ads:
LARISSA DE BIAGGI VILLAS BÔAS
ESTUDO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS ANSIOLÍTICOS E SEDATIVOS DE
Passiflora actinia Hook., PASSIFLORACEAE
CURITIBA
2007
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Curso de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, Setor
de Ciências da Saúde, Universidade Federal
do Paraná.
Orientador: Prof. Tit. Cid Aimbiré M. Santos
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
LARISSA DE BIAGGI VILLAS BÔAS
ESTUDO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS ANSIOLÍTICOS E SEDATIVOS DE
Passiflora actinia Hook., PASSIFLORACEAE
CURITIBA
2007
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Curso de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas,
Setor de Ciências da Saúde, Universidade
Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Tit. Cid Aimbiré M. Santos
ads:
i
NOTA BIOGRÁFICA
A autora graduou-se em Farmácia e Indústria pela Universidade Federal do Paraná em
2004. Durante sua graduação foi bolsista de iniciação científica duas vezes: em 2001,
no Departamento de Bioquímica, sob orientação da Prof
a
Dr. Selma Faria Zawadzki, na
área de biossíntese de heteropolissacarídeos, de agosto/2002 a julho/2003, no
Laboratório de Farmacognosia, sob orientação do Prof. Tit. Cid Aimbiré de Moraes
Santos, desenvolvendo o projeto “Determinação da atividade antioxidante de plantas
medicinais e aromáticas”, cujos resultados conferiram à autora o primeiro lugar no XI
EVINCI (Evento de Iniciação Científica da UFPR, 2003). Em 2004 foi professora de
química na Sociedade Educacional Le Cristo/Centro Estudantil Domus Mariae, em
Curitiba, e no ano seguinte ingressou no Programa de Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas na UFPR, área de insumos, medicamentos e correlatos, onde
desenvolveu trabalho de pesquisa dos constituintes químicos ansiolíticos e sedativos de
Passiflora actinia Hook.. Como contribuições desse estudo foram publicados os
seguintes trabalhos:
1. Villas-Bôas, L. B., Sanches, M. C. R., Oliveira, R. M. M. W. e Santos, C. A. M.:
Estudo cromatográfico da fração n-butanol das folhas do extrato hidroalcoólico
de Passiflora actinia Hooker. Em V Jornada Catarinense e I Jornada
Internacional de Plantas Medicinais, Hotel Bourbon, Joinville-SC, 8-12 de maio,
p. 172, 2006.
2. Lolli, L. F., Sato, C. M., Romanini, C. V., Villas-Bôas, L. B., Santos, C. A. M. e
Oliveira, R. M. W.: Possible involvement of GABA
a
-benzodiazepine receptor in
the anxiolitic-like effect induced by Passiflora actinia extracts in mice. Journal of
Ethnopharmacology, articles in press, doi:10.1016/j.jep.2006.11.02, 2007.
ii
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Ademar e Silvana
iii
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Cid Aimbiré de Moraes Santos pela seriedade com que conduz seus
projetos, pela dedicação constante e acima de tudo por ter me acolhido em seu
laboratório e acreditado no meu trabalho.
Aos meus pais Ademar e Silvana, irmãos Guilherme e Luis Felipe e os familiares que
sempre foram a minha base, pelo incansável apoio, amor e estímulo em todos os
momentos.
Ao Marlos, meu amor. Por me apoiar em todos os momentos da minha vida, me
incentivar nos estudos e por entender minha ausência nos momentos que eram
exclusivamente seus.
A técnica Maria da Graça Toledo (Gracinha) por ter me auxiliado nos experimentos no
equipamento de CLAE.
A Professora Rúbia M. W. de Oliveira da UEM, pela colaboração no projeto realizando
os experimentos farmacológicos.
Ao Dr. Anderson Barrisson e a técnica Paula Zangaro dos Santos do Departamento de
Química da UFPR pela indispensável colaboração na obtenção e interpretação dos
espectros de ressonância.
Ao Professor Eloir Paulo Schenkel por ter me recebido em seu laboratório na UFSC,
compartilhado comigo sua experiência e cedido padrões. Agradeço também ao casal de
amigos Juliana e Flávio pela hospitalidade em sua casa.
A Professora Maique Weber Biavatti por todo o apoio durante a execução desse
projeto, interpretação dos espectros de ressonância e cromatogramas obtidos em
CLAE, doação de reagentes e por ter me acolhido em sua casa em Itajaí-SC.
Aos colegas de laboratório Ingrid, Ciça, Cláudia, Elise, Lígia, Fernanda, Dania, Juliano,
Cris, Rodrigo, Rosana, Ariane, Jane, Wesley, Marcelo, Mariana, Tammy, Beatriz,
Patrícia, Melissa, Fabiana por toda ajuda prestada e pelas boas risadas. A D. Maria,
pelo auxílio técnico e por estar sempre disposta a ajudar.
Aos amigos de mestrado Lorena, Christian e Sílvia por terem compartilhado comigo
todos os momentos de conquistas, frustração e cansaço. E acima de tudo por
entenderem esse meu sentimento.
Ao Professor José Domingos Fontana por ter nos cedido padrão e pelas suas idéias
sempre muito úteis.
iv
A Professora Almeriane Maria Weffort Santos, coordenadora do programa de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas, por toda a amizade e pelo esforço em sempre
fazer desse curso o melhor possível.
A CAPES, Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela bolsa
de mestrado.
v
EPÍGRAFE
"É melhor tentar e falhar,
que preocupar-se e ver a vida passar;
é melhor tentar, ainda que em vão,
que sentar-se fazendo nada até o final.
Eu prefiro na chuva caminhar,
que em dias tristes em casa me esconder.
Prefiro ser feliz, embora louco,
que em conformidade viver..."
Martin Luther King
vi
SUMÁRIO
NOTA BIOGRÁFICA .........................................................................................................i
DEDICATÓRIA................................................................................................................. ii
AGRADECIMENTOS ...................................................................................................... iii
EPÍGRAFE .......................................................................................................................v
SUMÁRIO........................................................................................................................vi
LISTA DE ESQUEMAS ................................................................................................. viii
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... viii
LISTA DE QUADROS ..................................................................................................... ix
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................x
ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS....................................................................... xi
RESUMO....................................................................................................................... xiii
ABSTRACT ................................................................................................................... xiv
INTRODUÇÃO.................................................................................................................1
Considerações botânicas.........................................................................................6
Gênero Passiflora....................................................................................................6
Considerações químicas..........................................................................................7
Glicosídeos cianogênicos........................................................................................7
Alcalóides..............................................................................................................10
Flavonóides ...........................................................................................................13
Saponinas .............................................................................................................18
Considerações farmacológicas .............................................................................20
A espécie Passiflora actinia...................................................................................31
Estudos prévios de Passiflora actinia...................................................................32
OBJETIVOS...................................................................................................................36
MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................................37
Procedimentos gerais.............................................................................................37
Reação de acetilação............................................................................................38
vii
Separação cromatográfica em Sephadex LH-20...................................................39
Separação cromatográfica em resina Amberlite XAD-16 ......................................39
Material botânico.....................................................................................................39
Preparo dos extratos...............................................................................................40
Extrato fluido e frações..........................................................................................40
Extrato metanólico e frações.................................................................................41
Técnica de CLAE.....................................................................................................43
Separação da fração n-BuOH.................................................................................43
Isolamento da substância ACT
24
...........................................................................43
Fração SP-HPLC1.................................................................................................44
Separação da fração aquosa..................................................................................45
Fracionamento da fração aquosa liofilizada ..........................................................45
Coluna CV
3
e subfrações.......................................................................................45
Coluna CV
2, 3
(todas) .............................................................................................46
Separação cromatográfica em Sephadex LH-20...................................................47
Separação cromatográfica em resina Amberlite XAD-16 ......................................47
Separação cromatográfica em resina Amberlite XAD-16/Sephadex .....................47
Reação de hidrólise ácida .....................................................................................48
RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................................49
Extrato fluido e metanólico desclorofilado...........................................................49
Fração n-BuOH........................................................................................................54
Fração aquosa.........................................................................................................60
CONCLUSÕES E TRABALHOS FUTUROS.................................................................73
REFERÊNCIAS..............................................................................................................75
viii
LISTA DE ESQUEMAS
1: Formação dos alcalóides β-carbolínicos a partir da condensação de
Pictet-Spengler...............................................................................................................11
2: Fluxograma do preparo do extrato fluido e fracionamento do extrato de P. actinia....41
3: Fluxograma de preparo do extrato metanólico e fracionamento de P. actinia............42
LISTA DE FIGURAS
1: Distribuição geográfica da espécie Passiflora actinia no Brasil, destacados em
vermelho ........................................................................................................................32
2: Aspecto geral de Passiflora actinia Hooker, Passifloraceae ......................................34
3: Cromatograma do extrato fluido de P. actinia obtido na sétima fase de otimização da
metodologia em CLAE. FM: sol. aquosa HCO
2
H 2%-CH
3
CN 87:13, fluxo 1,2 ml/min e
λ=340 nm .......................................................................................................................51
4: Cromatograma do padrão isovitexina em CLAE. FM: sol. aquosa HCO
2
H 2%-CH
3
CN
87:13, fluxo 1,2 ml/min e λ=340 nm ...............................................................................52
5: Cromatograma do extrato fluido de P. actinia, extrato fluido adicionado de padrão de
isovitexina e padrão isovitexina em CLAE. FM: sol. aquosa HCO
2
H 2%-CH
3
CN 87:13,
fluxo 1,2 ml/min e λ=340 nm ..........................................................................................53
6: Cromatograma do extrato metanólico desclorofilado de P. actinia em CLAE. FM: sol.
aquosa HCO
2
H 2%-CH
3
CN 87:13, fluxo 1,2 ml/min e λ=340 nm...................................53
7: CCD da fração n-BuOH e aquosa do extrato metanólico desclorofilado de P. actinia
FM: EtOAc-HCO
2
H-H
2
O (8:1:1), revelador: NEU ...........................................................54
8: Perfil cromatográfico em CLAE da fração n-BuOH de P. actinia. FM: sol. aquosa
HCO
2
H 2%-CH
3
CN 87:13, fluxo 1,2 ml/min e λ=340 nm................................................55
9: Perfil cromatográfico em CLAE da fração n-BuOH e dos padrões vitexina, isovitexina
e orientina. FM: sol. aquosa HCO
2
H 2%-CH
3
CN 87:13, fluxo 1,2 ml/min e λ=340 nm...56
10: Espectro de
1
H- RMN (400 MHz, CDCl
3
) da substância 30 .....................................57
ix
11: (a) Perfil cromatográfico da fração SP-HPLC1 em CCD. FM: EtOAc-HCO
2
H-H
2
O
(6:1:1), revelador NEU e (b) CLAE FM: sol. aquosa HCO
2
H 2%-CH
3
CN 90:10, fluxo 1,0
ml/min e λ=340 nm.........................................................................................................59
12: Perfil cromatográfico em CCD da fração (I) e sub-frações da SP-HPLC1 FM: EtOAc-
HCO
2
H-H
2
O (6:1:1), revelador anisaldeído sulfúrico......................................................60
13: Fracionamento da fração aquosa do extrato metanólico desclorofilado em coluna à
vácuo (CV
3
), FM: DCM-EtOH (1:1), revelador anisaldeído sulfúrico ..............................61
14: Resultado da coluna ACT 4, 5, 6 CV
3
. FM: tolueno-EtOAc (1:1), revelador
anisaldeído sulfúrico.......................................................................................................62
15: Resultado da coluna ACT 7, 8, 9 CV
3
(material partida, frações e material limpeza
coluna). FM: tolueno- EtOAc (1:1), revelador anisaldeído sulfúrico ..............................62
16: Espectro de
1
H-RMN (400 MHz, CDCl
3
) da substância ACT
43
.................................63
17: Espectro de
1
H-RMN (400 MHz, CDCl
3
) do glicerol acetilado..................................66
18: Espectro de COSY (400 MHz, CDCl
3
) do glicerol acetilado.....................................67
19: Substância tri-acetato de glicerol .............................................................................67
20: CCD da fração aquosa e suas frações da SP
1
. Em destaque a F
3
de coloração
avermelhada. FM: DCM-EtOH (1:1), revelador anisaldeído sulfúrico.............................68
21: Frações SP
4
(F
3
-SP
1
)F
1
e SP
4
(F
3
-SP
1
)F
2
nas seguintes fases móveis: (1) EtOAc-
HCO
2
H-H
2
O (6:1:1) e (2) DCM-EtOH (1:1), revelador anisaldeído sulfúrico ..................69
22: Coluna Amberlite XAD-16 fração SP
4
(F
3
-SP
1
)F
1
F
2
FM: EtOAc-HCO
2
H-H
2
O (6:1:1),
revelador anisaldeído sulfúrico.......................................................................................70
23: Coluna AMB-FLO da fração aquosa. Em destaque a fração F
1
.
FM: EtOAc-HCO
2
H-
H
2
O (5:1:1), revelador anisaldeído sulfúrico...................................................................71
24: Espectro de
1
H-RMN (400 MHz, CDCl
3
) dos cristais (F
1
).........................................72
LISTA DE QUADROS
1: Posição sistemática da espécie Passiflora actinia segundo Engler e Cronquist ........31
x
LISTA DE TABELAS
1: Etapas de otimização da metodologia de CLAE para extratos e frações
de P. actinia....................................................................................................................51
xi
ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
No presente trabalho foi adotado o Sistema Internacional de pesos e medidas.
λ
Comprimento de onda
°C Grau Celsius
% Porcentagem
µ Micra
µg Micrograma
CA Campo aberto
CC Cromatografia em coluna
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CDCl
3
Clorofórmio deuterado
CHCl
3
Clorofórmio
CH
3
CN Acetonitrila
CH
3
CO
2
H Ácido acético
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
COSY COrrelated SpectroscopY
CV Coluna à vácuo
D
2
O Água deuterada
DCM Diclorometano
δ Delta
EtOAc Acetato de etila
EtOH Etanol
FM Fase móvel
GABA Ácido g-aminobutírico
g Grama
h Hora
1
H-RMN Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
H
2
O Água
xii
HCl Ácido clorídrico
HCO
2
H Ácido fórmico
HDL Lipoproteínas de alta densidade
HPLC
High performance liquid chromatography
HPTLC
High performance thin layer chromatography
i. p.
Intraperitonial
J
Constante de acoplamento
LCE Labirinto em cruz elevada
LDL Lipoproteína de baixa densidade
MeOD Metanol deuterado
MeOH Metanol
min Minuto
mg Miligrama
ml Mililitro
mm Milímetro
MS Espectrometria de massa
nm Nanômetro
n-BuOH Fração n-butanol
p.e. Ponto de ebulição
p/p Peso/peso
R
f
Relação de frente
ppm Parte por milhão
RMN Ressonância Magnética Nuclear
SNC Sistema Nervoso Central
t
r
Tempo de retenção
UV Ultravioleta
v.o.
Via oral
xiii
RESUMO
O maracujá é constituído por diversas espécies do gênero Passiflora, cujas
folhas são utilizadas como sedativo e calmante na forma de extratos, tinturas infusos e
decoctos. A espécie Passiflora actinia Hook., conhecida popularmente como maracujá-
do-mato, é uma espécie nativa da região Sul do Brasil. Seus estudos químicos e
farmacológicos são ainda escassos, sendo o objetivo dessa dissertação de mestrado
contribuir para o conhecimento dessa espécie. Os extratos, fluido e metanólico
desclorofilado, analisados em CLAE apresentaram pico com tempo de retenção
semelhante ao do padrão isovitexina, que também está presente em grande quantidade
na espécie P. incarnata. As frações mais polares (n-BuOH e aquosa) apresentaram em
estudos anteriores resultados que sugerem a existência de potencial ansiolítico e
sedativo em ratos, sendo que o isolamento de substâncias presentes nessas frações,
juntamente com biomonitoramento foi um dos objetivos desse trabalho. A fração n-
BuOH, constituída majoritariamente por flavonóides, possui isovitexina, mas orientina e
vitexina estão ausentes. Outros flavonóides estão presentes nas frações, mas não
puderam ser isolados e identificados. Parte da fração aquosa do extrato metanólico
desclorofilado foi submetida à acetilação, de onde foi isolada uma substância e,
identificada por
1
H e
13
C-RMN como glicerol. As separações de substâncias ativas das
frações polares utilizando cromatografia em coluna com Sílica Gel 60G, Sephadex LH-
20 e Amberlite XAD-16 não foram bem sucedidas, demonstrando a dificuldade de
isolamento de constituintes ativos do maracujá, fato já experimentado por outros
pesquisadores.
xiv
ABSTRACT
The passion fruit is constituted by several species from the genus Passiflora,
whose leaves are used as sedative and to calm down in the form of extracts, tinctures,
infusion and decocts. The species Passiflora actinia Hook., known popularly as
"maracujá-do-mato", is a native species of the South area of Brazil. Its chemical and
pharmacological studies are still scarce, being the objective of the dissertation to
contribute for the knowledge of that species. The extracts fluid and methanolic free from
chlorophyl analyzed by HPLC presented pick with retention time similar to the
isovitexina, which is also present in great amount in the species P. incarnata. The most
polar (n-BuOH and aqueous) fractions presented in previous studies results that suggest
the existence of potential anxiolitic and sedative activities, in mice, being the isolation of
active compounds in those fractions through bioassay, was one of the objectives of that
work. The fraction n-BuOH, constituted mainly of flavonoids, contain isovitexin but
orientin and vitexin are absent. Other flavonoids are present in the fractions, but they
could not be isolated and identified. Part of the aqueous fraction of the methanolic
extract free from chlorophyl was submitted to the acetilation, from where a compound
was isolated and identified for
1
H- and
13
C-RMN as glycerol. The separation of active
compounds from the polar fractions using column chromatography with Silica Gel 60G,
Sephadex LH-20 and Amberlite XAD-16 was not successful, demonstrating the difficulty
already experienced for other researchers when trying to isolate active compounds from
the passion fruit leaves.
1
INTRODUÇÃO
Plantas, animais e minerais têm sido usados por toda a civilização humana na
História para fazer remédios. As civilizações primitivas cedo se aperceberam da
existência, ao lado das plantas comestíveis e de outras dotadas de maior ou menor
toxicidade que, ao serem experimentadas no combate à doença, revelaram, embora
empiricamente, o seu potencial curativo. No Brasil, as plantas eram usadas pelos povos
indígenas em rituais de cura, da mesma maneira que os povos africanos faziam sua
associação com rituais religiosos (Ferro, 2006). Registros escritos como os antigos
hieróglifos egípcios e manuais chineses de fitoterapia descrevem o uso extensivo de
produtos naturais para fins medicinais e a natureza continua a ser o maior recurso de
medicamentos em todo o mundo (Polunin e Robbins, 1992).
Um século atrás, muitas drogas eram derivadas de plantas. Drogas sintéticas
somente apareceram no mercado no final do Século XIX. Apesar de todo o progresso
no desenvolvimento de novas drogas sintéticas, os fármacos naturais nunca perderam
totalmente a sua importância. De fato, no final do Século XX, eles conquistaram
novamente popularidade, devido às substâncias sintéticas apresentarem grandes
efeitos colaterais (Wichtl, 2004).
As plantas são fontes importantes de produtos naturais biologicamente ativos,
muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número de
medicamentos (Nodari e Guerra, 2003).
Para a obtenção de novos fármacos existem três tipos de abordagem que são
utilizadas há muito tempo e podem ser aplicadas até o momento. São elas: a
2
tradicional, a empírica e a molecular. A tradicional utiliza as informações obtidas (erros
e acertos) pelas diversas culturas e sistemas de medicina. Muitas drogas como a
morfina e a quinina são exemplos de drogas descobertas pela abordagem tradicional. A
empírica se baseia no entendimento de processos fisiológicos e frequentemente utiliza
moléculas naturais modelos, que servem de base para o desenvolvimento de outras
moléculas ativas. Exemplos incluem a tubocurarina e outros relaxantes musculares,
propanolol e outros antagonistas de receptores β-adrenérgicos. A abordagem molecular
se baseia no conhecimento do local de ação para o agente terapêutico (Harvey, 1999).
Para a obtenção de novos fármacos, dois aspectos distinguem os produtos de
origem natural dos sintéticos: a diversidade estrutural e a função biológica. A
diversidade estrutural dos produtos naturais é muito superior àquela derivada dos
produtos de síntese sendo esse fato muito útil na abordagem molecular quando se
utiliza a metodologia de seleção ao acaso. Além disso, existem em uma mesma planta
substâncias de mesmo grupo químico, com similaridade estrutural, possibilitando uma
maior chance de descobrimento de informações sobre estrutura-atividade. Esses fatos
possibilitam que as substâncias químicas presentes nas plantas possam vir a se tornar
fármacos em potencial para as mais diferentes moléstias (Harvey, 1999; Nodari e
Guerra, 2003).
Muitos dos nossos medicamentos atuais são derivados de plantas. A
porcentagem de drogas derivadas de produtos naturais era de 40% no ano de 2000,
mantendo-se aproximadamente constante nos anos seguintes (Butler, 2004). Exemplos
de drogas importantes obtidas de plantas são: morfina, um potente analgésico derivado
do ópio (Papaver somniferum, Papaveraceae); digoxina, um medicamento para
3
congestão cardíaca derivado da digital (Digitalis spp., Scrophulariaceae); o
antihipertensivo reserpina, derivado da ralwolfia (Rauvolfia serpentina, Apocynaceae);
quinina e quinidina, substâncias antimalária derivadas da Cinchona spp., Rubiaceae;
vincristina e vimblastina, anticâncer derivados da Catharanthus roseus, Apocynaceae;
atropina da Atropa belladona, Solanaceae (Cass, 2004; Rates, 2001) e o taxol,
anticâncer conhecido pelo nome genérico Paclitaxel, que é um diterpenóide oxigenado
complexo isolado da árvore teixo-do-pacífico, Taxus brevifolia, Taxaceae. Essa
substância foi isolada durante um árduo trabalho de screening de diferentes plantas
antineoplásicas no final da década de 60 por um grupo de pesquisadores através de
abordagem sistemática. Mais tarde, foi isolado em várias outras espécies do gênero
Taxus (incluindo Taxus wallichiana), onde já foram isolados mais de 300 taxóides. O
taxol como fármaco foi desenvolvido pelo National Cancer Institute nos Estados Unidos.
Em 1992, a Bristol–Myers–Squibb recebeu a aprovação para comercializar o taxol para
o tratamento de câncer de ovário refratário, de mama metastático, câncer de pulmão e
sarcoma de Kaposi. Um derivado semisintético do taxol, o taxotere, é conhecido
atualmente como uma droga anticâncer melhor que o taxol (Srivastava et al., 2005).
Apesar de todas as técnicas analíticas disponíveis a maioria das espécies de
plantas não são investigadas quimicamente e biologicamente com grandes detalhes, e,
até mesmo plantas medicinais bem conhecidas necessitam de mais estudos clínicos
(Phillipson, 2003). Para a pesquisa de novas drogas derivadas de produtos naturais
continuarem sendo competitivas com outros métodos de descoberta de fármacos se faz
necessário um aumento na velocidade dos processos de estudos prévios, isolamento e
elucidação estrutural (Butler, 2004).
4
O conhecimento da biodiversidade vegetal, além de ser considerado uma fonte
de modelos químicos para a síntese de novas moléculas, também deve ser incentivado
como um recurso natural com possível atividade na forma de fitoterápico padronizado,
eficiente e seguro (Simões e Schenkel, 2002).
A partir das últimas décadas do século XX houve um aumento no uso dos
fármacos vegetais em substituição aos medicamentos sintéticos. A Organização
Mundial da Saúde (OMS) estima que 80% da população acredita e tem confiança em
plantas medicinais para o tratamento de sintomas e patologias diversos. Na grande
maioria dos casos, o uso dos medicamentos sintéticos é o melhor tratamento, mas,
quando apropriadamente utilizadas, as plantas medicinais podem ser a escolha correta.
Apesar de nem sempre ser verdade, a população tem descoberto que os fármacos
naturais frequentemente podem ser seguros, efetivos e mais baratos em relação aos
fármacos comerciais. Algumas das vantagens são: o menor grau de efeitos colaterais, o
sinergismo entre os componentes químicos presentes na planta que podem atuar em
diferentes sintomas ao mesmo tempo e a atuação das plantas como um agente de
equilíbrio na fisiologia do indivíduo e não somente no sintoma específico. Muitas vezes
os resultados clínicos com a utilização de plantas medicinais tende a ser mais lento e
gradativo do que com os fármacos tradicionais (Cass, 2004).
A seleção de plantas com possível poder farmacológico depende de diversos
fatores que incluem: conteúdo químico, toxicidade e uso tradicional pela população em
diferentes culturas, que é conhecido como etnobotânica, mais especificamente
etnofarmacologia (Rates, 2001). Esta constitui um desdobramento da etnobotânica e
estuda os remédios simples ou compostos, produzidos a partir de vegetais, envolvendo
5
sempre o objetivo de corrigir problemas de saúde, tanto da ordem física, como mental
ou espiritual (Camargo, 2003). Um exemplo é o maracujá, cuja droga é constituída por
diversas espécies do gênero Passiflora, da família Passifloraceae. Passiflora incarnata
Linn. e outras espécies do gênero (P. alata Curtis; P. coerulea Linn. , P. edulis Sims, P.
edulis Sims f. flavicarpa Degener), são amplamente usadas na medicina tradicional por
toda a Europa e nas Américas por suas propriedades sedativas e ansiolíticas.
Passiflora incarnata é a espécie oficial em Farmacopéias de diversos países, como
Suíça, França, Egito, Alemanha (Dhawan et al., 2001a). Esta espécie cresce em solos
secos e pobres não se adaptando bem ao clima tropical brasileiro, além de seu fruto
possuir sabor amargo, fatos que podem justificar a sua pequena difusão no Brasil
(Moraes, 1995; Pereira et al., 2004).
A espécie de maracujá oficializada pelas três primeiras edições da Farmacopéia
Brasileira é Passiflora alata Curtis (Da-Silva, 1926; Farmacopéia, 1959; Farmacopéia,
1977) indicando as folhas como parte utilizada. Os extratos desta espécie estão
incluídos em diversas preparações farmacêuticas registradas, apesar dos poucos
estudos químicos e farmacológicos existentes. O desenvolvimento de metodologias
para o controle de qualidade das drogas e das preparações farmacêuticas existentes se
faz necessário, tanto para a espécie oficial nas Farmacopéias Brasileiras, como para as
outras espécies nativas do Brasil.
6
Considerações Botânicas
Gênero Passiflora
A família Passifloraceae compreende cerca de dezoito gêneros e seiscentas e
trinta espécies, sendo os gêneros com o maior número de espécies o Passiflora (400
espécies) e Adenia (100 espécies). As do gênero Passiflora estão distribuídas
principalmente em regiões tropicais e sub-tropical mas se desenvolvem melhor no
clima temperado das Américas e África (Cronquist, 1981; Judd et al., 1999). São
plantas escandentes, herbáceas ou lenhosas e possuem gavinhas, as quais são ramos
modificados, podendo ainda ser detectada a presença de nectários extraflorais
(Barroso, 1978)
Das quatrocentas espécies conhecidas de Passiflora, trinta são descritas por
terem frutos comestíveis. Somente poucas espécies alcançaram desenvolvimento
comercial (Pereira e Vilegas, 2000).
O nome Passiflora é atribuído ao significado místico das características físicas
de suas flores, nas quais os escritores do século XVI interpretaram suas diferentes
partes como representando os símbolos da Paixão de Cristo. O nome Passiflora
provém do latim passio, o equivalente a paixão e flos oris o equivalente a flor. Por essa
razão, esses vegetais são conhecidos na Europa e América do Norte como flor-da-
paixão (Alonso, 1998; Barroso, 1978; Freitas, 1985).
Dentre as várias plantas com atividade farmacológica conhecida, destacam-se
algumas espécies do gênero Passiflora, conhecido popularmente no Brasil como
maracujá (no Brasil termo originado do tupi guarani muruku’ia, que significa comida feita
7
em cuia, numa alusão aos frutos édulos do vegetal) (Moraes, 1995), cujas partes
aéreas são empregadas medicinalmente por suas propriedades sedativas,
antiespasmódica e ansiolítica (Zuanazzi e Montanha, 2003). Desde 1867, é parte da
medicina clássica como sedativo em caso de insônia e irritabilidade (Freitas, 1985).
Considerações químicas
Os estudos referentes à composição química de diversas espécies de Passiflora
evidenciam principalmente os alcalóides e flavonóides. Entretanto, outras substâncias
como glicosídeos cianogênicos (Seigler et al., 1982), maltol (Aoyagi et al., 1974),
aminoácidos (Gavasheli et al., 1974), antocianidinas (Kidoy et al., 1997) e glicosídeos
fenólicos (Chassagne et al., 1997) também são frequentemente citadas na literatura. A
literatura atual revela um grande número de estudos químicos para a Passiflora
incarnata e Passiflora edulis, mas para as outras espécies os estudos são poucos no
que diz respeito aos aspectos químicos (Dhawan et al., 2004). Juntamente com as duas
espécies citadas, em torno de apenas quarenta outras espécies foram fitoquimicamente
investigadas desde os anos 60 (Abourashed et al., 2002). Saponinas são uma classe
de substâncias químicas também citadas, apesar de poucos os artigos ao seu respeito
para o gênero Passiflora.
Glicosídeos cianogênicos
Folhas, raízes, caule e arilo de sementes imaturas são as partes das plantas com
maior quantidade de substâncias cianogênicas (Seigler, 1975; Seigler et al., 1982).
8
A distribuição dos glicosídeos cianogênicos no gênero Passiflora apresenta
variações distintas para cada nível de subgênero (Jaroszewski et al., 2002).
A maioria dos glicosídeos cianogênicos relatados na literatura são da espécie P.
edulis. Em P. incarnata foi encontrado o glicosídeo cianogênico ginocardina (1). Esse
não é um glicosídeo cianogênico típico do gênero, visto que outras espécies que foram
estudadas não possuíam tal substância (Spencer e Seigler, 1984).
O
O
HO
HO
HO
HO
CN
OH
OH
1
Alguns frutos imaturos de espécies de Passiflora (ex. P. adenopoda) podem ser
tóxicos e até fatais quando ingeridos (Seigler et al., 1982).
Agliconas cianogênicas já foram relatadas na literatura, cuja concentração é bem
maior nos frutos imaturos que, por isso são tóxicas. O uso de chá das folhas deve ser
controlado devido aos riscos de intoxicação cianídrica conseqüente ao uso de doses
altas (Souza, 1991). Prunasina (2) foi relatado pela primeira vez em 1983 em folhas e
frutos de P. edulis Sims. e P. edulis Sims f. flavicarpa Degener (Spencer e Seigler,
1983).
CN
OH
O
OH
OH
OH
OH
2
9
Em 1996 menores quantidades de prunasina foram encontradas em P. edulis
Sims. Isso pode ser devido às diferenças de maturação do fruto e sua origem. Nas
cascas são encontradas as maiores concentrações de glicosídeos cianogênicos, sendo
80% dessas substâncias a prunasina (2) (Chassagne et al., 1996). Foram também
encontrados os glicosídeos passicoriacina (3), passicapsina (4), passibiflorina,
epipassicoriacina, epitetrafilina B (Dhawan et al., 2004), amigdalina (5), sambunigrina,
ramnopiranosil β-
D-glucopiranosídeo de mandelonitrila (Chassagne et al., 1996). O
glicosídeo cianogênico β-rutinosídeo de α-
L-ramnopiranosil-β-D-glucopiranosídeo de
mandelonitrila foi isolado de frutos de P. edulis (Chassagne e Crouzet, 1998).
O
O
HO
HO
HO
HO
NC
H
OH
O
O
HO
HO
HO
HO
O
O
OH
OH
OH
OH
NC
3 4
O
C H
CN
O
HO
HO
HO
O
O
HO
HO
HO
HO
5
Os glicosídeos cianogênicos geralmente têm a propriedade de proteger as
plantas de herbívoros e fitopatógenos (Francisco e Pinotti, 2000). A substância 4-
hidroxi-2-ciclopentenona (6) isolada de folhas de Passiflora tetraedra foi responsável
pela atividade antibacteriana frente a bactérias gram-positivas e gram-negativas
(Escherichia coli, Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa) (Perry et al., 1991).
10
O
HO
6
Analisando dezenove espécies de Passiflora foi possível identificar para as
espécies P. apetala, P. cuneata, P. indecora, P. murucuja e P. perfoliata o glicosídeo
passibiflorina contendo o resíduo 6-deoxi-β-
D-glucopiranosil (Jaroszewski et al., 2002).
Esses mesmos autores isolaram o glicosídeo passiguatemalina da espécie P.
guatemalensis.
Tetrafilina A e B, deidaclina e volkenina foram isolados de sementes de P. foetida
coletadas no oeste do Pacífico, nas Ilhas Galápagos. Quando coletadas no “Reunion
Island” foram identificados os glicosídeos tetrafilina B, sulfato de tetrafilina B e volkenina
juntamente com um glicosídeo derivado da valina chamado linamarina (Andersen et al.,
1998). Em 1982, uma mistura epimérica de sulfatos de tetrafilina B e epitetrafilina B foi
isolada de Passiflora caerulea e P. alato-caerulea (Seigler et al., 1982).
Alcalóides
Os alcalóides são um grupo de substâncias químicas presente em plantas
medicinais com grande importância no desenvolvimento de novas drogas. Isso se deve
provavelmente à variedade de estruturas químicas possíveis, que podem ser os
responsáveis pelas respostas farmacológicas dos alcalóides presentes nas plantas
(Elizabetsky e Costa-Campos, 2006).
11
Os alcalóides já encontrados no gênero Passiflora são do tipo indólicos simples,
derivados do sistema β-carbolina. Conhecidos como β-carbolinas ou alcalóides β-
carbolínicos, o mecanismo de reação sugerido para a sua formação se dá por meio da
condensação de Pictet-Spengler (Esquema 1) entre a triptamina e um aldeído. A
triptamina reage com um aldeído, formando a base de Schiff, que por sua vez, por meio
da reação do tipo Mannich, o carbono α age como um nucleófilo para formar o
alcalóide. A aromaticidade é restaurada por tautomerismo. Posteriormente, por
oxidação forma-se a substância com esqueleto β-carbolina, conforme o esquema a
seguir (Cordell, 1981).
N
H
NH
2
N
H
N
CH
3
C
O
H
CH
3
N
NH
CH
3
H
H
H
N
H
NH
CH
3
N
H
N
CH
3
Esquema 1: Formação dos alcalóides β-carbolínicos a partir da condensação de Pictet-
Spengler
Os alcalóides do tipo harmana (alcalóides indólicos) tem sido alvo de interesse
desde o início do século devido as suas diversas propriedades farmacológicas. Os
alcalóides harmana (7), harmina (8), harmalina (9), harmalol (10) e harmol (11) foram
detectados em P. incarnata primeiramente na década de 60 (Lutomski, 1959).
12
Posteriormente (década 70), utilizando um método mais seletivo, detectou-se somente
harmana (7) e os outros alcalóides não foram encontrados. A concentração encontrada
foi tão baixa, que não se pode afirmar que os alcalóides são os princípios ativos
responsáveis pelas atividades farmacológicas do maracujá (Löhdefin e Kating, 1974;
Poethke et al., 1970).
N
N
H CH
3
N
N
H CH
3
H
3
CO
N
N
H CH
3
H
3
CO
7 8 9
N
N
H CH
3
HO
N
N
H CH
3
HO
10 11
Speroni e Minghetti (1988) realizaram determinação do teor de harmana por
HPLC em um extrato fluido de P. incarnata e observaram que a sua quantidade não
excedia 0,01 µg/ml no extrato. Considerando que a concentração de extrato que
apresentava atividade farmacológica era de 160 g/kg, a quantidade de harmana
presente na dose correspondia a negligenciável quantia de 40 ng/kg. Na dose de 4
mg/kg de harmana, os ratos não apresentavam atividade sedativa, concluindo-se que o
alcalóide harmana não pode ser o responsável pela atividade farmacológica.
13
Em 1995, um estudo realizado com amostras comerciais de Passiflora incarnata,
sendo duas das amostras com coleta de trinta anos atrás, não apresentou nenhum dos
alcalóides citados anteriormente, com exceção de uma amostra que detectou um teor
de harmana de aproximadamente 0,1 ppm. Imaginou-se que o conteúdo de alcalóides
possa ter mudado devido ao modo de cultivo da planta, mas, como as amostras de
trinta anos atrás foram também negativas, esta hipótese pode ser desconsiderada. Os
autores sugerem que a análise de alcalóides na rotina de controle de qualidade de
Passiflora incarnata não se faz necessária (Rehwald et al., 1995).
Flavonóides
Os flavonóides estão amplamente distribuídos no Reino Vegetal. Estão
presentes em abundância em Angiospermas, apresentando nesse grupo, enorme
diversidade estrutural (Zuanazzi e Montanha, 2003).
Os flavonóides são capazes de modular a atividade de enzimas e afetar o
comportamento de muitos sistemas celulares, sugerindo que muitas substâncias podem
possuir efeitos anti-hepatotóxico, antialérgico, antiinflamatório, antiosteoporótico a até
antitumoral (Carlo et al., 1999).
Os flavonóides são biosintetizados por vias combinadas do ácido chiquímico e
policetídeos. O ácido cinâmico (derivado fenil propanóide), sintetizado pela via do ácido
chiquímico, atua como o iniciador na síntese da porção policetídica, no qual são
incorporados três resíduos de acetato. A partir daí segue-se o fechamento do anel.
Ocorrem então hidroxilações e reduções subseqüentes que formarão as diferentes
classes de flavonóides existentes nas plantas (Carlo et al., 1999).
14
Devido às diversas atividades farmacológicas que os flavonóides apresentam,
sua identificação e quantificação têm sido estudadas extensivamente (Pietta et al.,
1989).
Segundo Harborne (1988) citado por Pereira e Vilegas (2000), aproximadamente
cinquenta flavonóides C-glicosídeos foram encontrados nas folhas de espécies da
família Passifloraceae.
Os principais flavonóides descritos para o gênero Passiflora são os C-glicosídeos
derivados da apigenina (12) e luteolina (13), sendo orientina (14), isoorientina (15)
derivados da luteolina e vitexina (16), isovitexina (17), shaftosídeo (18) e swertisina (19)
derivados da apigenina (Geiger e Markham, 1986) os mais frequentemente
encontrados. Nesses flavonóides os açúcares estão ligados ao núcleo aromático por
uma ligação carbono-carbono, resistente à hidrólise ácida (Zuanazzi e Montanha,
2003).
O
OOH
HO
OH
O
OOH
HO
OH
OH
12 13
O
O
OH
HO
OH
glu
OH
O
O
OH
HO
OH
OH
glu
14 15
15
O
OOH
HO
OH
glu
O
O
OH
HO
OH
glu
16 17
O
OOH
ara
HO
glu
OH
O
OOH
H
3
CO
glu
OH
18 19
Os estudos a respeito da composição flavonoídica de Passiflora foram realizados
em sua maioria para a espécie P. incarnata. Orientina, isoorientina, shaftosídeo,
isoshaftosídeo, isovitexina-2”-O-glucopiranosídeo, isoorientina-2”-O-glucopiranosídeo,
isovitexina, vitexina, swertisina, isoscoporamina-2”-O-glicosídeo, vicenina-2, lucenina-2,
apigenina-6-glucosil-8-β-
D-ribofuranosídeo já foram detectados em espécies de
Passiflora (Abourashed et al., 2002; Geiger e Markham, 1986; Li et al., 1991; Marchart
et al., 2003; Quercia et al., 1978; Raffaelli et al., 1997; Rahman et al., 1997; Rehwald et
al., 1994).
As substâncias isovitexina, 2”-xilosilvitexina, luteolina-7-O-glicosídeo foram
isoladas de P. pittieri, e uma mistura de vicenina-2, shaftosídeo e isoshaftosídeo foi
identificada. Da espécie P. ambigua apenas o flavonóide sapogerina foi obtido
(Ulubelen et al., 1982).
16
A espécie P. alata teve o flavonóide 2”-xilosilvitexina isolado em grande
quantidade de extrato das suas folhas, mas, apenas pequenas quantidades de vitexina,
isovitexina e orientina foram isolados. Isoorientina também já foi identificado na espécie
(Freitas, 1985; Ulubelen et al., 1982).
Passiflora edulis foi descrita como sendo rica em glicosídeos que incluem
luteolina-6-C-chinovosídeo e luteolina-6-C-fucosídeo (Mareck et al., 1991). Vitexina,
isovitexina e orientina foram detectados por CCD (Freitas, 1985) e HPLC (Moraes,
1995).
O O-glicosídeo rutina (20) foi detectado pela técnica de HPLC (comparação de
tempo de retenção, enriquecimento do extrato com padrões e comparação dos
espectros de UV com o dos padrões) nas espécies P. edulis e P. alata (Moraes, 1995).
Hiperosídeo já foi detectado em P. incarnata (Pietta et al., 1986; Pietta et al., 1989).
O
OOH
HO
OH
OH
O rham-glu
20
Os flavonóides constituem atualmente os melhores marcadores de controle de
qualidade de medicamentos fitoterápicos, pois através deles é possível identificar
muitas espécies de Passiflora (Bokstaller e Schmidt, 1997; Li et al., 1991; Quercia et al.,
1978), sendo que o desenvolvimento de novos métodos analíticos para análise dos
flavonóides se faz necessário (Muller et al., 2005).
Os dados encontrados na literatura sobre a quantificação dos flavonóides são
contraditórios, pois a fração flavonoídica está sujeita a variação no seu conteúdo que
17
pode ser devido à época da colheita, ao local de cultivo ou à metodologia de análise
empregada (Li et al., 1991). Um trabalho realizado com P. incarnata que teve como
objetivo determinar a variação do conteúdo de flavonóides nos vários estágios de
desenvolvimento da planta, mostrou uma maior concentração dessas substâncias nos
períodos que antecedem a floração até o período de floração do vegetal sendo ainda
que o maior conteúdo de isovitexina foi encontrado nas folhas. O conteúdo total de
flavonóides foi expresso em % de isovitexina (Menghini e Mancini, 1988).
O conteúdo de flavonóide diminui rapidamente durante o período de estocagem,
por isso deve-se preparar os medicamentos utilizando folhas de P. incarnata logo após
a colheita (Menghini e Mancini, 1988).
Um dos métodos de quantificação para flavonóides freqüentemente utilizados é a
análise espectrométrica de complexos formados com adição de cloreto de alumínio
após hidrólise e extração com acetato de etila. Seu cálculo é feito baseado na leitura de
absorvância no ultravioleta. Os C-glicosídeos resistem à hidrólise ácida e
conseqüentemente não são determinados através do método clássico da
espectrometria (Petry et al., 1998; Rehwald et al., 1994).
Estudos têm demonstrado que cromatografia líquida é um método eficiente para
análise qualitativa e quantitativa de flavonóides C-glicosídeos presentes em espécies
de maracujá (Petry et al., 1998).
Um método utilizando cromatografia líquida, apropriado e reprodutível para
análise quantitativa e qualitativa de extratos fluidos de P. alata e P. incarnata e para
diferenciação de espécies foi desenvolvido. Os extratos fluido das folhas de P. alata
apresentaram isovitexina (0,018 mg/ml) e apenas traços de vitexina. Um extrato fluido
18
comercial de P. incarnata foi analisado, apresentando 1,198% de isovitexina. Apesar da
presença do mesmo flavonóide nas duas espécies, o perfil cromatográfico observado
foi diferente. Esse mesmo trabalho demonstrou que diferença de estação do ano (verão
e inverno) altera a concentração de flavonóides, sendo que no inverno a concentração
é menor, sem entanto alterar o seu perfil cromatográfico (Muller et al., 2005).
HPTLC também tem sido empregado na quantificação de flavonóides em folhas
de espécies de Passiflora. Uma metodologia HPTLC padronizada possibilitou a
quantificação das dez substâncias majoritárias do extrato metanólico de P. coerulea
(Pastene et al., 1997).
As C-glicosilflavonas dos diversos gêneros de Passiflora geralmente ocorrem
como isômeros (Pereira e Vilegas, 2000), e já existem maneiras de diferenciá-los. Uma
delas é utilizar técnicas HPLC-CID/MS para produzir pseudos espectros MS/MS que
fornecem dados de fragmentação incluindo medidas exatas de massa para diferenciar
os pares vitexina/isovitexina e orientina/isoorientina de extratos de Passiflora (Pereira et
al., 2005).
Saponinas
Atualmente, as saponinas também estão sendo estudadas. Segundo Reginatto
et al. (2001), isso se deve ao fato de que muitas das atividades terapêuticas, ou até
substâncias alérgicas presentes nos extratos de Passiflora são ainda desconhecidas.
Saponinas já foram relatadas em P. quadrangularis (Orsini et al., 1987; Orsini et
al., 1986) da qual foi isolada pela primeira vez a saponina quadrandulosídeo (21), em P.
edulis (Bombardelli et al., 1975; Yoshikawa et al., 2000a; Yoshikawa et al., 2000b) e em
19
P. alata (Reginatto et al., 2001) podendo ser este grupo de substâncias químicas
altamente polares a grande aposta em relação aos responsáveis pelo potencial
farmacológico sedativo e ansiolítico do gênero. Passiflorina (22) foi encontrado em P.
edulis em 1975 (Bombardelli et al., 1975).
Cinco glicosídeos foram isolados de folhas de Passiflora alata (3-O-β-D-
glicopiranosil-estigmasterol, ácido 3-O-β-D-glicopiranosil-oleanólico, ácido 3-O-β-D-
glicopiranosil-(1→3)-β-D-glicopiranosil-oleanólico, ácido 3- O-β-D-glicopiranosil-(1→2)-
β-D-glicopiranosil-oleanólico e 9,19-ciclolanost-24-Z-en-3β,21,26-tri-hidroxi-3,26-di-O-
gentiobiose (quadrangulosídeo) (Reginatto et al., 2001).
Reginatto em 2004 desenvolveu uma metodologia por HPLC com detecção em
UV com o objetivo de quantificar quadrangulosídeo (21), a saponina em maior
quantidade em folhas de Passiflora alata. A quantidade de quadrangulosídeo presente
no extrato aquoso de folhas de P. alata foi estimada em 22% p/p correspondendo a
0,8% (p/p) em relação às folhas secas (Reginatto et al., 2004).
RO
CH
2
OR
HOH
2
C
R= gentiobiosideo
HO
OH
H
O
OH
OH
CO
2
-β-
D
-glu
21 22
20
Considerações farmacológicas
A atividade sedativa pode ser definida pela redução da atividade locomotora e
diminuição do nível de vigilância, útil para aliviar estados de excitação excessiva. O
efeito hipnótico, diferente da sedação, é capaz de induzir e manter o sono de uma
pessoa por certo período de tempo (Guimarães, 1999). É difícil estabelecer distinção
entre os estados patológico e normal de uma ansiedade; todavia, a despeito desta
imprecisão, os agentes ansiolíticos estão entre as substâncias prescritas com maior
freqüência e utilizadas por mais de 10% da população na maioria dos países
desenvolvidos (Rang et al., 2001).
As classes mais comuns de agentes ansiolíticos são os agonistas dos receptores
5-HT que foram recentemente introduzidos, mostrando atividade ansiolítica com pouca
sedação, barbitúricos que atualmente são obsoletos como agentes ansiolítico/sedativo,
antagonistas dos receptores β-adrenérgicos utilizados freqüentemente para reduzir os
sintomas físicos de ansiedade (tremor, palpitação) e benzodiazepínicos (23) que é a
classe mais importante para esta finalidade terapêutica (Rang et al., 2001). O
benzodiazepínico diazepam é o derivado 7-cloro-1-metil, e o flunitrazepam é o derivado
2’-flúor-1-metil-7-nitro.
4'
3'
6'
2'
5'
N
N
O
R
1
4
3
2
6
7
8
9
23
21
Os efeitos indesejáveis destes medicamentos variam desde efeitos tóxicos,
resultantes de superdosagem aguda, efeitos colaterais do uso terapêutico normal
(sonolência, confusão, amnésia, comprometimento da coordenação) tolerância e
dependência (Carlini, 2003; Rang et al., 2001). Isso significa que o uso destes
medicamentos deve ser realizado com cautela (Shinomiya et al., 2005).
Por outro lado, existem diversas drogas vegetais que são utilizadas pela
medicina tradicional e popular como ansiolíticas e sedativas como Melissa officinalis L.,
Lamiaceae; Tilia europaea L., Tiliaceae; Hypericum perforatum L., Clusiaceae;
Matricaria recutita L., Asteraceae; e Passiflora sp. (Coleta et al., 2001; Loggia et al.,
1981; Shinomiya et al., 2005).
Apesar do seu uso popular e da presença de diversos constituintes químicos no
gênero Passiflora, apenas poucos artigos considerando investigações farmacológicas
estão disponíveis. Destes, a maioria dos estudos farmacológicos tem sido realizado no
intuito de verificar os efeitos depressivos no sistema nervoso central (SNC) (Dhawan et
al., 2004).
Alguns aspectos bioquímicos também têm sido avaliados por pesquisadores em
modelos animais. Estudos com ratos em relação ao ganho de peso e aos parâmetros
bioquímicos (colesterol total, HDL-colesterol, LDL-colesterol, triacilglicerídeos,
glutationaperoxidade, atividade da superóxido desmutase, proteínas totais, ganho de
peso e glucose) após administração de 1000 mg/kg do chá das folhas (3x por semana-
15 dias) foram realizados. O único parâmetro que apresentou alteração significativa foi
HDL-colesterol, sem modificar a concentração de colesterol total, sugerindo ser o
extrato de P. alata cardioprotetor e antiaterogênico (Doyama et al., 2005).
22
Vários tipos de testes podem ser utilizados para medir a atividade ansiolítica em
modelos animais. Um rato em ambiente não familiar normalmente responde ao
permanecer imóvel, porém alerta (“supressão comportamental”) por algum tempo, o que
pode representar uma ansiedade produzida pelo ambiente estranho. Este estado de
imobilidade é reduzido se forem administrados fármacos ansiolíticos (Rang et al., 2001)
O modelo experimental Labirinto em Cruz Elevado (LCE) é um modelo utilizado
em estudos recentes para detecção de efeitos ansiolíticos em várias espécies de
Passiflora em roedores. Neste teste, dois braços da cruz são fechados, enquanto os
outros dois são abertos. Em estado normal, os ratos passam a maior parte do seu
tempo nos braços fechados e evitam os braços abertos (com medo de caírem). A
administração de agentes ansiolíticos aumenta o tempo em que os animais ficam nos
braços abertos e também aumenta a mobilidade dos ratos, a julgar pela freqüência que
atravessam o cruzamento (Handley e Mithani, 1984; Rang et al., 2001). Outro teste
utilizado é o do Campo Aberto (CA). Durante o período do teste são observados os
seguintes aspectos: freqüência de locomoção ou número de cruzamentos (número de
quadrantes percorridos) e o número de levantamentos ou rearings (levantamento do
animal sobre as patas traseiras) (Royce, 1977).
Os derivados das pironas maltol (24) e etil maltol (25) isolados da Passiflora
incarnata, causaram efeitos depressores em estudo com camundongos.
O Me
OH
O
O Et
OH
O
24 25
23
Maltol causou potencialização do sono induzido por hexobarbital, ação
anticonvulsivante em altas doses e diminuição da atividade locomotora em doses
baixas. Etil maltol apresentou as mesmas ações, com maior poder anticonvulsivante e
menor poder inibidor dos efeitos na atividade locomotora (Aoyagi et al., 1974). Análogos
estruturais do maltol foram avaliados farmacologicamente, e verificou-se que dois deles,
ácidos 2-butil (26) e 2-isobutilpiromecônico (27) apresentaram efeito anticonvulsivante
superior que ao maltol (Kimura et al., 1980).
O
O
OH
(CH
2
)
3
CH
3
H
O
O
OH
CH
2
H
CH
CH
3
H
3
C
26 27
O flavonóide vitexina foi investigado farmacologicamente em relação ao seu
poder hipotensivo, antiinflamatória e antiespasmódico (propriedades não específicas).
Os efeitos da atividade hipotensiva da vitexina foram atribuídos às propriedades
bloqueadoras dos gânglios e, as atividades antiinflamatórias, às propriedades anti-
histamínicas, antibradicinina e anti-serotonina (Prabhakar et al., 1981). Os flavonóides
vitexina e isovitexina foram utilizados em testes neurofarmacológicos sendo que
nenhum apresentou efeito nas doses de 5,0 e 10,0 mg/kg (Speroni e Minghetti, 1988).
Em relação à Passiflora alata, droga oficial na Farmacopéia Brasileira, os
estudos farmacológicos iniciaram-se apenas em 1984. O efeito do extrato bruto (extrato
fluido preparado segundo Farmacopéia Francesa VIII) de P. alata foi avaliado sobre o
SNC de ratos. Depois de evaporado e contendo princípios flavonoídicos e alcaloídicos,
24
a administração i. p. do extrato fluido (75 e 150 mg/kg) reduziu a atividade motora
espontânea, prolongou o tempo de sono induzido por pentobarbital e aumentou o
tempo de latência das convulsões induzidas por pentilenotetrazol (Oga et al., 1984). Em
suas conclusões os pesquisadores sustentaram a idéia de que os alcalóides e
flavonóides podem ser os responsáveis pelos efeitos depressores desse maracujá.
Estudo comparativo da atividade ansiolítica de extratos hidroetanólicos das
folhas de P. alata e P. edulis mostrou ser P. edulis mais ativa farmacologicamente que
P. alata utilizando administração i. p. e o modelo de ansiedade LCE. Com metade da
dose (50 mg/kg) P. edulis apresentou efeitos ansiolíticos que só existiram para P. alata
na dose de 100 mg/kg. Nos resultados fitoquímicos P. edulis apresentou em torno de
duas vezes mais flavonóides que P. alata (Petry et al., 2001). Utilizando extratos
aquosos (1:10) de P. edulis (50, 100 e 150 mg/kg) e P. alata (100 e 150 mg/kg), esse
mesmo grupo de pesquisadores encontraram a mesma proporção de flavonóides (1:2)
entre as duas espécies, sugerindo que o solvente utilizado (sol. EtOH 40% ou H
2
O) não
altera qualitativamente a composição química dos extratos e nem a atividade
farmacológica (Paris et al., 2002). Utilizando o mesmo modelo de ansiedade v. o., com
extratos aquosos secos em "spray-dried", Reginatto et al. (2006) confirmaram os
resultados já observados no estudo anterior, além de estar de acordo com o uso
etnofarmacológico de Passiflora (extrato aquoso).
O extrato aquoso (20 e 40 mg/kg i. p.) de Passiflora edulis f. flavicarpa Degener,
promoveu depressão no SNC em camundongos (Vale e Leite, 1983). Os autores do
estudo apresentam indícios sugerindo que o principio ativo seja de natureza protéica ou
25
alguma molécula associada a proteínas, mas, deixando indefinida a classificação
farmacológica do(s) princípio(s) determinante(s) de sua ação psicofarmacológica.
Foram estudadas as propriedades neurofarmacológicos do extrato fluido de P.
incarnata. Na dose de 160 mg/kg estas propriedades foram evidentes, mas não pode
estar relacionado com a presença dos alcalóides harmana, pois este está presente no
extrato em quantidades mínimas (Speroni e Minghetti, 1988).
Em um estudo de caso, foram identificadas reações alérgicas em paciente que
manipulava P. alata, apesar de não se conhecerem os agentes causadores das
reações (Giavina-Bianchi et al., 1997).
O flavonóide crisina (28) foi identificado em Passiflora coerulea em 1990 (Medina
et al., 1990).
O
OOH
HO
28
Os seus efeitos farmacológicos foram avaliados juntamente com o diazepan,
droga reconhecidamente ansiolítica. Ambas as drogas (crisina 1 mg/kg e diazepan 0,3-
0,6 mg/kg), no teste de LCE, apresentaram resultados consistentes com ações
ansiolíticas. Em comparação ao diazepan, crisina possui ações ansiolíticas sem
indução da sedação ou relaxamento muscular, onde postularam ser a crisina um
monoflavonóide agonista parcial dos receptores benzodiazepínicos (Wolfman et al.,
1994). Contradizendo essa teoria, Speroni et al (1996), não identificou crisina em P.
coerulea e P. incarnata (limite de detecção 1 ppm) utilizando sistema de CLAE. Crisina
26
apresenta efeitos sobre o Sistema Nervoso Central (SNC), mas as doses necessárias
para se obter esses efeitos são muito maiores do que as detectadas nas duas espécies
de maracujá.
Os efeitos na mudança do comportamento em ratos foram avaliados quando
administrados intraperitonialmente os flavonóides crisina e apigenina (12), da P.
incarnata e Matricaria recutita respectivamente. Ambos flavonóides foram capazes de
reduzir a atividade locomotora em ratos (dose mínima de 25 mg/kg), enquanto que em
baixas doses (1 mg/ml) somente crisina demonstrou ser ativo como ansiolítico no
modelo de ansiedade claro-escuro. O efeito sedativo desses flavonóides não pode ser
atribuído a uma interação com os receptores GABA-benzodiazepínicos, visto que estes
estavam bloqueados por injeção prévia do antagonista benzodiazepínico flumazenil
(Zanoli et al., 2000).
Derivados semi-sintéticos das flavonas obtidos por introdução de halogênios,
grupos nitro, ou ambos, tiveram um aumento na afinidade pelos receptores
benzodiazepínicos e no seu potencial ansiolítico. O 6,3´-dinitroflavona (29) foi a
molécula modificada derivada da flavona mais ativa. Quando administrada em ratos,
teve um potente efeito no teste de LCE, mas não exibiu efeito anticonvulsivante ou
miorelaxante (Wolfman et al., 1996). Este estudo deixou claro que muitos flavonóides
são moléculas ativadoras do SNC e modificações químicas no núcleo das flavonas
aumentam consideravelmente o potencial ansiolítico (Paladini et al., 1999).
27
O
O
NO
2
NO
2
29
O extrato fluido de Passiflora incarnata foi utilizado para avaliação das
propriedades neurofarmacológicas em ratos. Quando utilizado intraperitonialmente, o
extrato prolongou o tempo de sono, protegeu os animais dos efeitos convulsivantes do
pentilenotetrazol e afetou a atividade locomotora. O extrato fluido foi particionado com
éter de petróleo (fração I) e n-butanol (fração II). O extrato aquoso restante foi liofilizado
(fração III). Duas substâncias isoladas da fração II apresentaram atividade, uma mais
hidrofílica e outra mais lipofílica, sugerindo-se terem a mesma estrutura ativa, sendo a
substância mais lipofílica a aglicona e a mais hidrofílica seu derivado hidroxilado ou
glicosilado (Speroni e Minghetti, 1988).
A atividade antiinflamatória dos extratos etanólicos de P. incarnata foi
investigada. Os resultados sugerem que nas doses de 125-500 mg/kg os extratos
exibem atividade antiinflamatória. O estudo concluiu que P. incarnata é capaz de inibir
formação de granuloma em ratos, apesar de sua atividade ser menor que para a droga
de referência (ácido acetilsalisílico) (Borreli et al., 1996).
Os efeitos antiinflamatórios de extratos aquosos das folhas de P. edulis f.
flavicarpa foram investigados segundo o modelo animal de pleurisia induzida por
carragenina sendo que migração de leucócitos, mieloperoxidade, concentração de
28
óxido nítrico, níveis de fator de necrose tumoral α (FNTα) e interleucina-1-β (IL-1-β)
foram os parâmetros avaliados. A migração de leucócitos foi utilizada para verificar a
atividade antiinflamatória dos extratos quando os animais foram induzidos a pleurisia
por bradicinina, histamina ou substância P. Na dose de 250 mg/kg (i. p. 30 min antes da
indução do pleurisia), o extrato de P. edulis diminuiu a migração de leucócitos,
neutrófilos, níveis de mieloperoxidade, óxido nítrico, FNTα e IL-1-β na pleurisia induzido
por carragenina. Também inibiu os leucócitos totais e diferenciais na pleurisia induzida
por bradicinina, histamina e substância P. Dexametasona foi utilizada como controle
positivo (0,5 mg/kg) (Montanher et al., 2006).
A partir de 2001, Dhawan et al. começaram a publicar uma série de
experimentos relacionados ao gênero Passiflora. Durante um estudo comparativo de
espécies, somente o extrato metanólico de P. incarnata exibiu significativa atividade
ansiolítica em ratos (dose oral de 125 mg/kg), enquanto P. edulis não apresentou
qualquer atividade ansiolítica em qualquer extrato/dose testada (éter de petróleo,
clorofórmio e água) usando o modelo de LCE e diazepam como droga de referência (2
mg/kg) (Dhawan et al., 2001c).
O extrato metanólico das folhas de P. incarnata apresenta atividade de
supressão de tosse induzida por dióxido de enxofre (SO
2
) em ratos, sendo essa
atividade comparada a codeína, reconhecido antitussígeno opióide (Dhawan e Sharma,
2002) e atividade afrodisíaca nas doses de 100 mg/kg (ratos machos via oral) (Dhawan
et al., 2003b).
Foi avaliado o efeito ansiolítico de extratos de vários órgãos vegetais de P.
incarnata usando o teste LCE. O extrato metanólico das raízes dessa planta é
29
praticamente destituído de efeitos ansiolíticos. Isso indica que inflorescências e raízes
presentes como adulterantes devem ser separadas das partes aéreas antes de
qualquer estudo farmacológico e/ou fitoquímico para se obter os melhores resultados
(Dhawan et al., 2001b).
Uma das frações derivadas do extrato metanólico de P. incarnata exibiu
significante atividade ansiolítica em ratos na dose de 10 mg/kg utilizando o modelo
LCE, sendo a substância presente na fração um derivado benzoflavônico trisubstituído
(Dhawan et al., 2001a), chamado de BZF o qual não foi apresentado por motivos de
patente.
Essa mesma substância amenizou os efeitos da abstinência de etanol em ratos.
Todos os grupos tiveram administração de álcool na dose de 2 g/kg durante 6 dias. A
substância BZF foi administrada juntamente com o álcool (10, 20 e 50 mg/kg de BZF)
(grupo 1, 2 e 3) ou agudamente (10, 20 e 50 mg/kg) (grupos 4, 5 e 6), após os seis dias.
Foram avaliados no LCE, e todos os grupos foram efetivos em diminuir os efeitos da
abstinência nos animais que pode ser medido pela diminuição da ansiedade (Dhawan
et al., 2002b). A mesma substância se mostrou útil em evitar o desenvolvimento de
tolerância em ratos em administração crônica de canabinóides (∆
9
–THC) quando
administrados juntos (Dhawan et al., 2002a). A própria substância BZF foi avaliada em
relação à chance de causar sintomas após abstinência e concluiu-se ser a substância
BZF livre de qualquer risco de tolerância ou dependência (Dhawan et al., 2003a).
Turnera aphrodisiaca Ward, Turneraceae, a qual é usada popularmente como
ansiolítica e afrodisíaca, seguiu um fracionamento biomonitorado com o objetivo de
encontrar o constituinte químico responsável por essa atividade. Do seu extrato
30
metanólico isolou-se a 5,7,4'-tri-hidroxiflavona (apigenina), também presente em
espécies de Passiflora, que exibiu atividade significante em ratos (2 mg/kg v.o.) no
modelo de ansiedade LCE, o qual os pesquisadores atribuíram ser a substância
responsável pelos seus efeitos ansiolíticos (Kumar e Sharma, 2006).
Shinomiya et al. (2005), avaliou a atividade hipnótica de extratos aquosos de
camomila (Matricaria chamomilla) e maracujá (P. incarnata) utilizando modelo animal de
distúrbio do sono. O extrato de maracujá não mostrou efeitos de latência para o sono
até mesmo na dose de 3000 mg/kg, enquanto a camomila apresentou atividade na
dose de 300 mg/kg.
As pessoas utilizam os frutos de P. edulis para fazer suco, mas a casca é
descartada. Utilizando extrato metanólico das cascas de P. edulis foi avaliada a
diminuição da pressão arterial (sistólica) em ratos. Os extratos (10 e 50 mg/kg) e
luteolina (50 mg/kg) foram administrados oralmente e foram capazes de atuar como
antihipertensivos. O extrato foi avaliado quanto à presença e quantidade de polifenóis e
GABA, sendo o efeito antihipertensivo do extrato de P. edulis atribuído ao efeito de
GABA e parcialmente ao efeito dos polifenóis que possuem reconhecida atividade
vasodilatadora (Ichimura et al., 2006).
Apesar de todos esses estudos apresentados, a(s) substância(s) ativa(s)
responsável (is) pela atividade sedativa e ansiolítica de Passiflora spp. não foram
identificadas até o momento (Reginatto et al., 2006).
31
A espécie Passiflora actinia
A espécie a ser estudada neste trabalho é Passiflora actinia Hook., uma das
diversas espécies nativas da flora brasileira. A espécie é conhecida popularmente como
maracujá-do-mato (Santos et al., 2005). Na medicina popular as folhas são usadas
como ansiolítica e sedativa, e os frutos, como suco, apesar de serem poucos os
estudos químicos e farmacológicos a respeito da espécie até o presente momento. A
posição sistemática da espécie encontra-se no Quadro 1.
Quadro 1: Posição sistemática da espécie Passiflora actinia segundo Engler e Cronquist
Segundo Engler (Joly, 1998) Segundo Cronquist (1988)
Divisão: Angiospermae (Anthophyta) Divisão: Magnoliophyta
Classe: Dicotyledoneae Classe: Magnoliopsida
Subclasse: Archichlamydeae Subclasse: Dilleniidae
Ordem: Violales Ordem: Violales
Família: Passifloraceae Família: Passifloraceae
Gênero:
Passiflora
Gênero:
Passiflora
Espécie: Passiflora actinia Hooker Espécie: Passiflora actinia Hooker
Esta é uma espécie típica de Floresta Ombrófila Densa (Mata Atlântica) e Mista
(Mata com Araucária). Cresce no interior ou borda de florestas até seus ramos
atingirem a parte mais alta e exposta à luz. Tem sua ocorrência no Brasil observada nos
estados do Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Paraná (PR),
Santa Catarina (SC) e Rio Grande do Sul (RS) (Figura 1) (Lorenz, 2002).
32
Figura 1: Distribuição geográfica da espécie Passiflora actinia no Brasil, destacados em
vermelho.
Estudos prévios de Passiflora actinia
Kurtz, em 2001, iniciou os trabalhos com P. actinia (Figura 2) no Grupo de
Pesquisa em Farmacognosia da UFPR. Realizou estudo morfo-anatômico e
investigação dos constituintes alcaloídicos das suas folhas. A análise morfo-anatômica
das folhas revelou um contorno oval, margem lisa, ápice obtuso, base arredondada e
limbo inteiro. Observou-se que a face abaxial da epiderme é papilosa, o mesofilo é
dorsiventral, os feixes vasculares são colaterais e idioblastos contendo drusas estão
distribuídos no parênquima foliar. Análise por CLAE demonstrou a presença de traços
do alcalóide harmana (7) na fração alcaloídica, dentre os cinco principais padrões
33
analisados: harmana (7), harmina (8), harmalina (9), harmalol (10) e harmol (11)
encontrados em Passiflora (Kurtz, 2001; Kurtz et al., 2003).
Santos, em análise comparativa em CLAE das espécies P. incarnata, P. alata e
P. actinia, sugeriu que o perfil cromatográfico de P. actinia tem maior semelhança com
P. incarnata do que com P. alata. Com o fracionamento do extrato metanol-água, foi
observado que a fração flavonoídica é constituída majoritariamente pela isovitexina
(17), enquanto que a fração alcaloídica, praticamente isenta de flavonóides, não
mostrou presença dos alcalóides β-carbolínicos clássicos e pode ser constituída por
alcalóides quaternários (Santos, 2003).
Reginatto (2000) comparando por CCD sete extratos de espécies de Passiflora,
identificou manchas com R
f
semelhantes aos padrões dos flavonóides isoorientina (15)
e isovitexina (17) em P. actinia. Não foram encontradas saponinas em P. actinia por
análise em CCD nos extratos etanólicos (Reginatto et al., 2001).
Utilizando método de extração em alta velocidade, solução aquosa de metanol a
20% como solvente e HPLC, foram identificados e quantificados para a espécie P.
actinia os alcalóides harmol, harmana, harmalina e harmina nas quantidades de 0,04;
0,08; 0,08 e 0,16 ppm respectivamente (Abourashed et al., 2003). Os flavonóides
presentes em extrato metanol:água (4:1) de P. actinia, foram identificados e
quantificados em HPLC como sendo shaftosídeo/isoshaftosídeo (0,08%) e isovitexina
(0,16%) (Abourashed et al., 2002).
34
Figura 2: Aspecto geral de Passiflora actinia Hooker, Passifloraceae.
Os primeiros ensaios farmacológicos com a espécie P. actinia foram realizados
utilizando a via intraperitonial (i. p.) como forma de administração dos extratos. A
administração do extrato bruto hidroalcoólico de P. actinia em camundongos, em doses
inferiores a 1800 mg/kg, não resultou em toxicidade aparente. Através dos métodos
LCE e CA, foi observado um efeito sedativo com o extrato hidroalcoólico bruto (100-300
mh/kg), extrato metanólico (300-600 mg/kg) e fração aquosa do extrato metanólico
(100-300 mg/kg), sendo que apenas este último também apresentou seletiva atividade
ansiolítica na dose de 30 mg/kg. Os efeitos sedativos puderam ser evidenciados por
uma diminuição no número de entrada nos braços abertos e fechados no teste de LCE
e uma diminuição na atividade motora como um todo, evidenciada pelo teste de CA
(Santos, 2003; Santos et al., 2006). Os animais tratados com os extratos e frações
avaliadas em relação à atividade ansiolítica apresentaram uma postura anormal em
35
comparação com os animais controle. Esse dado indica a ocorrência de catalepsia em
ratos, que é usado para prever a atividade tranqüilizante (Santos et al., 2005).
Os extratos hidroalcoólicos (300 e 600 mg/kg) e metanólicos (100 e 300 mg/kg)
de P. actinia resultaram em efeitos ansiolíticos em tratamento agudo v. o. Quando
administrados primeiramente com flumazenil, um antagonista dos receptores
benzodiazepínicos GABA
A
, a atividade ansiolítica dos extratos metanólico e
hidroalcoólico foi diminuída, sugerindo que os efeitos de atividade ansiolítica desses
extratos possa se dar por ligação a esses receptores. Nas suas maiores doses, os
extratos foram capazes de potencializar o sono induzido por pentobarbital (Lolli et al.,
2007).
Dar continuidade aos trabalhos já realizados buscando um melhor conhecimento
da P. actinia que é facilmente cultivada na região Sul do Brasil e procurar determinar
quais são o(s) seu(s) constituinte(s) químico(s) com potencial atividade ansiolítica e/ou
sedativa, justificam a escolha da referida espécie.
36
OBJETIVOS
• Identificar e quantificar os constituintes químicos da Passiflora actinia
Hooker, Passifloraceae.
• Identificar os extratos e frações farmacologicamente ativas em relação ao
poder sedativo e ansiolítico.
• Determinar metodologia em CLAE para separação de substâncias em P.
actinia.
37
MATERIAIS E MÉTODOS
Procedimentos gerais
Para a realização das análises cromatográficas em CCD analítica e preparativa
dos extratos e frações de P. actinia foram utilizadas placas pré-ativadas Merck com fase
estacionária Kiesegel 60 (F
254
). Foram utilizadas as fases móveis EtOAc:HCO
2
H:H
2
O
(6:1:1); EtOAc:HCO
2
H:H
2
O (8:1:1); DCM:EtOH (1:1) e tolueno:EtOAc (1:1), observadas
em câmara de luz de UV ondas longas (365 nm) e ondas curtas (254 nm) e solução de
ácido fosfomolíbdico 10% em EtOH, reagente de anisaldeído-sulfúrico e solução
reagente de NEU (difenilboriloxietilamina 1% em EtOH), preparados segundo Wagner e
Bladt (1996) foram usados como reveladores.
As colunas cromatográficas foram realizadas em Sílica Gel 60G 70-230 mesh
(Merck), Sephadex LH-20 (Pharmacia) ou Amberlite XAD-16 (Aldrich).
As análises em CLAE foram realizadas em equipamento Varian, bomba Prostar
210 (série 02038), detector UV-VIS Prostar 320 (série 01453), módulo organizador,
válvula rheodyne, Programa Workstation Star 6.0. Foi utilizada coluna Microsorb-MV
100 C-18 de 250 mm, tamanho de partícula de 5 µm e diâmetro interno de 4,6 mm. O
loop foi de 20 µl. Os solventes utilizados em todos os procedimentos cromatográficos
utilizando CLAE foram grau HPLC. A água utilizada foi purificada no sistema Puritech/
Permution PT0020, filtro de 0,2 µm, apresentando também alto grau de pureza. Para as
amostras sólidas, foram preparadas soluções de concentração 1 mg/ml em líquido
diluente MeOH/H
2
O (1:1). Para as amostras líquidas, foram preparadas solução na
38
proporção 1:10 (extrato:líquido diluente). Antes de serem injetadas no equipamento de
CLAE foram filtradas em membrana de celulose regenerada com poros de abertura
0,22 µm da millipore. Padrões de vitexina (0,1 mg/ml), isovitexina (0,1 mg/ml) e
orientina (0,1 mg/ml) foram diluídos em MeOH.
Os extratos liofilizados foram realizados em equipamento Labconco freeze dryer
4,5. Os espectros de absorção no UV foram realizados em equipamento Shimadzu UV-
1601. Espectrômetro Bruker 400 MHz, do Departamento de Química da UFPR foi
utilizado na obtenção dos espectros de ressonância magnética nuclear (RMN). Foram
utilizados CDCl
3
(Aldrich), MeOD (Cambridge Isotope Laboratories, Ind.) e D
2
O
(Cambridge Isotope Laboratories, Ind.) como solventes.
Solventes e reagente foram purificados quando necessário por métodos
padronizados (Armarego e Perrin, 1996).
Reação de acetilação
Para realização da reação de acetilação foram utilizados anidrido acético (10
ml/g de extrato) e piridina (5 ml/g de extrato). A solução reagente foi deixada por 12 h à
temperatura ambiente e após este período o material evaporado em rotaevaporador
sob pressão reduzida, com auxílio de tolueno para obtenção de mistura azeotrópica. O
resíduo foi ressuspenso em CHCl
3
, lavado 2-3 vezes com solução de HCl 5% e 2-3
vezes com H
2
O. A porção orgânica foi seca em sulfato de sódio anidro, filtrada e
evaporada sob pressão reduzida. O material foi então filtrado através de óxido de
alumínio Merck, atividade II-III padronizado segundo Brockmann, deativada com
39
CH
3
CO
2
H (5 ml solução a 10% de CH
3
CO
2
H/100 g de alumina) para posterior
realização de procedimentos cromatográficos.
Separação cromatográfica em Sephadex LH-20
As colunas cromatográficas que foram utilizadas para separação em Sephadex
LH-20 foram de três tamanhos. A primeira de 90 cm (65 cm de altura de fase
estacionária) e 2 cm de diâmetro que foi chamada de SP
maior
. A segunda de 80 cm (45
cm de altura de fase estacionária) e 1,5 cm de diâmetro e foi chamada de SP
menor
. A
terceira de 40 cm de altura (20 cm de altura de fase estacionária) e 2 cm de diâmetro e
foi chamada de SP
mini
. Todas foram empacotadas com MeOH após o Sephadex ter sido
deixado em repouso com solvente por 3 h. O empacotamento foi realizado
cuidadosamente para evitar a formação de bolhas de ar que interferissem com o fluxo
de fase móvel na coluna. Em todas as separações a fase móvel utilizada foi MeOH.
Separação cromatográfica em resina Amberlite XAD-16
Foi utilizada a proporção de 1:10 (amostra:resina), sendo o extrato/fração
solubilizado em H
2
O. A eluição foi feita com H
2
O, H
2
O:EtOH 5%, H
2
O:EtOH 10% e
H
2
O:EtOH 20%.
Material botânico
O material vegetal foi coletado na Fazenda Experimental do Canguiri da
Universidade Federal do Paraná (UFPR) em outubro de 2005 (20 kg). As folhas frescas
40
(9 kg) de Passiflora actinia Hook. foram estabilizadas por secagem em estufa a 45 °C
(30% de rendimento) e pulverizadas, obtendo-se material seco (2,7 kg). O tamanho das
partículas de pó foi padronizado em tamis de abertura 250 mm/mm. A amostra coletada
está registrada no Herbário do Departamento de Botânica da UFPR, sob N° UCPB
30.831.
Preparo dos extratos
Extrato fluido e frações
O extrato fluido (500 ml) foi preparado segundo metodologia descrita na
Farmacopéia Brasileira 2.ed. utilizando como líquido extrator sol. de EtOH 45% (Newall
et al., 1996). Parte do extrato fluido (100 ml) foi guardado em geladeira, o restante foi
concentrado em rotaevaporador, ressuspenso em água (volume final de 400 ml) e
fracionado utilizando solventes de diversas polaridades (DCM, EtOAc, n-BuOH) em funil
de separação (3x 100 ml) (Esquema 1). Todas as frações foram concentradas em
rotaevaporador sob pressão reduzida a 50 °C, obtendo-se rendimento de 4,4 g para a
fração DCM, 1,2 g para a EtOAc, 6,4 g para n-but e 24 g para a fração aquosa
restante, a qual foi liofilizada. O extrato fluido (100 ml) foi utilizado para realização de
ensaios farmacológicos em modelos de ansiedade (Lolli et al., 2007).
41
Esquema 2: Fluxograma do preparo do extrato fluido e fracionamento do extrato de P. actinia
Extrato metanólico e frações
O extrato metanólico foi obtido pela técnica de turbólise. Em equipamento
apropriado, foi adicionado a droga vegetal (1 kg) e metanol (5x 2 l). Este material sofreu
extração por 30 min e a cada 48 h, filtrado em sistema de filtração a vácuo. O MeOH foi
evaporado em rotaevaporador sob pressão reduzida a 50 °C, obtendo-se um
rendimento de 240 g de extrato/kg de folhas secas. O resíduo foi ressuspenso em água
(1:8) e desclorofilado por agitação com água gelada por 8 h, seguido de filtração do
material gorduroso. O filtrado foi chamado de extrato metanólico desclorofilado. Parte
Planta seca e
moída (500 g)
EtOH 45%
(percolação após
48 h)
Concentrado em
rotaevaporador
Ressuspenso em á
g
ua
deionizada- volume final
400 ml
Partição
lí
q
uido
/
lí
q
uido
Fra
ç
ão
DCM
4,4 g
Fra
ç
ão
EtOAc
1,2 g
Fra
ç
ão
n
-BuOH
6,4 g
Fra
ç
ão aquosa
Liofilizada
24
g
Extrato
fluido
500 ml
100 ml
Ensaios
farmacoló
g
icos
42
do extrato metanólico desclorofilado (100 ml) foi guardado para realização de ensaios
farmacológicos. O restante foi utilizado em fracionamento utilizando solventes (3x 300
ml) de diversas polaridades (n-hex, CHCl
3
, EtOAc e n-BuOH) em funil de separação
(partição líquido/líquido), concentrados em rotaevaporador sob pressão reduzida a 50
°C obtendo-se as frações n-hex (8,4 g), CHCl
3
(4,2 g)
,
EtOAc (3,4 g), n-BuOH (30 g). A
fração aquosa foi liofilizada (120 g) (Esquema 2).
Esquema 3: Fluxograma de preparo do extrato metanólico e fracionamento de P. actinia
Planta seca e
moída (1000 g)
MeOH
(turbólise 30min)
48 h
Filtração a vácuo,
concentrado em
rotaevaporador e
desclorofilado
Sobrenadante:
Extrato metanólico
desclorofilado (2000 ml)
Partição
lí
q
uido
/
lí
q
uido
Fração
n-
hex
8,4 g
Fração
CHCl
3
4,2 g
Fração
EtOAc
3,4 g
Fração
n
-BUOH
30 g
Fração aquosa
Liofilizada
120 g
100 ml
Ensaios
farmacológicos
43
Técnica de CLAE
Para a avaliação do perfil cromatográfico dos extratos e frações de Passiflora
actinia em CLAE foi necessário otimizar as condições cromatográficas, incluindo fase
móvel e fluxo. A fase móvel aquosa escolhida para as separações analíticas foi uma
mistura de solvente A (HCO
2
H 2%) e solvente B (CH
3
CN) (87:13) e fluxo de fase móvel
de 1,2 ml/min.
Separação da fração n-BuOH
Isolamento da substância ACT
24
O material acetilado da fração n-BuOH do extrato metanólico desclorofilado (0,7
g) (Esquema 2) foi utilizado para isolar a substância ACT
24
. Foram realizadas duas CC
com Sílica Gel 60G. A primeira CC foi realizada utilizando Sílica Gel (20 g) em uma
coluna de 25 cm de altura e diâmetro 2,5 cm. Sua eluição foi feita com ciclohexano,
ciclohexano-DCM (1:1), DCM-CHCl
3
(1:1) CHCl
3
e CHCl
3
-MeOH (9,9:0,1 - 9,8:0,2 -
9,7:0,3 - 9,6:0,4 - 9,5:0,5 - 9:1 - 8,5:1,5 - 4:1 - 3:1 - 7:3). Foram coletadas frações de 8
ml e após observação em CCD foram reunidas as semelhantes dando origem as
frações mais apolares 1-85 (F1
15/03
) e as frações mais polares 86-300 (F2
15/03
). F1
15/03
(570 mg) foi novamente submetida à cromatografia em coluna de Sílica Gel, desta vez
em tamanho menor (20 cm) e de menor diâmetro (1,5 cm). As coletas foram realizadas
de 100 em 100 ml. A fase móvel utilizada foi um gradiente de ciclohexano-DCM onde foi
aumentando a concentração de DCM de 10 em 10%. As frações 12-16 apresentaram
44
uma mancha majoritária de R
f
0,54 em CCD quando utilizado eluente tolueno-DCM
(3:1)
e revelador ácido fosfomolíbdico. Estas foram então agrupadas e submetidas à CCD
preparativa Merck (20x20 cm) utilizando tolueno-DCM (1:1) como eluente. A substância
isolada foi então chamada de ACT
24
. A substância foi avaliada em experimentos de
1
H-
e
13
C- RMN utilizando CDCl
3
como solvente.
Fração SP-HPLC1
Parte da fração n-BuOH (2,5 g) (Esquema 2) foi utilizada para realização de
separação em Sephadex utilizando a coluna SP
maior
. Frações (147) de 4 ml foram
coletadas com fluxo de 3 ml/min, onde, após comparação dos seus perfis
cromatográficos foram reunidas em quatro subfrações e chamadas de SP
5
/n-but
(F
1
,
2
,
3
,
4
,
5
). A fração SP
5
/n-but F
3
(1,1 g) dessa coluna foi submetida a uma segunda
cromatografia em coluna com Sephadex LH-20 (SP
menor
). Foram coletadas frações de 4
ml e as semelhantes foram reunidas e deram origem a seis subfrações chamadas de
SP
6
/F
3
SP
5
(F
1
,
2
,
3
,
4
,
5
e
6
). As frações SP
5
/n-but F
4
e SP
6
/F
3
SP
5
F
5
que apresentavam
perfil cromatográfico semelhante foram reunidas e foi chamada de fração SP-HPLC1
(690 mg). Essa fração foi ainda submetida à CC em Sephadex na coluna SP
mini
sucessivas vezes, não obtendo-se boa separação. A fração SP
6
/F
3
SP
5
F
6
(295 mg)
apresentou em CCD, FM EtOAc-HCO
2
H-H
2
O (6:1:1), apenas uma substância quando
revelada com anisaldeído sulfúrico. Experimentos em RMN foram realizados utilizando
MeOD como solvente.
45
Separação da fração aquosa
Fracionamento da fração aquosa liofilizada
O fracionamento da fração aquosa liofilizada do extrato metanólico desclorofilada
(Esquema 2) foi realizado em coluna a vácuo utilizando como fase estacionária Sílica
Gel 60G para cromatografia em camada delgada. A amostra foi preparada solubilizando
o extrato (5 g) em MeOH e posterior incorporação na própria sílica em separado. A
coluna utilizada foi um funil de vidro sinterizado de 4 cm de diâmetro, tamanho de poro
G3, altura de 7 cm acoplada a um kitasato. A fase móvel utilizada foi um gradiente de
DCM em EtOH, iniciando-se com DCM 100% (100 ml), DCM:EtOH 10% (100 ml), e
assim sucessivamente até chegar a EtOH 100%. Onze frações foram coletadas,
chamadas de frações 1-11 da CV. Foram realizadas duas colunas a vácuo e foram
denominadas de CV
2
e CV
3
. A CV
2
deu origem a onze subfrações e as semelhantes
reunidas após análise em CCD utilizando revelador anisaldeído sulfúrico em (1-8), (9-
10) e 11. A CV
3
gerou onze frações as quais foram reunidas em 1, 2, 3, (4, 5, 6), (7, 8,
9) e (10,11).
Coluna CV
3
e subfrações
As subfrações (4, 5, 6) (680 mg) e (7, 8, 9) (1 g) da coluna CV
3
foram acetiladas
separadamente e cada uma foi utilizada para separação em coluna cromatográfica. A
fração ACT 4, 5 ,6 CV
3
(500 mg) foi submetida a cromatografia em coluna com sílica gel
60G como fase estacionária utilizando coluna de 20 cm de altura e 1,5 cm de diâmetro.
A fase móvel foi inicialmente tolueno e um aumento gradual de EtOAc. Foram coletadas
46
127 frações de 4 ml e reunidas em cinco subfrações, das quais da fração 1 (1-39) foi
separada a substância ACT
43
que apresentava uma mancha em CCD. Análise em
1
H-
RMN utilizando CDCl
3
como solvente mostrou que a amostra não estava pura, sendo
difícil a identificação.
A fração ACT 7, 8, 9 CV
3
(770 mg) foi submetida à coluna cromatográfica nas
mesmas condições que a fração ACT 4, 5, 6 CV
3
. As frações semelhantes foram
reunidas em sete subfrações. A fração (29-47) cristalizou, sendo que seus cristais após
filtração em coluna de sílica foram recristalizados com CHCl
3
(30 mg). Análise em RMN
foi realizada utilizando CDCl
3
como solvente, mas mostrou-se tratar-se de uma mistura,
não sendo possível a sua identificação.
Coluna CV
2
,
3
(todas)
As frações ACT 7, 8, 9 CV3 (1,0 g), ACT 10, 11 CV
3
(580 mg) e ACT 9, 10 CV
2
(620 mg) por apresentarem perfil cromatográfico em CCD semelhantes foram reunidas.
O material (2,2 g) foi utilizado para realização de coluna cromatográfica utilizando Sílica
Gel 60G como fase estacionária em uma coluna de 1,5 cm de diâmetro e 40 cm de
altura e a eluição foi realizada inicialmente com tolueno com um aumento gradual de
EtOAc. As frações coletadas (8 ml) foram analisadas em CCD (FM tolueno-EtOAc 1:1)
e as amostras semelhantes foram reunidas. As primeiras frações (1-22) formaram um
precipitado, o qual foi analisado em
1
H-,
13
C-RMN.
47
Separação cromatográfica em Sephadex LH-20
A primeira coluna (SP
1
) foi utilizando SP
menor
e 2,5 g da fração aquosa. Foram
coletadas frações de 50 ml utilizando MeOH como eluente. A fração F
3
SP
1
(470 mg) foi
submetida novamente a cromatografia em SP
menor
. Foram coletadas 118 frações de 2
ml. As semelhantes foram reunidas e dessas sub-frações foram separadas duas que
foram chamadas de SP
4
(F
3
-SP
1
)F
1
e SP
4
(F
3
-SP
1
)F
2
.
Separação cromatográfica em resina Amberlite XAD-16
As frações SP
4
(F
3
-SP
1
)F
1
e SP
4
(F
3
-SP
1
)F
2
foram reunidas (300 mg) e realizada
separação em Amberlite. A eluição foi feita com H
2
O, H
2
O:EtOH 5%, H
2
O:EtOH 10% e
H
2
O:EtOH 20%. Uma mancha de coloração azul quando revelada com anisaldeído
sulfúrico presente em quase todas as frações dessa separação, foi separada das
demais substâncias por CCD preparativa utilizando EtOAc-HCO
2
H-H
2
O (5:1:1) como
fase móvel. Não foi possível a identificação em RMN da substância isolada (AMB-
BLUE) devido a pouca quantidade do material obtido (12 mg).
Separação cromatográfica em resina Amberlite XAD-16/Sephadex
Foi realizada uma separação com a fração aquosa (10 g) (Esquema 2) em 100 g
de Amberlite XAD-16 (coluna AMB-FLO), do qual foram obtidas cinquenta frações de 75
ml cada. O acompanhamento da coluna foi realizado por comparação dos perfis
cromatográficos das frações e as semelhantes foram agrupadas, obtendo-se assim
nove subfrações. A fração 1 (F
1
) (7 g) apresentou uma substância de coloração rosa
quando revelada com anisaldeído sulfúrico. Com o objetivo de isolar essa substância,
48
parte desse material (1 g) foi utilizado para separações em Sephadex (SP
mini
), obtendo-
se 33 frações de 4 ml da primeira coluna, das quais por agrupamento das semelhantes
foram agrupadas em três subfrações. Uma dessas subfrações (F
3
10-33) (0,3 g) foi
submetida novamente à cromatografia em Sephadex, e foram recolhidas 39 frações de
4 ml. As frações de número 15-21 apresentavam perfis semelhantes, e quando
agrupadas formaram cristais. Os cristais foram analisados em experimentos em
equipamento de RMN utilizando D
2
O como solvente.
Reação de hidrólise ácida
A fração F
1
da coluna AMB-FLO foi submetida à reação de hidrólise ácida
utilizando HCl 1% e metodologia adaptada de (Weissenberg, 2001). Foi utilizada a
proporção de 1:3:2:1 de fração-tolueno-H
2
O-HCl conc. em refluxo por 6 h. A fração
orgânica foi recolhida e a aquosa foi extraída 3x 6 ml com tolueno. As frações tolueno
foram reunidas, secas com sulfato de sódio anidro e concentradas em rotaevaporador
dando origem à F
1
(AMB-FLO) hidrolizada a qual foi comparada em CCD com a F
1
sem
hidrolizar e com o ácido p-cumárico.
49
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Extrato fluido e metanólico desclorofilado
Os pesquisadores de química de produtos naturais normalmente preferem
trabalhar com produtos de baixa e média polaridade. Esta preferência é justificada pela
maior solubilidade dessas substâncias em solventes voláteis (p.e. < 100°C), fato que
facilita a remoção destes após os processos de fracionamento e purificação, através
das técnicas cromatográficas entre outras, ou mesmo após análises espectrométricas
(Chaves et al., 2000).
Os extratos e frações de Passiflora actinia Hooker foram estudados
quimicamente e biomonitoradas em relação à atividade sedativa e ansiolítica em
modelos animais. Nas frações bioativas espera-se encontrar a (s) substância (s)
química (s) responsável (is) por esta atividade. Estudo realizado por Santos, (2003)
encontrou atividade farmacológica nas frações mais polares, como n-BuOH e aquosa,
sendo essas as frações de interesse no presente estudo.
A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está
fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre
devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase
estacionária. A principal diferença entre a cromatografia líquida clássica e a CLAE é a
utilização de fases estacionárias com micropartículas esféricas, de preferência. Estas
fases, por serem muito permeáveis, tornam necessária a utilização de bombas para a
eluição da fase móvel. A utilização destas novas fases estacionárias, associada ao
50
desenvolvimento da instrumentação, levou esta técnica a um melhor desempenho em
termos de resolução, quantificação e detecção em um menor tempo de análise (Cass e
Degani, 2001).
A técnica de CLAE pode também ser útil para realizar o fingerprint de diversas
espécies vegetais. Isso trás uma grande quantidade de informações, incluindo
autenticidade da amostra, determinação de marcadores taxonômicos, identificação de
constituintes padrões relacionados com a localidade da planta, suporte para estudos
genéticos (espécies híbridas), diferenças entre espécies que possuem semelhanças
anatômicas e atividades biológicas relacionadas ao perfil fitoquímico (Abourashed et al.,
2002).
O perfil cromatográfico dos extratos e das frações de P. actinia foi realizado em
CLAE. Seguindo a metodologia proposta por Pereira et al. (2004), adaptações foram
feitas para atender as condições existentes visto que a metodologia proposta utiliza o
modo gradiente e o equipamento utilizado permite apenas o modo isocrático. Os
extratos analisados foram o fluido e metanólico desclorofilado e os padrões vitexina (16)
e isovitexina (17) foram utilizados para verificar sua presença nas folhas da planta.
A Tabela 1 sintetiza o que foi realizado nas diversas etapas de otimização da
metodologia, sendo solvente A sol. aquosa HCO
2
H 2% e solvente B CH
3
CN. Em
detalhe as modificações que foram realizadas entre uma etapa e outra. Para o extrato
fluido o melhor sistema cromatográfico encontrado para separação analítica foi solvente
A-solvente B (87:13) e fluxo de 1,2 ml/min (Figura 3).
51
Tabela 1. Etapas de otimização da metodologia de CLAE
para extratos e frações de P. actinia
.
Fase Fase móvel (FM)
solvente A:solvente B
Fluxo de FM
1 (80:20) 1ml/min
2 (80:20) 0,8ml/min
3 (85:15) 0,8ml/min
4 (85:15) 1,0ml/min
5 (87:13) 0,8ml/min
6 (87:13) 1,0ml/min
7 (87:13) 1,2ml/min
10 20 30 40
Minutes
-22
0
50
100
150
200
mV o lt s
2.267
2.842
2.975
3.362
3.606
3.883
4.459
4.882
5.566
6.735
7.604
8.368
9.055
9.740
10.423
11.736
12.399
13.446
15.140
16.611
ISOVITEXINA (18.006)
20.995
22.527
26.773
33.098
c:\larissa-mst\02_09_2005\ext_fluido_1_202-09-0515;15;46.run File:
Channel:
Last recalc:
c:\larissa-mst\02_09_2005\ext_fluido_1_202-09-0515;15;46.run
1 = INTGR 1 Results
02/09/05 15:58
X:
Y:
Peak Name:
Result:
Area:
Width:
4.4587 Minutes
82.7 mVolts
6.959
2232 mVolts*sec
48.9 sec
W
I
:
8
W
I
:
1
6
W
I
:
3
2
W
I
:
6
4
2.267
2.842
2.975
3.362
3.606
3.883
4.459
4.882
5.566
6.735
7.604
8.368
9.055
9.740
10.423
11.736
12.399
13.446
15.140
16.611
ISOVITEXINA (18.006)
20.995
22.527
26.773
33.098
Figura 3: Cromatograma do extrato fluido de P. actinia obtido na sétima fase de
otimização da metodologia em CLAE. FM: sol. aquosa HCO
2
H 2%:CH
3
CN 87:13, fluxo
1,2 ml/min e λ=340 nm.
Após análise dos cromatogramas (Figura 3) confirmou-se que o flavonóide
vitexina (16,8 min) não está presente na espécie em questão estudada, ou se presente
sua quantidade é muito pequena (traços). Abourashed et al. (2002) em seu estudo
(fingerprint) utilizando a técnica de CLAE em extratos de 115 espécies de Passiflora,
sendo uma delas a P. actinia, relata a presença somente dos flavonóides
52
shaftosídeo/isoshaftosídeo e isovitexina para a espécie, não detectando também
vitexina na P. actinia.
Por comparação do tempo de retenção dos picos dos padrões com os picos
encontrados nos cromatogramas dos extratos verificou-se a presença de isovitexina
(t
r
=18,189) (Figura 4), o qual por adição de padrão confirmou-se a presença do
flavonóide. Ao analisar o cromatograma (Figura 5) verifica-se que o pico da isovitexina
diminuiu como todos os outros picos, em função do padrão adicionado estar em
solução. Mesmo assim pode-se confirmar que o que aparece no cromatograma do
extrato fluido é a isovitexina, pois nenhum outro pico aparece no cromatograma de
adição de padrão (Figura 5).
5101520
Minut es
-3
0
5
10
15
20
25
mV o lt s
ISOVITEXINA (18.189)
c:\larissa-mst\02_09_2005\pad_isovit_1_202-09-0514;53;13.run
File:
Channel:
Last recalc:
c:\larissa-mst\02_09_2005\pad_isovit_1_202-09-0514;53;13.run
1 = INTGR 1 Results
02/09/05 15:16
X:
Y:
8.9604 Minutes
0.664 mVolts
I
I
+
I
I
-
W
I
:
8
ISOVITEXINA (18.189)
Figura 4: Cromatograma do padrão isovitexina em CLAE. FM: sol.
aquosa HCO
2
H 2%:CH
3
CN 87:13, fluxo 1,2 ml/min e λ=340 nm.
53
Figura 5: Cromatograma do extrato fluido de P. actinia ( ), extrato fluido
adicionado de padrão de isovitexina ( ) e padrão isovitexina ( ) em
CLAE. FM- sol. aquosa HCO
2
H 2%-CH
3
CN 87:13, fluxo 1,2 ml /min e
λ=340 nm.
Foi realizada análise em CLAE do extrato metanólico desclorofilado de P. actinia
(Figura 6). Em comparação com o extrato fluido (Figura 3), ambos apresentam o
mesmo perfil cromatográfico, confirmando-se que o solvente escolhido para a extração
e fracionamento, extrai os mesmo marcadores químicos.
10 20 30 40
Minutes
-16
0
25
50
75
100
125
150
mV olts
2.260
2.447
2.692
2.898
3.347
3.574
3.872
4.438
4.882
5.555
6.794
7.575
8.299
9.686
10.379
11.635
12.307
13.352
15.046
16.437
ISOVITEXINA (17.887)
20.833
22.415
c:\larissa-mst\02_09_2005\ext_met_1_202-09-0515;57;41.run File:
Channel:
Last recalc:
c:\larissa-mst\02_09_2005\ext_met_1_202-09-0515;57;41.run
1 = INTGR 1 Results
NA
X:
Y:
36.1551 Minutes
0.327 mVolts
W
I
:
8
W
I
:
1
6
W
I
:
3
2
2.260
2.447
2.692
2.898
3.347
3.574
3.872
4.438
4.882
5.555
6.794
7.575
8.299
9.686
10.379
11.635
12.307
13.352
15.046
16.437
ISOVITEXINA (17.887)
20.833
22.415
Figura 6: Cromatograma do extrato metanólico desclorofilado de P. actinia em CLAE.
FM: sol. aquosa HCO
2
H 2%-CH
3
CN 87:13, fluxo 1,2 ml/min e λ=340 nm.
54
Os mesmos resultados foram observados para o extrato metanólico
desclorofilado obtido por extração a quente em equipamento de Soxhlet (Santos, 2003).
Isso demonstra que a temperatura utilizada na extração não interfere com a
composição química, pelo menos em relação às substâncias flavonoídicas. Esse
mesmo autor verificou em análise cromatográfica em CLAE dos extratos metanólicos
desclorofilados de P. actinia, P. alata e P. incarnata uma maior similaridade da P.
actinia com a espécie importada P. incarnata do que com P. alata (oficial no Brasil),
sugerindo-se dessa forma, pelo menos em relação à ótica química, que poderia haver
possibilidade da espécie P. actinia ser uma alternativa de substituição à espécie
importada.
Fração n-BuOH
A fração n-BuOH é rica em flavonóides os quais podem ser observados quando
se utiliza o revelador NEU (Figura 7).
Figura 7: CCD da fração n-BuOH e aquosa do
extrato metanólico desclorofilado de P. actinia
FM: EtOAc-HCO
2
H-H
2
O (8:1:1), revelador: NEU
55
A varredura no UV da fração n-BuOH mostrou que ocorre absorção em 274 e
342 nm. Por essas razões o comprimento de onda escolhido para a técnica de CLAE foi
340 nm.
Os padrões utilizados para comparação de tempo de retenção foram a orientina
(14), vitexina (16) e isovitexina (17). Por comparação de tempo de retenção e adição de
padrão, o único flavonóide detectado para a fração foi isovitexina (Figura 9). Os tempos
de retenção dos padrões foram de 11,22 min para orientina, 16,41 min para vitexina e
18,82 min para isovitexina (Villas-Bôas et al., 2006).
10 20 30
Min ut es
-23
0
50
100
150
200
mV ol ts
2.655
3.318
3.524
3.824
4.207
4.768
5.024
5.213
5.567
6.319
6.973
7.248
8.284
8.866
10.312
11.409
12.313
12.966
13.203
14.021
15.653
17.140
18.682
19.390
21.189
23.648
25.498
27.780
29.917
33.084
34.285
c:\larissa-mst\27_04_2006\fracao_n_but_27_0427-04-0611;02;54.run File:
Channel:
Last recalc:
c:\larissa-mst\27_04_2006\fracao_n_but_27_0427-04-0611;02;54.run
1 = INTGR 1 Results
NA
X:
Y:
2.1675 Minutes
1.33 mVolts
2.655
3.318
3.524
3.824
4.207
4.768
5.024
5.213
5.567
6.319
6.973
7.248
8.284
8.866
10.312
11.409
12.313
12.966
13.203
14.021
15.653
17.140
18.682
19.390
21.189
23.648
25.498
27.780
29.917
33.084
34.285
Figura 8: Perfil cromatográfico em CLAE da fração n-BuOH de P. actinia.
FM: sol. aquosa HCO
2
H 2%-CH
3
CN 87:13, fluxo 1,2 ml/min e λ=340 nm.
56
10 20 30
Min ut es
-23
0
50
100
150
200
mV ol ts
2.683
16.412
X:
Y:
0.0584 Minutes
1.13 mVolts
c:\larissa-mst\27_04_2006\pad_vit3b_27_0427-04-0609;19;58.run
c:\larissa-mst\27_04_2006\pad_isovit_27_0427-04-0609;47;32.run
c:\larissa-mst\27_04_2006\fracao_n_but_27_0427-04-0611;02;54.run
c:\larissa-mst\27_04_2006\pad_orientina_27_0427-04-0611;45;53.run
File:
Channel:
Last recalc:
c:\larissa-mst\27_04_2006\pad_vit3b_27_0427-04-0609;19;58.run
1 = INTGR 1 Results
NA
2.683
16.412
Figura 9: Perfil cromatográfico em CLAE da fração n-BuOH ( ) e dos
padrões vitexina ( ) , isovitexina ( ) e orientina ( ) . FM: sol. aquosa HCO
2
H
2%-CH
3
CN 87:13, fluxo 1,2 ml/min e λ=340 nm.
O perfil cromatográfico da fração n-BuOH em CLAE pode ser observado na
Figura 8, o qual é muito semelhante com o do extrato fluido e extrato metanólico
desclorofilado (Figuras 3 e 6), justificando a tentativa de isolamento dos componentes
químicos presentes nessa fração, uma vez que são semelhantes aos da espécie P.
incarnata, uma das mais estudadas em relação às propriedades farmacológicas do
gênero.
O processo de separação da fração n-BuOH se deu inicialmente em coluna de
Sílica Gel 60G. A fração é solúvel em MeOH, mas é necessário muito solvente. Como a
coluna foi empacotada com CHCl
3
, ao tentar colocar este solvente na amostra ocorre a
formação de precipitados, não sendo o procedimento adequado para este material.
Para tentar solucionar o problema da solubilidade, parte da fração n-BuOH (1 g) foi
submetida à reação de acetilação e 0,7 g foi utilizado para realização de separação em
Isovitexina
57
coluna cromatográfica, do qual após duas purificações em coluna de sílica gel 60G foi
separada a substância ACT
24
. O espectro de ressonância magnética nuclear de
hidrogênio (Figura 10) apresentou dois sinais de duplo dubletos em região aromática,
um multiplete bem definido em 4,2 ppm indicando a proximidade de um éster, além de
sinais de metilas e metilenos em campo alto. Juntamente com outros dados espectrais,
foi sugerida a estrutura 30 para esta substância. Esse produto, de estrutura simétrica e
nunca identificada em nenhum outro produto natural, pode ser um artefato de solvente,
embora os solventes utilizados tenham sido destilados e purificados antes do uso.
Figura 10: Espectro de
1
H- RMN (400 MHz, CDCl
3
) da substância 30
58
O
O
O
O
30
Como a amostra n-BuOH sem ser acetilada apresenta solubilidade em MeOH, e
este solvente dissolve parte da sílica, foi discutida a possibilidade de utilizar colunas do
tipo Sephadex, pela facilidade de utilizar solventes polares como MeOH e H
2
O, nos
quais as amostras de interesse são solúveis. As frações mais polares puderam ser
separadas nesse tipo de fase estacionária, deixando de lado a necessidade de
submeter às frações a reação de acetilação.
Sephadex LH-20 é formada por polímeros de dextrana e é utilizada nos
processos de filtração em gel de produtos naturais. Vários pesquisadores tem obtido
sucesso no isolamento de substâncias utilizando esse sistema de filtração por exclusão
(Endale et al., 2005; Orsini et al., 1986; Woldemichael et al., 2003).
Parte da fração n-BuOH (2,5 g) foi utilizada para realização de coluna em
Sephadex utilizando a coluna SP
maior
. As frações semelhantes reunidas foram
submetidas à CC (SP
menor
), as frações SP
5
/n-BuOH F
4
e SP
6
/F
3
SP
5
F
5
que
apresentavam perfil cromatográfico semelhante em CCD foram reunidas e foi chamada
de fração SP-HPLC1. A fração SP-HPLC1 apresenta apenas uma substãncia em CCD
(Figura 11a). O espectro UV mostrou absorçôes em 210, 269 e 348 nm sugerindo-se a
presença de flavonóides. O perfil cromatográfico em CLAE (Figura 11b) mostra a
predominância de uma substância com t
r
32,639. O flavonóide isovitexina está
59
presente na amostra, em t
r
63,044, não sendo essa a substância em maior quantidade
na fração.
a b
Figura 11: (a) Perfil Cromatográfico da fração SP-HPLC1 em CCD. FM: EtOAc-
HCO
2
H-H
2
O (6:1:1), revelador NEU e (b) CLAE FM: sol. aquosa HCO
2
H 2%-
CH
3
CN 90:10, fluxo 1,0 ml/min e λ=340 nm.
Parte da fração (30 mg) SP-HPLC1 foi submetida à análise em RMN, mas não
pôde ser identificada devido a pouca quantidade de material. O restante do material foi
submetido novamente a CC (SP
mini
) com o objetivo de se isolar a substância em maior
quantidade na fração. O que antes parecia uma fração com apenas uma substância
(Figura 11a), após sucessivas colunas em Sephadex podem ter se decomposto,
mostrando substâncias que não estão presentes na fração original (Figura 12). A
extração com MeOH pode resultar na formação de metil derivados, não encontrados
originalmente nas plantas (Oleszek e Bialy, 2006).
60
Figura 12: Perfil Cromatográfico em CCD da fração (I) e sub-frações da SP-
HPLC1 (FM: EtOAc-HCO
2
H-H
2
O (6:1:1), revelador anisaldeído sulfúrico.
A fração SP
6
/F
3
SP
5
F
6
apresentou apenas uma mancha quando em CCD
(EtOAc-HCO
2
H-H
2
O 6:1:1) com R
f
de 0,66. A substância presente na fração, codificada
por SP
6
F
6
50, foi analisada em experimentos de RMN (solvente MeOD).
Fração aquosa
A fração aquosa do extrato metanólico desclorofilado de P. actinia mostrou-se
interessante, pois uma CCD geral utilizando revelador anisaldeído sulfúrico evidenciou
a presença de possíveis saponinas na forma de manchas de coloração rósea. A
literatura até o momento relatou saponinas para a espécie P. alata, P. quadrangularis e
P. edulis, mas nunca para a espécie P. actinia. Quando aplicada a técnica de agitação
em tubo, ocorre a formação de espuma, em pouca quantidade, mas persistente.
A primeira tentativa de separação da fração aquosa foi realizada em coluna à
vácuo utilizando Sílica Gel 60G em um funil de vidro sinterizado (pag. 43). As frações
61
da coluna CV
3
(Figura 13), após análise do seu perfil cromatográfico foram separadas
em 1, 2, 3, (4, 5, 6), (7, 8, 9), (10, 11). As frações 1, 2 e 3 foram guardadas para
estudos posteriores. As frações 7, 8, 9 apresentaram uma macha vermelha em CCD
bem polar quando revelada com anisaldeído sulfúrico, sendo que a acetilação dessas
frações foi realizada numa tentativa de isolar as possíveis substâncias triterpênicas.
Figura 13: Fracionamento da fração aquosa do extrato metanólico
desclorofilado em coluna à vácuo (CV
3
), FM: DCM-EtOH (1:1), revelador
anisaldeído sulfúrico. Frações 4, 5, 6 (amarelo), 7, 8, 9 (vermelho) e 10,
11 (azul)
.
Após análise em CCD e reação de acetilação, separações em coluna de Sílica
Gel 60G das frações semelhantes foram realizadas (Figura 14 e 15).
62
F1 F2 F3 F4 F5
Figura 14: Resultado da coluna ACT 4, 5, 6
CV
3
. FM: tolueno-EtOAc (1:1), revelador
anisaldeído sulfúrico.
Figura 15: Resultado da coluna ACT 7, 8, 9 CV
3
(material de partida,
frações e material de limpeza da coluna). FM: tolueno-EtOAc (1:1),
revelador anisaldeído sulfúrico
A F1 da coluna ACT 4, 5, 6 CV
3
(Figura 14) formou cristais e a substância
presente em maior quantidade foi chamada de ACT
43.
O mesmo ocorreu com a fração
29-47 que continha a substância ACT
46
da coluna ACT 7, 8, 9 da CV
3
(Figura 15).
63
Uma varredura em UV foi realizada com as frações que contêm as substâncias
ACT
43
e ACT
46
e os espectros mostraram que ambas absorvem no mesmo
comprimento de onda (273 e 225 nm) sugerindo serem a mesma substância. Os
espectros de
13
C- e
1
H-RMN das frações que continham as substâncias ACT
43
e ACT
46
apresentou diversos sinais demostrando que as substâncias estavam impuras, não
sendo possível a sua identificação.
O espectro de
1
H-RMN de ACT
43
(Figura 16) apresentou sinais característicos de
acetatos em 2,0 ppm, série de sinais entre 4 e 6 ppm, um sinal de dupla ligação em 6,2
ppm, indicando tratar-se possivelmente de uma substância glicosilada.
Figura 16: Espectro de
1
H- RMN (400 MHz, CDCl
3
) da substância ACT
43
64
Uma coluna foi realizada com as frações ACT 7, 8, 9 CV3, ACT 10, 11 CV
3
e
ACT 9, 10 CV
2
, chamada coluna CV
2
,
3
(todas). As primeiras frações (1-22) da coluna
CV
2
,
3
(todas) formaram um precipitado, o qual foi analisado em
1
H-RMN e
13
C-RMN.
O espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (Figura 17)
apresentou um sinal singlete em 2,09 ppm para três hidrogênios e um sinal singlete em
2,08 ppm, referente a seis hidrogênios, indicando a presença de três acetatos. Outros
sinais importantes apareceram em δ 4,15 como duplo dubleto com constantes de
acoplamento de 12 e 5,8 Hz e integração para dois hidrogênios e também um duplo
dubleto em δ 4,29, também com integração para dois hidrogênios e J = a 12 e 4,3 Hz.
Um quinteto em δ 5,24 para um hidrogênio, J = 4,3 demonstra um acoplamento com o
sinal em δ 4,29, confirmado pelo espectro de COSY (Figura 18). Nenhum outro sinal no
espectro apresentou qualquer possibilidade de correlação entre os sinais citados,
sugerindo ser uma substância de baixo peso molecular. O espectro de HMQC
apresentou correlações próprias entre os sinais dos hidrogênios do radical acetila com
sinais em 20,7 e 20,9 ppm, como também sinais em 170,7 e 170,2, próprios para a
presença de três carbonilas, confirmando a presença dos três grupos acetatos. Um
sinal em 62,1 ppm apresentou correlação com os sinais em δ 4,29 e 4,15,
demonstrando tratar-se de hidrogênios geminais (Williams e Fleming, 1995), sendo que
o sinal do hidrogênio em δ 5,24 apresentou correlação com o sinal em 62,3 ppm do
espectro de
13
C-RMN. A posição dos três sinais de carbono em torno de 60 ppm indica
tratar-se de ésteres, o que corrobora com os sinais de grupos acetilas. Dessa forma,
resta caracterizar a substância como sendo o tri-acetato de glicerol (Figura 19), uma
65
substãncia que provavelmente exista em plantas desde sua origem há 200 milhões de
anos (Gerber et al., 1988; Khorun et al., 2006).
A presença de glicerol em produtos naturais é bem conhecida em insetos e
animais como crioprotetores (Li et al., 2003). Plantas possuem células especializadas
que confinam e protegem tecidos. Esta proteção é necessária para defender as plantas
de patógenos e evitar sua desidratação. As folhas são protegidas pela epiderme
principalmente pelo seu conteúdo em biopolímeros, p.ex. cutina na epiderme e suberina
na periderme (Graca et al., 2002). Suberina, conforme demonstrado por Graca e
Pereira (1997) e Moire et al. (1999) possui glicerol em quantidade suficiente para
esterificar a maior parte dos grupos carboxilas presentes em sua estrutura, o que
sugere justificar a presença desta substãncia nas folhas de P. actinia. Gerber (1988)
desenvolveu um procedimento por HPLC para quantificar a presença de glicerol em
vegetais, demonstrando que em anaerobiose, as plantas apresentam maior quantidade
dessa substãncia (Gerber et al., 1988).
66
Figura 17: Espectro de
1
H- RMN (400 MHz, CDCl
3
) do glicerol acetilado
H
C
C
C
H
H
H
H
O
O
O
CH
3
CH
3
CH
3
O
O
O
δ 4,15, dd
12 e 5,8 Hz
δ 4,15, dd
12 e 5,8 Hz
δ 5,24
4,3 Hz
δ 4,29, dd
12 e 4,3 Hz
δ 4,29, dd
12 e 4,3 Hz
62,1
62,1
68,9
2,08, s
2,08, s
2,09, s
170,7
20,7
20,9
20,7
170,2
170,7
67
Figura 18: Espectro de COSY (400 MHz, CDCl
3
) do glicerol acetilado
H
C
C
C
H
H
H
H
O
O
O
CH
3
CH
3
CH
3
O
O
O
δ
4,15, dd
12 e 5,8 Hz
δ 4,15, dd
12 e 5,8 Hz
δ 5,24
4,3 Hz
δ 4,29, dd
12 e 4,3 Hz
δ 4,29, dd
12 e 4,3 Hz
62,1
62,1
68,9
2,08, s
2,08, s
2,09, s
170,7
20,7
20,9
20,7
170,2
170,7
Figura 19: Substância tri-acetato de glicerol
68
A fração aquosa (2,5 g) também foi fracionada utilizando colunas Sephadex LH-
20. Foram realizadas separações cromatográficas diversas (página 45) com o objetivo
de ir separando ao máximo as substâncias presentes na fração. Na primeira coluna
realizada, foram reunidas as frações semelhantes, mas como a separação não foi muito
efetiva, apenas uma das frações foi utilizada (F
3
) e as demais foram guardadas para
posteriormente fazer outra coluna. A fração F
3
(Figura 20) foi chamada de F
3
SP
1
. Essa
fração apresentou, quando submetida a CCD e revelada com anisaldeído sulfúrico, uma
mancha vermelha, o que sugere a presença de glicosídeos triterpênicos, possíveis
saponinas.
F
aq
F
1
F
2
F
3
F
4
Figura 20: CCD da fração aquosa e
suas frações da SP1. Em destaque a
F
3
de coloração avermelhada. FM:
DCM-EtOH (1:1), revelador
anisaldeído sulfúrico.
A fração F
3
SP
1
foi submetida novamente a cromatografia em SP
menor
e foram
separadas subfrações SP
4
(F
3
-SP
1
)F
1
e SP
4
(F
3
-SP
1
)F
2
. Ambas apresentaram manchas
de coloração rosa (Figura 21). Foram reunidas as frações para posterior separação.
69
Como a separação da fração F
3
SP
1
em Sephadex não foi eficiente, foi feita uma
tentativa de fracionamento em resina Amberlite XAD-16.
A grande maioria dos artigos onde se fala do isolamento e identificação de
substâncias polares (saponinas) fala também da utilização de resinas iônicas do tipo
Amberlite, sugerindo a utilização primeiramente de resinas do tipo Amberlite, seguido
por purificações em Sephadex. A resina muito utilizada para separação das substãncias
polares contidos em extratos de plantas são as do tipo Amberlite XAD-16. Essas
resinas são úteis na separação de substâncias polares hidro e álcool solúveis. Quando
se elui a coluna com água, as substâncias fenólicas ficam retidas na coluna, enquanto
as demais são eluidas sem nenhuma interação, sendo interessante na separação de
glicosil flavonóides e saponinas.
A coluna em Amberlite XAD-16 da fração F
3
SP
1
resultou em uma separação
mais efetiva (Figura 22).
F
1
F
2
F
1
F
2
(1) (2)
Figura 21: Frações SP
4
(F
3
-SP
1
)F
1
e SP
4
(F
3
-SP
1
)F
2
nas seguintes
fases móveis: (1) AcOEt-HCO
2
H-H
2
O (6:1:1) e (2) DCM-EtOH (1:1),
revelador anisaldeído sulfúrico.
70
Figura 22: Coluna Amberlite XAD-16 fração
SP
4
(F
3
-SP
1
)F
1
F
2
FM: AcOEt-HCO
2
H-H
2
O
(6:1:1), revelador anisaldeído sulfúrico.
A mancha azul, que não apresenta fluorescência em ondas longas, foi obtida em
pequena quantidade (12 mg) após isolamento por CCD preparativa, sendo que não foi
possível a sua identificação por RMN uma vez que a amostra estava muito diluída.
Numa tentativa de verificar se a separação poderia ser melhor se fosse utilizada
a resina Amberlite XAD-16 como primeira opção de separação, foi realizada uma
separação com a fração aquosa (coluna AMB-FLO) (Figura 23).
71
Figura 23: Coluna AMB-FLO da fração aquosa. Em destaque a
fração F
1
.
FM: AcOEt-HCO
2
H-H
2
O (5:1:1), revelador anisaldeído
sulfúrico.
A fração 1 (F
1
) apresentou uma mancha rósea, com possível perfil de uma
aglicona de saponina. Ácido p-cumárico revela com coloração rosa com anisaldeído
sulfúrico, semelhante à mancha da F
1
na Figura 23. CCD do ácido p-cumárico em
comparação com a fração F
1
mostrou R
f
de 0,9 e 0,7 para a mancha vermelha da
fração F
1
, ambas com coloração igual. Para verificar se a mancha rosa presente na F
1
apresenta alguma correlação com o ácido p-cumárico (31), possivelmente um éster, foi
realizada hidrólise com HCl 1% e 36%. Os resultados em CCD obtidos mostraram que
não há nenhuma correlação da mancha rosa obtida com o ácido p-cumárico.
HO
OH
O
31
72
Com o objetivo de isolar essa substãncia rósea, foram realizadas separações
em Sephadex da F1 sem hidrolizar utilizando MeOH como eluente. Da primeira coluna
em Sephadex foram obtidas 33 frações de 4 ml, das quais por agrupamento das
semelhantes foram agrupadas em três subfrações. Uma dessas subfrações foi
submetida novamente a cromatografia em Sephadex, e foram recolhidas 39 frações de
4 ml. As frações de número 15-21 apresentavam perfis semelhantes, e quando
agrupadas formaram cristais na forma de prismas. Os cristais foram solúveis somente
em D
2
O, e insolúveis em qualquer outro solvente. O espectro de
1
H-RMN (Figura 24)
mostrou dois duplos dubletos em 6,5 ppm, um sinal possivelmente para um grupo
metoxila em 3,2 ppm, além dos sinais do solvente. Apesar da substância estar
cristalizada, por RMN não foi possível a sua identificação, mas, por ser um cristal com
formas bem definidas espera-se conseguir elucidar a sua estrutura atrvés de
experimentos utilizando experimentos de Raio-X.
Figura 24: Espectro de
1
H- RMN (400 MHz, D
2
O) dos cristais (F
1
)
73
CONCLUSÕES E TRABALHOS FUTUROS
Em função da dificuldade de isolar substâncias polares pelos procedimentos
adotados, como alternativa, pretende-se utilizar para as subfrações de SP-HPLC1 o
método de separação em CLAE semi-preparativa para isolar a substância que aparece
em maior quantidade (maior pico no tempo de retenção de 32 min). A fase móvel
escolhida é HCO
2
H 2% e CH
3
CN (90:10) e fluxo 1,0 ml/min. Essa fase móvel foi testada
em CLAE analítica e mostrou-se apropriada para a separação. A substância que
aparece em tempo de retenção 63 min é a isovitexina, sendo que sua purificação
também poderá ser realizada pela mesma técnica e obter através de análise por RMN a
confirmação definitiva da presença desse flavonóide em P. actinia.
Encontrou-se grande dificuldade em trabalhar com as frações polares e sílica,
sendo que utilizar Amberlite e Sephadex, nessa ordem, está se mostrando muito útil na
separação da fração aquosa ao invés de Sephadex antes de Amberlite. As outras
subfrações da separação Amberlite/Sephadex poderão ser fracionadas posteriormente
em Sephadex para tentar separar outras substâncias polares que possuem similaridade
em CCD com saponinas.
Ao mesmo tempo, a utilização de MeOH em coluna de Sephadex pode ter
gerado substâncias de decomposição que não estavam presentes na amostra. O
solvente utilizado nas análises de RMN foi MeOD sugerindo a ocorrência de alguma
interferência do solvente em função dos resultados obtidos em ambos os experimentos,
o que deverá ser investigado posteriormente.
74
O biomonitoramento pode ser útil no desenvolvimento desse trabalho, sendo que
as frações semi-purificadas serão utilizadas para a realização de experimentos
farmacológicos em modelos de ansiedade para verificar se existe alguma correlação
dessas substâncias com a atividade já observada para os extratos brutos e frações
polares. A substância responsável pela atividade ansiolítica e sedativa do maracujá
ainda é uma incógnita, sugerindo-se ser um grupo de substâncias, e não somente uma
substância isolada a responsável pelos seus efeitos.
75
REFERÊNCIAS
Abourashed, E. A., Vanderplank, J. e Khan, I. A.: High-speed extraction and
HPLC fingerprinting of medicinal plants - II. Application to harman alkaloids of
genus Passiflora. Pharmaceutical Biology 41 (2): 100-106, 2003.
Abourashed, E. A., Vanderplank, J. R. e Khan, I. A.: High-speed extraction and
HPLC fingerprinting of medicinal plants - I. Application to Passiflora flavonoids.
Pharmaceutical Biology 40 (2): 81-91, 2002.
Alonso, J. R.: Tratado de fitomedicina: bases clínicas e farmacológicas, ISIS,
Buenos Aires, 1998.
Armarego, W. L. F., Perrin, D. D.: Purification of Laboratory Chemicals,
Butterworth Heinemann, Auckland, 1996.
Andersen, L., Adsersen, A. e Jaroszewski, J. W.: Cyanogenesis of Passiflora
foetida. Phytochemistry 47 (6): 1049-1050, 1998.
Aoyagi, N., Kimura, R. e Murata, T.: P. incarnata dry extracts. I. Isolation of maltol
and Pharmacological action of maltol and ethyl maltol. Chemical and
Pharmaceutical Bulletin 22: 1008-1013, 1974.
Barroso, G. M.: Sistemática de angiosperma do Brasil, Editora Universitária de
São Paulo, Viçosa, 1978.
Bokstaller, S. e Schmidt, P. C.: A comparative study on the content of
passionflower flavonoids and sesquiterpenes from valerian roots extracts in
pharmaceutical preparations by HPLC. Pharmazie 52 (7): 552-557, 1997.
Bombardelli, E., Bonati, A., Gabetta, B., Martinelli, E. M. e Mustich, G.:
Passiflorine, a new glycoside from Passiflora edulis. Phytochemistry 14: 2661-
2665, 1975.
Borreli, E., Pinto, L., Izzo, A. A., Mascolo, N., Capasso, F., Mercati, V., Toja, E. e
Autore, G.: Anti-inflamatory activity of Passiflora incarnata L. in rats. Phytoterapy
Research 10: S104-6, 1996.
Butler, M. S.: The role of natural product chemistry in drug discovery. Journal of
natural products 67: 2141-2153, 2004.
Camargo, M. T. L. A.: Etnofarmacobotânica: conceituação e metodologia de
pesquisa, Humanitas/FFLCH/USP: Terceira margem, São Paulo, 2003.
76
Carlini, E. A.: Plants and the central nervous system. Pharmacology,
biochemistry, and behavior 75 (3): 501-12, 2003.
Carlo, G. D., Mascolo, N., Izzo, A. A. e Capasso, F.: Flavonoids: old and new
aspects of a class of natural therapeutic drugs (Minireview). Life Sciences 65 (4):
337-53, 1999.
Cass, H.: Herbs for the nervous system: Ginkgo, Kava, Valerian, Passionflower.
Seminars in integrative medicine 2: 82-88, 2004.
Cass, Q. B. e Degani, A. L. G.: Desenvolvimento de métodos por HPLC:
Fundamentos, estratégias e validação, EdUFSCar, São Carlos, 2001.
Chassagne, D. e Crouzet, J.: A cyanogenic glycoside from Passiflora edulis fruits.
Phytochemistry 49 (3): 757-759, 1998.
Chassagne, D., Crouzet, J., Bayonove, C. L. e Baumes, R. L.: Glycosidically
bound eugenol and methyl salicylate in the fruit of edible Passiflora species.
Journal of Agricultural and Food Chemistry 45 (7): 2685-2689, 1997.
Chassagne, D., Crouzet, J. C., Bayonove, C. L. e Baumes, R. L.: Identification
and quantification of passion fruit cyanogenic glycosides. Journal of Agricultural
and Food Chemistry 44 (12): 3817-3820, 1996.
Chaves, M. H., Freitas, A., Roque, N. F. e Cavaleiro, A. J.: Separação e
identificação de constituintes químicos polares dos galhos de Porcelia
macrocarpa. Química nova 23 (3), 2000.
Coleta, M., Campos, M. G., Cotrim, M. D. e Cunha, A. P. d.: Comparative
evaluation of Melissa officinalis L., Tilia europaea L., Passiflora edulis Sims. and
Hypericum perforatum L. in the elevated plus maze anxiety test.
Pharmacopsychiatry 34 Suppl 1: S20-1, 2001.
Cordell, G. A.: Introduction to alkaloids: A biogenetic approach, John Wiley and
sons, New York, 1981.
Cronquist, A.: An integrated system of classification of flowering plants, Columbia
University Press, New York USA, 1981.
Da-Silva, R. A. D.: Pharmacopéia dos Estados unidos do Brasil, Companhia
Editora Nacional, São Paulo, 1926.
Dhawan, K., Dhawan, S. e Chhabra, S.: Attenuation of benzodiazepine
dependence in mice by a tri-substituted benzoflavone moiety of Passiflora
77
incarnata Linneaus: A non-habit forming anxiolytic. Journal of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences 6 (2): 215-222, 2003a.
Dhawan, K., Dhawan, S. e Sharma, A.: Passiflora: a review update. Journal of
Ethnopharmacology 94 (1): 1-23, 2004.
Dhawan, K., Kumar, S. e Sharma, A.: Anti anxiety studies on extracts of
Passiflora incarnata Linneaus. Journal of Ethnopharmacology 78 (2-3): 165-170,
2001a.
Dhawan, K., Kumar, S. e Sharma, A.: Anxiolytic activity of aerial and underground
parts of Passiflora incarnata. Fitoterapia 72 (8): 922-926, 2001b.
Dhawan, K., Kumar, S. e Sharma, A.: Comparative biological activity study on
Passiflora incarnata and P. edulis. Fitoterapia 72 (6): 698-702, 2001c.
Dhawan, K., Kumar, S. e Sharma, A.: Reversal of cannabinoids (∆(9)-THC) by
the benzoflavone moiety from methanol extract of Passiflora incarnata Linneaus
in mice: a possible therapy for cannabinoid addiction. Journal of Pharmacy and
Pharmacology 54 (6): 875-881, 2002a.
Dhawan, K., Kumar, S. e Sharma, A.: Suppression of alcohol-cessation-oriented
hyper-anxiety by the benzoflavone moiety of Passiflora incarnata Linneaus in
mice. Journal of Ethnopharmacology 81 (2): 239-244, 2002b.
Dhawan, K., Kumar, S. e Sharma, A.: Aphrodisiac activity of methanol extract of
leaves of Passiflora incarnata Linn. in mice. Phytotherapy Research 17 (4): 401-
403, 2003b.
Dhawan, K. e Sharma, A.: Antitussive activity of the methanol extract of
Passiflora incarnata leaves. Fitoterapia 73 (5): 397-399, 2002.
Doyama, J. T., Rodrigues, H. G., Novelli, E. L., Cereda, E. e Vilegas, W.:
Chemical investigation and effects of the tea of Passiflora alata on biochemical
parameters in rats. Journal of Ethnopharmacology 96 (3): 371-4, 2005.
Elizabetsky, E. e Costa-Campos, L.: The alkaloid alstonine: a review of its
pharmacological properties. Evidence based complementary and alternative
medicine 3 (1): 39-48, 2006.
Endale, A., Wray, V., Murillo, R., Schmidt, P. C. e Merfort, I.: Hopane-type
saponins from the seds of glinus lotoides. Journal of Natural Products 68: 443-
446, 2005.
Farmacopéia: Farmacopéia dos Estados Unidos do Brasil (F. Bras. II), Indústria
Gráfica Siqueira S.A., São Paulo, 1959.
78
Farmacopéia: Farmacopéia Brasileira (F. Bras. III), Organização Andrei Editora
S.A., São Paulo, 1977.
Ferro, D.: Fitoterapia : Conceitos clínicos, Editora Atheneu, São Paulo, 2006.
Francisco, I. A. e Pinotti, M. H. P.: Cyanogenic glycosides in plants. Brazilian
Archives of Biology and Technology 43 (5): 487-492, 2000.
Freitas, P. C. D.: Estudo Farmacognóstico comparativo de espécies Brasileiras
do Gênero Passiflora L., Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de
São Paulo, São Paulo, 1985.
Gavasheli, N. M., Moniava, I. I. e Eristavi, L. I.: Aminoacids from Passiflora
Incarnata, Cultivated in Georgian SSR. Khimiya Prirodnykh Soedinenii 10 (2):
266-266, 1974.
Geiger, H. e Markham, K. R.: The C-glycosylflavone pattern of Passiflora
incarnata L. Zeitschrift Fur Naturforschung C- a Journal of Biosciences 41 (9-10):
949-950, 1986.
Gerber, D. W., Byerrum, R. U., Gee, R. W. e Tolbert, N. E.: Glycerol
Concentrations in Crop Plants. Plant Science 56 (1): 31-38, 1988.
Giavina-Bianchi, P. F., Castro, F. F. M., Machado, M. L. S. e Duarte, A. J. S.:
Occupational respiratory allergic disease induced by Passiflora alata and
Rhamnus purshiana. Annals of Allergy Asthma & Immunology 79 (5): 449-454,
1997.
Graca, J. e Pereira, H.: Cork suberin: a glyceryl based polyester. Holzforschung
51: 225–234, 1997.
Graca, J., Schreiber, L., Rodrigues, J. e Pereira, H.: Glycerol and glyceryl esters
of omega-hydroxyacids in cutins. Phytochemistry 61 (2): 205-215, 2002.
Guimarães, F. S.: Medicamentos hipnóticos. Em Fundamentos de
Psicofarmacologia, ed. by F. G. Graeff and F. S. Guimarães, pp. 161-174,
Atheneu, São Paulo, 1999.
Handley, S. L. e Mithani, S.: Effects of alpha adrenoceptor agonists and
antagonists in a maze exploration model of fear motivated behavior. Naunyn-
Schmiedebergs Archives of Pharmacology 327 (1): 1-5, 1984.
Harborne, J. B.: The flavonoids: advances in research since 1980, Chapman &
Hall, London, 1988.
79
Harvey, A. L.: Medicines from nature: are natural products still relevant to drug
discoverey? Trends in pharmacological sciences 20: 196-198, 1999.
Ichimura, T., Yamanaka, A., Ichiba, T., Toyokawa, T., Kamada, Y., Tamamura, T.
e Maruyama, S.: Antihypertensive effect of an extract of Passiflora edulis rind in
spontaneously hypertensive rats. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 70
(3): 718-721, 2006.
Jaroszewski, J. W., Olafsdottir, E. S., Wellendorph, P., Christensen, J., Franzyk,
H., Somanadhan, B., Budnik, B. A., Jorgensen, L. B. e Clausen, V.: Natural
cyclopentanoid cyanohydrin glycosides, part 23. Cyanohydrin glycosides of
Passiflora: distribution pattern, a saturated cyclopentane derivative from P.
guatemalensis, and formation of pseudocyanogenic alpha-hydroxyamides as
isolation artefacts. Phytochemistry 59 (5): 501-511, 2002.
Judd, W. S., Campbell, C. S., Kelogg, E. A. e Stevens, P. F.: Plant systematics- A
phylogenetic approach, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massachussetts
USA, 1999.
Khorun, L. V., Zakharov, V. G. e Sokolov, D. D.: Quantitative estimation of the
dynamics of adventive flora (by the example of the Tula region). Zhurnal
Obshcheĭ Biologii 67 (4): 298-310, 2006.
Kidoy, L., Nygard, A. M., Andersen, O. M., Pedersen, A. T., Aksnes, D. W. e
Kiremire, B. T.: Anthocyanins in fruits of Passiflora edulis and P. suberosa.
Journal of food composition and analysis 10: 49-54, 1997.
Kimura, R., Matsui, S., Ito, S., Aimoto, T. e Murata, T.: Studies on Passiflora
incarnata dry extract .2. Central depressant effects of maltol analogs in mice.
Chemical & Pharmaceutical Bulletin 28 (9): 2570-2579, 1980.
Kumar, S. e Sharma, A.: Apigenin: The anxiolytic constituent of Turnera
aphrodisiaca. Pharmaceutical Biology 44 (2): 84-90, 2006.
Kurtz, S. M. T. F.: Maracujá: Farmacognose das folhas de Passiflora actinia
Hooker e estudo preliminar de formulação para incorporar a tintura de Passiflora
alata Dryander, Passifloraceae. Em Farmacognosia, Universidade Federal do
Paraná, Curitiba, 2001.
Kurtz, S. M. T. F., Santos, C. A. M., Duarte, M. R. e Sato, M. E. O.:
Morfoanatomia de folhas de maracujá: Passiflora actinia Hooker, Passifloraceae.
Acta Farmaceutica Bonaerense 22 (2): 105-112, 2003.
80
Li, N. G., L.Osakovskii, V. e Ivanova, S. S.: Chemical composition and
cryoprotective activity of ethanol extract from winter caterpillars Aporia crataegi L.
Izvestiia Akademii nauk. Seriia biologicheskaia / Rossiĭskaia akademiia nauk 5:
547-52, 2003.
Li, Q. M., Heuvel, H. V. D., Delorenzo, O., Corthout, J., Pieters, L. A. C., Vlietinck,
A. J. e Claeys, M.: Mass spectral characterization of C-glycosidic flavonoids
isolated from a medicinal plant (Passiflora incarnata). Journal of Chromatography:
Biomedical Applications 562 (1-2): 435-446, 1991.
Loggia, R. D., Tubaro, A. e Redaelli, C.: Evaluation of the activity on the mouse
CNS of several plant extracts and a combination of them. Rivista di neurologia 51
(5): 297-310, 1981.
Löhdefin, J. e Kating, H.: Zur Frage des Vorkommens von Harmanalkaloiden in
Passiflora incarnata Planta Medica 25 (2): 101-104, 1974.
Lolli, L. F., Sato, C. M., Romanini, C. V., Villas-Bôas, L. B., Santos, C. A. M. e
Oliveira, R. M. W.: Possible involvemet of GABAa-benzodiazepine receptor in the
anxiolitic-like effect induced by Passiflora actinia extracts in mice. Journal of
Ethnopharmacology, 2007.
Lorenz, A. P.: Relações evolutivas entre Passiflora actinia Hooker e Passiflora
elegans Masters (Passifloraceae). In Departamento de Genética e Biologia
Molecular, pp. 95, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,
2002.
Lutomski, J.: Qualitative and quantitative chromatographyc investigation of
alkaloids of Passiflora incarnata. Biul. Inst. Roslin Leczniczych 5: 181-198, 1959.
Marchart, E., Krenn, L. e Kopp, B.: Quantification of the flavonoid glycosides in
Passiflora incarnata by capillary electrophoresis. Planta Medica 69 (5): 452-456,
2003.
Mareck, U., Herrmann, K., Galensa, R. e Wray, V.: The 6-C-chinovoside and 6-C-
fucoside of luteolin from Passiflora edulis. Phytochemistry 30 (10): 3486-3487,
1991.
Medina, J. H., Paladini, A. C., Wolfman, C., Stein, L. L. d., Calvo, D., Diaz, L. E. e
Peña, C.: Chrysin, a naturally occurring monoflavonoid, recognises
benzodiazepine receptors and possesses anticonvulsivat properties. Biochemical
Pharmacology 40 (2227-2232), 1990.
81
Menghini, A. e Mancini, L. A.: TLC determination of flavonoid accumulation in
clonal populations of Passiflora incarnata L. Pharmacoogical Research
Communications 20 (5): 113-6, 1988.
Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R. E. e Ryser, U.: Glycerol is
a suberin monomer. New experimental evidence for an old hypothesis. Journal of
plant physiology 119 (3): 1137-46, 1999.
Montanher, A. B., Zucolotto, S. M., Schenkel, E. P. e Fröde, T. S.: Evidence of
anti-inflammatory effects of Passiflora edulis in an inflammation model Journal of
Ethnopharmacology 109 (2): 281-88, 2006.
Moraes, M. L. L.: Extração e análise de flavonóides em espécies brasileiras de
Passiflora L. Em Instituto de Química de São Carlos, Universidade Federal de
São Carlos, São Carlos, 1995.
Muller, S. D., Vasconcelos, S. B., Coelho, M. e Biavatti, M. W.: LC and UV
determination of flavonoids from Passiflora alata medicinal extracts and leaves.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 37 (2): 399-403, 2005.
Newall, C. A., Anderson, L. A. e Phillipson, J. D.: Herbal medicines. A guide for
health care professionals, The Pharmaceutical Press, Cambridge, 1996.
Nodari, R. O. e Guerra, M. P.: Biodiversidade: aspectos biológicos, geográficos,
legais e éticos. Em Farmacognosia: da planta ao medicamento, ed. por C. M. O.
Simões, E. P. Schenkel, G. Gosmann, J. C. P. Mello, L. A. Mentz, e P. R.
Petrovick, pp. 11-24, Editora UFSC/Editora UFRGS, Florianópolis/Porto Alegre,
2003.
Oga, S., Freitas, P. C. D. D., Silva, A. C. G. D. e Hanada, S.: Pharmacological
trials of crude extract of Passiflora alata. Planta Medica 50 (4): 303-306, 1984.
Oleszek, W., e Bialy, Z.: Chromatographic determination of plant saponins-An
update (2002-2005). Journal of Chromatography A 1112 (1-2): 78-91, 2006.
Orsini, F., Pelizzoni, F., Ricca, G. e Verotta, L.: Triterpene Glycosides Related to
Quadranguloside from Passiflora quadrangularis. Phytochemistry 26 (4): 1101-
1105, 1987.
Orsini, F., Pelizzoni, F. e Verotta, L.: Quadranguloside, a cycloartane triterpene
glycoside from Passiflora quadrangularis. Phytochemistry 25 (1): 191-193, 1986.
Paladini, A. C., Marder, M., Viola, H., Wolfman, C., Wasowski, C. e Medina, J. H.:
Flavonoids and the central nervous system: from forgotten factors to potent
82
anxiolytic compounds. Journal of Pharmacy and Pharmacology 51 (5): 519-526,
1999.
Paris, F. d., Petry, R. D., Reginatto, F. H., Gosmann, G., Quevedo, J., Salgueiro,
J. B., Kapczinski, F., Ortega, G. G. e Schenkel, E. P.: Pharmacochemical study of
aqueous extracts os Passiflora alata Dryander and Passiflora edulis Sims. Acta
Farmaceutica Bonaerense 21 (1): 5-8, 2002.
Pastene, E., Montes, M. e Vega, M.: New HPTLC method for quantitative
analysis of flavonoids of Passiflora coerulea L. Journal of Planar Chromatography
10 (5): 362-367, 1997.
Pereira, C. A. M. e Vilegas, J. H. Y.: Constituíntes químicos e farmacologia do
gênero Passiflora com ênfase a P. alata Dryander, P. edulis Sims e P. incarnata
L. Revista Brasileira de Plantas Medicinais 3 (1): 1-12, 2000.
Pereira, C. A. M., Yariwake, J. H., Lancas, F. M., Wauters, J. N., Tits, M. e
Angenot, L.: A HPTLC densitometric determination of flavonoids from Passiflora
alata, P. edulis, P. incarnata and P. caerulea and comparison with HPLC method.
Phytochemical Analysis 15 (4): 241-248, 2004.
Pereira, C. A. M., Yariwake, J. H. e McCullagh, M.: Distinction of the C-
glycosylflavone isomer pairs orientin/isoorientin and vitexin/isovitexin using
HPLC-MS exact mass measurement and in-source CID. Phytochemical Analysis
16: 295-301, 2005.
Perrin, D. D., Armarego, W. L. F. e Perrin, D. R.: Purification of Laboratory
Chemicals, Pergamon Press, Oxford, 1966.
Perry, N. B., Albertson, G. D., Blunt, J. W., Cole, A. L. J., Munro, M. H. G. e
Walker, J. R. L.: Antibiotic compounds from New-Zealand plants. IV. 4-hydroxy-2-
cyclopentenone - an antipseudomonas and cytotoxic component from Passiflora
tetrandra. Planta Medica 57 (2): 129-131, 1991.
Petry, R. D., Reginatto, F., de-Paris, F., Gosmann, G., Salgueiro, J. B., Quevedo,
J., Kapczinski, F., Ortega, G. G. e Schenkel, E. P.: Comparative pharmacological
study of hydroethanol extracts of Passiflora alata and Passiflora edulis leaves.
Phytotherapy Research 15 (2): 162-164, 2001.
Petry, R. D., Souza, K. C. B. d., Bassani, V. L., Petrovick, P. R. e Ortega, G. G.:
Doseamento do teor de flavonóides totais em extratos hidroalcóolicos de
Passiflora alata Dryander (maracujá). Revista Brasileira de Farmácia 79 (1/2): 7-
10, 1998.
83
Phillipson, J. D.: 50 years of medicinal plant research - Every progress in
methodology is a progress in science. Planta Medica 69 (6): 491-495, 2003.
Pietta, P., Manera, E. e Ceva, P.: Isocratic liquid chromatographic method for the
simultaneous determination of Passiflora incarnata L. and Crataegus monogyna
flavonoids in drugs. Journal of Chromatography 357 (1): 233-238, 1986.
Pietta, P. G., Mauri, P. L., Manera, E., Ceva, P. L. e Rava, A.: An Improved
determination of flavonoids in medicinal plant extracts. Chromatographia 27 (9-
10): 509-512, 1989.
Poethke, W., Schwarz, C. e Gerlach, H.: Ueber die inhaltsstoffe von Passiflora
bryonioides. Planta Medica 18 (4): 303-314, 1970.
Polunin, M. e Robbins, C.: A farmácia natural: Guia de medicamentos naturais,
Dorling Kindersley, Londres, 1992.
Prabhakar, M. C., Bano, H., Kumar, I., Shamsi, M. A. e Khan, M. S. Y.:
Pharmacological investigations on vitexin. Planta Medica 43 (4): 396-403, 1981.
Quercia, V., Turchetto, L., Pierini, N., Cuozzo, V. e Percaccio, G.: Identification
and determination of vitexin and isovitexin in Passiflora incarnata extracts.
Journal of Chromatography 161 (NOV): 396-402, 1978.
Raffaelli, A., Moneti, G., Mercati, V. e Toja, E.: Mass spectrometric
characterization of flavonoids in extracts from Passiflora incarnata. Journal of
Chromatography A 777 (1): 223-231, 1997.
Rahman, K., Krenn, L., Kopp, B., SchubertZsilavecz, M., Mayer, K. K. e Kubelka,
W.: Isoscoparin-2''-O-glucoside from Passiflora incarnata. Phytochemistry 45 (5):
1093-1094, 1997.
Rang, H. P., Dale, M. M. e Ritter, J. M.: Drogas ansiolíticas e hipnóticas. Em
Farmacologia, pp. 442-450, Guanabra Koogan S. A., Rio de Janeiro, 2001.
Rates, S. M. K.: Plants as source of drugs. Toxicon: official journal of the
International Society on Toxinology 39: 603-613, 2001.
Reginatto, F. H., De-Paris, F., Petry, R. D., Quevedo, J., Ortega, G. G.,
Gosmann, G. e Schenkel, E. P.: Evaluation of anxiolytic activity of spray dried
powders of two south Brazilian Passiflora species. Phytotherapy Research 20 (5):
348-351, 2006.
84
Reginatto, F. H., Gosmann, G., Schripsema, J. e Schenkel, E. P.: Assay of
quadranguloside, the major saponin of leaves of Passiflora alata, by HPLC-UV.
Phytochemical Analysis 15 (3): 195-197, 2004.
Reginatto, F. H., Kauffmann, C., Schripsema, J., Guillaume, D., Gosmann, G. e
Schenkel, E. P.: Steroidal and triterpenoidal glucosides from Passiflora alata.
Journal of the Brazilian Chemical Society 12 (1): 32-36, 2001.
Reginatto, F. R.: Saponinas em Passiflora alata Dryander, Faculdade de
Farmácia: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2000.
Rehwald, A., Meier, B. e Sticher, O.: Qualitative and quantitative reversed-phase
high-performance liquid chromatography of flavonoids in Passiflora incarnata L.
Pharmaceutica Acta Helvetiae 69: 153-158, 1994.
Rehwald, A., Sticher, O. e Meier, B.: Trace analysis of harman alkaloids in
Passiflora incarnata by reversed high performance liquid chromatography.
Phytochemical Analysis 6 (2): 96-100, 1995.
Royce, J. R.: On the construct vality of open-field measures. Psychological
Bulletin 84: 1098-1106, 1977.
Santos, K. C.: Atividades sedativa e ansiolítica dos extratos de Passiflora actinia
Hooker, Passifloraceae. Em Departamento de Farmácia-Programa de Pós
Graduação em Ciências Farmacêuticas, pp. 77, Universidade Federal do Paraná,
Curitiba, 2003.
Santos, K. C., Kurtz, S. M. T. F., Muller, S. D., Biavatti, M. W., Oliveira, R. M. W.
e Santos, C. A. M.: Sedative an ansiolytic afects os methanolic extract from the
leaves of Passiflora actinia. Brazilian Archives of Biology and Technology 49 (4):
565-573, 2006.
Santos, K. C., Santos, C. A. e Oliveira, R. M. d.: Passiflora actinia Hooker
extracts and fractions induce catalepsy in mice. Journal of Ethnopharmacology
100 (3): 306-9, 2005.
Seigler, D. S.: Isolation and characterization of naturally occurring cyanogenic
compouds. Phytochemistry 14: 9-29, 1975.
Seigler, D. S., Spencer, K. C., Statler, W. S., Conn, E. E. e Dunn, J. E.:
Tetraphyllin B and epitetraphyllin B sulfates - novel cyanogenic glucosides from
Passiflora caerulea and Passiflora alato caerula. Phytochemistry 21 (9): 2277-
2285, 1982.
85
Shinomiya, K., Inoue, T., Utsu, Y., Tokunaga, S., Masuoka, T., Ohmori, A. e
Kamei, C.: Hypnotic activities of chamomile and Passiflora extracts in sleep
disturbed rats. Biological & Pharmaceutical Bulletin 28 (5): 808-810, 2005.
Simões, C. M. O. e Schenkel, E. P.: A pesquisa e a produção brasileira de
medicamentos a partir de plantas medicinais: a necessária interação da indústria
com a academia. Revista Brasileira de Farmacognosia 12 (1): 27-32, 2002.
Souza, M. P.: Constituintes químicos ativos de plantas medicinais brasileiras,
Edições UFC/Laboratório de Produtos naturais, Fortaleza, 1991.
Spencer, K. C. e Seigler, D. S.: Cyanogenesis of Passiflora edulis. Journal of
Agricultural Food Chemistry 31 (4): 794-6, 1983.
Spencer, K. C. e Seigler, D. S.: Gynocardin from Passiflora. Planta Medica 50 (4):
356-357, 1984.
Speroni, E., Billi, R., Perellino, N. C. e Minghetti, A.: Role of chrysin in sedative
effects os Passiflora incarnata L. Phytotherapy Research 10: S98-S100, 1996.
Speroni, E. e Minghetti, A.: Neuro pharmacological activity of extracts from
Passiflora incarnata. Planta Medica 54 (6): 488-491, 1988.
Srivastava, V., Negi, A. S., Kumar, J. K., Gupta, M. M. e Khanuja, S. P. S.: Plant
based anticancer molecules: A chemical and biological profile of some important
leads. Bioorganic & Medicinal Chemistry 13 (21): 5892-5908, 2005.
Ulubelen, A., Oksuz, S., Mabry, T. J., Dellamonica, G. e Chopin, J.: C-
Glycosylflavonoids from Passiflora pittieri, Passiflora alata, Passiflora ambigua
and Adenia mannii. Journal of Natural Products 45 (6): 783-783, 1982.
Vale, N. B. e Leite, J. R.: Efeitos psicofarmacológicos de preparações de
Passiflora edulis (maracujá). Ciência e Cultura 35 (1): 11-24, 1983.
Villas-Bôas, L. B., Sanches, M. C. R., Oliveira, R. M. M. W. e Santos, C. A. M.:
Estudo cromatográfico da fração n-butanol das folhas do extrato hidroalcoólico
de Passiflora actinia Hooker. In V Jornada Catarinense e I Jornada Internacional
de Plantas Medicinais, Hotel Bourbon, Joinville-SC, 8-12 de maio, p. 172.
Wagner, H. e Bladt, S.: Plant drug analysis. A thin layer chromatography atlas,
Springer, Heidelberg- Germany, 1996.
Weissenberg, M.: Isolation of solasodine and other steroidal alkaloids and
sapogenins by direct hydrolysis-extraction of Solanum plants or glycosides
therefrom. Phytochemistry 58 (3): 501-508, 2001.
86
Wichtl, M.: Herbal drugs and phytopharmaceuticals: A handbook for practice on a
scientific basis, Medpharm scientific publishers, Boca Raton, 2004.
Williams, D. H. e Fleming, E.: Spectroscopic methods in organic chemistry,
McGraw-Hill, London, 1995.
Woldemichael, G. M., Montenegro, G. e Timmermann, B. N.: Triterpenoidal lupin
saponins from the chilean legume Lupinus oreophilus Phil. . Phytochemistry 63:
853-857, 2003.
Wolfman, C., Viola, H., Marder, M., Wasowski, C., Ardenghi, P., Izquiero, I.,
Paladini, A. C. e Medina, J. H.: Anxioseletive properties of 6,3´- dinitroflanone, a
high-affinity benzodiazepine receptor ligand. European Journal of Phamacology
318: 23-30, 1996.
Wolfman, C., Viola, H., Paladini, A., Dajas, F. e Medina, J. H.: Possible anxiolytic
effects of chrysin, a central benzodiazepine receptor ligand Isolated from
Passiflora coerulea. Pharmacology Biochemistry and Behavior 47 (1): 1-4, 1994.
Yoshikawa, K., Katsuta, S., Mizumori, J. e Arihara, S.: Four cycloartane
triterpenoids and six related saponins from Passiflora edulis. Journal of Natural
Products 63 (9): 1229-1234, 2000a.
Yoshikawa, K., Katsuta, S., Mizumori, J. e Arihara, S.: New cycloartane
triterpenoids from Passiflora edulis. Journal of Natural Products 63 (10): 1377-
1380, 2000b.
Zanoli, P., Avallone, R. e Baraldi, M.: Behavioral characterisation of the
flavonoids apigenin and chrysin. Fitoterapia 71: S117-S123, 2000.
Zuanazzi, J. A. S. e Montanha, J. A.: Flavonóides. Em Farmacognosia: da planta
ao medicamento, ed. por C. M. O. Simões, E. P. Schenkel, G. Gosmann, J. C. P.
Mello, L. A. Mentz, e P. R. Petrovick, pp. 489-516, Editora UFSC/Editora UFRGS,
Florianópolis/Porto Alegre, 2003.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
