Message -----

From: elizabeth oliveira da costa

To: Cristina

Sent: Wednesday, October 26, 2005 4:31 PM

Subject: Re: Ref NAPGAMA: Estudo Epidemiológico Molecular de Staphylococcus

aureus associados à Mastite bovina provenientes do estado de Pernambuco, Brasil.

São Paulo 26 de outubro de 2005

Prezada Dra Tereza Cristina Leal-Balbino

Acusamos o recebimento de seu e-mail e aproveitamos a oportunidade para comunicar que

o referido trabalho já foi submetido à apreciação do corpo editorial da revista Napgama e

recebeu parecer favorável de ambos referees que o analisaram, estando portanto aceito para

a publicação. Esclaremos que por ocasião da publicação será atendida a correção quanto

aos nomes dos autores e inclusão do autor: Isabelle da Silva Luz - Pibic/Fiocruz.

Sem mais reiteramos nosso apreço,

Elizabeth Oliveira da Costa

Editora Científica da Revista Napgama

194

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

ANEXO 2

eterinary Microbiology

Guide for Authors

Types of contribution

1. Original research papers (Regular Papers)

2. Review articles

3. Short Communications

4. Letters to the Editor

5. Book Reviews

Original research papers should report the results of original research. The material should not

have been previously published elsewhere, except in a preliminary form.

Review articles should cover subjects falling within the scope of the journal. Of particular

interest are topical, short (Mini) Reviews in areas of current interest. Instructions for the

preparation of such articles are available from the Reviews Editor J. Glenn Songer

([email protected].edu). Prior to submitting Review papers, authors should discuss the

proposed content with the Reviews Editor.

A Short Communication is a concise but complete description of a limited investigation, which

will not be included in a later paper. Short Communications should be as completely

documented, both by reference to the literature and description of the experimental procedures

employed, as a regular paper. They should not occupy more than 6 printed pages (about 12

manuscript pages, including figures, tables and references).

Letters to the Editor offering comment or useful critique on material published in the journal are

welcomed. The decision to publish submitted letters rests purely with the Editor-in-Chief. It is

hoped that the publication of such letters will permit an exchange of views which will be of

benefit to both the journal and its readers.

Book Reviews will be included in the journal on a range of relevant books which are not more

than 2 years old.

Submission of manuscripts

Submission to Veterinary Microbiology now proceeds online via Elsevier Editorial System -

http://ees.elsevier.com/vetmic. Authors will be guided step-by-step through uploading files

directly from their computers. Authors should select a set of classifications for their papers from

a given list, as well as a category designation (Original Research Paper, Short Communication,

and so on). Electronic PDF proofs will be automatically generated from uploaded files, and used

for subsequent reviewing.

Authors should send queries concerning the submission process or journal procedures to:

AuthorSupport@elsevier.com. Authors can check the status of their manuscript within the

195

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

review procedure using Elsevier Editorial System.

Authors submitting hard copy papers will be asked to resubmit using Elsevier Editorial System.

Submission of an article is understood to imply that the article is original and is not being

considered for publication elsewhere. Submission also implies that all authors have approved the

paper for release and are in agreement with its content. Upon acceptance of the article by the

journal, the author(s) will be asked to transfer the copyright of the article to the Publisher. This

transfer will ensure the widest possible dissemination of information.

Circumstances relating to animal experimentation must meet the International Guiding

Principles for Biomedical Research Involving Animals as issued by the Council for the

International Organizations of Medical Sciences. They are obtainable from: Executive Secretary

C.I.O.M.S., c/o WHO, Via Appia, CH-1211 Geneva 27, Switzerland, or at the following URL:

http://www.cioms.ch/frame_1985_texts_of_guidelines.htm. Unnecessary cruelty in animal

experimentation is not acceptable to the Editors of Veterinary Microbiology.

Any new nucleotide or amino acid sequence data will be deposited in publically accessible

databases, such as GenBank, and the accession numbers will be included in the manuscript

(Methods section) before it is finally accepted for publication. In addition, it is expected that any

plasmids, transposons, viruses, microbial strains, or cell lines described for the first time in the

paper will made available to scientists for non-commercial purposes at reasonable cost following

publication.

Preparation of manuscripts

1. Manuscripts should be written in English. Authors whose native language is not English are

strongly advised to have their manuscripts checked by an English-speaking colleague prior to

submission.

Language Editing: Elsevier's Author Gateway provides details of some companies who can

provide English language and copyediting services to authors who need assistance before they

submit their article or before it is accepted for publication. Authors should contact these services

directly. For more information about language editing services, please email

authorsupport@elsevier.com.

Please note that Elsevier neither endorses nor takes responsibility for any products, goods or

services offered by outside vendors through our services or in any advertising. For more

information please refer to our terms & conditions

http://authors.elsevier.com/terms_and_conditions.html?dc=TANDC.

2. Manuscripts should have (numbered lines)with wide margins and double spacing

throughout, i.e. also for abstracts, footnotes and references. Every page of the manuscript,

including the title page, references, tables, etc. should be numbered. However, in the

text no reference should made to page numbers; if necessary, one may refer to sections. Avoid

excessive usage of italics to emphasize part of the text.

3. Manuscripts in general should be organized in the following order:

Title (should be clear, descriptive and not too long)

Name(s) of author(s)

Complete postal address(es) of affiliations

Full telephone, Fax No. and E-mail of the corresponding author

Present address(es) of author(s) if applicable

Complete correspondence address including e-mail address to which the proofs should be sent

Abstract

196

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Keywords (indexing terms), normally 3 - 6 items. Please refer to the cumulative index.

Introduction

Material studied, area descriptions, methods,techniques

Results

Discussion

Conclusion

Acknowledgements and any additional information concerning research grants, etc.

References

Tables

Figure captions

Tables (separate file(s))

Figures (separate file(s))

4. Titles and subtitles should not be run within the text. They should be typed on a separate

line, without indentation. Use lower-case letter type.

5. SI units should be used.

6. Elsevier reserves the privilege of returning to the author for revision accepted manuscripts

and illustrations which are not in the proper form given in this guide.

Abstracts

Manuscripts of original research papers should include a structured Abstract of 250 or fewer

words, organised under the sections: Problem addressed; Objective; Methods and approach;

Results; Conclusions. Do not actually include section headings, but use this structure for the

Abstract.

Tables

1. Authors should take notice of the limitations set by the size and lay-out of the journal. Large

tables should be avoided. Reversing columns and rows will often reduce the dimensions of a

table.

2. If many data are to be presented, an attempt should be made to divide them over two or

more tables.

3. Tables should be numbered according to their sequence in the text. The text should include

references to all tables.

4. Each table should occupy a separate page of the manuscript. Tables should never be included

in the text.

5. Each table should have a brief and self-explanatory title.

6. Column headings should be brief, but sufficiently explanatory. Standard abbreviations of units

of measurement should be added between parentheses.

7. Vertical lines should not be used to separate columns. Leave some extra space between the

columns instead.

8. Any explanation essential to the understanding of the table should be given as a footnote at

the bottom of the table.

Illustrations

1. All illustrations (line drawings and photographs) should be submitted as separate files,

preferably in TIFF or EPS format.

2. Illustrations should be numbered according to their sequence in the text. References should

be made in the text to each illustration.

3. Illustrations should be designed with the format of the page of the journal in mind.

Illustrations should be of such a size as to allow a reduction of 50%.

4. Lettering should be big enough to allow a reduction of 50% without becoming illegible, any

lettering should he in English. Use the same kind of lettering throughout and follow the style of

the journal.

5. If a scale should given, use bar scales on all illustrations instead of numerical scales that

must be changed with reduction.

6. Each illustration should have a caption. The captions to all illustrations should be typed on a

197

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

separate sheet of the manuscript.

7. Explanations should be given in the figure legend(s). Drawn text in the illustrations should

kept to a minimum.

8. Photographs are only acceptable if they have good contrast and intensity.

9. If you submit usable colour figures, Elsevier would ensure that these figures appeared free-

of-charge in colour in the electronic version of your accepted paper, regardless of whether or not

these illustrations are reproduced in colour in the printed version. Colour illustrations can only

be included in print if the additional cost of reproduction is contributed by the author: you would

receive information regarding the costs from Elsevier after receipt of your accepted article.

Please note that because of technical complications which may arise by converting colour figures

to 'grey scale' (for the printed version, should you not opt for colour in print), you should submit

in addition usable black and white figures corresponding to all colour illustrations.

10. Advice on the preparation of illustrations can be found at the following URL:

http://www.authors.elsevier.com/artwork

Preparation of supplementary data

Elsevier now accepts electronic supplementary material to support and enhance your scientific

research. Supplementary files offer the author additional possibilities to publish supporting

applications, movies, animation sequences, high-resolution images, background datasets, sound

clips and more. Supplementary files supplied will be published online alongside the electronic

version of your article in Elsevier web products, including ScienceDirect:

http://www.sciencedirect.com. In order to ensure that your submitted material is directly

usable, please ensure that data is provided in one of our recommended file formats. Authors

should submit the material together with the article and supply a concise and descriptive caption

for each file. For more detailed instructions please visit the journal's home page and click on the

right-hand side link to the Author Gateway.

References

1. All publications cited in the text should be presented in a list of references following the text

of the manuscript. The manuscript should be carefully checked ensure that the spelling of

author's names and dates are exactly the same in the text as in the reference list. For original

research papers, the list should not exceed 35 references (it may be longer for review articles).

2. In the text refer to the author's name (without initial) and year of publication, followed- if

necessary - by a short reference to appropriate pages. Examples: "Since Peterson (1988) has

shown that..." "This is inagreement with results obtained later (Kramer, 1989, pp.12-16)".

3. If reference is made in the text to a publication written by more than two authors the name

of the first author should be used followed by "et al.". This indication, however, should never be

used in the list of references. In this list names of first author and co-authors should be

mentioned.

4. References cited together in the text should be arranged chronologically. The list of

references should be arranged alphabetically on authors' names, and chronologically per author.

If an author's name in the list is also mentioned with co-authors the following order should be

used: publications of the single author, arranged according to publication dates -publications of

the same author with one co-author - publications of the author with more than one co-author.

Publications by the same author(s) in the same year should he listed as 1974a, 1974b, etc.

5. Use the following system for arranging your references:

a. For periodicals

Chin, J.C., Dai, Y., Watts, J.E., 1995. Antibody response against Pseudomonas aeruginosa

membrane proteins in experimentally infected sheep. Vet. Microbiol. 43, 21-32.

b. For edited symposia, special issues, etc. published in a periodical

Caffrey, J.P., 1994. Status of bovine tuberculosis eradication programmes in Europe. In: Wood,

P.R., Monaghan, M.L., Rothel, J.S. (Eds.), Bovine Tuberculosis. Vet. Microbiol. 40, 1-4.

c. For books

Armitage, P., Berry, G., 1987. Statistical Methods in Medical Research. Blackwell Scientific

Publications, Oxford, pp. 94-100, 411-416.

198

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

d. For multi-author books

Butler, J.E., 1981. A concept of humoral immunity among ruminants and an approach to its

investigation. In: Butler, J.E., Nielson, K., Duncan, J.R. (Eds.), The Ruminant Immune System,

Plenum Press, New York, pp. 3-55.

6. Abbreviate the titles of periodicals mentioned in the list of references; according to the

International List of Periodical Title Word Abbreviations. The correct abbreviation for this journal

is Vet. Microbiol.

7. In the case of publications in any language other than English, the original title is to be

retained. However, the titles of publications in non-Latin alphabets should be transliterated, and

a notation such as "(in Russian)" or "(in Greek, with English abstract)" should he added.

8. Work accepted forpublication but not yet published should be referred to as "in press".

9. References concerning unpublished data and "personal communications" should not be cited

in the reference list but may be mentioned in the text.

10. Web references may be given. As a minimum, the full URL is necessary. Any further

information, such as Author names, dates, reference to a source publication and so on, should

also be given.

11. Articles available online but without volume and page numbers may be referred to by means

of their Digital Object identifier (DOI) code.

Formulae

1. Give the meaning of all symbols immediately after the equation in which they are first used.

2. For simple fractions use the solidus (/) instead of a horizontal line.

3. Equations should be numbered serially at the right-hand side in parentheses. In general only

equations explicitly referred to in the text need be numbered.

4. The use of fractional powers instead of root signs is recommended. Powers of e are often

more conveniently denoted by exp.

5. In chemical formulae, valence of ions should be given as, e.g. Ca

, not as Ca

6. Isotope numbers should precede the symbols, e.g.

7. The repeated writing of chemical formulae in the text is to be avoided where reasonably

possible; instead, the name of the compound should be given in full. Exceptions may be made in

the case of a very long name occurring very frequently or in the case of a compound being

described as the end product of a gravimetric determination (e.g. phosphate as P

Footnotes

1. Footnotes should only be used if absolutely essential. In most cases it should be possible to

incorporate the information in normal text.

2. If used, they should be numbered in the text, indicated by superscript numbers, and kept as

short as possible.

Nomenclature

1. Authors and editors are, by general agreement, obliged to accept the rules governing

biological nomenclature, as laid down in the International Code of Botanical Nomenclature, the

International Code of Nomenclature of Bacteria, and the International Code of Zoological

Nomenclature. Virologists should consult the latest Report of the International Committee on

Taxonomy of Viruses for proper nomenclature and spelling.

2. All biotica (crops, plants, insects, birds, mammals, etc.) should be identified by their scientific

names when the English term is first used, with the exception of common domestic animals.

3. All biocides and other organic compounds must be identified by their Geneva names when

first used in the text. Active ingredients of all formulations should be likewise identified.

4. For chemical nomenclature, the conventions of the International Union of Pure and Applied

Chemistry and the official recommendations of the IUPAC-IUB Combined Commission on

Biochemical Nomenclature should be followed.

199

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

If excerpts from other copyrighted works are included, the Author(s) must obtain written

permission from the copyright owners and credit the source(s) in the article. Elsevier has

preprinted forms for use by Authors in these cases: contact Elsevier's Rights Department,

Philadelphia, PA, USA: phone (+1) 215 239 3804, fax (+1) 215 239 3805, e-mail

[email protected]. Requests may also be completed online via the Elsevier

homepage

http://www.elsevier.com/locate/permissions.

Material in unpublished letters and manuscripts is also protected and must not be published

unless permission has been obtained.

Authors Rights

As an author you (or your employer or institution) may do the following:

• make copies (print or electronic) of the article for your own personal use, including for

your own classroom teaching use

• make copies and distribute such copies (including through e-mail) of the article to

research colleagues, for the personal use by such colleagues (but not commercially or

systematically, e.g., via an e-mail list or list server)

• post a pre-print version of the article on Internet websites including electronic pre-print

servers, and to retain indefinitely such version on such servers or sites

• post a revised personal version of the final text of the article (to reflect changes made in

the peer review and editing process) on your personal or institutional website or server,

with a link to the journal homepage (on elsevier.com)

• present the article at a meeting or conference and to distribute copies of the article to

the delegates attending such a meeting

• for your employer, if the article is a 'work for hire', made within the scope of your

employment, your employer may use all or part of the information in the article for other

intra-company use (e.g., training)

• retain patent and trademark rights and rights to any processes or procedure described in

the article

• include the article in full or in part in a thesis or dissertation (provided that this is not to

be published commercially)

• use the article or any part thereof in a printed compilation of your works, such as

collected writings or lecture notes (subsequent to publication of your article in the

journal)

• prepare other derivative works, to extend the article into book-length form, or to

otherwise re-use portions or excerpts in other works, with full acknowledgement of its

original publication in the journal

US National Institutes of Health (NIH) voluntary posting (" Public Access") policy.

Elsevier facilitates author response to the NIH voluntary posting request (referred to as the NIH

"Public Access Policy"; see

http://www.nih.gov/about/publicaccess/index.htm) by posting the

peer-reviewed author's manuscript directly to PubMed Central on request from the author, 12

months after formal publication. Upon notification from Elsevier of acceptance, we will ask you

to confirm via e-mail (by e-mailing us at

NIHauthorrequest@elsevier.com) that your work has

received NIH funding and that you intend to respond to the NIH policy request, along with your

NIH award number to facilitate processing. Upon such confirmation, Elsevier will submit to

PubMed Central on your behalf a version of your manuscript that will include peer-review

comments, for posting 12 months after formal publication. This will ensure that you will have

responded fully to the NIH request policy. There will be no need for you to post your manuscript

directly with PubMed Central, and any such posting is prohibited.

200

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Proofs

One set of proofs will be sent by e-mail to the corresponding author as given on the title page of

the manuscript. Only typesetter's errors may be corrected; changes in, or additions to, the

edited manuscript will be allowed.

Elsevier will do everything possible to get your article corrected and published as quickly and

accurately as possible. Therefore, it is important to ensure that all of your corrections

are sent back to us in one communication. Subsequent corrections will not be possible, so

please ensure your first sending is complete.

Offprints

1. Twenty-five offprints will he supplied free of charge (100 for Review Articles).

2. Additional offprints can be ordered on an offprint order form, which is included with the

proofs.

3. UNESCO coupons are acceptable in payment of extra offprints.

Author Services

Questions arising after acceptance of the manuscript, especially those relating to proofs, should

be directed to Elsevier Ireland, Elsevier House, Brookvale Plaza, East Park, Shannon, Co. Clare,

Ireland, Tel.: (+353) 61 709600, Fax: (+353) 61 709111/113.

Authors can also keep a track of the progress of their accepted article, and set up e-mail alerts

informing them of changes to their manuscript's status, by using the "Track a Paper" feature of

Elsevier's Author Gateway. For privacy, information on each article is password-protected. The

author should key in the "Our Reference" code (which is in the letter of acknowledgement sent

by the Publisher on receipt of the accepted article) and the name of the corresponding author.

eterinary Microbiology has no page charges

201

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

ANEXO 3

INSTRUÇÕES AOS AUTORES

• Objetivos e política editorial

•

Formato e estilo

•

Checklist para os manuscritos

Objetivos e política editorial

As Memórias do Instituto Oswaldo Cruz são uma revista

multidisciplinar que publica pesquisas originais relativas aos

campos da medicina tropical (incluindo patologia,

epidemiologia de campo e estudos clínicos), parasitologia

médica e veterinária (protozoologia, helmintologia,

entomologia e malacologia) e microbiologia médica (virologia,

bacteriologia e micologia). A revista aceita, especialmente,

pesquisas básicas e aplicadas em bioquímica, imunologia,

biologia molecular e celular, fisiologia, farmacologia e genética

relacionada a essas áreas. Comunicações breves são também

consideradas. Artigos de revisão só quando solicitados.

Ocasionalmente, trabalhos apresentados em simpósios ou

congressos são aparecem como suplementos.

Os artigos apresentados devem ser escritos preferencialmente

em inglês. Quando neste idioma, devem ser checados por

alguém que tenha o inglês como primeira língua e que,

preferencialmente, seja um cientista da área.

A submissão de um manuscrito às Memórias requer que este

não tenha sido publicado anteriormente (exceto na forma de

resumo) e que não esteja sendo considerado para publicação

por outra revista. A veracidade das informações e das citações

bibliográficas é de responsabilidade exclusiva dos autores.

Os manuscritos serão analisados por pelo menos dois

pareceristas; a aprovação dos trabalhos será baseada no

conteúdo científico e na apresentação.

Todo o material deve ser enviado para a Produção Editorial,

Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Av. Brasil 4365,

Pavilhão Mourisco, sala 308, 21045-900 Rio de Janeiro, RJ,

202

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Brasil.

Os manuscritos que não estiverem de acordo com estas

instruções serão imediatamente devolvidos.

Ao encaminhar um manuscrito para a revista, os autores devem

estar cientes de que, se aprovado para publicação, o copyright

do artigo, incluindo os direitos de reprodução em todas as

mídias e formatos, deverá ser concedido exclusivamente para

as Memórias. A revista não recusará as solicitações legítimas

dos autores para reproduzir seus trabalhos.

Favor providenciar e checar cada item abaixo antes de

submeter seu manuscrito para as Memórias do Instituto

Oswaldo Cruz:

• Carta de submissão do trabalho, assinada por todos os

autores, especificando o autor de contato, bem como endereço,

telefone, fax e e-mail.

• Quatro cópias completas do artigo, incluindo as ilustrações e

um disquete contendo o texto, tabelas, gráficos e fotografias

digitalizadas.

• O manuscrito (incluindo tabelas e referências) deve ser

preparado em um software para edição de textos, em espaço

duplo, fonte 12, impresso em papel padrão e paginado. As

margens devem ser de pelo menos 3 cm.

• A seqüência do artigo deve ser: título resumido (com até 40

caracteres - letras e espaços), título (com até 250 caracteres),

autores (sem títulos ou graduação), afiliação institucional

(endereço completo somente do autor correspondente),

resumo, palavras-chave, notas de rodapé indicando a fonte

de financiamento ou mudanças de endereço, introdução,

material e métodos, resultados, discussão, agradecimentos

(os mínimos necessários), referências, tabelas (fora do texto e

com título), e figuras (com legendas em folha separada).

• Só as referências citadas no texto devem aparecer nas lista e

devem seguir o estilo do Index Medicus. Se a referência for de

artigo ainda não publicado, mas já aceito, deverá ser

apresentada carta da revista que publicará o manuscrito ou de

outros autores autorizando a referida citação.

Para maiores informações sobre o formato e o estilo da revista,

favor consultar um número recente da Revista ou entrar em

contato com a Editoria Científica pelo telefone (+55-21-

2598.4335), fax (+55-21-2561.1442 / 2280-5048), ou e-mail

([email protected] / m[email protected])

203

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Formato e estilo

O manuscrito deve ser organizado de acordo com a seguinte

ordem: título corrente, título, nomes dos autores, afiliações

institucionais, resumo, palavras-chave, introdução,

materiais e métodos, resultados, discussão, agradecimentos

e referências. Patrocínios devem ser mencionados em nota

de rodapé na primeira página.

Resumo: Com até 200 palavras (100 palavras no caso de

comunicações breves), o resumo deve apresentar os objetivos

do estudo ou pesquisa, seus procedimentos básicos (seleção dos

temas de estudo ou animais de laboratório; métodos analíticos

ou de observação), as principais descobertas ou resultados

(oferecendo dados específicos e seu significado estatístico, se

possível), e as principais conclusões. Deve enfatizar novos e

importantes aspectos do estudo ou observações.

Palavras-chave: Devem ser fornecidos de 3 a 6 termos, de

acordo com a lista Medical Subject Headings (Mesh) do Index

Medicus.

Introdução: Deve determinar o propósito do estudo, oferecer

um breve resumo (e não uma revisão de literatura) dos

trabalhos anteriores relevantes, e especificar quais novos

avanços foram alcançados através da pesquisa. A introdução

não deve incluir dados ou conclusões do trabalho em

referência.

Materiais e métodos: Deve oferecer, de forma breve e clara,

informações suficientes para permitir que o estudo seja repetido

por outros pesquisadores. Técnicas padronizadas bastam ser

referenciadas.

Ética: Ao descrever experimentos relacionados a temas

humanos, indicar se os procedimentos seguidos estiveram de

acordo com os padrões éticos do comitê responsável por

experimentos humanos (institucional ou regional) e de acordo

com a Declaração de Helsinki de 1975, revisada em 1983. Não

citar os nomes ou iniciais dos pacientes ou registros de

hospitais, especialmente nos materiais ilustrativos. Ao relatar

experimentos em animais, indicar se diretrizes de conselhos de

pesquisa institucionais ou nacionais, ou qualquer lei nacional

relativa aos cuidados e ao uso de animais de laboratório foram

seguidas.

Resultados: Devem oferecer uma descrição concisa das novas

204

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

informações descobertas, com o mínimo julgamento pessoal.

Não repetir no texto todos os dados contidos em tabelas e

ilustrações.

Discussão: Deve limitar-se ao significado de novas

informações e relacionar as novas descobertas ao conhecimento

existente. Somente as citações indispensáveis devem ser

incluídas.

Agradecimentos: Devem ser breves e concisos e se restringir

ao absolutamente necessário.

Referências: Devem ser precisas. Somente as citações que

aparecem no texto devem ser referenciadas. Trabalhos não

publicados, a não ser os já aceitos para publicação, não devem

ser citados. Trabalhos aceitos para publicação devem ser

citados como "in press"; nesse caso, uma carta de aceitação da

revista deverá ser fornecida. Dados não publicados devem ser

citados somente no texto como "unpublished observations";

nesse caso, uma carta com a permissão do autor deve ser

fornecida. As referências ao final do manuscrito devem ser

organizadas em ordem alfabética de acordo com o sobrenome

do primeiro autor.

Os títulos de revistas devem ser abreviados de acordo com o

estilo usado no Index Medicus. Consultar a List of Journals

Indexed no Index Medicus publicada no número de janeiro do

Index Medicus ou no website

http://www.nlm.nih.gov/serials/lii.html.

- No texto, usar o sobrenome dos autores e a data:

Lutz (1910) ou (Lutz 1910).

Com dois autores, a forma é

(Lutz & Neiva 1912) ou Lutz and Neiva (1912).

Quando há mais que dois autores, somente o primeiro é

mencionado:

Lutz et al. (1910) ou (Lutz et al. 1910).

- No final do trabalho, usar os seguintes estilos:

205

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

Artigo de revista

Chagas C, Villela E 1922. Forma cardíaca da tripanosomiase

americana. Mem Inst Oswaldo Cruz 14: 15-61.

Livro ou Tese

Morel CM 1983. Genes and Antigens of Parasites. A

Laboratory Manual, 2nd ed., Fundação Oswaldo Cruz, Rio de

Janeiro, xxii + 580 pp.

Capítulo de livro

Cruz OG 1911. The prophylaxis of malaria in central and

southern Brasil. In R Ross, The Prevention of Malaria, John

Murray, London. p. 390-398.

Ilustrações: As ilustrações devem ser limitadas ao mínimo

necessário para exemplificar estruturas ou condições

particulares, para sintetizar dados ou para registrar resultados

quantitativos. Detalhes de resultados apresentados nessa forma

não devem ser repetidos no texto. Figuras e tabelas devem ser

compreensíveis sem a necessidade de referência ao texto.

- Figuras devem ser apresentadas em uma folha de mesmo

tamanho que as do manuscrito. As fotografias devem ser bem

nítidas, com alto contraste, ampliadas em preto e branco em

papel brilhante. As fotografias e os desenhos devem ser

marcados no verso com o nome do autor, o número da figura e

uma seta indicando a parte de cima da ilustração. Se

apresentadas lâminas, as figuras devem ser numeradas

consecutivamente em algarismos arábicos. As escalas devem

ser indicadas por uma linha ou barra na figura, e referenciadas,

se necessário, na legenda (por exemplo, bar = 1 mm etc.).

Lâminas e gráficos devem ajustar-se tanto em uma coluna (7

cm) ou na largura completa (14.5 cm) da página, e devem ser

menores que a página para permitir a inclusão da legenda. As

legendas devem ser encaminhadas em uma folha separada. As

letras e números nas figuras devem ter tamanho legível após a

redução ou a impressão. Ilustrações coloridas somente podem

ser aceitas se os autores assumirem os custos. Por outro lado,

uma fotografia colorida ilustra a capa de cada fascículo de

Memórias, e os autores são convidados a submeter para

consideração da revista ilustrações com legendas de seus

manuscritos que poderão vir a ilustrar a capa sem custos para

206

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

os autores.

- Tabelas devem complementar, e não duplicar, o texto. Elas

devem ser numeradas em algarismos romanos. Um título breve

e descritivo deve constar no alto de cada tabela, com quaisquer

explicações ou notas de rodapé (identificadas com letras a, b, c

etc.) colocadas abaixo.

Comunicações breves devem ser breves e diretas. Seu objetivo

é comunicar com rapidez resultados ou técnicas particulares.

As comunicações não devem ocupar mais do que quatro

páginas impressas, incluindo figuras e/ou tabelas. Não devem

conter referências em excesso. As referências devem ser

citadas no final do texto, usando o mesmo formato para artigos

originais. Um resumo breve e três palavras-chave devem ser

apresentados.

Formato alternativo: Os manuscritos podem ser submetidos

seguindo os "Uniform Requirements for Manuscripts

Submitted to Biomedical Journals" produzidos pelo

International Committee of Medial Journal Editors, também

conhecidos como Vancouver Style. Nesse caso, os autores

devem seguir as diretrizes da quinta edição (Annals of Internal

Medicine 1997; 126: 36-47, ou no website

http://www.acponline.org/journals/resource/unifreqr/htm),

sendo responsáveis por modificar o manuscrito onde diferir das

instruções aqui apresentadas, se o manuscrito for aceito para

publicação. Os autores também deverão seguir os Uniform

Requirements para quaisquer outras diretrizes omitidas nestas

instruções.

Uma vez que um trabalho seja aceito para publicação, os

autores devem enviar:

- um disquete contendo o texto completo da versão final

aprovada do manuscrito (incluindo tabelas e gráficos),

processado em um editor de texto como Word ou Word Perfect

para Windows (formato Macintosh deverá ser convertido);

- uma declaração assinada por todos os autores afirmando que:

(i) todos os dados contidos no trabalho são precisos;

(ii) todos os autores participaram do trabalho de forma

substancial e estão preparados para assumir responsabilidade

pública pelo seu conteúdo;

(iii) o manuscrito ora apresentado a essa revista não está sendo

207

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

publicado no todo ou em parte por outra revista, assim como

não está sendo encaminhado para outra publicação. Autores de

diferentes países ou instituições podem assinar em diferentes

folhas que contenham a mesma declaração;

- uma declaração de copyright fornecida pela produção

editorial da revista, assinada pelo autor responsável pela

correspondência.

Taxas: A revista não cobra taxas para publicação.

Provas: Serão enviadas provas tipográficas aos autores para a

correção de erros de impressão. As provas devem retornar para

a Produção Editorial na data estipulada. Outras mudanças no

manuscrito original não serão aceitas nesta fase.

Separatas: Os autores receberão 30 separatas gratuitamente.

Junto, um formulário de pedidos e uma lista de preços serão

enviados aos autores, permitindo que novas separatas sejam

solicitadas.

Checklist para os manuscritos

Os autores devem verificar cada um dos itens abaixo antes

de enviar seus manuscritos a Memórias do Instituto

Oswaldo Cruz.

• Incluir uma carta de apresentação assinada por

todos os autores, junto com o manuscrito,

especificando o nome do autor que será responsável

pela correspondência, assim como endereço,

números de telefone e fax, e e-mail.

• Enviar quatro cópias do manuscrito (original mais

três cópias), cada uma acompanhada de um jogo

completo de ilustrações.

• Todo o manuscrito (incluindo tabelas e referências)

deve ser digitado em espaço duplo, usando fonte

tamanho 12, e impresso em folhas de papel de

tamanho padrão. Margens esquerdas e direitas

devem ser de pelo menos 3 cm.

• As páginas devem ser numeradas a partir da página

de rosto.

• A página de rosto deve incluir um cabeçalho com no

máximo 40 letras e espaços, um título de no máximo

três linhas impressas (250 letras e espaços), nomes

dos autores (não citar títulos ou graus), afiliações

institucionais, endereço completo do autor

208

Freitas, M. F. L. Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

responsável pela correspondência, e notas de rodapé

indicando as fontes de recursos financeiros e

mudanças de endereço.

• A ordem de apresentação do material em todos os

manuscritos deve ser a seguinte: cabeçalho, título,

autores, afiliações institucionais, resumo, palavras-

chave, notas de rodapé, introdução, materiais e

métodos, resultados, discussão, agradecimentos,

referências, tabelas, legendas para as figuras, e

figuras.

• As referências devem ser citadas no texto entre

parênteses, por exemplo, (Chagas 1909). As

referências não citadas no texto não podem aparecer

na seção de referências. As referências bibliográficas

devem seguir o formato estabelecido pelo "Index

Medicus and Biological Abstract" (veja exemplos em

Formato e estilo).

• Se um trabalho não publicado de autoria de um dos

autores do manuscrito for citado (ou seja, um artigo

"in press"), será necessário incluir a carta de

aceitação da revista que publicará o referido artigo.

• Se dados não publicados pertencentes a outros

pesquisadores forem citados pelo manuscrito, será

necessário incluir uma carta de autorização dos

respectivos autores dos referidos dados.

• Incluir quatro impressões de cada figura em papel

fotográfico ou produzidas por laser. Identificar todas

as figuras com o nome do primeiro autor e o número

da figura (por meio de uma etiqueta auto-adesiva

datilografada e colada no verso da figura). Incluir

uma legenda para cada figura. As legendas devem

ser apresentadas em folha separada no final do

manuscrito.

• As tabelas também devem ser apresentadas em

folhas separadas no final do manuscrito. Um título

breve e descritivo deve encabeçar cada tabela.

Para outras informações, consultar as Instruções aos Autores

publicadas no primeiro número de cada volume da revista.

[Home] [Sobre a revista] [Corpo editorial] [Assinaturas]

Av. Brasil, 4365

21040-900 Rio de Janeiro RJ Brazil

Tel.: +55 21 2598-4335

Fax: +55 21 2280-5048 / 2561-1442

209

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 