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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
FATORES DE VIRULÊNCIA EM LINHAGENS DE Escherichia
coli ISOLADAS DE INFECÇÃO DE TRATO URINÁRIO,
PIOMETRA E FEZES DE CÃES
AMANDA KELLER SIQUEIRA
Dissertação apresentada junto
ao Programa de Pós Graduação
em Medicina Veterinária para
obtenção do título de Mestre
Orientador: Prof. Ass. Dr. Márcio Garcia Ribeiro
BOTUCATU – SP
Dezembro, 2006
Siqueira, A.K., 2006.
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Siqueira, Amanda Keller.
Fatores de virulência em linhagens de Escherichia coli isoladas de infecção
do trato urinário, piometra e fezes de cães / Amanda Keller Siqueira. – 2006.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2006.
Orientador: Márcio Garcia Ribeiro
Assunto CAPES: 50502034
1. Cão - Doenças infecciosas. 2. Aparelho gênito-urinário.
3. Escherichia coli – Virulência.
CDD 636.708966
Palavras-chave: Cães: E.coli; Fatores de virulência; Infecção do trato
urinário; Piometra.
Siqueira, A.K., 2006.
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais (Armando e
Vanilda) e ao meu irmão (Armando Júnior) pelo apoio e
conforto familiar, amor incondicional, compreensão e pelo
gosto ao estudo e vontade de desenvolvimento pessoal. Sem
a base que vocês me deram não chegaria aonde cheguei e
não teria a vontade que tenho em prosseguir.
Biba, você é a alegria desta família e colaboradora
deste projeto.
Siqueira, A.K., 2006.
Dedico esta pesquisa ao meu orientador, Prof. Ass.
Dr. Márcio Garcia Ribeiro, pelo exemplo de profissional,
incentivo ao trabalho em grupo e confiança no meu potencial.
Siqueira, A.K., 2006.
Dedico este trabalho ao meu “orientador de UNESP”,
Prof. Ass. Dr. Antonio Carlos Paes, pelo apoio desde que
cheguei a MI, confiança, estágios, amizade e
desenvolvimento cultural.
Siqueira, A.K., 2006.
AGRADECIMENTOS
“Nenhum homem dispõe de faculdades completas e é pela união social que
eles se completam uns aos outros, para assegurarem o seu próprio bem-estar e
progredirem. Eis porque, tendo necessidade uns dos outros,
são feitos para viver em sociedade e não isolados”
Allan Kardec
A família Keller e agregados, que me acompanham desde a
graduação em São Paulo, dando casa, comida, amor e muito incentivo.
Esta etapa da minha vida que termina com a finalização desta pesquisa
tem muito de vocês. Obrigada!
Família Siqueira, família séria e trabalhadora, obrigada pelo apoio e
compreensão pelas ausências, ataques de mau humor, cansaço....
Palavras de afeto não são rotineiramente ditas, mas amo vocês e sinto
que sou amada. Obrigada!
Siqueira, A.K., 2006.
Tia Maza, Isa, Ro, Sil e todos os animais deste lar, vocês me
acolheram, me fizeram sentir em casa, me respeitaram e serviram de
“psicólogos”. O que seria de mim em Campinas sem vocês? Minha
eterna gratidão, meu sincero carinho. Saudade de vocês!
Agradeço ao meu orientador Prof. Márcio Garcia Ribeiro pelo
auxílio na redação e correção deste texto, pelas publicações e trabalhos
que o grupo de pesquisa desenvolveu neste tempo que trabalhamos em
conjunto.
Agradeço ao Prof. Antonio Carlos Paes pela incomparável bagagem
cultural e apoio a esta pesquisa e a minha permanência no
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da FMVZ-Unesp.
Prof. Hélio Langoni, Prof. Paulo Francisco Domingues, Prof. Rafael
Modolo e Profa. Jane Megid, obrigada pelos ensinamentos, por me
aceitarem neste departamento e por apoiarem esta pesquisa.
Fernando José Paganini Listoni, Fê, muito obrigada por todo meu
desenvolvimento teórico-prático em microbiologia, pela amizade e
Siqueira, A.K., 2006.
convivência neste cinco anos de MI. Agradeço o trabalho em conjunto
e todo apoio que você deu para o desenvolvimento desta pesquisa. Posso
dizer que você foi o verdadeiro mestre e responsável por meu
descobrimento de aptidão e gosto pela microbiologia.
Acácia Elias, Ana Paula Contente, Ana Paula (Prof. Paes),
André Peres Barbosa, Audrey Rennó, Cátia Voss, Fábio Shimabukuro
(Shima), Jana, Juliana Machado, Juliano, Karina Rasquel, Liliane
Dantas, Marcela Zampoli Troncarelli, Nair, Roberto Bolsanello, Rodrigo
Costa da Silva, Simone Mangia, Taís Fukuta, Vanessa Salgado, Veruska
e Walkiria e todos os pós-graduandos do departamento, obrigada por
colaborarem com este sonho, com amizade, auxílio e ombro.
Camile, Gustavo, Marta, Vitória e todos os residentes e ex-
residentes que colaboraram com a coleta de material, auxílio na
necrópsia e envio de trabalho aos congressos e cursos, muito obrigada.
Tânia e Adriana, equipe do Planejamento, obrigada pelas
conversas, almoços, cafés e pela companhia.
Siqueira, A.K., 2006.
Equipe de apoio do departamento, Dna. Rita, Dna. Mércia, Dna.
Dora e ex-funcionários (Dna. Geni, Dna. Maria), agradeço a amizade e
a dedicação ao departamento que elegi como segunda casa.
Tio Humberto, saudade! O senhor e sua tranqüilidade fazem falta.
Jú, Danilo, Rodrigo e toda família Carreira, obrigada pela amizade
e momentos de diversão.
Wander e Sérgio obrigada pelo apoio, amizade e ajuda no
desenvolvimento deste trabalho. Nossa agradável e divertida convivência
colaborou muito para minha permanência aqui.
Prof. Domingos da Silva Leite, a boa recepção, convivência
harmoniosa, divertida e amistosa transformaram o “pavor” de biologia
molecular em ótimos dias. Obrigada pelos ensinamentos valiosos,
disponibilidade de tempo e por todo material cedido por seu grupo de
pesquisa. Tenho saudade!
Cláudia Moura, Monique Tiba (Mo), Mirtes, Erivaldo (Eri),
Maria Cláudia, Ademir, Michelle (Mi) e todas as estagiárias da época,
Siqueira, A.K., 2006.
muito obrigada por toda ajuda, pelas aulas de PCR, grande paciência,
disponibilidade e pela maneira como vocês me receberam. Me senti
muito bem o tempo que permaneci entre vocês. Saudades de todos!
Prof. José Piantino e Profa. Claudete, pós-graduandos e
estagiários do Laboratório de Ornitopatologia da FMVZ-USP, obrigada
pelos ensinamentos na pesquisa de sideróforos e pela cessão de
materiais e de cepas bacterianas.
Profa. Maria Denise Lopes, Prof. Nereu Carlos Prestes, pós-
graduandos e residentes do Departamento de Reprodução e Radiologia
da FMVZ-Unesp agradeço a coleta e envio de material de piometra,
fornecimento de material didático e disponibilidade de tempo e auxílo
para esta pesquisa.
Profa. Regina Takahira, pós-graduandos e residentes do
Laboratório Clínico, obrigada pela colaboração no envio de material,
fornecimento de referências, explicações e disponibilidade de tempo
para esta pesquisa.
Siqueira, A.K., 2006.
Professores da Clínica Médica de Pequenos Animais, pós-
graduandos e residentes, agradeço a colaboração guardando e enviando
material.
Prof. Quin, Dna. Sônia, galera da oftalmo e agregados, como eu e
Ana Carolina Mortari, obrigada pelos momentos de desestresse.
Daniela Cremonini e João Leandro Chiurciu, vocês moram no meu
coração.
Pessoal do predinho, a boa convivência foi fundamental para a
conclusão desta pesquisa. Denis e Fábio, a amizade dos dois me
“socorreu” em muitos momentos.
Audrey, que bom que você veio. Nossa alegre convivência foi
fundamental.
Tatiana Salerno, “minha filha”, amiga, companheira, nossa amizade
é muito importante para mim.
Siqueira, A.K., 2006.
República dos Belos (Jú, Liguito, Béia e Kity), todos os
agregados e população flutuante (Roger Giuffrida), vocês foram o início
de tudo em Botucatu.
Funcionários da pós-graduação, do arquivo, da biblioteca, obrigada
pela inestimável ajuda.
Centro Veterinário de Bauru, sem sombra de dúvida vocês todos
foram importantes para esta pesquisa. Denise Peruca de Melo Moretti,
agradeço sua compreensão, caronas, amizade e trabalho.
Aristeu obrigada por sua disponibilidade, agilidade e explicações
para os “mistérios” da estatística.
Para todos os animais que participaram ativamente desta pesquisa,
minha admiração e agradecimento.
À Capes pelo apoio financeiro a esta pesquisa.
A todos aqueles que me auxiliaram e que por um lapso de memória
eu não citei, muito obrigada!
Siqueira, A.K., 2006.
RESUMO
SIQUEIRA, A. K. Fatores de virulência de Escherichia coli isoladas de
infecção do trato urinário, piometra e fezes de cães. 2006, 136p, dissertação
(Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu,
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Botucatu, SP.
Escherichia coli é considerado o principal agente causal de infecção de trato
urinário (ITU) e piometra em cães. A patogenicidade das linhagens está relacionada a
presença de adesinas e diferentes fatores de virulência. Foram avaliadas alterações
hematológicas e diferentes fatores de virulência em 51 linhagens de E. coli isoladas de
ITU, 52 de piometra e 55 de fezes de cães sem sinais entéricos. A produção de α-
hemolisina foi verificada em 26 (51,0%) das estirpes de ITU e em 20 (38,5%) de
piometra. Exames hematológicos revelaram principalmente anemia, trombocitopenia e
leucocitose por neutrofilia e monocitose nos cães com ITU e piometra. Os maiores
índices de sensibilidade nas 158 estirpes foram observados para norfloxacina,
ciprofloxacina e enrofloxacina em mais de 60% dos isolados. Os maiores índices de
resistência foram encontrados em 60% ou mais das estirpes com o uso de
sulfametoxazole/trimetoprim. Linhagens resistentes a três ou mais antimicrobianos
foram constatadas em 24 (47,1%) de ITU, 7 (13,5%) de piometra e 4 (7,3%) das fezes,
das quais respectivamente, 17 (33,3%), 1 (1,9%) e 3 (5,5%), com resistência múltipla a
cinco ou mais drogas. fimH foi observado em mais de 90% dos isolados. papC foi
detectado em 12 (23,5%) linhagens de ITU, 19 (36,5%) de piometra e 10 (18,2%) das
fezes. papGI não foi detectado, enquanto papGII foi observado em 3 (5,8%) isolados
de piometra. papGIII foi expressado em 10 (19,6%) linhagens de ITU, 15 (28,8%) de
piometra e 9 (16,4%) das fezes. sfaS foi encontrado em 22 (43,1%) de ITU, 24 (46,1%)
de piometra e 19 (34,5%) das fezes. afa foi detectado em 1 (1,9%) linhagem de ITU e
de piometra. A citolosina hlyA foi expressada em 17 (33,3%) linhagens de ITU, 18
(34,6%) de piometra e 7 (12,7%) das fezes, enquanto cnf-1 foi detectado em 11
(21,6%) de ITU, 21 (40,4%) de piometra e 9 (16,4%) das fezes. Dentre outros fatores
relacionados à virulência, foram observados presença de aerobactina (iucD) em 12
Siqueira, A.K., 2006.
(23,5%) isolados de ITU, 9 (17,3%) de piometra e 1 (1,8%) das fezes, enquanto a
proteína específica uropatogênica (usp) foi detectada em 17 (33,3%) linhagens de ITU
e 36 (69,9%) de piometra. Não foram detectados nas 158 linhagens genes
codificadores de intimina (eae) e verotoxinas (vt1 e vt2) encontrados no sorotipo
O157:H7. A principal associação expressada pelas 158 linhagens foi papC, papGIII,
sfaS, hlyA e cnf-1. Depreendeu-se do estudo intensa resposta inflamatória no exame
hematológico dos cães com piometra e ITU, similaridade das adesinas entre as
linhagens isoladas nos três grupos estudados, alta ocorrência de expressão
simultânea de hlyA, cnf-1 e fímbria P, e a elevada multi-resistência das linhagens aos
antimicrobianos nos cães com ITU e piometra. Ressalta-se para os reflexos em saúde
pública representado pela detecção de linhagens de E. coli patogênicas em cães com
ITU e piometra, em face do estreito contato do homem com os cães.
Palavras-chave: Cães; E. coli; Fatores de virulência; Infecção do trato urinário;
Piometra.
Siqueira, A.K., 2006.
ABSTRACT
SIQUEIRA, A. K. Virulence factors in Escherichia coli strains from
urinary tract infection, pyometra and feces from dogs. 2006, 136p, dissertação
(Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu,
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Botucatu, SP.
Escherichia coli is considered the more important microrganism in urinary
tract infection (UTI) and pyometra in dogs. The pathogenicity of strains is associated
with different adhesins and virulence factors. Haematological exams and different
virulence factors was evaluated in 51 E. coli strains isolated from UTI, 52 from
pyometra and 55 from feces of dogs without enteric signs. Alpha-haemolysin was
verified in 26 (51.0%) strains from UTI and 20 (38.5%) from pyometra. Haematological
exams revealed mainly anaemia, thrombocytopenia and leucocytosis by neutrophilia
and monocitosis in dogs with UTI and pyometra. Norfloxacin, ciprofloxacin and
enrofloxacin were the most-effective drugs (>60%) for 158 E. coli strains. High rates of
E. coli resistance to antimicrobials were observed in 60% or more of strains using
sulfametoxazole/trimetoprim. Multiple drug resistance for three or more antimicrobials
was observed in 2 (47.1%) strains isolated from UTI, 7 (13.5%) from pyometra and 4
(7.3%) from feces. From these, 17 (33.3%), 1 (1.9%) and 3 (5.5%), respectively,
showed multiple resistance to five or more drugs. fimH was observed in 90% or more
of 158 isolates. papC was detected in 12 (23.5%) strains isolated from UTI, 19 (36.5%)
from pyometra and 10 (18.2%) from feces. None strain expressed papGI, while papGII
was observed in 3 (5.8%) strains of pyometra. papGIII was detected in 10(19.6%)
strains of UTI, 15 (28.8%) from pyometra and 9 (16.4%) from feces. sfaS was observed
in 22 (43.1%) strains of UTI, 24 (46.1%) of pyometra and 19 (34.5%) of feces. afa was
identified in 1 (1.9%) strains isolated from UTI and pyometra. hlyA citolisin was
expressed in 17 (33.3%) strains from UTI, 18 (34.6%) from pyometra and 7 (12.7%)
from feces, while cnf-1 was detected in 11 (21.6%) strains from UTI, 21 (40.4%) from
pyometra and 9 (16.4%) from feces. Among other factors related to E. coli virulence,
aerobactin (iucD) was observed in 12 (23.5%) strains from UTI, 9 (17.3%) from
Siqueira, A.K., 2006.
pyometra and 1 (1.8%) from feces, while uropathogenic specific protein (usp) was
detected in 17 (33.3%) strains of UTI and 36 (69.9%) of pyometra. None strains
expressed gene encoding for intimin (eae) and verotoxin (vt1 and vt2) associated to E.
coli O157:H7 serotype. The most common combination of virulence genes appears
with high frequency in 158 strains isolated from UTI, pyometra and feces were
observed to papC, papGIII, sfaS, hlyA and cnf-1. In summary, high inflammatory
response in haematological exams, similarity between adesins from three groups
studied and high ocurrence of hlyA, cnf-1 and p fimbriae, and elevated drug resistance
expression of strains were observed in dogs with urinary tract infection and pyometra.
The results alert for public health reflexes of study represented by pathogenic E. coli
identification in strains, due to close contact of human and dogs.
Keywords: Dogs; E. coli; Virulence factors; Urinary tract infection; Pyometra.
Siqueira, A.K., 2006.
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Perfil de sensibilidade microbiana em 158 estirpes de Escherichia coli
isoladas de ITU, piometra e das fezes de cães, segundo a porcentagem e os
diferentes grupos de estudo. Botucatu, 2006. ..............................................77
Siqueira, A.K., 2006.
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Iniciadores utilizados para detecção de diferentes fatores de virulência em linhagens de E. coli
isoladas de infecção do trato urinário, piometra e fezes de cães, utilizando a reação em cadeia
pela polimerase. Botucatu, 2006............................................................................69
Quadro 2. Prevalência de multi-resistência in vitro a diferentes antimicrobianos em
estirpes de Escherichia coli, isoladas de casos de ITU, piometra e fezes de
cães. Botucatu, 2006. ...................................................................................78
Quadro 3. Freqüência de detecção de genes de diferentes adesinas, toxinas e outros
fatores de virulência em estirpes de Escherichia coli isoladas de ITU,
piometra e fezes de cães (controle). Botucatu, 2006. ..................................80
Siqueira, A.K., 2006.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Reagentes para as reações de PCR na detecção de fatores de virulência de
E. coli isoladas de cão. Botucatu, 2006. ......................................................70
Tabela 2. Achados hematológicos em cães com ITU e piometra por Escherichia coli.
Botucatu, 2006. ............................................................................................74
Tabela 3. Freqüência de estirpes de Escherichia coli com presença de hemólise no
ágar sangue bovino (5%), isoladas de casos de ITU, piometra e das fezes
de cães sem diarréia. Botucatu, 2006. .........................................................75
Tabela 4. Sensibilidade microbiana em estirpes de Escherichia coli isoladas de ITU,
piometra e das fezes de cães. Botucatu, 2006. ...........................................76
Tabela 5. Associações entre diferentes genes de fatores de virulência investigados em
linhagens de E. coli isoladas de ITU em cães. Botucatu, 2006. ..................81
Tabela 6. Associações entre diferentes genes de fatores de virulência investigados em linhagens
de E. coli isoladas de piometra em cães. Botucatu, 2006. ..................81
Tabela 7. Associações entre diferentes genes de fatores de virulência investigados em
linhagens de E. coli isoladas fezes de cães sem sintomas entéricos.
Botucatu, 2006. ......................................................................................82
Siqueira, A.K., 2006.
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
% - porcentagem
® - marca registrada
μg – micrograma
ηg – nanograma
μl - microlitro
μm – micrômetro
ηm – nanômetro
< - menor que
> - maior que
°C – graus Celsius
A - nucleotídeo adenina
A/E – “attaching e effacing”
afa – gene codificador de adesina afimbrial
ALT – alanina aminotransferase
APEC – Escherichia coli patogênica para aves
ATP – adenosina trifosfato
BHI – caldo cérebro-coração
bpm – batimentos por minuto
C – nucleotídeo citosina
CEH – hiperplasia cística endometrial
céls – células
cnf – fator necrosante citotóxico
Siqueira, A.K., 2006.
DAEC – Escherichia coli de aderência difusa
DEC – Escherichia coli diarreiogênica
DNA – ácido desoxirribonucléico
E. coli - Escherichia coli
eae – Escherichia coli “attachment and effacing” / intimina
EAEC – Escherichia coli enteroagregativa
EHEC – Escherichia coli enterohemorrágica
EIEC – Escherichia coli enteroinvasora
EPEC – Escherichia coli enteropatogênica
ETEC – Escherichia coli enterotoxigênica
EUA – Estados Unidos da América
ExPEC – Escherichia coli extra-intestinal
FA – fosfatase alcalina
Fe – ferro
fimH – gene codificador de fímbria H / pili tipo 1
FV – fator de virulência
g – gravidade terrestre (9,81m/s2)
G – nucleotídeo guanina
g/dl – gramas por decilitro
GI, GII, GIII – variantes de papG
H – antígeno flagelar
HeLa – células de linhagem contínua de carcinoma epitelial de cérvix humana
Hep-2 – células de linhagem contínua de carcinoma de laringe humana
Siqueira, A.K., 2006.
hly – gene codificador de hemolisina
IE – infecção extra-intestinal
ITU – infecção de trato urinário
iuc – gene codificador de aerobactina
K – antígeno capsular
Kda – quilo dálton
LPS – lipopolissacarídeo
LT – termolábil
mg/kg – miligramas por quilo
MgCl2 – cloreto de magnésio
MIC – concentração inibitória mínima
mM – mili Molar
MNEC – Escherichia coli associada com meningite neonatal
NaCl – cloreto de sódio
NCCLS – “National Commitee for Laboratory Standards”
O – antígeno somático
OSH – ovariosalpingohisterectomia
PAI – ilha de patogenicidade
papC – subunidade C de fímbria P
papG – subunidade G de fímbria P
pb – pares de base
PCR – reação em cadeia pela polimerase
PGF2α - prostaglandina F2α
Siqueira, A.K., 2006.
pH – pressão de hidrogênio
qsp – quantidade suficiente para
RNA – ácido ribonucléico
rpm – rotações por minuto
sfa – gene codificador de fímbria S
SIRS – síndrome da resposta inflamatória sistêmica
ST – termoestável
STEC – Escherichia coli produtora de toxina de Shiga
Stx – toxina de Shiga
SUH – síndrome urêmica hemolítica
T – nucleotídeo timina
TA – temperatura de anelamento
Taq polimerase – polimerase Thermus aquaticus
THP – proteína de Tamm-Horsfal
TSA – ágar tríplice de soja
UPEC – Escherichia coli uropatogênca
usp – proteína específica uropatogênica
Vero – células de linhagem contínua de rim de macaco verde africano
vt – verotoxina / verocitotoxina
* Em virtude do uso consagrado na literatura técnica, algumas abreviaturas seguem
sua grafia no inglês.
Siqueira, A.K., 2006.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 27
2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 29
2.1 INFECÇÃO DO TRATO URINÁRIO NO HOMEM E ANIMAIS DE COMPANHIA
POR E. coli .................................................................................................................. 29
2.2 PIOMETRA EM CÃES POR E. coli........................................................................ 36
2.3 Escherichia coli ..................................................................................................... 40
2.4 E. coli DIARREIOGÊNICAS (DEC) ....................................................................... 41
2.4.1 E. coli ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) ............................................................. 42
2.4.2 E. coli ENTEROHEMORRÁGICA (EHEC) ......................................................... 43
2.4.3 E. coli ENTEROTOXIGÊNICA (ETEC) ............................................................... 44
2.4.4 E. coli ENTEROAGREGATIVA (EAEC) ............................................................. 45
2.4.5 E. coli ENTEROINVASORA (EIEC).................................................................... 46
2.4.6 E. coli que ADERE DIFUSAMENTE (DAEC) ..................................................... 47
2.5 Escherichia coli EXTRA-INTESTINAL
(ExPEC – “ extraintestinal pathogenic E. coli”) ............................................................ 47
2.5.1 Escherichia coli UROPATOGÊNICA (UPEC – “uropathogenic E. coli”)...............48
2.6 FATORES DE VIRULÊNCIA (FV) ......................................................................... 49
2.6.1.1 Fímbria tipo1 .................................................................................................... 51
2.6.1.2 Fímbria P (papC/papG) ................................................................................... 53
Siqueira, A.K., 2006.
2.6.1.3 Fímbria S(sfa) .................................................................................................. 54
2.6.1.4 Família de adesinas Dr .................................................................................... 54
2.6.2 INTIMINA (eae) .................................................................................................. 55
2.6.3 TOXINAS OU CITOLISINAS ............................................................................. 56
2.6.3.1 Hemolisina (hly) ............................................................................................... 56
2.6.3.2 Fator Necrosante Citotóxico 1 (CNF-1) ........................................................... 57
2.6.3.3 Verotoxinas (vt1 e vt2) ..................................................................................... 58
2.6.4 AEROBACTINA (aer) ......................................................................................... 60
2.6.5 PROTEÍNA ESPECÍFICA UROPATOGÊNICA (usp) ......................................... 61
3 OBJETIVOS ............................................................................................................. 64
3.1 Geral ...................................................................................................................... 64
3.2 Específicos ............................................................................................................ 64
4 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................ 65
4.1 Delineamento experimental ................................................................................... 65
4.2 Colheita de material ............................................................................................... 65
4.2.1 Piometra ............................................................................................................. 65
4.2.2 Infecção do trato urinário .................................................................................... 65
4.2.3 Fezes .................................................................................................................. 65
4.3 Identificação e manutenção das estirpes de E. coli ............................................. 65
4.4 Exames hematológicos ................................................ ........................................ 66
4.5 Teste de sensibilidade microbiana (antibiograma) e multi-resistência das linhagens ............................... 66
Siqueira, A.K., 2006.
4.6 Detecção de hemolisinas no meio de ágar sangue .............................................. 67
4.7 Reação em Cadeia pela Polimerase ..................................................................... 67
4.7.1 Controles positivos.............................................................................................. 68
4.7.2 Obtenção de DNA para PCR .............................................................................. 68
4.7.3 Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) ....................................................... 68
4.7.4 Eletroforese em gel de agarose ......................................................................... 71
4.8 Análise estatística .................................................................................................. 71
4.8.1 Cálculo amostral ................................................................................................. 71
4.8.2 Testes estatísticos .............................................................................................. 71
5 RESULTADOS ......................................................................................................... 73
6 DISCUSSÃO............................................................................................................. 84
7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 102
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFRICAS ....................................................................... 104
Siqueira, A.K., 2006.
1 INTRODUÇÃO
As enterobactérias são reconhecidas como um dos grupos bacterianos
mais estudados em todo mundo. A família Enterobacteriaceae compreende vários
patógenos incluindo Escherichia coli (E. coli), microrganismo complexo e
extremamente versátil quanto a diversidade de infecções no homem e em animais
(Trabulsi, 2005; Veronesi, 2005).
No que diz respeito as interações entre animais, seres humanos e
Escherichia coli, podemos dividir esta espécie bacteriana em dois grupos. O primeiro
grupo é formado por comensais que habitam o intestino grosso de homeotérmicos de
seu nascimento até a morte. O segundo, formado por E. coli patogênicas, pode
causar diversos tipos de infecções e é constituído por muitos patótipos. Os
microrganismos comensais podem causar infecções em indivíduos
imunocomprometidos ou de maneira iatrogênica (Trabulsi, 2005; Veronesi, 2005).
As estirpes patogênicas são importantes causas de infecções hospitalares,
especialmente de distúrbios entéricos. Ao observarmos as relações entre os animais e
o homem, os animais tornam-se importantes reservatórios (Trabulsi, 2005; Veronesi,
2005) e, quando infectados, geram graves perdas econômicas, principalmente quando
se trata de animais de produção.
Há vasta diversidade patogênica de E. coli. A espécie bacteriana
compreende pelo menos seis patótipos associados às infecções intestinais (DEC –
“Diarrheagenic Escherichia coli”) e vários outros associados com infecções extra–
intestinais (ExPEC – “Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli”) (Acha & Szyfres,
2001; Kaper et al., 2004; Trabulsi, 2005; Veronesi, 2005; Greene, 2006).
As manifestações clínicas das colibaciloses estão intimamente associadas
com os diferentes fatores de virulência observados nos patótipos. Estes atributos
específicos de virulência conferem enorme habilidade de adaptação para a bactéria a
novos sítios de infecção (Kaper et al., 2004; Greene, 2006).
Siqueira, A.K., 2006.
As infecções do trato urinário (ITUs) em homens e animais são as
infecções extra – intestinais mais comuns causadas por E. coli. As estirpes são
convencionalmente denominadas uropatogênicas (UPEC – “Uropathogenic
Escherichia coli”) (Kaper et al, 2004; Greene, 2006). Além disto, E. coli também é o
microrganismo mais freqüentemente isolado na piometra em cães (Nelson & Feldman,
1986; Nelson & Couto, 2003; Greene, 2006).
Considerando a alta ocorrência de E. coli na casuística de infecções do
trato urinário e piometra em cães, a severidade dos sintomas clínicos, a diversidade
de fatores de virulência nas estirpes associadas às infecções entéricas e extra-
intestinais e a possibilidade de transmissão de estirpes patogênicas entre os animais
e o homem - notadamente os animais de companhia em virtude do estreito contato
com o homem -, o presente estudo procurou avaliar a ocorrência de diferentes
adesinas e fatores de virulência de E. coli isoladas de ITU, piometra e fezes de cães.
Siqueira, A.K., 2006.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 INFECÇÃO DO TRATO URINÁRIO NO HOMEM E ANIMAIS DE
COMPANHIA POR E. coli
Define-se como infecção do trato urinário a colonização microbiana de
qualquer órgão do sistema urinário. Esta infecção pode ocorrer em apenas um órgão
ou em vários do sistema urinário (Cetin et al., 2003; Greene, 2006).
No homem, as infecções de trato urinário nos EUA representam
anualmente, cerca de um bilhão de dólares do gastos com saúde pública e mais de
seis milhões com consultas médicas (Veronesi, 2005). Estima-se que 50% das
mulheres norte-americanas irão apresentar no mínimo uma infecção urinária em sua
vida adulta (Stamm & Hooton, 1993; Heilberg et al., 1997; Schor & Srougi, 1998;
Anderson, 2003; Veronesi, 2005).
Os primeiros registros de reconhecimento das infecções do trato urinário
datam do século IX. Somente em 1881, foi associada a presença de bactérias na
urina de paciente com sintomas de infecção do trato urinário. No final do século,
Escherich isolou “Bacillus coli” da urina de criança com ITU que, posteriormente, foi
denominado Escherichia coli (Heilberg et al., 1997).
O estreitamento do contato do homem com animais domésticos gera
reflexões sobre os riscos de transmissão cruzada de microrganismos patogênicos
entre espécies, notadamente pelo consumo de alimentos, fômites ou mesmo pelo
contato direto.
E. coli é considerado o principal microrganismo na casuística de infecções
do trato urinário no homem e animais. As infecções de trato urinário são traduzidas
por processos infecciosos de sintomatologia clínica variada envolvendo rins, pelve
renal, ureteres, bexiga e/ou uretra, além de estruturas adjacentes como próstata e
epidídimo. Alternativamente, grande parcela das infecções do trato urinário podem ser
Siqueira, A.K., 2006.
assintomáticas o que dificulta o diagnóstico (Stamm & Hooton, 1993; Heilberg et al.,
1997; Schor & Srougi, 1998; Veronesi, 2005).
Cerca de 70% das infecções são causadas por um único gênero
bacteriano. Em pacientes com anomalias anatômicas ou funcionais a associação de
agentes torna-se mais comum (Greene, 2006).
As bactérias Gram-negativas mais comumente encontradas são E. coli,
Proteus sp, Klebsiella sp, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter sp. E. coli é
responsável por 37 a 65% das ITUs. Determinadas linhagens de E. coli extra-
intestinais isoladas de ITUs caninas são indistingüíveis daquelas isoladas de humanos
(Bonagura, 2000; Cetin et al., 2003; Nelson & Couto, 2003; Greene, 2006).
Microrganismos Gram-positivos correspondem entre 25 a 30% da casuística de
infecções do trato urinário (Greene, 2006). Ocasionalmente, outros tipos de
microrganismos, como fungos, podem ser isolados de ITU (Barsanti & Finco, 2006).
Assim, as enterobactérias constituem-se no principal grupo de patógenos
relacionados às ITU nos animais e no homem.
As relações entre homens e animais têm se tornando cada vez mais
estreitas, fazendo com que os animais de estimação sejam considerados potenciais
fontes de infecção para as doenças infecciosas.
Nos animais, as infecções bacterianas no trato urogenital estão certamente
entre os principais problemas no cotidiano da clínica médica veterinária. Infecções nos
tratos urinário e genital podem ocorrer de maneira concomitante ou separadamente.
Assim como nos seres humanos, podem se apresentar desde infecções
extremamente severas até assintomáticas (Barsanti & Finco, 2006).
Nos cães, estudos assinalam que 14% desenvolvem esta afecção pelo
menos uma vez na vida (Cetin et al., 2003). Estima-se que mais de 10% de todos os
cães levados aos médicos veterinários apresentam alguma forma de ITU (Bonagura,
2000; Cetin et al., 2003). Assume-se que a ocorrência de ITUs é mais freqüente em
fêmeas e animais mais velhos do que em machos e jovens (Cetin et al., 2003).
Siqueira, A.K., 2006.
A maioria das ITUs em cães são causadas pela ascensão das bactérias
pela uretra, provenientes da microbiota cutânea, peri-anal e intestinal dos animais ou
mesmo da bexiga. A partir da infecção estabelecida na bexiga urinária, os
microrganismos podem colonizar uretéres e rins (Bonagura, 2000; Nelson & Couto,
2003; Greene, 2006).
O desenvolvimento de infecções do trato urinário invariavelmente se traduz
por desequilíbrio entre bactérias da microbiota e hospedeiro (Greene, 2006). Os
mecanismos de defesa do hospedeiro, a dose infectante e os fatores de virulência
bacterianos são fundamentais para o estabelecimento da infecção (Forrester, 2000;
Nelson & Couto, 2003; Greene, 2006).
A presença de microbiota residente, idade e sexo do hospedeiro, as
características da urina e a anatomia normal do trato urinário, além da resposta
inflamatória local são reconhecidos como mecanismos de defesa contra as infecções
(Jarvinem, 1980; Nelson & Couto, 2003; Greene, 2006). A proximidade da genitália
das fêmeas com a região anal favorece a infecção do trato urinário das fêmeas por
enterobactérias (Greene, 2006).
Além dos fatores predisponentes e imunes intrínsecos do animal
susceptível, a presença de fatores de virulência é fundamental para que os
microrganismos possam se estabelecer no sistema urinário, especialmente
enterobactérias como E. coli (Greene, 2006).
A aderência da bactéria ao epitélio do trato urinário previne que o próprio
fluxo de urina carreie estes microrganismos para o exterior. Esta colonização ocorre
mediante fímbrias - apêndices filamentosos constituídos por proteínas -, presentes na
maioria das bactérias Gram-negativas (Nelson & Couto, 2003).
Outros fatores que contribuem para a virulência do microrganismo são
antígenos capsulares (K) que interferem com a fagocitose e opsonização bacteriana,
e os antígenos somáticos (O) que diminuem a contratilidade da musculatura lisa.
Determinadas linhagens bacterianas produzem também hemolisinas que aumentam a
Siqueira, A.K., 2006.
capacidade de penetração e o grau de lesão nos tecidos do hospedeiro (Nelson &
Couto, 2003). Algumas estirpes apresentam resistência aos antimicrobianos pela
produção de enzimas, mutações e seleção genética ou possuem em seu DNA um
fator de resistência denominado Fator R (George, 1996; Nelson & Couto, 2003).
E. coli uropatogênias (UPEC) possuem em seu material genético diversos
grupos de genes denominados ilhas de patogenicidade (PAIs). Estas PAIs codificam
diversos fatores de virulência (FV) relacionados à patogenicidade do agente nas
infecções entéricas e extra-intestinais (Greene, 2006)
Causas iatrogênicas de ITU também são referidas em cães e a mais
importante decorre da cateterização das vias urinárias. As bactérias são levadas
diretamente para a vesícula urinária durante o procedimento. Como conseqüências, o
animal pode apresentar pielonefrite e bacteremia, nos machos podem ocorrer
prostatite e epididimite bacterianas secundárias à cateterização (Nelson & Couto,
2003; Greene, 2006).
As ITUs em animais de companhia muitas vezes são assintomáticas
(subclínicas) e devido a ausência de sinais clínicos tais infecções são difíceis de
serem diagnosticadas. Estes animais podem sofrer severa injúria no aparelho genito-
urinário em virtude de agressões de caráter crônico. Estas infecções subclínicas
ratificam a importância de exames urinários minuciosos na rotina clínica veterinária,
mesmo em animais aparentemente saudáveis (Greene, 2006).
A pielonefrite bacteriana em cães geralmente ocorre associada a outros
problemas no trato urinário (Greene, 2006). Nesta espécie caracteriza-se clinicamente
por febre, depressão, anorexia e falência renal. Entre os sinais gastrintestinais,
destacam-se os episódios de vômito (Nelson & Couto, 2003; Greene, 2006).
A pielonefrite crônica pode ser assintomática ou manifestar-se clinicamente
por poliúria e polidipsia (Nelson & Couto, 2003; Greene, 2006). A proximidade entre a
uretra e a bexiga, resulta, geralmente, na inflamação concomitante dos dois órgãos
(Greene, 2006).
Siqueira, A.K., 2006.
Como sinais clínicos observamos disúria e polaquiúria e a urina apresenta-
se hemorrágica, turva e fétida. Grande quantidade de sangue no final da micção
sugere ao clínico hemorragia da bexiga. Já a hematúria, no meio da micção, sugere
ao veterinário doença uretral ou prostática. Ao exame clínico o veterinário pode
constatar dor à palpação abdominal e espessamento da parede da vesícula urinária
(Greene, 2006).
Em virtude da presença da microbiota da vagina, prepúcio e uretra distal, o
método de colheita é fundamental para o diagnóstico correto. Usualmente pode ser
obtido pela cistocentese, sondagem ou micção espontânea (Greene, 2006).
A cistocentese é o método considerado de escolha por evitar contaminação
da urina com a microbiota do trato urinário inferior (Nelson & Couto, 2003). Qualquer
presença bacteriana indica infecção, porém pode haver contaminação por bactérias
da pele. Assim, a cultura deve ser inicialmente quantitativa e, depois, qualitativa,
visando a identificação do microrganismo (Greene, 2006).
A vesícula urinária não palpável ou falha na cistocentese permite ao clínico,
principalmente nos machos, utilizar sondas para a colheita de urina. Antes da
passagem da sonda na uretra do animal, deve ser realizada limpeza e anti-sepsia do
prepúcio ou da vulva. A sonda deve ser estéril e manuseada com luvas ou
instrumentos esterilizados. Mesmo com os cuidados prévios de antisepsia, devemos
lembrar da existência de microbiota no trato urinário inferior. Na passagem da sonda
pode haver o carreamento de bactérias patogênicas para a bexiga, levando a
infecções urinárias decorrentes do procedimento de sondagem uretral. Estas
complicações reduzem a qualidade do material colhido por sondagem
comparativamente a cistocentese. Outro método de colheita de urina é representado
pela micção espontânea. A colheita de urina durante a micção natural do animal
aumenta o risco de contaminação da amostra, não sendo indicada como método
adequado para cultura microbiana, somente para urinálise (Greene, 2006).
A colheita da urina por cistocentese é o método mais apropriado de
diagnóstico com vistas para cultura e identificação de microrganismos causais nas
Siqueira, A.K., 2006.
ITUs (Barsanti & Finco, 1979; Greene, 2006). Tanto para a urinálise quanto para a
urocultura, as amostras de urina devem ser colhidas antes da instituição de
tratamento com antimicrobianos. Caso o tratamento já tenha sido iniciado, deve ser
descontinuado por no mínimo três dias para a realização do procedimento de cultura
(Barsanti & Finco, 1979; Greene, 2006), sendo questionável, pois muitos
antimicrobianos deixam resíduos mais duradouros.
Os cuidados com acondicionamento e manuseio da amostra são
importantes para prevenir contaminação posterior a colheita e para garantir resultado
fidedigno da cultura. Considera-se ideal que a amostra seja imediatamente
encaminhada para cultura microbiana após a colheita. Caso não seja possível, a urina
deverá ser refrigerada no máximo seis horas. Existem meios de transporte que podem
ser utilizados para manter a amostra viável por até 72 horas sob refrigeração (Nelson
& Couto, 2003; Greene, 2006).
Na urinálise os achados no sedimento urinário que sugerem ITU são piúria,
hematúria e bacteriúria, dos quais este último é o mais específico. Piúria e bacteriúria
nem sempre estão associadas a ITU. A ausência de piúria não indica ausência de
bacteriúria. Porém, a presença única de piúria demonstra processo inflamatório.
Sempre que possível, a cultura deve ser realizada para confirmar a presença ou não
do agente infeccioso (Greene, 2006).
A urocultura é apontada como teste diagnóstico definitivo para a
confirmação laboratorial de infecção do trato urinário. Diversos gêneros bacterianos e,
secundariamente, fungos, podem promover infecções isoladas ou múltiplas no trato
urinário de animais de companhia (Greene, 2006).
Dentre os exames clínico-laboratoriais, a presença de leucocitose por
neutrofilia, com ou sem desvio à esquerda, é o principal achado nas ITUs em cães.
Anormalidades na função renal, como aumento de creatinina, são observados
principalmente nos casos de pielonefrite (Greene, 2006).
Siqueira, A.K., 2006.
À semelhança de outras infecções bacterianas em cães, recomenda-se que
a terapia seja fundamentada em testes de sensibilidade in vitro dos agentes frente aos
antimicrobianos de escolha (Nelson & Couto, 2003; Cetin et al., 2003; Greene, 2006).
Os dois principais testes utilizados são o método de difusão com discos (Bauer et al.,
1966) e a determinação da concentração inibitória mínima-MIC (Quinn & Carter,
1994).
Para o método de difusão são utilizados discos impregnados com
concentrações específicas para cada antimicrobiano, de acordo com normas
internacionais (NCCLS, 1999). O método de difusão toma como base concentrações
séricas atingidas in vitro pelos antimicrobianos, o que pode gerar limitações nas
concentrações terapêuticas alcançadas in vivo em determinados órgãos na terapia
(Jarvinem, 1980; Quinn & Carter, 1994).
A concentração inibitória mínima pode ser aferida com fitas impregnadas
por diferentes concentrações de antimicrobianos ou utilizando meios de cultura
acrescidos de diluições diferentes da droga a ser testada. Este método fornece para o
clínico a concentração mínima do medicamento que deverá ser utilizada para inibir a
multiplicação bacteriana (Quinn & Carter, 1994). Ambos os testes são padronizados
de acordo com as normas do “National Commitee for Laboratory Standards” - NCCLS.
A escolha do antimicrobiano deve ser baseada no agente infeccioso, no
perfil de sensibilidade in vitro, na concentração terapêutica no trato urinário, assim
como outros fatores como custo, disponibilidade comercial e vias de administração da
droga.
Na ausência de diagnóstico microbiológico o clínico deve realizar a
bacterioscopia da urina corada por Gram visando, minimamente, direcionar a escolha
do antimicrobiano para bactérias Gram-positivas ou negativas. O pH da urina também
pode nortear a escolha do antimicrobiano. Estudos indicam que na presença de urina
ácida e bastonetes Gram-negativos, existe maior probabilidade de isolamento de
Escherichia coli, enquanto na presença de cocos Gram-positivos, existe maior
probabilidade de isolamento de Streptococcus sp. Já em urinas alcalinas contendo
Siqueira, A.K., 2006.
bastonetes Gram-negativos comumente é isolado Proteus sp, e na presença de cocos
Gram-positivos, Staphylococcus sp (Nelson & Couto, 2003; Greene, 2006).
De forma geral, são recomendados na terapia de ITUs em cães: ampicilina,
amoxicilina, amoxicilina com ácido clavulânico, cefalexina, ciprofloxacina,
enrofloxacina, gentamicina, tetraciclina e sulfametoxazol com trimetoprim. A terapia
deve ser preconizada por no mínimo uma semana, podendo se extender até seis
semanas nos casos complicados (Bonagura, 2000; Nelson & Couto, 2003; Cetin et al.,
2003).
Adicionalmente, recomenda-se a realização de nova cultura de urina que
deverá ser realizada após o término do tratamento para avaliar a eficácia do
antimicrobiano utilizado (Bonagura, 2000; Nelson & Couto, 2003).
2.2 PIOMETRA EM CÃES POR E. coli
A piometra é caracterizada como inflamação do útero com acúmulo de pús
intraluminal (Greene, 2006). Esta síndrome afeta cadelas adultas não castradas,
causando uma variedade de sinais clínicos sistêmicos (Fransson & Ragle, 2003;
Fransson et al., 2003).
Historicamente, a piometra é também denominada hiperplasia endometrial
cística, já que as mudanças hormonais uterinas, principalmente na fase luteal
provocadas pela progesterona, aumentam a atividade secretória das glândulas do
endométrio e diminuem a contratilidade do miométrio, gerando acúmulo de fluidos.
Estes fatores, associados com a presença de bactérias no útero, levam a piometra ou
complexo hiperplasia cística endometrial (Nelson & Feldman, 1986; Ferreira & Lopes,
2000; Fransson & Ragle, 2003; Nelson & Couto, 2003; Coogan et al., 2004;
Romagnoli, 2005; Greene, 2006). Recentemente sugeriu-se a separação deste
Siqueira, A.K., 2006.
complexo em hiperplasia endometrial cística (CEH) e piometra. A CEH pode predispor
à piometra. No entanto, a piometra pode cursar sem CEH (Fransson & Ragle, 2003).
A piometra é mais freqüente em cães de meia idade e idosos. A
administração de estrógenos pode induzir a doença também em animais jovens
(Sandholm et al., 1975; Nelson & Couto, 2003; Fransson & Ragle, 2003; Greene,
2006).
À semelhança das ITUs, E. coli é o microrganismo mais comumente
associado com a enfermidade, observado como o único agente entre 59 e 96% dos
casos. Adicionalmente, é considerado como a principal causa de morbi-mortalidade
na piometra em cães (Sandholm et al., 1975; Nelson & Couto, 2003; Fransson &
Ragle, 2003; Greene, 2006). E. coli infecta o útero, via ascendente, pela cérvix. A
predominância do agente está associada com a presença de sítios antigênicos
específicos no endométrio - estimulado pela progesterona -, e no miométrio,
facilitando a aderência ao tecido uterino (Faldyna et al., 2001; Nelson & Couto, 2003;
Greene, 2006).
Linhagens de E. coli isoladas do útero de cadelas com piometra têm sido
comparadas com estirpes isoladas das fezes dos animais e da vesícula urinária. Estes
estudos têm apontado que as linhagens são bioquimicamente e geneticamente
semelhantes (Faldyna et al., 2001; Fransson & Ragle, 2003; Greene, 2006),
confirmando que a infecção uterina ocorre por bactérias de origem entérica.
Tanto na piometra quanto nas ITUs, as estirpes de E. coli possuem fatores
de virulência semelhantes, sugerindo também mecanismos similares de
patogenicidade entre os microrganismos causadores de ambas infecções (Greene,
2006).
Os gêneros Streptococcus, Staphylococcus, Proteus, Klebsiella, Salmonella
e Pseudomonas aeruginosa são isolados em menor freqüência na piometra em cães
(Faldyna et al., 2001; Fransson & Ragle, 2003; Coggan et al., 2004; Bigliardi et al.,
2004; Romagnoli et al., 2005; Greene, 2006).
Siqueira, A.K., 2006.
Os casos de piometra ocorrem comumente em torno de dois meses após
estro ou acasalamento, ou após administração de estrógenos ou progestágenos
(Greene, 2006). A piometra pode ser classificada como aberta ou fechada, de acordo
com a presença ou ausência de secreção vulvar. A enfermidade é mais severa em
fêmeas que apresentam a cérvix fechada. Em animais com descarga vulvar, a
secreção apresenta-se purulenta e usualmente com sangue (Nelson & Feldman,
1986; Kaymaz et al., 1999; Nelson & Couto, 2003; Fransson & Ragle, 2003).
Os principais sinais clínicos relatados são anorexia, vômitos, polidipsia,
poliúria e letargia. Os animais afetados também podem apresentar desidratação e
febre (Sandholm et al., 1975; Nelson & Feldman, 1986; Kaymaz et al., 1999; Nelson &
Couto, 2003; Fransson & Ragle, 2003; Greene, 2006).
O útero das fêmeas com cérvix fechada é mais facilmente palpável. Estes
animais podem evoluir para septicemia ou endotoxemia, choque e morte. O conjunto
destes sintomas clínicos nos casos graves é denominado “síndrome da resposta
inflamatória sistêmica” (SIRS) (Nelson & Feldman, 1986; Fransson, 2003; Fransson &
Ragle, 2003; Nelson & Couto, 2003; Greene, 2006).
A SIRS é associada com infecções severas que provocam a liberação de
mediadores inflamatórios afetando sistemicamente o animal (Fransson, 2003;
Fransson & Ragle, 2003; Greene, 2006). Clinicamente os cães podem apresentar
febre, aumento da freqüência cardíaca e respiratória. Dentre os achados clínico-
laboratoriais na SIRS em cães destacam-se a leucocitose com desvio à esquerda,
anemia normocítica normocrômica, assim como alterações hepáticas e renais (Nelson
& Couto, 1986; Fransson, 2003; Fransson & Ragle, 2003).
O diagnóstico da piometra é firmado com base na associação dos sinais
clínicos e histórico do animal (idade, fase do ciclo estral, acasalamento), aliado a
exames clínico-laboratoriais e de diagnóstico por imagem (Nelson & Feldman, 1986;
Nelson & Couto, 2003; Greene, 2006).
Siqueira, A.K., 2006.
Diferentes exames subsidiários são utilizados na rotina clínica-diagnóstica
e os achados laboratoriais são mais graves em animais com a cérvix fechada
(Greene, 2006). A contagem absoluta de leucócitos freqüentemente excede 30.000
células por microlitro. A leucocitose deriva da neutrofilia com desvio à esquerda
degenerativo e presença de neutrófilos tóxicos, aliada a anemia normocítica.
Concomitantemente há hiperproteinemia (7,5 – 10,0g/dl), decorrente de
hiperglobulinemia e hipoalbuminemia, em conseqüência da desidratação e estímulo
antigênico (Schepper et al., 1987).
As anormalidades bioquímicas podem incluir azotemia, pequeno a médio
aumento da alanina amino transferase (ALT) e alterações em fosfatase alcalina (FA)
(Nelson & Feldman, 1986; Nelson & Couto, 2003; Fransson et al., 2003; Greene,
2006). Na urinálise os achados incluem piúria, hematúria e proteinúria. A densidade
pode apresentar valores acima de 1030 (Nelson & Feldman, 1986; Kaymaz et al.,
1999; Nelson & Couto, 2003; Bigliardi et al., 2004; Greene, 2006).
A radiografia e a ultrassonografia são os métodos de diagnóstico por
imagem mais comumente utilizados na piometra em cães. A radiografia abdominal
permite a visualização do útero e diagnóstico de piometra, caracterizada por estrutura
tubular contendo fluido denso, localizada ventral e caudalmente ao abdômen,
deslocando as alças intestinais (Prestes et al., 1991). A ultrassonografia é utilizada
como método alternativo quando o raio-X é inconclusivo, permitindo determinar o
tamanho do útero, a espessura da parede uterina e a presença de fluidos no lúmen do
órgão (Kaymaz et al., 1999; Bigliardi, et al. 2004).
O isolamento dos microrganismos da secreção uterina colhidos com “swab”
ou mesmo por punção aspirativa, são definitivos no diagnóstico. À semelhança da
ITU, a terapia dos animais acometidos deveria ser embasada na identificação dos
microrganismos e no teste de sensibilidade aos antimicrobianos (Quinn & Carter,
1994; Ferreira & Lopes, 2000; Fransson et al., 2003; Greene, 2006).
O tratamento deve ser imediato em virtude da agressão do organismo nos
animais com piometra. A ovariosalpingohisterectomia (OSH) aliada a terapia
Siqueira, A.K., 2006.
antimicrobiana e a recuperação do equilíbrio hidro-eletrolítico são os procedimentos
de escolha no tratamento. O prognóstico do paciente é bom após a cirurgia, com
exceção dos casos de ruptura uterina que aumentam em até 50% o risco de morte,
conseqüente ao desenvolvimento de peritonite e septicemia (Nelson & Feldman,
1986; Fransson, 2003; Fransson & Ragle, 2003; Nelson & Couto, 2003; Greene,
2006). A terapia com estrógenos, andrógenos e ocitocina não apresenta incremento
nos índices de efetividade da terapia (Nelson & Feldman, 1986; Ferreira & Lopes,
2000).
Em animais com cérvix aberta e sem sinais sistêmicos severos, a terapia
com prostaglandina (PGF2α) é uma alternativa. Os efeitos desta droga são a
contração do miométrio e relaxamento da cérvix auxiliando na drenagem do conteúdo
uterino. Apenas as prostaglandinas naturais devem ser utilizadas, pois as sintéticas
são muito potentes e o uso indevido pode levar à morte do animal (Greene. 2006).
2.3 Escherichia coli
E. coli são bacilos Gram-negativos, móveis ou não, anaeróbios facultativos,
não esporulados, contendo diferentes fatores de colonização (Quinn & Carter, 1994;
Acha & Szyfres, 2001; Trabulsi; 2005).
Estas enterobactérias apresentam membrana citoplasmática, espaço
periplásmico, peptidioglicanos ou mureína e membrana externa. Podem apresentar
filamento flagelar que se projeta do citoplasma. Possuem cápsula conhecida como
antígeno K. A membrana externa é constituída por lipopolissacarídeos (LPS), porinas
e fímbrias. O material genético é formado por um único cromossomo circular. Os
plasmídeos - material genético extra-cromossomal – contém informações como a
produção de toxinas, resistência aos antimicrobianos e podem ser transmitidos entre
as linhagens de E. coli (Trabulsi, 2005).
Siqueira, A.K., 2006.
Os polissacarídeos de membrana, denominados antígenos O ou somáticos,
determinam os mais de 170 sorogrupos de Escherichia coli. Os antígenos flagelares
ou H são de natureza protéica e distinguem os sorotipos dos diferentes sorogrupos
(Acha & Szyfres, 2001).
A patogenicidade e as manifestações clínicas das colibaciloses variam de
acordo com a presença de diferentes fatores de virulência das linhagens bacterianas,
em especial representados pelas adesinas, toxinas, sistemas de aquisição de ferro e
multirresistência (Greene, 2006).
Classicamente E. coli é considerado um dos principais agentes causais de
enterite no homem e animais. Ocasionalmente o agente é encontrado em ampla
variedade de manifestações clínicas extra-intestinais, incluindo afecções
dermatológicas, pulmonares, neurológicas, oculares, articulares, gênito-urinárias,
entre outras (Radostitis, 2000; Trabulsi, 2005; Greene, 2006), conotando também seu
comportamento oportunista.
2.4 E. coli DIARREIOGÊNICAS (DEC)
As linhagens de E. coli relacionadas às manifestações clínicas entéricas ou
diarreiogênicas são divididas na atualidade em seis classes ou grupos: E. coli
enteropatogênica (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enterotoxigênica
(ETEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli enteroinvasora (EIEC) e E. coli que
adere difusamente (DAEC) (Nataro & Kaper, 1998; Ribeiro, 2001; Acha & Szyfres,
2001; Dantas, 2002; Kaper et al., 2004; Trabulsi, 2005; Veronesi, 2005; Von Sydow,
2005; Greene, 2006).
Siqueira, A.K., 2006.
2.4.1 E. coli ENTEROPATOGÊNICA (EPEC)
Foi a primeira categoria de E. coli diarreiogênica descrita. Os primeiros
estudos datam de 1920 e 1930 na Alemanha, sendo confirmados em 1945 na
Inglaterra (Kaper et al., 2004; Trabulsi, 2005; Veronesi, 2005).
Esta classe de E. coli é considerada a maior causa de diarréia em crianças
com idade inferior a um ano em países em desenvolvimento (Kaper et al., 2004;
Trabulsi, 2005; Veronesi, 2005).
Em 1995 foi reconhecida a existência de duas categorias de EPEC,
denominadas típica e atípica. Esta última é considerada patógeno emergente tanto
em países desenvolvidos quanto em desenvolvimento, incluindo o Brasil. Ambas
causam lesão histopatológica no epitélio intestinal denominada lesão A/E (“attaching
and effacing”). As principais diferenças são os sorotipos e a presença de plasmídeos
específicos. Além disto, as linhagens típicas se aderem de forma localizada. As
estirpes atípicas também se caracterizam por aderência localizada, porém frouxa
(Kaper et al., 2004; Trabulsi, 2005; Veronesi, 2005).
EPEC se adere às células da mucosa do intestino delgado e cólon
causando perda das microvilosidades e formando um pedestal de filamentos de actina
(lesão A/E). As mudanças morfológicas nas microvilosidades estão associadas com a
resposta inflamatória. Clinicamente observa-se diarréia aquosa com muco e sem
sangue, febre e desidratação (Trabulsi, 2005; Veronesi, 2005; Greene, 2006).
Segundo Trabulsi (2005), o homem é reconhecido como único reservatório
das EPEC típicas. Raramente são encontradas em animais. As prováveis fontes de
infecção são portadores sadios ou doentes. As vias de transmissão incluem contato
pessoal e ingestão de água e alimentos contaminados.
Siqueira, A.K., 2006.
2.4.2 E. coli ENTEROHEMORRÁGICA (EHEC)
Descrita em 1983 com infecção intestinal, esta categoria de DEC foi
reportada nos EUA em surtos de diarréia humana ocorridos após ingestão de
hambúrgueres (Trabulsi, 2005).
As EHEC são relatadas predominantemente em surtos ou em casos
isolados em países desenvolvidos, tendo baixa freqüência de isolamento em países
em desenvolvimento (Veronesi, 2005; Trabulsi, 2005). A grande maioria dos surtos
estão relacionados ao sorotipo O157:H7 (Acha & Szyfres, 2001; Kaper et al., 2004;
Trabulsi, 2005).
Esta categoria é caracterizada por diarréia sanguinolenta, trombocitopenia
e síndrome urêmica hemolítica (SUH) no homem. A causa da colite e da SUH é
atribuída a produção da toxina de Shiga (“Shiga toxin producing E. coli”) ou STEC
pelo sorotipo O157:H7. A toxina é também denominada verocitotoxina (vt) (Acha &
Szyfres, 2001; Kaper et al., 2004; Trabulsi, 2005; Veronesi, 2005; Greene, 2006).
A absorção da toxina Shiga provoca hemorragias intestinais e lesão renal
por inibição da síntese protéica. Os casos de infecção humana por E. coli O157:H7,
principalmente em crianças, evoluem para falência renal e geralmente têm
prognóstico desfavorável, mesmo com a instituição do tratamento (Veronesi, 2005;
Trabulsi, 2005).
Assim como as EPEC, EHEC também causa lesão A/E (Trabulsi, 2005;
Veronesi, 2005; Greene, 2006), porém colonizam somente o cólon (Veronesi, 2005).
As EHEC podem ser encontradas nas fezes da maioria dos animais
domésticos, mas o reservatório mais importante para o homem é o bovino (Acha &
Szyfres, 2001; Kaper et al., 2004; Trabulsi, 2005; Greene, 2006). A principal via de
transmissão é a ingestão de carnes mal passadas. Atualmente têm crescido os casos
relacionados ao consumo de água, alface, frutas, sucos fermentados e leite (Acha &
Szyfres, 2001; Kaper et al., 2004; Trabulsi, 2005).
Siqueira, A.K., 2006.
No Brasil, Cerqueira et al. (1999) identificaram o sorotipo O157:H7 nas
fezes de bovinos de abatedouros. Ribeiro et al. (2006) não identificaram o sorotipo
O157:H7 em 120 linhagens de E. coli isoladas de mastite, embora tenham identificado
estirpes produtoras de verotoxinas.
Há relato de isolamento do sorotipo O157:H7 a partir de fezes de cães
provenientes de fazendas, porém sem sinais clínicos de doença por EHEC. Greene
(2006) refere o sorotipo O157:H7 nas fezes de cães que freqüentam praias ou que se
alimentam de comida caseira, porém sem qualquer sintomatologia clínica.
2.4.3 E. coli ENTEROTOXIGÊNICA (ETEC)
As ETEC produzem dois tipos principais de enterotoxinas denominadas
toxinas termolábeis (LT) e termoestáveis (ST) (Acha & Szyfres, 2001; Kaper et al.,
2004; Trabulsi, 2005; Veronesi, 2005; Greene, 2006).
A toxina LT possui grande peso molecular e está relacionada
imunologicamente com a toxina da cólera. A toxina ST possui baixo peso molecular,
perdendo a capacidade antigênica. Ambas são encontradas no DNA plasmidial,
podendo ser transferidas entre linhagens de ETEC (Acha & Szyfres, 2001; Veronesi,
2005).
Ao aderirem às células da mucosa do intestino delgado com o auxílio de
fímbrias de colonização, as bactérias liberam as toxinas. A LT altera a atividade da
adenil ciclase ativando canais de cloro, com conseqüente saída de água e diarréia. A
toxina ST estimula a secreção de cloro e inibe a reabsorção de NaCl, aumentando o
afluxo de fluídos intestinais (Kaper et al., 2004; Veronesi, 2005; Trabulsi, 2005;
Greene, 2006). A ação das duas toxinas resulta na incapacidade do enterócito em
reter eletrólitos e líquidos celulares provocando diarréia profusa e aquosa (Trabulsi,
2005).
Siqueira, A.K., 2006.
Segundo Acha & Szyfres (2001) e Trabulsi (2005) as ETEC constituem um
dos mais importantes enteropatógenos para o homem. São responsáveis por
aproximadamente 20% dos casos de diarréia em crianças com menos de cinco anos
em países desenvolvidos. Também é o principal agente da “diarréia dos viajantes” em
adultos.
O principal reservatório é o homem e as vias de transmissão são as fezes
de doentes e portadores. A infecção ocorre pela ingestão de água e alimentos
contaminados (Acha & Szyfres, 2001; Trabulsi, 2005). Existem evidências de
transmissão por contato pessoal, em berçários e enfermarias de pediatria. Pacientes
acometidos pelo vírus da aids também são alvos destas bactérias (Trabulsi, 2005).
2.4.4 E. coli ENTEROAGREGATIVA (EAEC)
A principal característica das E. coli enteroagregativas é seu padrão de
adesão às células epiteliais que consiste em um agregado celular que lembra “tijolos
empilhados” (Acha & Szyfres, 2001; Kaper et al., 2004; Trabulsi, 2005; Veronesi,
2005). Tal padrão é denominado agregativo e foi estabelecido em 1987 por
pesquisadores chilenos, em estudo epidemiológico sobre a etiologia da diarréia infantil
no país (Trabulsi, 2005).
Esta categoria de E. coli diarreiogênica tem sido associada à doença
diarréica aguda ou persistente em casos esporádicos, e em surtos de diarréia em
países desenvolvidos ou em desenvolvimento, sendo considerado patógeno
emergente (Kaper et al., 2004; Veronesi, 2005; Trabulsi, 2005). Outros estudos
relatam a presença significativa de portadores assintomáticos (Veronesi, 2005).
Os mecanismos de patogenicidade das EAEC ainda permanecem em
estudo, mas vários fatores de virulência foram descritos (Kaper et al., 2004; Veronesi,
2005; Trabulsi, 2005). Esta classe de E. coli possui a toxina termoestável de EAC
(EAST-1) e a “plasmid-encoded toxin” (PET). A EAST-1 se correlaciona com ST de
ETEC, alterando a corrente iônica das células intestinais. PET induz rompimento do
Siqueira, A.K., 2006.
esqueleto da membrana celular (Kaper et al., 2004; Trabulsi, 2005). Sugere-se que a
associação destes fatores culmina com a diarréia. Foram descritas duas proteínas
extracelulares denominadas PIC (“protein involved in intestinal colonization”) e
dispersina. PIC é uma mucinase que confere à bactéria, in vitro, resistência ao soro e
a hemaglutinação. A dispersina é imunogênica e auxilia na dispersão da EAEC pela
mucosa intestinal (Trabulsi, 2005).
A doença típica é caracterizada por diarréia secretória, mucóide e aquosa,
com período de incubação curto, pouca febre e vômitos esporádicos. A classe EAEC
foi associada com diarréia persistente em diversos países, inclusive o Brasil, com
duração igual ou superior a 14 dias. Diarréia do viajante também é associada com
esta categoria de DEC (Trabulsi, 2005).
Estirpes de EAEC já foram isoladas de animais (cavalos, cães, macacos,
bovinos e suínos), mas o papel destes como reservatórios para o homem ainda não
foi estabelecido (Trabulsi, 2005). Diversos estudos em vários países apontam que os
alimentos contaminados podem ser veículos de transmissão (Trabulsi, 2005).
2.4.5 E. coli ENTEROINVASORA (EIEC)
A enfermidade diarréica provocada por E. coli enteroinvasora é semelhante
à infecção causada pelo gênero Shigella. Possui a capacidade de invadir e multiplicar-
se nas células do cólon intestinal do homem (Acha & Szyfres, 2001; Kaper et al.,
2004; Trabulsi, 2005; Veronesi, 2005).
A diarréia causada por esta categoria é aquosa, seguida por muco e
sangue. O paciente também apresenta febre, mal estar e cólicas abdominais (Acha &
Szyfres, 2001; Kaper et al., 2004; Trabulsi, 2005).
A capacidade de invasão de células epiteliais e conseqüente infecção de
células adjacentes por estas bactérias é regulada tanto por genes plasmidiais quanto
por genes cromossomais (Trabulsi, 2005; Veronesi, 2005).
Siqueira, A.K., 2006.
As infecções causadas por EIEC são mais freqüentes em crianças maiores
que dois anos de idade e em adultos (Veronesi, 2005; Trabulsi, 2005). A transmissão
é via fecal-oral e ocorre pela ingestão de água e alimentos contaminados. O
reservatório desta categoria de DEC é o homem (Trabulsi, 2005). Possui importância
indefinida nos animais.
2.4.6 E. coli que ADERE DIFUSAMENTE (DAEC)
As E. coli de aderência difusa são caracterizadas por padrão agregativo
que envolve toda a célula (Kaper et al., 2004; Veronesi, 2005). Estudos demonstram
DAEC como causa de diarréia em crianças maiores de um ano (Kaper et al., 2004;
Veronesi, 2005).
Kaper et al. (2004) afirmam que, aproximadamente, 78% das linhagens de
DAEC produzem uma adesina fimbrial denominada F1845 responsável pela ação
citopática da bactéria. Esta ação se caracteriza pelo alongamento das
microvilosidades ao redor da célula bacteriana, reduzindo a borda em escova da
mucosa intestinal.
Trabulsi (2005) não aponta a classe DAEC entre as categorias de DEC
justificando que o processo de aderência difusa não define uma categoria, e é
encontrado em estirpes associadas com ITUs e infecções intestinais.
2.5 Escherichia coli EXTRA-INTESTINAL
(ExPEC – “ extraintestinal pathogenic E. coli”)
As infecções extra-intestinais (IEs) por E. coli ocorrem em todos os grupos
etários e podem acometer diversos órgãos. Como IEs típicas são citadas infecções do
Siqueira, A.K., 2006.
trato urinários (UTIs), meningite (em neonatos e em complicações neurocirurgicas),
infecções intra-abdominais, pneumonia (particularmente em pacientes hospitalizados),
infecções intravasculares, osteomielite e infecções em tecidos moles (Russo &
Johnson, 2000; Kaper et al., 2004; Trabulsi, 2005; Greene, 2006).
As linhagens de E. coli ExPEC são filogeneticamente e
epidemiologicamente distintas das comensais e patogênicas do intestino.
Aparentemente as ExPEC são incapazes de causar doença entérica, colonizando o
trato intestinal de forma estável em animais e humanos saudáveis, a não ser que se
estabeleça em sítios extra-intestinais (Russo & Johnson, 2000).
Russo & Johnson (2000) propuseram a utilização do acrônimo ExPEC
(“extraintestinal pathogenic E. coli”) como nova forma de denominação para as
estirpes de Escherichia coli não diarreiogênicas. Dependendo do sistema ou órgão
acometidos, estas linhagens podem ser denominadas UPEC (“uropathogenic E. coli´),
MNEC (meningits – associated E. coli”) e ainda APEC (“avian pathogenic E. coli”)
(Russo & Johnson, 2000; Kaper et al., 2004).
2.5.1 Escherichia coli UROPATOGÊNICA (UPEC – “uropathogenic E.
coli”)
As infecções do trato urinário (ITUs) estão entre as infecções mais
freqüentes no homem e em animais de todo mundo (Trabulsi, 2005; Sousa, 2006).
Nos EUA, os custos anuais diretos ou indiretos com infecções urinárias são
superiores a 1,6 bilhões de dólares (Marss et al., 2005). E. coli é o principal agente
etiológico de cães com infecção urinária, em casos recorrentes de ITU e em cães que
apresentem urolitíase (Greene, 2006).
A ocorrência de ITU por E. coli em cães é proporcionalmente tão alta como
no homem. Em ambos, os patógenos urinários derivam tipicamente de clones
específicos, contendo fatores de virulência associados filogeneticamente com o grupo
Siqueira, A.K., 2006.
BB
2
. Estas bactérias têm como reservatório o intestino e região peri-anal, e ingressam
pelo sistema urinário via ascendente, pela uretra (Greene, 2006).
As UPEC pertencem a um pequeno número de sorogrupos, ao redor de
seis, os quais possuem fenótipos epidemiologicamente associados com cistites e
pielonefrites. Os principais fatores de virulência expresados por estas estirpes são
adesinas, toxinas, proteínas fixadoras de ferro e os antígenos O e K (Kaper et al.,
2004; Trabulsi, 2005; Greene, 2006).
O advento da tecnologia molecular tem facilitado os estudos sobre E. coli
uropatogênica. O rápido acesso aos determinantes virulentos pela PCR (“polimerase
chain reaction” / reação em cadeia pela polimerase) tem permitido avanços na
epidemiologia, diagnóstico e estratégias de controle. O reconhecimento das
características de virulência do microrganismo favorece a interpretação clínica,
possibilitando melhor prognóstico dos pacientes decorrentes de ações terapêuticas
diferenciadas (Usein et al., 2001).
Linhagens de E. coli isoladas de cães e gatos com ITU são similares
fenotipicamente e geneticamente com aquelas isoladas de pacientes humanos. Estes
achados sugerem que poderia existir infecção cruzada com estirpes patogênicas entre
os animais de companhia e seus proprietários (Kurazono et al., 2003).
2.6 FATORES DE VIRULÊNCIA (FV)
A patogenicidade das linhagens de E. coli está diretamente ligada a
diferentes fatores de virulência, incluindo adesinas, toxinas, mecanismos de captação
de ferro, multi-resistência aos antimicrobianos, entre outros (Sousa, 2006).
Tanto nas infecções entéricas quanto no trato urinário faz-se necessária a
adesão entre o patógeno e o epitélio do hospedeiro, mediante a interação de adesinas
Siqueira, A.K., 2006.
da bactéria com receptores no tecido. Este contato desencadeia alterações
moleculares que iniciam o processo infeccioso (Kau et al., 2005; Sousa, 2006).
As principais barreiras contra as infecções no organismo são representadas
pelos mecanismos inatos de defesa, ou inespecíficos, que incluem o fluxo urinário,
esfoliação de células epiteliais, secreção da proteína Tamm-Horsfal e quemocinas
(interleucina 8), resultando na quimiotaxia de neutrófilos (Oelschlaeger et al., 2002).
A proteína Tamm-Horsfal (THP–“Tamm-Horsfal Protein”) é também
denominada proteína uromucóide, responsável por interferência na colonização
bacteriana. Esta proteína é composta por 25 a 30% de resíduos de carboidratos, os
quais são constituintes de receptores análogos para algumas adesinas de E. coli.
Estas observações sugerem que ao se ligar com a THP, a bactéria não consegue
aderir ao uroepitélio, facilitando sua eliminação pelo fluxo urinário (Garcia & Lê
Bouguénec, 1996).
Em casos simples de ITU estes mecanismos são suficientes para conter a
infecção em apenas alguns dias. Todos estes microrganismos dispõem de uma
variedade de fatores de virulência que os capacitam para causarem infecção no trato
urinário. Desta forma, o grupo das E. coli uropatogênicas são isoladas de infecções
simples, e também responsáveis por infecções em pacientes cateterizados, com
formação de cálculos ou com comprometimento do sistema imune (Oelschlaeger et
al., 2002).
Os fatores de virulência se encontram inseridos no cromossomo de UPEC
e em sua grande maioria em regiões instáveis (regiões móveis de DNA) denominadas
ilhas de patogenicidade (PAIs-“Pathogenicity Islands”). Estas PAIs se localizam
próximas ou inseridas aos genes do RNA transportador (Nakano et al., 2001; Emody
et al., 2003). A transferência horizontal de PAIs é um importante mecanismo de
transporte de fatores de virulência de UPEC (Emody et al., 2003).
A regulação da expressão gênica também é aspecto importante na
manifestação da virulência das enterobactérias. Condições ambientais como
Siqueira, A.K., 2006.
temperatura, oferta de nutrientes e ferro são fundamentais para o desenvolvimento
fenotípico dos sinais clínicos relacionados aos fatores de virulência (Emody et al.,
2003).
2.6.1 ADESINAS
As enterobactérias carreiam em sua superfície monômeros, oligômeros
simples ou componentes de fibras supramoleculares denominadas adesina, pili ou
fímbria. As organelas de aderência mais comumente associadas com UPEC são
fímbria H, P e S e a família Dr de adesinas (Mulvey, 2002).
Linhagens de E. coli produzem adesinas fimbriais que são estruturas
presentes no envelope celular, facilmente identificadas por microscopia eletrônica. E.
coli carreia em torno de 500 fímbrias em sua superfície, sendo cada uma destas
estruturas constituídas por aproximadamente 1000 subunidades protéicas (Hacker,
1992).
Fímbrias e flagelos são morfologicamente e funcionalmente distintos. Os
flagelos são longos e flexíveis, sendo responsáveis por motilidade e não por
aderência. Diferem também de pili sexual, o qual possui função de conjugação e não
de ligação com outras superfícies (Johnson, 1991).
Os receptores para adesinas são produzidos por células epiteliais,
eritrócitos e pelo glicocálix urinário. Especificamente estas adesinas podem ligar-se
com componentes da matriz extracelular como fibronectina, laminina ou colágeno
(Garcia & Lê Bouguénec, 1996).
2.6.1.1 Fímbria tipo1
Fímbria tipo 1 ou pili tipo1 é a adesina codificada por UPEC mais
prevalente. Aproximadamente 80% das linhagens codificam esta fímbria (Hacker,
Siqueira, A.K., 2006.
1992; Mulvey, 2002). Estruturalmente apresenta-se como bastonete helicoidal
espesso, com 7ηm de diâmetro e comprimento entre 0,5 e 2μm (Johnson, 1991;
Mulvey, 2002), constituído por proteínas de subunidade principal fimA e três proteínas
de subunidades menores fimF, fimG e fimH (Mulvey, 2002; Tiba, 2004).
Adesinas fimbriais mostram especificidade diferente quanto aos seus
receptores presentes em eritrócitos de diversas espécies. Bactérias com a expressão
da fímbria do tipo 1 se aderem a diferentes células, incluindo do epitélio bucal
humano, intestinais, vaginais, do epitélio uretral e de vasos sanguíneos (Johnson,
1991). Pili do tipo1 reconhece como receptor celular a manose presente em uma
glicoproteína secretada pelo epitélio da bexiga denominada uroplaquina, recebendo a
denominação de adesina fimbrial sensível a manose (Hacker, 1992; Oelschlaeger et
al., 2002; Trabulsi, 2005; Kau et al., 2005).
Pili tipo1 também é considerada invasina, pois sua ligação com a
uroplaquina provoca a endocitose de UPEC. Depois da internalização, a bactéria se
prolifera no vacúolo endocítico, aderindo e invadindo o epitélio do trato urinário. Este
mecanismo pode ser considerado de evasão da bactéria visto que UPEC não será
eliminada pelo fluxo urinário. A própria endocitose também protege o microrganismo
da ação de imunoglobulinas e antimicrobianos (Trabulsi, 2005).
A subunidade menor protéica denominada fimH é responsável pela invasão
bacteriana no tecido do hospedeiro, atuando propriamente como adesina. fimA sem a
expressão da subunidade fimH não possui capacidade de aderência (Johnson, 1991;
Oelschlaeger et al., 2002; Mulvey, 2002; Tiba, 2004).
Estudos recentes demonstraram que determinadas variantes de fimH
podem mediar contato inter-bacteriano, estimulando auto-agregação das bactérias e
formação de biofilme. Estas propriedades conferem maior resistência bacteriana às
defesas do hospedeiro e também contra a ação de determinados antimicrobianos. A
formação de biofilme, mediada por fímbria do tipo1, também confere a UPEC a
capacidade de colonizar catéteres urinários e outros implantes médicos, gerando
Siqueira, A.K., 2006.
infecção em pacientes hospitalizados (Mulvey, 2002; Oelschlaeger et al., 2002;
Emody et al., 2003; Kau et al., 2005).
2.6.1.2 Fímbria P (papC/papG)
O receptor de fímbria P é alfa-D-Gal(1-4)alfa-D-Gal (globobiose), um
digalactosídeo que se encontra associado a um grupo de ceramidas ancorados na
membrana de células epiteliais de pacientes do grupo sanguíneo P (Johnson, 1991;
Mulvey, 2002; Oelschlaeger et al., 2002; Trabulsi, 2005). Estes receptores são
observados em eritrócitos humanos, de suínos, pombos, caprinos, ovinos, caninos e
em células uroepiteliais (Johnson, 1991).
De maneira similar a fímbria do tipo1, a fímbria P é composta por
subunidades que constituem uma fibrila pequena e flexível. Grande parte de sua
massa é formada pela subunidade papA. Esta fibrila contém uma adesina distalmente
localizada, papG, em associação com três outras subunidades, papE, papF e papK
(Johnson, 1991; Mulvey, 2002; Tiba, 2004). A subunidade papH atua como âncora
para papA na membrana externa bacteriana. A papA é necessária para a formação
da fímbria, mas não para a aderência com o receptor “Gal-Gal” (Johnson, 1991). A
adesina papG reconhece receptores expressos por eritrócitos e por células presentes
no rim de animais e do homem (Mulvey, 2002).
A subunidade papG é dividida em três variantes distintas, GI, GII e GIII
(Johnson, 1991; Mulvey, 2002). O alelo papGI é associado aos isolados de fezes,
enquanto GII está relacionado a pielonefrite e GIII com cistite (Johnson, 2002; Mulvey,
2002; Tiba, 2004).
Estudos apontam maior associação de fímbria P, especificamente papG,
com pielonefrite. Também há a correlação deste fator de virulência com o
desenvolvimento de bacteriúria (Mulvey, 2002; Tiba, 2004).
Siqueira, A.K., 2006.
2.6.1.3 Fímbria S (sfa)
Esta fímbria está relacionada a meningites causadas por Escherichia coli
(Tiba, 2004; Trabulsi, 2005). Também foi encontrada em bactérias isoladas de
infecções do trato urinário e sepsis (Mulvey, 2002; Tiba, 2004).
Pili S é composto por uma subunidade maior sfaA associada com três
subunidades menores sfaG, sfaH e sfaS. A subunidade sfaS está localizada na
extremidade distal da fímbria e permite interações da bactéria com resíduos de ácido
siálico expressos por receptores em células do epitélio renal e do endotélio dos vasos
(Mulvey, 2002).
Fímbria S facilita a disseminação da bactéria pelos tecidos do hospedeiro
(Mulvey, 2002), inclusive causando infecções na bexiga, pois foi verificado resíduo de
ácido siálico na uroplaquina3 (membrana que reveste o lúmem da bexiga) (Mulvey,
2002; Tiba, 2004).
2.6.1.4 Família de adesinas Dr
Este grupo de adesinas inclui adesinas fimbriais Dr e adesinas não
fimbriais afaI, afaII, afaIII, afaIV, nfaI e DrII (Johnson, 1991; Mulvey, 2002), além de
O75X. A adesina afimbrial afa é codificada pelo operon afa e expressa por UPECs
pertencentes a família de hemaglutininas resistentes a manose (Johnson, 1991; Tiba,
2004).
Todas estas adesinas possuem como receptor o antígeno do grupo
sanguíneo Dr (Mulvey, 2002; Tiba, 2004). O antígeno denominado DAF (“Deccay
Accelerating Factor”) é uma glicoproteína regulatória do sistema complemento. A
expressão de DAF aumenta durante a gestação, justificando a maior susceptibilidade
da mulher gestante para a infecção por UPEC Dr positiva (Mulvey, 2002). Estes
receptores são amplamente distribuídos em superfícies epiteliais do trato
gastrintestinal, pelve renal, uretra, bexiga e mucosa uterina (Johnson, 1991; Mulvey,
Siqueira, A.K., 2006.
2002; Tiba, 2004). Sugere-se que a família de adesinas Dr facilita a ascensão e
colonização bacteriana, e o desenvolvimento de infecção intersticial crônica no trato
urinário (Mulvey, 2002).
Contrastando com a fímbria P, as adesinas Dr estão mais freqüentemente
associadas com cistites (26 a 50% dos casos) comparativamente às pielonefrites (6 a
26% dos pacientes) (Johnson, 1991). Estudos indicam o aumento no risco de
infecções do trato urinário recorrentes naqueles pacientes nos quais as estirpes
UPEC apresentaram adesinas da família Dr, pois estes fatores de virulência
promovem maior persistência da bactéria no sistema urinário. Recentemente foi
descrito que UPEC detentores destas adesinas poderiam manter-se viáveis por mais
de um ano no tecido renal (Mulvey, 2002).
2.6.2 INTIMINA (eae)
EPECs clássicas são responsáveis por epidemias graves de diarréia
aquosa em crianças, principalmente aquelas que não se alimentaram de leite mateno
(Acha & Szyfres, 2001). Este grupo de E. coli diarreiogênica adere-se intimamente às
células intestinais formando expansões. O sorotipo O157:H7 também se adere as
células formando grupamentos de microcolônias na superfície do enterócito de
maneira íntima e localizada, destruindo as microvilosidades, provocando alterações
na constituição e no metabolismo celular. Este tipo de lesão foi denominada
Attachment/Effacement (A/E), pois após sua adesão há também formação de
“pedestais ou saliências” nas células (Nataro & Kaper, 1998; Ribeiro, 2001; Dantas,
2002; Moura, 2005; Von Sydow, 2005).
O desenvolvimento da lesão A/E envolve a participação de genes
plasmidiais e cromossômicos, bem como resposta celular. Porém, os principais genes
envolvidos com A/E se encontram inseridos no cromossomo bacteriano formando
uma ilha de patogenicidade denominada LEE (“Locus of enterocyte effacement”).
Dentre os genes nesta PAI, encontra-se o gene eae (E. coli attachment and effacing)
que codifica a síntese de uma proteína denominada intimina. Esta intimina é
Siqueira, A.K., 2006.
responsável pela adesão íntima da bactéria com a célula intestinal (Nataro & Kaper,
1998; Ribeiro, 2001; Dantas, 2002; Moura, 2005).
2.6.3 TOXINAS OU CITOLISINAS
Diferentes toxinas com efeito lítico em células epiteliais, eritrócitos e
leucócitos são produzidas por E. coli, especialmente em linhagens que promovem
infecções extra-entéricas. Dentre as principais toxinas e citolisinas, assumem
destaque para α-hemolisina (hlyA), fator necrosante citotóxico (cnf) e verotoxinas (vt).
2.6.3.1 Hemolisina (hly)
A α-hemolisina é uma citotoxina capaz de induzir a formação de poros na
membrana de diversas células do hospedeiro, resultando em morte celular (Trabulsi,
2005).
Esta toxina faz parte da família RTX (“Repeat Toxin”). Promove a lise em
eritrócitos, leucócitos, células endoteliais e do epitélio renal (Johnson, 1991; Emody et
al., 2003), recebendo a denominação de citolisina (Reingold et al., 1999; Tiba, 2004).
A hemolisina é codificada por um operon cromossomal composto de quatro
genes designado hlyABCD. O gene hlyA é estrutural, hlyC é responsável pela
ativação pós transcricional da proteína estrutural e as proteínas hlyB e hlyC de
membrana, compõem a maquinaria secretória de hlyA (Garcia & Le Bouguénec, 1996;
Tiba, 2004). Em animais, o operon hly costuma se localizar em plasmídeos (Johnson,
1991; Reingold et al., 1999).
A exposição de polimorfonucleares à α-hemolisina estimula a degranulação
e a liberação de ATP e leucotrienos, causando severas alterações morfológicas,
diminuindo quimiotaxia e fagocitose. A lise celular ocorre em altas concentrações da
Siqueira, A.K., 2006.
toxina. Monócitos e granulócitos são altamente sensíveis a citotoxicidade da
hemolisina, enquanto linfócitos são relativamente resistentes (Johnson, 1991).
A formação de poros, decorrente da ligação de hly com o receptor na célula
do hospedeiro permite o fluxo livre de cátions, íons e água, levando a perda do
conteúdo intracelular, alterações no citoesqueleto e no metabolismo da célula
(Johnson, 1991; Tiba, 2004).
A produção de hemolisina por E. coli uropatogênica em infecções no
homem é mais comum em linhagens isoladas de ITU superior, sendo mais freqüente
em pacientes com pielonefrite (49%) do que acometidos por cistite (40%) (Johnson,
1991), diminuindo consideralvelmente em isolados de bacteremia e das fezes
(Johnson, 1991; Tiba, 2004).
2.6.3.2 Fator Necrosante Citotóxico 1 (cnf-1)
Caprioli e colaboradores em 1980 descreveram uma toxina produzida por
estirpes de E. coli isoladas de enterite de crianças capaz de induzir lesões necróticas
em pele de coelho. O efeito citopático desta toxina em linhagens celulares HeLa e
Vero leva ao desarranjo do tapete celular, formação de células gigantes e
multinucleadas. Em 1983 a toxina foi denominada Fator Necrosante Citotóxico (cnf)
(Gyles, 1992; Pohl et al., 1993; Garcia & Le Bouguénec, 1996; Boquet, 2001).
A toxina cnf-1 induz profunda reorganização no citoesqueleto de actina,
multinucleação e alongamento de células HeLa, formação de grandes vacúolos e
capacidade de internalização bacteriana em células Hep-2. Estas características
sugerem que este fator de virulência pode facilitar a disseminação bacteriana do trato
urinário para a corrente circulatória (Garcia & Le Bouguénec, 1996; Zamora et al.,
2000; Boquet, 2001; Tiba, 2004).
A produção de cnf-1 foi reportada em E. coli isoladas de casos de enterite,
septicemia e nefrite em humanos, diarréia em vacas e suínos, septicemia em touros, e
Siqueira, A.K., 2006.
em casos de septicemia e infecção do trato urinário em cães e gatos (Gyles, 1992;
Pohl et al., 1993).
Estudos epidemiológicos revelaram 37% de UPECs produtoras de cnf-1 e
0,9% de linhagens provenientes das fezes. A produção desta toxina também é
freqüentemente associada com a produção de fímbria P e α-hemolisina (Gyles, 1992;
Ribeiro et al., 2002). Hemolisina, fímbria P e cnf-1 se encontram na mesma PAI na
maioria das UPECs, pressupondo que estas toxinas possam atuar em conjunto,
favorecendo a patogenicidade da bactéria (Landraud et al., 2000; Boquet, 2001; Tiba,
2004; Tavechio et al., 2004).
2.6.3.3 Verotoxinas (VT1 e VT2)
Konowalchuk e colaboradores descreveram pioneiramente as verotoxinas
em 1977, investigando a citotoxicidade do sobrenadante bacteriano filtrado sobre
culturas de células Vero (células de rim de macaco verde africano) (Moura, 2005).
A verotoxina tipo 1 (VT1) é funcionalmente e estruturalmente similar à
toxina de Shiga (sintetizada por Shigella dysenteriae). A VT2 é antigenicamente
distinta de VT1, sendo também denominadas toxinas Shiga-like (Stx 1 e 2) (Nataro &
Kaper, 1998; Ribeiro, 2001; Dantas, 2002; Moura, 2005; Von Sydow, 2005).
As verotoxinas inibem a síntese protéica das células do hospedeiro. Ainda
permanece incerto o papel destas toxinas para os quadros diarréicos (Dantas, 2002).
Porém, sabe-se que a diarréia ocorre pela destruição da camada de células de
absorção do intestino (Moura, 2005).
As toxinas VT1 e VT2 são constituídas por duas subunidades (A – B). A
subunidade B é um pentâmero que se liga a um receptor glicolipídico específico,
presente na superfície das células eucarióticas. Após a ligação de B com os
enterócitos, a subunidade A é carreada para o interior celular, sofrendo ação de
enzimas proteolíticas, reduzida a subfrações. A subfração A
1
remove resíduo de
Siqueira, A.K., 2006.
adenina da porção 28S ribossomal, inibindo a síntese protéica e causando morte
celular (Nataro & Kaper, 1998; Ribeiro, 2001; Moura, 2005; Von Sydow, 2005).
Os genes estruturais para as verotoxinas são encontrados em
bacteriófagos lisogênicos que os inserem no cromossomo bacteriano (Nataro &
Kaper, 1998; Dantas, 2002; Moura, 2005).
Em todo mundo mais de 50 sorotipos de E. coli têm sido identificados como
produtores de verotoxinas. Entretanto, o sorotipo O157:H7 é o melhor caracterizado e
o que desperta maior preocupação no contexto de saúde pública (Nataro & Kaper,
1998; Ribeiro, 2001; Dantas, 2002; Moura, 2005; Von Sydow, 2005).
O impacto das E. coli verotoxigênicas como agentes causadores de diarréia
em cães ainda não está esclarecido, bem como há pouca informação sobre o sorotipo
O157:H7 causando doença na espécie canina. (Von Sydow, 2005). Em cães da raça
Greyhound e Dog Alemão há a descrição de uma síndrome, semelhante com a SUH
nos homens, denominada Vasculopatia Glomerular Renal e Cutânea (“Alabama Rot”).
Esta síndrome, causada pela produção de toxinas por E. coli, possui caráter agudo e
letal. Lesões cutâneas como crostras e úlceras são observadas em 75% dos animais
acometidos e cerca de 25% destes cães podem apresentar falência renal (Nichols et
al., 2001; Chantrey et al., 2002; Rotermund et al., 2002; Greene, 2006).
Estas bactérias podem ser isoladas de uma grande variedade de animais.
Porém, a espécie mais importante é a bovina, considerada fonte de infecção e
reservatório para o homem e outras espécies animais (Nataro & Kaper, 1998; Ribeiro,
2001; Dantas, 2002; Moura, 2005; Von Sydow, 2005).
No Brasil são escassos os estudos conduzidos na investigação de toxinas
produzidas por linhagens de E. coli isoladas de cães (Dantas, 2002; Von Sydow,
2005).
Siqueira, A.K., 2006.
2.6.4 AEROBACTINA (aer)
O ferro é um dos elementos essenciais para o metabolismo bacteriano.
Atua no transporte de elétrons e como catalizador de reações enzimáticas
importantes, tais como aquelas envolvidas no metabolismo de hidrogênio, oxigênio e
nitrogênio, além de síntese de DNA (Johnson, 1991; Braun et al., 1999; Faraldo-
Gomez et al., 2003). O ferro é um dos elementos químicos mais abundantes nos
humores orgânicos. Entretanto, em determinadas condições de disponibilidade de
oxigênio e pH neutro torna-se escasso em virtude da rápida oxidação de Fe
2+
para
Fe
3+
, e da subseqüente formação de hidróxidos insolúveis (Johnson, 1991; Braun et
al., 1999; Braun et al., 2002; Faraldo-Gomez et al., 2003).
As bactérias possuem vários mecanismos para a captação do íon ferro.
Estes se traduzem por receptores de membrana que se ligam especificamente com
moléculas carreadoras de ferro, como por exemplo a transferrina ou os haemóforos.
Alternativamente, bactérias e fungos sintetizam grande variedade de moléculas de
baixo peso molecular capazes de quelar o ferro exógeno chamados sideróforos
(Braun et al., 1999; Faraldo-Gomez et al., 2003).
Os sideróforos são representados por três tipos de estruturas:
hidroxamatos, catecolatos e α-hidroxicarboxilatos. Assim como as transferrinas e
lactoferrinas, quelam Fe
3+
muito fortemente, transportando o íon para o citoplasma
bacteriano através de porinas (Braun et al., 1999; Braun et al., 2002; Faraldo-Gomez
et al., 2003).
O sideróforo hidroxamato aerobactina é o mais efetivo sistema de captação
de ferro para E. coli. Aerobactina é uma molécula pequena formada pela
condensação de duas moléculas de lisina e uma de citrato. Linhagens detentoras
deste fator de virulência multiplicam-se ou mantém-se viáveis em baixas condições de
ferro, incluindo soro e urina. A produção deste hidroxamato é estimulada por baixas
concentrações do íon encontradas nos fluídos corpóreos (Orskov et al., 1988;
Johnson, 1991; Garcia & Le Bouguénec, 1996; Tiba, 2004).
Siqueira, A.K., 2006.
Em todas as linhagens de E. coli o sistema de aerobactina é codificado por
um operon de cinco genes (iucABCD e iutA), no qual quatro genes (iucABCD)
codificam enzimas necessárias para a síntese da aerobactina e um quinto gene (iutA),
codifica o receptor de membrana externa denominado ferroaerobactina (Johnson,
1991; Garcia & Le Bouguénec, 1996; Tiba, 2004). Os determinantes genéticos que
regulam a síntese de aerobactina podem ser plasmidiais ou cromossomais (Orskov et
al., 1988; Garcia & Le Bouguénec, 1996; Tiba, 2004).
Eventos sucessivos na biossíntese de aerobactina são catalizados pelos
genes iuc na seqüência DBAC e envolvem: (I) hidroxilação da lisina, (II) acetilação do
grupo hidroxil para ácido hidroxâmico e (III) condensação sucessiva de duas
moléculas de ácido hidroxâmico para aerobactina (Johnson, 1991; Tiba, 2004).
Aerobactina e fímbria P são comumente encontradas em associação em
isolados de pacientes com ITU e urosepsis (Johnson, 1991). Orskov et al. (1988)
identificaram, simultaneamente, aerobactina, fímbria P e hemolisina em pacientes
com infecção urinária. Plasmídios carreadores de genes de aerobactina
freqüentemente possuem genes associados com resistência aos antimicrobianos
(Johnson, 1991; Tiba, 2004).
A detecção de aerobactina é freqüente em E. coli isoladas de pacientes
com pielonefrite (73%), cistite (49%) ou bacteremia (58%), comparativamente a
pacientes com bacteriúria assintomática (38%) ou de estirpes fecais (41%), denotando
a participação deste fator de virulência para o desenvolvimento de ITU (Orskov et al.,
1988; Johnson, 1991; Garcia & Le Bouguénec, 1996).
2.6.5 PROTEÍNA ESPECÍFICA UROPATOGÊNICA (usp)
A toxina zot foi encontrada em sobrenadante de cultura de Vibrio cholerae.
Tem como função aumentar a permeabilidade de membrana do intestino delgado.
Siqueira, A.K., 2006.
Recentemente descobriu-se que esta toxina induz a reorganização do citoesqueleto
de actina por um mecanismo mediado por fosfolipase C e por proteína quinase. Zot foi
classificada como uma nova família de enterotoxinas, porém também encontrada em
UPECs (Kurazono et al., 2000).
Com o intuito de investigar a prevalência de zot em estirpes de UPEC,
Kurazono et al. (2000) descreveram uma nova ilha de patogenicidade responsável
pela expressão de proteína associada com E. coli uropatogênicas. Esta proteína,
formada por 346 aminoácidos, foi designada proteína específica uropatogênica (usp-
“uropathogenic specific protein”).
A aderência às células do hospedeiro é um estágio essencial para o
desenvolvimento de ITUs, seguida pela expressão de fatores de virulência. Muitos
genes de virulência têm sido identificados em UPEC, incluindo fímbria tipo1, P, F e S
e família Dr. Destas adesinas, fímbria P mostra alta associação com pielonefrite. A
ocorrência de E. coli produtoras de usp é significativamente maior do que a presença
de fímbria P ou qualquer outro fator de virulência. Este fato também é observado
quando linhagens de UPEC são comparadas com estirpes de origem fecal. Dentre os
vários fatores de virulência de UPEC, nenhum é tão especificamente associado com
todas as manifestações de ITU quanto usp (Kurazono et al., 2000).
A proteína específica uropatogênica aumenta a infectividade da bactéria
(Yamamoto et al., 2001). Estudos demonstraram a presença de usp em 80% de
pacientes com cistite, 93% com pielonefrite e 24% em linhagens isoladas de fezes de
indivíduos sadios (Kurazono et al., 2000; Kurazono et al., 2003; Tiba, 2004).
Entretanto, são poucos os estudos no Brasil visando a investigação da proteína
específica uropatogênica em linhagens de E. coli isoladas de animais, especialmente
em animais de companhia.
No Brasil são escassos os estudos com o objetivo de avaliar os fatores de
virulência de E. coli isoladas de cães, assim como sua inter-relação com achados
clínico-epidemiológicos e reflexos em saúde pública, em virtude do estreito contato do
homem com animais de companhia. O presente estudo pretendeu avaliar os principais
Siqueira, A.K., 2006.
fatores de virulência (adesinas e toxinas) em estirpes de E. coli isoladas de infecções
do trato urinário, piometra e das fezes de animais sem sintomas entéricos.
Adicionalmente foram investigados os principais achados clínico-laboratoriais dos
animais, além da realização do teste de sensibilidade microbiana, com intuito de
fornecer, respectivamente, subsídios ao clínico de pequenos animais, no tocante ao
diagnóstico e terapia das afecções. A caracterização das UPEC visa contribuir no
entendimento da epidemiologia e fisiopatogenia das infecções do trato urinário e
piometra em cães. A caracterização de fatores de virulência nas estirpes que sejam
comuns ao desenvolvimento de doença no homem e em cães, ou que favoreçam a
patogenicidade das estirpes, pode alertar para o risco de transmissão destas
linhagens para o homem, decorrente do contato estreito com esta espécie animal.
Siqueira, A.K., 2006.
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
• Avaliar a presença de diferentes fatores de virulência em estirpes
de E. coli isoladas de infecção do trato urinário, piometra e fezes de cães.
3.2 Específicos
• Analisar a resposta hematológica em cães acometidos por
infecção do trato urinário e piometra decorrente de infecção por E. coli;
• Estabelecer o perfil de sensibilidade microbiana e a ocorrência de
multi-resistência a diferentes antimicrobianos nas linhagens de E. coli;
• Verificar a presença do gene codificador de fímbria tipo 1, fímbria
P, fímbria S e adesina afimbrial nas estirpes de E. coli;
• Avaliar a presença do gene codificador das citotoxinas cnf1 e vt
nas estirpes de E. coli;
• Verificar a presença de genes de hemolisinas e aerobactina,
mecanismos ligados à patogenicidade de E. coli por captação do íon ferro;
• Determinar a ocorrência do gene da proteína específica
uropatogênica nas linhagens de E. coli;
• Comparar a expressão gênica de diferentes adesinas, a
produção de toxinas, e a ocorrência de mecanismos de captação de ferro e multi-
resistência aos antimicrobianos entre as linhagens de E. coli isoladas de infecção do
trato urinário, piometra e das fezes;
• Avaliar os reflexos em saúde pública da presença de linhagens
de E. coli patogênicas isoladas de cães com ITU, piometra e das fezes.
Siqueira, A.K., 2006.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Delineamento experimental
Foram estudados os fatores de virulência em 158 linhagens de E. coli
isoladas de ITU (51 linhagens), piometra (52 linhagens) e fezes (55 linhagens) de
cães.
4.2 Colheita de material
4.2.1 Piometra: As linhagens de E. coli isoladas de piometra foram obtidas
de material colhido, assepticamente, diretamente do útero de cadelas no centro
cirúrgico da disciplina de Reprodução Animal da FMVZ. No local da punção foi
realizada anti-sepsia com álcool-iodado (70%/1%) e utilização de agulhas e seringas
estéreis.
4.2.2 Infecção do trato urinário: As estirpes de E. coli isoladas de infecção
do trato urinário foram obtidas através de colheita de urina por cistocentese (Greene,
2006), após devida anti-sepsia local com álcool-iodado (70%/1%) e com o uso de
agulhas e seringas estéreis.
4.2.3 Fezes: As linhagens de E. coli isoladas de fezes foram obtidas após
coleta de material fecal diretamente da ampola retal de animais saudáveis, sem
sintomas entéricos, com auxílio de “swabs” estéreis.
4.3 Identificação e manutenção das estirpes de E. coli
Todo material coletado foi enviado imediatamente ao Serviço de
Diagnóstico Microbiológico de Doenças Infecciosas dos Animais do Departamento de
Higiene Veterinária e Saúde Pública da FMVZ-UNESP, Botucatu, SP, sob condições
de refrigeração (4-8°C).
Siqueira, A.K., 2006.
O isolamento dos microrganismos provenientes de ITU, piometra e das
fezes foi realizado semeando-se o material nos meios de ágar sangue bovino
desfibrinado (5%) e ágar Mac Conkey. As placas foram mantidas em condições de
aerobiose a 37°C, por três dias, avaliadas a cada 24 horas.
As colônias lactose-positivas no meio de Mac Conkey foram submetidas a
testes bioquímicos MILI (motilidade, lisina, indol), EPM (glicose, gás, LTD, H
2
S,
réase) e citrato (Trabulsi, 2005). E. coli foi caracterizada segundo as características
morfo-tintoriais, bioquímicas e de cultivo (Edwards & Ewing, 1972; Krieg & Holt, 1994;
Trabulsi, 2005).
4.4 Exames hematológicos
Foi realizado o hemograma completo (eritrograma, leucograma e contagem
de plaquetas) em 33 animais com ITU e 26 com piometra, segundo Feldman et al.
(2000)(Anexo).
4.5 Teste de sensibilidade microbiana (antibiograma) e multi-
resistência das linhagens
As 158 linhagens de E. coli foram submetidas ao teste de sensibilidade
microbiana – método de difusão com discos – (Bauer et al., 1966), utilizando-se
antimicrobianos indicados para a terapia de ITU e piometra por E. coli em animais de
companhia e/ou disponíveis comercialmente para uso na rotina veterinária, a saber:
ampicilina (10μg), cefalexina (30μg), ceftiofur (30μg), ciprofloxacina (5μg),
enrofloxacina (5μg), florfenicol (30μg), gentamicina (10μg), norfloxacina (10μg) e
sulfametoxazol com trimetoprim (25μg). A leitura dos antibiogramas foi realizada
segundo o “National Commitee for Clinical Laboratory Standards” – NCCLS (NCCLS,
1999).
Siqueira, A.K., 2006.
Foram consideradas multi-resistentes as linhagens que apresentaram
resistência a três ou mais antimicrobianos.
As linhagens de E. coli isoladas foram estocadas em triplicata, em solução
de BHI acrescido de glicerol (5%) e congeladas a – 80°C. Adicionalmente, foram
mantidas sob temperatura de refrigeração (4°C) em ágar nutriente. Posteriormente, as
estirpes passaram a ser estocadas no meio de Liginiéres, em temperatura ambiente
(25ºC).
4.6 Detecção de hemolisinas no meio de ágar sangue
A detecção da produção de hemolisina foi realizada semeando todas as
amostras de material no meio de ágar sangue bovino desfibrinado (5%), conforme
descrito no item 4.3, mantidas em condições de aerobiose, a 37°C, por três dias. As
linhagens que apresentaram halo de hemólise total ao redor das colônias no meio de
ágar sangue, com identificação concomitante de E. coli no ágar Mac Conkey e
caracterizadas bioquimicamente, foram considerados como hemolíticas.
4.7 Reação em Cadeia pela Polimerase
A PCR foi realizada com intuito de diagnóstico dos seguintes fatores de
virulência:
• adesinas: fímbria tipo 1, fímbria P, fímbria S, adesina afimbrial e intimina eae;
• toxinas: hemolisina, fator necrosante citotóxico, verotoxinas;
• sistema de captação de ferro: aerobactina;
• proteína específica uropatogênica.
Siqueira, A.K., 2006.
4.7.1 Controles positivos: Como controle positivo para as adesinas e
demais fatores de virulência foram utilizadas as seguintes cepas padrão: FVL2 (sfa,
pap, iuc, hly, cnf-1), FVL16 (cnf-1, hly, pap, sfa), FV35 (afa, iuc, cnf-1), FVL8 (sfa, pap,
papGII, hly, iuc, usp, cnf-1), J96 (papGI, papGIII), ORN 115 (fimH) e O157:H7 (vt1 e
vt2 e eae). Todas as amostras foram cedidas pelo Prof. Dr. Domingos da Silva Leite
do Laboratório de Antígenos Bacterianos II, do Departamento de Microbiologia e
Imunologia/IB – UNICAMP, Campinas, SP.
4.7.2 Obtenção de DNA para PCR: O método utilizado para obtenção de
DNA foi descrito por Blanco et al. (1997). Este método consistiu no cultivo das
linhagens em caldo cérebro coração (BHI), a 37°C, “over night”. Em seguida as
estirpes foram semeadas em ágar TSA (Tryptic Soy Agar), a 37°C, por 24 horas, para
crescimento confluente. Um raspado de cada uma das linhagens foi suspenso em
100µl de água ultra-pura estéril. Estas suspensões foram fervidas por 10 minutos e
centrifugadas a 9676,8g (12.000 rpm) por 3 minutos (centrífuga Sorvall® MC12). Após
cetrifugação, foram utilizados os sobrenadantes destes materiais para as reações de
PCR.
4.7.3 Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR): Para a PCR foram
utilizados “primers” específicos para cada um dos genes: fimH (adesina da fímbria do
tipo 1), papC (proteína de membrana externa da fímbria P), papGI/GII/GIII (alelos da
adesina papG), sfaD/E (região conservada sfa/foc de fímbria S), afaB/C (região
conservada chaperona âncora de adesina afimbrial), hlyA (proteína estrutural
hemolítica), iucD (oxigenase responsável pela biossíntese da aerobactina), usp
(proteína específica uropatogênica), vt1 e vt2 (genes codificadores para verotoxinas
dos tipos 1 e 2) e eae (gene codificador para eae - E. coli attachment and effacing). O
quadro 1 apresenta a seqüência de iniciadores, peso molecular e temperatura de
anelamento das reações de cada fator de virulência investigado.
Siqueira, A.K., 2006.
Quadro 1. Iniciadores utilizados para detecção de diferentes fatores de virulência em
linhagens de E. coli isoladas de infecção do trato urinário, piometra e fezes de cães,
utilizando a reação em cadeia pela polimerase. Botucatu, 2006.
GENE
SEQÜÊNCIA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS
(5’ – 3’)
TA*
(°C)
PRODUTO
AMPLIFICADO
(pb)
QUANTIDADE
INICIADORES
POR REAÇÃO
(ng/μg)
REFERÊNCIA
cnf1
CNF1: GAA CTT ATT AAG GAT AGT
CNF2: CAT TAT TTA TAA CGC TG
63 533 90
Blanco et al.,
1997
hlyA
1: AAC AAG GAT AAG CAC TGT TCT GGC T
2: ACC ATA TAA GCG GTC ATT CCC GTC A
63 1.177 60
Yamamoto et al.,
1995
papC
1: GAC GGC TGT ACT GCA GGG TGT GGC G
2: ATA TCC TTT CTG CAG GGA TGC AAT A
60 328 60
Daigle et al.;
1994
papG
classe
I
1: CAA CCT GCT CTC AAT CTT TAC TG
2: CAT GGC TGG TTG TTC CTA AAC AT
63 692 60
Karkkainem et
al., 1998
papG
classe
II
1: GGA ATG TGG TGA TTA CTC AAA GG
2: TCC AGA GAC TGT TCA AGA AGG AC
63 562 60
Karkkainem et
al., 1998
PapG
classe
III
PG1: CAT GGC TGG TTG TTC CTA AAC AT
PG2: TCC AGA GAC TGT GCA GAA GGA C
63 421 60
Karkkainem et
al., 1998
fimH
A: TGC AGA ACG GAT AAG CCG TGG
B: GCA GTC ACC TGC CCT CCG GTA
63 508 60
Johnson & Stell,
2000
afaB/C
1: GCT GGG CAG CAA ACT GAT AAC TCT C
2: CAT CAA GCT GTT TGT TCG TCC GCC G
76 750 60
Yamamoto et al.,
1995
sfaD/E
1: CGG AGG AGT AAT TAC AAA CCT GGC A
2: CTC CGG AGA ACT GGG TGC ATC TTA C
63 410 90
Daigle et al.,
1994
iucD
A: TAC CGG ATT GTC ATA TGC AGA CCG T
B: AAT ATC TTC CTC CAG TCC GGA GAA G
63 602 60
Yamamoto et al.,
1995
usp
A: ATG CTA CTG TTT CCG GGT AGT GTG T
B: CAT CAT GTA GTC GGG GCG TAA CAA T
66 1.000 60
Nakano et al.,
2001
vt1
A: AAG TTG CAG CTC TCT TTG AAT A
B: TGC AAA CAA ATT ATC CCC TGA G
53 364 90
Geniyi et al.,
1994
vt2
A: GGG CAG TTA TTT TGC TGT GGA
B: GTA TCT GCC TGA AGC GTA A
53 515 90
Geniyi et al.,
1994
eae
A: GAC CCG GCA CAA GCA TAA GG
B: CCA CCT GCA GCA ACA AGA GC
63 384 30
Yu & Kaper,
1992
*TA: Temperatura de anelamento
A tabela 1 apresenta os reagentes utilizados na PCR no diagnóstico de
fatores de virulência em E. coli isoladas de ITU, piometra e fezes de cães.
Siqueira, A.K., 2006.
Tabela 1. Reagentes para as reações de PCR na detecção de fatores de virulência de
E. coli isoladas de cão. Botucatu, 2006.
REAGENTES VOLUME (μl) CONCENTRAÇÃO FINAL
Água ultra-pura estéril (qsp) 30 -----
10X “PCR Buffer” (Fermentas) 3 1X
10mM “dNTP mixture”
(Fermentas)
0,6 0,2mM cada
“primer” 1 * -----
“primer” 2 * -----
50mM MgCl
2
(Fermentas) 1,2 2,0mM
DNA extraído 7 -----
“Taq-DNA Polimerase”
(Fermentas)
1 1,0U
TOTAL 30 -----
*Os inciadores foram preparados em uma concentração de 30ng/µl. De acordo com a necessidade de iniciadores para as
reações de PCR utilizou-se 1, 2 ou 3 vezes da concentração inicial.
As PCRs das soluções foram realizadas em termocicladores (GeneAmp®,
PCR System 9700 PE Applied Biosystems) programados para pré-aquecimento a
94°C/10 minutos e 30 ciclos de: 94°C/1 minuto, temperatura de anelamento de acordo
com o gene pesquisado, temperatura de extensão 72°C/2 minutos, seguida por 72°C/
7 minutos.
Siqueira, A.K., 2006.
4.7.4 Eletroforese em gel de agarose: Após realizadas as amplificações
dos DNAs bacterianos, às soluções foi adicionado 5μl de tampão de amostra (0,25%
de azul de bromofenol; 0,25% de xilenocianol e 25% de ficoll). O gel de agarose
(Amersham Pharmacia Biotech/Suécia) foi preparado em concentração 2,0% em TAE
(tampão Tris 2M, ácido acético 0,04M, EDTA 0,01M pH 8,0). Em cada poço do gel
foram dispostos 10μl da mistura.
As “corridas” foram realizadas em cubas de eletroforese Horizon® 11-14 ou
58, Life Technologies
TM
, Gibco BRL Horizontal Gel Electrophoresis Apparatus, com
100mV por 40 minutos e amperagem variável.
As bandas foram identificadas após incubação em solução de brometo de
etídio (1,5μg/ml), por 15 minutos, e visualizadas em transiluminador de luz UV. Os
géis foram fotografados e as imagens capturadas pelo sistema Image Master® VDS
(Pharmacia Biotech) e programa LISCAP-Capture Application, respectivamente.
4.8 Análise estatística
4.8.1 Cálculo amostral: O cálculo amostral foi fundamentado em
levantamento da casuística de ITU e piometra por E. coli, diagnosticada pelo Serviço
de Diagnóstico Microbiológico de Doenças Infecciosas dos Animais da FMVZ –
UNESP/Botucatu, SP, entre 1999 e 2004. O estudo acusou 435 animais com ITU e 87
com piometra, nos quais E. coli foi isolada em 20% do total de animais. Considerando-
se um erro de 5% e limite de confiança de 99%, foi estimada a amostragem mínima
estatística, determinando o estudo de 43 cães com ITU e 31 com piometra. Como
cães controle – amostras de material fecal – foi aconselhado o uso equivalente da
amostragem mínima de piometra, de 31 cães infectados por E. coli. Para a análise dos
resultados foi utilizado o programa EpiInfo 6.0 (Centers for Disease Control, Atlanta),
conforme descrito por Kish (1965).
4.8.2 Testes estatísticos: Os grupos com infecção do trato urinário,
piometra e controle foram comparados entre si, quanto à freqüência de caracteres
Siqueira, A.K., 2006.
fenotípicos, bem como quanto à freqüência de detecção de genes, utilizando o teste
de χ
2
, contrastando as freqüências entre grupos pelo cálculo do intervalo de confiança
95%. A freqüência de linhagens resistentes a um ou mais antimicrobianos foi
comparada entre os grupos pelo teste de Kruskall-Wallis. A associação entre
caracteres fenotípicos e a freqüência de genes específicos foi realizada pela análise
de regressão logística. Todos os cálculos foram realizados utilizando-se o programa
EpiInfo 6 (Centers for Disease Control, Atlanta), considerando um nível de significância
α=0,05 (Triola, 1999).
Siqueira, A.K., 2006.
5 RESULTADOS
Os dados de todos os animais utilizados no estudo, resultados dos exames
clínico-laboratoriais, detecção de hemolisinas, perfil de sensibilidade microbiana,
pesquisa de adesinas e fatores de virulência encontram-se sumariados no anexo B.
Nas tabelas 2, 3, e 4 e no quadro 3 são agrupados, respectivamente,
achados clínico-laboratoriais, hemolisina, perfil de sensibilidade das linhagens aos
antimicrobianos, adesinas e fatores de virulência.
Os achados dos exames clínico-laboratoriais dos cães com infecção do trato
urinário revelaram 17 (51,5%) dos animais com anemia, 11 (33,4%) com
trombocitopenia e 11 (33,4%) com leucocitose, dos quais 3 (9,0%) apresentaram
leucocitose por neutrofilia e 7(21,2%) leucocitose por neutrofilia e monocitose.
Nas cadelas com piometra observou-se anemia em 18 (69,2%) dos animais,
trombocitopenia em 13 (50,0%) e leucocitose em 20 (76,9%), dos quais 5 (19,2%)
leucocitose por neutrofilia e 15 (57,7%) leucocitose por neutrofilia e monocitose.
Ao compararmos os achados laboratoriais de hemograma entre os animais
com ITU e piometra, não observamos diferença estatística (p>0,05). Ao contrário, o
leucograma dos animais com ITU e piometra revelam diferença estatisticamente
significante (p<0,01) entre estes dois grupos (Tabela 2).
Siqueira, A.K., 2006.
Tabela 2. Achados hematológicos em cães com ITU e piometra por Escherichia coli.
Botucatu, 2006.
Grupo
Freqüencia (%)
Variáveis
ITU PIO
Estatística
Hemácias
Abaixo 17 (51,5%) 18 (69,2%)
Normal 16 (48,5%) 8 (30,7%)
p = 0,1337
Hematócrito
Abaixo 16 (48,5%) 18 (69,2%)
Normal 17 (51,5%) 8 (30,7%)
p = 0,0903
Plaquetas
Abaixo 11 (33,4%) 13 (50,0%)
Normal 17 (51,5%) 8 (30,7%)
Elevado 2 (6,0%) 0 (-)
p = 0,2533
Leucócitos***
Abaixo 6 (18,2%) 0 (-)
Normal 16 (48,5%) 3 (11,5%)
Elevado 11 (334%) 20 (76,9%)
p = 0,0001
Neutrófilos
Abaixo 2 (6,0%) 0 (-)
Normal 16 (48,5%) 2 (7,7%)
Elevado 15 (45,4%) 24 (92,3%)
p = 0,0008
Linfócitos
Abaixo 14 (42,4%) 3 (11,5%)
Normal 19 (57,6%) 21 (80,7%)
Elevado 0 (-) 2 (7,7%)
p = 0,0142
Monócitos***
Abaixo 2 (6,0%) 0 (-)
Normal 22 (66,7%) 11 (42,3%)
Elevado 9 (27,3%) 15 (57,5%)
p = 0,0402
*ITU: infecção do trato urinário
PIO: piometra
%: porcentagem
Valores de p menores que 0,05 indicam diferença estatística significante entre os grupos, considerando α=0,05
A presença de hemólise no meio de ágar sangue bovino (5%) foi observada
em 26 (51,0%) das linhagens de E. coli isoladas de ITU, 20 (38,5%) de piometra e em
nenhuma estirpe isolada de fezes (Tabela 3).
Siqueira, A.K., 2006.
Tabela 3. Freqüência de estirpes de Escherichia coli com presença de hemólise no
ágar sangue bovino (5%), isoladas de casos de ITU, piometra e das fezes de cães
sem diarréia. Botucatu, 2006.
Ocorrência de hemólise
Freqüencia (%)
Grupo
Sim Não
Total
ITU 26 (51,0%) 25 (49,0%) 51
PIO 20 (38,5%) 32 (61,5%) 52
Fezes 0 (-) 55 (100,0%) 55
Total 46 (29,1%) 112 (70,9%) 158
*ITU: infecção do trato urinário
PIO: piometra
%: porcentagem
Entre as linhagens isoladas de ITU e piometra não houve diferença
estatística (p>0,05) para a produção de hemolisina no meio de AS. Entretanto, foi
observada diferença estatística (p<0,05) entre o grupo controle e os isolados de ITU e
piometra.
Os maiores índices de sensibilidade das linhagens de E. coli isoladas de
ITU foram observados para gentamicina (70,6%), ciprofloxacina e norfloxacina, ambas
com 62,7% das estirpes sensíveis. Para piometra observou-se maior sensibilidade
para norfloxacina (98,1%), ciprofloxacina e enrofloxacina, ambas com 90,4%. Para o
grupo controle (fezes) os maiores índices de efetividade foram observados com o uso
da ciprofloxacina (92,7%), norfloxacina (92,7%) e florfenicol (90,9%). O maior índice
de resistência das linhagens foi observado com o uso de sulfametoxazole com
trimetoprim em 64,7% das linhagens de ITU, 73,1% de piometra e 61,8% das fezes
(Tabela 4, Gráfico 1).
Siqueira, A.K., 2006.
Tabela 4. Sensibilidade microbiana em estirpes de Escherichia coli isoladas de ITU,
piometra e das fezes de cães. Botucatu, 2006.
ITU piometra fezes
s ps r s ps r s ps r
Antimicrobianos
nº linhagens (%) n° linhagens (%) n° linhagens (%)
Ampicilina
16
(31,7)
6
(11,7)
29
(56,8)
32
(61,5)
5 (9,6)
15
(28,8)
49
(89,1)
0 (-)
6
(10,9)
Cefalexina
24
(47,0)
8
(15,7)
34
(66,7)
39
(75,0)
8
(15,4)
5 (9,6)
49
(89,1)
3 (5,4)
3
(5,4)
Ceftiofur
30
(58,8)
16
(31,4)
5 (9,8)
37
(71,1)
12
(23,1)
3 (5,7)
49
(89,1)
4 (7,2)
2
(3,6)
Ciprofloxacina
32
(62,7)
3 (5,9)
16
(31,4)
47
(90,4)
3 (5,7) 2 (3,8)
51
(92,7)
1 (1,8)
3
(5,4)
Enrofloxacina
31
(60,8)
4 (7,8)
16
(31,4)
47
(90,4)
4 (7,7) 1 (1,9)
49
(89.1)
3 (5,4)
3
(5,4)
Florfenicol
24
(47,0)
14
(27,4)
10
(19,6)
43
(82,7)
6
(11,5)
3 (5,7)
50
(90,9)
5 (9,1) 0 (-)
Gentamicina
36
(70,6)
6
(11,7)
9 (17,6)
33
(63,4)
14
(26,9)
5 (9,6)
33
(60,0)
17
(30,9)
5
(9,1)
Norfloxacina
32
(62,7)
3 (5,9)
16
(31,4)
51
(98,1)
0 (-) 1 (1,9)
51
(92,7)
1 (1,8)
3
(5,4)
Sulfametoxazol/
trimetoprim
18
(35,3)
0 (-)
33
(64,7)
14
(26,9)
0 (-)
38
(73,1)
21
(38,2)
0 (-)
34
(61,8)
*n°: número
ITU: infecção do trato urinário
%: porcentagem
s: sensível
ps: parcialmente sensível
r: resistente
Siqueira, A.K., 2006.
Gráfico 1. Perfil de sensibilidade microbiana em 158 estirpes de Escherichia coli
isoladas de ITU, piometra e das fezes de cães, segundo a porcentagem e os
diferentes grupos de estudo. Botucatu, 2006.
0
20
40
60
80
100
120
SPS RSPS RSPS R
PIOMETRA ITU FEZ ES
ANTIMICROBIANOS
%
A MPICILINA
CEFA LEXINA
CEFTIOFUR
CIPROFLOXACINA
ENROFLOXA CINA
FLORFENICOL
GENTAMICINA
NORFLOXA CINA
SULFAMETOXAZOLE/
TRIMETOPRIM
* %: porcentagem
ITU: infecção do trato urinário
s: sensível
ps: parcialmente sensível
r: resistente
A ocorrência de linhagens de E. coli resistentes a pelo menos três
antimicrobianos foi observada em 24 (47,1%) linhagens isoladas de ITU, 7 (13,5%) de
piometra e 4 (7,3%) de fezes (controle). Resistência a cinco ou mais drogas foi
constatada em 17 (33,3%) das estirpes isoladas de ITU, 1 (1,9%) de piometra e 3
(5,5%) de fezes (quadro 2).
Siqueira, A.K., 2006.
Quadro 2. Prevalência de multi-resistência in vitro a diferentes antimicrobianos em
estirpes de Escherichia coli, isoladas de casos de ITU, piometra e fezes de cães.
Botucatu, 2006.
multi-resistência a 3 ou mais*
antimicrobianos
multi-resistência a 5 ou mais**
antimicrobianos
Grupos
sim não sim não
ITU (n= 51)
24 (47,1%) 27 (52,9%) 17 (33,3%) 34 (66,7%)
PIOMETRA (n= 52)
07 (13,5%) 45 (86,5%) 01 (1,9%) 51 (98,1%)
FEZES (n= 55)
04 (7,3%) 51 (92,7%) 03 (5,5%) 52 (94,5%)
ITU: infecção do trato urinário
%: porcentagem
* Entre as E. coli isoladas de ITU, piometra e controle, houve diferença entre os grupos, com
X
2
= 27,68(p<0,0001)
** Entre as E. coli isoladas de ITU, piometra e controle, houve diferença entre os grupos, com
X
2
= 26,54(p<0,0001)
Houve diferença estatisticamente significante (p<0,0001) entre os grupos
para multi-resistência a três ou mais, ou a pelo menos cinco ou mais antimicrobianos.
O quadro 3 apresenta a freqüência de detecção dos genes para adesinas,
toxinas e outros fatores de virulência em estirpes de Escherichia coli isoladas de ITU,
piometra e fezes em cães.
A presença o gene fimH foi observado em mais de 90% da totalidade
linhagens de E. coli, nos três grupos de estudo. A subunidade fimbrial papC foi
observada em 12 (23,5%) das linhagens isoladas de ITU, 19 (36,5%) de piometra e 10
(18,2%) das estirpes do grupo controle. A subunidade papGI não foi observada em
nehuma linhagem, enquanto papGII foi constatada em 3 (5,8%) das linhagens
isoladas de piometra e não foi observada nos outros grupos. A subunidade papGIII foi
encontrada em 10 (19,6%) das estirpes de ITU, 15 (28,8%) de piometra e em 9
(16,4%) isoladas de fezes de cães sem sintomas entéricos. O gene sfa foi observado
em 22 (43,1%) linhagens isoladas de ITU, 24 (46,1%) de piometra e 19 (34,5%) de
Siqueira, A.K., 2006.
fezes. A adesina afimbrial (afa) foi encontrada em 1 (1,9%) estirpe de ITU e 1 (1,9%)
de piometra, não ocorrendo no grupo controle.
Dentre as toxinas investigadas, hemolisina (hlyA) foi observada em 17
(33,3%) das linhagens de ITU, 18 (34,6%) de piometra e em 7 (12,7%) das isoladas
das fezes. Não houve diferença estatística (p<0,05) entre a expressão do gene hlyA e
a presença de hemólise em agar sangue, entre as estirpes isoladas de piometra e
ITU.
O gene para o fator necrosante citotóxico (cnf-1) foi detectado em 11
(21,6%) das estirpes de ITU, 21 (40,4%) de piometra e 9 (16,4%) de fezes.
Para os outros fatores de virulência estudados foi constatado aerobactina
(iucD) em 12 (23,5%) das linhagens isoladas de ITU, 9 (17,3%) de piometra e 1
(1,8%) do grupo controle. A proteína específica uropatogênica (usp) foi detectada em
17 (33,3%) das estirpes de ITU e 36 (69,2%) de piometra, não sendo observado em
linhagens do grupo controle.
Para a detecção de E. coli enterohemorrágicas (relacionadas ao sorotipo
O157:H7 foram pesquisados genes codificadores da intimina determinada por eae e
verotoxinas (vt1 e vt2). Os três grupos utilizados foram negativos para estes fatores
de virulência.
Siqueira, A.K., 2006.
Quadro 3. Freqüência de detecção de genes de diferentes adesinas, toxinas e outros
fatores de virulência em estirpes de Escherichia coli isoladas de ITU, piometra e fezes
de cães (controle). Botucatu, 2006.
Genes ITU piometra controle
cnf-1
11 (21,6%) 21 (40,4%) 9 (16,4%)
iucD
12 (23,5%) 9 (17,3%) 1 (1,8%)
hlyA
17 (33,3%) 18 (34,6%) 7 (12,7%)
sfaS
22 (43,1%) 24 (46,1%) 19 (34,5%)
papC
12 (23,5%) 19 (36,5%) 10 (18,2%)
papGII
0 (0,0%) 3 (5,8%) 0 (0,0%)
papGIII
10 (19,6%) 15 (28,8%) 9 (16,4%)
usp
17 (33,3%) 36 (69,2%) 0 (-)
afa
1 (1,9%) 1 (1,9%) 0 (-)
vt1
0 (-) 0 (-) 0 (-)
vt2
0 (-) 0 (-) 0 (-)
eae
0 (-) 0 (-) 0 (-)
papGI
0 (-) 0 (-) 0 (-)
*ITU: infecção do trato urinário
%: porcentagem
Siqueira, A.K., 2006.
Tabela 5. Associações entre diferentes genes de fatores de virulência investigados em
linhagens de E. coli isoladas de ITU em cães. Botucatu, 2006.
sa*
cnf hly iuc usp
cnf,
usp
cnf,
hly
hly,
iuc
hly,
usp
iuc,
usp
cnf,
iuc,
usp
hly,
iuc,
usp
cnf,
hly,
iuc,
usp
TOTAL
sa*
25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25
papC
0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2
gIII
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
sfa
0 0 0 0 6 0 0 0 1 0 3 0 1 11
afa
0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
papC, gII
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
papC, gIII
0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
papC, sfa
0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 2
gIII, sfa
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 2
papC,
gIII, sfa
0 0 0 0 0 0 6 0 1 0 0 0 0 7
papC, gII,
gIII, sfa
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
TOTAL
25 0 1 3 6 0 6 0 4 0 5 0 1 51
*sa: sem associação
ITU: infecção do trato urinário
Tabela 6. Associações entre diferentes genes de fatores de virulência investigados em
linhagens de E. coli isoladas de piometra em cães. Botucatu, 2006.
*sa
cnf hly iuc usp
cnf,
usp
cnf,
hly
hly,
iuc
hly,
usp
iuc,
usp
cnf,
iuc,
usp
hly,
iuc,
usp
cnf,
hly,
iuc,
usp
TOTAL
sa*
22 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 22
papC
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1
gIII
0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1
sfa
0 0 0 0 3 2 0 0 0 1 4 0 0 10
afa
0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
papC,
gII
0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 2
papC,
gIII
0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 2
papC,
sfa
0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2
gIII, sfa
0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1
papC,
gIII, sfa
0 0 0 1 0 2 1 0 0 0 4 0 1 9
papC,
gII, gIII,
sfa
0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1
TOTAL
22 1 0 2 4 5 3 1 0 2 10 1 1 52
*sa: sem associação
ITU: infecção do trato urinário
Siqueira, A.K., 2006.
Tabela 7. Associações entre diferentes genes de fatores de virulência investigados em
linhagens de E. coli isoladas fezes de cães sem sintomas entéricos. Botucatu, 2006.
*sa
cnf hly iuc usp
cnf,
usp
cnf,
hly
hly,
iuc
hly,
usp
iuc,
usp
cnf,
iuc,
usp
hly,
iuc,
usp
cnf,
hly,
iuc,
usp
TOTAL
sa*
45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 45
papC
0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
gIII
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
sfa
0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0
afa
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
papC, gII
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
papC,
gIII
0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1
papC,
sfa
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
gIII, sfa
0 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 3
papC,
gIII, sfa
0 1 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 5
papC,
gII, gIII,
sfa
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
TOTAL
45 2 0 1 0 0 7 0 0 0 0 0 0 55
*sa: sem associação
Das 158 linhagens de E. coli estudadas, em 105 (66,4%) foi detectado pelo
menos um gene investigado e, em 66 (41,7%) pelo menos dois genes. Em 53 (33,5%)
das linhagens não foi constatado nenhum fator de virulência dentre os investigados no
estudo (Tabelas 5, 6 e 7; Anexo B).
Dentre todos os genes estudados, foi significativa (p<0,05) a associação
entre cnf-1, iucD, hlyA, papGII e usp nas 158 linhagens de E. coli (Tabelas 6, 7 e 8).
Entre as linhagens de ITU e piometra, a maior diferença foi observada quanto à
detecção do gene usp (p=0,002) presente em 33,3% das estirpes de ITU e 69,2% de
piometra.
A detecção de cnf-1, hly, sfa, papGII e usp foi estatisticamente significante
(p<0,05) nas linhagens isoladas de ITU ou piometra, comparativamente aos isolados
das fezes.
Siqueira, A.K., 2006.
A detecção de iucD e hlyA foi estatisticamente significativa (p<0,05) nas
linhagens com hemólise no meio de ágar sangue.
Ocorreu associação significante (p<0,05) para a presença e iucD, usp e a
multi-resistência a três ou mais antimirobianos. A multi-resistência a cinco ou mais
antimicrobianos também mostrou associação significante (p<0,05) com a presença
dos genes iucD e usp.
Siqueira, A.K., 2006.
6 DISCUSSÃO
As infecções bacterianas do trato urinário e genital dos cães estão entre as
afecções mais comumente diagnosticadas na clínica de pequenos animais. Estas
infecções podem se apresentar de forma assintomática ou até sob a forma de sinais
sistêmicos severos (Greene, 2006). Diversos autores afirmam que E. coli é o principal
microrganismo envolvido na gênese destas enfermidades.
Dentre os órgãos do sistema urogenital, a vagina, o prepúcio e a uretra
distal contém microrganismos residentes que desempenham papel fundamental na
defesa do hospedeiro, mantendo o equilíbrio da microbiota local. Entretanto, em
determinadas situações também podem causar infecções. Bactérias não são
normalmente encontradas em trato urinário superior, bexiga, uretra proximal ou
próstata. O útero também é geralmente livre de microrganismos, exceto durante as
fases do proestro e estro (Greene, 2006).
O desenvolvimento das infecções urogenitais geralmente indica
desequilíbrio entre a microbiota residente e o hospedeiro. Para que a infecção
efetivamente ocorra, as bactérias colonizam a mucosa se aderindo ao epitélio. As
propriedades de virulência de E. coli são fundamentais para a viabilidade do agente
no ambiente extra-entérico e para a severidade dos processos urogenitais (Greene,
2006).
O estreito contato entre o homem e animais domésticos gera condições
favoráveis para a transmissão de bactérias por contato direto, ou através de
contaminação ambiental. As crianças têm maior risco de se infectarem do que os
adultos por estabelecerem relações mais íntimas com os cães e gatos, por hábitos
precários de higiene e também pela maior exposição ao ambiente contaminado
(Guardabassi et al., 2004).
O reconhecimento dos fatores de virulência de E. coli relacionados à
patogenicidade de infecções em cães contribui no entendimento da epidemiologia do
agente, na adoção de medidas de controle, assim como dos reflexos em saúde
Siqueira, A.K., 2006.
pública em face do estreito contato do homem com animais de companhia. Neste
contexto foi proposto o presente estudo procurando avaliar, comparativamente, os
principais fatores de virulência de linhagens de E. coli isoladas de ITU, piometra e
fezes de cães.
Ao investigarem os achados hematológicos de cães com ITU atendidos em
hospitais e clínicas nos EUA, Barsanti & Finco (1979) observaram que os animais com
infecções na bexiga ou uretra apresentavam valores hematológicos usualmente
normais. No mesmo estudo foi constatado que cães com infecções crônicas renais ou
prostáticas também apresentavam hemogramas normais. Entretanto, ao investigarem
cães com pielonefrite, prostatite bacteriana aguda ou com abcessos prostáticos,
freqüentemente se depararam com leucocitose por neutrofilia. Cetin et al. (2003) na
Turquia, assinalaram a leucocitose entre 17.000 e 22.000céls/µl como o achado
hematológico mais freqüente em 100 cães com sinais de ITU.
No presente estudo, 11 (33,4%) animais com ITU apresentavam
leucocitose por neutrofilia, variando entre 17.000 e 30.000céls/µl. Em consonância
com esses resultados, Nelson & Couto (2003), também assinalaram a leucocitose por
neutrofilia como achado clínico-laboratorial mais significativo em cães com ITU. Tais
resultados provavelmente encontram justificativa no grande afluxo de células
inflamatórias, principalmente neutrófilos, relacionados às infecções bacterianas em
órgãos internos, caracterizadas, hematologicamente, por leucocitose por neutrofilia
(Stockham & Scott, 2002; Fransson, 2003).
Na literatura consultada são escassas as citações a respeito de anemia e
trombocitopenia em animais com infecção do trato urinário. Dentre os 51 animais com
ITU estudados, 51,5% apresentaram-se anêmicos e 33,4% com trombocitopenia. A
presença de trombocitopenia nos cães com ITU poderia ser justificada pela redução
no número destas células em infecções bacterianas graves. Nesses casos, a redução
do número de plaquetas decorre de mecanismos multi-fatoriais, incluindo supressão
da medula óssea por mediadores químicos da inflamação, alterações na
megacariocitopoiese ou trombopoiese e/ou infecção direta de megacariócitos ou
precursores hematopoiéticos (Stockham & Scott, 2002).
Siqueira, A.K., 2006.
A anemia nos animais com ITU se reflete na presença de doença crônica,
sendo reconhecida como anemia da inflamação. Esta é justificada pela liberação de
mediadores químicos da inflamação, alterações na mobilização e utilização de ferro,
além de modificação na produção e na estrutura da membrana de eritrócitos, que
induzem a redução da vida média na circulação e/ou na produção de hemácias na
medula óssea (Feldman et al., 2000; Stockham & Scott, 2002; Fransson, 2003).
À semelhança das ITU em cães, Nelson & Feldman (1986) relataram
aumento nas contagens de leucócitos em cadelas e gatas com piometra, com valores
acima de 30.000céls/µl, decorrentes fundamentalmente, de neutrofilia. No mesmo
estudo, também observaram anemia normocítica normocrômica que retornou a
normalidade com o tratamento da piometra. Ao estudarem 112 cadelas com piometra,
Schepper et al. (1987) encontraram 69% dos animais com anemia e 42,8% com
leucocitose, mostrando valores entre 22.000 e 44.000céls/µl. Monocitose foi
observada com maior freqüência nos animais que apresentaram anemia e leucocitose
como achados de hemograma.
Kaymaz et al. (1999) encontraram 73,3% de leucocitose e 26,6% de
anemia em 18 cadelas com piometra. Faldyna et al. (2001) em um grupo de 34
cadelas com piometra descreveram leucocitose por neutrofilia e monocitose em 62%
dos animais. Bigliardi et al. (2004) relataram neutrofilia (15.000 – 60.000céls/µl) em
75% de 45 cadelas. Os outros parâmetros hematológicos estavam dentro da
normalidade.
No presente estudo as 52 cadelas com piometra estudadas revelaram
anemia em 69,2% e leucocitose em 76,9%, dos quais 57,7% apresentaram neutrofilia
e monocitose. No Brasil, Prestes et al. (1991) investigando 25 casos de piometra em
cães também ressaltaram a alta ocorrência de leucocitose no hemograma dos
animais. Nelson & Couto (2003) afirmaram que a leucocitose por neutrofilia e
monocitose, além de anemia são os achados mais comuns da piometra em cadelas.
À semelhança das ITUs em cães, a ocorrência de leucocitose por
neutrofilia nas fêmeas encontra reflexo no elevado afluxo destas células em
processos inflamatórios em órgãos e tecidos (Stockham & Scott, 2002; Fransson,
Siqueira, A.K., 2006.
2003). A presença de monocitose em grande parte dos animais provavelmente
decorre do aumento destas células em processos infecciosos de evolução crônica
(Feldman et al., 2000; Stockham & Scott, 2002).
A trombocitopenia foi encontrada em metade dos animais com piometra
(50,0%). Apesar deste resultado, este achado não tem sido citado por outros autores.
À semelhança da leucocitose por neutrofilia, a trombocitopenia pode ocorrer em
processos infecciosos graves decorrentes da liberação de mediadores químicos da
inflamação, alterações na trombocitopoiese e megacariocitopoiese e/ou infecção
direta de megacariócitos ou precursores hematopoiéticos (Stockham & Scott, 2002).
O conjunto destes resultados hematológicos no presente estudo sugerem
que a presença de leucocitose por neutrofilia, aliada a trombocitopenia, poderiam ser
indicativos de casos graves de piometra em cadelas por E. coli. Tais achados
poderiam ser utilizados no estabelecimento do prognóstico dos animais e na decisão
de resolução cirúrgica e/ou terapêutica dos casos.
A terapia dos casos de ITU e piometra em cães é fundamentada na
utilização de antimicrobianos. Entretanto, nos casos mais graves ou crônicos de
piometra indica-se a resolução cirúrgica do processo, preconizando a OSH. Tanto na
ITU como na piometra a terapia deveria ser instituída com base no teste de
sensibilidade microbiana. Pressupõe-se que as drogas de escolha para a terapia
devem apresentar amplo espectro, custo acessível, indicação por via intra-venosa
(casos de septiemia) e bons índices terapêuticos no trato genito-urinário (Tavares,
2003).
A despeito destas características do antimicrobiano ideal, por questões
econômicas, desconhecimento técnico ou mesmo dificuldade de acesso a
laboratórios, a escolha dos antimicrobianos recai na experiência profissional ou no
apelo comercial de determinados produtos. Cresce também, de forma preocupante, a
indicação destes fármacos por práticos que atuam em estabelecimentos comerciais
do ramo de animais de companhia. Neste sentido, o uso indevido e indiscriminado dos
antimicrobianos (sub-doses, superdoses, descontinuidade da terapia e “promotores de
crescimento”) podem aumentar a pressão seletiva para linhagens multi-resistentes.
Siqueira, A.K., 2006.
Como conseqüência, o consumo de alimentos contaminados ou mesmo o contato
estreito com animais de companhia pode aumentar o risco de infecção do homem por
bactérias multi-resistentes.
A resistência aos antimicrobianos tem sido reconhecida como problema
emergente tanto na medicina humana como na veterinária. Existem quatro
mecanismos principais de resistência, regulados por genes específicos: inativação ou
modificação enzimática dos antimicrobianos, impermeabilidade da parede ou
membrana bacteriana, expulsão ativa da droga por bomba de efluxo e alteração dos
receptores alvo. As bactérias adquirem genes de resistência aos antimicrobianos por
plasmídeos, transposons e integrons, que resultam em mutações nos genes
responsáveis pelos sítios de ligação com as drogas ou na ativação de porções do
cromossomo bacteriano. Uma vez adquiridos estes genes de resistência podem ser
transferidos entre bactérias. Neste sentido, a habilidade de E. coli na transferência de
resistência às drogas é motivo de preocupação continuada na área médica (George,
1996; Mateu & Martin, 2001; Poletto & Reis, 2005; Sayah et al., 2005).
Dentre os antimicrobianos utilizados no presente estudo, as fluorquinolonas
(ciprofloxacina, norfloxacina e enrofloxacina) e gentamicina foram os antimicrobianos
mais efetivos nas linhagens de E. coli (Tabela 4). Yates (1996) estudando 30 cadelas
com piometra também evidenciaram alta sensibilidade de E. coli a enrofloxacina e
gentamicina. Villarroel et al. (2002), na Venezuela, investigando o perfil de
sensibilidade de 538 estirpes de E. coli isoladas de cães com ITU observaram boa
sensibilidade dos agentes para gentamicina, ampicilina e fluorquinolonas. Esses
resultados são equivalentes ao presente estudo, com exceção da ampicilina que
apresentou 28% ou mais de resistência nas estirpes isoladas de ITU e piometra.
Nos animais é notória a preocupação nos últimos anos com estudos
envolvendo o perfil de sensibilidade de agentes aos antimicrobianos, assim como a
emergência de linhagens multi-resistentes. Sanchez et al. (2002) estudando 21
linhagens de E. coli isoladas de urina de cães observaram resistência para
sulfonamidas, tetraciclinas, cefalosporinas e gentamicina. Contrariamente, no
Siqueira, A.K., 2006.
presente estudo, a gentamicina foi uma droga eficaz para ITU, com mais de 70% de
sensibilidade das linhagens.
Sayah et al. (2005) observaram as fluorquinolonas como o grupo de drogas
mais eficazes no tratamento de infecções por E. coli. Estes dados são concordantes
com o presente estudo uma vez que ciprofloxacina e norfloxacina aparecem como as
drogas mais eficientes frente às estirpes de E. coli nos três grupos de estudo. A maior
sensibilidade às fluorquinolonas pode ser explicada pelo fato de serem drogas
relativamente novas (20 anos) para a medicina veterinária, o que se traduz por pouco
tempo de exposição dos animais se comparado com outras drogas do mercado. No
entanto, diversos autores têm relatado aumento crescente de resistência de E. coli
frente as fluorquinolonas em outros países (Sárkozy, 2001; Webber & Piddock, 2001;
Trott et al., 2004), fato que discorda dos achados do presente estudo, no qual as
fluorquinolonas foram as drogas mais eficazes nos três grupos.
No Brasil, Von Sydow (2005) avaliando linhagens de E. coli isoladas de
fezes de cães errantes observou 100% de sensibilidade para norfloxacina, 87,18%
para enrofloxacina e 73,58% para gentamicina, resultados que assemelham-se com o
perfil de sensibilidade do presente estudo. No entanto, os autores observaram alta
sensibilidade das estirpes frente a sulfametoxazole (75,6%), resultado que distoa do
presente estudo, no qual o fármaco mostrou baixa efetividade.
Adicionalmente, a presença de linhagens de E. coli multi-resistentes aos
antimicrobianos em animais de companhia, ressalta para os reflexos em saúde
pública, em virtude do risco de transmissão dessas bactérias dos animais para o
homem, em face do estreito contato com esta espécie animal. Neste contexto,
Maynard et al. (2004) referiram o isolamento de linhagens de E. coli multi-resistentes
de suínos e de seus proprietários (incluindo familiares), após a introdução da
estreptomicina como “promotor de crescimento” na suinocultura. O conjunto destes
dados sugere que os animais de produção e de companhia podem atuar como fontes
de infecção de E. coli multi-resistentes para o homem, fato reforçado pela semelhança
filogenética, patotípica e genotípica entre ExPEC isoladas de homens e animais
(Maynard et al., 2004; Guardabassi et al., 2004).
Siqueira, A.K., 2006.
Estudo investigando o perfil de sensibilidade microbiana de E. coli isoladas
de fossas domésticas, animais domésticos e selvagens, ambiente e água de rio em
Michigan, USA, encontrou maiores taxas de resistência das linhagens com o uso de
cefalosporinas (20,5%), tetraciclinas (28,1%) e sulfonamidas (13,9%). No mesmo
estudo, os autores alertaram para a multi-resistência a três ou mais antimicrobianos
em 4,3% das estirpes (Sayah et al., 2005). Estes resultados concordam com os
encontrados nas 158 estirpes de E. coli, nos quais as sulfonamidas e derivados β-
lactâmicos também apresentaram as maiores taxas de resistência, com 7,3% dos
isolados resistentes a três ou mais antimicrobianos e 5,5% das estirpes a cinco ou
mais drogas.
Esses resultados assinalam de forma preocupante a ocorrência de multi-
resistência de linhagens de E. coli isoladas de ITU e piometra em cães. Salienta-se
assim, a importância da realização dos testes de sensibilidade microbiana
previamente a instiuição da terapia, com vistas a atingir melhor efetividade e
minimizar os riscos com a presença de estirpes multi-resistentes.
Os estudos de transmissão cruzada de E. coli patogênicas, multi-
resistentes, entre o homem e os animais também têm sido motivo de preocupação
entre os pesquisadores.
Maynard et al. (2004) investigando ExPEC isoladas de diferentes espécies
animais e do homem, descreveram 60% de resistência às sulfonamidas e acima de
50% para tetraciclinas e ampicilina. A multi-resistência a três ou mais drogas foi
observada em mais de 50% dos isolados, mostrando a similaridade de resistência
entre estirpes isoladas de homens e animais. Sáenz et al. (2004) avaliando 515 E. coli
isoladas de produtos de origem animal e de fezes de animais saudáveis e de homens,
encontraram 17 estirpes multi-resistentes (até sete antimicrobianos), especialmente
com o uso da ampicilina e sulfametoxazole. Estes dados são similares aos obtidos no
presente estudo no qual 24 (47,1%) das estirpes de ITU e 07 (13,5%) de piometra
foram resistentes à pelo menos três drogas, e 17 (33,3%) linhagens de ITU e 1 (1,9%)
de piometra resistentes a cinco ou mais drogas.
Siqueira, A.K., 2006.
Matute et al. (2004) estudando 35 E. coli isoladas de ITU de pacientes na
Nicaraguá observaram 74% de resistência à amoxicilina e 63% para sulfatrimetoprim.
Gentamicina foi efetiva em 88% das linhagens e ciprofloxacina em 70% dos isolados.
Estes dados são similares aos obtidos nos cães do presente estudo, reforçando a
similaridade entre as estirpes de E. coli isoladas do homem e animais.
Os estudos de vigilância são métodos de grande utilidade para se
determinar as tendências da sensibilidade antimicrobiana das bactérias. Porém, estes
estudos possuem validade temporal devido a capacidade das bactérias em
desenvolverem mecanismos de resistência aos antimicrobianos. Esta realidade
pressupõe a necessidade de estudos continuados de sensibilidade bacteriana,
especialmente para E. coli, em virtude dos diferentes mecanismos de resistência do
agente e da possibilidade de transmissão destes fatores de virulência entre a espécie
e, até mesmo, para outros gêneros (Villarroel et al., 2002).
A patogenicidade de estirpes de E. coli causadoras de piometra é
semelhante às estirpes isoladas de infecções do trato urinário, no que tange aos
fatores de virulência (Greene, 2006).
O desenvolvimento de infecções em sítios extra-intestinais por E. coli
depende de mecanismos de aderência, invasão, replicação nas células do hospedeiro
e produção de diferentes toxinas. Tais mecanismos são denominados fatores de
virulência (Sousa, 2006). Dentre os principais fatores de virulência podem ser
mencionados os sistemas de aderência (fimH, papC e G, sfaS e afa), de captação de
ferro (iucD), toxinas (hlyA e cnf-1), além de proteínas que auxiliam na infectividade
das UPEC (usp).
A similaridade entre a ocorrência de genes fimH, papC, sfaS, afa, hlyA e
cnf-1 isoladas de ITU e piometra em cães e a prevalência dos mesmos genes em
isolados de ITU no homem, sugerem que os mecanismos de virulência das bactérias
causadoras de infecções uterinas são similares aos requeridos para ITUs no homem e
nos cães (Chen et al., 2003).
Siqueira, A.K., 2006.
Nas infecções extra-intestinais o fenômeno da aderência de E. coli às
células epiteliais é fundamental na patogenicidade do agente. A aderência é mediada
por proteínas denominadas adesinas que podem ou não estar associadas com
fímbrias (Garcia & Le Bouguénec, 1992).
Em estudos com cães, gatos, aves e o homem, o gene codificador para a
adesina fimH foi encontrado em mais de 80% das estirpes isoladas. Este achado é
similar ao encontrado nos três grupos de E. coli estudados (ITU, piometra e fezes de
animais saudáveis), ratificando a importância desta adesina na virulência de afecções
extra-intestinais nos animais e no homem (Yamamoto et al., 1995; Andreu et al., 1997;
Yuri et al., 1998; Chen et al., 2003; Johnson et al., 2003; Tiba, 2004; Rodríguez-Siek
et al., 2005; Freitag et al., 2005; Santo et al., 2006).
De maneira similar, fimH também foi dectado em mais de 90% dos isolados
dos três grupos. No entanto, a importância desta adesina na patogenicidade das
UPECs torna-se questionável visto que é observada em mais de 90% dos isolados de
fezes. Diversos autores também referem esta fímbria no epitélio bucal e em vasos
sangüíneos (Johnson, 1991). Assim, permenace não totalmente esclarecida a
participação de fímbria do tipo 1 na virulência de UPEC nos cães, a despeito da sua
relevância como mecanismo de aderência (Mulvey et al., 2002; Oelschlaeger et al.,
2002).
Pili associado com pielonefrite (pap) ou fímbria P é formado por duas
subunidades mais comumente investigadas, denominadas papC e papG (Tiba, 2004).
Estudo conduzido na investigação de papC em mulheres com ITU revelou
a presença da fímbria em 23% de E. coli isoladas (Andreu et al., 1997). No Brasil,
Coogan et al. (2004) encontraram papC em 39,1% das estirpes de E. coli isoladas de
cadelas com piometra, enquanto Von Sydow (2005) detectou o gene papC em 19,4%
de estirpes de E. coli isoladas das fezes de cães. Estes dados assemelham-se aos
obtidos nas 158 linhagens estudadas, nas quais foi detectado gene papC em 23,5%
das linhagens isoladas de ITU, 36,5% de piometra e 18,2% das fezes. Contudo,
outros estudos encontraram maior prevalência de papC em isolados de cães com ITU
(Yuri et al., 1998; Féria et al., 2001b; Johnson et al. 2003). A similaridade dos estudos
Siqueira, A.K., 2006.
com fímbria P em linhagens isoladas de afecções genito-urinárias no homem e
animais reforçam o postulado que as bactérias causadoras de ITU e piometra
descendem de um mesmo clone bacteriano, assim como a preocupação com o cão
como reservatório de estirpes patogênicas para o homem.
No homem, outros autores encontraram o gene codificador para papC de
E. coli em maiores índices, comparativamente ao presente estudo, principalmente em
casos de ITU e nas fezes (Le Bouguénec et al., 1992; Yamamoto et al., 1995; Blanco
et al., 1995; Tiba, 2004; Rodriguez et al., 2004; Santo et al., 2006). Estes resultados
apontam para maior participação de papC na patogenicidade das estirpes de E. coli
das infecções urinárias no homem.
A adesina papG localiza-se na fímbria P. É composta por três variantes, das
quais GI tem sido detectada predominantemente nas fezes, GII na pielonefrite e GIII
em casos de cistite (Johnson, 1991; Johnson et al., 2002; Mulvey et al., 2002; Tiba,
2004)
A fração papGI foi observada em baixa freqüência por diversos autores em
linhagens isoladas de ITU em cães, gatos e no homem (Féria et al., 2001a; Johnson
et al., 2001; Tiba, 2004), variando entre 0 e 6% de ocorrência. No tocante aos
isolados de piometra canina, Chen et al. (2003) não observaram a expressão deste
alelo. Em estudos investigando a expressão de papGI em isolados das fezes de cães
e aves, foi constatada baixa freqüência deste gene (Rodriguez-Siek et al., 2004). Nas
158 linhagens estudadas papGI, não foi detectada em nenhuma das linhagens dos
animais. Estes resultados sugerem a baixa participação deste alelo de pap nas
linhagens UPEC e em fezes na espécie canina.
A variante papGII é o alelo associado com pielonefrite, uma das mais
graves complicações clínicas de ITU. A expressão deste alelo foi observada em 13%
de isolados de E. coli na ITU felina (Freitag et al., 2005), em 22% de ITU canina (Féria
et al., 2001a) e em mais de 17% de ITU humana (Tiba, 2004; Rodriguez-Siek et al.,
2005). No presente estudo não foi encontrada a seqüência gênica de GII em
linhagens de ITU. Como não foi realizada a diferenciação entre as manifestações
Siqueira, A.K., 2006.
clínicas de ITU, não é possível afirmar que os animais estudados não apresentaram
pielonefrite pelo fato dos isolados não possuírem papGII. Entretanto, diferentemente
de Chen et al. (2003) que não observaram o alelo GII em isolados de piometra canina,
o presente estudo revelou 5,8% dos isolados de piometra com este gene. Cabe
salientar que a síndrome piometra em cães manifesta-se clinicamente de forma
severa, principalmente com a tendência a cronicidade do processo. A pielonefrite é
reconhecida como uma das graves complicações da piometra, o que justificaria, em
parte, a presença de GII em determinadas estirpes isoladas.
Nos isolados de E. coli das fezes dos cães estudados não foi observado a
presença de GII. Este resultado também foi assinalado em estudos similares em cães
em outros países (Johnson et al., 2003; Chen et al. 2003). Em fezes de aves,
Rodriguez et al. (2005) encontraram este alelo em 39,1% das linhagens de E. coli.
Estes dados reforçam a baixa expressão de GII em isolados de fezes de cães,
comparativamente a ocorrência do gene na pielonefrite em cães ou em isolados de
fezes de aves.
O alelo papGIII, predominantemente relacionado à cistite no homem e
animais, foi encontrado no presente estudo em 19,6% dos isolados de ITU. Tiba
(2004) e Rodriguez-Siek et al. (2005) observaram resultados similares ao encontrarem
GIII, respectivamente, em 14,2% e 25,5% de isolados de E. coli em homens
acometidos de ITU. Outros estudos referem variações entre 33 a 100% de expressão
de GIII em isolados de felinos, cães e homem (Féria et al., 2001a; Féria et al., 2001b;
Freitag et al., 2005). Para os animais estudados com piometra, foram encontrados
28,8% das estirpes que possuíam GIII. A baixa ocorrência de GIII nas linhagens de E.
coli estudadas oriundas de ITU e piometra sugere a participação de outras fímbrias
nas infecções gênito-urinárias em cães. Adicionalmente, não há evidências concretas
da presença de receptores para papGIII no endométrio, o que minimizaria o efeito
desta fímbria na patogenicidade das E. coli no ambiente uterino (Chen et al., 2003).
No entanto, vale destacar que 16,4% das estirpes do grupo controle,
isolados das fezes, foram positivas para GIII, salientando a importância da microbiota
Siqueira, A.K., 2006.
intestinal como reservatório de UPEC para os cães e para o homem. Segundo
Johnson et al. (2001), a presença de papGIII associada com cistites no homem e nos
cães é o principal argumento para considerar o cão como reservatório de ExPEC para
o homem, ressaltando, conseqüentemente, os reflexos desta espécie animal como
portadores de linhagens virulentas para o homem.
A fímbria s é composta por subunidades, sendo sfaS a subunidade
localizada na extremidade distal e responsável pela interação da bactéria com o
epitélio renal e bexiga (Mulvey et al., 2002).
No homem, a expressão desta subunidade sfaS tem sido evidenciada em
mais de 20% de isolados de E. coli em pacientes no Brasil (Tiba, 2004) e em outros
países (Yamamoto et al., 1995; Yuri et al., 1998; Féria et al., 2001b; Johnson et al.,
2003; Rodriguez et al., 2005; Freitag et al., 2005). No presente estudo, foram
encontrados resultados similares visto que em 43,1% dos isolados de ITU foi
detectado o gene da subunidade sfaS. À semelhança dos casos de ITU, nos animais
com piometra sfaS foi detectado em 46,1%, achado que está em consonância com
outros estudos no Brasil (Coogan et al., 2004) e em outros países (Chen et al., 2003),
que também têm observado estreita relação entre a expressão gênica da fração sfaS
e a ocorrência de piometra em cães.
O gene codificador da fímbria s também tem sido observado em isolados
fecais no homem e animais. O presente estudo revelou que 34,5% das estirpes
isoladas do grupo controle possuíam sfaS. Estudos similares em fezes de cães no
Brasil (Von Sydow, 2005) e em outros países (Yuri et al., 1998; Chen et al., 2003)
revelaram sfaS em mais de 27% das estirpes de E. coli. Em fezes humanas, a
expressão de sfaS foi observada em 14% das linhagens do agente (Yamamoto et al.,
1995).
Diferentemente da fímbria P, na qual as frações GI, GII e GIII foram
identificadas em baixas freqüências ou mesmo não foram detectadas nos três grupos
de estudo, o gene da fração sfa da fímbria S apresentou elevada relação com animais
acometidos por ITU e piometra. Estes achados denotam a relevância deste fator de
Siqueira, A.K., 2006.
virulência na patogenicidade de E. coli nestas formas clínicas de infecções extra-
intestinais, assim como reforçam a provável origem entérica das linhagens de E. coli
encontradas em infecções gênito-urinárias em cães.
A adesina afa (afimbrial) foi encontrada em menor freqüência no presente
estudo, cerca de 1,9% de isolados de ITU e piometra e em nenhuma estirpe isolada
das fezes. Ao contrário, em isolados de ITU no homem esta adesina tem sido
observada em porcentagens iguais ou superiores a 64% (Yamamoto et al., 1995;
Mulvey et al., 2002; Tiba, 2004). Estas adesinas possuem como receptor um antígeno
do grupo sangüíneo Dr bem caracterizado no homem (Mulvey et al, 2002; Tiba, 2004).
A ausência deste grupo sangüíneo em cães provavelmente justifique a baixa relação
desta adesina com a ocorrência de infecções gênito-urinárias por E. coli em cães, ou
mesmo em outras espécies domésticas.
Além da fímbria P, fímbria S e adesina afimbrial referidas como fatores de
virulência de UPEC, o presente estudo investigou o gene codificador da intimina eae.
Esta adesina é codificada por linhagens de E. coli diarreiogênicas e também pelo
sorotipo O157:H7, relatado como doença emergente no homem, em face da
ocorrência de colite hemorrágica, trombocitopenia e SUH, geralmente fatal em
crianças (Ribeiro, 2001; Rangel et al., 2002). Os bovinos são reconhecidos como a
principal fonte de infecção do sorotipo O157:H7. No entanto, com o aumento da
criação de cães e o estreitamento de contato com o homem, esta espécie animal
poderia representar um elo na cadeia epidemiológica da doença. Contudo, o gene eae
não foi detectado em nenhuma estirpe do presente estudo. Porém, Dantas (2002)
observou mais de 5% de E. coli isoladas de crianças e cães no Brasil, com ou sem
diarréia, carreando este gene. Entretanto, no mesmo estudo não foi observada
associação com verotoxinas, o que indicaria a presença de outras DAEC não
pertencentes ao sorotipo O157:H7. Apesar da ausência do gene eae nos 158
isolados de E. coli de cães, faz-se imprescindível a vigilância continuada do sorotipo
O157:H7 em diversas espécies domésticas no intuito de esclarecer a epidemiologia
da doença no Brasil.
Siqueira, A.K., 2006.
As linhagens de E. coli que promovem infecções extra-entéricas
necessitam de mecanismos adicionais de virulência para manter-se viáveis, incluindo
a lise de células inflamatórias e a captação exógena do íon ferro.
A hemolisina é uma citolisina capaz de lisar eritrócitos, leucócitos, células
endoteliais e renais, favorecendo a infecção do agente (Johnson et al., 1991; Reingold
et al., 1999; Emody et al., 2003; Tiba, 2004; Trabulsi, 2005). Ao lisar eritrócitos capta o
ferro exógeno, elemento necessário ao metabolismo bacteriano (Quinn & Carter,
1994). No presente estudo, o gene codificador para hemolisina (hlyA) foi encontrado
em ITU e piometra em cerca de 33% dos isolados (Quadro 3). Estes dados são
similares aos relatados por Garcia & Le Bougénec (1996), Tiba (2004) e Rodriguez et
al. (2005) que encontraram 30%, 25,3% e 31%, respectivamente, em isolados de ITU
em homens. Em cães e gatos diferentes estudos têm apontado a expressão do gene
hlyA em níveis iguais ou superiores a 41% (Yamamoto et al., 1995; Yuri et al., 1998;
Féria et al., 2001b; Johnson et al., 2003; Freitag et al., 2005), valores semelhantes
aos detectados nas 158 linhagens de E. coli estudadas.
À semelhança dos animais com ITU, 34,6% das linhagens isoladas de
piometra possuíam hlyA. Este resultado concorda com os achados de Chen et al.
(2003), que encontraram 52% de estirpes de E. coli isoladas de piometra, contendo o
gene hlyA.
As linhagens isoladas das fezes foram o grupo de estudo que apresentou a
menor expressão do gene hly, detectado em 12,7% dos isolados. Garcia & Lê
Bouguénec (1996) obtiveram resultados equivalentes avaliando a presença de hly em
E. coli isoladas das fezes de pacientes humanos. Também em pacientes humanos,
Orskov et al. (1988) e Yamamoto et al. (1995) identificaram o gene hly em,
respectivamente, 19,6% e 18% dos isolados. Em estudos com cães em outros países,
Yuri et al. (1998) e Chen et al. (2003) encontraram a expressão do gene hly em
valores superiores ao obtido no presente estudo, respectivamente, em 31% e 25%
dos isolados.
Siqueira, A.K., 2006.
Foi estatisticamente significante (p<0,05) a presença do gene hlyA nas
linhagens obtidas dos animais estudados acometidos por ITU e piometra,
comparativamente aos isolados das fezes. Estes resultados ratificam a importância da
presença do gene hlyA e, conseqüentemente, da lise de células inflamatórias e
eritrócitos como mecanismo de virulência na infecção e viabilidade da E. coli em
ambientes extra-intestinais, notadamente na ITU e piometra em cães.
O fator necrosante citotóxico tipo 1 (cnf-1) é uma importante citotoxina
facilitadora da disseminação bacteriana no lúmen da bexiga e do trato intestinal para a
circulação sangüínea (Garcia & Le Bouguénec, 1996; Zamora et al., 2000; Bouquet,
2001; Tiba, 2004). No homem, Tiba (2004) investigando fatores de virulência de ITU
encontrou 18,5% de cnf-1. Blanco et al. (1995) e Yamamoto et al. (1995) detectaram,
respectivamente, 28 e 48% das linhagens carreando este gene em pacientes com
infecções urinárias. Andreu et al. (1997) ao estudarem mulheres com cistite
observaram cnf-1 em 47% das UPEC. Landraud et al. (2000), em pacientes
hospitalizados ou não, encontraram cnf-1, respectivamente, em 33% e 34% das
estirpes isoladas. Rodriguez et al. (2005) detectaram cnf-1 em 27,5% de ITUs
humanas, mostrando a relevância desta citotoxina em infecções urinárias no homem.
Em animais, Pohl et al. (1993) encontraram cnf-1 em diversas espécies
acometidas de várias afecções. Yuri et al. (1998) também evidenciaram a presença do
fator necrosante em infecções em animais de companhia. Johnson et al. (2003)
revelaram a expressão de cnf-1 em 41% das linhagens de E. coli isoladas de ITU em
cães. Em linhagens isoladas das fezes, estudos no Brasil e em diferentes países tem
revelado também cnf-1 em estirpes isoladas das fezes de cães, em porcentagens
variando de 12% a 81,5% (Pohl et al., 1995; Yuri et al., 1998; Chen et al., 2003;
Johnson et al. 2003; Von Sydow, 2005). No presente estudo, a presença do gene cnf-
1 foi detectada em 11 (21,6%) isolados de ITU, 21 (40,4%) de piometra e em 9
(16,4%) das fezes.
A despeito das variações de detecção de cnf-1 em outros estudos em cães,
nos isolados dos animais acometidos por piometra e ITU foi observada diferença
Siqueira, A.K., 2006.
estatisticamente significante (p<0,05) para as linhagens obtidas das fezes. Estes
resultados sugerem que as linhagens que possuem cnf-1 seriam dotadas de
mecanismo adicional de virulência nas afecções extra-intestinais em cães, incluindo
ITU e piometra. Adicionalmente, a detecção de linhagens de E. coli detentoras de cnf-
1 nos cães, reconhecida como citotoxina relacionada à infecções entéricas e extra-
entéricas no homem, ressalta para os reflexos em saúde pública da presença de
linhagens virulentas, em virtude da proximidade de contato e/ou co-habitação do
homem com os cães.
Evidências apontam que cnf-1 e hlyA atuariam em conjunto favorecendo a
infecção por linhagens produtoras destas citotoxinas (Landraud et al., 2000; Boquet et
al., 2001; Tiba, 2004, Tavechio et al., 2004). Ambas cnf-1 e hlyA, e ainda a fímbria p
se encontram em uma mesma ilha de patogenicidade. Esses fatores de virulência são
expressados, geralmente, em porcentagens semelhantes, passíveis de transmissão
por plasmídeos e detactados associados em diversas estirpes de E. coli (Gyles et al.,
1992). No presente estudo observamos perfil semelhante a estes achados, visto que
estes fatores de virulência foram detectados em proporções semelhantes entre os três
grupos, sugerindo que cnf-1, hlyA e fímbria p estão em uma mesma ilha de
patogenicidade na maioria das linhagens isoladas. No grupo controle também foi
evidenciada a expressão destes genes o que demonstra que esta PAI pode ser
transmitida entre linhagens patogênicas e comensais. Assim, sugere-se que este
grupo gênico contribui na virulência de estirpes ligadas às infecções genito-urinárias
em cães.
Para que o sorotipo O157:H7 seja devidamente caracterizado, faz-se
necessário a detecção das verotoxinas, além do gene codificador de eae. Nenhuma
das 158 linhagens estudadas apresentou os genes eae, vt1 e vt2.
Rangel et al. (2005) realizando levantamento epidemiológico nos EUA,
entre 1982 e 2002, observaram 73.000 casos de infecções por O157:H7, 350 surtos,
1493 hospitalizações, 353 casos de SUH que culminaram com 40 mortes. As
principais formas de transmissão incriminadas foram os alimentos. O contato com
Siqueira, A.K., 2006.
animais foi responsável por 3% destes casos, sendo que os cães não foram
apontados nestas estatísticas.
No Brasil, Dantas (2002) não encontrou o gene das verotoxinas nas fezes
de crianças e de cães com ou sem diarréia. Von Sydow (2005) detectou 0,5% das
estirpes de E. coli isoladas de fezes de cães errantes expressando vt2. O conjunto
desses dados provavelmente apontam que o cão tem baixo risco ou participação na
veiculação para o homem de linhagens verotoxigênicas.
E. coli necessitam de ferro para o metabolismo bacteriano. Este elemento é
abundante no intestino, porém não é encontrado de forma livre em sítios extra-
intestinais. Ao colonizarem o sistema urogenital o agente utiliza mecanismos de
captação de ferro que incluem as hemolisinas e os sideróforos (Johnson, 1991; Braun
et al., 1999; Braun et al., 2002, Faraldo-Gomez et al., 2003). A aerobactina é
considerado o sistema de captação mais efetivo para linhagens UPEC (Orskov et al.,
1988). O gene iucD é codificador da aerobactina. No presente estudo, a presença de
iucD foi observada em 23,5% dos isolados de ITU, 17,3% de piometra e em 1,8% de
fezes. Em pacientes humanos com ITU a detecção do gene tem sido encontrada com
variações entre 25,9 e 76% (Orskov et al., 1988; Yamamoto et al., 1995; Féria et al.,
2001b; Tiba, 2004; Santo et al., 2006). Na piometra canina, Chen et al. (2003)
revelaram iucD em 8% da amostragem. No Brasil, Coogan et al. (2004) encontraram
expressão de iucD em 17,4% de estirpes isoladas de cadelas com piometra.
A expressão gênica de iucD foi estatisticamente significante (p<0,05) nos
animais estudados com piometra e ITU, em detrimento do grupo controle. À
semelhança dos achados de hly, a captação de ferro exógeno, mediante a produção
de sideróforos, parece desempenhar papel importante na infectividade de E. coli em
casos de piometra e ITU em cães. No entanto, diferente do supracitado, Chen et al.
(2003) referem que iucD e afa são fatores de virulência que menos contribuem na
patogenicidade de linhagens de E. coli nas infecções uterinas em cadelas.
Recentemente foi descrita a proteína uropatogênica específica (usp)
associada à linhagens virulentas encontradas no trato urinário (Kurazono et al., 2000;
Siqueira, A.K., 2006.
Kurazono et al., 2003; Tiba, 2004). No presente estudo foram encontrados 33,3% nos
isolados de ITU e 69,2% de piometra que possuíam o gene usp. No grupo controle
este gene não foi detectado. Tiba (2004) encontrou usp em 22,2% de isolados de ITU
em pacientes humanos. Kurazono et al., (2000, 2003) referem 80% dos isolados de
cistite humana e 24% em fezes de homens expressando o gene usp. Ainda são
escassos os estudos relacionando a proteína específica uropatogênica às infecções
em animais. No entanto, a ocorrência do gene usp em ITU no presente estudo sugere
sua relevância na patogenicidade de E. coli em infecções urinárias de cães. Dentre a
literatura consultada não foi possível encontrar estudos investigando a participação de
usp na piometra em cães. Entretanto, em face da elevada ocorrência do gene usp nas
linhagens de E. coli, no presente estudo, e da provável origem entérica ou peri-anal
das linhagens causadoras de ITU e piometra em cães, sugere-se que usp teria
participação importante na infectividade de estirpes em afecções do sistema gênito-
urinário.
Nas linhagens isoladas de ITU e piometra foi estatisticamente significante
(p<0,05) a presença simultânea dos genes para proteína específica uropatogênica
(usp), aerobactina (iucD) e a multi-resistência in vitro a cinco ou mais antimicrobianos.
Esses dados apontam que as linhagens que contém este conjunto de fatores de
virulência deteriam mecanismos adicionais na patogenicidade em infecções gênito-
urinárias em cães, e que a ocorrência simultânea nas linhagens poderia decorrer de
provável transmissão plasmidial desses fatores de virulência em conjunto.
O estudo ressalta a intensa resposta inflamatória no exame hematológico
dos cães com piometra e ITU, similaridade das adesinas entre as linhagens isoladas
nos três grupos estudados e alta ocorrência de expressão simultânea de hlyA, cnf-1 e
fímbria P. A elevada multi-resistência das linhagens aos antimicrobianos nos cães
com ITU e piometra,reforça a necessidade de estudos continuados de sensibilidade
bacteriana, principalmente E. coli. Ressalta-se para os reflexos em saúde pública
representados pela detecção de linhagens de E. coli patogênicas em cães com ITU e
piometra em face do estreito contato do homem com os cães.
Siqueira, A.K., 2006.
7 CONCLUSÕES
Os resultados do presente estudo permitem concluir que:
• Os principais achados clínico-laboratoriais nos animais foram
anemia, trombocitopenia, leucocitose por neutrofilia e monocitose condizentes,
geralmente, com infecções bacterianas graves em cães com piometra e infecções
urinárias;
• O perfil de sensibilidade microbiana revelou que a gentamicina e
as fluorquinolonas (ciprofloxacina, enrofloxacina e norfloxacina) foram os
antimicrobianos mais efetivos em Botucatu e região, podendo ser indicados como de
escolha na terapia de ITU e piometra em cães;
• Alta freqüência de resistência múltipla aos antimicrobianos foi
observada nas linhagens, especialmente para ampicilina e
sulfametoxazole/trimetoprim - drogas consideradas de escolha na terapia de afecções
genito-urinárias em cães -, ratificando a importância dos testes de sensibilidade
microbiana antes da instituição da terapia;
• Os genes hlyA, iucD e cnf-1 apresentaram significância
estatística nas linhagens isoladas de piometra e ITU, comparativamente aos isolados
das fezes, representando importantes mecanismos de virulência para as linhagens
ExPEC nas afecções gênito-urinárias em cães, decorrente da ação de lise de células
inflamatórias e/ou captação do íon ferro;
• O gene fimH foi observado em mais de 90% dos isolados nos
três grupos de estudo, não representando, provavelmente, um fator essencial à
patogenicidade de linhagens ExPEC em infecções gênito-urinárias em cães;
• O gene codificador de adesina afimbrial (afa) foi encontrado em
baixa freqüência nos três grupos de estudo, não se constituindo, provavelmente, em
Siqueira, A.K., 2006.
mecanismo importante para a adesão de linhagens ExPEC nas infecções gênito-
urinárias em cães;
• A presença do gene cnf-1 foi estatisticamente significativa nas
linhagens de ITU e piometra comparativamente aos isolados fecais, confirmando sua
importância como fator de virulência no que tange a lise celular e facilitação da
disseminação bacteriana pelo sistema gênito-urinário em cães;
• A presença da proteína específica uropatogênica (usp)
apresentou diferença estatisticamente significante nas linhagens de piometra
comparativamente às isoladas de ITU e fezes, resultado infreqüente, mas que poderia
decorrer da origem comum das linhagens que acometem o trato urinário e o útero dos
cães;
• Os genes papC e papGIII, sub-unidades da fímbria P, e a fímbria
S, foram encontrados em alta freqüência nas linhagens isoladas de ITU e piometra,
indicando a importância destes fatores de virulência no mecanismo de adesão ao
epitélio gênito-urinário em cães,
• Não foram encontradas estirpes detentoras dos genes para
verotoxinas e da intimina eae nas linhagens estudadas, mostrando que,
provavelmente, o cão é de baixo risco como fonte de infecção de linhagens
verotoxigênicas para o homem;
• A associação gênica mais freqüente nas linhagens foi observada
entre papC, papGIII, sfaS, cnf-1 e hlyA, mostrando que linhagens dotadas do conjunto
destes fatores de virulência apresentariam maior probabilidade de exercer efeito
patogênico nas infecções gênito-urinárias em cães;
• Fatores de virulência com relevância em saúde pública foram
detectados nos cães estudados, com destaque para linhagens multi-resistentes aos
antimicrobianos e necrotoxigênicas, conotando eventual risco de transmissão cruzada
de estirpes patogênicas, em face do estreito contato do cão com o homem.
Siqueira, A.K., 2006.
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