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Estudo Morfológico Ultraestrutural e
Imuno-Histoquímico da Influência do
Excesso de Flúor no Desenvolvimento do
Germe Dental de Incisivo de Rato
RENATO MASSAHARU HASSUNUMA
Tese apresentada à Faculdade de
Odontologia de Bauru, da Universidade de
São Paulo, como parte dos requisitos para
obtenção do grau de DOUTOR em
Odontologia, área de Biologia Oral.
(Edição Revisada)
Bauru
2006
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Estudo Morfológico Ultraestrutural e
Imuno-Histoquímico da Influência do
Excesso de Flúor no Desenvolvimento do
Germe Dental de Incisivo de Rato
RENATO MASSAHARU HASSUNUMA
Tese apresentada à Faculdade de
Odontologia de Bauru, da Universidade de
São Paulo, como parte dos requisitos para
obtenção do grau de DOUTOR em
Odontologia, área de Biologia Oral.
(Edição Revisada)
Orientador:
Prof. Dr. Gerson Francisco de Assis
Bauru
2006
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Hassunuma, Renato Massaharu
H279e Estudo morfológico ultraestrutural e imuno-
histoquímico da influência do excesso de flúor no
desenvolvimento do germe dental de incisivo de rato. /
Renato Massaharu Hassunuma – Bauru, 2006.
199p.: il.; 30cm
Tese. (Doutorado) – Faculdade de Odontologia de
Bauru. USP.
Orientador: Prof. Dr. Gerson Francisco de Assis
Autorizo, exclusivamente para fins acadêmicos e científicos a
reprodução total ou parcial desta tese, por processos fotocopiadores
e/ou meio eletrônico.
Assinatura do autor: _______________________________________
Data: ___________________________________________________
Comitê de Ética no Ensino e Pesquisa em Animais da FOB: Projeto de
pesquisa aprovado em 05 de Maio de 2004
Número do protocolo: 09/2004
iii
DADOS CURRICULARES
RENATO MASSAHARU HASSUNUMA
22 de Setembro de 1973 Nascimento
Bauru – SP
1991 – 1994 Curso de Graduação em Odontologia, na Faculdade
de Odontologia de Bauru, na Universidade de São
Paulo.
1
o
semestre de 1995 Estágio voluntário junto ao setor de Prótese no
Hospital de Pesquisa e Reabilitação de Lesões Lábio-
Palatais, na Universidade de São Paulo.
2
o
semestre de 1995 – 1998 Curso de Pós-graduação em Patologia Bucal, em
nível de Mestrado, na Faculdade de Odontologia de
Bauru, na Universidade de São Paulo.
2
o
semestre de 1998 - 2003 Professor Adjunto I das Disciplinas de Biologia I e II,
Citologia, Embriologia e Histologia I e II dos Cursos
de Odontologia, na Universidade Paulista (UNIP –
Objetivo).
2
o
semestre de 1998 - 2003 Professor Adjunto I das Disciplinas de Citologia,
Embriologia e Histologia I e II dos Cursos de
Farmácia e Bioquímica na Universidade Paulista
(UNIP – Objetivo).
1999 Professor Adjunto I da Disciplina de Microbiologia,
Imunologia e Parasitologia I e II do Curso de
Odontologia e Farmácia e Bioquímica na
Universidade Paulista (UNIP – Objetivo).
1999-2000 Professor Adjunto I da Disciplina de Diagnóstico
Bucal I e II do Curso de Odontologia na Universidade
Paulista (UNIP – Objetivo).
iv
1999 - 2003 Professor Adjunto I da Disciplina de Patologia Geral e
Bucal I e II do Curso de Odontologia na Universidade
Paulista (UNIP – Objetivo).
1999 - atual Professor Adjunto I da Disciplina de Patologia I e II –
Processos Gerais do Curso de Farmácia e Bioquímica
na Universidade Paulista (UNIP – Objetivo).
2002 - 2004 Professor Adjunto I das Disciplinas de Fundamentos
de Biologia I e II do Curso de Enfermagem na
Universidade Paulista (UNIP – Objetivo).
2002 - 2004 Professor Adjunto I das Disciplinas de Fundamentos
de Biologia e Fundamentos Biológicos aplicados à
Educação Física do Curso de Educação Física na
Universidade Paulista (UNIP – Objetivo).
2004 Professor Adjunto I da Disciplina de Histomorfologia
do Curso de Farmácia e Bioquímica na Universidade
Paulista (UNIP – Objetivo).
2005 Professor Adjunto I da Disciplina de Histologia e
Embriologia (Genética) dos Cursos de Enfermagem,
Farmácia e Bioquímica e Fisioterapia na Universidade
Paulista (UNIP – Objetivo).
2006-atual Professor Adjunto I da Disciplina de Patologia do
Curso de Farmácia e Bioquímica na Universidade
Paulista (UNIP – Objetivo).
2006-atual Professor Adjunto I da Disciplina de Patologia do
Curso de Fisioterapia na Universidade Paulista (UNIP
– Objetivo).
2006-atual Professor Adjunto I da Disciplina de Patologia do
Curso de Enfermagem na Universidade Paulista
(UNIP – Objetivo).
Associações Conselho Federal e Regional de Odontologia
v
“ – Ainda por aqui, Laertes? – diz Polônio, entrando na sala. – Que vergonha, já para bordo! O
vento está soprando as velas do seu navio, e só falta você embarcar. Vá com a minha benção –
continua, pondo a mão sobre a cabeça de Laertes – e leve estes conselhos gravados na memória.
Não diga nem faça nada antes de pensar. Seja amistoso sem ser vulgar. Prenda os amigos de
verdade à sua alma com ganchos de aço, mas não faça calos na mão cumprimentando e abraçando
qualquer um que apareça. Nunca entre em brigas, mas se entrar, faça o adversário ficar com medo
de você. Escute todo mundo, mas fale com poucos. Leve sempre em consideração as críticas dos
outros, mas não julgue ninguém. Compre só as roupas que possa pagar, sem se preocupar em seguir
a moda. Pode-se ser rico sem ostentação: a roupa já mostra quem é a pessoa. Na França, as pessoas
de melhor condição dão o melhor exemplo disso. Não empreste nem peça emprestado, pois
quando se empresta em geral se perde o amigo e o que se emprestou, e quando se toma emprestado
se perde a noção certa do que é economia. E, acima de tudo, o seguinte, a saber: seja verdadeiro
com você mesmo; a conseqüência disso (assim como a noite e o dia vêm um depois do outro) é que
você não será falso com ninguém. Adeus! Que a minha benção faça todos esses bons propósitos
crescerem dentro de você!”
(Hamlet, William Shakespeare)
vi
(Verso da folha comum)
vii
Aos meus pais, Eiso Hassunuma e Mary Hitomi Hassunuma, por todo apoio e
dedicação em todos os momentos de minha vida.
À minha irmã Cristina Yuka Hassunuma e meu cunhado Leonardo Oshiro por seus
exemplos de força, coragem, companheirismo e amor.
Ao Professor Doutor Gerson Francisco de Assis por todos estes anos de colaboração e
dedicação, desde a Graduação em Odontologia, durante o Mestrado em Patologia Bucal até
a conclusão do Doutorado em Biologia Oral. Obrigado por acreditar em meu potencial e,
especialmente, por seu exemplo de humanidade, humildade e altruísmo.
Meu Agradecimento (mais que) Especial.
viii
(Verso da folha comum)
ix
AGRADECIMENTOS
É um prazer muito grande fazer parte da primeira Turma de Doutorado do Programa de
Biologia Oral, o qual faz parte do Curso de Pós-Graduação de Estomatologia. Sendo assim,
primeiramente devo agradecer o Diretor da Faculdade de Odontologia de Bauru (USP) Prof. Dr.
Luiz Fernando Pegoraro, o Presidente da Comissão de Pós-Graduação Prof. Dr. José Carlos
Pereira, a Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Estomatologia Profa. Dra. Ana Lúcia
Álvares Capelozza e o Prof. Dr. Antonio de Castro Rodrigues, Coordenador do Curso de Pós-
Graduação em Biologia Oral. Sem esquecer de agradecer aos professores que assumiam estes
cargos no momento da minha entrada no curso: a Profa. Dra. Maria Fidela de Lima Navarro
(Direção da FOB-USP), o Prof. Dr. José Humberto Damante (Coordenação do Curso de
Estomatologia) e o Prof. Dr. José Mauro Granjeiro (Coordenação do Curso de Biologia Oral).
Em março de 2004, quando foi aberta a inscrição para o Doutorado em Biologia Oral, fui
muito bem acolhido pelo Professor Doutor Gerson Francisco de Assis, o qual prontamente me
adotou como orientado. Aliás, como já havia feito antes durante o mestrado. Por um lapso meu, o
Dr. Gerson não recebeu na época os merecidos créditos de co-orientador da minha tese de
mestrado. Mas hoje, através destas palavras, agradeço novamente por toda força e ensinamentos
recebidos em minha vida acadêmica. Aliás, antes disso... na verdade desde julho 1991, quando foi
meu orientador num estágio que realizei em meu primeiro ano de graduação no Laboratório de
Histologia. Posso dizer com certeza que o Professor Gerson e o Professor Doutor Rumio Taga
são hoje os principais responsáveis pela minha formação acadêmica.
Durante estes já 15 anos de convivência no Laboratório de Histologia ganhei a amizade de
muitas “celebridades” das ciências morfológicas como os Professores Doutores Antonio Carlos
Marconi Stipp, Dagoberto Sottovia Filho e mais recentemente o Professor Doutor Gustavo
Pompermayer Garlet. Em todos estes anos também pude contar com a força e a amizade das
funcionárias Beonildes Teresinha Ruiz Correia e Aldivina da Silva Michelotto, que sempre me
apoiaram durante toda minha estada no Departamento.
Ainda me lembro como se fosse hoje, quando eu e minha turma de doutorado alugamos
uma “van” para prestar o exame do “Toefl” em São Paulo: Ana Eliza Akashi, Esther Rieko
Takamori, Flávia Mauad Levy, Maria Heloísa Correa Rodrigues, Sílvia Helena de Carvalho
Sales Peres, Tania Mary Cestari e eu! Todos “desesperados” para saber o resultado da prova!
Ainda bem que tudo deu certo! A nós se juntaram Ariadne Machado Gonçalves Letra e Cláudia
Barbosa Quintella para completar o time! Foi muito corrido estudar várias disciplinas básicas para
x
a prova de seleção, mas por sorte contei com a ajuda da Técnica Telma Lopes Silva para
esclarecer várias dúvidas em relação à bioquímica.
E então o Doutorado começou. Durante o cumprimento das disciplinas, eu pude ter a
oportunidade de conhecer muitas pessoas, entre elas a Profa. Dra. Marília Afonso Rabelo
Buzalaf. Já nos conhecíamos do tempo de ginásio, no Colégio Prevê-Objetivo em Bauru, e depois
voltamos a nos encontrar na FOB-USP. Desde jovem a Profa. Marília já demonstrava uma
inteligência muito acima da média! E pude comprovar durante meu curso que sua fama faz jus a
toda sua capacidade intelectual. Aprendi muito... não apenas em conhecimento, mas também pelo
seu exemplo de humildade e educação.
Cerca de um mês antes da prova de seleção para Doutorado, após várias reuniões com o
Dr. Gerson, decidimos que o tema da minha tese seria a continuação de uma linha de pesquisa já
em andamento. Por isso não posso deixar de agradecer a todos que abriram esta linha de pesquisa e
que deixaram um legado para eu pudesse continuar: a Doutora Maria Renata Sales Nogueira
Costa e o Professor Doutor Daniel Araki Ribeiro (por suas Teses de Mestrado) e Alexandre
Yunomae e Marcelo Matida Hamata (por seus projetos de iniciação científica).
Após a aprovação na seleção de Doutorado, comecei a me dedicar à parte prática da Tese.
Embora tenha usado parte do material coletado pelo Alexandre e pelo Marcelo, fizemos alguns
pilotos para testar a reação imuno-histoquímica para amelogenina e outros tipos de fixadores. Para
isso, contamos com a colaboração do Coordenador do Biotério Luiz Carlos Silva para planejar a
utilização dos animais e orientar sobre o comportamento alimentar e o desenvolvimento dentário
dos animais utilizados. Aprendi com o Luiz que os animais que utilizamos em pesquisa não são
apenas “cobaias”, mas são seres vivos que têm comportamentos que podem influenciar nos
resultados da pesquisa. E só quem convive e cuida destes animais é que pode nos ajudar a descobrir
quais são estes comportamentos!
Depois partimos para os cortes histológicos para microscopia óptica. Para isso contei com
a Técnica Danielle Santi Ceolin. Embora eu tenha experimentado realizar alguns cortes, somente
a Danielle (e ninguém mais!) seria capaz de realizá-los tão bem. Somente uma pessoa com tanta
habilidade poderia conseguir cortes histológicos transversais de um incisivo com cerca de um
milímetro...
Em seguida veio a execução da reação imuno-histoquímica para amelogenina. Nesta fase,
contei mais uma vez com a ajuda da Tania que me demonstrou o protocolo de execução. Contei
também com o auxílio do aluno de graduação Edson Virgílio Zen Filho. Foram dias e dias
padronizando a reação até que se chegasse no resultado final. Mas valeu a pena...
Então foi a vez da Microscopia Eletrônica de Transmissão. Contamos com a ajuda do
Professor Doutor Elliot Watanabe Kitajima que nos abriu as portas do Laboratório de
Microscopia da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” para que as amostras fossem
analisadas. Nestas várias idas e vindas a Piracicaba pude contar mais uma vez com a ajuda do
Professor Dr. Gerson (o qual acompanhou diretamente o exame de todas amostras analisadas), da
xi
Tânia e da Danielle, além dos alunos de graduação da UNESP – Bauru: Bruno Alvares Viscelli e
Juliana Gonçalves de Oliveira.
No final de meu doutoramento, contei com a ajuda da Bibliotecária Valéria Cristina
Trindade Ferraz para relembrar todas as normas para publicação da Tese. Não posso esquecer de
agradecer “a mais do que essencial” Secretária do Curso de Biologia Oral Vera Lúcia Rosa Rufino
que ajudou a mim e a todos os meus colegas em vários momentos de nosso curso.
E não foi apenas na FOB-USP que tive ajuda de amigos. Sou muito grato a todos amigos,
coordenadores, professores e funcionários da UNIP-Objetivo. Sou muito grato especialmente às
amigas Márcia Heloísa R. Conti Silveira, Mara Regina Silva e Thaís Maria Vieira, que me
apóiam desde minha entrada na UNIP em 1997. E também aos amigos do Instituto de Arte
Contemporânea (IAC-Bauru), especialmente Edu Toledo e Sandra Regina Rodrigues por todo
apoio, compreensão e confiança. Obrigado, por realmente acreditarem em meu potencial.
Tenho que agradecer também à irmã de coração que eu ganhei no Curso de Doutorado em
Biologia Oral Esther Rieko Takamori por confiar sempre em mim e sua amizade. Obrigado pelo
apoio, dedicação e principalmente pelo exemplo de altruísmo em prestar a sua ajuda de forma tão
incondicional a todas pessoas que a cercam.
Agradeço também a FAPESP por meio de auxílio à pesquisa dos processos FAPESP n
o
02/13984-4, 03/06082-7 e 04/07854-6 (todos orientados pelo professor doutor Gerson Francisco
de Assis), cujos recursos materiais puderam também ser aproveitados no desenvolvimento da atual
pesquisa.
Meus Sinceros Agradecimentos a Todos.
xii
(Verso da folha comum)
xiii
SUMÁRIO
RESUMO xxiii
1 Introdução 1
2 Revisão de literatura 7
2.1 A passagem do flúor pela placenta 10
2.2 O flúor presente no leite materno 19
2.3 Os efeitos do flúor sobre o esmalte dentário 29
2.4 Os efeitos do flúor sobre os ameloblastos 34
2.4.1 Alterações morfológicas em ameloblastos causadas pelo flúor 34
2.4.2 Alterações na modulação de ameloblastos causadas pelo flúor 44
3 Proposição 47
4 Material e métodos 51
4.1 Tratamento e obtenção dos animais 53
4.2 Eutanásia dos animais, coleta e fixação das hemimandíbulas 56
4.2.1 Fixação para o estudo em microscopia óptica e análise imuno-histoquímica 56
4.2.2 Fixação para o estudo em microscopia eletrônica 56
4.2.3 Desmineralização 56
4.3 Procedimento laboratorial e metodologia para microscopia óptica 57
4.3.1 Análise morfológica pela coloração de hematoxilina e eosina 57
4.3.2 Tratamento imuno-histoquímico para amelogenina 57
4.4 Procedimento laboratorial e metodologia para microscopia eletrônica de transmissão 59
4.5 Análises morfométricas e estatísticas 61
4.5.1 Avaliação do comprimento da matriz de esmalte 61
4.5.2 Avaliação da altura celular 61
xiv
4.5.3 Avaliação do volume nuclear absoluto 61
4.5.4 Avaliação da densidade de volume nuclear e citoplasmático 62
4.5.5 Avaliação do volume citoplasmático absoluto 63
4.5.6 Análise estatística 63
5 Resultados 65
5.1 Resultados morfológicos 67
5.1.1 Descrição morfológica macroscópica 67
5.1.2 Descrição morfológica microscópica 69
5.1.2.1 Grupo I: animais recém-nascidos 69
5.1.2.2 Grupo II: animais com sete dias de vida pós-natal 77
5.1.2.3 Grupo III: animais com 14 dias de vida pós-natal 87
5.1.3 Descrição morfológica da microscopia eletrônica 93
5.1.3.1 Grupo I: animais recém-nascidos 93
5.1.3.1.1 Descrição do ameloblasto do subgrupo controle 93
5.1.3.1.2 Descrição do ameloblasto do subgrupo de 7ppm 94
5.1.3.1.3 Descrição do ameloblasto do subgrupo de 100ppm 94
5.1.3.2 Grupo II: animais com sete dias de vida pós-natal 103
5.1.3.2.1 Descrição do ameloblasto do subgrupo controle 103
5.1.3.2.2 Descrição do ameloblasto do subgrupo de 7ppm 103
5.1.3.2.3 Descrição do ameloblasto do subgrupo de 100ppm 104
5.1.3.3 Grupo III: animais com 14 dias de vida pós-natal 115
5.1.3.3.1 Descrição do ameloblasto do subgrupo controle 115
5.1.3.3.2 Descrição do ameloblasto do subgrupo de 7ppm 115
5.1.3.3.3 Descrição do ameloblasto do subgrupo de 100ppm 116
5.2 Resultados morfométricos 123
5.2.1 Comprimento da matriz de esmalte 123
5.2.2 Altura e volume dos ameloblastos 125
6 Discussão 129
6.1 Considerações sobre os resultados obtidos na análise morfológica em microscopia óptica e
análise imuno-histoquímica para amelogenina 134
6.2 Considerações sobre os resultados obtidos na análise morfológica em microscopia eletrônica
139
6.3 Considerações sobre os resultados morfométricos da matriz de esmalte 143
xv
6.4 Considerações sobre os resultados morfométricos para ameloblastos 147
7 Conclusões 153
Anexos 157
Anexo 1 Protocolo para preparo da solução fixadora de paraformaldeído 159
Anexo 2 Protocolo para preparo da solução fixadora de EDTA 159
Anexo 3 Protocolo para preparo dos corantes utilizados na técnica de hematoxilina e eosina 160
Anexo 4 Protocolo para coloração de hematoxilina e eosina 161
Anexo 5 Protocolo para o tratamento imuno-histoquímico da amelogenina 162
Anexo 6 Protocolo para o processamento e inclusão dos fragmentos histológicos em resina
Spurr 165
Anexo 7 Protocolo para solução aquosa de azul de metileno a 1% e azur II a 1% 165
Referências bibliográficas 167
ABSTRACT 197
xvi
(verso da folha comum)
xvii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Distribuição dos animais nos grupos experimentais 55
FIGURA 2 Visão macroscópica de rato recém-nascido do subgrupo controle 67
FIGURA 3 Montagem de cortes histológicos de germe de incisivo de rato
recém-nascido do subgrupo controle para visão panorâmica
71
FIGURA 4 Cortes histológicos de germe de incisivo de rato recém-nascido do
subgrupo controle
73
FIGURA 5 Cortes histológicos de germe de incisivo de rato recém-nascido do
subgrupo controle
73
FIGURA 6 Cortes histológicos de germe de incisivo de rato recém-nascido do
subgrupo controle
75
FIGURA 7 Cortes histológicos de germe de incisivo de rato recém-nascido do
subgrupo de 100ppm
75
FIGURA 8 Cortes histológicos de germe de incisivo de rato com sete dias de
vida pós-natal do subgrupo controle
81
FIGURA 9 Cortes histológicos de germe de incisivo de rato com sete dias de
vida pós-natal dos subgrupos controle, de 7 e de 100ppm
83
FIGURA 10 Cortes histológicos de germe de incisivo de rato com sete dias de
vida pós-natal do subgrupo de sete ppm
85
FIGURA 11 Cortes histológicos de germe de incisivo de rato com 14 dias de
vida pós-natal do subgrupo controle
89
FIGURA 12 Cortes histológicos de germe de incisivo de rato com 14 dias de
vida pós-natal dos subgrupos controle e de sete ppm
91
FIGURA 13 Cortes histológicos da fase de maturação do germe de incisivo de
rato com 14 dias de vida pós-natal dos subgrupos controle e de
100ppm
91
FIGURA 14 Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato recém-nascido do
subgrupo controle
95-97
FIGURA 15 Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato recém-nascido do
subgrupo de 100ppm
99-101
FIGURA 16 Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato com sete dias de
vida pós-natal do subgrupo controle
105
xviii
FIGURA 17 Corte ultrafino de ameloblasto na fase de maturação com borda
lisa de rato com sete dias de vida pós-natal do subgrupo controle
107
FIGURA 18 Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato com sete dias de
vida pós-natal do subgrupo de sete ppm
109
FIGURA 19 Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato com sete dias de
vida pós-natal do subgrupo de 100ppm
111
FIGURA 20 Corte ultrafino de ameloblasto na fase de maturação com borda
lisa de rato com sete dias de vida pós-natal do subgrupo de
100ppm
113
FIGURA 21 Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato com 14 dias de
vida pós-natal do subgrupo de sete ppm
117
FIGURA 22 Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato com 14 dias de
vida pós-natal do subgrupo de 100ppm
119
FIGURA 23 Corte ultrafino de ameloblasto na fase de maturação com borda
rugosa de rato com 14 dias de vida pós-natal do subgrupo de
100ppm
121
xix
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Média e desvio-padrão do comprimento de matriz do esmalte dos
grupos de tratamento com flúor para ratos com 0, 7 e 14 dias de
vida pós-natal
124
TABELA 2 Média e desvio-padrão dos parâmetros morfométricos obtidos para
ameloblastos do grupo de ratos recém-nascidos
126
TABELA 3 Média e desvio-padrão dos parâmetros morfométricos obtidos para
ameloblastos do grupo de ratos com sete dias de vida pós-natal
127
TABELA 4 Média e desvio-padrão dos parâmetros morfométricos obtidos para
ameloblastos do grupo de ratos com 14 dias de vida pós-natal
128
xx
(verso da folha comum)
xxi
LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E PALAVRAS
DE LÍNGUA ESTRANGEIRA
° = graus
% = por cento
µg = micrograma
µg/g = micrograma por g (1µg/g = 1ppm)
µgF/g = micrograma de flúor por g (1µg F/g = 1ppm)
µgF/mL = micrograma de flúor por mililitro (1µg F/mL = 1ppm)
µL = microlitro
µm = micrometro
µm
3
= micrometro cúbico
µM = micromolar (1µM = 0,019ppm)
µmol/L = micromol por litro
ad libitum
(latim) = à vontade
cm = centímetro
d = diâmetro nuclear menor
D = diâmetro nuclear maior
DI = dictiossoma
DNA = ácido desoxirribonucléico
EDTA = etilenodiaminotetra acético sal dissódico
F = flúor
g = grama
GTP = guanosina trifosfato
H.E. = hematoxilina e eosina
in vitro
(latim) = em laboratório
in vivo
(latim) = em ser vivo
L = lisossomo
M = molar
MA = matriz de esmalte
MET = microscopia eletrônica de transmissão
MF = microfilamento
MFP = monofluorofosfato de sódio
mg = miligrama
mg/kg = miligrama por quilograma
mg/L = miligrama por litro
xxii
mgF/kg = miligramas de flúor por quilo
mgNaF/kg = miligramas de fluoreto de sódio por quilo
MI = mitocôndria
ml/g = mililitros por grama
mm = milímetro
mM = milimolar (1mM = 19ppm)
MMP = metaloproteinase da matriz
MO = microscopia óptica
N = núcleo
n = número de animais da amostra
NaF = fluoreto de sódio
NaSn
2
F
5
= fluoreto estanoso de sódio
ng/g = nanogramas por grama
ng/L = nanograma por litro
nm = nanômetro
NU = nucléolo
p = nível de significância, probabilidade
p.a. = pró análise
ppm = parte por milhão
pH = potencial hidrogeniônico
PT = processo de Tomes
REG = retículo endoplasmático granular ou rugoso
Scel = área ocupada pela célula
Scit = área ocupada pelo citoplasma
SnF
2
= fluoreto de estanho
Svcit = densidade de volume citoplasmático
Svn = densidade de volume nuclear
V = vacúolo
Vcit = volume citoplasmático
VD = vacúolo digestivo
Vn = volume nuclear
Vvn = densidade de volume nuclear
Vvcit = densidade de volume citoplasmático
x = vezes aumentadas de uma imagem
xxiii
RESUMO
A fluorose dentária resulta da toxicidade do flúor durante a odontogênese.
Vários modelos experimentais têm sido utilizados para tentar explicar a
patogênese do flúor no esmalte, mas durante o período fetal e pós-natal inicial,
pouco se conhece a respeito da sua ação. Por isso, no atual trabalho, foram
utilizadas ratas que receberam 0, 7 ou 100ppm de fluoreto de sódio na água de
beber, no período a partir de uma semana antes do acasalamento, durante
toda gestação e durante o aleitamento. As hemimandíbulas dos filhotes com 0,
7 e 14 dias de vida pós-natal (n = 6) foram coletadas para o estudo
morfológico em microscopia óptica e eletrônica, análise imuno-histoquímica
para amelogenina e estudo morfométrico da matriz de esmalte e dos
ameloblastos nas fases de secreção e maturação do incisivo inferior. Os
resultados mostraram em ameloblastos secretores do grupo experimental de
100ppm em todos períodos experimentais: uma menor secreção de matriz de
esmalte, a desorganização das cristas das mitocôndrias, o aparecimento de
grandes vacúolos na região apical do citoplasma, o acúmulo de material
intracisternal e a dilatação de algumas cisternas de retículo endoplasmático
rugoso. Nos grupos de animais com 7 e 14 dias, a análise de variância (ANOVA)
mostrou uma redução significativa (p<0,05) no volume citoplasmático,
respectivamente, de 23,80% e 24,75% em relação aos grupos controles. Nos
ameloblastos em maturação de borda lisa, foi observada uma grande
quantidade de vacúolos com matriz eletrondensa endocitada, sugerindo retardo
na reabsorção. Nos ameloblastos de borda rugosa, foi observada a presença de
algumas mitocôndrias dilatadas. A análise imuno-histoquímica mostrou que não
houve diferença na intensidade e no padrão de marcação da matriz de esmalte
em nenhum dos grupos estudados. Portanto, parte do fluoreto de sódio
administrado em excesso à mãe na água de beber pode alcançar o filhote pela
placenta e pelo leite materno, provocando alterações morfológicas observadas
em ameloblastos que sugerem uma redução na secreção e um retardo na
reabsorção da matriz de esmalte.
1 Introdução
Introdução
3
1 Introdução
A presença excessiva de flúor durante a formação do esmalte provoca a
fluorose dentária, visualizada clinicamente como manchas ou zonas de
hipomineralização no esmalte (DEAN
39
, 1942; FEJERSKOV et al.
65
, 1994). Em
ratos, a administração prolongada de flúor, pode provocar alterações como a
formação de cistos, calcificações de aspecto amorfo e proliferação papilar no
órgão do esmalte. Essas alterações são menos acentuadas no início da
formação da matriz de esmalte e na mineralização inicial, onde o ameloblasto
encontra-se na sua fase secretora (DAJEAN; MENANTEAU
38
, 1989;
DENBESTEN; THARIANI
47
, 1992; RIBEIRO; ASSIS; HIROTA
140
, 2001;
ROBINSON; KIRKHAM
142
, 1990). Na fase de maturação, são observadas as
maiores alterações na matriz pela influência do flúor, como a perda parcial ou
completa da pigmentação do esmalte de incisivos de ratos (DENBESTEN;
CRENSHAW
44
, 1984), diminuição do índice de reabsorção extracelular das
proteínas da matriz (COSTA
33
, 2000; DENBESTEN
41
, 1986; DENBESTEN;
CRENSHAW
44
, 1984) e hipomineralização do esmalte (ROBINSON; KIRKHAM
142
,
1990).
Todas essas alterações ainda não estão devidamente esclarecidas, mas
alguns autores suspeitam que dependendo da sua concentração o flúor possa
interferir também na atividade extracelular das proteinases necessárias para
degradar as amelogeninas durante a maturação do esmalte (AOBA
4
, 1994;
SMITH et al.
164
, 1989) ou formar a fluorapatita, que dificultaria a ação das
proteinases (DAJEAN; MENANTEAU
38
, 1989; ROBINSON; KIRKHAM
142
, 1990).
Possivelmente o flúor também possa alterar o balanço do íon cálcio, dificultando
o crescimento dos cristais do esmalte (AOBA
4
, 1994; ROBINSON; KIRKHAM
142
,
1990). Tanto as dosagens crônicas como as agudas de flúor provocam
alterações na ultraestrutura do ameloblasto de dentes de rato, como a atrofia
da porção distal, dilatação de mitocôndrias, distensão e acúmulo de material de
Introdução
4
secreção no retículo endoplasmático (KRUGER
94
, 1968; RIBEIRO
139
, 2001;
RIBEIRO; ASSIS; HIROTA
140
, 2001), acúmulo aumentado de vacúolos claros
(KRUGER
94
, 1968; OLIVEIRA
128
, 1988; WALTON; EISENMANN
178
, 1974) e de
corpos escuros no citoplasma, aumento de grânulos de secreção na região
apical, fragmentação e redução do processo de Tomes. Além disso, também
pode ocorrer uma desorganização do aspecto prismático das células (LYARUU
et al.
107
, 1986; WALTON; EISENMANN
178
, 1974) e uma redução do número de
ameloblastos de porção terminal lisa durante a sua modulação da fase de
secreção para maturação nos incisivos de ratos (SMITH; NANCI;
DENBESTEN
164
, 1993). Estudos utilizando ameloblastos cultivados
in vitro
têm
indicado que o excesso de flúor possa causar um estresse no retículo
endoplasmático granular (REG) alterando a síntese protéica (KUBOTA et al.
98
,
2005) ou uma interferência no citoesqueleto do ameloblastos, prejudicando
tanto a via de síntese, quanto a de reabsorção das proteínas do esmalte (LI et
al.
103
, 2005).
A maioria dessas pesquisas foi realizada em animais adultos, mas sabe-
se que o flúor durante a gestação pode atravessar a placenta, tanto de
humanos (AVERY
13
, 2005; FASSMAN
62
, 1993; TEN CATE
172
, 2001) quanto de
ratos (KATZ; STOOKEY
91
, 1973), podendo estar presente também no leite
materno (AVERY
13
, 2005; BUTTNER; MUHLER
24
, 1958; DRINKARD; DEATON;
BAWDEN
54
, 1985).
Assim, o flúor pode atingir os tecidos dentários (DRINKARD; DEATON;
BAWDEN
54
, 1985; GEDALIA; SHAPIRA
71
, 1989), alterando o seu
desenvolvimento durante o período fetal ou pós-natal inicial (MACIEJEWSKA;
ADAMOWICZ-KLEPALSKA
108
, 2000; MACIEJEWSKA et al.
109
, 2000; MATSUO et
al.
112
, 1996). Entretanto, ainda faltam informações morfológicas que mostrem a
interferência do flúor na amelogênese durante os períodos gestacionais e na
amamentação.
Desta forma, no atual trabalho, foram verificadas possíveis alterações
em incisivos inferiores de ratos com 0, 7 e 14 dias de vida pós-natal, cujas
mães receberam água deionizada com 0, 7 ou 100ppm de flúor no período a
partir de uma semana antes do acasalamento das ratas, durante a gestação e a
Introdução
5
amamentação até o momento da eutanásia. Os incisivos inferiores dos filhotes
foram analisados em estudo imuno-histoquímico utilizando anticorpos primários
contra amelogenina, descrição morfológica em imagens obtidas no Microscópio
Óptico (MO) e Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET) e avaliação
morfométrica em microscopia óptica da matriz e ameloblastos nas fases de
secreção e maturação.
Introdução
6
2 Revisão de Literatura
Revisão de Literatura
8
Revisão de Literatura
9
2 Revisão de literatura
Complementando as considerações apresentadas na introdução, será
apresentada uma revisão de literatura, ordenada em partes específicas para
facilitar o entendimento do tema proposto:
• A passagem do flúor pela placenta
• O flúor presente no leite materno
• Os efeitos do flúor sobre o esmalte dentário
• Os efeitos do flúor sobre os ameloblastos
• Alterações morfológicas provocadas pelo flúor em ameloblastos
• Alterações na modulação de ameloblastos causadas pelo flúor
Revisão de Literatura
10
2. 1 A passagem do flúor pela placenta
A ingestão pré-natal de flúor deve ser considerada como fator importante
no desenvolvimento pós-natal do esmalte. Estudos em cobaias têm
demonstrado que filhotes expostos à fluoretação antes do nascimento
apresentam mais flúor no esqueleto e no esmalte (PARKER; BAWDEN
132
, 1986).
O flúor ingerido pela mulher grávida atinge a corrente sangüínea,
passando pela barreira placentária (onde é parcialmente armazenada) e
alcançando a circulação sangüínea do feto (FELTMAN; KOSEL
67
, 1955;
FELTMAN; KOSEL
68
, 1961; GARDNER et al.
70
, 1952; GEDALIA et al.
73
, 1961).
A placenta humana retira parte significativa do flúor. Este fato pode ser
comprovado quando se comparam os níveis de flúor no plasma materno e fetal.
Devido à barreira placentária, os níveis de fluoreto na circulação sangüínea do
feto são relativamente mais baixos quando comparados aos níveis maternos
(AVERY
13
, 2005).
ARMSTRONG; SINGER; MAKOWSKI
11
, 1970, coletaram amostras de
plasma sangüíneo materno e do cordão umbilical de seis mulheres no momento
da cesariana. Neste trabalho, não houve controle da dieta, nem foi informada a
quantidade de flúor disponível na água de abastecimento. Por colorimetria e
análise de absorção atômica, foi constatado um nível de flúor de 0,10ppm no
plasma sangüíneo obtido de uma veia materna e de 0,11ppm no coletado a
partir de uma artéria materna. No plasma fetal obtido tanto da artéria quanto
da veia umbilical, o valor observado foi de 0,14ppm, sem diferença
estatisticamente significante com os valores maternos.
LOUW; VAN WYK
106
, 1984, realizaram um estudo semelhante analisando
material coletado de dez mulheres no momento da cesariana. Neste trabalho,
também não foi informado o nível de flúor da água de abastecimento, nem
houve controle da dieta. Estes autores obtiveram, por técnica de eletrodo
seletivo para flúor, um valor de 0,27mg/L de flúor no plasma materno e
Revisão de Literatura
11
0,25mg/L no plasma fetal, não havendo diferença estatisticamente significante
entre estes valores.
MONTHERRAT-CARRET et al.
116
, 1996, analisaram o nível de flúor no
plasma materno e da veia do cordão umbilical de mães que residiam em áreas
fluoretadas (onde havia mais de 0,7 partes/10
6
de flúor na água de beber) e
não fluoretadas (onde havia menos de 0,1 partes/10
6
de flúor na água de
beber). Utilizando um eletrodo íon-específico, foi obtida uma média de 0,034
partes/10
6
de flúor (1,79µM) no plasma materno e 0,031 partes/10
6
de flúor
(1,63µM) no plasma obtido do sangue da veia do cordão umbilical. Neste
trabalho, os autores não indicaram as médias para as amostras obtidas de
áreas fluoretadas e não fluoretadas, uma vez que havia um número reduzido de
amostras (dez fetos oriundos de áreas fluoretadas e três de áreas não
fluoretadas). A razão entre a concentração de flúor no plasma materno e do
plasma da veia do cordão umbilical foi de 1,1, o que confirma a transferência
de flúor pela placenta, quando a administração de flúor é baixa. Neste mesmo
trabalho, foi verificado que a concentração de flúor no germe dentário e na
mandíbula aumenta de acordo com o nível de flúor na água de beber,
sugerindo mais uma vez a passagem de flúor pela placenta.
A ação da barreira placentária pode ser observada também quando se
analisa a deposição de flúor em tecidos duros. GEDALIA; ZUKERMAN
72
, 1965,
analisaram por colorimetria a quantidade de flúor presente nos ossos femurais,
mandíbula e dentes de 71 fetos de cinco a nove meses de idade que sofreram
aborto espontâneo ou morte prematura ainda na vida intra-uterina. As mães
residiam em Israel, onde o nível de flúor na água era de 0,5 a 0,6ppm ou
1ppm. Foi verificado que o conteúdo de flúor nos ossos e dentes aumentava
com o avanço da idade do feto, sendo este aumento maior no osso e menor no
dente. Existiram algumas diferenças estatísticas entre os grupos, mas não
houve um aumento diretamente proporcional. Por exemplo, no dente de fetos
cujas mães recebiam 0,5ppm de flúor na água de beber, foram observadas
concentrações de flúor de 2,63, 3,26, 4,30, 5,79 e 6,97mg/100g de cinza,
respectivamente para fetos nas idades de 5, 6, 7, 8 e 9 meses. Para os fetos
cujas mães recebiam 1ppm, os valores foram de 4,40, 4,70, 5,20 e
Revisão de Literatura
12
5,38mg/100g de cinza, respectivamente para os fetos de 6, 7, 8 e 9 meses de
idade (não houve amostra de fetos com 5 meses de idade). Desta forma, a
placenta parece representar uma barreira parcial à passagem de quantidades
maiores de flúor.
Mas a placenta não permite a passagem de todo o flúor plasmático ao
feto. Existe também um acúmulo de flúor no tecido placentário, mesmo quando
baixas doses são administradas. GEDALIA et al.
73
, 1961, analisaram por
colorimetria a concentração de flúor na placenta, cordão umbilical e plasma
sangüíneo materno de 25 mulheres saudáveis, próximo ao parto, as quais
viviam em Jerusalém em áreas cujo nível de flúor na água de abastecimento
era de 0,55ppm. O nível médio de flúor na placenta (0,15ppm) foi
significantemente maior que o do plasma sangüíneo obtido do cordão umbilical
(0,11ppm) e do sangue materno (0,09ppm). Não houve diferença estatística
entre a concentração de flúor do plasma sangüíneo materno e do cordão
umbilical. Um fato bastante interessante, é que o plasma coletado de mulheres
não grávidas apresentava um nível de flúor (0,18ppm) maior que das mulheres
grávidas, o que poderia sugerir o acúmulo de flúor na placenta durante a
gravidez e a remoção do mesmo da corrente sangüínea da mãe. Em todos os
casos, a concentração de flúor na placenta foi maior que a observada no
plasma materno. O fato da concentração média de flúor ser maior na placenta
que no cordão umbilical e que existe uma correlação positiva entre eles, indica
que a placenta permite a passagem de flúor ao feto. Porém, parte do flúor deve
se acumular no tecido placentário, obstruindo parcialmente a sua transmissão
ao feto; uma vez que não houve diferença estatística entre a concentração
média de flúor no plasma sangüíneo materno e no cordão umbilical.
A passagem de flúor através da placenta e seu acúmulo na mesma está
relacionada com a quantidade de flúor administrada durante a gravidez.
GEDALIA et al.
74
, 1964, estudaram três grupos de mulheres grávidas. O grupo I
estava composto por 39 mulheres de Upper Galilee e Tel-Aviv em áreas onde a
água de abastecimento continha 0,06 a 0,15ppm de flúor, sendo considerada
uma baixa concentração. O grupo II estava formado pode 20 mulheres de
Kiriath-Chaim que bebiam água de abastecimento contendo 0,6 a 0,9ppm de
Revisão de Literatura
13
flúor, considerada uma alta concentração. E no grupo III havia 18 mulheres de
Jerusalém que residiam em áreas onde o nível de flúor era de 0,5 a 0,6ppm de
flúor (concentração média) e que recebiam também um tablete de 0,5mg de
NaF por dia. Nas análises de flúor da placenta e do plasma sangüíneo foi
utilizada a técnica da colorimetria. No grupo I (baixa concentração), o nível de
flúor no cordão umbilical (0,165ppm) foi significantemente maior que o
observado na placenta (0,121ppm) e no plasma materno (0,150ppm).
Entretanto, os valores obtidos para placenta e plasma materno não foram
significantemente diferentes. Entre os grupos II e III (alta concentração), as
diferenças entre o nível de flúor na placenta, cordão umbilical e sangue
materno foram insignificantes. Na obtenção das médias, os resultados de
ambos os grupos foram reunidos. Portanto, no grupo de alta concentração, o
nível de flúor do cordão umbilical (0,175ppm) foi significantemente menor que
o observado na placenta (0,228ppm) e no plasma materno (0,234ppm). Os
valores observados para o tecido placentário e o plasma materno não foram
estatisticamente significantes. Quando se comparou o resultado dos grupos de
baixa e alta concentração de flúor, os valores obtidos para o cordão umbilical
não apresentaram diferenças estatisticamente significantes. Entretanto, os
níveis de flúor na placenta e no plasma materno foram significantemente
maiores no grupo de alta concentração que no de baixa. Estes resultados
sugerem que quando a concentração é baixa, o flúor atravessa livremente a
placenta, mas quando o consumo é alto, a placenta regula a sua passagem,
protegendo o feto do excesso.
Este fato pode ser verificado pelo nível de flúor analisado no esmalte
produzido no período pré- e pós-natal. TOYAMA et al.
176
, 2001, mensuraram a
concentração de flúor de incisivos e caninos decíduos de esfoliados de crianças
que residiam em áreas naturalmente fluoretadas (1,0 a 1,3 partes/10
6
de flúor
na água de beber) em West Hartlepool e de regiões não fluoretadas (menos de
0,1 partes/10
6
de flúor na água de beber) em Leeds na Inglaterra. Utilizando
um eletrodo íon-específico, foram analisadas camadas de 100µm antes e depois
da linha neonatal, as quais correspondem a áreas de esmalte pré- e pós-natal,
respectivamente. Foi verificado que não houve diferença estatística entre o
Revisão de Literatura
14
nível de flúor no esmalte sintetizado nos períodos pré- e pós-natal, mas a
concentração de flúor foi maior no esmalte de dentes de crianças residentes em
área fluoretada. Desta forma, o flúor passa pela placenta, mesmo quando é
administrado na água de beber em doses abaixo da ideal (no caso 0,1ppm de
flúor), mas não é acumulado significativamente no esmalte dentário.
Em animais, existem vários relatos na literatura abordando também a
transferência do flúor através da placenta. Não existem dúvidas que o flúor
passe pela barreira placentária, atingindo os tecidos fetais (ERICSSON;
ULLBERG
60
, 1958; FASSMAN
62
, 1993; KATZ; STOOKEY
91
, 1973; MAPLESDEN et
al.
110
, 1960; THEUER; MAHONEY; SARETT
174
, 1971; THYLSTRUP
175
, 1981) e
podendo alcançar estruturas dentárias fetais em diversas espécies de animais
(DRINKARD; DEATON; BAWDEN
54
, 1985; GEDALIA; SHAPIRA
71
, 1989; ZIPKIN;
BABEAUX
186
, 1965).
Embora a placenta permita a transferência de flúor ao feto, existe uma
retenção proporcionalmente maior quanto maior for a sua ingestão. Sabe-se
também que a exposição de flúor antes da gestação causa um aumento na
quantidade de flúor transferido pela placenta durante a gravidez. Embora não
haja informações suficientes para elucidar o mecanismo pelo qual este processo
ocorre, o flúor provavelmente deva ser armazenado no esqueleto antes da
gravidez e durante este período seja mobilizado e transferido aos filhotes.
Assim, o flúor consumido na água de beber antes, durante ou antes e durante a
gestação é transferido parcialmente à prole, devido ao fato da placenta ser
permeável ao flúor e parte ficar retida nos ossos (KATZ; STOONEY
91
, 1973).
Em ratos, como nos humanos, a placenta bloqueia parcialmente a
passagem do flúor da mãe ao feto (KATZ; STOONEY
91
, 1973; MAPLESDEN et
al.
110
, 1960; THYLSTRUP
175
, 1981).
A ação da placenta como barreira ao flúor pode ser verificada também
quando se compara a passagem de flúor da mãe para o filhote nos períodos
pré- e pós-natal. MAPLESDEN et al.
110
, 1960, verificaram, utilizando técnica de
destilação, o nível de flúor na carcaça de fetos e filhotes de ratos
Sprague-
Dawley
cujas mães receberam 0, 50, 100, 200 e 300ppm de flúor adicionados
em uma dieta sólida de 3ppm de flúor. Os autores não descreveram se as mães
Revisão de Literatura
15
recebiam esta mesma dieta ou água fluoretada antes do acasalamento. Nos
fetos nos 21
o
dia de gestação, foram observados níveis de flúor de 0, 1,0 ± 1,2,
1,8 ± 0,8 e 4,1 ± 1,3ppm, respectivamente para os grupos de 0, 50, 100 e
200ppm. Ao nascimento, as carcaças dos filhotes dos grupos de 0, 50, 100, 200
e 300ppm apresentavam 0,3 ± 0,1, 1,4 ± 1,9, 1,7 ± 1,6, 2,8 ± 2,2 e 5,6 ±
2,8ppm; e aos 21 dias de vida pós-natal, apresentavam 0,0, 2,1 ± 1,1, 4,7 ±
2,4, 10,1 ± 5,9 e 9,9 ± 2,3ppm. Este experimento foi repetido em ratas
Wistar
, onde foram observados valores de 0,0, 0,6 ± 0,1 e 3,5 ± 3,5ppm de
flúor em recém-nascidos cujas mães receberam 0, 50 e 300 ppm de flúor.
A quantidade de flúor retida na placenta foi mensurada por THEUER;
MAHONEY; SARETT
174
, 1971. Neste estudo, os pesquisadores avaliaram, por
espectrofotometria, o nível de flúor encontrado nas cinzas das placentas e de
fetos de ratos
Sprague-Dawley
com 20 dias de gestação, cujas mães receberam
dieta sólida fluoretada. Durante 12 semanas, as ratas recebiam uma dieta com
baixo nível de flúor. Após este período, ocorria o acasalamento e as ratas
prenhes recebiam ração com 0, 50, 100 e 200ppm de flúor. Os autores
realizaram vários experimentos utilizando diferentes formas de flúor (NaF,
NaSn
2
F
5
, SnF
2
e NaF + SnF
2
), mas não observaram diferenças estatisticamente
significantes nos resultados obtidos. Na placenta dos fetos cujas mães
receberam NaF, o nível de flúor foi de 0,4, 1,1 e 1,1ppm; e nos fetos, o nível foi
de 0,65, 1,15 e 3,02ppm, respectivamente para os grupos de 50, 100 e
200ppm. Desta forma, o nível de flúor fetal é consideravelmente maior que o
da placenta. A análise estatística revelou um aumento significativo apenas nos
animais cujas mães que receberam 200ppm.
A retenção de flúor tem como objetivo proteger o feto contra
quantidades tóxicas de flúor que possam alterar o desenvolvimento ou
crescimento fetal (THYLSTRUP
175
, 1981). O flúor, que não foi retido, consegue
atravessar a barreira placentária e circula no plasma sangüíneo, depositando-se
parcialmente no esqueleto fetal (ERICSSON; ULLBERG
60
, 1958). Desta forma, o
acúmulo no esqueleto fetal é menor do que o acumulado no materno
(ERICSSON; HAMMARSTRÖM
59
, 1964).
Revisão de Literatura
16
Vários estudos demonstraram que o flúor não apenas é capaz de
atravessar a placenta como também está presente no plasma sangüíneo e é
armazenado nos tecidos fetais (COHEN; WINER; CURBY
32
, 1959), inclusive no
esmalte dentário (BAWDEN et al.
16
, 1989; BAWDEN et al.
17
, 1992; PARKER;
BAWDEN
132
, 1986).
Estudos sugerem que seja necessária uma dieta de pelo menos 10 a
15ppm de flúor para ser observado um aumento significante no conteúdo total
de flúor em cinzas cremadas dos filhotes. BUTTNER; MUHLER
24
, 1958,
utilizaram ratas que receberam 0, 1, 3, 5, 10, 25 e 50ppm de flúor na forma de
NaF em água de beber e ração contendo 1,0µgF/g durante a prenhez. Os
filhotes foram sacrificados no momento do nascimento, com 10 e 30 dias de
vida pós-natal para análise de flúor nas cinzas da carcaça cremada. Foi
verificado que é necessária a administração de pelo menos 10ppm de flúor na
água de beber para que seja observado um aumento significante no conteúdo
total de flúor nos filhotes. Enquanto o nível de flúor nos filhotes recém-nascidos
cujas mães receberam 5ppm foi de 5,2µg, nos filhotes cujas mães receberam
50ppm foi de 11,9µg. Ou seja, foi necessário um aumento de dez vezes do flúor
na água de beber das mães para dobrar a quantidade do flúor na carcaça dos
filhotes. Devido ao fato da placenta atuar como barreira à passagem do flúor,
não se pode fazer uma correlação direta entre o aumento de flúor na dieta com
o valor esperado nos filhotes.
BRZEZINSKI et al.
21
, 1961, estudaram cinco grupos de ratas que
receberam os seguintes tratamentos:
- grupo I: ração com 0,20ppm de flúor e água com zero ppm de flúor;
- grupo II: ração com 0,20ppm de flúor e água com cinco ppm de flúor;
- grupo III: ração com 4,55ppm de flúor e água com 0,65 ppm de flúor;
- grupo IV: ração com 4,55ppm de flúor e água com 10 ppm de flúor;
- grupo V: ração com 4,55ppm de flúor e água com 50 ppm de flúor;
- grupo VI: ração com 4,55ppm de flúor e água com 100 ppm de flúor.
Os filhotes de cada grupo foram sacrificados logo após o nascimento
para análise de flúor por colorimetria. Foi verificado que é necessária uma dieta
de pelo menos 10 a 15ppm de flúor para ser observado um aumento
Revisão de Literatura
17
significante no conteúdo total de flúor em cinzas cremadas dos ossos dos
filhotes.
Em pesquisas experimentais para avaliar o acúmulo de flúor em tecidos
fetais, deve ser considerado também o tempo de exposição do mesmo. O
tempo de administração deste íon parece ser importante não apenas quando se
estuda o esmalte, mas também o tecido ósseo, e também pode ser válido para
o período pós-natal. Assim, quanto maior é o tempo de exposição ao flúor,
maior o acúmulo de flúor em tecidos ósseos (WEDDLE; MUHLER
181
, 1955).
Ao estudar a transferência do flúor através da placenta, deve ser levada
em conta também a retenção do flúor no esqueleto da mãe. Doses agudas de
fluoreto de sódio injetadas em ratos adultos podem acarretar fluorose no
esmalte subseqüentemente irrompido, mesmo após os índices altos de flúor
plasmático terem retornado aos níveis basais (ANGMAR-MANSSON;
WHITFORD
2
, 1983).
Em animais adultos, foi verificado que o flúor parece ser mobilizado do
osso adjacente para o órgão do esmalte, resultando numa concentração de
flúor local suficiente para afetar a amelogênese e agravar as alterações
decorrentes da fluorose (ANGMAR-MANSSON; WHITFORD
2
, 1983; ANGMAR-
MANSSON; LINDH; WHITFORD
3
, 1990; BRÓGLIO
20
, 1994).
Fica claro então que as alterações provocadas pelo flúor estão
intimamente ligadas ao flúor administrado anteriormente ao experimento e que
se encontra armazenado no osso. Desta forma, em estudos deve-se considerar
também a administração do flúor antes do período gestacional. KATZ;
STOONEY
91
, 1973, analisaram o conteúdo de flúor na carcaça de filhotes de
ratos cujas mães que receberam água de beber contendo 25ppm de flúor, na
forma de NaF antes e/ou durante a gestação. Nos animais cujas mães
receberam flúor antes da prenhez, foi observada uma quantidade de flúor de
5,63µg por filhote. Nos animais cujas mães receberam flúor durante a prenhez,
foi observada uma quantidade de 5,09µg por filhote. Nos animais cujas mães
receberam flúor antes e durante a prenhez, foi observada uma quantidade de
7,36µg por filhote. Isto demonstra que a placenta do rato albino é permeável
ao flúor se é fornecido numa concentração de 25ppm na água de beber e se for
Revisão de Literatura
18
administrado antes e/ou durante o período gestacional. Menos de 1% do flúor
administrado às ratas prenhes durante toda gestação é transferida à prole,
devido à ação da presença da barreira placentária. O flúor administrado antes
do período gestacional foi parcialmente transferido ao feto através da placenta,
provavelmente como resultado da estocagem do mesmo no tecido ósseo
materno antes da gestação e a subseqüente mobilização durante a prenhez.
A manutenção deste estado de equilíbrio aparente da concentração de
flúor no sangue é função da ingestão continua e parece ser mantido pela
concentração de flúor lábil nos ossos (CURY
36
, 1984).
Sendo assim, as modificações celulares ocorridas em detrimento do flúor
podem ser dependentes de vários fatores, como a dose, o tempo decorrido
após a sua administração, o momento da administração do flúor em relação ao
ciclo circadiano, o estágio em que se encontra do ameloblasto no momento de
administração da droga, a calcemia e a idade do animal utilizado no
experimento e a liberação de cálcio pelo tecido ósseo circunjacente (ANGMAR-
MANSSON; WHITFORD
2
, 1983; DENBESTEN
43
, 1999; DENBESTEN; THARIANI
47
,
1992; KRUGER
96
, 1970; LARSEN; RICHARDS; FEJERSKOV
100
, 1981).
Revisão de Literatura
19
2. 2 O flúor presente no leite materno
Independente da via de aplicação, o flúor administrado na fase pré-natal
está presente tanto nos tecidos maternos, quanto nos tecidos fetais. Parte do
flúor presente no corpo materno pode ser transmitido à criança pelo leite
durante o período de amamentação. Entretanto, estudos realizados em
humanos demonstraram a presença de pequena quantidade de flúor presente
no leite materno. Utilizando um eletrodo íon-seletivo, HOSSNY et al.
80
, 2003,
verificaram que o nível de flúor no leite materno é de aproximadamente 0,1 a
0,6µmol/L em mulheres que residiam no Cairo, onde o nível de flúor na água de
abastecimento é de 0,3ppm.
Vários estudos foram realizados comparando o nível de flúor no leite
materno em mães que moram em áreas fluoretadas e não fluoretadas. Neste
sentido, CHOWDHURY; BROWN; SHEPHERD
31
, 1990, realizaram um estudo
utilizando eletrodo íon-específico para mensuração do nível de flúor iônico livre
no leite de mães que viviam na Nova Zelândia em áreas fluoretadas (0,8 –
0,9µgF/mL) e não fluoretadas (0,09 – 0,10µgF/mL). Tanto na área fluoretada
quanto na área não fluoretada foi observado um valor médio de 0,003µgF/mL,
não havendo diferença estatisticamente significante.
A quantidade de flúor é considerada baixa não apenas no leite materno
comum, mas também no colostro. SPAK; EKSTRAND; HARDELL
166
, 1983,
analisaram o nível de flúor no colostro por técnica de microdifusão em mães
que residiam em áreas onde a fluoretação da água era de 0,2 e 1ppm. A
concentração de flúor observada foi de 0,30 ± 0,10µM e 0,36 ± 0,15µM,
respectivamente para os grupos citados anteriormente, sem diferença
estatística entre os mesmos. Na região onde o nível de flúor na água era de
1ppm, foram analisadas amostras de leite materno, sendo obtido um valor de
0,38 ± 0,20µM. Isto mostra que crianças alimentadas com leite materno, cujas
mães residam em áreas de 0,2 a 1ppm de flúor na água de beber, talvez
Revisão de Literatura
20
tenham recebido aproximadamente a mesma quantidade de flúor,
independente da diferença na ingestão de flúor por suas mães.
O nível de flúor no leite materno está diretamente relacionado com a
quantidade presente na água de beber. DABEKA et al.
37
, 1986, coletaram
amostras de leite materno de voluntárias do Canadá e verificaram por técnica
de microdifusão com eletrodo flúor-específico que a concentração média de
flúor no leite materno era de 7,08ng/g. Nas áreas fluoretadas (onde o nível de
flúor na água de abastecimento era de 1µg/g) a concentração média era de
9,80ng/g e nas áreas não fluoretadas (onde o nível de flúor na água de
abastecimento era menor que 0,16µg/g) era de 4,41ng/g, com diferença
estatística significativa entre estes grupos. Nesta mesma pesquisa, os autores
verificaram outras fontes de flúor como consumo de peixe e suplementos
fluoretados ingeridos antes, durante e depois da gravidez. Porém, a água de
beber foi a variável mais claramente associada com os níveis de flúor, sendo
confirmada pela análise de regressão, a associação entre a concentração de
flúor na água de beber e a concentração presente no leite materno.
Desta forma, a quantidade de flúor consumida pela mãe antes e durante
a gravidez pode influir na quantidade do flúor no leite materno. ESALA;
VUORI
61
, 1982, realizaram um estudo na Finlândia pesquisando o nível de flúor
no leite materno de mulheres que residiam em áreas com alta e baixa
concentração de flúor na água de abastecimento. Por técnica de microdifusão
por eletrodo flúor-seletivo foi verificado que na área de baixa concentração
(onde havia 0,2µgF/mL na água de abastecimento), o nível de flúor iônico no
leite materno das mães que residiam nesta região foi de 0,005µgF/mL e de
flúor total foi de 0,007µgF/mL. Na área de alta concentração (onde havia
1,7µgF/mL na água de abastecimento), o valor obtido foi de 0,009µgF/mL,
sendo este valor significantemente maior que o observado na área de baixa
concentração. Entretanto, vale ressaltar que os autores não descreveram se
todas as mulheres selecionadas para o estudo haviam nascido em tais regiões
ou permanecido toda vida nestas áreas, ou ainda se havia mulheres na amostra
que tinham migrado de outras regiões para estas áreas, o que poderia talvez
influir nos resultados obtidos.
Revisão de Literatura
21
Este fato pode ser comprovado no estudo de SIMPSON; TUBA
159
, 1968,
os quais analisaram amostras de leite materno coletado de mães que residiam
em Edmonton em Alberta (Canadá) por meio de eletrodo específico. Neste
trabalho, os autores analisaram amostras de leite materno coletadas dois meses
antes e um mês após o início de fluoretação da água de abastecimento. Antes
da fluoretação, o nível de flúor na água era de 0,26ppm, passando para 1ppm
com o tratamento da água. Foram selecionadas mães que não utilizavam
suplementos alimentares fluoretados. Foi verificado que o nível de flúor no leite
materno aumentou de 0,20ppm para 0,49ppm após a fluoretação da água, com
diferenças estatisticamente significantes entre estas amostras. Todavia, vale
ressaltar que as amostras foram coletadas de um hospital local, não estando
descrito se havia mulheres de outras cidades, o que talvez pudesse influir nos
resultados obtidos.
O nível de flúor no leite materno não acompanha o nível no plasma
sangüíneo materno, pelo menos num período após a sua administração. Neste
sentido, EKSTRAND; BOUREUS; DE CHATEAU
55
, 1981, administraram uma dose
de 1,5mg de flúor na água de beber em forma de solução aquosa de NaF para
cinco mães entre 27 e 36 anos no 3
o
dia pós-parto. Foi analisada a quantidade
de flúor no plasma sangüíneo materno (com eletrodo flúor-específico) e no leite
materno (por técnica de microdifusão) antes, 30, 69, 90 e 120 minutos após a
administração do flúor. Foi observado que a concentração de flúor em todos
indivíduos aumentou rapidamente após a ingestão de flúor, com pico observado
30 minutos após. Mas não houve um aumento correspondente na quantidade
de flúor detectado no leite materno. Isto sugere que durante o período
examinado, o flúor seja pobremente transferido ao leite materno, talvez devido
ao curto período analisado.
O nível de flúor no leite materno pode variar durante gravidez. LATIFAH;
RAZAK
101
, 1989, verificaram o nível de flúor em amostras de leite materno de
mães residentes em áreas fluoretadas (0,7ppm) da Malásia; todas residentes na
localidade há mais de um ano e sem receber suplementos ou drogas
fluoretadas. A concentração de flúor obtida por meio de eletrodo para flúor
variou de 0,024 a 0,172ppm, com valor médio de 0,077ppm, considerado
Revisão de Literatura
22
relativamente baixo. Em sete mães, foi coletada uma segunda amostra em um
outro período da gravidez, entretanto não houve um critério para determinar o
momento no qual esta amostra foi coletada. O nível de flúor obtido nestas
amostras era variável, podendo ser igual, maior ou até mesmo menor que as
coletadas inicialmente. Estas variações podem estar relacionadas a outros
fatores não estudados na pesquisa, como a dieta, por exemplo.
A fluoretação da água parece aumentar especialmente o nível de flúor
iônico no leite materno. DIRKS et al.
52
, 1974, por cromatografia e eletrodo para
flúor verificaram diferenças significantes no nível de flúor iônico presente no
leite materno de mães que residiam em áreas fluoretadas e não-fluoretadas.
Neste estudo foram analisadas amostras de leite materno de mães no 4
o
ou 5
o
dia pós-parto que residiam em áreas onde o nível de flúor na água era de
0,1ppm (não-fluoretada) e 1ppm (fluoretada). Os níveis de flúor no leite
materno foram de 0,046ppm e 0,052ppm, respectivamente para os mesmos
grupos, sem diferença estatística entre os mesmos. Os níveis de flúor iônico
foram de 0,004ppm e 0,008ppm, respectivamente, com diferenças estatísticas
entre os mesmos.
Nos estudos em humanos, deve ser considerado também que existe uma
variação na quantidade de leite materno ingerida pela criança durante a
amamentação. EKSTRAND; HARDELL; SPAK
56
, 1984, analisaram por técnica de
microdifusão a quantidade de flúor presente no leite materno de mães que
viviam em Estocolmo na Suécia em áreas onde o nível de flúor na água era de
1ppm. A concentração de flúor presente no leite materno variou de 4 a 8ng/mL
(0,2 a 0,4µM). As crianças eram amamentadas de 4 a 9 vezes durante o dia, o
que resultava numa dose diária de aproximadamente 6µg. Os autores
atribuíram esta variação ao número de vezes que a criança era amamentada e
a quantidade de leite materno ingerido pela criança (sendo uma variável que
não pode ser determinada). Neste mesmo estudo, os autores verificaram que
as crianças que consumiam fórmulas infantis, além do leite materno, eram mais
expostas ao flúor, pois ingeriam de 891 a 1012µg de flúor. Desta forma, para
prevenção da fluorose dentária, deve ser preferido adotar uma alimentação
Revisão de Literatura
23
com leite materno ao invés de fórmulas infantis durante a fase de
amamentação da criança.
Um outro fator que dificulta o estudo da passagem do flúor no leite
materno em humanos é o controle da dieta da mãe. KOPARAL; ERTUGRUL;
OZTEKIN
92
, 2000, analisaram, por eletrodo específico para o flúor, as amostras
de leite materno de 57 mães coletadas quatro ou cinco dias após o nascimento
de seus filhos. Elas moravam em Izmir em áreas onde o nível de flúor na água
de abastecimento era de 0,3ppm e não utilizavam nenhum suplemento
fluoretado. O nível de flúor no leite materno foi de 0,019 ± 0,004ppm, variando
de 0,005ppm a 0,025ppm. Entretanto, o trabalho ressalta que 64,91% das
mães consumiam a água de abastecimento e 35,09% compravam água no
mercado.
RAHUL; HEDGE; MUNSHI
137
, 2003, coletaram amostras de leite materno
de 20 mães residentes em Mangalore na Índia. Por meio de eletrodo específico,
o conteúdo de flúor no leite materno variou de 0,05 a 0,10ppm com uma média
de 0,08 ± 0,132ppm. Esta variação nos resultados pode-se dever a uma
variação na concentração de flúor: na água de abastecimento o nível foi de
0,01ppm, da água obtida em poços abertos foi de 0,02 a 0,04ppm e da água
oriunda de poços perfurados foi de 0,04 a 0,05ppm. Neste mesmo estudo, os
autores verificaram que o nível de flúor no leite de vaca variava de 0,06 a
0,17ppm, com média de 0,12 ± 0,04ppm. Em formulações comercializadas à
base de leite, o nível de flúor variava de 1,95 a 7,45ppm. Desta forma, outras
fontes de flúor na dieta devem ser consideradas quando se estudam os efeitos
do flúor em humanos.
Em humanos, a glândula mamária atua como uma barreira à passagem
do flúor, assim como a placenta. EKSTRAND et al.
57
, 1984, realizaram o estudo
de um caso onde foram avaliadas amostras de leite materno coletado de uma
mãe que ingeria altas dosagens de flúor por motivo de tratamento de
osteoporose. A paciente tinha 33 anos e era tratada com duas doses diárias de
tabletes de 25mg de NaF durante um mês. O experimento ocorreu sete meses
após o parto e quando a produção de leite materno era normal. A paciente
ficava em jejum oito horas antes do início do experimento e em seguida ingeria
Revisão de Literatura
24
a dose oral de 25mg de NaF. Amostras de sangue venoso foram coletadas após
0, 2, 4, 6 e 8h. Amostras de leite materno foram coletadas 15 minutos antes e
0,5; 1; 1,5; 2; 4; 6 e 8 horas após a ingestão do tablete. O nível de flúor
plasmático foi verificado utilizando um eletrodo específico para o íon flúor e no
leite materno pela técnica de microdifusão modificada. Os picos de flúor no
plasma materno e no leite materno ocorreram duas horas após a ingestão,
entretanto os valores observados para o leite materno foram menores que os
plasmáticos. Neste momento, a razão entre o flúor plasmático e no leite
materno foi de 0,21 e após oito horas aumentou para 0,32. Duas horas após a
administração de flúor, a concentração começou a declinar, mas não retornou a
níveis basais mesmo após oito horas. Assim, um pequeno aumento na
concentração de flúor no leite materno ocorre quando a mãe recebe altas
dosagens de flúor. Mesmo quando a mãe recebe uma alta dosagem de flúor
(25mg), a criança recebe no máximo uma dose de 30µg de flúor por dia ou
0,2% da dose ingerida pela mãe. Isto representa apenas 3% da dose
comparada à quantidade diária ingerida pela criança, quando ela é alimentada
com mamadeira. Com uma fórmula infantil diluída em água contendo 1ppm de
flúor, a criança recebe aproximadamente 1mg por dia. Assim, a quantidade de
flúor ingerida pela criança no leite materno é muito baixa quando comparada
com outras fontes, como a água de beber fluoretada.
Em ratos, por outro lado, a glândula mamária parece poder concentrar o
flúor no leite materno, uma vez que os níveis neste são maiores que os
plasmáticos. O nível de flúor no leite materno foi avaliado por DRINKARD;
DEATON; BAWDEN
54
, 1985, utilizando método de microdifusão rápida com
eletrodo íon-específico. Foram utilizadas ratas prenhes que receberam 0 (grupo
I), 50 (grupo II) e 100ppm (grupo III) de flúor na água de beber no início da
prenhez. As mães e os filhotes foram sacrificados 13 dias após o parto, sendo
determinado os níveis de flúor no plasma sangüíneo das mães e dos filhotes, no
leite materno e no esmalte dos dentes molares dos filhotes. A concentração
média de flúor plasmático materno foi de 0,02, 0,10 e 0,21ppm para os grupos
I, II e III, respectivamente. Os valores de flúor no leite materno foram
aproximadamente duas vezes mais alto que os plasmáticos, com valores de
Revisão de Literatura
25
0,044, 0,349 e 0,401ppm para os grupos I, II e III, respectivamente. As
concentrações de flúor plasmático nos filhotes foram de 0,003, 0,005 e
0,006ppm respectivamente nos grupos I, II e III. As concentrações de flúor no
esmalte dos filhotes foram de 0,62, 4,72 e 8,80ppm para os grupos I, II e III,
respectivamente. Desta forma, foi observado que os níveis de flúor no plasma
e, especialmente, no leite materno são muito maiores que os observados no
plasma e no esmalte dos filhotes; sendo estes valores ligeiramente aumentados
quando altas doses eram oferecidas às mães.
Num outro estudo também realizado em ratos, CHAN et al.
29
, 1989,
foram utilizadas 16 ratas
Sprague-Dawley
divididas em quatro grupos: (a)
receberam ração com baixa dosagem de flúor (0,5 partes/10
6
F) antes da
prenhez até 13 dias após o nascimento dos filhotes; (b) receberam ração com
dosagem regular de flúor (28-32 partes/10
6
F) antes da prenhez até 13 dias
após o nascimento dos filhotes; (c) receberam 100 partes/10
6
F durante a
prenhez (3 semanas) e a mesma ração com dosagem regular de flúor antes da
prenhez até 13 dias após o nascimento dos filhotes; e (d) receberam 100
partes/10
6
F por três semanas antes da prenhez e a mesma ração com
dosagem regular de flúor antes da prenhez até 13 dias após o nascimento dos
filhotes. Após 13 dias depois do nascimento, os filhotes e as mães foram
sacrificados para análises do conteúdo de flúor por método de microdifusão. Foi
observado que os níveis de flúor no plasma e no leite materno aumentaram
proporcionalmente com os níveis de flúor na dieta. Os níveis de flúor do plasma
materno foram de 0,020, 0,069, 0,117 e 0,090 partes/10
6
, respectivamente
para os grupos a, b, c e d. Os níveis de flúor no leite materno foram de 0,033,
0,103, 0,128 e 0,112 partes/10
6
, respectivamente para os grupos a, b, c e d.
No plasma sangüíneo dos filhotes, os valores foram de 0,008, 0,012, 0,015 e
0,011 partes/10
6
para os mesmos grupos. Para os incisivos inferiores
(considerando todo o dente) dos filhotes os valores foram de 32,8, 41,9, 57,1 e
45,5 partes/10
6
, respectivamente para os mesmos grupos. Para as epífises
femorais dos filhotes, as concentrações foram de 117,0, 161,0, 222,6 e 178,5
partes/10
6
, respectivamente. Assim, a suplementação de flúor durante a
prenhez (grupo c) aumentou a concentração em incisivos inferiores 36%, e
Revisão de Literatura
26
antes da prenhez (grupo d) aumentou apenas 9%, quando comparados com os
animais que receberam ração com dosagem regular de flúor (grupo b). Desta
forma, o flúor administrado, tanto durante quanto antes da prenhez, parecem
influenciar no nível de flúor nos incisivos, entretanto, o acúmulo parece ser
maior quando a sua administração ocorre durante a prenhez.
Por outro lado, ainda deve ser estudado melhor a capacidade do flúor
presente no leite materno ser absorvido, uma vez que a inclusão suplementar
de cálcio na dieta poderia certamente reduzir a absorção de flúor em alguma
extensão do tubo digestório e aumentar a sua excreção nas fezes
(WHITFORD
183
, 1994).
Entretanto, ERICSSON
58
, 1958, analisando amostras de leite fluoretado,
sugeriu que o flúor presente seja relativamente estável, ocorrendo apenas uma
quantidade limitada de ligação do flúor com constituintes orgânicos. Além disso,
demonstrou que embora o nível inicial de absorção de flúor no rato seja menor
quando administrado no leite, o seu nível sangüíneo permanece por um período
maior do que quando é fornecido na água de beber.
A biodisponibilidade do flúor no leite também foi estudada por VILLA et
al.
177
, 1989. Utilizaram ratos desmamados divididos em grupos que receberam
uma dieta sólida balanceada especialmente preparada com baixo conteúdo de
flúor (menos de 1µg/g) e 10ppm de monofluorofosfato de sódio (MFP)
preparado em leite em pó ou 10ppm de NaF na água de abastecimento ou na
água destilada ou no chá. Os animais foram sacrificados após três semanas e
os fêmures foram removidos para análise. Não foram observadas diferenças
entre a concentração de flúor nos fêmures de animais que receberam MFP no
leite em pó preparado, NaF na água de abastecimento ou na água destilada,
entretanto houve uma redução nas concentrações de flúor nos ossos de
animais que receberam NaF no chá.
Numa segunda parte desta pesquisa, crianças pré-escolares (entre 3 e 5
anos) que receberam 1mg de flúor em tabletes de NaF e após uma semana
receberam 1,18mg de MFP em leite em pó preparado com água de
abastecimento. Num primeiro momento, as crianças receberam flúor cinco
minutos antes do almoço. Num segundo momento, as mesmas crianças
Revisão de Literatura
27
receberam flúor após um jejum de dez horas, não sendo permitidas de
alimentar-se até três horas após a ingestão. A água de beber possuía uma
concentração de flúor de 0,18ppm. Foi verificada então a excreção de flúor na
urina a cada 24 horas. Os resultados sugeriram que a absorção de flúor
(analisada pela sua excreção renal) na forma de MFP no leite preparado é tão
alto quanto do NaF na água de beber quando ingeridos em jejum, porém a
biodisponibilidade do flúor no leite diminuiu quando a ingestão ocorreu
simultaneamente ao consumo de alimentos.
Porém, quando se refere ao efeito protetor contra as cáries, parece não
existir diferenças entre a utilização do flúor adicionado ao leite ou à água de
beber (POULSEN, LARSEN, LARSON
136
, 1976).
Em termos de saúde pública e prevenção da fluorose, deve-se lembrar
que a quantidade de flúor presente no leite materno é menor que o presente
em alimentos derivados do leite de vaca. ADAIR e WEI
1
, 1978, analisaram a
quantidade de flúor presente em amostras de leite materno de duas mães que
residiam em Iowa em áreas onde a fluoretação na água de abastecimento é de
1,0mgF/kg, utilizando um eletrodo específico para o íon flúor. Foram obtidos
valores de 0,016 e 0,015µg/mL para a dosagem de flúor iônico livre. A
quantidade de flúor total foi menor que 0,10µg/mL para as duas amostras.
Neste trabalho, também foi verificado que a quantidade de flúor das amostras
de leite materno humano foi menor que a presente em produtos derivados do
leite de vaca. Isto significa que a ingestão de flúor é menor quando a criança
recebe leite materno ao invés de outras preparações alimentares.
De forma geral, verifica-se uma limitação nas informações obtidas na
literatura a respeito dos efeitos clínicos da fluoretação no leite, da capacidade
de absorção do flúor ingerido no leite materno, da secreção do flúor no leite
materno, da importância do flúor presente no leite materno na patogenia da
fluorose; sendo assim, mais estudos devem ser realizados nesta área para que
se entenda melhor a importância do flúor no leite materno e no leite fluoretado
na patogênese da fluorose especialmente em dentes decíduos.
Revisão de Literatura
28
Assim, após a análise desses trabalhos, percebe-se que o nível de flúor
no leite materno está diretamente relacionado com:
● A quantidade de flúor presente na água ingerida pela mãe antes e durante a
gravidez e durante o período de amamentação;
● O tempo em que o feto ou a criança foram expostos ao flúor;
● A dieta da mãe antes e durante a gravidez e durante a amamentação;
Conclui-se também que, apesar do flúor estar presente no leite materno,
a glândula mamária, assim como a placenta, atua como uma barreira seletiva,
diminuindo a sua concentração. Por outro lado, no rato, a glândula mamária
parece concentrar o flúor no leite, promovendo uma maior acúmulo no filhote.
Revisão de Literatura
29
2.3 Os efeitos do flúor sobre o esmalte dentário
Existe uma série de eventos que ocorrem durante o desenvolvimento do
esmalte dentário nos quais o flúor pode ter algum efeito:
1. Proliferação celular
2. Diferenciação e morfologia celular
3. Função celular
a. Síntese e secreção da matriz orgânica
a1. Amelogeninas
a2. Proteínas não amelogeninas
b. Deposição da matriz inorgânica
b1. Iniciação
b2. Crescimento do cristal
b3. Propriedades bioquímicas
c. Maturação do esmalte
c1. Processamento e remoção de proteínas e perda de água
Estabeleceram-se algumas hipóteses sobre a patogenia da fluorose, das
quais foram propostos três mecanismos que poderiam alterar a produção, a
degradação e a remoção das proteínas da matriz. O primeiro diz respeito à
interferência na diferenciação ou na perda funcional dos ameloblastos que
afetariam diretamente suas propriedades de secreção e reabsorção
(DENBESTEN; CRESHAW; WILSON
48
, 1985; HOLLAND; HONGSLO
78
, 1979). O
segundo indica que o fluoreto incorporado à estrutura do cristal de apatita
promove uma união mais estável entre a matriz inorgânica e a orgânica,
tornando a clivagem das proteínas menos acessível, uma função executada
pelas enzimas presentes no esmalte (TAN et al.
170
, 1998; TANABE et al.
171
,
1988). E um outro mecanismo está vinculado à inibição da atividade proteolítica
das enzimas destinadas à degradação da matriz, como as metaloproteínases e
Revisão de Literatura
30
a calicreína 4 (AOBA; FEJERSKOV
6
, 2002; DENBESTEN; THARIANI
47
, 1992;
DENBESTEN et al.
49
, 1992; DENBESTEN et al.
50
, 2002;FUKAE et al.
69
, 1998;
GERLACH et al.
75
, 2000; LIMEBACK
105
, 1994).
A fundamentação dessas três hipóteses relativas à patogenia da fluorose
dentária tem uma característica comum, concorda-se que a porção protéica da
matriz fica retida após o início da fase de maturação do esmalte, momento em
que deveriam ser removidas paulatinamente até serem quase totalmente
endocitadas pelos mesmos ameloblastos que as produziram e secretaram
(DENBESTEN; CRENSHAW; WILSON
48
, 1985; NANCI et al.
122
, 1998).
O flúor apresenta a capacidade de ligar-se não apenas aos cristais de
apatita, mas também a proteínas da matriz do esmalte (CRENSHAW;
BAWDEN
34
, 1981; CRENSHAW; WENNBERG; BAWDEN
35
, 1978). Os efeitos do
flúor parecem estar relacionados à fase de produção ou maturação do esmalte,
pois o flúor poderia estar ligado à matriz orgânica, ou mais especificamente às
proteínas da matriz orgânica sendo, por isso, encontrado em maior
concentração no esmalte jovem (CRENSHAW; WENNBERG; BAWDEN
35
, 1978).
A ligação de íons como o flúor no esmalte em desenvolvimento parece
depender também da porosidade e do estado de hidratação do tecido. Devido a
este fato, o esmalte jovem que é um tecido mais hidratado que o esmalte
maduro contém, então, maior concentração de flúor principalmente na forma
de íons livres em solução. Posteriormente, o flúor presente no esmalte jovem,
ligado à matriz orgânica ou na forma iônica, seria perdido, durante a fase de
maturação do esmalte, que é caracterizada pela deposição mineral com perda
de proteínas e água (ROBINSON; KIRKHAM; HALLSWORTH
144
, 1988).
Sabe-se também que a substituição da hidroxila por fluoreto nos cristais
de apatita pode elevar a adsorção das proteínas do esmalte. Como a
fluorapatita desloca mais água que a hidroxiapatita, as moléculas hidrofílicas de
amelogeninas e seus produtos teriam sua interação com essa superfície
aumentada, sendo necessária menos energia para a adsorção de proteínas.
Estes resultados sugerem que a retenção das proteínas da matriz no esmalte
em desenvolvimento poderia ser afetada pela natureza dos cristais formados.
Esses eventos poderiam afetar a degradação enzimática das amelogeninas
Revisão de Literatura
31
durante o processo de fluorose, contribuindo com um retardo na remoção das
proteínas do esmalte (AOBA et al.
7
, 1990; TANABE et al.
171
, 1988).
Existem muitas controvérsias a respeito dos possíveis efeitos do flúor
sobre o processo de mineralização. Vários autores acreditam que ocorram as
alterações na seqüência de aminoácidos das proteínas constituintes da matriz
do esmalte, que pode ser responsável pelo quadro de fluorose dental. Isto
levaria a alterações na matriz orgânica o que impediria ou dificultaria a
degradação enzimática das proteínas do esmalte, impedindo ou dificultando a
mineralização (BASFORD; PATTERSON; KRUGER
14
, 1976; DENBESTEN
41
, 1986;
DENBESTEN; CRENSHAW
44
, 1984; DRINKARD; CRENSHAW; BAWDEN
53
, 1983;
KRUGER
96
, 1970; KRUGER
97
, 1972; PATTERSON; BASFORD; KRUGER
133
, 1976).
Considerando esta teoria, o esmalte fluorótico apresentaria uma maior
concentração do conteúdo orgânico, por maior retenção do mesmo (AOBA et
al.
8
, 1987; SHINODA
151
, 1975), uma menor concentração do conteúdo mineral,
caracterizando uma hipomineralização (AOBA et al.
8
, 1987; DENBESTEN;
CRENSHAW
44
, 1984; SHINODA
151
, 1975) e alteração na composição da matriz
protéica (DENBESTEN; CRENSHAW
44
, 1984; PATTERSON; BASFORD;
KRUGER
133
, 1976). Entretanto, estudos subseqüentes sugeriam não existir
diferenças na qualidade protéica da matriz de esmalte produzida por animais
expostos ou não ao flúor (AOBA et al.
7
, 1990; DENBESTEN
41
, 1986).
Uma outra possibilidade para explicar os efeitos do flúor sobre o esmalte
está na teoria em que a ligação do flúor à matriz extracelular do esmalte
dificulte a digestão enzimática por proteinases (AOBA
4
, 1994; DENBESTEN et
al.
49
, 1992; HEFFERMAN; DENBESTEN
77
, 1991). Isto causaria um atraso na
degradação da matriz do esmalte, ao invés de uma alteração nas proteínas que
são inicialmente secretadas (DENBESTEN
41
, 1986).
Um fato interessante a ser observado é que o comprimento da matriz na
região pós-secretora (em maturação) é maior em grupos com fluorose
(causadas pela administração de 75 e 100ppm em ratos no período de seis
semanas), que em animais que não recebem fluoretos em sua alimentação.
Este fato parece ser uma confirmação morfológica do atraso da degradação e
Revisão de Literatura
32
reabsorção das proteínas de matriz, causando hipomineralização (ZHOU; ZAKI;
EISENMANN
185
, 1996).
Desta forma, o retardo da remoção protéica parece ser um dos efeitos
do flúor sobre a matriz de esmalte. DENBESTEN
41
, 1986, realizou um estudo
utilizando ratos submetidos a doses de 10, 25, 50 e 100ppm de NaF na água de
beber durante cinco semanas, utilizando-se a eletroforese e a cromatografia.
Foi verificado em animais que receberam 25ppm de flúor ou mais (o
correspondente a 0,05ppm de flúor plasmático ou mais) apresentavam um
atraso na clivagem enzimática de todas as isoformas de proteínas durante a
fase de maturação. Por outro lado, apenas quando os animais recebiam mais
de 100ppm de flúor, ocorria uma maior retenção de proteínas no esmalte. Ou
seja, nos grupos de 25 e 50ppm, embora houvesse um retardo na remoção das
proteínas, estas eram removidas por completo na fase de maturação. Ficou
claro então que os altos níveis de flúor podem retardar os mecanismos de
remoção das proteínas do esmalte e que este efeito é dose-dependente.
A alteração na atividade proteolítica por ingestão de flúor num prazo
prolongado parece também ser um importante mecanismo na formação do
esmalte fluorótico (DENBESTEN; HEFFERNAN
46
, 1989). Acredita-se na
possibilidade de uma interferência direta do flúor na atividade extracelular das
proteinases (AOBA
4
, 1994; AOBA
5
, 1997; BAWDEN; DEATON; CRENSHAW
15
,
1987; DENBESTEN; HEFFERNAN
46
, 1989; LIMEBACK
105
, 1994; RICHARDS
141
,
1990), necessárias para degradar as amelogeninas durante a maturação do
esmalte (AOBA
4
, 1994; OVERALL; LIMEBACK
130
, 1988), ou na formação da
fluorapatita, dificultando a ação das proteinases. Desta forma, o flúor poderia
ter um efeito direto na atividade enzimática de proteases e conseqüentemente
causaria um atraso na remoção das proteínas do esmalte (AOBA et al.
7
, 1990;
LIMEBACK
105
, 1994; MONSOUR; KRUGER; SMID
115
, 1985; RICHARDS
141
, 1990;
ROBINSON; KIRKHAM
142
, 1990; TANABE et al.
171
, 1988), uma vez que
concentrações micromolares de flúor podem alterar a atividade das
metaloproteinases, como por exemplo, a metaloproteinase-20 (MMP-20 ou
enamelisina), particularmente quando o pH é reduzido a 6,0. Sendo assim, é
Revisão de Literatura
33
possível que o flúor esteja envolvido com a secreção ou atividade da proteinase
durante a patogênese da fluorose (DENBESTEN et al.
50
, 2002).
Uma possível explicação para a redução na atividade da MMP-20 na
presença de flúor num pH reduzido é a capacidade dos íons flúor em ligar-se a
três resíduos de histidina localizados em sítios altamente conservados de
ligação ao zinco das metaloproteinases (incluindo a MMP-20) (BIRKEDAL-
HANSEN et al.
18
, 1993). Os íons flúor altamente eletronegativos poderiam ligar-
se mais rapidamente à histidina pelos íons hidrogênio, quando o pH é diminuído
e poderia interferir na ligação do metal necessário para a atividade enzimática
(DENBESTEN et al.
50
, 2002).
Alguns trabalhos sugerem que o flúor seja capaz de inibir também a
calicreína 4 a qual apresenta-se ativa apenas no esmalte em maturação
(LIMEBACK
105
, 1994; OVERALL; LIMEBACK
130
, 1988). Por outro lado, a
quantidade de flúor necessária para inibir a digestão da amelogenina é
desconhecida (LIMEBACK
105
, 1994).
O flúor parece ter ação também sobre as enzimas lisossomais. Deve-se
lembrar que uma significante quantidade de proteinas do esmalte é removida
por endocitose, envolvendo as enzimas lisossomais. Estas parecem ser inibidas
por altas concentrações de flúor (LIMEBACK
105
, 1994).
A ação do flúor foi verificada avaliando-se a dipeptil peptidase II, uma
exopeptidase lisossomal que tem sido adotada como um marcador para
lisossomas em estudos citoquímicos. SMID et al.
160
em 1990, utilizaram ratas de
21 dias de idade que receberam injeções intraperitoneais de 10 e 20mg de
NaF/kg de peso corporal duas vezes por dia durante quatro dias consecutivos e
uma vez no quinto dia. Foi observada uma menor marcação da dipeptidil
peptidase II em ameloblastos secretores e em modulação de incisivos inferiores
que no grupo que não recebeu flúor. Este dado sugere que um dos
mecanismos envolvidos na fluorose também possa ser a inibição da atividade
de enzimas lisossomais proteolíticas de ameloblastos.
Revisão de Literatura
34
2. 4 Os efeitos do flúor sobre os ameloblastos
2.4.1 Alterações morfológicas em ameloblastos causadas pelo flúor
Poucos são os estudos na literatura que descrevem especificamente as
alterações morfológicas ultraestruturais de ameloblastos causadas pela
administração de flúor. De forma geral, tanto as dosagens crônicas como as
agudas de flúor provocam alterações na ultraestrutura de ameloblastos de
dentes de ratos adultos, como a atrofia da porção distal, mitocôndrias dilatadas,
distensão bem como acúmulo de material de secreção no retículo
endoplasmático (KRUGER
94
, 1968; RIBEIRO; ASSIS; HIROTA
140
, 2001), maior
acúmulo de vacúolos claros (KRUGER
94
, 1968; OLIVEIRA
128
, 1988; WALTON;
EISENMANN
178
, 1974) e corpos escuros no citoplasma, além do acúmulo de
grânulos de secreção na região apical, processo de Tomes fragmentado ou
reduzido e desorganização do aspecto colunar das células (LYARUU et al.
107
,
1986; WALTON; EISENMANN
178
, 1974).
A utilização de uma dose única de flúor administrada por injeção
subcutânea em ratos adultos pode provocar distúrbios intracelulares na via de
síntese-secreção do ameloblasto (MATSUO; KIYOMIYA; KUREBE
111
, 1998;
MATSUO et al.
112
, 1996), formação de uma matriz do esmalte hipomineralizada
(MATSUO et al.
112
, 1996; NEIMAN; EISENMANN
123
, 1975; NORDLUND;
EKSTRAND; HAMMARSTRÖM
126
, 1986; SIMMELINK; LANGE
154
, 1986), e
degenerações císticas na região subameloblástica (NORDLUND; LINDSKOG
125
,
1986; NORDLUND; EKSTRAND; HAMMARSTRÖM
126
, 1986; SIMMELINK;
LANGE
154
, 1986).
Uma série de estudos foi realizada em microscopia eletrônica de
transmissão utilizando o flúor em uma alta dosagem aplicada por múltiplas
injeções intraperitoneais. Em 1967, KRUGER
93
analisou os efeitos da injeção
intraperitoneal de 7mgNaF/kg de massa corporal em incisivos e molares de
ratos
Osborne-
Mendel de diferentes idades divididos nos seguintes grupos: 1)
Revisão de Literatura
35
primeira série: receberam duas injeções diárias no 4
o
, 5
o
e 6
o
dia de vida pós-
natal; 2) segunda série: receberam duas injeções diárias no 6
o
, 7
o
, 8
o
9
o
dia de
vida pós-natal e uma injeção diária no 10
o
e 13
o
dia; 3) terceira série:
receberam duas injeções diárias no 8
o
, 9
o
, 10
o
e 11
o
dia de vida pós-natal e
uma injeção diária no 12
o
dia. Foi verificado que em molares, dois tipos de
glóbulos apareciam na região distal do citoplasma de ameloblastos: vacúolos
claros com mais de 10µm de diâmetro e pequenos glóbulos escuros de 3 a
6µm. Os glóbulos escuros eram também vistos próximos à região basal e no
estrato intermediário, porém não foram visualizados em animais do grupo
controle. Nos animais que receberam tratamento, grandes vacúolos claros eram
vistos na região distal do citoplasma em diferentes posições e tamanhos que os
observados normalmente no início da maturação, os quais estavam localizados
mais na região distal dos ameloblastos e apresentavam diâmetros aproximado
de 3 a 5µm. Os autores sugeriram ainda que vacúolos claros apresentavam
aspectos semelhantes aos observados em células que sofriam degeneração
hidrópica.
Posteriormente, analisando ameloblastos secretores em utilizando
microscopia eletrônica de transmissão, em 1968, KRUGER
94
analisou o germe
dental do primeiro molar de ratos após três injeções intraperitoneais de
7mgNaF/kg aplicadas diariamente em diferentes períodos do 4
o
e 5
o
dia de vida
pós-natal. Os ameloblastos secretores apresentavam distensões vacuolares do
retículo endoplasmático e dilatação das mitocôndrias com desaparecimento das
cristas.
Em 1970, KRUGER
96
descreveu alterações morfológicas em ameloblastos
de incisivos de ratos, desta vez causadas por uma única injeção intraperitoneal
de flúor. Nesta pesquisa, foram utilizados ratos
Osborne-Mendel
de quatro dias
de vida que receberam uma única injeção intraperitoneal de 0,1, 3 ou
7mgNaF/kg de massa corporal. Estes animais foram decapitados 30, 60 e 90
minutos após a injeção. Observou que uma dose única de 0,1mgNaF/kg não
alterava a ultraestrutura dos ameloblastos. A dose de 3mgNaF/kg induzia a
dilatação das cisterna do retículo endoplasmático depois de 30 minutos após a
injeção, sendo que este aspecto permanecia nos animais sacrificados após 60 e
Revisão de Literatura
36
90 minutos. Quando os animais recebiam 7mgNaF/kg observavam-se amplas
áreas de dilatações de retículo endoplasmático, sendo estas regiões livres de
ribossomas. Desta forma, a dose de 0,1mgNaF/kg
de massa corporal foi
considerada como dose limítrofe na promoção de fluorose (sendo essa
quantidade consideravelmente mais alta que os 0,04mgNaF/kg capazes de
causar fluorose em humanos). Esta dose é capaz de causar alterações
compatíveis com fluorose dentária, sem provocar alterações ultraestruturais em
ameloblastos.
Num estudo subseqüente, WALTON; EISENMANN
178
, 1974, utilizaram
incisivos de ratos que receberam duas injeções peritoneais diárias de NaF a
2,5% (17mg/kg) durante quatro dias. Na manhã do quinto dia, a injeção final
era ministrada e o animal era sacrificado três horas depois. Foram observadas
alterações no terço distal do corpo celular e no processo de Tomes de
ameloblastos secretores. Vacúolos claros que pareciam empilhados na célula e
grupos de corpos escuros ambos com tamanhos e densidades variados
ocupavam especialmente o terço distal da célula. Ocasionalmente, grandes
vacúolos de formatos irregulares continham material pontilhado esparso
localizado próximo à rede terminal distal da célula. O processo de Tomes
apresentava-se fragmentado em sua extremidade. No corpo celular, eram
observados corpos esféricos, os quais apresentavam gradiente de variação em
tamanho e densidade, um diâmetro que geralmente estendia-se quase a toda
largura das células e uma tendência em deslocar organelas, particularmente o
retículo endoplasmático. Os corpos eram discretos e não se comunicavam entre
si, nem com organelas ou inclusões. O aparelho de Golgi localizava-se próximo
aos corpos esféricos e parecia não ser afetado pelo flúor. Na fase de
maturação, os ameloblastos apresentavam vacúolos de diferentes tamanhos e
contornos. As células variavam de um formato normal até aquelas com grandes
vacúolos que deslocavam a membrana celular, o núcleo e organelas. Os
vacúolos revestidos por membrana estavam preenchidos por um material
pontilhado difuso e geralmente contidos dentro de uma membrana circular
formando um vacúolo dentro de um vacúolo. Freqüentemente, continham
corpos granulares escuros que tendiam a localizar-se próximos à superfície
Revisão de Literatura
37
interna da membrana. Quanto mais distantes do esmalte os vacúolos estavam
localizados, maior era o tamanho deles. A extremidade distal dos ameloblastos
em maturação adaptava-se e interdigitava-se na superfície irregular do esmalte.
As alterações em ameloblastos também foram estudadas por NEIMAN;
EISENMANN
123
, 1975, num estudo utilizando injeção subcutânea de 5mg de
NaF em dose única em ratos
Sprague-Dawley
machos com peso corporal de
175-250g que foram sacrificados após 1, 2, 4, 8, 16, 24 e 48 horas. Alterações
morfológicas apareceram apenas duas horas após a injeção quando numerosos
vacúolos enormes e glóbulos escuros pareciam empilhar-se na metade distal do
corpo celular. Estes corpos esféricos variavam em tamanho e densidade,
estendendo-se por toda largura da célula e deslocando cisternas de retículo
endoplasmático. Estavam envolvidos por membrana e pareciam não se
comunicar entre si ou com qualquer outra organela. As organelas do corpo
celular eram de aparência normal e a quantidade de grânulos de secreção era
similar a do grupo controle. Nenhuma alteração foi observada no processo de
Tomes. Após quatro horas, os corpos escuros e os vacúolos aumentavam em
número e em alguns casos estendiam-se na região nuclear. Pequenos grupos
de material pontilhado acumulavam-se fora da porção distal do processo de
Tomes. A aparência geral dos demais componentes da célula e do processo de
Tomes apresentavam-se inalterados. Após oito horas, grandes áreas de
material puntiforme estavam presentes na região distal do processo de Tomes.
Havia uma diminuição na formação de esmalte entre os processos. Os grandes
corpos, observados anteriomente, apresentavam-se reduzidos em número e em
tamanho. Após 16 horas, os corpos escuros e vacúolos, observados na região
central dos ameloblastos, eram semelhantes em tamanho e quantidades
àqueles observados no grupo controle. Nenhuma alteração era observada nas
organelas, mas a morfologia e tamanho do processo de Tomes estava alterado.
A formação de esmalte estava reduzida entre os processos de Tomes e na
região distal de cada processo, deixando para trás grandes áreas de material
pontilhado não ou pouco cristalizado. Após 24 a 48 horas, observa-se a
continuação das alterações observadas no processo de Tomes e o esmalte
normal é depositado sobre uma banda hipomineralizada.
Revisão de Literatura
38
MÖRNSTAD; HAMMARSTRÖM
117
, 1978, verificaram os efeitos do flúor
sobre o órgão do esmalte em ratos
Sprague-Dawley
de ambos os sexos de 2 a
12 dias de idade que receberam injeção intraperitoneal de 0,01mL/g de peso
corporal da solução aquosa de NaF a 0,6%. Os animais foram sacrificados 1, 2,
3, 6, 8, 24, 48 ou 72 horas após a injeção. Alterações celulares foram
observadas em molares, mas não foram observadas nos germes dentários de
incisivos. A alteração mais proeminente observada nos períodos de uma e duas
horas após a injeção foi uma marcada vacuolização no citoplasma de
ameloblastos secretores. Mitocôndrias inchadas e rompidas eram proeminentes
em toda célula, mas principalmente próximo ao núcleo, próximo à região distal
ao núcleo e na maior parte da região distal das células. Foram observadas uma
severa desintegração e degranulação da superfície do retículo endoplasmático
rugoso e de polirribossomos. Estas injúrias intracelulares eram geralmente
associadas à separação dos ameloblastos da matriz do esmalte. A formação
destas fendas separando a célula da matriz aparecia apenas em locais onde o
ameloblasto exibia alterações celulares pronunciadas. No citoplasma de alguns
ameloblastos secretores sem vacuolização havia grupos de glóbulos muito
corados de diâmetro de cerca de 10µm de três tipos: um fortemente elétron-
denso sem revestimento de membrana, outro elétron-denso revestido por
membrana e um terceiro de menor densidade limitado por membrana. Duas
horas após a injeção de flúor, os ameloblastos secretores mostraram as
mesmas alterações observadas uma hora após a injeção de flúor. Nos períodos
de três e seis horas após a injeção, além das características morfológicas
observadas, grupos de ameloblastos eram reduzidos em tamanho, enquanto
algumas células adjacentes mantinham a altura normal e formavam estruturas
semelhantes a bulbos projetando na fenda que separava as células. Oito horas
após a injeção, as estruturas semelhantes a bulbos eram mais proeminentes,
mas havendo também áreas de separações entre as células não associadas às
estruturas semelhantes a bulbos. Após 24 horas, as formações semelhantes a
bulbos situavam-se longe da matriz do esmalte, sendo constituídos por células
que perdiam a orientação regular. Entre os ameloblastos lesionados e a matriz
de esmalte havia cavidades semelhantes a cistos preenchidas por material
Revisão de Literatura
39
vacuolar. A matriz de esmalte debaixo destas cavidades apresentava uma
superfície irregular e era geralmente coberta por material puntiforme em forma
de gotas pequenas, arredondadas e escuras. Após 48 horas, as células
desarranjadas se deslocavam para longe da matriz do esmalte, mas esta
permanecia em contato com os ameloblastos normais adjacentes. Nas regiões
centrais das cavidades semelhantes a cistos foram identificadas estruturas
pequenas, arredondadas e fortemente coradas. Após 72 horas, grupos de
ameloblastos apareciam como ilhas isoladas no retículo estrelado, entretanto,
sempre demonstrando conexão com células que rodeavam as cavidades
císticas. Os resultados sugeriram que os ameloblastos secretores eram mais
sensíveis que as células pós-secretoras e que o órgão do esmalte de molares
era mais sensível que o de incisivos.
Em 1980, FEJERSKOV et al.
63
realizaram um estudo com objetivo de
examinar os efeitos da exposição crônica do flúor na amelogênese. Foram
utilizado três grupos de ratos que receberam 0, 56,5 e 113ppm de flúor na
água de beber do 30
o
ao 90
o
dia de vida. Foram observados grânulos densos
pequenos na região proximal do processo de Tomes de ameloblastos
secretores, mas que não apresentavam alterações patológicas.
NORDLUND et al.
127
, 1986, analisaram por microscopia eletrônica de
transmissão ameloblastos secretores de primeiro molar superior de ratos
Sprague-Dawley
que receberam uma injeção subcutânea única de 60mgNaF/kg
de peso corporal. Foi observada a formação de uma luz cística, delineada, de
um lado por uma parede de ameloblastos desarranjados e, do outro por um
esmalte em desenvolvimento. Os ameloblastos da parede cística apresentavam
vários graus de alterações citoplasmáticas e nucleares. As alterações
citoplasmáticas eram evidentes em todas células que circundavam a luz cística.
Algumas células apresentavam sinais de necrose, indicada pela condensação da
cromatina em combinação com as alterações degenerativas do citoplasma como
a distensão do retículo endoplasmático, das vesículas de complexo de Golgi e a
fragmentação citoplasmática. Várias células de formatos arredondados ou
irregulares perdiam contato com o estrato intermediário e estavam deslocadas
em direção da luz cística. Esta apresentava material floculento elétron-lúcido e
Revisão de Literatura
40
células inteiras com extensas alterações nucleares e citoplasmáticas,
fragmentos celulares, aparentemente oriundos da camada ameloblástica.
Alguns ameloblastos apresentavam atividade fagocítica indicada por vacúolos
contendo fragmentos celulares e material extracelular. Produtos de secreção
eram observados no meio extracelular entre os ameloblastos e entre as células
do estrato intermediário. As maiores alterações citoplasmáticas foram
observadas na região distal dos ameloblastos que recobriam a luz cística. Os
processos de Tomes desaparecem e surgem indentações e protusões de
membrana plasmática. A presença de fragmentos citoplasmáticos na luz cística
sugere que o citoplasma tenha sido perdido antes e que parte das protusões
representavam justamente esta perda. Além disso, nas células próximas à luz,
esta perda era, algumas vezes, tão grande que as células remanescentes
consistiam apenas de um núcleo envolvido por uma margem muito pequena de
citoplasma. O desaparecimento do processo de Tomes parece estar relacionado
à perda de adesão dos ameloblastos à matriz do esmalte. As alterações no
retículo endoplasmático e complexo de Golgi podiam ser observadas na maioria
das células da parede cística mais severamente afetada e nas células presentes
na luz cística. Em algumas áreas, as cisternas de ambas organelas
apresentavam-se dilatadas, possivelmente devido à retenção de produto de
secreção, indicados por seu conteúdo densamente corado. Os grânulos de
secreção eram observados espalhados por toda periferia citoplasmática e
fusionando-se à membrana plasmática. Grandes vacúolos ocasionalmente
continham um material cristalino ou granular cuja composição era
desconhecida. Em alguns ameloblastos severamente afetados na luz, as
mitocôndrias apresentavam-se dilatadas e sofriam lise. O núcleo dos
ameloblastos da parede cística estava localizado proximalmente ou
centralmente. Alterações nucleares, como a concentração de cromatina e
fragmentação da carioteca, eram apenas notadas em células que apresentavam
maiores alterações citoplasmáticas ou deslocamento nuclear. Todas estas
alterações degenerativas parecem ser semelhantes ao padrão característico de
degeneração celular.
Revisão de Literatura
41
OLIVEIRA
128
em 1988 estudou por microscopia óptica ameloblastos
secretores de incisivos de ratos que receberam injeções intraperitoneais de
0,06, 0,12 e 4,0mgF/kg na forma de solução de NaF durante 45 dias. Um maior
número de vacúolos claros no citoplasma dos ameloblastos secretores e um
espaço rendilhado no processo de Tomes foram visíveis nos grupos
experimentais, quando comparados ao controle.
Outras alterações ultraestruturais em ameloblastos de ratos que
receberam uma dose intraperitoneal única de flúor também foram relatadas por
MONSOUR; HARBROW; WARSHAWSKY
114
, 1989. Nesta pesquisa, estes autores
estudaram os efeitos causados pela injeção intravenosa na veia femural de 10
ou 20mgNaF/kg de peso corporal em ratos machos
Wistar
que foram
sacrificados 40, 90, 180 minutos e 24 horas após a administração. Utilizando
microscopia eletrônica de transmissão, foi observado que as alterações
morfológicas na região proximal dos ameloblastos secretores eram mínimas. Na
região supranuclear, houve um aumento de vários tipos de grânulos próximos à
região do complexo de Golgi. Foi observado também um aumento de material
pontilhado próximo aos cristais de esmalte na porção de interdigitações do
processo de Tomes e acúmulos deste material eram encontrados entre as
porções proximais. Os resultados demonstraram que a injeção aguda de flúor
interferiu na função normal dos ameloblastos secretores, causando alteração na
síntese do esmalte.
PERGOLIZZI et al.
134
(1995) estudaram incisivos inferiores de ratos
albinos com peso médio de 150g os quais receberam aproximadamente 35ppm
de flúor na água de beber durante 60 dias. Neste trabalho, os ameloblastos
secretores mostraram REG bastante evidente e perda de grânulos densos. Em
relação à fase de maturação, foi observado que os efeitos do flúor ocorrem
especialmente em ameloblastos de terminação lisa, em detrimento ao de
terminação rugosa; havendo um decréscimo da secreção de enzimas
lisossômicas e, como conseqüência, uma redução na reabsorção de matriz
orgânica. Além disso, foram observados danos às mitocôndrias, o que poderia
ser sugestivo de uma redução na captação de cálcio por um déficit na atividade
Revisão de Literatura
42
energética, podendo justificar a redução na mineralização do esmalte causada
pelo flúor em ameloblastos.
As alterações ultraestruturais observadas em ameloblastos secretores
utilizando técnicas imuno-histoquímicas foram relatadas por MATSUO et al.
112
,
1996. Neste trabalho, os autores utilizaram anticorpos contra amelogenina pela
técnica do ouro coloidal numa diluição não informada para avaliar ratos
Wistar
de oito semanas de vida que receberam injeções subcutâneas de 20mgF/kg a
partir de uma solução de NaF a 1,25% durante quatro dias. No grupo controle,
o qual não recebeu flúor, a deposição de partículas de ouro foi observada no
retículo endoplasmático rugoso, complexo de Golgi e vacúolos de condensação.
Intensa deposição também foi observada na camada de esmalte. Nos
ameloblastos secretores dos animais tratados com NaF, as partículas de ouro
eram observadas em grandes grânulos formados anormalmente, assim como
no retículo endoplasmático rugoso, complexo de Golgi e esmalte. A quantidade
de partículas dentro dos grandes grânulos diferia entre eles de acordo com a
propriedade de seu conteúdo. A maior marcação era observada em grandes
grânulos de baixa densidade contendo conteúdo de granulação fina. O
conteúdo destes grânulos lembrava aqueles dos grânulos de secreção em
relação à sua elétron-densidade. Por outro lado, grandes grânulos de
granulação grosseira exibiam marcação fraca ou ausente. Os grânulos estavam
geralmente fusionados uns aos outros. Além disso, os grânulos ocasionalmente
continham dois tipos de conteúdo: um conteúdo de baixa elétron-densidade na
zona central dos grânulos e um conteúdo altamente elétron-denso na periferia
do grânulo. Apenas a zona central dos grânulos era marcada por partículas de
ouro. Em alguns destes grânulos, as zonas periféricas e central não estavam
claramente delimitadas. Na análise ultraestrutural deste estudo foram
observados grandes grânulos formados anormalmente e acumulados na região
distal do citoplasma. Estes exibiam diferentes densidades e seu conteúdo
variava de um material granular fino a grosseiro. Alguns grandes grânulos
continham pequenas vesículas, as quais variavam de número em cada grânulo.
Estes grandes grânulos eram freqüentemente unidos ao longo eixo da célula e
ocasionalmente fusionados uns aos outros. Pequenas vesículas também se
Revisão de Literatura
43
acumulavam formando grupos no citoplasma, sendo estes observados próximo
ao complexo de Golgi, grandes grânulos e entre os sáculos do retículo
endoplasmático rugoso. A exposição ao flúor induziu alterações morfológicas no
complexo de Golgi, como a substituição de grupos de pequenas vesículas por
sáculos. Ocasionalmente, uma pilha do complexo de Golgi era substituída por
um grupo de pequenas vesículas e grânulos. Pilhas de complexo de Golgi
fragmentadas eram também observadas entre acúmulos de grânulos. Além
disso, os sáculos do complexo de Golgi estavam eventualmente dilatados em
cada compartimento do complexo de Golgi. Em alguns casos, os sáculos da
face
cis
estavam dilatados e em outros os presentes na região
medial
ou face
trans
. O acúmulo de grandes grânulos anormais e a dilatação dos sáculos do
complexo de Golgi com o tratamento de flúor parece indicar alterações na
formação e arranjo de vesículas secretoras. Estes resultados sugerem que a
administração de flúor possa causar distúrbios na via de síntese-secreção
celular que possam participar da formação do esmalte fluorótico.
As alterações morfológicas em ameloblastos tratados com NaF na água
de beber foram descritas por MATSUO; KIYOMIYA; KUREBE
111
, 1998, em ratos
de oito semanas de vida pós-natal que receberam injeções subcutâneas de
20mg/kg de solução de NaF a 1,25% duas vezes ao dia durante quatro dias ou
12,62mM de NaF na água de beber durante quatro semanas. Neste estudo, os
autores observaram alterações celulares semelhantes em ambos grupos
experimentais. Foi observado que o aparelho de Golgi dos ameloblastos em
secreção apresenta-se localizado na região apical da célula, sendo as pilhas de
sáculos unidas umas às outras em seu longo eixo celular. As vesículas de
transporte estão localizadas na face
cis
da pilha e os grânulos de secreção na
face
trans
. Grandes grânulos estavam anormalmente formados e acumulados
na região apical do citoplasma, sendo encontrados freqüentemente interligados
ao longo eixo da célula. Pequenas vesículas também se acumulavam no
citoplasma, especialmente próximas ao complexo de Golgi e grandes grânulos,
e também entre sáculos do retículo endoplasmático rugoso. O flúor também
induzia alterações morfológicas no complexo de Golgi. Em algumas regiões,
Revisão de Literatura
44
grupos de pequenas vesículas eram substituídos por sáculos. Alguns destes
apresentavam-se também dilatados.
No trabalho de RIBEIRO
139
, 2001, foram utilizadas ratas
Wistar
de 30
dias de vida pós-natal com peso aproximado de 100g, as quais receberam 0, 7
e 100ppm de flúor na água de beber durante seis semanas. Neste estudo,
foram verificadas algumas alterações ultraestruturais em ameloblastos na fase
de maturação da amelogênese. A dosagem tóxica de flúor provocou redução da
quantidade de cisternas de REG, dilatação e redução da quantidade de
mitocôndrias, dilatação dos lisossomos e redução do tamanho particular de
cada vacúolo digestivo.
Alterações semelhantes também foram observadas em ameloblastos
secretores por RIBEIRO; ASSIS; HIROTA
140
, 2001, estudando incisivos de ratos
adultos que receberam 100ppm de flúor na água de beber
ad libitum
. Nesta
pesquisa, foram observadas na análise morfológica subjetiva áreas de distensão
de retículo endoplasmático rugoso no grupo experimental, embora as análises
morfométricas para volume e superfície não tenham demonstrado diferença
estatisticamente significativa (p>0,05). As mitocôndrias apresentaram um
aumento de 29% (p<0,01) na densidade de volume e volume absoluto e não
apresentaram diferença estatística na análise de densidade de superfície.
2.4.2 Alterações na modulação de ameloblastos causadas pelo flúor
Um possível efeito do flúor na amelogênese pode estar ligado a um
distúrbio na modulação ameloblástica (AOBA
4
, 1994; DENBESTEN
42
, 1999;
DENBESTEN; CRENSHAW
45
, 1987; DENBESTEN; THARIANI
47
, 1992;
DENBESTEN; CRENSHAW; WILSON
48
, 1985; LIMEBACK
105
, 1994; ROBINSON;
KIRKHAM
142
, 1990; SMITH; NANCI; DENBESTEN
164
, 1993; THARIANI; McKEE;
DENBESTEN
173
, 1991).
FEJERSKOV et al.
63
, 1980, observaram uma redução de 4-5 para 2-3
modulações de ameloblastos de incisivos de ratos que receberam 56,5 e
113ppm de flúor na água de beber do 30
o
ao 90
o
dia de vida pós-natal.
Estes resultados foram semelhantes aos observados por DENBESTEN;
CRENSHAW; WILSON
48
, 1985. Estes pesquisadores utilizaram ratos que
Revisão de Literatura
45
receberam 0, 75, 100 e 150ppm de flúor na água de beber durante cinco
semanas. Após este período, os animais receberam calceína e após 30 minutos
os incisivos foram removidos e fotografados em luz ultravioleta. A calceína é um
marcador para o cálcio que parece estar relacionado com a modulação celular
do ameloblasto. Nos animais que receberam flúor, foram observadas alterações
nos padrões cíclicos da fase de maturação do esmalte, representados por uma
menor marcação pela calceína. Esta relação era dose-dependente, quanto
maior a dosagem de flúor, menor a marcação pela calceína (o que significaria
menos ciclos de modulação celular). Assim, o menor conteúdo mineral no
esmalte fluorótico poderia ser efeito de uma menor quantidade de ciclos de
modulação do ameloblasto; a qual por sua vez levaria a uma menor remoção
protéica, inibindo a mineralização ou crescimento do cristal. Um fato
interessante observado é que no início da fase de maturação do esmalte, a
ingestão crônica de 75ppm de flúor é suficiente para quebrar a modulação dos
ameloblastos. A redução no número de modulações juntamente ao consumo
crônico excessivo de flúor poderia contribuir para a retenção das proteínas. Em
um grupo de animais que receberam 100ppm de flúor durante 15 dias e
posteriormente receberam água deionizada. Os animais eram sacrificados em
intervalos de três dias quando era utilizada a marcação com o Ca
45
imediatamente após a injeção da calceína. Este experimento demonstrou que
incorporação de cálcio retornava a valores semelhantes ao grupo controle e
que, portanto, os efeitos do flúor são reversíveis.
A redução no número de modulações também foi observada por SMITH;
NANCI; DENBESTEN
164
, 1993, utilizando incisivos de ratas
Sprague-Dawley
que
receberam 100ppm de flúor na água de beber. Em algumas áreas foi observado
que os ameloblastos permaneciam com a borda rugosa por um período 30%
maior que o normal por ciclo. Houve também uma redução no número de
bandas de ameloblastos de borda lisa de 6,4 (grupo controle) para 4,5 (grupo
de 100ppm). A redução no número de ameloblastos de borda lisa poderia levar
a uma menor reabsorção das proteínas da matriz com conseqüente redução na
deposição de minerais, durante a fase de maturação
Revisão de Literatura
46
Entretanto, outros estudos sugerem um aumento no número de
modulações de ameloblastos. Segundo THARIANI; McKEE; DENBESTEN
173
,
1991, o flúor numa concentração de 100ppm na água de beber causa em
incisivos de ratos não apenas uma redução na área de ameloblastos com borda
lisa, como também aumenta o número de ciclos de modulações dos
ameloblastos durante a fase de maturação.
A influência do flúor sobre a modulação do ameloblastos também foi
estudada por marcação da actina F por fluorescência. NISHIKAWA;
JOSEPHSEN
124
, 1987, estudaram os efeitos causados por 113ppm de flúor
administrado na água de beber juntamente com 25-30ppm de flúor na dieta
durante dois meses em ratos
Wistar
machos inicialmente com um mês de
idade. Utilizando método para localização da actina F foi verificado que nos
animais do grupo controle (que não receberam flúor) as bandas de
ameloblastos de borda lisa exibiam intensa fluorescência apenas na porção
basal. Bandas de ameloblastos de borda rugosa exibiam forte fluorescência na
região apical assim como na região basal. A fluorescência da região apical
diminui em direção incisal do dente e desapareceu na área adjacente à banda
de ameloblastos de borda lisa. O padrão de fluorescência de ambos tipos de
ameloblastos repetiam ciclicamente na região de modulação. Nos animais que
receberam flúor, o número de áreas marcadas por fluorescência e de regiões de
modulação foram reduzidas igualmente indicando que a localização da actina F
está relacionada com a modulação do ameloblasto.
3 Proposição
Proposição
48
Proposição
49
3 Proposição
Foram utilizados ratos com 0, 7 e 14 dias cujas mães foram submetidas
a doses de 0, 7 e 100ppm de fluoreto de sódio na água de beber no período a
partir de uma semana antes e durante a gestação e amamentação até o
momento da eutanásia. Os incisivos inferiores destes animais foram utilizados
para os seguintes estudos:
• Observação morfológica em microscopia óptica;
• Descrição morfológica subjetiva em microscopia eletrônica de transmissão;
• Análise imuno-histoquímica em microscopia óptica utilizando anticorpos
primários contra amelogenina;
• Análise do comprimento da matriz do esmalte retido na fase de secreção e
após a fase de secreção (fases de transição e maturação);
• Análise morfométrica de altura celular, volume nuclear e citoplasmático de
ameloblastos nas fases de secreção e maturação em microscopia óptica.
Proposição
50
4 Material e Métodos
Material e Métodos
52
Material e Métodos
53
4 Material e métodos
4.1 Tratamento e obtenção dos animais
Todos os animais foram obtidos do Biotério Central da Faculdade de
Odontologia de Bauru (FOB-USP), após parecer favorável do comitê de ética em
animais da FOB-USP quanto à condição experimental, manuseio e eutanásia
dos ratos.
Inicialmente foram utilizados 27 ratos (
Rattus norvergicus
,
Wistar
)
adultos do gênero feminino de 90 dias de vida mantidos em três grupos de
nove animais em caixas individuais de poliestireno durante o período
experimental, que receberam como dieta sólida ração granulada da marca
Purina para ratos. Na água de beber receberam o seguinte tratamento:
- Grupo experimental I: As ratas receberam água deionizada
ad libitum
a
partir de uma semana antes do acasalamento, sendo um grupo controle para
comparação dos resultados dos demais grupos;
- Grupo experimental II: As ratas receberam 7ppm de flúor, ou seja
15,47mg/L de fluoreto de sódio em água deionizada
ad libitum
(considerada
uma dosagem compatível com a recomendada para humanos) a partir de uma
semana antes do acasalamento;
- Grupo experimental III: As ratas receberam 100ppm de flúor ou seja,
221mg/L de fluoreto de sódio em água deionizada
ad libitum
(considerada uma
dosagem tóxica) a partir de uma semana antes do acasalamento.
Cada grupo experimental foi subdividido em subgrupos cujos filhotes
foram sacrificados com 0, 7 e 14 dias de vida pós-natal. Desta forma, as
Material e Métodos
54
fêmeas receberam flúor nas quantidades descritas durante o período entre a
semana anterior ao acasalamento e durante toda a gestação e amamentação
até o momento da eutanásia dos filhotes.
De cada mãe foram selecionados aleatoriamente quatro filhotes, dois
receberam os procedimentos necessários para a análise morfológica
ultraestrutural e os outros dois receberam os procedimentos para a análise
imuno-histoquímica. Cada grupo experimental (cujas mães receberam 0, 7 e
100ppm de flúor) foi subdividido em três subgrupos etários (0, 7 e 14 dias).
Como foram utilizadas três mães, no final obtiveram-se 12 filhotes por
subgrupo de estudo, utilizados para o estudo em microscopia óptica (MO) e
microscopia eletrônica de transmissão (MET) (FIGURA 1). Para as análises em
microscopia eletrônica e óptica foram utilizados apenas cinco animais, sendo o
sexto animal utilizado como reserva para substituição ou para controle negativo
na análise imuno-histoquímica.
Material e Métodos
55
27 ratas
com 90 dias
Grupo
Experimental I
9 ratas prenhes
Água deionizada
Grupo
Experimental II
9 ratas prenhes
Água deionizada
com 7ppm de
flúor
Grupo
Experimental III
9 ratas prenhes
Água deionizada
com 100ppm de
flúor
12 filhotes
recém-nascidos
(4 por mãe)
6 MO
6 MET
12 filhotes
de 7 dias
(4 por mãe)
12 filhotes
de 14 dias
(4 por mãe)
12 filhotes
recém-nascidos
(4 por mãe)
12 filhotes
de 7 dias
(4 por mãe)
12 filhotes
de 14 dias
(4 por mãe)
12 filhotes
recém-nascidos
(4 por mãe)
12 filhotes
de 7 dias
(4 por mãe)
12 filhotes
de 14 dias
(4 por mãe)
6 MO
6 MET
6 MO
6 MET
6 MO
6 MET
6 MO
6 MET
6 MO
6 MET
6 MO
6 MET
6 MO
6 MET
6 MO
6 MET
3 ratas
3 ratas
3 ratas
3 ratas
3 ratas
3 ratas
3 ratas
3 ratas
3 ratas
FIGURA 1 –
Distribuição
dos animais
nos grupos
ex
p
erimentais
Material e Métodos
56
4.2 Eutanásia dos animais, coleta e fixação das
hemimandíbulas
Os filhotes tiveram a cabeça decepada e as mandíbulas foram dissecadas
e separadas em duas hemimandíbulas.
4.2.1 Fixação para o estudo em microscopia óptica e análise imuno-
histoquímica da amelogenina
As hemimandíbulas destinadas ao estudo em microscopia óptica e
imuno-histoquímico para marcação da amelogenina foram imersas na solução
fixadora de paraformaldeido a 4% + aldeído glutárico a 1% em tampão
cacodilato de sódio 0,08M, pH 7,3, durante 24h. O protocolo do preparo da
solução fixadora de paraformaldeído encontra-se no ANEXO 1.
4.2.2 Fixação para o estudo em microscopia eletrônica
As hemimandíbulas destinadas ao estudo em microscopia eletrônica
foram imersas na solução fixadora de aldeído glutárico a 2,5% em tampão
cacodilato de sódio 0,08M, pH 7,3 (NANCI; SLAVKIN; SMITH
119
, 1987;
WARSHAWSKY; MOORE
179
, 1967) por 24 horas em geladeira.
4.2.3 Desmineralização
As peças foram imersas, em seguida, em solução de ácido
etilenodiaminotetra acétido sal dissódico p. a. (EDTA) (C
10
H
14
N
2
O
8
Na
2
.2H
2
O) a
4,13% (WARSHAWSKY; MOORE
179
, 1967) até a completa desmineralização em
geladeira. O protocolo para o preparo da solução de EDTA encontra-se no
ANEXO 2.
Material e Métodos
57
4.3 Procedimento laboratorial e metodologia para
microscopia óptica
Após a desmineralização as hemimandíbulas foram processadas para
inclusão em Histosec (Merck) e foram obtidos cortes histológicos de 5µm de
espessura que continham o incisivo inferior cortado em seu longo eixo. Estes
cortes foram utilizados para análise morfológica e estudo imuno-histoquímico.
Os cortes utilizados para o estudo imuno-histoquímico foram montados em
lâminas silanizadas.
4.3.1 Análise morfológica pela coloração de Hematoxilina e Eosina
As lâminas da mandíbula de cada rato foram coradas pela técnica de
Hematoxilina e Eosina (H.E.), para acompanhar a relação do desenvolvimento
do dente com os tecidos circunvizinhos. O protocolo para a preparação dos
corantes utilizados e o processo de coloração pela técnica da Hematoxilina e
Eosina encontram-se, respectivamente, nos ANEXOS 3 e 4.
4.3.2 Tratamento imuno-histoquímico para amelogenina
Os anticorpos policlonais primários, dirigidos contra a forma
recombinante amelogenina de porco, foram gentilmente cedidos pelo Dr. James
P. Simmer, do Departamento de Odontologia Pediátrica, Escola de Odontologia,
do Centro de Ciência e Saúde da Universidade do Texas em San Antonio,
Texas, USA. As amelogeninas recombinantes foram preparadas a partir de
Escherichia coli
transgênicas (SIMMER et al.
157
, 1994).
Os dois frascos recebidos continham o soro obtido do segundo
sangramento de coelho e o mesmo absorvido com extrato de
Escherichia coli
,
com a finalidade de evitar reações cruzadas com proteínas da própria
Escherichia coli
. A proteína utilizada como antígeno diferencia-se de sua
isoforma
in vivo
(com 173 aminoácidos) por perder uma metionina no término
Material e Métodos
58
N, contendo apenas 172 resíduos aminoácidos (comunicação pessoal do Prof.
James P. Simmer durante o desenvolvimento do trabalho de COSTA
33
, 2000).
Seguindo as instruções do autor, os anticorpos, que foram enviados
liofilizados, já foram reconstituídos em 100µL de água destilada e aliquotados
em frascos de 10µL. No momento da sua utilização, estes frascos foram
descongelados e o conteúdo diluído na razão de 1:3000 em PBS.
O processamento imuno-histoquímico seguiu o protocolo apresentado no
ANEXO 5, modificado a partir do protocolo apresentado no trabalho de
COSTA
33
, 2000.
Material e Métodos
59
4.4 Procedimento laboratorial e metodologia para a
microscopia eletrônica de transmissão
Após a completa desmineralização, a parte da hemimandíbula contendo
o órgão do esmalte com camada de esmalte subjacente e o tecido conjuntivo
labial foi seccionada em faixas com fragmentos de 1mm ao longo de cada
incisivo, usando o primeiro molar como linha de referência para alinhar as
faixas dos estádios da amelogênese ao longo do comprimento do dente
(SMITH; NANCI
161
, 1989; SMITH; NANCI
163
, 1996; NANCI; SLAVKIN; SMITH
119
,
1987).
Os fragmentos do incisivo, contendo regiões com ameloblastos nas fases
de secreção e maturação, receberam tratamento padronizado como o descrito
no ANEXO 6 e foram incluídos em resina Spurr.
Os blocos de cada animal foram trimados, sendo selecionados pelo
menos dois por região (secreção e maturação) por animal para o estudo em
microscopia eletrônica. Cortes semifinos de 0,5µm foram coletados em lâminas
histológicas e corados por solução aquosa de Azul de Metileno 1% e Azur II
1%, cujo protocolo para preparação encontra-se no ANEXO 7. Esses cortes
foram utilizados para observação em microscopio óptico e triagem para a
seleção dos cortes para microscopia eletrônica, bem como para análise
morfométrica em microscopia óptica.
Os cortes ultrafinos de aproximadamente 70 a 100nm foram colhidos
sobre telas de cobre de 150
“meshes”
recobertas por película de parlódio e
foram contrastadas em solução aquosa saturada de acetato de uranila por 20
minutos e em solução de citrato de chumbo por dez minutos.
O exame dos cortes selecionados e a obtenção dos negativos mais
representativos para a reprodução das imagens do ameloblasto foram
realizados no microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM900 do Núcleo de
Apoio à Pesquisa em Microscopia Eletrônica Aplicada à Pesquisa Agropecuária
Material e Métodos
60
(NAP/MEPA) da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, USP, Piracicaba
(SP). Os negativos foram obtidos em filmes fotográficos (Kodak Eletron
Microscope Film) de 8,3 x 10,2cm em vários aumentos, suficientes para
demonstrar as estruturas celulares mais expressivas.
As imagens dos cortes histológicos provenientes dos negativos foram
capturadas em Scanner Genius ColorPage-HR7X Slim (em resolução de 300dpi)
acoplado em um computador IBM para as observações finais que nortearam a
descrição morfológica.
Material e Métodos
61
4.5 Análises morfométricas e estatísticas
4.5.1 Avaliação do comprimento da matriz de esmalte
Para as medidas de comprimento da matriz do esmalte foram utilizadas
as mesmas lâminas utilizadas para análise morfológica no H.E.. Foi avaliado o
comprimento da matriz de quatro cortes de cada uma das cinco mandíbulas de
cada subgrupo de animais, sendo tomadas as medidas da matriz de esmalte na
fase de secreção, após a fase de secreção (englobando a fase de transição e
maturação) e o somatório das medidas destas duas fases.
Para a análise morfométrica, o início da fase de secreção foi determinado
pela análise visual do início da produção da matriz na região mais próxima à
alça cervical. O final da fase de secreção foi considerado quando havia perda da
homogeneidade da matriz e a redução da altura dos ameloblastos (SIMMER;
HU
156
, 2002). A partir deste ponto até o desaparecimento da matriz do esmalte
na região mais incisal do dente foi considerado como uma região após a
secreção, a qual corresponde às fases de transição e de maturação. Vale
lembrar também que os ameloblastos de ratos recém-nascidos alcançaram
apenas a fase de secreção, não havendo, portanto, resultados para a fase após
a secreção nestes animais.
A análise quantitativa microscópica foi realizada em um analisador de
imagens KS300 (Kontron Eletronic GMBM) da Carl Zeiss, composto por uma
câmera CCD – IRIS RGB – Sony, instalada em um microscópio Zeiss Axioskop 2
trinocular. As imagens obtidas por meio de objetiva de 10x foram transmitidas a
um computador IBM.
4.5.2 Avaliação da altura celular
Para o cálculo da altura celular, foram utilizados os mesmos cortes
semifinos semi-seriados de 0,5µm obtidos em lâminas histológicas e corados
com azul de metileno + azur II. No mesmo sistema de análise de imagem,
foram obtidas imagens provenientes de cortes escolhidos aleatoriamente por
Material e Métodos
62
subgrupo, ampliadas em objetiva de 100x, onde foram determinadas a altura
de 50 ameloblastos na fase de secreção e 50 ameloblastos na fase de
maturação de todos subgrupos experimentais.
4.5.3 Avaliação do volume nuclear absoluto
Para o cálculo do volume nuclear, foram utilizados os mesmo cortes
semifinos semi-seriados de 0,5µm obtidos em lâminas histológicas e corados
com azul de metileno + azur II. No mesmo sistema de análise de imagem
foram obtidas dez imagens provenientes de cinco cortes escolhidos
aleatoriamente por subgrupo, ampliadas em objetiva de 100x, onde foram
determinados o diâmetro maior (D) e o diâmetro menor (d) de transecções do
núcleo da mesma célula orientada no sentido longitudinal em vários cortes.
Para o cálculo do volume do núcleo (Vn), foi utilizada a fórmula geométrica do
volume do elipsóide, como indicado por PARDINI; TAGA
131
, 1996:
(µm
3
)
Esse procedimento foi realizado em 50 núcleos de ameloblastos na fase
de secreção e 50 núcleos de ameloblastos na fase de maturação em cada um
dos subgrupos experimentais, para determinar-se o volume médio por animal.
Foram escolhidos os 50 maiores núcleos para se ter certeza que o equador
celular estava sendo medido.
4.5.4 Avaliação da densidade de volume nuclear e citoplasmático
A fração de volume celular ocupada pelo núcleo (Vvn) e citoplasma
(Vvcit) foi determinada pelo princípio básico enunciado por DELESSE
40
, 1847,
onde: “a fração de volume (Vvn) ocupada por um objeto num continente, é
diretamente proporcional à fração de área (Svn) que o mesmo ocupa num
plano seccional ao acaso pelo continente”.
Para a obtenção desses parâmetros foram utilizadas as mesmas dez
imagens usadas para avaliação do volume nuclear, com aumento nominal de
1000x, capturadas e armazenadas em formato bmp em um computador IBM.
D.d . d . D .
6
Vn
π
=
Material e Métodos
63
Para cada imagem obtida, determinou-se no sistema de análise de
imagem KS300 da Carl Zeiss a área ocupada pelo citoplasma (Scit) e a área
total sobre o ameloblasto (Scel). A densidade de superfície citoplasmática
(Svcit) ocupada no ameloblasto é:
(µm
0
)
Desta forma, a densidade de volume citoplasmático foi calculada pela
mesma fórmula, pois segundo DELESSE
40
, 1847,
Svcit= Vvcit (µm
0
)
Devido à densidade de superfície nuclear (Svn) ocupada no ameloblasto
estar relacionada à densidade de volume citoplasmática, este parâmetro foi
calculado pela seguinte fórmula:
Svn = 1 - Svcit (µm
0
)
Assim sendo, a densidade de volume nuclear também foi calculada pela
mesma fórmula, pois segundo DELESSE
40
, 1847,
Svn = Vvn (µm
0
)
4.5.5 Avaliação do volume citoplasmático absoluto
Conhecendo-se o volume nuclear médio (Vn) e a fração de volume
celular ocupada pelo núcleo (Vvn) e pelo citoplasma (Vvcit), calculou-se o
volume citoplasmático (Vcit) pela relação:
Vvn
Vvcit.Vn
Vcit =
(µm
3
)
4.5.6 Análise estatística
Todos os parâmetros quantitativos foram confrontados pela análise de
variância (ANOVA) usando o software MICROSOFT EXCEL, para saber se os
mesmos diferiam entre si dentro de um nível de significância de 5% (p < 0,05).
Como indicação da variação das determinações dentro de cada
subgrupo, calculou-se a média e o desvio-padrão da média.
Scel
Sci
t
Svcit =
Material e Métodos
64
5 Resultados
Resultados
66
Resultados
67
5 Resultados
5.1 Resultados morfológicos
5.1.1 Descrição morfológica macroscópica
O aspecto macroscópico revelou os recém-nascidos desdentados,
mostrando na hemimandíbula, as regiões mais claras e edemaciadas aonde
incisivos e molares iriam se romper.
FIGURA 2a-b – Visão macroscópica de rato recém-nascido do subgrupo controle. Observar: a)
cabeça de rato; b) detalhe da mandíbula
a
b
Resultados
68
(verso do gloss paper)
Resultados
69
5.1.2 Descrição morfológica da microscopia óptica
5.1.2.1 Grupo I: animais recém-nascidos
A microscopia óptica revelou quadros semelhantes nos animais recém-
nascidos que receberam 0 (subgrupo controle), 7 ou 100ppm de flúor na água
de beber. Os aspectos microscópicos, observados na Hematoxilina e Eosina
(H.E.) mostraram fragmentos de hemimandíbula de rato contendo o incisivo e
em alguns havia também os três germes dos molares.
Na montagem observada na FIGURA 3 (a-c), nota-se o incisivo inferior
ainda em formação, apresentando-se circunscrito por tecido conjuntivo
periodontal associado ao osso alveolar, ambos em formação.
Da porção proliferativa (FIGURA 4a) diferenciam-se ameloblastos que
iniciam a produção de uma matriz de esmalte homogênea (FIGURA 4b) que
aumenta em espessura quanto mais coronal (FIGURA 4c). A porção proliferativa
(FIGURA 5a) não mostra o sinal imuno-histoquímico para amelogenina, que
pode ser observado na matriz durante a fase de secreção (FIGURA 5b). Nos
cortes utilizados como controles negativos neste e nos demais subgrupos, o
sinal imuno-histoquímico também não foi detectado.
A marcação para amelogenina mostrou-se pontual e intensa no início da
secreção do esmalte (FIGURA 6a). Durante todo o restante da secreção, a
marcação mostrou-se homogênea, apresentando sempre uma maior
intensidade na região da junção amelodentinária (FIGURA 6b). Essa intensidade
foi também observada na coloração de H.E. (FIGURA 6c). Na região apical dos
ameloblastos, observou-se um sinal moderado puntiforme (FIGURA 6a).
O desenvolvimento da matriz do esmalte e as marcações observadas nos
subgrupos de animais recém-nascidos que receberam 7 e 100ppm foram
semelhantes as observadas no subgrupo controle (FIGURA 7a-b), mostrando
um sinal pontual no início da fase de secreção e um aspecto mais homogêneo à
medida que aumentava a quantidade de esmalte produzido. Nesta região
secretora mais coronal, a marcação foi mais intensa no esmalte, que na pré-
Resultados
70
dentina. O gel da matriz mostrou marcação intensa e homogênea. Os
ameloblastos iniciando a modulação para a fase de maturação foram raramente
detectados na maioria dos ratos recém-nascidos.
Resultados
71
FIGURAS 3a-c
–
Monta
g
em de cortes histoló
g
icos de
g
erme de incisivo de rato recém-
nascido do subgrupo controle para visão panorâmica. H.E.
a
b
c
200µm
Resultados
72
(verso do gloss paper)
Resultados
73
FIGURAS 4a-c –
Cortes histológicos de germe de incisivo de rato recém-nascido do subgrupo
controle. Observar: a) região apical proliferativa (asterisco); b) início (seta) e c)
desenvolvimento da matriz do esmalte (seta). H.E.
FIGURAS 5a-b
–
Cortes histológicos de germe de incisivo de rato recém-nascido do subgrupo
controle. Observar: a) porção proliferativa e b) matriz de esmalte imunomarcada na porção
secretora (seta). Reação imuno-histoquímica para amelogenina
a cb
*
a
b
200µm
100µm
Resultados
74
(verso do gloss paper)
Resultados
75
FIGURAS 6a-c
–
Cortes histológicos de germe de incisivo de rato recém-nascido do subgrupo
controle. Observar: a) marcação intensa na matriz e discreta nos ameloblastos (seta); b) forte
marcação na junção amelodentinária (seta) e c) coloração mais intensa no H.E (seta). Reação
imuno-histoquímica para amelogenina (7a,b) e H. E. (7c)
FIGURAS 7a-b
–
Cortes histológicos de germe de incisivo de rato recém-nascido do subgrupo
de 100ppm. Observar: a) início da amelogênese (H.E.); b) a marcação na pré-dentina
(asterisco) e na matriz de esmalte (seta). (Reação imuno-histoquímica para amelogenina)
a b c
a
b
*
25µm
50µm
Resultados
76
(verso do gloss paper)
Resultados
77
5.1.2.2 Grupo II: animais com sete dias de vida pós-natal
A microscopia óptica revelou quadros semelhantes nos animais recém-
nascidos que receberam 0 (subgrupo controle), 7 ou 100ppm de flúor na água
de beber. Os aspectos microscópicos, observados na Hematoxilina e Eosina
(H.E.) mostraram fragmentos de hemimandíbula de rato compostos por três
germes de molares e um incisivo, seccionados aproximadamente em plano
paralelo ao longo eixo dessas estruturas.
Nas FIGURAS 8a–d, nota-se o incisivo inferior ainda em formação,
apresentando-se circunscrito por tecido conjuntivo periodontal associado ao
osso alveolar, ambos em formação. Todos os germes mostram ameloblastos
secretores e modulados para a fase de maturação, mas o dente ainda não
irrompeu na cavidade bucal.
A matriz do esmalte apresentou variações discretas em sua
homogeneidade. Na fase de secreção, o gel da matriz mostrou-se bastante
homogêneo, sendo que essa característica perdia-se com o avançar da
amelogênese. Na morfologia dos ameloblastos, houve alterações compatíveis
com as fases de secreção, transição e maturação.
Nas FIGURAS 9a-d, pode ser observado na reação imuno-histoquímica
para amelogenina um quadro semelhante ao observado nos animais do
subgrupo controle de recém-nascidos. Observa-se nesta seqüência de figuras, a
ausência de marcação na região proliferativa (FIGURA 9a), o aumento na
marcação no início da fase de secreção com aspecto mais heterogêneo
(FIGURA 9b), a marcação mais homogênea no final da fase de secreção
(FIGURA 9c) e a redução na marcação na fase de maturação (FIGURA 9d).
Deve-se lembrar que a fase de maturação não foi observada em animais
recém-nascidos. Nas FIGURAS 9e e 9f, observam-se padrões semelhantes nos
animais cujas mães receberam 7 e 100ppm de flúor, respectivamente, mas com
padrão de marcação mais intenso que o controle, na matriz de esmalte em
maturação.
Resultados
78
A seqüência das FIGURAS 10a-h, mostra os cortes histológicos do
subgrupo de ratos de sete dias de idade que receberam 7ppm de flúor.
Observa-se nessa seqüência que a marcação imuno-histoquímica inicia-se de
forma intensa e difusa no ameloblasto, com pouca marcação inespecífica em
odontoblastos, matriz de dentina e tecido conjuntivo (FIGURA 10a). A seguir
esta marcação passa a ser mais intensa na região da junção amelodentinária
(FIGURA 10b). No restante do esmalte, a marcação é heterogênea e
puntiforme. À medida que o esmalte é depositado, a marcação na região
amelodentinária diminui, embora o aspecto heterogêneo permaneça (FIGURA
10c). Com o aumento da secreção do esmalte, permanece ainda intensa a
marcação nas regiões da junção amelodentinária e do esmalte recém-
sintetizado (FIGURA 10d). Com a secreção de toda camada de esmalte, a
marcação na região central do esmalte diminui (FIGURA 10e). Quando inicia a
fase de maturação do esmalte, a marcação volta a ser intensa (provavelmente
devido à degradação de parte das moléculas de amelogenina) havendo
novamente o aparecimento de áreas com uma marcação pontilhada, mesmo na
região central do esmalte, onde predominava anteriormente a homogeneidade
da amostra. Voltam a ser mais intensas as pigmentações nas áreas da junção
amelodentinária e na camada mais superficial do esmalte (onde a degradação
das proteínas do esmalte deve começar primeiramente). Nesta região
observam-se também evidentes espaços negativos mais ou menos hexagonais
entre as áreas marcadas pela imuno-histoquímica, que correspondem aos
cristais de apatita que aumentam gradativamente até ocuparem, de modo
coordenado, quase todo o espaço do material orgânico do esmalte em
formação (FIGURA 10f). Com o avanço do processo de maturação, o esmalte
mostra-se cada vez mais marcado pela reação imuno-histoquímica,
especialmente nas áreas citadas anteriormente (FIGURA 10g). A parte final da
matriz do esmalte em maturação, que resta após o processamento imuno-
histoquímico e é possível de ser observada no corte, está representada por um
pequeno filete de matriz orgânica altamente reativo a imuno-histoquímica
(FIGURA 10h), como marcação de intensidade semelhante à observada na
camada superficial do esmalte (FIGURA 10g). Esta intensidade de marcação
Resultados
79
provavelmente ocorre por que os epítopos das amelogeninas estão mais livres
para agregar-se ao anticorpo.
O comportamento da marcação imuno-histoquímica para amelogenina no
subgrupo de ratos de sete dias que receberam 100ppm de flúor, pela análise
morfológica subjetiva, parecer ser similar àqueles que receberam sete ppm de
flúor.
Resultados
80
(Verso de papel comum)
Resultados
81
FIGURAS 8a-d – Cortes histológicos de germe de incisivo de rato com sete dias de vida pós-
natal do subgrupo controle. Observar: a) região proliferativa; b e c) região secretora do
esmalte; d) dente ainda não irrompido na cavidade bucal. H.E.
a b
c d
500µm
Resultados
82
(verso do gloss paper)
Resultados
83
FIGURAS 9 a – d – Cortes histológicos de germe de incisivo de rato com sete dias de vida
pós-natal do subgrupo controle. Observar: a) região proliferativa; b) região secretora do
esmalte; c) região de transição de secreção para maturação; d) região de maturação. Reação
imuno-histoquímica para amelogenina
FIGURAS 9 e – f – Cortes histológicos de germe de incisivo de rato com sete dias de vida pós-
natal dos subgrupos de 7 e 100ppm. Observar: e) região de maturação no subgrupo de 7ppm;
f) região de maturação do subgrupo de 100ppm. Reação imuno-histoquímica para amelogenina
a b
c d
e
f
200µm
200µm
Resultados
84
(verso do gloss paper)
Resultados
85
FIGURAS 10a – h – Cortes histológicos de germe de incisivo de rato com sete dias de vida
pós-natal do subgrupo de 7ppm. Observar: a) marcação inespecífica na matriz dentinária e
tecido conjuntivo, b e c) marcação intensa na junção amelodentinária, d e e) padrão de
marcação mais homogênea, f e g) padrão de marcação heterogênea e puntiforme, h) marcação
da matriz retida. Reação imuno-histoquímica para amelogenina
a b
c d
e
f
g
h
50µm
Resultados
86
(verso do gloss paper)
Resultados
87
5.1.2.3 Grupo III: animais com 14 dias de vida pós-natal
Nos animais com 14 dias de vida pós-natal, o incisivo inferior
apresentava-se numa etapa mais adiantada de irrupção dentária. Os aspectos
microscópicos, observados na Hematoxilina e Eosina (H.E.) mostraram
fragmentos de hemimandíbula de rato compostos por três germes de molares e
um incisivo, seccionados aproximadamente em plano paralelo ao longo eixo
dessas estruturas.
Os resultados morfológicos dos animais de 14 dias de vida pós-natal dos
subgrupos de 0, 7 e 100ppm mostraram padrões semelhantes de marcações
observados em animais de sete dias, com todo processo evolutivo registrado
anteriormente. Portanto, o aspecto morfológico observado nos animais do
grupo de 14 dias permanece similar ao constatado em animais do grupo de 7
dias, como pode ser notado nas FIGURAS 11, 12 e 13.
Resultados
88
(verso de papel comum)
Resultados
89
FIGURAS 11a – d – Cortes histológicos de germe de incisivo de rato com 14 dias de vida pós-
natal do subgrupo controle a) região proliferativa; b) região de secreção do esmalte; c) região
de transição de secreção para maturação; d) região coronal do incisivo. H. E.
FIGURAS 11e – f – Cortes histológicos de germe de incisivo de rato com 14 dias de vida pós-
natal do subgrupo controle e) região de secreção; f) região de maturação H. E.
a b
c d
e
f
400µm
50µm
Resultados
90(verso do gloss paper)
Resultados
91
FIGURAS 12a – b – Cortes histológicos de germe de incisivo de rato com 14 dias de vida pós-
natal dos subgrupos controle e de 7ppm, respectivamente. Reação imuno-histoquímica para
amelogenina
FIGURAS 13 c – d – Cortes histológicos da fase de maturação do germe de incisivo de rato
com 14 dias dos subgrupos controle e de 100ppm, respectivamente. Reação imuno-
histoquímica para amelogenina
a b
c d
200µm
50µm
Resultados
92
(verso do gloss paper)
Resultados
93
5.1.3 Descrição morfológica da microscopia
eletrônica
5.1.3.1 Grupo I: animais recém-nascidos
5.1.3.1.1 Descrição do ameloblasto do grupo controle
As observações dos cortes ultrafinos em Microscópio Eletrônico de
Transmissão (MET) e das imagens digitalizadas e impressas mostraram neste
grupo que a região apical antes do início do processo de Tomes é preenchida
por cisternas de retículo endoplasmático granular (REG) e alguns pequenos
grânulos de secreção distribuídos por todo citoplasma apical (FIGURA 14a, b). A
concentração destes grânulos parece ser maior na região do processo de
Tomes. A matriz recém-sintetizada parece estar distribuída de forma
homogênea em volta do processo (FIGURA 14c). A porção apical do
ameloblasto no início do processo de Tomes é marcada por uma região mais
eletrondensa formada por uma rede de complexo juncional (FIGURA 14a). A
região média mostra o complexo de Golgi formado por vários dictiossomas
arranjados em poucos e pequenos sáculos próximos da rede intensa de REG.
Estes últimos apresentam suas cisternas homogêneas e paralelamente
distribuídas entre si (FIGURA 14d), estando localizadas no sentido longitudinal
do ameloblasto ao lado de algumas porções de microfilamentos (FIGURA 14e).
O núcleo alongado ocupa grande parte da região suprabasal, mostrando quase
toda cromatina desespiralizada (eucromatina) (FIGURA 14f). Uma grande
quantidade de pequenas mitocôndrias arredondadas, ovaladas ou alongadas
concentra-se entre o núcleo e o plasmalema basal (FIGURA 14f) e uma
pequena quantidade está distribuída por todo o restante do citoplasma.
Convém lembrar que nesta idade os ameloblastos estão na fase de secreção,
não sendo observadas células na fase de maturação.
Resultados
94
5.1.3.1.2 Descrição do ameloblasto do grupo de 7ppm
O ameloblasto secretor dos ratos recém-nascidos do grupo de 7ppm
mostra na região apical imediatamente antes do processo de Tomes vários
vacúolos claros, similares aos encontrados nos animais de 7 ou 14 dias com
tratamento de 7ppm de flúor, mas diferentes dos observados nos animais dos
grupos de 100ppm. Os pequenos grânulos de secreção, presentes no processo
de Tomes entre porções de matriz interprismática, parecem em quantidade e
morfologia similares aos observados em ameloblastos do grupo controle. Na
região média e basal, o REG mostra morfologia normal e as mitocôndrias de
vários formatos também não indicam alterações morfológicas.
5.1.3.1.3 Descrição do ameloblasto do grupo de 100 ppm
Os ameloblastos dos animais recém-nascidos do grupo experimental de
100ppm observados no MET mostraram na região do processo de Tomes
presença de enormes vacúolos, lembrando formações císticas (FIGURA 15a, b),
algumas vezes com material eletrondenso no seu interior. Embora ocorra essa
vacuolização, a maioria das interfaces entre os processos de Tomes e a matriz
recém-sintetizada (FIGURA 15a, b, c) mostrou-se com morfologia preservada
semelhante ao observado no grupo controle. Mesmo os pequenos grânulos de
secreção (FIGURA 15b, c) aparecem sem alterações morfológicas, entretanto
parece estar em quantidade reduzida em relação ao controle. Em toda a região
supranuclear, o REG apresentou cisternas mais dilatas e desorganizadas
(FIGURA 15d, e, f) que as observadas no grupo controle. Alguns dos sáculos do
aparelho de Golgi parecem mais dilatados e menos organizados também
(FIGURA 15f). Na região basal, as mitocôndrias mostraram-se, em sua maioria,
mais dilatadas e com as cristas menos organizadas que as observadas no grupo
controle (FIGURA 15g, h). As mitocôndrias de outras regiões também
apresentaram essas mesmas características.
Resultados
95
FIGURA 14 (a-b) – Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato recém-nascido do grupo
controle. Observar na região apical: a) quando inicia a secreção da matriz de esmalte, o
processo de Tomes (PT) é marcado por uma região mais eletrondensa, formada por uma rede
de complexo juncional (linha pontilhada) e algumas cisternas de retículo endoplasmático
granular (setas) e no processo de Tomes alguns pequenos grânulos de secreção (setas largas);
b) Ampliação da FIGURA 14a
a b
PT
PT
1µm1µm
Resultados
96
Resultados
97
FIGURA 14 (c-f) – Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato recém-nascido do grupo
controle. Observar: c) o processo de Tomes (PT) apresenta uma concentração dos grânulos de
secreção (setas largas) e a matriz de esmalte (MA) recém-sintetizado parece estar distribuída
de forma homogênea em volta do processo; d-e) a região média mostra uma rede intensa de
retículo endoplasmático granular (setas) apresentando suas cisternas homogêneas e
paralelamente distribuídas entre si, seguindo o sentido longitudinal do ameloblasto ao lado de
algumas porções de microfilamentos (MF); e f) o núcleo (N) alongado ocupa grande parte da
região suprabasal, mostrando evidente eucromatina e a maior parte das pequenas
mitocôndrias concentra-se entre o núcleo e o plasmalema basal (*)
c d
f
e
PT
MA
MF
MF
N
N
*
*
3µm
1µm
1µm
0,5µm
Resultados
98
(verso do gloss paper)
Resultados
99
FIGURA 15 (a-d) – Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato recém-nascido do grupo
de 100ppm. Observar: a e b) enormes vacúolos (V) localizados na região do processo de
Tomes; c) a maioria das interfaces entre os processos de Tomes (PT) e a matriz (MA) recém-
sintetizada e os grânulos de secreção (seta) aparecem preservados e com morfologia normal;
d) na região supranuclear, o retículo endoplasmático rugoso (REG) (setas) parece tortuoso
a b
c d
V
V
V
V
PT
MA
1µm 1µm
1µm3µm
Resultados
100
(verso do gloss paper)
Resultados
101
FIGURA 15 (e-h) – Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato recém-nascido do grupo
de 100ppm. Observar: e-f) na região supranuclear, podem ser observados pequenos sáculos do
aparelho de Golgi () e cisternas dilatadas de retículo endoplasmático rugoso (REG) (setas); g-
h) na região basal, a maioria das mitocôndrias (*) mostra-se mais dilatada, com as cristas
menos organizadas que as observadas no grupo controle
e
f
g
h
*
*
*
*
1µm 0,5µm
0,5µm1µm
Resultados
102
(
verso do gloss paper)
Resultados
103
5.1.3.2 Grupo II: animais com sete dias de vida pós-
natal
5.1.3.2.1 Descrição do ameloblasto do grupo controle
O ameloblasto secretor do grupo controle de ratos com sete dias de vida
pós-natal observado no microscópio eletrônico de transmissão mostrou as
mesmas características ultraestruturais observadas nos ratos recém-nascidos,
ou seja, a região supranuclear até antes do início do processo de Tomes
preenchida por muitas cisternas homogêneas e paralelas de retículo
endoplasmático granular (REG) e por algumas formações de complexo de Golgi
representados por pequenos dictiossomas com poucos sáculos paralelos e
achatados (FIGURA 16a, b, c). Na região do processo de Tomes foram
observados pequenos grânulos de secreção. O núcleo eucromático com
nucléolo evidente ocupa a região suprabasal e grande quantidade de pequenas
mitocôndrias arredondada, oval ou alongada ocupam a região basal (FIGURA
16a).
Os ameloblastos em maturação, tanto de borda lisa quanto de borda
rugosa, mostraram características normais. Por exemplo, o de borda lisa
apresenta na região basal (FIGURA 17a-b) muitas mitocôndrias alongadas e
arredondadas localizadas entre as invaginações do plasmalema basal e o núcleo
mostra-se menor ou menos alongado, com cromatina mais densa que o
observado no ameloblasto secretor. Na região média (FIGURA 17c-d) do
ameloblasto de borda lisa observa-se menos REG que nos secretores e em seu
lugar aparecem mitocôndrias, lisossomos, vacúolos digestivos e microfilamentos
mais evidentes.
5.1.3.2.2 Descrição do ameloblasto do grupo de 7ppm
O ameloblasto secretor dos ratos com sete dias de vida pós-natal do
grupo de 7ppm mostra vários vacúolos claros de vários tamanhos às vezes com
material eletrondenso na região apical, imediatamente antes do processo de
Tomes (FIGURA 18a). Os pequenos grânulos de secreção presentes no
Resultados
104
processo de Tomes entre porções de matriz interprismática parecem em
quantidade e com morfologia similar à observada nos ameloblastos do grupo
controle da mesma idade. Na região média e basal, o REG e as mitocôndrias de
vários formatos não apresentaram alterações morfológicas (FIGURA 18b-c).
Os ameloblastos em maturação de borda lisa e no de borda rugosa
mostraram, respectivamente, invaginações no plasmalema basal e apical. A
quantidade e distribuição de REG, mitocôndrias, lisossomos e microfilamentos
apresentaram-se nos padrões morfológicos de características normais.
5.1.3.2.3 Descrição do ameloblasto do grupo de 100ppm
O ameloblasto secretor dos ratos com sete dias de vida pós-natal do
grupo de 100ppm mostra na região apical (FIGURA 19a) imediatamente antes
do processo de Tomes vários vacúolos claros de vários tamanhos similares aos
observados no grupo de 7ppm. Os grânulos de secreção observados no
processo de Tomes não mostram anormalidades. As cisternas de REG dessa
região mostram-se mais dilatas, com disposição espacial menos paralela que as
observadas nos ameloblastos controles e 7ppm. Na região basal (FIGURA 19b-
c) não só o REG, mas também as mitocôndrias mostram-se mais dilatadas,
estas últimas com maiores espaços entre as suas cristas. A retração entre a
porção basal do ameloblasto e as células do estrato intermediário parece maior
que a observada no grupo controle.
As imagens ultraestruturais observadas do ameloblasto em maturação de
borda rugosa não sugeriram anormalidades morfológicas. O de borda lisa
(FIGURA 20a-b) mostrou pequenas vesículas claras de pinocitose e figuras de
endocitose eletrondensa em grande quantidade na região apical imediatamente
próximo a matriz de esmalte. Essa grande quantidade de material na porção
apical sugere uma velocidade reduzida de transporte e digestão do material
endocitado. O REG e as mitocôndrias observados nesta região não mostram
diferenças com os observados no grupo controle. Na região basal (FIGURA 20c-
d), as mitocôndrias, microfilamentos, núcleo e nucléolo parecem com
características morfológicas normais.
Resultados
105
FIGURA 16 (a-c) – Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato com sete dias de vida pós-
natal do grupo controle. Observar na região basal: a) grande quantidade de mitocôndrias (MI) e
o núcleo (N) com morfologia preservada; b) as cisternas de REG paralelamente distribuídas e os
pequenos dictiossomas () do complexo de Golgi de aspecto normal na região supranuclear; c)
dictiossomos (DI) e REG (setas) num maior aumento da FIGURA 16b
N
MI
a b
c
DI DI
2µm 0,5µm
0,25µm
Resultados
106
(verso do gloss paper)
Resultados
107
FIGURA 17 (a-d) - Corte ultrafino de ameloblasto na fase de maturação com borda lisa de
rato com sete dias de vida pós-natal do grupo controle. Observar na região basal: a) as
mitocôndrias (MI) alongadas e arredondadas, núcleo (N) e o nucléolo (seta) preservados; b)
detalhe da FIGURA 17a, mitocôndrias (MI) entre as invaginações do plasmalena basal; c)
microfilamentos (MF), mitocôndrias (MI), vacúolos digestivos (VD), lisossomos (L) e o núcleo
(N) na região média com aspectos morfológicos normais; d) detalhe da FIGURA 17c, onde se
observa REG (seta), microfilamentos (MF), mitocôndrias (MI), lisossomo (L)
N
MI
a b
MI
VD
L
N
F
c d
MF
L
MI
MI
MI
3µm 0,5µm
3µm 1µm
Resultados
108
(verso do gloss paper)
Resultados
109
FIGURA 18 (a-c) – Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato com sete dias de vida pós-
natal do grupo de 7ppm. Observar na região do processo de Tomes: a) vacúolos claros (setas
largas) e entre a matriz de esmalte interprismático os pequenos grânulos de secreção (setas
pequenas); b) uma grande quantidade de mitocôndrias (MI) normais de várias formas na região
basal; c) ampliação da FIGURA 18b com mitocôndrias (MI) e REG (setas) de aspectos normais
a b
MI
c
MI
MI
3µm 3µm
0,5µm
Resultados
110
(vverso do gloss paper)
Resultados
111
FIGURA 19 (a-c) – Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato com sete dias de vida pós-
natal do grupo de 100ppm. Observar na região do processo de Tomes: a) poucos e pequenos
grânulos de secreção (setas pequenas), vacúolos claros (setas largas) entre a matriz
interprismática e cisternas de REG mais dilatadas com disposição aleatória em sua maioria na
região média-apical; b) algumas mitocôndrias (MI) com aspecto dilatado, mostrando maior
espaço entre as cristas e retração entre a porção basal dos ameloblastos e as células do estrato
intermediários (*) na região basal; c) ampliação da FIGURA 19b, com REG (setas) e
mitocôndrias (MI) de aspecto dilatado entre as invaginações do plasmalema basal (setas)
a b
MI
MI
MI
c
*
*
*
*
2µm 3µm
1µm
Resultados
112
(verso do gloss paper)
Resultados
113
FIGURA 20 (a-d) – Corte ultrafino de ameloblasto na fase de maturação de borda lisa de rato
com sete dias de vida pós-natal do grupo de 100ppm. Observar próximo à matriz na região
apical: a) grandes vacúolos eletrondensos de endocitose (seta larga) ao lado de mitocôndrias
(MI) normais; b) detalhe da FIGURA 20a, demonstrando em maior aumento de microvesículas
claras de endocitose (setas pequenas) e grandes vacúolos de endocitose (setas largas), REG
(setas vazadas) e mitocôndrias (MI); c) o núcleo (N), nucléolo (Nu) e microfilamentos (seta)
normais na região basal; d) detalhe da FIGURA 20c com mitocôndrias (MI) de morfologia
normal
a b
MI
MI
N
Nu
MI
c d
MI
3µm
3µm
1µm
1µm
Resultados
114
(
vverso do glosss paper)
Resultados
115
5.1.3.3 Grupo III: animais com 14 dias de vida pós-natal
5.1.3.3.1 Descrição do Ameloblasto do Grupo Controle
O ameloblasto secretor de ratos com 14 dias de vida pós-natal do grupo
controle observado no microscópio eletrônico de transmissão mostrou as
mesmas características ultraestruturais observadas nos ratos recém-nascidos e
nos de sete dias de vida pós-natal (FIGURAS 14, 16, 17). A região supranuclear
até antes do início do processo de Tomes é preenchida por muitas cisternas
homogêneas e paralelas de retículo endoplasmático granular (REG). Algumas
formações de complexo de Golgi são representadas por pequenos dictiossomas
com poucos sáculos paralelos e achatados. Na região do processo de Tomes,
são observados pequenos grânulos de secreção. O núcleo eucromático com
nucléolo evidente ocupa a região suprabasal. Na porção basal, existe uma
grande quantidade de pequenas mitocôndrias de formato arredondado, oval ou
alongado.
Os ameloblastos em maturação, tanto de borda lisa quanto de borda
rugosa, mostraram características normais similares aos observados nos ratos
do grupo de sete dias, lembrando que nos recém-nascidos esses ameloblastos
ainda não estão presentes. As características morfológicas dos ameloblastos de
borda lisa e de borda rugosa são as mesmas descritas nos animais adultos.
5.1.3.3.2 Descrição do ameloblasto do grupo de 7ppm
O ameloblasto secretor dos ratos com 14 dias de vida pós-natal do grupo
de 7ppm de flúor mostra na região apical também vacúolos claros, como os
observados nos ratos recém-nascidos e com sete dias de vida (FIGURA 18a).
Os grânulos de secreção presentes no processo de Tomes são normais. Tanto
na região supranuclear (FIGURA 21a), quanto na região basal (FIGURA 21b) a
morfologia do REG, mitocôndrias, microfilamentos e núcleo também são
normais.
Resultados
116
Os ameloblastos em maturação de borda lisa mostraram as invaginações
no plasmalema basal, enquanto que os de borda rugosa as apresentaram na
região apical. A quantidade e distribuição de REG, mitocôndrias, lisossomos e
microfilamentos foram observadas dentro dos padrões morfológicos de
características normais.
5.1.3.3.3 Descrição do ameloblasto do grupo de 100ppm
O ameloblasto secretor de ratos com 14 dias de vida pós-natal do grupo
de 100ppm de flúor mostra também vacúolos claros de vários tamanhos e
grânulos de secreção na região apical similares aos observados nos grupos
experimentais de outras idades. Algumas cisternas de REG dessa região apical e
outras da região central (FIGURA 22a, c) mostram-se preservadas, mas grande
parte encontra-se com maior dilatação, muitas vezes preenchidas por material
eletrondenso intracisternal e disposição espacial não paralela. A maioria dos
pequenos dictiossomas de complexo de Golgi apresentou sáculos mais dilatados
que os normais, estando localizados próximos ao plasmalema lateral. Na região
basal (FIGURA 22b) as mitocôndrias mostram-se mais dilatadas, apresentando
maior espaço entre as cristas mitocondriais.
As observações ultraestruturais do ameloblasto em maturação de borda
lisa apresentam um padrão morfológico similar ao observado nos ratos com
sete dias do grupo de 100ppm (FIGURA 20), destacando-se as figuras de matriz
orgânica de esmalte endocitadas. No ameloblasto de borda rugosa (FIGURA
23a), está evidente uma grande quantidade de mitocôndrias dilatadas entre e
abaixo das invaginações apicais. Na região basal e central (FIGURA 23b-c), o
REG e o núcleo não mostram quaisquer alterações morfológicas que possam
ser subjetivamente detectadas pela metodologia descritiva adotada.
Resultados
117
FIGURA 21 (a-c) – Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato com 14 dias de vida pós-
natal do grupo de 7ppm. Observar na porção supranuclear: a) o REG (seta grande), pequenas
mitocôndrias (MI) e microfilamentos (seta pequena) de aspectos morfológicos normais; b)
pequenas mitocôndrias (MI) e o núcleo (N) de morfologia preservada na região basal; c)
destaque da FIGURA 21a onde pode ser observados cisternas de REG (seta grande),
mitocôndrias (MI) e microfilamentos (seta pequena)
MI
a b
MI
N
c
MI
3µm 2µm
1µm
Resultados
118
(verso do glosss paper)
Resultados
119
FIGURA 22 (a-c) – Corte ultrafino de ameloblasto secretor de rato com 14 dias de vida pós-
natal do grupo de 100ppm. Observar na porção supranuclear: a) algumas cisternas de REG
preservadas (estrelas) e outras dilatadas com material intracisternal (seta grande), pequenos
dictiossomos de complexo de Golgi (seta pequena) localizados na maioria junto à porção
próxima ao plasmalema lateral formados por pequenos sáculos dilatados; b) mitocôndrias (MI)
de aspecto mais dilatado mostrando maiores espaços claros entre as cristas na porção basal; c)
destaque da FIGURA 22a onde se observa cisternas de REG preservadas (estrela) e dilatadas
preenchidas com material intracisternal (seta grande) e sáculos de Golgi (seta pequena)
ba
c
MI
3µm 3µm
1µm
Resultados
120
(verso do gloss paper)
Resultados
121
FIGURA 23 (a-c) – Corte ultrafino de ameloblasto na fase de maturação de borda rugosa de
rato com 14 dias de vida pós-natal do grupo de 100ppm. Observar na porção apical: a) grande
quantidade de mitocôndrias (MI) dilatadas e cisternas de REG (seta) preservadas; b) núcleo
(N), REG (seta) com morfologia normal e possível região (estrela) do complexo de Golgi mal
definida ou preservada na região média; c) destaque da FIGURA 23b, onde se observam
cisternas de REG (seta) e parte do núcleo (N), ambos com aspecto normal
MI
a b
N
MI
c N
MI
1µm 3µm
0,5µm
Resultados
122
(verso do gloss paper)
Resultados
123
5.2 Resultados morfométricos
5.2.1 Comprimento da matriz do esmalte
Para as medidas de comprimento da matriz do esmalte foram verificados
o comprimento da matriz do esmalte retida durante a fase de secreção, após a
fase de secreção (englobando a fase de transição e maturação) e o valor total
de comprimento (correspondente à somatória dos valores obtidos na fase de
secreção e após a mesma). A partir das medidas obtidas de comprimento em
µm da matriz do esmalte, foram calculadas a média e o desvio-padrão para
cada grupo a fim de se determinar variações entre as amostras. (TABELA 1).
Da análise da TABELA 1, pode-se constatar que:
• nos animais recém-nascidos
- não houve diferença estatística entre nenhum dos subgrupos avaliados.
• nos animais de sete dias
- na fase de secreção, houve uma redução de 14,38% e 13,47% no
comprimento da matriz do subgrupo de 100ppm, respectivamente, em relação
aos subgrupos controle e de 7ppm;
- após a fase de secreção, não houve diferenças estatísticas entre os subgrupos
analisados;
- considerando o comprimento total de matriz retida na lâmina, o subgrupo de
100ppm apresentou, respectivamente, um valor 5,78% e 5,02% menor que o
subgrupo controle e de 7ppm;
• nos animais de 14 dias
- na fase de secreção, foi observado no subgrupo de 7ppm que o comprimento
foi, respectivamente, 16,47% e 18,53% maiores que os valores
correspondentes ao grupo controle e de 100ppm;
Resultados
124
- após a fase de secreção, não houve diferenças estatisticamente significantes
em relação ao comprimento da matriz;
- o comprimento total da matriz do subgrupo de 7ppm foi, respectivamente,
11,43% e 16,71% maior que o subgrupo controle e de 100ppm.
TABELA 1 – Média e desvio-padrão do comprimento de matriz de esmalte (em µm) dos grupos
de tratamento com flúor para ratos com 0, 7 e 14 dias de vida pós-natal (n = 5)
Recém-nascidos
0ppm 7ppm 100ppm
Fase de secreção 1833,31 ± 299,46 1856,30 ± 181,79 1615,91 ± 198,01
7 dias
0ppm 7ppm 100ppm
Fase de secreção 4733,57 ± 393,50
a*
4683,87 ± 177,82
a
4052,92 ± 311,94
b
Após a fase de
secreção
2852,43 ± 222,85 2841,48 ± 275,74 3094,39 ± 157,41
Comprimento total 7585,99 ± 398,61
a
7525,35 ± 368,15
a
7147,31 ± 423,39
b
14 dias
0ppm 7ppm 100ppm
Fase de secreção 4622,38 ± 351,43
a
5383,64 ± 471,77
b
4541,83 ± 249,80
a
Após a fase de
secreção
3080,11 ± 348,38 3313,09 ± 515,90 3326,43 ± 171,85
Comprimento total 7702,49 ± 535,31
a
8696,73 ± 143,53
b
7868,26 ± 361,02
a
* Letras iguais ou ausência de letras mostram ausência de diferença estatística (p>0,05)
Letras diferentes mostram diferença estatisticamente significante (p<0,05)
Resultados
125
5.2.2 Altura e volume dos ameloblastos
Nas medidas morfométricas dos ameloblastos, foram realizados os
cálculos e obtidos a média e o desvio-padrão para cada grupo. As médias e
desvio padrão de altura celular, densidade de volume nuclear e citoplasmático,
volume nuclear e citoplasmático dos animais de 0, 7 e 14 dias de vida pós-natal
encontram-se respectivamente nas TABELAS 2, 3 e 4.
Da análise das TABELAS 2, 3 e 4, pode-se constatar que:
- o flúor não interferiu na altura dos ameloblastos em nenhuma das fases,
dentro da mesma idade;
- no grupo de sete dias, o volume citoplasmático do ameloblasto secretor do
subgrupo de 100ppm foi 23,80% e 17,63% menor que os valores observados
respectivamente para os subgrupos de zero e 7ppm de flúor;
- no grupo de 14 dias, o volume citoplasmático do ameloblasto secretor do
subgrupo de 100ppm foi 24,75% e 16,09% menor que os valores observados
respectivamente nos subgrupos de zero e 7ppm de flúor;
- o volume do núcleo e do citoplasma dos ameloblastos da fase de maturação
não mostraram diferenças estatisticamente significantes em função do
tratamento com o flúor em nenhuma das idades estudadas.
Resultados
126
TABELA 2 – Média e desvio-padrão dos parâmetros morfométricos obtidos para ameloblastos
do grupo de ratos recém-nascidos (n = 5)
Fase de secreção 0ppm 7ppm 100ppm
Altura celular
(em µm)
63,94 ± 2,38 63,89 ± 2,64 63,35 ± 2,35
Densidade de volume
nuclear (em %)
27,32 ± 2,27 27,32 ± 2,31 27,81 ± 2,22
Densidade de volume
citoplasmático (em %)
72,68 ± 2,27 72,30 ± 2,31 72,19 ± 2,22
Volume nuclear
(em µm
3
)
447,73 ± 62,49 447,05 ± 68,08 441,03 ± 69,78
Volume citoplasmático
(em µm
3
)
1195,03 ± 103,01 1167,71 ± 53,42 1148,22 ± 88,30
* Letras iguais ou ausência de letras mostram ausência de diferença estatística (p>0,05)
Letras diferentes mostram diferença estatisticamente significante (p<0,05)
Resultados
127
TABELA 3 – Média e desvio-padrão dos parâmetros morfométricos obtidos para ameloblastos
no grupo de ratos com sete dias de vida pós-natal (n = 5)
Fase de secreção 0ppm 7ppm 100ppm
Altura celular
(em µm)
69,50 ± 4,37 70,08 ± 4,76 69,50 ± 3,78
Densidade de volume
nuclear (em %)
19,28 ± 2,42
a*
20,38 ± 3,02
a
23,50 ± 2,40
b
Densidade de volume
citoplasmático (em %)
80,72 ± 2,42
a
79,62 ± 3,02
a
76,50 ± 2,40
b
Volume nuclear
(em µm
3
)
444,40 ± 64,09 439,63 ± 62,40 436,22 ± 60,04
Volume citoplasmático
(em µm
3
)
1867,50 ± 152,93
a
1727,53 ± 183,76
a
1423,05 ± 87,11
b
Fase de maturação 0ppm 7ppm 100ppm
Altura celular
(em µm)
45,50 ± 3,40 44,40 ± 2,80 43,94 ± 2,58
Densidade de volume
nuclear (em %)
20,64 ± 2,41 20,64 ± 2,16 21,83 ± 2,56
Densidade de volume
citoplasmático (em %)
79,36 ± 2,41 79,36 ± 2,16 78,17 ± 2,56
Volume nuclear
(em µm
3
)
294,88 ± 63,73 286,27 ± 51,73 284,36 ± 48,86
Volume citoplasmático
(em µm
3
)
1136,86 ± 77,05 1103,87 ± 120,81 1022,11 ± 107,92
* Letras iguais ou ausência de letras mostram ausência de diferença estatística (p>0,05)
Letras diferentes mostram diferença estatisticamente significante (p<0,05)
Resultados
128
TABELA 4 – Média e desvio padrão dos parâmetros morfométricos obtidos para ameloblastos
no grupo de ratos com 14 dias de vida pós-natal (n = 5)
Fase de secreção 0ppm 7ppm 100ppm
Altura celular
(em µm)
74,28 ± 3,42 73,71 ± 3,64 72,63 ± 4,18
Densidade de volume
nuclear (em %)
18,44 ± 2,26
a*
19,99 ± 3,43
a
22,49 ± 3,40
b
Densidade de volume
citoplasmático (em %)
81,56 ± 2,26
a
80,01 ± 3,43
a
77,51 ± 3,40
b
Volume nuclear
(em µm
3
)
428,48 ± 67,90 425,10 ± 62,33 416,06 ± 64,35
Volume citoplasmático
(em µm
3
)
1905,76 ± 181,25
a
1709,20 ± 174,46
a
1434,18 ± 43,99
b
Fase de maturação 0ppm 7ppm 100ppm
Altura celular
(em µm)
42,07 ± 3,88 41,53 ± 3,90 38,58 ± 4,18
Densidade de volume
nuclear (em %)
21,94 ± 2,90 20,30 ± 3,01 21,97 ± 2,84
Densidade de volume
citoplasmático (em %)
78,06 ± 2,90 79,70 ± 3,01 78,03 ± 2,84
Volume nuclear
(em µm
3
)
284,91 ± 51,57 282,29 ± 51,09 281,77 ± 48,57
Volume citoplasmático
(em µm
3
)
1019,63 ± 115,60 1118,42 ± 148,01 1002,35 ± 45,11
* Letras iguais ou ausência de letras mostram ausência de diferença estatística (p>0,05)
Letras diferentes mostram diferença estatisticamente significante (p<0,05)
6 Discussão
Discussão
130
Discussão
131
6 Discussão
Não existe dúvida a respeito da importância do flúor no controle da cárie
dentária. Porém, devido ao seu uso indevido, o flúor pode levar a várias
alterações celulares e na matriz de esmalte, levando à fluorose que aparece nos
resultados epidemiológicos de várias pesquisas realizadas em diferentes regiões
do mundo (BUDIPRAMANA et al.
22
, 2002; BURT; KEELS; HELLER
23
, 2003;
CHOUBISA; CHOUBISA; CHOUBISA
30
, 2001) e no Brasil (BRANDÃO et al.
19
,
2002; CANGUSSU et al.
26
, 2002; MENEZES et al.
113
, 2002). Assim sendo, a
fluorose está associada, principalmente, à incapacidade de se controlar a
ingestão de flúor das várias fontes oferecida no dia-a-dia, que no somatório
leva a uma dosagem tóxica (BUZALAF et al.
25
, 2002; JACKSON et al.
86
, 2002;
LIMA; CURY
104
, 2001). O estabelecimento de uma conduta profilática universal
para solucionar este problema ainda não foi encontrado. Para isto é necessária
a compreensão da patogenia multifatorial da fluorose. Se isso definitivamente
for esclarecido talvez métodos educacionais ou farmacológicos profiláticos e
sanitários mais simples podem auxiliar a Saúde Pública a adotar métodos mais
eficazes de controle.
Por motivos éticos, os estudos em humanos não permitem simular
situações experimentais para buscar o entendimento das alterações
morfológicas e bioquímicas durante o desenvolvimento da fluorose. Por isso,
utilizam-se modelos experimentais em animais. Especialmente, o incisivo de
rato é um dos modelos mais utilizados, por apresentar um crescimento
contínuo, onde todas as fases da amelogênese podem ser observadas ao
mesmo tempo (MATSUO et al.
112
, 1996; RIBEIRO; ASSIS; HIROTA
140
, 2001;
SMITH; NANCI; DENBESTEN
164
, 1993).
O conhecimento do momento em que o flúor afeta de forma mais
intensa o esmalte pode ser considerado de extrema importância na minimização
dos riscos para o desenvolvimento da fluorose (AOBA; FEJERSKOV
6
, 2002). O
risco de fluorose parece ser menor quando a exposição ocorre apenas na fase
Discussão
132
de secreção, sendo maior quando a exposição ocorre tanto na fase de secreção
quanto na fase de maturação (incluindo obviamente a fase de transição entre
ambas) (DENBESTEN
42
, 1999; DENBESTEN
43
, 1999; DENBESTEN; THARIANI
47
,
1992; HOROWITZ
79
, 1989).
Em animais adultos, a fase de secreção parece ser mais afetada quando
o esmalte é exposto a níveis elevados de flúor na forma aguda (como na
utilização de suplementos de flúor, como a aplicação tópica de fluoretos). Por
outro lado, a fase de maturação será mais afetada na utilização de dosagens
crônicas de flúor. É importante lembrar que o processo de mineralização do
esmalte ocorre principalmente durante a fase de maturação, portanto, para
reduzir a risco de fluorose, a exposição a fluoretos sistêmicos deveria ocorrer
apenas após a irrupção dentária para um efeito benéfico com menor risco
(DENBESTEN; THARIANI
47
, 1992; DENBESTEN
43
, 1999).
Em relação aos estádios mais avançados da amelogênese, vários
trabalhos realizados demonstraram a influência do flúor na matriz do esmalte e
nas alterações morfológicas em ameloblastos (KRUGER
94
, 1968; KRUGER
96
,
1970; MÖRNSTAD; HAMMARSTRÖM
117
, 1978; NEIMAN; EISENMANN
123
, 1975;
NORDLUND; EKSTRAND; HAMMARSTRÖM
126
, 1986; NORDLUND et al.
127
, 1986;
WALTON; EISENMANN
178
, 1974).
Segundo vários autores, a condição magna na etiopatogenia da fluorose
parece ser a retenção de proteínas do esmalte, representada principalmente
pelas amelogeninas, durante a mineralização (ASSIS et al.
12
, 1999;
DENBESTEN
41
, 1986; DENBESTEN; CRENSHAW
44
, 1984; DENBESTEN;
THARIANI
47
, 1992; DENBESTEN; CRENSHAW; WILSON
48
, 1985; LIMEBACK
105
,
1994; OLIVEIRA
128
, 1988; RICHARDS
141
, 1990; SMITH; NANCI; DENBESTEN
164
,
1993; ZHOU; ZAKI; EISENMANN
185
, 1996).
A matriz do esmalte que, frente à fluorose, mineraliza-se sem a
apropriada nucleação e alongamento dos cristais gera uma estrutura porosa
com excesso de componentes protéicos. As proteínas retidas nesse tipo de
matriz podem ser identificadas, por exemplo, por meio de imuno-histoquímica,
onde as amelogeninas podem ser marcadas com anticorpos primários
antiamelogeninas e analisadas em microscopia óptica de luz ou eletrônica
Discussão
133
(DIEKWISCH et al.
51
, 1997; NANCI et al.
122
, 1998; SIMMER
155
, 1995; SIMMER
et al.
158
, 1994).
Como as amelogeninas perfazem mais de 90% da matriz secretada, a
correlação entre as propriedades das amelogeninas e o mecanismo pelo qual se
dá a fluorose dentária tornou-se uma peça chave para o entendimento da sua
patogenia. Para tanto, houve a necessidade de padronização e reprodutibilidade
experimental da fluorose, o que levou à proposição de diferentes modelos
experimentais, dentre os quais os roedores (RICHARDS
141
, 1990).
No passado, as pesquisas em animais nesta área eram questionadas
devido ao fato das doses administradas serem maiores que as doses
consumidas por humanos. Isto poderia fazer com que as alterações produzidas
não fossem relevantes para a comparação em humanos. Entretanto, inúmeros
estudos realizados nas últimas décadas com dosagens mais altas têm
demonstrado que as lesões fluoróticas e concentrações plasmáticas observadas
em animais são da mesma magnitude que aquelas observadas em humanos
(AOBA; FEJERSKOV
6
, 2002).
Desta forma, para que as lesões produzidas em animais pudessem
mimetizar as humanas, as doses de flúor ingeridas deveriam ser
proporcionalmente similares. Entretanto, as diferenças entre espécies não
invalidam os resultados experimentais, principalmente se tais diferenças forem
previsíveis e mensuráveis. Entre ratos e homens, o índice metabólico dos
dentes é obviamente incompatível, além disso, o desenvolvimento dentário é
bem mais curto no rato e, portanto, requer doses maiores de flúor para afetar o
incisivo do rato. Daí a necessidade de doses bem mais altas para que haja
distúrbios nos dentes de roedores. Um parâmetro que pode ser quantificado e
correlacionado ao grau de agressão ocasionado pelo flúor, em qualquer espécie
estudada, é a concentração desse composto no plasma (RICHARDS
141
, 1990).
Assim, na atual pesquisa, a dose fisiológica utilizada foi mais alta que a
administrada em humanos, pois segundo FEJERSKOV et al.
64
, 1979, embora as
lesões causadas por doses únicas ou múltiplas sejam semelhantes no rato e no
homem, são necessárias doses de 10 a 50 vezes maiores em ratos. A
quantidade de flúor utilizada também foi utilizada por seguir os valores
Discussão
134
sugeridos por outros trabalhos realizados anteriormente por COSTA
33
, 2000,
RIBEIRO
139
, 2001 e SMITH; NANCI; DENBESTEN
164
, 1993.
Vale lembrar também que todas as mães receberam ainda ração da
marca Purina
ad libitum
, a qual apresentava um teor de flúor de
aproximadamente 40µg/g, conforme relatado por CARVALHO
27
, 2005. A
quantidade de água ingerida pelas mães dos animais utilizados no experimento
não foram quantificadas. Estudos semelhantes realizados por COSTA
33
, 2000 e
RIBEIRO
139
, 2001, não verificaram diferenças na quantia de líquido consumido
por animais adultos que receberam 0, 7 ou 100ppm de flúor.
6.1 Considerações sobre os resultados obtidos na análise morfológica
em microscopia óptica e análise imuno-histoquímica para amelogenina
A microscopia óptica revelou os germes dos incisivos de ratos recém-
nascidos circunscritos por tecido conjuntivo periodontal associados ao osso
alveolar. Os aspectos microscópicos subjetivos observados em Hematoxilina e
Eosina (H.E.) foram similares tanto no grupo controle quanto nos
experimentais. Da porção proliferativa diferenciam-se ameloblastos que
produzem uma matriz de esmalte homogênea que aumenta em espessura
quanto mais coronal.
A análise morfológica da amelogenina mostrou um sinal imuno-
histoquímico intenso (pontual ou homogêneo) por toda a matriz do esmalte dos
incisivos, sendo menor na região central e aumentando moderadamente em
direção da junção amelodentinária, onde a marcação foi a mais intensa.
A marcação do material acumulado na junção amelodentinária também
foi observada por outros autores tanto em microscopia óptica (ORSINI et al.
129
,
2001; YAMAMOTO et al.
184
, 1997), quanto em microscopia eletrônica (NANCI et
al.
122
, 1998). Este padrão de marcação sugere que as formas intactas de
amelogeninas podem apresentar uma distribuição complexa no esmalte e não
apenas distribuídas uniformemente por toda matriz.
Também houve um sinal moderado na porção apical do citoplasma dos
ameloblastos. No início da produção da matriz do esmalte, o padrão de
Discussão
135
marcação puntiforme intenso no citoplasma foi semelhante tanto no grupo
controle, quanto nos experimentais. Esse tipo de marcação imuno-histoquímica
também foi observado no citoplasma de pré-ameloblastos e ameloblastos de
germes de incisivos e molares de ratos na primeira semana de vida pós-natal
por INAI et al.
84
, 1992, INAI et al.
85
, 1991, TABATA et al.
169
, 1996 e
YAMAMOTO et al.
184
, 1997.
Em condições normais, estudos que utilizaram técnicas imuno-
histoquímicas para amelogenina mostraram que durante a fase pré-secretora,
existe um aumento na marcação ao redor do retículo endoplasmático rugoso,
complexo de Golgi e dos grânulos de secreção. Durante a diferenciação dos
odontoblastos e antes da destruição da membrana basal, uma marcação
dispersa pode ser observada ao redor da matriz extracelular em formação. No
início da fase de secreção, os anticorpos antiamelogenina demonstram intensa
marcação no material extracelular denso localizado entre as células na região
distal e nuclear, e também ao redor de lisossomos escuros (ARANA-CHAVEZ;
NANCI
10
, 2001; INAGE et al.
82
, 1989; NANCI et al.
122
, 1998). Durante a fase de
secreção, os ameloblastos secretores mostram imunorreatividade no retículo
endoplasmático rugoso, complexo de Golgi, grânulos de secreção, corpos
multivesiculares e lisossomos grandes e claros próximos ao complexo de Golgi.
Existe também a intensa marcação pelo anticorpo de toda a camada recém-
sintetizada de esmalte (principalmente entre os cristais de hidroxiapatita), das
invaginações de membrana da região distal das células próximo as
microvilosidades e da matriz orgânica presente na superfície lateral dos
ameloblastos pré-secretores e secretores. Pouca marcação pode ser observada
ao redor de mitocôndrias e do núcleo, podendo ser utilizada como um índice
para a marcação inespecífica (CASASCO; CALLIGARO; CASASCO
28
, 1992; INAGE
et al.
82
, 1989; NANCI; KAWAGUCHI; KOGAYA
118
, 1994; NANCI, SLAVKIN;
SMITH
119
, 1987; NANCI et al.
122
, 1998). Após o início da fase de maturação, a
imunomarcação pode ser encontrada nos grânulos de secreção, retículo
endoplasmático rugoso, sáculos do complexo de Golgi e lisossomos. Os
grânulos de secreção estão presentes em menor quantidade que na fase de
secreção e apenas no início da fase de maturação. A maior marcação
Discussão
136
intracelular pode ser observada dentro dos grânulos de secreção e lisossomos
do tipo multivesicular. As análises quantitativas demonstraram que os sáculos
do complexo de Golgi e os lisossomos multivesiculares dos ameloblastos em
modulação eram geralmente menos reativos que as mesmas organelas dos
ameloblastos na fase de secreção. Material amorfo e granular localizado entre
as células e nas dobras da borda rugosa da membrana plasmática também
demonstram marcação (INAGE et al.
81
, 1996; INAGE et al.
82
, 1989; NANCI;
SLAVKIN; SMITH
119
, 1987; NANCI; SLAVKIN; SMITH
120
, 1987; NANCI et al.
121
,
1996; NANCI et al.
122
, 1998). Uma marcação intensa também pode ser
observada na camada de esmalte, ao redor do material granular situado nos
espaços extracelulares ao longo das bordas laterais ou dentro das invaginações
apicais dos ameloblastos de borda rugosa. Eventualmente observam-se
marcações dentro ou fora de células da camada papilar, incluindo macrófagos.
Apenas pequenos focos de material granular imunorreativo são observados
algumas vezes entre as células da camada papilar próximo à base dos
ameloblastos (INAGE et al.
82
, 1989; NANCI; SLAVKIN; SMITH
119
, 1987; NANCI;
SLAVKIN; SMITH
120
, 1987). Na região final da fase de maturação, quando os
prismas são visíveis, as partículas de ouro estão associadas aos cordões de
matriz e parecem concentradas na periferia dos prismas. Nesta região, a
marcação é menor que quando comparada com o início da fase de maturação.
A marcação também ocorre no material elétron-denso acumulado nos espaços
próximos à junção amelodentinária, assim como o material orgânico encontrado
dentro ou na periferia dos túbulos dentinários (NANCI et al.
122
, 1998).
De forma geral, a marcação na matriz recém-sintetizada de esmalte
parece não mostrar diferenças significativas nesse nível de observação na atual
pesquisa, mas o que chama a atenção é marcação na pré-dentina, também
descrita na literatura por outros pesquisadores (ARANA-CHAVEZ; NANCI
10
,
2001; INAI et al.
85
, 1991; KARG et al.
89
, 1997).
Intensa marcação em dentina foi descrita em ratos por INAGE et al.
82
,
1989 e NANCI et al.
122
, 1998. Nestes trabalhos, respectivamente, foram
utilizados ratos machos
Wistar
com peso aproximado de 40g e 100g. Foi
constatada marcação imuno-histoquímica ao redor do material denso ao longo
Discussão
137
do processo odontoblástico e próximo do corpo celular de odontoblastos, na
dentina, ao longo da membrana plasmática da região distal e no material
encontrado dentro e na periferia de túbulos dentinários de pré-ameloblastos de
incisivos de ratos.
No atual trabalho, na fase de secreção mais avançada, o gel de matriz
de esmalte mostrou-se bastante homogêneo, sendo essa característica perdida
com o avançar do processo de amelogênese. Nos germes de recém-nascidos
não pode ser observada a fase de maturação, uma vez que encontram-se no
início de sua formação. Nos ratos de 7 e 14 dias de idade a matriz de esmalte
em maturação mostrou espaços negativos mais ou menos hexagonais e
dispostos como se estivessem empilhados, dirigindo-se desde a superfície apical
dos ameloblastos até a região de esmalte aprismático, próxima à junção
amelodentinária, onde perdiam parcialmente a conformação descrita, tornando-
se um pouco desorganizados. Nesta porção de esmalte a marcação para
amelogenina foi mais intensa em todos os grupos, tanto nos controle, quanto
nos experimentais.
Marcações inespecíficas foram observadas no complexo dentinopulpar,
nas fibras colágenas do tecido conjuntivo, em células progenitoras
hematopoiéticas da medula óssea e na superfície epitelial da mucosa bucal.
Para reduzir esta marcação inespecífica sugere-se aumentar a diluição dos
anticorpos primários. Por isso, foi realizada a diluição de 1:3000, como sugerido
por COSTA
33
, 2000, a qual determinou este valor seguindo as normas
encontradas no trabalho de DIEKWISCH et al.
51
, 1997, no qual a diluição do
anticorpo primário deve ser determinada por vários experimentos preliminares.
A diluição do anticorpo primário foi chamada de ótima quando houvesse um
forte sinal, mas sem marcações inespecíficas detectadas.
Nos cortes microscópicos usados como controle negativo, onde se omitiu
o anticorpo primário, em nenhum momento observou-se qualquer marcação
imuno-histoquímica.
Foram poucos os trabalhos que utilizaram técnicas imuno-histoquímicas
como método para avaliação das alterações causadas na matriz orgânica de
dentes com fluorose. SHORE et al.
152
, 1993, relataram que a marcação para
Discussão
138
amelogenina torna-se mais evidente durante a fase de transição, quando ocorre
a degradação da matriz, com o alcance da máxima marcação no final da fase
de transição e início da fase de maturação. O efeito do flúor observado por
estes autores foi de uma redução na intensidade de marcação da matriz do
esmalte até o final da fase de transição, sugerindo que este íon possa reduzir a
degradação enzimática, resultando assim numa matriz residual que inibiria o
crescimento do cristal, talvez explicando assim a presença dos defeitos de
esmalte após a exposição a altos níveis de flúor. É possível que o flúor diminua
a marcação imuno-histoquímica por reduzir a degradação enzimática, o que
levaria a uma menor exposição dos epítopos.
As alterações ultraestruturais causadas pelo flúor em ameloblastos
secretores utilizando técnicas imuno-histoquímicas foram relatadas por
MATSUO et al.
112
, 1996. Estes autores utilizaram anticorpos contra amelogenina
para avaliar ratos Wistar de oito semanas de vida que receberam injeções
subcutâneas de 20mgF/kg a partir de uma solução de NaF a 1,25% durante
quatro dias. Nos ameloblastos secretores dos animais tratados com NaF, a
marcação era observada em grandes grânulos formados anormalmente, assim
como no retículo endoplasmático rugoso, complexo de Golgi e esmalte. A maior
marcação era observada em grandes grânulos de baixa densidade contendo
conteúdo de granulação fina de elétron-densidade semelhante àquela dos
grânulos de secreção. Grandes grânulos de granulação grosseira exibiam
marcação fraca ou ausente.
Com a avaliação morfológica subjetiva realizada na atual pesquisa,
utilizando imuno-histoquímica, pode-se observar que embora o flúor em altas
doses na água de beber alcance os tecidos em filhotes de ratas pela placenta e
pelo leite materno, parece pouco capaz de alterar o padrão de marcação
imuno-histoquímica das amelogeninas em filhotes com 0, 7 e 14 dias de vida
pós-natal.
Discussão
139
6.2 Considerações sobre os resultados obtidos na análise morfológica
em microscopia eletrônica
Nos exames subjetivos das imagens ultraestruturais da microscopia
eletrônica de transmissão (MET), os ameloblastos dos grupos controles (os
quais receberam água deionizada sem flúor) apresentaram as mesmas
características morfológicas descritas em ratos adultos (RIBEIRO
139
, 2001).
Na maioria dos ameloblastos secretores dos animais experimentais, foi
verificada a presença de vacúolos claros na porção apical do citoplasma antes
do processo de Tomes, em todas as idades estudadas dos grupos de 100ppm.
Estas observações também foram descritas em ratos adultos com dosagens
agudas e crônicas de flúor por AOKI
9
, 1989, KRUGER
94
, 1968, OLIVEIRA
128
,
1988, RIBEIRO; ASSIS; HIROTA
140
, 2001 e WALTON; EISENMANN
178
, 1974. Em
todas as imagens de MET examinadas, os aspectos morfológicos do núcleo dos
ameloblastos foram similares entre os grupos controles e experimentais,
mostrando a cromatina e o envoltório nuclear íntegros. O nucléolo também se
mostrou com a mesma freqüência e morfologia nos diferentes grupos. Esses
dados confirmam que a exposição crônica (RIBEIRO; ASSIS; HIROTA
140
, 2001)
ou aguda (KRUGER
94
, 1968) de flúor pode promover alterações no citoplasma
distal dos ameloblastos, exibindo um padrão semelhante à degeneração
hidrópica e outros distúrbios no estádio de secreção (FEJERSKOV et al.
63
,
1980), mas parece não ser capaz de interferir no núcleo celular e, portanto,
possivelmente não possa causar interferências no processo de transcrição
protéica.
Os ameloblastos secretores observados no grupo experimental de
100ppm nas três idades estudadas mostraram muitas vezes o REG dilatado e
desorganizado (com as cisternas nem sempre paralelas). Na idade de 14 dias,
foi possível observar inclusive algumas vezes inclusões intracisternais, o que
pode ser sugestivo de um não prejuízo da produção protéica. Mas a dilatação
das cisternas e a presença de material retido podem sugerir algum distúrbio na
via de transporte das proteínas produzidas. Não apenas o REG, mas também os
sáculos de Golgi apresentaram-se mais dilatados, como descrito por MATSUO;
Discussão
140
KIYOMIYA; KUREBE
111
, 1998. MATSUO et al.
112
, 1996, já haviam chamado
atenção para um maior acúmulo de pequenas vesículas na rota da via secretora
entre o REG e o complexo de Golgi, o acúmulo de material intracisternal e a
formação anormal de largos grânulos no citoplasma distal. Poder-se-ia deduzir
que o flúor interfere no mecanismo de transporte intracelular e exocitose,
retardando material protéico dentro das cisternas de REG.
As formações dilatadas do REG sob a ação do flúor já haviam sido
descritas por KRUGER
94
, 1968, PATTERSON; BASFORD; KRUGER
133
, 1976 e
RIBEIRO; ASSIS; HIROTA
140
, 2001, em ratos adultos.
Vários estudos propõem possibilidades que expliquem as alterações
celulares causadas pelo flúor. MATSUO; KIYOMIYA; KUREBE
111
, 1998,
estudaram a participação da proteína de ligação guanosina trifosfato (GTP)
pequena (proteína G pequena), a qual é uma unidade modular que participa do
transporte vesicular e da via secretora. Foi sugerido que esta proteína possa
participar no distúrbio do transporte intracelular do ameloblasto secretor
exposto ao flúor.
LI et al.
103
, 2005, em um estudo utilizando ameloblastos de camundongo
em cultura mostraram que a administração de NaF numa dosagem de 40mM
causa alteração na quantidade de actina F. Acredita-se que este aumento
ocorra devido o flúor inativar a RhoGAP, a qual é uma molécula que regula a
produção de uma pequena proteína G denominada RhoA. Assim, acredita-se
que a administração de flúor inative o RhoGAP, permitindo a ativação da RhoA,
que leva ao aumento de actina F. Desta forma, o flúor pode alterar o
citoesqueleto da célula pela interferência da via de sinalização Rho, o que pode
causar uma interferência não apenas na via secretora, mas também na via de
reabsorção das proteínas.
KUBOTA et al.
98
, 2005, realizaram um estudo em ameloblastos de
camundongos cultivados
in vitro
expostos a diferentes concentrações de NaF
que variaram de 0 e 2mM. Nesta pesquisa, os autores sugeriram que a
exposição a altos níveis de flúor possa inibir a síntese protéica por indução de
agentes, como a proteína Ire1, que possam causar estresse no retículo
endoplasmático, alterando o processo de síntese celular e retenção das
Discussão
141
proteínas. Isto favoreceria a ativação de caspases as quais atuam no DNA
provocando danos que podem levar a apoptose. Apesar desta hipótese ser
levantada por estes autores, nas lâminas e imagens do MET examinadas na
atual pesquisa não foi possível encontrar corpos apoptóticos ou núcleos
celulares que pudessem estar sofrendo um processo apoptótico. Talvez uma
amostragem maior ou uma metodologia específica como uma reação imuno-
histoquímica pudessem comprovar essa hipótese.
As mitocôndrias observadas nos ameloblastos secretores estavam
principalmente localizadas na porção basal, ocupando todo o citoplasma
subnuclear. Algumas nos grupos experimentais muitas vezes davam a
impressão de estar mais dilatadas que as observadas nos grupos controles,
mostrando espaços claros maiores entre as cristas mitocondriais. Estas
observações foram semelhantes às mencionadas por KRUGER
94
, 1968,
PERGOLIZZI et al.
134
, 1995 e RIBEIRO; ASSIS; HIROTA
140
, 2001, em animais
adultos.
Muitos estudos ultraestruturais focaram ameloblastos secretores. Mas
poucos são os trabalhos em ameloblastos na fase de maturação em condições
experimentais de fluorose. Um dos poucos trabalhos foi desenvolvido por
RIBEIRO
139
, 2001, em um estudo estereológico utilizando ratos adultos. Nesta
pesquisa, o autor observou redução da quantidade de REG e mitocôndrias e um
aumento de os vacúolos digestivos de menor diâmetro.
No atual trabalho, foi observado uma grande quantidade de produtos de
endocitose eletrondensos na região apical próxima à matriz do esmalte em
ameloblastos em maturação de borda lisa nas idades de 7 e 14 dias do grupo
de 100ppm de flúor. Esse material endocitado parece ser semelhante ao
descrito por RIBEIRO
139
, 2001.
AOKI
9
, 1989, também descreveu em ratos submetidos a condições de
fluorose a presença de vacúolos mais densos na região apical dos ameloblastos
de borda lisa. Na transição dos ameloblastos secretores para maturação, foi
verificado que os vacúolos claros presentes no ameloblasto secretor ainda
permanecem algum tempo no período de transição, prejudicando o início da
reabsorção da matriz.
Discussão
142
Nos ameloblastos de borda rugosa a única alteração morfológica
subjetiva verificada foi a presença de mitocôndrias dilatadas entre as
invaginações do plasmalema apical. O dano em mitocôndrias também foi
descrito por PERGOLIZZI et al.
134
, 1995, o qual ainda demonstrou a diminuição
da quantidade de ameloblastos de borda em escova (rugosa) em incisivo de
ratos adultos expostos a dosagens crônicas de flúor em água de beber.
6.3 Considerações sobre os resultados morfométricos da matriz de
esmalte
Acredita-se que o esmalte formado na presença de flúor apresenta uma
maior abundância de proteínas de baixo peso molecular na fase de secreção e
uma menor redução de proteínas de alto peso molecular durante a fase de
maturação. Desta forma, o flúor talvez possa atuar reduzindo ou prevenindo a
quebra de proteínas de alto peso molecular em unidades menores, podendo
induzir alterações molecular ou estrutural nas proteínas, tornando-as menos
sujeitas à degradação. Assim, o flúor pode apresentar efeitos sobre as
amelogeninas, enamelinas ou em ambas proteínas, alterando a composição
bioquímica da matriz de esmalte. Desta forma, os efeitos do flúor sobre o
esmalte parecem iniciar durante a fase de secreção da amelogênese
(BASFORD; PATTERSON; KRUGER
14
, 1976; DENBESTEN; CRENSHAW
44
, 1984;
DRINKARD; CRENSHAW; BAWDEN
53
, 1983; PATTERSON; BASFORD;
KRUGER
133
, 1976; ROBINSON et al.
145
, 1979).
Uma grande dificuldade na realização desta etapa do projeto foi a
obtenção e seleção de material adequado para análise. Embora vários cortes
representassem uma fatia exata no longo eixo do incisivo e no maior
comprimento, a maioria deles não preenchia os requisitos necessários para a
sua utilização.
Para a seleção dos cortes foram utilizados alguns critérios.
Primeiramente, o corte deveria ter sido realizado o mais próximo do longo eixo
do dente, evitando cortes em posição oblíqua ou inclinada, o que poderia
Discussão
143
impossibilitar a avaliação de toda a matriz ou mesmo aumentar a área da
mesma.
Sabe-se que o incisivo de rato não apresenta uma disposição retilínea,
mas sim uma curvatura considerada como um pequeno segmento de uma
espiral de 140 a 150
o
(SCHOUR; MASSLER
150
, 1949). Além disso, nos animais
recém-nascidos e jovens, o seu pequeno tamanho e pouca espessura
dificultaram em muito a obtenção de cortes numa posição correta para a
análise.
Foram desprezados os cortes onde a alça cervical não era visualizada,
uma vez que poderia sugerir um corte fora da região central ao longo eixo do
dente. Os cortes também foram descartados quando os ameloblastos
apresentavam-se cortados obliquamente, pois, além de representarem um corte
inadequado do incisivo, também dificultariam a avaliação do final da fase de
secreção. Qualquer outro corte onde se percebesse uma secção não realizada
próxima à região central do seu longo eixo, teve que ser desprezada. Além
disso, para a análise as amostras deveriam apresentar a matriz de esmalte
preservada ao máximo em toda sua extensão. Os cortes onde a porção final da
matriz tivesse sido perdida ou deslocada da sua posição original foram
desprezados. Todos estes critérios reduziram em muito o material disponível
para análise.
Devido ao fato de existir pouco material adequado para a análise, optou-
se por utilizar lâminas de diferentes colorações. Este material, utilizado
anteriormente para análise morfológica, foi corado pelas técnicas de
Hematoxilina e Eosina (H.E.) e imuno-histoquímica.
Em relação a animais recém-nascidos e no período pós-natal inicial do
desenvolvimento, não existem estudos que avaliaram o comprimento da matriz
do esmalte. Na atual pesquisa, não foram observadas diferenças significantes
no comprimento da matriz na fase de secreção dos subgrupos de zero dias.
Este fato sugere que o flúor administrado em mães durante o período da
gestação, embora chegue aos fetos por via placentária, parece não afetar a
síntese e secreção da matriz de esmalte nesta idade.
Discussão
144
Na fase de secreção, aos sete dias de vida pós-natal, também não houve
diferença estatística entre as medidas de comprimento da matriz de animais
cujas mães receberam 0 e 7ppm de flúor. Isto pode sugerir que o flúor na
concentração de 7ppm administrado para a mãe não cause toxicidade aos
filhotes nesta idade, os quais recebem parte destes íons por via do leite
materno. Entretanto, em relação ao grupo de 100ppm nota-se uma redução de
14,38% no comprimento da matriz na fase de secreção, quando comparado ao
grupo controle. Isto pode sugerir que o flúor recebido no leite materno possa
reduzir a produção de esmalte, antecipando assim a maturação do esmalte
nesta idade. Em relação à fase após secreção, a qual incluía os períodos de
transição e maturação do esmalte não foram observadas diferenças estatísticas
em nenhum dos subgrupos analisados. Em relação ao comprimento total da
matriz, notou-se uma redução significativa de 5,78% no comprimento da matriz
de animais cujas mães receberam 100ppm.
Aos 14 dias de vida pós-natal, o comprimento da matriz na fase de
secreção no grupo de 7ppm foi 16,47% maior que o grupo de zero ppm com
significância estatística. Na fase de maturação, não foram observadas
diferenças estatísticas entre nenhum dos subgrupos estudados. Em relação ao
comprimento total da matriz, houve um aumento significativo de 12,91% no
comprimento da matriz de animais do grupo de 7ppm, quando comparado ao
grupo controle.
Segundo MACIEJEWSKA; ADAMOVICZ-KLEPALSKA
108
, 2000 e
MACIEJEWSKA et al.
109
, 2000, o flúor em baixas doses acelera o
desenvolvimento do germe dentário. Um aumento no comprimento dentário por
ação do flúor foi descrito por GLENN; GLENN; BURDI
76
, 1997, utilizando
hamsters prenhes de três dias que receberam 0, 10 e 20ppm de flúor na água
de beber. Os filhotes dessas mães foram sacrificados ao nascimento, sendo os
incisivos inferiores utilizados para medida de comprimento dentário. Foram
observados valores de comprimento dentário de 1,95, 2,11 e 2,26mm,
respectivamente para os grupos de 0, 10 e 20ppm de flúor, todos apresentando
diferenças estatísticas entre si. Os autores inclusive sugeriram que o flúor possa
Discussão
145
servir de nutriente essencial para o desenvolvimento dentário, sendo
importante a administração do íon durante a formação de dentes decíduos.
Entretanto, de qualquer forma, ainda é precoce afirmar que uma
dosagem ideal de flúor possa favorecer o desenvolvimento dentário ou
aumentar a retenção da matriz de esmalte.
Em relação aos animais adultos, os resultados obtidos em animais jovens
diferem-se em alguns parâmetros. No trabalho realizado por COSTA
33
, 2000,
foram utilizados 15 ratos
Wistar
, divididos em três grupos tratados com 0, 7 ou
100ppm de flúor em água de beber
ad libitum
durante 42 dias. Foram utilizados
cortes histológicos dos incisivos inferiores que sofreram a mesma reação
imuno-histoquímica utilizada na atual pesquisa. Os resultados para
comprimento total de matriz foram de 6,79, 6,25 e 9,94mm, respectivamente
para os animais que receberam 0, 7 e 100ppm de flúor. Para o comprimento da
matriz na fase de maturação foram obtidos valores de 1,81, 2,06 e 5,32mm,
respectivamente para os mesmos grupos. Para ambas medições, houve
diferença estatística significante apenas nos animais que receberam 100ppm.
Isto sugere que ocorra uma retenção de 2,94 vezes, ou seja, quase 300%
maior da matriz na fase de maturação em animais que receberam 100ppm flúor
quando comparados com o grupo controle. Fazendo-se o cálculo para a fase de
secreção, a autora sugere não haver influência do flúor sobre a quantidade
linear de matriz produzida e secretada. Nesta mesma pesquisa, embora não
tenha sido mensurado o comprimento da coroa clínica dos incisivos, foi
sugerido que os animais que receberam 100ppm apresentavam incisivos
inferiores mais curtos que os demais, sugerindo um atraso em sua formação.
Por outro lado, a compatibilidade dos valores obtidos em animais que
receberam 0 e 7ppm de flúor pode ser considerada como um indicador da falta
de toxicidade do flúor na concentrações adotada no segundo grupo.
A retenção e o conseqüente aumento no comprimento da matriz de
esmalte foram detectados também em um estudo de SMITH; NANCI;
DENBESTEN
164
, 1993, utilizando incisivos inferiores de ratas
Sprague-Dawley
com peso corporal aproximando de 250g, as quais receberam 100ppm de flúor
na água de beber durante seis semanas. Foi observado um aumento no
Discussão
146
comprimento sagital dos dentes cujos animais receberam flúor, sendo obtidos
valores de comprimento do esmalte parcialmente solúvel em EDTA de 3480 e
3112µm, respectivamente para animais que receberam 100ppm e o grupo
controle. E valores de comprimento de esmalte totalmente solúvel em EDTA de
5592 e 4607µm, respectivamente para os mesmos grupos. Foi observado
também que o tratamento crônico de flúor na água induz a produção de uma
camada mais fina de esmalte, sendo observados valores de espessura de
esmalte entre as fases de secreção e maturação de 105 e 115µm,
respectivamente para os animais expostos e não expostos ao flúor.
ZHOU; ZAKI; EISENMANN
185
, 1996, também observaram a retenção da
matriz numa pesquisa utilizando ratas
Sprague-Dawley
de peso corporal de 30-
35g as quais consumiram água contendo 0, 75 ou 100ppm de flúor na água de
beber durante seis semanas. Respectivamente, nestes grupos foram
observados valores de comprimento de matriz de esmalte de 5,561, 7,1441 e
7,4334mm; sem diferenças estatísticas entre os grupos que receberam flúor.
Para os respectivos grupos, os valores de espessura da matriz de esmalte no
início da fase de maturação foi de 0,10311, 0,08459 e 0,09340mm,
apresentando diferenças estatísticas entre todos os grupos. Estes resultados
assemelham-se aos obtidos por SMITH; NANCI; DENBESTEN
164
, 1993, onde
ocorre uma maior retenção da matriz e menor espessura do esmalte.
Entretanto, os resultados em relação ao comprimento da matriz de
esmalte são controversos. FEJERSKOV et al.
63
, 1980, realizaram um estudo em
ratos de 30 e 90 dias de vida pós-natal os quais receberam 0, 56,5 e 113ppm
de flúor na água de beber. Neste trabalho, foi verificado que o comprimento da
matriz na fase de maturação era em média 25% menor nos animais expostos
ao flúor quando comparado com o grupo controle.
6.4 Considerações sobre os resultados morfométricos para ameloblastos
Os ameloblastos secretores são células altamente polarizadas,
organizadas em um epitélio prismático simples alto (SASAKI; TAKAGI;
YANAGISAWA
148
, 1997). No atual trabalho, foi verificado em analisador de
Discussão
147
imagem que estas células atingem uma altura média de 63,35µm no dia de
nascimento, aumentando para 69,50µm aos sete dias de vida pós-natal e
alcançando um valor de 72,63µm no 14
o
dia. Estes valores encontram-se
próximos aos observados na literatura.
Em incisivos superiores de ratos adultos, REITH
138
, 1961, verificou que
estas células medem aproximadamente 60µm ou mais em altura, mas apenas 2
a 3µm de largura. Um valor máximo para altura foi determinado por SMITH;
NANCI
163
, 1989, os quais verificaram que, em incisivos inferiores de ratos
machos
Wistar
com peso aproximado de 100g, os ameloblastos secretores
chegam atingir até um pico de 70µm de altura.
Valores semelhantes foram encontrados por ROBINSON; BRIGGS;
ATKINSON
143
, 1981. Estes autores também consideraram que a altura média
dos ameloblastos secretores varia entre 60-70µm em incisivos inferiores de
ratos machos
Wistar
pesando 200-250g. Resultados semelhantes a estes foram
também verificados em incisivos superiores de ratos albinos por PINDBORG;
WEINMANN
135
, 1959. Estes pesquisadores encontraram um valor médio para
altura celular de ameloblastos secretores de 70µm.
Vale ressaltar que, uma dificuldade verificada a análise morfométrica da
altura celular está no fato que o ameloblasto apresenta alturas diferentes de
acordo com a sua localização em relação à sua posição na coroa dentária e o
momento em que se encontra durante o processo de amelogênese, podendo
aumentar ou até mesmo diminuir na mesma fase da formação do esmalte. Ou
seja, pode haver uma variação no comprimento da célula durante a fase de
secreção e também na fase de maturação.
Isto pode ser observado, por exemplo, no estudo de LANGE;
HAMMARSTRÖM
99
, 1984, os quais estudaram primeiros molares superiores de
ratos
Sprague-Dawley
de 2 a 12 dias de vida pós-natal. Nesta pesquisa, os
autores verificaram que o valor máximo para altura de ameloblastos secretores
foi de 109µm no lado mesial da cúspide medial aos quatro dias de vida. O valor
correspondente no lado distal da mesma cúspide é de 60µm. As diferenças na
altura das células dos lados mesial e distal foram observadas nas cúspides
mesial, medial e distal estudadas.
Discussão
148
Não foram encontrados trabalhos na literatura que tenham observado a
influência do flúor na altura celular de ameloblastos secretores de animais
recém-nascidos, jovens ou adultos. Embora pareça haver uma redução na
altura celular quanto maior é a dosagem de flúor, não houve diferenças
estatísticas na altura celular em nenhum dos subgrupos estudados. Desta
forma, o flúor parece não interferir de forma significativa na altura celular em
nenhuma das dosagens administradas e em nenhum dos grupos etários.
No período de transição entre a fase de secreção e a de maturação,
ocorrem uma redução na altura dos ameloblastos e uma modificação no tipo de
organelas citoplasmáticas predominantes. Neste período, também ocorre a
remoção do excesso de organelas associadas à síntese, as quais são
acondicionadas em vacúolos autofágicos e digeridas por enzimas lisossômicas.
Dentro destes vacúolos encontram-se cisternas de retículo endoplasmático
rugoso, polirribossomas, mitocôndrias, estruturas filamentosas e numerosos
grânulos (SALAMA; ZAKI; EISENMANN
146
, 1991; TEN CATE
172
, 2001).
Na fase de transição, em incisivos inferiores de ratos adultos, podem ser
facilmente observados ameloblastos altos (60-70µm), outros sofrendo redução
de altura e outros baixos (40-50µm). Ao microscópio de luz, a redução brusca
na altura celular pode ser facilmente verificada (KALLENBACH
88
, 1974; SILVA-
SOUSA et al.
153
, 2003).
Na atual pesquisa, os ameloblastos da fase de maturação apresentaram
uma altura de 45,50µm aos sete dias e 42,07µm aos 14 dias de vida pós-natal.
JOSEPHEN; FEJERSKOV
87
, 1977, observaram que ameloblastos de incisivos
superiores de ratas fêmeas com 91 dias de vida apresentam altura variando de
40 a 60 µm e largura aproximada de 5µm. Entretanto, segundo SMITH;
NANCI
162
, 1989, os quais utilizaram como modelo os incisivos inferiores de ratos
machos
Wistar
com peso aproximado de 100g, os ameloblastos na fase de
maturação possuem cerca de 40µm de altura, um valor correspondente ao
mínimo observado por JOSEPHSEN; FEJERSKOV
87
, 1977. Resultados
semelhantes a estes foram também verificados em incisivos superiores de ratos
albinos por PINDBORG; WEINMANN
135
, 1959. Estes pesquisadores encontraram
um valor médio para altura celular de ameloblastos na fase de maturação de
Discussão
149
aproximadamente 40µm. Valores menores na altura celular foram encontrados
em incisivos superiores de ratos adultos por REITH
138
, 1961, o qual verificou em
sua amostra que estas células medem aproximadamente 35µm de altura.
Em relação ao tipo de ameloblasto na fase de maturação, SASAKI
147
,
1984, verificou, em germes de primeiros e segundo molares de gatos com
quatro meses de vida, que tanto as células de terminação rugosa quanto as de
borda lisa apresentam uma altura de aproximadamente 30 a 40µm. SASAKI et
al.
149
, 1983, em incisivos inferiores de ratos
Sprague-Dawley
de 3 a 5 semanas
de vida pós-natal, observaram uma altura média de 30 a 35µm em
ameloblastos de borda lisa na fase de maturação.
Existem poucos trabalhos na literatura que tenham observado a
influência do flúor na altura celular de ameloblastos na fase de maturação de
animais recém-nascidos, jovens ou adultos. RIBEIRO
139
, 2001, utilizou incisivos
inferiores de ratas
Wistar
de 30 dias de vida pós-natal com peso aproximado de
100g, as quais receberam 0, 7 e 100ppm de flúor na água de beber durante
seis semanas. Nestas amostras foram determinados os mesmos cálculos
morfométricos estudados na atual pesquisa. A altura do ameloblasto na fase de
maturação dos grupos controle e experimentais de 7 e 100ppm foi,
respectivamente, de 48,14 ± 3,69, 42,16 ± 4,36 e 35,32 ± 3,66µm, havendo
uma redução estatisticamente significante de 27% no grupo de 100 ppm em
relação ao grupo controle. Vale lembrar que estes cálculos foram realizados
aleatoriamente, sem distinções em ameloblastos de borda lisa e rugosa.
A redução na altura do ameloblasto também foi detectada em um estudo
de SMITH; NANCI; DENBESTEN
164
, 1993, utilizando incisivos inferiores de ratas
Sprague-Dawley
com peso corporal aproximando de 250g, as quais receberam
100ppm de flúor na água de beber durante seis semanas. Embora o trabalho
demonstre por figuras a diferença estatística observada na altura de
ameloblastos na fase de maturação dos grupos experimental e controle, os
autores não descreveram em termos percentuais os valores encontrados para o
decréscimo em altura. A redução na altura celular foi descrita tanto para
ameloblastos de borda rugosa quanto para os de borda lisa. Foi observada
também uma redução na altura da camada papilar.
Discussão
150
Embora os resultados obtidos na atual pesquisa sugiram haver uma
redução na altura celular quanto maior é a dosagem de flúor, não houve
diferenças estatísticas na altura celular em nenhum dos subgrupos estudados
na fase de maturação.
No atual trabalho, foi observada uma redução no volume citoplasmático
em ameloblastos secretores. No grupo de sete dias, o volume citoplasmático do
ameloblasto secretor do subgrupo de 100 dias foi 23,80% e 17,63% menor que
os valores observados para os subgrupos de zero e 7 ppm de flúor. No grupo
de 14 dias, o volume citoplasmático do ameloblasto secretor do grupo de 100
dias foi 24,75% e 16,09% menor que os valores observados nos subgrupos de
zero e 7 ppm de flúor. Uma vez que o flúor não interferiu na altura das
ameloblastoss, dentro da mesma idade, parece possível que tenha existido uma
redução na largura dos ameloblastos secretores da atual pesquisa.
Entretanto, estas alterações morfológicas em ameloblastos secretores
não foram observadas por RIBEIRO; ASSIS; HIROTA
140
, 2001, estudando
incisivos de ratos adultos que receberam 0 ou 100 ppm de flúor na água de
beber
ad libitum
. Nesta pesquisa, também não foram observadas diferenças
estatísticas na densidade de volume e volume absoluto do núcleo e citoplasma
entre os grupos.
Na fase de maturação, o volume do núcleo e do citoplasma dos
ameloblastos não mostraram diferenças estatisticamente significantes em
função do tratamento com o flúor em nenhuma das idades estudadas.
RIBEIRO
139
, 2001, observou, em ameloblastos na fase de maturação de
incisivos de ratos adultos, valores de volume absoluto citoplasmático de
2244,48 ± 315,51, 1864,18 ± 316,88 e 1538,13 ± 346,58µm
3
, respectivamente
para os mesmos grupos. Apenas o volume citoplasmático do grupo de 100ppm
foi 31% menor (p<0,05) que o grupo controle. Esta redução no volume
absoluto do citoplasma foi atribuída à diminuição da altura do ameloblasto, uma
vez que as densidades de volume do núcleo e do citoplasma, e a relação
núcleo/citoplasma não mostraram diferenças estatisticamente significantes.
Como vimos na atual pesquisa, as alterações morfométricas foram mais
significativas na fase de secreção que na de maturação. Outros estudos
Discussão
151
também demonstraram que, embora os efeitos do flúor sejam mais evidentes
na fase de maturação do esmalte, a concentração do mesmo é maior na matriz
do esmalte parcialmente mineralizado do que nos estádios mais avançados da
mineralização (OLIVEIRA
128
, 1988; SPEIRS
167
, 1975; SPEIRS
168
, 1978;
WEATHERELL et al.
180
, 1975).
A maior concentração de flúor no interior do esmalte durante a
amelogênese é observada no início da fase de maturação (KATO et al.
90
, 1988).
Assim, no momento ou logo antes dessa fase, quando o esmalte começa a
mineralizar rapidamente, as concentrações de flúor são particularmente altas. A
concentração cai rapidamente à medida que o conteúdo mineral do tecido
atinge aquela do esmalte maduro (WEATHERELL et al.
180
, 1975).
Existem várias hipóteses que tentam explicar porque o flúor tem maior
ação sobre o esmalte no início da fase de maturação. Uma delas é que o flúor
provavelmente possa estar ligado seletivamente às proteínas do esmalte jovem
(CRENSHAW; WENNBERG; BAWDEN
35
, 1978). Outra hipótese sugere que o
flúor, possivelmente adquirido na forma iônica quando o esmalte está
parcialmente mineralizado, seja diluído durante a deposição subseqüente de
esmalte relativamente livre de flúor. Outra possibilidade seria que o flúor
adquirido nas fases iniciais da amelogênese fosse perdido durante a
mineralização do tecido (WEATHERELL et al.
180
, 1975). Ou ainda, a
susceptibilidade aos efeitos negativos do flúor no início do estádio de
maturação parece estar associada à inibição da proteólise na matriz, resultando
no acúmulo de material orgânico. Especialmente as amelogeninas parecem
sofrer maior retenção durante o início da fase de maturação. Mesmo não se
conhecendo com exatidão a função das amelogeninas na mineralização do
esmalte, acredita-se que as mesmas controlam a orientação do crescimento dos
cristais em extensão. A administração de flúor, durante a fase secretora da
amelogênese, inibe tal crescimento, indicando que o flúor rompe
temporariamente o controle das amelogeninas sobre a mineralização
(DENBESTEN; CRENSHAW
45
, 1987).
Discussão
152
7 Conclusões
Conclusões
154
Conclusões
155
7 Conclusões
Baseado nos resultados obtidos pode-se constatar que a dosagem de
7ppm não provocou alterações morfológicas significativas, exceto no grupo de
14 dias onde foi observado um maior comprimento da matriz de esmalte. O
excesso de flúor na dosagem de 100ppm provocou em germes dos incisivos de
ratos recém-nascidos e com sete e 14 dias de vida pós-natal:
Na matriz do esmalte examinada no microscópio óptico:
- um padrão de identificação imuno-histoquímico da amelogenina homogêneo e
pouco intenso na matriz do esmalte, mas intenso na pré-dentina, semelhante
ao grupo controle;
- um menor comprimento de matriz de esmalte retida.
Nos ameloblastos secretores:
- o aparecimento de grandes vacúolos na região apical do citoplasma;
- o aparecimento de algumas regiões de retículo endoplasmático rugoso mais
dilatadas, com as cisternas mais desorganizadas e material intracisternal retido
e com poucas alterações no complexo de Golgi ou nos grânulos de secreção;
- dilatações das mitocôndrias, mostrando as cristas mais desorganizadas;
- uma redução no volume citoplasmático apenas nos animais de 7 e 14 dias.
Nos ameloblastos em maturação:
- de borda lisa: o aparecimento de grande quantidade de vacúolos com matriz
eletrondensa endocitada, sugerindo retardo na reabsorção;
- de borda rugosa: a presença de algumas mitocôndrias dilatadas.
Portanto, de acordo com o protocolo deste estudo, o fluoreto de sódio
oferecido em excesso à ratos durante a prenhez em água de consumo passa
pela placenta e pelo leite e não altera a produção das amelogeninas dos
incisivos dos filhotes, interferindo na secreção e reabsorção da matriz.
Conclusões
156
Anexos
Anexos
158
Anexos
159
ANEXO 1 - Protocolo para preparo da solução fixadora de paraformaldeído
Preparo da solução A
Paraformaldeído a 4% (SIGMA) ........................................................................................ 4g
Solução de fosfato de sódio (Na
3
PO
4
) (MERCK) ............................................................. 100ml
Preparo da solução de paraformaldeído a 4% e aldeído glutárico a 1%
Glutaraldeído a 70% (SIGMA) ......................................................................................... 1ml
Solução A .................................................................................................................... 69ml
ANEXO 2 - Protocolo para preparo da solução de EDTA
EDTA (MERCK) ............................................................................................................ 41,3g
Hidróxido de sódio (NaOH) (MALINCKRODT) ................................................................... 4,4g
Água destilada .......................................................................................................... 1000ml
Anexos
160
ANEXO 3 – Protocolo para preparo dos corantes utilizados na técnica de
Hematoxilina e Eosina (H.E.)
HEMATOXILINA DE HARRIS
Solução A
Hematoxilina ................................................................................................................... 5g
Álcool 100% ................................................................................................................ 50ml
Solução B
Alúmen de potássio ...................................................................................................... 100g
Água destilada quente ............................................................................................... 1000ml
Preparo
Juntar as soluções A e B e depois adicionar 2,5g de óxido de mercúrio vermelho. Ferver e
depois esfriar rapidamente
EOSINA DE LISON
Solução A
Eosina ........................................................................................................................... 10g
Álcool 100% ............................................................................................................... 100ml
Solução B
Bicromato de potássio ...................................................................................................... 5g
Água destilada ............................................................................................................ 800ml
Solução saturada de ácido pícrico
Ácido pícrico ............................................................................................................... 1,22g
Água destilada ............................................................................................................ 100ml
Preparo
Juntar as soluções A e B e depois adicionar a solução saturada de ácido pícrico
Anexos
161
ANEXO 4 - Protocolo para preparo da coloração de Hematoxilina e Eosina
Desparafinização
- Dois banhos em xilol (1) por 15 minutos
- Um banho em xilol (2) por 15 minutos
Hidratação
- Dois banhos em álcool absoluto (1) por cinco minutos
- Um banho em álcool absoluto (2) por cinco minutos
- Um banho em álcool 70 por cinco minutos
Lavagem
- Lavagem em água corrente por dez minutos, sendo cinco trocas rápidas de água e mais cinco
trocas a cada dois minutos
Coloração
- Um banho em Hematoxilina de Harris por um minuto
- Lavagem em água corrente, sendo várias trocas rápidas até água perder o corante e um
banho até completar dez minutos
- Um banho em Eosina e Lison por dois minutos
- Lavagem rápida em água corrente
Desidratação
- Um banho rápido em álcool 70%
- Dois banhos rápidos em álcool absoluto (1)
- Um banho de álcool absoluto (2) por três minutos
- Um banho de álcool absoluto (3) por três minutos
- Um banho de álcool absoluto (4 – produto novo) por três minutos
Diafanização
- Um banho de xilol (1) por três minutos
- Um banho de xilol (2) por três minutos
- Um banho de xilol (3) por três minutos
Montagem da Lâmina
- Montagem da lâmina com resina ENTELLAN (Merck, Alemanha)
Anexos
162
ANEXO 5 - Protocolo para o tratamento imuno-histoquímico da
amelogenina
Desparafinização, Reidratação e Lavagem
- Desparafinização em estufa a 63°C por 30 minutos
- Desparafinização em xilol com três banhos de dez minutos
- Reidratação em álcool etílico absoluto com um banho de dez minutos e um de cinco minutos
- Reidratação em álcool etílico a 95% com um banho de cinco minutos
- Reidratação em álcool etílico a 80% com um banho de cinco minutos
- Lavagem em água destilada com dois banhos de cinco minutos
- Secagem do excesso ao redor do corte com gaze ou papel de filtro
Inibição da Peroxidase Endógena
- Inibição da peroxidase endógena com gotejamento de peróxido de hidrogênio a 3% (DAKO
®
Peroxidase Blocking Reagent ~ Code no. S2001) por 15 a 25 minutos
- Lavagem em PBS com pipeta P1000 (Pipeta Pipetman – precision microliter pipette – GILSON)
- Lavagem em PBS com dois banhos de dez minutos
- Secagem do excesso ao redor do corte com gaze ou papel de filtro
Exposição dos Epítopos
- Exposição dos epítopos com proteinase K (30 µl de proteinase K diluídos em 7,5ml de PBS)
por uma hora
- Lavagem em PBS com pipeta P1000 (Pipeta Pipetman – precision microliter pipette – GILSON)
- Lavagem em PBS com três banhos de cinco minutos
- Secagem do excesso ao redor do corte com gaze ou papel de filtro
Bloqueio das proteínas do sangue
- Gotejamento do bloqueador das proteínas do sangue (Dako X0909 – soro eqüino normal a 2%
em PBS) por uma hora para evitar o “background”;
- Lavagem em PBS com pipeta P1000 (Pipeta Pipetman – precision microliter pipette – GILSON)
- Lavagem em PBS com dois banhos de PBS por cinco minutos
- Secagem do excesso ao redor do corte com gaze ou papel de filtro
Exposição ao anticorpo primário
- Incubação dos cortes no respectivo anticorpo primário previamente diluído (1:3000, utilizando
pipeta P10 marcando 010 (1µl) do anticorpo primário previamente descongelado) em 3ml de
Anexos
163
PBS pH 7,4 contendo BSA (albumina sorológica bovina) a 1% por dez horas em câmara úmida.
Separa-se uma ou mais lâmina do grupo que não receberá o anticorpo primário para ser
utilizada como controle. Esta lâmina permanece com PBS durante o tempo de exposição ao
anticorpo primário.
- Lavagem em PBS com pipeta P1000 (Pipeta Pipetman – precision microliter pipette – GILSON)
- Lavagem em PBS com três banhos de cinco minutos
- Secagem do excesso ao redor do corte com gaze ou papel de filtro
Exposição ao anticorpo secundário conjugado com biotina
- Tratamento dos cortes no anticorpo secundário conjugado com biotina (imunoglobulinas
eqüinas anti-coelho e anti-camundongo biotinilada - Dako LSAB
®
2 system - universal para rato
- Kit-Link-biotinylate anti-mouse Ig / biotinilated anti-rabbit Ig ~ Item no. 002525) diluído em
1:400 em PBS ou kit ABC (seguindo as instruções do fabricante) por 30 minutos
- Lavagem em PBS com pipeta P1000 (Pipeta Pipetman – precision microliter pipette – GILSON)
- Lavagem em PBS com três banhos de cinco minutos
- Secagem do excesso ao redor do corte com gaze ou papel de filtro
Tratamento com enzima avidina-biotina
- Tratamento com a enzima avidina-biotina (Dako LSAB
®
2 system – universal para rato –
Streptavidin – HPR – Streptavidin peroxidase conjugated ~ Item no. 002527) diluída em 1:400
em PBS ou kit ABC (seguindo as instruções do fabricante) por 30 minutos
- Lavagem em PBS com pipeta P1000 (Pipeta Pipetman – precision microliter pipette – GILSON)
- Lavagem em PBS com três banhos de cinco minutos
- Secagem do excesso ao redor do corte com gaze ou papel de filtro
Aplicação da diaminobenzidina
- Incubação em solução de uma gota de diaminobenzidina (DAB) (DAKO Liquid DAB Chromogen
~ Code no. 003222) diluída em 1ml de solvente (Buffered substrate for liquid DAB ~ Item no.
002897) do KIT DAKO Liquid DAB substrate – chromogen system ~ Code no. K3466 por 25
segundos
- Lavagem em água destilada com pipeta P1000 (Pipeta Pipetman – precision microliter pipette
– GILSON)
- Lavagem em água destilada com dois banhos de dez minutos
Contra-coloração
- Contra-coloração com Hematoxilina de Harris por dois a três minutos
- Lavagem em água destilada por cinco minutos
Anexos
164
Desidratação, Diafanização e Montagem da Lâmina
- Desidratação em álcool a 80% por cinco minutos
- Desidratação em álcool a 95% por cinco minutos
- Desidratação em álcool a 100% por cinco minutos
- Diafanização em xilol com três banhos de cinco minutos
- Montagem da lâmina com resina ENTELLAN (Merck, Alemanha)
Protocolo para o preparo da solução de PBS (0,01 M)
Fosfato de sódio dibásido anidro (Na
2
HPO
4
) (MERCK) .................................................... 1,09g
Fosfato de sódio monobásico anidro (NaH
2
PO
4
) (MERCK) ............................................... 0,32g
NaCl (MERCK) .................................................................................................................. 9g
Água destilada .......................................................................................................... 1000ml
Obs.: Após a dissoluição dos sais, o pH foi corrigido para 7,4 em pHmetro utilizando NaOH ou HCl de acordo com o pH
obtido na solução acima.
Protocolo para o preparo da solução de citrato de sódio tamponado (10 mM)
Citrato de sódio ........................................................................................................... 2,94g
Água destilada .......................................................................................................... 1000ml
Obs.: A diluição dos sais é realizada sob aquecimento. Após a dissoluição dos sais, o pH foi corrigido para 6,0 em
pHmetro utilizando NaOH ou HCl de acordo com o pH obtido na solução acima.
Anexos
165
ANEXO 6 - Protocolo para o processamento e inclusão dos fragmentos
histológicos em resina Spurr
- Lavagens rápidas em solução tampão cacodilato com 7% de sacarose
- Pós-fixação em tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato de sódio 0,08M, pH 7,3 por
uma hora
- Lavagem rápida em solução tampão cacodilato
- Coloração
‘en bloc’
em acetato de uranila a 0,5%
- Desidratação em banhos de etanol 50% até 100%
- Dois banhos de 10 minutos cada em óxido de propileno
- Um banho de óxido de propileno com resina SPURR na proporção de 1:1, sob movimento
giratório em temperatura ambiente por até 12 horas
- Uma hora em resina SPURR pura em estufa a 60°C
- Inclusão em resina SPURR pura
- Polimerização em estufa a 60°C
ANEXO 7 - Protocolo para solução aquosa de Azul de Metileno a 1% e Azur
II a 1%
Solução A
Azur II ............................................................................................................................ 1g
Água destilada ............................................................................................................ 100ml
Solução B
Azul de Metileno .............................................................................................................. 1g
Solução de Bórax a 1% ............................................................................................... 100ml
Ácido Clorídrico .............................................................................................................. 2ml
Preparo
Juntar partes iguais das soluções A e B.
Anexos
166
Referências bibliográficas
Referências Bibliográficas
168
Referências Bibliográficas
169
Referências bibliográficas*
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* Normas recomendadas para uso no âmbito da Universidade de São Paulo, com base no documento “Referências
Bibliográficas: exemplos”, emanado do Conselho Supervisor do Sistema Integrado de Bibliotecas da USP, em reunião de
20 de setembro de 1990. Optou-se, entretanto, pela citação de todos os autores das publicações.
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Abstract
Abstract
198
Abstract
199
ABSTRACT
Morphological ultrastructural and immunohistochemical study of the
fluorine excess influence on rat incisor tooth germ development
The dental fluorosis is a result of fluorine toxicity during odontogenesis. Several
experimental models have been used in attempt to explain the fluorine
pathogenesis in enamel, but during the fetal or the initial postnatal period,
there is not much information about its action. For this reason, in this research,
the female rats received 0, 7 or 100 ppm of sodium fluoride in drinking water,
one week before matching, during all gestation (21 days) and nursing phases.
The hemimandibles of the pups at the age of 0, 7 and 14 days of postnatal life
(n = 6) were collected for the morphologic study in optical and electronic
microscopy, immunohistochemistrical analysis for the amelogenin and
morphometric study of the enamel matrix and of ameloblasts in the secretion
and maturation phases of the lower incisive. The results showed a reduction of
the enamel matrix secretion, disorganization of the mitochondrial crests, large
vacuoles in the apical portion of the cytoplasm, retention of the intracisternal
material and dilatation of some cisterns in rough endoplasmic reticulum for the
secretory ameloblasts of 100 ppm experimental group in all experimental
periods. In the groups of animals at the age of 7 and 14 days, a reduction
(p<0.05) in the cytoplasmic volume of 23.80% and 24.75%, respectively, was
observed in relation to the control groups. In smoothed-border maturation
ameloblasts, there was a great amount of vacuoles with endocited
electrondense matrix, suggesting a retard in the reabsorption process. In
ruffled-border ameloblasts, there were some dilated mitochondrias. The
immunohistochemistrical analysis showed no difference in intensity and marking
pattern of the enamel matrix in any of the studied groups. Therefore, part of
the excessive dose of sodium fluoride given to the mother in drinking water can
reach the pup by the placenta and by the mother’s milk, causing morphological
alterations in ameloblasts and suggesting a reduction in the secretion and a
retard in the matrix reabsorption.
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