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ANÁLISE DA VIABILIDADE DE
TRANSFORMAÇÃO DE DIFERENTES
LEVEDURAS DE INTERESSE
BIOTECNOLÓGICO UTILIZANDO O SISTEMA
CANl
(CGC)
Juliana Ferreira de Meio
Dissertação (Mestrado) apresentada ao programa de
Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia
USP Instituto Butantã IPT, para obtenção do Título
de Mestre em Ciências (Biotecnologia).
Área de concentração: Biotecnologia
Orientador (a): Dra. Elisabete José Vicente
São Paulo, 2006
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ABREVIATURAS
?: comprimento de onda
?g: micrograma
?L: microlitro
?m: micrometro
Ab: absorbância
Ade: mutante de levedura na síntese de adenina
Ap
R
: resistência a ampicilina
CGC: cassete de expressão contendo cDNA da glicoamilase sob controle transcricional
de promotor e terminador PGK, ladeado por fragmentos do gene CAN1
DNA: ácido desoxirribonucléico
his: mutante de levedura na síntese de histidina
IPTG: isopropil B-D-tiogalactopiranosídeo
Kb: quilo base = 1000 pares de bases
leu: mutante de levedura na síntese de leucina
lys: mutante de levedura na síntese de lisina
MAT a: gene de tipo de acasalamento a
MAT ? : gene de tipo de acasalamento ?
nm: nanômetros
pb: pares de bases
PCR: reação de polimerase em cadeia
PEG: polietilenoglicol
pg: picograma
PGK: gene que codifica a fosfoglicerato quinase
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r.p.m.: rotações por minuto
SD: meio mínimo de cultivo de leveduras em glicose
trp: mutante de levedura na síntese de triptofano
ura: mutante de levedura na síntese de uracila
X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactosídeo
YPD: meio completo de cultivo de leveduras em glicose
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RESUMO
Por serem microrganismos eucariontes, as leveduras são capazes de realizar
modificações pós–traducionais das proteínas. Conseqüentemente, a levedura apresenta
enormes vantagens para ser empregada como hospedeira de plasmídios recombinantes,
portadores de informações genéticas provenientes de outros organismos eucariontes. Neste
trabalho, foi utilizado um sistema de transformação genética construído por Camargo (1994),
que possui como gene repórter o cDNA da glicoamilase de Aspergillus. awamori, sob o
controle do promotor e terminador PGK de Saccharomyces cerevisiae. Esse vetor possui as
extremidades do gene CAN1 de S. cerevisiae, que, por recombinação homóloga, provoca
disrupção gênica resultante da integração na região homóloga do gene CAN1 da levedura
transformada. Ao longo das últimas duas décadas, outras leveduras têm sido apresentadas
como sistemas alternativos de expressão por apresentarem vantagens sobre S. cerevisiae. O
uso de leveduras não convencionais (leveduras outras que não S. cerevisiae e
Schizosaccharomyces pombe) vem aumentando drasticamente com o passar dos últimos anos.
Isto despertou o interesse em examinar o sistema de transformação por disrupção de CAN1
em outras leveduras de interesse biotecnológico. Incialmente, empregando-se a técnica de
PCR, verificou-se o potencial de aplicação do sistema CGC como vetor de clonagem em
várias leveduras. Algumas leveduras contêm em seu cromossomo o gene alelo CAN1
funcional e são sensíveis a um aminoácido básico análogo da arginina, a L-canavanina (um
potente inibidor de crescimento de muitos microrganismos). Após o processo de
transformação com o sistema CGC, as células foram selecionadas pelo cultivo em meio
mínimo, acrescido de L-canavanina. Em seguida os transformantes foram analisados quanto a
aquisição da capacidade de produzir halos de amilolise em meio sólido contendo 0,5% de
amido, sendo este degradado por reações de hidrólise em carboidratos menores, pela ação da
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enzima a amilase que rompe as ligações glicosídicas a-1,4 da amilose originando uma mistura
de maltose, arnilopectina e glicose. Rompe também as ligações a-1,4 da amilopectina
originando uma mistura de polissacarídeos denominadas destrinas. Neste trabalho apenas
Candida glabrata, Saccharomyces bayanus e Saccharomyces cerevisiae apresentaram
integração do fragmento CGC, confirmado por PCR e produção da glicoamilase pela
formação de halos de amilolise. Foi avaliada a estabilidade do sistema nestas diferentes
leveduras, tendo sido verificado que a imcorporação heteróloga manteve-se 100% estável
após 144 gerações sem pressão seletiva.
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6
ABSTRACT
For being microorganisms eukaryotes, the leavenings are capable to carry through
modifications pos-traducionais of proteins. Consequently, the leavening presents enormous
advantages to be used as hostess of recombinant, carrying plasmídios of genetic information
proceeding from other organisms eukaryotes. In this work, a system of genetic transformation
was used constructed by Camargo (1994), which it possesses as gene reporter the DNA of
glicoamilase of Aspergillus. awamori, under the control of the promoter and terminador PGK
of Saccharomyces cerevisiae. This vector possesses the extremities of gene CAN1 of S.
cerevisiae, that, for homologous recombination, it provokes resultant genetic disruption of the
integration in the homologous region of gene CAN1 of the transformed leavening. To the
long one of last the two decades, other leavenings have been presented as alternative systems
of expression for presenting advantages on S. cerevisiae. The use of not conventional
leavenings (leavenings others that not S. cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe) comes
drastically increasing with passing of the last years. This being the interest in examining the
system of transformation for disrupção of CAN1 in other leavenings of biotechnological
interest. Incialmente, using itself it PCR technique, verified the potential of application of
system CGC as vector of cloning in some leavenings. Some leavenings contain in its
chromosome the functional gene alelo CAN1 and are sensible to an analogous basic amino
acid of the arginine, the L-canavanina (a powerful inhibitor of growth of many
microorganisms). After the process of transformation with system CGC, the cells had been
selected by the culture in half minimum, increased of L-canavanina. After that the
transforming ones had been analyzed how much the acquisition of the capacity to produce
halos of amilolise in half solid contend 0.5% of starch, being this degraded by hydrolysis
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reactions in lesser carboidratos, for the action of the enzyme? amilase that it breaches the
glicosídicas linkings?-1,4 of amilose originating a maltose mixture, arnilopectina and glucose.
?-1,4 of the amilopectina also breaches the linkings originating a mixture of destrinas called
polissacarídeos. In this work only Candida glabrata, Saccharomyces bayanus and
Saccharomyces cerevisiae had presented integration of it breaks up CGC, confirmed for PCR
and production of glicoamilase for the halo formation of amilolise. The stability of the system
in these different leavenings was evaluated, having been verified that the heteróloga
imcorporação remained 100% after steady 144 generations without selective pressure.
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1. INTRODUÇÃO
1.1. LEVEDURAS
Leveduras constituem um grupo de microrganismos eucariontes, unicelulares, que se
reproduzem assexuadamente por brotamento ou por cissiparidade e que realizam fermentação
alcoólica (Lodder J, et al., 1969). Embora as leveduras sempre tenham sido utilizadas
empiricamente pelo homem no processo de fermentação alcoólica, o conhecimento da
participação destes organismos vivos na fermentação somente foi demonstrado em 1876 por
Louis Pasteur, sendo que 12 anos depois, Hansen isolou leveduras de processo de fermentação
e propagou a cultura pura.
As leveduras apresentam grande importância sob vários aspectos biotecnológicos: são
agentes de fermentação alcoólica (produção de álcool industrial e produção de bebidas
alcoólicas destiladas e não destiladas); são utilizadas na panificação; são importantes fontes
de proteína e de fatores de crescimento, são utilizadas como suplemento protéico na
alimentação animal e humana. Todavia, algumas espécies apresentarem-se patogênicas a
plantas, animais e ao homem (Tuse, 1984).
Existe uma grande biodiversidade de leveduras na natureza, sendo que até o momento
existem apenas 700 espécies descritas e assim, esse número representa uma pequena fração do
total existente em nosso planeta (Walker, 1998). Dentro dos ascomicetos, estima-se a
existência de 62.000 gêneros e 669.000 espécies cuja maioria ainda não foi descrita
(Hawksworth et al., 1994). Com o surgimento de novas demandas de mercado, e a vasta
possibilidade de aplicação desses microrganismos, vem crescendo o interesse no isolamento e
preservação de um crescente número de novas espécies de leveduras.
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9
1.2. LEVEDURAS COMO ORGANISMO HOSPEDEIRO DE GENES
HETERÓLOGOS
O pão, a cerveja e o vinho representam os produtos mais expressivos do processo de
utilização das leveduras. Em todos esses processos, a levedura Saccharomyces cerevisiae tem
um papel de destaque, onde além de ser considerada um dos microrganismos mais úteis ao
homem, é um dos sistemas eucarióticos mais bem conhecidos. Sua genética é bem dominada
e seu genoma foi totalmente seqüenciado (Goffeau et al., 1997), fato este que representou
uma das maiores conquistas da Biologia do século XX.
Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, a levedura Saccharomyces
cerevisiae pôde ser empregada em estudos de genética molecular a partir do final dos anos 70,
quando se conseguiu pela primeira vez a transformação genética da levedura (Hinne et al.,
1978). No campo da pesquisa aplicada, a levedura Saccharomyces cerevisiae logo se destacou
como um interessante candidato para a expressão de genes heterólogos de interesse
biotecnológico. Embora a bactéria Escherichia coli represente um dos mais poderosos
sistemas de expressão heteróloga, várias proteínas eucarióticas de interesse comercial não
puderam ser expressas eficientemente neste microrganismo procariótico. Entre as razões para
esses insucessos poderíamos citar: conformação incorreta da molécula protéica, ausência de
modificações pós-traducionais e baixos níveis de expressão. Alguns desses problemas
puderam ser resolvidos quando as mesmas proteínas foram expressas em Saccharomyces
cerevisiae. O ambiente intracelular da levedura é adequado para a ocorrência de várias
reações que normalmente ocorrem em células de mamíferos (Castilho-Valavicius et al.,
1992). Mecanismos de transcrição, tradução e processamento pós-transcricional e pós-
traducional, são semelhantes àqueles observados em células de eucariontes superiores
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10
(Kingsman e Kingsman, 1988). Modificações pós-traducionais, tais como, acetilação,
fosforilação e glicosilação, podem ser necessárias para otimização da atividade protéica.
Proteínas heterólogas, quase sempre resultam em produtos com diferentes modificações em
relação à proteína nativa. Diferente de muitas proteínas heterólogas expressas em Escherichia
coli, por exemplo, proteínas expressas em S. cerevisiae são acetiladas e, portanto, mais
semelhantes às proteínas humanas. Este fato faz com que a levedura seja um dos organismos
escolhidos para expressão funcional de genes eucarióticos clonados (Romanos et al, 1992).
Por vir sendo utilizada há milênios sem causar problemas de patogenicidade, a
levedura S. cerevisiae é um dos poucos microrganismos que recebeu status de GRAS
(Generally Recognized As Safe) pelo FDA americano.
Ao longo das últimas duas décadas, outras leveduras têm sido apresentadas como
sistemas alternativos de expressão por apresentarem vantagens sobre S. cerevisiae e, assim, o
uso de leveduras não convencionais (leveduras outras que não Saccharomyces cerevisiae e
Schizosaccharomyces pombe) vem aumentando dramaticamente com o passar dos últimos
anos. Uma categoria de leveduras que vem sendo muito utilizada é o das leveduras
metilotróficas, que utilizam o metanol como fonte de carbono e energia, podendo-se citar
como exemplos Pichia pastoris, Hansenula polymorpha e Candida boidinii (Wolf, 1996).
A comparação genômica em eucariotos era limitada pela considerável distância
filogenética entre o primeiro organismo cujo genoma havia sido totalmente seqüenciado, a
levedura S. cerevisiae (Goffeau, A. et al, 1996); um nemátóide, Cenorhabditis elegans (The
C. elegans sequencing cosortium, 1998); um inseto, Drosophila melanogaster (Amanatides,
et al, 2000); uma planta dicotiledônea, Arabidopsis thaliana (The Arabidopsis Genome
Initiative, 2000), e o Homo sapiens (International Human Genome Sequencing Consortium,
2001).
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De acordo com Bernardo Dujon (2004) que trabalhou com grupos distantes de
hemiascomicetos, Candida glabrata, o segundo maior causador de candidíase humana, está
filogenéticamente mais próximo à Saccharomyces cerevisiae do que a Candida albicans, uma
vez que a levedura.
Na indústria, Saccharomyces cerevisiae vem sendo utilizada em processos industriais
com fermentação de alimentos como pão, cerveja, extrato de levedura, produção de aroma e
sabor em alimentos, vinho, sakê, aguardente, bebidas destiladas em geral, glicerol,
suplementação para ração animal e na produção de álcool combustível. Com a tecnologia do
DNA recombinante, tanto S. cerevisiae, quanto leveduras relacionadas ganharam grande
impulso na produção de proteínas heterólogas, como biofármacos (Walker, 1998).
Com o desenvolvimento tecnológico, as indústrias estão buscando cada vez mais
novas alternativas para aperfeiçoar a produção, e com isso vem crescendo o interesse de
leveduras recombinantes.
Porém, existe um tópico muito importante quando se trata de microrganismo
recombinante: a comercialização desse produto gerado por um organismo geneticamente
modificado, que envolve outros campos de discussão como, científico, econômico, técnico,
marketing, segurança, regulamentos legais e éticos, que precisam ser resolvidos entre todos
envolvidos no processo e não somente os que lucram com a comercialização do produto
(Walker, 1998). Os aspectos legais, econômicos e sociais da utilização de produtos
geneticamente modificados, estão sendo revistos com muito interesse pelos órgãos
competentes, pois muitas desses produtos recombinantes já estão sendo comercializados e
muitos outros ainda estão sendo desenvolvidos.
No Brasil, um dos setores que desperta grande interesse para a aplicação de leveduras
é o da indústria de etanol combustível. Devido à crise mundial do petróleo, houve o interesse
em aumentar a produção de etanol, especialmente no Brasil, que teve em 1975 o incentivo
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governamental, com a aprovação do Plano Nacional de Álcool (PNA), através da fermentação
do caldo da cana por leveduras de panificação (Walker, 1998).
1.3. VETORES DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS E SISTEMAS
DE TRANSFORMAÇAO
Em paralelo ao desenvolvimento de técnicas de transformação genética para leveduras,
novos vetores também vêm sendo desenvolvidos, onde geralmente são bifuncionais, que
podem ser usados tanto em bactéria quanto em leveduras. Esses vetores contem uma origem
de replicação em bactéria, que permite sua propagação em alto número de cópias, uma
seqüência que confere resistência a antibióticos, permitindo assim a seleção dos
transformantes e seqüências que complementam marcas auxotróficas, que permite a seleção
dos clones transformantes em leveduras.
Um sistema de transformação genética depende de alguns fatores, como a introdução
de uma molécula de DNA exógeno, a manutenção desta informação no organismo hospedeiro
e a possibilidade de seleção desse evento (Wery et al., 1999).
Somente após Hinnen et al. (1978) terem demonstrado ser possível a transformação
genética de protoplastos da levedura S. cerevisiae, pôde-se utilizar este microrganismos como
hospedeiro para a expressão de proteínas heterólogas.
A maioria dos vetores de expressão construída apresenta genes marcadores para a
seleção dos transformantes, sendo os mais freqüentes URA3 e LEU2 (Ratzkin e Carbon,
1980); promotores para controlar a expressão dos genes heterólogos (Shuster, 1989); e,
origem de replicação em S. cerevisiae e E. coli, permitindo que alguns passos da manipulação
genética sejam realizados em bactérias, onde o rendimento na produção de plasmídios é maior
(Schenberg e Bonatelli, 1987).
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A maioria dos plasmídios de levedura utilizados para a expressão de proteínas
heterólogas pertence à classe dos epissomais (Yep – Yeast Epissomal Plasmids), que
apresentam características importantes como alta eficiência de transformação, grande número
de cópias por célula e segregação correta durante a divisão celular (Broach, 1983).
Plasmídios centroméricos (YCp), apresentam regiões centroméricas, plasmídios
lineares (YLp), que apresentam centrômeros e dois telômeros e plasmídios integrativos, que
são mais estáveis, embora com número de cópias menor (Schenberg e Bonatelli, 1987).
Plasmídios replicativos (YRp), contêm uma seqüência de replicação autônoma de levedura
(ARS), sendo capazes de se replicar autonomamente na levedura (Struhl et al., 1979).
Atualmente, há grande interesse em desenvolver novos vetores, que dispensem a
utilização de marcas auxotróficas para seleção e células recombinantes, uma vez que a
presença destas marcas limita-se às leveduras de laboratório, não abrangendo as linhagens
industriais, que geralmente são prototróficas. Portanto, estratégias alternativas, como a
disrupção do gene da permease da arginina (CAN1) que permite a seleção positiva dos clones
transformantes resistentes à L-canavanina (CAN1), são mais adequadas para transformação e
conseqüente seleção de linhagens industriais prototróficas recombinantes (Camargo, 2000).
1.10. PROMOTORES UTILIZADOS PARA A EXPRESSÃO EM Saccharomyces
cerevisiae
As primeiras proteínas recombinantes foram obtidas na levedura utilizando-se
promotores da via glicolítica, como é o caso da produção do alfa interferon humano utilizando
o promotor do gene da álcool desidrogenase I (ADH1) (Hitzeman et al., 1981).
O promotor PGK, do gene da fosfoglicerato quinase, foi utilizado para a produção de
proteínas heterólogas (Tuite et al., 1982; Chang et al., 1986) com níveis de expressão
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semelhantes aos obtidos com o promotor ADH1. Sistemas baseados no controle pelo
promotor do gene da gliceraldeído 3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) (Bitter e Egan, 1984),
permitiram a expressão da timidina-quinase do Herpes vírus (Zhu et al., 1984) e transcriptase
reversa do HIV (Barr et al., 1987b).
Altos níveis de expressão também podem ser obtidos quando apenas porções
derivadas destes promotores são utilizadas (Rosenberg et al., 1990). Baseados nestas
características foram construídos promotores híbridos, contendo regiões do promotor GAPDH
e regiões reguladoras de promotores indutíveis como GAL1 (Bitter e Egan, 1988), GAL7
(Wagenbach et al., 1991) e ADH2 (Cousens et al., 1987).
1.10. PROMOTOR PGK
O gene da fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae é altamente expresso
“in vivo” e possui sinais transcricionais tanto na região promotora quanto na região
codificadora.(Ogden et al., 1986; Dobson et al., 1982; Mellor et al., 1985).
A eficiência do promotor PGK tem sido demonstrada pelos altos níveis de expressão
de vários genes heterólogos em leveduras (Tuite et al., 1982; Mellor et al., 1983; Kingsman et
al., 1985).
Recentemente, em estudos com o promotor PGK, identificou-se a posição da
seqüência de ativação “upstream”, sendo que a deleção deste elemento causa uma significante
queda nos níveis de transcrição (Ogden et al., 1986). Em vários genes de leveduras têm sido
demonstrados que também possuem esta seqüência de ativação (Guarente, L., 1984). Em
alguns casos esta seqüência de ativação está envolvida na interação específica DNA-Proteína
(Giniger et al., 1985; Hope, I.A. and Struhl, K.,1985; Arcangioli, B. and Lescure, B.,1985;
Hope, I.A. and Struhl, K., 1986;).
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Genes heterólogos sob o comando do promotor PGK, estão sujeitos à indução pela
glicose, o que leva a conclusão de que o promotor PGK está sujeito à regulação pela fonte de
carbono; entretanto o grau de indução ainda não foi determinado.
Todo o controle da expressão do gene glicolítico em leveduras ainda não está bem
elucidado, entretanto Clifton and Fraenkel (1981) relataram a identificação de um gene que se
acredita estar envolvido neste processo, que é chamado de GCR ('glycolysis regulation'). A
mutação nesse gene resulta em 50-80% e 90-95% na redução da enzima glicolítica em
substratos fermentáveis e não fermentáveis. Isto sugere que o produto do GCR está envolvido
no mecanismo que controla a expressão do gene glicolítico.
1.4. O SISTEMA CAN1 DE TRANSFORMAÇÃO
O gene CAN1, localizado no braço esquerdo do cromossomo V de S. cerevisiae,
codifica a proteína permease da arginina (CAN1p) (Opekarová et al., 1998).
Em 1979, Broach e colaboradores isolaram o gene CAN1 de S. cerevisiae e
construíram o plasmídio TLC-1. Alguns anos depois, Hoffmann (1985) caracterizou esse
gene, descrevendo-o com 2381 pares de bases.
A permeabilidade celular controlada pelo gene CAN1, é mediada por uma proteína
associada à membrana celular. Durante o crescimento em meio mínimo, a permease da
arginina é o único sistema de transporte desse aminoácido para dentro da célula (Broach et al.,
1979 e Whelan et al., 1979). O transporte da arginina através da membrana plasmática em
levedura é mediado pelo amino ácido permease que é codificado pelo gene GAP 1 e pelo gene
constitutivo altamente específico CAN1. O Can1p é altamente específico. O CAN1 de
Saccharomyces cerevisiae possui grande afinidade e especificidade a arginina e lisina, sendo
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que tem maior afinidade a arginina do que pela lisina. (Alena Matijèková e Hana Sychrová,
1997).
Linhagens de levedura, com o gene CAN1 funcional, são sensíveis a um aminoácido
análogo da arginina, que foi isolado da leguminosa Canavalia ensiformis na forma de L-
canavanina (The Merck Index, 1976). A L-canavanina é um potente inibidor do crescimento
de muitos microrganismos, incluindo Saccharomyces cerevisiae (The Merck Index, 1976).
A célula produzindo a permease da arginina incorpora o aminoácido arginina e por
conseqüência a L-canavanina caso esteja presente no meio o que provocará uma inibição do
crescimento celular enquanto o gene CAN1 estiver sendo expresso. Porém, se o gene CAN1
sofrer uma mutação, deixará de produzir a permease da arginina, não permitindo a entrada da
L-canavanina, fazendo com que ocorra crescimento celular após alguns dias de incubação.
Neste trabalho, foi utilizado um sistema desenvolvido em nosso laboratório que já
havia sido comprovado ser capaz de transformar com eficiência e estabilidade diferentes
linhagens de Saccharomyces cerevisiae. Este sistema de transformação genética é capaz de
integrar-se no gene da permease da arginina (CAN1), causando disrupção gênica e permitindo
a seleção dos clones transformantes que se tornam resistentes à L-canavanina (análogo tóxico
da arginina) Figura 1, introduzindo assim, uma informação genética adicional, que se mantém
estável como parte do genoma da célula hospedeira.
O vetor em questão é composto pelo promotor e terminador transcricional da
fosfoglicerato quinase (PGK), inserido dentro da seqüência do CAN1, contendo como gene
repórter o cDNA da glicoamilase de A. awamori.
Neste trabalho, além da levedura Saccharomyces cerevisiae, foram utilizadas outras
leveduras como Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces bayanus, Hansenula
polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Candida tropicalis, Candida glabrata,
Kluyveromyces fragilis e I. orientalis, tendo como objetivo examinar a eficiência de
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transformação do sistema CGC e sua viabilidade como vetor de transformação genética de
outras leveduras além de S. cerevisiae, bem como atividade enzimática da glicoamilase
secretada pelas células transformadas e a estabilidade da informação genética integrada nos
cromossomos dos transformantes.
1.4. O SISTEMA CANAVANINA
Muitos dos aminoácidos não protéicos sintetizados por plantas superiores fazem parte
de uma grande diversidade de metabólitos secundários. (Robinson, 1975; Fowden, 1976).
Muitos desses aminoácidos não protéicos são relatados estruturalmente como constituintes
de proteínas (Fowden, Lewis, and Tristram, 1967). Um excelente exemplo é a L-canavanina,
a guanidinoxi análogo estrutural da L-arginina,
As funções bioquímicas e fisiólogicas de aminoácidos não protéicos ainda não são
completamente entendidas mas tem sido estabelecido seu modo de ação.
A abilidade da canavanina de inibir o crescimento microbiano tem sido estudada por
mais de vinte e cinco anos. Horowitz and Srb (1948) mostrou a toxicidade da canavanina em
Neurospora e relatou que a arginina neutraliza a inibição do crescimento canavanina-
dependente.
As propriedades antimetabólicas da L-canavanina tem sido demonstrada com um
amplo espectro de organismos, como pode ser observado na tabela abaixo:
ORGANISMOS EFEITOS BIOLÓGICOS REFERÊNCIAS
Streptococcus bovis Estimula o crescimento em
baixa concentração de CO
2
e
de arginina
Prescott et al., 1957
Sthaphylococcus aureus Diminuição da atividade
enzimática
Richmond, 1959ª
Saccharomyces, Torulopsis e
outras leveduras
Severa redução de
crescimento
Miller & Harrison, 1950;
Walker, 1955ª
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18
Sacharomyces cerevisiae Redução da atividade
respiratória
Seaston et al., 1973
Candida albicans Redução da sobrevivência
com exposição a luz UV
SArachek et al., 1969
É enfatizado que a canavanina pode competir com a arginina e efetivamente inibe
enzimas do metabolismo da arginina. Além disso, Tschiersch (1966) demonstrou que a
canavanina inibe não competitivamente as enzimas álcool desidrogenase, ß-glucosidase,
oxinitrilase entre outras.
As potentes propriedades antimetabólicas dos aminoácidos não protéicos têm sido
firmemente estabelecidas (Fowden, Lewis, and Tristram, 1967; Bell, 1972). Como no caso da
canavanina, estes metabólicos tóxicos são frequentemente relatados como aminoácidos que
entram na formação de proteínas. Estas considerações devem ter levado Fowden (1965) a
postular que a via metabólica culmina na síntese de certos aminoácidos não protéicos podendo
refletir em uma brusca alteração no complemento genético responsável pela formação de
aminoácidos essenciais.
As plantas superiores sintetizam uma série de aminoácidos não protéicos nos quais são
altamente tóxicos a vários herbívoros e constituem 10% do peso seco da semente. (Freeland
and Janzen, 1974). A presença de altas concentrações desses aminoácidos tóxicos em plantas
leguminosas deve resultar de respostas bioquímicas destas plantas pela pressão seletiva de
animais e plantas patogênicas (Rehr, Bell, Janzen and Feeny, 1973ª).
A L-canavanina, um guanidinoxy análogo a L-arginina, é um representante deste
grupo. Isto forneceu valiosa contribuição dentro dos efeitos biológicos e do modo de ação do
amino-ácido não protéico que age como análogo do amino ácido protéico. A arginil – tRNA
sintetase é a enzima responsável pela incorporação da canavanina na cadeia polipepitidica.
Esta proteína, contendo a canavanina é responsável por alterações no metabolismo de DNA,
RNA, tanto quanto a síntese protéica. A canavanina também afeta reações catalíticas e
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19
regulatórias do metabolismo da arginina, captação da arginina, formação de componentes
estruturais e outros processos celulares. Nessas vias, a canavanina altera reações bioquímicas
essenciais e torna-se um potente antimetabólito da arginina em espécies selvagens. As
propriedades deletérias da canavanina rendem uma alta toxicidade secundária da planta que
provavelmente atua como um agente aleloquímico que detém atividade alimentar de insetos e
outros herbívoros. (Rosental, 1977).
C - N - C - C - C - C - C
Figura Y. Estrutura molecular do amido.
Figura 1.
Fórmulas do aminoácido L
-
arginina e de seu análogo L
-
canavanina.
(The Merck
Index, 1976; Lehninger et al., 1993)
L-CANAVANINA
L-ARGININA
C
6
H
14
N
4
O
2
C
5
H
12
N
4
O
2
HN
H H H H
O
OH
H H H H
NH
2
H
2
N
H H H
H H H NH
2
C - N - C - C - C - C
H
2
N
HN
OH
O
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20
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
21
2. OBJETIVOS
O objetivo desse trabalho foi analisar a capacidade de abrangência do sistema CGC
em transformar outras leveduras que não Saccharomyces cerevisiae, através da disrupção do
gene da permease da arginina (CAN1).
Para tanto, o sistema CGC de transformação foi estudado quanto a:
2.1. Detecção do gene CAN1 nas diferentes leveduras através da amplificação por
PCR;
2.2. integração do fragmento de DNA linear CGC em diferentes gêneros e espécies
de leveduras;
2.3. confirmação da presença do fragmento CGC integrado no gene CAN1 do
genoma das leveduras;
2.4. Análise quanto a estabilidade da informação genética integrada nos genomas
das diferentes leveduras.
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
22
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. LINHAGENS E VETORES DE TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA
3.1.1. LEVEDURAS:
Tabela 1. Leveduras utilizadas.
LINHAGEM CARACTERÍSTICA GENOTÍPICA PROCEDÊNCIA
S. cerevisiae
S288C
S. cerevisiae MAT? , wt, CAN1
, linhagem
padrão, com genoma seqüenciado.
ICB/USP
Pichia pastoris Linhagem prototrófica ICB/USP
Candida
tropicalis
Linhagem prototrófica
ICB/USP
Schizosaccharo
myces pombe
Linhagem prototrófica
ICB/USP
Yarrowia
lipolytica
Linhagem prototrófica
ICB/USP
Hansenula
anomala
Linhagem prototrófica
ICB/USP
Candida
lusitaneae
Linhagem prototrófica
ICB/USP
Candida
glabrata
Linhagem prototrófica Fundação Oswaldo Cruz
Saccharomyces
bayanus
Linhagem prototrófica UNESP
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
23
Issatchenkia
orientalis
Linhagem prototrófica UNESP
Kluyveromyces
lactis
Linhagem prototrófica ICB/USP
Kluyveromyces
marxianus
Linhagem prototrófica
ICB/USP
ICB/USP – Linhagens já existentes na coleção de cultura do laboratório
UNESP – Linhagens gentilmente cedidas pela Universidade Estadual de São Paulo –
Araraquara
Fundação Oswaldo Cruz – Linhagens gentilmente cedidas pela coleção da Fundação Oswaldo
Cruz – Rio de Janeiro.
3.1.2 BACTÉRIA:
Tabela 2. Bactéria utilizada.
LINHAGEM CARACTERÍSTICA GENOTÍPICA PROCEDÊNCIA
DH5?
Escherichia coli. F'/endA1 hsdR17(r
k
-
m
k
+) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nal
r
)
relA1 ?(lacZYA-argF)U169 (?80dlac?
(lacZ)M15)
ICB/USP
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
24
3.1.3. VETORES DE TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA:
Tabela 3. Vetores de transformação genética utilizadas.
VETOR CARACTERÍSTICAS REFERÊNCIA
pUCGC
CGC
pUC19 contendo CGC, 7,8Kb (Figura 2)
Fragmento de DNA dupla fita ladeado por
seqüências a montante e a jusante do gene
CAN 1 de S. cerevisiae
contendo o cassete de
expressão do cDNA da glicoamilase de
Aspergillus awamori.
Contém a seqüência
promotora PGK, da glicoamilase, seqüência
estrutural da glicoamilase e terminador de
transcrição da glicoamilase, 7,8Kb
Camargo, 1994.
Camargo, 2000.
Figura 2. Esquema representativo do vetor pUCGC e dos respectivos sítios de restrição que
libera o fragmento CGC. (CAN1 – seqüência do gene que codifica a permease da arginina,
glico – glucoamilase, pPGK – promotor da fosfoglicerato quinase, tPGK – terminador da
fosfoglicerato quinase.
CAN1CAN1
tPGKtPGK
GLICOGLICO
pPGKpPGK
CAN1CAN1
pUC19pUC19
HindIII
HindIII
Bsu36I
Bsu36I
Bsu36I
BssHII
BssHII
pUCGC
7830 b.p.
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
25
3.2. MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO DE BACTÉRIAS E
LEVEDURAS
Tabela 4. Meios de cultura e condições de crescimento de bactérias. (todos
de procedência Difco)
CONDIÇÕES DE
CRESCIMENTO
MEIO / COMPOSIÇÃO / INFORMAÇÕES
ADICIONAIS
MEIO
LÍQUIDO
MEIO
SÓLIDO
LB (Luria Broth): bacto triptona 1%; cloreto de
sódio 0,5%. Meio sólido + 2% ágar-
ágar.
Esterelizado por autoclavação a 120°C por 20
minutos. Adição de 100 ?
g/mL de ampicilina
caso necessário. (SAMBROOK et al., 1989)
SOC: Triptona 2%; Extrato de levedura 0,5%;
NaCl 10mM; KCl 2,5mM; MgCl2 10mM;
MgSO4 10mM; glicose 2%. Esterelizado por
autoclavação a 120°C por 20 minutos. Ad
ição
de 100 ?
g/mL de ampicilina, caso necessário.
Utilizado na transformação por eletroporação.
(SAMBROOK et al., 1989)
Aeração em
“Shaker”
New
Brunswick
Scientific a
37°C e 150
rpm
Estufa a
37°C
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
26
3.2.2.. LEVEDURAS
Tabela 5. Meios de cultura e condições de crescimento de levedura.
CON
DIÇÕES DE
CRESCIMENTO
MEIO / COMPOSIÇÃO / INFORMAÇÕES
ADICIONAIS
MEIO
LÍQUIDO
MEIO
SÓLIDO
YPD (meio completo): peptona 2%; extrato de
levedura 1%; glicose 2%. Meio sólido + 2%
ágar-ágar.
Esterilizado por autoclavação a
120° por 20 minutos. (SHERMAN et al.,
1979).
SD (meio mínimo): bacto base de nitrogênio
de levedura sem aminoácidos 0,67%; glicose
2%. Meio sólido + 2% ágar-
ágar. Autoclavado
a 120° por 20 minutos. Suplementado se
necessário, com 40 ?g/mL de aminoácidos
ou
com 60 ?g/mL de L-
canavanina.
(SHERMAN et al., 1979).
Aeração
em“Shaker”
New
Brunswick
Scientific a
28°C e 150
rpm
Estufa a
28°C
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
27
3.3. REAGENTES E SOLUÇÕES
Todos os reagentes empregados no preparo das soluções foram de qualidade analítica
e de procedência dos fabricantes Sigma, Merk ou Gibco-BRL.
Todas as soluções foram preparadas conforme descrito por
Sambrook et al., 1989, exceto quando indicado.
3.3.1. SOLUÇÕES PARA EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA, EM PEQUENA
E GRANDE ESCALA
? Solução I: Tris-HCl 25 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM; glicose 50 mM
? Solução II: NaOH 0,2N; SDS 1%(p/v)
? Solução III: Acetato de sódio 3M, pH 4,8
? Solução Tampão de eluição (TE): Tris-HCl 20 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM
? Solução tampão de suspensão (TR): Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; EDTA 1,0 mM
? Solução tampão de lavagem (STE): Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1,0 mM;
NaCl 100 mM
? Solução de polietileno glicol e cloreto de sódio (PEG-NaCl): PEG 8000 13%
(P/v); NaCl 1,6M
? Solução de Cloreto de lítio: LiCl 5M – utilizada na concentração final de 2,5M
? Clorofil: clorofórmio 24 partes; álcool isoamílico 1 parte; tampão TE
? Fenol tamponado: fenol destilado; solução tampão Tris-HCl 1M, pH 8,0. A
solução de fenol foi equilibrada várias vezes com Tris-HCl 0,1M, pH 8,0,
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
28
até atingir o pH 7,5. Uma vez tamponada, foi estocada com um volume igual
de Tris-HCl 0,01M, a 4°C em frascos de vidro ambar.
? Solução de RNase A (Sigma): RNase A 10mg; Solução III 1mL. A
solução foi fervida em banho-maria por 10 minutos e estocada a temperatura
de –20°C.
3.3.2. SOLUÇÕES PARA ELETROFORESE DE DNA EM GEL DE AGAROSE
? Solução tampão tris-borato (TBE): Tris-HCl 0,89M; Ácido bórico 0,29M;
EDTA 8mM, pH 8,0. Solução estoque 10 vezes (10X) concentrada e diluída
em água destilada para concentração final de 1 parte de tampão para 20 partes
de água (0,5X), quando utilizada para eletroforese em gel de agarose.
? Gel de agarose para eletroforese de DNA: agarose (Sigma tipo II) 0,8%(p/v);
tampão TBE diluído em água destilada para concentração final de 0,5X. O gel
de agarose foi misturado ao tampão TBE e aquecido até dissolução.
? Solução de Brometo de Etídio (EtBr): EtBr 10 mg; água destilada 1mL.
Solução estoque preparada na concentração de 10mg/mL em água destilada e
utilizada na concentração final de 5 ?g/mL.
? Solução tampão de amostra para DNA (“Stop mix”): azul de bromofenol 0,5%;
Tris 100mM pH 8,0; glicerol 50%. O tampão de amostra foi preparado 10
vezes (10X) concentrado e utilizado na concentração final de 1X na mistura de
DNA.
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
29
3.3.3. SOLUÇÕES PARA TRANSFORMAÇÃO DE LEVEDURAS
? LiAc 100Mm
? PEG (50%W/V) - PM: 3350
? LiAc 1M
? ss-DNA (2mg/mL)
3.4. TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA POR ELETROPORAÇÃO
3.4.1. PREPARO DE CÉLULAS COMPETENTES
De uma cultura pré-crescida durante a noite, 1mL foi inoculado em 100 mL de meio
LB, seguindo-se incubação a 37 ?C com agitação em “shaker” a 110 rpm, até atingir uma
absorbância em 600 nm em torno de 0.5-0.6. A suspensão foi então coletada em tubos de
centrífuga, deixada em repouso no gelo por cerca de 15-30 minutos e centrifugada a 4.500 g,
por 15 minutos a 4?C. O sobrenadante foi removido e o sedimento foi ressuspendido em 100
mL de água destilada estéril a 4?C. As células foram centrifugadas como descrito no item
anterior. Após a centrifugação, as células foram ressuspensas em 50 mL de água destilada
estéril gelada e centrifugada novamente. As células foram ressuspensas em 2 mL de glicerol
a 10% a 4?C e centrifugadas pela última vez. As células foram ressuspensas num volume final
de 300 ?l com glicerol 10% gelado (concentração de 1-3 x 10
10
células/mL). A suspensão de
células foi aliquotada em tubos “Eppendorf” de 1,5 mL em alíquotas de 40 ?l e armazenada à
temperatura de -70 ?C.
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
30
3.4.2. TRANSFORMAÇÃO
As células foram retiradas do freezer -70?C, colocadas imediatamente no gelo e
utilizadas somente depois de descongeladas. Cerca de 40 ?L da suspensão de células foi
colocada em tubos gelados de microcentrífuga com 2 ?L de DNA. O aparelho eletroporador
“Gene-Pulser” da BioRad foi calibrado de acordo com a cubeta utilizada. A mistura
célula/DNA foi transferida para a cubeta a 4?C e esta inserida no eletroporador. Em seguida o
pulso foi aplicado nas condições estabelecidas (voltagem: 2,5 kv, capacitor: 25 µF, resistor:
200 ? e constância do tempo: 4,6-4,8 seg.). Imediatamente após o pulso, as cubetas foram
removidas da câmara de aplicação do pulso e foi adicionado às células 1 mL de meio SOC. A
suspensão foi então transferida para um tubo de ensaio e incubada a 37 ?C com agitação de
110 rpm, por 1 hora. Após esse tempo de incubação, visando a expressão do gene de
resistência presente no plasmídio, a suspensão bacteriana foi semeada em placas contendo
meio sólido seletivo e as placas incubadas em estufa a 37 ?C por 24 horas.
3.5. EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL BACTERIANOS
A extração de DNA plasmidial foi feita segundo metodologia descrita por Sambrook
et al. (1989).
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
31
3.5.1. PREPARAÇÕES DE DNA PLASMIDIAL EM PEQUENA ESCALA
Os clones de E.coli foram inoculados em 5 mL de meio LB contendo ampicilina à
concentração final de 100 ? g/mL de meio. O inóculo foi incubado a 37°C durante a noite
(aproximadamente 16 horas) com agitação a 110 rpm. Uma alíquota de 3 mL foi centrifugada
em 2 tubos do tipo “Eppendorf” a 4.500 g por 2 minutos, sendo o sobrenadante descartado e
o excesso retirado com uma pipeta de ponteira fina. O sedimento foi ressuspenso em 300 ? l
de solução I com pipeta. A seguir, adicionaram-se 300 ?l de solução II, e o tubo foi mantido
em repouso por 5 minutos à temperatura ambiente. Adicionaram-se 300 ?l de solução III, e
armazenou-se o tubo por 10 minutos no gelo. Decorrido este tempo, os tubos foram
centrifugados por 15 minutos a 4 ?C a 10.000 g. O sobrenadante foi recuperado e a este foram
acrescentados 600 ?L de solução clorofórmio/álcool isoamílico (solução 24:1), misturado por
inversão e centrifugado por 2 minutos a 4.500 g, à temperatura ambiente. A fase aquosa foi
então recuperada e a esta foram acrescentados 600 ?L de álcool isopropílico (isopropanol). A
solução foi misturada por inversão e deixada por 30 minutos à temperatura ambiente. A
solução foi centrifugada a 10.000 g, por 15 minutos a 4 ?C. O sedimento foi lavado com
etanol 70% a 4?C e seco a vácuo durante 10 minutos. O resíduo seco foi ressuspendido em 50
?l de água bi-destilada estéril contendo 1?g de RNaase. O material foi submetido à corrida
eletroforética em gel de agarose a 0,8%.
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
32
3.5.2. PREPARAÇÕES DE DNA PLASMIDIAL EM MÉDIA ESCALA (MIDI-
PREPARAÇÃO)
Os clones de E.coli foram inoculados em 50 mL de meio LB contendo ampicilina à
concentração final de 100 ? g/mL de meio. O inóculo foi incubado a 37°C durante a noite
(aproximadamente 16 horas) com agitação a 110 rpm. A cultura foi centrifugada a 4°C por 5
minutos a 4500g e o sobrenadante, sendo o sobrenadante descartado. O sedimento foi
ressuspenso em 1000 ?l de solução I com pipeta. A seguir, adicionaram-se 2000 ?l de
solução II, e o tubo foi mantido em repouso por 5 minutos à temperatura de 4°C.
Adicionaram-se 1500 ?l de solução III, e, armazenou-se o tubo por 30 minutos a 4°C.
Decorrido este tempo, o tubo foi centrifugado por 15 minutos a 4 ?C a 8500g. A fase aquosa
foi então recuperada e a esta foram acrescentados 8 mL de álcool isopropílico (isopropanol).
A solução foi misturada por inversão e deixada por 30 minutos à temperatura ambiente. A
solução foi centrifugada a 10.000 g, por 15 minutos a 4 ?C. O sedimento foi lavado com
etanol 70% a 4?C e seco à vácuo durante 10 minutos. O resíduo seco foi ressuspenso em 2
mL de fenol tamponado e o tubo foi agitado vigorosamente e então centrigugado por 2
minutos a 4500g. Esta operação foi repetida utilizando-se solução clorofórmio/álcool
isoamílico (solução 24:1). A fase aquosa, contendo o DNA, foi transferida para outro tubo, ao
qual foram adicionados 2 volumes de isopropanol á temperatura ambiente. Após os 15
minutos de incubação, foi realizada outra centrifugação por 15 minutos a 7800g, e o
sobrenadante obtido foi descartado. O precipitado foi dissolvido em 0,4 mL de TE e
transferido para microtubo “Eppendorf”. Foram adicionados 60 ?L de acetado de sódio 3M e
1 mL de etanol –20°C. Após incubação por 10 minutos a –20°C, centrifugou-se 2 minutos a
15000g. O precipitado final foi dissolvido em 0,2 mL de TE, ao qual foram adicionados 20
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
33
?L de RNase A (1mg/mL) e incubado por 30 minutos a 37°C. A precipitação do DNA foi
realizada adicionado-se 20 ?L de NaAc 3M, 0,3 ?L de etanol –20°C com incubação por 10
minutos à temperatura ambiente. Centrifugou-se por 2 minutos e o sobrenadante foi
descartado. A ressuspensão do DNA foi feita em 100 ?L de TR.
3.6. ANÁLISE ELETROFORÉTICA DE DNA EM GEL DE AGAROSE (SAMBROOK
et al., 1989).
A análise do DNA quanto às características físicas tais como, integridade, pureza,
conformação e tamanho molecular, foram feitas por meio da técnica de eletroforese. Estes
dados foram obtidos através de análise dos perfis de migração dos fragmentos de DNA em
géis de agarose, submetidos à eletroforese. A concentração de agarose dos géis variou de 0,7 a
0,8%, todos contendo 5?g/mL de brometo de etídio, agente que atua intercalando-se às
moléculas de DNA, permitindo sua visualização em transluminador com luz ultravioleta.
Como padrão de tamanho molecular, foi utilizado DNA Ladder 1KB; 1KB plus e
Lambda/Hind III. O tampão de corrida utilizado foi o TBE 0,5X. Para a fotodocumentação
dos géis, foi utilizado o aparelho “Eagle-eye” da "Stratagene".
3.6.1. MARCADORES DE PESO MOLECULAR PARA DNA
Os marcadores de peso molecular de DNA, DNA ? / HindIII utilizados como
referências de tamanho nas análises dos fragmentos (bandas) de DNA obtidos após a digestão
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
34
com as enzimas de restrição que são da marca Gibco – BRL e foram submetidos à corrida
eletroforética para análise dos perfis de migração em gel de agarose.
Tamanho dos fragmentos (em pares de bases): 23.130pb; 9.416pb; 6.557pb; 4.361pb;
2.322pb; 2.027pb; 0,5pb.
3.7. TRATAMENTO DO DNA COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Os tratamentos de DNA com as enzimas de restrição ou com enzimas
modificadoras foram feitos conforme as recomendações sugeridas nos catálogos dos
fabricantes New England Biolabs ou Gibco-BRL.
3.7.1. DIGESTÃO DE DNA COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
As digestões do DNA com enzimas de restrição foram realizadas em sistemas de 10
a 50 ?l, observando-se os tampões de restrição apropriados, de acordo com os fabricantes, e
adicionados a partir de estoques concentrados 10X. As digestões foram realizadas na
temperatura adequada a cada enzima, geralmente a 37 ?C por 2 a 5 horas e, ocasionalmente,
durante a noite.
A quantidade de DNA digerida variou de acordo com o experimento, utilizando-se
de 1 a 2 U/uL (unidades) de enzima para cada ?g de DNA.
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
35
3.8. TRANSFORMAÇÃO DE LEVEDURAS (Gietz et al., 1992)
Um pré-inóculo de células foi incubado em 2 a 5 mL de YPD durante 16 h a 30ºC. A
partir de 0,5 mL deste primeiro cultivo foi realizado um inóculo em 50 mL de YPD, para uma
densidade de células inicial de 5x 10
6
cel/mL. Esta cultura foi incubada em shaker a 200 rpm
até Ab 550nm= 0,5. Após este período, a cultura foi centrifugada por 8 minutos a 3000g
(aproximadamente 5000rpm). O sobrenadante foi descartado e as células ressuspensas em 25
mL de água, seguindo-se nova centrifugação em demelhantes condições. A água foi
descartada, e o sedimento foi ressuspensas em 1 mL de LiAc 100mM e transferido para tubo
(de 1,5 mL) de microcentrífuga. O material foi centrifugado por 15 segundos, todo o LiAc foi
retirado, e o sedimento ressuspenso em 500µL de LiAc 100mM.
As células foram agitadas em "vortex" e 50µL foram pipetados para outro tubo. Todo o
LiAc foi removido e o material novamente centrifugado. Foram adicionados, nesta ordem,
sobre o sedimento de células:
? 240µL de PEG (50%W/V) - PM: 3350 – Sigma.
? 36µL de LiAc 1M.
? 25µL de ss-DNA (2mg/mL).
? 50µL de suspensão de DNA e água (0,1 a 10µg de DNA).
Cada tubo foi agitado em "vortex" até completa ressuspensão do sedimento e incubado em
estufa a 30ºC, por 30 minutos. Após esta primeira incubação, os tubos foram incubados em
banho-maria a 42ºC, por 20 a 25 minutos. O material foi centrifugado a 6000 ou 8000 rpm por
5 segundos e o sobrenadante removido. Foi adicionado 1 mL de água estéril e realizada a
ressuspensão vagarosa com pipeta. As células foram semeadas em placas de seleção de 2 a
200µL/placa. Para transformação de leveduras com o fragmento CGC, os transformantes
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
36
foram selecionados em meio SD sem aminoácidos, adicionado de 60 ?g/mL de L-canavanina
(concentração final).
3.9. SELEÇÃO DOS TRANSFORMANTES
Para a seleção das células transformadas com os fragmentos integrativos CGC,
adicionou-se 60 ?g/mL de uma droga fungistática ao meio, a L-canavanina, o que possibilitou
a seleção direta dos transformantes. A inserção do fragmento CGC no gene CAN1 interrompe
a produção da permease da L-arginina, impedindo a entrada deste aminoácido na célula e
conseqüentemente impedindo também a entrada do análogo tóxico L-canavanina. Desta forma
as linhagens recombinantes transformadas perdem a sensibilidade a este agente e formam
colônias sobre o meio contendo L-canavanina.
Para certificar se a linhagem a ser tranformada era sensível a L-canavanina, cultivou-
se as leveduras em meio mínimo líquido e meio mínimo sólido acrescido com diferentes
concentrações de L- canavanina que foi de 60 a 500 ?g/ml, no período de 5 dias.
3.10. ANÁLISE DA ESTABILIDADE DO FRAGMENTO INTEGRADO NO
GENOMA DA LEVEDURA
Para a análise da estabilidade do inserto integrativo CGC, nos clones
recombinantes, foi avaliada a porcentagem de perda da informação clonada por geração.
Foram feitos repiques sucessivos em meio não-seletivo a cada 24 horas, durante 5 dias. O
inóculo inicial, assim como todos os repiques, continham aproximadamente 1,0x10
6
células/mL de YPD. A cada 24 horas, as culturas foram lavadas, diluídas e semeadas, por um
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
37
lado, em meio mínimo sólido (SD) acrescido dos aminoácidos necessários ou do fungistático
L-canavanina e, por outro lado, no meio completo (YPD). Após incubação em estufa a 28ºC
durante 48 horas, as colônias foram contadas, comparando-se o número de colônias crescidas
nas placas de meio mínimo com as crescidas nas de meio completo. As colônias de
transformantes crescidas em meio seletivo foram submetidas à análise de PCR para a
determinação da presença do fragmento CGC. O número de gerações estimado e a perda de
plasmídio por geração foI calculada, respectivamente, conforme as seguintes fórmulas
(RUBIÓ, 1996; CAMARGO, 1994):
N = In (X / X
0
), onde: N = número de gerações
??????? In2 X = número final de células
X
0
= número inicial de células
In = logarítmo neperiano (In2= 0,6931)
P = C / N, onde: P = % de perda do plasmídio ou da
informação clonada por geração
C = % de colônias não produtoras
N = número de gerações sem pressão seletiva
3.11. EXTRAÇÃO DE DNA CROMOSSÔMICO DE LEVEDURAS
As extrações de DNA cromossomal total das leveduras foram feitas pelo protocolo de
Sherman, 1990.
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
38
3.12. REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO EM CADEIA DA DNA POLIMERASE (PCR)
A confirmação da integração do fragmento CGC no cromossomo das leveduras
transformadas, foi obtida através de Reação de Amplificação em cadeia da DNA Polimerase
(PCR) (figura 3). O molde utilizado foi o DNA total obtido da extração dos diferentes clones
transformantes da levedura.
Para as reações de PCR, foram empregados os seguintes iniciadores (“primers”):
Primer 1 – Seqüência referente à extremidade 3’do fragmento CGC, composto por fragmento
da região interna do gene CAN 1 de S. cerevisiae, que amplifica no sentido reverso 5’TCA
AAG CTT GCA TAA ATC TG 3’ (Camargo, 2000).
Primer 2 – Seqüência referente a extremidade 5’do fragmento CGC, composto por fragmento
da região interna do gene CAN1 de S. cerevisiae, que amplifica no sentido “foward” 5’ GTT
GAA GCT TCA CAA ACA CAC 3’ (Camargo, 2000).
Todos os iniciadores utilizados nas reações foram sintetizados pela GIBCO-BRL.
Os reagentes empregados nas reações, assim como, a enzima Platinum Pfx DNA polimerase,
foram provenientes da Invitrogen.
As reações seguiram as indicações do fabricante da enzima, inclusive o programa
aplicado. O equipamento utilizado foi o DNA enzinae – MJ Research – modelo PTTC-200
Peltier Thermal Cycler.
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
39
Figura 3. Esquema da localização dos iniciadores, indicando os tamanhos dos produtos
amplificados por reação de PCR, onde (A) mostra o gene CAN1 (funcional) presente no
cromossomo V de Saccharomyces cerevisiae, e (B) gene CAN1 interrompido pelo fragmento
CGC.
3.13. DETERMINAÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO
Foi verificada a taxa de crescimento das leveduras transformadas com o fragmento
CGC e das mesmas linhagens não transformadas. Para isso partiu-se de culturas contendo 2,0
x 10
5
células/ml em 25 ml de meio completo contendo amido e incubação a 28°C com
agitação de 150 rpm.
A leitura de absorbância era feita em placas de microtitulação de 96 poços, com 200
microlitros de cada cultura. A leitura era feita sem diluição ou com diluição de 10 ou 100
vezes, de acordo com a fase de crescimento das culturas, de forma que a absorbância fosse
2
1
Hind
III
1350 pb
CAN
1
Cromossomo
5’
3’
A
2
1
Hind
III
5100 pb
CAN
1
C
G
C
Cromossomo com
fragmento CGC inserido
no gene CAN1
3
’
5
’
B
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
40
menor que 1,0. A leitura era obtida em aparelho eppendorf, num comprimento de onda de
600nm.
Retiraram-se pontos de leitura a cada 2 horas durante as primeiras 14 horas. Após esse
período, os pontos foram analisados a cada 24 horas, durante 7 dias.
3.14.” BASIC LOCAL ALIGNMENT SEARCH TOOL (BLAST)”:
Utilizada acordo site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
Foi utilizada a seqüência do gene CAN1 que flanqueia o fragmento CGC para
comparação entre seqüências no programa BLAST.
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
41
4. RESULTADOS
4.1. OBTENÇÃO DO FRAMENTO CGC
Para obtenção do fragmento CGC, o plasmídio quimérico denominado pUCGC foi
submetido à análise de restrição pela enzima Hind III, que apresentou como perfil uma banda
de 5,1Kb correspondente ao fragmento CGC e uma segunda banda de 2,7 Kb correspondente
ao plasmídeo pUC19 linearizado (Figura 4).
Figura 4. Fotografia do gel de agarose, corado com bometo de etídeo, após corrida
eletroforética das amostras de DNA. Digestão do plasmídio pUCGC com a enzima Hind III,
para obtenção do fragmento CGC. 1. pUCGC clivado com Hind III (a seta indica o fragmento
CGC), 2. pUCGC não clivado, 3. ?Hind (50ng/µl)
bp
21,130
9,416
6,557
4,361
2,322
2,027
1 2 3
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
42
4.2. TESTE DE SENSIBILIDADE A DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DA L-
CANAVANINA
Para a escolha das leveduras a serem utilizadas neste trabalho, foi realizado
inicialmente um ensaio de sensibilidade, onde diferentes espécies de leveduras foram
incubadas em meio de cultura mínimo (SD), acrescido de L-canavanina em diferentes
concentrações crescentes (60, 100, 200, 250, 300 e 500 µg/mL). Essas culturas foram
incubadas a 28?C com agitação de 100 rpm durante 5 dias, onde foi possível observar que as
leveduras Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolitica,
Hansenula anomala, Kluyveromyces marxianus, Candida glabrata, Saccharomyces bayanus
e Issatchenchia. orientalis apresentaram-se sensíveis à L-canavanina. As leveduras Pichia
pastoris, Candida tropicalis, Kluveromyces lactis e Candida lusitaneae por apresentarem
resistência a altos níveis de L-canavanina foram ignoradas, uma vez que a possibilidade de
integração do fragmento CGC nas mesmas era muito baixa (Tabela 6).
Tabela 6. Avaliação da sensibilidade de diferentes linhagens de leveduras à L-canavanina.
Concentração de canavanina (µg/ml) 60 100 200 250 300 500 PCR
Candida glabrata R R R S S S +
Candida lusitaneae R R R R R R _
Candida tropicalis R R R R S S _
Hansenula anomala S S S S S S _
Isstachenquia orientalis S S S S S S _
Kluyveromyces lactis R R R R R R _
Kluyveromyces marxianus S S S S S S _
Pichia pastoris R R R R R R _
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
43
Saccharomyces bayanus S S S S S S +
Saccharomyces cerevisiae S S S S S S +
Schizosaccharomyces pombe S S S S S S _
Yarrowia lipolitica S S S S S S _
4.3. COMPARAÇÃO DA HOMOLOGIA DO GENE CAN1 DE S. cerevisiae EM
DIFERENTES LEVEDURAS
Realizou-se análise por PCR (“Polymerase Chain Reaction”) em todas as leveduras
que apresentaram sensibilidade à L-canavanina, com o objetivo de detectar a homologia entre
o fragmento CGC e o genoma das leveduras e detectar desta forma quais as leveduras que
apresentariam recombinação homóloga com o fragentoo CGC.
Para a detecção do gene CAN1, utilizaram-se os iniciadores específicos para a
seqüência do gene CAN1 de Saccharomyces cerevisiae também utilizado na construção do
plasmídio integrativo pUCGC.
Como pode ser observado na Figura 5, apenas as leveduras Saccharomyces bayanus,
Candida glabrata e Saccharomyces cerevisiae apresentaram o gene CAN 1 amplificado, e
portando foram submetidas à análise BLAST para verificar o grau de homologia entre o
fragmento CGC e o genoma destas leveduras.
As espécies de leveduras que não apresentaram homologia por PCR foram ignoradas.
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
44
Figura 5. Fotografia do gel de agarose, corado com bometo de etídeo, após corrida
eletroforética das amostras de DNA. Reação de PCR para verificação da presença do gene
CAN1 em diferentes leveduras. 1. Controle Negativo, 2. ?Hind (50ng/µl), 3. Controle
Positivo (linhagem S288c padrão de S. cerevisiae), 4. Saccharomyces cerevisiae, 5. Candida
glabrata, 6. Saccharomyces bayanus, 7. I. orientalis, 8. S. pombe, 9. Yarrowia lipolitica, 10.
Hansenula anomala, 11. Kluveromyces marxianus,
Todas as leveduras que apresentaram sensibilidade à L-canavanina foram submetidas à
análise por BLAST com o objetivo de verificar o grau de homologia ao fragmento de
transformação CGC e assim confirmar os resultados obtidos pela análise de PCR. A
comparação da homologia entre as seqüências do gene CAN1 e as leveduras, foi realizada
pelo sistema BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), onde se verificou que somente as
leveduras Saccharomyces cerevisiae (Figura 6), Saccharomyces bayanus (Figura 7) e
Candida glabrata (Figura 8) apresentaram alto grau de homologia, 100%, 82% e 72%
respectivamente, sendo que as demais leveduras analisadas apresentaram graus de homologia
não significativos. Desta maneira, estas três leveduras foram selecionadas para se prosseguir o
trabalho.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1,5Kb
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
45
Sequence 1
lcl|seq_1
Length
1357
(1 .. 1357)
Sequence 2
lcl|seq_2
Length
2056
(1 .. 2056)
2
1
NOTE:The statistics (bitscore and expect value) is calculated based on the size of nr
database
NOTE:If protein translation is reversed, please repeat the search with reverse strand of the
query sequence
Score = 2609 bits (1357), Expect = 0.0
Identities = 1357/1357 (100%)
Strand = Plus / Plus
ALINHAMENTO DO CAN1CGC com S.
c
erevisiae
Figura 6. Análise de BLAST entre o gene CAN1 e a levedura Saccharomyces cerevisiae
Sequence 1
lcl|seq_1
Length
1357
(1 .. 1357)
Sequence 2
lc l|seq_2
Length
1773
(1 .. 1773)
2
1
NOTE:The statistics (bitscore and expect value) is calculated based on the size of nr
database
NOTE:If protein translation is reversed, please repeat the search with reverse stra nd of the
query sequence
Score = 1254 bits (652), Expect = 0.0
Identities = 1120/1354 (82%)
Strand = Plus / Plus
ALINHAMENTO DO CAN1CGC com S. bayanus
Figura 7. Análise de BLAST entre o gene CAN1 e a levedura Saccharomyces bayanus
ALINHAMENTO DO CAN1CGC COM
S. cerevisiae
ALINHAMENTO DO CAN1CGC COM
S. bayanus
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
46
Sequence 1
lcl|seq_1
Length
1357
(1 .. 1357)
Sequence 2
lcl|seq_2
Length
1719
(1 .. 1719)
2
1
NOTE:The statistics (bitscore and expect value) is calculated based on the size of nr
database
NOTE:If protein translation is reversed, please repeat the search with reverse strand of the
query sequence
Score = 377 bits (196), Expect = e- 101
Identities = 856/1186 (72%)
Strand = Plus / Plus
ALINHAMENTO DO CAN1CGC com C. glabrata
Figura 8. Análise de BLAST entre o gene CAN1 e a levedura Candida glabrata
Realizaram-se também alinhamentos com a seqüência integral do gene CAN1 de
Saccharomyces cerevisiae utilizado para construção do vetor e as mesmas leveduras, onde
pudemos verificar os mesmos resultados de homologia.
A busca por similaridade de seqüências de aminoácidos é realizada com o objetivo de
identificar relações de evolução, estruturais e funcionais entre as seqüências que estão sendo
estudadas. Esta busca é feita através de um alinhamento de seqüências, que é um processo
computacional com o objetivo de dispor seqüências alinhadas de forma a ressaltar as
similaridades entre elas e que permita dizer se as seqüências têm uma similaridade suficiente
que justifique inferir que elas são homólogas. Embora os termos similaridade e homologia são
muitas vezes confundidos, nesta situação eles possuem significados diferentes. Similaridade é
uma quantidade que pode ser expressa em, por exemplo, porcentagem de identidade.
ALINHAMENTO DO CAN1CGC COM
C. glabrata
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
47
Homologia, por outro lado, se refere a uma conclusão tirada desses dados que dois genes tem
uma história evolucionária comum.
4.4. TRANSFORMAÇÃO DAS LEVEDURAS SELECIONADAS COM O
FRAGMENTO CGC E CONFIRMAÇÃO DA INSERÇÃO NO GENOMA
As linhagens prototróficas das leveduras selecionadas pela presença do gene CAN1 e
sensíveis à L – canavanina foram submetidas à transformação com o fragmento CGC. Os
transformantes foram selecionados através da aquisição de resistência à L-canavanina e
observação de halo de degradação do amido (Figura 9, Figura 10 e Figura 11).
Figura 9. Clones da levedura Saccharomyces cerevisiae S288c transformada com o
fragmento CGC que apresentaram halos de degradação do amido devido à expressão da
glicoamilase recombinante (clone 1 – controle negativo; clone 2 S288c/CGC)
1 2
3
4 5 6
7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22
2
3 24 25
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
48
Figura 10. Clones da levedura Saccharomyces bayanus transformada com o fragmento CGC
que apresentaram halos de degradação do amido devido à expressão da glicoamilase
recombinante (clone 1 – controle negativo; clone 2 – S288c/CGC)
Figura 11. Clones da levedura Candida glabrata transformada com o fragmento CGC que
apresentaram halos de amilolise devido à expressão da glicoamilase recombinante (clone 1 –
controle negativo; clone 2 – S288c/CGC)
1 2
3 4 5 6
3 4 5 6 7
8
9 10 11 12 13 14
15 16 17 18
19 20 21
1 2
3 4 5 6
7 8
9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22
23 24 25
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
49
A confirmação da integração do fragmento CGC no genoma das leveduras
transformantes foi realizada por PCR, através da amplificação da seqüência de DNA
utilizando os iniciadores homólogos à seqüência do gene da permease da arginina, CAN1.
Um dos iniciadores (iniciador 1) corresponde à região 3’do fragmento CGC, sendo
que o outro (iniciador 2) à região 5’do fragmento CGC. Esta reação apresenta um produto de
5,1 Kb (Figura 12), indicando a integração do fragmento CGC na seqüência do gene CAN1,
na região de homologia entre o gene e o fragmento, sendo que este fato indica que a
interrupção do gene leva à sua inatividade, conferindo resistência à L-canavanina.
Já as reações, feitas nas mesmas condições, porém, DNA das células não
transformadas, apresentaram um produto de 1,5Kb, que indica apenas a amplificação da
região do gene CAN1 homóloga aos iniciadores empregados, sem a interrupção do gene.
Nesse caso, a célula produz a permease da arginina, sendo sensível à L-canavanina (Figura
12).
Figura 12. Fotografia do gel de agarose, corado com brometo de etídio, após corrida
eletroforética das amostras de DNA. Análise de PCR para confirmação da integração do
bp
21,130
9,416
6,557
4,361
2,322
2,027
1 2 3 4 5
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
50
fragmento CGC no genoma das leveduras: 1. Saccharomyces cerevisiae/CGC; 2.
Saccharomyces cerevisiae não transformada ; 3. Saccharomyces bayanus/CGC , 4. Candida
glabrata CGC; 5. ?Hind (50ng/µL).
4.5. ANÁLISE DA EFICIÊNCIA DE TRANSFORMAÇÃO DO FRAGMENTO CGC
EM DIFERENTES TIPOS DE LEVEDURAS
A transformação das leveduras foi realizada com 03 diferentes espécies, S. cerevisiae, S.
bayanus e Candida glabrata que foram escolhidas, pois foram as únicas que apresentaram
sensibilidade à L-canavanina e homologia ao gene CAN1.
O fragmento CGC construído, obtido a partir de pUCGC, foi utilizado para a
transformação das linhagens de levedura após seu tratamento com a enzima HindIII e
obtenção somente do fragmento integrativo CGC.
Os resultados referentes à transformação de cada linhagem estão apresentados na tabela 7.
Tabela 7. Eficiência de transformação das leveduras transformadas com o
fragmento CGC (*).
Leveduras N
0
total de
transformantes
Eficiência de
Transformação
(nº transf./µg DNA)
Eficiência de
Transformação
(%)
Saccharomyces
cerevisiae
57 11.4 100%
Saccharomyces
bayanys
31 6.2 54%
Candida glabrata 25 5 43%
(*) Concentração de DNA a 5 µg
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
51
4.6. ANÁLISE DA ESTABILIDADE DO FRAGMENTO CGC NAS DIFERENTES
LEVEDURAS TRANSFORMADAS
A estabilidade do fragmento integrado no genoma das leveduras Saccharomyces
cerevisiae, Saccharomyces bayanus e Candida glabrata, durante o crescimento, foi analisada
após 144 repiques sucessivos em meio completo YPD2% e semeadura em placas contendo
meio sólido SD2% acrescido de L-canavanina, através do cálculo de perda por geração (tabela
8).
A porcentagem de perda do fenótipo de resistência à L-canavanina e, portanto do
fragmento CGC integrado no genoma, foi zero em todas as linhagens transformadas
analisadas. A estabilidade do sistema é, portanto, de 100% em todas as leveduras analisadas.
Conforme já mencionado, esta análise foi realizada por sucessivos repiques em meio não
seletivo durante cerca de 144 gerações e, após este período, realizou-se análise por PCR, para
confirmação que o fragmento ainda estava integrado no genoma das leveduras.
Os tranformantes obtidos resultantes da transformação de S. cerevisiae, S. bayanus e C.
glabrata com o sistema CGC, em todas as análises realizadas mostram-se ser 100%
estáveis (tabela 8).
Tabela 8. Análise da estabilidade das leveduras Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces bayanus e Candida glabrata apresentando o fragmento CGC
Linhagem Nº de gerações em
meio completo
% de Perda % de Perda / Geração
Saccharomyces
cerevisiae
144 0% 0%
Saccharomyces
bayanus
144 0% 0%
Candida glabrata 144 0% 0%
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
52
5. DISCUSSÃO
Neste trabalho, foi utilizado um sistema de transformação genética construído
anteriormente em nosso laboratório por Camargo, (1994), que permite a introdução de um
gene exógeno de interesse em leveduras prototróficas contanto que sejam sensível à L-
canavanina.
Esse sistema de transformação é composto por um fragmento linear de DNA de dupla
fita, que contém um cassete de expressão formado pelo cDNA da glicoamilase de A. awamori
sob regulação do promotor e terminador da fosfoglicerato quinase (PGK) de S. cerevisiae,
flanqueado por seqüências do gene CAN1 de S. cerevisiae. As extremidades do fragmento
permitem recombinação gênica na região de homologia das leveduras que apresentam o gene
CAN1. Esse fragmento, uma vez inserido provoca disrupção gênica do gene CAN1, fazendo
com que a levedura não produza mais a permease da arginina, impedindo assim a entrada da
L-canavanina na célula tornando-a resistente à droga. Sendo assim, podem ser selecionadas as
células recombinantes independentemente da presença de marcas de auxotrofia.
Com a inserção do fragmento CGC (promotor PGK, seqüência sinal de A. awamori,
seqüência estrutural do gene da glicoamilase de A. awamori e terminador de transcrição PGK)
na região de homologia, a célula passa a ter um novo gene como parte de seu genoma. Dessa
forma, passa a expressar um proteína que é produzida e/ou excretada pela célula, sendo que
neste exemplo, os transformantes obtidos com o fragmento CGC excretam glicoamilase para
o meio de cultura.
O uso de leveduras como organismo hospedeiro de genes heterólogos é conveniente,
pois são microrganismos unicelulares que oferecem vantagens como fácil manipulação, fácil
condição de crescimento e segurança. Saccharomyces cerevisiae é, sem dúvida, a levedura
mais utilizada para ser hospedeira de expressão de proteínas heterólogas, mas já vem sendo
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
53
notadas algumas limitações para a utilização desta levedura, como por exemplo, os baixos
níveis de expressão do produto de interesse, hiperglicosilação e retenção de proteínas dentro
do espaço periplasmático. (Buckholz e Gleeson, 1991).
Tendo em vista a busca por um sistema mais eficiente de expressão de genes
heterólogos, vem crescendo o número de leveduras não Saccharomyces, para serem utilizadas
como hospedeiras, o que nos levou a testar a eficiência de transformação com o sistema CGC
de diferentes leveduras de interesse biotecnológico.
Todas as leveduras selecionadas nesse trabalho são prototróficas e, primeiramente,
foram testadas quanto à sensibilidade à L- canavanina. Foram usadas diferentes concentrações
de L- canavanina (60, 100, 200, 250, 300 e 500?g/ml), sendo que algumas das leveduras se
mostraram resistentes apenas a altas concentrações da mesma, como é o caso de Candida
tropicalis e outras resistentes a todas as concentrações analisadas como a Pichia pastoris.
A inserção do fragmento CGC no genoma das células recombinantes, foi facilmente
comprovada através dos produtos obtidos nas reações de amplificação por PCR. Quando é
obtido um único produto, fragmento de DNA de 5,3Kb, demonstra a presença do cassete de
expressão da glicoamilase inserido em todos os alelos CAN 1. Como um dos iniciadores é
homólogo ao gene CAN1 em uma região externa ao fragmento CGC, os resultados da
amplificação por PCR indicam que a inserção do fragmento CGC ocorreu nos loci esperados.
E verificou-se também que céluas que apresentavam um produto de PCR de apenas 1,5Kb não
continham o cassete de expressão inserido em seu genoma.
Além disso, foram feitas análises de alinhamento de seqüências por BLAST onde
apenas Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus e Candida glabrata apresentaram
alto grau de homologia com o fragmento CGC de transformação, com 100%, 82% e 72% de
homologia, respectivamente.
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
54
Após essas análises, as leveduras com alto grau de homologia ao fragmento CGC
foram submetidas a processos de transformação. A linhagem S288c, considerada como
referência de linhagem prototrófica, também foi transformada e a seleção ocorreu nas mesmas
condições que as demais. Pode-se constatar que S. cerevisiae mostrou-se mais eficiente como
hospedeira de transformação do que Candida glabrata e Saccharomyces bayanus, mesmo
sabendo da proximidade filogenética que existe entre essas leveduras (Dujon, et al., 2004).
Em leveduras como Saccharomyces, a recombinação é preferencialmente homóloga,
podendo também ocorrer recombinação não homóloga e ilegítima, ou seja, recombinação
entre seqüências curtas de homologia, porém com uma freqüência mais baixa que a homóloga
(Tsukamoto et al., 1996). Já em Candida glabrata, ocorrem os mesmos tipos de
recombinação que em S. cerevisiae, sendo que já foram descritos altos níveis de
recombinação não homóloga, caracterizando sítios específicos de não homologia. Isto abre
um novo caminho, uma vez que pode ser explorado como novo método de mutagênese
insercional (Cormack, et al., 1998). Esses fatos confirmaram os resultados dos trabalhos
anteriores, uma vez que as leveduras de gênero Saccharomyces apresentaram um maior
eficiência de transformação em relação a Candida glabrata.
Todas as leveduras transformadas foram submetidas à análise de integração do gene
repórter da glicoamilase. As colônias que cresceram em meio mínimo contendo L-canavanina
foram repicadas em meio sólido com 0,5% de amido e submetidas a vapor de iodo, para
observar a formação de halos de degradação do amido.
Os transformantes resistentes à L-canavanina obtidos com as três leveduras
hospedeiras (S. cerevisiae, S. bayanus e C. glabrata) produziram grandes halos de degradação
do amido confirmando que o sistema CGC é capaz de transformar estas três leveduras. Ainda,
fica comprovado que todo o sistema que garante a expressão e secreção do cDNA da
glicoamilase de Aspergillus awamori em S. cerevisiae, incluindo promotor PGK, terminador
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
55
de transcrição PGK de S. cerevisiae, bem como a seqüência sinal do próprio gene da
glicoamilase de A. awamori (presente no fragmento CGC) é funcional nestas duas outras
leveduras.
Um fato relevante é que o fragmento é capaz de integrar em quantos genes CAN1
existirem nas células, ou seja, independe da ploidia, pois a seleção se dá somente quando a
célula adquire resistência à L-canavanina, deixando de ter qualquer gene CAN1 funcional. De
toda maneira é possível explicar a entrada do fragmento CGC em quantos genes CAN1
existirem na célula, pois a seleção se dá somente quando a célula adquire resistência à L-
canavanina, deixando de ter qualquer gene CAN1 funcional. Com isso, pode-se afirmar que,
quanto maior for o número de alelos CAN1 presentes na célula, maior será o número de cópias
inseridas do gene exógeno desejado na célula recombinante. Em muitos casos, esse fato pode
ser de grande interesse, devido ao aumento da quantidade de proteína a ser produzida pela
célula recombinante.
Para verificar a estabilidade do fragmento clonado na célula, a alteração fenotípica foi
acompanhada ao longo de 144 gerações, e pudemos observar que a nova informação mantém-
se integrada no genoma das células com 100% de estabilidade, não sendo possível detectar
perda da atividade amilolítica e ou resistência à L-canavanina nas leveduras transformadas.
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
56
6. CONCLUSÕES
6.1. O sistema CGC é capaz de transformar outras leveduras além de Saccharomyces
cerevisiae, como Cândida glabrata e Saccharomyces bayanus
6.2. Todos os transformantes obtidos com as linhagens S. cerevisiae, S. bayanus e C.
glabrata, mostraram-se 100% estáveis.
6.3. Todas as seqüências que garantem o funcionamento adequado do cassete de expressão do
cDNA da glicoamilase de A. awamori (promotor e terminador de transcrição PGK de S.
cerevisiae, seqüência sinal e seqüência estrutural do cDNA da glicoamilase de A. awamori)
adequadas para S. cerevisiae também se mostraram adequadas para S. bayanus e C.glabrata.
6.4. As células transformadas dispensam pressão seletiva para a manutenção da nova
informação clonada, sendo a L-canavanina necessária apenas para efetuar a seleção inicial;
MELO, J.F.______________________________________________________________________________
57
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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