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SINARA MÔNICA DE OLIVEIRA LEITE
CRITÉRIOS CLÍNICOS (AMSTERDÃ II E BETHESDA) E
CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS (INSTABILIDADE DE
MICROSSATÉLITES) EM PACIENTES COM CÂNCER
COLORRETAL EM MINAS GERAIS
BELO HORIZONTE
PÓS-GRADUAÇÃO DA SANTA CASA DE BELO HORIZONTE
2006
SINARA MÔNICA DE OLIVEIRA LEITE
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CRITÉRIOS CLÍNICOS (AMSTERDÃ II E BETHESDA) E
CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS (INSTABILIDADE DE
MICROSSATÉLITES) EM PACIENTES COM CÂNCER
COLORRETAL EM MINAS GERAIS
BELO HORIZONTE
PÓS-GRADUAÇÃO DA SANTA CASA DE BELO HORIZONTE
2006
2
Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação em
Medicina/Biomedicina da Santa Casa de Belo Horizonte,
como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em
Medicina/Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Magela Gomes da Cruz
Co-Orientadora: Prof. Dra. Karina Braga Gomes
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4
À minha família, esteio de vida toda, pelo carinho,
compreensão e alegria compartilhada em cada realização.
Agradecimentos:
Ao Dr. Geraldo Magela Gomes da Cruz pelo exemplo de profissionalismo, ética e seriedade,
ensinando-me a cultivar o amor pela pesquisa. Agradeço pelo carinho e dedicação na realização
deste trabalho e pela amizade e incentivo sempre presentes.
À Dra. Karina Braga Gomes pela presença constante e incansável; mais que aprender, aprendi a
ensinar. Meus sinceros agradecimentos pelo estímulo, delicadeza e generosidade sempre
presentes.
Aos colegas da equipe de coloproctologia, companheiros de tantos anos, pela valiosa
contribuição com seus pacientes; pelo estímulo e interesse cotidianos, participando nos
momentos de decisões mais difíceis.
À Dra. Patrícia Salomé Gouvêa Braga, patologista do Hospital Biocor e à Valdinéia Rocha
Teixeira, funcionária do Laboratório de Anatomia Patológica daquela instituição, pelo trabalho
preciso e fundamental com as amostras de tecidos em parafina.
Ao Dr. Hermes Pardini, pela confiança e estímulo, tornando possível a realização deste
trabalho.
Ao Dr. Victor Cavalcanti Pardini, por acreditar no projeto e viabilizar a execução dos testes de
instabilidade de microssatélites, sempre contribuindo para sua realização.
Ao Alessandro Clayton de Souza Ferreira, pelo incentivo e valiosa contribuição no
desenvolvimento da metodologia utilizada neste estudo.
À Vanessa Cristina de Oliveira pela dedicação e desvelado capricho na execução dos testes.
Minha gratidão pela infinita gentileza, generosidade e carinho ao me ensinar e acompanhar em
cada etapa da execução do processo laboratorial.
5
Aos alunos de medicina da Faculdade de Ciências Médicas de Minas Gerais e aos pacientes,
que ao longo da vida têm sido estímulo constante, mantendo em mim a vontade de estudar e
perguntar, sempre.
Aos professores da Pós-Graduação da Santa Casa, em especial ao Dr. Francisco das Chagas
Lima e Silva, pelo apoio pessoal durante o processo de elaboração deste estudo.
A todos aqueles que, de alguma maneira, colaboraram para a realização e finalização deste
trabalho.
6
Sumário:
Lista de tabelas 09
Lista de quadros 10
Lista de figuras 11
Lista de abreviaturas e siglas 12
Resumo 14
Abstract 16
01) Introdução 18
02) Revisão da literatura 22
2.1) Introdução 23
2.1.1) Histórico 23
2.1.2) Definição 24
2.1.3) Freqüência de doença 25
2.2) Bases genéticas do câncer 27
2.2.1) Definição de câncer 27
2.2.2) Fatores hereditários e não-hereditários 28
2.2.3) Mutações genéticas 30
2.2.4) Fenômenos epigenéticos 32
2.2.5) Vias de carcinogênese 33
2.2.6) Vias de sinalização nas células colônicas normais e tumorais 36
2.2.7) Genes de reparo do DNA 43
2.2.8) Mecanismo reparador dos erros de replicação 46
2.2.9) Oncogênese devido ao reparo de pareamento incorreto 49
2.3) HNPCC 52
2.3.1) Critérios de Amsterdã 52
2.3.2) Critérios de Bethesda 57
2.3.3) Validação dos critérios de Bethesda 65
2.3.4) Critérios de Bethesda revisados 65
2.3.5) Perspectivas para a prevenção e tratamento 71
03) Objetivos 73
3.1) Objetivo geral 74
3.2) Objetivos específicos 74
04) Material e métodos 75
4.1) Material clínico 76
4.2) Material biológico 77
4.2.1) Blocos de parafina 77
4.2.2) Tecido a fresco 77
7
4.3) Critérios de inclusão e exclusão 77
4.4) Características das amostras e indivíduos estudados 78
4.5) Análise estatística 78
4.5.1) Variáveis resposta 78
4.5.2) Testes estatísticos utilizados 78
4.6) Aspectos éticos 79
4.7) Equipamentos utilizados 79
4.8) Preparo das soluções 80
4.9) Extração de DNA 82
4.10) Análise de microssatélites – amplificação por reação em cadeia da polimerase
4.10.1) BAT 25 89
4.10.2) BAT 26 90
4.10.3) BAT 40 91
4.10.4) D5S346 (APC) 91
4.10.5) D2S123 93
4.10.6) D17S250 94
05) Resultados 96
5.1) Descrição da amostra estudada 97
5.2) Análise de microssatélites 98
5.3) Comparação com os critérios de Amsterdã II e Bethesda 101
5.4) Comparação entre gênero e RER status 102
5.5) Comparação entre pacientes segundo o RER status 103
5.6) Comparação entre localização do tumor e demais variáveis 104
5.7) Sensibilidade e especificidade dos marcadores e dos critérios
clínicos (Amsterdã II e Bethesda) 105
06) Discussão 107
07) Conclusões 114
08) Referências Bibliográficas 116
09) Apêndice 1 – Termo de consentimento livre e esclarecido (modelo) 125
10) Apêndice 2 – Parecer consubstanciado do Comitê de Ética em Pesquisa
da Santa Casa 126
11) Anexo 1 – Ficha clínica dos pacientes 128
12) Anexo 2 - Descrição dos pacientes 129
Lista de Tabelas
8
Tabela 1: Descrição das características principais da amostra (pacientes e
tumores) estudada 97
Tabela 2: Resultados da pesquisa de MSI por cada marcador estudado em
66 pacientes portadores de CCR 100
Tabela 3: Freqüência de pacientes versus o número de marcadores com MSI
e RER status em 66 pacientes portadores de CCR 100
Tabela 4: Comparação dos resultados dos marcadores e RER status com
os critérios de Amsterdã II em 66 pacientes portadores de CCR 101
Tabela 5: Comparação dos resultados dos marcadores e RER status com
os critérios de Bethesda em 66 pacientes portadores de CCR 102
Tabela 6: Comparação dos resultados dos marcadores e RER status
com o gênero em 66 pacientes portadores de CCR 103
Tabela 7: Comparações entre RER status em 66 pacientes com CCR
e as seguintes variáveis: gênero, critérios clínicos e localização do CCR 104
Tabela 8: Comparações entre a localização do CCR e as seguintes variáveis:
gênero, critérios clínicos e idade 105
Tabela 9: Sensibilidade e especificidade dos marcadores e
dos critérios clínicos (RER status como padrão-ouro) 106
9
Lista de Quadros
Quadro 1: Síndromes hereditárias com aumento do risco de CCR 29
Quadro 2: MMRG de DNA relacionados ao HNPCC 46
Quadro 3: Características dos tumores extra-colorretais 55
Quadro 4: Critérios internacionais para avaliação do CCR MSI/ICG-HNPCC 61
Quadro 5: Critérios de interpretação dos resultados de MSI segundo ICG/HNPCC 61
Quadro 6: Loci alternativos para análise de MSI no CCR 62
Quadro 7: Seqüências dos iniciadores utilizados para análise de MSI 88
Quadro 8: Seqüências dos marcadores 89
Quadro 9: PCR para amostras a fresco e fixadas em parafina para o BAT 25 89
Quadro 10: Reação de amplificação para o BAT 25 90
Quadro11: PCR para amostras a fresco e fixadas em parafina para o BAT 26 90
Quadro 12: Reação de amplificação para o BAT 26 90
Quadro 13: PCR para amostras a fresco e fixadas em parafina para o BAT 40 91
Quadro 14: Reação de amplificação para o BAT 40 91
Quadro 15: PCR para amostras fixadas em parafina para o APC 91
Quadro 16: PCR para amostras a fresco para o APC 92
Quadro 17: Reação de amplificação para o APC/ amostras parafinadas 92
Quadro 18: Reação de amplificação para o APC/amostras a fresco 92
Quadro 19: PCR para amostras de tecidos fixados em parafina para o D2S123 93
Quadro 20: PCR para amostras de tecidos a fresco para o D2S123 93
Quadro 21: Reação de amplificação para tecidos fixados em parafina / D2S123 94
Quadro 22: Reação de amplificação para tecidos a fresco / D2S123 94
Quadro 23: PCR para amostras de tecidos fixados em parafina para o D17S250 94
Quadro 24: PCR para amostras a fresco para o D17S250 95
Quadro 25: Reação de amplificação para tecidos fixados em parafina / D17S250 95
Quadro 26: Reação de amplificação para tecidos a fresco / D17S250 95
10
Lista de Figuras
Figura 1: Eventos genéticos envolvidos na carcinogênese colorretal 35
Figura 2: Regulação da via APC/WNT 37
Figura 3: Via de carcinogênese TGF – β 40
Figura 4: Mecanismo reparador dos RER e as conseqüências da alteração
de cada um de seus componentes 47
Figura 5: Papel das mutações nos MMRG do DNA 51
Figura 6: Linha do tempo na síndrome de Lynch 56
Figura 7: MS: BAT25 98
Figura 8: MS: BAT 26 98
Figura 9: MS: BAT 40 98
Figura 10: MS: APC 99
Figura 11: MS: D2S123 99
Figura 12: MS: D17S250 99
11
Lista de abreviaturas e siglas:
As abreviaturas foram utilizadas para auxiliar a leitura do texto, tornando-a mais
dinâmica. Como quase a totalidade dos trabalhos sobre genética na literatura estão em língua
inglesa optou-se por mantê-las no original. Sempre que possível foram traduzidas para o
português, entre parênteses. As duas exceções, que foram mantidas em português, são o CCR –
câncer colorretal e INCA – Instituto Nacional do Câncer.
APC adenomatous polyposis coli (polipose adenomatosa do cólon)
APC-Wnt APC-WNT signaling pathway (via de sinalização APC-WNT)
BCL-2 apoptosis regulator (regulador de apoptose)
BAX BCL-2-associated X
CI chromossomic instability (instabilidade cromossômica)
CCR câncer colorretal
CIN chromossomic instability (instabilidade cromossômica)
COX ciclo-oxigenase
DCC deleted in colorectal cancer
DNA deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico)
DSH dishevelled protein
EDB Early Detection Branch
EXO-I exonuclease I
FAP familial adenomatous polyposis (polipose adenomatosa familiar)
FRZ frizzled-related protein (WNT pathway)
GSK-3 β glycogen synthase kinase 3
β
(glicogênio sintetase quinase 3 β)
IARC International Agency for Research on Cancer
ICG-HNPCC International Collaborative Group in Hereditary Nonpolyposis
Colorectal Cancer
IGI Intragenic instability (instabilidade intragênica)
IGF II R insulin-like growth factor II receptor
IHC imunohistochemistry (imunohistoquímica)
INCA Instituto Nacional do Câncer
hMLH1 mutL homolog 1
hMSH2 mutS homolog 2
hMSH6 mutS homolog 6
hPMS1 e 2 post meiotic segregation increased 1/2
hMSH3 mutS homolog 3
HNPCC hereditary non-polyposis colorectal cancer (síndrome de Lynch –
câncer colorretal hereditário sem polipose)
k-ras v-Ki-ras 2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
LOH loss of heterozigosity (perda de heterozigosidade)
MMRG mismatch repair genes (genes de reparo de pareamento)
MS microsatellite (microssatélite)
MSI microsatellite instability (instabilidade de microssatélites)
MSI-H microsatellite instability-high (alta instabilidade de microssatélites)
MSI-L microsatellite instability-low (baixa instabilidade de microssatélites)
MSS microsatellite stability (estabilidade de microssatélites)
NCI National Cancer Institute
NDNA Normal DNA (DNA normal)
OG Oncogene (gene tumoral)
OMIM Online Mendelian Inheritance in Man (Herança Mendeliana no
Homem,
12
Online)
PCNA proliferating cell nuclear antigen
p53 p53 protein, product of TP53 – 17p12 (proteína tumoral p53)
PCR polimerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase)
Ras/RAF/Mapk v-raf-1 murine leukemia viral oncogene homolog/
mitogen-activated protein kinase
RER replication error (erro de replicação)
RIZ retinoblastoma-protein-interacting zinc finger
RNA Ribonucleic acid (Ácido ribonucleico)
RPA single-stranded DNA-binding protein
SCC sporadic colorectal cancer (câncer colorretal esporádico)
TCF-4 transcription factor 4 (fator de transcrição 4)
TCF/LEF T-cell factor/lymphoid enhancing factor
TDNA Tumor DNA (DNA tumoral)
TGF-β transforming growth factor –
β
TGF β 1RII transforming growth factor
β
1, receptor II
TSG tumour suppressor gene (gene supressor de tumor)
Wnt wingless-type
13
Resumo:
A taxa de mortalidade devido ao câncer colorretal pode ser reduzida através da detecção e
tratamento deste tumor em estágio precoce, de preferência através da identificação e remoção
de pólipos adenomatosos, lesões precursoras destes tumores. A identificação dos indivíduos em
risco para o desenvolvimento destas lesões na população geral é cada vez mais importante para
adequada prevenção. A síndrome de Lynch (câncer colorretal hereditário sem polipose) é
responsável por cerca de 4% dos tumores colorretais na população ocidental. Como não há um
marcador patognomônico para o reconhecimento desta síndrome, a história familiar e o uso
racional dos critérios clínicos e biomoleculares tornam-se fundamentais para a realização da
prevenção secundária em cada grupo populacional. O objetivo deste trabalho é estudar uma
população de pacientes operados de adenocarcinoma colorretal utilizando critérios clínicos e
moleculares definidos atualmente para a identificação de portadores da síndrome de Lynch.
Foram estudados sessenta e seis pacientes,com idade média de 62,9 anos, operados por um
mesmo grupo de cirurgiões colorretais, após determinação de sua história familiar. Foram
colhidos tecidos tumoral e normal para análise genética quanto à presença de instabilidade de
microssatélites, utilizando-se os critérios de Bethesda.
Dos 66 indivíduos estudados, oito (12,1%) preencheram os critérios de Amsterdã II e 15
(22,7%) preencheram os critérios de Bethesda, com sensibilidade de 13,3% para Amsterdã II e
26,6% para Bethesda e especificidade de 88,2% e 78,4%, respectivamente, considerando o RER
status (positividade para erros de replicação após pesquisa de instabilidade de microssatélites –
MSI-H) como padrão-ouro. Para estudo molecular utilizaram-se seis marcadores (BAT25,
BAT26, BAT40, D5S346, D2S123 e D172250) conforme preconizado pelo NCI para a
classificação do RER status. Considerou-se MSI-H se dois ou mais marcadores fossem
positivos; MSI-L se apenas um fosse positivo e MSS se todos fossem negativos. Pacientes MSI-
H foram classificados como portadores de erros de replicação (ou RER positivo). O BAT25 foi
o mais sensível deles (86,7%) enquanto o BAT26 teve menor sensibilidade (66,7%), porém
14
especificidade de 100% em predizer o RER status. Quanto à localização do tumor houve
diferença estatística significativa com predominância dos tumores proximais nos pacientes que
apresentaram instabilidade (RER+), sendo dois terços destes. Neste estudo foram identificados
15 (22,7%) pacientes RER+, sendo quatro indivíduos (6%) RER+ e Bethesda+, portanto em
risco para HNPCC, que serão encaminhados para sequenciamento dos genes de reparo numa
próxima etapa deste trabalho.
Concluímos que, a identificação dos indivíduos em risco para câncer colorretal a partir da sua
história familiar é exeqüível e fundamental para adequada prevenção desta doença. A partir dos
critérios clínicos (Bethesda) devemos encaminhar os pacientes para os testes moleculares, para
que os possíveis portadores da síndrome de Lynch sejam identificados. Isto permitirá adequada
vigilância, não só para o câncer colorretal, mas também para as neoplasias extra-colorretais
associadas à síndrome.
.
15
Abstract
Mortality rates due to colorectal cancer (CRC) is still high, but can decrease through adequate
detection and treatment of the tumor in early stages. Identification and resection of colorectal
polyps is the main chain to reduce mortality rates in CRC. So, identification of high-risk people
as far as develoment of polyps and cancer in the general population are the best way to prevent
bad results in approaching this disease. CRC in patients with Lynch syndrome (HNPCC -
Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer) accounts for nearly 4% of all CRC in the
occidental population. The best way to identify this syndrome is the family history of
malignancies and the correct use of clinical criteria (Amsterdam and Bethesda) and genetic
assays (microsatellite instability – MSI - for replication errors –RER -) so as to achieve cancer
prevention in high-risk groups.
The aim of this study is to analyse 66 patients bearing CRC with the mean age of 62.9 years
who underwent colorectal resection for CRC by the same group of colorectal surgeons after
special attention to their family history for colorectal and extra-colorectal malignancies.
DNA was extracted from normal (NDNA – normal DNA) and tumor (TDNA – tumor DNA)
tissues of the same patient and both were analyzed: the DNA for MSI, and the patients for
Bethesda criteria. Eight (12.1%) of 66 patients fulfilled the Amsterdam II criteria and 15
patients (22.7%) fulfilled the Bethesda criteria, showing 88.2 % and 78.4% of specificity,
respectively. Six microsatellites markers (BAT25, BAT26, BAT40, APC, D2S123 and
DI72250) were used to analyse MSI as recommended by NCI (National Cancer Institute) as far
as RER status is concerned. BAT25 showed the highest and BAT26 the lowest sensibility rates
(86.7% and 66.7% respectively). But BAT26 displayed 100% specificity. Most (two thirds) of
MSI phenotype tumors (RER +) were distal to the splenic flexure. Four (6.6%) high-risk
patients for HNPCC were identified in this group and their NDNA and TNDN are to be sent to
16
have mismatch repair genes MLS1 expression protein determined by PCR sequencing in a next
study to be considered.
In conclusion, to identify high-risk patients for HNPCC through their family history of
malignancies and the correct use of clinical criteria (Amsterdam and Bethesda) and genetic
analysis (MSI/RER -) is the best way to prevent this disease. Patients fulfilling the Bethesda
criteria should undergo PCR sequencing for their NDNA and TDNA in order to identify
possible bearers of Lynch syndrome. And MSI/RER+ patients should be considered for
adequate surveillance not only for CRC but for all malignancies associated to the Lynch
syndrome (HNPCC).
17
18
Introdução
Introdução:
O câncer colorretal (CCR) apresenta uma incidência anual no mundo muito alta. Em
2006 estimam-se 945000 casos novos no mundo e 25360 no Brasil (11390 homens e 13970
mulheres), segundo a estimativa do INCA, 2006. Corresponde ao 4º tumor mais freqüente no
mundo, o segundo em países desenvolvidos, com sobrevida média mundial de 44%. O risco de
desenvolver CCR ao longo da vida, na população em geral, é de 6% (ROSSI et al., 2004).
Pacientes com risco familiar – aqueles que têm dois ou mais parentes de primeiro ou segundo
grau (ou ambos) com CCR - perfazem cerca de 20% de todos os pacientes com esta doença,
enquanto aproximadamente 5 a 10% destes tumores são de natureza mendeliana, isto é, são
herdados de forma autossômica dominante (LYNCH & DE LA CHAPELLE, 2003).
O CCR resulta do progressivo acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas que levam
à transformação do epitélio colorretal normal em adenocarcinoma colorretal. Esta
transformação pode seguir pelo menos duas vias moleculares genéticas. A maioria dos CCR
(cerca de 85%) começa a partir de uma instabilidade cromossômica (CI), o que envolve a via de
sinalização WNT (wingless type) e o gene APC (adenomatous polyposis coli), enquanto 10 a
15% destes tumores seguem a via de instabilidade de microssatélites (MSI) (alteração da função
dos genes de reparo do DNA - MMRG) (THIBODEAU, 1993; AALTONEN, 1993). As
alterações genéticas mais comuns nos tumores com CI são as perdas alélicas, amplificações
cromossômicas e translocações que afetam principalmente os genes supressores de tumor
(TSG) (APC, p53 e smad4) e alguns oncogenes (OG) (k-ras) (FEARON & VOGELSTEIN,
1990). Já os tumores com MSI mostram mutações com mudança na fase de leitura (frameshift)
e alteração no número de bases nos microssatélites (MS) (IONOV, 1993; PAPADOPOULOS,
1994; WHEELER, 2000). Estes erros normalmente são controlados e reparados pelos MMRG,
incluindo hMLH1, hMSH2, hMSH6, hPMS2 e hMSH3.
19
A deficiência no reparo do pareamento incorreto de DNA pode iniciar de forma
esporádica ou ser herdada de forma autossômica dominante, como na síndrome de Lynch
(HNPCC) – câncer colorretal hereditário sem polipose (JASS, 1999). Na maioria dos casos da
síndrome de Lynch, a causa é uma mutação germinativa herdada em um dos três principais
MMRG (hMLH1, hMSH2 e hMSH6), seguida por um segundo evento somático que leva à
perda da capacidade da célula para reparar erros durante a replicação do DNA levando, por
fim, ao desenvolvimento do câncer (BRONNER, 1994; THIBODEAU, 1998). Entretanto, cerca
de 15% dos tumores colorretais mostram MSI sem evidência de anormalidades germinativas.
Nestes casos a causa é a metilação das ilhas CpG na região promotora do gene hMLH1, uma
alteração epigenética que leva à deficiência dos MMRG (CUNNINGHAM, 1998).
Nos últimos anos a detecção de MSI tem se tornado importante de forma progressiva.
Esta detecção não apenas permite a identificação do HNPCC, permitindo a identificação
precoce dos indivíduos em risco, como também esta alteração nos MS está associada com a
resposta à quimioterapia (pior resposta nos pacientes com MSI) e com o prognóstico dos
pacientes com CCR (melhor prognóstico nos pacientes com MSI) (UMAR, 2004).
A literatura internacional mostra um crescente interesse pelo conhecimento das
populações no que diz respeito à síndrome de Lynch – identificação de famílias portadoras da
doença, critérios clínicos e laboratoriais para esta identificação, identificação de mutações nos
MMRG com criação de bancos de dados de acesso público, além de técnicas custo-benefício
mais indicadas para este diagnóstico. A possibilidade de diagnosticar e remover pólipos
adenomatosos benignos, impedindo sua transformação em adenocarcinomas, cria a necessidade
de se identificarem indivíduos em risco na população, estabelecendo critérios para adequada
prevenção e vigilância (idade de início, intervalos entre os exames e propedêutica para os
tumores extra-colorretais associados com a síndrome de Lynch). Embora muito já tenha sido
estabelecido, ainda há muito para se descobrir e padronizar. Vários trabalhos mostram que não é
possível simplesmente transpor os dados internacionais para o nosso meio, devido às diferenças
20
raciais, étnicas e de hábitos de vida. As medidas diagnósticas e preventivas necessárias têm um
elevado custo, o que dificulta a sua aplicação de forma ampla. Finalmente, para fazer uso
adequado destes exames, os médicos deveriam se familiarizar com os critérios clínicos em uso
para identificação de indivíduos em risco (atualmente os critérios de Bethesda revisados são os
mais efetivos) (UMAR, 2004).
Apesar da alta incidência da doença no nosso meio, ainda são escassos os trabalhos
visando conhecer melhor esta população. Este trabalho tem como objetivo principal
caracterizar, clínica e geneticamente, uma população de pacientes operados de CCR no estado
de Minas Gerais; e seus resultados poderão contribuir para a definição de uma abordagem
propedêutica e terapêutica confiáveis, com custo-benefício adequado para a nossa população.
21
22
Revisão da Literatura
“Nada na vida deve ser temido,
Somente compreendido.
Agora é hora de compreender mais,
Para temer menos.”
(Marie Curie, física)
Revisão da literatura:
2.1) Introdução:
A causa do CCR é multifatorial envolvendo susceptibilidade genética, fatores
ambientais e alterações genéticas somáticas adquiridas durante a progressão do tumor. A
história familiar de CCR é um fator de risco significante e pode ser encontrada em até 20% de
todos os pacientes com este tipo de câncer (WIJNEN et al., 1998). Podemos classificar o CCR
em dois tipos:
1) SCC (sporadic colorectal cancer): CCR esporádico, não hereditário, certamente o tipo
mais frequente na população;
2) CCR hereditário, que engloba:
2.1) Síndromes com polipose: caracterizadas pela presença de polipose intensa, entre elas a
FAP (familial adenomatous polyposis) ou polipose adenomatosa familiar, a síndrome de Peutz-
Jeghers, a polipose juvenil familiar e a síndrome de polipose mista hereditária.
2.2) Síndromes sem polipose: HNPCC (hereditary nonpolyposis colorectal cancer),
síndrome de Lynch ou o câncer colorretal hereditário sem polipose: é o tipo de CCR
familiar mais comum. O HNPCC é uma doença hereditária, autossômica dominante
onde a característica molecular típica é uma mutação nos MMRG no momento da
replicação celular (BAILEY-WILSON et al., 1986).
2.1.1) Histórico:
Apesar da maioria dos conhecimentos sobre a síndrome, principalmente sobre a sua
base molecular, ter surgido nos últimos 10 anos, o HNPCC teve seu primeiro registro em 1895
quando Aldred Warthin, então um patologista da Faculdade de Medicina da Universidade de
23
Michigan, descreveu a família G – Germany family (WARTHIN, 1913, 1925, 1931 apud
LYNCH & SMYRK, 1996). Nesta data, sua costureira teria dito a ele que morreria em idade
precoce de câncer de cólon ou em seus órgãos reprodutores pois “a maioria das pessoas de sua
família morria destes tipos de tumores”. Como ela havia dito, sua morte ocorreu devido a um
câncer endometrial. Sua família, agora conhecida como família G, foi estudada por Warthin e
mais tarde por Hauser e Weller (1936, apud LYNCH & SMYRK, 1996). Entretanto, o
significado da ocorrência dos tumores de cólon, estômago e endométrio na família G só seria
valorizado muitos anos mais tarde, em 1966, quando uma síndrome que predispunha ao câncer
foi observada em duas famílias e nomeada como síndrome do câncer familiar (LYNCH et al.,
1966). Mais tarde passou a ser conhecida como HNPCC e posteriormente como síndrome de
Lynch I e II (BOLAND & TRONCALE, 1984).
2.1.2) Definição:
A síndrome de Lynch I é caracterizada por uma susceptibilidade herdada ao CCR, de
caráter autossômico dominante e com alta penetrância (80%-85%). É caracterizada por início da
doença em idade precoce (aproximadamente aos 44 anos), tendo maior ocorrência no cólon
proximal à flexura esplênica (em 70% dos casos), excesso de tumores colorretais sincrônicos e
metacrônicos (em 35% dos pacientes, sendo que destes, 45% dentro de 10 anos após ressecção
colorretal incompleta) e o achado de MSI em mais de 90% dos casos.
A histologia dos tumores também tem achados típicos que incluem carcinomas
pobremente diferenciados, com alto conteúdo mucíparo, células em anel de sinete e histologia
indiferenciada ou medular.
A síndrome de Lynch II tem, além da predisposição a estes tumores já descritos, a
associação freqüente de tumores em outras localizações como endométrio, estômago, ovários,
intestino delgado, ureter, pelve renal, cérebro e trato hepato-biliar (AARNIO et al., 1995;
24
SIJMONS et al., 1998; VASEN et al., 1996a, 1996b; WATSON & LYNCH, 1993). A família
Warthin era portadora desta síndrome.
Os adenomas (pólipos) que ocorrem no HNPCC tendem a se desenvolver em uma
idade precoce, com maior componente viloso (que está associado à maior tendência de
transformação maligna) e são mais displásicos do que os adenomas esporádicos detectados na
população geral (JASS & STEWART, 1992). Embora múltiplos adenomas possam ser
encontrados no HNPCC, uma polipose intensa não é característica. Destarte, quanto maior o
número encontrado destas características em uma família, maior a suspeita de se tratar de uma
família portadora de HNPCC.
2.1.3) Freqüência da doença:
Uma série de estudos internacionais documentou a existência de famílias com câncer
em países ao redor do mundo, incluindo Inglaterra, Nova Zelândia, Países Baixos, Itália, Israel
e Finlândia. O grupo finlandês, em virtude do seu acesso ao registro de câncer populacional, foi
capaz de demonstrar que a síndrome não era rara naquele país (LYNCH & SMYRK, 1996).
Entretanto, apesar dos inúmeros estudos, a prevalência real da síndrome de Lynch ainda não é
conhecida. A freqüência de HNPCC na população geral parece variar entre 1 a 5% de todos os
CCR. Esta variação pode ser devida a diferenças étnicas, mas é mais provável que isto se deva à
variação dos critérios utilizados para a definição da síndrome. Além disto, há as dificuldades de
compilação adequada de dados, falta de verificação de registros de câncer na população e a falta
de colaboração dos parentes dos indivíduos afetados, o que contribuiria para a sub-notificação
da síndrome. Há, também, aqueles casos em que o indivíduo afetado é o primeiro caso na
família e não preenche os critérios clínicos de Amsterdã para ser identificado como portador da
doença (BELLACOSA et al., 1996).
25
Assim, independente das características mencionadas, deve-se realizar uma busca pela
história familiar e, se possível, estudo genealógico extenso em todos os pacientes portadores de
câncer colorretal.
26
2.2) Bases genéticas do câncer e a relação com o HNPCC:
2.2.1) Definição do câncer:
O câncer é uma das principais causas de morte entre os seres humanos. Apesar disto,
até bem recentemente, não se sabia como um tumor se formava a partir de um tecido normal,
como se desenvolvia e como era possível que suas células se instalassem em outros órgãos,
como metástases. Os estudos epidemiológicos apontavam fatores de risco para o
desenvolvimento de neoplasias e as doenças eram classificadas de acordo com sua histologia e
localização anatômica. Porém, na prática, observava-se que os pacientes evoluíam de forma
imprevisível, particularizada, sem ser possível prognosticar sua evolução clínica com os dados
que eram conhecidos.
A partir das descobertas sobre a carcinogênese, com os conhecimentos progressivos
em biologia molecular, foi possível demonstrar que alterações ocorridas em nível intracelular
eram capazes de alterar os mecanismos de divisão celular levando ao desenvolvimento de novos
tecidos (neoplasias).
Era sabido, há muito tempo, que um pólipo benigno poderia se transformar em câncer,
porém, a forma como isto ocorria era completamente desconhecido até há cerca de uma década.
Foi a partir dos trabalhos de Fearon e Vogelstein (1990), que ficou bem demonstrada esta
relação entre alterações genotípicas e fenotípicas no CCR. Estes autores pressupõem que as
neoplasias são de natureza clonal, ou seja, todas as células malignas de um tumor derivam de
um único progenitor. Esta célula progenitora experimenta uma ou mais mutações que lhe
conferem vantagens proliferativas. Uma vez que uma célula-filha adquire uma nova mutação
que se traduz em uma vantagem biológica adicional, uma nova onda de expansão clonal ocorre.
Este processo se sucede até que uma célula adquira uma série de mutações suficiente para
torná-la independente do controle do meio, com crescimento desordenado, evasão de
27
mecanismos normais de apoptose, indução de angiogênese, instabilidade genômica importante,
capacidade de invasão local e dos tecidos adjacentes e, finalmente, a capacidade de
metastatizar-se (CUTAIT et al., 2004).
Estima-se que, após a mutação do gene APC, evento precoce no desenvolvimento do
pólipo, seriam necessárias a presença de no mínimo quatro a sete mutações acumuladas em
genes diferentes, entre os quais K-ras, DCC e o p53. Cada uma destas mutações produziria uma
vantagem clonal seletiva, levando à progressão desde o adenoma simples, através de estágios
progressivos de degeneração adenomatosa, até o CCR (CAHILL et al., 1999).
Hoje, portanto, pode-se definir o CCR como o resultado final do acúmulo de mutações
em genes que participam do controle da proliferação e morte celular. A aquisição de alterações
genéticas por uma célula normal leva a uma progressiva independência da mesma em relação
aos fatores que controlam o ciclo celular normal. Estas alterações genéticas podem ser
herdadas, germinativas (o indivíduo já recebe a alteração de um de seus pais e a carrega em
todas as suas células) ou podem ser mutações adquiridas, somáticas, que ocorrem a partir de
estímulos externos ou de hábitos de vida e não serão transmitidas.
2.2.2) Fatores hereditários e não-hereditários:
Os tumores herdados respondem por cerca de 5-10% de todos os CCR e nestas
famílias pode-se identificar uma segregação monogênica do câncer denominado “câncer
hereditário”. Quadro 1
Quadro 1: Síndromes hereditárias com aumento do risco de câncer colorretal (ALONSO et al., 2006)
Síndrome Gene
envolvido
Locus
Adenoma e carcinoma colorretal múltiplo (MAP) MYH 1p34.3-1p32.1
28
Carcinoma colorretal hereditário e agenesia dental AXIN2 17q24
Câncer colorretal hereditário HNPCC MSH2
MLH1
PMS1
PMS2
MSH6
TGF-B RII
MSH5
CDH1
EXO1
MLH3
2p21-22
3p21
2q31-q33
7p22
2p16
3p22
6p22-21
16q22.1
1q42-43
14q24.3
Desmóide hereditário APC
SDHB
5q2q22
1p36.1-p35
Polipose adenomatosa familiar APC
MYH
AXIN2
5q21-q22
1p34.3-1p32.1
17q24
Polipose juvenil MADH4
BMPR1A
18q21.1
10q22.23
Síndrome de predisposição ao câncer mama-cólon CHEK2 22q12.1
Síndrome de Bannayan-Riley-Ruvacalba PTEN 10q23.3
Síndrome de Cowden (hamartomatose múltipla) PTEN 10q23.3
Síndrome de Gardner APC 5q21-q22
Síndrome de Gorlin (basalioma nevóide) PTCH 9q22.3
Síndrome de Muir-Torre MSH2
MLH1
2p21-22
3p21
Síndrome de Peutz-Jeghers PMS2 7p22
Síndrome de Turcot MLH1 3p21
Além destas síndromes, em cerca de 20% das famílias com CCR, existem
antecedentes de dois ou mais familiares de primeiro grau com esta doença, sugerindo que existe
uma ação sinérgica de alterações poligênicas e fatores epigenéticos (alterações no genoma nas
quais não há mutação dos genes mas alteração em suas regiões promotoras, levando ao seu
silenciamento e à ausência de produção de sua proteína) que conferem a estes indivíduos 1,5 a
2,5 vezes maior risco de desenvolvimento da doença que a população geral. Isto é o que se
constitui como “câncer familiar”.
Segundo dados da IARC (International Agency for Research on Cancer) a idade
média ao diagnóstico de CCR se situa em 67,9 anos. A apresentação das variantes hereditárias
mostra um adiantamento de 10-15 anos quando consideradas as mesmas localizações para
tumores esporádicos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002).
29
Em relação aos estímulos externos vários fatores podem funcionar como gatilhos na
promoção da carcinogênese, ao induzir modificações na fisiologia normal dos tecidos, levando
a um aumento do metabolismo: sedentarismo e obesidade (devido a níveis mais elevados de
insulina circulante, a qual exerce uma ação positiva sobre o ciclo celular, atuando como fator
de crescimento); níveis hormonais como os estrogênios, por exemplo; aumento na produção de
radicais livres, com sua ação oxidante (a ingestão de frutas e verduras frescas, alimentos ricos
em agentes antioxidantes, tem uma ação aparentemente protetora que se relaciona de forma
inversamente proporcional à incidência de câncer); estado de inflamação crônica e proliferação
celular reativa (ingestão de bebidas alcoólicas e exposição exagerada ao sol). Nestes casos há
um estado permanente de estímulo proliferativo, o que aumenta a possibilidade de ocorrência de
mutações que afetam genes cujo produto protéico atua no controle do ciclo celular, levando ao
surgimento da característica básica da neoplasia, que é a incapacidade da célula em responder
aos estímulos inibitórios para a divisão celular (PINHO, 2005).
2.2.3) Mutações genéticas:
Quando uma célula portadora de uma mutação não responde à inibição a sua divisão,
dará origem à células-filhas que, além de preservarem aquela mutação já existente, acumularão
novas mutações e continuarão a se multiplicar, o que levará à formação do tecido neoplásico.
Estas mutações podem ser divididas em dois grupos:
1) Instabilidades intra-cromossômicas (CIN): pode haver ganho ou perda de um ou mais
cromossomos, o que irá resultar em alteração da ploidia celular. Pode também ocorrer
um rearranjo em fragmentos dos cromossomos como translocações, inversões, deleções,
duplicações ou inserções. O ganho de um fragmento cromossômico pode levar à
superexpressão gênica devido à presença inadequada de várias cópias do mesmo gene,
enquanto a perda de um gene (deleção) leva à ausência na sua expressão. Genes que são
alvos de mutação em que há ganho de função codificam proteínas que atuam como
30
propulsores do ciclo celular e são chamados de oncogenes (OG). Estes genes induzem à
produção de células imortais, capazes de evitar a apoptose (PARK, 1998). Hoje se
conhece a existência de mais de cem destes OG, a maioria deles implicados em
alterações somáticas. Entretanto, alguns casos raros de câncer familiar gastrointestinal
também se devem a mutações constitucionais em OG (NISHIDA et al., 1998).
2) Instabilidades na seqüência de nucleotídeos (intragênicas) (IGI): são anormalidades que
ocorrem no pareamento de nucleotídeos ao longo do DNA. Dependendo de onde a
alteração ocorre haverá diferentes efeitos sobre a expressão do gene. Se um único
nucleotídeo é trocado (mutação pontual) isto pode levar a uma alteração na composição
da proteína a ser codificada por aquele gene. No momento da leitura daquela seqüência
(tradução) aquele nucleotídeo trocado pode levar à codificação de um aminoácido
errado (erro de sentido - missense). Se este nucleotídeo leva ao surgimento de um códon
de terminação (stop codon), ou seja, uma tríade de nucleotídeos que determina uma
parada na leitura daquela seqüência gênica, ocorrerá interrupção precoce da proteína,
que é chamada proteína truncada (nossense). Pode ainda ocorrer a inserção ou deleção
de um ou mais nucleotídeos, o que leva a uma mutação com mudança na fase de leitura
(frameshift), porque altera todo o processo de tradução a partir daquele ponto, com a
formação de uma proteína completamente modificada, numa seqüência de nucleotídeos
sem sentido. Os genes afetados por este tipo de alteração são conhecidos como TSG. Os
TSG têm sido mais relacionados à síndromes hereditárias de predisposição ao câncer do
que os OG. Eles estão envolvidos na parada do ciclo celular, ou seja, no controle para
que a divisão do DNA ocorra organizadamente ou na manutenção da célula em estado
quiescente (na fase G0) e na indução da apoptose (morte celular). Podemos dividir os
genes supressores de tumor em:
31
a) “gatekeepers” (porteiros ou guardiões): são os TSG clássicos como o TP53,
RB1, VHL ou APC, cuja inativação bialélica é determinante para o
desenvolvimento da neoplasia no tecido.
b) “caretakers” (zeladores): ao contrário dos TSG (gatekeepers), não têm papel
essencial no desenvolvimento da neoplasia mas atuam como supressores
indiretos, acelerando o curso do processo. Nesta categoria foram incluídos
inicialmente os MMRG, como o MLH1 e MSH2, considerados, posteriormente,
como genes de estabilidade, e os controladores do ciclo celular (KINZLER &
VOGELSTEIN, 1997).
c) “landscapers”(indicadores): estão implicados na explicação de doenças como os
pólipos endometriais, retocolite ulcerativa e polipose juvenil, onde as alterações
clonais estão nas células estromais e não nas células epiteliais (KINZLER &
VOGELSTEIN, 1997, 1998).
2.2.4) Fenômenos epigenéticos:
Além destes mecanismos, existem alterações epigenéticas que levam à alteração na
função dos genes, mas que não envolvem nenhum defeito direto na estrutura física do gene e
sim resultam de modificações químicas das bases do DNA. Estes genes perdem sua função, não
pela aquisição de mutações, mas por obstrução de mecanismos normais que os estimulam a
transcrever uma proteína.
O exemplo mais típico deste tipo de anormalidade é a metilação das regiões que
induzem os genes a transcrever. Muito próximo ao início dos genes existe a região promotora,
onde proteínas regulatórias de genes se ligam para ativar a transcrição daquele gene, produzindo
sua proteína correspondente. A metilação de um promotor impede que os fatores de transcrição
se liguem ao mesmo, e, desta forma, bloqueiam a transcrição do gene correspondente. Cada
gene tem seu próprio promotor, e a metilação é um fenômeno habitual e necessário em células
32
normais, para que genes (cuja ativação seria indesejável) possam manter-se inativos. Porém, em
determinados casos, a metilação de um promotor pode bloquear um gene importante para o
funcionamento da célula, contribuindo para o desenvolvimento de um câncer. Entre os alvos
mais comuns de metilação no CCR figuram os que regulam o ciclo celular, como o p16
ink4a
;
MMRG como o MLH1 e O
6
-MGMT; moduladores de apoptose, como o p14
arf
e o gene
multifuncional APC (CUTAIT et al., 2004).
2.2.5) Vias de Carcinogênese:
Em uma célula tumoral há várias mutações genéticas envolvendo genes gatekeepers e
caretakers. A maneira pela qual esta combinação de defeitos genéticos ocorre no CCR pode
distinguir duas vias de malignização, que resultam em doenças diferentes (CHUNG, 2000):
1) Instabilidade cromossômica (CIN): é a via que ocorre em cerca de 80% dos casos de
CCR. Caracteriza-se por um padrão de ganhos ou perdas de cromossomos inteiros
(aneuploidia), indicando a presença de defeitos em sistemas responsáveis pela separação
apropriada dos cromossomos durante a divisão celular. O achado mais comum é a
inativação de genes gatekeepers, freqüentemente identificada por um fenômeno
chamado perda de heterozigose (LOH). Esta LOH caracteriza a perda de função de
ambos os alelos de um gene, geralmente o primeiro por mutação e o segundo por
deleção (LENGAUER et al., 1998). O gene APC tem importante papel como
gatekeeper, e a inativação desta proteína é um achado muito freqüente em etapas iniciais
da transformação neoplásica, em vários tumores do trato digestivo. O gene APC aparece
mutado em cerca de 70 a 80% dos CCR e até 50% deles mostram mutações
independentes na β-catenina, destacando o papel preponderante da via WNT para o
controle da tumorigênese colorretal, principalmente em seus estágios iniciais) (SPARKS
et al., 1998). A mutação germinativa do APC é o evento causador da FAP.
33
2) Instabilidade intragênica (IGI): responde por cerca de 20% dos casos de CCR. O evento
desencadeador é a perda de função caretaker, representada pelos MMRG durante a
duplicação do DNA (LENGAUER et al., 1998).
Apesar destas subdivisões – CIN, IGI, gatekeepers e caretakers – indicarem a
existência de duas vias de carcinogênese e dois grupos de genes que participam destas vias, o
processo não é estanque e sim dinâmico. Alguns genes têm papel relevante em ambas as vias,
tendo funções tanto como gatekeepers como caretakers. Assim, a melhor forma de estudar o
desenvolvimento do CCR é através das alterações que afetam os conjuntos de genes que
interagem em vias fisiológicas distintas e cruciais para a manutenção do epitélio colorretal.
Estas vias consistem de uma cascata de genes que se ativa de forma ordenada e com resultados
finais específicos, como a indução de proliferação celular ou a produção de algum fator
fundamental para a sobrevivência da célula, como proteínas de membrana ou de citoesqueleto
(CUTAIT et al., 2004). Figura 1
34
Figura 1: Representação esquemática dos eventos genéticos envolvidos na carcinogênese colorretal (adaptado de Fearon & Vogelstein, 1990)
Epitélio
normal
Displasia
em criptas
Adenoma
inicial
Adenoma
tardio
Carcinoma
in situ
Carcinoma
invasivo
APC/β-catenina
K-ras/LOH
K-
ras
TGF-β
TGF-β
Caderina-E
α-catenina
MSH2
MLH1
MSH6
Aumento da instabilidade genômica
Aumento da metilação anormal de diversos genes
Via II - MSI
Via I- APC/WNT
2.2.6) Vias de sinalização nas células colônicas normais e tumorais:
Os genes mais afetados no desenvolvimento do SCC são os que participam das vias
APC/WNT, TGF—β, Ras/Raf/MapK e p53. No HNPCC (tumor MSI), os genes que estão
mutados participam de vias diferentes daquelas observadas nos tumores esporádicos. Porém,
quando a neoplasia está em fases mais avançadas, é possível encontrar anormalidades em genes
comuns aos dois mecanismos de cancerização, a CIN e a MSI.
Via Wnt/APC/β-catenina:
Como dito acima, o gene APC tem papel fundamental na progressão do CCR. Isto se
deve à sua importante ação regulatória de uma via celular que transmite os sinais de
receptores de superfície para o núcleo, modificando a expressão de diversos genes. Esta via,
chamada de wingless-type (Wnt), é importante para o desenvolvimento embrionário e
mantém-se ativa em células epiteliais intestinais onde desempenha função na renovação da
mucosa (BIENZ & CLEVERS, 2000). Figura 2
36
Figura 2: Representação esquemática da regulação da via APC/WNT – via
wingless-type (ROEL, 2006)
37
Na ausência da proteína WNT (figura 2, á esquerda) as moléculas de β-catenina são
capturadas pela proteína APC, tanto no citoplasma como no núcleo celular e conduzidas
para a formação de um complexo com a axina e GSK-3β (glicogênio sintetase quinase 3-β).
A GSK-3β fosforila todas as proteínas do complexo, incluindo a β-catenina que é removida
por mecanismos de ubiqüinação e degradação por proteossomos. A redução dos níveis de β-
catenina compromete a transcrição de diversos genes por meio de recrutamento de co-
fatores repressores. Na presença de proteínas WNT na superfície celular (figura 2, à direita),
um grupo de receptores frizzled (FRZ), é ativado e fosforila a proteína dishevelled (DSH).
Esta, em conjunto com a caseína-quinase I (CKI), inativa a GSK-3 β. Desta forma, o
complexo fosforilado β-catenina, APC e axina não se forma. β-catenina deixa de ser
destruída e seus níveis se acumulam no citoplasma. Assim, esta proteína migra para o
núcleo celular e lá se acumula, formando um complexo com os fatores de transcrição
TCF/LEF (T cell factor/lymphoid enhancing factor), responsáveis pela transcrição de genes
envolvidos no crescimento celular, o que inibe a ação dos co-fatores de repressão e dispara
a transcrição destes genes.
O complexo TCF/LEF tem sua função limitada pelos níveis de β-catenina no núcleo.
Na ausência de β-catenina, TCF/LEF recruta fatores inibitórios da transcrição de diversos
genes. No entanto, na presença de β-catenina, estes dois fatores formam um complexo
capaz de reverter os fatores inibitórios de transcrição e de atrair proteínas que aumentam a
transcrição e a expressão gênicas.
Assim, explica-se porque muitos dos genes ativados pelo complexo TCF/LEF estejam
anormalmente expressos em pólipos e em células de CCR. São exemplos de genes
controlados por esta via: ciclina DI (gene central na passagem da fase S para M durante o
ciclo celular), MDRI (gene de sistema de detoxificação das células e de resistência a
38
drogas), COX-2 (ciclo-oxigenase-2) (enzima da via metabólica de prostaglandinas) e
gastrina, entre outros (LYNCH & HOOPS, 2002).
A β-catenina tem, portanto, importante papel na ativação da via Wnt, com a
transcrição exagerada de genes que favorecem a proliferação celular. Estudos em tumores
humanos revelaram que, de fato, mutações no gene da β-catenina são eventos relativamente
comuns em CCR em que o APC está com função normal, ocorrendo em até 50% destes
casos (cerca de 10 a 15% de todos os casos de CCR) (SPARKS et al., 1998).
Os outros genes implicados nesta via Wnt também têm sido estudados amplamente em
cânceres humanos, porém ainda não se demonstraram mutações patogênicas nos mesmos
(POLAKIS, 2000).
Via TGF-β:
O TGF-β (transforming growth factor
β
) é um entre os vários membros de uma
família de proteínas que desempenham papel importante na condução de sinais
intracelulares e que estimulam a divisão e a diferenciação celular. O TGF-β encontra-se
expresso em uma grande variedade de tecidos de origem mesenquimal e epitelial. Em
células epiteliais, incluindo colonócitos, o TGF-β é um inibidor de crescimento (WONG &
LAI, 2001). A perda de sensibilidade de certas células epiteliais (por exemplo, pâncreas,
mama e cólon) ao TGF- β está diretamente relacionada à progressão maligna.
39
Figura 3: Esquema do funcionamento da via TGF-β (FANG, 2003)
40
A proteína TGF-β inicia a sinalização ao ligar-se com os receptores TGF-β RI e TGF-
β RII. A ligação permite que TGF-β RII fosforile TGF-β RI, desencadeando uma cascata de
sinais mediados por proteínas que se ativam seqüencialmente, em especial as proteínas da
família Smad. Inicialmente, as proteínas R- Smad que se encontram inativas na membrana,
ligadas à proteína Sara, são fosforiladas e conseguem liberar-se e alterar sua conformação.
Então, estas moléculas de R- Smad ligam-se às proteínas Co- Smad, que também se ativam,
criando um complexo R- Smad /Co- Smad. Este complexo transloca-se para o núcleo, onde
atua como fator transcripcional para uma série de genes vitais para a sobrevivência da
célula, alterando, desta forma, a capacidade de perpetuação da mesma. As proteínas Smad
podem produzir efeitos opostos em uma mesma célula ao atuarem sobre genes diferentes.
Esta variabilidade de efeitos se deve à capacidade de interagirem com diversas outras
proteínas de sinalização e fatores transcripcionais.
Estudos com diversas linhagens de CCR mostraram que cerca de 75% destes tinham
perda de controle de crescimento celular dependente de TGF-β (GRADY et al., 1999). Isto
não surpreende, dada a alta complexidade e o grande número de interações da mesma. Há
uma grande probabilidade de que uma célula que tenha adquirido várias mutações no
processo de carcinogênese possa, em algum momento, ter algum elemento da via TGF-β
comprometido e ter esta via parcial ou totalmente inativada.
Uma das alterações mais comuns de inativação de TGF-β ocorre por meio de
mutações no receptor TGF-β RII. Uma característica das mutações neste receptor é a MSI
de alta frequência. De fato, a MSI é encontrada em até 90% dos tumores com mutações nos
dois alelos deste receptor. Esta alta taxa de MSI pode ser explicada pelo fato de o gene
TGF-β albergar duas seqüências de MS que são os alvos mais comuns de mutação no gene
(HUSSAIN et al., 2000). Estudos experimentais e observações feitas em adenomas sugerem
41
que a inativação de TGF-β RII causada por estas mutações é evento tardio na carcinogênese
colorretal (CUTAIT et al., 2004).
Também já foram identificadas mutações que inativam as proteínas Smad e que estão
envolvidas na progressão de CCR e outros tumores, como o câncer de pâncreas. Estas
mutações podem ocorrer nas proteínas Smad 4 ou Smad 2, cujo gene se encontra muito
próximo do gene DCC, no cromossoma 18 (CUTAIT et al., 2004). A perda de função de
qualquer um destes genes, por mutações ou deleções, leva à resistência na via TGF-β e,
conseqüentemente, à liberação descontrolada de sinais proliferativos.
Via p53:
O p53 é conhecido como o “guardião do genoma” devido às suas funções na
manutenção da integridade do DNA. Esta proteína tem papel importante durante a divisão
celular, quando ela pára o ciclo celular para permitir correção de defeitos no DNA; e,
quando não é possível esta correção, induz a célula à apoptose, impedindo sua divisão e
propagação de mutações, com a conseqüente formação de clones de células mutadas. Sua
função é exercida através da alteração de diversos genes, com funções muito diferentes e
que necessitam rígida regulação para a manutenção do equilíbrio entre sobrevivência e
apoptose.
A inativação de p53 é um fenômeno tardio na carcinogênese colorretal, com exceção
do câncer associado à colite. Em até 70% dos casos de CCR ocorre, inicialmente, a
inativação de um alelo de p53 por mutação, seguida da perda completa do outro alelo. Nos
outros casos (30%), fenômenos epigenéticos são responsáveis por esta inativação
(HUSSAIN et al., 2000).
Via ras:
42
A proteína k-ras é uma das proteínas codificadas pela família de genes ras e se
expressa em tecidos epiteliais como o epitélio colônico. Estas proteínas encontram-se nas
porções intracelulares de receptores da membrana celular e, quando fosforiladas (ativas),
elas acionam vias efetoras distintas dentro da célula, tais como raf/MAPK (que participa da
conexão de outras vias que promovem a entrada da célula em ciclo) ou PI3K/Akt (que
regula um complexo equilíbrio entre sobrevivência e apoptose).
Ras é um oncogene típico, pois seu papel na carcinogênese ocorre por um ganho de
função e não por inativação do gene. Em 70 a 80% dos casos de SCC podem-se encontrar
mutações em regiões específicas do gene, os códons 12, 13 e 61. Estas regiões são
reconhecidas por enzimas que transformam a forma ativada da proteína ras em uma forma
inativa, por meio da hidrólise da primeira, desligando a cascata de sinalização ras. Estas
mutações tornam os sítios de ligação irreconhecíveis para a enzima, e os sinais
proliferativos disparados por ras tornam-se permanentes (CUTAIT et al., 2004). Estas
mutações em k-ras, embora fenômeno muito precoce na carcinogênese colorretal, são
extremamente raras em CCR com MSI, como no HNPCC.
Assim, apesar do enorme número de genes implicados hoje no desenvolvimento do
CCR, ainda não se conhecem todos eles e há uma tendência evidente de que estes genes estejam
relacionados a uma das duas vias de carcinogênese colorretal: CIN e IGI (MSI/RER).
2.2.7) Genes de reparo do DNA (Mismatch Repair Genes – MMRG) e HNPCC:
Os pacientes com HNPCC herdam uma mutação em um dos MMRG. Durante uma
divisão celular ocorre a replicação do DNA a partir de uma fita molde, de forma muito precisa,
para que os nucleotídeos sejam pareados na seqüência exata. Quando ocorre algum erro nesta
replicação, chamado de mutação, este poderá ser transmitido às células-filhas ou, se for uma
célula germinativa, poderá ser herdado pelo indivíduo gerado a partir deste zigoto alterado. As
43
conseqüências podem ser, portanto, muito graves. Assim, apesar da ocorrência destas mutações
serem raras, para evitá-las, o ciclo celular dispõe de importantes mecanismos de prevenção e
reparo do DNA, os quais aparentemente corrigem cerca de 99% dos RER, reduzindo para 1/10
9
a probabilidade destas replicações anormais (PINHO, 2005). De forma simplificada, o sistema
de reparo de pareamento identifica, excisa e corrige seqüências de DNA através da remoção de
um segmento de 100 a 200 nucleotídeos incluindo o defeito, sendo este espaço preenchido
corretamente através da ação da proteína DNA-polimerase δ. Os erros de pareamento podem
ocorrer devido a pareamento de base incorreta (C-A ao invés de C-G, por exemplo) ou por
deslizamento da DNA-polimerase (enzima responsável pela replicação do DNA) sobre a fita
molde. Este deslizamento (slippage) ocorre com maior freqüência durante a replicação de
sequências repetidas longas, aumentando ou diminuindo o número de nucleotídeos destas
sequências.
A identificação dos genes responsáveis pelo HNPCC tornou-se possível devido a um
trabalho crítico com MS do DNA. MS são seqüências repetidas que estão distribuídas através
do genoma humano, em regiões codificantes e não-codificantes, mais comumente (A)n/(T)n
(mononucleotídeos) e (CA)n/(GT)n (dinucleotídeos). A função dos MS é desconhecida, porém,
devido ao seu alto grau de polimorfismo, são muito úteis na identificação de cada pessoa, sendo
considerados as impressões digitais do DNA de cada indivíduo.
Os MMRG foram inicialmente estudados em bactérias, nas quais três proteínas foram
identificadas: MutS, MutL e MutH. Pelo menos sete MMRG estão envolvidos em todo o
sistema de reparo em humanos e seus nomes derivam da similaridade estrutural entre eles e os
genes correspondentes encontrados nas bactérias: MSH2, MSH3 E MSH6 – homólogos a MutS;
MLH1 e MLH3 – homólogos a MutL. Dois outros genes, sem homologia em bactérias também
participam do MMRG humano: PMS1 e PMS2 (proteínas de segregação pós-meiótica)
(MARRA & BOLAND, 1995; PELTÖMAKI & VASEN, 1997).
44
A base genética do HNPCC foi documentada pela primeira vez por Peltömaki et
al.(1993) que usou um painel de marcadores de MS que estudava todo o genoma e mapeou o
gene HNPCC 2p15-16 em duas famílias. Trabalhando com SCC, Ionov et al.(1993) e
Thibodeau et al. (1993), observaram que alguns tumores se caracterizavam pela MSI, isto é, o
comprimento dos MS variava entre o DNA tumoral (TDNA) e o normal (NDNA) do mesmo
paciente. Peltömaki et al.(1993) e Aaltonen et al.(1993) descobriram que a maioria dos CCR de
pacientes HNPCC mostrava MSI e usaram o termo “erro de replicação positivo” (RER+) para
descrever tais tumores.
A alta freqüência de MSI (MSI-H) nos CCR relacionados ao HNPCC sugeria que o
gene HNPCC (assim denominado na época) poderia ser um homólogo humano dos MMRG
previamente descrito em bactérias e fungos. Fishel et al.(1993) clonaram com sucesso um
destes genes (hMSH2) e o localizaram no cromossoma 2p21-22. Eventos subseqüentes
provaram que mais de um gene contribui para o reparo do pareamento de DNA, e que a
síndrome HNPCC poderia estar associada a qualquer um deles. Em março de 1994 dois grupos
relataram a clonagem do hMLH1 (mutL homólogo) no cromossoma 3p21 (BRONNER, 1994;
PAPADOPOULOS, 1994). (Quadro 2). Outros genes têm sido identificados, mas não se sabe se
todos estão implicados na doença.
Quadro 2: MMRG relacionados ao HNPCC (BRONNER, 1994; PAPADOPOULOS, 1994):
MMRG Topografias no Aparente contribuição ao HNPCC
45
Cromossoma %
hMSH2 2p21-22 31%
hMLH1 3p21 33%
hPMS1 2q31-33 2%
hPMS2 7p22 4%
2.2.8) Mecanismo reparador dos erros de replicação (RER):
Quando ocorre um pareamento incorreto, inicia-se o reconhecimento desta alteração
por meio de um complexo heterodímero formado pelas proteínas MSH2 associada à MSH6 ou
MSH3. MSH2-MSH6 é denominado Mut e é necessário para o reconhecimento de erros
envolvendo bases únicas. MSH2-MSH3 se chama Mut e participa da correção de inserções ou
deleções produzidas durante a replicação (ALONSO et al, 2006). Posteriormente, o
heterodímero formado por MLH1 e PMS2 se une com Mut ou Mut em um complexo que,
junto com outras proteínas, realiza a excisão, ressíntese e união do DNA. Entre as proteínas
envolvidas neste processo estão a exonuclease I (EXO I), as helicases, o antígeno nuclear de
proliferação celular (PCNA), a proteína de ligação ao DNA de fita simples (RPA) e a DNA-
polimerase III. (Figura 4)
46
Figura 4: Mecanismo reparador dos erros de replicação e as conseqüências da alteração de
cada um de seus componentes (Alonso, 2006)
47
Assim, uma vez que haja a perda de função destes MMRG, seja por mutação
germinativa (como no HNPCC), seja por metilação do promotor do MLH1 (como nos casos de
SCC), haverá deficiência nas proteínas que seriam produzidas por eles, que por sua vez são
fundamentais na correção de mutações ocorridas durante o processo de divisão celular. Células
deficientes neste reparo de DNA acumulam mutações em uma taxa prodigiosa: em fungos com
reparo deficiente dos erros de pareamento podem ocorrer 700 vezes mais mutações do que num
fungo normal (STRAND et al., 1993); e a freqüência de mutações em células humanas pode
estar aumentada 1000 vezes (SHIBATA et al., 1994). Tais células resumem o “fenótipo
mutador” como um pré-requisito para a carcinogênese de múltiplos estágios.
São conhecidas mais de 300 mutações destes MMRG, registradas em bases de dados
eletrônicos. A maioria das mutações descritas são mutações “sem sentido” (nonsense),
inserções/deleções pequenas ou substituições de nucleotídeos nos sítios de ajuste ou splicing
(divisão). As mutações nos genes MLH1 e MSH2 são responsáveis por 90% dos casos de
HNPCC, se distribuem em toda a extensão destes genes, não havendo “hot points” – pontos em
que são mais freqüentes estas alterações ou que se associem com alterações fenotípicas
específicas, como visto na FAP.
Por fim, é importante ressaltar que as freqüências de mutação nos MMRG associados
ao HNPCC variam de uma população para outra. Assim, dados de freqüência de mutações
nestes genes não podem ser simplesmente extrapolados quando trabalhando com populações
etnicamente distintas, principalmente quando se considera que a maior parte das mutações
descritas ocorreu em países do norte da Europa (CUTAIT et al., 2004).
2.2.9) Oncogênese devido ao reparo de pareamento incorreto:
48
A descoberta de que um defeito no reparo de pareamento do DNA estaria envolvido
na patogênese do HNPCC e pelo menos em uma fração dos SCC trouxe nova luz sobre o papel
da taxa de mutações aumentada na indução e progressão de um CCR. No mundo ocidental a
incidência de CCR, bem como de outros cânceres, aumenta com a idade e é proporcional ao
tempo decorrido (MILLER, 1980). Isto sugere que a carcinogênese ocorre em múltiplos
estágios, ao longo do tempo. A análise molecular do CCR confirmou que quatro ou mais
alterações genéticas de OG ou TSG são necessárias para o início do carcinoma e menor número
para o adenoma. Entretanto, é improvável que várias mutações independentes se acumulem em
uma única célula em uma taxa espontânea de mutação. Portanto, assumiu-se que nas células
tumorais a taxa de mutação aumente durante a progressão (hipótese do mutador de Loeb)
(LOEB, 1991, 1994) Além disto, a taxa de mutação é criticamente restrita no início da
tumorigênese, quando o número de células-alvo pré-malignas é pequeno. De fato, tem sido
demonstrado que a MSI ocorre desde os primeiros estágios de adenoma e que persiste através
de toda a progressão do desenvolvimento tumoral. Mais ainda, deve-se lembrar que, de acordo
com alguns autores (JASS & STEWART, 1992), a incidência de adenomas no HNPCC, ao
contrário da FAP, parece ser baixa, semelhante à da população geral, embora a progressão de
adenoma a carcinoma seja significantemente acelerada, 8 a 10 anos na população geral e 2 a 3
anos nos pacientes com HNPCC.
As mutações nos MMRG não causariam diretamente uma vantagem proliferativa. Na
verdade, elas facilitariam a ocorrência de mutações em OG-alvo e TSG. Portanto, espera-se que
os genes envolvidos na patogênese do SCC sejam os mesmos envolvidos no HNPCC, porém
em graus diferentes (LYNCH & DE LA CHAPELLE, 2003). Parece que as vias genéticas
envolvidas são as mesmas, embora o envolvimento de genes diferentes possa variar.
A figura 5 mostra que uma mutação em um dos três MMRG principais leva à
deficiência de proteínas de reparo do DNA, o que promove mutações em alguns dos genes
49
tradicionais, tais como o APC ou K-ras. Genes com MS codificantes acumulam mutações
frameshift e perdem a função, assim afetando, e talvez acelerando, a evolução do tumor. Eles
também podem afetar a especificidade do órgão nos tumores relacionados ao HNPCC. As
percentagens aproximadas de todos os CCR com deficiência de reparo que albergam estas
mutações frameshift estão assinaladas.
50
51
Exemplos de genes com
microssatélites
codificantes:
TGFβ1RII 90%
RIZ 37%
TCF4 35%
BAX 33%
IGFIIR 27%
Epitélio normal Adenoma
precoce
Adenoma
intermediário
Adenoma
tardio
Carcinoma Metástase
APC K-ras
DCC
Smad4
P53 Outros
MSH6
MSH3
MSH2
MMR genes com
microssatélites
codificantes
MLH1
MSH2
MSH6
Genes
MMR
Figura 5: Esquema do possível papel das mutações nos MMRG (LYNCH & DE LA CHAPELLE, 2003)
TGF 1RII: transforming growth factor 1receptor II; RIZ: retinoblastoma-protein-interacting zinc finger; TCF4: transcription factor 4; BAX: BCL-2-associated X;
IGFIIR: insulin-like growth factor II receptor ; DCC: deleted in colorectal cancer
2.3) HNPCC:
2.3.1) Critérios de Amsterdã: o começo da padronização
O Grupo Colaborativo Internacional em HNPCC (ICG-HNPCC) em um esforço para
padronizar, em todo o mundo, os estudos sobre HNPCC, estabeleceu os critérios necessários
para este diagnóstico, uniformizando os estudos colaborativos, em um encontro realizado em
1991 em Amsterdã (VASEN et al., 1991).
Critérios (ICG/HNPCC) para diagnóstico eram: (Amsterdã I)
1) No mínimo três membros de uma mesma família com CCR, dois dos quais sendo
parentes em primeiro grau.
2) No mínimo duas gerações sucessivas afetadas.
3) No mínimo um dos indivíduos com menos de 50 anos à época do diagnóstico.
4) Excluir FAP
5) Os tumores deveriam ser diagnosticados por exame histopatológico
Até 1990 não existiam tais critérios e as descrições da síndrome na literatura variavam
largamente. Na ausência de uma nomenclatura comum era impossível comparar os resultados
dos diferentes estudos sobre HNPCC. A grande aceitação dos critérios do ICG é percebida pelo
fato de que, por muito tempo, quase todos os investigadores os usaram. Como critério para
seleção de famílias para pesquisa, eles objetivavam mais especificidade do que sensibilidade e
eram adequados para este fim. No entanto, para aplicação clínica, com finalidade diagnóstica,
esta base lançada em Amsterdã era deficiente por vários fatores.
Os critérios eram muito restritivos: famílias pequenas dificilmente os preenchiam,
além de não considerarem os tumores extra-colônicos, que são claramente um importante
componente da síndrome. Assim, pela utilização destes critérios, a freqüência de HNPCC ficava
52
muito subdimensionada. Utilizando estes critérios, Ponz de Leon et al(1993) relataram uma
incidência de 3,4% de todos os CCR em Modena, Itália (LYNCH & SMYRK, 1996).
Portanto, pelos critérios de Amsterdã I, certamente várias famílias não seriam
incluídas nos programas de prevenção, aconselhamento genético e vigilância. Para sanar estas
falhas muitos investigadores desenvolviam critérios adicionais. Por causa disto, no nono
encontro do ICG-HNPCC (Noordwijk, Países Baixos, 1997), foi proposta uma definição de
HNPCC que tinha como objetivo auxiliar os médicos na identificação destas famílias. Era uma
descrição detalhada dos aspectos específicos da síndrome, mais do que rígidos critérios
necessários aos estudos colaborativos. Além disto, tanto neste encontro como no décimo,
realizado em Coimbra, Portugal (1998), foi proposta uma nova seleção de critérios para estudos
colaborativos, que incluíam os cânceres extra-colônicos associados ao HNPCC (VASEN et al.,
1999).
Critérios revisados ICG-HNPCC (Amsterdã II):
1- Deveria haver pelo menos três indivíduos em uma mesma família com um câncer
HNPCC-relacionado: CCR, endométrio, intestino delgado, ureter ou pelve renal.
2- Um deles deveria ser parente em primeiro grau dos outros dois
3- Pelo menos duas gerações sucessivas deveriam estar afetadas
4- Pelo menos um dos indivíduos com menos de 50 anos à época do diagnóstico
5- Excluir polipose adenomatosa familiar nos casos de CCR
6- Os tumores deveriam ser confirmados por exame histopatológico
Houve grande polêmica sobre quais tumores extra-colônicos deveriam ser incluídos
nestes critérios. (Quadro 3) O tumor de estômago foi um dos pontos debatidos. Nos países
ocidentais o câncer de estômago é incomum e observado principalmente em pessoas idosas. Na
Ásia, no entanto, o câncer de estômago está freqüentemente associado às famílias HNPCC.
53
Porém, a alta prevalência deste câncer na população geral em alguns países asiáticos pode
aumentar a chance de agregação familiar dos tumores gástrico e colorretal. A inclusão do câncer
de estômago nos critérios poderia, portanto, diminuir a certeza de se estar lidando com HNPCC.
Assim, mesmo que estudos futuros nos países asiáticos mostrassem que o risco relativo de se
desenvolver câncer de estômago nos portadores de mutação fosse alto, haveria relutância em se
adotarem critérios condicionados aos países de origem da família em estudo; esta abordagem
seria contrária ao princípio de que os critérios diagnósticos deveriam ser simples e comparáveis
entre os estudos internacionais. Importante salientar que sempre esteve claro que os objetivos
dos critérios eram fornecer uma nomenclatura comum para a seleção das famílias para estudos e
para comparação dos resultados. Não se pretendia que fossem algo fixo, permanente; entendia-
se que eles iriam mudando à medida em que o conhecimento fosse avançando. Além disto, os
critérios não visavam servir como guia para se excluírem as famílias suspeitas da propedêutica
adequada ou do aconselhamento genético.
54
Quadro 3: Características dos tumores extra-colorretais (Vasen et al., 1999):
Sítio Comentários
Endométrio Segundo mais comum no HNPCC
Estômago Mais comum nas gerações mais antigas das famílias HNPCC
Intestino delgado Um tumor raro, mas de risco aumentado (25X) no HNPCC
Trato biliar 5% de risco
Ureter e pelve renal 14-20% de risco para carcinoma de células transicionais
Pele Lesões de pele na síndrome de Muir-Torre, variante do HNPCC
Pâncreas Tendência para incidência aumentada no HNPCC
Cérebro Glioblastoma multiforme em alguns pacientes com defeitos
germinativos no MMRG
Tumores hematológicos Relato de caso
Partes moles Relato de caso
Laringe Relato de caso de carcinomas laríngeos múltiplos em uma família
HNPCC
55
1960:
mutações
iniciam da
“hélice-com-
voltas”
1966 DNA polimerase
desliza em seqüências
repetidas
1975-76:Atividade de reparo
de pareamento em E. coli
(ensaio genético)
mutHLS em E. coli
(métodos
bioquímicos)
1988-91: Atividade de
reparo de pareamento
em células humanas
1989: PMS
genes em
fungos
Nov.1993:
Segundo locus
HNPCC mapeado
no 3q
Mar.1994: hMLH1 no 3q
clonado, outro gene de
reparo de pareamento; ligado
ao HNPCC
Set.1994:outros dois
genes HNPCC:
hPMS1 e hPMS2
1995: confirmação
de vantagem de
sobrevida do CRC
1960s 1970s 1980s 1990s
1913: Primeira
descrição da
família G
prediposta ao
câncer
1966: descrição de
duas extensas
famílias chamadas
“Síndrome do
Câncer Familiar”
1971:
Família
câncer G
1978-1983:vantagem de
sobrevida nos cânceres
familiares
1984: dois diferentes
fenótipos de HNPCC,
chamados de Síndrome
de Lynch I e II
1987: Primeira evidência da
freqüência de HNPCC
1991: “Critérios
de Amsterdam”
para HNPCC
1993: Reparo de
pareamento em tumores
colorretais esporádicos e
outros tumores
esporádicos
Maio, Junho 1993:
1- Instabilidade de microssatélites
em HNPCC e outros tumores
colorretais
2- HNPCC locus mapeado em 2q
Dezembro1993:
hMSH2 clonado;
ligado ao
HNPCC;
envolvido no
reparo de
pareamento
1995: significado
do intervalo
adenoma –
carcinoma na
proporção de
câncer
Figura 6: Linha do tempo para os avanços clínicos, patológicos e em genética na síndrome de Lynch (adaptado de Lynch & Smyrk, 1996)
56
2.3.2) Critérios de Bethesda:
A descoberta da presença de MSI no CCR (THIBODEAU et al., 1993) e sua ligação
com o HNPCC, abriu novos capítulos na biologia tumoral e na condução clínica dos pacientes
com susceptibilidade aumentada para câncer. De 1993 a 1998 o conhecimento progressivo da
MSI mostrou que esta era uma forma única de instabilidade genômica, largamente envolvida na
gênese do câncer e não limitada ao HNPCC ou ao CCR.
A IGI (MSI/RER) é causada pela falência dos MMRG do DNA em corrigir erros que
ocorrem durante a duplicação do DNA, e é caracterizada pelo acúmulo acelerado de mutações
pontuais em um nucleotídeo e em alterações no comprimento de seqüências repetitivas simples,
chamadas MS, que ocorrem em todo o nosso genoma. A MSI é encontrada na maioria dos
tumores HNPCC e em uma apreciável proporção dos SCC. A presença de MSI em um TDNA
está associada a certas características patológicas e clínicas típicas (já descritas para o CCR
anteriormente).
Assim, paralelamente aos encontros do ICG-HNPCC, onde os critérios clínicos foram
estabelecidos para uniformizar a identificação das famílias em risco para CCR, em 1995, o
Early Detection Branch (EDB) do National Cancer Institute (NCI) convocou um encontro para
discutir o papel dos testes genéticos no diagnóstico de HNPCC. Em 1996, um novo encontro
organizado pelo NCI e intitulado “A intersseção da patologia e da genética na síndrome do
câncer colorretal hereditário não-polipose (HNPCC)” levou ao desenvolvimento de critérios –
os critérios de Bethesda - para testar os CCR quanto à presença de MSI. Para facilitar a
comunicação entre os investigadores, o EDB patrocinou um terceiro encontro intitulado
“Encontro internacional sobre instabilidade de microssatélites e fenótipos RER na detecção do
câncer e predisposição familiar” em dezembro de 1997, em Bethesda, MD, para definir critérios
uniformes para MSI, propor um roteiro técnico para sua detecção, rever a literatura pertinente às
implicações deste fenótipo e desenvolver uma agenda de pesquisa para o futuro. Em particular,
57
a identificação de áreas potenciais de aplicação clínica para a detecção precoce do câncer, seu
prognóstico e a resposta terapêutica foram considerados alta prioridade.
A MSI foi inicialmente descrita em publicações independentes de três grupos que
apareceram quase simultaneamente na literatura em 1993, cada um utilizando descritores únicos
para seus achados. Thibodeau et al (1993) se referiram ao processo como MSI (que eles
abreviaram como MIN – microsatellite instability) e reconheciam que tumores com MSI
ocorriam predominantemente no cólon proximal, estavam associados a uma sobrevida melhor e
eram notáveis pela ausência de LOH. Peltömaki et al. (1993) usaram o termo fenótipo RER
(erro de replicação) e Aaltonen et al (1993) ligaram isto a um locus que mais tarde seria
reconhecido como o primeiro de vários MMRG responsáveis pelo HNPCC. Ionov et al. (1993)
referiram-se ao processo como sendo “mutações somáticas ubíquas em seqüências repetitivas
simples, ligadas ao câncer familiar” e fez outras observações sobre esta nova via de progressão
tumoral. Ao longo dos anos, vários laboratórios desenvolviam suas próprias ferramentas para
medir MSI e a profusão de abordagens dificultava a comparação dos resultados de grupos
diferentes e confundia os investigadores que queriam entrar no campo de estudos genéticos.
Assim, em 1997, cerca de 120 pesquisadores e outros interessados se reuniram em
Bethesda para discutir MSI. Após uma sessão geral que reviu o conhecimento atual do tema,
três grupos foram formados. O primeiro foi encarregado de desenvolver uma definição de
consenso sobre MSI, estabelecendo critérios para medir MSI e recomendar os marcadores que
facilitariam a uniformidade entre aqueles que estavam realizando pesquisas neste campo. O
segundo grupo revisaria todos os dados existentes, publicados ou não, sobre a história natural
dos CCR com MSI, discutindo modelos animais relevantes para os estudos sobre MSI e
exploraria se a presença de MSI teria implicações para a terapia naquela época. Ao terceiro
grupo foi pedido que estudasse a MSI em SCC e tumores não-colorretais. Após encontrarem-se
individualmente, os três grupos apresentaram seus achados a todo o grupo para o
58
desenvolvimento de um consenso (BOLAND et al., 1998). Neste consenso, várias definições e
critérios foram estabelecidos:
A) MSI: definido como uma alteração de qualquer comprimento do DNA, devido à
inserção ou deleção de unidades repetidas (nucleotídeos), em um MS de TDNA quando
comparado ao NDNA. É importante salientar que MSI, conforme esta definição, não
descreve um fenótipo tumoral particular, mas refere-se apenas à observação de
instabilidade em um determinado marcador.
B) De acordo com a positividade para MSI podemos dividir os CCR em três subgrupos:
a) MSI-H (alta MSI) - em que a maioria dos marcadores exibe MSI (dois ou mais
marcadores em cinco): aproximadamente 15% dos CCR estão neste grupo
b) MSI-L (baixa MSI) – em que a minoria dos marcadores exibe MSI (um em cinco):
aproximadamente 15% dos CCR
c) MSS (estabilidade de MS) – em que nenhum marcador mostra MSI : cerca de 60 a 70%
dos CCR
Hoje há uma tendência em se considerarem os grupos MSI-L e MSS como um só grupo,
pois vários trabalhos (DIETMAIER et al., 1997; RISIO et al., 1996; SAMOWITZ et al.,
1995) demonstraram não haver diferenças significativas entre eles quando considerados
vários parâmetros clínicos e patológicos como: localização do CCR, estágio, gênero,
ploidia, histologia e evolução clínica. Entre MSI-H e MSI-L/MSS as diferenças eram
importantes nestes aspectos. Critérios mínimos necessários para definir e distinguir os
grupos tumorais em MSI-H e MSI-L.
Quantos e quais marcadores deveriam ser utilizados e quantos marcadores deveriam
mostrar instabilidade para os tumores serem enquadrados como MSI-H? De forma ideal,
uma sequência dada de MS deveria demonstrar MSI freqüentemente (>80% do tempo, por
59
exemplo) para um CCR definido como MSI-H, e infrequentemente (<20% do tempo) para
um CCR no grupo MSI-L, demonstrando boa sensibilidade e especificidade em predizer
erros de replicação.
Algumas repetições de mononucleotídeos, tais como BAT25, BAT26 e BAT40,
provaram ser muito úteis para a identificação de CCR MSI-H. Além de muito específicos,
um deles, o BAT26, é quase monomórfico na população; assim, os alelos alterados instáveis
são claramente distinguíveis do alelo normal na maioria dos casos. É recomendado que
sempre se deve examinar estes marcadores usando os pares de NDNA e TDNA devido à
falta de informação em diferentes grupos étnicos e raciais, não se podendo afirmar que o
tamanho do alelo selvagem seja constante em todas as populações.
Baseado nestes estudos ficou claro que vários marcadores poderiam ser utilizados para
definir e distinguir os CCR MSI-H dos MSI-L/MSS. Entretanto, como propósito de estudo,
foi criado um painel de referência com critérios para definir os grupos de tumor MSI-H.
(Quadros 4, 5 e 6)
Quadro 4: Critérios internacionais para avaliação do CCR/MSI segundo ICG/HNPCC:
Painel de referência
Marcador Unidade repetitiva Número de acesso no genbank
60
BAT25 Mononucleotídeo 9834508
BAT26 Mononucleotídeo 9834505
D5S346 (APC) Dinucleotídeo 181171
D2S123 Dinucleotídeo 187953
D17S250 Dinucleotídeo 177030
Quadro 5: Critérios de interpretação dos resultados de MSI segundo ICG/HNPCC:
Critérios de interpretação
Nº de marcadores
exibindo MSI e
alterações de compri-
mento do DNA
5 loci analisados > 5 loci analisados Interpretação
> ou = 2 > ou =30-40% MSI-H
1 <30-40% MSI-L
0 0 MSS
61
Quadro 6: Loci alternativos para análise de MSI nos CCR:
*
BAT 40 D18S55 D3S1029 D5S107
BAT34C4 D18S58 D10S197 D8S87
TGF-β-RII
D18S61 D13S175 D18S69
ACTC (635/636) D18S64 D17S588 D13S153
D17S787 D7S519 D20S100
Utilizando este painel de referência, os CCR/MSI-H são definidos como aqueles que
mostram MSI em dois ou mais marcadores, enquanto os MSI-L são definidos como tendo
MSI em apenas um marcador. CCR que não mostram MSI são incluídos no grupo estável
(lembrando que se aumentarmos o número de marcadores é possível que apresente
instabilidade em algum deles; porém, na prática, este CCR continuará sendo MSI-L, e que
não difere do CCR/MSS nos parâmetros clínicos e histológicos, bem como na evolução).
Dados históricos sugerem que estes marcadores de referência identificarão aqueles CCR
caracterizados por reparo deficiente de pareamento incorreto primariamente nos dois
maiores MMRG, hMSH2 e hMLH1 (DIETMAIER et al., 1997).
C) Metodologia:
A MSI pode ser determinada em tecido a fresco ou parafinado. Porém, em ambos os
casos, é essencial comparar NDNA e TDNA em bandas adjacentes. O ideal é que o tecido
tumoral, se parafinado, seja obtido por microdissecção, com o auxílio de um patologista,
para propósito de controle de qualidade.
D) Controle de qualidade:
*
Informação sobre os marcadores foram dadas por J. Ruschoff, R. Fishel, S. Hamilton, R. Fodde, J. Gilbert, R.
Hamelin, I. Kirsch, S. Markowitz, B. Bapat e S. N. Thibodeau (BOLAND et al., 1998).
62
Embora o grupo tenha apresentado um painel de referência, há o reconhecimento de
que, às vezes, algum dos loci tenha que ser substituído por questões técnicas. Quando estas
análises são realizadas uma variedade de problemas interpretativos e técnicos podem
ocorrer. Um problema potencial é a falha na PCR (polimerase chain reaction, reação em
cadeia da polimerase), responsável pela amplificação do segmento de DNA que se deseja
estudar, na qual não se consegue amplificar um locus. Em situações nas quais há falha na
amplificação, há a necessidade de se reanalisarem as informações obtidas considerando-se
os marcadores que foram amplificados com sucesso. Assim, se apenas um marcador não
amplifica, e dos amplificados três estão positivos para MSI, este tumor será considerado
MSI-H, independente daquele que não amplificou. Porém, se apenas um marcador está
positivo, três amplificaram e estão negativos, e um não amplificou, a situação se torna mais
complicada, pois o resultado deste passa a ser fundamental: se positivo, caracteriza o tumor
como MSI-H (dois em cinco positivos); se negativo, MSI-L (apenas um em cinco
positivos). Neste caso é necessária a utilização de outro marcador.
E) Estratégias alternativas:
A imunohistoquímica (IHC) representa uma alternativa estratégica útil para
identificar tumores com atividade defeituosa do sistema de reparo do DNA. Vários estudos
demonstraram uma correlação estrita entre CCR com MSI-H e a ausência de expressão da
proteína de hMSH2 ou hMLH1 (BOLAND et al., 1998; THIBODEAU et al., 1998). Além
disto, a IHC pode fornecer informação sobre o MMRG defeituoso específico, assim
limitando o número de genes a serem seqüenciados para identificação os indivíduos em
risco em uma determinada família.
F) Indicações para o teste de MSI:
63
Desta maneira, após todas as apresentações dos grupos e estabelecidas as normas,
foram criados os critérios de Bethesda, bem mais inclusivos que os critérios de Amsterdã,
com propósitos clínicos e científicos, e não só para pesquisas.
Critérios de Bethesda (Boland et al., 1998):
a. indivíduos que preenchem os critérios de Amsterdã;
b. indivíduos com dois cânceres-relacionados ao HNPCC, incluindo CCR
sincrônicos e metacrônicos ou tumores extra-colorretais associados (endométrio,
ovário, estômago, vias biliares, adenocarcinoma de intestino delgado ou
carcinoma de células transicionais de pelve renal ou ureter);
c. indivíduos com CCR e um parente em primeiro grau com câncer colorretal e/ou
câncer extra-colorretal relacionado ao HNPCC e/ou um adenoma colorretal, no
qual um dos tumores tenha sido diagnosticado antes dos 45 anos e o adenoma
antes dos 40 anos;
d. indivíduos com CCR ou de endométrio diagnosticado antes dos 45 anos;
e. indivíduos com câncer no hemicólon direito, com um padrão indiferenciado
(sólido/cribiforme, definido como carcinoma pobremente diferenciado ou
indiferenciado composto por lâminas sólidas irregulares de grandes células
eosinofílicas e contendo espaços pequenos como glândulas; carcinoma medular)
à histopatologia, diagnosticado antes dos 45 anos;
f. indivíduos com CCR com células em anel de sinete (mais de 50% de células em
anel de sinete) diagnosticado antes dos 45 anos;
g. indivíduos com adenomas diagnosticados antes dos 40 anos.
2.3.3) Validação dos critérios de Bethesda:
64
Estes critérios selecionam pacientes e familiares em risco para tumores HNPCC sendo,
portanto, utilizados para encaminhamento destes indivíduos para testes de MSI.
Em um estudo realizado através do exame das características clínicas de 303 CCR em
peças congeladas (BOLAND et al., 1998), considerando a classificação de MSI dos CCR
(estabelecido por exame de seis marcadores) foi demonstrado que o grupo MSI-H era
completamente diferente do grupo MSI-L e MSS; e que estes dois últimos eram semelhantes
entre si. O grupo MSI-H tinha maior número de tumores localizados em cólon proximal,
histologia indiferenciada e mucinosa e presença de linfócitos infiltrando tumor. Havia uma
tendência de menor metastatização hepática e infiltração local. As características patológicas
combinadas tinham 93% de acurácia para predizer sobre a MSI.
Foi notado ainda que os achados patológicos nos SCC e HNPCC, ambos com MSI-H,
parecem ser similares, embora possa haver uma diferença nos tipos de alterações que ocorrem
nos marcadores de MS, particularmente nos SCC mostrando MSI-L.
2.3.4) Critérios de Bethesda revisados (Umar et al., 2004):
Assim, estabelecidos estes critérios de consenso, vários estudos em todo o mundo
passaram a utilizá-los de forma efetiva. Em 2002, com o objetivo de reavaliar e melhorar os
critérios de Bethesda, o NCI promoveu novo encontro em Bethesda, Estados Unidos. Foram
apresentados os resultados relacionados à performance, sensibilidade e especificidade dos
critérios de Bethesda, revistos os critérios para identificar os indivíduos em risco para HNPCC e
recomendados critérios atualizados para indicação de testes de MSI.
Novos conhecimentos continuaram a surgir: tumores com MSI respondem por 15% de
todos os CCR (normalmente devido a metilação de MLH1) e três MMRG são responsáveis
pelas mutações germinativas em HNPCC: MSH2, MLH1 e, nos casos atenuados, MSH6.
Alguns outros MMRG, como o PMS2 e MLH3, estão aguardando validação sobre o seu papel
na etiologia dos CCR com MSI.
65
O objetivo dos critérios de Bethesda é identificar pacientes com HNPCC e não de
identificar CCR/MSI-H de indivíduos em população com SCC que podem ter melhor
prognóstico ou implicações terapêuticas diferentes. Portanto, a pergunta feita para avaliar a
sensibilidade e especificidade dos critérios estabelecidos foi: os critérios de Bethesda podem
identificar de forma efetiva os carreadores de mutações em MSH2 e MLH1? Em um estudo de
70 famílias coletadas de um registro de famílias encaminhadas ao Dana-Farber Cancer
Institute, foi realizado o sequenciamento completo dos MMRG (MSH2 e MLH1) em indivíduos
portadores de CCR, sem pré-exame para MSI (SYNGAL et al., 2000). A performance dos
critérios de Bethesda foi comparada com outros critérios clínicos existentes para predizer
mutações germinativas em MLH1 e MSH2. Os critérios de Bethesda foram os mais sensíveis de
todos os critérios existentes, porém, os menos específicos. O painel de cinco marcadores do
NCI identificou todos os pacientes com uma mutação germinativa em MSH2 e MLH1 e
encontrou-se que todas as mutações germinativas estavam associadas com CCR/MSI-H. Assim,
como discutido anteriormente para os critérios de Amsterdã, onde o objetivo era pesquisa e,
portanto, era importante os critérios terem uma especificidade alta para não se incluírem no
grupo famílias que não fossem HNPCC, aqui o objetivo era a clínica; e o importante é não
deixar de incluir famílias com HNPCC, a despeito de se incluírem algumas a mais, permitindo
que todos fossem identificados e devidamente tratados.
Freedman (Divisão de Controle de Câncer e Ciências Populacionais, NCI, Bethesda)
(FREEDMAN, 2004 apud UMAR, 2004) conduziu uma pesquisa na literatura e encontrou 10
estudos de CCR em base populacional que examinavam a história familiar, a clínica e a
prevalência de HNPCC. Apesar destes estudos terem sido conduzidos em populações
diferentes, com tamanhos de amostras desiguais, faixas etárias e métodos diferentes, foi
encontrada prevalência semelhante para HNPCC em todos os trabalhos. A prevalência de
66
HNPCC em estudos populacionais baseados em história familiar e clínica foi de 1,5% (95% de
intervalo de confiança, IC 1,2% a 1,8%) usando os critérios de Amsterdã I e II.
Combinando os resultados de cinco grandes estudos populacionais de pacientes com
CCR que examinaram tanto o RER status quanto as mutações nos genes MLH1 e MSH2,
15,2% (500/3300) dos CCR eram positivos para MSI-H. A prevalência de mutações de MLH1 e
MSH2 nos estudos populacionais de pacientes com CCR (usando MSI como critério de
varredura) variou de 0,9% a 2,7%. Entretanto, deve-se notar que testes de desempenho de
características clínicas e de história familiar e presença de MSI podem ser diferentes entre uma
população geral com CCR e uma população de pacientes de alto-risco.
Assim, Freedman et al. (2004) examinaram pacientes com CCR em dois programas de
Vigilância, Epidemiologia e Resultados Finais (SEER Program), do Novo México e da
Universidade do Sul da Califórnia (USC) – portanto, em uma amostra de alto-risco. Os
resultados foram basicamente os mesmos daqueles encontrados nos estudos populacionais
anteriormente mencionados: 1,8% dos pacientes encontrados naqueles programas preenchiam
os critérios de Amsterdã e 26% preenchiam os critérios de Bethesda. Usando MSI como
varredura, os pesquisadores identificaram 438 tumores de cólon, 16% (70/438) dos quais MSI-
H. O sequenciamento completo dos MMRG foi realizado em 65 dos 70 tumores MSI-H e a taxa
de mutação encontrada foi de 2,7%. A sensibilidade, especificidade e valor preditivo dos
critérios de Bethesda para identificar um portador de HNPCC foram semelhantes aos dos
critérios de MSI-H numa análise preliminar (UMAR et al., 2004).
Além do teste de MSI, a pesquisa por IHC pode ser realizada no tumor para procurar
expressão de proteínas dos MMRG de DNA. Vários estudos comparando a IHC com os testes
de MSI mostraram que a IHC pode fornecer informação excepcional e até maior sobre defeitos
nos MMRG. A perda de expressão dos genes MLH1 e MSH2 está associada a
aproximadamente 100% com um fenótipo MSI-H. Da mesma maneira, demonstrou-se que a
67
expressão normal destes genes prediz um fenótipo MSS em 93% dos casos. Além disto, a perda
de expressão identifica o MMRG específico que está comprometido. No entanto, a perda de
expressão de MLH1, na maioria dos casos MSI esporádicos, é epigenética. A decisão final em
realizar testes para MSI e IHC juntos ou em uma ordem específica pode ser paciente e/ou
centro-específica e está baseada em probabilidades anteriores de um teste anormal,
disponibilidade destas técnicas, análise de custos rigorosa e se o teste está sendo usado como
rastreamento ou diagnóstico.
Os dados atuais sugerem que no HNPCC 95% aproximadamente dos casos MSI-H são
causados por perda de expressão de MLH1 (~40%), MSH2 (~40%), MSH6 (~10%) ou PMS2
(~5%). Em cerca de 5% dos casos a etiologia da MSI permanece desconhecida (UMAR et al.,
2004).
Ambos os testes – MSI ou IHC, embora chamados testes genéticos, avaliam mais o
fenótipo do que o genótipo. O ideal é que sejam complementados pelo sequenciamento com
determinação do defeito nos MMRG. Como os custos são altos para realizar estes testes em
uma população geral com CCR, o papel do patologista é muito importante, pois seus achados ao
exame histológico podem ser de relevância para levantar a suspeita de HNPCC. Quanto mais
critérios clínicos utilizarmos para selecionar a população de pacientes que serão submetidos aos
testes, maior será a sensibilidade e especificidade para diagnosticar pacientes com HNPCC.
Critérios de Bethesda revisados para testar CCR para MSI:
Desta forma, após as considerações relatadas foram estabelecidos os novos critérios de
Bethesda, mais objetivos. Os tumores deveriam ser testados para MSI nas seguintes situações:
1) CCR diagnosticado em um paciente com menos de 50 anos.
68
2) Presença de CCR sincrônicos e metacrônicos ou outros tumores HNPCC-relacionado
*
,
independentemente da idade.
3) CCR com histologia
**
para MSI-H
***
diagnosticados em um paciente com menos de 60
anos.
#
4) CCR diagnosticado em um ou mais parentes de primeiro grau com um tumor HNPCC-
relacionado, com um dos tumores sendo diagnosticado abaixo dos 50 anos.
5) CCR diagnosticado em dois ou mais parentes de primeiro ou segundo graus com
tumores HNPCC-relacionados, independente da idade.
Outro ponto importante é a escolha dos marcadores de MS e sua sensibilidade. O painel
original de cinco marcadores do NCI para avaliação de MSI pode subestimar o número de
tumores MSI-H (por causa do uso de três dinucleotídeos) e por outro lado superestimar o
número de tumores MSI-L (devido ao uso de duas repetições de mononucleotídeos). A adição
de mononucleotídeos no painel melhora a sensibilidade, o que tem sido defendido por alguns
estudiosos (Umar et al., 2004). Repetições de dinucleotídeos podem apresentar desafios
interpretativos e marcadores monomórficos podem reduzir a necessidade de tecidos normais
para comparação nos testes para MSI. Estes marcadores são válidos para os CCR e de
endométrio mas não para outros tipos tumorais. Além disto, este painel tem baixa sensibilidade
para o gene MSH6 e talvez alguns destes CCR possam ser diagnosticados como MSI-L. Como
*
Tumores HNPCC-relacionados incluem: cólon e reto, endométrio, estômago, ovário, pâncreas, ureter e pelve renal, trato
biliar e cérebro (normalmente gliomas, como visto na síndrome de Turcot), adenomas de glândulas sebáceas e
ceratoacantomas na síndrome de Muir-Torre e intestino delgado.
**
Histologia: presença de linfócitos infiltrando o tumor, reação linfocítica Crohn’s-like (como encontrado na doença de
Crohn), células mucíparas ou em anel de sinete ou padrão de crescimento medular.
***
MSI-H: refere-se a alterações em dois ou mais dos cinco marcadores do painel de MS recomendado pelo NCI.
Não houve consenso entre os participantes do encontro sobre se incluiria este critério de idade neste item 3;
participantes votaram para manter menos de 60 anos nestes critérios.
69
tumores MSI-L ainda não estão bem determinados em relação ao seus significados clínico,
patológico e biológico, mais pesquisas são necessárias para seu esclarecimento.
Novas recomendações para avaliação de MSI-H e MSI-L (Umar et al., 2004):
O painel original de marcadores de MS do NCI incluiu BAT25, BAT26, D2S123,
D5S346 e D17S250; entretanto os seguintes critérios podem ser aplicados:
1- Se apenas os dinucleotídeos estão mutados, testar um painel secundário de marcadores
de MS com repetições de monucleotídeos (por exemplo, BAT40 e/ou MYCL) para
excluir MSI-L.
2- Repetições de dinucleotídeos são menos sensíveis do que mononucleotídeos para MSI-
H, entretanto elas fornecem um controle interno para a prevenção de confusão de
amostra.
3- Um painel pentaplex de repetições de mononucleotídeos quasimonomórficos pode ser
mais sensível para tumores MSI-H do que outros marcadores de MS e pode reduzir a
necessidade de NDNA para comparação; esta abordagem requer três ou mais alelos
mutantes para indicar MSI-H.
Assim, baseado nas considerações do encontro de Bethesda, foram estabelecidas as
recomendações para se avaliarem os pacientes em risco pelo processo molecular.
Processo de avaliação molecular:
1- A melhor abordagem para avaliação é a análise dos tumores para MSI ou por IHC, seguida
pelo seqüenciamento de MSH2/MLH1 nos pacientes com tumores MSI-H ou tumores com
perda de expressão de proteínas de um dos MMRG.
2- Após a mutação ser identificada, os familiares em risco deveriam ser encaminhados para
aconselhamento genético e testados, se assim o desejarem.
*
*
Para famílias com uma forte suspeita de HNPCC, deveriam ser considerados testes de sequenciamento mesmo quando os
resultados de MSI/IHC indicam MSI-L, MSS ou expressão normal. A probabilidade de encontrar mutação germinativa nos
genes MLH1/MSH2 em pacientes com CCR que não são MSI-H é baixa; entretanto, esta probabilidade ainda não foi
completamente elucidada.
70
3- Uma abordagem alternativa, se o tecido para teste não está disponível, é realizar diretamente
o sequenciamento dos genes MSH2/MLH1.
4- Se nenhuma mutação nos MMRG for encontrada em um paciente com tumor MSI-H e/ou
história clínica para HNPCC, o teste genético resulta em não informativo. Os pacientes e seus
familiares em risco deveriam ser aconselhados como se HNPCC tivesse sido confirmado e deve
ser realizada vigilância de alto-risco.
5- É necessário reafirmar aos pacientes a confidencialidade do processo para aquietar medos
relacionados à discriminação baseada na condição genética.
2.3.5) Perspectivas para prevenção e tratamento:
A morbidade e a mortalidade das formas hereditárias do CCR podem ser reduzidas uma
vez que o risco familiar seja estabelecido e programas de vigilância estritos possam ser
realizados (JÄRVINEN et al., 2000). Se a mutação é detectada, é ainda mais fácil identificar as
pessoas com risco maior de desenvolvimento da doença, permitindo uma vigilância custo-
benefício mais efetiva. A prevenção do CCR, particularmente entre pacientes com FAP e
HNPCC, será mais efetiva quando se compreender melhor a história natural e as bases
moleculares destas doenças.
Além dos métodos diagnósticos, os médicos devem se familiarizar com os métodos de
rastreamento disponíveis e com as opções cirúrgicas profiláticas. Devem ser lembradas a
colectomia, a histerectomia e a salpingo-ooforectomia profiláticas (após o término das
gestações) em pacientes com HNPCC.
Avanços tecnológicos, tanto no diagnóstico como na identificação de marcadores
biológicos de susceptibilidade ao CCR, tais como a MSI e testes de sequenciamento
específicos, aceleram estas tentativas de se obterem os objetivos de prevenção ao CCR.
71
Tratamentos farmacológicos baseados em estratégias para atingir moléculas alvo são uma
grande promessa (LYNCH & DE LA CHAPELLE, 2003).
Assim, as pesquisas moleculares genéticas sobre as formas hereditárias de CCR
devem continuar para buscar novas mutações e características destas doenças tão heterogêneas.
72
Objetivos
“Lembre-se, toda ação começa com
uma idéia.”
(Kátia Zero, jornalista)
73
Objetivos:
3.1 Objetivo Geral:
Pesquisa de síndrome de Lynch (HNPCC) através da aplicação de critérios clínicos (Amsterdã
II e Bethesda) e exame molecular (instabilidade de microssatélites) em pacientes com câncer
colorretal.
3.2 Objetivos específicos:
- Identificação e seleção de pacientes adultos operados de CCR, todos do tipo
histológico adenocarcinoma.
- Caracterização clínica dos pacientes estudados.
- Caracterização fenotípica dos pacientes através dos critérios de Amsterdã II e
Bethesda.
- Desenvolvimento de metodologia para a classificação molecular dos tumores
através dos marcadores: BAT 25, BAT 26, BAT 40, D2S123, D17S250 e
D5S346.
- Classificação dos tumores quanto à presença ou ausência de RER.
- Verificação da incidência de indivíduos com RER nesta população estudada e
comparação com os dados da literatura internacional.
- Correlação das variáveis: classificação quanto aos critérios de Bethesda e
Amsterdã II, localização do tumor, tipagem molecular e classificação quanto ao
RER status, entre si e em relação aos achados da literatura internacional.
74
“Dai-me, Senhor,
a perseverança das ondas do mar,
que fazem de cada recuo
um ponto de partida para um novo avanço.”
(Gabriela Mistral, poetisa)
Material e métodos
75
Material e métodos:
4.1) Material clínico:
Cada paciente incluído no estudo foi questionado, assim como seus familiares, a
respeito da história familiar para câncer, não só CCR, mas de forma global. Apesar da
conscientização sobre a importância desta referência histórica da família foi constatado não ser
um dado fácil de ser conseguido. Raramente se obteve confirmação histopatológica dos tumores
existentes na família. Optou-se por valorizar a informação dada, com exceção de câncer de
fígado e ossos, pelo fato de serem órgãos freqüentemente sede de metástases, assim como o
tumor de útero, dificilmente distinguido pelos informantes como sendo de endométrio ou de
colo uterino, o que dificulta sua valorização como HNPCC. Todos os pacientes incluídos foram
classificados em relação aos critérios de Amsterdã II e Bethesda.
O objetivo deste trabalho é estudar os tumores pelo método molecular para pesquisa
de MSI, de acordo com o preconizado pelo NCI. Não foi realizada pré-seleção dos pacientes
pelos critérios clínicos. Foram obtidos materiais biológicos de todos os pacientes, sempre de
forma pareada tumor/normal: inicialmente, através de material armazenado em parafina no
laboratório de anatomia patológica; posteriormente, pela pesquisa em material a fresco, devido
às dificuldades inerentes à extração de DNA de material parafinado.
Foram utilizados três mononucleotídeos (BAT 25, BAT 26 e BAT 40) e três
dinucleotídeos (D5S346, D2S123 e D17S250), conforme técnicas descritas a seguir de forma
detalhada. Posteriormente, utilizando os critérios estabelecidos pelo NCI, classificaram-se os
indivíduos como RER positivo e negativo. Todas as análises estavam em concordância com o
consentimento informado assinado pelos pacientes (Apêndice 1).
Após esta classificação, foram realizados estudos estatísticos para determinar as
características da nossa amostra e comparar os resultados com os dados da literatura
internacional.
76
4.2) Material biológico:
4.2.1) Blocos de parafina com material biológico:
Foram obtidos dois blocos de parafina de cada paciente, contendo tecido obtido em cirurgia,
um com amostra do tumor e outro com amostra de tecido normal, visando TDNA e NDNA.
Estes blocos foram microdissecados pelo patologista com base nas lâminas feitas deste
material, onde eram identificadas as regiões contendo maior número de células tumorais e
onde havia tecido sem alterações patológicas. Foram estudados 33 pacientes cujos materiais
estavam fixados em blocos de parafina.
4.2.2) Tecido a fresco:
Um segundo grupo, formado por 33 pacientes, foi estudado a partir de amostras
teciduais colhidas no pós-operatório imediato, da peça cirúrgica, pelo próprio cirurgião. A
amostra tumoral era colhida da porção mais central do tumor, onde havia maior infiltração (nos
casos de lesão ulcerada) e a amostra sem alteração da borda mais distal da peça cirúrgica,
macroscopicamente livre de lesão. O material era colocado em solução salina e enviado ao
laboratório para ser processado.
4.3) Critérios de inclusão e exclusão:
Foram incluídos pacientes portadores de adenocarcinoma colorretal, histologicamente
comprovados, todos operados pelo mesmo grupo de coloproctologistas. A história pregressa e
familiar dos pacientes foi pesquisada pelo cirurgião responsável pelos mesmos, através de
critérios padronizados de anamnese (Anexo 1).
Foram excluídos pacientes portadores de doença inflamatória intestinal e FAP, bem como
aqueles que desconheciam suas histórias familiares.
4.4) Características das amostras e pacientes estudados:
77
O grupo completo ficou constituído por 66 pacientes, 33 deles estudados a partir de
blocos de parafina e 33 a partir de amostras não-parafinadas. Foram 25 pacientes do sexo
masculino e 41 do sexo feminino. A idade variou de 22 a 89 anos.
4.5) Análise estatística:
As informações coletadas foram digitadas em um banco de dados desenvolvido no
programa EpiInfo versão 6.04 e os resultados descritivos (apresentados na seção de resultados)
foram obtidos através da listagem e freqüência das características das diversas variáveis.
4.5.1) Variáveis resposta
Neste estudo foram consideradas quatro variáveis resposta: classificação de Amsterdã
II, classificação de Bethesda, localização do CCR e presença de RER/MSI-H (RER status).
Esta última variável foi definida de acordo com a recomendação dos critérios de Bethesda,
considerando os resultados do painel de marcadores preconizados e estudados neste trabalho:
BAT 25, BAT 26, BAT 40, D2S123, D17S250, D5S346, conforme descrito anteriormente.
4.5.2) Testes estatísticos utilizados
As variáveis resposta consideradas nesta pesquisa foram comparadas com outras
variáveis categóricas através de tabelas de contingência, sendo utilizado o teste do qui-quadrado
com correção de Yates para comparação de proporções. Quando uma das freqüências esperadas
foi menor que cinco foi utilizado o teste de Fisher. A análise univariada foi feita através do
programa EpiInfo versão 6.04. A categoria considerada como padrão está indicada nas tabelas
de resultados com o valor 1,0 na coluna dos valores de odds ratio e a porcentagem corresponde
ao total de pacientes de cada linha.
A variável “idade”, quantitativa, foi comparada com outras variáveis categóricas
através do teste Kruskal-Wallis, que não necessita de premissas a respeito da distribuição da
variável e são mais conservadores (menos sensíveis) na detecção de uma diferença
78
estatisticamente significativa. Por isso, quando um resultado de um teste não paramétrico é
considerado significativo, ele também o será em testes paramétricos, como ANOVA, por
exemplo.
A comparação da variável “idade” com o RER status foi feita através do coeficiente
de correlação de Pearson, que tem o símbolo “r”. Este coeficiente fornece uma medida da força
de relacionamento linear entre duas variáveis contínuas e varia de –1 a +1, passando pelo zero.
O nível de significância estatística estabelecido para as comparações foi cinco por
cento (p< 0,05).
4.6) Aspectos éticos:
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Santa Casa
segundo os trâmites exigidos pelo Programa de Pós-Graduação daquela instituição (Apêndice
2).
4.7) Equipamentos utilizados:
4.7.1) Termocicladores:
Foi utilizado o termociclador “Geneamp PCR System 2400” da Applied Biosystems
R
(Cingapura).
4.7.2) Fonte de energia para eletroforese:
Foi utilizada a fonte “Model 4001p Programmable Eletrophoresis Power Supply” da
Gibco BRL
R
(EUA).
4.7.3) Cubas para eletroforese:
Foi utilizada a cuba modelo “SA 32” da Gibco BRL
R
.
4.7.4) Detector de fluorescência:
79
Foi utilizado o fluorômetro “FMBIO II” da HITACHI
R
(Japão) para a detecção de
fluorescência emitida pelos oligonucleotídeos.
4.7.5) Documentação:
Foi utilizado o programa FMBIO Read Image versão 1.5 (Japão).
4.8) Preparo das soluções:
Para o preparo das soluções empregadas neste estudo foram utilizados os protocolos
descritos por Sambrook et al (1989).
4.8.1) EDTA 0,5 M pH 8,0
Pesar 37,22 g de EDTA, dissolver sob agitação em 150 ml de água destilada e deionizada
(ddH
2
O) e adicionar pastilhas de NaOH para auxiliar a dissolução. Em uma proveta
completar o volume do ddH
2
O para 200 ml. Ajustar o pH para 0,8 + 0,4.
4.8.2) Tampão TBE 5X – tampão de corrida
Pesar 54 g de Tris-Base e 27,5 g de ácido bórico e dissolver em aproximadamente 500 ml
de ddH
2
O sob agitação e aquecimento. Adicionar 20 ml de EDTA (0,5 M, pH 8,0) e
completar o volume com ddH
2
O para um litro. A solução deve ser filtrada.
4.8.3) Tampão TBE 1X
Em uma proveta de 1000 ml medir 200 ml de TBE 5X e completar o volume para 1000 ml
com ddH
2
O (água destilada e deionizada).
4.8.4) Solução acrilamida – bis acrilamida 19:1 (40%)
Pesar 114 g de acrilamida e 6 g de bis-acrilamida. Adicionar aproximadamente 150 ml de
ddH
2
O. A mistura deve ser homogeneizada até dissolução total. Posteriormente deve ser
transferida para uma proveta e completada com ddH
2
O até 300 ml.
4.8.5) PAGE 4% desnaturante
80
Pesar 126 g de uréia e dissolver inicialmente em 100 ml de ddH
2
O sob agitação e
aquecimento. Adicionar 15 ml de TBE 10X e 30 ml da solução de acrilamida-bis acrilamida
19:1. Completar o volume com ddH
2
O para 300 ml em uma proveta. A solução deve ser
filtrada.
4.8.6) Persulfato de amônia 10%
Adicionar 10 g de persulfato de amônia à 100 ml de ddH
2
O e, posteriormente,
homogeneizar.
4.8.7) Proteinase K
Adicionar 7 ml da água tipo I no frasco com proteinase K liofilizada (Invitrogen
R
) (125 mg).
Aliquotar 1,0 ml em tubos Eppendorf de 1,5 ml e estocar a –20ºC + 5°C (pode permanecer
estocado nestas condições por até 25 anos).
4.8.8) Clorofórmio : álcool isoamílico
Misturar clorofórmio e álcool isoamílico na proporção 24:1, respectivamente, para um
volume final de 200 ml.
4.8.9) Cloreto de lítio
Diluir para a concentração de 8M e conservado a 0-8º C.
4.8.10) Tween 0,5%
Diluir 0,5 µL Tween 20 USP Synth
R
em 99,5 µL de água tipo I.
4.8.11) Chelex
R
100 (5%) Tris EDTA
Pesar em uma balança 5 g de Chelex
R
100 e, em um béquer de 500 ml, dissolver em 100 ml
de água tipo I e estocar em temperatura ambiente.
4.8.12) Preparo do gel para eletroforese:
81
Para um gel de 32 cm de comprimento e 0,04 mm de espessura medir 30 ml da solução
PAGE 4% (vide preparo das soluções) e em um béquer adicionar 200 µl de persulfato de
amônia (10%) e 25 µL de TEMED
R
(solução padrão).
4.9) Extração do DNA:
4.9.1) Tecidos a fresco:
Método de fenol:clorofórmio
Procedimento técnico:
1. Cortar um fragmento de tecido de aproximadamente três gramas com auxílio de bisturi e
pinça e transferir para um tubo Eppendorf de 1,5 ml identificado com o número do
exame.
Nota: O material biológico poderá ser tratado com nitrogênio líquido e triturado quando
necessário.
2. Adicionar 600 µl de solução de lise no tubo Eppendorf contendo o tecido.
3. Homogeneizar no vórtex e aquecer a 65 + 3ºC entre 15-60 min.
4. Adicionar 50 µl de proteinase K (125mg) no lisado e incubar durante toda a noite a 55 +
3ºC.
5. Adicionar 600 µl de uma mistura fenol:clorofórmio:álcool isoamílico.
6. Homogeneizar no vórtex entre 15-20 seg.
7. Centrifugar a 13000-16000 g por 1 min.
8. Transferir a fase aquosa (parte superior) para outro tubo Eppendorf de 1,5 ml
identificado com o número do exame e repetir os passos 5, 6 e 7.
9. Transferir a fase aquosa (parte superior) para outro tubo Eppendorf de 1,5 ml
identificado com o número do exame e adicionar 600 µl de clorofórmio:álcool
isoamílico.
82
10. Homogeneizar no vórtex durante 15 seg.
11. Centrifugar a 13000-16000 g por 1 min.
12. Transferir a fase aquosa (parte superior) para outro tubo Eppendorf de 1,5 ml
identificado com o número do exame e adicionar igual volume de etanol absoluto
gelado.
13. Homogeneizar por inversão e deixar os tubos 15-60 min no congelador para que o DNA
possa precipitar.
14. Centrifugar a 13000-16000 g por 8 min.
Nota: Caso não ocorra a formação do pélete, centrifugar por mais 7 min.
15. Descartar o sobrenadante com o auxílio de uma pipeta automática e lavar o pélete com
etanol gelado a 70%.
16. Centrifugar a 13000-16000 g por 3 min.
17. Descartar o sobrenadante com o auxílio de uma pipeta automática e deixar os tubos
abertos durante 20 min a temperatura ambiente para que o etanol possa evaporar.
18. Hidratar o pélete com 20 µl de solução de hidratação.
Nota: o volume de hidratação pode variar dependendo do tamanho do pélete.
19. Conservar o DNA de 0° a 8°C enquanto em uso e armazenar de 0° a -20°C por até 25
anos.
4.9.2) Tecidos fixados em parafina:
A) Procedimento técnico
1. Cortar uma lâmina muito fina do tecido fixado no bloco de parafina com auxílio do
bisturi e transferir para o tubo Eppendorf identificado com o número do exame.
83
2. Acrescentar 600 µl de solução de lise celular no tubo Eppendorf contendo o tecido e
homogeneizar no vórtex 15-20 seg.
3. Homogeneizar no vórtex e aquecer a 90ºC por 5 min.
4. Centrifugar por 5 min a 14.000 rpm.
5. Colocar o material em gelo por 5 min.
6. Descartar a parafina sobrenadante da solução e conservar o tecido.
7. Repetir os passos anteriores até o tecido ficar totalmente sem parafina (isto é, o
sobrenadante ficará límpido).
8. Acrescentar 500 µl de solução de lise no tubo Eppendorf.
9. Acrescentar 10 µl de proteinase K.
10. Homogeneizar por 15-20 seg no vórtex.
11. Colocar em banho-maria 55-60°C por 24 h em agitação branda (300rpm).
12. Centrifugar por 20 min a 14.000 rpm.
13. Transferir o sobrenadante para um outro tubo Eppendorf de 1,5 ml identificado com o
número do exame.
14. Acrescentar 300 µl de cloreto de lítio 8M.
15. Congelar em gelo seco por 10 min.
16. Centrifugar por 20 min a 14.000 rpm.
17. Transferir o sobrenadante para um outro tubo Eppendorf de 1,5 ml identificado com o
número do exame e adicionar etanol 100% absoluto até encher o Eppendorf.
18. Levar a –70°
C por 60 min.
19. Centrifugar por 20 min a 14.000 rpm.
20. Verter o etanol, deixando o pélete no fundo.
21. Acrescentar 1 ml de etanol a 70% e homogeneizar no vórtex por 15-20 seg.
22. Centrifugar por 15 min a 14.000 rpm.
23. Verter o etanol e deixar secar em temperatura ambiente por + 20 min.
84
24. Ressuspender o pélete com 20 µl de água deionizada e autoclavada. Homogeneizar no
vórtex por 15-20 seg.
25. Deixar por 10 min a 55°C no termobloco.
26. Homogeneizar no vórtex por 15-20 seg.
27. Conservar o DNA de 0
o
a 8°C, enquanto em uso e armazenar de 0 a –20°C por até 25
anos.
B) Extração de DNA para tecidos fixados em parafina (reagentes da Amersham
Biosciences
R
)
1.1 Preparação da seção de parafina
1. Cortar uma seção de 20 a 30 micrômetros do tecido parafinado e transferir para um tubo
Eppendorf de 1,5 ml identificado com o número do exame.
2. Cobrir a seção com xilol. Incubar a 37ºC por 20 min. Centrifugar a 5000rpm por 5 min e
remova o xilol.
3. Cobrir a seção com xilol novamente e incubar a temperatura ambiente por 2 min.
Centrifugar a 14000rpm por 5 min e remover todo o xilol.
4. Reidratar a seção a partir de lavagens consecutivas em etanol 100%, etanol 75%, etanol
50%, etanol 25% e finalmente em água. Centrifugar a 14000rpm por 1-3 min entre cada
lavagem.
Cuidado com o pélete nas lavagens com etanol 25% e água, pois este pode estar solto.
5. Remover a água do pélete e adicionar 0,35 ml do reagente B
R
. Caso o reagente B
R
não
esteja completamente dissolvido, aquecê-lo.
6. Adicionar 18µl de solução de proteinase K e incubar a 55°C durante a noite.
1.2 Desproteinizaçao
7. Adicionar 100 µl da solução de perclorato de sódio. Homogeneizar por inversão, no
mínimo 7 vezes.
1.3 Extração de DNA
85
8. Adicionar 600 µl de clorofórmio. Homogeneizar por inversão, no mínimo 7 vezes.
9. Adicionar 150 µl de Nucleon resina
R
e sem misturar as fases, centrifugar a 2000rpm por
1 min.
1.4 Precipitação de DNA
10. Sem misturar a Nucleon resina
R
, transferir o sobrenadante para um tubo limpo.
11. Adicionar 2 volumes de etanol absoluto gelado. Homogeneizar por inversão e levar a –
20°C por 1 a 2 h para precipitar o DNA.
1.5 Lavagem de DNA
12. Centrifugar a 14000rpm por 15 min. Descartar o sobrenadante.
13. Adicionar 1 ml de etanol 70% frio e homogeneizar várias vezes por inversão.
Recentrifugar e descartar o sobrenadante. Repetir esta etapa se necessário.
14. Secar o pélete por 10 min, certificando que todo o etanol tenha sido removido.
15. Hidratar o pélete de DNA em volume apropriado de água (30 µl).
C) Extração de DNA para tecidos fixados em parafina pelo método de Chelex
1. Retirar com um bisturi um fragmento do tecido parafinado (apenas tecido).
2. Colocar em um Eppendorf pequeno contendo 100 µl de Tween 0,5%.
3. Agitar levemente e deixar 10 min a 90°C.
4. Resfriar a 55ºC.
5. Colocar 10 µl de proteinase K.
6. Deixar 3 h a 55°C agitando levemente de hora em hora.
7. Colocar 100 µl de Chelex 100 5% Tris EDTA.
8. Agitar levemente (invertendo o tubo).
9. Centrifugar 14.000 rpm por 15 min à temperatura ambiente.
86
10. Colocar no gelo e remover com uma ponteira o anel de parafina que se forma na
superfície (às vezes não forma o anel, porque há pouca parafina).
11. Aquecer a 45°C.
12. Colocar 100 µl de clorofórmio (temperatura ambiente).
13. Agitar levemente, invertendo tubo.
14. Centrifugar a 14.000 rpm.
15. Retirar a fase aquosa e transferi-la para um tubo limpo e identificado, a fim de ser usada
como material para PCR.
87
4.10) Análise de MS:
Amplificação por PCR
A reação de amplificação dos oligonucleotídeos foi realizada através da técnica de PCR
(MULLIS & FALOONA, 1987; SAIKI et al., 1988) em programas especificados a seguir para
cada um dos oligonucleotídeos.
Protocolos para os marcadores de MSI:
Quadro 7: Seqüências dos iniciadores utilizados para análise de MSI
Denominação do oligonucleotídeo Iniciadores
BAT 25 S: 5’TCGCCTCCAAGAATGTAAGT 3’
A: 5’TCTGCATTTTAACTATGGCTC 3’
BAT 26 S: 5’AACCATTCAACATTTTTAACC3’
A: 5’TGACTACTTTTGACTTCAGCC3’
BAT 40 S: 5’ATTAACTTCCTACACCACAAC 3’
A: 5’GTAGAGCAAGACCACCTTG3’
APC (D5S346) S: 5’ACTCACTCTAGTGATAAATCG3’
A: 5’AGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT3’
D2S123 S: 5’AAACAGGATGCCTGCCTTTA3’
A: 5’GGACTTTCCACCTATGGGAC3’
D17S250 S: 5’GGAAGAATCAAATAGACAAT3’
A: 5’GCTGGCCATATATATATTTAAACC3’
S: senso; A: anti-senso
Quadro 8: Seqüências dos marcadores:
88
Marcador Sequência
BAT 25
TCGCCTCCAAGA ATGTAAGTGG GAGTGATTCT CTAAAGAGTT TTGTGTTTTG
TTTTTTTGATTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTGAGAAC AGAGCATTTT
AGAGCCATAG TTAAAAGCAGA
BAT 26
TGACT ACTTTTGACT TCAGCCAGTA
TATGAAATTGGATATTGCAGCAGTCAGAGC
CCTTAACCTTTTTCAGGTAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAG
GGTT AAAAATGTTG AATGGTT
BAT 40
ATTAACTTCCTACACCACAACCCTGCTTTTGTTCCTTTTTTTGTTGTTGC
TTGTGTGGTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGA
GA
CAA GGTGGTCTTGCTCTAC
APC
AGC AGATAAGACAGTATTACTAG TTTTTCAGGGAATTGAGAGTTACAGGTTAC
TCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAATTTCC
CGATTTATCACTAGAGTGAGT
D2S123
AAA CAGGATGCCTGCCTTTAACAGTGCTATTCA
ACATTGCTGGAAGTTCTGGC
CAGAGAAATTAGACACAGTGATACACACACACACACACACACACACACAT
ACACACACACACACACACACACACACACACATATTTTATAGATAGATAGA
TGGTATCCAAGTCAGAAAGGGNGAAGTAAA NCTATCCCTA
TTGTAGATGNCACAGTCCCA TAGGTGGAAA GTCC
D17S250
GGAAGAATCAAATAGACAATAAAAATATGTGTGTGTTTATATATATATATAC
ACATACATAAACTTTCAAATGGTTTCAAACACACACACAC
ACACACACACACACACACACACACACACTTTCAAAT
GGTTTAAATATATA TATGGCCAGC
4.10.1) BAT 25
Quadro 9: Programa para amostras de tecidos a fresco e fixados em parafina
Temperatura Tempo Número de ciclos
94ºC 10 min 1ciclo
94ºC 30 seg
56ºC 2 min 40 ciclos
72ºC 1 min
72ºC 3 min
4ºC 10 min 1 ciclo
10ºC ...
As amostras fixadas em parafina foram aquecidas por 5 min a 55°C, previamente à PCR.
Quadro 10: Reação de amplificação para o BAT 25
Para 1
Água
11,15 µl
Tampão
1,5 µl
89
Bat 25 A
0,1 µl
Bat 25 S
0,1 µl
Taq PLATINUM
0,15 µl
Total
13,00 µl
DNA (1:10)
2,0 µl
4.10.2) BAT 26
Quadro11: Programa para amostras de tecidos a fresco e fixados em parafina
As amostras de tecidos fixados em parafina foram aquecidas por 5 min a 55°C, previamente à
PCR.
Quadro 12: Reação de amplificação para o BAT 26
Para 1
Água
11,15 µl
Tampão
1,5 µl
Bat 26 A
0,1 µl
Bat 26 S
0,1 µl
Taq PLATINUM
0,15 µl
Total
13,00 µl
DNA (1:10)
2,0 µl
4.10.3) BAT 40
Quadro 13: Programa para amostras de tecidos a fresco e fixados em parafina
Temperatura Tempo Número de ciclos
94ºC 10 min 1ciclo
94ºC 30 seg
56ºC 2 min 40 ciclos
72ºC 1 min
72ºC 3 min
4ºC 10 min 1 ciclo
10ºC ...
90
As amostras de tecidos fixados em parafina foram aquecidas por 5 min a 55°C, previamente à
PCR.
Quadro 14: Reação de amplificação para o BAT 40
Para 1
Água
10,75 µl
Tampão
1,5 µl
Bat 40 A
0,3 µl
Bat 40 S
0,3 µl
Taq
0,15 µl
Total
13,0 µl
DNA (1:10)
2,0 µl
4.10.4) APC (D5S346)
Quadro 15: Programa para amostras de tecidos fixados em parafina para o APC
As amostras fixadas em parafina foram aquecidas por 5 min a 55°C, antes da PCR.
Quadro 16: Programa para amostras de tecidos a fresco para o APC
Temperatura Tempo Número de ciclos
95ºC 10 min 1ciclo
94ºC 30 seg
59ºC 2 min 40 ciclos
72ºC 1 min
72ºC 3 min
4ºC 10 min 1 ciclo
10ºC ...
Temperatura Tempo Número de ciclos
94ºC 5 min 1ciclo
94ºC 1 min
55ºC 1 min 35 ciclos
72ºC 1 min
72ºC 15 min
4ºC 5 min 1 ciclo
10ºC ...
91
Quadro 17: Reações de amplificação em amostras de tecidos fixados em parafina:
Quadro 18: Reações de amplificação para o APC em amostras de tecido a fresco:
4.10.5) D2S123
Quadro 19: Programa para amostras de tecidos fixados em
parafina:
Temperatura Tempo Número de ciclos
94ºC 3 min 1ciclo
94ºC 48 seg
61ºC 48 seg 10 ciclos
72ºC 1 min
90ºC 48 seg
59ºC 48 seg 18 ciclos
72ºC 1 min
72ºC 15 min
4ºC 5 min 1 ciclo
10ºC ...
Água
9,75 µl
Tampão
1,5 µl
DMSO
0,5 µl
APC A
0,3 µl
APC S
0,3 µl
Taq
Accuprimer
0,15 µl
Total
12,5 µl
DNA
2,5 µl
Para 1
Água
10,75 µl
Tampão
1,5 µl
APC A
0,3 µl
APC S
0,3 µl
Taq
0,15 µl
Total
13,0 µl
DNA
2,0 µl
Temperatura Tempo Número de ciclos
94ºC 5 min 1ciclo
94ºC 1 min
54ºC 1 min 35 ciclos
72ºC 1 min
72ºC 15 min
4ºC 5 min 1 ciclo
10ºC ...
92
As amostras de tecidos fixados em parafina foram aquecidas por 5 min a 55°C, antes da PCR.
Quadro 20: Programa para amostras de tecidos a fresco / Programa cromossomo 21
Quadro 21: Reação de amplificação de amostras de tecidos fixados em parafina:
Para 1
Água
1,7 µl
Tampão
0,85 µl
D2S123 A
1,0 µl
D2S123 S
1,0 µl
Taq Accuprimer
0,45 µl
Total
5,0 µl
DNA
3,5 µl
Quadro 22: Reação de amplificação de amostras de tecidos a fresco:
Temperatura Tempo Número de ciclos
94ºC 3 min 1ciclo
94ºC 48 seg
60ºC 48 seg 10 ciclos
72ºC 1 min
90ºC 48 seg
58ºC 48 seg 18 ciclos
72ºC 1 min
72ºC 15 min
4ºC 5 min 1 ciclo
10ºC ...
93
4.10.6) D17S250
Quadro 23: Programa para amostras de tecidos fixados em parafina:
As amostras fixadas em parafina foram aquecidas por 5 min a 55°C, previamente à PCR
Quadro 24: Programa para amostras de tecidos a fresco:
Para 1
Água
10,75 µl
Tampão
1,5 µl
D2S123 A
0,3 µl
D2S123 S
0,3 µl
Taq
0,15 µl
Total
13,0 µl
DNA (1:10)
2,0 µl
Temperatura Tempo Número de ciclos
94ºC 5 min 1ciclo
94ºC 1 min
53ºC 1 min 35 ciclos
72ºC 1 min
72ºC 15 min
4ºC 5 min 1 ciclo
10ºC ...
Temperatura Tempo Número de ciclos
94ºC 5 min 1ciclo
94ºC 48 seg
56ºC 48 seg 10 ciclos
72ºC 1 min
90ºC 48 seg
51ºC 48 seg 18 ciclos
72ºC 1 min
72ºC 15 min
4ºC 5 min 1 ciclo
10ºC ...
94
Quadro 25: Reação de amplificação para amostras fixadas em parafina (amostras diluídas 1:10 e
1:20)
Quadro 26: Reação de amplificação para amostras a fresco:
Para 1
Água
1,4 µl
DMSO
0,3 µl
Tampão
0,85 µl
D17 A
1,0 µl
D17 S
1,0 µl
Taq Accuprimer
0,45 µl
Total
5,0 µl
DNA
3,5 µl
Para 1
Água
10,75 µl
Tampão
1,5 µl
APC A
0,3 µl
APC S
0,3 µl
Taq
0,15 µl
Total
13,0 µl
DNA
2,0 µl
95
“Quando nada é certo, tudo é
possível.”
(Margaret Drabble, escritora)
Resultados
96
Resultados
5.1 Descrição das amostras estudadas: clínica (pacientes) e molecular (DNA
normal e tumoral)
Foram 66 pacientes portadores de adenocarcinoma colorretal. A média de idade dos
pacientes foi de 62,9 anos com desvio-padrão de 13,6 e mediana de 64,5 anos. A idade mínima
foi 22,0 e a máxima 89,0 anos.
Observa-se (Tabela 1) que o sexo feminino corresponde a quase dois terços dos
pacientes e que oito pacientes (12,1%) tiveram classificação de Amsterdã II positiva, enquanto
15 (22,7%) tiveram classificação de Bethesda positiva. Com relação à localização dos tumores
36,4% estavam localizados no reto, 25,8% no hemicólon esquerdo e 33,3% no hemicólon
direito. Para a finalidade deste estudo os tumores foram classificados como proximais (33,3%) e
distais (62,1%) ao ângulo esplênico, dois casos metacrônicos e um caso sincrônico (4,6%).
TABELA 1
Descrição das características principais da amostra (pacientes e tumores) estudada
Característica n %
Sexo
Masculino 25 37,9
Feminino 41 62,1
Classificação pelos critérios de Amsterdã II
Positivo 8 12,1
Negativo 58 87,9
Classificação pelos critérios de Bethesda
Positivo 15 22,7
Negativo 51 77,3
Localização tumor
Hemicólon direito 22 33,3
Hemicólon esquerdo 17 25,8
Reto 24 36,4
Metacrônico 2 3,0
Sincrônico 1 1,5
RER status
Positivo (MSI-H) 15 22,7
Negativo (MSI-L e MSS) 51 77,3
5.2) Análise de MS:
A seguir são apresentados os resultados dos testes de MSI obtidos para cada marcador.
97
5.2.1) BAT 25 (Figura 7)
5.2.2) BAT 26 (Figura 8)
5.2.3) BAT 40 (Figura 9)
5.2.4) APC (Figura 10)
BAT26
D2
13N 13T 13T C B
12T12N13T13T13N
14T 14N 15T 15N C
12T 12N 13T 13T 13N
14T 14N 15T 15N
T
N
BAT26
T
N
BAT25
D2 D2
27T 27N 28T 28N C B
23T 23N 24T 24N 25T 25N 26T 26N
22T 22N 23T 23N 24T 24N
25T 25N
22N
BAT25
T
N
BAT25
T
N
MSI MSS
BAT25
BAT26
D2
13N 13T 13T C B
12T12N13T13T13N
14T 14N 15T 15N C
12T 12N 13T 13T 13N
14T 14N 15T 15N
T
N
BAT26
BAT25
BAT40
16T 16N 17T 17N 18T 18N C B
16T 16N 17T 17N 18T 18N C B
C B
16N 17T 17N 18T 18N
BAT26
T
N
MSI MSS
BAT40
18N18N
22T22N22T22N
29T29N29T29N 31T31N 31T31N
32T32N 32T 32N34T34N34T34N39N39N
BAT40
T
N
BAT40
BAT25 E BAT 26
BAT40
T
N
MSI MSS
APC
18T18N 39T39N 39N 39N
40T 40N 40T 40N 41T 41N41N 44T 44N 41T 44N
C B
APC
T
N
T
APC
N
APC
18T18N 39T39N 39N 39N
40T 40N 40T 40N 41T 41N41N 44T 44N 41T 44N
C B
APC
T
N
T
APC
N
MSI MSS
98
5.2.5) D2S123 (Figura 11)
5.2.6) D17S250 (Figura 12)
BAT25
25A 25B 29T 29N 30T30N 31T31N 32T 32N 33T 33N C B
22T 22N
25A25B 29T 29N 30T 30N 31T31N
N
T
D2S123
T
N
T
N
T
N
T
N
T
N
T
N
T
N
T
N
T N
T
N
1
1
9 9
10 10
B
D2S123
D2S123
D2S123
MSI MSS
16T16N
18T 18N
C B
BAT25
16T 16N
D17S250
.
T
N
BAT26
22T 22N 25A25B 29T 29N30T 30N 31T 31N
25A 25B29T29N
30T 30N 31T 31N 32T 32N33T 33N C B
D17S250
T
N
MSI MSS
99
O marcador que apresentou instabilidade com mais freqüência foi o BAT 25 e, com
menos freqüência, o APC (Tabela 2). Na Tabela 3 observa-se a freqüência de tumores versus o
número de marcadores com MSI identificadas no presente estudo: 57% não apresentaram
nenhum marcador com MSI (MSS), 21,2% tinham um marcador positivo apresentando MSI-L e
22,7% tinham dois ou mais marcadores positivos apresentando MSI-H.
TABELA 2
Resultados da pesquisa de MSI por cada marcador estudado em 66 pacientes portadores de
CCR
MSI MSS
n % n %
BAT 25 18 27,3 48 72,7
BAT 40 15 22,7 51 77,3
D2S123* 13 20,0 52 60,0
D17S250 11 16,7 55 83,3
BAT 26 10 15,2 56 84,8
APC 9 13,6 57 86,4
*No paciente de número 66 não houve amplificação deste oligonucleotídeo, sem prejuízo da sua
classificação como RER positivo, pois dois outros marcadores já eram positivos
TABELA 3
Freqüência de pacientes versus número de marcadores com MSI e RER status em 66 pacientes
portadores de CCR
Número de marcadores
com MSI
Número de
pacientes
% RER status
0 37 56,1 Negativo = 77,3%
1 14 21,2
2 5 7,6
3 1 1,5 Positivo = 22,7%
4 1 1,5
5 3 4,5
6 5 7,6
5.3 Comparação segundo os critérios de Amsterdã II e Bethesda
As Tabelas 4 e 5 comparam as classificações pelos critérios de Amsterdã II e Bethesda,
respectivamente, com os resultados da pesquisa de MSI por cada marcador estudado e com o
RER status.
100
TABELA 4
Comparação dos resultados dos marcadores e RER status com os critérios de Amsterdã II em
66 pacientes portadores de CCR
Amsterdã
Positivo Negativo p OR IC 95%
n % n %
BAT 25
Positivo 2 25,0 16 27,6 1,0* 0,88 0,11-5,74
Negativo 6 75,0 42 72,4 1,0
BAT 26
Positivo 1 12,5 9 15,5 1,0* 0,78 0,00-8,07
Negativo 7 87,5 49 84,5 1,0
BAT 40
Positivo 1 12,5 14 24,1 0,67* 0,45 0,02-4,35
Negativo 7 87,5 44 75,9 1,0
D2S123
Positivo 2 25,0 11 19,3 0,65* 1,39 0,17-9,64
Negativo 6 75,0 46 80,7 1,0
D17S250
Positivo 2 25,0 9 15,5 0,61* 1,81 0,21-13,04
Negativo 6 75,0 49 84,5 1,0
APC
Positivo 1 12,5 8 13,8 1,0* 0,89 0,00-9,48
Negativo 7 87,5 50 86,2 1,0
RER status
Positivo 2 25,0 13 22,4 1,0* 1,15 0,14-7,77
Negativo 6 75,0 45 77,6 1,0
* teste exato de Fisher
101
TABELA 5
Comparação dos resultados dos marcadores e RER status com os critérios de Bethesda em 66
pacientes portadores de CCR
Bethesda
Positivo Negativo p OR IC 95%
n % n %
BAT 25
Positivo 5 33,3 13 25,5 0,53* 1,46 0,35-5,99
Negativo 10 66,7 38 74,5 1,0
BAT 26
Positivo 3 20,0 7 13,7 0,68* 1,57 0,27-8,53
Negativo 12 80,0 44 86,3 1,0
BAT 40
Positivo 3 20,0 12 23,5 1,0* 0,81 0,15-3,95
Negativo 12 80,0 39 76,5 1,0
D2S123
Positivo 4 26,7 9 18,0 0,47* 1,66 0,34-7,70
Negativo 11 73,3 41 82,0 1,0
D17S250
Positivo 5 33,3 6 11,8 0,11* 3,75 0,78-18,38
Negativo 10 66,7 45 88,2 1,0
APC
Positivo 2 13,3 7 13,7 1,0* 0,97 0,00-6,26
Negativo 13 86,7 44 86,3 1,0
RER status
Positivo 4 26,7 11 21,6 0,73* 1,32 0,28-5,90
Negativo 11 73,3 40 78,4 1,0
* teste exato de Fisher
5.4 Comparação entre gênero e MSI/RER status
Observa-se na tabela 6 que não existem diferenças na comparação de proporções de
pacientes do sexo masculino/feminino e os resultados de MSI por marcador ou RER status,
apesar de 62,1% da amostra ser do gênero feminino.
102
TABELA 6
Comparação dos resultados dos marcadores e RER status com o gênero em 66 pacientes
portadores de CCR
Masculino Feminino p OR IC 95%
n % n %
RER
Positivo 5 35,7 10 64,3 0,90 0,89 0,22-3,54
Negativo 20 38,5 31 61,5 1,0
BAT 25
Positivo 5 27,8 13 72,2 0,45 0,54 0,14-2,01
Negativo 20 41,7 28 58,3 1,0
BAT 26
Positivo 4 40,0 6 60,0 1,0* 1,11 0,23-5,28
Negativo 21 37,5 35 62,5 1,0
BAT 40
Positivo 7 46,7 8 53,3 0,62* 1,60 0,43-6,04
Negativo 18 35,3 33 64,7 1,0
D2S123
Positivo 6 46,2 7 53,8 0,75 1,49 0,37-6,02
Negativo 19 36,5 33 62,5 1,0
D17S250
Positivo 2 18,2 9 81,8 0,18* 0,31 0,04-1,80
Negativo 23 41,8 32 58,2 1,0
APC
Positivo 3 33,0 6 66,7 1,0* 0,80 0,14-4,20
Negativo 22 38,6 35 61,4 1,0
* teste exato de Fisher
5.5 Comparação entre pacientes segundo o RER status
Na Tabela 7 observa-se que não foi encontrada diferença com significância estatística na
comparação de pacientes segundo o RER status e as seguintes variáveis: classificações pelos
critérios de Amsterdã II, Bethesda e idade. A média de idade e desvio-padrão dos pacientes
RER + e RER – foram, respectivamente, 64,7±13,0 e 62,5±13,8 (p=0,74). Significa: neste
estudo estas variáveis tiveram baixa sensibilidade para identificar os pacientes RER+. No
entanto, foi observada diferença quando se comparam RER status e localização do CCR,
havendo maior proporção de RER+ nos CCR proximais.
103
TABELA 7
Comparação entre RER status em 66 pacientes portadores de CCR e as seguintes variáveis:
gênero, critérios clínicos e localização do CCR.
RER+ RER- p OR IC 95%
n % n %
Sexo
Masculino 5 33,3 20 39,2 0,91 0,78 0,19-3,02
Feminino 10 66,7 31 60,8 1,0
Critérios de Amsterdã II
Positivo 2 13,3 6 11,8 1,0* 1,15 0,14-7,77
Negativo 13 86,7 45 88,2 1,0
Critérios de Bethesda
Positivo 4 26,7 11 21,6 0,73* 1,32 0,28-5,90
Negativo 11 73,3 40 78,4 1,0
Tumor(1)
Cólon proximal 8 61,5 14 28,0 0,04* 4,11 1,01-18,14
Cólon distal 5 38,5 36 72,0
Idade
a) ≤ 30 anos 0 0,0 1 2,0 0,49
30| 45 anos
0 0,0 5 9,8
45| 60 anos
4 26,7 16 31,4
> 60 anos 11 73,3 29 56,9
b) ≤ 60 anos 4 26,7 22 43,1 0,40 0,48 0,11-1,98
> 60 anos 11 73,3 29 56,9 1,0
(1) não considerados 2 tumores metacrônicos e 1 sincrônico
* teste exato de Fisher
5.6 Comparação entre localizações do tumor e demais variáveis:
Observa-se (Tabela 8) a comparação entre diversas variáveis categóricas e as
localizações do CCR (proximal x distal). Dois tumores metacrônicos e um sincrônico não foram
considerados nesta tabela (devido ao pequeno número de pacientes).
Não se observa diferença na comparação com a classificação de Bethesda, Amsterdã II e
gênero dos pacientes. Na variável “idade” observa-se uma tendência de significância estatística
com maior chance de tumor localizado no cólon proximal para os pacientes acima de 60 anos.
104
TABELA 8
Comparações da localização do CCR e as seguintes variáveis: gênero, critérios clínicos e idade
Proximal Distal p OR IC 95%
n % n %
Sexo
Masculino 8 36,4 17 41,5 0,90 0,81 0,24-2,69
Feminino 14 63,6 24 58,5 1,0
Amsterdã
Positivo 2 9,1 5 12,2 1,0* 0,72 0,09-4,90
Negativo 20 90,9 36 87,8 1,0
Bethesda
Positivo 4 18,2 8 19,5 1,0* 0,92 0,20-4,10
Negativo 18 81,8 33 80,5 1,0
Idade
a) ≤ 30 anos 0 0,0 1 2,4 0,23
30| 45 anos
1 4,5 4 9,8
45| 60 anos
4 18,2 15 36,6
> 60 anos 17 77,3 21 51,2
b) ≤ 60 anos 5 22,7 20 48,8 0,08 0,31 0,08-1,14
> 60 anos 17 77,3 21 51,2 1,0
* teste exato de Fisher
5.7 Sensibilidade e especificidade dos marcadores e dos critérios clínicos
(Amsterdã II e Bethesda)
Na Tabela 9 são apresentados os valores de sensibilidade e especificidade dos
marcadores e dos critérios clínicos comparados à categoria-padrão (RER) sendo 15 pacientes
RER+ e 51 RER-. Sensibilidade é a proporção de pacientes RER+ que apresentavam
marcadores e critérios clínicos positivos. Especificidade é a proporção de pacientes RER- que
apresentavam os marcadores e critérios clínicos negativos. Apenas um marcador, o BAT25,
apresentou sensibilidade maior que 85%. Ao contrário, praticamente todos os marcadores
apresentaram especificidade igual ou maior que 90%.
A combinação dos mononucleotídeos (BAT25+BAT26+BAT40), pacientes com
resultados iguais para as três áreas simultaneamente, apresentou sensibilidade de 66,7% e
especificidade de 100%. A combinação dos dinucleotídeos, pacientes com resultados idênticos
para D2S123+D17S250+APC, apresentou sensibilidade inferior (33,3%) e especificidade de
100%.
105
TABELA 9
Sensibilidade e especificidade dos marcadores e dos critérios clínicos (RER status como
padrão-ouro)
Áreas de instabilidade Sensibilidade Especificidade
BAT 25 86,7 90,2
BAT26 66,7 100,0
BAT40 80,0 94,1
D2S123 78,6 96,1
D17S250 53,3 94,1
APC 53,3 98,0
BAT25+BAT26+BAT40 66,7 100,0
D2S123+D17S250+APC 33,3 100,0
BAT25+D2S123* 66,7 100,0
Amsterdã II 13,3 88,2
Bethesda 26,7 78,4
*Agrupamento dos mononucleotídeos e dinucleotídeos com maiores sensibilidades
106
“Nunca se deve engatinhar quando se
tem o impulso de voar.”
(Hellen Keller, escritora e educadora)
Discussão
107
Discussão:
A síndrome de Lynch (HNPCC) tem sido muito elucidada pelas pesquisas dos últimos
15 anos. A partir de 1991, quando o gene APC foi clonado e relacionado à FAP, os esforços se
voltaram para a descoberta dos possíveis genes relacionados ao HNPCC (VASEN & BOLAND,
2006). Hoje sabemos que o indivíduo afetado pela síndrome de Lynch herda uma mutação em
um dos vários MMRG. E, desde 1993, é reconhecida a presença de MSI em mais de 90% dos
HNPCC (e também em 15% dos SCC). A MSI resulta do defeito nos MMRG, o que leva ao
acúmulo de alterações somáticas no comprimento dos MS. Assim, a MSI é um “marcador
fenotípico” de reparo incorreto no pareamento do DNA.
Além de rastrear HNPCC, o teste de MSI representa indicador prognóstico, com
melhor evolução dos indivíduos portadores de tumores MSI-H do que de tumores MSS
(GRYFE et al., 2000; WRIGHT et al., 2000) e também tem sido mostrado que a resposta à
quimioterapia adjuvante é diferente entre estes tumores (HEMMINKI et al., 2000; RIBIC et al.,
2003) sendo melhor nos tumores MSS.
A elaboração dos critérios de Bethesda (que incluem critérios clínicos e define os
testes moleculares para detecção de MSI) aumentou muito a sensibilidade para detecção de
indivíduos em risco e seus familiares, permitindo melhor vigilância para o CCR. Atualmente, o
padrão-ouro para avaliação de competência dos MMRG é o teste molecular para pesquisa de
MSI (BOUZOURENE et al., 2006). No entanto, na prática clínica, testar MSI como rotina,
seguindo os critérios clínicos de Bethesda, não é simples, devido à baixa disponibilidade de
laboratórios especializados, além das dificuldades de se obterem e analisarem tecidos
conservados em blocos de parafina, por dificuldades técnicas e logísticas (SYNGAL et al.,
2000).
Assim, este estudo teve como objetivo principal pesquisar a síndrome de Lynch em
pacientes com CCR através da aplicação de critérios clínicos e moleculares – MSI. Como
objetivos específicos realizamos a classificação fenotípica destes pacientes, através dos critérios
de Amsterdã II e Bethesda, com posterior padronização de metodologia para a análise
molecular dos CCR através dos marcadores estabelecidos pelo NCI, classificando-os como
portadores ou não de RER. A impossibilidade de transpor para a população brasileira os dados
encontrados na literatura internacional, devido às diferenças étnicas e culturais, motivou esta
pesquisa, pois os dados para esta caracterização em nosso meio ainda são escassos.
Os critérios de Amsterdã I tiveram como objetivo principal fornecer uma
nomenclatura comum para a síndrome de Lynch com propósito de pesquisa e foram bastante
úteis neste sentido. Porém, sua sensibilidade para identificar famílias com mutações MMRG era
108
muito limitada. Assim, a utilização destes critérios na prática clínica excluía muitos indivíduos
que deveriam ser estudados, motivo pelo qual não foram utilizados no presente estudo. Os
critérios de Amsterdã II surgiram para melhorar estas limitações, incluindo na classificação os
tumores extra-colorretais e por isto foram aplicados neste trabalho.
Foram estudados 66 pacientes portadores de CCR, com média etária de 62,9 anos.
Houve predominância de pacientes do sexo feminino (37,9% de homens e 62,1% de mulheres).
Foram aplicados os critérios de Amsterdã II e encontraram-se oito pacientes (12,1%) Amsterdã
positivos e 58 (87,9%) Amsterdã negativos. A sensibilidade destes critérios (proporção de
pacientes RER+ que preencheram os critérios clínicos) foi de 78% no trabalho de Syngal et
al.(2000). A sensibilidade dos critérios de Amsterdã II neste trabalho, quando comparada ä
literatura, foi muito baixa, 13,3%. A hipótese mais provável para explicar esta discrepância é a
dificuldade em identificar, com precisão, a história familiar no nosso meio, por
desconhecimento do paciente, até à falta de colaboração dos familiares (o diagnóstico de câncer
ainda é ocultado por medo ou vergonha), além do desagregamento das famílias por migrações e
perda de contato. Apesar da baixa sensibilidade, a especificidade (proporção de pacientes RER-
que não preencheram os critérios clínicos) foi alta (88,2%), estando de acordo com a literatura
(SYNGAL et al., 2000). Para o cálculo de sensibilidade e especificidade foi utilizado o RER
status como padrão.
Posteriormente foram desenvolvidos os critérios de Bethesda com o objetivo de
rastrear indivíduos com mutações patogênicas nos genes de reparo MLH1 e MSH2, através de
critérios clínicos e orientar os testes moleculares para MSI, detectando famílias não
identificadas pelos critérios de Amsterdã. Estes critérios introduziram algumas variáveis que
aumentaram o número de pacientes incluídos, a saber: 1) a permissão de dois tumores
sincrônicos ou metacrônicos como único critério diagnóstico; 2) a inclusão de adenomas de
início precoce (abaixo dos 40 anos) como um dos tumores HNPCC e 3) a necessidade de apenas
dois parentes em primeiro grau com CCR ou adenomas, um deles de início precoce. Neste
estudo foram encontrados 15 pacientes (22,7%) Bethesda positivos e 51 (77,3%) Bethesda
negativos, com sensibilidade de 26,6% e especificidade mais baixa que a dos critérios de
Amsterdã II, 78,4%. De fato, a sensibilidade, embora ainda baixa quando comparada com a
literatura, provavelmente pelos motivos já citados para os critérios de Amsterdã, foi duas vezes
maior do que com aquele critério, mostrando que os critérios de Bethesda são bem mais
inclusivos, identificando maior número de indivíduos que devem ser testados. Porém, como
esperado, houve redução da especificidade.
109
Foram realizadas comparações de cada marcador individualmente e do RER status
com os critérios clínicos (Amsterdã II e Bethesda) e não houve diferença estatística significativa
entre as variáveis. Assim, isoladamente, nenhum dos critérios conseguiu predizer positividade
para os marcadores e para o RER status.
Destarte, baseados nos resultados de nosso estudo, concluímos que os critérios de
Bethesda devem ser utilizados na prática clínica, pois incluem os critérios de Amsterdã e são
mais sensíveis para rastrear indivíduos em risco para síndrome de Lynch. Além disto, estes
critérios orientam a realização do teste molecular de MSI e tem sido preconizado pela literatura
(SYNGAL et al., 2000). Atenção deve ser dada à busca de uma história familiar detalhada,
explicando ao indivíduo a importância deste dado para adequada prevenção do CCR.
Um dos critérios de Amsterdã é a idade mais precoce do surgimento de CCR (embora
nos critérios revisados a idade já tenha sido aumentada de 50 para 55 anos). Mesmo nos
critérios de Bethesda, este dado é valorizado. No entanto, neste trabalho a média etária dos
pacientes RER+ foi 64,7 anos; em trabalho de Bouzourene et al. (2006) a média foi 76 anos.
Hampel et al, (2005), estudando 1066 pacientes, 208 (19,5%) deles com MSI-H e 23 com
mutação identificada (síndrome de Lynch em 2,2% da amostra) observaram que 10 dos 23
estavam acima dos 50 anos de idade e cinco deles não preenchiam os critérios de Amsterdã ou
Bethesda. Estes autores enfatizam a necessidade de se buscar o diagnóstico da síndrome de
Lynch também naqueles pacientes aparentemente fora da típica situação de “alto-risco”. No
presente estudo a idade foi avaliada de duas maneiras diferentes: de forma fracionada, em faixas
de 15 anos (< 30 anos até > 60 anos) e utilizando 60 anos como ponto de coorte. Observou-se
que não houve diferença significativa quando considerado RER status, independente do coorte
realizado. A média etária e desvio-padrão dos pacientes RER+ foi 64,7 +13,0 e RER– foi
62,5+13,8, p=0,74. Portanto, a conclusão deste estudo, em concordância com as referências
citadas, é que a idade avançada por ocasião do diagnóstico de CCR não exclui a possibilidade
de HNPCC e não deve ser usada para discriminar pacientes para serem submetidos ao teste de
MSI, embora início da doença em idade precoce ainda seja dado de grande relevância.
Também concordante com o achado da maioria dos trabalhos já realizados (JASS,
1999; THIBODEAU et al., 1993) este trabalho detectou que tumores RER+ estão localizados
com maior freqüência no cólon proximal (2/3 deles), o que não significa serem todos HNPCC.
Também foi encontrada tendência de significância (p = 0,08) com maior chance de tumor
localizado no cólon proximal em pacientes acima dos 60 anos de idade. No entanto, a média
etária da amostra foi maior que 60 anos, o que pode explicar esta tendência encontrada. Sabe-se,
no entanto, que é maior a incidência de SCC proximais nesta faixa etária (ROSSI et al., 2004).
110
Assim, os dados obtidos de maior freqüência de tumores proximais, RER positivos, em
pacientes acima dos 60 anos de idade, podem indicar serem eles portadores de SCC e não de
HNPCC. Estudos complementares de metilação do hMLH1 poderão confirmar esta hipótese.
Tumores no cólon direito causam sintomas tardiamente e precisam ter alto grau de
suspeita para diagnóstico em fases mais precoces. Isto aumenta a necessidade de identificação
adequada dos indivíduos em risco, e de exames para vigilância disponíveis para esta população.
Não houve correlação entre os critérios clínicos (Amsterdã II e Bethesda) e a localização dos
tumores.
Outro objetivo do presente estudo foi padronizar em nosso meio metodologia para
classificação molecular dos tumores, a partir do painel de marcadores indicados pelo NCI, para
identificação de pacientes com MSI. Inicialmente foi utilizado DNA obtido de blocos de
parafina (33 pacientes) e ocorreram problemas técnicos para adequada amplificação do DNA
nos seis marcadores. Sabe-se que o material biológico sofre degradações do DNA quando em
contato com solventes orgânicos como o formol, utilizado na conservação dos tecidos antes de
colocados em blocos de parafina. Esta dificuldade na extração do DNA de tecido parafinado já
foi descrita anteriormente (O´LEARY, 1999). Assim, optou-se pela utilização de tecidos
colhidos a fresco durante o ato cirúrgico (33 pacientes), com amplificação adequada de todos os
marcadores. Utilizaram-se seis marcadores (três mononucleotídeos – BAT 25, BAT 26 e BAT
40 e três dinucleotídeos – APC, D2S123 e D17S250) neste trabalho. A possibilidade de
obtenção de DNA de material conservado em parafina, com finalidade de estudos futuros, é de
grande valor para indivíduos em risco para várias doenças. O uso de formol tamponado, que
não degrada o DNA, permitindo sua adequada conservação, deve ser estimulado nos serviços de
anatomia patológica.
Foram estudadas a sensibilidade e a especificidade isolada e combinada dos
marcadores procurando-se reduções do número dos mesmos necessários para a classificação
como RER, devido aos custos e dificuldades técnicas. O BAT 25 foi o marcador mais sensível
(86,7%). O BAT 26 foi menos sensível (66,7%), porém, teve alta especificidade (100,0%),
equivalente à dos dinucleotídeos. Recentemente alguns estudos (DE LA CHAPELLE, 2002;
UMAR, 2004) mostraram que o BAT 25 e o BAT 26 eram os mais alterados e que eram os
marcadores mais sensíveis e específicos, capazes de identificar mais de 95% dos casos de MSI.
Neste trabalho tivemos redução da sensibilidade quando associados os mononucleotídeos
(66,7%) ou os dinucleotídeos (33,3%), ou mesmo quando associados o mono e o dinucleotídeo
mais sensíveis (66,7%). Assim, estes resultados não apoiam aquela afirmação. Porém, mesmo
limitando o estudo de deficiência dos MMRG a um ou dois marcadores, o teste continua caro e
trabalhoso, necessitando laboratório e técnicos especializados, o que dificulta o acesso para a
111
maioria da população. Destarte, sugere-se que seja realizado o painel completo conforme
preconizado pelo NCI, pois cada marcador contribui para a sensibilidade e especificidade de
forma complementar.
Seria pertinente saber quão importante é a síndrome de Lynch em nosso meio e que
recursos deveriam ser disponibilizados nesta direção. A síndrome de Lynch é o tipo mais
prevalente de predisposição hereditária ao CCR, ocorrendo em cerca de uma a duas de 1000
pessoas (DE LA CHAPELLE, 2005). O diagnóstico desta doença hereditária tem implicações
importantes para o tratamento do paciente e cada um dos seus parentes em primeiro grau. A
progressão de adenoma a carcinoma ocorre de forma substancialmente mais rápida na síndrome
de Lynch que no SCC – um achado que leva à necessidade de colonoscopias mais freqüentes
para vigilância adequada dos indivíduos em risco.
Neste estudo, aplicando os critérios de Bethesda e o teste de MSI foram encontrados
quatro indivíduos em risco de HNPCC, candidatos portanto ao sequenciamento para adequado
diagnóstico. Isto implica em risco, nesta amostra, de 6% de portadores de HNPCC. Não se pode
afirmar que os quatro indivíduos sejam portadores da síndrome apenas pelos critérios utilizados,
principalmente porque todos eles estavam acima dos 45 anos de idade, dois acima dos 60 anos,
superpondo com a idade de incidência de SCC. Assim, oportunamente, estes tumores serão
submetidos ao sequenciamento dos MMRG.
Avaliando-se a estimativa do INCA do número esperado de CCR para 2006 no Brasil,
de 25360 novos casos e aplicando-se a estimativa de 2% deles serem portadores de síndrome de
Lynch (HAMPEL, 2005), serão encontrados 507 portadores de mutação para a síndrome de
Lynch, e entre os familiares de cada probando, três ou mais carreadores podem ser identificados
(1521 portadores). Portanto, o rastreamento permitiria a identificação anual de cerca de 2028
portadores da síndrome de Lynch no Brasil.
Embora estes números sejam apenas uma estimativa, principalmente porque não se
tem dados da incidência de HNPCC na população brasileira, é importante identificar estes
indivíduos para realizar o diagnóstico de forma mais precoce e efetiva, direcionando os recursos
disponíveis para aqueles que estão em risco aumentado de desenvolver a doença.
Neste estudo foi observado que os critérios clínicos isoladamente não são capazes de
identificar os indivíduos portadores de HNPCC, embora sejam importantes na detecção dos
pacientes em risco. A idade, assim como o gênero, também não foram fatores discriminantes de
risco. Porém, pacientes abaixo de 45 anos com CCR são considerados fortes suspeitos. Apenas
não devemos excluir aqueles que estejam acima desta faixa etária, principalmente se preenchem
outros critérios. A suspeita de HNPCC no pré-operatório, através da busca adequada da história
112
familiar para neoplasias, aplicando-se os critérios de Bethesda, possibilita que o material
biológico para estudo seja coletado antes do seu contato com formol, melhorando a
performance do teste molecular. Porém, a execução do teste é fundamental na identificação dos
pacientes RER+, possíveis portadores de HNPCC, os quais deverão ser submetidos,
posteriormente, ao sequenciamento do MMRG, na busca de mutações. Com este trabalho foi
obtida a caracterização de portadores de CCR, clínica e geneticamente, através do teste para
MSI, além de ter permitido o estabelecimento desta metodologia.
113
Conclusões
114
Conclusões:
1) Os critérios de Bethesda foram duas vezes mais sensíveis e menos específicos que os
critérios de Amsterdã II para classificação quanto ao RER status (presença de MSI).
2) Foi possível padronizar método diagnóstico a partir do painel de marcadores
preconizado pelo NCI.
3) Tumores proximais apresentaram mais MSI-H.
4) A incidência de pacientes RER+ na amostra foi de 22,7%, e de suspeitos de HNPCC,
6%, em concordância com a literatura mundial.
Conclusão final:
Devem-se aplicar os critérios de Bethesda (clínicos e moleculares) para se avaliarem
adequadamente portadores de CCR.
115
Referências Bibliográficas
116
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123
Apêndices
124
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
PROJETO: Estudo genético de tumor colorretal (tumor de intestino)
O câncer é uma doença genética e, em algumas vezes, hereditário (tem uma
predisposição herdada da família materna ou paterna). O câncer do intestino é considerado
modelo de estudo dos tumores em geral pela possibilidade de estudarmos a doença desde uma
condição benigna – pólipo - até sua transformação em tumor maligno.
Em todo o mundo a doença vem sendo estudada e, é muito importante estudarmos nossa
população, pois não podemos simplesmente transferir os resultados dos estudos de outros países
para o nosso, devido às diferentes características de cada população (raça, costumes e hábitos
em geral).
Este trabalho tem como objetivos: (a) estudar o material recolhido durante cirurgia de
indivíduos operados de câncer colorretal, determinando se há indício de ser lesão hereditária
(não será necessário colher outro material do paciente ou seus familiares); (b) relacionar os
resultados do teste com a história familiar do indivíduo, avaliando o comportamento do teste
diante destas informações; (c) relacionar nossos resultados com os dados da literatura
internacional para observar se o comportamento da população estudada é semelhante àquela.
Assim, poderemos traçar estratégias para a prevenção da doença futuramente.
Fica garantido o sigilo sobre os dados clínicos e laboratoriais, assim como a proteção da
identidade do indivíduo em caso de publicação deste trabalho na imprensa científica.
Os coordenadores do projeto são a Dra. Sinara Mônica de Oliveira Leite e o Dr. Geraldo
Magela Gomes da Cruz (médicos especialistas em doenças do intestino) e a Dra. Karina Braga
Gomes (farmacêutica responsável pelo Departamento de Biologia Molecular do Laboratório
Hermes Pardini, onde o teste será realizado). O trabalho será realizado dentro da pós-graduação
da Santa Casa. Todo o material biológico será descartado, segundo as normas da Vigilância
Sanitária, após a extração do DNA contido no mesmo.
Eu, __________________________________________________________, concordo em
participar do estudo genético de tumor colorretal. Eu concordo com a coleta do material durante
cirurgia realizada em mim ou em membro da minha família para o estudo acima citado. Eu
entendo que as amostras serão utilizadas com o propósito de estudar a possibilidade da doença
ser hereditária e que, até o momento, isto não muda o tratamento da doença.
Assinatura: __________________________________________________________
Data: ______ / ______ / _______
125
126
Anexos
127
Anexo 1
Ficha clínica do paciente:
N
o
:
Nome:
Idade: Sexo:
Localização do tumor:
CD CT CE CS RETO SINCRÔNICO METACRÔNICO
Histologia: Classificação T N M
Indiferenciado Sólido/cribiforme Infiltração linfocítica Céls. anel de sinete/mucíparo
Observações:
História Familiar:
Pai
Mãe
Irmãos/filhos:
História de câncer na família:
Obs: se possível comprovar com resultados de exames
128
Anexo 2
Descrição dos pacientes
Idade Sexo Tumor C. Amsterdã II C. Bethesda RER Bat 25 Bat 26 Bat40 D2S123 D17S250 APC
1 83 F direito N N N N N N N N N
2 88 F direito N N P N N P N P N
3 60 M reto N N N N N N N N N
4 79 F direito N N N N N N N N N
5 72 F reto N N N N N N N N N
6 78 F metacrônico N P P P P P P P N
7 49 F esquerdo N N N N N N N N N
8 71 F reto N N N N N N N P N
9 76 F reto N N N N N N N N N
10 75 M reto P P N N N N N N N
11 59 M esquerdo N N N N N N N N N
12 67 M direito N N P P P P P P P
13 22 F esquerdo N N N N N N N N N
14 61 F direito N N P P P P P P P
15 72 M esquerdo N N N N N N N N N
16 42 M direito N N N N N N N N N
17 58 F reto N N N N N N N N N
18 64 M direito N N P P P P P P P
19 67 F direito N N N N N N N N N
20 57 M reto N N N N N N N N N
21 68 F direito N N N N N N N N N
22 57 M direito N N N N N N N N N
23 76 F reto N N N N N N N N N
24 66 M esquerdo N N N N N P N N N
25 50 F direito N N P P P P P P P
26 47 F esquerdo N N N N N N N N N
27 57 F reto N N N N N N N N N
28 49 F esquerdo N N N N N N N N N
29 62 M reto N N N N N N N N N
30 75 M reto P P N N N N N N N
31 43 M reto N N N N N N N N N
32 87 F direito P P N N N N P N N
33 62 F direito P P N N N N N N N
34 70 F reto N N N N N N N N N
35 31 F esquerdo P P N N N N N N N
36 65 F direito N N N N N N N N N
37 58 F reto N N N P N N N N N
38 56 F direito N N N P N N N N N
39 54 F reto P P N N N N N P N
40 60 F reto N N N N N N N N N
41 79 M reto N N P N N P P N N
42 69 F esquerdo N N N N N N N N N
43 50 F esquerdo N N N N N N N N N
44 61 F metacrônico P P P P P P N P P
45 81 F direito N P N P N N N N N
46 66 F esquerdo N P N N N N N P N
47 63 F direito N N N N N N N N P
Idade Sexo Tumor C. Amsterdã II C. Bethesda RER Bat 25 Bat 26 Bat40 D2S123 D17S250 APC
129
48 50 F reto P P P P N N P N N
49 53 F sincrônico N P N N N N N N N
50 73 M reto N P N N N N N N N
51 67 F esquerdo N N N P N N N N N
52 42 F reto N N N N N P N N N
53 66 M esquerdo N N N N N N P N N
54 48 F reto N P P P P P N N N
55 71 M esquerdo N P N N N N N N N
56 89 M direito N N N N N N N N N
57 73 M direito N N N N N P N N N
58 70 F reto N N P P N N P N N
59 59 M esquerdo N N N P N N N N N
60 72 M reto N N N N N N N N N
61 65 M direito N N P P P P P N N
62 46 F direito N P P P P P P P P
63 83 M direito N N P P P P P N P
64 36 M esquerdo N N N N N N N N N
65 70 M reto N N N N N N N N N
66 61 F esquerdo N N P P N N Sem dado N P
M – masculino F – Feminino N – negativo P - positivo
130
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