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DANIEL MOURA DE AGUIAR
Aspectos epidemiológicos da erliquiose canina no Brasil
São Paulo
2006
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DANIEL MOURA DE AGUIAR
Aspectos epidemiológicos da erliquiose canina no Brasil
Tese apresentada ao programa de Pós-
graduação em Epidemiologia Experimental
e Aplicada às Zoonoses da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para obtenção
do título de Doutor em Medicina Veterinária
Departamento:
Medicina Veterinária Preventiva e Saúde
Animal
Área de concentração:
Epidemiologia Experimental e Aplicada às
Zoonoses
Orientador:
Prof. Dr. Marcelo Bahia Labruna
São Paulo
2006
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Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que
citada a fonte.
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: AGUIAR, Daniel Moura de
Título: Aspectos epidemiológicos da erliquiose canina no Brasil
Tese apresentada ao programa de Pós-
graduação em Epidemiologia Experimental
e Aplicada às Zoonoses da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para obtenção
do título de Doutor em Medicina Veterinária
Data: __/__/____
Banca examinadora:
Prof. Dr. _________________________ Instituição: _______________________
Assinatura: _______________________ Julgamento: ______________________
Prof. Dr. _________________________ Instituição: _______________________
Assinatura: _______________________ Julgamento: ______________________
Prof. Dr. _________________________ Instituição: _______________________
Assinatura: _______________________ Julgamento: ______________________
Prof. Dr. _________________________ Instituição: _______________________
Assinatura: _______________________ Julgamento: ______________________
Prof. Dr. _________________________ Instituição: _______________________
Assinatura: _______________________ Julgamento: ______________________
DEDICATÓRIA
Em especial aos meus pais Álvaro e Eliane;
irmãos Guilherme, Ricardo e Marcos; avós
paterno Alberto (in memorian) e Maria e
materno Dulsidio e Eliete, por todo amor e
apoio necessário.
A Cris pelo apoio e amor durante toda esta tese.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao amigo professor Marcelo Bahia Labruna
pela paciência e ensinamentos desde o
mestrado e por sempre acreditar no
sucesso deste experimento.
À amiga professora Solange Maria Gennari,
por todo apoio dado desde o mestrado
(quando me deu a chance de participar do
projeto em Rondônia) e também durante
todo o doutorado.
AGRADECIMENTO
Falar do doutorado, sem lembrar dos anos de residência e mestrado seria
uma grande injustiça, pois estas etapas foram importantes para a minha formação, e
me ajudaram em muito a superar dificuldades encontradas nesta etapa. Por outro
lado, falar disso tudo, sem lembrar dos amigos e das histórias vividas nessas
épocas, seria uma injustiça muito maior, porém não haveria páginas suficientes para
tudo isso. Mesmo durante o doutorado, que durou no VPS apenas 17 meses, e
foram uns dos melhores anos de minha vida. Por esse motivo, em respeito a todos
os amigos que participaram da minha vida “pós-graduação”, agradeço em especial
àqueles que me ajudaram nesta etapa final:
• As professoras Mitika K. Hagiwara e Rosângela Z. Machado, e as amigas
Márcia Hasegawa e Thais Saito pela ajuda no decorrer da tese.
• Aos amigos da parasitária: Adriano, Alessandra, Alexandre Ataliba, Alexandre
Thomas, Aline, Eliana, Guacyara, Hilda, Jonas, Iara, Lucia, Luciana, Luciana
(Carioca), Marcelo Meirelles, Marcelo (Wilinha), Maria, Mauricio, Micaela,
Pedro, Renata, Ricardo, Richard, Silvio, Tatiana, Tiago e Vanessa.
• Aos amigos Adriana, César, Cris Brito, Esther, Fábio, Ivan, Lara, Laura,
Leandro, Letticie, Patrícia (Lira), Renata, Renata Paixão, Roberto e Flávia.
• Aos professores Fernando, Leonardo, Paulo, Ricardo, Rodrigo, Silvio e Sônia.
• Aos amigos Alexandre (Finus), Cláudia, Cristina, Danival, Sandra e Virginia.
• A todos os amigos do VPS, entre alunos, professores, funcionários e
estagiários, nunca vou me esquecer de vocês.
• A APTA e todos os amigos de lá, pelo apoio nos momentos finais desta tese.
• A FAPESP pelo apoio financeiro (processo: 04/01638-2).
RESUMO
AGUIAR, D. M. de Aspectos epidemiológicos da erliquiose canina no Brasil.
[Epidemiological aspects of canine ehrlichiosis in Brazil]. 2006. 95 f. Tese (Doutorado
em Medicina Veterinária). - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
O presente estudo visou obter informações sobre a epidemiologia da erliquiose
canina no Brasil, a partir da caracterização molecular de isolados nacionais e de
estudo de prevalência da infecção em cães (Canis familiaris) e carrapatos
Rhipicephalus sanguineus. Inicialmente, padronizou-se o isolamento de Ehrlichia
canis em cultivo de células DH82, a partir de um cão inoculado com a cepa
Jaboticabal, seguida da identificação do isolado pelo sequenciamento de DNA de
um fragmento do gene dsb de Ehrlichia. Posteriormente, realizou-se o isolamento de
E. canis de um cão naturalmente infectado, atendido no Hospital Veterinário
(HOVET) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São
Paulo. Este novo isolado foi geneticamente caracterizado a partir da PCR almejando
fragmentos dos genes dsb, 16S rRNA e P28. Com o estabelecimento do isolado
Jaboticabal em cultivo celular, padronizou-se a Reação de Imunofluorescência
Indireta (RIFI), utilizando-a em amostras de soros de 314 cães de áreas urbana e
rural do Município de Monte Negro, RO. Finalmente, avaliou-se pela PCR do gene
dsb, a freqüência de carrapatos infectados e de cães oriundos de quatro populações
de R. sanguineus, uma do município de Monte Negro, RO. e três do estado de São
Paulo. Do cão inoculado com o isolado Jaboticabal, constatou-se o crescimento de
E. canis em cultivo celular, no 27
o
dia pós-inoculação, confirmado pela PCR e
citologia. Após o seqüenciamento de DNA, o fragmento amplificado a partir do
isolado apresentou-se 100% similar a seqüência correspondente ao gene dsb de E.
canis depositada no GenBank. O isolamento de E. canis, a partir do cão atendido no
HOVET, foi obtido no 14
o
dia pós-inoculação. Esta nova cepa, designada como
isolado São Paulo, apresentou-se idêntica às seqüências do gene dsb e similares às
seqüências dos genes 16S rRNA e P28, de outros isolados de E. canis disponíveis
no GenBank. Dos soros testados pela RIFI, observou-se prevalência (títulos ≥ 40) de
31,2% (98/314), sendo 37,9% (58/153) em cães urbanos e 24,8% (40/161) em cães
rurais (P < 0,05) de Monte Negro, Estado de Rondônia. A prevalência de carrapatos
infectados (dada como freqüência mínima de infecção) foi de 2,3, 6,2, e 3,7% para
as populações 1 (Monte Negro), 2 (Jundiaí, SP), e 3 (São Paulo I, SP),
respectivamente (P > 0,05). Nenhum carrapato infectado foi detectado na população
4 (São Paulo II, SP). Os produtos da PCR dos carrapatos e de cães das populações
1, 2 e 3 foram idênticos entre si e à seqüência de E. canis disponível no GenBank.
Estes resultados reforçam estudos anteriores, que relataram a infecção por E. canis
em cães do Brasil, contudo descreve pela primeira vez no Brasil a infecção natural
por E. canis em carrapatos R. sanguineus, tido como o principal carrapatos de cães
no país.
Palavras-chave: Ehrlichia canis, Isolamento animal, Epidemiologia (Prevalência),
Rhipicephalus sanguineus.
ABSTRACT
AGUIAR, D. M. de Epidemiological aspects of canine ehrlichiosis in Brazil.
[Aspectos epidemiológicos da erliquiose canina no Brasil]. 2006. 95 f. Tese
(Doutorado em Medicina Veterinária). - Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
The present study was conducted to investigate the canine ehrlichiosis epidemiology
in Brazil, through molecular characterization of indigenous isolates and prevalence of
infection in dogs (Canis familiaris) and Rhipicephalus sanguineus ticks. Firstly, it was
performed the isolation of the Jaboticabal strain of Ehrlichia canis in DH82 cells from
an experimentally infected dog, followed by molecular identification of the isolate by
sequencing a fragment of the Ehrlichia dsb gene. After that, a new strain of E. canis
was isolated from a naturally infected dog, assisted in the Veterinarian Hospital
(HOVET) of the Faculty of Veterinary Medicine, University of São Paulo. This isolate
was characterized by obtaining dsb, 16S rRNA and P28 nucleotide partial
sequences. After the establishment of Jaboticabal strain in DH82 cells, an Indirect
Immunofluorescence Test (IFAT) was developed, and 314 urban and rural dogs from
Monte Negro Municipality were tested by this technique. Finally the prevalence of E.
canis was determined in four different populations of Rhipicephalus sanguineus ticks,
being one population from Monte Negro, RO. and three from different areas from São
Paulo state using a PCR targeting an erlichial dsb gene fragment. Culture of E. canis
Jaboticabal presented positive results by PCR on day 27. The dsb sequence was
identical to other E. canis sequences available in GenBank. Cell culture inoculated
with material from the dog assisted in the HOVET became positive by day 14
when
dsb PCR was positive. This new strain was designated as isolate São Paulo of E.
canis and showed to contain identical dsb and high similar partial sequences of 16S
rRNA and P28 genes with others E. canis strains available in GenBank. Antibodies
Anti-E. canis (titers ≥ 40) were detected in 31.2% (98/314) of the dogs, being 37.9%
(58/153) in urban and 24.8% (40/161) in rural dogs of Monte Negro; these values
were significantly different (P<0.05). The prevalence of infected ticks (given as
minimal infection rate) was 2.3, 6.2, and 3.7% for populations 1 (Monte Negro), 2
(Jundiaí, SP), and 3 (São Paulo I, SP), respectively, which were statistically similar
(P>0.05). In contrast, no infected tick was detected in population 4 (São Paulo II,
SP). DNA sequences were determined for some of the PCR products generated from
ticks and dogs from populations 1-3, being all identical to each other and to available
sequences of E. canis. These results reinforce previous studies that reported E.
canis infecting dogs in Brazil, but report for the first time in Brazil the natural infection
of E. canis in its vector, R. sanguineus, which is the commonest tick infesting dog in
this country.
Key-words: Ehrlichia canis, Animal Isolation, Epidemiology (Prevalence),
Rhipicephalus sanguineus.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO………………………..………………………………..
16
CAPITULO I…………………………….……………………………..
23
1
INTRODUÇÃO………………………………………………………....
23
2
MATERIAL E MÉTODOS…………………………………………….
26
2.1 ISOLADO E OBTENÇÃO DO INOCULO DE E. canis................... 26
2.2 INOCULAÇÃO EM CÉLULAS DH82............................................. 27
2.3 EXTRAÇÃO DE DNA..................................................................... 27
2.4 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR)...................... 28
2.5 SEQUENCIAMENTO...................................................................... 29
3
RESULTADOS...............................................................................
30
3.1 ISOLAMENTO DE E. canis EM CÉLULAS DH82.......................... 30
3.2 SEQUENCIAMENTO...................................................................... 32
4
DISCUSSÃO..................................................................................
33
CAPITULO II..................................................................................
36
1
INTRODUÇÃO...............................................................................
36
2
MATERIAL E MÉTODOS..............................................................
39
2.1 ORIGEM DO ISOLADO DE E. canis.............................................. 39
2.2 ISOLAMENTO EM CULTIVO DE CÉLULAS DH82....................... 39
2.3 EXTRAÇÃO DE DNA..................................................................... 40
2.4 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR)...................... 41
2.4.1 GENE dsb...................................................................................... 41
2.4.2 GENE 16S rRNA............................................................................ 42
2.4.3 GENE P28...................................................................................... 42
2.5 CLONAGEM DOS GENES 16S rRNA e P28................................. 43
2.6 SEQÜENCIAMENTO DOS GENES dsb, 16S rRNA e P28........... 44
2.7 ACESSO ÀS SEQÜÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS E
AMINOÁCIDOS.............................................................................
44
3
RESULTADOS...............................................................................
46
3.1 CASO CLÍNICO............................................................................. 46
3.2 ISOLAMENTO DE E. canis EM CÉLULAS DH82.......................... 46
3.3 SEQÜENCIAMENTO..................................................................... 48
4
DISCUSSÃO..................................................................................
52
CAPITULO III.................................................................................
56
1
INTRODUÇÃO...............................................................................
56
2
MATERIAL E MÉTODOS..............................................................
59
2.1 LOCAL DO ESTUDO E AMOSTRAGEM....................................... 59
2.2 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE SANGUE E QUESTIONÁRIO
EPIDEMIOLOGICO...........................................
61
2.3 CONFECÇÃO DAS LÂMINAS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
INDIRETA......................................................................................
61
2.4 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (RIFI)........... 62
2.5 ANÁLISE DOS DADOS.................................................................. 62
3
RESULTADOS...............................................................................
63
4
DISCUSSÃO..................................................................................
71
CAPITULO IV.................................................................................
74
1
INTRODUÇÃO...............................................................................
74
2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................... 77
2.1 LOCAL DO ESTUDO..................................................................... 77
2.2 AMOSTRAGEM E COLHEITA DE CARRAPATOS....................... 77
2.3 EXTRAÇÂO DE DNA DOS CÃES SUSPEITOS E DOS
CARRAPATOS...............................................................................
78
2.4 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR)...................... 79
2.5 SEQÜENCIAMENTO...................................................................... 80
2.6 PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO E ANALISE ESTATISTICA......... 80
3
RESULTADOS...............................................................................
81
3.1 COLEÇÃO DE CARRAPATOS...................................................... 81
3.2 PCR E FMI..................................................................................... 81
3.3 SEQUENCIAMENTO...................................................................... 83
4
DISCUSSÃO...................................................................................
84
REFERÊNCIAS..............................................................................
87
1 INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, a erliquiose tem sido identificada como causa crescente
de morbi-mortalidade de caninos e, em alguns países, do homem, em virtude da
maior exposição a locais onde é comum a presença de carrapatos. A erliquiose
canina é uma doença infecciosa severa, que acomete cães (Canis familiaris),
causada por bactérias do gênero Ehrlichia, sendo a principal espécie a Ehrlichia
canis. Sua ocorrência vem aumentando significativamente nos últimos anos em
todas as regiões do Brasil e está veiculado ao seu vetor, o carrapato Rhipicephalus
sanguineus, conhecido como o “carrapato marrom do cão”, que se encontra
disseminado por toda área urbana do Brasil (LABRUNA; PEREIRA, 2001).
A erliquiose canina no Brasil vem apresentando casuística crescente em
hospitais e clínicas veterinárias, sendo considerada por muitos como uma das mais
importantes doenças transmissíveis na clinica de pequenos animais, principalmente
pela elevada infestação do carrapato vetor, e pela inexistência de vacina.
O reconhecimento da erliquiose, como potencial causa de doença em
humanos na década de 80, estimulou as pesquisas desse agente. A detecção de
outras espécies próximas, combinada com a aplicação cada vez maior de técnicas
de biologia molecular, culminou num maior número de publicações e descobertas,
que resultaram na reclassificação das erliquias (COHN, 2003).
Dumler et al. (2001), incorporando informações de biologia molecular
referentes aos genes 16S rRNA e groESL, reclassificaram a família
Anaplasmataceae. Algumas espécies foram transferidas para o gênero Anaplasma:
Anaplasma platys (antiga E. platys), A. phagocytophilum (junção entre E. equi e E.
phagocytophila), A. bovis (antiga E. bovis); outras para o gênero Neorickettsia:
Neorickettsia risticii (antiga E. risticii) e N. sennetsu (antiga E. sennetsu). Por outro
lado, a espécie Cowdria ruminantium foi inserida no gênero Ehrlichia, passando a
ser E. ruminantium.
Atualmente o gênero Ehrlichia contempla seis espécies: E. canis, E.
chaffeensis, E. ewingii, E. muris e E. ruminantium (DUMLER et al., 2001). Uma
possível sexta espécie foi identificada recentemente por Shibata et al. (2000) no
Japão, onde foi isolada de carrapatos Ixodes ovatus, sendo designada como
Ehrlichia OIE. São bactérias gram-negativas, parasitas intracelular obrigatórias de
células hematopoiéticas maduras ou imaturas, especialmente do sistema fagocitário
mononuclear, tais como monócitos e macrófagos, e para algumas espécies,
neutrófilos e células endoteliais (DUMLER et al., 2001).
A única espécie descrita até o momento no Brasil é E. canis, agente
etiológico da erliquiose monocítica canina (EMC). Seu primeiro relato no país foi feito
por Costa et al. (1973) em Belo Horizonte. A doença vem sendo relatada em vários
estados, acometendo aproximadamente 20 a 30% dos cães atendidos em hospitais
e clínicas veterinárias (BULLA et al., 2004; DAGNONE et al., 2003; LABARTHE et
al., 2003; TRAPP et al., 2002).
O ciclo da E. canis, começa com a inoculação do agente no cão pelo
carrapato R. sanguineus, no momento do repasto sanguíneo. A E. canis penetra nas
células mononucleares sob a forma de corpúsculos elementares. Posteriormente,
multiplica-se nos fagolisossomos celulares desenvolvendo seguidamente em dois
estágios, os corpúsculos iniciais e as mórulas (POPOV et al., 1998; SANTÁREM,
2003).
A patogenia da erliquiose canina envolve um período de incubação de oito a
20 dias. A doença é caracterizada por ser multissistêmica, de sintomatologia
complexa, que varia na intensidade de acordo com as fases da doença: aguda,
assintomática (subclínica) e crônica. Em infecções experimentais, é possível
diferenciar as três fases, mas em animais naturalmente infectados, é difícil definir a
fase da doença, uma vez que a apresentação clínica e os achados laboratoriais são
similares e a duração e severidade dos sinais clínicos é variável (HARRUS et al.,
1997; SANTARÉM, 2003).
Mecanismos inflamatórios e imunológicos estão envolvidos na patogenia da
doença. Estes incluem intensa infiltração leucocitária em órgãos parenquimatosos,
manguitos perivasculares (particularmente nos pulmões, rins, baço, meninges e
olhos), hemaglutinação e hipergamaglobulinemia. A demonstração de anticorpos
anti-plaquetários em cães experimentalmente infectados por E. canis reforça a teoria
de que a doença possuiu um componente imunopatológico (HARRUS et al., 1997).
No Brasil, o isolado Jaboticabal de E. canis foi recentemente estudado do ponto de
vista clínico, patológico e imunológico (CASTRO et al., 2004; HASEGAWA, 2005),
onde foi confirmada a teoria do envolvimento imunopatológico na erliquiose canina.
O carrapato se infecta ao ingerir leucócitos circulantes contendo o agente.
Isto geralmente ocorre na segunda ou terceira semana de infecção do cão (fase
aguda), pois no início há maior quantidade de leucócitos infectados. A E. canis se
multiplica nas células epiteliais do intestino, hemócitos e nas células das glândulas
salivares. Ocorre transmissão transestadial, mas não transovariana, fazendo do cão
o principal reservatório do agente. Dessa forma, a transmissão para o hospedeiro
vertebrado ocorre pelos estágios de ninfa e adulto (GROVES et al., 1975).
Recentemente, Bremer et al. (2005) experimentalmente demonstraram que machos
adultos de R. sanguineus, sem a presença da fêmea, podem se infectar e transmitir
(transmissão intraestadial) a doença a diferentes cães de um mesmo local.
Poucos estudos têm avaliado a freqüência da infecção por E. canis em R.
sanguineus, ainda assim sem resultados relevantes (INOKUMA et al., 2003; SARIH
et al., 2005). Outros dois estudos avaliaram carrapatos de diferentes cães e sem
número representativo para uma população inteira (MURPHY et al., 1998; UNVER et
al., 2001). No Brasil, a presença de E. canis em carrapatos ainda não foi realizada.
Ao contrário do que ocorre com a EMC, a prevalência de carrapatos A.
americanum infectados por E. chaffeensis ou E. ewingii nos Estados Unidos tem
sido verificada em diversos trabalhos, variando entre 0,5 a 10% (BURKET et al.,
1998; WHITLOCK et al., 2000; WOLF et al., 2000).
E. canis pode ser cultivada in vitro em células DH82 (dog histiocytosis),
linhagem originária de monócitos caninos, que foi adaptada após um caso de
histiocitoma (WELLMAN et al., 1988). Até o momento, são vários os isolados de E.
canis cultivados e geneticamente caracterizados. Na América do Sul, a Venezuela é
o único país onde o mesmo agente foi isolado de cães e humano, sendo também
caracterizados geneticamente (UNVER et al., 2001). No Brasil, Torres et al. (2002)
na cidade do Rio de Janeiro, isolaram E. canis em células DH82 a partir de um cão
experimentalmente infectado com um isolado local.
No tocante a caracterização molecular de amostras brasileiras, Machado
(2004) e Rosa (2005) verificaram haver similaridade entre amostras Brasileiras de E.
canis e a de outros paises. Estes autores compararam as seqüências parciais dos
genes 16S rRNA do isolado Jaboticabal e dsb de cepas oriundas da grande São
Paulo com as correspondentes de outros isolados mundiais disponíveis no
GenBank.
A propagação de E. canis em cultura celular tem sido a base para produção
de antígenos a serem aplicados em testes sorológicos (PADOCK; CHILDS, 2003).
Atualmente a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) é o teste mais utilizado
para a pesquisa de anticorpos anti-E. canis. Entretanto, não há consenso no ponto
de corte utilizado na reação sorológica. Segundo Harrus et al. (1997) soros
reagentes na diluição 1:40 são considerados positivos e o aumento significativo no
título de anticorpos indica infecção ativa, sendo recomendados testes sorológicos
pareados para confirmar a suspeita clínica.
McBride et al. (2001), avaliando por “Western blotting” a reatividade de
diferentes proteínas de membrana (P28 e P43) de E. canis, verificaram boa
correlação com a RIFI (≥ 40). A proteína P43 apresentou 100% de sensibilidade e
85% de especificidade quando comparada à RIFI, enquanto a P28 apresentou
sensibilidade de 96% e especificidade de 100%. Entretanto, a RIFI empregada am
alguns inquéritos epidemiológicos utilizaram diluições iniciais de 1:20, conforme
demonstrado no quadro 1.
Quadro 1 - Ocorrência de anticorpos anti-Ehrlichia canis em cães oriundos de diversas
partes do mundo. São Paulo - 2006
Local Ano Cães % Titulo Referência
testados Positivos
E.U.A. 1986/87 259 138 53 1:10 Rodger et al. (1989)
Zimbábue 1992 105 37 52 1:20 Mathewman et al. (1993)
Espanha 1993/94 308 59 19 1:20 Sáinz et al. (1996)
Israel 1996 410 123 30 1:20 Baneth et al. (1996)
Suíça 1991/98 996 22 02 1:20 Pusterla et al. (1998)
Austrália 1996/99 316 07 02 1:20 Mason et al. (2001)
Costa do Marfim 2003 137 93 68 1:80 Davoust et al. (2005)
Gabão 2003 253 08 03 1:80 Davoust et al. (2005)
Camarôes 2005 104 33 32 1:64 Ndip et al. (2005)
Estudos epidemiológicos sobre a infecção de cães por E. canis no Brasil,
vêm sendo realizados envolvendo a clinica da doença, a idade, sexo e raça dos
cães ou mesmo a presença de carrapatos, na tentativa de se estabelecer fatores de
riscos para a infecção (DAGNONE et al., 2003; SANTARÉM, 2003; TRAPP et al.,
2002). Entretanto, se não ausentes, são raros os estudos avaliando a prevalência da
infecção por E. canis em cães e carrapatos no Brasil.
Dada a indiscutível relevância da EMC na clínica veterinária, o presente
estudo foi elaborado com vistas a obter informações sobre a epidemiologia da
doença no Brasil, caracterizando isolados nacionais, e conhecendo os índices de
infecção em cães e carrapatos.
Em especial foram avaliados:
I. Isolamento de E. canis em células DH82, a partir de cão
experimentalmente infectado com o isolado Jaboticabal;
II. Isolamento e caracterização molecular de um novo isolado local, a
partir de cão naturalmente infectado atendido no Hospital Veterinário (HOVET) da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade de São
Paulo (USP);
III. Padronização da RIFI a partir do isolado Jaboticabal para determinar a
prevalência de anticorpos anti-E. canis em cães das zonas urbana e rural do
município de Monte Negro, RO;
IV. Determinar pela PCR a freqüência de infecção por E. canis em
diferentes populações de carrapatos R. sanguineus.
CAPITULO I
PADRONIZAÇÃO DO ISOLAMENTO E CULTIVO IN VITRO DE Ehrlichia canis
(RICKETTSIALES: ANAPLASMATACEAE).
1 INTRODUÇÃO
O gênero Ehrlichia, atualmente compreende cinco espécies: Ehrlichia canis,
E. chaffeensis, E. ewingii, E. muris e E. ruminantium (DUMLER et al. 2001). Uma
possível sexta espécie foi identificada recentemente de carrapatos Ixodes ovatus no
Japão, sendo designada como Ehrlichia OIE (SHIBATA et al., 2000). São bactérias
gram-negativas, parasitas intracelulares obrigatórios de células hematopoiéticas
maduras ou imaturas, especialmente do sistema fagocitário mononuclear, como
monócitos e macrófagos e para algumas espécies, em neutrófilos e células
endoteliais (DUMLER et al., 2001).
No Brasil, a única espécie descrita até o momento é E. canis, responsável
pela erliquiose monocítica canina (EMC), doença considerada endêmica
principalmente nas áreas urbanas, onde abundam populações do carrapato vetor,
Rhipicephalus sanguineus (LABRUNA; PEREIRA, 2001). Em Belo Horizonte, foi por
Costa et al. (1973) que a doença foi primeiramente diagnosticada no Brasil. Desde
então vem sendo relatada acometendo aproximadamente 20 a 30% dos cães (Canis
familiaris) atendidos em hospitais e clínicas veterinárias de estados das regiões
nordeste, sudeste, sul e centro-oeste (BULLA et al., 2004; DAGNONE et al., 2003;
LABARTHE et al., 2003; TRAPP et al., 2002).
A E. canis pode ser cultivada in vitro em células DH82 (dog histiocytosis),
linhagem originária de monócitos caninos, que foi adaptada em cultivo celular a
partir de células obtidas de um caso de histiocitoma (WELLMAN et al., 1988). Até o
momento, são vários os isolados de E. canis cultivados in vitro e geneticamente
caracterizados na América do Norte e no Velho Mundo. No caso da América Latina,
o isolamento in vitro de E. canis de cães, foi relatado apenas na Venezuela (UNVER
et al., 2001) e no Brasil por Torres et al. (2002) no Rio de Janeiro. Na Venezuela, há
pelo menos seis casos clínicos descritos de erliquiose humana causada por E. canis,
indicando que este agente pode causar infecções no homem (PEREZ et al., 2005).
A propagação de E. canis em cultura celular tem sido a base para produção
de antígenos a serem aplicados em testes sorológicos (PADOCK; CHILDS, 2003). A
Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) é o teste mais utilizado para a
pesquisa de anticorpos anti-E. canis. Por outro lado, o diagnóstico direto da
erliquiose canina, por meio de exames citológicos do sangue, vem sendo
frequentemente utilizado na clínica veterinária. Todavia, esta técnica resulta
freqüentemente em resultados falsos negativos (HARRUS et al., 1997). Para tentar
minimizar esta desvantagem, a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) tem sido
utilizada e vem se mostrando sensível e específica para o diagnóstico da erliquiose
canina. La Scola e Raoult (1997), relataram que a PCR é técnica de eleição para o
diagnóstico da erliquiose canina, pois pode detectar o agente mesmo antes da
formação de mórulas ou de soroconversão.
A recente caracterização molecular do gênero Ehrlichia tem identificado
novos genes como alvos para ensaios moleculares. O gene Thio-dissulfóxido-
oxiredutase foi caracterizado em várias bactérias, sendo recentemente identificada
no gênero Ehrlichia (MCBRIDE et al., 2002). Este gene codifica proteínas
responsáveis pelas ligações dissulfídicas (disulfide bond - dsb) das bactérias.
Apesar disso, é muito divergente entre as bactérias, sendo útil para ensaios
moleculares de alta especificidade (KUYLER DOYLE et al., 2005a). A PCR do gene
dsb de Ehrlichia mostrou-se altamente específico, já que é altamente divergente dos
outros gêneros de bactérias, mesmo daquelas filogeneticamente mais próximas
(KUYLER DOYLE et al., 2005a).
Visando a obtenção de novos isolados nacionais, este trabalho relata a
padronização de um método de isolamento de E. canis em cultivo de células DH82,
a partir do isolado Jaboticabal e da utilização da PCR do gene dsb de Ehrlichia spp
na identificação e caracterização do agente.
2 MATERIAL E MÉTODOS
Neste experimento, foi inoculado um cão com a cepa Jaboticabal de E.
canis, para tentativa de isolamento em cultura celular, como segue adiante.
2.1 ORIGEM DO ISOLADO E OBTENÇÃO DO INOCULO DE E. canis
Uma cepa de E. canis foi isolada de um cão fêmea da raça Weimaraner, em
fase aguda da doença (informação verbal
1
), na cidade de Jaboticabal-SP, sendo
mantida até o presente por passagens em cães, através da inoculação de sangue
infectado e de amostras de sangue infectado congelado. Esta cepa foi designada
como isolado Jaboticabal.
Para o presente estudo, uma cadela saudável, sem raça definida, de
aproximadamente três anos, vermifugada, vacinada contra as principais doenças
caninas e com exame de PCR (gene dsb, protocolo descrito abaixo) negativo para
erliquiose, foi inoculada com 5 ml de sangue canino infectado com a cepa
Jaboticabal de E. canis. Após a inoculação, a cadela foi acompanhada diariamente,
até o aparecimento dos sinais clínicos da erliquiose (anorexia, apatia,
linfoadenopatia e febre), quando foram realizados exame hematológico e PCR.
Paralelamente, foram realizados esfregaços de sangue periférico, corados pelo Kit
Panótico Rápido (Laborclin
®
), para visualização de estruturas compatíveis com E.
canis (mórulas). Quando positivo na PCR, foram amostrados 10 ml de sangue
heparinizado para fins de isolamento.
1
Informação fornecida por Machado, R. Z. (FCAV-UNESP Campus de Jaboticabal) em 2004.
2.2 INOCULAÇÃO EM CÉLULAS DH82.
A amostra de sangue positiva na PCR foi processada para o isolamento de
leucócitos, utilizando o protocolo descrito por Paddock et al. (1997), baseado no uso
de Histopaque 1083 (Sigma Diagnostics, St. Luis, Mo). Os leucócitos foram então
inoculados em monocamadas de células DH82, repicadas três dias antes e mantidas
a 37
o
C e 5% de CO
2
. Para o crescimento e manutenção celular foi utilizado o meio
Dulbecco´s, Modified Eagle´s (Sigma Aldrich
®
) acrescido de 5% de soro de bezerro
(Bovine Calf Serum – BCS; Hyclone
®
), renovado parcialmente a cada 3-4dias.
A monocamada inoculada foi acompanhada após a segunda semana, à
cada 5-6 dias por exames citológicos, corados com o Kit Panótico rápido (Laborclin
®
)
e pela PCR do gene dsb para confirmação da infecção. Quando a monocamada
desta primeira passagem apresentou no mínimo de 50% de infecção, alíquotas de
seu sobrenadante foram inoculadas em novas monocamadas não infectadas, a fim
de estabelecer novas passagens. Este procedimento foi realizado em passagens
subseqüentes, até que a monocamada apresentasse 90 a 100% de infecção dentro
de poucos dias após a inoculação, implicando no estabelecimento do isolado em
cultivo celular.
2.3 EXTRAÇÃO DE DNA
A extração de DNA do sangue do cão inoculado e da monocamada infectada foi
realizada com kit de extração “DNeasy Tissue Kit” (Qiagen, Chatsworth, Ca)
conforme manual de instrução.
2.4 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR)
Foi utilizada uma PCR contendo: 100-400 ng de DNA; 0,2 mM de cada
nucleotídeo dATP, dTTP, dCTP e dGTP (Promega
®
); 0,4 µM de cada iniciador
(primer) dsb: Dsb–330 (senso: 5’-GAT GAT GTC TGA AGA TAT GAA ACA AAT-3’) e
Dsb-729 (anti-senso; 5’-CTG CTC GTC TAT TTT ACT TCT TAA AGT-3’); 1,25 U de
Taq Polimerase (Platinum
®
Taq DNA polymerase - Invitrogen); solução tampão (pH
8,4) contendo 50 mM de KCL; 20 mM Tris-HCL e 3 mM de MgCl
2
. O volume foi
completado com água MilliQ autoclavada para completar 50µl e a amplificação foi
efetuada em termociclador automático (Eppendorf
®
). Em cada série, foram incluídos
controles positivo (DNA de E.chaffeensis) e negativo (água).
Inicialmente, as amostras foram desnaturadas a 95
o
C por dois minutos,
seguida de uma seqüência de 50 ciclos repetidos de 15 segundos a 95
o
C
(desnaturação das fitas de DNA), 30 segundos a 58
o
C (pareamento dos “primers”) e
30 segundos a 72
o
C (extensão da cadeia), seguidos de cinco minutos de extensão
final a 72
o
C. Os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em gel
de agarose 1,5-2% em ácido-EDTA tris-bórico tamponado, revelados com brometo
de etídio em transiluminação ultravioleta. Compararam-se os fragmentos
amplificados, com marcadores de DNA de 100 pares de base (pb; Fermentas Life
Science
®
, Burlington, On), considerando como positivas amostras cujos produtos
apresentaram tamanho aproximado de 409 pb.
2.5 SEQUENCIAMENTO
Os produtos amplificados foram seqüenciados para confirmar a identidade
da espécie de Ehrlichia. As seqüências de nucleotídeos dos fragmentos amplificados
foram analisadas em seqüenciador automático de DNA modelo ABI Prism 310
Genetic Analyser (Applied Biosystens/Perkin Elmer), segundo seu manual de
instruções. As seqüências obtidas foram alinhadas com outra seqüência
correspondente de E. canis, disponível no GenBank, utilizando-se o programa
MegAlign do pacote DNAstar (Lasergene). O número de acesso da seqüência de
dsb obtida no GenBank usada para comparação é AF403710, correspondente ao
isolado Jake de E. canis.
3 RESULTADOS
Os resultados foram descritos por etapa para uma melhor compreensão.
3.1 ISOLAMENTO DE E. canis EM CÉLULAS DH82
Após a inoculação da cadela com o isolado Jaboticabal de E. canis, a
doença foi manifestada com alterações clínicas (apatia, febre e linfoadenopatia) a
partir de 14 dias. O exame hematológico apresentou: hemácias: 6,1 x 10
6
/mm
3
;
hematócrito: 40%; contagem total de leucócitos: 3.000/mm
3
; plaquetas 47.000/mm
3
.
Neste momento, verificou-se o aparecimento de mórulas em monócitos sanguíneos
(Figura 1) quando houve também a confirmação pela PCR.
Figura 1 – Fotomicrografia de monócito canino infectado por
Ehrlichia canis sob a forma de mórula (seta) aos 14
dias pós-inoculação. Panótico rápido (Laborclin
®
); 100X
No 15
o
dia pós-inoculação, durante o pico febril de 41
o
C, foram amostrados
10 ml de sangue heparinizado, que foi processado para ser inoculado numa
monocamada de células DH82 não infectada. No 27
o
dia pós-inoculação, obteve-se
o primeiro resultado positivo na PCR (Figura 2), confirmando o isolamento com a
visualização de mórulas no exame citológico aos 28 dias (Figura 3). No 33
o
dia pós-
inoculação, observou-se 20% de células infectadas e aos 53 dias, 60% de infecção.
Figura 2 - Amplificação de um fragmento do gene dsb de Ehrlichia sp,
correspondente a 409 pares de bases (pb), em gel de
eletroforese corado com brometo de etídio. Linha 1: sangue do
cão doador antes de receber o inoculo de E. canis; Linha 2:
sangue do cão aos 14 dias pós-inoculação. Linha 3:
monocamada de células DH82 infectadas com E. canis no 27
o
dia pós-inoculação. Linhas 4 e 5: controles negativos; Linha 6:
marcador de peso molecular (100 pb)
A partir da segunda passagem, amostras de células infectadas foram
criopreservada a –80
o
C, em soro de bezerro com Dimetilsulfóxido (DMSO) a 10%.
Atualmente, o isolado encontra-se estabelecido em células DH82, com várias
passagens atingindo 90-100% de infecção dentro de 7-10 dias após a inoculação.
Figura 3 - Fotomicrografias de células DH82 provenientes de monocamada
inoculada com o isolado de Jaboticabal, SP apresentando mórulas
de Ehrlichia canis (setas) aos 28 dias pós-inoculação. Panótico
rápido (Laborclin
®
); 100X
3.2 SEQUENCIAMENTO
Após exclusão das porções correspondentes aos primers dos produtos
amplificados do sangue do cão inoculado e do cultivo celular (primeira e quarta
passagens), obteve-se um fragmento de 355 nucleotídeos de cada produto da PCR.
As seqüências foram idênticas entre si, e quando comparadas com as seqüências
disponíveis no GenBank, apresentaram 100% de similaridade com a seqüência de
E. canis AF403710. O código de acesso da seqüência de nucleotídeos do gene dsb
do isolado Jaboticabal no GenBank é DQ460716.
4 DISCUSSÃO
O presente trabalho relata o cultivo in vitro de E. canis em células DH82,
proveniente de cão experimentalmente infectado com a amostra Jaboticabal. Em
estudo prévio, Torres et al. (2002) também obtiveram êxito no isolamento de uma
amostra de E. canis na cidade do Rio de Janeiro, utilizando protocolo semelhante,
separando a fração leucocitária com auxílio de Histopaque 1077 (Sigma Diagnostics,
St. Luis, Mo).
Durante a infecção experimental por E. canis no presente trabalho, a
observação do início dos sintomas clínicos da erliquiose teve início aos 14 dias pós-
inoculação. Este resultado encontra-se dentro do esperado, conforme relatado por
Castro et al. (2004) e Machado (2004) e confirmado por Hasegawa, (2005). O
resultado de hemograma, feito no momento em que o cão apresentou sinais clínicos,
foi compatível ao relatado na literatura (HARRUS et al., 1997; MACHADO, 2004), a
exceção das hemácias que se mantiveram acima dos valores relatados por Castro et
al. (2004). Vale ressaltar que este isolado foi recentemente estudado do ponto de
vista clínico, patológico e imunológico (CASTRO et al., 2004; HASEGAWA, 2005).
O cultivo in vitro de E. canis vem sendo realizado em diversas partes do
mundo (KEYSARY et al., 1996; TORRES et al., 2002; UNVER et al., 2001), em
células de linhagem originária de histiocitoma canino – DH82. Outras linhagens
celulares têm se mostrado útil para o isolamento in vitro de E. canis, como
macrófago peritoneal canino (STEPHENSON; OSTERMAN, 1977), monócito
primário canino (HEMELT et al., 1980), célula endotelial humana (DAWSON et al.,
1993) e células macrofágicas de camundongos BALB/C (KEYSARY et al., 2001). Os
isolamentos foram importantes para obtenção de diferentes isolados, o que
possibilitou a comparação de várias estirpes de E. canis (UNVER et al., 2001).
O isolamento em cultivo celular se mostrou positivo no 27
o
dia pós-
inoculação pela PCR. Aos 28 dias, foi observada a presença de mórulas no
citoplasma celular. Aguirre et al. (2004) e Dawson et al. (1991) apresentaram
resultados semelhantes a este estudo, com a visualização de mórulas aos 30 e 24
dias pós-inoculação. Com base nas observações de Iqbal e Rikihisa (1994), o tempo
requerido para a cultura se tornar positiva, está diretamente relacionada com o
número de monócitos infectados no inóculo. Torres et al. (2002) realizaram o cultivo
primário de leucócitos caninos, antes de inocular em células DH82, e com isso
observou positividade aos 14º dia pós-inoculação.
No acompanhamento da cultura da primeira passagem foi observado no 33
o
dia pós-inoculação 20% de células infectadas e aos 53 dias, 60% de infecção.
Torres et al. (2002) observaram 30% de infecção no 28
o
dia e 60% no 42
o
dia pós-
inoculação. Estas diferenças ocorrem em virtude de diversos fatores, como o
tamanho do inóculo, diferenças entre meio de cultura, uso de antibióticos e o método
utilizado para a observação das mórulas (IQBAL; RIKIHISA, 1994).
A amplificação de porções do gene dsb de Ehrlichia spp mostrou-se útil para
a detecção molecular do agente. Kuyler Doyle et al. (2005a), durante a padronização
desta PCR, demonstraram que a amplificação do gene dsb apresentou sensibilidade
e especificidade similares a amplificação do gene 16S rRNA, quando utilizadas em
amostras clínicas. Além do mais, a PCR do gene dsb de Ehrlichia spp, apresentou
sensibilidade para uma única cópia deste gene em E. cheffeensis e 10 cópias em E.
canis (informação verbal
2
). O gene dsb, recentemente foi alvo de novos estudos
2
Informação fornecida por Labruna, M. B. (FMVZ- USP, campus de São Paulo) em 2004.
epidemiológicos e filogenéticos no Brasil (ROSA, 2005) e em Camarões (NDIP et al.,
2005).
O seqüenciamento de um fragmento do gene dsb do isolado Jaboticabal,
quando comparado com as seqüências disponíveis no GenBank, apresentou-se
idêntico a um isolado norte americano (GenBank: AF403710). Recentemente, Rosa
(2005) e Ndip et al. (2005), também apresentaram resultados semelhantes aos deste
estudo. O gene dsb é altamente variado (variando entre 69,5 – 91,5%) entre as
espécies, porém as seqüências de E. canis disponíveis no GenBank são todas
idênticas. Recentemente, o isolado Jaboticabal teve seu fragmento de 398 pb do
gene 16S rRNA, seqüenciado, demonstrando também identidade com a seqüência
correspondente de 16S rRNA de E. canis depositada no GenBank (MACHADO,
2004), o que reforça a possibilidade dos isolados do continente americano
apresentarem pouco polimorfismo.
O presente isolado de E. canis encontra-se depositado na Coleção de
Erlíquias e Riquétsias do Laboratório de Doenças Parasitárias do Departamento de
Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Destaca-se neste trabalho, a
manutenção contínua do isolado Jaboticabal de E. canis em células DH82.
Conseqüentemente, sua manutenção será utilizada na produção de antígenos para
o diagnóstico complementar da erliquiose canina brasileira.
CAPITULO II
ISOLAMENTO IN VITRO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UM NOVO
ISOLADO DE Ehrlichia canis (Rickettsiales: Anaplasmataceae).
1 INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, a erliquiose tem sido identificada como causa crescente
de morbi-mortalidade de caninos e, em alguns países, do homem, em virtude da
maior exposição a locais onde é comum a presença de carrapatos. A erliquiose
canina é uma doença infecciosa severa, que acomete cães (Canis familiaris),
causada por bactérias do gênero Ehrlichia. Este gênero comporta as espécies E.
canis, E. chaffeensis, E. ewingii, E. muris e E. ruminantium (DUMLER et al., 2001).
Uma possível sexta espécie foi isolada de carrapatos Ixodes ovatus no Japão, e foi
designada como Ehrlichia OIE (SHIBATA et al., 2000).
A erliquiose canina caracteriza-se por uma doença multissistêmica, de
sintomatologia complexa, que varia na intensidade, de acordo com a fase clínica da
doença (COHN, 2003). Esta ampla variação do quadro clínico, aliado ao longo
período de portador e a natureza nidícola do Rhipicephalus sanguineus,
contribuíram para a disseminação da E. canis, tornando-a uma das doenças
infecciosas mais diagnosticadas nos países tropicais (HASEGAWA, 2005).
No Brasil, a doença é considerada enzoótica. Segundo dados de
estimativas recentes, obtidas por Trapp et al. (2002), Dagnone et al. (2003),
Labarthe et al. (2003) e Bulla et al. (2004), a erliquiose canina vem acometendo
aproximadamente 20 a 30% dos cães atendidos em hospitais e clínicas veterinárias
de vários estados do Brasil.
A E. canis é cultivada in vitro em células DH82 (dog histiocytosis), linhagem
originária de monócitos caninos, que foi adaptada em cultivo celular a partir de
células obtidas de um caso de histiocitoma (WELLMAN et al., 1988). Até o momento,
são vários os isolados de E. canis cultivados in vitro e geneticamente caracterizados
(MCBRIDE et al., 1999; UNVER et al., 2001). A Venezuela é o único país onde E.
canis foi identificada simultaneamente em cães, humanos e carrapatos R.
sanguineus, confirmando o papel zoonótico de E. canis (PEREZ et al., 2005; UNVER
et al., 2001).
No tocante à identificação taxonômica da E. canis, técnicas moleculares de
seqüenciamento têm sido freqüentemente empregadas, já que este método
possibilita também uma análise comparativa entre os diversos isolados de E. canis
encontrados na literatura, através de um banco genético disponível mundialmente -
Genbank (UNVER et al., 2001; ZHANG et al., 2003).
O gene 16S rRNA tem sido utilizado freqüentemente para detecção e
caracterização de Ehrlichia spp em carrapatos e amostras clinicas de humanos e
animais (PADDOCK; CHILDS, 2003). Entretanto, como o gene 16S rRNA é
altamente conservado em todas as espécies de bactérias, os diferentes isolados
mundiais de E.canis obtidos in vitro, quando avaliados geneticamente, apresentaram
pouco polimorfismo genético (AGUIRRE et al., 2004). No Brasil, a amostra de E.
canis da cidade de Jaboticabal, SP, foi seqüenciada segundo um fragmento de 398
pares de bases (pb) do gene 16SrRNA, demonstrando identidade com as
seqüências de E. canis disponíveis no GenBank (MACHADO, 2004).
McBride et al. (1999), comparando o gene p28 de sete isolados de E. canis
dos EUA, observaram completa conservação deste gene, sugerindo a inexistência
de variação antigênica entre os isolados norte-americanos. A proteína p28 é
considerada forte candidata a ser base para uma futura vacina para a prevenção da
erliquiose canina.
O gene Thio-dissulfóxido-oxiredutase (dsb) foi caracterizado em várias
bactérias, sendo recentemente identificado no gênero Ehrlichia. Este gene codifica
proteínas responsáveis pelas ligações dissulfídicas (disulfide bond - pdsb) e por isso
possui domínios protéicos que são funcionalmente conservados entre diferentes
bactérias (MCBRIDE et al., 2002). Entretanto, a seqüência de nucleotídeos, que
codifica esta proteína, diverge significamente entre os diferentes gêneros
bacterianos. Por esse motivo, o gene dsb é um excelente alvo para ensaios
moleculares de alta especificidade (KUYLER DOYLE et al., 2005a).
Decorrente da escassez de estudos filogenéticos sobre E. canis no Brasil,
este trabalho visou relatar um novo isolamento in vitro de E. canis em células DH82,
a partir de um cão naturalmente infectado, seguido da caracterização molecular dos
genes dsb, 16S rRNA e P28.
2 MATERIAL E MÉTODOS
Para este experimento, foi utilizado um cão atendido no Hospital Veterinário
(HOVET) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São
Paulo (FMVZ/USP) com suspeita clinica de erliquiose canina.
2.1 ORIGEM DO ISOLADO DE E. canis
Um cão macho, da raça Labrador, de sete anos, foi atendido pela Clinica
Médica do HOVET (FMVZ/USP), apresentando apatia, anorexia, hematoquesia e
histórico recente de infestação pelo carrapato R. sanguineus. O animal tinha sido
recentemente tratado para erliquiose canina com Doxiciclina (10 mg/Kg, bid/21 dias)
e duas aplicações de Imidorcarb (5mg/Kg) a intervalos de 14 dias. Porém,
apresentou recidiva clínica 21 dias após o termino do tratamento. No momento do
atendimento, foram obtidas amostras de sangue para exame hematológico,
pesquisa do agente pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) do gene dsb de
Ehrlichia spp e para tentativa de isolamento em cultivo celular.
2.2 ISOLAMENTO EM CULTIVO DE CÉLULAS DH82
A amostra de sangue destinada ao isolamento foi processada utilizando o
protocolo descrito por Paddock et al. (1997), baseado no uso de Histopaque 1083
(Sigma Diagnostics, St. Luis, Mo). Os leucócitos foram no primeiro momento,
ressuspendido em 5 ml de meio Dulbecco´s, Modified Eagle´s (Sigma Aldrich
®
)
acrescido de 10% de soro de bezerro (Bovine Calf Serum – BCS; Hyclone
®
) em
frasco de 25 cm
2
(aqui designado como cultivo primário de leucócito canino). Após
24 horas, adicionou-se mais 2 ml do meio de cultura. Paralelamente, vinha sendo
mantido um frasco de monocamada de células DH82 não infectada, com meio
Dulbecco´s Modified Eagle´s acrescido de 5% de soro de bezerro. Após 36 horas, 3
ml do sobrenadante do cultivo primário de leucócito canino foi descartado, sendo
reposto com 3 ml de solução de repique (1:2) da monocamada não infectada. Este
frasco foi mantido em meio Dulbecco´s, Modified Eagle´s acrescido de 5% de soro
de bezerro, renovado parcialmente a cada 3-4dias.
A monocamada inoculada foi acompanhada após a segunda semana, à
cada 5-6 dias por exames citológicos, corados com o Kit Panótico rápido (Laborclin
®
)
e pela PCR do gene dsb para confirmação da infecção. Quando a monocamada
desta primeira passagem apresentou 50% de infecção, alíquotas de seu
sobrenadante foram inoculadas em novas monocamadas não infectadas, a fim de
estabelecer passagens do isolado. Este procedimento foi realizado em passagens
subseqüentes, até que a monocamada apresentasse 90 a 100% de infecção dentro
de poucos dias após a inoculação, implicando no estabelecimento do isolado em
cultivo celular.
2.3 EXTRAÇÃO DE DNA
As extrações de DNA, procedentes do sangue do cão atendido no HOVET e das
monocamadas infectadas foram realizadas com kit de extração “QIAamp Blood
Kit” (Qiagen, Chatsworth, Ca) conforme manual de instrução.
2.4 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR)
Inicialmente, foi realizada a amplificação do gene dsb de Ehrlichia spp
(KUYLER DOYLE et al., 2005a) nas amostras de sangue e na monocamada de
células DH82 infectadas para confirmação da infecção. Após a confirmação do
isolamento, foram realizadas mais duas PCRs a fim de avaliar a seqüência de
nucleotídeos dos genes 16S rRNA (ANDERSON et al., 1992; BREITSCHWERDT et
al., 1998; ROSA, 2005) e P28 (MCBRIDE et al., 1999).
2.4.1 GENE dsb
Para a amplificação do gene dsb de Ehrlichia, utilizou-se uma PCR
contendo: 100-400 ng de DNA; 0,2 mM de cada nucleotídeo dATP, dTTP, dCTP e
dGTP (Promega
®
); 0,4 µM de cada iniciador (primer) dsb: Dsb–330 (senso: 5’-GAT
GAT GTC TGA AGA TAT GAA ACA AAT-3’) e Dsb-729 (anti-senso; 5’-CTG CTC
GTC TAT TTT ACT TCT TAA AGT-3’); 1,25 U de Taq Polimerase (Platinum
®
Taq
DNA polymerase - Invitrogen); solução tampão (pH 8,4) contendo 50 mM de KCL; 20
mM Tris-HCL e 3 mM de MgCl
2
. O volume foi completado com água MilliQ
autoclavada para completar 50µl e a amplificação foi efetuada em termociclador
automático (Eppendorf
®
). Foram incluídos um controle positivo (DNA de E.canis,
cepa Jaboticabal) e um controle negativo (água).
Inicialmente as amostras foram desnaturadas a 95
o
C por dois minutos,
seguida de uma seqüência de 50 ciclos repetidos de 15 segundos a 95
o
C, 30
segundos a 58
o
C e 30 segundos a 72
o
C, seguidos de cinco minutos de extensão
final a 72
o
C.
2.4.2 GENE 16S rRNA
O gene 16S rRNA, foi amplificado numa PCR contendo: 100-400 ng de
DNA; 0,2 mM de cada nucleotídeo dATP, dTTP, dCTP e dGTP (Promega
®
); 0,4 µM
de cada iniciador (primer) GE2’F2’ (senso: 5’-GTT AGT GGC ATA CGG GTG AGT-
3’) (BREITSCHWERDT et al., 1998) e HE3 (anti-senso; 5’-TAT AGG TAC CGT CAT
TAT CTT CCC TAT-3’) (ANDERSON et al., 1992); 1,25 U de Taq Polimerase
(Platinum
®
Taq DNA polymerase - Invitrogen); solução tampão (pH 8,4) contendo 50
mM de KCL; 20 mM Tris-HCL e 3 mM de MgCl
2
. O volume foi completado com água
MilliQ autoclavada para completar 50µl e a amplificação foi efetuada em
termociclador automático (Eppendorf
®
). A amplificação envolveu dois ciclos, que
foram programados juntos. Inicialmente as amostras foram desnaturadas a 94
o
C por
cinco minutos, seguida de uma seqüência de 20 ciclos repetidos de 30 segundos a
94
o
C, 30 segundos a 58
o
C e 30 segundos a 72
o
C. Em seguida dá-se inicio ao
segundo ciclo, com uma seqüência de 40 ciclos repetidos de 30 segundos a 94
o
C,
30 segundos a 56
o
C e 30 segundos a 72
o
C, seguido de cinco minutos de extensão
final a 72
o
C. Foram incluídos um controle positivo (DNA de E. canis, cepa
Jaboticabal) e um controle negativo (água).
2.4.3 GENE P28
Para amplificar fragmentos do gene P28, foi utilizada uma PCR contendo:
100-400 ng de DNA; 0,2 mM de cada nucleotídeo dATP, dTTP, dCTP e dGTP
(Promega
®
); 0,4 µM de cada iniciador (primer), 793’ (senso: 5’-GCA GGA GCT GTT
GGT TAC TC-3’) e 1330 (anti-senso; 5’-CCT TCC TCC AAG TTC TAT GCC-3’); 1,25
U de Taq Polimerase (Platinum
®
Taq DNA polymerase - Invitrogen); solução tampão
(pH 8,4) contendo 50 mM de KCL; 20 mM Tris-HCL e 3 mM de MgCl
2
. O volume foi
completado com água MilliQ autoclavada para completar 50µl e a amplificação foi
efetuada em termociclador automático (Eppendorf
®
). Inicialmente, as amostras foram
desnaturadas a 95
o
C por dois minutos, seguidos de uma seqüência de 30 ciclos
repetidos de 30 segundos a 95
o
C, um minuto a 60
o
C e dois minutos a 72
o
C,
seguidos de cinco minutos de extensão final a 72
o
C. Foram incluídos um controle
positivo (DNA de E.canis, cepa Jaboticabal) e um controle negativo (água).
Os produtos das amplificações foram submetidos à eletroforese em gel de
agarose 1,5-2% em ácido-EDTA Tris-bórico tamponado, revelados com brometo de
etídio em transiluminação ultravioleta. Compararam-se os fragmentos amplificados
com marcadores de DNA de 100 pares de base (pb; Fermentas Life Science
®
),
considerando como positivas, as amostras cujos produtos apresentaram tamanho
aproximado de 409 pb para o gene dsb, 360 pb para o gene 16SrRNA e 518 pb para
o gene P28.
2.5 CLONAGEM DOS GENES 16S rRNA e P28
Os produtos amplificados dos genes 16S rRNA e P28, foram purificados do
gel de agarose com auxilio do Kit de purificação “QIAquick Gel Extraction Kit”
(Qiagen, Chatsworth, Ca) segundo manual de instruções. Os produtos, depois de
purificados, foram clonados em Escherichia coli através do vetor “PCR 2.1-TOPO”
com Kit de clonagem “PCR TOPO TA cloning vector” (Invitrogen, Santa Clarita, Ca)
segundo manual de instruções.
2.6 SEQÜENCIAMENTO DOS GENES dsb, 16S rRNA e P28.
As seqüências de nucleotídeos obtidas do gene dsb, e dos produtos
clonados (mínimo de 3 clones para cada gene) dos genes 16S rRNA e P28, foram
analisadas em seqüenciador automático de DNA modelo ABI Prism 310 Genetic
Analyser (Applied Biosystens/Perkin Elmer), segundo seu manual de instruções.
Para isso, foram utilizados os primers senso e anti-senso de cada gene pesquisado.
As seqüências obtidas foram alinhadas com outra seqüência correspondente de E.
canis, disponível no GenBank, utilizando-se o programa MegAlign do pacote
DNAstar (Lasergene).
2.7 ACESSO ÀS SEQÜÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS E AMINOÁCIDOS
Os números de acessos das seqüências de dsb obtidas no GenBank,
usadas para as comparações foram: AF403710, DQ460716 e DQ124254,
correspondentes aos isolados Jake e Jaboticabal e a cepa camaronesa de E. canis.
As espécies E. chaffeensis (CP000236 e AF403711), E.ewingii (AY428950), E. muris
(AY236484), IOE (AY23485) e E. ruminantium (AF308669) também foram
comparadas à seqüência do gene dsb.
Para comparar a seqüência de nucleotídeos do gene 16S rRNA, utilizou-se
as seqüências correspondentes aos isolados Israeli (U26740), Madrid (AY394465),
Jake (AF403711), Oklahoma (M73221), Flórida (M73226), VDE (AF373613), VHE
(AF373612) e Jaboticabal (DQ460716) e às cepas TW17209 da Tailândia
(DQ228512), Germishuys (U54805) da África do Sul e Kagoshima do Japão
(AF536827). Também foram comparadas, as seqüências dos isolados Arkansas
(AF416764) e Jax de E. chaffeensis (ECU86664), E. ewingii (AY093439), E. muris
(U15527), E. ruminatium (CR925678) e IOE (AB28319).
O produto amplificado do gene P28 foi comparado às seqüências dos
isolados norte-americanos Jake (AF082744) e Oklahoma (AF078553) e a
seqüências dos isolados Jax (AF479840) e Arkansas (AF479833) de E. chaffeensis,
E. ewingii (AF287961), E. muris (AB78804), IOE (AB178802) e E. ruminantium
(AF368012).
A seqüência de aminoácidos da proteína dsb (pdsb) foi comparada ao
isolado de E. canis Jake (AAZ68742) e às espécies E. chaffeensis (YP_507114), E.
muris (AAO92065), IOE (AAO92066), E. ruminantium (ALLO8831) e E. ewingii
(AAR29080). A seqüência de aminoácidos da proteína de membrana p28 foi
comparada aos isolados Oklahoma (AAK28699) e Jake (AAZ68946) de E. canis e à
E. chaffeensis (AAL12921), E. muris (BAD66856), E. ewingii (AAG44897) E.
ruminantium (ABC87920) e IOE (BAD66850).
3 RESULTADOS
Os resultados foram descritos por etapa para uma melhor compreensão.
3.1 CASO CLÍNICO
No momento do atendimento, o cão não apresentava alterações clínicas. A
temperatura retal era normal (38,5
o
C). O exame hematológico apresentou:
hemácias: 4,7 x 10
6
/mm
3
; (5–8
∗
) hematócrito: 33% (37–54); hemoglobina: 10,8 g/dL
(12–18); leucócitos: 4.700 cel/mm
3
(6-17); neutrófilos: 2.444 cel/mm
3
(3.000–11.500);
linfócitos: 1.598 cel/mm
3
(1.500–5.000); monócitos: 658 cel/mm
3
(0–800) e plaquetas
19.000/mm
3
(200–500.000). O exame da PCR do sangue apresentou-se positivo,
amplificando um produto de 409 pb.
3.2 ISOLAMENTO DE E. canis EM CÉLULAS DH82
Aos 14 dias pós-inoculação, a monocamada de células DH82 apresentou-se
positiva à PCR do gene dsb, e as primeiras estruturas foram visualizadas aos 21
dias. Nesta ocasião, constatou-se a presença de pequeno número de mórulas
compatíveis com Ehrlichia spp (Figura 1). Aos 28 dias, a monocamada permaneceu
com a taxa de infecção inalterada (entre 5 e 10%), apresentando resultados
positivos na PCR (Figura 2). O crescimento da taxa de infecção foi lento, apenas
após três meses a monocamada apresentou 90 a 100% de infecção. Porém, após a
∗
Parâmetros normais segundo JAIN, 2000.
adaptação em cultivo celular, este isolado passou a atingir 90-100% de infecção
dentro sete dias após a inoculação.
Figura 1 - Fotomicrografia de células DH82 aos 21 dias pós-inoculação
apresentando mórulas de Ehrlichia canis (setas). Panótico rápido
(Laborclin
®
); 100X
Figura 2 – Eletroforese em gel de agarose (1,5%) dos produtos amplificados
do gene dsb das monocamadas de células DH82 inoculadas
com sangue de cão com erliquiose proveniente do
HOVET/USP. Linha 1: PCR aos 14 dias pós-infecção (dpi); linha
4: PCR aos 28 d.p.i.; linha 7: controle positivo; linhas 02, 03, 05
e 06: controle negativo; 8: Ladder de 100 pares de bases (pb)
1
2
3
4
5
6
7
8
← 409 pb
3.3 SEQÜENCIAMENTO
O presente isolado apresentou-se positivo na PCR dos genes 16S rRNA e
P28 conforme o esperado (Figura 3). Os fragmentos amplificados destes genes
foram clonados, o que permitiu obter fragmentos melhores para a analise de
seqüenciamento.
Figura 3 – Eletroforese em gel de agarose (1,5%) dos produtos amplificados do
gene P28 (linhas 2 e 4; 518 pb) e 16S rRNA (linhas 10 e 12; 360 pb)
do isolado de Ehrlichia canis. Linhas 7 e 15: controles positivos;
linhas 1, 3, 6, 8, 9, 11, 14 e 16: controles negativos; linhas 5 e 13:
Ladder de 100 pares de bases (pb)
1
2
3
4
5
6
7
←← 518 pb
8
9
10
11
12
13
14
15
1
6
← 360 pb
Depois da exclusão das porções correspondentes aos primers, obteve-se
fragmentos de 355 nucleotídeos de cada produto amplificado do gene dsb, 339
nucleotídeos do gene 16S rRNA e 484 nucleotídeos do gene P28. A Tabela 1
apresenta os resultados da Blast Analysis com as seqüências disponíveis no
GenBank. Esta nova cepa foi designada como isolado São Paulo de E. canis.
Os números de acesso no GenBank para as seqüências de nucleotídeos
dos genes estudados são: dsb (DQ460715), 16S rRNA (DQ460714), P28
(DQ460713).
A seqüência de aminoácidos da proteína pdsb apresentou-se idêntica ao
isolado Jake de E. canis (118/118). Frente a outras espécies, apresentou 83,8%
(99/118) de similaridade a E. chaffeensis, 79,6% (94/118) à E. muris, 78,8% (93/118)
à IOE, 74,5% (88/118) à E. ewingii e 72,8% (86/118) à E. ruminantium.
A seqüência de aminoácido da proteína p28 apresentou-se similar aos
isolados Oklahoma 98,7% (159/161) e Jake 99,3% (160/161) de E. canis. Quando
comparada a outras espécies apresentou 81,9% (132/161) similar à E. chaffeensis,
74,5% (120/161) à IOE, 72,6% (117/161) à E. muris, 63,7% (65/102) à E. ewingii e
58,3% (91/156) à E. ruminantium.
Tabela 1 – Similaridade entre o isolado São Paulo de Ehrlichia canis e as diferentes
amostras de Ehrlichia spp, segundo os produtos amplificados dos genes
dsb, 16S rRNA e P28. São Paulo - 2006
% Similaridade (nucleotídeos idênticos/ total nucleotídeos)
Espécie/isolado
Ehrlichia canis São Paulo
dsb
16S rRNA
P28
E. canis Jaboticabal
100,0% (355/355)
na
na
E. canis VDE
na
100,0% (339/339)
na
E. canis VHE
na
100,0% (339/339)
na
E. canis Florida
na
99,7% (338/339)
na
E. canis Jake
100,0% (355/355)
100,0% (339/339)
99,3% (481/484)
E. canis Oklahoma
na
99,7% (338/339)
99,5% (482/484)
E. canis Israel
na
99,7% (338/339)
na
E. canis Madrid
na
100,0% (339/339)
na
E. canis Kagoshima
na
100,0% (339/339)
na
E. canis Tailândia
na
100,0% (339/339)
na
E. canis Camarões
100,0% (355/355)
na
na
E. canis Germishuys
na
99,7% (338/339)
na
E. chaffeensis Arkansas
81,8% (288/352)
98,5% (334/339)
78,5% (351/447)
E. chaffeensis Jax
81,8% (288/352)
98,5% (334/339)
81,8% (384/469)
E. ewingii
76,5% (268/350)
98,2% (333/339)
79,7% (126/158)
E. muris
79,6% (282/354)
97,0% (329/339)
82,4% (281/341)
E. ruminantium
74,0% (259/350)
97,0%(329/339)
75,6% (189/250)
Ehrlichia IOE
79,3% (281/354)
97,3%,(330/339)
82,9% (283/341)
na: não avaliado
A tabela 2 apresenta as posições de divergência entre os nucleotídeos dos
genes 16S rRNA e P28 identificados no isolado São Paulo frente a outras amostras
de E. canis.
Tabela 2 – Diferenças de nucleotídeo dos genes 16S rRNA e P28 do isolado
São Paulo de Ehrlichia canis frente a outros isolados, segundo a
posição no gene estudado. São Paulo - 2006
Posição dos nucleotídeos
a
16S rRNA P28
Isolados de
Ehrlichia canis
97 253 284 126 143 290 403
São Paulo
G C G G G A A
Jake
• • • •
A G G
Oklahoma
A
• •
A A
• •
Flórida
A
• • • • • •
Israeli
• •
nd
• • • •
Germishuys
•
nd
• • • • •
a
Pontos representam nucleotídeos idênticos ao isolado São Paulo de Ehrlichia canis
nd: não determinado
4 DISCUSSÂO
O presente trabalho relata o isolamento de uma nova cepa de E. canis,
procedente de um cão com histórico recente de infecção, atendido no HOVET-
FMVZ/USP. Em estudo anterior, Torres et al. (2002) no Rio de Janeiro, isolaram E.
canis em células DH82, após infecção experimental em cão saudável, com sangue
oriundo de cão clinicamente doente. Este mesmo procedimento foi realizado com
sucesso no Capítulo I deste estudo, com o isolado Jaboticabal de E. canis. Neste
Capítulo, o isolamento foi realizado diretamente a partir de um cão infectado
naturalmente.
O cão atendido apresentou-se normal no momento do exame clínico.
Porém, o exame hematológico revelou discreta anemia (4,7 x 10
6
/mm
3
; hematócrito:
33%) e leucopenia (4.700 cel/mm
3
), mas trombocitopenia acentuada (19.000/mm
3
).
A trombocitopenia é o achado mais freqüente nos cães infectados, enquanto que a
leucopenia parece ocorrer após a segunda e terceira semana pós-infecção
(HASEGAWA, 2005; MACHADO, 2004). Estes resultados sugerem infecção crônica,
pois nesta fase comumente se estabelece a pancitopenia, com acentuada queda do
número de plaquetas (BULLA et al., 2004).
Segundo o histórico clinico, o cão havia sido tratado com 10mg/Kg de
Doxiciclina diariamente por 21 dias e Imidorcarb (5mg/Kg) a intervalos de 14 dias.
Entretanto, houve a recidiva do quadro clínico, três semanas após tratamento.
Nesse intervalo, o proprietário também alegou ter observado a presença de
carrapatos. Ibqal e Rikihisa (1994), já haviam relatado o reisolamento de E. canis em
cães tratados com Doxiciclina, tanto de sangue periférico como de órgão linfóides e
discutiram sobre a possibilidade de falhas no tratamento antimicrobiano. Por outro
lado, há possibilidade do cão ter se reinfectado, pois foi observada a infestação por
carrapatos após o término do tratamento. Sabe-se que o R. sanguineus está apto a
transmitir E. canis por até 155 dias (LEWIS et al., 1977), além do que não há
imunidade efetiva e duradoura contra nova infecção (COHN, 2003). Contudo,
também não há como descartar uma possível falha na execução do tratamento
prescrito pelo veterinário.
A monocamada de células DH82 apresentou-se positiva aos 14 dias pós-
inoculação pela PCR e aos 21 dias no exame citológico, semelhante ao resultado de
Torres et al. (2002) e Keysary et al. (1996), que também realizaram o cultivo primário
de leucócitos antes da inoculação em células DH82. O protocolo de inoculação em
células utilizado neste experimento apresentou resultado mais precoce que o
utilizado no Capítulo I, com o isolado Jaboticabal. Por outro lado, o crescimento da
taxa de infecção foi mais lento, chegando a altos índices de infecção apenas aos 80-
90 dias pós-inoculação. O fato de o cão ter sido tratado previamente, pode ter
influenciado na propagação do agente. Iqba e Rikihisa (1994) relataram o isolamento
de E. canis após 51 dias da inoculação em DH82 a partir de cães tratados com
Doxiciclina sete dias antes da colheita de sangue para o isolamento.
As comparações entre diferentes seqüências de nucleotídeos, referente ao
gene 16S rRNA, revelaram alta conservação do isolado São Paulo frente a outras
cepas de E. canis. Estes resultados concordam com a afirmação, de que as
diferentes cepas de E. canis apresentam pouco polimorfismo, sugerindo uma origem
comum, com ponto de divergência não muito distante (AGUIRRE et al., 2004;
KEYSARY et al., 1996; UNVER et al., 2001). Adicionalmente, foi observada
similaridade entre outras espécies de Ehrlichia, conforme relatado por Dumler et al.
(2001), de que há no mínimo 97% de identidade entre as espécies segundo o gene
16S rRNA.
O fragmento do gene dsb analisado demonstrou completa conservação
(100%) entre as amostras de E. canis, em contraste com as outras espécies de
Ehrlichia, o qual variou de 74% a 81% de similaridade. Estes resultados concordam
com Kuyler Doyle et al. (2005a), os quais afirmam que o gene dsb é altamente
conservado entre as espécies do gênero Ehrlichia (E. ewingii e E. ruminantium os
mais divergentes e E. muris e IOE as mais similares). Mesmo assim, o gene possui
regiões de ácido nucléico, suficientemente heterólogas, que permite ser utilizado
como alvo específico para PCR. Estes resultados mostraram-se concordantes a
analise da seqüência de aminoácidos da proteína DSB, que se revelou idêntica ao
isolado Jake e divergente das outras espécies de Ehrlichia. Segundo McBride et al.
(2002), a DSB possui até 87% de homologia entre as espécies E. canis e E.
chaffeensis.
O gene P28 do isolado São Paulo demonstrou-se conservado, quando
comparados às amostras Jake e Oklahoma (99,3% e 99,5% respectivamente)
isoladas nos Estados Unidos. Mcbride et al. (1999) observaram a conservação deste
gene entre os isolados norte-americanos, sugerindo a inexistência de variação
antigênica. Por outro lado, quando a seqüência do gene P28 do isolado São Paulo
foi comparado a duas amostras de E. chaffeensis (Arkansas e Jax), estas
apresentaram similaridades diferentes (78,5% e 81,8% respectivamente). Estudos
envolvendo E. chaffeensis têm demonstrado diversidade molecular do gene P28. A
comparação deste gene em cinco diferentes isolados de E. chaffeensis revelou
distinção entre as cepas estudadas com até 13% de divergência (YU et al., 1999).
Analisando a seqüência de aminoácidos na proteína p28, observou-se a
quase total identidade dos isolados São Paulo, Jake (99,3%) e Oklahoma (98,7%). A
proteína p28 (≈ 30kDa) de E. canis tem sido descrita como um dos principais
antígenos imunodominantes, e como é altamente conservada entre os isolados, tem
sido seguramente indicada como antígeno diagnóstico e vacinal (MCBRIDE et al.,
1999; MCBRIDE et al., 2000). No entanto, a p28 tem apresentado semelhança
antigênica, quando comparada a proteínas homólogas de outras espécies, como da
E. chaffeensis (REDDY et al., 1998). No presente trabalho foi observado que a
semelhança de aminoácidos entre as espécies variou de 58% a 82%. Por essa
estreita homologia protéica dentro do gênero Ehrlichia, sugere-se que a p28 faça
parte da classe de proteínas codificadas por genes familiares (multigene family), e
devem ser importantes durante o curso da infecção e até mesmo na evasão da
resposta imune do animal infectado (MCBRIDE et al., 1999; MCBRIDE et al., 2000;
OHASHI et al., 1998; YU et al., 1999).
Outros estudos avaliaram seqüências de genes, que codificam proteínas de
membranas como a p120 (YU et al., 2000) e gp36 (KUYLER DOYLE et al., 2005b),
sendo confirmada a presença de similaridade entre os isolados de E.canis, inclusive
com a seqüência correspondente ao gene gp36 do isolado São Paulo.
Estes resultados sugerem, em termos evolutivos, que a E. canis foi
recentemente introduzida no continente americano, justificando a reservada relação
entre os diferentes isolados e espécies de Ehrlichia.
CAPITULO III
PREVALENCIA DE ANTICORPOS ANTI-Ehrlichia canis (Rickettsiales:
Anaplasmataceae) EM CÃES DO MUNICIPIO DE MONTE NEGRO, RO. –
AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA
1 INTRODUÇÃO
A erliquiose é uma doença infecciosa severa que acomete os cães (Canis
familiaris), causada por bactérias do gênero Ehrlichia, sendo a principal espécie a
Ehrlichia canis. Sua ocorrência vem aumentando significativamente nos últimos anos
em todas as regiões do Brasil e está veiculado ao seu vetor, o carrapato
Rhipicephalus sanguineus, conhecido como o “carrapato marrom do cão”, que se
encontra disseminado por toda área urbana do Brasil.
No Brasil, o primeiro diagnóstico da erliquiose canina foi feito por Costa et
al. (1973), em cão proveniente de Belo Horizonte. Posteriormente, a doença foi
relatada acometendo aproximadamente 20 a 30% % dos cães atendidos em
hospitais e clínicas veterinárias dos estados do Alagoas, Bahia, Ceará, Distrito
Federal, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Paraná, Pernambuco, Rio Grande do
Sul, Rio de Janeiro, Santa Catarina e São Paulo (BULLA et al., 2004; DAGNONE et
al., 2003; LABARTHE et al., 2003; TRAPP et al., 2002).
A ampla variação clínica da erliquiose, aliada ao longo período de portador e
a natureza nidícola do R. sanguineus, contribuíram para a disseminação da E. canis,
tornando-a uma das doenças infecciosas mais diagnosticadas nos países tropicais,
sobretudo no Brasil (HASEGAWA, 2005).
Estudos epidemiológicos sobre a infecção por E. canis no Brasil têm sido
realizados envolvendo a clínica da doença, seja avaliando a idade, sexo e raça dos
cães ou mesmo a presença de carrapatos, na tentativa de se estabelecer fatores de
riscos para a doença (DAGNONE et al., 2003, SANTARÉM, 2003; TRAPP et al.,
2002). Porém, ainda não há dados de prevalência da infecção por E. canis nas
populações caninas do Brasil.
Os relatos oficiais de ocorrência de erliquiose canina em áreas urbanas da
região norte do Brasil ainda são escassos. Como houve uma grande expansão de
populações do carrapato R. sanguineus nesta região nas últimas décadas
(LABRUNA; PEREIRA, 2001), é bem provável que a doença venha ocorrendo
freqüentemente em seus cães.
Nos anos de 2001 e 2003, foram amostrados cães da zona urbana e rural
do município de Monte Negro, RO, os quais foram utilizados em estudos
soroepidemiológicos frente a agentes infecciosos como Toxoplama gondii, Neospora
caninum, Brucella spp, Leptospira spp e Rickettsia spp (AGUIAR, 2004; CAÑON-
FRANCO, 2002; CAVALCANTE, 2004; LABRUNA et al., 2005a). Estas amostras
encontram-se armazenadas em banco de soros do Laboratório de Doenças
Parasitárias dos Animais (LDP), do Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva e Saúde Animal (VPS) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
(FMVZ) da Universidade de São Paulo (USP) e ainda não foram averiguadas quanto
à presença de anticorpos contra Ehrlichia spp.
Recentemente, foi verificado que os cães da área urbana de Monte Negro,
encontravam-se parasitados quase que exclusivamente por uma única espécie de
carrapato, o R. sanguineus. Por outro lado, os cães da área rural, eram parasitados
quase que exclusivamente pelas espécies Amblyomma ovale, Amblyomma
oblongoguttatum e Amblyomma scalpturatum (LABRUNA et al., 2005b).
Diante da falta de conhecimento referente à prevalência da infecção por E.
canis em cães no Brasil e da escassez de estudos conduzidos sobre este agente na
região norte do país, o presente trabalho objetivou determinar a prevalência de
anticorpos anti-Ehrlichia spp em cães do município de Monte Negro, RO. As
prevalências de cães soropositivos para E. canis foram analisadas com os dados da
fauna de carrapatos presentes nas áreas rurais e urbanas de Monte Negro.
2 MATERIAL E MÉTODOS
O local de estudo, a obtenção das amostras e as metodologia empregadas
estão descritas nos tópicos a seguir.
2.1 LOCAL DO ESTUDO E AMOSTRAGEM
O estudo foi conduzido no município de Monte Negro, RO, localizado a oeste da
Amazônia Brasileira (10
o
18' Sul; 63
o
14' Oeste; Figura 1). A região é caracterizada
por solos mistos e vegetação equatorial amazônica de terra firme e clima quente e
úmido, com pluviosidade elevada (média anual variando entre 1.440 mm nos
meses de novembro a abril e 557 mm no período seco, de maio a outubro), com
temperatura de 25 a 29
o
C e umidade relativa entre 70 a 80% durante o ano
(CAMARGO et al., 2002).
Foram examinados 314 cães provenientes de ambientes urbano e rural, de idade
e raças variadas e de ambos os sexos. Os parâmetros adotados para a
amostragem dos cães urbanos foram prevalência esperada de 50%, precisão
mínima de 7% e intervalo de confiança de 95%, de um total de 671 cães
residentes na área urbana. Os cães do meio rural foram obtidos durante estudo
conduzido na região, que avaliou doenças reprodutivas em bovinos (AGUIAR,
2004). Para determinar o número de fazendas a serem estudadas, utilizou-se
prevalência estimada de 50%, precisão mínima de 10% e 95% de intervalo de
confiança, de um total de 722 propriedades. Os cálculos para obtenção da
amostragem dos cães, foram realizados com o auxílio do programa EPIINFO
6.04.
AMAZONAS
MATO
GROSSO
AMAZONAS
ACRE
MATO
GROSSO
B
O
L
Í
V
I
A
PORTO VELHO
B
R
-
3
6
4
B
R
-
3
6
4
B
R
-
4
2
5
R
I
O
É
R
O
M
A
M
R
I
O
M
A
D
E
I
R
A
R
I
O
M
A
C
H
A
D
O
R
I
O
G
U
A
P
O
R
É
R
I
O
A
B
U
N
Ã
GUAJARÁ-MIRIM
MACHADINHO
CANDEI AS DO
JAMARI
ARIQUEMES
SÃO FRANCISCO
D'OESTE
ALTA
FLORESTA
CORUMBIARA
CACOAL
BURITIS
CAMPO
NOVO
GOVERNADOR
JORGE
TEI XE IRA
SÃO
MI GUE L
NOVA
MAMO RÉ
JAMARI
ESPIGÃO
D'OESTE
ALVORADA
D'OESTE
VILHENA
ROLIM
DE
MOUR A
PA R E C I S
CHU PI NGUAI A
SERINGUEIRAS
COSTA MARQUES
R O N D Ô N I A
Figura 1 - Localização do Município de Monte Negro/RO
Município de
Monte Negro/RO
Fonte: SEDAM/IBGE
BRASIL
Estrada sem pavimentação
Sede do Município
2.2 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE SANGUE E QUESTIONÁRIO
EPIDEMIOLOGICO
As amostras de sangue foram obtidas assepticamente por venopunção da
cefálica ou jugular, com agulhas 21G apropriadas para tubos a vácuo. Os soros
foram obtidos após a retração do coágulo, e estocados a -20
o
C até o momento das
análises. Na ocasião da colheita de sangue, aplicou-se um questionário com intuito
de verificar possíveis fatores de risco. Foram abordados a procedência dos cães
(área urbana ou rural), idade e sexo. Nos cães urbanos, questionou-se a forma de
criação (domiciliado e com acesso livre a rua), enquanto que nos cães do meio rural,
foi abordado dado referente ao hábito de caça.
2.3 CONFECÇÃO DAS LÂMINAS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
As lâminas foram confeccionadas conforme descrito por Ristic et al. (1972).
Monocamadas de células DH82, inoculadas com a cepa Jaboticabal de E. canis,
apresentando 80-90% de infecção, foram desprendidas da garrafa com auxilio de
raspadores apropriados (Corning
®
). A suspensão de células foi centrifugada a 4000
rpm por 5 minutos. Desprezado o sobrenadante, as células foram ressuspendidas
em Solução Tampão Fosfatada (PBS; pH 7,2; 0,0084M Na
2
HPO
4
, 0,0018M
NaH
2
PO
4
e 0,147M NaCl), para obter uma concentração de 10.000 células por ml.
Adicionou-se então, 10µl da solução em cada orifício de lâminas apropriadas para a
imunofluorescência, sendo secadas em temperatura ambiente. As lâminas foram
fixadas em acetona por 10 minutos e depois estocadas a -20
o
C até o momento do
uso.
2.4 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (RIFI)
A RIFI foi realizada a partir das células DH82 infectadas com o isolado
Jaboticabal de E. canis, fixado em lâminas de imunofluorescência, como descrito por
Ristic et al. (1972). Os soros dos cães foram diluídos a 1:40 (HARRUS et al., 1997;
MCBRIDE et al., 2001) em PBS pH 7,2 e aplicados às laminas com antígeno fixado,
sendo incubados por 30 minutos a 37
o
C em câmara úmida. Em seguida, foi feita
lavagem de 10 minutos em PBS 7,2. Após a secagem em temperatura ambiente, foi
adicionado conjugado de coelho anti-IgG de cão (Sigma Diagnostics, St. Luis, Mo)
na diluição de 1:1000. Novamente as lâminas foram incubadas a 37
o
C por 30
minutos e lavadas conforme descrito acima. Após a secagem, aplicou-se Glicerina
pH 8,5 em cada lâmina e estas foram examinadas em microscópio de
epifluorescência OLIMPUS
®
. As amostras consideradas positivas foram
sucessivamente diluídas na razão dois, para obtenção do título final. Os soros
controles positivo e negativo foram provenientes de um recente estudo de infecção
experimental com o isolado Jaboticabal (HASEGAWA, 2005).
2.5 ANÁLISE DOS DADOS
A soroprevalência obtida na RIFI foi calculada com intervalo de confiança de
95% (IC 95%). As freqüências encontradas para as variáveis obtidas no questionário
foram analisadas pelo teste do Qui-Quadrado (χ
2
). A diferença foi considerada
significativa quando P < 0,05. As analises foram realizadas pelo programa estatístico
EPIINFO 6.04.
3 RESULTADOS
Do total de 314 cães, 153 pertenciam à área urbana de Monte Negro
(amplitude: 1-4 cães por quadra), enquanto 161 eram provenientes de 70 fazendas
(amplitude: 1-6 cães por fazenda) de criação de bovinos. A tabela 1 apresenta a
distribuição da população canina amostrada segundo o sexo e a idade.
Tabela 1 - Distribuição da população de cães amostrados do município de Monte
Negro, RO. segundo sexo e faixa etária. São Paulo - 2006
Idade Número de cães (%)
(meses) Machos Fêmeas Total
01 a 12 25 (50,0) 25 (50,0) 50 (16,0)
> 12 a 24 37 (66,0) 19 (34,0) 56 (18,0)
> 24 116 (60,4) 76 (39,6) 192 (61,0)
Não determinada 09 (56,3) 07 (43,7) 16 (05,0)
Total 187 (59,5) 127 (40,5) 314 (100,0)
No ambiente urbano, 105 (68,6%) cães tinham acesso livre à rua enquanto
que 48 (31,4%) eram domiciliados. Quanto aos cães do ambiente rural, 93 (57,7%)
praticavam a caça, enquanto 68 (42,3%) não caçavam. Das 314 amostras de soro,
examinadas pela RIFI, 98 reagiram a partir da diluição 1:40 (Figura 2), obtendo-se
uma prevalência geral de 31,2% (IC 95%: 26 – 36%) (Figura 3).
Figura 2 - Fotomicrografia de células DH82 infectadas com Ehrlichia canis com
reação fluorescente positiva (setas). Notar a fluorescência positiva de
forma difusa caracterizando aparentemente antígenos solúveis (A) no
citoplasma celular, corpúsculos elementares e iniciais (B) bem como a
presença de mórulas (C). Imunofluorescência Indireta; 40X
Figura 3 – Prevalência de anticorpos anti-Ehrlichia canis em cães do município de
Monte Negro, RO. São Paulo – 2006
31,2%
68,8%
Reagente Não reagente
Os títulos de anticorpos variaram de 40 a 40.960. O maior titulo foi
observado no ambiente urbano. A tabela 2 e figura 4 apresentam as freqüências
obtidas segundo o título final de reação.
Tabela 2 - Distribuição dos títulos de anticorpos anti-Ehrlichia canis em cães reagentes
a Reação de imunofluorescência Indireta (título ≥40), da área urbana e rural
do município de Monte Negro, RO. São Paulo - 2006
Títulos Cães de área urbana Cães de área rural Total
Reagentes % Reagentes % Reagentes %
40 15 25,9 09 22,5 24 24,5
80 10 17,3 09 22,5 19 19,4
160 06 10,4 08 20,0 14 14,3
320 02 3,4 06 15,0 08 8,1
640 02 3,4 03 7,5 05 5,1
1.280 02 3,4 02 5,0 04 4,1
2.560 03 5,2 01 2,5 04 4,1
5.120 05 8,6 0 0 05 5,1
10.240 09 15,5 0 0 09 9,2
20.480 03 5,2 02 5,0 05 5,1
40.960 01 1,7 0 0 01 1,0
Total 58 100 40 100 98 100
Figura 4 - Número (n) e freqüência (%) de cães reagentes a Reação de
Imunofluorescência Indireta (título ≥ 40), contra antígenos de Ehrlichia
canis segundo titulo final da reação. São Paulo - 2006
Quando as amostras foram estratificadas pelas áreas urbana e rural, as
prevalências foram 37,9% (IC 95%: 30 – 45%; 58/153) e 24,8% (IC 95%: 18 – 31%;
40/161), respectivamente para ambas as áreas estudadas. Estes resultados, quando
comparados pelo teste do χ
2
, foram significativamente diferentes (χ
2
= 5,6; P =
0,017). A tabela 3 e a figura 5 apresentam as prevalências obtidas nas áreas urbana
e rural.
Tabela 3 - Prevalência de anticorpos anti-Ehrlichia canis em cães de área urbana e
rural do município de Monte Negro, RO
Área estudada N
o
cães avaliados N
o
cães positivos Prevalência IC - 95%*
Urbana 153 58 37,9% 30 – 46%
a
Rural 161 40 24,8% 18 – 32%
b
Total 314 98 31,2% 26 – 36%
* Letras diferentes indicam diferença entre áreas urbana e rural (P < 0,05)
0
5
10
15
20
25
Número
de cães
40 80 160 320 640 1.280 2.560 5.120 10.240 20.480 40.960
Título de anticorpos
24,5 %
19,4%
14,3%
8,1%
5,1%
4,1% 4,1%
5,1%
9,2%
5,1%
1,0%
Figura 5 – Freqüência (%) e número (n) de cães reagentes a Reação de
Imunofluorescência Indireta (título ≥ 40), contra antígenos de Ehrlichia
canis segundo ambiente urbano e rural do município de Monte Negro,
RO. São Paulo – 2006
Em relação à faixa etária, foi observado aumento da freqüência de reações
positivas, conforme o aumento da idade (χ
2
= 7,3; P = 0,006) (Tabela 4). Esse
resultado, não foi observado nos cães quando estratificados pelos diferentes
ambientes (P > 0,05; Tabela 5 e Figura 6).
Tabela 4 – Freqüência (%) cães reagentes e não reagentes a Reação de
Imunofluorescência Indireta (título ≥ 40) contra antígenos de
Ehrlichia canis, segundo a faixa etária. São Paulo - 2006
Número de cães (%) Odds Ratio Faixa etária
(meses)
Amostrados Não reagentes Reagentes*
0 – 12 50 41 (82,0) 09 (18,0)
a
1,00
>12 – 24 56 41 (73,2) 15 (26,7)
a, b
1,67
>24 192 121 (63,0) 71 (37,0)
b
2,67
Indeterminada 16 13 (81,2) 03 (18,8) -
Total 314 216 (69,0) 98 (31,0)
* Letras diferentes nas colunas indicam P < 0,05, χ
2
= 7,3; P = 0,006
Os cães com idade indeterminada não fizeram parte da análise estatística.
37,9 %
24,8 %
0
5
10
15
20
25
30
35
40
%
Urbano
Rural
n = 58
n = 40
Tabela 5 - Freqüência (%) de cães procedentes dos ambiente urbano e rural, reagentes
a Reação de Imunofluorescência Indireta (título ≥ 40) contra antígenos de
Ehrlichia canis, segundo a faixa etária. São Paulo - 2006
Área urbana Área Rural
N
o
de cães N
o
de cães
Faixa etária
(meses)
Amostrados Positivo (%) Amostrados Positivo (%)
0 to 12 19 4 (21,0)
a
31 5 (16,1)
a
>12 to 24 19 8 (42,1)
a
37 7 (19,0)
a
>24 112 45 (40,1)
a
80 26 (32,5)
a
Indeterminada 3 1 (33,3) 13 2 (15,3)
Total 153 58 161 40
* Letras iguais nas linhas e colunas indicam P > 0,05
Figura 6 – Freqüência (%) e número (n) de cães reagentes a Reação de
Imunofluorescência Indireta (título ≥ 40) contra antígenos de Ehrlichia
canis segundo a faixa etária na totalidade dos cães segregados por
área urbana e rural do município de Monte Negro, RO. São Paulo -
2006
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
%
Total
Urbano
Rural
0
-
12 meses
>12-24 meses
>24 meses
Indeterminada
n=9
n=15
n=71
n=4
n=3
n=8
n=45
n=1
n=5
n=7
n=26
n=2
FAIXA ETÁRIA
Não foi observada diferença significativa quando a freqüência de anticorpos
foi analisada frente ao sexo (χ
2
= 1,05; P = 0,30), mesmo quando foi analisado
separadamente por área urbana (χ
2
= 0,65; P = 0,41) e rural (χ
2
= 0,27; P = 0,60).
Quando as proporções de reatividade dentro de cada sexo (machos ou fêmeas) de
ambientes diferentes foi comparada, verificou-se discreta diferença entre os machos
reagentes do ambiente urbano (41,0%) e rural (26,8%; χ
2
= 3,6; P = 0,055). Esta
diferença não foi observada quanto às fêmeas (urbana: 33,3% e rural: 21,4%; χ
2
=
1,55; P = 0,212) (Tabela 6).
Tabela 6 - Freqüência dos cães reagentes e não reagentes a Reação de
Imunofluorescência Indireta (título ≥ 40), contra antígenos de Ehrlichia
canis, segundo o sexo nas diferentes áreas do município de Monte Negro,
RO. São Paulo - 2006
Número de cães (%)
Sexo
Urbano Rural
Amostrados Não reagentes Reagentes Amostrados Não reagentes Reagentes
Macho 90 53 (59,0) 37 (41,0)
a
97 71 (73,2) 26 (26,8)
a
Fêmea 63 42 (66,7) 21 (33,3)
a
64 50 (78,2) 14 (21,8)
a
Total 153 95 58 161 121 40
Letras iguais nas colunas e linhas representam P > 0,05
Dos 105 cães da área urbana que tinham acesso a rua, 41 (39,0%) foram
sororeagentes a RIFI (título ≥ 40). Porém, não foi observada diferença significativa
(χ
2
= 0,06; P = 0,80) quando comparado à freqüência verificada nos cães
domiciliados [35,4% (17/48)].
A variável caça, analisada nos cães do meio rural, não apresentou diferença
significativa (χ
2
= 0,27; P = 0,60). Dos 93 cães que tinham esse hábito, 25 (27%)
foram sororeagentes a RIFI (título ≥ 40), enquanto que 22% (15/68) que não
praticavam foram sororeagentes. A tabela 7 ilustra as freqüências de sororeagentes
segundo o tipo de criação na área urbana e o hábito de caça na área rural do
município de Monte Negro, RO.
Tabela 7 – Freqüência (%) e valor de Qui-quadrado (χ
2
) dos cães amostrados, não
reagentes e reagentes a Reação de Imunofluorescência Indireta (título ≥
40) contra antígenos de Ehrlichia canis segundo o tipo de criação na
área urbana e hábito de caça na área rural do município de Monte
Negro, RO. São Paulo - 2006
Cães (%) Variável
Amostrados Não reagentes Reagentes
χ
2
P
Área urbana
Criação
Domiciliado
Acesso livre a rua
48
105
31 (65,0)
64 (61,0)
17 (35,0)
41 (39,0)
0,06
0,80
Área rural
Hábito de caça
Não
Sim
68
93
53 (78,0)
68 (73,0)
15 (22,0)
25 (27,0)
0,27
0,60
4 DISCUSSÂO
O presente trabalho avaliou a prevalência da infecção por Ehrlichia canis em
cães da cidade de Monte Negro, RO, demonstrando soroprevalência de 31,2%
(98/314). Este é o primeiro inquérito epidemiológico em cães da região norte do
Brasil, sendo também pioneiro por comparar a infecção por E. canis em cães de
área urbana e rural. Além disso, este foi o primeiro trabalho a determinar a
prevalência de E. canis no Brasil, pois foi o único que partiu de uma amostragem
estatisticamente calculada para representar uma população de cães, sem efeitos
tendenciosos de amostragem. Todos os inquéritos já realizados no Brasil basearam-
se em amostras viciadas, pois restringiram-se a cães atendidos em clínicas e
hospitais veterinários, não representando uma população real de cães.
O teste sorológico é uma importante ferramenta para obtenção de
informações epidemiológicas de diversas enfermidades. A RIFI, utilizada neste
estudo para averiguar a infecção por E. canis em cães, indica apenas que houve ou
há a infecção no animal, não sendo capaz de identificar a espécie envolvida,
decorrente da presença de reações cruzadas entre as espécies de Ehrlichia spp
(NDIP et al., 2005; WANER et al., 2001). O ponto de corte adotado neste estudo foi
de 40. O mesmo utilizado na RIFI de McBride et al. (2001), que observaram boa
correlação com a reação de “Western blotting”.
Este é o primeiro inquérito soroepidemiológico realizado em cães da
América do Sul. Em outras localidades, os valores de prevalência encontrados,
variaram em torno de zero a 50% na América do Norte (MURPHY et al., 1998;
RODGER et al., 1989; RODRIGUES-VIVAS et al. 2005; YAMANE,et al., 1994), dois
a 20% na Europa (PUSTERLA et al., 1998; SAINZ et al., 1996), 30% em Israel
(BANETH et al., 1996) e 32 a 68% no continente africano (DAVOUST et al., 2005;
MATHEWMAN et al., 1993; NDIP et al., 2005). Em trabalho realizado na Austrália,
Mason et al. (2001) verificou ocorrência de infecção em 2% dos cães testados. O
resultado encontrado no presente trabalho apresentou valores de prevalência
similares aos de outros paises que estão entre as zonas tropical e subtropical,
concordando com a afirmação de Keefe et al. (1982), de que cães situados nessa
zona climática apresentam maiores freqüências de infecção por E. canis.
No presente estudo, foi observado ocorrência de anticorpos anti-E. canis em
37,9% (58/153) dos cães urbanos. Em recente estudo realizado por Labruna et al.
(2005b), no ano de 2000, 43% dos cães urbanos de Monte Negro encontravam-se
infestados pelo R. sanguineus, e no ano de 2001, estes representavam 32% da
população canina da cidade. Segundo os autores, os cães urbanos de Monte Negro
eram parasitados quase que exclusivamente pela espécie R. sanguineus. Por outro
lado, verificaram que os cães rurais eram parasitados quase que exclusivamente
pelos carrapatos A. ovale, A. oblongoguttatum e A. scalpturatum e menos
frequentemente por R. sanguineus. Destes carrapatos, 121 A. ovale, 30 A.
oblongoguttatum e 35 A. scalpturatum foram averiguadas pela PCR a fim de
pesquisar a presença de DNA de Ehrlichia spp, mas não foram detectadas amostras
positivas (informação verbal
3
). Estes achados corroboram com os resultados do
presente trabalho, onde foi verificada maior prevalência nos cães urbanos do que
nos cães rurais (P < 0,05). A ocorrência encontrada nos cães da área rural de 24,8%
(40/161), condiz com os poucos relatos de infestação por R. sanguineus nesses
cães e com os resultados negativos da PCR dos carrapatos A. ovale, A.
oblongoguttatum e A. scalpturatum.
3
Informação fornecida por Labruna, M. B. (FMVZ – USP, Campus de São Paulo) em 2003.
A presença de alguns cães do ambiente rural com altos títulos de anticorpos
anti-E. canis (20.480) sugere infecção homóloga e reforçam a presença da E. canis
em cães do ambiente rural. Num estudo preliminar com os cães desta região, Aguiar
(2004), discutiu a possibilidade da movimentação dos cães urbanos em ambientes
rurais (principalmente porque muitos produtores rurais residiam na cidade, e
frequentemente levavam os cães às áreas rurais) e vice-versa. É bem provável que
a movimentação de cães entre os diferentes ambientes e a presença da infestação
pelo carrapato R. sanguineus nestes cães contribuíram para a ocorrência da
infecção nos cães da zona rural.
No presente estudo foi observado aumento da freqüência de anticorpos
conforme o aumento da idade dos cães (P < 0,05). Entretanto, quando esta análise
foi realizada por ambientes, não foi observada diferença significativa (P > 0,05).
Como havia grande infestação por R. sanguineus nos cães do ambiente urbano,
estes provavelmente adquiriram a infecção nos primeiros meses de vida. Por isto,
não foi constatada associação entre o acesso à rua e a ocorrência de anticorpos
anti-E. canis nos cães deste ambiente. A ocorrência de anticorpos anti-E. canis,
quando avaliada segundo o sexo, não apresentou diferença entre machos e fêmeas.
O sexo parece não ter importância epidemiológica na infecção por E. canis,
conforme relatado por Baneth et al. (1996), Rodrigues-Vivas et al. (2005) e Sainz et
al. (1996).
Na tentativa de estabelecer risco para a infecção no ambiente rural,
avaliamos a prática de caça. Entretanto, não observamos tal associação. Como já foi
amplamente discutido, não foi observado indícios de infecção por outra espécie de
Ehrlichia que possam ser veiculadas por outros gêneros de carrapatos, como
Amblyomma spp.
CAPITULO IV
PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO POR Ehrlichia canis (Rickettsiales:
Anaplasmataceae) EM DIFERENTES POPULAÇÕES DE CARRAPATOS
Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae).
1 INTRODUÇÃO
As doenças transmitidas por carrapatos, representam um emergente
problema em animais e humanos, pois vem causando sérias doenças em regiões
tropicais e subtropicais. Recentemente, os carrapatos têm sido associados a
doenças em cães (Canis familiaris) de zonas temperadas e em ambientes urbanos
(SHAW et al., 2001), pois estão bem adaptados a transmitir agentes virais
(Arbovirus), protozoários (Babesia spp, Hepatozoon spp e Theileria spp) e
bacterianos (Neorickettsia spp, Ehrlichia spp, Rickettsia spp, Anaplasma spp e
Borrelia spp) (GREENE, 1998).
A Erliquiose Monocítica Canina (EMC) é uma enfermidade causada por
bactérias do gênero Ehrlichia, nos cães, identificada parasitando monócitos e
granulócitos (SHAW et al., 2001). A única espécie descrita até o momento no Brasil
é a Ehrlichia canis, que vem acometendo aproximadamente 20% a 30% dos cães
atendidos em hospitais e clínicas veterinárias dos estados do Alagoas, Bahia, Ceará,
Distrito Federal, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Paraná, Pernambuco, Rio
Grande do Sul, Rio de Janeiro, Santa Catarina e São Paulo (BULLA et al., 2004;
DAGNONE et al., 2003; LABARTHE et al., 2003; TRAPP et al., 2002).
A doença está veiculada ao seu vetor, o carrapato Rhipicephalus
sanguineus, conhecido como o “carrapato marrom do cão”, que se encontra
disseminado por toda área urbana do Brasil. Originário da África e única espécie do
gênero Rhipicephalus nas Américas, o R. sanguineus foi introduzido no Brasil
possivelmente a partir do século XVI, com a chegada dos colonizadores europeus e
seus animais domésticos. R. sanguineus é um carrapato trioxeno e possui hábito
nidícola, o que torna os cães sempre sujeitos a grandes infestações, visto que este
carrapato tem grande capacidade de se multiplicar e se manter em ambientes
urbanos (LABRUNA; PEREIRA, 2001).
A ampla variação do quadro clínico da EMC, aliado ao longo período de
portador e a natureza nidícola do R. sanguineus, contribuíram para a disseminação
da E. canis, tornando-a uma das doenças infecciosas mais diagnosticadas nos
países tropicais. No Brasil, as condições climáticas são ideais para manutenção do
vetor, além do que, a grande população canina errante no nosso país contribuiu para
a disseminação deste carrapato (BULLA et al., 2004). A infestação por R.
sanguineus, tem sido considerada importante fator de risco para a infecção por E.
canis (SANTARÉM, 2003; TRAPP et al., 2002).
No carrapato ocorre transmissão transestadial, mas não transovariana, o
que faz do cão, o reservatório do agente. Portanto, a infecção do hospedeiro
vertebrado é transmitida pelos estágios de ninfa e adulto do carrapato (GROVES et
al., 1975). Recentemente, Bremer et al. (2005) experimentalmente demonstrou que
machos adultos de R. sanguineus, na procura de uma fêmea para cópula, podem se
infectar e transmitir a doença a diferentes cães de um mesmo local (transmissão
intraestadial).
No Brasil, a presença de E. canis em carrapatos ainda não foi relatada.
Poucos estudos abordaram a infecção natural por E. canis em carrapatos R.
sanguineus. No continente americano, Murphy et al. (1998) nos Estados Unidos e
Unver et al. (2001) na Venezuela realizaram a identificação do agente em carrapatos
R. sanguineus. Por outro lado, estudos realizados no Japão (INOKUMA et al., 2003)
e na Tunísia (SARIH et al., 2005) não obtiveram êxito na identificação de carrapatos
infectados por E. canis.
Ao contrário do que ocorre com a EMC, a prevalência de carrapatos
Amblyomma americanum infectados por E. chaffeensis tem sido verificada. Relatos
norte-americanos estimaram a freqüência mínima de infecção, variando de um a
10% (BURKET et al., 1998; STEINER et al., 1999; WHITLOCK et al., 2000).
Prevalência menor ainda, foi detectada na infecção por E. ewingii em A.
americanum, que ficou em torno de 0,5% de carrapatos amostrados nos Estados
Unidos (WOLF et al., 2000).
Diante da importância da EMC na clinica veterinária brasileira, da freqüência
e disseminação do carrapato R. sanguineus no Brasil, e da sua importância como
agente difusor de enfermidades transmissíveis, o presente estudo procurou avaliar a
prevalência da infecção por E. canis em diferentes populações de carrapatos R.
sanguineus.
2 MATERIAL E MÉTODOS
Para melhor compreensão a metodologia está dividida em tópicos.
2.1 LOCAL DO ESTUDO
Foram amostradas populações de carrapatos R. sanguineus de diferentes
localidades, onde apresentavam pelo menos um cão suspeito de EMC: população 1:
município de Monte Negro, RO (10
o
18’ Sul; 63
o
14’ Oeste), amostrados de uma
residência em outubro de 2004; população 2: município de Jundiaí, SP (23
o
11’ Sul;
46
o
52’ Oeste), amostrado de um canil comunitário em dezembro de 2004; população
3: município de São Paulo (designada São Paulo I), SP (23º32' Sul; 46º37' Oeste)
amostrado de um canil em maio de 2005. Uma quarta população foi obtida de uma
comunidade do município de São Paulo (designada São Paulo II) em janeiro de
2005. As duas últimas populações procedentes da mesma cidade são
geograficamente separadas (bairros Butantã e Jardim Bonfiglioli, respectivamente).
Para confirmar se as populações de carrapatos eram oriundas de local onde havia
infecção por E. canis, foram amostrados sangues de cinco cães contactantes de
Monte Negro, dois de Jundiaí, e um de cada local de São Paulo.
2.2 AMOSTRAGEM E COLHEITA DE CARRAPATOS
O número mínimo de carrapatos a serem amostrados em cada população
foi determinado com auxílio do programa EPIINFO 6.04. Este cálculo foi realizado
para populações infinitas, utilizando-se prevalência esperada de 10%, erro
estatístico de 5% e intervalo de confiança (IC) de 95%. A prevalência de 10% de
carrapatos infectados foi extrapolada de estudos sobre prevalência de carrapatos
Amblyomma americanum infectados por E. chaffeensis (PADDOCK; CHILDS, 2003).
No laboratório, os espécimes foram agrupados em grupos (pools) de três carrapatos,
mantidos em álcool isopropílico 100% até a extração de DNA total ser realizada.
Na população 1 os carrapatos foram colhidos dos cães, sendo a maioria,
fêmeas parcialmente ingurgitadas. Na população 2 os carrapatos foram tanto adultos
não alimentados e teleóginas (recém desprendidas dos cães) das paredes dos
canis. Todos os carrapatos das populações 3 e 4 foram adultos não alimentados
retirados do ambiente.
2.3 EXTRAÇÂO DE DNA DOS CÃES SUSPEITOS E DOS CARRAPATOS
A extração de DNA do sangue dos cães presentes nas localidades foi
realizada com kit de extração “DNeasy Tissue Kit” (Qiagen, Chatsworth, Ca)
conforme manual de instrução.
Os carrapatos foram secos ao ar livre e posteriormente triturados em
microtubos eppendorf com auxilio de ponteiras de 1,0 mililitros (ml) estéreis. Após
trituração, o DNA total foi extraído com auxilio do kit de extração “DNeasy Tissue Kit”
(Qiagen, Chatsworth, Ca). Como não há instruções para utilização em carrapatos,
utilizou-se o manual de extração para insetos. Do município de Jundiaí, as
teleóginas foram dissecadas com lâminas de bisturis em placa de petri com solução
Tampão Tris-EDTA (10mM TrisCl, 1 mM EDTA) pH 8,0 estéril, para retirada das
glândulas salivares, as quais tiveram o DNA extraído posteriormente com o kit de
extração “DNeasy Tissue Kit” (Qiagen, Chatsworth, Ca).
2.4 PCR
Para a amplificação, utilizou-se uma PCR com uma reação contendo: 100-
400 ng de DNA; 0,2 mM de cada nucleotídeo dATP, dTTP, dCTP e dGTP
(Promega
®
); 0,4 µM de cada iniciador (primer) dsb: Dsb–330 (senso: 5’-GAT GAT
GTC TGA AGA TAT GAA ACA AAT-3’) e Dsb-729 (anti-senso: 5’-CTG CTC GTC
TAT TTT ACT TCT TAA AGT-3’); 1,25 U de Taq Polimerase (Platinum
®
Taq DNA
polymerase - Invitrogen); solução tampão (pH 8,4) contendo 50 mM de KCL; 20 mM
Tris-HCL e 3 mM de MgCl
2
(KUYLER DOYLE et al., 2005a). O volume foi
completado com água MilliQ autoclavada para completar 50µl e a amplificação foi
efetuada em termociclador automático (Eppendorf
®
). Em cada série foram incluídos
controles positivo (DNA de E.canis) e negativo (água).
Inicialmente, as amostras foram desnaturadas a 95
o
C por dois minutos,
seguida de uma seqüência de 50 ciclos repetidos de 15 segundos a 95
o
C, 30
segundos a 58
o
C e 30 segundos a 72
o
C, seguidos de cinco minutos de extensão
final a 72
o
C. Os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em gel
de agarose 1,5-2% em ácido-EDTA tris-bórico tamponado, revelados com brometo
de etídio em transiluminação ultravioleta. Compararam-se os fragmentos de DNA
com marcadores de DNA de 100 pares de base (pb; Fermentas Life Science
®
Burlington, On), considerando como positivas, as amostras cujos produtos
apresentaram tamanho aproximado de 409 pb. Em cada série foram incluídos
controles positivo (DNA de E.canis) e negativo (água).
2.5 SEQÜENCIAMENTO
Foram seqüenciados os produtos da PCR de ao menos um cão amostrado
de cada localidade. Dos carrapatos, foram seqüenciados fragmentos amplificados de
um pool da população 1 (Monte Negro), quatro pools da população 2 (Jundiaí) e
cinco pools da população 3 (São Paulo I). Os produtos da PCR foram purificados
com Kit comercial ExoSAP-IT
®
(USB Corporation, Cleveland, Oh) conforme manual
de instruções. As seqüências de nucleotídeos dos fragmentos amplificados foram
analisadas em seqüenciador automático de DNA modelo ABI Prism 310 Genetic
Analyser (Applied Biosystens/Perkin Elmer), segundo seu manual de instruções. As
seqüências obtidas foram alinhadas com outro isolado de E. canis disponível no
GenBank, utilizando o programa MegAlign do pacote DNAstar (Lasergene). O
número de acesso da seqüência de dsb obtida no GenBank usada para comparação
foi AF403710, correspondente ao isolado Jake de E. canis.
2.6 PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO E ANALISE ESTATISTICA
A prevalência de carrapatos infectados foi calculada como Freqüência
Mínima de Infecção (FMI) (BURKET et al., 1998; WHITLOCK et al., 2000). Este
cálculo foi realizado tanto para o total de pools das três populações, quanto para os
pools de cada localidade. As diferentes freqüências verificadas entre as populações
foram analisadas pelo teste do Qui-Quadrado (χ
2
) ou pelo teste exato de Fisher
(Fisher) quando necessário. A diferença foi considerada significativa quando P <
0,05. As analises foram realizadas pelo programa estatístico EPIINFO 6.04.
3 RESULTADOS
Os resultados foram descritos por etapa para uma melhor compreensão.
3.1 COLETA DE CARRAPATOS
Os carrapatos amostrados estão apresentados na tabela 1.
Tabela 1 – Número e freqüência (%) de carrapatos Rhipicephalus sanguineus
amostrados em quatro diferentes populações. São Paulo - 2006
População Número de carrapatos Rhipicephalus sanguineus (%) Total (%)
(Local) Parasitando cão Vida livre
Não ingurg. Ingurgitado Não ingurg. Ingurgitado
1 (Monte Negro) 96 (58,0) 69 (42,0) 0 0 165 (27,0)
2 (Jundiaí) 0 0 90 (55,6) 72 (44,4) 162 (26,5)
3 (São Paulo I)
0 0 162 (100) 0 162 (26,5)
4 (São Paulo II)
0 0 120 (100) 0 120 (20,0)
Total 96 (15,5) 69 (11,0) 372 (61,0) 72 (12,5) 609 (100)
3.2 PCR E FMI
Quatro cães da população 1 (Monte Negro/RO) e os cães amostrados das
populações 2 e 3 (Jundiaí e São Paulo I) foram positivos ao PCR para o gene dsb de
Ehrlichia spp. Já o cão procedente da população 4 foi negativo. Baseada nos
resultados da PCR, a FMI foi calculada para as populações 1, 2 e 3 e para o total de
carrapatos amostrados. Para cada pool positivo assumiu-se conter, no mínimo, um
carrapato infectado. A tabela 2 e a figura 1 apresentam os resultados da FMI. A
população 1 (Monte Negro) apresentou prevalência de 2,4% (IC 95%:0,7 – 5,7%), a
população 2 (Jundiaí) de 6,2% (IC 95%: 3,0 – 10,7%) e a população 3 (São Paulo I)
de 3,7% (IC 95%: 1,5 – 7,0%). Os resultados, quando comparados entre si,
apresentaram-se estatisticamente semelhantes (P > 0,05). A prevalência total de
infecção por E. canis em R. sanguineus foi de 4,1% (IC 95%: 2,5 – 6,1%).
Contrariamente, a população 4 (São Paulo II) apresentou-se negativa e este
resultado, quando comparado à população de carrapatos positivos, foi
estatisticamente diferente (P< 0,05).
Tabela 2 – Prevalência da infecção por Ehrlichia canis em carrapatos Rhipicephalus
sanguineus, calculada como Freqüência Mínima de Infecção (FMI) com
intervalo de Confiança de 95% (IC 95%). São Paulo - 2006
Populações Número total FMI IC 95%
(Local) Carrapatos Pools Pools positivos
1 (Monte Negro) 165 55 04 2,4
a
0,7 – 5,7
2 (Jundiaí) 162 54 10 6,2
a
3,0 – 10,7
3 (São Paulo I) 162 54 06 3,7
a
1,5 – 7,5
Total 489 163 20 4,1 2,5 – 6,1
*
letras iguais na mesma coluna indicam P > 0,05
Figura 1. Freqüência Mínima de Infecção (FMI) das quatro populações de
carrapatos Rhipicephalus sanguineus infectados por Ehrlichia canis.
São Paulo – 2006
0
1
2
3
4
5
6
7
Total Monte Negro Jundiaí São Paulo I
4,1
2,4
6,2
3,7
FMI
%
A tabela 3 apresenta a FMI obtida das diferentes fontes de DNA
(ingurgitados, glândulas salivares e não ingurgitados). Na população 1 (Monte
Negro), as FMI encontradas para carrapatos ingurgitados (4,3%; 3/69) e não
ingurgitados (1,0%; 1/96) foram estatisticamente semelhantes (Fisher = 1,7; P =
0,30). O mesmo ocorreu quando se comparou a freqüência dos grupos composta
pelas glândulas salivares dos carrapatos ingurgitados (6,9%; 5/72) e dos não
ingurgitados (5,5%; 5/90) da população 2 (Jundiaí) (χ
2
= 0,0; P = 0,90).
Tabela 4 – Número (n) de carrapatos processados e número de pools infectados (infect)
para E. canis (FMI) nos diferentes grupos de carrapatos Rhipicephalus
sanguineus, segundo as diferentes localidades. São Paulo - 2006
Local Grupos de carrapatos Total
Ingurgitados Gl. Salivar Não ingurgitados
n Infec (FMI) n Infec (FMI) n Infec (FMI) Infec. (FMI)
1 (Monte Negro)
69 3 (4,3)* 0 0 96 1 (1,0%)* 4 (2,4)
2 (Jundiaí)
0 0 72 5 (6,9)** 90 5 (5,5)** 10 (6,2)
3 (São Paulo I)
0 0 0 0 162 6 (100,0) 6 (3,7)
* 1
Fisher = 1,7; P = 0,30
** 2
χ
2
= 0,0; P = 0,90
3.3 SEQUENCIAMENTO
Após exclusão das porções correspondentes aos primers, foram obtidos
fragmentos de 355 nucleotídeos de cada produto amplificado, e todas as seqüências
se mostraram idênticas entre si. Quando elas foram comparadas com as seqüências
disponíveis no GenBank, através de Blast Analysis, apresentaram 100% de
similaridade com a seqüência de E. canis (AF403710).
4 DISCUSSÃO
O presente trabalho averiguou a prevalência da infecção por E. canis em
carrapatos R. sanguineus, considerado como o principal vetor da EMC no Brasil e
em todo o mundo. Pesquisa de E. canis em R. sanguineus nunca fora averiguada
nos moldes deste trabalho, de forma a ser pioneiro neste tipo de estudo. Estudos
anteriores analisaram a presença de E. canis em pequenas amostras de R.
sanguineus, sem a preocupação de avaliar a prevalência da infecção (INOKUMA et
al., 2003; MURPHY et al., 1998; UNVER et al., 2001).
Todas as seqüências obtidas dos cães e dos carrapatos, das diferentes
regiões estudadas no presente trabalho, apresentaram-se idênticas à seqüência
correspondente do gene dsb de E. canis disponível no GenBank (AF403710).
Atualmente a E. canis é a única espécie do gênero Ehrlichia identificada no Brasil, e
todas que foram identificadas pelo gene dsb apresentaram-se idênticas entre si,
como os isolados Jaboticabal e São Paulo e as cepas identificadas por Rosa (2005).
Do total de pools positivos, verificou-se FMI de 4,1% (20/489). As
populações de carrapatos, onde foi detectada a presença de E. canis, foram
oriundas de locais onde havia ao menos um cão portador. Por outro lado, a quarta
população (população 4 – São Paulo) analisada, não apresentou carrapatos
positivos, tão pouco a presença de cão portador. O cão doméstico é considerado o
principal reservatório da E. canis, uma vez que a transmissão transovariana do
agente não ocorre no carrapato R. sanguineus (GROVES et al., 1975).
Todos os carrapatos da população 1 (Monte Negro) foram amostrados
parasitando cães, tanto por adultos ingurgitados como os não ingurgitados. De
acordo com Burket et al. (1998), a utilização de carrapatos ingurgitados pode
interferir na PCR, pois a presença do sangue pode ser prejudicial para obtenção de
DNA de qualidade. Com a utilização de um Kit comercial de extração (DNeasy
Tissue Kit
®
), aparentemente a qualidade do DNA não foi alterada, pois a presença
do DNA foi confirmado por eletroforese em gel de agarose (dado não apresentado).
Nesta população, constatamos a FMI em 2,4% (4/165) dos carrapatos. As fêmeas
ingurgitadas apresentaram 4,3% (03/69) de infecção enquanto que 1,0% (01/96) dos
carrapatos não ingurgitados apresentaram-se positivos (P > 0,05).
Já na população 2 (Jundiaí), todos os carrapatos eram de vida livre, e as
teleóginas foram dissecadas para retirada da glândula salivar. Os resultados obtidos
nestas duas fontes de DNA não apresentaram diferença significativa [P > 0,05; 6,9
% (5/72) - glândula salivar e 5,5% (5/90) - carrapatos inteiros não ingurgitados]. A
PCR da glândula salivar mostrou-se útil para a detecção do agente, já que
aparentemente é o ultimo local de instalação do agente no carrapato (SMITH et al.,
1976), minimizando dessa forma, a detecção de DNA proveniente do sangue
infectado ingerido no hospedeiro vertebrado. Todos os carrapatos da população 3
(São Paulo I) eram de vida livre, sendo verificada FMI de 3,7% (06/162).
A FMI das três populações foi estabelecida em 4,1 % (2,5 – 6,1%; 95% IC) e
para cada uma delas também não foi observada diferença significativa (P > 0,05).
Como os resultados obtidos pela FMI foram relativamente baixos, sugere-se que
nem todo sangue infectado ingerido pelos carrapatos resulta na infecção do vetor.
Este dado foi comprovado por Bremer et al. (2005), os quais demonstraram que
apenas 50 a 70% dos carrapatos R. sanguineus que se alimentaram quando ninfas
em cães experimentalmente infectados com E. canis foram positivos.
A presença de carrapatos adultos que parasitaram (quando ninfa) cães em
fase subclinica ou crônica pode também influenciar a baixa taxa de infecção, já que
é na fase aguda que o encontro do agente na circulação sanguínea é mais freqüente
(LEWIS et al., 1977). Isto tem sido observado na infecção por E. chaffeensis em A.
americanum e no veado da cauda branca (Odocoileus virginianum). A prevalência
de E. canis em carrapatos A. americanum nos Estados Unidos variou de 3 a 10%
(BURKET et al., 1998; STEINER et al., 1999; WHITLOCK et al., 2000). Por outro
lado, Arens et al. (2003) observaram alta prevalência sorológica (87%), com baixa
detecção (23%) do agente no sangue dos animais (veado da cauda branca),
sugerindo a existência de animais portadores crônicos da infecção, contribuindo
para a baixa taxa de infecção observada nos carrapatos.
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