( PDF ) Caracterização da expressão do RNAm das gonadotropinas de Salminus hilarii (characiformes: characidae) ao longo do ciclo reprodutivo: efeitos do bloqueio reprodutivo

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

RENATO GARCIA DE MELO

CARACTERIZAÇÃO DA EXPRESSÃO DO RNAm DAS

GONADOTROPINAS DE Salminus hilarii

(CHARACIFORMES: CHARACIDAE) AO LONGO DO CICLO

REPRODUTIVO: EFEITOS DO BLOQUEIO REPRODUTIVO

MOGI DAS CRUZES, SP

2006

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

RENATO GARCIA DE MELO

CARACTERIZAÇÃO DA EXPRESSÃO DO RNAm DAS

GONADOTROPINAS DE Salminus hilarii

(CHARACIFORMES: CHARACIDAE) AO LONGO DO CICLO

REPRODUTIVO: EFEITOS DO BLOQUEIO REPRODUTIVO

Apresentação de Dissertação para obtenção

do Título de Mestre em Biotecnologia pelo

Núcleo de Ciências Ambientais da

Universidade de Mogi das Cruzes.

Área de Concentração: Biológicas

Orientadora: Profa. Dra. Renata Guimarães Moreira

MOGI DAS CRUZES, SP

2006

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FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

DEDICATÓRIA

À Deus, acima de tudo, pela vida.

À minha mãe Neli Garcia e ao meu pai José

Neto, por me criar, educar, amar e incentivar

a lutar pelos meus sonhos.

À Kethy e à Paloma, minhas sobrinhas

queridas.

À minha querida Jessy, meu amor. Por me

incentivar, inspirar, amar e compreender.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, a Profa. Dra. Renata Guimarães Moreira, em especial, pela

confiança depositada em mim, pelo apoio, encorajamento e pela grande contribuição à minha

formação acadêmica. Também a todos os alunos de seu laboratório pela ajuda e amizade.

Aos Professores Dr. Ronaldo de Carvalho Araújo, Dr. Alexandre Wagner Silva

Hilsdorf, Dr. Welington Luiz de Araújo, Dr. Jorge Luiz Pesquero, Dr. José Luis Wolf

do Curso de Mestrado em Biotecnologia da UMC, pela grande contribuição à minha

formação acadêmica e pela possibilidade do uso de seus laboratórios.

Ao Laboratório de Genética da Escola Superior de Agricultura Luis de Queiroz

– ESALQ – USP, pela realização dos experimentos de Real Time PCR e aos alunos

Priscilla Rossetto e Rodrigo Mendes pela ajuda com os experimentos.

Ao Laboratório de Animais Transgênicos e Estrutura de Proteínas da Universidade de

Mogi das Cruzes - UMC, pela oportunidade de estágio e realização da maior parte dos

experimentos desse trabalho, pelos oligoiniciadores de βFSH de salmão testados nesse

trabalho. Em especial ao João Davison pelo apoio durante o estágio.

Ao Laboratório de Genética de Peixes da Universidade de Mogi das Cruzes -

UMC, pela realização de parte dos experimentos desse trabalho. Em especial às

alunas Ângela, Cristiane e Juliana pela ajuda nos experimentos.

Ao Laboratório de Virologia da Universidade de Mogi das Cruzes - UMC e ao

Laboratório de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, pela

realização dos seqüenciamentos realizados ao longo desse projeto, fundamentais

para confirmação dos resultados.

À FAPESP e à Secretaria de Educação do Estado de São Paulo, pelo auxílio

financeiro. Ao ex-governador de São Paulo Geraldo Alckmin e ao ex-secretário da

educação do estado de São Paulo, Gabriel Chalita, pela criação do projeto Bolsa

Mestrado.

O único homem que nunca comete erros é aquele que

nunca faz coisa alguma. Não tenha medo de errar, pois

você aprenderá a não cometer duas vezes o mesmo

erro.

(Roosevelt)

RESUMO

Nos últimos anos, um número cada vez maior de estudos tem sido realizado a fim de

melhor compreender o mecanismo de reprodução em peixes. Diversos autores têm

investigado a síntese de hormônios relacionados à reprodução em peixes e os

possíveis efeitos do isolamento desses animais em ambientes de cativeiro. Diversos

estudos têm demonstrado a existência de dois hormônios glicoproteícos, FSH e LH,

produzidos pela hipófise e que desempenham um papel importante na reprodução

de peixes. Entretanto, existem variações de uma espécie para outra com relação à

quantidade dos hormônios sintetizados e ao período do ciclo em que são

sintetizados. No presente trabalho, buscou-se confirmar pela primeira vez na

literatura, a dualidade das gonadotropinas em um Characiforme, Salminus hilarii,

importante exemplar da fauna íctia da Bacia do Alto Tietê, que por ser uma espécie

reofílica, necessita realizar um processo migratório a fim de poder se reproduzir.

Quando impedidas de migrar, as fêmeas dessa espécie não completam o ciclo

reprodutivo e os oócitos produzidos não são liberados no processo de desova. Para

investigar possíveis alterações nos níveis de expressão do FSH e do LH na S. hilarii

(S. hilarii), foram identificadas regiões conservadas nos genes FSH e LH de peixes

Siluriformes, por serem os mais próximos filogeneticamente dos Characiformes, e

construídos iniciadores para amplificar o cDNA desses genes. Depois de confirmada

a validação dos iniciadores para amplificação desses genes, foi utilizada a técnica

de PCR em tempo real a fim de determinar os níveis de expressão desses dois

genes em animais de três ambientes (rio, barragem e cativeiro) e em três estádios

diferentes do ciclo reprodutivo (repouso, maturação final e regressão), a fim de

verificar se o insucesso da reprodução estaria relacionado com a expressão alterada

desses hormônios quando os animais são impedidos de migrar. Os resultados

mostraram que o bloqueio migratório interfere no ciclo reprodutivo da espécie. O LH

desempenha papel chave na maturação final e desova e seus baixos níveis de

expressão no ambiente de cativeiro, parece explicar o insucesso na reprodução

desses animais no ambiente impactado. Além disso, um possível papel do FSH na

fase final de maturação e desova é proposto, uma vez que o mesmo é expresso

durante todo o ciclo no ambiente natural, o que não ocorre nos ambientes

impactados.

Palavras-chave: FSH, LH, reprodução de peixes, Real Time PCR, Salminus hilarii.

ABSTRACT

During the past decade research on fish reproduction has intensified markedly, as

the need to understand the mechanisms of fish reproduction is of growing

economical and ecological importance. Many papers have investigated the synthesis

of hormones related to reproduction in fish and the possible effects of the

maintenance of these animals in captivity. Most of these studies demonstrated the

existence of two glycoproteic hormones, FSH (follicle stimulating hormone) and LH

(luteinizing hormone) that are released by pituitary and play an important role in

vertebrate reproduction. However, there are considerable differences in the amount

of hormone secreted by the pituitary and also the periodicity of production of these

gonadotropins, in connection with the reproductive cycle and the considered species.

The present work is the first that aimed to confirm the duality of gonadotropins in a

teleost from the Characiformes order. The species Salminus hilarii is an important

component of the Upper Tietê River Basin. It is a rheophylic fish that needs to

migrate to reproduce. When the migration is impossible, the females do not finish the

reproductive cycle and the oocytes cannot ovulate and consequently spawn. To

investigate the possible alterations in the reproductive physiology when the S. hilarii

(S. hilarii) cannot migrate, FSH and LH gene expression were assessed, based on

primers constructed according to conserved gene regions of Siluriformes

(philogenetically closer) that amplified cDNA of these genes. After the validation of

the primers, the real time PCR protocol was applied to determine the levels of

expression of the β subunit of these two genes (FSH and LH) in animals from three

experimental groups (river, dam and captivity) and from three different maturations

stages of the reproductive cycle (resting, maturation and regression). These analyses

were done in order to verify whether there are two gonadotropins in S. hilarii; how the

gonadotropin expression is distributed along the cycle, and finally to investigate if the

failure of reproduction in lentic environments can be related to the altered expression

of these hormones, when the animals are not allowed to migrate. The results showed

that LH plays a key role in the final maturation of S. hilarii and the low expression

levels in captivity can explain the reproduction failure in this environment. In addition,

a possible role of FSH during final maturation and spawning can be considered,

since this hormone is expressed during the entire reproductive cycle in the river,

which does not occur in the impaired environments.

Keywords: FSH, LH, fish reproduction, Real Time PCR, Salminus hilarii,

environment impairment.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 -

Esquema de controle neuroendócrino da reprodução

em fêmeas de peixe........................................................ 15

Figura 2 -

Ação do FSH e do LH nas camadas foliculares. (+)

estimulação; (-) inibição................................................. 17

Figura 3 -

Salminus hilarii................................................................ 21

Figura 4-

Família Characidae, suas subfamílias, gêneros e

espécies. O gênero Salminus, ao qual pertence

Salminus hilarii, situa-se na subfamília Bryconinae. A

ausência do Salminus hilarii indica a inexistência de

trabalhos sobre essa espécie no Genebank. (Benson,

2004).

Figura 5-

Diversidade dos peixes teleósteos. Número de

espécies cadastradas no Fishbase (FROESE &

PAULY, 2006)................................................................. 23

Figura 6-

Sistema TaqmMan. (A) Sonda Taqman e (B) Esquema

de funcionamento do sistema Taqman........................... 25

Figura 7 -

Sistema Beacons. Dispensa a necessidade de

hidrólise por atividade.....................................................

Figura 8 -

SYBR Green intercalado em DNA................................ 26

Figura 9 -

Estádios do ciclo reprodutivo do S. hilarii (Amaral,

2006)............................................................................... 28

Figura 10 -

Rio Tietê – Ponto de coleta 1.......................................... 28

Figura 11 -

Rio Tietê – Ponto de coleta 2 (poço da barragem).........

Figura 12 -

Mapa de localização dos pontos de coleta: Rio (1) e

Barragem (2)...................................................................

Figura 13 -

Viveiros – Tanques com 100m

na Piscicultura da

Barragem de Ponte Nova. Utilizados para criação dos

animais de cativeiro........................................................ 29

Figura 14 -

Ovários – Fase de Repouso .......................................... 30

Figura 15 -

Ovários – Fase de maturação avançada........................ 30

Figura 16 -

Ovários - Regressão ......................................................

Figura 17 -

Hipófise de S. hilarii ...................................................... 31

Figura 18 -

Seqüência dos iniciadores utilizados nos experimentos

de RT- PCR e PCR em tempo real (Benson, 2004).......

Figura 19 -

pGEM-T Easy (WANG, H. & PERRY, S. E., 2001)........ 37

Figura 20 -

Eletroforese em gel de agarose 1% corado com

brometo de etídeo (0,5 µg/µl. (M) – Marcador de peso

molecular ladder 100pb. (T1) Fragmento de ~420pb e

(T2) fragmento de ~280pb, ambos amplificados a partir

de cDNA da hipófise da tabarana usando iniciadores

para βFSH de peixes Siluriformes..................................

Figura 21 -

Confirmação de isolamento da seqüência parcial do

βFSH de S. hilarii (Benson, 2004)..................................

Figura 22 -

18S rRNA. Comparação do fragmento isolado como

sendo 18S RNA ribossomal (Benson, 2004)..................

Figura 23 -

Seqüência parcial do βFSH de S. hilarii. A seta indica o

códon de parada. A numeração é contada a partir do

primeiro nucleotídeo do fragmento solado até o ultimo

do códon de parada........................................................

Figura 24 -

Códons de terminação de algumas espécies de peixes

teleósteos. Characiformes (A), Siluriformes (B) e

Cypriniformes (C). .......................................................... 43

Figura 25 -

Seqüência de aminoácidos do FSHβ. Salminus hilarii

(1), Ictalurus punctatus (2), Clarias gariepinus (3),

Cyprinus carpio (seqüência parcial) (4), Cyprinus

carpio (seqüência completa) (5) e Oncorhynchus

tshawytscha (Chinook salmon) (6). Em verde, estão

destacadas, nesses organismos, as 12 cisteínas

conservadas para β FSH em vertebrados. É possível

observar sete dessas cisteínas na seqüência da

tabarana (Benson, 2004)................................................

Figura 26 -

Curva de Melting. Amplificação com iniciadores para

Fator de elongação α (Ef1α) utilizados como controle

interno (placa1)...............................................................

Figura 27 -

Curva de Melting. Amplificação com iniciadores para

Fator de elongação α (Ef1α) utilizados como controle

interno. (placa2).............................................................

Figura 28 -

Curva de Melting. Amplificação com iniciadores para

βFSH de S. hilarii. (placa1)............................................

Figura 29 -

Curva de Melting. Amplificação com iniciadores para

βFSH de S. hilarii. (placa2)............................................

Figura 30 -

Curva de Melting. Amplificação com iniciadores para

βLH de S. hilarii.............................................................

Figura 31 -

Curva de amplificação. Amostras amplificadas com

iniciadores para βLH de S. hilarii...................................

Figura 32 -

Curva de amplificação. Amostras amplificadas com

iniciadores para βFSH de S. hilarii. (placa1).................

Figura 33 -

Curva de amplificação. Amostras amplificadas com

iniciadores para Fator de elongação α (Ef1α) utilizados

como controle interno. (placa1)......................................

Figura 34 -

Curva de amplificação. Amostras amplificadas com

iniciadores para βFSH de S. hilarii. (placa2).................

Figura 35 -

Curva de amplificação. Amostras amplificadas com

iniciadores para Fator de elongação α (Ef1α) utilizados

como controle interno. (placa2)......................................

Figura 36 -

Expressão do βFSH durante o ciclo reprodutivo. Visão

geral por ambiente. (N.D.) significa valor não

determinado....................................................................

Figura 37 -

Expressão do βFSH durante o ciclo reprodutivo. Visão

geral por estado do ciclo. (N.D.) significa valor não

determinado....................................................................

Figura 38 -

Expressão do βFSH durante o ciclo reprodutivo.

Estádio de Repouso.

Letras diferentes indicam

diferenças significativas (p≤0,05)....................................

Figura 39 -

Expressão do βFSH durante o ciclo reprodutivo.

Estádio Maduro.

Letras diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05).....................................................

Figura 40 -

Expressão do βFSH durante o ciclo reprodutivo.

Estádio de Regressão. Letras diferentes indicam

diferenças significativas (p≤0,05)....................................

Figura 41 -

Expressão do βFSH durante o ciclo reprodutivo. RIO.

Letras diferentes indicam diferenças significativas

(p≤0,05). ......................................................................... 49

Figura 42 -

Expressão do βFSH durante o ciclo reprodutivo.

BARRAGEM. Letras diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05).....................................................

Figura 43 -

Expressão do βFSH durante o ciclo reprodutivo.

CATIVEIRO. Letras diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05).....................................................

Figura 44 -

Expressão do βLH durante o ciclo reprodutivo. Visão

geral por ambiente. (N.D.) significa valor não

determinado....................................................................

Figura 45 -

Expressão do βLH durante o ciclo reprodutivo. Visão

geral por estádio do ciclo. (N.D.) significa valor não

determinado....................................................................

Figura 46 -

Expressão do βLH durante o ciclo reprodutivo. Estádio

de Repouso. Letras diferentes indicam diferenças

significativas ...................................................................

Figura 47 -

Expressão do βLH durante o ciclo reprodutivo. Estádio

maduro. Letras diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05).....................................................

Figura 48 -

Expressão do βLH durante o ciclo reprodutivo. Estádio

de regressão. Letras diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05).....................................................

Figura 49 -

Expressão do βLH durante o ciclo reprodutivo. RIO.

Letras diferentes indicam diferenças significativas

(p≤0,05). .........................................................................

Figura 50 -

Expressão do βLH durante o ciclo reprodutivo.

BARRAGEM. Letras diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05).....................................................

Figura 51 -

Expressão do βLH durante o ciclo reprodutivo.

CATIVEIRO. Letras diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05).....................................................

Figura 52 -

Participação do estradiol (E2) na amplificação da

expressão do βLH. O modelo propõem a interação do

E2 com receptores e fatores de transcrição de modo a

amplificar a ação do GnRH no estímulo à expressão do

βLH.(Adaptado de Ando e Urano, 2005) ....................... 52

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µg micrograma

µI microlitro

ANOVA "Analise of Variance"

BLAST "Basic Local Alignment Search Tool "

cDNA ácido desóxirribonucleico complementar

DNA ácido desóxirribonucleico

EF1α fator de enlongamento 1 α

ESALQ Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz"

EtBr brometo de etídeo

FRET "Fluorescence Resonance Energy Transfer"

FSH hormônio folículo estimulante

GnRH hormônio liberador de gonadotrofina

GtH gonadotropina

IPTG "isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside"

LB Luria Bertani

LH hormônio luteinizante

mg miligrama

ml mililitro

NCBI National Center for Biotechnology Information

NIB Núcleo Integrado de Biotecnologia

ºC graus Celsius

PCR reacção em cadeia da polimerase

RNA ácido ribonucleico

RNAm ácido ribonucleico mensageiro

RNAr ácido ribonucleico ribossomal

RT transcrição reversa

Taq Thermus aquaticus

UA unidade arbitraria

UMC Universidade de Mogi das Cruzes

UNIFESP Universidade Federal de São Paulo

USP Universidade de São Paulo

UV ultra violeta

RIO

1 INTRODUÇÃO.................................................................................

1.1 Reprodução em peixes............................................................ 15

1.2 Gonadotropinas........................................................................ 18

1.3 Dificuldades na reprodução.................................................... 18

1.4 Salminus hilarii.........................................................................

1.5 Estudo da expressão gênica................................................... 24

1.6 PCR em tempo real.................................................................. 24

2 OBJETIVOS..................................................................................... 27

2.1 Objetivo Geral.................................................................. 27

2.2 Objetivos específicos.............................................................. 27

3 MÉTODO..........................................................................................

3.1 Material biológico.....................................................................

3.2 Extração de RNA Total............................................................

3.3 Iniciadores...............................................................................

3.3.1 βFSH..............................................................................

3.3.2 βLH................................................................................

3.4 RT-PCR......................................................................................

3.5 Reação em Cadeia da Polimerase..........................................

3.6 Clonagem..................................................................................

3.7 Mini preparação plasmidial.....................................................

3.8 Digestão de DNA plasmidial com enzimas de restrição.......

3.9 Seqüenciamento.......................................................................

3.10 PCR em tempo real................................................................

3.11 Análise estatística.................................................................

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................

4.1 Isolamento dos cDNA de βFSH e βLH de S. hilarii..............

4.2 Desenho e utilização dos iniciadores....................................

4.3 Clonagem do cDNA parcial de βFSH de S. hilarii................

4.4 Seqüência parcial de aminoácidos do βFSH de S. hilarii...

4.4.1 Comparação entre βFSH de S. hilarii com βFSH de

siluriformes e cypriniformes ...........................................

4.4.2 Comparação entre βFSH de S. hilarii com βFSH de

Salmoniformes..........................................................................

4.5 Análise da expressão de βFSH e βLH por PCR em tempo

real...................................................................................................

4.5.1 Análise dos resultados...................................................

5 CONCLUSÕES E SUGESTÕES...................................................... 54

REFERÊNCIAS..................................................................................... 56

1 INTRODUÇÃO

1.1 Reprodução em peixes

Embora a reprodução em peixes seja desencadeada por fatores ambientais, o

controle desse processo é regulado endogenamente pelo eixo hipotálamo-hipófise-

gônadas (Figura 1). Esse eixo é responsável pela síntese e secreção de neuro-

hormônios, gonadotropinas e esteróides, que modulam o processo reprodutivo.

Geralmente, esse processo ocorre naturalmente, com a maturação, liberação e

fertilização dos gametas no ambiente externo (água). Os ovos fecundados originam

embriões e posteriormente larvas, que crescem e se tornam animais adultos,

reiniciando o ciclo.

(-)

GnRH (+) Dopamina (-)

(

)

Figura 1 - Esquema de controle neuroendócrino da reprodução em fêmeas de peixe.

(BALDISSEROTTO, 2002; REDDING & PATINO, 1993).

De forma simplificada, o controle da reprodução em peixes ocorre como

sintetizado abaixo.

Nas fêmeas, fatores externos como fotoperíodo, temperatura e,

possivelmente as chuvas nas espécies tropicais, estimulam o hipotálamo a produzir

o Hormônio Liberador de Gonadotropinas (GnRH) que atuará na hipófise induzindo a

produção e secreção de Gonadotropina I (GtH I) e Gonadotropina II (GTH II),

embora existam relatos de peixes que possuam apenas uma única gonadotropina

(SOWER et al., 2006). O GtH I, também conhecido como Hormônio Folículo

Estimulante (FSH), atua nos folículos promovendo o crescimento folicular,

transcrição de genes que codificam fatores de crescimento, atividade da aromatase

nas células da granulosa, formação de receptores de GtH II, também denominado

Hormônio Luteizante (LH), na membrana das células da granulosa e síntese de

estradiol (CAVAGNA et al., 2004).

O FSH chegando às camadas foliculares dos oócitos em desenvolvimento,

mais especificamente na camada teca converte o colesterol em testosterona, que é

transportada à camada granulosa, e aromatizada a 17β-estradiol pela enzima

aromatase. O 17β-estradiol age no fígado, estimulando a síntese da

fosfolipoproteína vitelogenina que, penetrando no oócito por micropinocitose

(processo dependente da FSH), promove o crescimento do oócito e a incorporação

de vitelo (NAGAHAMA 1987) (Figura 2). Assim, na fase de vitelogênese

(incorporação de vitelo) ocorre um aumento na concentração plasmática de 17β-

estradiol e testosterona e esse aumento induz a secreção de LH nas fases finais de

vitelogênese.

O LH, por sua vez, promove a síntese de androgênios nas células da teca;

esses hormônios atuam como substratos para a aromatização, podendo ser

convertidos à 17,20β-dihidroxy-4-pregnen-3-one ou 17,20β-21-trihydroxy-4 pregnen-

3-one, dependendo da espécie considerada, e a conseqüente secreção de estradiol,

que ocorre nas células da granulosa (NAGAHAMA, 1987; SULLIVAN et al., 1999;

CAVAGNA et al., 2004).

Em machos adultos, o controle da síntese de esteróides é semelhante ao das

fêmeas. FSH e LH estimulam a esteroidogênese testicular e espermatogênese,

sendo os andrógenos testosterona e 11-ceto-testosterona produzidos pelas células

de Leydig nos testículos. Ambas gonadotropinas estimulam além da produção de

andrógenos, os progestágenos, principalmente a 17α-20β-dihidroxiprogesterona,

sendo esta última produzida em maior quantidade pela ação do LH (CYR &

EALES,1996).

Considerando-se os teleósteos nativos, o perfil de esteróides gonadais só foi

descrito para poucas espécies, como o Piaractus mesopotamicus (GAZOLLA et al.,

1996; GAZOLLA & BORELLA, 1997; ISEKI, 2002), Colossoma macropomum

(VENTURIERI, 1997), Salminus brasiliensis (MOREIRA et. al., 1999).

Figura 2 – Ação do FSH e do LH nas camadas foliculares. (+) estimulação; (-) inibição.

(BALDISSEROTTO, 2002; CAVAGNA et al. 2004)

1.2 Gonadotropinas

Gonadotropina (GtH) é uma glicoproteína que consiste de duas subunidades,

α e β, ligadas não covalentemente. Embora apenas uma gonadotropina tenha sido

observada no “catfish” (SCHULZ et al., 1995), estudos mostraram existir duas

distintas gonadotropinas na hipófise de peixes: FSH (GtH-I) e LH (GtH-II) as quais já

foram identificadas em várias espécies de teleósteos (TANAKA et al., 1995; ELIZUR

et al., 1996; HASSIN et al., 1995). Essas proteínas compartilham em comum a

subunidade α, mas diferem em suas subunidades β, que confere especificidade

imunológica e biológica a cada hormônio (JACKSON et al., 1999).

Em salmonídeos constatou-se que estas duas glicoproteínas diferem em seu

padrão de expressão na hipófise nos diferentes estágios do ciclo reprodutivo

(NOZAKI et al., 1990). Neste grupo de peixes, tem sido relatado que o FSH é

expresso durante o período de vitelogênese e o LH na fase de maturação avançada

e ovulação (MAL et al., 1989; WEIL et al., 1995). Contudo, um padrão diferente de

expressão nessas duas gonadotropinas foi encontrado em Trichogaster trichopterus,

o que, provavelmente, seria devido à diferente estratégia reprodutiva adotada por

essa espécie (desova parcelada) (JACKSON et al., 1999).

Os estudos fisiológicos das gonadotropinas de teleósteos têm sido

conduzidos principalmente com o LH, enquanto a função do FSH ainda não está

inteiramente elucidada (ELIZUR et al., 1996). Acredita-se que o FSH regule a

gametogênese, estimulando a produção do hormônio estradiol (SEKINE et al., 1989)

e que o LH, seria responsável pela maturação avançada dos oócitos, por ser mais

ativo em estimular a liberação do 17,20β-dihidroxy-4-pregnen-3-one pelos oócitos

pós-vitelogênicos (NAGAHAMA, 1994).

1.3 Dificuldades na reprodução

Os processos relacionados à reprodução de peixes podem sofrer alterações

de acordo com a estratégia reprodutiva que a espécie adotar, com relação à

periodicidade na eliminação dos gametas e ainda, com relação à quantidade e

tamanho desses gametas. O desenvolvimento oocitário em peixes está relacionado

com o tipo de estratégia reprodutiva, ou seja, o tipo de desova que as fêmeas

apresentam. Grande parte da fauna íctia é representada principalmente por espécies

com desenvolvimento oocitário do tipo sincrônico em grupo, e são conhecidas como

peixes de desova total. Essas espécies passam um grande intervalo de tempo

“amadurecendo” seus gametas para eliminá-los em um curto período de tempo.

Alguns estudos já foram realizados para determinar o tipo de desova de

algumas espécies nativas, podendo ser revisado em Baldisserotto & Gomes (2005).

Animais com esta estratégia reprodutiva na maioria das vezes dependem de

um comportamento característico para completar a maturação dos gametas que é a

migração reprodutiva. O processo de migração envolve custos energéticos, que

podem estar relacionados com a locomoção, desenvolvimento reprodutivo e

aclimatização a um novo ambiente. De uma forma geral, a migração está

acompanhada de uma série de alterações nas capacidades metabólicas (LEONARD

& MCCORMICK, 1999), no desenvolvimento gonadal (DUQUE et al., 1998;

GRAYNOTH, 1995) e no perfil dos esteróides gonadais (DISTEFANO et al., 1997;

MUNAKATA et al., 2001).

No Brasil, grande parte dos peixes de água doce de valor comercial são

representados pelas espécies migradoras, que também têm sua importância na

dinâmica dos ecossistemas aquáticos. Quando estas espécies são transferidas para

o cativeiro, em operações de cultivo comercial, não conseguem eliminar seus

gametas de forma natural. Neste caso, intervenções hormonais exógenas em

determinados níveis do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas, são necessárias, para dar

continuidade ao processo de maturação gonadal. O mesmo bloqueio parece ocorrer

no ambiente natural, quando a presença de obstáculos artificiais, como as

barragens, diminui ou até mesmo impede a migração e conseqüentemente a

reprodução.

O motivo que impede a ovulação e conseqüentemente a desova em peixes

migradores, quando os mesmos estão confinados ainda não é conhecido. No

período reprodutivo, as fêmeas quando em cativeiro, apresentam os seus oócitos

vitelogênicos, mas não conseguem eliminá-los ao meio externo. Desta forma,

investigações no eixo hipotálamo-hipófise-gônadas devem ser realizadas a fim

entender quais seriam as bases fisiológicas que acarretam este bloqueio.

1.4 Salminus hilariii

A espécie Salminus hilarii (Figura 3), conhecia no Brasil pelo nome popular de

tabarana, é uma espécie migradora, de clima tropical, que vive em ambientes

bentopelágicos (poços profundos onde se acumulam bentos - pequenos crustáceos

e moluscos) e potamódromos (ambientes de rio, água corrente) habitando os rios

das Bacias do São Francisco, Prata e Araguaia-Tocantins, podendo ainda ser

encontrada nas bacias superiores do rio Amazonas e do rio de Orinoco, sendo

também de grande importância na Bacia do Alto Tietê (FROESE & PAULY, 2006).

O corpo desse animal apresenta coloração cinza-esverdeada com nadadeiras

avermelhadas sendo a caudal mais escura que as outras e com uma faixa escura no

centro do pedúnculo. Cabeça com focinho pontiagudo e boca com duas fileiras de

dentes cônicos na mandíbula e no maxilar superior. Podendo seu tamanho atingir 40

cm (FROESE & PAULY, 2006).

Segundo Nelson (1994), S. hilarii pertence à classe Actinopterygii, ordem

Characiformes, família Characidae, gênero Salminus. O gênero Salminus

compreende 3 espécies, Salminus affinis, Salminus brasiliensis e Salminus hilarii.

Estudos recentes têm sugerido que, Bryconinae e Salmininae (Figura 4),

compartilhando vários caracteres cromossômicos, podem formar uma unidade

monofilética entre os Characidae (CARVALHO et al., 1998, MARGARIDO et al.,

1999).

Segundo Fink & Fink (1981), entre os peixes teleóteos (Figura 5), os

Characiformes e os Siluriformes formam um grupo irmão entre si, e, embora formem

um grupo irmão dos Cypriniformes, estão mais próximos entre si do que com o

último. Além disso, sugere também que os Cypriniformes seriam mais antigos

evolutivamente e que Characiformes e Siluriformes teriam surgido mais

recentemente.

Figura 3 – Salminus hilarii

Figura 4- Família Characidae, suas subfamílias, gêneros e espécies. O gênero Salminus, ao qual pertence Salminus hilarii, situa-se

na subfamília Bryconinae. A ausência do Salminus hilarii indica a inexistência de trabalhos sobre essa espécie no Genebank.

(Benson, 2004).

Figura 5 – Diversidade dos peixes teleósteos. Número de espécies cadastradas no Fishbase (FROESE & PAULY, 2006).

1.5 Estudo da Expressão gênica

Embora diversas técnicas possam ser utilizadas para quantificação dos níveis

de expressão de um gene, abordagens diferentes são necessárias dependendo dos

níveis de expressão do gene alvo. Recentemente, o método de PCR quantitativo em

tempo real tem se mostrado uma ferramenta de extrema importância na

quantificação de RNAs mensageiros em baixos níveis, tornando a quantificação mais

rápida e acurada. Diferente de métodos tradicionais que utilizam espectrofotometria

para quantificação (HASSIN, 1995, JACKSON 1999).

1.6 PCR em Tempo Real

A técnica de PCR quantitativo em tempo real é muito sensível, podendo ser

usada quando se deseja quantificar a expressão de RNAs mensageiros expressos

em baixos níveis. Possibilita a detecção direta dos produtos da PCR durante a fase

exponencial da reação, combinando amplificação e detecção em um só passo.

A facilidade de detecção por esse método tem possibilitado seu emprego no

estudo de diversos genes (SAITO et al., 2003; VONG et al., 2003; DHEDA et al.,

2004, SOUTO et al., 2004; OLSVIK et al., 2005; SO et al., 2005).

Com a finalidade de detectar o sinal de fluorescência durante as reações,

diversos sistemas têm sido desenvolvidos. Em PCR em tempo real utilizando o

sistema de sondas TaqMan, leva-se em consideração a atividade exonuclease 5’ - 3’

da enzima Taq DNA polimerase, e a construção de sondas de oligonucletídeos

marcadas duplamente, baseadas no princípio FRET (do inglês, Fluorescence

Resonance Energy Transfer). A emissão do sinal de fluorescência ocorre somente

quando as sondas são clivadas. Devendo a sonda utilizada ser específica para o

gene de interesse e marcada duplamente com um corante “repórter” em uma

extremidade e um corante “silenciador” na outra. Quando na forma livre, a

transferência de energia fluorescente ocorre de maneira que a emissão pelo

“repórter” é absorvida pelo “silenciador”. No momento em que ocorre a degradação

da sonda pela atividade nuclease da enzima Taq DNA polimerase, durante a PCR,

os corantes repórter e silenciador são separados e a emissão de fluorescência do

repórter, não mais absorvida pelo silenciador, resulta em um aumento de emissão de

fluorescência pelo repórter, que é detectada e quantificada (GIULIETTI et al., 2001;

GINZINGER, 2002) (Figura 6).

Recentemente, sistemas mais sofisticados têm sido desenvolvidos. Estes,

embora também baseados no princípio FRET, dispensam a necessidade de hidrólise

por atividade nuclease (Figura 7).

Uma outra forma de detecção consiste na utilização de corantes como o

SYBR Green, que é capaz de se ligar ao DNA dupla fita e emitir fluorescência

(Figura 8). O uso deste método de detecção tem sido bastante empregado em

ensaios de PCR quantitativo em tempo real, pois apresenta a vantagem de ser mais

barato em relação à construção de sondas marcadas. Um aspecto importante no uso

de SYBR Green é que os primers específicos utilizados na reação de PCR devem

ser desenhados cuidadosamente para evitar a amplificação de produtos

inespecíficos e formação de dímeros, uma vez que esse corante se liga a qualquer

DNA dupla fita.

Figura 6 – Sistema TaqMan. Esquema de funcionamento do sistema (CARVALHO 2006).

Figura 8 - SYBR Green intercalado em DNA (CARVALHO 2006).

Figura 7 – Sistema Beacons. Dispensa a necessidade de hidrólise

por atividade nuclease (CARVALHO 2006).

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

O objetivo principal do presente estudo foi avaliar a expressão das

gonadotropinas em fêmeas de Salminus hilarii ao longo do ciclo reprodutivo e

verificar a existência de pos síveis diferenças de expressão destas gonadotropinas

em peixes com a migração reprodutiva bloqueada.

2.2 Objetivos específicos

• Investigar a existência de duas gonadotropinas (FSH e LH) em fêmeas de

Salminus hilarii.

• Caracterização parcial das subunidades β dos genes FSH e LH de Salminus

hilarii.

• Comparar a expressão dessas gonadotropinas ao longo do ciclo reprodutivo;

• Verificar a existência de diferenças na expressão desses hormônios quando

os peixes são impedidos de realizar a migração reprodutiva.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Material biológico

Fêmeas adultas de S. hilarii foram capturadas ao longo de um ano em

diferentes fases do desenvolvimento gonadal (Figura 9), em dois diferentes pontos

do Rio Tietê no trecho correspondente à Bacia do Alto Tietê e Cabeceiras. No

primeiro ponto (Rio), os animais foram capturados em uma área lótica deste rio

(Figura 10) e no segundo ponto, em uma área lêntica, à jusante da Barragem do

Reservatório de Ponte Nova (Figura 11). No mapa situado à Figura 12, estes dois

pontos de coleta podem ser localizados no Rio Tietê. Os animais do Rio, por

estarem em um trecho livre para migração foram considerados como grupo controle

neste trabalho.

Figura 11 – Rio Tietê – Ponto de coleta 2

(poço da barragem).

Figura 10 – Rio Tietê – Ponto de coleta 1.

Figura 9 - Estádios do ciclo reprodutivo do S. hilarii (Amaral, 2006).

Os animais do terceiro grupo experimental, chamado de cativeiro, foram

mantidos por 7 anos em cativeiro e no primeiro semestre de 2005, 24 fêmeas foram

distribuídas em 2 viveiros de 100m

(Figura 13) na Piscicultura da Barragem de

Ponte Nova (12 fêmeas por viveiro). Durante estes 7 anos em cativeiro, os animais

não se reproduziram por isso representam um grupo ideal para a investigação do

bloqueio da reprodução.

Figura 12 – Mapa de localização dos pontos de coleta: Rio (1) e Barragem (2)

(AMARAL, 2006).

Figura 13 – Viveiros – Tanques com 100m

na Piscicultura da Barragem de Ponte Nova.

Utilizados para criação dos animais de cativeiro.

No cativeiro, os animais foram alimentados diariamente ad libitum com uma

ração comercial de 40% de proteína bruta (Agribrands do Brasil) e granulometria de

15mm.

A concentração de oxigênio dissolvido na água foi monitorada diariamente

com um oxímetro (YSI) que registra também a temperatura da água.

Neste estudo os animais estão sendo classificados em Repouso (Fig.14),

Maturação Avançada (Fig.15) e Regressão (Fig.16).

As hipófises (Figura 17) foram extraídas, congeladas e armazenadas a –80

Figura 14: Ovários – Fase de repouso.

Figura 15: Ovários – Fase de maturação

avançada.

ura 16: Ovários

–

Fase de re

ressão

3.2 Extração de RNA total

O RNA total da hipófise de S. hilarii nos estádios de repouso, maturação

avançada e regressão, foi isolado utilizando o kit SV Total RNA Isolation System

(Promega) de acordo com as instruções do fabricante. É importante salientar o uso

de DNAse contida no kit, que impede a contaminação da amostra de RNA total por

DNA genômico (VERZOLA 2004), o que afetaria o resultado da quantificação. Os

RNAs totais extraídos foram quantificados por leitura em espectrofotômetro a 260

nm e a análise qualitativa, pela verificação da pureza (relação DO a 260nm/DO a

280nm), da integridade e da presença de DNA residual (por separação em gel de

agarose). Procedimento idêntico foi realizado utilizando-se hipófise de uma carpa

fêmea (Cyprinus carpio) a fim de servir como controle positivo.

Figura 17 – Hipófise de S. hilarii

3.3 Iniciadores

3.3.1 βFSH

A Figura 18 mostra todos os iniciadores (oligosiniciadores) utilizados nos

experimentos. A princípio foram utilizados iniciadores para a subunidade β do gene

FSH do Oncorhynchus tshawytscha, Chinook salmon, (iniciadores 1 e 2),

gentilmente fornecidos pelo Dr. Ronaldo Araújo de Carvalho do Laboratório de

Animais Transgênicos e Proteínas Recombinantes da Universidade de Mogi das

Cruzes. Além disso, devido à inexistência de trabalhos envolvendo a tabarana,

houve a necessidade de uma pesquisa no banco de dados de seqüências de genes,

para a definição de regiões conservadas que pudessem servir como base para a

construção dos iniciadores. As seqüências de nucleotídeos do cDNA da subunidade

β do FSH de alguns Cypriniformes e Siluriformes foram obtidas do GenBank do

National Center for Biotechnology Information (NCBI) (BENSON, 2004). Com base

no alinhamento dessas seqüências, foram desenhados 4 oligos iniciadores de

acordo com regiões conservadas nesses genes (Figura 18 - iniciadores 3 e 4,

Siluriformes, 5 e 6, Cypriniformes).

3.3.2 β- LH

Da mesma forma como para o βFSH, seqüências de βLH de espécies de

peixes das ordens dos Siluriformes e Cypriniformes foram obtidas do GenBank. Tais

seqüências foram então alinhadas com o programa MEGA 3.1 (KUMAR et al., 2004)

para estabelecimento das regiões consenso (regiões do DNA que possuem a

mesma seqüência de bases nitrogenadas) utilizadas para o desenho dos iniciadores

(Figura 18 - iniciadores 7 e 8, Siluriformes, 9 e 10, Cypriniformes).

3.4 RT-PCR

As reações de transcrição reversa foram feitas a partir de 1 µg de RNA total,

em presença da enzima RT-MMLV (Invitrogen) e de inibidor de RNases RNase out

(Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante.

3.5 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Realizaram-se as amplificações utilizando-se a enzima Taq DNA Polimerase

Recombinante (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante e sob as

seguintes condições: 94ºC (3 min), seguidos de 30 ciclos 94ºC (40s), 56ºC (30s) e

72ºC (1 min e 30s) e então 10 min a 72ºC no termociclador Robocycler Gradient 40

(Stratagene), utilizando 5 µL de cDNAs correspondentes aos estádios de repouso,

maturação avançada e regressão. Os oligonucleotídeos mostrados na Figura 18

foram utilizados esperando-se amplificar um fragmento em torno de ~420pb. O

Figura 18 - Seqüência dos iniciadores utilizados nos experimentos

de RT- PCR e PCR em tempo real (Benson, 2004).

número de ciclos (30) foi definido de forma a permanecer em condições não

saturantes (fase exponencial). Submeteu-se o produto da amplificação à migração

em gel de agarose 1%. Procedimento idêntico foi realizado utilizando o cDNA obtido

a partir da hipófise de carpa, a fim de servir como controle.

3.6 Clonagem

Após amplificação, clonou-se os fragmentos de DNA em vetor pGEMT-Easy

(Promega) (Figura 19), de acordo com as recomendações do fornecedor. A

construção foi utilizada para a transformação de E. coli DH5α (Life Technologies).

Figura 19 – pGEM-T Easy (WANG, H. & PERRY, S. E., 2001)

3.7 Mini preparação plasmidial

Selecionaram-se as bactérias recombinantes em meio LB sólido, contendo

ampicilina a 50 µg.µL-1, IPTG e X-gal. A extração do DNA de plasmídeo das

colônias de bactérias foi realizada pelo método de lise alcalina, utilizando-se o

QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Alemanha), conforme instruções do fabricante. A

concentração do DNA plasmidial foi determinada por migração eletroforética em gel

de agarose 1% com 10 mg/ml de EtBr e visualização em um transiluminador de UV

(BIORAD Gel Doc 1.000 Darkroom).

3.8 Digestão de DNA plasmidial com enzimas de restrição

As digestões foram realizadas num volume final de 20 ml. As reações

continham o DNA (10µg); o tampão de reação como discriminado pelo fabricante;

REACT 10X; água deionizada e a enzima de restrição (EcoR1). A reação foi

incubada por 12 horas a 37ºC. A análise foi feita com uma alíquota da digestão em

gel de agarose e migração eletroforética.

3.9 Seqüenciamento

Em uma primeira etapa, clones obtidos com os iniciadores de β FSH de

salmão e com iniciadores para β FSH de Cypriniformes a partir do cDNA da

tabarana e da carpa foram seqüenciados no Laboratório de Virologia Molecular do

Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB) da Universidade de Mogi das Cruzes

(UMC), São Paulo. Numa etapa posterior, novas amostras foram seqüenciadas no

Laboratório de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP. Ambos

experimentos utilizaram seqüenciador automático ABI 377 (Applied Biosystems),

empregando-se os mesmos iniciadores utilizados na reação de PCR e o reagente

Big Dye II (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. A

seqüência de DNA obtida foi comparada com outras presentes no GenBank, através

do programa BLAST. O mesmo procedimento foi realizado utilizando

oligonucleotídeos SP6 e T7.

3.10 PCR em tempo real

Foram sintetizados novos iniciadores para uma região interna da seqüência

parcial do βFSH de S. hilarii isolada (Figura 18 - iniciadores 13 e 14) que, juntamente

com os iniciadores para uma região interna do βLH (Figura 18 - iniciadores 7 e 8),

foram utilizados na análise da expressão de βFSH e βLH, por PCR em tempo real .

O experimentos com PCR em tempo real foram realizados no Laboratório de

Genética da Escola Superior de Agricultura Luis de Queiroz – ESALQ – USP, a partir

do cDNA das amostras da hipófise de todos os animais. Todas as amostras foram

analisadas em duplicata. A quantificação relativa da expressão de um gene pode ser

realizada através da comparação da amplificação com um controle endógeno. A

melhor escolha de um gene como controle endógeno varia de acordo com o tecido

de interesse de um dado experimento. Devido a isso, diversos genes têm sido

selecionados para normalização dos dados de expressão de mRNA (Olsvik et al.,

2005). Para a quantificação dos genes em estudo e normalização do método,

utilizou-se o gene do Fator de Elongação 1 Alfa (EF1α) (Figura 18 - iniciadores 11 e

12), como controle endógeno. Já que, segundo Olsvik e seus colaboradores, num

estudo para validação de seis genes de referência, o gene do Fator Elongação 1 α,

foi aquele que teve melhor avaliação no controle de expressão gênica em Atlantic

salmon. Desta forma, por comparação com os controles, foi possível comparar a

expressão relativa entre os diversos animais em estágios diferentes do ciclo

reprodutivo e de ambientes diferentes. Através desta análise foram obtidos valores

representados da seguinte maneira:

- CT: Threshold Cycle – indica o número do ciclo no qual a quantidade do “alvo”

amplificado alcança um limiar fixo; quanto menor o valor numérico de CT, mais

rapidamente foi atingido o número de cópias estabelecido;

- ∆CT: normalização com gene de expressão constitutiva; foi obtido pela diferença

entre o CT do gene alvo (βFSH ou βLH) e o CT do gene constitutivo (EF1α) para

cada animal.

- ∆∆CT: média do ∆CT do grupo controle - ∆CT de cada animal de cada grupo; Os

valores obtidos foram transformados para Unidades Arbitrárias (UA), através da

equação: UA=2-∆∆CT (MORAES et al., 2004; SOUTO et al., 2004).

Os experimentos de amplificação e quantificaçao foram relizados utilizando

12,5µl de Platinum SYBR Green qPCR SuperMx-UDG (Invitrogen), 0,5µl de primer

sense, 0,5µl de primer antisense, 1µg de cDNA e H2O para um volume final de 25µl.

As amostras foram amplificadas em um termociclador iCycler iQ (Bio-Rad) nas

seguintes condições: 50ºC por 2 minutos, 95ºC por 1 minuto, seguidos de 40 ciclos

de 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 30 segundos. Para curva de melting foram

utilizadas temperaturas de 72ºC a 95ºC com incremento de 0,5ºC a cada 30

segundos.

3.11 Análise estatística

Para a análise estatística foram utilizados o teste de Análise de Variância (One-

way Anova). Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão (SD),

adotando-se o nível de significância de 95%, onde p ≤ 0,05 (VONG et al., 2003).

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Isolamento dos cDNA DE βFSH E βLH DE S. hilarii

Embora as seqüências do βFSH e βLH de vários peixes teleósteos tenham

sido identificadas (ELIZUR et al., 1996; JACKSON et al., 1999; SAITO et al., 2003;

VONG et al., 2003; DHEDA et al., 2004; SOUTO et al., 2004;OLSVIK et al., 2005;

SO et al., 2005), até o presente momento, nenhum trabalho tem relatado estudos

com βFSH e βLH em peixes characiformes. No presente estudo, buscou-se

encontrar regiões conservadas em seqüências desses genes em duas ordens irmãs,

os cypriniformes e os siluriformes, as quais apresentam espécies que já tiveram

esses genes seqüenciados (CHANG et al., 1992; YOSHIURA et al., 1997; LIU et al.,

2001; VISCHER et al., 2003), a fim de identificar seqüências capazes de servir como

iniciadores para os experimentos de isolamento, clonagem e quantificação da

expressão gênica.

4.2 Desenho e utilização dos iniciadores

Os experimentos para amplificação do cDNAs de βFSH da tabarana foram

realizados utilizando 3 pares de iniciadores, sendo um par com base na seqüência

do βFSH de salmonídeos, e que foi gentilmente cedido pelo Dr. Ronaldo Araújo de

Carvalho do Laboratório de Animais Transgênicos e Proteínas Recombinantes da

Universidade de Mogi das Cruzes. Os outros dois pares foram obtidos a partir da

seqüência de βFSH de peixes Cypriniformes e Siluriformes.

As tentativas de amplificação utilizando iniciadores para salmonídeos não

apresentaram resultados positivos.

O alinhamento dos iniciadores utilizados com a seqüência de βFSH de

salmonídeos utilizando o software Mega 3.1, revelou que a região de anelamento do

iniciador sense se dava em um trecho do cDNA que codifica para o peptídeo sinal,

ou seja, uma região que pode apresentar maiores variações em sua seqüência de

espécie para espécie. Este resultado contribui para a confirmação do fato de que os

salmonídeos pertencem a um grupo filogeneticamente mais distante dos

Characiformes, grupo a que pertence a tabarana (FINK & FINK, 1981).

Foram realizados testes com os outros dois pares de iniciadores, em que

apenas os iniciadores baseados na seqüência de βFSH de Siluriformes

apresentaram resultados positivos. Em seguida, foram amplificadas duas bandas,

sendo uma de ~420pb e outra em torno de ~280pb (Figura 20).

4.3 Clonagem do cDNA parcial de βFSH de S. hilarii

Os dois amplicons obtidos foram inseridos no vetor PGEMT-easy e clonados

em bactérias E. coli DH5α. Foram selecionados os clones positivos que foram

confirmados por digestão enzimática e posterior seqüenciamento. A análise dos

resultados do seqüenciamento revelou que clones contendo um inserto de ~420pb

eram na realidade de cDNAs diferentes. Quando comparados com seqüências

depositadas no genebank, um clone mostrou ser semelhante a βFHB de peixe

(Figura 21), o que confirmava nossa busca. Entretanto, vários outros clones

Figura 20 - Eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo (0,5

µg/µl. (M) – Marcador de peso molecular ladder 100pb. (T1) Fragmento de ~420pb e

(T2) fragmento de ~280pb, ambos amplificados a partir de cDNA da hipófise da

tabarana usando iniciadores para βFSH de peixes Siluriformes.

600pb

500pb

400pb

T1 T2

mostraram ser fragmentos do gene que codifica RNA ribossomal 18S em peixes

(Figura 22).

Figura 21 - Confirmação de isolamento da seqüência parcial do βFSH de S. hilari

(Benson, 2004).

Após novos experimentos, foi possível identificar a seqüência parcial do βFSH

da tabarana, um fragmento com 219pb (Figura 23).

Figura 23 - Seqüência parcial do βFSH de S. hilarii. A seta indica o códon de parada. A numeração

é contada a partir do primeiro nucleotídeo do fragmento solado até o ultimo do códon de parada.

Figura 22 - 18S rRNA. Comparação do fragmento solado como sendo 18S RNA ribossomal

(Benson, 2004).

Os resultados sugerem no entanto, que esses iniciadores não podem ser

validados para isolamento do βFSH completo da tabarana, uma vez que o mesmo

se liga inespecificamente a fragmentos do 18S rRNA, tornando inviável seu uso,

principalmente tendo em vista a abundância nos níveis de expressão desse tipo de

gene (~80% do RNA total) (FUKADA, 2005). Dessa maneira, novos experimentos

devem ser realizados a fim de determinar a seqüência completa desse gene em S.

hilarii.

4.4 Seqüência parcial de aminoácidos do βFSH da tabarana

4.4.1 Comparação entre βFSH da tabarana com βFSH de

siluriformes e cypriniformes

Uma vez que a seqüência parcial obtida do βFSH da tabarana apresenta o

códon de terminação, foi possível, a partir daí, deduzir a seqüência de aminoácidos

e compará-la a de outros peixes teleósteos (Figura 24). Tal comparação possibilitou

a identificação da porção terminal do βFSH de S. hilarii e permitiu perceber que essa

região é mais similar entre a tabarana (Characiforme) e Siluriformes, do que de S.

hilarii com Cypriniformes. Tais observações parecem corroborar com estudos de

filogenética que apontam para uma maior proximidade entre Characiformes e

Siluriformes (FINK & FINK, 1981). É possível perceber o maior número de

aminoácidos na região terminal quando comparada a seqüência de S. hilarii com de

Cypriniformes, mas um número igual ao comparar com Siluriformes. Além disso, os

códons de terminação para siluriforme e S. hilarii são idênticos, enquanto que esses

diferem dos códons de terminação nos Cypriniformes estudados.

4.4.2 Comparação entre βFSH de

s. Hilarii com βFSH de

salmoniformes

Diferenças observadas na seqüência de aminoácidos de S. hilarii quando

comparadas ao β FSH de salmão (Figura 25), parecem corroborar com estudos

recentes que indicam que mudanças pontuais de aminoácidos podem conferir ao

βFSH de salmão uma estrutura diferente daquela encontrada em espécies mais

recentes. Tais fatos talvez expliquem os resultados negativos quando ensaios

imunohistoquímicos utilizando anti-hormônio para βFSH de salmão tem sido

realizados para identificação de βFSH de S. hilarii (HONJI, 2006).

Figura 24 - Códons de terminação de algumas espécies de peixes teleósteos.

Characiformes (A), Siluriformes (B) e Cypriniformes (C).

Figura 25 – Seqüência de aminoácidos do FSHβ. Salminus hilarii (1), Ictalurus punctatus (2), Clarias gariepinus (3), Cyprinus carpio (seqüência parcial) (4),

Cyprinus carpio (seqüência completa) (5) e Oncorhynchus tshawytscha (Chinook salmon) (6). Em verde, estão destacadas, nesses organismos, as 12

cisteínas conservadas para β FSH em vertebrados. É possível observar sete dessas cisteínas na seqüência da tabarana. (Benson, 2004).

4.5 Análise da expressão de βFSH e βLH por PCR em tempo real

As Figuras a seguir mostram os resultados do experimento do PCR em tempo

real. Os picos de melting das amostras amplificadas com iniciadores de EF1α

(Figuras 26 e 27), de βFSH (Figuras 28 e 29) e βLH (Figura 30) mostram a

especificidade das amplificações, uma vez que o pico de temperatura de melting é

igual para as amostras de cada experimento. A linha verde da Figura 26 representa

amostra não amplificada.

Figura 26 – Curva de Melting. Amplificação com

iniciadores para Fator de elongação α (Ef1α) utilizados

como controle interno.

Placa 1.

Figura 27 - Curva de Melting. Amplificação com

iniciadores para Fator de elongação α (Ef1α) utilizados

como controle interno. Placa 2.

Figura 28 – Curva de Melting. Amplificação com

iniciadores para βFSH de tabarana. Placa 1.

Figura 29 - Curva de Melting. Amplificação

com iniciadores para βFSH de tabarana. Placa 2.

Figura 30 – Curva de Melting. Amplificação com

iniciadores para βLH de tabarana.

Figura 31 – Curva de amplificação. Amostras

amplificadas com iniciadores para βLH de

tabarana.

As Figuras de 31 à 35 mostram os valores de CT para as amostras testadas.

Figura 32 – Curva de amplificação. Amostras

amplificadas com iniciadores para βFSH de

tabarana. Placa 1.

Figura 33 – Curva de amplificação. Amostras

amplificadas com iniciadores para Fator de

elongação α (Ef1α) utilizados como controle

interno. Placa 1.

Figura 34 – Curva de amplificação. Amostras

amplificadas com iniciadores para βFSH de

tabarana. Placa 2.

Figura 35 - Curva de amplificação. Amostras

amplificadas com iniciadores para Fator de

elongação α (Ef1α) utilizados como controle

interno. Placa 2.

4.5.1 Análise da expressão do FSH e do LH

As figuras a seguir mostram os resultados da quantificação do βFSH (36 à 43)

e do βLH (44 à 51) do tabarana usando como controle interno o gene EF1α.

Figura 36 – Expressão do βFSH durante o ciclo

reprodutivo. Visão geral por ambiente. (N.D.)

significa valor não determinado.

Figura 37 - Expressão do βFSH durante o ciclo

reprodutivo. Visão geral por estado do ciclo. (N.D.)

significa valor não determinado.

Figura 38 – Expressão do

βFSH durante o ciclo

reprodutivo. Estádio de

Repouso. Letras diferentes

indicam diferenças significativas

(p≤0,05).

Figura 39 - Expressão do

βFSH durante o ciclo

reprodutivo. Estádio de

Maturação Avançada. Letras

diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05).

Figura 40 - Expressão do

βFSH durante o ciclo

reprodutivo. Regressão. Letras

diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05).

Figura 41 – Expressão do

βFSH durante o ciclo

reprodutivo. RIO. Letras

diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05).

Figura 42 - Expressão do

βFSH durante o ciclo

reprodutivo. BARRAGEM.

Letras diferentes indicam

diferenças significativas

(p≤0,05).

Figura 43 - Expressão do

βFSH durante o ciclo

reprodutivo. CATIVEIRO. Letras

diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05).

Figura 44 – Expressão do βLH durante o ciclo

reprodutivo. Visão geral por ambiente. (N.D.)

significa valor não determinado.

Figura 45 – Expressão do βLH durante o ciclo

reprodutivo. Visão geral por estádio do ciclo.

(N.D.) significa valor não determinado.

Figura 46 – Expressão do βLH

durante o ciclo reprodutivo.

Estádio de Repouso. Letras

diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05).

Figura 47 - Expressão do βLH

durante o ciclo reprodutivo.

Estádio de Maturação Avançada.

Letras diferentes indicam

diferenças significativas (p≤0,05).

Figura 48 - Expressão do βLH

durante o ciclo reprodutivo.

Estádio de Regressão. Letras

diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05). (N.D.)

significa valor não determinado.

O presente estudo revelou que os níveis de expressão do FSH foram

menores na barragem (6,3x) e no cativeiro (15,6x) do que aqueles encontrados nos

animais na fase de repouso, do rio. Isso sugere que os baixos níveis de expressão

de FSH no ambiente de cativeiro possam estar relacionados com o insucesso de

reprodução dos animas de cativeiro.

Comparando-se os níveis de expressão do FSH ao longo do ciclo reprodutivo,

os dados mostram que os animais presentes no ambiente natural, nos trechos livres

de barramento (rio), ocorre uma queda nesses níveis na transição da fase de

repouso para de maturação avançada, aumentando em seguida esses valores, na

Figura 49 – Expressão do

βLH durante o ciclo

reprodutivo. RIO. Letras

diferentes indicam diferenças

significativas (p≤0,05).

Figura 50 - Expressão do βLH

durante o ciclo reprodutivo.

BARRAGEM. Letras diferentes

indicam diferenças significativas

(p≤0,05). (N.D.) significa valor

não determinado.

Figura 51 - Expressão do βLH

durante o ciclo reprodutivo.

CATIVEIRO. Letras diferentes

indicam diferenças significativas

(p≤0,05).

fase de regressão gonadal. Esse perfil é normalmente encontrado na maioria dos

teleósteos estudados (ROCHA & ROCHA, 2006). No entanto, nos animais

encontrados nos ambientes impactados (barragem e cativeiro), a expressão do FSH

desde o estádio de repouso já apresentou-se baixa, não se alterando com o avanço

da maturação.

Análises da concentração dos esteróides gonadais de S. hilarii, realizadas em

nosso laboratório, mostraram haver um aumento da concentração de estradiol nos

animais do rio com o avanço da maturação e uma queda não significativa na fase de

maturação avançada (AMARAL et al., 2006). O aumento de estradiol na fase de

maturação corrobora a queda da expressão do FSH nos animais Maturação

Avançadas, via o controle de feedback negativo proposto na literatura (ROCHA &

ROCHA, 2006). A queda na expressão gênica do FSH nas fêmeas em maturação

avançada está acompanhada pelo aumento na expressão do LH, que também

corrobora o aumento na síntese de 17α hidroxiprogesterona observada por Amaral

et al., (2006) nas fêmeas do rio, na chegada da fase de maturação avançada do

ciclo reprodutivo.

Nos animais da barragem, os dados do presente trabalho mostram que não

houve aumento da expressão gênica do LH entre os animais em repouso e

Maturação Avançadas, demonstrando claramente que o ambiente da barragem está

inibindo o aumento da expressão gênica desta glicoproteína neste ambiente

impactado. Este dado é interessante quando observa-se o incremento do perfil

plasmático da 17α hidroxiprogesterona, que no rio apresenta um incremento de 4,5 x

da fase de maturação para maturação avançada, enquanto que na barragem este

incremento é de apenas 1,9 x (AMARAL et al., 2006). Tais resultados diferem

daqueles encontrados por Zohar & Mylonas (2001) em estudos com Gilthead

seabream, onde foram não encontradas diferenças nos níveis de expressão do LH

entre animais selvagens e de cativeiro, sendo sugerido que o problema estaria

relacionado com a falta de liberação do LH da hipófise.

No cativeiro, fêmeas em maturação avançada apresentaram expressão do LH

3x menor do que as fêmeas no rio na mesma fase, embora a produção de 17α

hidroxiprogesterona tenha sido a mesma que aquela observada nos animais do rio

(AMARAL et al., 2006). Tais dados sugerem a possibilidade da 17α

hidroxiprogesterona não estar sendo convertida em 17α20β-Progesterona, a forma

ativa responsável pela maturação avançada, uma vez que, mesmo com níveis

similares de 17α hidroxiprogesterona não ocorre a maturação avançada

(BALDISSEROTTO, 2002).

Levando em consideração os dados obtidos neste estudo e a participação do

FSH na expressão de receptores de LH (ANDO & URANO 2005), é possível

especular que, um possível mecanismo que explicaria a relação entre os baixos

níveis de FSH, LH e a concentração de 17α hidroxiprogesterona, uma vez que a

expressão de receptores de LH estaria diminuída, a 17α hidroxiprogesterona

inicialmente produzida seria convertida em testosterona, que por sua vez seria

convertido em estradiol. A medida que o estradiol fosse produzido na fase inicial de

maturação, participaria da síntese de vitelogenina e, por feedback negativo, inibiria a

síntese de FSH. Como o estradiol participa do processo de expressão do LH

aumentando a ação de fatores de transcrição - proteínas que se ligam ao DNA em

regiões específicas e regulam a transcrição - (Figura 52) (ANDO & URANO 2005),

sugere-se um aumento nos níveis de expressão do LH o que manteria os níveis de

17α hidroxiprogesterona e testosterona. Com a inibição da síntese de FSH, a

testosterona deixaria de ser convertida em estradiol, o que afetaria a expressão do

LH. Com uma menor expressão de LH e de seus receptores, os níveis de colesterol

convertidos em 17α hidroxiprogesterona, e conseqüentemente, sua conversão em

17α20β-Progesterona seria reduzida e comprometeria a maturação avançada do

oócito. Aos poucos a síntese de FSH seria retomada, já que não havia inibição pelo

estradiol e o ciclo recomeçaria. Levando em conta esse mecanismo, ocorrerá a

vitelogênese, mas não a maturação avançada e desova.

Figura 52 - Participação do estradiol (E2) na amplificação da expressão do βLH. O

modelo propõem a interação do E2 com receptores e fatores de transcrição de modo a

amplificar a ação do GnRH no estímulo à expressão do βLH.(Adaptado de Ando e Urano,

2005).

Esse fato levaria a suspeitar que, não apenas a síntese reduzida do LH esteja

impedindo a maturação avançada, mas de um possível papel do FSH nesse

processo, uma vez que o FSH poderia estar envolvido no processo de expressão de

receptores de LH. Além disso, estudos com salmonídeos tem demonstrado que o

GnRH produzido pelo hipotálamo pode estimular a expressão tanto de FSH como de

LH (ANDO & URANO, 2005). Tais glicoproteínas são produzidas em células

diferentes da hipófise e esses estudos demonstraram que a gonadotropina a ser

expressa em resposta ao estímulo do GnRH é altamente dependente do estádio do

ciclo reprodutivo do animal, sugerindo a participação de hormônios esteróides na

modulação desse processo (ANDO & URANO, 2005). Dessa forma, isso poderá

levar a supor que os hormônios esteróides estejam também relacionados com a

expressão de receptores de GnRH nas células da hipófise, modulando, de acordo

com a fase do ciclo, quais células devem expressar esses receptores, e assim,

definir qual gonadotropina será sintetizada. Isso sugere que alterações na produção

desses hormônios esteródes, bem como de outros fatores que participem da

expressão de receptores de GnRH possam interferir na síntese de gonadotropinas e,

conseqüentemente, estar relacionado com o insucesso na reprodução em ambientes

impactados. Assim, investigações relacionadas a expressão tanto do GnRH quanto

de seus receptores poderiam dar pistas do motivo da baixa expressão do FSH e do

LH em fêmeas de S. hilarii quando impedidas de migrar.

De uma forma geral, as alterações observadas nos níveis de expressão das

gonadotropinas comparando-se os animais que vivem em ambientes de cativeiro,

justificam o sucesso que os métodos de hipofisação in vivo que suplementam o

animal com gonadotropinas de um doador apresentam sucesso nas técnicas de

reprodução induzida. Além disso, preparações de GnRH hipotalâmico, análogos ou

não, também são utilizados em grande escala na indução à maturação, devido

possivelmente ao seu papel em estimular as células gonadotrópicas hipofisárias a

secretarem tanto o FSH quanto principalmente o LH, desencadeando o processo de

ovulação e desova (ZOHAR & MYLONAS, 2001).

5 CONCLUSÕES E SUGESTÕES

O presente trabalho contribuiu para a confirmação de que Salminus hilarii,

assim como outros teleósteos já estudados possui duas gonadotropinas: FSH e LH.

Além disso, foi o primeiro estudo a utilizar técnicas de biologia molecular, como o

PCR em tempo real, para investigar a expressão dessa gonadotropinas em um

characiforme durante o ciclo reprodutivo e no ambiente natural e impactado. Foi

também o primeiro a identificar a seqüência parcial do cDNA do gene da subunidade

β do FSH de um representante da ordem dos peixes Characiformes, bem como a

seqüência de aminoácidos deduzida a partir dele.

No ambiente natural, o FSH de S. hiilarii é mais expresso no estádio de

repouso. Seu nível de expressão mantém-se elevado durante a fase de maturação,

o que sugere seu envolvimento na vitelogênese. Passada essa fase, seu nível

diminui ao longo da fase de maturação avançada, voltando a elevar-se na fase de

regressão gonadal. Embora ocorra essa queda na fase de maturação avançada, seu

nível de expressão permanece detectável durante todo o ciclo, sugerindo um papel

desse hormônio também no processo de maturação avançada e desova.

Já o LH de S. hilarii apresenta níveis detectáveis de expressão no início da

maturação e segue em elevação durante a fase de maturação avançada até o

período de desova. Em seguida,o LH diminui à medida que o animal entra na fase

de regressão.

O bloqueio migratório interfere na expressão de gonadotropinas em S. hilarii.

O LH parece desempenhar papel chave na maturação avançada e desova, e os

baixos níveis de expressão encontrados no ambiente de cativeiro, possivelmente

estejam relacionados ao insucesso na reprodução desses animais no ambiente

impactado. Além disso, um possível papel do FSH na fase final de maturação e

desova é proposto, uma vez que o mesmo é expresso durante todo o ciclo no

ambiente natural, o que não ocorre nos ambientes impactados.

Para confirmação do que foi observado e do mecanismo aqui proposto, novos

ensaios devem ser realizados para medir o perfil plasmático desses hormônios,

assim como o acúmulo dos grânulos destas glicoproteínas na hipófise. Além disso,

experimentos envolvendo a quantificação da 17α20β-Progesterona poderão ajudar a

compreender melhor o por que de os níveis de 17α hidroxiprogesterona não se

alterarem, embora não haja a desova. Além disso, investigação na expressão do

GnRH e seus receptores contribuirão para um melhor entendimento da baixa

expressão de FSH e LH.

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