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ANA PAULA DE SANTI RAMPAZZO
ANÁLISE CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DAS
SUBFAMÍLIAS CHEIRODONTINAE E
APHYOCHARACINAE (TELEOSTEI,
CHARACIDAE).
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado em Ciências Biológicas – Área
de concentração Biologia Celular, da
Universidade Estadual de Maringá para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Biológicas.
MARINGÁ – PARANÁ
2006
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ANA PAULA DE SANTI RAMPAZZO
ANÁLISE CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DAS
SUBFAMÍLIAS CHEIRODONTINAE E
APHYOCHARACINAE (TELEOSTEI,
CHARACIDAE).
ORIENTADORA: Dr
a
Isabel Cristina
Martins dos Santos.
MARINGÁ – PARANÁ
2006
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“Uma das principais razões do êxito na
vida é a habilidade de manter um interesse
diário pelo trabalho que se faz, de ter um
entusiasmo crônico de considerar cada dia
especialmente importante”.
(W.L. Phelps)
Dedico este trabalho…
Aos meus pais Pedrino e Rosalina
Ao meu irmão João Paulo
Ao meu marido Reinaldo
À minha tia Ina (in memorian).
Agradecimentos
Ao Departamento de Biologia Celular e Genética da Universidade Estadual de
Maringá, por fornecer as condições necessárias à elaboração desta dissertação.
Ao NUPELIA, em particular ao Prof
o
Dr. Horácio Ferreira Júlio Júnior, pelo
auxílio na coleta dos espécimes analisados.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos.
À Prof
a
Dr
a
Isabel Cristina Martins dos Santos pela orientação, conhecimentos
transmitidos, apoio na pesquisa científica e dedicação na realização deste trabalho.
Agradeço especialmente pela amizade, pela paciência e por confiar na minha
capacidade durante estes sete anos.
À Prof
a
Dr
a
Ana Luiza de Brito Portela Castro, pelos conhecimentos
transmitidos, pelo incentivo e pela amizade.
À Prof
a
Dr
a
Claudete Aparecida Mangolin por toda a atenção e por estar sempre
disposta a compartilhar seus valiosos conhecimentos. Á doutoranda Adriana pela
disposição em me atender sempre que solicitei.
Às colegas Luciana Ramos Sato e Patrícia Belini Nishiyama pelo auxílio na
realização do trabalho.
Aos amigos do laboratório de Citogenética de Peixes - Luciana, Sônia
Mizogushi, Sônia Carvalho, Marli, Edner, Gisele, Kátia, Alaim, Letícia, Thiago,
Leonardo e, em especial ao Alexandre, à Fernanda, ao Cleverson e ao Paulo Emílio, que
me ajudaram muito durante o mestrado.
Aos professores do curso de pós-graduação em Biologia Celular pela
contribuição em minha formação profissional.
À Maria José, a auxiliar mais competente, humana e mãe que este laboratório
podia ter. Obrigado por você irradiar esta energia que fez os meus dias bem melhores.
Aos amigos do coração - Suzana, Leandro, Adriana Sinópolis, Luiz Cristiano e
Valéria, pela verdadeira amizade e por todos os momentos de companheirismo.
À Rosana e Márcia, pela infinita amizade que resiste ao tempo e á distância.
Aos meus pais Pedrino e Rosalina, que me concederam a vida e fizeram dela um
aprendizado constante, lutando ao meu lado em busca da realização deste sonho. O
grande mérito é de vocês!!!
Ao meu irmão João Paulo, que sempre torceu por mim.
Ao maridão Reinaldo, pelo incentivo, por ser o meu porto seguro e compartilhar
comigo os momentos mais felizes da minha vida.
À minha tia Ina ( Pedra Constantino Santi), que sempre me deu o apoio que uma
mãe dá para uma filha, me incentivando, torcendo e rezando por mim em cada etapa da
minha vida. Tenho certeza que de onde estiver, está muito orgulhosa e feliz por mais
essa conquista. Valeu Tia!!!!
Á DEUS, principal força que move cada passo que dou, fonte inesgotável de
inspiração e sabedoria. Obrigado pela vida e por ter me dado o dom de saber como
conduzi-la.
APRESENTAÇÃO
Esta dissertação é composta por três artigos, os quais foram concluídos a partir
da análise citogenética de espécies pertencentes à subfamília Cheirodontinae
(Serrapinnus notomelas e Serrapinnus sp.1) e Aphyocharacinae (Aphyocharax anisitsi).
Os espécimes foram coletados em diferentes localidades na bacia do rio Tietê (rio
Pântano, rio Araquá e Córrego Cascatinha) e no rio Paraná (região do município de
Porto Rico). Cada artigo está diagramado de acordo com as normas da revista a qual
será submetido para publicação.
1 - Análise Citogenética e Descrição de Sistema de Determinação Sexual ZZ/ZW
em espécies do Gênero Serrapinnus (Characidae, Cheirodontinae). Revista
Genetica.
2 - Polimorfismo Intrapopulacional das Regiões Organizadoras de Nucléolo em
Serrapinnus notomelas (Characidae, Cheirodontinae) do rio Paraná, detectado por
impregnação pela prata, Banda C e Hibridação Fluorescente in situ. Revista
Chromosome Research.
3 - Estudos Citogenéticos em Aphyocharax anisitsi (Characidae, Aphyocharacinae)
de ocorrência no rio Paraná – SHORT COMMUNICATION. Revista Genetics and
Molecular Biology.
ANÁLISE CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DAS
SUBFAMÍLIAS CHEIRODONTINAE E
APHYOCHARACINAE (TELEOSTEI, CHARACIDAE).
Resumo
No presente trabalho foram analisadas três espécies de peixes: duas
pertencentes à subfamília Cheirodontinae (Serrapinnus notomelas e Serrapinnus sp.1) e
uma pertencente à subfamília Aphyocharacinae (Aphyocharax anisitsi), coletados nas
bacias do rio Paraná e Tietê. Quatro populações de S. notomelas foram estudadas,
provenientes dos rios Araquá e Pântano, Córrego Cascatinha e rio Paraná. Esta última
também foi a localidade de coleta das demais espécies. A análise dos resultados
mostrou, para os representantes do gênero Serrapinnus, um número diplóide igual a 52
cromossomos para todas as populações analisadas, contudo, diferenças interespecíficas
na fórmula cariotípica foram observadas. S. notomelas apresentou
16M+22SM+10ST+4A, com NF=100 para os machos e 16M+23SM+10ST+3A, com
NF=101 para as fêmeas. Serrapinus sp.1 apresentou 8M+16SM+4ST+24A, com NF=80
para machos e 8M+15SM+4ST+25A, com NF=79 para fêmeas. A diferença de NF entre
os sexos é devido à presença de um par heteromórfico (submetacêntrico/acrocêntrico)
nas fêmeas das duas espécies, caracterizando um mecanismo de determinação sexual
cromossômica do tipo ZZ/ZW. Este sistema de cromossomos sexuais heteromórficos
mostrou-se diferente em relação aos tipos de cromossomo W nas duas espécies;
enquanto em S. notomelas o W é um cromossomo submetacêntrico em Serrapinnus
sp.1 ele é um acrocêntrico. A técnica de banda C demonstrou um padrão de
heterocromatina pericentromérica com NOR banda C positiva em todas as populações
de S. notomelas estudadas. Além disso, foi observada a presença de um par de
cromossomos submetacêntricos, com banda C intersticial no braço longo, não
relacionado à NOR.
Em relação às NORs, diferenças intraespecíficas também foram encontradas.
Enquanto um sistema AgNOR simples (par 26) foi detectado para três das quatro
populações estudadas de S. notomelas, para Serrapinnus sp.1 dois pares cromossômicos
estiveram envolvidos com esta região. A população do rio Paraná apresentou
variabilidade intrapopulacional com seis padrões distintos de NOR em nove indivíduos
analisados, o que nos leva a propor que estes sítios podem corresponder a transposição
de cópias dos cístrons de rDNA, fixos no par 26 (NOR preferencial), para diferentes
locais no genoma. Isto pode ser corroborado pelo fato das outras populações
apresentarem AgNOR simples no par 26. Embora consideremos que o mecanismo de
transposição por elementos móveis, seja o mais provável, não podemos descartar a
hipótese da ocorrência de outros tipos de rearranjos, tais como translocações,
duplicações, amplificações, dentre outros. Além disso, pôde-se observar a coincidência
de variação de banda C com os diferentes tipos de padrões estabelecidos. Possivelmente
a heterocromatina presente no par 26, flanqueando o genes rDNA, acompanhe estes
genes por qualquer que seja o mecanismo envolvido nesta variabilidade.
A. anisitsi apresentou 2n=50, com fórmula cariotípica consistindo de
4M+4SM+42A e NOR simples que foi detectada pela prata, FISH e CMA
3
. Apesar dos
escassos estudos realizados
dentro desta subfamília pode-se verificar que o número
diplóide é conservativo neste gênero, contudo diferenças interespecíficas podem ser
observadas, principalmente em relação às regiões organizadoras de nucléolo. Nas
análises realizadas até o momento, somente a espécie estudada no presente trabalho
apresentou NOR simples, indicando diferenças na evolução cariotípica das mesmas. A
banda C apresenta blocos pericentroméricos e teloméricos na maioria dos cromossomos,
inclusive nas regiões de NOR.
Os dados apresentados neste estudo apresentam mais um suporte à sistemática
destas subfamílias e reforçam a necessidade de ampliação dos conhecimentos acerca da
citogenética deste grupo, que funciona não só como uma ferramenta para os
taxonomistas, mas também como auxílio no esclarecimento de possíveis mecanismos
genéticos que possam estar ocorrendo durante a especiação.
Abstract
In the present work three fish species were analyzed: two belong to the Cheirodontinae
subfamily (Serrapinnus notomelas and Serrapinnus sp.1) and one to Aphyocharacinae
subfamily (Aphyocharax anisitsi), collected from basins of the Paraná river and Tietê
river. Four S. notomelas populations from the Araquá and Pântano rivers, Cascatinha
Stream and Paraná river, were studied. In this last also were the others species. The
analysis of the results showed a diploid number the 52 chromosomes for all the
analyzed populations in the Serrapinnus genus, however, interespecific differences in
the karyotypic formulae, were observed. S. notomelas showed 16M+22SM+10ST+4A,
with NF=100 for males and 16M+23SM+10ST+3A, with NF=101 for females.
Serrapinnus sp.1 showed 8M+16SM+4ST+24A, with NF=80 for males and
8M+15SM+4ST+25A, with NF=79 for females. The difference in the NF among the
sexes is due to presence of one heteromorphic pair (submetacentric/acrocentric) in the
females of the two species, characterizing a sexual chromosomal mechanism of the type
ZZ/ZW. This sexual heteromorphic chromosomes system showed to be different in
relation to the type of W chromosomes in the two species, while that in S. notomelas the
W is a submetacentric chromosomes in the Serrapinnus sp.1 is acrocentric. The C band
technique demonstrated a pericentromeric heterocromatin pattern with NOR region
positive C band in all the S. notomelas populations studied. Moreover, the presence of
interstitial C band in long arm of a submetacentric chromosomes pair, was observed. In
relation to the NORs, intraespecific differences also were found. While the system
simple AgNOR (pair 26) was detected for three of four S. notomelas populations
studied, to Serrapinnus sp.1 two chromosomal pairs were involved with this region.
The population from Paraná river showed intrapopulational variability and six diferent
NOR patterns were distinguished among 9 specimens. This can correspond the copies
transposition of rDNA citrons, fixed in the 26 pair (preferential NOR), for different
locality in the genome. This is corroborated by the fact of other populations showed
simple AgNOR, in the 26 pair. Although the mechanism of transposition by mobile
elements, are most probabily we not discard the hypothesis of occurrence of other
rearrangements types such as translocations, duplications, amplifications, amongst
others. Moreover, C band variation coincidence with patterns types different was
observed. Probability the heterocromatin that flank the rDNA genes of the 26 pair,
follow these genes independently of the mechanism involved in this variability.
A. anisitsi showed 2n=50, with karyotypic formulae consisting of
4M+4SM+42A and simple NOR detected by the silver, FISH and CMA
3
. Despite the
scarce studies carried in this subfamily was verified that the diploid number this genus
is conservative. However interespecific differences were observed in relation nucleolus
organizers regions. In the analyses carried until moment, only the species studied in
present work presented simple NOR, indicating differences in karyotype evolution this
species. C-Band showed pericentromeric and telomeric blocks in the majority of the
chromosomes and in the NOR regions.
The data evidenced in the present study are a support for systematic these
subfamilies and also strengthen the necessity of increase the knowledge about of the
cytogenetic this group beside the constitutive tool useful for the taxonomists aiding to
clear possible genetic mechanisms that have been occurred during the speciation.
Análise citogenética e descrição de um sistema de
determinação sexual ZZ/ZW em espécies do gênero
Serrapinnus (Characidae, Cheirodontinae).
Ana Paula de Santi-Rampazzo
1
, Patrícia Belini Nishiyama
2
, Paulo Emílio Botura
Ferreira
1
& Isabel Cristina Martins-Santos
1
1
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá,
Avenida Colombo 5790, 87020-900, Maringá, PR, Brasil,
2
Departamento de Biologia-
UNIPAR.
(E-mail: apsanti1@hotmail.com)
Resumo
Foram estudadas quatro populações da espécie Serrapinnus notomelas e uma
população da espécie Serrapinnus sp.1, ambas pertencentes à subfamília
Cheirodontinae, através da técnica convencional (Giemsa), impregnação por nitrato de
prata e bandamento C, afim de detectar possíveis mecanismos de evolução cariotípica.
A análise dos resultados mostrou um número diplóide igual a 52 cromossomos para
todas as populações analisadas, contudo, diferenças interespecíficas na fórmula
cariotípica foram observadas. S. notomelas apresentou 16M+22SM+10ST+4A, com
NF=100 para os machos e 16M+23SM+10ST+3A, com NF=101 para as fêmeas.
Serrapinnus sp.1 apresentou 8M+16SM+4ST+24A, com NF=80 para machos e
8M+15SM+4ST+25A, com NF=79 para fêmeas. A diferença de NF entre os sexos é
devido à presença de um par heteromórfico (submetacêntrico/acrocêntrico) nas fêmeas
das duas espécies, caracterizando um mecanismo de determinação sexual cromossômica
do tipo ZZ/ZW. Em relação às NORs, diferenças intraespecíficas também foram
encontradas. Enquanto um sistema de NOR simples foi detectado para três das quatro
populações estudadas de S. notomelas, para Serrapinnus sp.1 dois pares cromossômicos
estiveram envolvidos com esta região. A técnica de banda C demonstrou, para S.
notomelas, que a heterocromatina está localizada em regiões centroméricas na maioria
dos cromossomos do complemento e, em alguns, em posição telomérica, inclusive a
região de NOR. Não houve evidência de marcação no par cromossômico sexual. A
despeito de S. notomelas e Serrapinnus sp.1 apresentarem o mesmo número diplóide,
elas mostraram diferenças na estrutura cariotípica, indicando que mecanismos de
inversões pericêntricas estiveram presentes durante a evolução cariotípica deste grupo.
Palavras-Chaves: ZZ/ZW, Serrapinnus, Cheirodontinae, cariótipo
Introdução
Os peixes da subfamília Cheirodontinae não ultrapassam o comprimento de 10 cm,
sendo comuns em vegetação marginal de ambientes lóticos e lênticos de todo o Brasil
(Buckup & Malabarba,1983). Segundo Malabarba (1994) a sistemática desta subfamília
apresenta muitas divergências, tendo sido discutida por vários autores nos últimos anos.
Gregory & Conrad (1938) relataram a possibilidade dos Tetragonopterinae serem
derivados da subfamília Cheirodontinae ou pertencentes a um ancestral comum. Ainda,
autores como Weitzman & Fink (1983) discutiram a fragilidade da classificação dos
caracídeos neotropicais e posteriormente Weitzman & Vari (1988) não mais
reconhecem Cheirodontinae separadamente de Tetragonopterinae. Ainda hoje, esta
classificação parece incerta e Malabarba (1998) redefine Cheirodontinae como uma
subfamília composta por 20 gêneros, entre eles o Serrapinnus.
Embora a ictiofauna de águas continentais da região Neotropical possa
apresentar até 8000 espécies (Vari & Malabarba, 1998), conclui-se que o estágio atual
de conhecimento nessa área é ainda pequeno. Além da análise cariotípica convencional
os citogeneticistas de peixe têm buscado caracterizar as espécies através de técnicas de
bandamentos como impregnação com nitrato de prata para localizar regiões
organizadoras de nucléolos (AgNOR), banda C (heterocromatina constitutiva),
fluorocromos (regiões ricas em AT e CG), 5-Bromodeoxiuridina (bandas de replicação),
hibridação fluorescente in situ (FISH) e enzimas de restrição, na busca de estabelecer
relações filogenéticas e evolutivas mais precisas entre elas.
A utilização da técnica AgNOR têm permitido a observação tanto de ocorrência
de NORs em um único par de cromossomos, quanto àquelas distribuídas em vários
pares (NORs múltiplas). Entre os caracídeos estas últimas têm sido as mais freqüentes.
Embora o padrão das AgNORs positivas seja, em geral, constantes para uma espécie,
tem sido demonstrado variações no número e/ou tamanho da região organizadora do
nucléolo entre diferentes indivíduos, ou mesmo entre diferentes células de um mesmo
indivíduo. Estas variações parecem refletir diferenças no número de pares de genes
RNAr decorrentes de quebras durante a associação destas regiões no núcleo interfásico
e forte contração durante a prófase, mas também podem representar uma diferença na
atividade transcricional desses genes.
Dentro do gênero Serrapinnus, S. notomelas tem sido a única espécie descrita de
ocorrência na bacia do rio Paraná. Esta espécie tem como característica distintiva as
nadadeiras dorsal e anal com pigmentos escuros localizados anteriormente. Contudo,
duas outras formas têm sido observadas e separadas morfologicamente: Serrapinnus
sp.1, que apresenta as nadadeiras dorsal e anal hialinas e Serrapinnus sp.2 que possui as
nadadeiras dorsal e anal com apenas as extremidades escuras (Graça, 2004). Estas
diferenças têm levado a supor que as mesmas possam constituir espécies diferentes.
Diante disso, e devido ao pequeno porte das espécies de Cheirodontinae são quase
inexistentes estudos citogenéticos nesta subfamília.
Desta forma, este trabalho teve como objetivo a caracterização cromossômica
das espécies pertencentes a este grupo, coletadas em diferentes localidades das bacias
do rio Tietê e no rio Paraná.
Material e Métodos
No presente trabalho foram analisados exemplares de quatro populações da espécie
Serrapinus notomelas provenientes do rio Paraná (Bacia do rio Paraná), Córrego
Cascatinha e rio Araquá da região de Botucatu-SP e rio Pântano da região de São
Carlos-SP (Bacia do rio Tietê) e espécimes de Serrapinnus sp.1 coletados no rio Paraná,
na região de Porto Rico - Paraná.
As preparações do material para análise dos cromossomos mitóticos foram
realizadas, utilizando-se células do rim e brânquias, de acordo com a técnica “air
drying” (Egozcue, 1971) e modificada para peixes por Bertollo et al. (1978). Esta
técnica consiste basicamente, no tratamento do animal com colchicina por quarenta
minutos, a fim de obter uma suspensão celular hipotonizada em KCL 0,075M e fixada
em solução de metanol e ácido acético (3:1). Os cromossomos foram identificados de
acordo com os critérios de relação de braços (RB), propostos por Levan et al. (1964).
Para caracterização das regiões organizadoras do nucléolo (NOR) utilizou-se a técnica
de Howell & Black (1980) e para a regiões heterocromáticas, a técnica de banda C
(Sumner, 1975).
Resultados
S. notomelas apresentou o número diplóide igual a 52 cromossomos para todas as
populações analisadas, com o cariótipo composto de 16 cromossomos metacêntricos, 22
submetacêntricos, 10 subtelocêntricos e 4 acrocêntricos com NF=100 para machos
(Figura 1a) e de 16 cromossomos metacêntricos, 23 submetacêntricos, 10
subtelocêntricos e 3 acrocêntricos com NF=101 para as fêmeas (Figura 1b),
caracterizando um sistema de heterogametia feminina (ZZ/ZW). Além disso, pode-se
observar diferença de tamanho entre o primeiro e segundo par. A NOR foi detectada no
braço curto de um par de cromossomos acrocêntricos (par 26), para as populações dos
rios Pântano e Araquá e Córrego Cascatinha (Figura 1-detalhe). Também nestas
localidades, a heterocromatina constitutiva está localizada em posição pericentromérica
em todos os cromossomos e, em alguns, em posição telomérica. Blocos conspícuos
foram observados na região intersticial do braço longo do par 13 e em posição
telomérica no braço curto do par 26 (Figura 3). Neste último, a marcação foi coincidente
com a região de NOR.
Em Serrapinnus sp.1 foi detectado número diplóide de 2n=52 cromossomos e
fórmula cariotípica composta por 8 cromossomos metacêntricos, 16 submetacêntricos, 4
subtelocêntricos e 24 acrocêntricos com NF=80 para machos (Figura 2a) e 8
cromossomos metacêntricos, 15 submetacêntricos, 4 subtelocêntricos e 25 acrocêntricos
com NF=79 para as fêmeas (Figura 2b). A NOR foi localizada em um dos homólogos
do par 19 e em ambos cromossomos do par 20 (Figura 2-detalhe). Estes últimos se
apresentaram fortemente marcados e heteromórficos em tamanho da NOR,
demonstrando um sistema de NOR múltipla.
Figura 1- Cariótipo de Serrapinnus notomelas do rio Paraná, representativo das outras
populações estudadas: dos rios Araquá e Pântano e do córrego Cascatinha. (a) macho e
(b) fêmea. Em detalhe os cromossomos portadores de NOR (par 26).
Figura 2- Cariótipo de Serrapinnus sp.1. (a) macho e (b) fêmea. Em detalhe os
cromossomos portadores de NOR (pares 19 e 20).
Figura 3- Metáfase de Serrapinnus notomelas submetida à técnica de Banda C,
representativo para as populações dos rios Araquá e Pântano e Córrego Cascatinha. O
bloco no par 26 corresponde à região Ag-NOR, em detalhe o par sexual ZW.
Discussão
Nestas análises verificou-se que, em Serrapinnus notomelas, todas as populações
analisadas apresentaram o mesmo número diplóide e a mesma constituição cariotípica.
Contudo, Serrapinnus sp.1 mesmo apresentando o mesmo número diplóide, mostrou
diferenças na constituição cariotípica quando comparado à S. notomelas. S. notomelas
apresentou uma maior quantidade de cromossomos submetacêntricos (11 pares) e menor
de acrocêntricos (3 pares), enquanto Serrapinnus sp.1, apresentou maior quantidade de
acrocêntricos (12 pares). Além disso, foram observadas diferenças na relação de
tamanho entre o primeiro e o segundo par para as duas espécies. Enquanto S. notomelas
apresentou o primeiro par maior que o segundo, em Serrapinnus sp.1 esta diferença não
foi significativa. Estas diferenças as caracterizam como espécies distintas, indicando
que rearranjos estruturais estiveram presentes durante ou após o processo de especiação
das mesmas. Em relação ao número diplóide da subfamília Cheirodontinae, têm sido
observadas variações tanto em nível intergenérico, com 2n=32 cromossomos em
Paracheirodon innesi (Gydenholm & Scheel, 1971) e 2n=52 cromossomos para a
maioria das espécies analisadas, como em nível interespecífico em Cheirodon tronneri
(n=25; Scheel, 1973), C. axelroidi (n=24; Post, 1965) (n=26; Scheel, 1973); e ao nível
intraespecífico em Paracheirodon innesi com 2n=32 e 36 (Gyldenholm & Scheel,
1971).
A despeito da igualdade do número diplóide verificado entre os sexos em S.
notomelas e Serrapinnus sp.1, elas apresentaram cromossomos sexuais heteromórficos
do tipo ZZ/ZW. Embora as duas espécies apresentem o mesmo tipo de mecanismo de
determinação cromossômica sexual, o par e o tipo de cromossomos envolvidos diferem
entre elas. Enquanto o cromossomo responsável pela heterogametia feminina em S.
notomelas é um submetacêntrico, em Serrapinnus sp.1 ele é acrocêntrico.
Provavelmente esta diferença de par sexual tenha surgido devido às inversões
pericêntricas que acompanharam a evolução cariotípica das duas espécies.
Wasko et al. (2001) analisando as espécies Odontostilbe paranensis e
Holoshestes heterodon, pertencentes à subfamília Cheirodontinae, evidenciaram um
número diplóide igual a 52 cromossomos, onde O. paranensis apresentou o mesmo tipo
de heteromorfismo sexual cromossômico encontrado no gênero Serrapinnus e
especificamente à S. notomelas, apresentando uma maior quantidade de M/SM. A
análise de fêmeas de H. heterodon também indicou um provável heteromorfismo sexual
cromossômico devido à presença de um cromossomo acrocêntrico e um metacêntrico,
ambos sem seus respectivos homólogos. Entretanto, Wasko & Galetti Jr. (1994) não
observaram diferença cariotípica entre os sexos em O. claudinae. Estes dados,
juntamente com os do presente trabalho, indicam que o mecanismo de cromossomos
sexuais do tipo ZZ/ZW é o único presente nesta subfamília, bem como na família
Characidae até o momento. Conforme dados compilados em Almeida & Toledo (2001),
este sistema é o mais freqüente entre os peixes Neotropicais.
Na família Characidae foram registrados cromossomos sexuais
morfologicamente diferenciados em Triportheus guintheri (Bertollo & Cavallaro, 1992;
Artoni et al., 2001; Artoni & Bertollo, 2002), T. albus, T. elongatus e T. flavus (Falcão,
1988), T. cf elongatus e T. paranense (Artoni et al. 2001; Artoni & Bertollo, 2002)
todos eles do tipo ZZ/ZW. Portanto, as únicas subfamílias a apresentarem evidências
citológicas de heterogametia de cromossomos sexuais entre os caracídeos foram os
Cheirodontinae e Triportheinae. Segundo Galetti Jr. et al. (1981), ao contrário do que se
pensava, o heteromorfismo de cromossomos sexuais está bem representado entre os
peixes. Moreira-Filho (1983) chamou a atenção para este fato, mostrando que entre as
espécies de peixes estudadas no Brasil, 15,8% apresentam mecanismo cromossômico
sexual, ocorrendo desde heterogametia simples XX/XY e ZZ/ZW, até casos de
mecanismos múltiplos envolvendo mais de um par cromossômico (X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y,
XX/XY
1
Y
2
e ZZ/ZW
1
W
2
).
No estudo da região organizadora do nucléolo da espécie S. notomelas
verificou-se a presença de AgNOR simples para três das quatro populações estudadas.
A população do rio Paraná foi a única a demonstrar variações no padrão de distribuição
da NOR (Santi-Rampazzo & Martins-Santos, em preparação). NOR simples foi
observado dentro da subfamília Cheirodontinae por Pacheco et al. (2002) para
Odontostilbe pequira do rio Cuiabá. Além disso, Wasko & Galetti Jr. (1994)
evidenciaram uma constrição secundária no braço curto de um cromossomo
acrocêntrico em Odontostilbe paranensis, determinando, provavelmente, a localização
da NOR nesta espécie.
Na espécie Serrapinnus sp.1, diferentemente da maioria das populações de
S. notomelas (rio Pântano, Araquá, e Córrego Cascatinha), um sistema de NOR múltipla
foi detectado, com três cromossomos evidenciados pela técnica de AgNOR.
Corroborando estes dados foram observados de um a três nucléolos em cada núcleo
interfásico. Estes dados estão de acordo com Pacheco et al. (2002), que detectou este
mesmo sistema de distribuição da NOR para S. kriege, com marcação em dois
cromossomos não homólogos e S. calliurus, com quatro cromossomos marcados.
A técnica de banda C demonstrou um padrão de heterocromatina
pericentromérica com NOR banda C positiva em todas as populações de S. notomelas
estudadas. Além disso, foi observada a presença de um par de cromossomos
submetacêntricos, com banda C intersticial no braço longo.
Desta forma, apesar deste ser um dos primeiros relatos em espécies de
Serrapinnus, podemos verificar que dados citogenéticos em Cheirodontinae têm
contribuído não só com mais uma característica taxonômica, permitindo identificar
espécies distintas e apresentando mais um suporte à sistemática desta subfamília, mas
também no estudo dos mecanismos de cromossomos sexuais próprios de cada espécie.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo suporte
financeiro.
Referências
Almeida-Toledo, L.F. & F. Foresti, 2001. Morphologically differentiated sex
chromosomes in neotropical freshwater fish. Genetica 111: 91-100.
Artoni, R.F., J.D.N. Falcão, O. Moreira-Filho & L.A.C. Bertollo, 2001. Na uncommon
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Polimorfismo intrapopulacional das regiões organizadoras de nucléolo
em Serrapinnus notomelas (Characidae, Cheirodontinae) do rio
Paraná, detectado por impregnação pela prata (AgNOR), banda C e
hibridação fluorescente in situ (FISH).
Santi-Rampazzo AP
1
, Belini PN
2
, Ferreira PEB
1
& Martins-Santos IC
1*
.
1
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá
(UEM), Avenida Colombo 5790, 87020-900, Maringá, PR, Brasil;
2
Departamento de
Biologia, (UNIPAR). (E-mail:apsanti1@hotmail.com)
Resumo
A análise citogenética de Serrapinnus notomelas, de ocorrência no rio Paraná confirmou
2n=52 cromossomos e mecanismo de determinação sexual do tipo ZZ/ZW. A análise
das regiões organizadoras do nucléolo por AgNOR, FISH e Banda C, desta população,
detectaram um polimorfismo intrapopulacional dos genes ribossomais classificados em
6 padrões diferentes. Variações intraindividuais de expressão destes genes também
puderam ser verificadas. Além disso, foi observado NOR preferencial localizada no par
26, com pelo menos um dos homólogos ativos, em todos os indivíduos. Isto, aliado ao
fato da existência de populações da mesma espécie com AgNOR simples neste par, nos
levam a propor que estas variações podem corresponder a transposição de cópias dos
cístrons de rDNA, fixos no par 26, para diferentes locais no genoma, indicando que na
população do rio Paraná este gene parece estar se movendo, provavelmente devido a
mecanismos de transposase ou via reinserção em sítios que mostram seqüências
homólogas com o inserto. Análise de banda C acompanharam esta variabilidade,
confirmando a presença dos diferentes padrões observados. Contudo, não podemos
descartar a hipótese da ocorrência de outros tipos de rearranjos.
Palavras-Chave: polimorfismo NOR, Cheirodontinae, Serrapinnus notomelas, FISH.
Introdução
Um aspecto amplamente estudado em peixes é a região organizadora de nucléolo
(NOR). Estas regiões têm mostrado serem importantes marcadores para o estudo da
evolução cromossômica (Amemiya &Gold, 1988). Vários trabalhos tem sido realizados
buscando entender a composição (Zhang et al. 2000) e a localização (Pendás et al.
1993, Brum & Mota 2002, Jesus & Moreira-Filho 2003) dos genes ribossomais, que
podem estar distribuídos em um único par cromossômico (Fenocchio & Bertollo 1992,
Porto et al. 1993, Margarido & Galetti Jr 1996, Martins-Santos & Tavares 1996, Venere
et al. 1997) caracterizando um sistema de NOR simples ou em vários pares (Galetti Jr &
Rasch 1993, Pacheco et al. 2001), o que é comumente denominado de NOR múltipla.
Além disso, o número e posição de NORs são usualmente característicos de
espécies ou populações, embora variabilidades intra e interindividuais destas regiões
tenham sido observados em vários organismos (Lourenço et al. 1998). A alta taxa de
polimorfismos envolvendo estas regiões tem sido atribuídos a rearranjos cromossômicos
(Rodrigues & Collares-Pereira 1996, Vasconcelos & Martins-Santos 2000, Rabová et al
2001,), variação de expressão (Mizoguchi & Martins-Santos 1998) e elementos de
transposição por modificações pós-zigóticas (Galetti Jr et al. 1995). De acordo com este
autor, o uso combinado de métodos baseados em diferentes mecanismos de ação como
coloração pela prata, por cromomicina A
3
e hibridação fluorescente in situ, podem
fornecer dados importantes para o entendimento da distribuição dos cístrons
ribossomais nos cromossomos.
Outro recurso bastante utilizado para o estudo das NORs é a técnica de banda C,
visto que, de acordo com Galetti et al. (1984), a heterocromatina constitutiva associada
com a região organizadora de nucléolo é praticamente uma constante em animais e
plantas, ou seja, a maioria das NORs são banda C positivas (Martins-Santos &Tavares
1996, Rodrigues & Collares-Pereira 1996, Venere et al.1997, Souza et al. 2001,
Martins-Santos et al. 2005). Porém, tem-se visto que, em alguns casos, a NOR não está
evidentemente associada a blocos heterocromáticos e pode ser caracterizada como
banda C negativa (Rabová et al. 2001, Fernandes & Martins-Santos 2004).
Assim, no presente estudo, foram utilizadas múltiplas técnicas de bandamento
visando descrever o polimorfismo intrapopulacional das regiões organizadoras de
nucléolo observado em Serrapinnus notomelas do rio Paraná.
Materiais e métodos
Foram analisados 9 indivíduos da espécie Serrapinnus notomelas (5 machos, 4 fêmeas)
provenientes do rio Paraná, região de Porto Rico.
As preparações do material, para análise dos cromossomos mitóticos, foram
realizadas utilizando-se células do rim e brânquias, de acordo com a técnica “air drying”
descrita por Bertollo et al. (1978). Esta técnica consiste, basicamente, em tratar o animal
com colchicina por quarenta minutos a fim de obter uma suspensão celular,
hipotonizada em KCL 0,075M durante vinte minutos e fixada em solução de metanol e
ácido acético (3:1). Os cromossomos foram identificados de acordo com os critérios de
relação de braços (RB), propostos por Levan et al. (1964).
Para caracterizar as regiões organizadoras do nucléolo (NORs) utilizou-se a técnica de
impregnação pelo nitrato de prata (Ag-NOR), descrita por Howell & Black (1980) e a
hibridação fluorescente in situ (FISH), realizada através de metodologia descrita por
Heslop-Harrison et al. (1991) e Cuadrado & Jouve (1994).
Para a obtenção da sonda
18S, o DNA genômico foi extraído de acordo com Sambrook et al., 1989; a
amplificação da seqüência de interesse, o PCR 18S foi realizado com os primers NS1 e
NS8 (White et al., 1990), e a marcação da sonda seguiu a metologia de Nick
Translation, seguindo as especificações do kit Bionick (Gibco). A heterocromatina
constitutiva foi evidenciada pela técnica de banda C (Sumner 1972).
Resultados
O presente estudo confirmou o número diplóide de 52 cromossomos e o mecanismo de
determinação cromossômica sexual ZZ/ZW para Serrapinnus notomelas do rio Paraná
(Santi-Rampazzo et al., em preparação). A aplicação das técnicas Ag-NOR e FISH em
118 metáfases de 9 indivíduos (5machos e 4 fêmeas), mostrou a presença de 6 padrões
diferentes entre os indivíduos analisados (Tabela 1), revelando assim, diferenças
intrapopulacionais na distribuição do DNAr na população de S. notomelas do rio
Paraná (Figuras 1 e 2). Os padrões III, IV e VI foram representados por 2 indivíduos
cada. A figura 3 mostra o diagrama dos seis padrões distintos, sendo a localização da
NOR no par 26, com ao menos um dos homólogos AgNOR positivo, comum a todos os
indivíduos.
O padrão I apresentou 4 marcações para AgNOR: terminal no braço curto de um
submetacêntrico maior (CSM), terminal no braço curto de um submetacêntrico menor
(CSm) , e no braço curto de um par acrocêntrico (BCA); e 5 para FISH, em que foram
marcados os mesmos cromossomos além do homólogo BCA. O padrão II mostra 2 a 6
marcações AgNOR: no braço longo de um submetacêntrico maior (LSM), terminal no
braço longo de um subtelocêntrico (LST), terminal no braço curto de um dos homólogos
do CSm e no braço curto de um dos homólogos do BCA, enquanto que a FISH produziu
7 marcações que diferiu apenas pela presença de marcação nos homólogos do BCA e do
CSm.. O padrão III marcou com AgNOR apenas o par BCA, e, na FISH, além deste par,
um dos homólogos do LSM foi marcado. O padrão IV mostrou em ambas metodologias
somente o par BCA marcado. O padrão V mostrou marcação AgNOR no BCA e
intersticial no braço curto de um metacêntrico (IBM) e na FISH além destes marca o
LSM e terminal no braço longo do IBM. No padrão VI os cromossomos marcados pela
prata foram: um dos homólogos LSM, um dos BCA e no braço longo de um submeta
médio (LSMe) e a FISH marcou além destes os homólogos dos pares LSM e BCA e um
outro cromossomo LSMe, não marcado pela AgNOR (Figura 3).
Todas as regiões de NOR demonstraram ser heterocromáticas (banda-C
positivas) quando submetidas à técnica de banda C (figura 4), portanto, detectou-se
também uma variação intrapopulacional na distribuição da heterocromatina constitutiva.
Porém, um bloco intersticial no par 13 não relacionado com a NOR foi detectado em
todos os indivíduos (figura 4, cabeça de seta).
Tabela 1
–
Padrões fenotípicos e quantidade de metáfases analisadas pelas técnicas AgNOR
e FISH dos espécimes de Serrapinnus notomelas. M=macho, F=fêmea.
AgNOR FISH
Padrão
Espécimes
1 2 3 4 5 6 7
1 2 3 4 5 6 7
Total
I
6 (M) 2 14 7 23
II
31(M) 2 1 3 2 1 3
12
III
32(F),33(F) 10 15 25
IV
34(M),49(F) 12 7 19
V
43 (M) 3 9 17 29
VI
47(F),58 (M)
3 1 6 10
Total 9
63 55
118
Figura 1- Metáfases somáticas de S. notomelas. (a), (c), (e) AgNOR; (b), (d), (f) FISH,
para os padrões I; II; III. As setas indicam os sítios de DNAr detectados pelas duas técnicas.
Figura 2- Metáfases somáticas de S. notomelas. (a), (c), (e) AgNOR e (b), (d), (f) FISH,
para os padrões IV; V; VI. As setas indicam os sítios de DNAr detectados pelas duas
técnicas. Cabeças de seta indicam o par 13.
Figura 3- Idiograma dos padrões de distribuição intrapopulacionais dos cístrons
ribossomais (em cinza) encontrados na espécie Serrapinnus notomelas.
Figura 4- Metáfases somáticas submetidas à técnica de banda-C. As setas indicam
blocos heterocromáticos polimórficos relacionados com as respectivas variações da
NOR. (a) Padrão III, (b) Padrão IV, (c) Padrão V e (d) Padrão VI. As cabeças de seta
indicam os blocos heterocromáticos detectados no par 13 que não tem relação com a
NOR.
Discussão
Em estudos citogenéticos do gênero Serrapinnus (Santi-Rampazzo et al. em preparação)
foram observados número diplóide 2n=52 para 4 populações de S. notomelas, sendo que
três apresentaram AgNOR simples, enquanto que a do rio Paraná apresentou uma
variação intrapopulacional que é descrita no presente trabalho.
A análise AgNOR revelou que, entre os espécimes de S. notomelas analisados,
há uma alta variabilidade interindividual de padrões de NOR ativos. Considerando que
este método indica somente as regiões que exibiram atividade na interfase anterior
(Miller et al. 1976), estes dados poderiam ser facilmente explicáveis como sendo devido
a diferenças de atividade gênica. De acordo com Almeida-Toledo et al. (1996), as
NORs usualmente tem uma localização muito constante em espécies de peixes, tendo
sido utilizadas como marcadores cromossômicos espécie-específico. Porém, a análise
dos indivíduos por FISH, que detecta sítios de DNAr em nível molecular independente
de sua atividade gênica, indicou que este heteromorfismo interindividual não estaria
relacionado à expressão gênica, visto que as variações foram confirmadas na análise
com FISH e seis padrões puderam ser distinguidos. Contudo, dentro dos distintos
padrões, também foram observadas variações intraindividuais devido a não expressão
de homólogos.
A NOR preferencial foi detectada em um par de cromossomos acrocêntricos (par
26-BCA), tendo sido encontrados pelo menos mais seis pares variáveis entre os
indivíduos além do BCA, como mostrado no diagrama, correspondentes aos
cromossomos CSM, CSm, LSM, LST, IBM, LSMe. Portanto, podemos propor que o
polimorfismo encontrado no presente trabalho consiste em variabilidade de sítios
adicionais de NOR ocorrendo em adição a um par nucleolar principal. Além disso, este
par tem mostrado inatividade de um dos homólogos nos padrões II e VI. Esses dados
são semelhantes aos apresentados por Lourenço et al. (1998), que detectou em
Physalaemus petersi (uma espécie de Anuro) uma variação intrapopulacional
distinguindo 7 padrões AgNOR, o qual sugere variabilidade dos locais de NOR. Estes
dados, no entanto, diferem do presente trabalho em relação à expressão intraindividual
da NOR, pois as análises pelo método AgNOR foram correspondentes aos detectados
nos experimentos com FISH.
Variações de expressão de NOR detectadas pela técnica de prata são freqüentes e
têm sido observadas em Chondrostoma lusitanicum (Rodrigues & Collares-Pereira
1996); Astyanax altiparanae (Pacheco et al. 2001); A. scabripinnis (Mizoguchi &
Martins-Santos 1998); Cobitis vardarensis (Rabová et al. 2001); Poecilia latipunctata
(Galetti Jr. & Rasch 1993), no gênero Diplodus (Vitturi et al. 1996) entre outros.
Almeida-Toledo et al. (1996) utilizando-se de FISH e prata, detectou diferenças
interpopulacionais em Eigenmannia sp.1 do rio Mogi-Guaçú, e aponta como principais
fatores pequenas translocações ou transposições. Contudo, variações intrapopulacionais
analisadas por estes métodos indicando transposições de NOR são menos freqüentes em
peixes, sugeridas por Galetti et al. (1995) na análise de um entre dez indivíduos de
Leporinus friderici. Os autores propõem que estes cístrons sejam altamente suscetíveis à
modificações estruturais pré-pós-zigóticas, como resultados de crossing over desigual,
duplicações regionais, transposições e outros rearranjos.
Todavia, em anuros, este parece ser um fenômeno comum descrito para várias
espécies (Bufo terrestris, Foote et al. 1991; Physalaemus petersi, Lourenço et al. 1998;
Hyla nana e Hyla sanborni, Medeiros et al. 2003; entre outros). Estes autores,
utilizando-se dos mesmos métodos do presente trabalho, atribuem estes resultados a
vários fatores, tais como amplificação de ‘orfan’ cístrons de rDNA, erros de reinserção
durante amplificação extracromossomal de cístrons ribossomais, além da presença de
elementos genéticos móveis, translocações e inversões envolvendo segmentos
cromossômicos contendo NORs como já citado anteriormente.
A observação de que nos distintos padrões encontramos sítios adicionais de
NOR em diferentes tipos cromossômicos, coincidentes pelas duas técnicas, aliadas ao
fato de não terem sido detectadas alterações na macroestrutura dos cromossomos que
apresentaram inserção, nos leva a propor que estes sítios podem corresponder a
transposição de cópias dos cístrons de rDNA, fixos no par 26, para diferentes locais no
genoma. Isto pode ser corroborado pela existência de populações desta espécie com
AgNOR simples no par 26 (Santi-Rampazzo et al. em preparação), indicando que na
população do rio Paraná este gene parece estar se movendo, provavelmente devido a
mecanismos de transposase ou via reinserção em sítios que mostram seqüências
homólogas com o inserto. Este mecanismo também é proposto por Foote et al. (1991)
em Bufo terrestris. Embora consideremos que o mecanismo de transposição por
elementos móveis, seja o mais provável não podemos descartar a hipótese da ocorrência
de outros tipos de rearranjos, tais como os observados em Anuros (Foote et al. 1991,
Lourenço et al. 1998, Medeiros et al. 2003)
Estes resultados acompanham ainda a coincidência de variação de banda C com
os diferentes tipos de padrões estabelecidos que ajudaram a identificar as modificações
ocorridas. Possivelmente a heterocromatina presente no par 26, flanqueando o genes
rDNA acompanhe estes genes por qualquer que seja o mecanismo envolvido nesta
variabilidade ou, ainda como sugerido por Almeida-Toledo et al. (1996), todos os sítios
de NOR associados com heterocromatina tem uma tendência a formar conexões intra e
intercromossomos, facilitando as trocas de seqüências. Os resultados do presente
trabalho diferem dos observados por Foote et al. (1991), nos quais o padrão de banda C
não acompanha as diferenças observadas para AgNOR e FISH.
Marcações de banda C não coincidentes com as de NOR e que, portanto,
determinam o padrão da espécie, ocorrem na região pericentromérica da maioria dos
cromossomos. Dois pares de cromossomos apresentam marcações mais conspícuas: um
com uma marcação intersticial proximal ao centrômero no braço curto do 2º par e o
outro com uma marcação intersticial proximal ao centrômero no braço longo do 13º par.
Este resultado pode ser observado para as populações de S. notomelas do rio Pântano,
rio Araquá e córrego Cascatinha (Santi-Rampazzo et al. em preparação). Devido à
presença da banda C no 13º par foi possível identificar um dos sítios de localização da
NOR no padrão VI e esta marcação só ocorre em um dos homólogos.
Embora alguns dos mecanismos propostos não estejam totalmente esclarecidos,
o presente estudo, através da combinação de diferentes metodologias (AgNOR, FISH e
Banda C) e análise da freqüência das marcações em diferentes indivíduos, permitiu uma
melhor interpretação do polimorfismo de NOR observados na população de S.
notomelas do rio Paraná. Desta forma, pela não utilização da técnica de hibridação in
situ; a variabilidade, muitas vezes atribuída à inativação gênica, pode tornar a hipótese
do mecanismo de transposição por elementos móveis muito mais comum do que tem
sido observado.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo suporte
financeiro.
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Short Communication
Estudos citogenéticos em Aphyocharax anisitsi (Characidae,
Aphyocharacinae) de ocorrência no rio Paraná
Ana Paula de Santi-Rampazzo
1
, Luciana Ramos Sato
2
, Paulo Emílio Botura Ferreira
1
e
Isabel Cristina Martins-Santos
1
1
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá,
Av.Colombo 5790, 87020-900, Maringá, PR, Brasil,
2
Depto de Biologia- UNESP,
Botucatu. (E-mail:apsanti1@hotmail.com)
Resumo
Aphyocharax anisitsi apresentou 2n=50 cromossomos, com fórmula cariotípica
consistindo de 4M+4SM+42A e NOR simples que foi detectada pela prata, FISH e
CMA
3
. Apesar dos escassos estudos realizados
dentro desta subfamília pode-se verificar
que o número diplóide é conservativo, contudo diferenças interespecíficas puderam ser
observadas, principalmente em relação às regiões organizadoras de nucléolo. Nas
análises realizadas até o momento, somente a espécie estudada no presente trabalho
apresentou NOR simples, indicando diferenças evolutivas. A banda C apresenta blocos
pericentroméricos e teloméricos na maioria dos cromossomos, inclusive nas regiões de
NOR.
Palavras-Chaves: Aphyocharax, Aphyocharacinae, Ag-NOR, banda C, cromomicina
A
3
.
Introdução
Os membros da família Characidae apresentam tamanhos variando desde dois
centímetros, como as pequiras, até mais de um metro, como os dourados e estão
distribuídos em vários ambientes da região Neotropical (Britski, 1972). Todos os peixes
da família Characidae possuem escamas, com exceção do gênero Gymnocharacinus,
(Géry, 1977) e são bastante conhecidos entre os pescadores. Os mais comuns são os
lambaris, piracanjubas, peixes-cachorro, pacus, piranhas e dourados.
Os Aphyocharacinae são peixes de porte pequeno, atingindo até 8cm de
comprimento, com dentes tricúspides e cônicos dispostos numa série única nas maxilas
com a cúspide mediana maior. Géry (1977) considera esta subfamília integrada apenas
por espécies do gênero Aphyocharax. Na bacia do Rio Paraná, de acordo com Graça
(2004), tem sido observada a ocorrência de três espécies de Aphyocharax (Aphyocharax
anisitsi, Aphyocharax dentatus e Aphyocharax sp) que podem ser distinguidas
principalmente pelo padrão de coloração das nadadeiras (todas vermelhas em A. anisitsi
e somente a caudal vermelha em A. dentatus e Aphyocharax sp), presença de mancha
umeral (ausente em A. anisitsi) e tamanho da órbita em relação à cabeça (mais de três
vezes em A. dentatus e menos de três vezes em Aphyocharax sp).
Dentro da subfamília Aphyocharacinae poucas espécies foram estudadas ( Souza
et al. 1995) e heteromorfismos de cromossomo sexual não foram detectados. Devido ao
pequeno porte das espécies pertencentes à esta subfamília aliada a dificuldade de
resultados satisfatórios, os estudos citogenéticos são quase inexistentes. Diante disso,
este trabalho visa a caracterização cromossômica de espécies pertencentes a este grupo,
de ocorrência na bacia do rio Paraná, região de Porto Rico.
Materiais e Métodos
Para a realização deste trabalho foram analisados 66 exemplares de
Aphyocharax anisitsi (30 machos e 36 fêmeas) representado na figura 1, pertencentes à
subfamília Aphyocharacinae que foram coletados no Rio Paraná, na região de Porto
Rico (base do Nupélia-UEM).
As preparações do material, para análise dos cromossomos mitóticos, foram
realizadas utilizando-se células do rim e brânquias, de acordo com a técnica “air drying”
descrita por Bertollo et al. (1978). Esta técnica consiste, basicamente, em tratar o animal
com colchicina por quarenta minutos a fim de obter uma suspensão celular,
hipotonizada em KCL 0,075M durante vinte minutos e fixada em solução de metanol e
ácido acético (3:1). Os cromossomos foram identificados de acordo com os critérios de
relação de braços (RB), propostos por Levan et al. (1964).
Para caracterizar as regiões organizadoras do nucléolo (NORs) utilizou-se a
técnica de impregnação pelo nitrato de prata (Ag-NOR), descrita por Howell e Black
(1980), a detecção de bases ricas em GC com Cromomicina A3 (Schmid, 1980; Galetti-
Jr e Rasch, 1993)
e a hibridação fluorescente in situ (FISH), realizada através de
metodologia descrita por Heslop-Harrison et al (1991) e Cuadrado e Jouve (1994). A
heterocromatina constitutiva foi evidenciada pela técnica de banda C (Sumner, 1972).
Figura 1 – Exemplar de A. anisitsi
Resultados
A análise das metáfases de A. anisitsi mostrou que esta espécie possui um
número diplóide modal de 50 cromossomos e cariótipo composto por 4 cromossomos
metacêntricos, 4 submetacêntricos e 42 cromossomos subtelo/acrocêntricos (NF=58).
Apresentou apenas um par de cromossomos contendo cístrons ribossomais, em
ambas as análises com FISH e Ag-NOR (Região Organizadora de Nucléolo), estando
esta região localizada no braço curto de um par de cromossomos submetacêntricos (par
4), coincidente com região de constrição secundária. Através da análise com
fluorocromo GC-específico (Cromomicina A
3
) também foi possível detectar que a NOR
é rica nestas duas bases nitrogenadas.
A heterocromatina constitutiva está distribuída em posição pericentromérica e
telomérica da maioria dos cromossomos, inclusive na região da NOR que pode ser
considerada banda C positiva. A análise com CMA
3
indicou que na maioria dos
cromossomos a heterocromatina não é rica em GC.
Figura 2 – Cariótipo com coloração convencional de Giemsa de A. anisitsi
Figura 3 – Metáfases somáticas de A. anisitsi. (a) Banda C, (b) Ag-NOR, (c)
Cromomicina A
3
, (d) FISH com sonda DNAr 18S. As setas indicam os cromossomos
portadores da NOR
Discussão
Devido ao grande volume de estudos cromossômicos realizados em diferentes
subgrupos de Characidae, tem sido possível constatar que nenhum outro grupo de
vertebrados apresenta uma diversidade cariotípica tão acentuada como neste grupo. No
entanto, a análise do número diplóide de suas subfamílias tem mostrado diferentes
caminhos de evolução cariotípica. Enquanto a maioria delas apresenta um alto grau de
variação numérica de cromossomos, podemos encontrar outras subfamílias com número
de cromossomos constantes. Entre elas destacam-se Acestrohrynchinae (Falcão et al.
1985), Salmininae (Marco, 1986; Oliveira et. al., 1992), Bryconinae (Margarido, 1995)
e Characidiinae (Miyazawa e Galetti Jr., 1994).
Dentro da subfamília Aphyocharacinae, Aphyocharax difficilis foi estudado
citogeneticamente mostrando um número diplóide de 2n=50 e ausência de
heteromorfismo de cromossomo sexual (Souza et al., 1995). Assim, A. anisitsi
analisado no presente trabalho mostra concordância de resultados para estas duas
características, quando comparadas com A. difficilis. No entanto, diferiram quanto ao
Número Fundamental (56 em A. difficilis e 58 em A. anisitsi) devido à presença de dois
pares de cromossomos submetacêntricos pequenos em A. anisitsi e ao padrão de banda
NOR, uma vez que A. difficilis apresentou marcações em dois pares de acrocêntricos.
Fracaro e Miyazawa (2002), analisando a espécie A. dentatus do rio Cuiabá
detectaram o mesmo número diplóide de A. anisitsi. Porém, um sistema de NOR
múltipla foi encontrado em A. dentatus, com ao menos cinco cromossomos marcados
pela prata, diferindo do presente trabalho, onde NOR simples foi detectada com análises
por várias técnicas (AgNOR, CMA
3
e FISH), que confirmam esta distribuição de DNAr
em A. anisitsi.
A aplicação da técnica de CMA
3
em A. anisitsi permitiu a visualização de
apenas duas marcações fortes nas metáfases analisadas, provavelmente coincidentes
com regiões de NOR. Fracaro e Miyazawa (2002), encontraram com a mesma técnica,
marcações brilhantes em quatro cromossomos correspondentes às AgNORs em
A.dentatus, reforçando a diferença entre as duas espécies. A heterocromatina
constitutiva evidenciada pela técnica de banda C está localizada nas regiões
pericentroméricas e teloméricas da maioria dos cromossomos, o que está de acordo com
os dados apresentados por Souza et al (1995), sendo que a grande maioria dos blocos
heterocromáticos não são ricos em bases GC, indicando que a heterocromatina da NOR
é qualitativamente diferente das demais banda C do genoma.
Portanto, dentro desta subfamília pode-se verificar que o número diplóide é
conservativo, contudo diferenças interespecíficas podem ser observadas, principalmente
em relação às regiões organizadoras de nucléolo. Nas análises realizadas até o
momento, somente a espécie estudada no presente trabalho apresentou NOR simples,
indicando diferenças evolutivas.
Agradecimentos
Os autores agradecem o Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo suporte
financeiro.
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