( PDF ) Estudo do polimorfismo de citocinas e do HLA em pacientes diabéticos tipo 2 portadores de periodontite crônica

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Adriano Monteiro d`Almeida Monteiro

ESTUDO DO POLIMORFISMO DE

CITOCINAS E DO HLA EM PACIENTES

DIABÉTICOS TIPO 2 PORTADORES DE

PERIODONTITE CRÔNICA

Salvador

2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

Instituto de Ciências da Saúde

Programa de Pós-Graduação em Imunologia

Tese de Doutorado

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Adriano Monteiro d`Almeida Monteiro

ESTUDO DO POLIMORFISMO DE

CITOCINAS E DO HLA EM PACIENTES

DIABÉTICOS TIPO 2 PORTADORES DE

PERIODONTITE CRÔNICA

Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Imunologia do Instituto de

Ciências da Saúde da Universidade Federal da

Bahia como requisito parcial para obtenção do

grau de Doutor em Imunologia.

Orientadora: Prof

. Dr

. Denise Carneiro Lemaire

Co-orientadora: Prof

. Dr

. Songeli Menezes Freire

Salvador

2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

Instituto de Ciências da Saúde

Programa de Pós-Graduação em Imunologia

Tese de Doutorado

ads:

Aos meus pais, Acir e Lucinha, à Cristina e,

aos meus irmãos, André, Paula e Alexandre

que souberam me entender, apoiar e incentivar

nos momentos mais difíceis e às duas princesas,

Carolina e Luísa, que estão para chegar ao nosso

convívio.

AG R A D E C IME N TO S

À Deus, por minha vida.

À Cristina que sempre me apoiou e incentivou nas conquistas dos meus sonhos, por ser uma mulher maravilhosa e

por me fazer sentir-me um homem muito amado.

Aos meus pais, Acir e Lucinha, exemplos de amor e honestidade e, principalmente, por terem me proporcionado uma

vida repleta de felicidade.

Aos meus irmãos André, Paula e Alexandre por me estimularem e incentivarem com seus exemplos.

À Prof

. Dr

. Denise Carneiro Lemaire pela atenção dispensada a este trabalho; por transmitir seus conhecimentos e,

principalmente, por ter tornado este desafio em um período de crescimento pessoal e intelectual e de grande

serenidade.

À Prof

. Dr

. Songeli Menezes Freire por ter acreditado em meu potencial, por ser a principal responsável pelo meu

amor à Imunologia e por dispensar seu tempo na co-orientação deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Urbino da Rocha Tunes, por sua inestimável ajuda para o enriquecimento deste trabalho e por ter aberto

as portas da Fundação Baiana para o Desenvolvimentos das Ciências para a realização deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Isaac Suzart Gomes Filho, por seu apoio e incentivo e por ter disponibilizado toda a estrutura da

Universidade Estadual de Feira da Santana.

Aos meus irmãos por afinidade Marcelo Rios e Jaqueline Gurjão, por terem acreditado em meu trabalho e pelo

intenso estímulo para o meu crescimento.

À Prof

. Dr

Ana Isabel Sccavuzzi pelo seu incentivo e flexibilidade.

À toda a equipe do LABIMUNO por me receberem de braços abertos e por não medirem esforços na realização deste

projeto.

Aos meus colegas de Doutorado, que transformaram esta árdua jornada em momentos extremamente prazerosos.

À Prof

. Maria Teresita Bendicho por sua amizade e por sua valorosa contribuição no desenvolvimento deste

trabalho.

A Aidil e Sônia pela amizade e ajuda nas técnicas laboratoriais.

À família Unime pelo convívio enriquecedor e estimulante.

À disciplina de Diagnóstico Oral I da Universidade Estadual de Feira de Santana nas pessoas das Prof

. Soraia

Trindade, Teresinha Santana e Viviane Sarmento e dos Prof

. Antônio César de Azevedo, Dario Miranda e Isaac

Suzart Gomes Filho.

À Prof

. Tereza não só por ter realizado a análise estatística deste trabalho, mas também por seus esclarecimentos

referentes aos resultados e à análise estatística.

Aos colegas do Laboratório de Patologia Clínica da UEFS pela grande contribuição na realização deste trabalho.

Aos amigos Jorge Filho, Almiro, Cecília, Raquel, Ana Emília, Carine e Fabiana pela amizade e inestimável ajuda na

realização deste trabalho.

Aos alunos das clínicas de extensão de Periodontia da Disciplina de Diagnóstico Oral da UEFS por toda a dedicação

ao atendimento dos pacientes diabéticos.

Às minhas amigas Luciana e Ângela pelo apoio e amizade.

Fonte Financiadora

Este estudo foi realizado com o apóio da Fundação de Amparo a Pesquisa do

Estado da Bahia (FAPESB).

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUÇÃO..........................................................................................................14

2 REVISÃO DA LITERATURA ....................................................................................19

2.1 Inter-relação Doença Periodontal e Diabetes Mellitus..................................................................19

2.1.1. Diabetes mellitus...............................................................................................................19

2.1.2. A patogênese da doença periodontal................................................................................20

2.1.3. A doença periodontal em diabéticos..................................................................................24

2.1.4. Efeito do tratamento periodontal no controle metabólico do diabetes

mellitus.............................................................................................................26

2.2 Estudos de associação entre os polimorfismos genéticos do HLA e o diabetes

mellitus................................................................................................................................................28

2.3 Estudos de associação entre os polimorfismos genéticos do HLA e a doença

periodontal..........................................................................................................................................31

2.4 Estudos de associação entre os polimorfismos genéticos de citocinas e a doença

periodontal..........................................................................................................................................34

2.4.1 TNF-α.....................................................................................................................................34

2.4.2 IL-10...................................................................................................................................35

2.4.3 TGF-β1..........................................................................................................................................36

2.4.4 IL-6.....................................................................................................................................37

2.5 Estudos de associação dos polimorfismos genéticos de citocinas e o diabetes

mellitus................................................................................................................................................38

3 OBJETIVOS ........................................................................................................................................41

3.1 Geral ..............................................................................................................................................41

3.2 Específicos ....................................................................................................................................41

4 DELINEAMENTO DO ESTUDO..........................................................................................................42

5 PRODUTOS DA TESE .......................................................................................................................43

5.1 Artigo 1 – “O efeito do tratamento periodontal não cirúrgico no controle metabólico em

pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2 não compensados

metabolicamente”...........................................................................................................................44

5.2 Artigo 2 – “Maior prevalência do HLA-DQB1*0301 em mestiços não diabéticos portadores de

periodontite crônica

severa............................................................................................................................................58

5.3 Artigo 3 – “Associação entre o polimorfismo do códon 10 do gene TGF-β1 e a doença

periodontal crônica severa em baianos, mestiços, diabéticos tipo

2”....................................................................................................................................................69

6 DISCUSSÃO .......................................................................................................................................85

7 CONCLUSÕES....................................................................................................................................93

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................................94

APÊNDICE .................................................................................................................................................102

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

A.a. Actinobacillus actinomycetemcomitans

AAP American Academy of Periodontology

AGE Produto final de glicosilação

CPH Complexo Principal de Histocompatibilidade

dL Decilitro

DM1

Diabetes mellitus tipo 1

DM2

Diabetes mellitus tipo 2

Desvio padrão

DP Grupo composto por diabéticos tipo 2 portadores de periodontite crônica

severa

DPS Doença Peridontal Severa

DSP Grupo composto por diabéticos tipo 2 não portadores de periodontite

crônica severa

FAPESB Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia

FBDC Fundação Baiana para Desenvolvimento das Ciências

G Grama

GADA Anticorpo contra o ácido glutâmico descarboxilase

h Hora

HbA

Hemoglobina glicosilada

HLA Antígeno leucocitário humano

ICA Anticorpos contra as ilhotas pancreáticas

IFN-γ Interferon γ

IgG Imunoglobulina G

IL-1 Interleucina-1

IL-1β Interleucina-1β

IL-2 Interleucina-2

IL-4 Interleucina-4

IL-5 Interleucina-5

IL-6 Interleucina-6

IL-8 Interleucina-8

IL-10 Interleucina-10

IL-12 Interleucina-12

ISS Índice de sangramento à sondagem

LABIMUNO

Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular

L Litro

LPS Lipopolissacarídeo

LT-α Linfotoxina-α

Md Mediana

µg

Micrograma

mg Miligrama

Min Minuto

mL Mililitro

µL

Microlitro

NIC Nível de Inserção Clínica

NDPC Grupo composto por não diabéticos portadores de periodontite crônica

severa

PA Periodontite agressiva

PC Periodontite crônica

PCS Periodontite Crônica Severa

P.g. Porphyromonas gingivalis

Pg Picograma

PGE

Prostaglandina E

PIL Perda de inserção leve

PIM Perda de inserção moderada

PIS Perda de inserção severa

PJG

PJL

PPR

Periodontite juvenil

Periodontite Juvenil generalizado

Periodontite Juvenil localizada

Periodontite de progressão rápida

PS Profundidade de Sondagem

PSR Profundidade de Sondagem Rasa

PSM Profundidade de Sondagem Média

PSP Profundidade de Sondagem Profunda

RAGE Receptor do produto final de glicosilação

RNAm RNA mensageiro

SPI Sem perda de inserção

TGF-β1 Fator Transformador de Crescimento β1

TNF-α Fator de Necrose Tumoral α

UEFS Universidade Estadual de Feira de Santana

UFBA Universidade Federal da Bahia

x Média

RESUMO

Portadores de diabetes mellitus tipo 2 apresentam maior prevalência e

severidade da periodontite. Nestes pacientes o processo inflamatório apresenta-se

exacerbado frente ao desafio microbiano. Os polimorfismos genéticos das citocinas e

do HLA têm sido apontados como responsáveis pelas peculiaridades da resposta imune

e podem influenciar a história natural da periodontite, exacerbando o processo

inflamatório, induzido por um padrão alterado na produção e secreção de citocinas pró-

inflamatórias e/ou das citocinas regulatórias, exercendo influência direta sobre o início,

a regulação e a perpetuação do processo infeccioso inflamatório periodontal. Foram

avaliados os polimorfismos do HLA (HLA-DRB1, -DRB3, -DRB4, -DRB5 e -DQB1) e de

genes de citocinas (IL-6, TNF-

, IL-10, TGF-

β1

, IFN-

). Também, foram avaliados os

efeitos do tratamento periodontal básico sobre o processo infeccioso periodontal no

controle metabólico de indivíduos portadores de diabetes mellitus tipo 2 utilizando o

ensaio da hemoglobina glicosilada. A amostra foi composta por 91 indivíduos mestiços,

com idade entre 40 e 70 anos, distribuídos em três grupos: DP- 31 indivíduos diabéticos

portadores de periodontite crônica severa; DSP- 30 indivíduos diabéticos que ao exame

clínico periodontal foram classificados como periodontalmente saudáveis, portadores de

gengivite ou de periodontite crônica leve; NDP- 30 indivíduos metabolicamente sadios,

portadores de periodontite crônica severa. Os indivíduos que compuseram a amostra

assinaram o Termo de consentimento livre e esclarecido. A amostra do trabalho que

avaliou o efeito do tratamento periodontal sobre o controle metabólico foi formada

apenas pelos grupos DP e DSP, compostos por 28 indivíduos cada. Após a triagem, os

indivíduos selecionados de ambos os grupos compareceram à clínica odontológica da

Cooperfeira em três oportunidades, intercaladas por um período de 90 dias. Nos três

tempos foram coletadas amostras de sangue para avaliação do controle metabólico

(HbA

) e dados clínicos periodontais. Para a avaliação dos polimorfismos genéticos

foram coletadas amostra de sangue dos três grupos apenas no tempo 1. Uma diferença

estatisticamente significativa foi observada na freqüência genotípica do gene TGF-

β1

códon 10 entre os grupos DP e DSP (p= 0,0127). Não foram observadas diferenças

estatisticamente significativas nas freqüências alélicas, genotípicas e dos fenótipos

previstos dos genes IL-6, TNF-

, IL-10, IFN-

entre os grupos. A prevalência do alelo

HLA-DQB1*0301 foi significativamente maior no grupo NDP quando comparado ao

DP(P= 0,0402). Por outro lado não foi observada diferença significativa nas freqüências

alélicas e genotípicas dos genes HLA-DRB1 e HLA-DRB3/4/5 entre os grupos. Os

grupos DP e DSP demonstraram melhora nos parâmetros clínicos periodontais após o

tratamento periodontal básico. A melhora no quadro clínico periodontal foi associada à

diminuição das porcentagens da hemoglobina glicosilada 180 dias após o tratamento

em ambos os grupos. Possivelmente o tratamento periodontal não cirúrgico está

associado à redução nas porcentagens de hemoglobina glicosilada. O genótipo GG do

gene TGF-

β1

códon 10

é um possível marcador de predisposição ao desenvolvimento da

periodontite na população estudada.

Palavras Chave: Diabetes mellitus, polimorfismo genético, citocinas, HLA,

controle metabólico, periodontite.

ABSTRACT

Diabetic patients are significantly and strongly related to both the prevalence and

severity of periodontal disease. In this status, differences in host response may

determine susceptibility and resistance to periodontal disease. There is growing

evidence that genetic factors play a role in the onset and severity of periodontal disease

once the expression levels of the cytokines may be modulated by genetic

polymorphisms. The polymorphisms studied were HLA-DRB1, -DRB3/4/5, -DQB1 and

TNF-[alpha] (-308G/A), TGF-[beta]1 (codon 10C/T, codon 25C/G), IL-10 (-1082A/G; -

819T/C; -592A/C), IL-6 (-174G/C), and IFN-[gamma] (+874T/A). The effects of basic

periodontal treatment were also studied in those individuals who had uncontrolled

diabetes mellitus type 2 through a glycated hemoglobin assay. The trial amount was

compounded by 91 mestizos patients, among 40 and 70 years, divided in 3 groups: (DP)

was formed by 31 diabetic subjects with severe chronic periodontal disease; (DSP)

consisted of 30 diabetic subjects without severe or moderate periodontal disease; and

(NDP) was formed by 30 metabolic healthy patients with severe chronic periodontal

disease. They all had subscribed to an agreement term. The sample that evaluated the

periodontal treatment effect on metabolic control was composed by two groups, DP (28)

with severe chronic periodontitis and DSP (28) orally-healthy, gingival disease or slight

chronic periodontitis controls. Both groups were evaluated after 90 and 180 days

through determination of the plaque index, bleeding on probing, probing depths, the

measures of clinical attachment levels and the plasmatic concentration of glycated

hemoglobin and both groups were submitted to periodontal treatment after the first

exam. A statistically significant difference was observed in the genotype frequency of

the polymorphisms of the TGF-

1 gene on codon 10 between DP and DSP patients (p=

0,0127). No statistically significant differences were found for allele, genotypic and

phenotypic frequencies on the genes that code IL-6, IL-10, TNF-

, IFN-

and TGF-

codon 25 between groups. No statistically significant differences were found for allele

and genotype frequencies on HLA-DRB1 and HLA-DRB3/4/5 genes. Furthermore, no

statistically significant differences were found for haplotypic frequencies among the

three groups. The genotypic frequencies of HLA-DQB1*0301 was found at a significantly

higher level in NDP patients than in the DP group (P= 0.0402). Both test and control

group showed a statistically significant effect for plaque index and bleeding on probing

after periodontal treatment. The test group showed clinical improvement in the severity

of periodontal status. HbA

levels in both groups, at 6 months, decreased significantly.

The non-surgical periodontal therapy results in the reduction of periodontal infection and

inflammation. This significantly improvement of the periodontal condition is associated

with a reduction in level of glycated hemoglobin and consequently in glycemic control. In

metabolic health mestizos patients with chronic periodontal disease from Bahia-Brazil,

there is a significant association with HLA-DQB1*0301. Further studies with a higher

population are warranted to confirm a lower frequency of HLA-DQB1*0301 in DP group

than DSP and NDP groups. A statistically significant difference was observed in the

genotype frequency of the polymorphisms of the TGF-

1 gene on codon 10 between DP

and DSP patients. The proportion of subjects that exhibited the TT genotype was

significantly larger in DP group than in DSP group. No statistically significant differences

were found for allele, genotypic and phenotypic frequencies on the genes that code IL-6,

IL-10, TNF-

, IFN-

and TGF-

1codon 25 between groups. These results demonstrate

that the polymorphism at TGF-

1 gene on codon 10C/T is associated to chronic

periodontitis in diabetic patients from Bahia-Brazil.

Key words: chronic periodontitis; type 2 diabetes mellitus, cytokines, genetic

polymorphism, transforming growth factor-β1, HLA Polymorphism.

1 INTRODUÇÃO

O diabetes mellitus é uma síndrome decorrente da falta de insulina ou de

produção insuficiente desse hormônio, indispensável, em particular, ao equilíbrio

metabólico dos carboidratos. Caracteriza-se pela hiperglicemia e, freqüentemente, por

complicações crônicas microvasculares, macrovasculares e neurológicas (LERÁRIO,

1997).

King et al. (1998) estimam que a prevalência do diabetes em todo o mundo

passaria de 4%, em 1995, para 5,4% em 2025, atingindo aproximadamente 300

milhões de indivíduos. Os três países mais afetados por esta doença são: a Índia, a

China e os Estados Unidos e estima-se que, em 2025, 75% dos indivíduos diabéticos

estarão em países em desenvolvimento; a maioria desses indivíduos será de mulheres

e residentes em áreas urbanas. O diabetes é uma nosologia de alta prevalência no

Brasil, onde as estimativas epidemiológicas apontam para uma elevação desses

índices na próxima década. Há a perspectiva de que, no ano 2010, existam duzentos e

trinta e nove milhões de diabéticos em todo o mundo. No Brasil, atualmente, estima-se

a existência de cinco milhões de diabéticos, sendo que a metade dessa população

desconhece ser portadora de tal doença. Levando-se em conta os dados obtidos no

censo de diabetes, realizado em 1988, observa-se, em brasileiros de 30 a 69 anos de

idade, uma prevalência de 7,6%, constituindo-se essa doença na quarta causa de óbito

no Brasil. A este alto índice de pacientes diabéticos são destinados 5% a 14% dos

recursos financeiros aplicados pelos setores responsáveis pela saúde da população

(LERÁRIO, 1995). Em 1995, o Brasil ocupava a sexta posição no rank dos países com

a maior população de indivíduos diabéticos e deverá, em 2025, ocupar a oitava posição

(KING et al. 1998).

O diabetes apresenta 5 complicações clássicas: retinopatia, neuropatia

periférica, microangiopatia, macroangiopatia e nefropatia. Löe (1993), em seu estudo

clássico intitulado “The sixth complication of diabetes mellitus”, concluiu que a

periodontite apresenta-se mais severa e prevalente entre os diabéticos e que esta

deveria ser considerada a sexta complicação do diabetes mellitus. Taylor (2001)

observou que a inter-relação entre a periodontite e o diabetes mellitus é bi-direcional.

A severidade, a prevalência e a incidência da periodontite são maiores em

diabéticos quando comparadas às dos indivíduos metabolicamente saudáveis

(BELTING et al. 1964; BRIDGES et al. 1996; SHLOSSMAN et al. 1990; NELSON et al.

1990 & EMRICH, SHLOSSMAN & GENCO 1991). O controle metabólico inadequado,

segundo Ervasti et al. (1985) e Oliver & Tervonen (1994), está correlacionado à

severidade da periodontite e ao aumento do risco de indivíduos diabéticos virem a

desenvolvê-la. Por outro lado, Hayden & Buckley (1989) dizem não haver inter-relação

da periodontite com o controle metabólico e a duração do diabetes. Entretanto,

segundo Hugoson et al. (1989), Cerda et al. (1994) e Firatli, Yilmaz & Onan (1996), tal

duração exerce grande influência sobre a severidade da periodontite. Estudos sobre a

periodontite em portadores de diabetes revelaram que a microbiota subgengival de

pacientes portadores de periodontite severa e diabetes não insulinodependente foi

similar à constatada em pacientes não diabéticos com periodontite severa (ZAMBON et

al. 1988; COLLIN et al. 1998).

Lalla et al. (1998) afirmaram que a glicosilação não enzimática de proteínas e

lipídios é conseqüência da hiperglicemia, resultando na formação dos produtos finais

avançados de glicosilação (AGEs), que são acumulados normalmente no plasma e nos

tecidos; este acúmulo é exacerbado em diabéticos. A interação entre os AGEs e o seu

receptor (RAGE) aumenta a produção do fator de necrose tumoral alpha (TNF-α)

resultando na exacerbação do processo inflamatório.

Por outro lado, a eliminação do processo infeccioso inflamatório acarretaria a

diminuição da concentração de citocinas pró-inflamatórias nos tecidos gengivais, dentre

elas o TNF-α. Esta citocina é um dos principais fatores envolvidos na resistência à

insulina (NISHIMURA et al. 1998); portanto, a eliminação ou diminuição do processo

inflamatório observado na periodontite favoreceria o controle metabólico em pacientes

diabéticos. Uma possível relação entre a diminuição do processo inflamatório e a

melhora no controle metabólico foi primeiramente apontada por Williams & Mahan

(1960), ao destacar o efeito do controle do processo infeccioso periodontal no controle

metabólico. Posteriormente, Miller et al. (1992) e Grossi et al. (1997) concluíram que a

terapia periodontal seria uma terapia importante no controle metabólico do diabetes, o

que não foi observado, no entanto, por Smith et al. (1996).

A periodontite é uma entidade nosológica de natureza infecciosa; caracterizada

pelo desencadeamento de uma potente resposta inflamatória, responsável pela

destruição dos tecidos de suporte das unidades dentárias. O estudo de Borrell &

Papapanou (2005), sugere que os microrganismos presentes na placa bacteriana são

os agentes etiológicos responsáveis por essa doença. Segundo Fox (1992) a resposta

de cada indivíduo à agressão bacteriana é singular, ocorrendo diferenças marcantes

até mesmo entre sítios de um mesmo indivíduo.

A susceptibilidade à periodontite envolve uma tríade formada por: bactéria,

hospedeiro e fatores ambientais (SEYMOUR & TAYLOR 2004). O hábito de fumo e o

diabetes são fatores de risco para o desenvolvimento da periodontite, uma vez que

aumentam a probabilidade de acometimento desta doença infecciosa. Porém, tanto o

fumo como o diabetes não são determinantes para o desenvolvimento da periodontite

(BORRELL & PAPAPANOU 2005).

Michalowicz et al. (1991) sugeriram que a singularidade da resposta imunológica

frente ao desafio microbiano pode ser induzida por fatores de risco genéticos.

Evidências sobre a influência genética na patogênese da periodontite foram publicadas,

em alguns artigos, na última década (MICHALOWICZ et al. 1994; D’AIUTO et al. 2004).

Van Der Velden et al. (1993) concluíram que fatores genéticos são os responsáveis

pela agregação familiar observada na epidemiologia da periodontite.

Loss John & Laine (2005) estimam que a periodontite apresenta entre 10 a 20

genes modificadores da doença. Estes contribuem para a susceptibilidade e severidade

da periodontite, porém, sua presença não determina o desenvolvimento da mesma,

sendo necessária a participação simultânea de outros fatores como a microbiota

patogênica para desencadeá-la (HART 1996).

Aspectos como o polimorfismo genético de citocinas e o polimorfismo da

molécula de classe II do HLA são fatores genéticos. Tais fatores, segundo Michalowicz

et al. (1991), podem influenciar a história natural da periodontite, exacerbando o

processo inflamatório, induzido por um padrão alterado na produção e secreção de

citocinas pró-inflamatórias e/ou das citocinas regulatórias, exercendo influência direta

sobre o início, a regulação e a perpetuação do processo infeccioso inflamatório

periodontal (GORE et al. 1998; BERGLUNDH, et al. 2003; D`AIUTO et al. 2004,).

Segundo Gemmell & Marshall (1997) as citocinas desempenham papel central no

processo inflamatório periodontal, na perda óssea alveolar e na regulação da resposta

imune adaptativa. Seymour & Taylor (2004) relataram que as citocinas atuam na

imunoregulação, determinando o perfil Th1/Th2 da resposta imune.

Gore et al. (1998) e Scarel-Caminaga et al. (2002) observaram que existe

associação entre a freqüência de determinados alelos ( alelo 2 na posição + 3953 da IL-

e o polimorfismo de um único nucleotídeo (T→G) na posição –330 da IL-2,

respectivamente) e a severidade da periodontite. Também, as concentrações das

citocinas IL-1β, TNF-α, IL-2 e IFN-γ estavam, em média, superiores no soro e nas

amostras de tecidos gengivais de indivíduos portadores de periodontite quando

comparadas àquelas obtidas em indivíduos periodontalmente saudáveis (GÓRSKA et

al. 2003). Por outro lado, Gonzales et al. em 2002, concluíram não haver associação

entre polimorfismos genéticos e as doenças periodontais crônica e agressiva.

O polimorfismo genético pode resultar em diferentes seqüências de resíduos de

aminoácidos modificando o padrão de resposta imune ao desafio microbiano (Mcdevitt

2000).

Vários autores (FIRATLI et al. 1996 ; OHYAMA et al. 1996 ; BONFIL et al. 1999;

MACHULLA et al. 2002) observaram associação entre a periodontite e a freqüência de

determinados antígenos do HLA como HLA-A24, -DR4 e -A9 ou de determinados alelos

DQB1 *0503, *0602 e *0603, HLA-DRB1 *0401, *0404, *0405 e *0408 e HLA-A*03 e

B*14. Por outro lado, Machulla, et al. (2002) observaram associação entre a menor

freqüência dos alelos HLA-A*31 e HLA-A*30/*31 e a incidência da periodontite.

Alley et al. (1993) estudaram as associações entre periodontite, diabetes tipo 1,

fenótipo HLA-DR/DQ e a reatividade do linfócito T a antígenos bacterianos da P.

gingivalis e C. sputigena. Os autores concluíram que a presença das moléculas de

HLA-DR4 e – DQ3 aumentam o risco para o desenvolvimento da periodontite. O

diabetes tipo 1 é considerado uma nosologia poligênica que apresenta 20 grupos de

genes associados à susceptibilidade desta forma de diabetes; destes, 13 evidenciam

associação significante (ONENGUT-GUMUSCU & CONCANNON 2002). Motala et al.

(2005) concluíram que em Bahrainis portadores de diabetes tipo 2, existe associação

significante entre os genótipos HLA-DRB1 e HLA-DQB1 e o diabetes mellitus tipo 2.

A periodontite, como outras infecções, pode complicar a saúde geral do diabético

através da indução da resistência à insulina, facilitando, conseqüentemente, a

hiperglicemia e dificultando o controle metabólico do diabetes. O presente estudo visa

observar o efeito do controle do processo inflamatório nos níveis glicêmicos, mediante

determinação da taxa da hemoglobina glicosilada em portadores de diabetes tipo 2.

Levando em consideração a multifatorialidade e o caráter individual da resposta

do hospedeiro frente ao desafio microbiano na periodontite e, observando o papel do

HLA como peça chave na apresentação de antígenos, e das citocinas na patogênese

da periodontite; é, também, objetivo deste trabalho investigar a possível associação

entre periodontite e a freqüência de determinados alelos que venha justificar a resposta

exacerbada de indivíduos diabéticos frente ao desafio microbiano e a predisposição de

indivíduos diabéticos à periodontite.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Inter-relação Periodontite e Diabetes Mellitus

2.1.1 Diabetes mellitus

O diabetes mellitus é uma nosologia decorrente da falta de insulina ou de

produção insuficiente desse hormônio, indispensável, em particular, ao equilíbrio

metabólico dos carboidratos; compreende um grupo heterogêneo de desordens

caracterizadas pela hiperglicemia e, freqüentemente, por complicações crônicas

microvasculares, macrovasculares e neurológicas (LERÁRIO, 1997). Essa entidade é

uma doença crônica que requer cuidados médicos contínuos e participação essencial

dos pacientes em programas de educação e motivação, objetivando a prevenção de

complicações crônicas (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2004).

De acordo com a classificação aprovada na 57

reunião anual da Associação

Americana de Diabetes (Boston, EUA), há o diabetes mellitus tipo 1 (DM1), o diabetes

mellitus tipo 2 (DM2), o diabetes gestacional e outros tipos específicos de diabetes

(GAVIN, 1997). No DM1, observa-se uma absoluta deficiência na secreção de insulina

determinada pela destruição imunomediada das células β do pâncreas, enquanto que,

no diabetes tipo 2, ocorre uma combinação entre a resistência periférica à ação da

insulina e uma secreção compensatória ineficiente deste hormônio frente a tal

resistência. Neste tipo de diabetes os indivíduos não dependem da administração de

insulina exógena para a sua sobrevivência, podendo a maioria dos pacientes ser

tratada com base em restrições dietéticas de carboidratos, muito embora, com o

decorrer dos anos, o uso de insulina tornar-se necessário. No diabetes gestacional,

constata-se uma intolerância aos carboidratos, de graus variados. Esse tipo de diabetes

mellitus costuma ser diagnosticado pela primeira vez durante a gestação, podendo ou

não persistir após o parto (LERÁRIO, 1997). Entre os outros tipos específicos de

diabetes, cita-se o induzido por drogas, como o dilantin e os corticóides (LERÁRIO,

1995).

Sabe-se que a resistência à insulina está diretamente relacionada à etiologia do

diabetes tipo 2 e que a obesidade é considerada como o principal fator de risco para a

resistência à insulina (SAITO, SHIMAZAKI & SAKAMOTO, 1998). Hotamisligil et al.

(1995) observaram associação entre a presença abundante do TNF-α nos adipócitos e

a resistência à insulina.

Segundo a American Diabetes Association (2004) atualmente, existem três

formas de diagnóstico laboratorial confiáveis: o teste de tolerância à glicose, a glicemia

casual e a glicemia plasmática em jejum, sendo esta última a preferencial para estudos

epidemiológicos. A hemoglobina glicosilada HbA

não é recomendada para fins de

diagnóstico, sendo, porém, utilizado como teste de eleição para o controle metabólico

da doença (PICHÉ, SWAN & HALLMON, 1989).

A expressão hemoglobina glicosilada se refere a uma série de pequenos

componentes da hemoglobina formados através da ligação de moléculas dessa

cromoproteína com um carboidrato, geralmente a glicose. A hemoglobina A

é um tipo

específico de hemoglobina glicosilada formada pela reação da glicose com o grupo

amino N-terminal do sítio de ligação β dessa heteroproteína.

A dosagem da hemoglobina glicosilada é realizada a partir de um ensaio de

captura iônica, onde se mensura a porcentagem de hemoglobina glicosilada no sangue

total humano (ABBOTT LABORATORIES, 1994). Os resultados são válidos como

indicativos da concentração de glicose no sangue por um período de 1 a 3 meses. Para

este ensaio o parâmetro de normalidade está entre 4,4% e 6,4% A

1c.

2.1.2 A patogênese da Periodontite

Apesar da periodontite ser uma nosologia inflamatória cujo fator etiológico

primário é a placa bacteriana, formas mais agressivas da periodontite podem ocorrer

associadas a pequena quantidade de placa. Microrganismos como o Actinobacillus

actinomycetemcomitans (A.a.) atuam na rápida destruição tecidual observada nas

doenças periodontais agressivas. Van Der Velden et al. (1989) avaliaram 4565

estudantes, sendo 1961 do sexo feminino e 2604 do sexo masculino. A perda de

inserção foi observada em 230 estudantes. Destes, 73,9% apresentaram perda de

inserção leve, 19,1% perda de inserção moderada e 7% apresentavam perda de

inserção severa. O A.a. foi encontrado em 18 dos 105 estudantes voluntários; a análise

estatística revelou que este microrganismo foi mais freqüente naqueles indivíduos que

apresentaram perda de inserção severa. Foi concluído que a destruição periodontal em

jovens parece estar associada à placa e à inflamação gengival; os homens são mais

afetados do que as mulheres, porém nestas a destruição periodontal observada é mais

intensa.

A resposta imunológica individual ao desafio bacteriano tem participação

fundamental na severidade e predisposição à periodontite; esta resposta sofre

influência direta de aspectos genéticos. Michalowicz et al. (1991), avaliaram 63 pares

de gêmeos monozigóticos criados juntos, 13 pares criados separadamente e 33 pares

de gêmeos dizigóticos criados juntos. Os autores concluíram que o componente

genético pode influenciar a profundidade de sondagem, o índice de placa e a perda de

inserção. Estimativas de hereditariedade apontam que de 38 a 82% da variação

observada entre os parâmetros avaliados deve ser atribuída a fatores genéticos,

sugerindo a influência destes na patogênese da periodontite. Van Der Velden et al.

(1993) concluíram que características de hereditariedade são as responsáveis pela

agregação familiar observada na periodontite.

Por outro lado, Michalowicz (1994) publicou revisão de literatura e considerou

que a teoria da predisposição genética ou hereditária vinculada à periodontite é melhor

aplicada nos indivíduos classificados como portadores da periodontite pré-puberal, uma

vez que está associada às diversas síndromes hereditárias e desordens genéticas

como a síndrome de Papillon-Lefèvre e a síndrome da deficiência de adesão

leucocitária. Hart et al. (1999), estudaram 4 mutações no gene da catepsina C (11q14)

em portadores da síndrome de Papillon-Lefèvre. A referida síndrome é uma desordem

autossômica recessiva caracterizada por hiperqueratose palmo-plantar e periodontite

severa de início precoce. Os resultados levaram os autores a concluir que o gene da

catepsina C apresenta-se como gene principal da periodontite de acometimento

precoce. A catepsina C é uma proteinase observada em neutrófilos, células epiteliais e

linfócitos. Hart et al. (2000.a) observaram que as crianças homozigotas para o

polimorfismo de transição de A→G na posição +1040 eram afetadas pela periodontite e

apresentavam uma diminuição da atividade da catepsina C. Porém, o papel que a

diminuição da atividade da catepsina C exerce sobre a patogênese da periodontite pré-

puberal permanece obscuro.

Michalowicz (1994), em sua revisão de literatura, concluiu que a periodontite

crônica é provocada pela conjunção de fatores ambientais e não ambientais; estudos

baseados em núcleos familiares não detectaram variações genéticas associadas à

periodontite; porém, dados obtidos por estudos em gêmeos sugerem que fatores

genéticos ainda indeterminados podem influenciar esta nosologia.

Page & Schroeder (1981) consideraram que a periodontite, sem exceção, é

causada pela placa bacteriana; porém, a presença da placa por si só é insuficiente para

o estabelecimento da lesão avançada, sendo necessária a interação da bactéria com o

sistema de defesa do hospedeiro. Este é ativado para proteger o indivíduo contra o

desafio microbiano, porém, paradoxalmente, atua ativamente no processo de

destruição tecidual. Os autores comentam que estudos anteriores sugeriram que os

antígenos bacterianos advindos da placa induziriam um processo de hipersensibilidade

tardia e que a ativação dos linfócitos B desencadearia a produção de anticorpos

específicos que ativariam a cascata do complemento. Também, foi sugerido que a

ativação dos linfócitos T e B resultaria no aumento da produção de citocinas. A análise

dos trabalhos mais atuais revela que a principal população de células presentes em

sítios com periodontite é de linfócitos B; portanto, o processo de hipersensibilidade

sugerido não se fez efetivo na destruição tecidual observada. A formação de

imunocomplexos também não foi determinante, uma vez que os periodontopatógenos

apresentam antígenos que desencadeiam a ativação do sistema complemento. Porém,

o aumento na produção de citocinas representa um dos principais papéis na destruição

tecidual observada.

A eficácia da resposta imune a um determinado patógeno depende da ativação

de funções efetoras adequadas. O perfil Th1 é caracterizado principalmente pela

secreção da citocina IFN-γ, que induz o aumento da capacidade dos macrófagos em

atuar contra patógenos intra e extracelulares. Por outro lado, o padrão Th2 induz a

secreção das citocinas IL-4, IL-5 e IL-6, levando a uma produção maciça de anticorpos.

Gemmell et al. (1998) avaliaram o perfil de produção de citocinas na resposta

local e sistêmica induzida pela ativação das células T pelos antígenos do P. gingivalis

(P.g.) e concluíram que a resposta protetora envolve uma intensa secreção do IFN-

. O

padrão de resposta imunológica resulta em proteção ou em destruição tecidual, no qual

o perfil de citocinas secretadas induz o tipo de anticorpos presentes. A lesão gengival é

caracterizada pela presença dominante de linfócitos T e pelo baixo número de linfócitos

B envolvidos. Na progressão da lesão gengival para a lesão periodontal observa-se

domínio dos linfócitos B e dos plasmócitos, sugerindo um padrão Th2. Por outro lado,

Gemmel et al. (2002), avaliaram se a apresentação do periodontopatógeno P.gingivalis

por diversas células apresentadoras de antígenos resultaria em diferenças no padrão

de liberação de citocinas e concluíram sugerindo que as células T ativadas pelos

antígenos do Pg induzem tanto o padrão Th1 quanto o Th2. Gemmell & Seymour

(2004), em um artigo de revisão, concluíram que a imunoregulação dos perfis Th1 e

Th2 de citocinas é fundamental no desenvolvimento da periodontite; neste caso, a lesão

estável apresenta-se similar a uma reação de hipersensibilidade tardia, vinculada à

presença maciça de células T, enquanto que na lesão ativa os linfócitos B e os

plasmócitos são as células mais freqüentes. Este perfil sugere uma associação do perfil

Th1 com a lesão estável e do perfil Th2 com a lesão ativa.

Da mesma forma Sigusch et al. (1998) concluíram que indivíduos portadores de

periodontite apresentam uma expressão anormal de citocinas; afirmam que as células T

e seus produtos têm grande importância na patogênese desta nosologia e que a

diminuição da resposta Th1 em indivíduos portadores de periodontite de início precoce

e o aumento da resposta Th2/Th0, entre os portadores da periodontite do adulto, pode

contribuir para o aumento na susceptibilidade à periodontite.

Górska et al. (2003) concluíram que as interleucinas IL-1β, TNF-α, IL-2 e IFN-γ,

predominam na patogênese da periodontite crônica severa; porém, a concentração

sérica de citocinas não pode ser utilizada como indicador da atividade ou severidade da

periodontite.

Prabhu, Michalowics & Mathur (1996) compararam o padrão de produção de

citocinas sintetizadas por linfócitos Th1 e Th2 e por células inflamatórias: IL-2, IL-6,

IFN-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10 e a expressão dos RNAm das citocinas: IL-1α, IL-2, IL-4, IL-6,

IL-8, IL-10, IFN-α, IFN-γ, TGF-β1 e IL-12 entre o grupo teste, formado por portadores da

periodontite do adulto, e o grupo controle, composto por indivíduos saudáveis. Os

autores observaram que não houve diferença entre os níveis plasmáticos das citocinas

entre os grupos. Os níveis de RNAm da IL-6 e do IFN-α, nas células dos tecidos

gengivais, foram significativamente mais altos no grupo teste.

2.1.3 A Periodontite em diabéticos

Williams (1928), em seu estudo clássico “Diabetic periodontoclasia”, afirmou que

a infecção oral apresenta certas características singulares bem definidas em diabéticos,

propondo a definição dessa infecção como uma entidade clínica distinta das infecções

orais em geral.

Nelson et al. (1990) avaliaram 2.273 indivíduos pertencentes à comunidade de

Pima Indians entre 1983 e 1989, e concluíram que a periodontite deveria ser

considerada uma complicação não específica do DM 2. Também, Emrich, Shlossman &

Genco (1991) realizaram estudo longitudinal com 1.342 portadores de DM 2 da mesma

população. Os resultados obtidos permitiram inferir associação entre a falta de controle

metabólico do diabetes, a idade e a presença de cálculo subgengival e o aumento da

prevalência e da severidade da periodontite. Foi observado que os diabéticos tipo 2

apresentam maior risco em desenvolver a periodontite destrutiva, com base na perda

de inserção obtida (risco aumentado em 2,81 vezes frente aos indivíduos sadios) e com

base na perda óssea detectada (risco aumentado na proporção de 3,43 vezes frente

àqueles indivíduos). Tais achados sugerem que os portadores de DM 2 apresentariam

risco aumentado na proporção de três vezes para desenvolver a periodontite destrutiva.

Löe (1993) avaliou 2.180 indivíduos, maiores de 15 anos, submetidos a exames

bianuais, entre 1983 e 1988 para estudar a prevalência do DM 2. No entanto, o estudo

da incidência do DM 2 nessa comunidade comportou uma amostra de 746 indivíduos

que não eram, a princípio, portadores da periodontite, 50 indivíduos diabéticos e 696

indivíduos não diabéticos, que foram observados durante o mesmo período. Para o

estudo diretamente relacionado ao DM 1, foram avaliados 102 dinamarqueses, entre os

quais 51 diabéticos e 51 não diabéticos, com idades entre 20 e 40 anos, todos

submetidos a exames padronizados. De acordo com os resultados obtidos, o autor

concluiu que: a prevalência da periodontite é substancialmente maior entre os

diabéticos tipo 2 frente aos indivíduos não diabéticos; a perda de inserção clínica e de

osso alveolar têm início precoce entre os diabéticos tipo 2 e que a taxa de incidência da

periodontite entre os portadores de DM 2 é, aproximadamente, três vezes maior do que

entre os não diabéticos. Este autor constatou também que : os diabéticos tipo 2 estão

quinze vezes mais propensos a se tornarem edêntulos em relação aos indivíduos não

diabéticos; a taxa de edentulismo é diretamente proporcional ao avanço do diabetes,

em termos de tempo da doença; os diabéticos tipo 1 diagnosticados há mais de 10

anos apresentam maior perda de inserção do que aqueles diagnosticados há menos de

10 anos; os portadores de DM 1 e DM 2 estão predispostos à periodontite, devendo

essa correlação ser considerada como a sexta complicação do diabetes.

Ao tratar da epidemiologia da periodontite, Papapanou (1996) registrou que,

entre os fatores de risco que predispõem os indivíduos a essa doença, acha-se o

distúrbio endócrino diabetes mellitus, constatação fundamentada em importantes dados

da literatura, entre eles os publicados por Hugoson et al. (1989), Nelson et al. (1990),

Shlossman et al. (1990) e Morton, William & Watts (1995). O autor concluiu pela

existência de associação, estatisticamente significativa, entre a periodontite e o

diabetes mellitus. Adicionalmente, Moore et al. (1999) concluíram que a idade, o tempo

de diagnóstico do diabetes e o hábito de fumar estão associados a uma alta prevalência

da periodontite.

Taylor et al. (1998) concluíram que existe um significativo gradiente de risco e de

severidade de perda óssea alveolar, que coloca os pacientes diabéticos

descompensados, do ponto de vista metabólico, como o grupo de indivíduos mais

suscetíveis em relação ao risco e à severidade de perda óssea alveolar, seguido pelos

diabéticos bem controlados, finalizando com os indivíduos não diabéticos.

A hiperglicemia, observada em diabéticos, expõe proteínas e lipídios a moléculas

de açúcar reduzidas; tal exposição resulta na glicosilação não enzimática e na oxidação

de proteínas e lipídios, formando, assim, os produtos finais avançados de glicosilação

(AGEs). Dentre os receptores dos AGEs, existe um membro da superfamília das

imunoglobulinas denominado RAGE, presente na membrana celular de monócitos e

células endoteliais, dentre outras. A interação AGE-RAGE, em monócitos, resulta no

aumento da migração para áreas inflamadas e no aumento da produção de citocinas

pró-inflamatórias como o TNF-α; já nos vasos sanguíneos, observa-se um aumento da

permeabilidade e outras alterações direcionadas para o aumento do processo

inflamatório. Desse modo, a interação AGE-RAGE seria responsável pela criação de

um ambiente pró-inflamatório, onde observa-se a ativação de osteoclastos e a liberação

de metaloproteinases, resultando em uma destruição tecidual exagerada, constatada

entre diabéticos portadores da periodontite (LALLA, LAMSTER & SCHMIDT, 1998). Em

estudo posterior, Lalla et al. (2000) relatam que nos fibroblastos, a interação AGE-

RAGE é a responsável pelo aumento na ativação das metaloproteinases da matriz e

pela diminuição na formação do colágeno descritas na periodontite.

As concentrações das citocinas pró-inflamatórias como a IL1β e o TNF-α no

fluido crevicular gengival dos diabéticos têm níveis elevados. Os diabéticos portadores

de periodontite moderada ou severa apresentavam concentração duas vezes maior dos

mediadores pró-inflamatórios no fluido crevicular em comparação às concentrações

observadas entre aqueles portadores de gengivite e periodontite crônica leve. A

secreção da PGE

, IL1β e TNF-α por monócitos ativados pelo LPS do P.g. foi 4,2, 4,4 e

4,6 vezes superior entre os diabéticos portadores de periodontite moderada ou severa.

Salvi, Beck & Offenbacher (1998) sugeriram que o diabetes mellitus é um fator de risco

significante para a severidade da periodontite, uma vez que reage de forma exacerbada

ao desafio microbiano.

2.1.4 Efeito do tratamento periodontal no controle

metabólico do Diabetes mellitus

Williams Jr. & Mahan (1960) estudaram a periodontite e o diabetes mellitus em 9

pacientes diabéticos, portadores de periodontite, que se encontravam metabolicamente

bem controlados através de dieta, administração de insulina ou hipoglicemiantes orais.

Os 9 pacientes foram submetidos a terapia antibiótica, tendo sido utilizado 300.000

unidades de penicilina G procainada e 0,5mg de estreptomicina por um período de dez

dias, e ao tratamento periodontal básico e cirúrgico. Os autores observaram uma

redução na necessidade de insulina em 7 dos 9 pacientes tratados, concluindo que a

terapia periodontal e extrações, quando indicadas, podem melhorar o controle

metabólico de pacientes diabéticos.

Também, Miller et al. (1992) observaram 9 pacientes DM 1 submetidos à terapia

mecânica, bochechos à base de clorexidina duas vezes ao dia por trinta segundos e o

uso de 100mg diários de doxiciclina durante 14 dias e observaram que o controle

metabólico do diabetes pode estar associado ao controle da inflamação periodontal.

Grossi et al. (1996) propuseram um novo protocolo de tratamento para doenças

periodontais em diabéticos que consiste na incorporação de agentes antimicrobianos e

na modulação farmacológica da resposta do hospedeiro, concluindo que a eliminação

da infecção periodontal e a redução do processo inflamatório tiveram como

conseqüência uma redução significativa, em curto prazo, dos valores encontrados

através do ensaio da hemoglobina glicosilada.

Nesta mesma linha de pesquisa, Grossi et al. (1997) avaliaram 113 diabéticos,

que receberam tratamento periodontal mecânico e foram divididos de modo aleatório

em cinco grupos, de acordo com o tratamento antimicrobiano prescrito. Todos os

grupos de estudo mostraram melhoras clínicas e microbiológicas, constatando-se, nos

grupos tratados com doxiciclina, uma maior redução na profundidade de sondagem,

nos níveis de P.g. e uma redução, em média, de 10% nos valores da HbA

. Os autores

concluíram que o controle da infecção periodontal deveria ser considerado como parte

fundamental na manutenção da saúde de pacientes diabéticos. Também, Collin et al.

(1998) concluíram que a periodontite severa é comum entre diabéticos não

insulinodependentes, que a infecção periodontal pode interferir sobre o controle

metabólico do diabetes nesses indivíduos e que a prevenção e o tratamento da

periodontite avançada devem ser enfatizados como essenciais em indivíduos diabéticos

não insulinodependentes.

Ainda estudando o efeito da terapia periodontal nos níveis glicêmicos, Stewart et

al. (2001) compararam as mudanças no controle metabólico entre dois grupos formados

por indivíduos portadores de DM 2; o grupo teste foi submetido a tratamento periodontal

não cirúrgico e exodontias e o grupo controle não recebeu qualquer tratamento. A

redução na porcentagem deste parâmetro metabólico no grupo teste foi da ordem de

17,1% e a observada no grupo controle foi de 6,7%, ambas foram estatisticamente

significantes. Os autores concluíram que a terapia periodontal está associada à melhora

no controle metabólico em indivíduos diabéticos tipo 2. Monteiro & Araújo (2003)

avaliaram 45 indivíduos diabéticos tipo 2, metabolicamente controlados, e concluíram

reforçando o pressuposto de que a recuperação da saúde do periodonto é um fator

positivo para o controle do diabetes mellitus, ainda que se trate de portadores de

diabetes tipo 2, controlados endocrinologicamente.

Também Kiran et al. (2005), ao avaliarem o efeito da melhora do quadro clínico

periodontal no controle metabólico de indivíduos diabéticos tipo 2, observaram que a

terapia periodontal resultou na melhora estatisticamente significativa dos parâmetros

clínicos periodontais e na diminuição da porcentagem da hemoglobina glicosilada no

grupo teste. Além disto, uma discreta elevação na porcentagem da hemoglobina

glicosilada foi observada no grupo controle. Os dados sugerem que o tratamento

periodontal está associado à melhora no controle metabólico em indivíduos diabéticos

tipo 2.

Por outro lado, Smith et al. (1996) concluíram que a raspagem e o alisamento

radicular de bolsas profundas e moderadas e uma boa higiene oral podem não ser

suficientes para a manutenção do periodonto em uma condição estável. Além disso,

mesmo naqueles pacientes que apresentaram uma melhora nos parâmetros clínicos,

ela poderia ser de curta duração. Da mesma forma Promsudthi et al. (2005), apesar da

melhora estatisticamente significante nos seus parâmetros clínicos periodontais

observados no grupo teste e do agravamento significativo da perda de inserção clínica

no grupo controle, não constataram diminuição estatisticamente significativa na

porcentagem da hemoglobina glicosilada após a terapia periodontal no grupo teste.

2.2 Estudos de associação entre os polimorfismos genéticos do HLA

e o Diabetes mellitus

O Antígeno Leucocitário Humano (HLA) de classe II tem papel central no

reconhecimento antigênico e, portanto, induz a diferentes formas de resposta

imunológica e a susceptibilidade imunogenética às diversas doenças influenciadas por

reações imunes. O grande polimorfismo observado nos genes do HLA de classe II pode

ser a causa das diferenças individuais observadas na resposta imunológica (OKADA et

al. 2002)

Forsblom et al. (1998), utilizando análise de regressão múltipla logística,

observou que a microangiopatia, a neuropatia, a porcentagem de hemoglobina

glicosilada e a taxa de excreção da albumina apresentam-se como fatores de risco

independentes para a mortalidade cardiovascular em indivíduos diabéticos tipo 2 e que

a presença do HLA-DR4 e de sinais de autoimunidade podem estar associados à

diminuição no risco em desenvolver doenças cardiovasculares.

Horton et al. (1999) genotiparam 1.712 indivíduos caucasianos diabéticos com

idade entre 25 e 65 anos e 200 controles para obter a freqüência dos alelos HLA-

DRB1*03 e HLA-DRB1*04 e do haplótipo HLA-DRB1*04/DQB1*0302. A presença dos

anticorpos ICA, GADA ou ambos foi avaliada entre os diabéticos; estes foram

subdivididos em 4 subgrupos (25-34, 35-44,45-54 e 55-65 anos) de acordo com a idade

na qual foram diagnosticados como diabéticos. Foi concluído que os genótipos do

DRB1 e do DQB1 são fatores de risco para o diabetes autoimune de início na idade

adulta, influenciando o período de acometimento do diabetes. Os anticorpos ICA e

GADA estão fortemente associados aos genótipos HLA-DRB1*03/ HLA-DRB1*04-

DQB1*0302 entre os indivíduos diagnosticados como diabéticos entre 25-34 anos.

Onengut-Gumuscu & Concannon (2002) concluíram que os genes que codificam

as moléculas HLA-DR influenciam na susceptibilidade ao diabetes tipo 1 e estão em

desequilíbrio de ligação com os genes DQB1 e DQA1, estando o HLA-DRB1*04 em

desequilíbrio de ligação com o HLA-DQB1*0302. Este último é considerado o principal

alelo na susceptibilidade ao diabetes tipo 1. Cerna, Novota & Kolostova ( 2003) também

observaram maior freqüência, estatisticamente significativa, dos alelos

DRB1*03/DRB1*04 e DQB1*0201/DQB1*0302, em heterozigose, entre os indivíduos

diabéticos tipo 1 oriundos da república Checa quando comparados aos controles. Os

autores sugeriram que a presença do alelo HLA-DQB1*0302 identifica indivíduos com

alto risco em requerer tratamento insulínico.

Neste mesmo ano, Haiyan et al. (2003) hipotetizaram o papel do polimorfismo

genético (G308A e G238A), na região promotora do IFN-γ, associados ao grupo alélico

HLA-DQB1*02, como potenciais fatores modificadores de risco para o diabetes tipo 2.

Também avaliaram se os supracitados polimorfismos atuariam associados ao locus de

classe II do HLA, induzindo o fenótipo dos indivíduos diabéticos tipo 2 que descendem

de famílias afetadas tanto pelo diabetes tipo 1 quanto pelo tipo 2. Os resultados

mostraram associação entre o polimorfismo genético e o fenótipo caracterizado pela

resistência à insulina associado ao HLA-DQB1*02. Também, em diabéticos que

descendem de famílias compostas por somente diabéticos do tipo 2, que apresentavam

genótipo AA/AG nas posições supracitadas, no gene do TNF-α , foi observado menor

concentração da proteína C quando comparados aos indivíduos que apresentavam o

genótipo GG. Os autores observaram que o alelo A está associado ao DM 2 de forma

independente ao lócus DQB1*02.

Mimura et al. (2003) avaliaram quarenta e quatro indivíduos diabéticos tipo 2

diagnosticados antes dos 30 anos de idade, portadores de retinopatia diabética, 45

indivíduos diabéticos diagnosticados precocemente, que não apresentavam qualquer

sinal de retinopatia, e 50 indivíduos saudáveis que formaram o grupo controle. Não

foram observadas diferenças significantes na freqüência dos antígenos: HLA-A,-B e –

DQ entre os 3 grupos. Os pacientes diabéticos, que não apresentavam retinopatia, ao

serem comparados ao grupo controle, mostraram maior freqüência do HLA Cw4 e DR4

e no grupo composto por indivíduos portadores de retinopatia, o antígeno HLA-DR4 foi

significativamente mais freqüente quando comparado ao grupo controle. Os autores

concluíram que o conhecimento do antígeno HLA pode ser útil para a avaliação da

predisposição do desenvolvimento do diabetes tipo 2 de início precoce.

Emery et al. (2005) pesquisaram a associação entre os genótipos HLA-DR e

HLA-DQ, a idade na qual a criança foi acometida pelo diabetes e a etnia em 1322

indivíduos diabéticos tipo 1 e em 3339 crianças que caracterizaram a população geral

de Denver, no Colorado. Foram observadas associações entre o DM-1 e os genótipos:

HLA-DR 3 /4, DQB1*0302, DR(1,4,8 OU 9)/4, DQB1*0302 e HLA-DR3/3; sendo que o

genótipo HLA-DR 3/4, DQB1*0302 apresentou a taxa de associação mais alta,

principalmente entre aqueles que desenvolveram o diabetes mais precocemente. A

frequência de aparecimento da combinação de alelos protetores DR2 e DQB1*0602 foi

significativamente maior na população em geral. Também os genótipos DR3/9 foram

associados ao diabetes tipo 1 entre caucasianos. Os autores concluíram que existem

múltiplos alelos associados ao diabetes tipo 1 e que o risco inerente aos diferentes

alelos associados varia de acordo com a idade na qual o diabetes foi desencadeado,

resultando em associações entre marcadores como HLA-DR 3/4, DQB1*0302 e formas

mais agressivas do diabetes tipo 1.

Neste mesmo ano, Motala et al. (2005) observaram que as freqüências dos alelos

HLA-DRB1*040101 e do DRB1*070101 foram significativamente maior entre os

indivíduos que compuseram o grupo teste; por outro lado, neste mesmo grupo, as

freqüências dos alelos DRB1*110101, DRB1*160101 e DRB1*1413 foram

significativamente menores quando comparadas às freqüências no grupo controle. Os

haplótipos DRB1*040101/DQB1*0302, DRB1*070101/DQB1*050101, DRB1*150101/

DQB1*060101 e DRB1*070101/ DQB1*0201 foram positivamente associados ao

diabetes mellitus tipo 2. O haplótipo DRB1*160101-DQB1*050101 apareceu em

freqüência significativamente maior no grupo controle. Na comparação entre a

freqüência dos haplótipos associados ao diabetes mellitus tipo 1 e a freqüência

haplotípica observada no diabetes mellitus tipo 2, entre indivíduos Bahraini, foi

observado que enquanto os haplótipos DRB1*030101-DQB1*0201 e

DRB1*030101/DQB1*0302 conferem susceptibilidade ao diabetes tipo 1, apresentam-

se neutros em relação ao diabetes tipo 2. Também os haplótipos

DRB1*070101/DQB1*050101, DRB1*040101/DQB1*0302 e

DRB1*150101/DQB1*060101 foram associados positivamente ao diabetes tipo 2 e não

foram associados ao diabetes tipo 1 e o haplótipo DRB1*070101/DQB1*0201 conferiu

susceptibilidade ao diabetes tipo 2 e resistência ao diabetes tipo 1. Os autores

concluíram que entre os Bahrainis, portadores de diabetes tipo 2, existe associação

estatisticamente significante entre os loci HLA-DRB1 e HLA-DQB1 e o DM-2.

2.3 Estudos de associação entre os polimorfismos genéticos do HLA

e a Periodontite

Okada et al. (2002) concluíram que os fatores genéticos do hospedeiro podem

ter efeito mais significativo no desenvolvimento da periodontite do que a presença de

periodontopatógenos. Katz et al. (1987) avaliaram a freqüência dos alelos dos loci HLA-

A, -B, -C e –DR. Não foram observadas diferenças significativas nas freqüências dos

antígenos do HLA-A, -B e -C entre os portadores de periodontite de progressão rápida

(PPR) e o grupo controle. Por outro lado, no grupo RPP a freqüência do antígeno HLA-

DR4 foi de 80%, enquanto que a mesma, no grupo controle, foi de 38,3%. Os autores

concluíram que a maior freqüência do antígeno DR4 pode predispor o indivíduo à PPR.

Também Alley et al. (1993) concluíram que as Moléculas HLA-DR4 e –DQ3 associadas

às células apresentadoras de antígeno podem sinalizar susceptibilidade aumentada à

periodontite e que o fenótipo do HLA-D tem maior influência sobre a susceptibilidade à

periodontite do que ao status do diabetes.

Bonfil et al. (1999) avaliaram a associação entre alelos do HLA-DR4, periodontite

severa e a periodontite de progressão rápida . Foi observado que os alelos HLA-

DRB1*0401, *0404, *0405 e *0408 tenderam, não de forma estatisticamente

significativa, a ser mais freqüentes entre os indivíduos que integravam o grupo teste

quando comparados aos indivíduos do grupo controle; porém, a análise do subgrupo

formado apenas por indivíduos portadores da periodontite de progressão rápida

mostrou que os referidos alelos estavam presentes em freqüência significativamente

maior quando comparada às observadas no grupo controle. A alta freqüência dos alelos

HLA-DRB1*0401, *0404, *0405 e *0408, observada entre os portadores de PPR, levou

os autores a concluírem que estes alelos podem ser considerados como fatores de

risco para a periodontite de progressão rápida.

Por outro lado, Takashita et al. (1994) observaram não haver associação

significante entre os tipos de periodontite e os diversos sorotipos do HLA de classe II.

Também, não foram observadas associações entre os diferentes tipos de periodontite e

os alelos do HLA-DR e, com exceção da idade, nenhum parâmetro clínico foi vinculado

à variação gênica. Porém, os autores concluíram que a variação genética do HLA-

DQB1 pode ser um fator imunogenético que afeta o início e a progressão da

periodontite de progressão rápida .

Shapira et al. (1994) investigaram a existência de associação entre a freqüência

de determinados antígenos do HLA e a periodontite juvenil (PJ) nas suas formas

generalizada (PJG) e localizada (PJL). Os resultados obtidos mostraram freqüência

significativamente maior dos antígenos HLA-A9 e -B15 nos indivíduos portadores de PJ

quando comparados aos indivíduos controles. Na divisão do grupo teste, a freqüência

aumentada dos antígenos HLA-A9 e -B15 só foi observada no subgrupo SGP. Não

foram observadas associações entre a EOP e o HLA-DR. Os autores concluíram que os

antígenos HLA-A9 e -B15 podem atuar como marcadores de risco para forma

generalizada da periodontite de acometimento precoce.

Também Firatli et al. (1996) observaram maior freqüência dos antígenos HLA-

A24 e HLA-DR4 entre os indivíduos portadores de periodontite (PJ) e dos antígenos

HLA-A9 e HLA-DR4 entre aqueles portadores de periodontite de progressão rápida

quando comparados ao grupo controle. A presença dos antígenos HLA-A24, HLA-DR4

e HLA-A9 conferem maior susceptibilidade às diversas formas de periodontite de

acometimento precoce.

Por outro lado, Ohyama et al. (1996) observaram que os alelos HLA-DRB1

*1401, *1501 e DQB1 *0503 e *0602 foram mais freqüentes nos indivíduos portadores

de PJ de forma não significativa. Também analisaram as seqüências de resíduos de

aminoácidos e constataram que a freqüência dos alelos HLA-DQB1 *0503, *0602 e

*0603, que possuem o ácido aspártico na posição 57 e glicina (G) na posição 70, foi

significativamente maior nos pacientes com PJ e concluíram que a variação dos

resíduos de aminoácidos dentro de um mesmo grupo de alelos do HLA influência na

resposta imune do indivíduo. Da mesma forma, Machulla et al. (2002) mostraram

associação positiva do HLA-DRB1*13 e a PPR e associação negativa da mesma com o

HLA-DR-*blank. Nos indivíduos portadores de periodontite do adulto foram constatadas

diminuição nas freqüências dos alelos HLA-A*03 e -B*14 e aumento na freqüência do

alelo HLA-CW*08. Foi concluído que é possível apontar associação entre o HLA e a

suscetibilidade e/ou resistência às doenças periodontais supracitadas. Por outro lado

Stein et al. (2003) observaram a dificuldade na indicação de um único alelo do HLA

como marcador de risco para a periodontite.

Fatores de risco, como o sexo, podem influir na predisposição do individuo à

periodontite. Reichert et al. (2003) avaliaram a associação entre a periodontite

agressiva (PA) e crônica (PC) e a freqüência de fenótipos do HLA; também

compararam os resultados desta associação aos obtidos no grupo controle. Os três

grupos foram divididos em relação ao gênero para análise da referida associação. No

grupo formado por indivíduos portadores de PA foi observada diminuição significativa

na freqüência do alelo HLA-DRB1*blank e um aumento significativo na freqüência do

HLA-DRB1*13. Apenas nas mulheres portadoras de periodontite agressiva, os alelos

HLA-A*68/*69 apresentaram freqüências significativamente maiores, enquanto que o

alelo HLA-DQB1*05 foi observado em freqüência significativamente menor, quando

comparadas às mulheres do grupo controle. Nenhuma diferença significativa foi

encontrada entre homens portadores de PA quando comparados aos do grupo controle.

Contudo, uma ocorrência significativamente maior na freqüência do alelo HLA-A*29, no

grupo PA, foi atribuída à maior freqüência, deste alelo, entre os homens. Além disso, a

freqüência do alelo HLA-DQB1*06, em homozigose, apresentava-se significativamente

maior apenas entre as mulheres. A análise da associação entre o grupo controle e o

grupo composto por indivíduos portadores de periodontite (PC + PA) mostrou maior

freqüência do alelo HLA-DQB1*06 entre as mulheres. Os autores concluíram que o

sexo é uma variável confundidora que deve ser considerada nos novos estudos que

abordem a associação entre o HLA e a periodontite.

2.4 Estudos de associação entre os polimorfismos genéticos de

citocinas e a Periodontite

2.4.1 TNF-α

αα

O TNF-α é uma citocina que está intimamente relacionada à periodontite, uma

vez que está envolvida no processo de reabsorção óssea e proliferação de fibroblastos.

Níveis elevados desta citocina já foram relatados em sítios com medidas de

profundidade de sondagem elevadas. Muitos fatores, incluindo o polimorfismo genético,

estão envolvidos na regulação da produção desta citocina pró-inflamatória.

Gillian et al. (1998) estudaram a distribuição dos polimorfismos dos genes dos

TNF-

(-308), TNF-

(-238) e TNF-

(+252) em 32 caucasianos portadores de

periodontite e 32 controles periodontalmente saudáveis; também pesquisaram uma

possível associação entre o polimorfismo genético do TNF-α e os níveis de produção

desta citocina por polimorfonucleares. Não foram observadas diferenças na freqüência

genotípica entre os grupos teste e controle e entre os subgrupos diferenciados pelo

grau de severidade da periodontite. Não foi observada associação entre a produção de

TNF-α e os alelos deste na posição -238; porém, os alelos do TNF-α na posição -308

foram associados à alta produção desta citocina nos dois grupos avaliados. Este

mesmo genótipo foi associado à alta produção desta citocina somente no subgrupo

portador de periodontite crônica severa. Foi concluído que o genótipo T1,2 do TNF-α

parece não estar associado à susceptibilidade genética à periodontite do adulto; por

outro lado, pode apresentar-se como possível marcador de susceptibilidade para a

severidade da periodontite.

Por outro lado, Craandijk et al. (2002) avaliaram o polimorfismo G/A nas posições

(-376), (-308), (-238) e na posição (+489) e concluíram que os polimorfismos genéticos

no gene TNF-α nas referidas posições não estão associados à susceptibilidade ou à

severidade da periodontite de forma independente do hábito de fumar.

Fassmann et al. (2003) investigaram a associação entre a periodontite crônica e

os polimorfismos G para A na posição (-308) na região promotora 5` do gene TNF-α e A

para G na posição (+252) da LT-α. Foi concluído que o genótipo composto G/A na

posição (-308) do gene TNF-α e A/G na posição (+252) da LT-α pode influenciar na

susceptibilidade à periodontite crônica na população da República Checa.

2.4.2 IL-10

A IL-10 é uma citocina que atua na periodontite regulando a produção das

citocinas pró-inflamatórias e estimulando a produção de anticorpos protetores. O

quadro clínico periodontal pode ser influenciado por fatores genéticos e os

polimorfismos dos genes da IL-10 podem inibir a liberação das citocinas pró-

inflamatórias.

Yamazaki et al. (2001) investigaram o polimorfismo genético na região promotora

da IL-10 nas posições (-506), (-1082) e (-1140) de 34 indivíduos portadores de

periodontite agressiva, 18 portadores de periodontite crônica e 52 controles. Os autores

observaram que o alelo -1082G não estava presente entre indivíduos japoneses e que

o haplótipo GCC foi observado em 68% da população japonesa e em apenas 25% dos

caucasianos; não foram observadas diferenças estatisticamente significativas nas

freqüências alélicas e haplotípicas entre indivíduos portadores de periodontite do

adulto, de início precoce e controles. Foi concluído que a frequência de haplótipos na

população japonesa difere significativamente da observada entre caucasianos e que a

produção da IL-10 deve ser regulada por uma rede complexa de citocinas.Também

Gonzales et al. (2002) concluíram que os polimorfismos dos genes da IL-10 nas

posições -597(C→A) e -824(C→T), em caucasianos, não estão associados à

periodontite crônica nem à periodontite agressiva.

Por outro lado, Berglundh et al.(2003) concluíram que o polimorfismo da IL-10 na

posição (-1087) está vinculado a periodontite crônica severa em indivíduos caucasianos

do norte da Europa e Scarel-Caminaga et al. (2004), ao avaliarem a associação entre a

periodontite crônica e o polimorfismo de um único nucleotídeo nas posições (–1087),(-

819) e (–592) e os haplótipos (ACC, ATA e GCC), observaram associação entre a

susceptibilidade à periodontite crônica e os polimorfismos no gene da IL-10 nas

posições (–819 e –592). Também observaram que o haplótipo ATA foi mais prevalente

no grupo teste entre as mulheres e o haplótipo GCC/ACC foi mais freqüente no grupo

controle e concluíram que haplótipos específicos e o polimorfismo de um único

nucleotídeo no gene da IL-10 estão associados a uma maior prevalência da

periodontite.

2.4.3 TGF-β1

β1β1

β1

Segundo Holla et al. (2002) o fator transformador de crescimento β (TGF-β1) é

uma citocina que apresenta atividades anti-inflamatórias, imunossupressoras e promove

a diminuição da transcrição de citocinas pró-inflamatórias como a IL-1β e o TNF- α;

acredita-se possuir papel regulador na periodontite, uma vez que influencia a

remodelação tecidual e o metabolismo ósseo e, seus níveis, no fluido crevicular

gengival, flutuam de forma inversamente proporcional à severidade da periodontite. O

objetivo do referido estudo foi avaliar a existência de associação entre a periodontite do

adulto e o polimorfismo genético do TGF

β1

-988 (C/A), -800 (G/A), -509 (C/T) e nos códons 10 (L10P) e 25

(R25P)

. Foram avaliados 198 indivíduos caucasianos naturais da república Checa; 90

portadores de periodontite do adulto e 108 formaram a população de referência. Não

foram observadas diferenças estatisticamente significativas na comparação entre a

distribuição das freqüências alélicas e genotípicas dos polimorfismos supracitados entre

os grupos teste e controle. Foi concluído que os polimorfismos do gene TGF-

β1

não

influenciam na susceptibilidade à periodontite do adulto e que não há associação entre

os polimorfismos citados e a severidade da periodontite.

Entretanto, de Souza et al. (2003) avaliaram a freqüência alélica e genotípica na

posição (-509) do gene do TGF-

β1

em indivíduos caucasianos oriundos do sudeste

brasileiro que apresentavam diferentes níveis de severidade da periodontite crônica e

mostraram haver diferenças estatisticamente significativas quando comparadas às

freqüências alélicas e genotípicas entre os grupos saúde e portadores de periodontite

severa (DPS). O alelo T foi mais freqüente entre os portadores de DPS e o genótipo TT

apresentou freqüência de 38,5% entre os portadores de DPS e de 8% e 12,6% entre os

portadores de saúde periodontal e de periodontite moderada respectivamente. Os

autores concluíram que o referido polimorfismo apresenta efeito discreto na modulação

do processo inflamatório periodontal.

2.4.4 IL-6

A interleucina 6 está relacionada à diferenciação dos linfócitos B e à proliferação

das células T; uma de suas principais atribuições é estimular a hematopoiese e acelerar

a reabsorção óssea. Trevilatto et al. (2003) avaliaram a associação entre o polimorfismo

da IL-6 na posição (-174) e a susceptibilidade à periodontite crônica em brasileiros

caucasianos. Foram avaliados 84 indivíduos não relacionados; estes foram agrupados

em subgrupos diferenciados de acordo com o estado clínico periodontal. As

comparações entre as freqüências alélicas entre os grupos não apresentaram diferença

estatística significante; porém, a comparação entre as freqüências genotípicas entre o

grupo controle e os portadores de periodontite crônica severa apresentou diferença

estatística significativa. Os dados obtidos indicam a associação entre o polimorfismo da

IL-6 na posição (-174) e a susceptibilidade à periodontite crônica entre caucasianos

oriundos do sudeste brasileiro.

Norteados pelo papel crucial do processo inflamatório na patogênese da

periodontite, D’aiuto et al. (2004) avaliaram a possível associação entre polimorfismos

genéticos específicos, tais como: IL-6 (-174), IL-1

(-889), IL-1

(-511, +3954), TNF-

308), e TLR4 (-299, -399) e a resposta inflamatória sistêmica em indivíduos portadores

de periodontite severa. Para tanto, 94 indivíduos portadores de periodontite severa

foram avaliados periodontalmente. Foram observadas associações entre o polimorfismo

genético da IL-6 (-174), IL-1

(-889), e TNF-α (-308) e uma maior concentração sérica

da IL-6 e da proteína C reativa. Os autores concluíram que a resposta inflamatória

sistêmica apresenta-se mais intensa entre indivíduos portadores de periodontite severa,

que apresentam alelos raros funcionais nos sistemas polimórficos de citocinas

associados à inflamação; também os genótipos observados são importantes

indicadores da resposta inflamatória sistêmica, explicando em parte a associação

pesquisada.

Por outro lado, Komatsu et al. (2005) analisaram os polimorfismos: -597(G/A), -

572 (C/G), -373 (AnTm), -190(C/T) e -174(G/C) no gene da IL-6 e observaram que a

freqüência do alelo A9T11 na posição (-373) foi significativamente superior no grupo

controle quando comparada à do grupo teste e que este haplótipo está associado às

baixas concentrações séricas da IL-10, sugerindo que o alelo A9T11 na posição (-373)

pode estar associado à redução na susceptibilidade em desenvolver a periodontite

entre os japoneses e à baixa liberação da IL-6.

2.5 Estudos de associação entre os polimorfismos genéticos de

citocinas e o Diabetes mellitus.

As citocinas pró-inflamatórias: TNF-α, IL-1β e o IFN-γ são consideradas os

principais mediadores das doenças crônicas inflamatórias. O aumento nos níveis de IL-

1 no fluido crevicular e nos tecidos periodontais dos pacientes com periodontite têm

sido descritos e a diminuição da concentração desta citocina inibe a reabsorção óssea

alveolar. Várias evidência têm mostrado a influência dos fatores genéticos na patogenia

e evolução clínica da periodontite em adultos. Essas informações sugestionaram Laine

et al. (2001) a investigarem o polimorfismo genético da IL-1, entre indivíduos diabéticos,

e compararam com o observado entre o grupo composto por indivíduos

periodontalmente saudáveis; fatores de risco como a presença de P. gingivalis e/ou A.

actinomycetemcomitans e o hábito de fumar, também foram levados em consideração.

Para tanto, 105 portadores da periodontite do adulto foram selecionados e compuseram

o grupo teste. A prevalência da P.g. e do A.a. foi similar entre os subgrupos fumantes e

não fumantes, enquadrados no grupo teste. Não foram observadas diferenças

significativas nos genótipos e nas freqüências dos alelos observados entre os grupos

estudados. Dividindo os grupos de fumantes e não fumantes em subgrupos de

indivíduos fumantes portadores ou não de P.g e A.a. e não fumantes portadores ou não

de P.g e A.a., foi observada alta freqüência, estatisticamente significativa, das

presenças simultâneas dos alelos IL-1A*2, IL-1B*2 e IL-1RN*2 entre os não fumantes

que não apresentaram P.g. e A.a. Estes resultados evidenciam que o polimorfismo dos

genes da família da interleucina 1 está associado à periodontite severa em adultos, na

ausência de outros fatores de risco.

Concentrações elevadas das citocinas TNF-α, IL-6 e da proteína C-reativa têm

sido observadas em diabéticos tipo 2. Os altos níveis destas citocinas e da proteína de

fase aguda vêm sendo associados ao desenvolvimento do diabetes tipo 2. Kubaszek et

al. (2003) investigaram se os polimorfismos (G-308A) e (C-174G) dos genes das

citocinas TNF-

e IL-6, respectivamente, aumentam o risco de conversão da

intolerância à glicose para o diabetes mellitus tipo 2. Foram avaliados 490 indivíduos.

Somente 6 indivíduos apresentaram o genótipo (A-308A) do gene do TNF-α; o alelo (-

308A) do gene TNF-α foi associado a um risco duas vezes maior em desenvolver

diabetes tipo 2 quando comparado ao do genótipo (G-308G). Indivíduos que

apresentam dois alelos A no gene TNF-α e o genótipo (C-174C) da IL-6 apresentam

risco 2.2 vezes maior em desenvolver o diabetes tipo 2 quando comparados àqueles

que não apresentam o genótipo de risco. Foi concluído que o alelo (-308A) do gene do

TNF-α é um preditor para a conversão do estado de intolerância à glicose para o

diabetes mellitus tipo 2. Também foi observado que este polimorfismo está associado

ao genótipo (C-174C) do gene da IL-6.

Illig et al. (2004) investigaram a associação entre os polimorfismos (C-174G) e

(A-598G) da IL-6 e o processo inflamatório sub-clínico e os parâmetros clínicos e

metabólicos do diabetes e observaram que os alelos (-174G) e (-598G) foram

significativamente associados ao diabetes mellitus tipo 2. Os níveis da IL-6 não foram

associados aos polimorfismos da IL-6 estudados. Os autores concluíram que os

polimorfismos genéticos estudados podem ser considerados fatores de risco

independentes na etiologia do diabetes mellitus tipo 2; sua atuação nesta nosologia

possivelmente é indireta, influenciando os níveis dos mediadores imunológicos.

3 Objetivos

3.1 Objetivo Geral

Estudar o polimorfismo do HLA (HLA-DRB1, -DRB3, -DRB4, -DRB5 e -DQB1) e

de genes de citocinas (IL-6, TNF-

, IL-10, TGF-

β1

, IFN-

) em pacientes diabéticos com

e sem periodontite e em pacientes metabolicamente normais com periodontite. Avaliar

os efeitos da intervenção odontológica sobre o processo infeccioso periodontal no

controle metabólico de indivíduos portadores de diabetes mellitus tipo 2 através do

ensaio da hemoglobina glicosilada.

3.2 Objetivos Específicos

-Avaliar a distribuição de freqüência de alelos do HLA de classe II (HLA-DRB1, -DRB3, -

DRB4, -DRB5 e –DQB1) em pacientes diabéticos com e sem periodontite e em

pacientes metabolicamente normais com periodontite;

-estudar a distribuição de freqüência dos alelos dos genes da IL-6, IL-10, TGF-

1, IFN-

e TNF-

em pacientes diabéticos, com e sem periodontite, e em pacientes com

periodontite cujo controle metabólico seja normal;

-comparar os valores determinados para as variáveis de avaliação periodontal e para o

ensaio da hemoglobina atribuídos aos portadores de diabetes mellitus tipo 2 que

apresentavam ou não periodontite severa, tendo como referencial o tempo de

observação (0, 90 e 180 dias).

4 Delineamento do Estudo

(07 dias após)

PACIENTES DIABÉTICOS ATENDIDOS PELA PREFEITURA DE

FEIRA DE SANTANA

TRIAGEM PERIODONTAL

DDP

DSDP

NDDP

FBDC

ANAMNESE EXAME CLÍNICO EXAMES LABORATORIAIS

→

exame de profundidade

de sondagem de sulco/

bolsa;

→ exame do nível de

inserção clínica;

→ índice de sangramento

à sondagem.

→

Genotipagem HLA e das

citocinas: IFN-

, TGF-

β1

, TNF-

IL-10 e IL-6.

Raspagem e alisamento radicular, Noções de higiene oral

-0

-90

-180

Dias

→

Hemoglobina glicosilada

5 PRODUTOS DA TESE

Artigo 1 – “O efeito do tratamento periodontal não cirúrgico no controle metabólico em pacientes

portadores de diabetes mellitus tipo 2 não compensados metabolicamente” (Journal of

Clinical Periodontology)

Artigo 2 – “Maior prevalência do HLA-DQB1*0301 em mestiços não diabéticos portadores de

periodontite crônica severa “ (Journal of Clinical Periodontology)

Artigo 3 – “Associação entre o polimorfismo do códon 10 do gene TGF-

1 e a periodontite

crônica severa em baianos, mestiços, diabéticos tipo 2” (Journal of Periodontology)

Artigo 1

“O efeito do tratamento periodontal não cirúrgico no controle

metabólico em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2

não compensados metabolicamente”

O EFEITO DO TRATAMENTO PERIODONTAL NÃO CIRÚRGICO NO

CONTROLE METABÓLICO EM PACIENTES PORTADORES DE DIABETES TIPO 2

NÃO COMPENSADOS METABOLICAMENTE.

(THE EFFECT OF NON SURGICAL PERIODONTAL TREATMENT ON

METABOLIC CONTROL IN UNCONTROLLED TYPE 2 DIABETICS PATIENTS.)

Monteiro, A.M.A., Freire, S.M., Meyer, R., Gomes-Filho, I.S., Pinto-Filho, J.M.,

Vasconcelos, A. A., Correia, J.E., Daltro, I.S., Lemaire, D.C.

Adriano M.A. Monteiro

1, 2,

Songeli M. Freire

Roberto Meyer

Isaac S. Gomes-Filho

Almiro A. Vasconcelos

Joelande E. Correia

Idiane S. Daltro

Denise C. Lemaire

Universidade Federal da Bahia - Programa de Pós-graduação em Imunologia;

Universidade Estadual de Feira de Santana – Departamento de Saúde;

Universidade

Estadual de Feira de Santana – Departamento de Biologia.

Abstract

Background, aims: The objective of this present study was to evaluate the effects of

the reduction of the periodontal infection in those individuals who have uncontrolled

diabetes mellitus type 2 through a glycated hemoglobin assay.

Methods: 56 uncontrolled diabetics type 2 were treated clinically by The Diabetic Center

of Feira de Santana- Bahia. They constituted two groups, DP (28) with severe chronic

periodontitis and DSP (28) orally-healthy, gingival disease or slight chronic periodontitis

controls. Both groups were evaluated after 90 and 180 days through the determination

of the plaque index, bleeding on probing, probing depths, the measures of clinical

attachment levels and the plasmatic concentration of glycated hemoglobin and both

groups were submitted to periodontal treatment after the first exam.

Results: Both test and control group showed a statistically significant effect for plaque

index and bleeding on probing after periodontal treatment. The test group showed

clinical improvement in the severity of periodontal status and in the control group, no

significant changes in the clinical severity parameters: probing depths and clinical

attachment loss were observed. HbA

levels in both groups, at 6 months, decreased

significantly.

Conclusions: The non-surgical periodontal therapy results in the reduction of

periodontal infection and inflammation. This significantly improvement of the periodontal

condition is associated with a reduction in levels of glycated hemoglobin and

consequently in glycemic control.

Key words: chronic periodontitis; glycemic control; type 2 diabetes mellitus.

A susceptibilidade à periodontite envolve uma tríade formada por: bactéria,

hospedeiro e fatores ambientais (Seymour & Taylor 2004). Certas condições sistêmicas

e alterações do hospedeiro são fatores adicionais (Nishimura et al. 1998). O diabetes

mellitus e o hábito de fumar são fatores de risco para a periodontite uma vez que

aumentam a probabilidade de acometimento desta doença infecciosa. Porém, tanto o

fumo como o diabetes não são determinantes para o desenvolvimento da periodontite

(Borrell & Papapanou 2005).

King et al. (1998) estimam que a prevalência do diabetes em todo o mundo

passaria de 4% em 1995, para 5,4% em 2025, atingindo aproximadamente 300 milhões

de indivíduos. Os três países mais afetados por esta doença são: a Índia, a China e os

Estados Unidos e estima-se que, em 2025, 75% dos indivíduos diabéticos estarão em

países em desenvolvimento; a maioria desses será de mulheres e residentes em áreas

urbanas. O diabetes é uma nosologia de alta prevalência no Brasil, onde as estimativas

epidemiológicas apontam para uma elevação desses índices. No Brasil, atualmente,

estima-se a existência de cinco milhões de diabéticos, sendo que a metade dessa

população desconhece ser portadora de tal doença. A este alto índice de pacientes

diabéticos são destinados 5% a 14% dos recursos financeiros aplicados pelos setores

responsáveis pela saúde da população (Lerário 1995).

O diabetes caracteriza-se por apresentar cinco complicações clássicas:

retinopatia, neuropatia periférica, microangiopatia, macroangiopatia e nefropatia. Löe

(1993) concluiu que a periodontite é mais severa e é mais prevalente entre os

diabéticos e que esta deveria ser considerada a sexta complicação do diabetes mellitus.

Estudos sobre a periodontite, em portadores de diabetes, revelaram que a

microbiota subgengival de pacientes portadores de periodontite severa e diabetes

não insulinodependente foi similar à constatada em pacientes não diabéticos com

periodontite severa (Zambon et al. 1988; Collin et al. 1998). Apesar disso, a

severidade, a prevalência e a incidência da periodontite são maiores em diabéticos

quando comparadas às dos indivíduos metabolicamente sadios (Belting et al. 1964;

Bridges et al. 1996; Shlossman et al. 1990; Nelson et al. 1990 & Emrich et al. 1991).

O controle metabólico inadequado, segundo Ervasti et al. (1985) e Oliver &

Tervonen (1994), está correlacionado à severidade da periodontite e ao aumento do

risco de indivíduos diabéticos virem a desenvolvê-la. Por outro lado, Hayden &

Buckley (1989) dizem não haver inter-relação entre a periodontite e o controle

metabólico e a duração do diabetes. Entretanto, segundo Hugoson et al. (1989),

Cerda et al. (1994) e Firatli et al. (1996), tal duração exerce grande influência sobre

a severidade da periodontite.

Lalla et al. (1998) afirmaram que a glicosilação não enzimática de proteínas e

lipídios é conseqüência da hiperglicemia, resultando na formação dos produtos finais

avançados de glicosilação (AGEs), que são acumulados normalmente no plasma e nos

tecidos; este acúmulo é exacerbado em diabéticos. A interação entre os AGEs e o seu

receptor (RAGE) aumenta a produção do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)

resultando na exacerbação do processo inflamatório.

A eliminação do processo infeccioso inflamatório acarretaria a diminuição da

concentração de citocinas pró-inflamatórias, dentre elas o TNF-α. Esta citocina é um

dos principais fatores envolvidos na resistência à insulina (Nishimura et al. 1998);

portanto, a eliminação ou diminuição do processo inflamatório observado na

periodontite favoreceria o controle metabólico em pacientes diabéticos.

Uma possível relação entre a diminuição do processo inflamatório e a melhora no

controle metabólico foi primeiramente apontada por Williams & Mahan (1960), ao

destacar o efeito do controle do processo infeccioso periodontal no controle metabólico.

Posteriormente, Miller et al. (1992) e Grossi et al. (1997) concluíram que a terapia

periodontal seria uma terapia importante no controle metabólico do diabetes, o que não

foi observado, no entanto, por Smith et al. (1996). O presente estudo visou observar o

efeito do controle do processo inflamatório periodontal nos níveis glicêmicos, pela

avaliação da taxa da hemoglobina glicosilada, em portadores de diabetes tipo 2.

Material e Métodos

População

A amostra foi composta por 56 indivíduos mestiços segundo os critérios de

Azevedo (1980), com idade entre 40 e 70 anos, distribuídos em dois grupos: DP - 28

indivíduos diabéticos portadores de periodontite crônica generalizada severa; DSP - 28

indivíduos diabéticos que, ao exame clínico periodontal, foram classificados como

periodontalmente saudáveis, portadores de gengivite ou periodontite crônica leve.

Todos os indivíduos do estudo eram portadores de diabetes mellitus tipo 2 há no

mínimo dois anos, de acordo com os critérios estabelecidos pela American Diabetes

Association (2004). O diagnóstico e o acompanhamento desses pacientes foi realizado

no Centro de Diabetes da Prefeitura Municipal de Feira de Santana.

Os indivíduos que formaram o grupo DP apresentavam periodontite crônica

severa caracterizada por, no mínimo, quatro unidades dentárias que apresentassem

profundidade de sondagem igual ou maior do que quatro mm, nível de inserção maior

ou igual a cinco mm e a ocorrência de sangramento à sondagem (Gomes-Filho et al.

2005); além de apresentarem, comprovadamente, habilidade física e motora que

assegurasse o eficiente controle da placa bacteriana.

Não foram incluídos na amostra os indivíduos que apresentassem infecção bucal

com indicação de drenagem ou que tivessem o hábito de fumar. Também foram

excluídos os indivíduos que não compareceram a todas as consultas, os que

necessitaram alterar a medicação do controle metabólico em uso, assim como aqueles

que receberam prescrição de antibióticos, anti-inflamatórios, corticosteróides,

antidepressivos, hormônios outros que não a insulina ou anticonvulsivantes nos quatro

meses que antecederam o início do estudo.

Coleta de Dados

Indivíduos diabéticos tipo 2, sem quaisquer restrições, foram encaminhados pelo

Centro de Diabetes da Prefeitura Municipal de Feira de Santana, já devidamente

diagnosticados, para atendimento periodontal na clínica da Cooperfeira. Todos os

indivíduos diabéticos encaminhados, incluídos ou não no protocolo de pesquisa, foram

avaliados em relação à saúde periodontal e, quando necessário, foram submetidos à

terapia periodontal não cirúrgica, em quantas consultas fossem necessárias para o

restabelecimento da sua saúde periodontal.

Após a triagem, os indivíduos selecionados para ambos os grupos

compareceram à clínica odontológica da Cooperfeira em três oportunidades,

intercaladas por um período de 90 dias (tempos 1, 2 e 3). Nos três tempos foram

coletadas amostras de sangue para avaliação do controle metabólico e dados clínicos

periodontais: índice de placa de O`Leary descrito por Badersten et al. (1990);

porcentagem de faces sangrantes à sondagem (Ainamo & Bay, 1975); medida de

profundidade de sondagem de sulco/bolsa (Pihlstrom et al. 1981) classificadas segundo

os critérios de Badersten, Nilvéus, & Egelberg (1985), e medida do nível de inserção

clínica (Ramjford 1959), cujos níveis foram agrupados segundo a classificação proposta

por Armitage (1999).

Os parâmetros clínicos periodontais foram obtidos com o auxílio da sonda

periodontal milimetrada XP23/UNC15 estandardizada tipo Williams da marca Hu-Friedy.

Foram investigados seis sítios por unidade dentária: médiovestibular, mesiovestibular,

distovestibular, médiolingual, distolingual e mesiolingual conforme descrito por Pihlstrom

et al. (1981).

Todos os parâmetros de avaliação periodontal foram mensurados por um único

pesquisador, especialista, tendo apresentado concordância intra-examinador média de

92,68%.

Foram coletados, nos tempos 1, 2 e 3, de cada indivíduo, de maneira estéril, 1,0

ml de sangue periférico para dosagem de hemoglobina glicosilada. A dosagem da

hemoglobina glicosilada foi realizada a partir de um ensaio de captura iônica, com o

qual se mensura a porcentagem de hemoglobina glicosilada no sangue total humano

(ABBOTT LABORATORIES, 1994). Os resultados são válidos como indicativos da

concentração de glicose no sangue por um período de 1 a 3 meses. Para este ensaio o

parâmetro de normalidade está entre 4,4% e 6,4% a

1c.

Tratamento Periodontal

Os 56 indivíduos que formaram os grupos DP e DSP retornaram à clínica da

Cooperfeira, quando, conforme necessário, foram submetidos ao tratamento periodontal

não cirúrgico, em quantas consultas fossem suficientes para se restabelecer a saúde

periodontal e receberam, também, noções sobre higiene oral com o auxílio de

macromodelos.

Os 28 indivíduos que compuseram o grupo DP, portadores de periodontite

crônica severa, pela própria intensidade da doença, foram submetidos a tratamento

periodontal mais extenso quando comparados ao tratamento a que foram submetidos

os indivíduos do grupo DSP.

Metodologia da análise estatística

Para as variáveis quantitativas do estudo, foi utilizado o teste de Kolmogorov-

Smirnov, para averiguar a aderência à distribuição normal. Os resultados foram

comparados usando o teste t de student para amostras pareadas e o teste t de

Wilcoxon para amostras não pareadas. Na comparação dos grupos independentes,

quando as variáveis foram mensuradas em escala ao mínimo ordinal sem aderência à

distribuição normal, foi empregado o teste de Mann-Whitney; o teste de t-Student não

pareado foi empregado quando o pressuposto de normalidade foi atendido. Foi

estabelecido o nível de significância de 5%.

Resultados

O grupo DP, de acordo com a tabela 1, foi formado por 13 mulheres e 15

homens, enquanto que no grupo DSP foram congregados 18 mulheres e 10 homens.

Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas em relação ao gênero

(p= 0,179) e à idade (p= 0,361) entre os dois grupos; porém, em relação ao tempo em

que esta doença endócrina foi diagnosticada foi observada diferença estatisticamente

significativa entre os grupos (p= 0,011). Nos grupos DP e DSP as médias do tempo de

diagnóstico foram de 8,25 e 12,75 anos respectivamente.

Tabela 1-Estatística descritiva das variáveis demográficas.

Idade

(anos)

Gênero

(%)

Tempo de

diagnóstico (anos)

Grupo N

DP M F

x DP

DSP 28 57,8

±1,91

36 64 12,75

±1.20

DP 28 55,3

±1,92

54 46 8,25

±1.20

DP= Diabéticos portadores de periodontite crônica severa; DSP= Diabéticos não portadores de periodontite crônica severa; x=

média; DP= desvio padrão da média; M=gênero masculino; F= Gênero feminino.

Os achados clínicos e laboratoriais foram agrupados em cinco tabelas (Tabelas 2

a 6) tendo como indicadores quatro parâmetros clínico-periodontais: índice de placa;

número de faces sangrantes após a sondagem; medida de profundidade de sondagem

e medida do nível de inserção clínica. A dosagem da hemoglobina glicosilada foi o

parâmetro laboratorial quantitativo utilizado como indicador do controle metabólico. Os

dados foram coletados nos três tempos pré-estabelecidos (t

, t

e t

No grupo DP no que se refere ao índice de placa, foi observada diferença

significativa entre os tempos t

x t

; porém, não foi observada diferença estatisticamente

significativa nos valores observados entre os tempos t

x t

e t

x t

. No grupo DSP foi

observada redução estatisticamente significativa no índice de placa na comparação

entre os tempos t

x t

e t

x t

. A comparação entre os valores dos grupos DP e DSP

nos três tempos só revelou diferença significativa no tempo 1. (Tabela 2).

Tabela 2 - Estatística descritiva do índice de placa de acordo com o grupo e o tempo.

Índice de Placa

md Min-Max DPxDSP

1 x

2 x

Grupo % %

P P P

0,534 0,042 0,101

86,40 40,6-100,00 0,028

60,85 30,4-100,00 0,657

61,75 19,5-100,00 0,395

DSP

<0,001 <0,001 0,831

78,00 0,0-100,00

67,00 22,3-97,00

60,40 0,0-100,00

DP= Diabéticos portadores de periodontite crônica severa; DSP= Diabéticos sem periodontite crônica severa; Mdn= mediana; Max=

máxima; Min= mínima; t

1, 2, 3

= tempo de experimentação 1, 2 e 3; p= Resultado estatístico da comparação entre os grupos.

Foi observada diferença significativa na porcentagem de faces sangrantes à

sondagem entre os tempos, em cada grupo; assim como entre os grupos nos três

tempos (Tabela 3).

Tabela 3 - Estatística descritiva da porcentagem de faces sangrantes à sondagem de

acordo com o grupo e o tempo.

Porcentagem de faces sangrantes á sondagem

md Min-Max DPxDSP

1 x

2 x

Grupo % %

P P P

<0,001 <0,001 <0,001

40,30 16,90-90,40 <0,001

15,95 0,0-36,90 <0,001

9,45 0,0-34,50 <0,001

DSP

0,004 0,002 <0,001

12,35 0,0-53,00

5,55 0,0-22,00

3,55 0,0-15,00

DP= Diabéticos portadores de periodontite crônica severa; DSP= Diabéticos sem periodontite crônica severa; Mdn+ mediana; Max+

máxima; Min= mínima; P1= diferentes tempos no mesmo grupo; P2 diferentes grupo no mesmo tempo; t

1, 2, 3

= tempo de

experimentação 1, 2 e 3.

As porcentagens de sítios sondados e agrupados de acordo com a medida de

profundidade de sondagem em três subgrupos: PSR - profundidade de sondagem rasa

(0-3 mm); PSM - profundidade de sondagem média (4-6 mm) e PSP - profundidade de

sondagem profunda (≥ 7 mm) foram obtidas segundo os critérios descritos por

Badersten, Nilvéus, & Egelberg (1985).

No grupo DP houve aumento significativo na porcentagem de faces agrupadas

no subgrupo PSR entre os tempos 1 e 2 e uma diminuição progressiva nos tempos 2 e

3 em relação ao tempo 1 nos subgrupos PSM e PSP. Não houve diferenças estatísticas

significativas nas comparações entre os subgrupos PSR, PSM e PSP no grupo DSP

nos três tempos de experimentação. As comparações entre os grupos DP e DSP, nos

três tempos, não resultaram em diferenças significativas apenas ao se comparar os

subgrupos PSR dos grupos nos tempos 2 e 3. (Tabela-4).

Tabela 4 - Estatística descritiva do número de faces de acordo com a profundidade de

sondagem dos subgrupos iguais no mesmo tempo e em tempos diferentes no mesmo

subgrupo.

Porcentagens de faces de acordo com a profundidade de sondagem

md Min-Max DPxDSP

1 x

2 x

Grupo / t % %

P P P

PSR t

62,50

26,00-141,00

0,002

<0,001 <0,001 0,260

74,50

32,00-138,00

<0,001

79,50

41,00-142,00

0,005

PSM t

23,00

6,00-67,00

<0,001 <0,001 0,839

15,00

0,00-71,00

<0,001

12,50

1,00-51,00

0,001

PSP t

1,50

0,00-53,00

0,006 <0,001 0,039

0,00

0,00-9,00

<0,001

0,00

0,00-9,00

0,017

DSP

PSR t

99,00

36,00-192,00

NS NS NS

93,00

0,00-192,00

93,00

0,00-192,00

PSM t

0,00

0,00-0,00

NS NS NS

0,00

0,00-0,00

0,00

0,00-0,00

PSP t

0,00

0,00-0,00

NS NS NS

0,00

0,00-0,00

0,00

0,00-0,00

DP= Diabéticos portadores de periodontite crônica severa; DSP= Diabéticos sem periodontite crônica severa; Md= mediana; Max=

máxima; Min= mínima; t

1, 2, 3

= tempo de experimentação 1, 2 e 3; PSR= o número de sítios com profundidade de sondagem entre 1

e 3 mm; PSM= o número de sítios que apresentam bolsas periodontais de 4 a 6 mm; PSP= número de sítios que apresentam

profundidade de sondagem maior que 7mm segundo (Badersten, Nilvéus, & Egelberg, 1985)

A medida do nível de inserção clínica em cada sítios dentário foi classificadas e

subdividida em 4 subgrupos: SPI - sem perda de inserção; PIL - perda de inserção leve

- de 1 a 2mm; PIM - perda de inserção moderada - de 3 a 4mm e PIS - perda de

inserção severa - ≥ 5mm segundo os critérios utilizados por Armitage (1999) (Tabela.

5).

O subgrupo SPI, no grupo DP, apresentou aumento significativo progressivo na

porcentagem de sítios enquadrados do tempo 1 ao 3 e no grupo DSP não foi observada

diferença estatisticamente significativa nos três tempos de estudo. No subgrupo PIL,

grupo DSP, foi observada diminuição estatisticamente significativa entre os tempos 1 e

3 e no grupo DP não foram observadas alterações significantes nos diferentes tempos.

O número de faces enquadrados no subgrupo PIM, grupo DP, sofreu diminuição

estatisticamente significante entre os tempos 1 e 3 e no grupo DSP ocorreu um

aumento estatisticamente significativo entre o tempo 1 e os tempos 2 e 3. No grupo

DSP não há diferenças estatisticamente significativas no subgrupo PIS, nos três tempos

de estudo; no entanto, no grupo DP foi observada uma diminuição progressiva

estatisticamente significativa da porcentagem de faces enquadradas nos três tempos de

estudo. Os valores dos quatro subgrupos que constituem os grupos DP e DSP, nos três

tempos, resultaram em diferenças significativas.

Tabela 5 - Estatística descritiva do número de faces de acordo com a perda de

inserção clínica entre subgrupos iguais no mesmo tempo e entre tempos diferentes no

mesmo subgrupo.

Número de faces de acordo com o nível de inserção (Perda de Inserção)

md Min-Max

DPxDSP

1 x

2 x

Grupo / t % %

P P P

SPI t

23,00

0,00-110,00

0,001

0,008 0,001 0,007

35,50

1,00-106,00

<0,001

44,50

3,00-106,32

<0,001

PIL t

11,50

0,00-34,00

<0,001

NS NS NS

7,00

1,00-29,00

0,002

11,50

4,00-37,01

0,002

PIM t

22,50

1,00-58,00

<0,001

0,014 0,011 0,001

19,50

5,00-67,00

<0,001

14,00

2,00-65,00

0,017

PIS t

30,50

3,00-114,00

<0,001

<0,001 0,006 0,001

15,50

0,00-101,00

0,001

13,00

0,00-98,00

<0,001

DSSP

SPI t

59,00

5,00-145,00

NS NS NS

71,00

5,00-145,00

71,00

0,00-147,00

PIL t

33,50

0,00-84,00

NS 0,007 NS

28,00

6,00-74,00

30,00

3,00-68,00

PIM t

0,00

0,00-3,00

0,017 0,005 NS

0,00

0,00-15,00

0,00

0,00-42,00

PIS t

0,00

0,00-0,00

NS NS

0,00

0,00-0,00

0,00

0,00-0,00

DP= Diabéticos portadores de periodontite crônica severa; DSP= Diabéticos sem periodontite crônica severa; Md= mediana; Max= máxima;

Min= mínima; t

1, 2, 3

= tempo de experimentação 1, 2 e 3; SPI= porcentagem de sítios sem perda de inserção; PIL= o número de sítios que

apresentam perda de inserção leve (1 a 2mm); PIM= número de sítios que apresentam perda de inserção moderada (3 a 4mm) e PIS= número de

sítios que apresentam perda de inserção severa (≥5 mm) segundo (Armitage 1999).

As taxas de hemoglobina glicosilada foram significativamente diferentes entre

os tempos 1 e 3 e 2 e 3 no grupo DSP; assim como entre os tempos 1 e 3 no grupo DP.

Por outro lado não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os

grupos, nos três tempos de experimentação.

Tabela 6 - Estatística descritiva da porcentagem de hemoglobina glicosilada.

Porcentagem de hemoglobina glicosilada

md Min-Max DPxDSP

1 x

2 x

Grupo % %

P P P

NS 0.033 NS

10.25 8.9-16.00 NS

9.75 4.8-14.60 NS

8.85 4.8-15.10 NS

DSP

NS 0.005 0.046

10.45 8.9-16.40

10.35 5.1-13.90

9.20 4.5-14.80

DP= Diabéticos portadores de periodontite crônica severa; DSP= Diabéticos sem periodontite crônica severa; Md= mediana; Max=máxima; Min=

mínima; P1= diferentes tempos no mesmo grupo; P2 diferentes grupo no mesmo tempo; t

1, 2, 3

= tempo de experimentação 1, 2 e 3.

Discussão

Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito do tratamento periodontal não

cirúrgico nos níveis glicêmicos de indivíduos diabéticos tipo 2, descompensados

metabolicamente, com periodontite (DP). Os dados obtidos foram comparados com

aqueles observados em uma amostra de indivíduos diabéticos com periodonto

clinicamente saudável, inflamação gengival ou perda de inserção classificada como

leve (DSP), que constituíram um grupo controle adequado, segundo Gomes-Filho et al.

(2005). Não foi observada diferença estatisticamente significante em relação ao gênero

e à idade. Borrel & Papapanou (2005), observaram não haver associação entre gênero

e susceptibilidade a periodontite. Por outro lado, quanto ao tempo de diagnóstico, o

grupo de diabéticos portadores de periodontite apresentou média significativamente

menor do que o grupo de diabéticos periodontalmente saudáveis (8,25 e 12,75 anos,

respectivamente); Cerda et al. (1994), Firatli Yilmaz & Onan (1996) e Monteiro et al.

(2002) observaram que quanto maior o tempo de diagnóstico, maior a severidade da

periodontite.

Diferentemente dos estudos de Miller et al. (1992), Grossi et al. (1997), Stewart

et al. (2001), Kiran et al. (2005) & Prosmsudthi et al. (2005) quando o grupo controle

não foi submetido à terapia periodontal, no presente estudo, o tratamento periodontal

não cirúrgico foi realizado tanto no grupo DP quanto no grupo DSP. A redução do

processo infeccioso inflamatório resultou na melhora dos parâmetros clínicos

periodontais, conforme descrito por Westfelt et al. (1996). A redução do quadro

inflamatório foi mais intensa no grupo DP, sendo, portanto esperada uma melhora mais

acentuada dos parâmetros clínicos periodontais e, conseqüentemente, do controle

metabólico, neste grupo. Contudo, não foi observada diferença significativa na redução

da taxa de hemoglobina glicosilada entre os grupos. Talvez a redução desta no grupo

DSP tenha sido devida à inclusão de indivíduos portadores de gengivite, ou periodontite

leve, no grupo controle (sem periodontite crônica severa). Por outro lado, em ambos os

grupos foi observada melhora significativa do controle metabólico cerca de seis meses

após o tratamento periodontal; este tratamento foi, provavelmente, o fator responsável

pela melhora observada, uma vez que os indivíduos que tiveram qualquer alteração na

dieta ou no protocolo medicamentoso, ou submeteram-se à terapia antibiótica foram

excluídos do estudo.

A associação entre a melhora no controle metabólico em indivíduos diabéticos

tipo 2, que apresentavam controle metabólico inadequado, e a diminuição do processo

inflamatório periodontal foi também observada por Stewart et al. (2001) e Kiran et al.

(2005); nestes estudos os indivíduos também foram submetidos exclusivamente à

terapia periodontal básica. A redução nas taxas de hemoglobina glicosilada após a

redução do processo inflamatório também foi observada por Williams & Mahan (1960),

Miller et al. (1992) e Grossi et al. (1997); contudo, nestes estudos, a terapia

antimicrobiana também pode ter tido um papel importante no efeito observado nos

níveis glicêmicos de pacientes com diabetes (tipo 1 ou tipo 2) submetidos à raspagem e

alisamento radicular. Por outro lado, Smith et al. (1996) e Promsudthi et al. (2005) não

observaram diminuição na porcentagem da hemoglobina glicosilada no grupo

submetido ao mesmo tipo de tratamento.

Segundo Hotamisligil et al. (1995) e Mccall et al. (1992) a citocina pró-

inflamatória TNF-α está associada à resistência à ação da insulina. Nishimura et al.

(2003) observaram que a diminuição do processo inflamatório periodontal reduz

significativamente os níveis desta citocina. Assim, a melhora do controle metabólico

observada neste e em outros estudos foi, provavelmente, devido a diminuição da

síntese de TNF-α após a redução do processo inflamatório periodontal.

Foi observada diferença estatisticamente significativa nas comparações entre os

parâmetros clínicos periodontais: placa, sangramento gengival à sondagem,

profundidade de sondagem e nível de inserção clínica entre os grupos DP e DSP no

tempo 1; refletindo o maior grau de acometimento periodontal observado no grupo de

portadores de periodontite crônica generalizada severa. O quadro de higiene oral

avaliado pelo índice de placa, em ambos os grupos, apresentou melhora

estatisticamente significativa entre os tempos 1 e 3 tanto no grupo DSP quanto no

grupo DP. Apesar da melhora no grau de higiene oral, após o tratamento periodontal,

ter sido significativa, este continuou em um patamar crítico.

O grupo DP apresentou melhora no quadro infeccioso periodontal após o

tratamento periodontal não cirúrgico. Esta afirmação está amparada pelo aumento

estatisticamente significativo do número de faces enquadradas no subgrupo PSR e pela

diminuição no número de faces agrupadas nos subgrupos associados à presença de

bolsas periodontais (PSM e PSP) entre os tempos 1 e 3. No grupo DSP não foram

observadas alterações estatisticamente significativas na distribuição de seus sítios nos

três subgrupos nos tempos 2 e 3 em relação ao tempo 1. Estes achados estão de

acordo com as observações de Miller et al. (1992), Smith et al. (1996) Grossi et al.

(1997), Stewart et al. em 2001, Kiran et al. (2005) & Prosmsudthi et al. (2005).

A melhora no quadro de severidade da periodontite foi observada utilizando o

nível de inserção clínica. No grupo DP foi observado aumento progressivo

estatisticamente significativo na porcentagem de faces enquadradas no subgrupo SPI

entre os tempos 1 e 3 e diminuição progressiva significativa na porcentagem de faces

enquadradas nos subgrupos PIM e PIS caracterizados pela perda de inserção

moderada e severa, respectivamente. No grupo DSP não foram vistas alterações

significativas na porcentagem de faces agrupadas nos subgrupo SPI e PIS. Por outro

lado foi observado aumento estatisticamente significativo na porcentagem de faces

enquadrados no subgrupo PIM e diminuição, também estatisticamente significativa, da

porcentagem de faces enquadrados no subgrupo PIL. Estes dados não caracterizam

piora no quadro clínico periodontal e estão de acordo com os trabalhos de Badersten

(1985), quando este conclui que os sítios dentais que apresentam bolsas rasas (≤

3,5mm), tendem a sofrer perda de inserção após raspagem e alisamento radicular,

ocorrendo o oposto com aqueles sítios cujas bolsas são profundas (≥ 7 mm), nos quais

se observa ganho de inserção após tratamento periodontal.

Os resultados obtidos neste trabalho ratificam o papel positivo da terapia

periodontal sobre os parâmetros clínicos periodontais e indicam a existência da

associação entre a eliminação do processo infeccioso periodontal e a melhora do

controle metabólico em indivíduos diabéticos tipo 2 não compensados

metabolicamente.

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Artigo 2

“Maior prevalência do HLA-DQB1*0301 em mestiços não

diabéticos portadores de periodontite crônica severa”

MAIOR PREVALÊNCIA DO HLA-DQB1*0301 EM MESTIÇOS NÃO

DIABÉTICOS PORTADORES DE PERIODONTITE CRÔNICA SEVERA

(HIGHER PREVALENCE OF HLA-DQB1*0301 IN MESTIZOS NON-DIABETIC

SUBJECTS WITH CHRONIC PERIODONTITIS )

Monteiro, A.M.A., Freire, S.M., Meyer, R., Gomes-Filho, I.S., Pinto-filho, J.M.,

Bendicho, M.T., Lemaire, D.C.

Adriano M.A. Monteiro

Songeli M. Freire

Roberto Meyer

Isaac S. Gomes-Filho

Jorge M. Pinto-Filho

Maria Teresita Bendicho

Denise C. Lemaire

Universidade Federal da Bahia - Programa de Pós-graduação em

Imunologia;

Universidade Estadual de Feira de Santana – Departamento de Saúde.

Abstract

Background, aims: Differences in host response may determine susceptibility or

resistance to periodontal disease. It is established that diabetes is a risk factor for the

development of periodontal disease in human subjects. Studies have linked the

increased propensity of diabetic subjects to develop periodontal disease to genetic

predisposition. There are growing evidences that genetic factors play a role in the onset

and severity of periodontal disease. The aim of this study was to investigate and to

compare the distribution of HLA alleles, genotypes and haplotypes among diabetics

subjects with or without severe chronic periodontal disease and non-diabetic subjects

with severe chronic periodontal disease.

Methods: 91 tested subjects were divided in 3 groups: (DP) was formed by 31 diabetic

subjects with severe chronic periodontal disease; (DSP) consisted of 30 diabetic

subjects without severe or moderate periodontal disease; and (NDP) was formed by 30

metabolic healthy patients with severe chronic periodontal disease. The DNA was

extracted from the samples using the modified salting out technique. Its concentration

were determinate for its optical density reading. The polymorphisms studied were HLA-

DRB1, -DRB3/4/5 and -DQB1. The data were transferred for a Generic HLA Class II

DNA Typing Tray map to determine alleles, genotypes and haplotypes results.

Results: No statistically significant differences were found for allele and genotypic

frequencies on HLA-DRB1 and HLA-DRB3/4/5 genes. Furthermore, no statistically

significant differences were found for haplotypic frequencies among the three groups.

The genotypic frequencies of HLA-DQB1*0301 was found at a significantly higher level

in NDP patients than in the DP group (P= 0.0402).

Conclusions: In metabolic health mestizos patients with chronic periodontal disease

from Bahia-Brazil, there is a significant association with HLA-DQB1*0301. Further

studies with a higher population are warranted to confirm a lower frequency of HLA-

DQB1*0301 in DP group than DSP and NDP groups.

Key words: Chronic periodontitis; Human leukocytes antigens; Diabetes mellitus;

Polymorphism.

A periodontite é uma entidade nosológica de natureza infecciosa, caracterizada

pelo desencadeamento de uma potente resposta inflamatória responsável pela

destruição dos tecidos de suporte das unidades dentárias. O estudo de Borrell &

Papapanou (2005) sugere que os microrganismos presentes no biofilme são os agentes

etiológicos responsáveis por essa doença. Segundo Fox (1992) a resposta de cada

indivíduo à agressão bacteriana é singular, ocorrendo diferenças marcantes até mesmo

entre sítios de um mesmo indivíduo.

A susceptibilidade à periodontite envolve uma tríade formada por: bactéria,

hospedeiro e fatores ambientais (Seymour & Taylor 2004). O hábito de fumar e o

diabetes são fatores de risco para o desenvolvimento da periodontite, uma vez que

aumentam a probabilidade de acometimento desta doença infecciosa. Porém, tanto o

hábito de fumar como o diabetes não são determinantes para o desenvolvimento da

periodontite (Borrell & Papapanou 2005).

Michalowicz et al. (1991) sugeriram que a singularidade da resposta imunológica

frente ao desafio microbiano pode ser induzida por fatores de risco genéticos.

Evidências sobre a influência genética na patogênese da periodontite foram publicadas

em alguns artigos na última década (Katz et al. 1997; Michalowicz et al. 1994; D’Aiuto et

al. 2004). Van Der Velden et al. (1993) concluíram que fatores genéticos são os

responsáveis pela agregação familiar observada na periodontite.

Loss, John & Laine (2005) estimam que a periodontite tem entre 10 a 20 genes

modificadores da doença. Estes contribuem para a susceptibilidade e severidade da

periodontite porém, sua presença não determina o desenvolvimento da mesma, sendo

necessária a presença simultânea de outros fatores como a microbiota patogênica para

desencadeá-la (Hart 1996).

O polimorfismo de genes de citocinas e do HLA são fatores de risco hereditários.

O polimorfismo pode resultar em diferentes seqüências de resíduos de aminoácidos nas

superfícies de ligação entre o HLA e o receptor de linfócitos T, modificando o padrão de

resposta imune ao desafio microbiano (Mcdevitt 2000).

Vários autores (Firatli et al. 1996; Ohyama et al. 1996 ; Bonfil et al. 1999;

Machulla et al. 2002) observaram associação positiva entre a periodontite e alguns

antígenos do HLA como HLA-A24, -DR4 e -A9; também, determinados alelos HLA-

DQB1*0503, *0602 e *0603, HLA-DRB1*0401, *0404, *0405 e *0408 e HLA-A*03 e -

B*14. Por outro lado, Machulla, et al. (2002) observaram associação entre a freqüência

significativamente menor do alelo HLA-A*31 e do genótipo HLA-A*30/*31 e a incidência

da periodontite.

Alley et al. (1993) estudaram as associações entre periodontite, diabetes tipo 1,

fenótipo HLA-DR/DQ e a reatividade do linfócito T a antígenos bacterianos da P.

gingivalis e C. sputigena. Os autores concluíram que a presença das moléculas de

HLA-DR4 e – DQ3 aumenta o risco para o desenvolvimento da periodontite. O diabetes

tipo 1 é considerado uma nosologia poligênica que apresenta 20 grupos de genes

associados à susceptibilidade a esta doença; destes, 13 evidenciam associação

significante (Onengut-Gumuscu & Concannon 2002). Motala et al. (2005) concluíram

que existe associação significante entre os genótipos HLA-DRB1 e HLA-DQB1 e o

diabetes mellitus tipo 2 em Bahrainis portadores de diabetes tipo 2.

Foi objetivo deste trabalho investigar e comparar as distribuições dos alelos,

genótipos e haplótipos do HLA de classe II (HLA-DRB1, -DRB3, -DRB4, -DRB5 e -

DQB1) entre diabéticos portadores ou não de periodontite crônica severa e não

diabéticos portadores de periodontite crônica severa.

Material e Métodos

População

A amostra de pacientes foi composta por 91 indivíduos mestiços segundo os

critérios de Azevedo (1980), com idade entre 40 a 70 anos, distribuída em três grupos:

DP- 31 indivíduos diabéticos tipo 2 portadores de periodontite crônica severa; DSP- 30

indivíduos diabéticos tipo 2 que ao exame clínico periodontal apresentavam periodonto

clinicamente saudável, gengivite ou periodontite crônica leve; NDP- 30 indivíduos

metabolicamente sadios, portadores de periodontite crônica severa triados pela

Fundação Baiana para o Desenvolvimento das Ciências. Os indivíduos que

compuseram a amostra assinaram o Termo consentimento livre e esclarecido. Os

critérios de severidade foram descritos por Gomes-Filho et al. (2005).

Não foram incluídos na amostra os indivíduos que apresentassem infecção bucal

com indicação de drenagem ou que fossem fumantes. Também foram excluídos os

indivíduos que receberam prescrição de antibióticos, antiinflamatórios, corticosteróides,

antidepressivos, hormônios outros que não a insulina e anticonvulsivantes nos quatro

meses que antecederam o início deste estudo.

Coleta de Dados

A avaliação clínica periodontal forneceu dados como a medida de profundidade

de sondagem, a medida do nível de inserção clínica, a porcentagem de faces

sangrantes à sondagem, o índice de placa, e os índices de recessão e hiperplasia. A

genotipagem do HLA-DRB1, -DRB3, -DRB4, -DRB5 e –DQB1 foi realizada com DNA

genômico obtido a partir de amostra de sangue periférico coletado.

Coleta dos dados clínicos periodontais

Os indivíduos da amostra compareceram à primeira consulta, quando foram

registrados em uma ficha odontológica dados referentes aos parâmetros clínicos

periodontais: índice de placa de O`Leary descrito por Badersten; Nilveus; Egelberg

(1990); porcentagem de faces sangrantes à sondagem (Ainamo & Bay, 1975); medida

de profundidade de sondagem de sulco/bolsa (Pihlstrom et al. 1981) e medida do nível

de inserção clínica (Ramjford, 1959).

Os parâmetros clínicos periodontais foram determinados com o auxílio da sonda

periodontal milimetrada XP23/UNC15 padronizada tipo Williams da marca Hu-Friedy.

Foram investigados seis sítios por unidade dentária: médiovestibular, mesiovestibular,

distovestibular, médiolingual, distolingual e mesiolingual conforme descrito por Pihlstrom

et al. (1981).

Todos os parâmetros de avaliação periodontal foram mensurados por um único

pesquisador, especialista, tendo apresentado concordância intra-examinador média de

92.68% para a realização do presente estudo longitudinal.

Genotipagem HLA-DRB1, -DRB3, -DRB4, -DRB5, -DQB1

O DNA genômico foi purificado a partir de leucócitos do sangue periférico

utilizando o Kit “GFX

Genomic Blood DNA Purification Kit” (Amerscham Pharmacia

Biotech). O DNA obtido teve sua concentração e pureza determinadas pela leitura da

densidade óptica em 260 e 280 nm, sendo as amostras posteriormente congeladas a –

20º C até seu uso.

A determinação dos genótipos HLA de classe II (HLA-DR, -DQ) foi realizada pelo

método PCR-SSP utilizando o Kit Micro SSP

DNA typing SSP2L (One Lambda, Inc.

Canoga Park C.A.U.S.A. Lote 05 A) de acordo com as instruções do fabricante. Os

produtos do PCR foram separados em gel de agarose 2,5%, contendo 10 µL de

brometo de etídio e a corrida eletroforética realizada entre 140 a 150 volts, com 40 mA

no início da migração. Em seguida, as bandas eram visualizadas utilizando-se luz UV,

fotodocumentada, e o padrão de bandas obtido era transcrito para o mapa de tipagem

próprio do Kit.

Análise estatística

Para a comparação das freqüências entre os grupos foram realizados teste de qui-

quadrado ou o teste exato de Fisher. O Risco Relativo (RR) foi calculado de acordo com

o método de Woolf.

Resultados

A distribuição dos indivíduos de acordo com a idade foi semelhante nos grupos

DP e DSP e significativamente diferente no grupo NDP quando comparado a ambos os

grupos (p= 0,0489 e p= 0, 0452, respectivamente). O tempo de diagnóstico do diabetes

foi significativamente maior no grupo DSP do que no grupo DP (p= 0,002). A

distribuição por gênero não apresentou diferença estatisticamente significativa entre os

grupos (p= 0,2411) (Tabela 1).

Tabela 1 Estatística descritiva das variáveis demográficas.

Idade Gênero

(%)

Tempo de

diagnóstico

Grupo

DP M F

DSP 30 54,83

±1,65

34 66 13,13

±1,13

DP 31 56,54

±1,59

55 45 7,87

±1,18

NDP 30 47,00

±1,38

42 58

DP= Diabéticos portadores de periodontite crônica severa; DSP= Diabéticos sem periodontite crônica severa; NDP= Não diabéticos

portadores de periodontite crônica severa; x= média; DP= desvio padrão da média; M=gênero masculino; F= Gênero feminino.

Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na distribuição

das freqüências alélicas e genotípicas dos genes HLA-DRB1, -DRB3, -DRB4 e -DRB5

entre os três grupos. No grupo DP, os alelos mais freqüentes foram HLA-DRB1*07,

DRB1*13, HLA-DRB1*01 e DRB1*11; os alelos que apresentaram menor freqüência

foram HLA-DRB1*12, -DRB1*14 e -DRB1*16. No grupo DSP, os alelos mais freqüentes

foram HLA-DRB1*07, -DRB1*0301 e -DRB1*04; os menos freqüentes foram HLA-

DRB1*10 e -DRB1*12. No grupo NDP os alelos mais freqüentes foram HLA-DRB1*07,

DRB1*13, HLA-DRB1*11 e DRB1*15; os menos freqüentes foram HLA-DRB1*09 e -

DRB1*16. Os alelos HLA-DRB1*0302, -DRB1*12 e –DRB1*14 não foram observados

no grupo NDP. Nos três grupos foi observada uma maior freqüência do alelo HLA-

DRB3*, em comparação aos alelos -DRB4* e -DRB5* (Tabela 2).

Tabela 2 - Distribuição da freqüência alélica do HLA-DRB1, DRB3*, DRB4* e DRB5*.

DP= Diabéticos portadores de periodontite crônica severa;

DSP= Diabéticos sem periodontite crônica severa; NDP= Não

diabéticos portadores de periodontite crônica severa.

A Tabela 3 mostra a distribuição de freqüência dos alelos HLA-DQB1* nos três

grupos. No grupo DP os alelos mais freqüentes foram HLA-DQB1*02, -DQB1*05 e -

DQB1*06; os alelos HLA-DQB1*0303, -DQB1*0302 e –DQB1*0301 foram os menos

freqüentes. No grupo DSP os alelos mais freqüentes foram HLA-DQB1*02, -DQB1*05 e

–DQB1*06; os alelos menos freqüentes foram HLA-DQB1*0303, e –DQB1*0302. No

grupo NDP os alelos HLA-DQB1*02, -DQB1*0301 e -DQB1*06 foram os mais

freqüentes; os alelos HLA-DQB1*0303 e -DQB1*0302 foram os menos freqüentes.

n=31

DSP

N=30

NDP

n=30

Grupo/

Alelo

n. (%)

DRB1

*Blank 5 (8,1) 3 (5,0) 5 (8,3)

*01 7 (11,3) 3 (5,0) 4 (6,7)

*0301 5 (8,7) 8 (3,3) 4 (6,7)

*0302 2 (3,2) 3 (5,00) 0 (0,0)

*04 3 (4,8) 6 (10,0) 3 (5,0)

*07 9 (14,5) 8 (13,3) 10 (16,7)

*08 2 (3,2) 5 (8,3) 4 (6,7)

*09 2 (3,2) 2 (3,3) 1 (1,7)

*10 3 (4,8) 1 (1,7) 2 (3,7)

*11 6 (9,7) 5 (8,3) 8 (13,7)

*12 1 (1,6) 1 (1,7) 0 (0,0)

*13 9 (14,5) 5 (8,3) 10 (16,7)

*14 1 (1,6) 3 (5,0) 0 (0,0)

*15 6 (9,7) 4 (6,7) 8 (13,3)

*16 1 (1,6) 3 (5,0) 1 (1,7)

DRB3* 24 (38,7) 25 (41,7) 22 (36,7)

DRB4* 13 (21,0) 16 (26,7) 14 (23,3)

DRB5* 7 (11,3) 7 (11,7) 9 (16,0)

Tabela 3 – Distribuição de Freqüência Alélica do HLA-DQB1

DP= Diabéticos portadores de periodontite crônica severa; DSP= Diabéticos sem periodontite crônica severa; NDP= Não

diabéticos portadores de periodontite crônica severa; RR= Risco relativo; p= resultado estatístico da compara,cão entre os grupos.

Foi observada diferença estatisticamente significativa ao se comparar a

prevalência do alelo HLA-DQB1*0301 entre os grupos NDP e DP (p= 0,0402). Também,

foi observada uma tendência dos indivíduos do grupo DSP em apresentar maior

freqüência alélica do HLA-DQB1*0301 em comparação à observada no grupo DP (p=

0,0561).

No grupo DP é observada uma tendência para a maior freqüência do alelo HLA-

DQB1*05 na comparação com o grupo NDP (p=0,073).

A distribuição de freqüência dos haplótipos HLA-DRB1*/DQB1* foi analisada,

mas não foi observada diferença significativa entre os três grupos (dados não

mostrados - ver apêndice da Tese); contudo, há uma tendência dos indivíduos do grupo

NDP em apresentar maior freqüência do haplótipo HLA-DRB1*11/DQBI*0301 em

comparação à freqüência observada no grupo DP (p=0,081).

Discussão

Este estudo teve como objetivo avaliar e comparar a freqüência dos alelos HLA-

DRB1, -DRB3, -DRB4, -DRB5 e -DQB1 em 91 pacientes distribuídos em três grupos: o

grupo DP - composto por 31 indivíduos diabéticos tipo 2, descontrolados

metabolicamente, portadores de periodontite crônica, generalizada, severa; o grupo

DSP - 30 diabéticos tipo 2, descontrolados metabolicamente, que apresentavam

periodonto clinicamente saudável, gengivite ou periodontite crônica leve que

constituíram um grupo controle adequado segundo Gomes-Filho et al. (2005). O grupo

NDP foi composto por 30 indivíduos não diabéticos portadores de periodontite crônica,

generalizada, severa.

A comparação entre as freqüências dos alelos HLA-DQB1, entre os três grupos e

entre diabéticos e não diabéticos, revelou diferença significante apenas na prevalência

do alelo HLA-DQB1*0301 entre os grupos DP e NDP (p= 0,040). Os indivíduos não

diabéticos portadores de periodontite crônica apresentaram uma prevalência deste alelo

cerca de três vezes maior do que a observada no grupo de diabéticos portadores de

periodontite crônica. Não foi encontrada na literatura qualquer associação entre o

referido alelo e a periodontite e entre o referido alelo e a saúde metabólica. No grupo

DP é observada uma tendência para a maior freqüência do alelo HLA-DQB1*05 na

comparação com o grupo NDP (p= 0,073). Tunes (2006) concluíram que este alelo

N=31

DSP

N=30

NDP

N=30

DPxDSP DPxNDP

Grupo

Alelo

No. (%)

DQB1

*02

15 (24,2 ) 16 (26,7) 13 (21,7)

*0301

4 (6,4) 7 (11,7) 11 (18,3)

0,0561

0,307

0,0402

*0302

3 (4,8) 5 (8,3) 3 (5,0)

*0303

1 (1,6) 2 (3,3) 2 (2,3)

*04

4 (6,5) 6 (10,0) 3 (5,0)

*05

14 (22,6) 10 (16,7) 7 (11,67)

*06

12 (19,4) 10 (16,7) 11 (18,4)

*Blank

9 (14,5) 4 (6,7) 10 (16,7)

pode ser um marcador genético de proteção para o desenvolvimento da periodontite

crônica.

Emery et al. (2005) e Cerna, Novota & Kolostova (2003) associaram o alelo

HLA-DQB1*0302 ao diabetes tipo 1. Este mesmo alelo foi associado ao diabetes tipo 2

por Haiyan et al. (2003). Reichert et al.(2002) observaram uma maior freqüência,

estatisticamente significativa, do alelo HLA-DQB1*06 entre os portadores de

periodontite quando comparado aos controles. No presente estudo não foi observada

associação deste alelo a periodontite crônica. Talvez esta diferença seja uma

conseqüência das diferentes origens étnicas das populações estudadas. Uma vez que

o estudo de Reichert et al.(2002) avaliou indivíduos caucasianos e o presente estudo

pesquisou uma população caracterizada pelo inter-relacionamento entre povos

distintos, resultando em uma etnia geneticamente híbrida. Esta população apresenta

origem tri-racial: brancos, negros e índios, resultando em uma grande variedade de

fenótipos mestiços (Azevedo 1980).

Neste estudo a distribuição da freqüência alélica do HLA-DRB1 entre os

mestiços de Feira de Santana-BA revelou que no grupo DP os alelos HLA-DRB1*07,

*13 e *01 foram os mais prevalentes e os alelos HLA-DRB1*12 e *14 os menos

prevalentes; já no grupo DSP os alelos mais freqüentes foram os HLA-DRB1, *0301 e

*07, enquanto que os mais raros foram os HLA-DRB1*0303 *10 e *12. No grupo NDP

os alelos mais freqüentes foram os HLA-DRB1*07 e *13.

Onengut-Gumuscu & Concannon (2002), relataram que o HLA-DRB1*04 está em

desequilíbrio de ligação com HLA-DQB1*0302, ocorrendo em alta freqüência entre os

diabéticos tipo 1; estes dados foram confirmados por Emery et al. (2005), Cerna,

Novota & Kolostova (2003) e Horton et al. (1999). Mimura et al. (2004) observaram

maior freqüência dos antígenos HLA-Cw4 e DR4 entre indivíduos Japoneses

portadores de diabetes mellitus tipo 2 e Motala et al. (2005) observaram que os grupos

alélicos: HLA-DRB1*04, *07 e *15 e HLA-DQB1*0302, *05, *06 e *02 foram os mais

freqüentes entre os indivíduos portadores de diabetes tipo 2. No presente estudo foi

observado que um dos grupos alélicos mais freqüentes, entre os diabéticos tipo 2, foi o

HLA-DRB1*07.

É importante levar em conta que nos estudos de Onengut-Gumuscu &

Concannon (2002), Cerna, Novota & Kolostova (2003) e Emery et al. (2005) foram

avaliados indivíduos diabéticos tipo 1; estes apresentam patogenia diferenciada da

apresentada pelos indivíduos portadores de diabetes tipo 2. Também é importante

considerar que nos estudos de Mimura et al. (2004) e Motala et al. (2005) as

populações estudados foram formadas por indivíduos diabéticos tipo 2, porém, de

origem japonesa e árabe respectivamente.

Stein et al. (2003) observaram associação positiva entre o HLA-DRB1*04, -

Cw*08 e -B*14 e a periodontite crônica. Também Bonfil et al. (1999) concluíram que os

HLA-DRB1*0401, 0404, 0405 e 0408 foram associados à periodontite rapidamente

progressiva. No presente estudo foi observado uma freqüência duas vezes maior, não

significativa, do alelo HLA-DRB1*04 no grupo de diabéticos tipo 2 sem periodontite

severa quando comparado aos DP. É importante enfatizar que a amostra deste estudo

foi composta por indivíduos portadores de periodontite crônica, que apresenta aspectos

peculiares em sua patogenia que a diferencia da patogenia observada na periodontite

agressiva.

Foi observada uma tendência dos indivíduos do grupo DP em apresentar maior

freqüência do alelo do HLA-DRB3* em comparação com a freqüência observada entre

os NDP (p=0,079). Por outro lado, Stein et al. (2003) avaliando indivíduos caucasianos

observaram maior freqüência, não estatisticamente significativa, do HLA-DRB5* entre

os portadores de periodontite crônica e Alley et al. (1993) relataram que o HLA-DRB4*

foi significativamente mais freqüente entre os portadores de periodontite, diabéticos ou

não. Estas diferenças podem ter origem nas diferentes etnias pesquisadas.

A avaliação dos haplótipos obtidos nos três grupos de estudo não mostrou

diferença estatística significativa; apenas o grupo NDP apresentou uma tendência

(p=0,081) para a maior freqüência do haplótipo HLA-DRB1*11-DQB1*0301 quando

comparado ao DP. Os haplótipos mais freqüentes entre os diabéticos portadores de

periodontite foram: DRB1*01-DQB1*05, DRB1*13-DQB1*06 e DRB1*07-DQB1*02 e os

mais freqüentes entre aqueles diabéticos periodontalmente saudáveis foram: DRB1*07-

DQB1*02 e DRB1*0301-DQB1*05,

Motola et al. (2005), observaram que os haplótipos: DRB1*040101-DQB1*0302,

DRB1*070101-DQB1*050101, DRB1*150101-DQB1*060101 e DRB1*070101-

DQB1*020101 foram os mais freqüentes entre os diabéticos tipo 2 quando comparados

aos não diabéticos e que o alelo DRB1*0701-DQB1*0201 conferiu susceptibilidade ao

diabetes tipo 2; este mesmo haplótipo foi um dos mais freqüentes entre todos os grupos

avaliados no presente estudo, resultado, provavelmente, determinado, muito mais, por

uma características populacional do que de um indicativo de susceptibilidade. Também,

o haplótipo DRB1*1501-DQB1*0601 foi positivamente associado ao diabetes tipo 2 por

Motola et al. (2005); no entanto, o mesmo haplótipo, no presente estudo, foi um dos

mais freqüentes entre os não diabéticos, apresentando o dobro da freqüência deste

haplótipo quando comparado aos grupos de diabéticos separadamente, sendo esta

diferença não significativa.

Os resultados obtidos neste trabalho sugerem uma associação entre o alelo

HLA-DQB1*0301 e os indivíduos metabolicamente saudáveis, mestiços, portadores de

periodontite crônica severa. Estudo redesenhado, com uma amostra significativamente

maior é necessário para confirmar a menor freqüência do alelo HLA-DQB1*0301 em

diabéticos tipo 2 portadores de doença periodontal crônica severa em comparação às

freqüências observadas em indivíduos diabéticos tipo 2 sem doença periodontal crônica

severa e em não diabéticos portadores de doença periodontal crônica severa.

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Artigo 3

“Associação entre o polimorfismo do códon 10 do gene TGF-

1 e

a doença periodontal crônica severa em baianos, mestiços,

diabéticos tipo 2”

ASSOCIAÇÃO ENTRE O POLIMORFISMO DO CÓDON 10 DO GENE

TGF-

1 E A PERIODONTITE CRÔNICA SEVERA EM BAIANOS,

MESTIÇOS, DIABÉTICOS TIPO 2.

(ASSOCIATION OF TGF-

1 CODON 10 GENE POLYMORPHISM WITH

CHRONIC PERIODONTAL DISEASE IN TYPE 2 DIABETICS PATIENTS

FROM BAHIA-BRAZIL)

Monteiro AMA, Freire SM, Meyer R, Gomes-Filho IS, Pinto-filho JM, Bendicho MT,

Lemaire DC.

Adriano d`Almeida Monteiro

Doutorando em Imunologia, Mestre em Odontologia.

Songeli Meneses. Freire

Doutora em Imunologia.

Roberto Meyer

Doutor em Imunologia.

Isaac Suzart Gomes-Filho

†

Doutor em Periodontia.

Jorge Moreira Pinto-Filho

†

Acadêmico de Odontologia.

Maria Teresita Bendicho

Mestra em Imunologia.

Urbino da Rocha Tunes

‡

Doutor em Imunologia.

Denise Carneiro Lemaire

Doutora em Imunologia.

Universidade Federal da Bahia – Laboratório de Imunogenética do Instituto de Ciências

da Saúde - Programa de Pós-graduação em Imunologia;

†

Universidade Estadual de

Feira de Santana – Departamento de Saúde;

‡

Fundação Bahiana para o

Desenvolvimento das Ciências.

Reprints: Adriano M. d`Almeida Monteiro, R. Santa Helena, 159, ap.602, Pituba,

Salvador, Bahia, Brasil, CEP-41927430 fax:71-33463331, e-mail:

[email protected].

Abstract

Background: Differences in host response may determine susceptibility or

resistance to periodontal disease. Studies have linked the increased propensity of

diabetic subjects to develop periodontal disease to genetic predisposition. There is

growing evidence that genetic factors play a role in the onset and severity of periodontal

disease once the expression levels of the cytokines may be modulated by genetic

polymorphisms.

Methods: 91 tested subjects were divided in 3 groups: DP was formed by 31

diabetic subjects with chronic periodontal disease; DSP consisted of 30 diabetic

subjects without severe or moderate periodontal disease; and NDP was formed by 30

metabolic healthy patients with severe chronic periodontal disease. The DNA was

extracted from the samples using the modified salting out technique. Its concentration

was determinate for its optical density reading. The polymorphisms studied were TNF-

[alpha] (-308G/A), TGF-[beta]1 (codon 10C/T, codon 25C/G), IL-10 (-1082A/G; -819T/C;

-592A/C), IL-6 (-174G/C), and IFN-[gamma] (+874T/A). The data were transferred for a

Cytokine Genotyping tray map.

Results: A statistically significant difference was observed in the genotype

frequency of the polymorphisms of the TGF-

1 gene on codon 10 between DP and DSP

patients. The proportion of subjects that exhibited the TT genotype was significantly

higher in DP group than in DSP group. No statistically significant differences were found

for allele, genotypic and phenotypic frequencies on the genes that code IL-6, IL-10,

TNF-

, IFN-

and TGF-

1codon 25 between groups.

Conclusions: These results demonstrate that the polymorphism at TGF-

gene on codon 10C/T is associated to chronic periodontitis in diabetic patients from

Bahia-Brazil. Further studies are warranted to determine if these polymorphism are a

risk factor for susceptibility to periodontal disease.

Key words: chronic periodontitis, cytokines, genetic polymorphism, transforming growth

factor-β1 .

A periodontite é uma entidade nosológica de natureza infecciosa, caracterizada

pelo desencadeamento de uma potente resposta inflamatória responsável pela

destruição dos tecidos de suporte das unidades dentárias. O estudo de Papapanou

sugere que microrganismos presentes no biofilme são os agentes etiológicos

responsáveis por essa doença. Segundo Fox

a resposta de cada indivíduo à agressão

bacteriana é singular, ocorrendo diferenças marcantes até mesmo entre sítios de um

mesmo indivíduo.

A susceptibilidade à periodontite envolve uma tríade formada por bactéria,

hospedeiro e fatores ambientais.

O hábito de fumar e o diabetes são fatores de risco

para o desenvolvimento da periodontite, uma vez que aumentam a probabilidade de

acometimento desta doença infecciosa. Porém, tanto o hábito de fumar como o

diabetes não são determinantes para o desenvolvimento da periodontite.

Diferenças na resposta imunológica frente ao desafio microbiano podem ser

determinadas por fatores genéticos de risco.

Evidências sobre a influência genética na

patogênese da periodontite foram publicadas, em alguns artigos, na última década.

6-8

Van Der Velden et al. concluíram que fatores hereditários são os responsáveis pela

agregação familiar observada na periodontite.

A periodontite tem entre 10 a 20 genes modificadores de doença.

Estes

contribuem para a susceptibilidade e severidade da periodontite porém, sua presença

não determina o desenvolvimento da mesma, sendo necessário que outros fatores

como a microbiota patogênica estejam presentes para desencadeá-la.

O polimorfismo genético de citocinas e do HLA são fatores de risco hereditários.

Tais fatores podem influenciar a história natural da periodontite, exacerbando o

processo inflamatório, induzido por um padrão alterado na produção e secreção de

citocinas pró-inflamatórias e/ou das citocinas regulatórias, exercendo influência direta

sobre o início, a regulação e a perpetuação do processo infeccioso inflamatório

periodontal.

7,11-12

As citocinas desempenham papel central no processo inflamatório

periodontal, na perda óssea alveolar e na regulação da resposta imune adaptativa,

atuando na imunoregulação, determinando o perfil Th1/Th2 da resposta imune.

Diversos estudos relatam a existência de associação entre a freqüência de

determinados alelos do gene da IL-1

( alelo 2 na posição + 3953 da IL-1

e o

polimorfismo de um único nucleotídeo (T→G) na posição – 330) e a severidade da

periodontite.

11,14

Também, as concentrações das citocinas IL-1β, TNF-α, IL-2 e IFN-y

estavam, em média, superiores no soro e nas amostras de tecidos gengivais de

indivíduos portadores de periodontite quando comparadas às concentrações obtidas em

indivíduos periodontalmente saudáveis;

as expressões do RNAm da IL-6 e do IFN-γ

estavam significativamente mais altas entre tecidos doentes quando comparadas às

expressões destes em tecidos sadios.

Também os haplótipos específicos e o

polimorfismo genético de um único nucleotídeo do gene da IL-10 estão associados à

maior susceptibilidade à periodontite crônica na população do sudeste brasileiro.

Por

outro lado, Gonzales et al.

concluíram não haver associação entre os polimorfismos

genéticos (A-597C) e (T-824C) e as doenças periodontais crônica e agressiva. Além

disto, as freqüências alélicas em 5 posições no gene TGF-

β1

foram avaliadas e foi

concluído que não há associação entre o polimorfismo do referido gene e a severidade

da periodontite.

O sistema imunológico é o responsável pela defesa do organismo;

paradoxalmente, atua diretamente na destruição dos tecidos periodontais ativando

osteoclástos.

O comportamento da Prostaglandina E2, IL1-β e do TNF-α, em

indivíduos diabéticos portadores de periodontite, resulta em uma reação exacerbada,

destes indivíduos, frente ao desafio microbiano.

A associação entre a presença de

determinados genótipos a um padrão na produção de citocinas vem sendo relatada por

diversos autores;

22-25

portanto, é plausível conjecturar sobre o possível papel do

polimorfismo de genes de citocinas na resposta imunológica exacerbada frente ao

desafio microbiano observada entre os indivíduos diabéticos.

Este estudo teve como objetivo a descrição e comparação das freqüências

alélicas, genotípicas e dos fenótipos previstos dos genes TGF-

códon 10 ; códon 25

, IL-6

-174

G/C

, IL-10

-1082 G/A; - 819 C/T; -592 C/A

, TNF-

-308 G/A

e IFN-

+874 A/T

entre grupos de mestiços

compostos por indivíduos diabéticos portadores de periodontite crônica generalizada

severa, indivíduos, também, diabéticos periodontalmente saudáveis, e indivíduos não

diabéticos portadores de periodontite.

Material e Métodos

Amostra

A amostra foi composta por 91 indivíduos mestiços segundo os critérios raciais

descritos de Azevedo (1980), com idade entre 40 a 70 anos, distribuída em três grupos:

DP- 31 indivíduos diabéticos tipo 2 portadores de periodontite crônica severa; DSP- 30

indivíduos diabéticos tipo 2 que ao exame clínico periodontal apresentavam periodonto

clinicamente saudável, gengivite ou periodontite crônica leve; NDP- 30 indivíduos

metabolicamente sadios, portadores de periodontite crônica severa triados pela

Fundação Baiana para o Desenvolvimento das Ciências. Os indivíduos que

compuseram a amostra assinaram o Termo de consentimento livre e esclarecido. Os

critérios de severidade foram descritos por Gomes-Filho et al. (2005).

Não foram incluídos na amostra os indivíduos que apresentaram infecção bucal

com indicação de drenagem ou que fossem fumantes. Também foram excluídos os

indivíduos que receberam prescrição de antibióticos, antiinflamatórios, corticosteróides,

antidepressivos, hormônios outros que não a insulina e anticonvulsivantes, nos quatro

meses que antecederam o início deste estudo.

Coleta de Dados

A avaliação clínica periodontal forneceu dados como a medida de profundidade

de sondagem, a medida do nível de inserção clínica, a porcentagem de faces

sangrantes à sondagem, o índice de placa, e os índices de recessão e hiperplasia. A

avaliação e a distribuição de freqüência dos alelos dos genes IL-6, IL-10, TGF-

, IFN-

e TNF-

foi realizada com DNA genômico, obtido a partir de amostra de sangue

periférico coletado.

Coleta dos dados clínicos periodontais

Os indivíduos selecionados compareceram à primeira consulta, quando foram

registrados, em uma ficha odontológica, os dados referentes aos parâmetros clínicos

periodontais: índice de placa de O`Leary,

porcentagem de faces sangrantes à

sondagem,

medida de profundidade de sondagem de sulco/bolsa

e medida do nível

de inserção clínica.

Foram investigados seis sítios por unidade dentária.

Todos os parâmetros de avaliação periodontal foram mensurados por um único

pesquisador, especialista, tendo apresentado concordância intra-examinador média de

92.68%.

Genotipagem

O DNA genômico foi purificado a partir de leucócitos do sangue periférico

utilizando o Kit “GFX

Genomic Blood DNA Purification Kit” (Amerscham Pharmacia

Biotech). O DNA obtido teve sua concentração e pureza determinada pela leitura da

densidade óptica em 260 e 280 nm. Foi usado o kit para genotipagem de citocinas da

One Lambda Incorporation- “Cytokine Genotyping Tray”, contendo 15 tubos de PCR,

cada um contendo dois pares de iniciadores. Um par com seqüências específicas que

amplificam seletivamente regiões regulatórias polimórficas dentro de genes que

codificam TNF-

(-308G/A), TGF-

1 (10C/T, 25C/G), IL-10 (-1082A/G, -819T/C,-

592A/C), IL-6 (-174C/G), e IFN-

(874T/A).

Sequenciadamente à amplificação, os fragmentos de DNA amplificados foram

separados por eletroforese em gel de agarose e visualizados por coloração com

brometo de etídio e exposição à luz ultravioleta. A cuba de eletroforese utilizada foi

desenvolvida pela One Lambda, de forma a permitir a análise concomitante de 96

produtos de PCR em um curto tempo de migração; assim, em cada gel, foram

analisados os resultados da amplificação de 6 diferentes amostras de DNA (16 reações

para cada amostra). A corrida eletroforética foi então realizada a 120-130V durante 4 a

5 minutos, ou até que o corante (vermelho de fenol) migrasse cerca de dois terços da

distância entre duas linhas de poços no gel.

A interpretação dos resultados de PCR-SSP foi baseada na presença ou ausência

de um fragmento de DNA específico amplificado. As reações positivas para um alelo, ou

grupo de alelos de citocina, forão visualizadas num gel como um fragmento de DNA

amplificado entre a banda produto do controle interno e a banda de iniciadores não

incorporados.

Após a eletroforese no gel, os produtos amplificados foram visualizados usando

luz ultravioleta e fotografados com auxílio de um transiluminador. Os resultados foram

interpretados usando mapas das placas de genotipagem de citocinas fornecidas junto

com as placas para PCR.

Metodologia da análise estatística

As freqüências genotípicas foram determinadas por contagem direta dos dados

obtidos com a reação em cadeia da polimerase; a freqüência alélica foi calculada

dividindo-se o número de cada um dos alelos encontrados pelo número total de alelos

possíveis, em cada grupo estudado. A freqüência dos fenótipos previstos foi obtida pela

adição dos valores absolutos de diferentes genótipos que apresentam o mesmo

fenótipo previsto para a produção das citocinas. As comparações das freqüências

alélicas, genotípicas e dos fenótipos previstos entre os diferentes grupos foram

realizadas utilizando-se o teste exato de FISHER, em níveis de significância onde p <

0,05.

Resultados

A amostra de pacientes diabéticos foi formada por 61 indivíduos mestiços,

classificados de acordo com a patogênese da doença, e tratados no Centro de Diabetes

da Prefeitura de Feira de Santana-Bahia. Os pacientes foram distribuídos em dois

grupos: o grupo DP - composto por 31 indivíduos diabéticos tipo 2, descontrolados

metabolicamente, portadores de periodontite crônica, generalizada, severa; o grupo

DSP - 30 diabéticos tipo 2, descontrolados metabolicamente, que apresentavam

periodonto clinicamente saudável, gengivite ou periodontite crônica leve. O grupo NDP

foi composto por 30 indivíduos não diabéticos portadores de periodontite crônica,

generalizada, severa, triados na Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das

Ciências.

A distribuição dos indivíduos de acordo com a idade foi semelhante nos grupos

DP e DSP e significativamente diferente no grupo NDP quando comparado a ambos os

grupos (p= 0,0489 e p= 0,0452), respectivamente. O tempo de diagnóstico do diabetes

foi significativamente maior no grupo DSP do que no grupo DP (p= 0,002). A

distribuição por gênero não apresentou diferença estatisticamente significativa entre os

grupos (p= 0,2411) (Tabela 1).

A comparação da freqüência genotípica do TGF-

β1

(TT, TC e CC) , no códon 10,

entre o grupo DP e DSP, resultou em diferença estatística significativa (p= 0,0127). Foi

observada, também, que o grupo DP apresenta uma tendência (p= 0,0674) para a

maior freqüência do genótipo TT quando comparado ao NDP. As comparações das

freqüências alélicas (G/C) e genotípicas do códon 25 (GG, GC e CC), entre os grupos,

não resultou em diferença estatística significativa. A comparação das freqüências dos

fenótipos previstos entre os grupos DP, DSP e NDP não mostraram significância

estatística (Tabela 3).

Não foram observadas diferenças estatísticas significantes, para o polimorfismo

genético do IFN-

γ,

IL-6, TNF-

e IL-10, ao se comparar as freqüência alélicas

genotípicas e dos fenótipos previstos entre os grupos. (Tabela 2)

As diferenças observadas das comparações das freqüências alélicas,

genotípicas e dos fenótipos previstos entre os grupos DP e DSP e DP e NDP não

resultaram em diferenças estatísticas significantes para o polimorfismo do gene IFN-

(+874 T/A) (Tabela 2).

As possíveis combinações do polimorfismo da IL-10, nas posições -1082, -819 e

-592, formam 6 possíveis genótipos: GCC/GCC, GCC/ACC, GCC/ATA, ACC/ACC,

ACC/ATA e ATA/ATA, onde o primeiro determina um fenótipo previsto como alto

produtor, os outros dois genótipos iniciados pela seqüência GCC determinam fenótipo

previsto como produtor intermediário e os demais genótipos são responsáveis,

provavelmente, por uma baixa produção desta citocina. Os resultados das

comparações entre as freqüências alélicas, genotípicas e dos fenótipos previstos desta

citocina, entre os grupos avaliados, não resultaram em diferenças estatísticas

significantes (Tabela 2).

A correlação dos genótipos com os prováveis fenótipos previstos de cada uma

das citocinas não foi realizada neste estudo, uma vez que esta correlação já foi descrita

na literatura.

22-25

Discussão

No presente estudo foram avaliadas as freqüências dos polimorfismos das

citocina IFN-γ, envolvida diretamente com a resposta Th1, das citocinas pró-

inflamatórias IL-6 e TNF-α e das citocinas regulatórias como o TGF-

β1

e a IL-10

associadas ao perfil Th2.

Foi observada diferença estatisticamente significativa nas freqüências

genotípicas do TGF-

códon 10

entre os grupos DP e DSP. No grupo DSP, o genótipo

mais prevalente foi o TC (63,3%) e no grupo DP o genótipo TT foi o mais freqüente

(51,6%). Este pode ser considerado um marcador de predisposição ao desenvolvimento

da periodontite crônica severa na população estudada. A diferença estatisticamente

significante em relação aos genótipos supracitados não resultou em diferença

significativa em relação aos fenótipos previstos. Em todos os grupos o fenótipo previsto

de alto produtor foi o mais prevalente seguido pelo produtor intermediário e baixo

produtor.

De Souza et al.

, ao avaliarem o polimorfismo C-509T do TGF-

1, observaram

que o alelo T e o genótipo TT são os mais freqüentes em portadores de periodontite

crônica e concluíram que este polimorfismo pode atuar na modulação do processo

inflamatório. No presente estudo, também, foi observado que o genótipo TT, no códon

10, pode estar associado a um processo inflamatório mais intenso, uma vez que foi

mais freqüente no grupo DP, onde o processo inflamatório é mais severo. No entanto,

no estudo de Holla et al.

, a avaliação dos polimorfismos -988 (C/A), -800 (G/A) e -509

(C/T) na região 5` e o polimorfismo L10P no códon 10 e o R25P no códon 25 não

resultou em associação entre estes polimorfismos e a severidade da periodontite.

achados divergentes podem ser o resultado das diferentes origens étnicas avaliadas; os

dois artigos acima citados avaliaram indivíduos caucasianos e o presente estudo

avaliou uma população caracterizada pelo inter-relacionamento entre povos distintos,

resultando em uma etnia geneticamente híbrida, de origem tri-racial, brancos, negros e

índios, levando a uma grande variedade de fenótipos mestiços (Azevedo 1980).

O presente estudo não observou diferença estatisticamente significante quando

comparou os grupos em relação às freqüência alélicas, genotípicas e do fenótipo

previsto do IFN-

. Em todos os grupos o genótipo AA homozigoto na posição +874 foi o

mais prevalente e está associado a um fenótipo previsto de baixo produtor, seguido do

genótipo heterozigoto TA associado à produção intermediária desta citocina e o

genótipo homozigoto TT à alta secreção desta citocina. A homogeneidade entre os

grupos em relação ao genótipo prevalente AA não era esperada neste estudo uma vez

que Gemmel & Seymor

concluíram que a lesão estável está associada ao perfil Th1 e

à maior secreção do IFN-γ e a lesão avançada ao perfil Th2, caracterizado pela intensa

secreção das citocinas IL-4, IL-5 e IL-10 e pela redução na secreção das citocinas do

perfil Th1.

Talvez a homogeneidade encontrada no presente estudo reflita o protocolo

de inclusão e exclusão que agrupou no grupo DSP indivíduos portadores de

periodontite crônica leve.

As distribuições alélicas, genotípicas e dos fenótipos previstos para o

polimorfismo -174 G/C do gene IL-6 entre os grupos não resultou em diferença

estatisticamente significativa. Em todos os grupos o alelo G e o genótipo homozigoto

GG foram os mais freqüentes. Também em todos os grupos foi observada maior

prevalência do fenótipo previsto como alto produtor apesar da diferença significativa

observada quando foram comparados os quadros inflamatórios periodontais entre os

grupos DP e DSP. Trevilatto, et al.

, estudando o polimorfismo IL-6

-174

, em

caucasianos oriundos do sudeste brasileiro, também observaram maior freqüência do

alelo G e do genótipo GG entre os indivíduos portadores de periodontite crônica

moderada e severa; os autores concluíram que o polimorfismo da IL-6

-174G/C

está

associado à susceptibilidade à periodontite crônica na população estudada.

importante destacar que apesar do estudo atual e do trabalho de Trevilatto, et al.

terem sido realizados no Brasil, a população estudada difere consideravelmente; no

primeiro a população é mestiça, com predomínio da raça negra e no segundo a amostra

é de caucasianos que sofreram influência de imigrações japonesas e européias. A

avaliação do polimorfismo genético da IL-6 na posição -174, em caucasianos, indicou

que o alelo G está associado ao diabetes mellitus tipo 2 e que o referido polimorfismo

não está associado aos níveis séricos da IL-6.

Entretanto, foi sugerido que este

polimorfismo está associado à maior concentração sérica da IL-6

; Kubaszak et al.

relataram que o genótipo C/C da IL-6 na posição -174 confere um risco duas vezes

maior em desenvolver o diabetes mellitus tipo 2 a partir de um estado de intolerância à

glicose.

Por outro lado, neste estudo, tanto os indivíduos diabéticos tipo 2 quanto os não

diabéticos apresentaram o genótipo GG como o mais prevalente.

Não foi observada diferença estatisticamente significativa, entre os grupos, na

distribuição das freqüências alélicas, genotípicas e dos fenótipos previstos dos

polimorfismos -1082 G/A, -819 C/T e -592 C/A da IL-10. Diferentemente dos resultados

obtidos neste estudo, no qual o alelo A na posição -1082 foi o mais prevalente, o alelo

G foi o de maior prevalência em uma amostra de indivíduos caucasianos suíços.

Nesta mesma população o genótipo GG foi significativamente mais freqüente entre os

portadores de periodontite severa quando comparados aos controles.

Contudo, o

estudo de indivíduos japoneses não revelou a presença do alelo G na posição -1082;

porém, determinou que o haplótipo GCC estava presente em 68% da população

japonesa, subsidiando a conclusão de que a freqüência de haplótipos, na população do

Japão, difere bastante da observada entre os caucasianos.

Neste estudo, o haplótipo

GCC esteve presente geralmente em 56% da população estudada.

No presente estudo os alelos da IL-10 -819C e -592C foram os mais prevalentes

em todos os grupos. Nos três grupos os genótipos mais freqüentes foram o GCC/ATA e

o ACC/ATA e, em relação aos fenótipos previstos, o mais prevalente foi o associado a

uma produção intermediária, apesar dos diferentes graus de severidade observados

entre os três grupos. Também a avaliação em caucasianos portadores de periodontite

crônica severa e em indivíduos periodontalmente saudáveis indicou que os

polimorfismos nas posições -597 e -874 não estão associados à periodontite;

observaram também que os alelos A e T foram os mais freqüentes nas posições -597 e

-874 respectivamente,

enquanto que, na população mestiça estudada, o alelo mais

freqüente foi o C, para ambas posições. Durante o estudo de caucasianos oriundos do

Sudeste Brasileiro, foi observada diferença estatística significativa na distribuição da

freqüência genotípica, nas posições -819 e -592, entre os portadores de periodontite

crônica e indivíduos periodontalmente saudáveis; neste caso, o alelo C foi o mais

freqüente em ambos os grupos e posições supracitadas.

A distribuição das freqüências para o polimorfismo -308 G/A, do gene TNF-

, não

apresentou diferenças estatísticas significantes entre os grupos avaliados. O alelo G e o

genótipo GG foram os mais freqüentes em todos os grupos, apesar da diferença

significativa observada quando foram comparados os quadros inflamatórios

periodontais entre os grupos DP e DSP. Também Craandijk et al.

concluíram que o

polimorfismo genético TNF-

-308(G/A)

pode não estar associado à susceptibilidade ou à

severidade da periodontite de forma independente do hábito de fumar; por outro lado, o

estudo deste polimorfismo na população checa observou associação à periodontite

crônica quando associado ao polimorfismo +252 (A/G) da linfotoxina-α.

Kubaszek et

al.

concluíram que o polimorfismo (G-308A) do gene TNF-α é um preditor para a

conversão do estado de intolerância à glicose para o diabetes mellitus tipo 2 e,

semelhantemente aos dados obtidos no presente estudo, o genótipo GG foi o mais

freqüente (74%), seguidos dos genótipos GA (25%) e AA (1%);

sendo que este último

esteve ausente entre os mestiços avaliados.

Assim, este estudo mostrou uma associação entre a periodontite crônica severa

em indivíduos diabéticos tipo 2 e a maior freqüência do genótipo TT do gene TGF-

códon 10

. Este genótipo pode ser considerado um possível marcador genético para a

periodontite. Não foi possível associar os polimorfismos dos genes IFN-

+874T/A

, IL-6

174G/C

, TNF-

−

308 G/A

TGF-

códon 25

e IL-10

-1082G/A,-819C/T,-592C/A

à periodontite cônica

severa.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia-

FAPESB pelo financiamento deste projeto de pesquisa.

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Tabela 1- Estatística descritiva das variáveis demográficas.

Idade Gênero

(%)

Tempo de diagnóstico

Grupo N

DP M F

DSP 30 54.83

±1.65

34 66 13.13

±1.13

DP 31 56.54

±1.59

55 45 7.87

±1.18

NDP 30 47.00

±1.38

42 58

DP= Diabéticos portadores de periodontite crônica severa; DSP= Diabéticos sem periodontite crônica severa; NDP= Não diabéticos portadores de

periodontite crônica severa; x= média; DP= desvio padrão da média; M=gênero masculino; F= Gênero feminino.

Tabela 2- Distribuição das freqüências genotípicas e dos fenótipos previstos dos genes

IFN-

+874T/A

, IL-6

-174G/C

, TNF-

−

308 G/A

e IL-10

-1082G/A,-819C/T,-592C/A

GENÓTIPO (FENÓTIPO)

N=31

(%)

DSP

n =30

(%)

NDP

n =30

(%)

DPXDSP DPXNDP

TNF-

αα

−

−−

−

308 G/A

G/G (baixo produtor) 20 (64.52) 20 (66.67) 20 (66.67) 0.8597 0.8597

GA+AA (alto produtor) 11 (35.48) 10 (33.33) 10 (33.33)

IL-6

-174G/C

GG+GC (alto produtor) 29 (93.55) 28 (93.3) 30 (100) 1.0000 0.4918

CC (baixo produtor) 2 (6.45) 2 (6.7) 0 (0)

IFN-

γγ

+874T/A

TT (alto produtor) 1 (3.22) 4 (13.33) 2 (6.67) 0.1232 0.7108

TA (produtor intermediário) 15 (48.39) 8 (26.67) 12 (40.0)

AA (baixo produtor) 15 (48.39) 18 (60.0) 16 (53.33)

IL-10

-1082G/A,-819C/T,-592C/A

GCC/GCC (alto produtor) 3 (9.68) 3 (10.00) 2 (6.67) 0.9910 0.9123

GCC/ACC; GCC/ATA (produtor

intermediário)

15 (48.39) 14 (46.47) 15 (50.00)

ACC/ACC; ACC/ATA; ATA/ATA

(baixo produtor)

13 (41.93) 13 (43.33) 13 (43.33)

DP= Diabéticos portadores de periodontite crônica severa; DSP= Diabéticos sem periodontite crônica severa; NDP= Não diabéticos

portadores de periodontite crônica severa; DP X DSP= Resultado estatístico da compara, cão entre os grupos; DP X NDP=

Resultado estatístico da comparação entre os grupos; A produção de citocinas relacionada ao fenótipo previsto está de acordo com

Hoffman et al. (2003), Pravica et al. (1997), Turner et al. (2000) e Wilson et al. (1993),

Tabela 3- Distribuição das freqüências alélicas, genotípicas e dos fenótipos previstos do

gene TGF-

codons 10 T/C e 25 G/C.

n =31

(%)

DSP

n =30

(%)

NDP

n =30

(%)

DPXDSP DPXNDP

TGF-

ββ

1 1

codon10

Alelo T 40 (64.52) 35 (58.33) 32 (53.33) 0.6062 0.2695

Alelo C 22 (35.48) 25 (41.67) 28 (46.67)

Genótipo TT 16 (51.61) 8 (26.67) 8 (26.67) 0.0127 0.0674

Genótipo TC 8 (25.81) 19 (63.33) 16 (53.33)

Genótipo CC 7 (22.58) 3 (10.00) 19 (20.00)

TGF-

ββ

1 1

códon 25

Alelo G 58 (93.55) 52 (86.67) 55 (91.67) 0.3311 0.9592

Alelo C 4 (6.45) 8 (13.33) 5 (8.33)

Genótipo GG 28 (90.32) 22 (73.33) 26 (83.33) 0.0705 0.2953

Genótipo GC 2 (6.45) 8 (26.67) 5 (16.67)

Genótipo CC 1 (3.22) 0 (0.00) 0 (0.00)

Fenótipo

Alto produtor 23 (74.19) 21 (70.00) 21 (70.00) 0.9271 0.9271

Produtor intermediário 6 (19.35) 7 (23.33) 7 (23.33)

Baixo produtor 2 (6.46) 2 (6.67) 2 (6.67)

DP= Diabéticos portadores de periodontite crônica severa; DSP= Diabéticos sem periodontite crônica severa; NDP= Não diabéticos

portadores de periodontite crônica severa. A produção de citocinas relacionada ao fenótipo previsto está de acordo com Hoffman et

al. (2001).

6 Discussão

Este trabalho teve como objetivo estudar o polimorfismo do HLA (HLA-DRB1, -

DRB3, -DRB4, -DRB5 e -DQB1) e de genes de citocinas (IL-6, TNF-

, IL-10, TGF-

IFN-

) em pacientes diabéticos com e sem periodontite crônica severa e em pacientes

metabolicamente saudáveis com periodontite crônica severa. Além de avaliar os efeitos

da intervenção odontológica sobre o processo infeccioso periodontal no controle

metabólico de indivíduos portadores de diabetes mellitus tipo 2 utilizando o ensaio da

hemoglobina glicosilada.

Para a avaliação da influência da eliminação do processo infeccioso periodontal

sobre a porcentagem de hemoglobina glicosilada compuseram a amostra apenas os

indivíduos dos grupos DP e DSP. Entre os grupos formados por indivíduos diabéticos

não foi observada diferença estatisticamente significativa em relação ao gênero e à

idade; Borrel & Papapanou (2005), indicaram não haver associação entre gênero e

susceptibilidade à periodontite. Por outro lado, quanto ao tempo de diagnóstico, o grupo

de diabéticos portadores de periodontite apresentou média significativamente menor do

que o grupo de diabéticos periodontalmente saudáveis (8,25 e 12,75 anos,

respectivamente); Monteiro, Araújo & Gomes-Filho (2002) e Cerda et al. (1994)

observaram que quanto maior o tempo de diagnóstico, maior será a severidade da

periodontite.

Neste estudo o tratamento periodontal não cirúrgico foi realizado tanto no grupo

DP quanto no grupo DSP. Porém, nos estudos de Miller et al. (1992), Grossi et al.

(1997), Stewart et al. (2001), Kiran et al. (2005) & Prosmsudthi et al. (2005) o grupo

controle não foi submetido à terapia periodontal. A redução do processo infeccioso

inflamatório resultou na melhora dos parâmetros clínicos periodontais, conforme

descrito por Westfelt et al. (1996). A redução do quadro inflamatório foi mais intensa no

grupo DP sendo, portanto, esperada uma melhora mais acentuada dos parâmetros

clínicos periodontais e, conseqüentemente, do controle metabólico, neste grupo.

Contudo, não foi observada diferença significativa na redução da taxa de hemoglobina

glicosilada entre os grupos. É possível que a redução desta no grupo DSP tenha sido

devido à inclusão de indivíduos portadores de gengivite, ou periodontite leve, no grupo

controle (sem periodontite crônica severa). Por outro lado, em ambos os grupos foi

observada melhora significativa do controle metabólico cerca de seis meses após o

tratamento periodontal; este tratamento foi, provavelmente, o fator responsável pela

melhora observada, uma vez que os indivíduos que tiveram qualquer alteração na dieta

ou no protocolo medicamentoso, ou submeteram-se à terapia antibiótica foram

excluídos do estudo.

A associação entre a melhora no controle metabólico em indivíduos diabéticos

tipo 2, que apresentavam controle metabólico inadequado, e a diminuição do processo

inflamatório periodontal foi também observada por Stewart et al. (2001) e Kiran et al.

(2005); nestes estudos os indivíduos também foram submetidos exclusivamente à

terapia periodontal básica. Por outro lado, Promsudthi et al. (2005) não observaram

diminuição na porcentagem da hemoglobina glicosilada no grupo submetido ao mesmo

tipo de tratamento. A redução nas taxas de hemoglobina glicosilada após a redução do

processo inflamatório também foi observada por Williams & Mahan (1960), Miller et al.

(1992) e Grossi et al. (1997); contudo, nestes estudos, a terapia antimicrobiana também

pode ter tido um papel importante no efeito observado nos níveis glicêmicos de

pacientes com diabetes (tipo 1 ou tipo 2) submetidos à raspagem e alisamento

radicular.

Segundo Hotamisligil et al. (1995) e Mccall et al. (1992) a citocina pró-

inflamatória TNF-α está associada à resistência à ação da insulina. Nishimura et al.

(1998) observaram que a diminuição do processo inflamatório periodontal reduz

significativamente os níveis desta citocina. Assim, a melhora do controle metabólico

observada neste e em outros estudos foi, provavelmente, devida a diminuição da

síntese de TNF-α após a redução do processo inflamatório periodontal.

Os resultados obtidos neste trabalho ratificam a existência da associação entre a

eliminação do processo infeccioso periodontal e a melhora do controle metabólico em

indivíduos diabéticos tipo 2 descompensados metabolicamente e o papel positivo da

terapia periodontal sobre os parâmetros clínicos periodontais nesses indivíduos.

A susceptibilidade à periodontite envolve uma tríade formada por: bactéria,

hospedeiro e fatores ambientais (SEYMOUR & TAYLOR 2004). Michalowicz et al.

(1991) sugeriram que a singularidade da resposta imunológica frente ao desafio

microbiano pode ser induzida por fatores genéticos. O polimorfismo de genes de

citocinas e do HLA são fatores de risco hereditários; este pode resultar em diferentes

seqüências de resíduos de aminoácidos nas superfícies de ligação entre o HLA e o

receptor de linfócitos T, modificando o padrão de resposta imune ao desafio microbiano

(MCDEVITT 2000). Evidências sobre a influência genética na patogênese da

periodontite foram publicadas em alguns artigos na última década (MICHALOWICZ et

al. 1994; D’AIUTO et al. 2004).

A comparação entre as freqüências dos alelos HLA-DQB1, entre os três grupos e

entre diabéticos e não diabéticos, revelou diferença significante apenas na prevalência

do alelo HLA-DQB1*0301 entre os grupos DP e NDP (p= 0,040). Os indivíduos não

diabéticos portadores de periodontite crônica apresentaram uma prevalência deste alelo

cerca de três vezes maior do que a observada no grupo de diabéticos portadores de

periodontite crônica.. Não foi encontrada na literatura qualquer associação entre o

referido alelo e periodontite e entre o referido alelo e a saúde metabólica. No grupo DP

foi observada uma tendência para a maior freqüência do alelo HLA-DQB1*05 na

comparação com o grupo NDP (p=0,073). Tunes (2006) observou que este alelo pode

ser um marcador genético de proteção para o desenvolvimento da periodontite crônica,

em pacientes não diabéticos.

Emery et al. (2005) e Cerna, Novota & Kolostova (2003) observaram associação

entre o alelo HLA-DQB1*0302 ao diabetes tipo 1. Para este mesmo alelo foi abservada

associação ao diabetes tipo 2 por Haiyan et al. (2003). Reichert et al. (2002)

observaram uma maior freqüência, estatisticamente significativa, do alelo HLA-

DQB1*06 no grupo de indivíduos portadores de periodontite quando comparados aos

controles. No estudo atual, não foi observada associação deste alelo à periodontite

crônica. Talvez estes achados contraditórios sejam conseqüentes das diferentes

origens étnicas das populações estudadas. Uma vez que o estudo de Reichert et al.

(2002) avaliou indivíduos caucasianos e o presente estudo pesquisou uma população

caracterizada pelo inter-relacionamento entre povos distintos, resultando em uma etnia

geneticamente híbrida, que apresenta origem tri-racial: brancos, negros e índios,

resultando em uma grande variedade de fenótipos mestiços (AZEVEDO 1980).

No estudo atual a distribuição da freqüência alélica do HLA-DRB1 entre os

mestiços de Feira de Santana-BA revelou que no grupo DP os alelos HLA-DRB1*07,

*13 e *01 foram os mais prevalentes e os alelos HLA-DRB1*12 e *14 os menos

prevalentes; já no grupo DSP os alelos mais freqüentes foram os HLA-DRB1, *0301 e

*07, enquanto que os mais raros foram os HLA-DRB1*0303 *10 e *12. No grupo NDP

os alelos mais freqüentes foram os HLA-DRB1*07 e *13.

Mimura et al. (2004) observaram maior freqüência dos antígenos HLA-Cw4 e

DR4 entre japoneses portadores de diabetes mellitus tipo 2 e Motala et al. (2005)

concluíram que os grupos alélicos: HLA-DRB1*04, *07 e *15 e HLA-DQB1*0302, *05,

*06 e *02 foram os mais freqüentes entre os indivíduos portadores de diabetes tipo 2 e

Stein et al. (2003) observaram que o alelo HLA-DRB1*04 foi mais freqüente entre os

indivíduos diabéticos tipo 2 periodontalmente saudáveis. Neste estudo foi observado

que um dos grupos alélicos mais freqüentes, entre os diabéticos tipo 2, foi o HLA-

DRB1*07. É importante considerar que nos estudos de Mimura et al. (2004) e Motala et

al. (2005) as amostras estudadas foram formadas por indivíduos diabéticos tipo 2, de

origem japonesa e árabe respectivamente.

Stein et al. (2003) observaram associação positiva entre o HLA-DRB1*04, -Cw

*08 e -B*14 e periodontite crônica. Também Bonfil et al. (1999) concluíram que os HLA-

DRB1*0401, 0404, 0405 e 0408 são associados à periodontite rapidamente

progressiva. No presente estudo foi observada uma freqüência duas vezes maior, não

significativa, do alelo HLA-DRB1*04 no grupo de diabéticos tipo 2 sem periodontite

severa quando comparado aos DP. É importante enfatizar que a amostra deste estudo

foi composta por indivíduos portadores de periodontite crônica, que apresenta aspectos

peculiares em sua patogenia que a diferencia da patogenia observada na periodontite

agressiva.

Foi observada uma tendência dos indivíduos do grupo DP em apresentar maior

freqüência do alelo do HLA-DRB3* em comparação com a freqüência observada dentre

os NDP (p=0,079). Por outro lado, Stein et al. (2003) avaliando indivíduos caucasianos

observaram maior freqüência, não estatisticamente significativa, do HLA-DRB5* entre

os portadores de periodontite crônica e Alley et al. (1993) relataram que o HLA-DRB4*

foi significativamente mais freqüente entre os portadores de periodontite, diabéticos ou

não. Estas diferenças podem ter origem nas diferentes etnias pesquisadas.

A avaliação dos haplótipos nos três grupos de estudo não resultou em diferença

estatística significativa; apenas o grupo NDP apresentou uma tendência (p=0,081) para

a maior freqüência do haplótipo HLA-DRB1*11-DQB1*0301 quando comparado ao DP.

Os haplótipos mais freqüentes entre os diabéticos portadores de periodontite foram:

DRB1*01-DQB1*05, DRB1*13-DQB1*06 e DRB1*07-DQB1*02 e os mais freqüentes

entre aqueles diabéticos periodontalmente saudáveis foram: DRB1*07-DQB1*02 e

DRB1*0301-DQB1*05.

Motola et al. (2005), observaram que os haplótipos: DRB1*040101-DQB1*0302,

DRB1*070101-DQB1*050101, DRB1*150101-DQB1*060101 e DRB1*070101-

DQB1*020101 foram os mais freqüentes entre os diabéticos tipo 2 quando comparados

aos não diabéticos e que o haplótipo DRB1*0701-DQB1*0201 conferiu susceptibilidade

ao diabetes tipo 2; este mesmo haplótipo foi um dos mais freqüentes entre todos os

grupos avaliados neste estudo, resultado, provavelmente, conseqüente, muito mais, de

características populacionais do que propriamente de um indicativo de susceptibilidade.

Também, o haplótipo DRB1*1501-DQB1*0601 foi positivamente associado ao diabetes

tipo 2 por Motola et al. (2005); no entanto, o mesmo haplótipo, no presente estudo, foi

um dos mais freqüentes entre os não diabéticos, apresentando o dobro da freqüência

quando comparada às dos grupos de diabéticos separadamente, sendo esta diferença

não significativa.

Os resultados obtidos neste trabalho sugerem uma associação entre o alelo

HLA-DQB1*0301 e os indivíduos metabolicamente saudáveis, mestiços, portadores de

periodontite crônica severa. Estudo redesenhado, com uma amostra significativamente

maior é necessário para confirmar a menor freqüência do alelo HLA-DQB1*0301 em

diabéticos tipo 2 portadores de doença periodontal crônica severa em comparação às

freqüências observadas em indivíduos diabéticos tipo 2 sem doença periodontal crônica

severa e em não diabéticos portadores de doença periodontal crônica severa.

Os polimorfismos genéticos de citocinas e do HLA são fatores de risco

hereditários. (MICHALOWICZ et al. 1991). Tais fatores podem influenciar a história

natural da periodontite, exacerbando o processo inflamatório, induzido por um padrão

alterado na produção e secreção de citocinas pró-inflamatórias e/ou das citocinas

regulatórias, exercendo influência direta sobre o início, a regulação e a perpetuação do

processo infeccioso inflamatório periodontal. (GORE et al. 1998; BERGLUNDH et al.

2003 e D`AIUTO et al 2004). As citocinas desempenham papel central na perda óssea

alveolar e na regulação da resposta imune adaptativa, atuando na imuno-regulação,

influenciando na indução do perfil Th1/Th2 da resposta imune (GEMMELL et al. 1997).

Foi observada diferença estatisticamente significativa nas freqüências

genotípicas do TGF-

códon 10

entre os grupos DP e DSP. No grupo DP o genótipo TT

foi o mais freqüente (51,6%) e no grupo DSP o genótipo mais prevalente foi o TC

(63,3%). Não foi contudo observada diferença estatisticamente significativa em relação

aos fenótipos previstos. Em todos os grupos o fenótipo previsto de alto produtor foi o

mais prevalente seguido pelo produtor intermediário e por último o baixo produtor.

De Souza et al. (2003), ao avaliarem o polimorfismo C-509T do TGF-

β1,

observaram que o alelo T e o genótipo TT são os mais freqüentes em portadores de

periodontite crônica e, concluíram que este polimorfismo pode atuar na modulação do

processo inflamatório. No presente estudo, também foi observado que o genótipo TT,

no códon 10, pode estar associado a um processo inflamatório mais intenso, uma vez

que foi mais freqüente no grupo DP quando comparado ao DSP. No entanto, no estudo

de Holla et al. (2002) a avaliação dos polimorfismos -988 (C/A), -800 (G/A) e -509 (C/T)

e o polimorfismo (L10P) no códon 10 e o (R25P) no códon 25 não resultaram em

associação entre estes polimorfismos do gene TGF-

β1

e a severidade da periodontite.

As diferenças observadas podem ser resultantes das diferentes origens étnicas entre as

amostras.

O estudo atual não observou diferença estatisticamente significante entre os

grupos em relação às freqüência alélicas, genotípicas e do fenótipo previsto do IFN-

Em todos os grupos o genótipo AA na posição +874 foi o mais prevalente e está

associado a um fenótipo previsto de baixo produtor; o genótipo TA está associado à

produção intermediária desta citocina e o genótipo TT à alta secreção desta citocina.

As distribuições alélicas, genotípicas e dos fenótipos previstos para o

polimorfismo -174 G/C do gene IL-6 entre os grupos não resultou em diferença

estatisticamente significativa. Em todos os grupos o alelo G e o genótipo GG foram os

mais freqüentes. Também, em todos os grupos foi observada maior prevalência do

fenótipo previsto como alto produtor apesar da diferença significativa observada quando

foram comparados os quadros inflamatórios periodontais entre os grupos DP e DSP.

Trevilatto et al. (2003) observaram maior freqüência do alelo G e do genótipo GG entre

os indivíduos portadores de periodontite crônica moderada e severa; os autores

concluíram que o polimorfismo da IL-6 na posição -174 está associado à periodontite

crônica na população estudada. É importante chamar a atenção de que, apesar do

estudo atual e do trabalho dos autores supra-citados terem sido feitos no Brasil, a

população estudada difere consideravelmente; no primeiro a população é mestiça, com

predomínio da raça negra e no segundo a amostra é de caucasianos que sofreram

influencia de imigrações japonesas e européias.

Também, a avaliação do polimorfismo genético da IL-6 na posição -174, em

caucasianos, indicou que o alelo G está associado ao diabetes mellitus tipo 2 e que o

referido polimorfismo não está associado aos níveis séricos da IL-6 (ILLIG et al. 2004).

Kubaszak et al. (2003) observaram que o genótipo C/C da IL-6 na posição -174 confere

um risco duas vezes maior em desenvolver o diabetes mellitus tipo 2 a partir de um

estado de intolerância à glicose.

Em relação à IL-10 não foram observadas diferenças estatisticamente

significativas na distribuição das freqüências alélicas, genotípicas e dos fenótipos

previstos para os polimorfismos -1082 G/A, -819 C/T e -592 C/A do IL-10 entre os

grupos. A freqüência do alelo -1082A, em todos os grupos, variou de 63% a 68% e os

alelos -819 C e -592C foram os mais prevalentes. Em todos os grupos os genótipos

mais freqüentes foram o GCC/ATA e o ACC/ATA e, em relação aos fenótipos previstos,

o mais prevalente foi o associado a uma produção intermediária desta citocina.

Gonzales et al. (2002) observaram que os polimorfismos nas posições -597 e -874 não

estão associados à periodontite; por outro lado os alelos -597A e -874 T foram os mais

freqüentes, enquanto que, na população mestiça estudada, o alelo mais freqüente foi o

C, em ambas posições. Scarel-Caminaga et al. (2004) observaram diferença

estatisticamente significativa na distribuição da freqüência genotípica nas posições -819

e -592 e, o alelo C foi o mais freqüente nas posições supracitadas e nos grupos

controle e no formado por portadores de periodontite crônica.

Berglundh et al. (2003)

observaram que o alelo G (-1082) foi o mais prevalente e o genótipo GG, nesta posição,

foi significativamente mais freqüente entre os portadores de periodontite severa.

Contudo, Yamazaki et al. (2001) concluíram que a distribuição de freqüência dos

haplótipos da IL-10, na população do Japão, difere da observada entre os caucasianos;

não foi constatada a presença do alelo -1082G; porém, foi observado que o haplótipo

GCC estava presente em 68% da população.

No presente estudo, a freqüência do

haplótipo GCC foi de 56%.

Neste trabalho não foram observadas diferenças estatisticamente significativas

em relação à distribuição das freqüências para o polimorfismo -308 G/A do gene TNF-

entre os grupos avaliados. O alelo G e o genótipo GG foram os mais freqüentes em

todos os grupos. Também, Craandijk et al. (2002) sugerem que o polimorfismo do gene

TNF-

α,

na posição -308, não está associado à susceptibilidade ou à severidade da

periodontite. Por outro lado, Fassman et al. (2003) concluíram que este polimorfismo

pode ser um marcador para a periodontite crônica. Kubaszek et al. (2003) observaram

que o polimorfismo (G-308A) do gene TNF-

é um preditor para a conversão do estado

de intolerância à glicose para o diabetes mellitus tipo 2 e, semelhantemente aos dados

obtidos no presente estudo, o genótipo GG foi o mais freqüente (74%), seguido dos

genótipos GA (25%) e AA (1%); sendo que este último esteve ausente entre os

mestiços avaliados.

Assim, este estudo mostrou que o alelo HLA-DQB1*0301 pode ser um marcador

genético de proteção para o desenvolvimento do diabetes mellitus tipo 2 na população

de mestiços de Salvador-Bahia-Brasil ; mostrou, ainda, que, há uma associação positiva

entre a periodontite crônica severa em indivíduos diabéticos tipo 2 e o genótipo GG do

TGF-

códon 10

, e que os polimorfismos IFN-

+874T/A

, IL-6

-174G/C

, TNF-

−

308 G/A

, TGF-

códon 25

e IL-10

-1082G/A,-819C/T,-592C/A

não estão associados a esta doença. Também foi

confirmado que o tratamento periodontal não cirúrgico está associado à melhora nos

parâmetros clínicos periodontais e à redução da porcentagem de hemoglobina

glicosilada.

7 Conclusões

Os resultados obtidos neste estudo sugerem que:

1. A melhora dos parâmetros clínicos periodontais em indivíduos portadores de

diabetes mellitus tipo 2 parece ser uma conseqüência do tratamento periodontal

não cirúrgico.

2. A redução na porcentagem da hemoglobina glicosilada em portadores de

diabetes mellitus tipo 2 é provavelmente resultado do controle do processo

infeccioso inflamatório periodontal.

3. É necessário o aumento da amostra para confirmar a menor freqüência do alelo

HLA-DQB1*0301 em indivíduos diabéticos portadores de doença periodontal

crônica severa em comparação com os diabéticos sem doença periodontal

crônica severa e com os não diabéticos portadores de doença periodontal

crônica severa.

4. O genótipo TT do TGF-

β1

códon 10

é um possível marcador de predisposição ao

desenvolvimento da periodontite crônica severa em mestiços diabéticos.

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102

APÊNDICE

Distribuição da freqüência Haplotípica do HLA DRB1/DQB1.

HAPLÓTIPOS/ GRUPOS DDP DSDP NDDP D

DRB1*01/DQBI*05 7 3 4 10

DRB1*13/DQBI*06 7 4 4 11

DRB1*09/DQBI*02 1 2 0 3

DRB1*07/DQBI*02 7 7 9 14

DRB1*11/DQBI*0301 2 3 7 5

DRB1*11/DQBI*06 2 2 1 4

DRB1*10/DQBI*05 3 1 2 4

DRB1*0301/DQBI*02 5 7 4 12

DRB1*04/DQBI*0302 2 5 3 7

DRB1*04/DQBI*04 1 1 0 2

DRB1*08/DQBI*04 2 2 3 4

DRB1*11/DQBI*02 1 0 0 1

DRB1*12/DQBI*0301 1 0 0 1

DRB1*15/DQBI*06 4 4 8 8

DRB1*15/DQBI*05 2 0 0 2

DRB1*16/DQBI*05 1 2 0 3

DRB1*16/DQBI*07 0 1 1 1

DRB1*0302/DQBI*04 0 3 0 3

DRB1*13/DQBI*0301 0 0 3 0

DRB1*13/DQBI*02 1 0 1 1

DRB1*0302/DQBI*05 1 0 0 1

DRB1*0302/DQBI*02 1 0 0 1

DRB1*13/DQBI*04 1 0 0 1

DRB1*09/DQBI*04 1 0 0 1

DRB1*14/DQBI*0301 1 1 0 2

DRB1*11/DQBI*05 1 0 0 1

DRB1*07/DQBI*0303 1 1 1 2

DRB1*14/DQBI*05 0 2 0 2

DRB1*12/DQBI*05 0 1 0 1

DRB1*08/DQBI*07 0 2 1 2

DRB1*09 /DQBI*0303 0 1 1 1

DRB1*04/DQBI*0301 0 1 0 1

DRB1*08/DQBI*06 0 1 0 1

DRB1*13/DQBI*05 0 1 2 1

DRB1*0301/DQBI*0303 0 1 0 1

DRB1*08/DQBI*05 0 0 1 0

DRB1*07/DQBI*0303 1 0 0 1

103

Comparação entre grupos da freqüência Haplotípica do HLA DRB1/DQB1.

HAPLÓTIPOS/ GRUPOS

DDPXDSDP DDPXNDDP DSDPXNDDP

DRB1*01/DQBI*05 0,301 0,508 1,000

DRB1*13/DQBI*06 0,508 0,508 1,000

DRB1*09/DQBI*02 0,612 1,000 0,492

DRB1*07/DQBI*02 0,944 0,510 0,559

DRB1*11/DQBI*0301 0,671 0,081 0,299

DRB1*11/DQBI*06 1,000 1,000 1,000

DRB1*10/DQBI*05 0,612 1,000 1,000

DRB1*0301/DQBI*02 0,479 1,000 0,506

DRB1*04/DQBI*0303 0,255 0,671 0,706

DRB1*04/DQBI*04 1,000 1,000 1,000

DRB1*08/DQBI*04 1,000 0,671 1,000

DRB1*11/DQBI*02 1,000 1,000 1,000

DRB1*12/DQBI*0301 1,000 1,000 1,000

DRB1*15/DQBI*06 1,000 0,211 0,333

DRB1*15/DQBI*05 0,492 0,492 1,000

DRB1*16/DQBI*05 0,612 1,000 0,492

DRB1*16/DQBI*0301 0,492 0,492 1,000

DRB1*0302/DQBI*04 0,113 1,000 0,237

DRB1*13/DQBI*0301 1,000 0,113 0,237

DRB1*13/DQBI*02 1,000 1,000 1,000

DRB1*0302/DQBI*05 1,000 1,000 1,000

DRB1*0302/DQBI*02 1,000 1,000 1,000

DRB1*13/DQBI*04 1,000 1,000 1,000

DRB1*09/DQBI*04 1,000 1,000 1,000

DRB1*14/DQBI*0301 1,000 1,000 1,000

DRB1*11/DQBI*05 1,000 1,000 1,000

DRB1*07/DQBI*0303 1,000 1,000 1,000

DRB1*14/DQBI*05 0,238 1,000 0,492

DRB1*12/DQBI*05 0,492 1,000 1,000

DRB1*08/DQBI*0301 0,238 0,492 1,000

DRB1*09 /DQBI*0303 0,492 0,492 1,000

DRB1*04/DQBI*0301 0,492 1,000 1,000

DRB1*08/DQBI*06 0,492 1,000 1,000

DRB1*13/DQBI*05 0,492 0,238 1,000

DRB1*0301/DQBI*0303 0,492 1,000 1,000

DRB1*08/DQBI*05 1,000 0,492 1,000

DRB1*07/DQBI*0302 1,000 1,000 1,000

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