( PDF ) Avaliação da resposta imune humoral IgG, IgA e IgM aos antígenos recombinantes MPT-64 e MT-10.3 de Mycobacterium Tuberculosis no líquido cefalorraquidiano de pacientes com meningite tuberculosa

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO-SENSU

MESTRADO EM NEUROLOGIA

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IgG, IgA E IgM AOS

ANTÍGENOS RECOMBINATES MPT-64 E MT-10.3

DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS NO

LIQUIDO CEFALORRAQUIANO DE PACIENTES

COM MENINGITE TUBERCULOSA

RAFAEL RIBEIRO HERINGER

Prof. Dra Marzia Puccioni Sohler

ORIENTADORA

Rio de Janeiro, RJ – Brasil

2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO-SENSU

MESTRADO EM NEUROLOGIA

Dissertação apresentada ao término do

Curso de Pós-Graduação Stricto-Sensu

em Neurologia, Área de Concentração

Neurociências, do Centro de Ciências

Biológicas e da Saúde da Universidade

Federal do Estado do Rio de Janeiro -

UNIRIO, como parte dos requisitos para

obtenção do grau de Mestre.

Rio de Janeiro, RJ – Brasil

2006

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Heringer, Rafael Ribeiro

H546a Avaliação da Resposta IgG, IgA e IgM aos Antígenos

Recombinantes MPT-64 e MT-10.3 de Mycobacterium

Tuberculosis no Liquido Cefalorraquidiano de Pacientes

com Meningite Tuberculosa / Rafael Ribeiro Heringer. –

Rio de Janeiro, 2005.

Xiii, 107 f. : il. ; 29cm

Dissertação (mestrado em Neurologia) – Universidade Federal

do Estado do Rio de Janeiro, Centro de Ciências Biológicas e da

Saúde, Rio de Janeiro, 2005.

Orientação: Marzia Puccioni Sohler. Maria Helena Feres Saad

1. Meningite tuberculosa 2. Liquido Cefalorraqueano 3.

Mycobacterium tuberculosis 4. MPT-64 5. MT-10.3 6. ELISA I

Puccioni-Sohler, Marzia. Saad, Maria Helena Feres II. Universidade

Federal do Estado do Rio de Janeiro, CCBS.

III- TITULO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO-SENSU

MESTRADO EM NEUROLOGIA

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IgG, IgA E IgM AOS

ANTÍGENOS RECOMBINATES MPT-64 E MT-10.3 DE

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS NO LIQUIDO

CEFALORRAQUIANO DE PACIENTES COM MENINGITE

TUBERCULOSA

Por

RAFAEL RIBEIRO HERINGER

Dissertação de Mestrado

BANCA EXAMINADORA

Profa.Dra. Marzia Puccioni Sohler

Profa.Dra. Leila de Souza Fonseca

Prof.Dr. Carlos Alberto Morais de Sá

Conceito:............................

Rio de Janeiro, RJ – Brasil, 2006

III

A Jesus Cristo, meu Senhor e Salvador, o único digno

de toda a honra, toda a Glória, porque dEle, por Ele e

para Ele são todas as coisas.

À minha esposa Cheila, pelo nosso amor, carinho,

dedicação e companheirismo nesta fase.

À minha filha, Camila, pelo meu imenso amor e

cuidado.

À professora Marzia Puccioni, pela confiança, paciência, incentivo, orientação e

dedicação neste trabalho.

À professora Maria Helena Saad, pela dedicação, paciência e orientações tão

importantes neste trabalho.

À professora Regina Papais Alvarenga, pelo imenso carinho, confiança e incentivo

recebido nesses quatro anos de trabalhos juntos.

À Isabela Gama Sardella, pelo grande apoio e dedicação na realização dos testes.

Ao Dr. Carlos Otávio Brandão pelo imenso apoio e confiança em meu trabalho e pela

disponibilização das amostras estudadas.

Às biólogas do Laboratório NEUROLIFE, pelo apoio recebido da coleta de dados e

amostras.

Aos meus pais e irmãs, que tanto me incentivaram, apoiaram, e me sustentaram em

amor, para que eu pudesse chegar tão longe.

A todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente com este estudo.

RESUMO

HERINGER, Rafael Ribeiro. Avaliação da resposta IgG, IgA E IgM aos antígenos

MPT-64 e MT-10.3 de Mycobacterium tuberculosis no liquido cefalorraquiano de

pacientes com meningite tuberculosa. Orientadoras: Marzia Puccioni Sohler,

Maria Helena Ferres Saad. Rio de Janeiro: UNIRIO/CCBS, 2006.

Dissertação (Mestrado em Neurologia)

INTRODUÇÃO: A meningite tuberculosa (MBK) é a principal forma de acometimento da

tuberculose no sistema nervoso central, sendo considerada um dos tipos mais graves

de tuberculose extra-pulmonar com alto potencial de morbi-mortalidade. Testes

acurados, de simples operacionalidade e de baixo custo são importantes para o

diagnóstico precoce da doença.

MÉTODOS: Enzymed-Lynked Immunosorbent Assay (ELISA) "in-house" foi usado para

detectar IgG, IgA e IgM contra os antígenos micobacterianos recombinantes MPT-64 e

MT-10.3 no líquido cefalorraquiano (LCR) de 19 pacientes com MBK e 71 pacientes

com cefaléia ou esclerose múltipla.

RESULTADOS: A melhor reação foi obtida com IgG MT-10.3 (100%, 92%), seguida de

IgG MPT-64 (90%, 94%), IgA MPT-64 (90%, 92%), IgM MT-10.3 (90%, 78%), IgA MT-

10.3 (79%, 75%) e IgM MPT-64 (68%, 66%), respectivamente para sensibilidade e

especificidade. A combinação dos testes aumenta a sensibilidade porém diminui a

especificidade. Todos os pacientes com MBK responderam positivamente à IgG MT-

10.3 (19/19), seguida por IgG (17/19) e IgA MPT-64 (15/19) e existe uma correlação

significativa entre a concentração proteica alta e a média de reatividade

(p<0,007). A coinfecção HIV/MBK não interfere na reatividade do teste para ambos os

antígenos (p>0,09).

CONCLUSÃO: De acordo com o nosso conhecimento, este é o primeiro

trabalho mostrando a reação imune no LCR de pacientes com MBK ao antígeno MT-

10.3. Considerando que todos os LCR mostraram reatividade ao MT-10.3, este é um

marcador útil para o diagnóstico da MBK. Estudos futuros devem ser feitos para validar

este teste.

ABSTRACT

HERINGER, Rafael Ribeiro. Avaliação da resposta IgG, IgA E IgM aos antígenos

recombinantes MPT-64 e MT-10.3 de Mycobacterium tuberculosis no liquido cefalorra_

quiano de pacientes com meningite tuberculosa. Orientadoras: Marzia Puccioni

Sohler, Maria Helena Ferres Saad. Rio de Janeiro: UNIRIO/CCBS, 2006.

Dissertação (Mestrado em Neurologia)

Tuberculous meningitis (MBK) is the most common form of tuberculosis in central

nervous system, has been considered one of the weightiest types of extra-pulmonary

tuberculosis with high potential of morbid-mortality. Development of simple,

reproducible, inexpensive diagnostic test for MBK are important to early diagnosis of

disease.

Enzymed-linked immunosorbent assay (ELISA) “in house” was carried out to detect IgG,

IgM, and IgA against recombinant mycobacterial antibody MT-10.3 and MPT-64 in

cerebrospinal fluid (CSF) of 19 patients with tuberculous meningitis (TMB) and 71

control patients (Multiple Sclerosis or headache).

The best reaction was obtained with IgG MT-10.3 (100%, 92%), followed by IgG MPT-64

(90%, 94%), IgA MPT-64 (90%, 92%), IgM MT-10.3 (90%, 78%), IgA MT-10.3 (79%,

75%) and IgM MPT-64 (68%, 66%), respectively to sensibility and specificity.

Combination of assays increase sensibility although decrease the specificity. All the

MBK patients responded positively to IgG MT-10.3 (19/19), followed by IgG (17/19) and

IgA MPT-64 (15/19) and there is a significant correlation between high protein

concentration and mean of reactivity (p< 0,007). HIV seropositivity did not interfere in the

test reactivity to both antigens (p>0,09).

This is, to the author’s knowledge, the first report to detect antibody against MT-10.3,

showing his potential immunodiagnostic detecting all CSF of TMB positive culture and

showing less than 10% of false-negative. Future studies must be done to validate this

test.

VII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representação esquemática das membranas conjuntivas (meninges) que

envolvem o sistema nervoso central. p. 18

Figura 2. Curva do tipo receiving operator characteristic curve (ROC) hipotética e ideal.

p. 60

Figura 3. Resultado da padronização com o concentrado de LCR MBK (controle

positivo) e Não TB (controle negativo) com o antígeno MPT-64 e MT-10.3 (1

μg/ml) e conjugados A) anti IgA, B) anti IgM e C) anti IgG. p. 69

Figura 4. Resultados do Liq-EIA expresssos em densidade ótica com os antígenos

MPT-64 e MT-10.3 para deteção dos anticorpos IgG, IgM e IgA IgG. p. 74

Figura 5. Curva ROC de sensibilidade x especificidade do Liq-EIA para detecção dos

diferentes tipos de Acs reativos aos Ags MT10.3 e MPT-64. p. 76

VIII

LISTA DE TABELAS

Tabela I. resume dos principais estudos da resposta imune no LCR, por ELISA, com

diferentes antígenos micobacterianos e tipos de anticorpos. p.48

Tabela II. Características clínicas e demográficas dos pacientes que tiveram LCR

incluídos neste estudo. p.63

Tabela III. Resultados dos exames bioquímico-celular dos LCR nos diferentes grupos

de LCR. p.65

Tabela IV: Características clínico e citoquímica dos LCR provenientes de pacientes com

MBK e sub-agrupados de acordo com a concentração protéica do LCR. p.

Tabela V. Resultados dos exames bioquímico-celular dos LCR do SubGrupo I Infetados

ou não pelo vírus da imunodeficiência adquirida (HIV). p.67

Tabela VI: Sensibilidade e especificdade do Liq-EIA na detecção de diferentes tipos de

Acs reativos aos antígenos MPT-64 e MT-10.3. p. 71

Tabela VII: Freqüência da resposta imune de IgG, IgM e IgA aos antígenos MPT-64 e

MT-10.3 no LCR de pacientes MBK subdivididos quanto a sorologia para

HIV e proteinorraquia (PR). p.72

Tabela VIII: Sensibilidade e especificidade do Liq-EIA analisando os resultados

cumulativamente. p.73

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

TB- Tuberculose

MBK- Meningite Tuberclosa

SNC- Sistema Nervoso Central

OMS- Organização Mundial de Saúde

PCT/SES/RJ- Programa de Controle de Tuberculose da Secretaria de Saúde do

Estado de Rio de Janeiro

HIV- Vírus da Imunodeficiência Humana

MTB- Mycobacterium tuberculosis

BK- Bacilo de Koch

H37Rv- Cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis H37

ELISA- Enzime-Linked Immunosorbent Assay

Ag- Antígeno

Ac- Anticorpo

BCG- Bacilo de Calmette Guerin

LCR- Liquido Cefalorraquiano

BHL- Barreira Hemato-Liquorica

BHE- Barreira Hemato-Encefálica

Qalb- Quociente de Albumina

AI- Índice de Anticorpo Específico

IgG- Imunoglobulina G

IgM- Imunoglobulina M

IgA- Imunoglobulina A

INF-g- Interferon Gama

TNF- Fator de Necrose Tumoral

C- Complemento

LT- Leucotrieno

IL- Interleucina

TGF- Fator de Estimulação de Colônias

14C- Carbono 14

ADA- Adenosina Deaminase

PCR- Reação em Cadeia de Polimerase

DNA- Ácido Desoxirribonucléico

IS6110E- Seqüência de Inserção 6110E

FDA- Food and Drug Administration

TC- Tomografia Computadorizada

RNM- Ressonância Nuclear Magnética

LAM- Lipoarabinomanan

CFP- Proteína filtrada de cultura

PPD- Derivado protéico purificado

BSA- Albumina Sérica Bovina

PBSt- Tampão Substrato Bifosfato

TMB- Substrato de Trimetilbenzidina

DO/OD- Densidade óptica

HUCFF/UFRJ- Hospital Universitário Clementino Fraga Filho/ Universidade Federal

do Rio de Janeiro

CRM-RJ- Conselho Regional de Medicina do Estado do Rio de Janeiro

PR- Proteinorraquia

G- Grupo

SG- Subgrupo

Liq-EIA- Teste Imunoenzimático em Líquido Cefalorraquiano

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO

1.1- CONCEITO.....................................................................................................14

1.2- EPIDEMIOLOGIA............................................................................................15

1.3- AS MENINGES...............................................................................................18

1.4- AGENTE ETIOLÓGICO..................................................................................20

1.5- ANTÍGENOS...................................................................................................22

1.6- LÍQUIDO CEFALORRAQUIANO ...................................................................25

1.6.1- BARREIRA HEMATO-LIQUÓRICA E BARREIRA

HEMATO-ENCEFÁLICA. ........................................................................26

1.6.2- SÍNTESE INTRATECAL DE ANTICORPO ESPECIFICO.......................29

1.6.3- SÍNTESE INTRATECAL DE ANTICORPOS

ESPECÍFICOS NA MENINGITE TUBERCULOSA ................................30

1.7- PATOGÊNESE...................................................................................................31

1.8- CLINICA..............................................................................................................34

1.9- DIAGNOSTICO...................................................................................................40

1.9.1- BACILOSCOPIA.........................................................................................41

1.9.2- CULTURA ..................................................................................................42

1.9.3- MÉTODO RADIOMÉTRICO (BACTEC).....................................................43

1.9.4- REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)......................................44

1.9.5- ENZIME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)………....………..46

1.9.6- EXAMES DE NEUROIMAGEM ................................................................49

2- JUSTIFICATIVA .........................................................................................................51

XII

3- OBJETIVO

3.1- OBJETIVO GERAL........................................................................................53

3.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS.........................................................................53

4- MATERIAIS E MÉTODOS

4.1- DESENHO DO ESTUDO..............................................................................54

4.2- CASUÍSTICA.................................................................................................54

4.3- CRITÉRIOS DE INCLUSÃO..........................................................................55

4.4- CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO.........................................................................56

4.5- AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL........................................56

4.6- ANTÍGENOS..................................................................................................56

4.7- ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA LCR COM OS ANTÍGENOS MPT-64 E

MT-10.3 (Liq-EIA)

4.7.1- ADSORÇÃO DOS ANTÍGENOS AO SUPORTE SÓLIDO (POÇOS

DE MICROPLACAS) ....................................................................... 57

4.8- ESTUDO ESTATÍSTICO...............................................................................59

4.7- ASPECTOS ÉTICOS.....................................................................................61

5- RESULTADOS

5.1- AMOSTRAGEM..................................................................................................62

5.2- PADRONIZAÇÃO DO Liq-EIA:...........................................................................68

5.3- TESTE IMUNOENZIMÁTICO EM LIQUIDO CEFALORRAQUIANO (Liq-EIA) ..68

6- DISCUSSÃO...............................................................................................................77

7- CONCLUSÕES...........................................................................................................85

8-REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA..................................................................................87

XIII

1- INTRODUÇÃO

1.1- CONCEITO

A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa crônica, cuja característica principal é a

preferência pelo parênquima pulmonar e a transmissão de pessoa para pessoa através

da inalação de partículas infectadas por este bacilo (Fundação Nacional de Saúde,

2002).

Os primeiros relatos históricos escritos sobre a tuberculose datam de 700 a.C.

Documentos arqueológicos mostram indícios da doença no período neolítico (5000 a.C.

a 4000 a.C.). Hipócrates denominava a doença como phitisis, que significa “derreter”,

“liquefazer” e “esvair-se”. Aristóteles descreveu pela primeira vez a natureza contagiosa

da doença, mas só confirmada pela descoberta do agente etiológico –Mycobacterium

tuberculosis – por Robert Koch (1843-1910), no século XIX. Com a revolução industrial,

no final do século XVIII e início do século XIX, o desenvolvimento das cidades e

proliferação dos aglomerados urbanos, houve um aumento no número de casos, e a

mortalidade alcançou cifras de 25% na população adulta na Europa, sendo por isto

chamada de a “peste branca” (Koch, 1882 apud Ayvazian et al, 1993; Wolinsky et al,

1990).

O tratamento baseava-se no repouso ao ar livre em sanatórios especializados, onde

metade dos pacientes morria, e na obliteração da cavidade infectada (colapsoterapia).

Com a descoberta e o desenvolvimento das drogas tuberculostáticas, a maioria dos

pacientes tratados obtinha a cura. Em 1946, a estreptomicina passou a ser usada com

sucesso; em 1952, surgiu a isoniazida e, em 1970, a rifampicina. A partir de então, a

letalidade diminuiu de 50% para menos de 10% (Ayvazian et al, 1993).

A tuberculose meníngea (MBK) pode se manifestar como meningoencefalite ou

meningite. É o tipo de acometimento mais comum da tuberculose no sistema nervoso

central (SNC), sendo considerada uma das formas mais graves de TB extrapulmonar,

com alto potencial de morbi-mortalidade. O tuberculoma, o abscesso cerebral

tuberculoso, a encefalopatia tuberculosa, a vasculopatia tuberculosa, a

pós-primária, que é a que ocorre após 1 a 2 anos da primo-infecção, ou por reativação

de um foco latente ou por uma reinfecção (van-Crevel et al, 2002).

O Brasil é o país com o maior número de casos notificados de tuberculose nas

Américas. A Organização Mundial de Saúde (OMS), em seu relatório anual de 2004, o

coloca na 15ª posição no “ranking” dos 22 países que concentram 80% dos casos

estimados de tuberculose no mundo. Os dados mais recentes publicados pelo

Ministério da Saúde indicam que a taxa de incidência de tuberculose vem se mantendo

estável nos últimos anos, 62/100.000 habitantes em 2003, com cerca de mais de

92.000 casos notificados a cada ano (WHO, 2005).

O Estado do Rio de Janeiro é o que apresenta a mais alta taxa de incidência de

tuberculose do país. A cada ano são notificados em média 16.000 casos de

tuberculose. Os 32 municípios prioritários concentram 95% dos casos de tuberculose e

a região metropolitana é responsável por 86% dos casos notificados no estado. De

acordo com o boletim informativo de 2005 do Programa de Controle da Tuberculose da

Secretaria de Saúde do Estado do Rio de Janeiro (PCT/SES/RJ), em 2003 foram

notificados 13.015 casos novos de tuberculose e a taxa de incidência no Estado foi de

87,5/100.000 habitantes. O número de óbitos e a taxa de mortalidade específica por

tuberculose, no estado, foram de 889 e 6,0%, respectivamente. De 13.015 casos novos

de tuberculose, foram solicitados 8.533 testes sorológicos para HIV (65,6%), sendo que

11,2% eram positivos (PCT/SES/RJ, 2005).

Também de acordo com o boletim informativo do PCT/SES/RJ, em 2003, a cidade

do Rio de Janeiro apresentou 6.434 casos de tuberculose, com taxa de incidência de

105/100.000 habitantes e o percentual de cura e o de abandono do total de casos no

município foi de 71,9% e 14,3%, respectivamente.

De acordo com dados publicados pela COVER/CGVEP/CENEPI/FUNASA/MS

(2001), no período entre 1990 e 2000 foram notificados 4.149 casos de meningite

tuberculosa no Brasil, com coeficiente de incidência variando entre 0,15 e 0,34 /100000

habitantes e taxa de mortalidade de 55,3% a 74,2%, chegando a 76,3% nos pacientes

menores de 4 anos (Nunes et al, 1998).

Nos Estados Unidos, a incidência de tuberculose extrapulmonar é de 0,19 / 100.000

habitantes e 4 a 15% das formas extrapulmonares da tuberculose são meníngeas, com

uma incidência anual de 0,008 a 0,029 /100.000 ao ano. Yechoor et al (1996),

mostraram incidência de MBK de 4,8 por 100000 em um período de 12 anos. No estudo

feito em dois hospitais de Madri entre os anos de 1985 e 1990, Berenguer et al (1992)

mostraram que de um total de 2.205 pacientes com tuberculose, 83 apresentaram MBK

(3,46%), sendo que 55% eram soropositivos para Vírus da Imunodeficiência Humana

(HIV). O estudo de Castilla et al (2005), feito entre 1994-2003 na cidade de Navarra,

Espanha, mostrou a incidência de 18 casos (1,79% dos 1005 casos estudados). Uma

revisão dos casos de MBK entre os anos de 1977 e 2003 em um hospital de Madri

(Espanha), foi encontrado 28 casos de MBK, sendo que 85% entre os anos de 1977 e

1991 (Jimenez et al, 2005). Cailhol et al (2005) estimou que a prevalência de MBK, na

França, no ano de 2000 foi de 41 e a incidência de 0.7 casos por milhão. Outro estudo

mostrou que menos de 10 casos de MBK são notificados por ano na França em

crianças com menos de 15 anos, sendo que este grupo populacional representa

anualmente 4,8% dos casos de TB (Gaudelus & Pontual, 2005). Hui et al (2005) na

China, mostraram que em 10 anos, dos 65 casos identificados numa população entre

15 e 86 anos, a MBK foi a forma mais comum de meningite em 46% dos casos.

1.3- AS MENINGES

O sistema nervoso é envolto por membranas conjuntivas denominadas meninges,

que são classificadas como dura-máter, aracnóide e pia-máter (Figura 1).

Dura Mater

Seio Sagital Superior

Granulações Aracnóideas

Aracnóide

Espaço

Subaracnóide

Pia Mater

Membrana Glial

Córtex Cerebral

Figura 1. Representação esquemática das membranas conjuntivas (meninges) que

envolvem o sistema nervoso central.

(http://www.anatomy.dal.ca/Human_Neuroanatomy/Lab_figures/Lab1_Figs/Lab1.fig1B.gif)

A dura-máter é representada pela meninge mais superficial, que se caracteriza

por uma membrana espessa e resistente, formada por tecido conjuntivo rico em fibras

colágenas, contendo nervos e vasos. A dura-máter é ricamente vascularizada pela

artéria meníngea média e inervada por terminações nervosas sensitivas, responsáveis

pela maioria das cefaléias (Kingsley, 2001; Clarck, 1976; Machado, 1991).

A aracnóide constitui-se em membrana muito delgada, justaposta à dura-máter,

da qual se separa por um espaço virtual, o espaço subdural, contendo uma pequena

quantidade de liquido necessário à lubrificação das superfícies de contato das

membranas. A aracnóide separa-se da pia-máter, formando o espaço subaracnóideo

que contém líquido cefalorraquiano (LCR) e onde atravessam as trabéculas aracnóides

para ligar à pia-máter. A profundidade do espaço subaracnóideo é muito variável,

formando nestas áreas dilatações chamadas de cisternas subaracnóideas, que contém

uma grande quantidade de LCR. Em alguns pontos da aracnóide formam pequenas

dilatações saculares que penetram no interior dos seios da dura-máter, constituindo as

granulações aracnóideas, mais abundantes no seio sagital superior, onde o LCR está

separado do sangue apenas pelo endotélio do seio e uma delgada camada de

aracnóide e será absorvido pela circulação venosa (Kingsley, 2001; Clarck, 1976;

Machado, 1991).

A pia-máter é a mais interna das meninges, aderindo intimamente à superfície do

encéfalo e da medula, acompanhando os relevos e depressões da superfície do

sistema nervoso, determinando resistência e consistência a eles (Kingsley, 2001;

Clarck, 1976; Machado, 1991).

AGENTE ETIOLÓGICO

O agente da tuberculose é a espécie Mycobacterium tuberculosis (MTB), ou Bacilo

de Koch (BK), classificado taxonomicamente na ordem dos Actinomycetales, família

Mycobacteriaceas, gênero Mycobacterium.

O gênero Mycobacterium contém aproximadamente 95 espécies que são divididas

em três grandes grupos: os de crescimento lento, como Mycobacterium tuberculosis; os

de crescimento rápido, como Mycobacterium fortuitum; e as de espécies que não são

cultivadas in vitro, como Mycobacterium leprae (Grosset, 1993).

O complexo Mycobacterium tuberculosis é constituído pelas espécies M.

tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. canetti e M.bovis sub espécie

caprae. Recentemente, foi proposta a inclusão no complexo da espécie Mycobacterium

pinnipedii sp. nov., isolada em focas. Estas espécies apresentam 99% de similaridade

genética (Cousins et al, 2003; Brooks et al, 1998; Grosset, 1993).

Mycobacterium tuberculosis é caracterizado como um bastonete delgado, imóvel,

sem cápsula ou esporos, com extremidades arredondadas, medindo de 2 a 5 µm de

comprimento e 0,2 a 0,3 µm de largura, aeróbico obrigatório, sobrevivendo em

microambientes aerados que contém altas tensões de oxigênio. Possui tempo de

geração de 17-18 horas ou mais, e tempo de crescimento de 2 a 4 semanas para que

as colônias sejam visualizadas em meio de cultura in vitro.

O genoma completo de M. tuberculosis H37Rv é uma seqüência cromossomal

circular contendo 4.411.529 pares de base, com 65,6% de guanina e citosina, além de

ser rico em DNA repetitivo. A seqüência do genoma de MTB é a segunda maior já

estudada (Cole et al, 1998a; 1998b).

Ao ser corado com o Carbol-fuccina, ou método de Ziehl-Neelsen, é resistente à

descoloração com ácidos fortes ou álcool, devido ao alto conteúdo lipídico de sua

parede celular; por isso, é chamado de bacilo álcool-ácido resistente (BAAR) (Grosset,

1993; Brooks et al, 1998).

À microscopia eletrônica, a parede celular tem uma espessura de 20nm. Sua

estrutura básica é o peptidioglicano, um polímero de n-acetilglicosamina e n-

glicosilmuramico. Os lipopolissacarídeos são compostos por arabinogalactanos,

arabinomananas, mananas e glucanas. O arabinogalactano é um polissacarídeo

presente nas bactérias do gênero Mycobacterium, Corynebacterium e Nocardia, que é

esterificado na sua extremidade distal com ácidos micólicos, que constitui a maior parte

da membrana externa da parede celular. São usados como antígenos em testes

sorológicos, por serem imunologicamente ativos, mas tem reação cruzada com

Corynebacterium e Nocardia, assim como todas as espécies de micobactérias.

(Grosset, 1993; Wolinsky, 1990).

Os componentes da parede celular como polissacarídeos, proteínas e peptídeos

têm mostrado propriedades antigênicas em algumas circunstancias. Arabinogalactano e

arabinomanana são excelentes antígenos. Muitas das proteínas citoplasmáticas de

MTB são antigênicas, sendo que algumas são espécies específicas. Antígenos

purificados, bem padronizados e espécie específicos são importantes não apenas

quanto ao seu potencial de auxiliar no diagnóstico clinico da tuberculose, mas também

servem como marcadores para o estudo da função imunológica dos linfócitos T em

várias situações clinicas (Daniel & Janicki, 1978).

MTB é capaz de sintetizar uma grande variedade de outras moléculas

complexas, associadas com a camada exterior da parede celular, que podem ter um

papel importante na virulência, pois impedem a fusão de fagossomos de macrófagos

infectados com MTB “in vitro”, tais como o fator corda, os micosideos, dimicocerosato e

o triacilglicerol (Minnikin, 1982).

O alto teor lipídico da parede celular é responsável não somente pela extrema

hidrofobicidade da célula micobacteriana, mas também pela resistência aos

procedimentos de descontaminação usando acido sulfúrico, hidróxido de sódio e outros

detergentes. Por outro lado, isso explica porque a MTB é susceptível como outras

bactérias ao calor, radiação a raios gama e álcool (Grosset, 1993).

1.4- ANTÍGENOS

Assim que Robert Koch preparou o primeiro concentrado protéico, chamado de

“old tuberculin”, Arloing desenvolveu em 1898, o primeiro teste sorológico para a

tuberculose (Arloing, 1904; apud Grosset, 1993). A partir de então, várias técnicas

sorológicas foram avaliadas, porém obtiveram resultados insuficientes, devido à reação

cruzada aos antígenos usados, pois os principais antígenos de MTB e M.bovis, como

os polissacarídeos arabinogalactanos, arabinomananas e o D-glucano são similares a

todas as espécies de micobacterias (Pottumarthy et al, 2000).

No entanto, a partir da introdução do teste de Enzime-Linked Immunosorbent

Assay ELISA, em 1971, por Engvall, aliada a identificação e caracterização de novos

antígenos mais específicos e purificados e de anticorpos monoclonais aumentou a

sensibilidade dos testes imunoenzimáticos (Engvall, 1971 apud Grosset, 1993). Este

método é simples, com excelente reprodutibilidade e boa sensibilidade. Mas, até o

momento, nenhum teste sorológico apresentou suficiente sensibilidade e especificidade

na prática clínica (Pottumarthy et al, 2000).

As proteínas secretadas pela membrana e parede celular de M. tuberculosis são

um importante alvo da resposta imune celular, sendo precocemente reconhecidas no

curso de infecção na TB experimental, o que estimula a proliferação de células T e a

produção de INF-γ, além de estimular a produção de anticorpos, que podem ser usados

como marcadores de infecção tuberculosa (Roche et al, 1996; Alderson et al, 2000).

Com o desenvolvimento das técnicas de biologia molecular e o recente

sequenciamento do genoma de MTB, vários antígenos foram identificados com

potencial para serem utilizados no desenvolvimento de métodos diagnósticos e vacinas.

Mycobacterium tuberculosis apresenta composição antigênica complexa e a

resposta imune dos pacientes com TB pode-se mostrar heterogênea para diferentes

antígenos. Assim a avaliação de antígenos relevantes é necessária para identificação

de moléculas com maior poder imunogênico, e que mostrem acurácia quando utilizados

sozinhos ou em combinação no desenvolvimento de testes diagnósticos simples,

rápidos e de baixo custo. Testes com estas características seriam importantes para

auxiliar no diagnóstico das infecções tuberculosas pulmonares e extrapulmonares

(Gennaro et al, 2000; Houghton et al, 2002; Young et al, 1992; Andersen et al, 1991;

Andersen et al, 2004; Rosenkrands et al, 1999).

Entre os vários antígenos obtidos do Complexo M. tuberculosis, descrito na

literatura internacional, o MPB-64 e MPT-64 são uma das principais proteínas, de 23,5 a

22 kDa, ativamente secretada em meio de cultura, sendo encontradas abundantemente

no filtrado precoce de cultura de Mycobacterium bovis BCG e M. tuberculosis,

respectivamente. A comparação da seqüência de nucleotídeos deses Ags mostra que

eles são idênticos, exceto por uma única mutação (Harboe et al, 1986; Andersen et al,

1991; Oettinger et al, 1994;1995).

O MPT 64 é estruturalmente homólogo ao antígeno (Ag) 85. Enquanto a família

do Ag 85 tem homólogos em todas as espécies estudadas de micobactérias, o MPT64

é restrito às espécies do complexo M. tuberculosis. Durante a infecção tuberculosa,

ocorre uma resposta imune celular por linfócitos T helper relativamente especifica ao

MPT-64. Pacientes expostos sadios não respondem a essa proteína. É usado como

antígeno para testes cutâneos para auxiliar no diagnóstico da tuberculose (Li et al 1993;

Roche et al ,1996; Musser et al, 2000).

Outro antígeno recentemente identificado é o ESAT-6. A família ESAT-6 compõe

um grupo de 14 a 23 proteínas secretadas, relacionadas entre si, que compartilham a

mesma região (região de diferença ou deletada 1, RD1) no genoma de MTB e possuem

características antigênicas semelhantes. Dessas proteínas, pelo menos 13 podem ser

agrupadas em três subfamílias. Uma dessas subfamílias é formada pelo antígeno TB-

10.4 (Rv0288) e duas moléculas homólogas, a TB-10.3 ou MT-10.3 (Rv3019c) e a TB-

12.9 (Rv3017c), os quais apresentam diversos epítopos únicos em linfócitos T.

Contrariamente ao ESAT-6, estas duas últimas moléculas ainda foram pouco

exploradas quanto ao seu potencial imunodiagnóstico.). Os antígenos TB-10.3 e TB-

10.4 são proteínas de baixo peso molecular, secretadas por MTB, com 84.4% de suas

seqüências idênticas e constituem juntamente com o TB-12.9 (Rv3017c) uma

subfamília altamente imunogênica (Skjøt et al, 2002; Soresen et al, 1995; Alderson et

al, 2000).

1.6- LÍQUIDO CEFALORRAQUIANO

O líquor, ou líquido cefalorraquiano, é um ultrafiltrado do plasma, caracterizado por

ser um fluido aquoso e incolor, que ocupa o espaço subaracnóideo e as cavidades

ventriculares. O LCR é formado principalmente no plexo coróide, que são ductos

capilares dilatados que se projetam nas paredes dos ventrículos laterais, terceiro e

quarto ventrículo, assim como na vascularização do encéfalo, nas raízes dos gânglios

dorsais, nas meninges e nas células estruturais que constituem o SNC. A sua principal

função é oferecer proteção mecânica ao SNC (Kingsley, 2001; Fishman, 1980; Jurado

c, 1990).

O LCR deixa os ventrículos laterais pelo Forame de Monro (forame

interventricular), passa pelo terceiro ventrículo e alcança o quarto ventrículo pelo

aqueduto do mesencéfalo (aqueduto cerebral). Existem duas aberturas ventriculares

laterais localizadas nos recessos laterais do quarto ventrículo (Forame de Luschka) e

uma abertura ventricular mediana na linha média do assoalho do quarto ventrículo

(forame de Magendie), pelos quais o LCR atinge o espaço subaracnóideo. O LCR

preenche a extensão tubular do espaço subaracnóideo em torno da medula espinhal,

difundindo-se para cima novamente, através de um movimento lento, até alcançar as

vilosidades aracnóideas na parede do seio sagital superior, onde o LCR será

reabsorvido e incorporado novamente à corrente sanguínea venosa (Clarck, 1976;

Thompson, 1995; Fishman, 1980; Jurado & Walker, 1990).

1.6.1- Barreira Hemato-Liquórica e Barreira Hemato-Encefálica

Existe uma interface entre o sistema vascular e o LCR e outra entre o sistema

vascular e o compartimento extracelular do SNC chamadas de barreira hemato-liquórica

(BHL) e barreira hemato-encefálica (BHE), respectivamente. As interfaces são formadas

pelas junções fechadas das células epiteliais especializadas dos capilares que

compõem a vasculatura encefálica e o plexo coróide, impedindo a passagem de

moléculas e íons para o LCR e o compartimento extracelular do SNC (Kingsley, 2001).

A concentração de proteínas do LCR é definida pela interação entre o fluxo

molecular e o fluxo do LCR. O transporte difusão-dependente de proteínas do cérebro e

do sangue para o LCR, segue as leis da difusão de acordo com o tamanho da

molécula, ou seja, quanto maior a molécula protéica, mais lentamente atinge o LCR e

maior é o gradiente de concentração. O conteúdo protéico do LCR é 250 vezes inferior

ao do plasma e os níveis de Imunoglobulina G (IgG), Imunoglobulina A (IgA) e

Imunoglobulina M (IgM) são, respectivamente, cerca de 500, 1000 e 5000 vezes inferior

no LCR, em comparação com os níveis plasmáticos (Reiber, 1998, 2001; Thompson

1995; Gerber et al, 1998; Sindic et al, 2001).

É possível calcular o perfil de proteínas através do quociente da concentração

dado pela concentração da albumina do LCR divida pela albumina do soro (Quociente

de Albumina - Qalb), que é um dos métodos importantes para o reconhecimento

precoce de doenças neurológicas caracterizadas por disfunção da BHL (Thompson,

1995; Puccioni -Sohler, 1996; Gerber et al, 1998; Sindic et al, 2001; Heringer et al,

2005).

A produção de LCR é raramente afetada nas anormalidades do plexo coróide. No

LCR normal, cerca de 80% das proteínas são provenientes do plasma e 20% são

sintetizadas no encéfalo. Nas doenças neurológicas, a disfunção da BHL pode ter

diferentes causas, (i) redução da produção do líquido (ii) obstrução do fluxo no espaço

subaracnóideo e (iii) obstrução da passagem através das vilosidades aracnóideas, que

induzirá:

a) a redução da renovação da troca do conteúdo LCR com um conseqüente

aumento da concentração protéica no LCR, tendendo a diminuir o fluxo do LCR.

b) o aumento da permeabilidade para albumina e outras grandes moléculas,

ocasionando o aumento do fluxo de proteínas do tecido para o LCR na borda do

espaço subaracnóideo (Thompson, 1995; Gerber et al, 1998; Reiber 1998,2001).

A BHL permite a passagem de grandes proteínas e, assim todas as proteínas

séricas chegam ao LCR em condições normais. Qualquer aumento nos níveis de

albumina do LCR é resultante do aumento da transudação do sangue. Portanto, o

quociente de albumina (LCR/soro) é um marcador da integridade das BHL. O Qalb é

utilizado como parâmetro da função da BHL, uma vez que a albumina é sintetizada nos

hepatócitos e não é catabolizada no SNC (Reiber, 1998; Puccioni-Sohler 1996; Sindic

et al, 2001).

Nas infecções agudas do SNC há aumento da concentração protéica do LCR

devido:

a) os leucócitos migram do tecido nervoso para o LCR,

b) as BHE e BHL se tornam permeáveis para albumina e outras grandes moléculas e

c) a resistência de saída do fluxo do LCR para deixar o espaço subaracnóideo pode

aumentar, tendendo a diminuir o fluxo do LCR.

A migração dos leucócitos e a entrada de proteínas no LCR podem variar de acordo

com a localização do espaço subaracnóideo, levando a uma variação na razão de

leucócitos e proteínas entre o LCR ventricular, cisternal e lombar. No foco infeccioso,

ocorre o estímulo de produção de leucócitos e o aumento da transudação de proteínas.

Por hipótese, quanto mais próximo do foco infeccioso bacteriano, o LCR coletado

apresentará maior concentração de leucócitos e proteínas, que no LCR coletado de

local mais afastado do foco (Gerber et al, 1998; Reiber, 2001; Heringer et al, 2005).

Da mesma forma que a albumina, em condições normais, a IgG encontrada no LCR

é proveniente do soro e não de produção dentro do SNC. A nefelometria é utilizada

para a rápida determinação da concentração de imunoglobulinas, entre outras

proteínas, em diferentes fluidos corporais inclusive no LCR (Puccioni-Sohler, 1996).

1.6.2- Síntese Intratecal de Anticorpo Especifico

A detecção da síntese intratecal de anticorpos (Ac) é feita através do cálculo da

proporção da média entre o quociente LCR/soro para anticorpos específicos e

anticorpos totais. Este índice de anticorpo (AI) discrimina a fração no LCR dos

anticorpos específicos derivados do sangue daqueles de produção intratecal. Na

ausência de síntese intratecal de anticorpo específico, a relação entre anticorpos

específicos e totais é igual a 1; considerando que ambos possuem o mesmo peso

molecular. Valores deste quociente >1,5 indicam síntese intratecal de anticorpos

especificos (Reiber, 2001).

As bandas oligoclonais ocorrem freqüentemente nas doenças inflamatórias do SNC.

O termo oligoclonal define proteína com características eletroforéticas semelhantes e

provenientes da mesma população de células imunocompetentes. A detecção de

bandas oligoclonais de IgG específicas no LCR, pela focalização isoelétrica, é o método

mais sensível as detectar e de demonstrar sua produção intratecal. As bandas

oligoclonais podem ocorrer na ausência de níveis elevados de gamaglobulinas no LCR.

A presença de bandas oligoclonais no LCR, que não aparecem no soro correspondente,

é considerada como prova de reação imune humoral no SNC (Sindic et al, 2001;

Puccioni-Sohler, 1996).

1.6.3- Síntese Intratecal de Anticorpos Específicos na Meningite

Tuberculosa

A MBK é caracterizada pela síntese intratecal de IgG oligoclonal, comprovadamente

contra antígenos micobacterianos. Esses anticorpos podem persistir por vários anos. As

bandas oligoclonais específicas de IgA, no LCR são raramente detectáveis (<5%)

quando demonstradas por medidas quantitativas. A síntese intratecal de IgA é

observada em meningite purulenta, meningite tuberculosa e encefalite herpética (Sindic

et al, 1990, 2001).

1.7- PATOGÊNESE

A fala, a tosse e o espirro de um paciente bacilífero lança no ar gotículas

contaminadas com 1 a 2 bacilos, chamados de núcleos de Wells. Essas partículas

infectantes podem se depositar nos objetos, podem ser retidas pela mucosa do trato

respiratório superior e serem removidas pelo mecanismo muco-ciliar dos brônquios ou

podem atingir os bronquíolos e alvéolos e assim iniciar o processo infeccioso (Rieder,

2001).

A chance de uma pessoa se infectar após contato com um paciente bacilífero

depende da concentração de bacilos expelidos pela fonte (multi-bacilíferos, pauci-

bacilíferos e não-bacilíferos), da intensidade e freqüência do contato com o paciente

tuberculoso, de condições ambientais (circulação de ar e ventilação, exposição à luz) e

da resposta imune do indivíduo exposto (Rieder, 2001).

Ao alcançar o espaço alveolar, os bacilos são fagocitados pelos macrófagos locais.

Os bacilos se proliferam livremente no interior dos macrófagos, pois são incapazes de

destruí-los ou inativá-los, até que eles se rompem, liberando os bacilos para infectar

outros macrófagos. Novos macrófagos são atraídos para o local, desenvolvendo um

foco pneumônico. Os bacilos são drenados para os linfonodos hilares e mediastinais

satélites e, em seguida atingem a corrente sanguínea, disseminando-se para diversos

órgãos e sistemas, onde também começam a se proliferar (Rieder, 2001).

Após 3 a 8 semanas a imunidade celular se desenvolve e os linfócitos T helper

CD4+, específicos para os antígenos bacilares, se proliferam ativando os macrófagos

através de interleucinas, citocinas ou linfocinas, promovendo o recrutamento e a

ativação de outros macrófagos e linfócitos.

Os macrófagos aumentam seu citoplasma, acumulam-se em volta do foco de

infecção primária e nos focos de disseminação linfonodal e hematogênica, formando

um granuloma, chamado de nódulo de Ghon. No centro do granuloma, forma-se uma

área de necrose caseosa devido a liberação de citocinas pelas células inflamatórias,

capaz de causar dano aos tecidos e às micobactérias (Alderson et al, 2000; Newport et

al, 1996; Cooper et al, 1993; Flynn et al, 1993).

O INF-g é um importante mediador da ativação de macrófagos e resistência aos

bacilos intracelulares, exercendo papel crucial na imunidade celular protetora à infecção

tuberculosa. Sua produção ativa macrófagos mais eficientes para a destruição

intracelular do bacilo. Na tentativa de controlar a infecção, o sistema imunológico gera

inflamação e destruição tecidual através da liberação de grandes quantidades de

proteases, lipases e nucleases pelos macrófagos ativados que circundam o foco

caseoso. Se o foco de necrose caseosa se liquefazer e atingir um brônquio, erodindo a

sua parede, permitirá a comunicação com o espaço aéreo rico em oxigênio, a

proliferação celular aumenta e surge a caverna tuberculosa (Alderson et al, 2000;

Newport et al, 1996; Cooper et al, 1993; Flynn et al, 1993).

Estima-se que cada paciente bacilífero infecte cerca de 10-15 pessoas, apenas

respirando, mantendo-se assim o ciclo vital do bacilo de Koch. Durante a disseminação

linfo-hematogênica da primo-infecção, o bacilo se aloja em múltiplos focos

subependimários, localizados nas adjacências da meninge, chamados focos de Rich.

Nos pacientes suscetíveis, esses focos continuam se proliferando, formando

granulomas que expelem bacilos para o espaço subaracnóideo. Com a ruptura dos

focos de Rich, os macrófagos ativados produzem Fator de Necrose Tumoral (TNF)

gama e alfa , Complemento 5a (C5a), Leucotrienos B4 (LTB4), Interleucina 8 (IL8),

Interleucina 6 (IL6), Interleucina 1 beta, fator de estimulação de colônias de granulócitos

(TGF) e monócitos. Acredita-se que o C5a, os LTB4 e a IL8 são fatores que mobilizam

e ativam neutrófilos. Após horas ou dias, segue-se a resposta linfocitária. O TNF alfa

está relacionado à gravidade da doença e pode contribuir para a necrose tissular,

enquanto que o TGF beta inibe a ativação de macrófagos e a IL2 melhora a resposta

imune nos pacientes com sorologia positiva para HIV (Thwaites et al, 2000; Patel et al,

2002; Marinho et al, 1997).

Na meningite tuberculosa o efeito antigênico das proteínas do bacilo promove uma

intensa reação inflamatória por fenômeno de hipersensibilidade do tipo IV,

desencadeando a formação de exsudato no espaço subaracnóideo, vasculite

obliterativa e encefalite ou mielite (Thwaites et al, 2000; Dastur et al , 1995).

O intenso estímulo inflamatório dos macrófagos provoca uma aracnoidite

proliferativa, formando um exsudato espesso que se concentra na base do crânio e

suas cisternas. O exudado é formado por células mononucleadas grandes e pequenas,

incluindo células epitelióides, fibrina e macrófagos que podem se fundir formando as

células gigantes de Langhans. Com o aumento do volume do exsudato, ele pode

comprimir a origem de nervos cranianos, principalmente o II, IV e VI, e provocar

vasculite dos vasos de pequeno e médio calibre localizados nesta região, como a

artéria carótida interna e os vasos perfurantes para os gânglios da base. Os infartos

cerebrais causados pela vasculite são os principais responsáveis pelas seqüelas

irreversíveis da doença. O exsudato espesso obstrui a passagem de LCR pelas

cisternas ou a sua drenagem nas granulações aracnóides, levando a uma complicação

comum da doença que é a hidrocefalia. Esta também pode ser causada pelo bloqueio

da circulação em torno do aqueduto de Silvius e do terceiro ventrículo pelos

tuberculomas. A encefalite tuberculosa é uma extensão do processo inflamatório no

parênquima cerebral (Thwaites et al, 2000; Thwaites & Tran, 2005; Dastur et al, 1995).

1.8- CLINICA

O quadro clínico da meningite tuberculosa é, geralmente, de início gradual,

ocorrendo em um período de aproximadamente três semanas, embora alguns casos

possam ter um começo abrupto marcado pelo surgimento de convulsões. Em 1948, o

British Medical Research Council desenvolveu um método de estadiamento da

gravidade de doença. De acordo com este método, a evolução clínica da infecção é

dividida em três estádios, conforme descrito abaixo (BRITISH MEDICAL RESEARCH

COUNCIL, 1948; apud Fundação Nacional de Saúde, 2002):

Estádio I: Em geral, tem duração de uma a duas semanas e se caracteriza pela

inespecificidade dos sintomas, podendo ocorrer febre, mialgias, sonolência, apatia,

irritabilidade, cefaléia, anorexia, vômitos, dor abdominal e mudanças súbitas do humor.

Estes sintomas são comuns a qualquer processo inespecífico, além de rigidez de nuca

(75% dos adultos e incomum em crianças) com sinais de Kernig e Brudzinski (a rigidez

de nuca é um sinal inespecífico também). Nessa fase, o paciente pode encontrar-se

lúcido e o diagnóstico geralmente é estabelecido pelos achados do LCR.

Estádio II: Após uma ou duas semanas, a doença se caracteriza pela persistência

dos sintomas sistêmicos, mas surgem evidências de dano cerebral manifestada pelos

sinais de localização e de hipertensão intracranianos (principalmente com

acometimento nervos cranianos III, V, VII), anisocoria, vômitos, ausência de reflexos

abdominais e convulsões que podem ser tônicas ou clônicas, focais ou generalizadas.

Nessa fase, alguns pacientes apresentam manifestações de encefalite com tremores

periféricos, distúrbios da fala e movimentos atetóides das extremidades.

Estádio III: O terceiro estádio, ou período terminal é caracterizado pelo déficit

neurológico focal, opistótono, rigidez de nuca, alterações do ritmo cardíaco e da

respiração, seguidos de graus variados de perturbação da consciência, incluindo o

coma. Nos casos não-tratados, a morte ocorre após cinco a oito semanas do início da

doença. Em qualquer estádio clínico da doença, podem-se observar convulsões focais

ou generalizadas.

A apresentação clínica da meningite tuberculosa é semelhante às outras

meningoencefalites. Como a cultura do LCR para MTB tem baixa sensibilidade e em

alguns casos de MBK ou de meningites bacterianas não é possível identificar o agente

causador, alguns critérios diagnósticos para MBK têm sido propostos como método

auxiliar dos métodos laboratoriais, com o objetivo de acelerar o diagnóstico e o inicio da

terapia específica.

Antes do surgimento da epidemia da síndrome da imunodeficiência adquirida

(AIDS/SIDA) pela infecção por HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana), a meningite

tuberculosa afetava principalmente as crianças, principalmente as dos países em

desenvolvimento. A infecção por HIV é um fator predisponente para a infecção com

MTB, podendo a incidência variar de acordo com a raça, as condições

socioeconômicas, a idade e o sexo. A apresentação clínica da tuberculose em

pacientes imunodeprimidos é diferente dos imunocompetentes e, dentre as formas

extrapulmonares a forma meníngea é a mais grave com alta morbidade e mortalidade.

Porém a apresentação clínica da MBK não se altera com a co-infecção com o HIV

(Chandramuki et al, 2002).

Thwaites et al (2002), propuseram um critério diagnóstico com sensibilidade de

98,4% e especificidade de 43,5% quando uma ou mais variáveis estão presentes e

sensibilidade de 98,3% e especificidade de 54,5% quando três ou mais variáveis estão

presentes. De acordo com este método, o diagnóstico de MBK é feito a partir do

isolamento do MTB no LCR ou a presença de sinais e sintomas de meningite com

microscopia negativa ou cultura para bactérias e fungos negativa no LCR, associado a

um ou mais dos seguintes características: (i) tomografia computadorizada de crânio

compatível com MBK (hidrocefalia, edema, captação meníngea basal de contraste); (ii)

radiografia de tórax com sinais de atividade de tuberculose pulmonar e (iii) boa

resposta à terapia antituberculosa.

Porém, como o desempenho do método varia de acordo com a área de prevalência

da doença e o início da terapia empírica para MBK, Thwaites et al (2002)

desenvolveram um método diagnóstico usando dados clínicos e laboratoriais de adultos

com suspeita de MBK, em área endêmica, que apresentou sensibilidade de 86% e

especificidade de 79%. Foram desenvolvidas duas classificações diagnósticas: a

primeira durante a admissão do paciente e a segunda após 48 horas do uso de um

antibiótico de largo espectro:

1. Durante a admissão do paciente, se o exame de LCR mostrar uma leucometria

menor que 760 x 10

cel/ml associado a uma historia de doença menor que seis dias e

leucocitose menor que 10200 x 10

cel/mL, trata-se de MBK. Neste mesmo paciente, se

a leucocitose for maior que 10200 x 10

cel/ml, trata-se de meningite bacteriana. Caso o

exame de LCR mostre uma leucometria menor que 760 x 10

cel/ml associado a uma

historia de doença maior que 6 dias, trata-se de MBK. Se o exame de LCR mostrar uma

leucometria maior que 760 x 10

cel/ml associado a uma historia de doença menor que

7 dias, trata-se de meningite bacteriana. E se o exame de LCR mostrar uma

leucometria maior que 760 x 10

cel/ml associado a uma historia de doença maior que 7

dias e idade menor que 42 anos, trata-se de MBK. Neste caso, se a idade for maior que

42 anos, trata-se de meningite bacteriana (Thwaites et al, 2002).

2. Após 48 horas de uso de um antibiótico de largo espectro, se a história da doença

for menor que oito dias, associado a neutrófilos no sangue menor que 80% e

neutrofilorraquia menor que 81%, trata-se de MBK. Neste mesmo caso, se a

neutrofilorraquia for maior que 81%, trata-se de meningite bacteriana. Se a historia da

doença for menor que 8 dias, associado a neutrófilos no sangue maior que 80%, trata-

se de meningite bacteriana. Já, se a história da doença for maior que 8 dias e a

proporção de glicose no LCR/soro for menor que 100%, trata-se de MBK. Neste mesmo

caso, se a proporção for maior que 100%, trata-se de meningite bacteriana (Thwaites et

al 2002).

Sunbul et al (2005) realizaram um estudo retrospectivo em pacientes com sorologia

negativa para HIV com meningite, para avaliar a aplicabilidade dos critérios

diagnósticos de Thwaites. Este estudo concluiu que os critérios são úteis para o

diagnostico da MBK, porém deve ser validado em uma amostra maior de pacientes com

meningite viral e glicorraquia baixa. A sensibilidade e a especificidade foram de 95,6% e

70,8%, respectivamente, enquanto que nos casos microbiologicamente provados, a

sensibilidade e a especificidade foram de 91,7% e 79,7%, respectivamente.

Kumar et al (1999) usando critérios clínicos e laboratoriais para diferenciar MBK e

meningite bacteriana em crianças, o diagnóstico de MBK foi definido positivo quando a

cultura ou baciloscopia no LCR era positiva, ou havia captação meníngea de contraste

na base à tomografia computadorizada e resposta clínica à terapia antituberculosa. Os

critérios foram utilizados na presença de uma das seguintes características: a) sinais

prodrômicos mais que 7 dias; b) fundoscopia com atrofia óptica; c) déficit focal; d)

desordens do movimento e d) leucorraquia com menos de 50% de neutrófilos a

sensibilidade do critério foi de 98,4% e especificidade de 43,5%. Se três ou mais

estiverem presentes, a sensibilidade será de 54,5% e a especificidade de 98,3%.

Alguns trabalhos sugerem que a co-infecção HIV-BK além de aumentar as chances

de desenvolvimento da TB, altera a apresentação clínica desta e também aumenta as

chances de seu envolvimento extrapulmonar. Entre as formas extrapulmonares da

tuberculose em pacientes imunodeprimidos, como meningoencefalite, abscesso

cerebral e tuberculoma, a forma meníngea é a principal causa de meningite nesses

pacientes em áreas endêmicas e também é a forma mais grave com alta morbi-

mortalidade, sendo que seu risco aumenta com a diminuição da carga de CD4

(Berenguer et al, 1992; Thwaites et al, 2000; Thwaites & Tran, 2005; Yechoor et al,

1996).

Embora a MBK em pacientes HIV positivos não altere a sua apresentação

clínica,laboratorial ,resposta ao tratamento e prognóstico, altera o número e a natureza

das complicações da doença (Garg et al, 1999).

1.9- DIAGNÓSTICO

A MBK é uma grave doença, que se não for diagnosticada e tratada precocemente,

leva a uma alta taxa de mortalidade e de morbidade. Os métodos laboratoriais têm um

papel importante no seu diagnóstico e no monitoramento da resposta terapêutica.

O diagnóstico precoce da MBK é de difícil realização. O diagnóstico é estabelecido

através da suspeita da história e dos sintomas clínicos, associado ao exame cito-

químico do LCR. Apesar das anormalidades do LCR na MBK serem sugestivas, a sua

apresentação clínica é similar às outras meningoencefalites de etiologias viral,

bacteriana (Haemophylus influenzae, Streptococcus pneumoniae e Neisseria

meningitidis) e fúngica (Cryptococcus neoformans) (Fundação Nacional de Saúde,

2002).

O diagnóstico definitivo é feito pela demonstração do MTB no LCR, mas os testes

microbiológicos são morosos e raramente positivos, assim testes alternativos (ELISA e

“protrein chain reaction”) foram desenvolvidos para auxiliar no diagnóstico da MBK e

diferenciá-la das outras meningites (Martins et al, 2000; Nunes et al, 1998; Daniel et al;

1987; Newton et al, 1994; Kumar et al, 1999; Chandramuki et al, 2002).

O diagnóstico precoce aumenta as chances de sobrevida e existe uma relação

direta entre a precocidade diagnóstica e o prognóstico. Porém, infelizmente, a maioria

só é diagnosticada nos estádios avançados, justificando assim, a alta letalidade e as

freqüentes seqüelas. A morte ocorre nos casos de meningite tuberculosa não-tratados

após 5 a 8 semanas do início da doença, com taxa de mortalidade de quase 100%.

Nos pacientes tratados tardiamente, já em coma, a taxa de mortalidade é de quase

50%. A taxa de mortalidade global dos pacientes com tuberculose do SNC é

significativa (cerca de 10%) com um risco maior nos lactentes e idosos. Estes dados

refletem o resultado do diagnóstico tardio bem como a emergência de cepas infectantes

resistentes às drogas tuberculostáticas (Fundação Nacional de Saúde, 2002; Bonington

et al, 2000; Katrak et al, 2000).

Como a meningite tuberculosa não tratada geralmente é fatal, um critério clínico

diagnóstico ou exame laboratorial para MBK deve ser sensível. Por isso, ao se

desenvolver novos testes que auxiliem no diagnóstico da MBK, busca-se uma boa

sensibilidade e especificidade associadas à facilidade operacional e rapidez. Porém, no

momento, nenhum critério laboratorial simples, rápido, barato e acurado para o

diagnóstico da MBK satisfaz essas exigências (Li et al, 1991; Kennedy et al, 1979).

1.9.1- Baciloscopia

A pesquisa direta do bacilo pela técnica de Ziehl-Neelsen é o principal método de

rotina laboratorial para o diagnóstico da MBK, por ser o mais simples e rápido. Porém a

confirmação bacteriológica é difícil, pois sua sensibilidade varia entre 10%–40%

(Chandramuki et al, 2002; Thwaites et al, 2004). No Brasil, a sensibilidade varia de

4,8% a 91% (Ceuci et al, 1998; 1996; Martins et al, 2000; Heringer et al, 2005).

O LCR contém poucos bacilos (paucibacilar), assim a sensibilidade da

bacterioscopia varia de acordo com o local da coleta, com o volume de LCR examinado,

com a velocidade e a duração da centrifugação, o tempo gasto no exame da

microscopia, além da quantidade de coletas seriadas feitas. Radhakrishnan et at (1990)

e Heringer et al (2005) sugerem que o local da coleta influi na positividade, pois quanto

mais próximo do local da lesão, ou seja, o exsudato inflamatório localizado na cisterna

da base, maior deve ser a acurácia da baciloscopia. Fallon & Kenned (1993)

mostraram que ao se examinar três ou mais amostras de LCR do mesmo paciente, em

punções seriadas, a positividade da baciloscopia aumenta de 37% para 81%. Já

Thwaites et al (2004) mostraram que a acurácia da baciloscopia aumenta quando o

volume de LCR coletado é maior que seis mL e examinado por pelo menos 30 minutos,

preferencialmente nas áreas da lâmina que contém maior densidade celular.

1.9.2- Cultura

A cultura de LCR no meio de Lowenstein-Jensen para o isolamento do bacilo é

considerada o método-padrão, para a confirmação diagnóstica da meningite

tuberculosa. Porém, este exame é importante do ponto de vista epidemiológico e não

clínico, pois demora de 45 a 60 dias para ser obtido o resultado. Além disso, sua

sensibilidade varia entre 25 a 70% (Fundação Nacional de Saúde, 2002; Chandramuki

et al, 2002).

Selvakumar et al (1996) sugerem em seu trabalho que a associação da

centrifugação e filtração do LCR possa aumentar a positividade da cultura.

Radhakrishnan et al (1991) mostraram positividade maior da cultura com LCR coletado

na cisterna da base (87.5%) e nos ventrículos (75%), em comparação com o LCR

lombar (20%), o que também sugere que a sensibilidade da cultura pode variar de

acordo com a localização da coleta, assim como ocorre na baciloscopia.

Tan et al (1999) analisaram os aspectos clínicos de 18 pacientes com sorologia

negativa para HIV que tiveram cultura positiva e observaram que a positividade da

cultura está relacionada a um mal-prognóstico da MBK, estando mais positiva em

pacientes nos estádios avançados da doença e com hidrocefalia.

1.9.3- Método Radiométrico (BACTEC)

A técnica do BACTEC utiliza os princípios de radiometria. O LCR é semeado em

um meio de cultura líquido (Middlebrook 7H-12A ou 7H-12B) que contém antibióticos,

suplementos e o ácido palmítico marcado com substancia radioativa, Carbono 14 (

C).

Durante o crescimento, MTB metaboliza essa substância, convertendo-a em CO

radioativo, que é detectado pelo aparelho após 14 dias, aproximadamente (Brooks et al,

1998; Katoch et al, 2004).

Dos 58 pacientes com MBK estudados por HOOKER et al (2003), o BACTEC foi

positivo em 20 casos, enquanto que a cultura somente foi positiva em 12 casos e a

PCR em um caso.

1.9.4- Reação em Cadeia de Polimerase

Desde o isolamento do bacilo de MTB H37Rv, em 1905, várias pesquisas foram

desenvolvidas explorando seu potencial de virulência em modelos animais de

tuberculose, inclusive sua manipulação genética para o desenvolvimento de métodos

moleculares de auxilio ao diagnóstico (Cole et al, 1998 a, b; Cole & Barrel, 1998).

Os métodos moleculares vêm se tornando úteis para o diagnóstico das doenças

infecciosas. Os métodos convencionais são de baixa sensibilidade em materiais

paucibacilares, como o LCR, pois são dependentes da carga bacilar, assim como a

reação em cadeia da polimerase (PCR). Mas esta técnica é de alta sensibilidade

podendo, teoricamente, amplificar o DNA alvo de apenas um bacilo (Katoch et al,

2004).

Basicamente existem duas técnicas da PCR para identificar o DNA de MTB: a

primeira pela amplificação da seqüência de DNA que contém genes que codificam

antígenos micobacterianos específicos; a segunda utiliza sondas genéticas baseadas

na amplificação de seqüências repetitivas, específicas de MTB, tais como a IS6110. No

caso da primeira, a especificidade varia de acordo com a escolha da seqüência a ser

amplificada, podendo chegar a 100% caso a técnica seja realizada em local adequado

e com profissionais especializados, de modo a evitar a contaminação cruzada. Para tal

deve-se ter o cuidado de coletar o material em dois tubos, para que possam ser

estocados separadamente para posterior contra-prova. Outra desvantagem desta

técnica é a presença de substâncias, que funcionam como fatores inibidores nos

materiais analisados, que podem impedir a amplificação da seqüência de DNA,

diminuindo a sua sensibilidade (Shankar et al, 1991; Monteyne et al, 1995).

Alguns métodos baseados nas sondas genéticas são licenciados pelo FDA

(Food and Drug Administration, USA) para o uso em amostras de tuberculose pulmonar:

o teste direto de amplificaçao de MTB (Gen-Probe, Inc., San Diego, Califórnia) e o teste

AMPLICOR (Roche Diagnostics, Inc., Indianapolis, Ind.). Este métodos não foram

liberados para uso em amostras de tuberculose extrapulmonar, inclusive no LCR.

Existem vários estudos avaliando a acurácia deste método nos pacientes com MBK.

Em 2003, Pai et al publicaram uma revisão sistemática com meta-análise de 49 testes

PCR para MBK. Destes, 14 testes comerciais mostraram as melhores sensibilidade e

especificidade (56% e 98%, respectivamente). Katoch et al (2004) comparou dados

publicados sobre a acurácia dos testes baseados na PCR-IS6110, PCR-TRC-4

(seqüência de inserção TRC-4) e PCR-MPB64 observando sensibilidades 81%, 91% e

75%, e especificidade de 80%, 76% e 100%, respectivamente. Também em 2004,

Thwaites et al e Johansen et al sumarizaram os dados estatísticos de estudos usando o

Gen-Probe no LCR para o diagnóstico da MBK. A sensibilidade e a especificidade do

teste variou entre 33% a 100% e 96 a 100%, respectivamente.

Apesar de ser um teste sensível e específico para o diagnóstico da MBK, esta

técnica é laboriosa e o seu uso só é viável em centros com pessoal qualificado e

estrutura física adequada, o que não atende as necessidades da rede pública de saúde

dos países em desenvolvimento, que requer método diagnóstico simples, rápido e de

baixo custo.

1.9.5- Enzime-Linked Immunosorbent Assay

Apesar da resposta imune não ser protetora na tuberculose, antígenos

micobacterianos induzem a produção de anticorpos nos indivíduos doentes, os quais

podem ser potencialmente úteis no diagnóstico precoce da MBK.

O teste Enzime-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) utiliza o conceito que

antígenos ligados a uma fase sólida podem ser usados para determinar a presença de

anticorpos em uma dada amostra. A quantidade de anticorpos ligados ao antígeno na

fase sólida é uma medida da concentração de anticorpos da amostra original. Esta

reação pode ser detectada pela adição de enzimas conjugadas a um segundo

anticorpo em uma reação colorimétrica em presença do substrato da enzima ou pela

adição de anticorpo conjugado com um marcador radioativo (Radio-imunoensaio) (Mims

et al, 1995).

Vários estudos baseados na resposta imune aos antígenos micobacterianos foram

realizados, sendo os testes imunoenzimáticos os mais atraentes por serem rápidos, de

fácil operacionalidade, sensíveis e de relativo baixo custo. Radhakrishnan et al (1991) e

Radhakrishnan & Mathai (1993), compararam a positividade da cultura a detecção de

antígenos micobacterianos pelo método do ELISA nos compartimentos ventricular,

cisternal e lombar. O trabalho mostrou que a cultura obteve uma positividade no LCR

lombar, cisternal e ventricular de 20%, 75% e 87,5%, respectivamente, enquanto que a

detecção de anticorpos contra o antígeno 5 não mostrou diferença estatística, estando

presente em concentração significativa, o que sugere que apesar da presença do bacilo

variar, a presença de anticorpos é uniforme nos três compartimentos.

A sensibilidade e a especificidade do teste do ELISA no LCR como método

diagnóstico da meningite tuberculosa varia de acordo com os antígenos e anticorpos

estudados, além da diluição do LCR utilizada (Mathai et a 1990). Além de método

diagnóstico, o teste ELISA pode ser usado como parâmetro para avaliar a resposta

terapêutica através da presença de antígenos e anticorpos no LCR. O estudo de Desai

et al (1993) mostrou que, após 4 semanas de tratamento, os antígenos persistiam no

LCR, enquanto que o estudo de Kadival et al (1994) mostrou que em 6 semanas de

acompanhamento os níveis de anticorpos caíram em todos os pacientes.

Tabela I. Resumo dos principais estudos da resposta imune no LCR, por ELISA, com

diferentes antígenos micobacterianos e tipos de anticorpos.

TESTE

ELISA

ANTIGENOS

ANTICORPO

SENSIBILIDADE

ESPECIFICIDADE

REFERENCIA

In-house H37RV IgG 79,73 100 DESAI 1993

Comercial BCG-HRP IgG 67,57 100

In-house CFP Ac-HRPO conjugado 86 95 KASHYAP RS 2003

CFP IgG 85 94 2004

30 kDa

80 91

30kDa

100 100 2005

In-house MSE IgG 97,72 95,35 MANIAR P 1990

In-house PPD IgG 90 100 BAIG SM 1995

In-house Ag-5 IgG 84 92 MATHAI A 1990

In-house H37Rv IgG 67,8 100 RADHAKRISHNAN VV 1990

In-house A60 IgG 60 100 SINGH 1999

A60 IgM 75 100

A60 IgM + IgG 60 100

In-house H37RV IgG 90 95,83 SRIVASTAVA KL 1998

In-house A60 IgG 62,5 100 MAHESHUARI 2000

A60 IgM 66,7 100

A60 IgA 75 100

A60 IgA + IgM 79,1 100

A60 IgG + IgA + IgM 79,1 100

Comercial A60 IgG 73,8 96,1 ALIFANO M 1998

A60 IgA 69 93,6

A60 IgG + IgA 80,9 92,3

In-house 38kDa IgG 80 95 KADIVAL GV 1994

In-house ESAT-6 IgG 10 100 CHANDRAMUKI A 2002

14kDa IgG 56 100

MPT-63

8 100

19kDa

6 100

MPT-64

12 100

38kDa

8 100

Comercial 38 kDa/16 kDa IgG 42 96 DEMKOW 2004

In-house 14kDa IgG 75,67 100 SUMI MG 2002

55,5 a 100 100 SUMI MG 2000

In-house LAM IgG 70,58 92,5 PATIL S.A 1996

38kDa

41,17 92,5

In-house 14kDa/LAM IgG 74 100 CHANDRAMUKI A 1989

14kDa/LAM/19kDa/

38kDa

61 100

In-house CFP IgG 70 100 ANNAMMA M 1990

In-house Ag-5 IgG 70 100 RADHAKRISHNAN VV 1991

In-house BCG IgM + IgG 52 96 WATT G 1988

LAM: Lipoarabinomanan; H37RV: cepa virulenta de M. tuberculosis H37; BCG: Bacilo de Calmette-Guerin; CFP: Proteína filtrada de cultura;

kDa: Kilodalton; PPD: Derivado protéico purificado; Ag: antígeno; IgG: imunoglobulina G; IgM: imunoglobulina M; IgA: imunoglobulina A

1.9.6- Exames de Neuroimagem

A tomografia computadorizada (TC) e a ressonância nuclear magnética de crânio

(RNM) são exames radiológicos importantes na definição do diagnóstico da MBK, pois

são capazes de mostrar as alterações patológicas da doença além de dar informações

sobre o prognóstico do paciente (Thwaites et al, 2000; Thwaites & Tran, 2005).

Os achados radiológicos incluem: captação de contraste na meninge basal e na

fissura silviana, tuberculomas, hidrocefalia, infartos isquêmicos nas regiões talâmicas,

nos gânglios da base e na cápsula interna. A angiorressonância pode também mostrar

alterações nos vasos do polígono de Willis, como estreitamento ou a completa oclusão

dos vasos (Garg et al, 1999; Thwaites et al, 2000; Berger et al, 1994; Jinkins et al,

1995).

Apesar de poucos trabalhos terem sido feitos com o objetivo de diferenciar os

achados da MBK de outras doenças neurológicas, estes sugerem que a RNM é melhor

que a TC para mostrar as alterações da MBK. Porém a RNM não é mais sensível para

diferenciar a MBK de outras doenças, como meningite criptocócica, encefalite viral,

sarcoidose, carcinomatose meníngea e linfoma (Thwaites et al, 2005; Offenbacher et

al, 1991; Tartaglione et al, 1998; Kumar et al, 1999).

Thwaites et al 2002, usou as características neurorradiológicas da MBK

determinadas pela TC, como hidrocefalia, edema e captação meníngea basal de

contraste, como critério para o diagnóstico diferencial da MBK com a meningite

bacteriana. Kumar et al (1996) comparou a TC de 94 crianças com MBK e 52 crianças

com meningite piogênica, tendo concluído que a presença de captação meníngea basal

de contraste ou tuberculoma, ou ambos, tem sensibilidade e especificidade de 89% e

100%, respectivamente. Verdon et al (1996) revisaram 48 casos de MBK, e 51%

apresentaram hidrocefalia, 38% captação meníngea, 36% ambas as características,

13% infartos isquêmicos e em 11% tuberculomas. Garg et al (1999) em sua revisão

sobre a MBK, mostraram que a freqüência de infartos na TC varia de 20,5% a 38%.

Monteyne et al (1995) descreveu uma associação entre tuberculomas e MBK que varia

de 28% a 65%. Segundo Andronikou et al (2004), a característica mais específica da

MBK é o sinal de hiperdensidade na base antes da administração de contraste e a

característica mais sensível é a captação de contraste na meninge basal. A combinação

de hidrocefalia, infartos e captação de contraste são específicas, mas tem baixa

sensibilidade (41%).

2- JUSTIFICATIVA

As dificuldades de se realizar o diagnóstico precoce da MBK estão bem ilustradas

na literatura descrita.

O diagnóstico precoce aumenta as chances de sobrevida e existe uma relação

direta entre a precocidade diagnóstica e o prognóstico, porém, infelizmente, a maioria

Como a meningite tuberculosa não tratada geralmente é fatal, um critério clínico

diagnóstico ou exame laboratorial para MBK deve ser sensível. No momento, nenhum

critério laboratorial rápido e barato para o diagnóstico da MBK satisfaz essa exigência.

Estudos baseados na resposta imune para os antígenos micobacterianos têm sido

realizados, sendo os testes imunoenzimáticos mais atraentes por serem rápidos, de

fácil operacionalidade, sensível e relativo baixo custo, quando comparado aos testes

moleculares. Porém, devido a variação na sua sensibilidade e especificidade, estes

testes ainda não são usados na rotina laboratorial.

Com o desenvolvimento dos métodos moleculares e elucidação do genoma de

MTB H37Rv, foram disponibilizados antígenos específicos de natureza protéica, sendo

necessária a avaliação da reatividade desses antígenos nas infecções tuberculosa

extra-pulmonares em áreas endêmicas.

3- OBJETIVO

3.1- Objetivo Geral

Avaliar a imunorreatividade dos anticoprpos do tipo IgG, IgM e IgA no LCR, aos

antígenos micobacterianos obtidos por recombinação genética, MT-10.3 e MPT-64, na

meningite tuberculosa.

3.2- Objetivos específicos

1) Estimar a sensibilidade, especificidade, dos testes imunoenzimático “in house”

para IgG, IgM e IgA, utilizando os antígenos, MT-10.3 e MPT-64, no LCR de

pacientes com meningite tuberculosa.

2) Correlacionar os parâmetros de celularidade e biquímicos nos LCR com a

resposta imune aos antígenos MPT-64 e MT-10.3.

4- MATERIAIS E MÉTODOS

4.1- DESENHO DO ESTUDO

Consiste em um estudo retrospectivo, transverso, envolvendo o uso de sobras de

amostras da rotina, estocadas nos Laboratórios de Líquido Cefalorraquiano do

HUCFF/UFRJ e do Laboratório NEUROLIFE LTDA, Rio de Janeiro, durante o período

de junho de 1999 a maio de 2005. O desenvolvimento dos testes imunoenzimáticos

para avaliação da resposta imune humoral foi realizado no Departamento de

Micobacterioses-IOC, Fundação Oswaldo Cruz.

4.2- CASUÍSTICA

O estudo inclui sobras de amostras de LCR de pacientes que tiveram cultura

positiva para Mycobacterium tuberculosis. Como controle não inflamatório, foram

utilizadas sobras de amostras de LCR provenientes da rotina de pacientes com queixas

de cefaléia e exame do LCR normal. Sobras de amostras de pacientes com o

diagnóstico de esclerose múltipla (EM), definida por critérios clínicos de McDonald et al

e Índice de IgG maior que 0,7 foram utilizadas como controle inflamatório (McDonald et

al , 2001). A esclerose múltipla é uma doença inflamatória, auto-imune caracterizando-

se pela presença de placas de desmielinização no SNC e se apresenta clinicamente

por surtos de parestesias, paresias, ataxia, neurite óptica, alterações esfincterianas e

outras síndromes neurológicas (McDonald et al, 2001; Poser, 1993).

.As amostras foram obtidas na liquoteca do LABORATÓRIO NEUROLIFE LTDA, a

partir do banco de dados PGLAB, que é um laboratório de análise de LCR para dar

apoio diagnóstico aos hospitais da região metropolitana do Rio de Janeiro. Os dados

de anamnese são sucintos e o material é cadastrado ao entrar no laboratório de acordo

com a suspeita diagnóstica do médico solicitante. Portanto, não há dados disponíveis

sobre vacinação, PPD e contatos com portadores de tuberculose, bem como dados de

acompanhamento diagnóstico e terapêutico. As amostras foram obtidas de pacientes

com suspeita de MBK que foram submetidos à raquicentese e examinados para

citologia global e específica, dosagem de glicose e proteínas, exame direto para

germes comuns (coloração de Gram), BAAR (coloração de Zielh-Neelsen) e fungos,

látex para germes comuns e criptococos, cultura para bactéria, fungo e BK. A deteção

de anticorpos anti-HIV foi realizada pelo teste de ELISA Genscreen (BioRad, França).

Após a realização dos testes de rotina, as amostras foram aliquotados em tubos de

microcentrífuga e estocados em freezer -20 °C até o uso.

4.3- CRITÉRIOS DE INCLUSÃO

1- Controle Positivo: Amostras de pacientes que preencheram os critérios

diagnósticos para meningite tuberculosa, caracterizada por sinais

meningorradiculares, cefaléia, febre, vomito, alteração do nível de consciência,

déficit neurológico focal, alteração clínica dos nervos cranianos e crises

convulsivas, associado à demonstração do agente etiológico no LCR (cultura ou

baciloscopia positiva).

2- Controle Negativo Inflamatório: Amostras de pacientes que preencheram os

critérios diagnósticos de Esclerose Múltipla, segundo Critérios de Mc Donald e

Índice de IgG maior que 0,7.

3- Controle Negativo Não-Inflamatório: Amostras de pacientes com cefaléia e

exame de LCR normal.

4.4- CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO

1. Amostras de pacientes menores de 18 anos.

4.5- AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL

Para os experimentos de detecção de anticorpos foram utilizadas a técnica de

ELISA que foi padronizada “in house”.

4.6- ANTÍGENOS

Os antígenos protéicos utilizados neste trabalho, MT-10.3 e MPT-64, foram

gentilmente doados pelo Dr. M. Singh (Lionex Diagnostics & Therapeutics GmbH,

Braunschweig, Germany) dentro do acordo de Cooperação Brasil x Alemanha com o

Departamento de Micobacterioses da Fundação Oswaldo Cruz. Os antígenos foram

obtidos por recombinação genética e expressos em Escherichia coli, resumidamente: os

genes codificantes de cada antígeno foram submetidos à amplificação por PCR, os

fragmentos obtidos foram clonados em vetor plasmidial e as proteínas foram expressas

em E. coli e purificadas (amylose resin affinity chromatography). Contaminação das

frações antigênicas foram purificadas pelo sistema Mono Q anion exchange

chromatography. Purificação final foi feita por diálise e as proteínas foram aliquotadas e

liofilizadas. A concentração das proteínas foi determinada pelo método de Lowry.

4.7- ENSAIO IMUNOEZIMÁTICO PARA LCR COM OS ANTÍGENOS MPT-

64 E MT-10 (Liq-EIA)

4.7.1- Adsorção dos antígenos ao suporte sólido (poços da microplaca)

Os antígenos foram diluídos nas concentrações de 1 µg/ml em tampão

carbonato-bicarconato. Cinqüenta µl de cada antígeno foram depositados nos poços

das microplacas de ELISA (Nunc flat bottom, immunoplate C96 Maxisorp, Thomas Sci,

USA), e em seguida incubadas por duas horas a 37°C. Ligações inespecíficas foram

bloqueadas pela adição de 100 µl, em cada poço, de solução tampão salina fosfato

adicionado de Tween 20 a 0,01% (PBSt) e contendo albumina sérica bovina a 5%

(BSA, (fraction V, Sigma, USA) e novamente incubada por duas horas a 37ºC. Em

seguida os poços foram lavados quatro vezes com 200 µl de PBSt e utilizadas

imediatamente ou armazenadas a 4ºC em sacos plásticos selados por no máximo, uma

semana.

Para os testes de padronização e controle das placas foram preparados

concentrados de controles positivos e negativos contendo alíquotas de 10 µl de 16

diferentes amostras de LCR oriundos de pacientes com MBK, para os controles

positivos, e de Esclerose Múltipla e cefaléias (Não-MTB), para os controles negativos,

que foram aliquotados em microtubos contendo glicerol volume a volume (Vetec, RJ).

Os concentrados de positivos e negativos foram diluídos seriadamente de 1:10 a

1:1600 (razão de 2x) em PBSt-BSA 1% e 50 µl de cada diluição foram adicionados aos

poços previamente adsorvidos com os antígenos. Depois de incubação por 60 min a

37°C, as placas foram lavadas como descrito acima e 50 µl de cada solução de

anticorpos anti IgG e A humana ligadas a peroxidase (conjugados) (Sigma, USA) e

anticorpos anti IgM humana (Pierce, Germany), previamente diluídas a 1:800, 1:2000 e

1:20000 em solução de PBSt-BSA a 1%, respectivamente, foram depositadas nos

respectivos poços. Após incubação de 1h/37°C, procedeu-se a lavagem como descrito

acima. As reações foram revolvidas com a adição de 50 µl de solução substrato de

trimetilbenzidina (TMB, SH, Germany) e as placas foram incubadas em local escuro à

temperatura ambiente. A reação de cor foi interrompida com a adição de 100 µl de

ácido sulfúrico 2,5 M. A intensidade das reações foi determinada com o uso de leitor de

microplacas (Labsystems Multiskan MS Plate Reader, USA) em dois comprimentos de

onda (450/630 nm) com movimento contínuo, para controlar possíveis variações de

absorbância (condensação, impressão digital). Os resultados serão expressos em

densidade ótica (DO) x 1000.

As diluições das amostras de LCR e conjugados a serem utilizadas para testar a

amostragem proposta, foram definidas pelas reações antígeno x anticorpo ideal, isto é,

as que mostraram maior discriminação entre os concentrados de MBK em relação aos

concentrados de não MBK.

Em todas as placas teste foram adicionados os concentrados positivos (MTB) e

negativos (não MTB) em no mínimo quatro diluições para servir como controle das

placas nos testes realizados no mesmo dia ou em dias diferentes. Cada placa continha

um poço com controle branco e a DO da solução branco (Solução substrato) não

ultrapassou o valor de 100. Quando isto ocorreu, devido a um erro operacional nas

etapas de lavagem, os testes foram repetidos. Todos os testes foram realizados em

duplicata e os seus valores não excederam 25% do valor médio das duplicatas. Quando

isto ocorreu o teste foi repetido.

4.8- ESTUDO ESTATÍSTICO

Resultados dos exames bioquímico-celular e dos testes imunoenzimáticos nas

amostras de LCR foram introduzidos em uma planilha Microsoft Excel. Os dados foram

transferidos para o programa SPSS 11.0 para análise estatística (SPSS Inc, Chicago,

IL, USA).

Um teste qualitativo tem como resultados possíveis, negativos ou positivos. Em

um teste quantitativo é necessário estabelecer um valor de corte a partir do qual ele

será considerado positivo; isto é, um valor que forneça maior sensibilidade possível sem

afetar a especificidade do teste. Sua finalidade é determinar o valor diagnóstico ótimo

de um método que expressa resultados na forma de valores contínuos.

Com esta finalidade, pode-se utilizar a fórmula de inserção dos resultados

obtidos de uma amostragem estudada em uma curva do tipo receiving operator

characteristic curve - ROC (curva de operação característica). Na curva ROC, o

diagnóstico é considerado uma variável estável, composta de dois valores possíveis

(neste caso, TB ou não TB). Um teste ideal deve fornecer sensibilidade e especificidade

altas, e no gráfico da curva ROC, este valor ideal deve estar próximo do ângulo superior

esquerdo. Quanto mais próximo desse ângulo, melhor o teste (Figura 2).

Figura 2. Curva do tipo receiving operator characteristic curve (ROC) hipotética e ideal

A comparação das médias de variáveis não contínuas foi realizada pelo teste “t”

de Student. Para comparar as diferenças nas freqüências dos resultados obtidos nos

diferentes grupos avaliados com os diferentes antígenos foi utilizado o teste Anova. A

comparação das médias entre os grupos foi realizada pelo teste de Student-Newman-

Keuls. O grau de concordância entre os antígenos testados com as diferentes

imunoglobulinas foi determinado pelo teste de correlação (r) e a significância pelo teste

de Pearson.

A presença de anticorpos para os antígenos de M. tuberculosis em pacientes

com meningite tuberculose, será a variável preditiva e espera-se positividade dos

testes.

4.9- ASPECTOS ÉTICOS

O presente estudo obteve aprovação dos Comitês de Ética do HUGG e HUCFF,

além de dispensa do termo de Consentimento informado para uso de amostras

estocadas, baseado na resolução n° 01/88 publicado na revista Bioética, CNS (vol.3 n°

2, 1995), Diretriz 9: ”Estudos epidemiológicos que requerem o exame de documentos,

tais como prontuários médicos, ou de sobras anônimas de amostras de sangue, urina,

ou espécimes de tecidos podem ser realizadas sem o consentimento dos indivíduos

envolvidos, desde que seu direito ao sigilo seja garantido, pelos métodos em estudo” e

na consulta junto ao CRM-RJ, o qual garante que a norma também se refere ao uso de

amostras deste fluido.

5- RESULTADOS

5.1-AMOSTRAGEM

Dos LCR estocados no Laboratório NEUROLIFE no período de junho de 1999 a

maio de 2005 foram selecionados 90 assim divididos: 19 oriundos de pacientes com

meningite tuberculosa diagnosticados pela cultura positiva para M. tuberculosis (Grupo

I), 26 oriundos de pacientes com esclerose múltipla (Grupo II) e 45 indivíduos com

cefaléia e exame de LCR normal (Grupo III). As características clínicas e demográficas

dos pacientes estão descritas na Tabela II .

O Grupo II (esclerose múltipla) é composto de indivíduos mais jovens que os

pacientes dos Grupos I e III (p=0,03). Houve uma predominância do sexo feminino nos

pacientes dos Grupos II/III (p=0,004) e o sexo masculino foi predominante no Grupo I

(p<0,05). Todos os LCR dos pacientes do Grupo I apresentaram Gram e BAAR

negativos e cultura para MTB positiva.

Tabela II. Características clínicas e demográficas dos diferentes grupos de LCR.

Diagnóstico

Número de pacientes (%)

Características

Grupo I

N= 19

Grupo II

N= 26

Grupo III

N= 45

valor

Idade x± (SE)

47,89 (17,6)

34,53 (10,42)

45,75 (22,97)

0,03

Sexo

Masculino

Feminino

12 (63)

7 (37)

4 (15,38)

22 (84,62)

16 (35,5)

29 (64,5)

Sorologia para HIV

positivo

negativo

Não Realizado

8 (42,1)

6 (31,6)

5 (26,3)

26 (100)

45 (100)

Bacterioscopia

BAAR Positiva

BAAR Negativa

100%

Cultura positiva 100% 0 0

HIV: Vírus da Imunodeficiência Adquirida. BAAR: Bacilos álcool-ácido resistente. (x± SE):

Média±Desvio Padrão. Grupo I (meningite tuberculosa), Grupo II (esclerose múltipla) e Grupo III

(cefaléia).

Os resultados dos exames bioquímico-celular das amostras de LCR estudados

estão mostrados na Tabela III. Como esperado, de um modo geral, os valores médios

de todos os parâmetros mostram-se mais elevados nos estados de MBK que nos

controles negativos. Contrariamente, às outras células encontradas no LCR, os

plasmócitos, basófilos e macrófagos não estão presentes em quantidades

significativamente diferentes aos outros Grupos. Os leucócitos, hemácias, neutrófilos,

eosinofilos e proteínas foram significativamente mais elevadas no Grupo I (p<0,05), já a

glicose, embora significativamente diferente entre os três Grupos, apresentou

concentração média menor no Grupo I (p<0,05).

Baseado no critério de gravidade da doença em relação à proteínorraquia, de

acordo com FUNASA 2002, os pacientes do grupo I (n=19) foram subdivididos em três

Sub-Grupos (SG): SG I.1= PR ≤40 mg/dl; SG I.2 = 40>PR<300 mg/dl e SG I.3 =

PR≥300 mg/dl. Como mostrado na Tabela IV a leucometria acompanhou o padrão de

aumento da concentração de proteínas. O número de neutrófilos aumentou nos LCR do

SGI.1 para o SGI.3, enquanto que o número de linfócitos mostrou-se mais elevado no

SGI.1, mas sem significância estatística, provavelmente devido ao baixo número de

LCR em cada SG.

Tabela III. Resultados dos exames bioquímico-celular dos LCR nos diferentes grupos

de LCR.

Características

Grupo I Grupo II Grupo III P valor

Leucócitos (cel/mm

)

196,2 ± 259

7,25 ± 13,68 1,73 ± 1,05

<0,05

Hemácias (cel/mm

)

9,68 ± 22,49

1,74 ± 5,22 1,55 ± 3,42

0,01

Neutrófilos (%)

53,52 ± 22,32

0,14 ± 0,45 0,04 ± 0,29

<0,05

Eosinófilos (%)

0,36 ± 0,59

0,03 ± 0,19

0 <0,05

Linfócitos (%)

36,7 ± 22 33,75 ± 44,86

8,15 ± 26,43

<0,05

Monócitos (%)

8,26 ± 3,12 3,11 ± 4,44 0,68 ± 2,53

<0,05

Plasmócitos (%)

0,1 ± 0,45

0 0 0,155

Basófilos (%)

0 0 0 0

Macrófagos (%)

1 ± 0,88

0 0 <0,05

Proteínas (mg/dL)

221,3 ± 278 35,4 ± 20,7 29,8 ± 4,38

<0,05

Glicose (mg/dL)

34,31 ± 12,3

52,3 ± 12,7 60,35 ± 10,81

<0,05

Grupo I: Meningite tuberculosa; Grupo II: Esclerose Múltipla; Grupo III: Cefaléia.

x± SE: Média±Desvio Padrão.

Tabela IV: Características clínicas e citoquímica dos LCR provenientes de pacientes

com MBK e sub-agrupados de acordo com a concentração protéica do LCR

SUB-GRUPO I

Características

SG I.1

n=2

SG I.2

n=12

SG I.3

n=5

P valor

HIV n (%)

Soropositivo

Soronegativo

Não realizado

100

5 (41,7)

2 (16,6)

3 (60)

1 (20)

Citoquímica (x± SE)

Leucócitos (cel/mm

)

16,5 ± 0,7 152,33 ± 185,80

373,4 ± 381,95

0,164

Neutrófilos (%)

31 ± 36,76 56,5 ± 23 55,2 ± 12,65

0,337

Linfócitos (%)

61,5 ± 40,3

35 ± 21,72 31 ± 10,81

0,239

Monócitos (%)

5,5 ±2,12 7,33 ±2,5 11,6 ± 2,3

0,007

Glicose (mg/dL)

46 ± 7 33,9 ± 11,7 30,6 ± 14,4

0,343

SUB-GRUPO I : pacientes com Meningite tuberculosa; SG I.1= Proteinorraquia ≤40 mg/dl; SG I.2 =

40>Proteinorraquia<300 mg/dl e SG I.3 = Proteinorraquia≥300 mg/dl. x± SE: Média±Desvio Padrão

Quando se analisou os resultados bioquímicos-celular do LCR do SG I co-infectado

ou não por HIV, observou-se que os leucócitos, proteínas e a glicose estão mais

elevados no LCR oriundos de pacientes HIV positivos (p<0,05). Os neutrófilos, linfócitos

e monócitos não mostraram diferença significativa entre os HIV positivo e negativo

(Tabela V).

Tabela V. Resultados dos exames bioquímico-celular dos LCR do SubGrupo I

Infetados ou não pelo vírus da imunodeficiência adquirida (HIV)

Exames Bioquímico-

SUBGRUPO I

(x± SE)

Celular HIV Soropositivo

HIV Soronegativo P Valor

N= 8 N= 6

Leucócitos (cel/mm

)

236,87 ± 260,18

115 ± 76,67

0,292

Neutrófilos (%)

55,87 ± 19,05 60,5 ± 23,08

0,688

Linfócitos (%)

34,2 ± 18,59 30,83 ± 20,97

0,753

Monócitos (%)

8,62 ± 2,82 7,33 ±

0,426

Proteínas (mg/dL)

324,87 ± 400,61

159 ± 102,9

0,346

Glicose (mg/dL)6

38,62 ± 14,16 25,83 ± 8,84

0,077

SUB-GRUPO I : pacientes com Meningite tuberculosa; x± SE: Média±Desvio Padrão

5.2- PADRONIZAÇÃO DO LIQ-EIA:

A padronização do Liq-EIA com os antígenos MPT-64 a MT-10.3 foi realizada com

os concentrados de LCR de pacientes MBK e Não-MBK. A Figura 3, mostra as

melhores diluições dos LCR e conjugados para a detecção dos diferentes tipos de

imunoglobulinas. O melhor resultado discriminatório das reações antígeno x anticorpo

nos LCR controle positivo (MBK) e negativo (Não MTB) foi obtido com a diluição a 1:40

e os conjugados anti-IgG, IgM e IgA diluídos respectivamente a 1:800, 1:20.000 e

1:2000.

5.3- TESTE IMUNOEZIMÁTICO EM LCR (LIQ-EIA)

Todos os LCR arrolados no estudo foram ensaiados para o método imunoenzimático

com os antígenos MPT-64 a MT-10.3. A Figura 4 mostra os resultados das densidades

óticas nos LCR individualmente. As médias de DO para os diferentes antígenos e tipos

de anticorpos foram significativamente diferentes entre o Grupo I e os Grupos controles

(Grupo II/III, p<0,05). As médias de reatividade para os antígenos MPT-64 e MT-10.3

foram maiores para a IgG (311,5 ± 145,5 e 215,8 ± 130,1, respectivamente) no Grupo I.

Para a IgM (153,9 ± 184,26 e 86,15 ± 49,14, respectivamente) e IgA (141,36 ± 94,9 e

168,26 ± 119,6, respectivamente) as médias de DO foram significativamente diferente

entre os Grupos I e II/III, embora com menor reatividade que para IgG. Não houve

diferença significativa entre as médias de DO dos LCR Não-MBK (p>0,22).

Figura 3. Resultado da padronização com o concentrado de LCR MBK (controle positivo) e Não TB

(controle negativo) com o antígeno MPT-64 e MT-10.3 (1 µg/ml) e conjugados A) anti IgA, B) anti IgM e

C) anti IgG

Conjugado anti IgA 1:2000

100

150

200

250

300

350

400

450

500

1:10 1:20 1:40 1:100 1:200 1:400

Diluição LCR

C+ MPT-64 IgA 1:2000

C- MPT-64 IgA 1:2000

C+ MT- 10 IgA 1:2000

C- MT- 10 IgA 1:2000

Conjugado anti IgM 1:20000

100

150

200

250

300

350

400

100

200

1:400

1:800

000

200

600

Diluição LCR

C+ MT-10 IgM 1:20000

C- MT-10 IgM 1:20000

C+ MPT-64 IgM 1:20000

C- MPT-64 IgM 1:20000

Conjugado anti IgG 1:800

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1:40

1:100

1:200

1:4

1:1000

1:1

Diluição LCR

C+ MPT-64 IgG 1:800

C- MPT-64 IgG 1:800

C+ MT -10.3 IgG 1:800

C- MT -10.3 IgG 1:800

DO= Densidade Óptica x 1000. C+ = Concentrado de LCR controles positivos (MBK). C- =

Concentrado de LCR controle negativo (Não-MBK)

A Figura 5 mostra a curva ROC de sensibilidade x especificidade do Liq-EIA para

detecção dos diferentes tipos de Acs reativos aos Ags MT10.3 e MPT-64. Os pontos de

cortes obtidos foram respectivamente 212, 94,5 e 98,5 para IgG, IgM e IgA-MPT64 e

109,5, 62,5 e 84,5 para MT10.3. A IgG-MT-10.3 mostrou a melhor sensibilidade (100%)

com boa especificidade (92%) e a IgG-MPT-64 a melhor especificidade (94%), mas com

menor sensibilidade (90%) seguidos da IgA MPT-64 (90% e 92 %), IgM-MT-10.3 (90 %

e 78%), IgA-MT-10.3 (79 % e 75 %) e IgM-MPT-64 (68 % e 66 %) quanto a

sensibilidade e especificidade, respectivamente (Figura 4 e Tabela VI).

A análise global e cumulativa, dos ensaios imunoenzimáticos com as IgA, IgM e IgG

dos LCR para cada um dos antígenos testados estão mostrados na Tabela VI. Embora

a sensibilidade dos testes -4(s )-2.022.002( )-299sIgA-M63(T)-9(-)3(/T)-9(I)-2(g)6(G)-2(-)3(M)3(P)7(T)-.08 0 Td[(%)-1())3(,)-2(0)-4(-4(4(o)-4(s-362(I)-2(g)62(-)3(M)3(T)-9(-)3(/T)-9(I)-2(g)6(G)-2(-)3(63(P)7(T)-.0195( q)6(u)-4(a)i)2(v)10(h3(a)-4( )-22.0195( s)-4(e)-4(o)-4(r)12.998((-4(4)2774898]TJ-316.)-4(o)-4( )-22(m)3(o)-4(st)-2[(%)-m2( )-22(a)-4([(%)-T)-.08 0 Tdn)-4 0 Td(l)2(a)-4(d3(a)-4( )-22.0)-1.993(-)3(M)3(04( )-22.0195( 2(7)-4(5)-4( 6)6( )-2(m)3(u0 Td(l)2( 0 Td[(%)-u)10(t)-2([(52(i)2(ci)2(dc-22(é-4(o)co)6(e)3(st)-2[(%)-n3(a)-4( )-22.0).2 -27.6 (0)-438.284(o)-4(s )a)-4( )-626e)-4(n)-4(si)2(b)-4(i)2(l-4( 0 Td[(%)--1.99<)4)-42.002(( )-2(()3(9)6(4)-4(%)-1())2.-)-2.00195 Tdn)-)-1())i)-)-1((n)-4(s(o)-4(r)12.998(38.284)277.998]TJa)-4(-4( )-22(e)-4()-22(ecTd[(m)-7)-4(,)7.9u)-4(d)6(L)-4(C)2(R)21F)1(i)2(g)6(-4( )-2(r)3(a)-4( )s)-4( )-4(m)829)7.99805(m)0 Td[(co).002(E)7.001a)-4

Tabela VI: Sensibilidade e especificidade do Liq-EIA na detecção de diferentes tipos de anticorpos reativos aos antígenos MPT-64 e MT-

10.3

Número de positivos /total (%)

IgM IgG IgA

MPT-64 MT-10.3 MPT-64 MT-10.3 MT-10.3 MPT-64

SENSIBILIDADE 13/19 (68) 16/ 19 (90) 17/ 19 (90) 19/ 19 (100) 15/ 19 (79) 15/ 19 (90)

ESPECIFICIDADE 24/ 71 (66) 16/ 71 (78) 4/ 71 (94) 5/ 71 (92) 18/ 71 (75) 6/ 71 (92)

Tabela VII: Freqüência da resposta imune de IgG, IgM e IgA aos antígenos MPT-64 e MT-10.3 no LCR de pacientes MBK subdivididos quanto

a sorologia para HIV e proteinorraquia (PR).

Número de positivo/ Total (%)

Ig G Ig M Ig A

MPT-64 MT-10.3 MPT-64 MT-10.3 MT-10.3 MPT-64

HIV + 8/8 (100) 8/8 (100) 6/8 (75) 8/8 (100) 7/8 (86) 7/8 (86)

HIV - 5/6 (83) 6/6 (100) 4/6 (67) 4/6 (67) 4/6 (67) 5/6 (83)

SG I.1 1/2 (50) 2/2 (100) 1/2 (50) 1/2 (50) 1/2 (50) 2/2 (100)

SG I.2 11/12 (92) 12/12 (100) 8/12 (67) 10/12 (83) 9/12 (75) 8/12 (67)

SG I.3 5/5 (100) 5/5 (100) 4/5 (80) 5/5 (100) 5/5 (100) 5/5 (100)

HIV +/- = Human Immunodeficiency Vírus soro-positivo/negativo; SGI= Grupo I (MBK), subdividido quanto a proteinorraquia: SGI.1 <

40mg/dl; SGI.2 40<PR<300 mg/dl; SGI.3 > 300 mg/dl.

Tabela VIII: Sensibilidade e especificidade do Liq-EIA analisando os resultados cumulativamente.

IgM IgG IgA

MPT-64 MT-10.3 MPT-64 MT-10.3 MPT-64

S (%) = 89,5 MT-10.3

IgM

E (%)= 49,3

S (%) = 89,5 94,7 MPT-64

IgG

E (%)= 64,8 71,8

S (%) = 100 100 100 MT-10.3

IgG

E (%) = 63,4 71,8 88,7

S (%)= 100 100 100 100 MPT-64

IgA

E (%)= 59,1 73,2 86 84,5

S (%) = 94,7 94,7 100 100 89,5

MT-10.3

IgA

E (%) = 43,7 60,5 70,4 69 73,2

Figura 4. Resultados do Liq-EIA expresssos em densidade ótica com os antígenos MPT-64 e MT-

10.3 para deteção dos anticorpos IgG, IgM e IgA IgG.

Analisando-se os resultados da leucometria e os valores médios da reatividade,

observou-se existir uma baixa correlação pata todas as imunoglobulinas com os

diferentes antígenos (r<45). Foi encontrada alta correlação entre a proteinorraquia e as

médias de DO, variando entre 88% e 89% para o teste IgA e IgM a 91,1% para IgG

MPT-64 (p=0,01).

Ao avaliar os dados dos LCR subdivididos em relação à concentração protéica, não

foi encontrada diferença entre os SG quanto a média das DOs para IgM MPT-64

(p=0,18) e IgG MT-10.3 (p= 0,11). A média de reatividade da IgG MT-10.3 no SG I.3

(321,2 ± 178,6) foi maior que os demais SG embora sem diferença significativa

(p=0,09). Porém as médias de reatividade das demais imunoglobulinas para ambos os

antígenos foram significativamente diferentes entre o SG I.3 x SGI.1/I.2 (p<0,007).

Comparando a freqüência de resposta imune em todos os SG, foi encontrada alta

freqüência de reatividade para IgG MT10.3 (100%), seguida pelas IgA e IgG MPT-64

(Tabela VII).

Analisando-se o Grupo I de acordo com o status do HIV, observou-se que não houve

diferença significativa de imunoreatividade para os diferentes Ac com ambos os Ags

(p>0.05), entretanto a freqüência de resposta foi mais elevada para IgG-MT10.3 (100%)

seguida da IgG MPT-64 (100% e 83%, respectivamente para HIV soropositivo e

negativo) (Tabela VII).

Figura 5. Curva ROC de sensibilidade x especificidade do Liq-EIA para detecção

dos diferentes tipos de Acs reativos aos Ags MT10.3 e MPT-64.

MT-10.3 IgA

1 - Specificity

1,0,8,5,30,0

Sensitivity

1,0

0,0

MPT-64 IgA

1 - Specificity

1,0,8,5,30,0

Sens itivity

1,0

0,0

MPT-64 IgM

1 - Specificity

1,0,8,5,30,0

Sensitivity

1,0

0,0

MT-10.3 IgM

1 - Specificity

1,0,8,5,30,0

Sensitivity

1,0

0,0

MPT-64 IgG

1 - Specificity

1,0,8,5,30,0

Sensitivity

1,0

0,0

MT-10.3 IgG

1 - Specificity

1,0,8,5,30,0

Sensitiv ity

1,0

0,0

6- DISCUSSÃO

Tanto o Brasil, como os países em desenvolvimento, enfrentam o desafio de

diagnosticar precocemente as doenças cuja morbidade e letalidade são elevadas,

objetivando reduzir o impacto econômico destas na política de saúde publica, pois

geram gastos excessivos.

A MBK, apesar de ter baixa prevalência no Brasil, entre 0,15 e 0,34/100.000

habitantes, apresenta uma taxa geral de mortalidade de 10% e para os tratados

tardiamente de 50%, podendo chegar a 100% caso não sejam tratados após 5 a 8

semanas do início da doença (GT-MENINGITE/COVER/CGVEP/CENEPI/FUNASA/MS

2000; Nunes et al, 1998a; 1998b).

Os métodos diagnósticos de rotina utilizados na MBK ainda se baseiam nos

microbiológicos e na bioquímica, sendo o padrão-ouro o microbiológico (cultura).

Entretanto, a cultura é morosa, laboriosa e de sensibilidade variável, comprometendo o

rápido diagnóstico. Com o desenvolvimento da biologia molecular, métodos alternativos

têm sido pesquisados nos últimos anos, entre estes os baseados na estrutura dos

ácidos nucléicos e na resposta imune do hospedeiro (Thwaites et al, 2002).

O imunodiagnóstico na tuberculose apresenta sensibilidade e especificidade

variadas devido à heterogeneidade dos antígenos e da resposta imune do hospedeiro.

Com o desenvolvimento da biologia molecular, vários antígenos específicos do MTB

têm sido obtidos, mas poucos são os estudos avaliando seu potencial para uso

diagnóstico na tuberculose extra-pulmonar. Entre os métodos imunodiagnósticos, o

teste de ELISA apresenta vantagem de ser de fácil realização, relativo baixo custo e

sensível. Portanto, seria um método útil em saúde pública se demonstrasse acurácia

adequada. O método de ELISA para o imunodiagnóstico precoce da MBK tem sido

estudado nas últimas décadas. Alguns trabalhos têm descrito as vantagens e

desvantagens do método direto (pesquisa de Antígenos) e indireto (pesquisa de

Anticorpos) no diagnóstico da MBK. (Chandramuki et al, 2002)

No presente trabalho, foi avaliada a imunorreatividade de IgG, IgM e IgA aos

antígenos micobacterianos, MPT-64 e MT-10.3 no LCR de MBK. O Liq-EIA IgG MT-10.3

mostrou a mais alta sensibilidade e especificidade (100% e 92%), seguidos das IgG

MPT-64 (90% e 94%), IgA MPT-64 (90% e 92%), IgM MT-10.3 (90% e 78%), IgA MT-

10.3 (79% e 75%) e IgM MPT-64 (68% e 66%). Os valores médios de DO no grupo com

MBK, para IgG MPT-64 (311,5 ± 145,5) e IgG MT-10.3 (215,8 ± 130,2), foi

significativamente mais elevado que para os controles negativos (p<0,005). Não há

relatos de estudos envolvendo a resposta imune ao antígeno MT-10.3 no LCR, portanto

esta é a primeira vez que este antígeno é avaliado quanto a sua imunoreatividade no

LCR de pacientes com MBK.

O Liq-EIA IgM MT-10.3, IgG e IgA MPT-64, resultou em menor sensibilidade (90%),

sendo que a IgG MPT-64 forneceu maior especificidade (94%). Entretanto,

Chandramuki et al (2002) estudando LCR de pacientes com MBK cultura positiva da

Índia, encontrou baixa sensibilidade para IgG MPT-64 (12%). Estes achados,

acentuadamente discrepantes, podem estar relacionados à qualidade do antígeno

utilizado, às diluições empregadas ou ao tamanho da amostragem testada, já que o

número de pacientes indianos foi de 50 e a nossa de 19. A especificidade do teste

encontrada por estes autores foi de 100%, similar ao encontrado em nosso estudo

(94%). Estes achados aliados a alta especificidade da IgG MT-10.3, corrobora a

hipótese de Chandramuki et al (2002) de que em regiões de alta endemicidade para

tuberculose (aproximadamente 40% de infecção latente na população adulta), a

tuberculose ativa estaria preferencialmente associada a detecção de anticorpos para os

antígenos micobacterianos no LCR. O presente trabalho mostra que o Liq-EIA para IgG

MT-10.3 foi capaz de detectar todos os LCR de MBK, apresentando menos de 10% de

falso-positivos. O fato do Liq-EIA IgG MT-10.3 mostrar alta sensibilidade favorece o

diagnóstico rápido de uma doença que apresenta rápida evolução e que pode levar ao

óbito, caso não seja diagnosticada e tratada precocemente.

Vários autores consideram que o uso de múltiplos antígenos na composição de um

teste diagnóstico seria uma estratégia importante para detectar um maior número de

pacientes com tuberculose, já que estes parecem responder de forma heterogênea aos

diferentes antígenos micobacterianos. Em nossa análise global e cumulativa de

diferentes imunoglobulinas com ambos os antígenos estudados, mostrou um aumento

da sensibilidade, porém com comprometimento da especificidade e nenhuma das

combinações apresentou melhor resultado que a IgG MT-10.3 (Tabela VIII).

Segundo Watt et al (1988), a baixa sensibilidade dos testes de ELISA pode estar

associada à ausência de anticorpos no LCR nos estádios iniciais da infecção ou com a

evolução do tratamento. Mas, em nosso estudo, dos dois pacientes do SGI.1 (baixa

concentração de proteínas), todos responderam para a IgG MT-10.3 (100%) (Tabela

VII). Os valores médios de DO neste grupo de pacientes, foi mais elevado que nos

controles negativo, embora sem diferença significativa (207 ± 8 / 179,5 ± 22, p= 0,39).

Recentes estudos populacionais de pacientes com MBK têm mostrado uma variação

na incidência entre os sexos e na média de idade. O estudo de Tan et al (1999)

mostrou média de idade de 37,9 ± 14,9 (9 a 63 anos) e predomínio de pacientes do

sexo feminino (1,44:1). Verdon et al (1996) em uma revisão de 46 casos de MBK na

França, encontraram média de idade de 46 anos (18 a 83) e um predomínio de

pacientes do sexo masculino (32 homens e 16 mulheres). No estudo de LAU et al

(2005) com 166 pacientes com MBK, em Hong Kong, média de idade foi 42,9 e 50%

dos pacientes eram do sexo masculino. Em nosso estudo, com pacientes brasileiros, os

resultados foram similares aos franceses e chineses, com predominância de pacientes

do sexo masculino (63%) e médias de idade acima de 45, embora não haja relevância.

Com relação à população controle, em nosso meio houve predomínio de indivíduos do

sexo feminino, o que também corrobora os achados na literatura internacional onde

pacientes com EM são predominantemente deste sexo. (Poser, 1992).

O Grupo II, em nosso estudo, é composto por indivíduos significativamente mais

jovens quando comparados com os pacientes dos Grupos I (47,89 ± 17,6) e Grupo III

(45,75 ± 22,97) (p=0,03), resultados estes similares aos encontrados em estudos

prévios. (Arruda et al, 2001; Ferreira et al, 2004).

As anormalidades no exame do LCR de pacientes com MBK são bem descritas na

literatura. Geralmente, a meningite tuberculosa apresenta-se com uma pleocitose com

predomínio de neutrófilos, nas fases iniciais, e à medida que a doença progride, ocorre

predomínio de linfócitos, aumento nos níveis de proteína e diminuição nos níveis de

glicose. Em nosso estudo, a média de todos os parâmetros citoquimicos mostra-se mais

elevada nos estados de MBK que nos controles negativos, exceto para a glicose, que

apresentou menor concentração média (p<0,05), corroborando os estudos anteriores

(Heringer et al, 2005; Verdon et al, 1996; Tan et al, 1999; Klein et al, 1985).

A infecção por MTB é uma complicação comum da infecção do HIV contribuindo

para aumentar a incidência da MBK. Segundo a literatura internacional, apesar deste

aumento de incidência, as características clínicas, laboratoriais e radiológicas ou a

resposta ao tratamento da MBK não se altera com a co-infecção HIV/TB (Yechoor et al,

1996; Berenger et al, 1992). Em nosso estudo, entretanto, o grupo dos pacientes com

MBK co-infectados pelo HIV, além de predominar o sexo masculino, a média dos

leucócitos, proteínas e da glicose está mais elevada. Esta discrepância pode estar

relacionada ao pequeno número de LCR testados.

A infecção causada pelo HIV tem dimensões pandêmicas e atinge áreas de alta

endemicidade para TB, sendo, portanto necessário investigar sua significação na

resposta imune dos infectados por MTB. Em nossos resultados, não houve diferença

significantiva da imunorreatividade da IgG e IgA, aos antígenos testados, nos LCR de

pacientes MBK co-infectados ou não pelo HIV (Grupo I, p>0,05), sugerindo que em

nossas amostras, a co-infecção HIV/MBK não interfere na resposta imune aos

antígenos MPT-64 e MT-10.3. Estes resultados estão em desacordo com os descritos

por Chandramuki et al (2002), que mostraram que a resposta imune em pacientes com

co-infecção MTB/HIV está diminuída. Entretanto, eles não encontraram diferença na

reatividade de anticorpos de pacientes MBK/HIV positivos diagnosticados clinicamente

e aqueles com cultura positiva, concluindo que o HIV parece reduzir a capacidade de

produção de anticorpos no LCR de MBK, mas não acentuadamente, o que na verdade

apóia os nossos achados.

Deeny et al (1985) e Nunes et al (1998) observaram que a MBK pode estar

associada a uma neutrofilia persistente, o que pode ser um fator de confusão para o

diagnóstico. Da mesma forma, Marinho et al (1997) mostraram que a MBK pode se

apresentar como uma meningite neutrofílica persistente em pacientes com SIDA, pois

supõe que o paciente co-infectado pelo HIV desenvolve uma resposta parcial inicial de

defesa, ocorrendo maior resposta de fase aguda, caracterizada pela contínua liberação

de fatores quimiotáxicos para neutrófilos, impedindo o predomínio linfocitário. Apesar de

não haver diferença estatística entre as médias dos linfócitos e neutrófilos (p>0,05) do

Grupo I em nosso meio, existe um predomínio neutrofílico, corroborando os relatos da

literatura. Porém, nos dois pacientes do SGI, a análise sugere que níveis normais de

proteína estão associados a um predomínio de linfócitos e apesar de não dispormos de

dados clínicos evolutivos, foi evidenciada neste estudo a ocorrência de meningite

neutrofílica nos LCR de pacientes HIV soropositivos e negativos (tabela V). Este é um

dado importante, pois não condiz com o padrão evolutivo da doença onde é esperado

um predomínio linfomonocitário (Deeny et al, 1985; Nunes et al, 1988).

Conseqüentemente, estes achados dificultam o diagnóstico apenas pelos métodos

citoquimicos. Portanto, considerando que a maioria dos LCR de MBK, infectados ou

não pelo HIV e com proteinorraquia elevada ou não, continha anticorpos IgG e IgA que

reconhecem os antígenos MT-10.3 e MPT-64 , o imunodiagnóstico parece ser uma

alternativa potencial (Tabela V).

Fatores como diagnóstico tardio, introdução de terapia especifica tardiamente,

idades extremas, estádio avançado da doença, presença de hidrocefalia e hipertensão

intracraniana, durante o curso da doença, e associação com doenças sistêmicas

crônicas estão associados ao mau prognóstico. Basicamente existem dois métodos

propostos na literatura para avaliar o prognóstico: a proteinorraquia e o estádio clínico

da doença. Entretanto há divergências entre os investigadores. Nunes et al (1998), Tan

et al (1999) e Wang et al (2002) mostraram que não há relação entre os níveis elevados

de proteína no LCR e o mau prognóstico da doença, enquanto que em outros estudos

foi sugerido que níveis > 300mg/dl de proteína no LCR são um marcador de pior

prognóstico. (Boissonnas et al, 1983; Fundação Nacional de Saúde, 2002; Porkert et al,

1997; Misra et al, 1996).

No presente estudo, o Grupo I foi subdivididos em 3 subgrupos de acordo com a

concentração de proteínas. O SG I.3, que apresentou maior concentração proteica, foi

também o grupo com maior imunorreatividade média para os antígenos

micobacterianos (p<0,007), exceto para IgG MT-10.3 e IgM MPT-64 (p>0,11). Portanto

em nossos resultados, o aumento da imunorreatividade em amostras com

proteinorraquia alta sugere que a produção de anticorpos aumenta com a gravidade da

doença, ou decorrente da disfunção da BHL e migração de proteínas do sangue para o

LCR,visto que os SG I.1 e 2 apresentaram menor média de reatividade que o SG I.3,

mas sem diferença significativa entre esses grupos (p>0,5). Mas a freqüência de

respondedores em todos os SG I foi alta principalmente para IgG MT-10.3 (100%),

seguido de IgA e IgG MPT-64 (Tabela VII). Entretanto maiores estudos são necessários

para elucidar se o aumento médio de anticorpos é de produção intratecal ou

provenientes do aumento de transudação do soro para o LCR.

Um desafio importante do diagnóstico precoce da MBK está na diferenciação com

as meningites não-tuberculosas ou as meningites bacterianas parcialmente tratadas. A

falha no tratamento das meningites piogênicas pode produzir achados LCR

semelhantes à MBK, além de interferir no diagnóstico bacteriológico. Os métodos

convencionais de diagnostico da MBK são pouco sensíveis ou exigem um tempo de

conclusão prolongado, como ocorre na baciloscopia liquórica (exame direto) e a cultura

em meio de LJ, respectivamente. Portanto, são necessário estudos futuros para avaliar

o Liq-EIA no diagnóstico diferencial das meningites infecciosas não-tuberculosas.

7- CONCLUSÕES

- O Liq-EIA para MT-10.3, neste estudo, foi pela primeira vez utilizado na detecção

de Ac em LCR na meningite tuberculosa mostrando seu potencial imunodiagnóstico ao

detectar todos os LCR de MBK cultura positiva, e apresentando menos de 10% de

falso-positivos.

- Liq-EIA para IgG MT-10 mostrou alto percentual de respondedores nos LCR, de

pacientes com MBK, com diferentes concentrações de proteínas, sugerindo a presença

de Ac para este antígeno.

- Os pacientes com MBK, co-infectados ou não pelo HIV, não apresentaram

diferença significativa na imunorreatividade da IgG e IgA aos antígenos testados,

sugerindo que em nossas amostras, a co-infecção HIV/MBK não interfere na resposta

imune aos antígenos MPT-64 e MT-10.3.

- A resposta imune não sofreu interferência dos níveis de proteína e do status do

HIV, portanto o Liq-EIA seria potencialmente útil para auxiliar no diagnóstico.

- Os pacientes com maior concentração protéica apresentaram maior

imunorreatividade média para os antígenos micobacterianos, sugerindo que o aumento

da imunorreatividade em amostras com proteinorraquia alta pode ser conseqüência do

aumento da concentração de anticorpos associado à gravidade da MBK.

Os resultados encontrados em nosso estudo são encorajadores quanto ao potencial

imunodiagnóstico dos antígenos estudados, entretanto pesquisas continuadas são

necessárias para elucidar questões tais como:

- Se a presença de Ac no LCR reflete uma produção intratecal ou é devido a

transudação do soro para o LCR.

- Estudar a correlação entre a proteinorraquia e a resposta imune em uma

população maior de pacientes em todos os subgrupos

- Estudar a imunorreatividade dos Ags no diagnóstico diferencial com outras

meningites infecciosas

Futuros estudos envolvendo maior número de amostras com os antígenos

estudados, favoreceria a validação de um teste para o diagnóstico da MBK.

8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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