( PDF ) Isolamento de bactérias produtoras de biossurfactantes ramnolipídios e polihidroxialcanoatos e avaliação da relação metabólica no processo de síntese

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TATIANA STRELEC

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE

BIOSSURFACTANTES RAMNOLIPÍDIOS E

POLIHIDROXIALCANOATOS E AVALIAÇÃO DA RELAÇÃO

METABÓLICA NO PROCESSO DE SÍNTESE

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação

Interunidades em Biotecnologia USP-IPT-

I.Butantan da Universidade de São Paulo,

para obtenção do Título de Mestre em

Biotecnologia.

Área de Concentração:

Biotecnologia

Orientador:

Prof. Dr. José Gregório Cabrera Gomez

SÃO PAULO

2006

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iii

A minha mãe, um exemplo de vida e amor.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiro a Deus, que sempre me iluminou e me deu forças durante toda

esta caminhada.

À minha mãe pôr acreditar no meu trabalho e sempre me incentivar.

Às minhas irmãs e familiares pela companhia, amizade e incentivo.

Ao meu orientador Dr. José Gregório que desde a graduação depositou confiança

no meu trabalho e dispensou sua paciência e dedicação para a realização do

mesmo.

À Dra. Luiziana Ferreira da Silva, pela indispensável e generosa ajuda e apoio.

Ao Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo (IPT) pelo suporte

técnico, físico e financeiro.

A todos os técnicos e auxiliares do Laboratório de Microbiologia e Fermentações

Industriais pelo grande auxílio e paciência na realização das minhas atividades.

À Maria das Graças, secretária do Agrupamento de Biotecnologia pela ajuda e

apoio.

Aos pesquisadores e amigos do Agrupamento de Biotecnologia.

Às minhas amigas Juliana Carvalho, Cristiane Ottoni, Luana Rissi, Taís Machado,

Thaíz Rizzi e Fernanda Matias, pelas alegrias, pelo convívio e pela amizade.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste.

“Nossa vida é um eterno escolher e todos os

caminhos levam à algum lugar. A escolha é de

cada um, porém as consequências são de todos.

Seja significativo para si mesmo e para todos.”

André Luiz Raphael

INDICE

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA 1

2. REVISÃO DA LITERATURA 3

2.1. Biodiversidade 3

2.2. Pseudomonas sp 4

2.3. Polihidroxialcanoatos 5

2.4. Surfactantes 15

2.5. Biossurfactantes 16

2.5.1. Definição 16

2.5.2. Aspectos Econômicos 17

2.5.3. Aplicações 19

2.6. Ramnolipídios 20

2.6.1. Aplicações dos Ramnolipídios 22

2.6.2. Produção de Ramnolipídios 23

2.6.3. Metabolismo e Genética da Biossíntese de ramnolipídios 25

2.6.4. Inter-Relações Metabólicas da produção de ramnolipídios e PHA 32

2.6.5. Quorum-Sensing 34

3. OBJETIVO 36

4. MATERIAIS E MÉTODOS 38

vii

4.1. Meios de Cultura 38

4.1.1. Caldo e Agar Nutriente 38

4.1.2. Agar Sabouraud Dextrose Agar 38

4.1.3. Agar Oligotrófico 39

4.1.3.1. Extrato de Solo 39

4.1.3.2. Composição do Meio Agar Oligotrófico 39

4.2. PIA ( Pseudomonas Isolation Agar) 40

4.3. Agar Cetrimide 40

4.4. PPSW 41

4.5. Meio Mineral 41

4.6. Esterilização 42

4.7. Isolamento de Novas Linhagens Bacterianas 42

4.7.1. Isolamento Direto 44

4.7.2. Enriquecimento do Meio de Cultivo 44

4.7.2.2. Seleção de Linhagens Produtoras de PHA 47

4.7.2.3. Caracterização de Linhagens Bacterianas Isoladas 48

4.7.2.3.1. Morfologia de Colônias 48

4.7.2.3.2. Teste de Catalase 49

4.7.2.3.3. Teste de Oxidase 49

viii

4.7.2.3.4. Coloração de Gram 49

4.7.2.3.5. Crescimento e Fluorescência em PIA e Agar Cetrimide 50

4.7.2.3.6. Biocódigo 50

4.8. Preservação de Linhagens Bacterianas 51

4.9. Cultivo de Microrganismos 52

4.9.1. Experimentos em Agitador Rotativo 52

4.9.2. Determinação de Biomassa 53

4.9.3. Determinação de PHA 53

4.9.4. Determinação de HA 54

4.9.5. Dosagem de Ramnose 54

4.9.6. Análise de Carboidratos 56

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 57

5.1. Isolamento e Caracterização de Linhagens Bacterianas 58

5.2. Avaliação da produção de Biossurfactantes e PHA 61

5.3. Produção de PHA 61

5.4. Produção de Ramnolipídios 66

5.5. Inter-Relação na síntese de PHA e ramnolipídios 73

5.6. Produção de L-ramnosil-L-ramnose?

5.7. Obtenção de Mutante afetado no metabolismo de biossíntese de PHA 79

6. CONCLUSÕES 82

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 84

LISTA DE ABREVIATURAS

3HD – 3- hidroxidecanoato

3HDd – 3-hidroxidodecanoato

3HHX- 3- hidroxihexanoato

3HO – 3-hidroxioctanoato

ABS – absorbância

AN - Agar Nutriente

CN – Caldo Nutriente

F – Frutose

G – Glicose

g - gramas

g/L – gramas por litro

mL – microlitros

mL- mililitros

MSC - Massa seca celular

NC – não cresceu

ND – não determinado

PHA – polihidroxialcanoatos

PHA

MCL

- polihidroxialcanoatos de cadeia média

PIA – Pseudomonas isolation agar

RHL- ramnolipídios

rpm – rotações por minuto

FIGURAS

PAG.

Figura 1. Grânulos de PHAs em Bactérias

Figura 2. Fórmula Genérica de Monômeros detectados em PHA

Figura 3. Modelo Metabólico genérico da Síntese de PHA

Figura 4. Síntese de PHA

MCL

Figura 5a. Monorramnolipídio

Figura 5b. Dirramnolipídio

Figura 6. Modelo Metabólico para a síntese de HAA e diferentes

ramnolipídios

Figura 7. Síntese de dTDP-L-ramnose

Figura 8. Quorum-Sensing em Pseudomonas aeruginosa

Figura 9. Metabolismo para a síntese de PHA e ramnolipídios

Figura 10. Parque Natural Serra do Itapety

Figura 11. Técnica de Isolamento e Enriquecimento

Figura 12a. Linhagens produtoras de ramnolipídios em meio PPSW

Figura 12b. Linhagens produtoras de ramnolipídios em meio PPSW

Figura 13. Experimentos em agitador Rotativo e Análises Realizadas

Figura 14. Curva Padrão de Ramnose

Figura 15. Variação na Composição de PHA produzidos a partir de

carboidratos ou óleo de soja

Figura 16. Variação na Composição de 3HÁ presentes em ramnolipídios

produzidos a partir de carboidratos ou óleo de soja

Figura 17. Relação entre o teor de PHA

MCL

acumulado e a quantidade de

3HÁ detectado no sobrenadante

Figura 18. Relação entre o teor de PHA

MCL

acumulado e a quantidade de

ramnose detectada no sobrenadante

Figura 19. Relação entre a quantidade de 3HÁ e ramnose no

sobrenadante dos cultivos

Figura 20. Análise do sobrenadante do cultivo da linhagem IPT 648 após

tratamento ácido

Figura 21. Análise do sobrenante do cultivo da linhagem IPT 648 sem

tratamento ácido

Figura 22. Cultivo de IPT 634 e seu mutante 15

A em meio mineral pobre

em nitrogênio contendo excesso de carboidratos

Figura 23. Cultivo de IPT 634 e seu mutante 15 A em meio mineral pobre

em nitrogênio contendo excesso de carboidratos e corante Nile Red

Figura 24. Cultivo de Mutante 15

A em meio PPSW

Figura 25. Cultivo da linhagem selvagem IPT 634 em meio PPSW

xii

TABELAS

Pag.

Tabela 1. Linhagens isoladas do Parque Natural Municipal da Serra do Itapety

Tabela 2. Caracterização de Linhagens Bacterianas Produtoras de PHA e

Biossurfactantes

Tabela 3 . Produção de PHA por Linhagens Bacterianas Isoladas e Controle

(P.aeruginosa IPT 719)

Tabela 4. Produção de ramnolipídios por Linhagens Bacterianas Isoladas e

Controle (P.aeruginosa IPT 719)

Tabela 5. Produção de Polihidroxialcanoatos pela Linhagem IPT 634 70

Tabela 6. Produção de Ramnolipídios pela Linhagem IPT 634

Resumo

xiii

RESUMO

Ramnolipídios (RHL) e polihidroxialcanoatos de cadeia média (PHA

MCL

) são

produzidos por Pseudomonas. PHA

MCL

são elastômeros termoplásticos e RHL

são surfactantes. Ambos são biodegradáveis e podem ser produzidos a partir de

matérias-primas renováveis, representando tecnologias sustentáveis seus

processos de produção. RHL e PHA

MCL

apresentam em sua composição 3-

hidroxidecanato (3HD) gerado a partir do metabolismo de ácidos graxos. Assim, a

síntese destes produtos está metabolicamente relacionada. Processos com o

objetivo de sintetizar um desses materiais pode ser menos eficiente devido à

síntese do outro produto pela bactéria. Dentre 293 bactérias isoladas de solo de

Mata Atlântica, 44 produziram biossurfactante aniônico, 70 PHA

MCL

, e 31

apresentaram produção simultânea tanto de ramnolipídios quanto de PHA

MCL

. A

quantidade de PHA

MCL

acumulada pelas linhagens isoladas atingiu valores da

ordem de 20-30% da massa seca celular. A concentração de RHL produzida

atingiu 1 g/L. A composição de RHL e PHA

MCL

foi diferente dependendo da fonte

de carbono ou da linhagem bacteriana utilizada, indicando que materiais com

diferentes composições e propriedades podem ser produzidos.

Abstract

xiv

ABSTRACT

Rhamnolipids (RHL) and medium-chain-lenght polyhydroxyalkanoates (PHA

MCL

)

are produced by Pseudomonas. PHAmcl are thermoplastic elastomers and RHL

are surfactants. Both are biodegradbel and can be synthesized from renewable

raw materials, so processes for their production represent sustainable

technologies. RHL and PHA

MC L

present in their composition 3-hydroxydecanoate

(3HD) generated from the fatty acid metabolism. Thus, the synthesis of these

products are metabolically related. Processes aiming at to synthesyze one of these

materials can be less efficient due to the synthesis of the other product by the

bacteria. Out of 293 bacteria isolated from a rain forest soil sample, 44 have ability

to produce biosurfactant, 70 have been detected as PHA producers, and 31

produced both. The accumulated PHA

MC L

reached 20-30% of the cellular dry

mass. The amount of RHL produced reached about 1 g/L. The RHL and PHA

MC L

composition varied depending on the carbon source supplied and bacterial strain

used, indicating that materials with different compositions and properties could be

obtained.

Introdução e Justificativa

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

Bactérias do gênero Pseudomonas acumulam, na forma de grânulos

intracelulares, polihidroxialcanoatos contendo monômeros de cadeia média

(PHA

MCL

). Estes polímeros têm despertado interesse industrial pois são

elastômeros termoplásticos biodegradáveis. São constituídos por longas cadeias

poliméricas (>1000 monômeros) contendo em geral 3-hidroxidecanoato (3HD) e 3-

hidroxioctanoato (3HO), entre outros constituintes.

Ramnolipídios são surfactantes produzidos por Pseudomonas aeruginosa e

outras Pseudomonas que também têm despertado interesse para diversas

aplicações industriais. Os principais componentes dos ramnolipídios consistem

principalmente de duas subunidades 3HD interligadas e que também se ligam a

uma ou duas subunidades de ramnose.

Uma vez que 3HD é um constituinte comum tanto em ramnolipídios como

em PHA

MCL

, devem existir inter-relações metabólicas na síntese destes produtos.

Por outro lado, processos com o objetivo de sintetizar cada um destes materiais

podem ser menos eficientes devido à síntese do outro. Assim, o objetivo deste

trabalho foi isolar bactérias capazes de produzir ramnolipídios e

polihidroxialcanoatos, cultivá-las sob condição de biossíntese desses produtos,

avaliando-se as inter-relações metabólicas no processo de síntese destes

compostos.

Vale destacar que tanto PHA

MCL

como ramnolipídios são produtos

apontados como potenciais substitutos de produtos de origem petroquímica. O

Introdução e Justificativa

primeiro atenderia requisitos como elastômero termoplástico e o segundo como

surfactante. PHA

MCL

e ramnolipídios são considerados menos agressivos ao meio

ambiente pois são biodegradáveis e menos tóxicos. Além disso, estes produtos

podem ser sintetizados a partir de matérias-primas renováveis e, deste modo,

processos de produção desses materiais representam tecnologias sustentáveis,

que permitem manter os benefícios advindos de produtos como plásticos ou

surfactantes.

Outro aspecto importante é que dentro do gênero Pseudomonas são

encontrados patógenos oportunistas (P.aeruginosa), assim, uma melhor

compreensão das vias metabólicas de síntese destes produtos poderá permitir, no

futuro, a clonagem de genes relacionados com a sua síntese e a geração destes

produtos em hospedeiros heterólogos.

Introdução e Justificativa

Revisão da Literatura

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Biodiversidade

A contribuição que microrganismos têm dado para o desenvolvimento de

biotecnologias abrange diversas aplicações, como: a produção de compostos

químicos (etanol, ácido acético, biogás, plásticos biodegradáveis, bioconversões

na indústria de alimentos e farmacêutica, etc); produtos para agricultura

(bioinseticidas, inoculantes agrícolas, etc), enzimas para diversos setores

industriais, com destaque para a indústria de detergentes e alimentícia; compostos

de interesse médico e veterinário (antibióticos, antitumorais, hipocolesterolêmicos,

imunossupressores, inibidores enzimáticos, antiparasitários, etc), apenas citando

alguns exemplos (Barnum, 1998).

Análises moleculares da diversidade de microrganismos presentes no

ambiente têm trazido uma importante informação. Grande parte da diversidade

microbiana, sobretudo de arqueobactérias e eubactérias, nunca foi isolada e

cultivada em laboratório pelas técnicas microbiológicas convencionais. Este é um

dos principais fatos que fazem acreditar que importantes produtos ainda provirão

da bioprospecção de microrganismos (Bull et al., 2000).

A base para o desenvolvimento biotecnológico é o material biológico, que

após ser adequadamente recuperado e avaliado para a presença de atributos

desejáveis culmina com o desenvolvimento de um processo ou produto comercial

Revisão da Literatura

(Bull et al., 2000). O material biológico ou parte deste pode ainda servir de base

para desenvolvimentos adicionais utilizando técnicas de melhoramento genético,

clonagem, recombinação e expressão heteróloga, ou ainda, no estabelecimento

da estrutura química da substância de interesse produzida com vistas a sua

produção em sistemas economicamente viáveis. Desta forma, a recuperação e

caracterização da biodiversidade existente podem garantir uma base ampla,

fornecendo subsídios para o desenvolvimento de biotecnologias. O Brasil, sendo

considerado um dos doze países com megadiversidade, que juntos concentram

70% da diversidade biológica do planeta (ComCiência, 2001), poderá garantir uma

posição de vanguarda no desenvolvimento dessas tecnologias dependendo,

portanto, de investimentos nessa área.

2.2. Pseudomonas sp.

Diversas espécies de Pseudomonas sp. podem ser isoladas de diferentes

habitats (água, solo, plantas) e devido a sua ampla distribuição no ambiente e

facilidade de cultivo, este gênero constitui-se em um dos grupos bacterianos

melhor estudado (Aagot et al., 2001). Os papéis desempenhados por

Pseudomonas sp. no ambiente incluem a biodegradação de compostos naturais e

xenobióticos (Galli et al., 1996), promotores de crescimento de plantas (O’Sullivan

& O’Gara, 1992) e patógenos de plantas (Schroth et al., 1991). Pseudomonas sp.

Revisão da Literatura

é ainda um gênero de grande importância em processos industriais envolvendo

biotransformações (Wubbolts & Witholt, 1998).

No gênero Pseudomonas encontramos P. aeruginosa, uma bactéria Gram-

negativa capaz de causar infecções em indivíduos imunocomprometidos, com

fibrose cística por exemplo (Govan & Deretic, 1996). Esse organismo possui a

capacidade de expressar diversos fatores de virulência que incluem toxinas,

proteases, alginato, lipopolissacarídeos (LPS), piocianina e ramnolipídios

(Stanislavsky & Lam, 1997; Rehm et al., 2001).

Esta bactéria é um patógeno humano oportunista que pode causar sérias

infecções (Pelczar et al.,1993). Estudo recente em hospital universitário brasileiro

indicou P. aeruginosa como o segundo agente causador de infecções nosocomiais

(De Moraes et al., 2000).

2.3. Polihidroxialcanoatos

Polihidroxialcanoatos (PHA) são polímeros que podem ser acumulados por

diversas bactérias em grande quantidade sem afetar a pressão osmótica das

células (Preusting, 1992). Estes polímeros são acumulados na forma de grânulos

intracelulares (Figura 1), que podem representar até cerca de 80% da massa seca

celular (Anderson & Dawes, 1990). A função mais freqüentemente atribuída a

estes grânulos é a de reserva de carbono, energia e equivalentes redutores.

Assim, a síntese de PHA normalmente ocorre quando há excesso de fonte de

Revisão da Literatura

carbono disponível e limitação de pelo menos um nutriente essencial à

multiplicação das células bacterianas (Brandl et al., 1990). Por outro lado, quando

há limitação de carbono ou energia, mas não de outros nutrientes, PHA podem ser

reutilizados para suprir essa necessidade.

Figura 1 . Grânulos de PHAs em bactérias

Uma fórmula genérica para os diversos monômeros já observados como

constituintes de PHA é apresentada na Figura 2. Cerca de 150 monômeros

diferentes já foram identificados como constituintes de PHA produzidos por

bactérias a partir de diversas fontes de carbono (Rehm, 2003). Os monômeros

constituintes de PHA são divididos em dois grandes grupos (Steinbüchel &

Valentin, 1995): (i) monômeros de cadeia curta (HA

SCL

– do inglês “HydroxyAcids

of Short-Chain-Length”), que compreendem monômeros contendo de 3 a 5 átomos

de carbono na cadeia principal, e (ii) monômeros de cadeia média (HA

MCL

– do

inglês “HydroxyAcids of Medium-Chain-Length”), compreendendo monômeros

contendo de 6 a 16 átomos de carbono na cadeia principal. Esta classificação é

bastante útil, pois os PHA produzidos podem ser classificados como (i) PHA

SCL

que contêm monômeros de cadeia curta em sua composição e (ii) PHA

MCL

, que

contêm monômeros de cadeia média. Enquanto PHA

SCL

são encontrados em

Revisão da Literatura

bactérias pertencentes aos mais diversos grupos taxonômicos (Steinbüchel,

1991), PHA

MCL

só foram detectados em Pseudomonas do grupo I de homologia do

RNA ribossomal (Pseudomonas sensu stricto) (Huisman et al., 1989). Uma das

características importantes de Pseudomonas do grupo I de homologia do RNAr é

sua incapacidade de produzir poli-3-hidroxibutirato (P3HB), ou seja, são incapazes

de sintetizar PHA

SCL

Figura 2 . Fórmula genérica de monômeros detectados em PHA

PHA são ainda materiais que apresentam propriedades semelhantes a

termoplásticos despertando grande interesse industrial. As propriedades de PHA

permitem a obtenção desde materiais rígidos, como o P3HB, a materiais flexíveis,

como PHA

MCL

, podendo também se apresentar como materiais viscosos e

aderentes, como PHA

MCL

contendo uma grande fração de monômeros

insaturados. Em 1990, foi lançado o primeiro produto comercial a partir de PHA

(um copolímero de 3HB e 3-hidroxivalerato - P3HB-co-3HV): uma garrafa

biodegradável para xampu de uma companhia alemã de cosméticos (Preusting,

Revisão da Literatura

1992). Desde então, diversas outras aplicações em pequena escala têm sido

desenvolvidas para P3HB ou P3HB-co-3HV. Embora ainda não disponíveis

comercialmente, uma série de aplicações potenciais têm sido vislumbradas para

PHA

MCL

, tais como: (a) filmes de recobrimento para papel, papelão, etc. (De

Koning et al., 1997a); (b) fonte de monômeros quirálicos para produtos

farmacêuticos (Witholt & Kessler, 1999; Ren et al., 2005); (c) componentes de

tintas a base de água (Van Der Walle et al.,1999, Buisman et al., 2000); (d)

suportes para engenharia de tecidos (Williams et al., 1999) e (e) componentes em

formulações de adesivos (Babu et al., 1997).

Embora um grande número de monômeros diferentes já tenha sido

observado como constituintes de PHA, convém destacar que a síntese e

incorporação destes monômeros dependem do fornecimento de um substrato

adequado, que possa ser convertido no hidroxiacil-CoA desejado através das vias

metabólicas existentes na célula bacteriana. Além disso, é necessário que a célula

bacteriana contenha uma PHA sintase capaz de incorporar ao poliéster formado, o

hidroxiacil-CoA gerado (Figura 3). Assim, tanto a especificidade das vias

metabólicas geradoras do hidroxiacil-CoA como da PHA sintase, podem impedir

ou favorecer a combinação de certos monômeros em uma mesma cadeia

polimérica ou, ainda, restringir a quantidade de um determinado monômero que

pode ser incorporada ao PHA (Gomez & Bueno Netto, 2001).

PHA sintases são as enzimas chaves no processo de síntese de PHA e

catalisam a ligação dos monômeros por transesterificação (Witholt & Kessler,

1999). PHA sintases têm sido agrupadas em quatro classes (Steinbüchel &

Revisão da Literatura

Valentin, 1995; Rehm, 2003). PHA sintases da classe I são encontradas em

diversas bactérias, consistem de um único polipeptídio e apresentam

especificidade por HA

SCL,

raramente

incorporando HA

MCL

. PHA sintases da classe

II são encontradas em Pseudomonas, constituem-se de um único polipeptídio e

apresentam especificidade por HA

MCL,

dificilmente incorporando HA

SCL

. A classe III

de PHA sintases compreende enzimas com especificidade para HA

SCL

constituídas de duas subunidades polipeptídicas. Uma exceção a esta

classificação é a PHA sintase de Thiocapsa pfennigii, que, embora seja

semelhante a PHA sintases da classe III, é caracterizada pela capacidade de

incorporar um amplo espectro de HAs

SCL

e HAs

MCL

(Liebergesell et al., 1993;

Valentin et al., 1994; Valentin et al., 1996). A quarta classe de PHA sintases é

encontrada em bactérias do gênero Bacillus sp e também são constituídas de

duas subunidades protéicas como as de classe III, apresentando, entretanto, uma

das subunidades muito menor (McCool & Cannon, 2001).

Revisão da Literatura

Figura 3 . Modelo metabólico genérico para a síntese de PHA (Gomez & Bueno

Netto, 2001).

A capacidade de sintetizar PHA

MCL

por Pseudomonas está claramente

relacionada com a classe de PHA sintases presente nestes organismos. Dos

cerca de 150 monômeros detectados em PHA, mais que 90% estão presentes

apenas em PHA

MCL

. Este fato é o resultado da inespecificidade destas PHA

sintases, bem como da grande versatilidade metabólica de Pseudomonas

(Ornston, 1971; Inouye, 1998) que permite a síntese de diversos monômeros a

partir de diferentes substratos metabolizados. A simples clonagem e expressão de

genes da PHA sintase de Pseudomonas em outros microrganismos não permite a

síntese de quantidades expressivas de PHA

MCL

. Em geral, somente linhagens

bacterianas afetadas no metabolismo de ácidos graxos conseguem sintetizar

estes polímeros em quantidades expressivas (Langenbach et al., 1997), ou então,

Revisão da Literatura

é necessária a expressão de outros genes em conjunto (Klinke et al., 1999), ou

ainda, inibidores específicos da degradação de ácidos graxos (Qi et al., 1998). Isto

reflete o fato que a capacidade de sintetizar PHA

MCL

não é o resultado exclusivo

da presença de PHA sintases do tipo II em Pseudomonas, mas também depende

de vias metabólicas que conseguem transferir eficientemente intermediários do

metabolismo de ácidos graxos para a síntese de PHA (Rehm et al., 2001).

A síntese de PHA

MCL

é dividida em dois grandes tipos com base nos

substratos fornecidos. O primeiro tipo é conhecido como síntese a partir de

substratos relacionados e é assim chamada, pois a composição do polímero

produzido claramente reflete ou está estruturalmente relacionada ao substrato

fornecido. A síntese a partir de substratos relacionados (hidrocarbonetos, álcoois,

ácidos carboxílicos) é a que permite a incorporação dos mais diversos monômeros

ao polímero, uma vez que a composição do mesmo pode ser amplamente

modificada dependendo do substrato fornecido. O outro tipo é conhecido como

síntese a partir de substratos não relacionados. Neste caso, diversas

Pseudomonas, quando são cultivadas em presença de glicose, frutose, gliconato,

acetato, glicerol, etc., ou seja, substratos que são metabolisados a acetil-CoA,

produzem um polímero contendo 3-hidroxidecanoato (3HD) como principal

constituinte, além de 3-hidroxioctanoato (3HO), 3-hidroxihexanoato (3HHx), 3-

hidroxidodecanoato (3HDD), 3-hidroxitetradecanoato (3HTD), 3-hidroxi-5-cis-

dodecenoato (3HDD∆

) e 3-hidroxi-7-cis-tetradecenoato (3HTD∆

) como

constituintes secundários (Huijberts et al., 1992).

Revisão da Literatura

Na presença do ácido acrílico, um inibidor específico da β-oxidação de

ácidos graxos, não foi observada a produção de PHA

MCL

por Pseudomonas putida

a partir de octanoato, enquanto a produção de PHA

MCL

a partir de glicose não foi

afetada (Huijberts et al., 1994). Uma vez que o ácido acrílico é um inibidor da β-

oxidação de ácidos graxos, estes resultados demonstram claramente o

envolvimento desta via na síntese de monômeros constituintes de PHA

MCL

a partir

de substratos relacionados.

Um importante aspecto deve ser ressaltado: os 3-hidroxialcanoil-CoA na β-

oxidação apresentam-se na configuração S, enquanto os 3-hidroxialcanoatos

(3HAs) encontrados em PHA apresentam-se na configuração R. Assim, outra(s)

enzima(s) deve(m) realizar a ligação entre a β-oxidação de ácidos graxos e a

síntese de PHA (Lageveen et al., 1988). Três alternativas metabólicas diferentes

têm sido propostas para tal conexão: (i) ação de uma epimerase que catalisaria a

conversão de (S)-3-hidroxialcanoil-CoA a (R)-3-hidroxialcanoil-CoA, (ii) ação de

uma enoil-CoA hidratase (R)-específica que catalisaria a conversão de 2-alcenoil-

CoA a (R)-3-hidroxialcanoil-CoA ou (iii) uma 3-cetoacil-CoA redutase NADPH

dependente que catalisaria a conversão de 3-cetoalcanoil-CoA a (R)-3-

hidroxialcanoil-CoA. Evidências para cada uma destas alternativas metabólicas

têm sido apresentadas (Kraak et al., 1997b, Tsuge et al., 2000, Taguchi et al.,

1999, Ren et al., 2000). Além das evidências individuais para a existência de cada

uma das alternativas metabólicas ligando a β-oxidação de ácidos graxos à

Revisão da Literatura

biossíntese de PHA

MCL

, existem indícios de que estas vias podem coexistir (Ren et

al., 1998).

Várias Pseudomonas pertencentes ao grupo I de homologia do RNA

ribossomal são capazes de acumular PHA contendo o ácido 3-hidroxidecanóico

(3HD) como principal constituinte a partir de gliconato (Haywood et al., 1990;

Timm & Steinbüchel, 1990). Já em 1990, foi proposta uma relação entre a síntese

de PHA contendo 3HD como principal constituinte e o metabolismo de ácidos

graxos (Haywood et al., 1990; Timm & Steinbüchel, 1990). PHA isolados de P.

putida cultivada em glicose, frutose e glicerol apresentaram uma composição

muito semelhante. Além dos 3-hidroxiácidos saturados detectados anteriormente

(Haywood et al., 1990; Timm & Steinbüchel, 1990), Huijberts et al., (1992)

observaram dois novos constituintes insaturados no PHA produzido por P. putida:

3-hidroxi-5-cis-dodecenoato (3HDD∆

) e 3-hidroxi-7-cis-tetradecenoato (3HTD∆

Assim, ficou claro que a estrutura química dos constituintes saturados e

insaturados é idêntica a intermediários observados na via de biossíntese de ácidos

graxos. Cerulenina, um inibidor específico da via de biossíntese de ácidos graxos,

foi testada sob condições de acúmulo de PHA em P. putida. Na presença de

cerulenina, não foi produzido polímero a partir de glicose, enquanto a partir de

octanoato o polímero foi produzido, embora em quantidade menor que aquela

obtida na ausência do inibidor (Huijberts et al., 1994). Estes resultados mais uma

vez confirmam que, quando carboidratos são supridos, os 3-hidroxiacil-CoA são

derivados direta e exclusivamente a partir da via de biossíntese de ácidos graxos

(Figura 4).

Revisão da Literatura

Figura 4 . Síntese de PHA

MCL

Deve ser notado que na via de biossíntese de ácidos graxos a coenzima

transportadora dos grupos acil é a ACP ("acyl carrier protein"), enquanto o

substrato para a enzima PHA sintase apresenta-se ligado à Coenzima A (CoA).

Rehm et al. (1998) demonstraram a existência em P. putida do gene phaG que

codifica para uma 3-hidroxiacil-ACP-CoA transacilase. A proteína PhaG

estabelece a ligação entre a biossíntese de ácidos graxos e a síntese de PHA

MCL

em diversas Pseudomonas (Hoffmann et al., 2000a; Hoffmann et al., 2000b;

Fiedler et al., 2000; Hoffmann et al., 2002).

Revisão da Literatura

2.4. Surfactantes

Surfactantes são moléculas anfifílicas que consistem de uma porção

hidrofílica e uma porção hidrofóbica. A fração apolar, hidrofóbica, é

freqüentemente uma cadeia de hidrocarbonetos, e a fração polar se apresenta

com diferentes componentes (Georgiou et al., 1992).

Estes compostos constituem uma importante classe de produtos químicos

largamente utilizados na indústria moderna, com aplicação na indústria

farmacêutica, cosmética, petroquímica e alimentícia (Duarte et al., 2003), uma vez

que atuam como dispersantes e/ou solubilizantes de compostos orgânicos, que

apresentam baixa solubilidade em água. São compostos capazes de reduzir a

tensão superficial e interfacial entre líquidos, sólidos e gases, e por isso permitem

misturar ou dispersar imediatamente como emulsões em água ou outros líquidos

(Banat et al., 2000).

Um bom surfactante deve diminuir a tensão superficial da água de 72 para

35 mN/m e sua eficiência está relacionada a uma baixa concentração micelar

crítica (CMC) (Mulligan et al., 2005) definida como a concentração mínima

necessária para iniciar a formação de micelas (Becher, 1965).

Durante a década passada, a demanda produtiva para surfactantes

aumentou aproximadamente 300% na indústria química americana (Lang &

Wulbrandt, 1999). Em 1997, o mercado mundial para surfactantes foi de

aproximadamente US$9,5 bilhões anuais (Desai & Banat, 1997). A importância

econômica dos surfactantes sintéticos reflete-se pelo aumento do número de

Revisão da Literatura

patentes e publicações como também pelo aumento do consumo destes

compostos em escala mundial (Kim et al., 2000).

A maioria dos surfactantes comercializados é derivada prinicipalmente do

petróleo. Entretanto, os rápidos avanços na biotecnologia e o aumento das

preocupações com o meio ambiente, combinado a mudanças nas legislações

(Banat et al., 2000), têm aumentado o interesse em biossurfactantes de origem

microbiana, uma vez que possuem como características principais: baixa

toxicidade, aceitabilidade ambiental e a possibilidade de produção utilizando

substratos renováveis (Makkar & Cameotra, 2002), além da tolerância à

temperatura, pH e força iônica e de serem biodegradáveis no solo e na água (Lin,

1996).

2.5. Biossurfactantes

2.5.1. Definição

Biossurfactantes são um grupo de metabólitos geralmente secundários com

propriedades de reduzir a tensão superficial e interfacial e são sintetizados por

uma ampla variedade de microrganismos. Esses metabólitos são moléculas

anfifílicas complexas em que as porções polares e hidrofóbicas dependem da

fonte de carbono e da espécie bacteriana (Benincasa et al., 2004).

Além das importâncias comerciais e biotecnológicas, é importante lembrar

que os microrganismos produzem biossurfactantes com finalidades fisiológicas.

Em geral os biossurfactantes permitem que os microrganismos cresçam em

Revisão da Literatura

substratos hidrofóbicos, diminuindo sua tensão superficial e consequentemente

este componente se torna disponível para o seu metabolismo. Admite-se também

que a produção desse tensoativo esteja ligada a fatores de virulência e a formação

de biofilme (Nitschke et al., 2005).

Estes compostos são considerados um grupo estruturalmente diverso de

moléculas sintetizadas por microrganismos. Diferente dos surfactantes

sintetizados por rotas químicas e que são classificados de acordo com a natureza

dos grupamentos polares, biossurfactantes são agrupados, principalmente, por

sua natureza química e origem microbiana. As principais classes de

biossurfactantes incluem: glicolipídios, lipopeptídios, lipoproteínas, fosfolipídios,

ácidos graxos, surfactantes poliméricos e surfactantes particulados (Desai &

Banat,1997).

Os microrganismos produtores de biossurfactantes pertencem aos mais

variados gêneros microbianos, contudo a maioria deles são produzidos por

bactérias (Desai & Banat, 1997). Propriedades físicas e químicas, redução da

tensão superficial, estabilidade na formação de emulsões são importantes na

escolha de um biossurfactante (Desai & Desai, 1993).

2.5.2. Aspectos econômicos

Revisão da Literatura

A pesquisa na área dos biossurfactantes tem se expandido muito nos

últimos anos pelo seu uso potencial em diferentes áreas, como indústria

alimentícia, agricultura, farmacêutica, petroquímica. Ainda mais, o

desenvolvimento nesta linha de pesquisa tem tido muita importância no que se

refere à proteção do meio ambiente (Santa Anna et al., 2002).

A empresa Jeneil Biosurfactant Corp (http://www.biosurfactant.com) iniciou

a produção comercial de ramnolipídios (Mulligan & Gibbs, 1993). A empresa de

Consultoria Frost & Sullivan, estimou que os surfactantes microbianos poderiam

representar 10% do mercado de surfactantes (Hester, 2001). Eles podem ser

produzidos utilizando procedimentos e substratos relativamente baratos e simples

(Lang & Wullbrandt, 1999; Makkar & Cameotra, 2002), assim, a otimização do

meio de cultivo e do processo como um todo é a chave da viabilidade econômica

para a produção de biossurfactantes. Atualmente, estima-se que a matéria-prima

representa cerca de 10 a 30% do custo geral da produção de biossurfactantes

(Lobato et al., 2003).

Kosaric et al. (1983) sugerem que quatro fatores devem ser focalizados

para reduzir custos de produção de biossurfactantes. É preciso obter boa

eficiência na conversão da fonte de carbono em produto, pois esta representa uma

importante parcela nos custos de produção, assim, microrganismos altamente

eficientes devem ser selecionados. A fonte de carbono utilizada deve ser de baixo

custo, assim, muitas vezes o principal objeto de estudo são resíduos de processos

agrícolas ou outros processamentos. Os processos de produção devem ser

altamente eficientes para minimizar os custos de investimentos, bem como custos

Revisão da Literatura

operacionais. O processo de extração e purificação também deve ser eficiente,

pois em alguns casos pode demandar recursos significativos para atingir a pureza

do produto necessária.

Em muitos aspectos econômicos, os processos de produção de PHA e de

biossurfactantes se assemelham. Diversas avaliações econômicas foram

realizadas em relação a produação de P3HB (Lee & Choi, 1998; Lee et al., 1997;

Choi & Lee, 1997; Choi & Lee, 1999). Aspectos econômicos da produção de

P3HB-co-3HV (Choi & Lee, 2000) e de PHA

MCL

(Hazenberg & Witholt, 1997; De

Koning et al., 1997) também foram avaliados. Três fatores foram identificados

como os mais importantes componentes do custo de produção de PHA: (i) retorno

do capital investido na planta de produção; (ii) substratos utilizados para produção

e (iii) separação e purificação do produto. A produtividade do processo terá forte

influência sobre o item (i), o fator de conversão do substrato em produto sobre o

item (ii) e as operações selecionadas para separação e purificação sobre o item

(iii). O teor de polímero acumulado influencia os três itens principais do custo de

produção (DeKoning et al., 1997).

2.5.3. Aplicações

A aplicação dos biossurfactantes está diretamente relacionada ‘as

propriedades físico-químicas de cada composto (Kosaric et al., 1983).

Revisão da Literatura

No setor ambiental, os biossurfactantes têm potenciais aplicações em

processos de biorremediação e tratamento de resíduos por causa de sua inerente

degradabilidade, além do mais, a população microbiana degrada hidrocarbonetos

do petróleo produzindo biossurfactante, aumentando a disponibilidade de

substratos (Sim et al., 1997). Embora existam diversos trabalhos relatando a

síntese de biossurfactantes por microrganismos degradadores de hidrocarbonetos,

alguns biossurfactantes podem ser produzidos em cultivos utilizando compostos

solúveis em água como fonte de carbono, tais como: glicose, sacarose, glicerol ou

etanol (Cooper & Goldberg, 1987; Guerra-Santos et al., 1986; Hommel et al.,

1994; Palejwala & Desai, 1989).

Os biossurfactantes são uma classe de compostos que têm demonstrado

utilidade em uma variedade de aplicações, incluindo remediação de compostos

orgânicos e metais, aumento do transporte por bactérias, aumento da recuperação

de óleo, como aditivos em cosméticos e controle biológico (Desai & Banat, 1997;

Herman et al., 1995; Zhang & Miller , 1992; Van Dyke et al., 1993; Zhang & Miller,

1994).

2.6. Ramnolipídios

Os glicolipídios pertencem à classe de biossurfactantes mais bem

conhecidos (Desai & Banat, 1997; Ron & Rosenberg, 2002).

Revisão da Literatura

Biossurfactantes dessa classe, os ramnolipídios, contendo ramnose e ácido

β-hidroxidecanóico foram descritos pela primeira vez por Bergström et al. (1946)

em Pseudomonas pyocyanea cultivada em glicose como fonte de carbono,

contudo não conseguiram determinar a proporção desses dois componentes. Isto

foi realizado por Jarvis & Johnson (1949), que demonstraram a ligação glicosídica

de β-hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato a duas moléculas de ramnose após o

cultivo de Pseudomonas aeruginosa em 3% de glicerol como fonte de carbono.

Mesmo assim a ligação entre as duas moléculas de açúcar ainda não estava clara

e foi foi elucidada por Edwards & Hayashi (1965).

Os ramnolipídios foram identificados, originalmente, como hemolisinas

produzidas por P. aeruginosa (Barbosa, 1972).

Segundo Ochsner & Raiser (1995), os principais ramnolipídios produzidos

por P. aeruginosa são o ramnosil-β-hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato

(monorramnolipídio) e o ramnosil-ramnosil-β-hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato

(dirramnolipídio), conforme Figuras 5a e 5b respectivamente.

Figura 5a. Monorramnolipídio.

Revisão da Literatura

Figura 5b. Dirramnolipídio

2.6.1. Aplicações dos Ramnolipídios

Os ramnolipídios podem ser comercialmente produzidos em concentrações

acima de 100 g/L (Giane et al., 1997) e nesta proporção os biossurfactantes

começam a competir com o custo dos surfactantes sintéticos (Lang & Wullbrandt,

1999).

Os ramnolipídios têm sido estudados para muitas aplicações em diversas

áreas; por exemplo, na descontaminação de áreas impactadas com óleo (Banat,

1995), na remoção de metais tóxicos do solo (Maier & Soberón-Chávez, 2000), na

recuperação de petróleo (Banat, 1995), na produção de cosméticos e na indústria

farmacêutica (Japanese Patent Kokai S63-77535 , 1988 ; Stanghelini & Miller,

1997 e Lang & Wullbrandt, 1999), processos de biorremediação (Maier & Soberón-

Chávez, 2000), na proteção agrícola (Desai & Banat, 1997), na biodegradação de

hidrocarbonetos (Zhang & Miller, 1994) e controle biológico de patógenos de

plantas (Stanghellini & Miller, 1997). Ramnolipídios são também fontes potenciais

de L-ramnose e 3-hidroxiácidos (Linhardt et al., 1989) e há um grande interesse

Revisão da Literatura

nesse aspecto devido às aplicações industriais deste produto, por exemplo L-

ramnose é utilizada como precursor na produção de aromas (Hauthal, 1994; Giane

et al., 1997, Lang & Wullbrandt, 1999). Apesar das diversas aplicações para estes

compostos, sua exata função fisiológica ainda não é muito clara (Beal & Betts,

2000).

2.6.2. Produção de ramnolipídios

A produtividade de produtos originados por bioprocessos é geralmente

atribuída ao desenvolvimento de linhagens eficientes seja via clássica ou por

técnicas recombinantes, por outro lado, fatores como nutrição e ambiente físico ao

qual o microrganismos é submetido podem alterar o rendimento ou até mesmo a

composição do produto desejado (Santos et al,, 2002).

A pré-condição essencial para a alta produção de ramnolipídios é a

limitação do crescimento, que se obtém através da limitação da concentração de

nitrogênio e íons multivalentes e excesso de fonte de carbono (Lang & Wullbrandt,

1999).

Para a produção de ramnolipídios, a escolha da fonte de carbono exerce

uma influência importante tanto na cinética e conversão do produto desejado,

como na proporção de ramnolipdídios produzidos (mono ou dirramnolipídio) (Desai

& Banat, 1997; Santos et al, 2002). A produção a partir de óleos vegetais

apresentou maiores rendimentos utilzando-se óleo de soja, óleo de milho, óleo de

Revisão da Literatura

canola e óleo de oliva como única fonte de carbono, já entre os substratos

solúveis em água, o manitol se apresentou como o mais eficaz (Soberón-Chavez,

2005b).

Outro fator importante a ser considerado é a fonte de nitrogênio, uma vez

que a limitação deste componente mesmo no início da fase estacionária de

crescimento em P.aeruginosa foi observada a síntese de ramnolipídios (Desai &

Banat, 1997). Oschner e colaboradores (1995) observaram a expressão de genes

de P.aeruginosa para a síntese de ramnolipidíos em P.fluorescens e P.putida

somente em condições de limitação de nitrogênio. Robert et al. (1989) observaram

que o início da produção de ramnolipídios coincidiu com a exaustão completa de

nitrogênio.

A produção de ramnolipídios foi observada na presença de nitrato,

glutamato e aspartato, contudo foi inibida na presença de NH

+, glutamina,

aspargina e arginina (Mulligan & Gibbs, 1989). Isto tem sido demonstrado pelo

fato de NO

é a melhor fonte de nitrogênio para a produção de ramnolipídios, uma

vez que foi observada maior expressão do gene rhlAB nesta condição, do que na

presença de NH

+ (Deziel et al., 2003).

A preferência pelo nitrato ainda não é clara, mas sugere-se que

Pseudomonas aeruginosa por se tratar de uma bactéria desnitrificante, acaba

utilizando esta substância como aceptor final de elétrons até mesmo na presença

de oxigênio (Soberón-Chavez, 2005b). Por outro lado, observou-se uma excelente

produção de ramnolipídios na ausência de oxigênio (Chayabutra et al., 2001).

Revisão da Literatura

Fatores ambientais e condições de crescimento como pH, temperatura,

agitação, oxigênio disponível também afetam a produção de biossurfactantes

através de seus efeitos no crescimento celular (Desai & Banat, 1997; Kosaric et

al., 1987). A produção de ramnolipídios em Pseudomonas spp, atingiu seu valor

máximo em pH 6,5 a 7,0 e reduziu este valor bruscamente em pH abaixo de 7,0

(Guerra-Santos et al., 1986).

A produção de biossurfactantes também é possível em condições

extremas. Muitos trabalhos descrevem a produção de biossurfactantes em

ambientes moderados, contudo são poucos que relatam a mesma em ambientes

termofílicos, psicrofílicos, halofílicos, acidófilos, osmofílicos. Estes são ambientes

que estão espostos a extremas condições de temperatura, pressão, pH,

salinidade e solventes orgânicos (Makkar & Cameotra, 1998).

Os microrganismos são encontrados em uma diversidade de ambientes,

tanto que alguns podem ser considerados extremos pelo homem, mas são

excelentes para o crescimento e desenvolvimento de outros. Esses

microrganismos são conhecidos como extremófilos e também possuem potencial

biotecnológico e consequentemente interesse comercial (Herbert, 1992).

2.6.3. Metabolismo e genética da biossíntese de ramnolipídios.

A estrutura química de glicolipídios produzidos em grande quantidade por

Pseudomonas aeruginosa foi definida por Jarvis & Johnson (1949) e Edwards &

Revisão da Literatura

Hayashi (1965) como sendo L-ramnosil-L-ramnosil-β-hidroxidecanoil-β-

hidroxidecanoato, também denominado ramnolipídio. Estudos sobre a biossíntese

destes compostos e que demonstraram sua secreção no meio de cultura durante a

fase de crescimento foram realizados durante os anos 1950s (Hauser &

Karnovsky, 1954; Hauser & Karnovsky, 1957; Hauser & Karnovsky, 1958).

Burger e colaboradores (1963) estabeleceram um sistema enzimático para

analisar a biossíntese de ramnolipídios in vitro. Dois sistemas enzimáticos de

ramnosil-transferases foram purificados e identificados como responsáveis pela: (i)

transferência de uma ramnose para β-hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato a partir

do doador timidina-difosfo-ramnose (TDP-ramnose), levando à formação de L-

ramnosil-β-hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato ou monorramnolipídio; (ii)

transferência de uma ramnose para o monorramnolipídio a partir do doador TDP-

ramnose, com a formação de L-ramnosil-L-ramnosil-β-hidroxidecanoil-β-

hidroxidecanoato ou dirramnolipídio. Segundo Burger e colaboradores (1963),

tentativas de demonstrar a reação de formação de β-hidroxidecanoil-

β−hidroxidecanoato não foram bem sucedidas devido à presença de enzimas

hidrolíticas, bem como ao fato das enzimas catalisando essa síntese aparentarem

ser lábeis. Nenhuma evidência foi obtida a respeito da síntese de ramnosil-

ramnose, livre ou ligada a TDP, por extratos de P. aeruginosa.

Um mutante de P. aeruginosa por inserção do transposon Tn5-GM

denominado 65E12 incapaz de crescer em hexadecano como fonte de carbono a

não ser que ramnolipídios fossem supridos exogenamente no meio de cultura foi

Revisão da Literatura

obtido (Koch et al., 1991). Esse mutante é incapaz de produzir ramnolipídios e, a

partir de uma biblioteca genômica obtida da linhagem selvagem PG201, obteve-se

um fragmento de DNA capaz de restabelecer a capacidade de produção desse

biossurfactante ao mutante (Ochsner et al., 1994a). No fragmento de DNA de 2 kb

obtido, apenas um quadro aberto de leitura (ORF) foi identificado que apresentou

similaridade com genes codificando para algumas proteínas regulatórias tais como

LasR de P. aeruginosa e LuxR de Vibrio fischeri, sugerindo que esse ORF codifica

para uma proteína ativadora transcricional.

Utilizando placas de meio SW contendo azul de metileno, outros três

mutantes de P. aeruginosa PG201 incapazes de produzir ramnolipídios foram

obtidos (Ochsner et al., 1994b). Estes mutantes não apresentavam atividade

ramnosil-transferase. A região de inserção do transposon foi utilizada como sonda

e permitiu identificar em uma biblioteca genômica de P. aeruginosa PG201 clones

capazes de complementar os três mutantes obtidos, bem como o mutante 65E12

obtido anteriormente (Ochsner et al., 1994a), indicando que os quatro mutantes

estavam afetados em uma mesma região do cromossomo de P. aeruginosa. O

seqüenciamento de um subfragmento de 9 kb e a análise de subfragmentos para

a complementação dos diferentes mutantes demonstrou a presença de duas

ORFs, dispostas na mesma orientação, nas quais o transposon havia se inserido e

que foram denominadas rhlA e rhlB. O gene rhlR foi detectado logo após o gene

rhlB. Ochsner e colaboradores (1994b) demonstraram que rhlA e rhlB são

transcritos juntos a partir de um promotor que antecede rhlA, assim, constituem

um operon. O mutante 65E12, afetado no gene rhlR, não apresenta a transcrição

Revisão da Literatura

do operon, portanto, RhlR deve estar envolvida na ativação transcricional do

operon. Antecedendo o promotor do operon, foram encontradas duas regiões

similares com simetria que permitiria o pareamento de bases e que foram

necessárias para a expressão do operon, indicando se tratar da região de ligação

da proteína ativadora RhlR. A atividade ramnosil-transferase foi claramente

associada a RhlB, mas não a RhlA. Assim, rhlB foi identificado como o gene

codificando para a proteína responsável pela transferência de uma ramnose a

partir de TDP-ramnose para β-hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato, ou seja,

constitui-se na ramnosil-transferase 1 (RT1). Quanto a rhlA ficou clara sua

participação na produção de ramnolipídios, mas seu papel exato não foi

identificado (Ochsner et al., 1994b).

Um ORF adicional foi identificado imediatamente após o gene rhlR de P.

aeruginosa PG201 (Ochsner & Reiser, 1995). Esse ORF apresentou similaridade

com alguns genes codificando para sintetases de autoindutores como LasI de P.

aeruginosa e LuxI de V. fischeri. Assim, a regulação da expressão dos genes do

operon rhlAB parece estar associada a um sistema denominado quorum sensing e

que depende de moléculas sinalizadoras. Ochsner & Reiser (1995) avaliaram

várias N-acil-homoserina lactonas para seus efeitos estimulatórios na síntese de

ramnolipídios em P. aeruginosa PG201. N-Butiril-homoserina lactona foi o indutor

mais eficiente, sendo que na concentração de 1 µM obteve completa indução.

Utilizando a seqüência de uma L-ramnosiltransferase de Shigella Flexneri,

Rahim e colaboradores (2001) identificaram um gene homólogo no genoma de P.

aeruginosa PAO1, diferente de rhlB. O gene foi amplificado por PCR e

Revisão da Literatura

denominado rhlC. Foi obtido mutante por recombinação homóloga inativado

especificamente no gene rhlC ou no gene rhlA. Enquanto a linhagem selvagem

apresentou capacidade de sintetizar tanto monorramnolipídio como

dirramnolipídio, o mutante rhlA não foi capaz de produzir qualquer ramnolipídio e o

mutante rhlC foi capaz de produzir apenas monorramnolipídio. Estes resultados

indicam que o gene rhlC codifica para a ramnosil-transferase 2 (RT2), ou seja, a

enzima que transfere uma ramnose de TDP-ramnose para o monorramnolipídio.

Rahim e colaboradores (2001) verificaram que o gene rhlC está organizado em um

operon com um outro gene denominado PA1131. Interessantemente, o gene

PA1131 é altamente similar a tetA, que confere resistência tetraciclina.

Lépine e colaboradores (2002) demonstraram que P. aeruginosa 57RP

produz extracelularmente HAAs (3-hidroxiacil-3-hidroxialcanoatos ou como eles

denominaram 3-(3-hidroxialcanoiloxi)alcanoatos) e que estes não eram

produtos da degradação de ramnolipídios, mas sim intermediários de sua síntese.

Uma vez que RhlA foi considerada como parte de um complexo

ramnosiltransferase 1 (Ochsner et al., 1994b), Déziel e colaboradores (2003)

previram que a inativação desse gene inibiria a glicosilação de HAAs e levaria a

um aumento na concentração destes no meio de cultura. Entretanto, o mutante

rhlA de P. aeruginosa não foi capaz de produzir HAAs, enquanto mutante rhlB

ainda era capaz de produzi-los, sugerindo que o produto do gene rhlA está

envolvido na síntese de HAAs (Déziel et al., 2003).

Com base nos resultados apresentados e considerando ainda que

ramnolipídios contendo apenas um hidroxialcanoato como componente hidrofóbico

Revisão da Literatura

pode ser sintetizado (Déziel et al., 1999; Déziel et al., 2000), a Figura 6 apresenta

o modelo metabólico de síntese de ramnolipídios a partir de 3-hidroxiacil-CoA ou

ACP e TDP-ramnose.

Figura 6. Modelo metabólico para a síntese de HAA e diferentes ramnolipídios.

Olvera e colaboradores (1999) analisaram um mutante de P. aeruginosa

PAO1 afetado no gene algC e que não produz ramonolipídios e alginato, além de

produzir um LPS defectivo. O gene algC em trans foi capaz de complementar o

mutante restabelecendo a capacidade de produzir ramnolipídios. AlgC apresenta

uma atividade fosfoglicomutase e foi proposto que catalisaria a conversão de

glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (Olvera et al., 1999). Assim, AlgC

juntamente com os produtos dos genes rmlABCD seriam responsáveis pela

síntese de dTDP-L-ramnose (Figura 7).

Revisão da Literatura

Figura 7. Síntese de dTDP-L-ramnose.

Um mutante de P. aeruginosa W51D incapaz de degradar citronelol foi

obtido e detectou-se que o mesmo estava afetado em um gene apresentando

homologia com fabG de E. coli e foi denominado rhlG (Campos-Garcia et al.,

1998). A inativação do gene rhlG em P. aeruginosa não estabeleceu uma

auxotrofia para ácidos graxos ou mesmo decréscimo na taxa de crescimento,

demonstrando que RhlG não está envolvida na biossíntese de ácidos graxos. A

análise da seqüência de nucleotídios antecedendo o gene rhlG revelou a presença

de um potencial promotor sigma 54, bem como seqüências associadas com a

ativação transcricional por proteínas como LuxR de V. fischeri, indicando um

sistema de regulação do tipo quorum sensing. A região regulatória do gene rhlG

apresentou similaridade com a mesma região do operon rhlAB, sugerindo que

ambos estão sujeitos à regulação genética similar. Mutante de P. aeruginosa

Revisão da Literatura

afetado no gene rhlG não foi capaz de produzir ramnolipídios e a produção de

PHA foi reduzida significativamente. A presença do gene rhlG em trans nesses

mutantes restabeleceu a capacidade de acumular PHA e de biossíntese de

ramnolipídios. Com base nesses resultados, Campos-Garcia e colaboradores

(1998) propuseram que RhlG é uma β-cetoacil redutase envolvida no

direcionamento de intermediários da biossíntese de ácidos graxos para a síntese

de ramnolipídios, entretanto, não conseguiram definir se o substrato dessa enzima

é um β−cetoacil ligado ao ACP ou CoA.

2.6.4. Inter-relações metabólicas da produção de ramnolipídios e PHA

MCL

Tanto a síntese de ramnolipídios como a síntese de PHA

MCL

utilizam

intermediários do metabolismo de ácidos graxos (degradação ou biossíntese).

Assim, a síntese de um deve interferir na do outro pelo menos pela competição

por esses intermediários. Talvez a interferência seja ainda maior, ou seja, o

metabolismo de cada um destes produtos pode envolver genes comuns não

associados com o metabolismo de ácidos graxos. Quando carboidratos ou outros

substratos metabolisados a acetil-CoA são utilizados como substrato, os produtos

dos genes rhlG e phaG têm sido associados à transferência de intermediários da

biossíntese de ácidos graxos para a síntese de ramnolipídios (Campos-Garcia et

al., 1998) e PHA (Rehm et al., 1998), respectivamente.

Campos-Garcia e colaboradores (1998) observaram um retardo na síntese

de PHA em mutante afetado no gene rhlG. Rehm e colaboradores (2001)

Revisão da Literatura

observaram que mutantes rhlG apresentavam uma menor produção de PHA e que

o gene rhlG suprido em trans (plasmídio) levava a um aumento da síntese de PHA

nesses mutantes, indicando uma relação deste gene com a síntese de PHA.

Entretanto, o gene rhlG não levou a um aumento na capacidade de sintetizar PHA

em mutante phaG. A biossíntese de ramnolipídios foi apenas levemente afetada

em mutantes phaG. Mutantes rhlG apresentaram redução expressiva na produção

de ramnolipídios que foi aumentada pela expressão do gene rhlG, mas não pela

expressão do gene phaG. Assim, o gene phaG parece não interferir de maneira

expressiva na síntese de ramnolipídios (Rehm et al., 2001). A inativação do gene

rhlG em P. aeruginosa levou à produção de um PHA com composição

sensivelmente modificada a partir de gliconato como única fonte de carbono,

indicando que o produto desse gene desempenha um papel importante na

transferência de intermediários da biossíntese de ácidos graxos para a síntese de

PHA (Rehm et al., 2001).

Além disso, a expressão do gene rhlG levou a um aumento na produção de

PHA

MCL

em linhagens de E.coli abrigando o gene phaC

de Pseudomonas sp 61-3

a partir de decanoato, indicando que o produto do gene rhlG também desempenha

um papel na transferência de intermediários da β-oxidação para a síntese de PHA.

Os 3-hidroxiácidos mais abundantes em PHA é 3HD

e também é a

substância mais encontrada em ramnolipídios e em HAAs, demostrando que

esses elementos ocorrem em passos comuns entre a síntese de PHA e

ramnolipídios (Soberón-Chavez, 2005b), entretanto, foi recentemente

Revisão da Literatura

demonstrado que a síntese de PHA não é necessária para a síntese de

ramnolipídios (Pham et al., 2004).

2.6.5.Quorum-Sensing

Pseudomonas aeruginosa é um microrganismo que possui diversos fatores

de virulência, alguns que fazem parte de sua estrutura celular e outos que são

produtos extra-celulares. Entre esses fatores incluem, pili, LPS, exotoxinas,

alginato, proteases, fosfolipases, fenanzinas, ramnolipídios, entre outros (Pelczar

et al., 1993).

A regulação dos genes de virulência em P. aeruginosa é bastante

complexa, envolve vários sistemas de regulação e depende de condições

ambientais como concentração de ferro e nível de nitrogênio por exemplo.

P.aeruginosa apresentam dois sistemas de regulação conhecidos como quorum

sensing ou comunicação célula-célula (Juhas et al., 2005). Esses sistemas

compreendem um peptídeo, um auto-indutor, e uma proteína ativadora da

transcrição, a proteína R. Um desses sistemas é o sistema las que é responsável

pela síntese de proteases, responsáveis pelas lesões na pele e de tecidos em

geral (Trabulsi & Althertum, 2004). O outro sistema é o sistema rhl, que regula a

expressão dos genes rhlAB (Ochsner et al., 1995) e rhlC (Rahim et al., 2001), foi

localizado imediatamente após os genes rhlAB e é composto pelos genes rhlR e

rhlI. RhlR pertence à família de proteínas que funcionam como ativadores

Revisão da Literatura

transcricionais (Figura 8) e que é ativada por N-butiril-homoserina lactona que são

produzidas por RhlI, uma sintetase de autoindutor (Brint & Ohman, 1995).

Figura 8. Quorum Sensing em Pseudomonas aeruginosa (Donabedian, 2003).

A Figura 9 apresenta um resumo sobre o metabolismo de síntese de

ramnolipídios.

Revisão da Literatura

Figura 9. Metabolismo de síntese de PHA e ramnolipídios.

Objetivo 37

3. OBJETIVO

O objetivo geral deste trabalho foi avaliar o potencial de produção de

polihidrialcanoatos e ramnolipídios por bactérias isolados de solo de Mata

Atlântica. Assim, foram definidos os seguintes objetivos específicos:

• Isolar bacterias a partir de solo de Mata Atlântica buscando explorar a

biodiversidade existente;

• Selecionar dentre os isolados bactérias capazes de produzir

simultaneamente PHA e biossurfactantes

• Avaliar a capacidade de produção de PHA e ramnolipídios pelos

isolados;

• Avaliar possíveis inter-relações metabólicas existentes entre a produção

de PHA e ramnolipídios.

Materiais e Métodos

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Meios de cultura

Neste estudo foram utilizados os seguintes meios de cultura: Agar Nutriente,

Agar Sabouraud Dextrose Agar, Agar Oligotróficos, PIA (Pseudomonas Isolation

Agar), Agar Cetrimide, PPSW, Caldo Nutriente (Meio Complexo) e Meio Mineral

(Meio sintético).

4.1.1. Caldo e Agar Nutriente

Os meios de cultura caldo nutriente possuia a seguinte composição:

Extrato de carne..................................... 3,0 g/L

Peptona bacteriológica........................... 5,0 g/L

Para obtenção do agar nutriente, foram adicionados 15-20 g/L de agar.

4.1.2. Agar Sabouraud Dextrose Agar

Peptona bacteriológica........................ 10,0 g/L

Glicose D(+)........................................ 40,0 g/L

Agar agar ............................................ 15-20,0 g/L

pH final: 5.6 +/-0,2

Materiais e Métodos

4.1.3. Agar Oligotrófico

Para a formulação de 1000 mL deste meio foram utilizados 900 mL de

solução Salina de Winogradsky que continha a seguinte composição:

• 0,4 g de K

HPO

• 0,13 g de MgSO.7H

• 0,13 g de NaCl

• 1,52 mg de MnSO4.H

• 0,5 g de NH

4.1.3.1. Extrato de Solo

Para o preparo deste extrato, o solo coletado foi seco a 20

C e passado

por uma peneira de diâmetro 2mm. Ao solo peneirado foi adicionada água

MilliQ na proporção 1:1 (m/v) e as partículas foram removidas por

sedimentação por 2 horas e foi centrifugado (5000g, 20

C, 20 min). O

sobrenadante foi filtrado em filtro estéril com porosidade 0,2 µm.

4.1.3.2. Composição do meio Agar oligotrófico

N-lauroyl sarcosina sódio( Sigma, St. Louis, Mo).........1,2 g

Materiais e Métodos

CSE ( Extrato de Solo)....................................................100 mL

Trimethropim (Sigma).................................................... 20 mg

Nistatina (Sigma) ...........................................................50 mg

Casamino Ácidos (Sigma)..................................................5 g

4.2. PIA (Pseudomonas Isolation Agar)

Peptona bacteriológioca ....................... 20,0 g/L

Cloreto de Magnésio ............................ 1,4 g/L

Sulfato de Potásssio ............................. 10,0 gL

Irgasan (Ciba-Geigy)............................ 0,025 g/L

Agar agar.............................................. 13,6 g/L

pH final : 7,0 +/- 0,2

4.3. Agar Cetrimide

Peptona bacteriológica ........................... 20,0 g/L

Cloreto de Magnésio............................... 1,4 g/L

Sulfato de Potássio................................. 10,0 g/L

Cetrimide (bromento de cetilmetilamônio) 0,3 g/L

Glicerol.................................................... 10mL/L

Agar agar ................................................ 15-20 g/L

pH final : 7,2 +/-0,2

Materiais e Métodos

4.4. PPSW

2 .............................................

0,02M

KCl....................................0,02M

Tris-HCl ...........................0,12M

MgSO

...............................0,0016M

Glicose..............................0,5%

Peptona.............................1,0%

CTAB ...............................200 mg/L

Azul de Metileno...............2,5 mg/L

Agar agar ....................... .20g/L

pH final ........................................7,2

4.5. Meio Mineral

Cada litro do meio sintético possuía a seguinte base de sais (Ramsay et al.,

1990):

HPO

..................................................... 3,50 g

....................................................... 1,50 g

MgSO

.7H

O............................................... 0,20 g

CaCl

.2H

O................................................. 0,01 g

Citrato férrico amoniacal............................ 0,06 g

Materiais e Métodos

Solução de elementos traços....................... 1 mL

Cada litro da solução de elementos traços continha:

.......................................................... 0,30 g

CoCl

.6H

O ................................................ 0,20 g

ZnSO

.7H

O ................................................ 0,10 g

MnCl

.4H

O ................................................ 0,03 g

NaMoO

.2H

O ............................................ 0,03 g

NiCl

.6H

O .................................................. 0,02 g

CuSO

.5H

O ................................................ 0,01 g

Ao meio de cultura sintético foram adicionados ainda diferentes fontes de

carbono e (NH

)

em diferentes concentrações para oferecer condições

adequadas para crescimento celular e acúmulo de PHA ou produção de

ramnolipídios. Meios de cultura sólidos foram obtidos com a adição de 15-20

g/L de agar.

4.6. Esterilização

As soluções e meios de cultura em geral foram esterilizados em autoclave

por 20 minutos, a 121ºC.

4.7. Isolamento de novas linhagens bacterianas

O isolamento de microrganismos foi realizado a partir de uma amostra de

solo coletada no Parque Natural Municipal da Serra do Itapety localizado no

Materiais e Métodos

município de Mogi das Cruzes, São Paulo, conforme Figura 10. A amostra de solo

foi utilizada para isolamento direto ou submetida a enriquecimento em meio

mineral contendo óleo de soja, petróleo ou naftaleno.

Figura 10. Serra do Itapety , município de Mogi das Cruzes

Materiais e Métodos

4.7.1. Isolamento Direto

O isolamento direto consistiu em obter microrganismos a partir da

suspensão da amostra de solo em solução salina, ou seja, com a ausência total de

qualquer nutrientes que não sejam aqueles já aderidos ao próprio solo de

isolamento. Desta maneira, 5 gramas de solo foram transferidos de forma

asséptica para 100 mL de solução salina (NaCl 0,85%), submetida a banho de

ultrassom por 12 minutos e agitada por 60 minutos, este ciclo de tratamento com

ultrassom e agitação foi repetido por 2 vezes. Após os dois ciclos, a amostra ficou

em descanso durante 20 minutos, para sedimentação do material particulado,

foram realizadas diluições decimais em solução salina e as diferentes diluições

foram inoculadas em meios de cultura sólidos para isolamento.

4.7.2. Enriquecimento do meio de Cultivo

O enriquecimento do meio de cultivo consistiu em isolar microrganismos em

meio mineral com a adição de fontes de carbono como nutriente. As fontes de

carbono selecionadas para este enriquecimento foram baseadas na literatura e

por se tratarem de substratos hidrofóbicos (Desai & Banat, 1997).

Para o enriquecimento, 5 gramas da amostra de solo foram transferidos de

maneira asséptica para meio mineral, descrito no item 3.1 .contendo óleo de soja

(8 g/L), petróleo (1% m/m) ou naftaleno (0,5 g/L) e incubados a 30

C, 150 rpm

durante 3, 7 e 14 dias, respectivamente. Após o período de incubação, cada uma

Materiais e Métodos

das amostras descansou por 20 minutos, para sedimentação do material

particulado. Foram realizadas diluições decimais em solução salina e as diferentes

diluições foram inoculadas em meios de cultura sólidos para isolamento.

Os meios de cultura agar nutriente (peptona 5 g/L, extrato de carne 3 g/L),

agar Sabouraud dextrosado (Oxoid) e agar oligotróficos (Aagot et al., 2001) foram

utilizados para o isolamento. A incubação das placas foi realizada a 30

Colônias isoladas foram transferidas para o mesmo meio de cultura de origem

para confirmar tratarem-se de culturas puras. Uma vez confirmado o isolamento,

estes isolados foram utilizados em experimentos para avaliar sua capacidade de

produzir biossurfactantes e PHA

MCL

. A Figura 11 demonstra as técnicas de

isolamento e enriquecimento utilizadas.

Figura 11 . Técnica de Isolamento e Enriquecimento.

Materiais e Métodos

4.7.2.1. Seleção de linhagens produtoras de biossurfactantes

Para avaliação da produção de biossurfactante foi utilizado o meio PPSW

(Wild et al., 1997), onde cada um dos isolados foi estriado nesse meio de cultura e

incubado a 30

C por até 7 dias. A formação de um halo ao redor da colônia indica

que houve produção de biossurfactante pelo microrganismo , conforme Figuras

12a e 12b.

Figuras 12a e 12b. Linhagens produtoras de ramnolipidíos com formação de halo

ao redor da colônia em meio PPSW

Materiais e Métodos

4.7.2.2. Seleção de linhagens produtoras de PHA

Para avaliar a produção de PHA, cada um dos isolados foi incubado em

meio mineral contendo excesso de fonte de carbono (glicose 5 g/L ou octanoato 2

g/L) e limitado na fonte de nitrogênio [(NH

)

– 0,06 g/L)] por 5 dias. Após esse

período de incubação, os isolados foram corados com Sudan Black B (0,02% m/v

em etanol 96%) por 10 minutos, descorados com etanol 96% por 1 minuto. Sudan

Black B é um corante lipofílico com afinidade pelo PHA, assim, as colônias

bacterianas contendo PHA adquirem coloração azul, enquanto linhagens que não

contêm; ou não se coram, ou ficam levemente azulados.

4.7.2.3. Caracterização de linhagens bacterianas isoladas

As linhagens que apresentaram capacidade de produzir biossurfactantes

foram submetidas a testes preliminares de caracterização com o objetivo de

identificar a diversidade de microrganismos isolados. Esta caracterização consistiu

de morfologia de colônias após 48 horas de crescimento em meio de cultura agar

nutriente, teste de catalase e oxidase, bem como coloração de Gram. Os isolados

foram ainda avaliados quanto ao crescimento e fluorescência em meio de cultura

PIA (Pseudomonas Isolation Agar – DIFCO) e Agar Cetrimide (Mikrobiologie). A

caracterização foi utilizada para geração de um biocódigo, que permitiu diferenciar

Materiais e Métodos

os grupos de morfologia de colônia em subgrupos, ou seja, ampliando a avaliação

da diversidade de microrganismos isolados.

4.7.2.3.1. Morfologia de Colônias

Cada um dos isolados foi estriado em placas de agar nutriente e incubados

a 30

C durante 48 horas e foi avaliada a semelhança morfológica entre os

isolados. Essa semelhança foi baseada em forma, tamanho e arranjo das colônias

bacterianas. A partir desta semelhança, os mesmos foram separados em grupos e

a cada um dos grupos foi atribuído um número de identificação conforme descrito

na Tabela 2.

4.7.2.3.2.Teste de Catalase

A reação de catalase é utilizada para identificar algumas espécies

bacterianas. A cada um dos isolados de interesse, foi adicionada uma gota de

peróxido de hidrogênio. Linhagens contendo catalase liberam imediatamente

bolhas de oxigênio. As linhagens que liberaram essas bolhas foram denominadas

catalase-positiva e as que não liberaram as bolhas foram denominadas catalase-

negativa.

Materiais e Métodos

4.7.2.3.3. Teste Oxidase

Este teste permite verificar a presença da enzima Oxidase. Com o auxílio

de um palito, uma colônia de cada um dos isolados foi .passado sobre a tira de

teste Oxidase Bactidente MERCK, caracterizando-se pela mudança de cor da tira

teste. O isolado que permitiu a mudança da tira de cinza para azul, foi

caracterizado como Oxidase positivo e os que mudavam para outra cor senão

azul, ou não se coravam, foram caracterizados como oxidase negativo.

4.7.2.3.4. Coloração de Gram (Pelczar et al.,1993)

Esfregaços de células fixadas pelo calor foram corados sucessivamente

com cristal de violeta e lugol, diferenciados com álcool acetonado e finalmente

corados com fuccina.

4.7.2.3.5. Crescimento e Fluorescência em PIA e Agar Cetrimide

O meio de cultura PIA (Pseudomonas Isolation Agar) permite diferenciar

linhagens do gênero Pseudomonas, enquanto o meio de cultura Agar Cetrimide

permite diferenciar o gênero Pseudomonas em espécie de Pseudomonas

aeruginosa. Os isolados pertencentes a esta espécie são diferenciados pela

Materiais e Métodos

fluorescência formada pela colônia, visualizada com o auxílio de uma lâmpada

Ultravioleta.

4.7.2.3.6. Biocódigo

Para obtenção do biocódigo foram atribuídos valores a cada um dos testes

realizados e cada grupo de três testes determinava um digito do biocódigo. Por

exemplo, o teste de catalase valia 1 ponto, o teste de oxidase 2 pontos e a

coloração de Gram 4 pontos. Estes três testes em conjunto determinavam o

primeiro digito do biocódigo. Assim, se o primeiro digito do biocódigo for 1 trata-se

de um microrganismo catalase positivo, oxidase negativo e Gram negativo. Se o

primeiro digito for 3 trata-se de um microrganismos catalase positivo, oxidase

positivo e Gram negativo. Para o segundo digito do biocódigo foram utilizados o

crescimento em meio agar cetrimide e PIA, o valor atribuído foi 1 para crescimento

em agar Cetrimide e 2 para o crescimento em PIA. O terceiro digito do biocódigo

foi obtido pela capacidade de produzir halo em meio PPSW (1 ponto) e

capacidade de produzir PHA (2 pontos).

4.8. Preservação de linhagens bacterianas.

Cada uma das linhagens bacterianas a ser preservada foi cultivada em caldo

nutriente por 24 horas e, em seguida, 5 mL de cada uma das culturas foi diluída

em 5 mL de uma solução aquosa de glicerol a 20%. A suspensão de células na

Materiais e Métodos

solução de glicerol foi distribuída em tubos de microcentrífuga (500 µL por tubo),

que foram mantidos em congelador de refrigerador doméstico por 2 horas e

finalmente congelados em freezer -80

Para a preservação das linhagens bacterianas por liofilização, 40 mL de uma

cultura em caldo nutriente por 24 horas foram centrifugados e as células

ressuspensas em 2 mL de solução aquosa de leite desnatado (10%) e glutamato

de sódio (5%). A suspensão de células no lioprotetor foi então distribuída em

ampolas de vidro (0,2 mL por ampola), congelada lentamente até -35

C e

liofilizada em aparelho Labconco, modelo 5-75050 (Silva et al., 1992). As ampolas

foram fechadas a vácuo e estocadas em refrigerador doméstico (4-8

C).

4.9. Cultivo de microrganismos

4.9.1. Experimentos em agitador rotativo

Cada uma das linhagens bacterianas foi estriada em agar nutriente e

cultivada por 72 horas. Colônias isoladas foram utilizadas para inocular 100 mL de

caldo nutriente e incubadas por 24 horas em agitador rotativo. Um volume de 6 mL

da cultura em caldo nutriente foi utilizado para inocular 200 mL de meio mineral

(meio de cultura sintético) contendo excesso de fonte de carbono (glicose e

frutose, cerca de 7,5 g/L cada, ou 9 g/L de óleo de soja) e quantidade limitada da

fonte de nitrogênio [(NH

)

cerca de 1 g/L]. As células foram cultivadas em

agitador rotativo, com retirada após 72 horas de cultivo para determinar: pH,

Materiais e Métodos

massa seca celular, concentração de fonte de carbono, quantidade e composição

de PHA, concentração de ramnolipídios, conforme Figura 13.

Figura 13. Experimentos em agitador rotativo e análises realizadas

4.9.2. Determinação de Biomassa (Massa Seca Celular)

Amostras das culturas (10-15 mL) foram centrifugadas (3521 xg), lavadas

com água destilada, filtradas em membranas de 0,45 m de porosidade e secas a

100

C, por 4 horas. Após esse período as membranas permaneceram durante 15

minutos no dessecador, foram pesadas e a massa seca celular (g/L) foi calculada

de acordo com a seguinte fórmula:

MS= (Mcel – Membrana+ UM) x1000

volume centrifugado

Materiais e Métodos

MS= massa seca celular (g/L)

Mcel= massa da membrana com as células (g)

M= massa da membrana sem células (g)

UM= umidade da membrana (g)

4.9.3. Determinação de PHA

Cerca de 10 mg de células liofilizadas foram submetidas à propanólise em

tubo ao qual foram adicionados 1 mL de solução de HCl em propanol (1:4 v/v), 1

mL de 1,2 dicloroetano e 100 µL de uma solução de ácido benzóico (40g/L) em

propanol (Riis & Mai, 1988). Após vigorosa agitação, incubou-se a mistura em

banho a 100

C por 3 horas, agitando-se mais uma vez após os primeiros 30

minutos. Em seguida, resfriaram-se os tubos, adicionou-se água Milli-Q (4 mL),

agitou-se em agitador de tubos Vortex e, após repouso, separou-se a fase

orgânica inferior, contendo os propil-ésteres. A concentração de propil-ésteres foi

determinada por cromatografia gasosa. Cerca de 1 µL da fase orgânica obtida na

propanólise foi analisada após a injeção (1:100), detectando-se os propil-ésteres

por meio de ionizador de chama. As temperaturas do injetor e detector, foram

250

C e 300

C, respectivamente. Empregou-se um programa de temperatura da

coluna para separar os propil-ésteres, que consistiu em 100

C por 1 minuto,

aumetando até 180

C a uma razão de 8

C/min e 180

C por 15 minutos. O gás de

arraste empregado foi Hélio a uma vazão de 0,8 mL/min.

Materiais e Métodos

4.9.4. Determinação de HA

Amostras das culturas (10-15 mL) foram centrifugadas (3521 xg), e o

sobrenadante (5 mL) foi separado para determinação de HA. Estas amostras

foram liofilizadas e submetidas a propanólise , conforme descrito no item 4.4.3.

4.9.5. Dosagem da Ramnose

Um volume de 2,0 mL dos sobrenadantes das culturas ou diluições deste

em água destilada foram utilizados para a dosagem da concentração da ramnose.

Nos cultivos utilizando carboidratos como fonte de carbono, os ramnolipídios

foram previamente extraídos com éter-etílico 1.1 v/v três vezes. Após extração, o

éter-etílico foi evaporado e o material extraído suspenso no mesmo volume

utilizado para a extração. A determinação de ramnose foi realizada de acordo com

o método do fenol/ácido sulfúrico descrito por Dubois e colaboradores (1956).

Ramnose (Sigma) foi utilizada como padrão na construção de uma curva de

calibração (Fgura 15). Brevemente, foram adicionados em tubos de vidro 2,0 mL

das amostras a serem analisadas, diluições desta ou do padrão externo, 20 µL de

uma solução aquosa de fenol a 80% e 5,0 mL de ácido sulfúrico a 98%

(Merck).Todas as amostras ou padrões foram analisadas em triplicatas e todos os

cálculos foram baseados na média da triplicata. Os tubos permaneceram em

repouso durante 10 minutos, sendo em seguida agitados vigorosamente e

incubados entre 25

C e 30

C, durante 10 a 20 minutos. Após esse período, a

Materiais e Métodos

quantidade de ramnose foi determinada considerando-se a leitura de absorbância

a 480 nm e a correspondência com os valores da curva padrão de ramnose.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Ramnose (

µµ

480

Figura 14. Curva Padrão de Ramnose

4.9.6. Análise de Carboidratos

A concentração de glicose e frutose foi determinada por cromatografia de

fase líquida (HPLC), os carboidratos foram detectados através de índice de

refração (Gomez et al., 1996). Um volume de 10 µL de amostra, adequadamente

diluída para uma concentração entre 0 e 3 g/L e filtrada através de membrana de

poro 0,22 µm ( Millipore), foi injetada em cromatógrafo (Waters 510 HPLC)

equipado com coluna para determinação de açúcares (Shodex SH 1011). Os

carboidratos separados foram identificados através do índice de refração

diferencial (Waters 410 differential refractometer). A calibração do aparelho foi

realizada com soluções contendo aproximadamente: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 2,0;

Materiais e Métodos

2,5; e 3,0 g/L de cada um dos açúcares. As condições de operação do aparelho

foram as seguintes:

Temperatura do forno: 72ºC

Pressão: <500 psi

Fase móvel: água purificada em sistema MilliQ ( Waters- Millipore) contendo EDTA

de cálcio e disódio ( C

CaNa

) para uma concentração igual a 0,01 M.

Vazão da Fase Móvel: 0,6 mL/min.

Esta metodologia também foi utilizada para analisar ramnose produzida

extracelularmente pelo isolado IPT 648. Para tanto o sobrenadante de um cultivo

dessa linhagem em carboidratos foi analisado diretamente ou após hidrólise ácida.

Para a hidrólise, 100 µL de ácido sulfúrico concentrado (37%) foi adicionado a 2

mL de amostra e incubado a 65

C por 10 minutos. Após o resfriamento da

amostra, esta foi neutralizada com NaOH 4N e utilizada para injeção no

cromatógrafo líquido.

Materiais e Métodos

Resultados e Discussão

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Isolamento e caracterização de linhagens bacterianas

Neste trabalho, os princípios que nortearam a estratégia de isolamento

tinham como finalidade buscar uma área pouco estudada do ponto de vista da

diversidade microbiana e o outro foi aplicar técnicas que tentassem aumentar as

chances de recuperação dos microrganismos a partir da amostra de solo, ou seja,

que permitissem recuperar o maior número possível de microrganismos diferentes.

Assim, uma série de etapas envolvendo agitação e tratamento por ultrassom

foram realizadas, com o objetivo de separar microrganismos firmemente aderidos

às partículas de solo. Além disso, optou-se por estratégias de enriquecimento que

poderiam privilegiar grupos particulares de microganismos. Foi testado o

enriquecimento em meio mineral contendo óleo de soja, petróleo ou naftaleno

como única fonte de carbono. Além dos meios de cultura ricos em nutrientes

(Agar Nutriente e Agar Sabouraud), foi utilizado o meio de cultura descrito por

Aagot et al. (2001) com o objetivo de isolar microrganismos oligotróficos. Os

resultados do isolamento nestas diferentes condições estão apresentados na

Tabela 1. O maior número de isolados capazes de produzir tanto biossurfactantes

como PHA foram obtidos a partir do enriquecimento em óleo de soja. Sendo este

um substrato hidrofóbico era esperado que de alguma forma privilegiasse

bactérias produtoras de biossurfactantes, mas não pode se estabelecer uma

Resultados e Discussão

relação clara entre esse substrato e a produção de PHA.

Tabela 1. Linhagens microbianas isoladas do Parque Natural Municipal da Serra

do Itapety.

Técnica de

Isolamento

Total de

Isolados

Produtores de

Biossurfactantes

Produtores de

PHAmcl

Produtores de PHAmcl e

Biossurfactantes

Isolam.Direto

67 8 20 8

Óleo de Soja 89 24 27 14

Petróleo 84 7 8 3

Naftaleno 53 6 16 6

Total 293 45 71 31

Com o objetivo de caracterizar os microrganismos isolados, estes foram

cultivados nos meios de cultura PIA (Pseudomonas Isolation Agar) e Agar

Cetrimide, para a detecção presuntiva de Pseudomonas spp. e P. aeruginosa,

respectivamente. Uma importante parcela dos isolados correspondeu a bactérias

do gênero Pseudomonas. Uma vez que o objetivo principal neste trabalho está

associado em avaliar a inter-relação metabólica entre a produção de ramnolipídios

e PHA, são estas linhagens que despertam maior interesse para os estudos que

se seguem, uma vez que Pseudomonas são citadas na literatura como produtoras

destas duas substâncias (Soberón-Chavez et al., 2005).

Foram detectados 31 isolados com capacidade de produzir tanto

biossurfactantes como PHA. Com o objetivo de avaliar a diversidade desses

microrganismos, eles foram caracterizados quanto à produção das enzimas

catalase e oxidase, sua resposta à coloração de Gram e morfologia das colônias

em agar nutriente. Estes resultados, juntamente com aqueles de crescimento e

Resultados e Discussão

formação de pigmento fluorescente em agar Cetrimide foram utilizados para definir

um biocódigo para cada um dos isolados.

Tabela 2. Caracterização de linhagens bacterianas produtoras de PHA e

biossurfactantes.

Testes

Bioquímicos

IPT

Biocódigo

Catalase

Oxidase

Coloração

de Gram

Morfologia

AN Cetrimide

PIA PPSW PHA

705 123 + - - GIII ++ -- + ++ ++

704 333 + + - GIII ++ F+ ++ ++ ++

714 133 + - - GI ++ F+ ++ ++ ++

711 133 + - - GVI ++ F+ ++ ++ ++

712 133 + - - GVI ++ F+ ++ ++ ++

713 133 + - - GVI ++ F+ ++ ++ ++

709 133 + - - GVI ++ F+ ++ ++ ++

666 133 + - - GVI ++ F+ ++ ++ ++

707 133 + - - GI ++ F+ ++ ++ ++

710 133 + - - GVI ++ F+ ++ ++ ++

716 303 + + - GI ++ -- -- ++ ++

715 303 + + - GV ++ -- -- ++ ++

708 303 + + - GV ++ -- -- ++ ++

702 313 + + - GII ++ F+ -- ++ ++

733 333 + + - GII ++ F+ + ++ ++

703 313 + + - GV ++ F+ -- ++ ++

648 323 + + - GIII ++ -- ++ ++ ++

647 323 + + - GIII ++ -- ++ ++ ++

717 323 + + - GI ++ -- ++ ++ ++

706 333 + + - GIII ++ ++ ++ ++ ++

635 333 + + - GI ++ F+ ++ ++ ++

638 333 + + - GI ++ F+ ++ ++ ++

642 333 + + - GII ++ F+ ++ ++ ++

650 333 + + - GII ++ F+ ++ ++ ++

633 333 + + - GV ++ F+ ++ ++ ++

636 333 + + - GVI ++ F+ ++ ++ ++

649 333 + + - GVI ++ F+ ++ ++ ++

634 333 + + - GIII ++ F+ ++ ++ ++

662 333 + + - GIII ++ F+ ++ + +

734 133 + - - GI ++ F+ ++ ++ +

735 133 + - - GIII ++ F+ ++ ++ +

+ positivo para a atividade testada ou crescimento intermediário F – fluorescência.

- negativo para a atividade testada ou sem crescimento AN – Agar Nutriente

++ - atividade ou crescimento intenso. PIA – Pseudomonas Isolation Agar

GI a GVI – grupos morfológicos de colônias observadas visualmente. PHA - Polihidroxialcanoatos

Cetrimide – Meio de cultura diferencial para Pseudomonas aeruginosa

Resultados e Discussão

Considerando os biocódigos, bem como morfologia de colônias identifica-se

a existência de pelo menos 13 grupos diferentes de microrganismos entre os

isolados. Três microrganismos pertencendo a esses 13 grupos e diferenciados dos

outros pertencentes ao mesmo grupo pela morfologia de colônia foram obtidos

exclusivamente utilizando o meio de cultura Agar Oligotrófico (Aagot et al., 2001),

indicando que este meio de cultivo permitiu o isolamento de microrganismos não

isolados com meios de cultura ricos em nutrientes.

5.2. Avaliação da produção de biossurfactantes e PHA.

As 31 linhagens bacterianas selecionadas como produtoras de PHA e

biossurfactantes de acordo com o item .5.1 foram avaliadas quanto à produção

desses bioprodutos em meio mineral líquido. Os cultivos foram realizados

utilizando carboidratos (glicose e frutose) ou óleo de soja como única fonte de

carbono. Os resultados obtidos estão apresentados a seguir.

5.3. Produção de PHA

Os resultados relacionados à produção de PHA pelos diferentes isolados

estão apresentados na Tabela 3. Apenas a linhagem IPT 648 não foi capaz de

produzir PHA. Essa linhagem no cultivo com óleo de soja não apresentou qualquer

crescimento e, embora tenha apresentado crescimento no meio de cultura

Resultados e Discussão

contendo glicose e frutose, não foi detectada a presença de PHA nas células. Para

as linhagens IPT 650, IPT 705, IPT 706 e IPT 734 não foi detectada a presença de

PHA no cultivo em óleo de soja com única fonte de carbono. Para as linhagens

IPT 716 e IPT 735, não foi detectada a presença de PHA no cultivo em

carboidratos.

A linhagens IPT 642, IPT 705 e IPT 707 produziram PHA em quantidades

muito pequenas (<5% da MSC). As demais linhagens produziram mais que 5% em

pelo menos um dos cultivos, atingindo em alguns casos valores da ordem de 20-

30% da massa seca celular. Esses valores são semelhantes àqueles obtidos por

Silva-Queiroz (2003), com linhagens de Pseudomonas aeruginosa isoladas de

solo de canavial e avaliadas quanto à produção de PHA

MCL

utilizando cinco tipos

de óleos vegetais. Entretanto, os valores obtidos são bastante inferiores aos

teores obtidos com linhagens de Pseudomonas putida, que atingiram teores da

ordem de até 50% da massa seca celular (Silva-Queiroz, 2003).

Nenhum dos isolados avaliados neste trabalho atingiu teores de PHA

MCL

superiores a 30% da massa seca celular utilizando glicose e frutose como única

fonte de carbono, enquanto que Gomez (2000) avaliando linhagens de

Pseudomonas atingiu valores superiores a 60% da massa seca celular para a

linhagem de P. putida IPT 046. Considerando que P. putida IPT 046 é incapaz de

produzir biossurfactantes (Gomez, 2000), uma hipótese seria admitir que o

acúmulo em quantidades reduzidas de PHA

MCL

pode estar associado à geração de

outro(s) produto(s) nas linhagens isoladas neste trabalho.

Resultados e Discussão

Tabela 3. Produção de PHA por linhagens bacterianas isoladas e controle (P.

aeruginosa IPT 719).

Linhagem

Bacteriana

Fonte

Carbono

MSC

(g/L)

Glicose

(g/L)

Frutose

(g/L)

3HHx

(mol%)

3HO

(mol%)

3HD

(mol%)

3HDD

(mol%)

PHA

(%MSC)

IPT 719 G+F 1,32 4,9 0,00 2,86 0,0 7,5 76,4 16,1 10,08

Óleo Soja 2,20 6,2 - - 4,3 30,3 54,9 10,5 25,43

IPT 633 G+F 4,09 6,5 0,00 2,02 3,2 12,1 51,8 32,9 11,48

Óleo Soja 2,45 6,4 - - 10,4 42,7 34,7 12,2 6,67

IPT 634 G+F 1,31 6,2 0,00 3,99 1,4 16,7 68,9 13,0 13,00

Óleo Soja 1,18 6,2 - - 0,0 20,1 71,8 8,1 23,09

IPT 635 G+F 2,14 4,7 0,40 1,32 3,3 24,1 59,8 12,8 12,06

Óleo Soja 1,68 6,4 - - 3,2 36,2 47,0 13,6 17,89

IPT 636 G+F 1,68 6,1 1,70 0,00 0,0 9,4 66,2 24,4 8,92

Óleo Soja 0,85 6,5 - - 5,8 64,4 24,1 5,7 1,69

IPT 638 G+F 1,87 6,5 0,00 0,74 0,0 11,1 67,0 21,9 13,41

Óleo Soja 1,03 6,5 - - 0,0 43,9 44,6 11,5 7,73

IPT 642 G+F 0,52 6,8 3,37 0,00 0,0 37,4 62,6 0,0 0,18

Óleo Soja NC NC

- - NC NC NC NC NC

IPT 647 G+F 2,07 5,0 0,00 1,54 1,6 11,6 62,7 24,1 16,71

Óleo Soja 4,16 6,2 - - 4,4 38,9 42,8 13,9 24,18

IPT 648 G+F 1,30 3,2 3,04 0,00 - - - - 0,0

Óleo Soja NC NC

- - NC NC NC NC NC

IPT 649 G+F 2,23 4,8 1,06 0,37 0,0 16,4 83,6 0,0 2,32

Óleo Soja 4,42 6,3 - - 4,1 38,7 42,7 14,5 26,22

IPT 650 G+F 0,85 6,8 1,82 1,73 9,2 37,9 30,0 22,9 7,10

Óleo Soja 0,25 6,4 - - - - - - 0,00

IPT 662 G+F 1,39 5,8 1,32 0,00 1,2 12,7 67,0 19,1 13,11

Óleo Soja 2,30 6,5 - - 0,0 45,4 43,7 10,9 7,36

IPT 666 G+F 0,54 4,6 0,52 0,0 0,0 17,1 51,2 31,7 2,67

Óleo Soja 3,13 6,5 - - 8,0 43,1 36,4 12,5 6,89

IPT 702 G+F 1,51 6,6 0,00 3,76 0,0 TR 60,3 39,7 9,77

Óleo Soja 2,38 5,5 - - 9,8 44,7 33,9 11,6 22,61

IPT 703 G+F 1,38 6,8 0,00 2,90 0,0 0,0 51,6 48,4 6,68

Óleo Soja 3,09 5,3 - - 0,0 0,0 39,0 61,0 1,49

IPT 704 G+F 1,60 6,0 0,00 2,77 1,7 12,9 70,1 15,3 14,42

Óleo Soja 2,03 6,4 - - 3,3 32,5 45,5 18,7 21,73

MSC – Massa Seca Celular 3HHx – 3-hidroxihexanoato 3HO – 3-hidroxioctanoato 3HD – 3-hidroxidecanoato

3HDD – 3-hidroxidodecanoato %MSC – percentual da massa seca celular PHA - polihidroxialcanoato.

NC – não cresceu

Resultados e Discussão

Tabela 3. Produção de PHA por linhagens bacterianas isoladas e controle (P.

aeruginosa IPT 719).

Linhagem

Bacteriana

Substrato

MSC

(g/L)

Glicose

(g/L)

Frutose

(g/L)

3HHx

(mol%)

3HO

(mol%)

3HD

(mol%)

3HDD

(mol%)

PHAs

(%MSC)

IPT 705 G+F 0,99 6,0 0,00 4,61 0 11,4 11,7 76,9 2,21

Óleo Soja 0,82 7,1 - - - - - - 0,00

IPT 706 G+F 1,10 5,7

0,00 3,74 1,2 12,9 68,4 17,5 7,82

Óleo Soja 0,61 7,1

- - - - - - 0,00

IPT 707 G+F 2,35 6,6

0,34 4,23 0,0 0,0 0,0 100 1,35

Óleo Soja NC NC

- - NC NC NC NC NC

IPT 708 G+F 1,69 6,5

0,00 1,79 3,2 13,7 45,8 37,3 11,83

Óleo Soja 1,95 6,0

- - 0,0 54,9 36,0 9,1 11,93

IPT 709 G+F 1,13 5,2

0,10 1,38 0,0 10,1 72,4 17,5 10,65

Óleo Soja 0,76 6,4

- - 0 34,5 47,3 18,2 3,26

IPT 710 G+F 0,81 6,5

0,00 1,16 0,0 12,7 66,1 21,2 23,81

Óleo Soja 3,59 6,5

- - 4,1 39,6 42,1 14,2 12,67

IPT 711 G+F 1,42 5,7

0,00 1,65 0,0 12,8 67,0 20,2 19,46

Óleo Soja 3,33 6,4

- - 4,2 39,3 41,5 15,0 18,92

IPT 712 G+F 1,29 4,8

1,11 0,84 2,4 8,8 62,8 26,0 5,57

Óleo Soja 5,36 6,4

- - 4,7 43,2 39,9 12,2 11,62

IPT 713 G+F 1,28 6,5

0,00 1,48 0 tr 76,6 23,4 28,66

Óleo Soja 1,57 6,4

- - 0,0 38,4 38,0 23,6 4,00

IPT 714 G+F 1,93 5,6

0,32 0,00 0,0 13,3 70,9 15,8 10,39

Óleo Soja 6,04 6,2

- - 0,0 42,8 44,6 12,6 8,86

IPT 715 G+F 1,64 6,5

0,00 1,97 0,0 20,1 37,3 42,6 2,46

Óleo Soja 1,72 6,4

- - 10,1 33,6 33,5 22,8 5,25

IPT 716 G+F 1,63 6,3

0,15 0,17 - - - - 0,0

Óleo Soja 3,29 6,6

- - 0 47,7 40,4 11,9 16,76

IPT 717 G+F 1,48 4,9

2,49 0,00 5,4 0 49,6 45,0 3,94

Óleo Soja 2,14 6,4

- - 9,2 47,5 32,0 11,3 17,82

IPT 733 G+F 1,42 6,2

0,13 2,24 0,0 16,1 83,9 0,0 6,16

Óleo Soja 0,94 6,8

- - 0,0 8,5 52,8 38,7 4,4

IPT 734 G+F 1,40 6,5

0,00 2,09 11,3 27,8 38,1 22,8 5,43

Óleo Soja 0,44 7,1

- - - - - - 0,00

IPT 735 G+F 1,25 6,5

0,19 0,21 - - - - 0,00

Óleo Soja 2,12 6,4

- - 1,3 10,5 64,0 24,2 12,06

MSC – Massa Seca Celular 3HHx – 3-hidroxihexanoato 3HO – 3-hidroxioctanoato 3HD – 3-hidroxidecanoato

3HDD – 3-hidroxidodecanoato %MSC – percentual da massa seca celular PHA - polihidroxialcanoato.

NC – não cresceu

Resultados e Discussão

A composição do PHA tipicamente mostrou uma diferença dependendo da

fonte de carbono fornecida (Figura 15). Observa-se uma tendência geral dos

isolados em incorporar preferencialmente os monômeros 3HD e 3HDd a partir de

carboidratos em comparação ao óleo de soja. Por outro lado, os monômeros 3HHx

e 3HO parecem ser geralmente incorporados preferencialmente a partir do óleo de

soja em comparação a carboidratos. Diferenças dessa natureza na composição de

PHA também foram observadas por Silva-Queiroz (2003).

PHA

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Glicose e Frutose (mol%)

Óleo de Soja (mol%)

3HO 3HHx 3HD 3HDd

Figura 15. Variação na composição de PHA produzidos a partir de carboidratos ou

óleo de soja.

Um aumento na fração de 3HO e redução na fração 3HD são em geral

observadas quando óleo de soja é utilizado como fonte de carbono em

comparação com carboidratos (Silva-Queiroz, 2003). Este fenômeno

Resultados e Discussão

provavelmente é reflexo da especificidade de enzimas que transferem

intermediários das vias de metabolismo de ácidos graxos para a síntese de PHA.

Ou seja, as enzimas que transferem intermediários da biossíntese de ácidos

graxos para a biossíntese de PHA devem apresentar uma especificidade maior

para monômeros com cadeia de carbonos mais longa (C10 e C12) do que o

sistema responsável pela transferência de intermediários da β-oxidação para a

biossíntese de PHA. O inverso deve ocorrer com relação a monômeros de cadeia

de carbonos mais curta (C6 e C8). Rehm et al. (2001) observaram um aumento

expressivo na fração de monômeros 3HD no PHA sintetizado por mutantes de P.

aeruginosa afetados no gene rhlG quando cultivados em meio contendo gliconato,

o que sugere que o produto do gene rhlG também contribui com o fornecimento de

monômeros para a biossíntese de PHA, embora, esse gene tenha sido identificado

como associado a biossíntese de ramnolipídios (Campos-Garcia et al., 1998).

5.4. Produção de ramnolipídios

A produção de ramnolipídios foi analisada tanto pela detecção da presença

de ramnose como de 3HA no sobrenadante da cultura (Tabela 4).

Resultados e Discussão

Tabela 4. Produção de Ramnolipídios por linhagens bacterianas isoladas e

controle (P. aeruginosa IPT 719).

Ramnolipídio

Composição do 3HA (mol%)

Concentração (mg/L)

Composição (mol/L)

Linhagem

Bacteriana

Fonte

Carbono

3HHx

3HO

3HD

3HDD

3HA

Ramnose

Total 3HA Ramnose

3HA/Ram

(mol/mol)

IPT 719 G+F 3,3 10,5 72,0

14,2 75,9 43,7 119,6 0,45 0,27 1,69

Óleo Soja

3,2 16,3 73,6

6,9 621,1 97,5 718,6 3,75 0,59 6,31

IPT 633 G+F - - - - 0,0 11,6 11,6 0,00 0,07 0,00

Óleo Soja

- - - - 0,0 68,8 68,8 0,00 0,42 0,00

IPT 634 G+F 1,8 9,8 80,6

7,8 441,1 492,9 934,0 2,62 3,01 0,87

Óleo Soja

2,6 17,6 69,4

10,4 1087,6

141,3 1228,9

6,53 0,86 7,58

IPT 635 G+F 0,0 42,8 45,7

11,5 11,4 24,2 35,6 0,05 0,15 0,03

Óleo Soja

- - - - 0,0 101,4 101,4 0,00 0,62 0,00

IPT 636 G+F - - - - 0,0 2,2 2,2 0,00 0,01 0,00

Óleo Soja

8,6 36,2 44,4

10,8 54,0 44,2 98,2 0,34 0,27 1,26

IPT 638 G+F - - - - 0,0 16,7 16,7 0,00 0,10 0,00

Óleo Soja

- - - - 0,0 76,5 76,5 0,00 0,47 0,00

IPT 642 G+F 0,0 54,6 45,4

0,0 16,8 179,0 195,8 0,08 1,09 0,07

Óleo Soja

NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC

IPT 647 G+F 0,0 7,1 76,9

16,0 14,5 4,8 19,3 0,08 0,03 2,67

Óleo Soja

3,8 35,4 46,7

14,2 184,8 63,3 248,1 0,80 0,39 2,07

IPT 648 G+F - - - - 0,0 401,0 401,0 0,00 2,45 0,00

Óleo Soja

NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC

IPT 649 G+F 0,0 18,9 81,1

0,0 27,9 0,0 27,9 0,17 0,00 -

Óleo Soja

7,1 43,2 40,6

9,1 156,9 56,6 213,5 0,72 0,35 2,09

IPT 650 G+F 6,6 14,0 79,4 0,0 13,9 0,0 13,9 0,09 0,00 -

Óleo Soja

0,0 18,2 81,8

0,0 58,4 0,0 58,4 0,35 0,00 -

IPT 662 G+F - - - - 0,0 1,8 1,8 0,00 0,01 0,00

Óleo Soja

- - - - 0,0 41,7 41,7 0,00 0,25 0,00

IPT 666 G+F - - - - 0,0 20,5 20,5 0,00 0,13 0,00

Óleo Soja

- - - - 0,0 71,5 71,5 0,00 0,44 0,00

IPT 702 G+F 0,0 0,0 100 0,0 6,8 0,0 6,8 0,04 0,00 -

Óleo Soja

0,0 58,3 34,6

7,1 193,0 113,4 306,4 1,24 0,69 1,79

IPT 703 G+F 0,0 41,1 46,3

12,6 69,1 0,0 69,1 0,43 0,00 -

Óleo Soja

- - - - 0,0 26,3 26,3 0,0 0,16 0,00

IPT 704 G+F 0,0 13,0 84,2

2,8 46,9 66,0 112,9 0,28 0,40 0,70

Óleo Soja

0,0 11,7 77,4

10,9 75,3 17,9 93,2 0,44 0,11 4,03

3HHx – 3-hidroxihexanoato 3HO – 3-hidroxioctanoato 3HD – 3-hidroxidecanoato 3HDD – 3-hidroxidodecanoato

3HA – 3-hidroxialcanoatos detectados no sobrenadante 3HA/Ram – relação 3-hidroxialcanoatos e ramnose detectados

no sobrenadante NC – não cresceu

Resultados e Discussão

Tabela 4. Produção de Ramnolipídios por linhagens bacterianas isoladas e

controle (P. aeruginosa IPT 719).

Ramnolipídio

Composição do 3HA (mol%)

Concentração (mg/L)

Composição (mol/L)

Linhagem

Bacteriana

Fonte

Carbono

3HHx

3HO

3HD

3HDD

3HA

Ramnose

Total 3HA Ramnose

3HA/Ram

(mol/mol)

IPT 705 G+F

- - - -

0,0 22,8 22,8 0,00 0,14 0,00

Óleo Soja

- - - -

0,0 6,9 6,9 0,00 0,04 0,00

IPT 706 G+F

- - - -

0,0 330,8 330,8 0,00 2,02 0,00

Óleo Soja

- - - -

0,0 57,1 57,1 0,00 0,35 0,00

IPT 707 G+F 0,0 23,0 39,2

37,8 44,4 0,0 44,4 0,19 0,00 -

Óleo Soja

NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC

IPT 708 G+F 0,0 0,0 100 0,0 11,3 0,0 11,3 0,07 0,00 -

Óleo Soja

- - - - 0,0 61,5 61,5 0,00 0,37 0,00

IPT 709 G+F 0,0 0,0 100 0,0 10,7 0,0 10,7 0,06 0,00 -

Óleo Soja

- - - - 0,0 30,8 30,8 0,00 0,19 0,00

IPT 710 G+F 0,0 0,0 0,0 100 35,1 0,0 35,1 0,18 0,00 -

Óleo Soja

5,8 36,8 57,4

0,0 36,6 49,6 86,2 0,23 0,30 0,77

IPT 711 G+F 0,0 0,0 100 0,0 17,0 0,0 17,0 0,10 0,00 -

Óleo Soja

0,0 42,6 57,4

0,0 50,4 58,6 109,0 0,32 0,36 0,89

IPT 712 G+F - - - - 0,0 34,7 34,7 0,00 0,21 0,00

Óleo Soja

- - - - 0,0 90,3 90,3 0,00 0,55 0,00

IPT 713 G+F 0,0 11,2 62,2

26,6 35,3 9,9 45,2 0,20 0,06 3,36

Óleo Soja

0,0 100 0,0 0,0 2,3 29,5 31,8 0,02 0,18 0,11

IPT 714 G+F - - - - 0,0 39,6 39,6 0,00 0,24 0,00

Óleo Soja

0,0 8,9 83,6

7,5 93,2 64,7 157,9 0,55 0,39 1,39

IPT 715 G+F 0,0 0,0 100 0,0 6,1 327,2 333,3 0,04 2,00 0,02

Óleo Soja

0,0 45,2 54,8

0,0 13,6 112,5 126,1 0,09 0,69 0,13

IPT 716 G+F - - - - 0,0 17,3 17,3 0,00 0,11 0,00

Óleo Soja

0,0 63,8 36,2

0,0 35,3 91,4 126,7 0,23 0,56 0,42

IPT 717 G+F 0,0 55,1 12,8

32,1 59,7 239,8 299,5 0,34 1,46 0,23

Óleo Soja

10,7 48,7 31,3

9,3 370,0 62,2 432,2 1,88 0,38 4,96

IPT 733 G+F - - - - 0,0 54,2 54,2 0,00 0,33 0,00

Óleo Soja

- - - - 0,0 9,4 9,4 0,00 0,06 0,00

IPT 734 G+F 12,4 31,1 35,7

20,8 41,3 7,5 48,8 0,26 0,05 5,69

Óleo Soja

- - - - 0,0 8,1 8,1 0,00 0,05 0,00

IPT 735 G+F - - - - 0,0 0,0 0,0 0,00 0,00 -

Óleo Soja

- - - - 0,0 95,4 95,4 0,00 0,58 0,00

3HHx – 3-hidroxihexanoato 3HO – 3-hidroxioctanoato 3HD – 3-hidroxidecanoato 3HDD – 3-hidroxidodecanoato

3HA – 3-hidroxialcanoatos detectados no sobrenadante 3HA/Ram – relação 3-hidroxialcanoatos e ramnose detectados

no sobrenadante NC – não cresceu

Resultados e Discussão

A análise do sobrenadante para a presença de 3-hidroxialcanoatos,

demonstrou que seis linhagens bacterianas (IPT 719, IPT 634, IPT 647, IPT 649,

IPT 702 e IPT 717) apresentaram quantidades de 3HA superiores a 150 mg/L.

Uma destas linhagens como já mencionada era aquela considerada como

referência no experimento e não se trata de um isolado novo (IPT 719). Foram

detectadas quantidades elevadas de 3HA para a linhagem IPT 634 tanto a partir

de carboidratos como a partir de óleo de soja. Já para as demais linhagens

quantidades elevadas de 3HA foram observadas apenas no cultivo em óleo de

soja.

Soberón-Chavez e colaboradores (2005) afirmam que a composição de 3-

hidroxiácidos presentes nos ramnolipídios produzidos por bactérias não variam em

função da fonte de carbono fornecida e sugerem que esse comportamento resulta

do fato que apenas a biossíntese de ácidos graxos forneceria intermediários. Ou

seja, mesmo quando ácidos graxos são supridos, estes são inicialmente

convertidos a acetil-CoA e posteriormente transformados nos intermediários

necessários à síntese do ramnolipídios pela via de biossíntese de ácidos graxos.

Os resultados apresentados neste trabalho demonstram variações

significativas na composição de 3HA presentes em ramnolipídios quando óleo de

soja ou carboidratos são supridos (Figura 16). Embora a relação não seja tão clara

como aquela observada para a composição de PHA, no caso de ramnolipídios,

também se observa uma tendência geral dos isolados em incorporar

preferencialmente os monômeros 3HD e 3HDd a partir de carboidratos em

Resultados e Discussão

comparação ao óleo de soja. Por outro lado, os monômeros 3HHx e 3HO parecem

ser geralmente incorporados preferencialmente a partir do óleo de soja em

comparação a carboidratos.

Ramnolipídio

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Glicose e Frutose (mol%)

Óleo de Soja (mol%)

3HHx 3HO 3HD 3HDd

Figura 16. Variação na composição de 3HA presentes em ramnolipídios

produzidos a partir de carboidratos ou óleo de soja.

A análise do sobrenadante para a presença de ramnose revelou seis

linhagens com produção de ramnose superior a 150 mg/L (IPT 634, IPT 642, IPT

648, IPT 706, IPT 715 e IPT 717). Valores de ramnose superiores a 150 mg/L

foram atingidos apenas nos cultivos a partir de carboidratos.

A linhagem IPT 648 apresentou um comportamento interessante. Essa

linhagem não foi capaz de crescer em óleo de soja e não acumulou PHA a partir

de carboidratos. A análise do sobrenadante dessa linhagem revelou a presença de

quantidade expressiva de ramnose a partir de carboidratos, entretanto 3HA não foi

Resultados e Discussão

detectado. Estes resultados sugerem que esta linhagem produz apenas ramnose

e que foi detectado como um biossurfactante levemente aniônico em meio de

cultura PPSW.

Ramnolipídios de diferentes composições têm sido descritos na literatura. O

monorramnolipídio e o dirramnolipídio, constituídos por duas moléculas de

hidroxiácidos ligadas a uma ou duas ramnoses, respectivamente, são

considerados os principais ramnolipídios produzidos por P. aeruginosa (Ochsner &

Raiser, 1995). Utilizando naftaleno como fonte de carbono, Deziel et al. (1999)

detectaram a presença de quantidades expressivas de ramnolipídios contendo

apenas um 3HA, embora ainda permaneça obscuro se estes são resultado do

processo de biossíntese ou de um processo de degradação. Deziel et al. (2003)

descreveram a síntese de um precursor anabólico dos ramnolipídios consistindo

de duas moléculas de 3HA ligadas (3HAA) e que apresentam propriedades

tensoativas.

Será realmente uma surpreendente novidade caso se possa confirmar a

produção de duas ou mais ramnoses ligadas entre si pela linhagem IPT 648 e que

essas moléculas apresentam propriedades tensoativas. Bonilla et al.,(2005)

observaram um exopolissacarídio produzido pela linhagem Pseudomonas putida

ML2 que apresentava propriedades emulsificantes e que deve ser constituído de

unidades repetitivas de um hexassacarídeo com resíduos de N-acetil e O-piruvil.

Pode existir ainda um interesse comercial nessa descoberta pois o

processo de produção de ramnose é baseado na síntese prévia de ramnolipídios

Resultados e Discussão

seguida da recuperação da ramnose presente neste (Giani et al., 1997;

Füchtenbusch et al., 2000) e esta linhagem despertaria interesse como uma

produtora de ramnose que não necessitaria ser separada dos 3HA.

Com o objetivo de avaliar a reprodutibilidade do procedimento experimental

foram realizados experimentos em triplicata com a linhagem IPT 634, utilizando

óleo de soja ou uma mistura de glicose e frutose como fonte de carbono. A Tabela

5 apresenta os resultados relativos a produção de PHA e a Tabela 6 apresenta os

resultados relativos à produção de ramnolipídios.

Tabela 5. Produção de Polihidroxialcanoatos pela linhagem IPT 634.

Fonte Carbono MSC

(g/L)

Glicose

(g/L)

Frutose

(g/L)

3HHx

(mol%)

3HO

(mol%)

3HD

(mol%)

3HDD

(mol%)

PHA

(%MSC)

Glicose 2,29 6,38 0,00 6,44 0,0 26,4 65,4 8,2 16,01

+ 1,62 6,25 0,00 1,16 ND ND ND ND ND

Frutose ND 6,27 0,00 0,71 0,0 15,9 74,0 10,1 13,73

Média 2,0 6,3 0,0 2,8 0,0 21,2 69,7 9,2 14,9

Desvio Padrão

0,5 0,1 0,0 3,2 0,0 7,4 6,1 1,3 1,6

5,60 5,10 - - 0,0 30,7 60,3 9,0 8,24

Óleo de 4,78 5,30 - - 0,0 23,0 68,5 8,5 13,59

soja 7,35 5,10 - - 0,0 27,3 63,9 8,8 7,62

Média 5,9 5,2 - - 0,0 27,0 64,2 8,8 9,8

Desvio Padrão

1,3 0,1 - - 0,0 3,9 4,1 0,3 3,3

MSC – Massa Seca Celular 3HHx – 3-hidroxihexanoato 3HO – 3-hidroxioctanoato 3HD – 3-hidroxidecanoato

3HDD – 3-hidroxidodecanoato %MSC – percentual da massa seca celular PHA - polihidroxialcanoato.

ND – não determinado

A análise de PHA resultou em desvios padrões em geral correspondendo a

valores entre 10 e 15%, embora em alguns casos tenha se observado desvios da

ordem de 30%. Deve se levar em conta, entretanto, que a análise de PHA

MCL

resultante da análise individual de cada um dos monômeros que estão presentes

em quantidade bastante diferentes no PHA. Para a análise de 3HD, que está

presente em quantidades maiores no polímero os erros experimentais são

Resultados e Discussão

inferiores a 10%. Por outro lado, valores maiores foram verificados para

monômeros presentes em menor quantidade, como por exemplo o 3HO que

apresentou erros experimentais que atingiram até cerca de 30%. Resultados

semelhantes podem ser observados na análise de 3HA detectados no

sobrenadante. A análise de ramnose demonstra ser o procedimento que

apresenta maiores desvios. Este procedimento experimental é realizado em

triplicata, mas mesmo assim, para algumas amostras padrão se observam erros

significativos (maior que 20%). Dessa forma, entende-se que para obtenção de

dados mais precisos seria necessário utilizar metodologia com maior precisão

para a determinação de ramnose.

Tabela 6. Produção de Ramnolipídios pela linhagem IPT 634.

Ramnolipídio

Composição do 3HA (mol%) Concentração (mg/L) Composição (mol/L)

Fonte Carbono

3HHx

3HO 3HD

3HDD

3HA Ramnose

Total 3HA Ramnose

3HA/Ram(

mol/mol)

Glicose

0,0 5,8 86,9

7,3 620,3 405,8 1026,1 3,64 2,47 1,5

0,0 6,2 86,9

6,9 553,7 24,4 578,1 3,25 0,15 21,8

Frutose

0,0 7,1 92,9

0,0 568,9 366,7 935,6 3,39 2,24 1,5

Média

0,0 6,4 88,9

4,7 581,0 265,6 846,6 3,4 1,6 8,3

Desvio Padrão

0,0 0,7 3,5 4,1 34,9 209,8 236,9 0,2 1,3 11,7

0,0 24,1

75,9

0,0 32,1 37,7 69,8 0,20 0,23 0,9

Óleo de

0,0 16,9

83,1

0,0 33,5 24,9 58,4 0,20 0,15 1,3

Soja

ND ND ND

ND ND 31,7 ND ND 0,19 ND

Média

0,0 20,5

79,5

0,0 32,8 31,4 64,1 0,2 0,2 1,1

Desvio Padrão

0,0 5,1 5,1 0,0 1,0 6,4 8,1 0,0 0,0 0,3

3HHx – 3-hidroxihexanoato 3HO – 3-hidroxioctanoato 3HD – 3-hidroxidecanoato 3HDD – 3-hidroxidodecanoato

3HA – 3-hidroxialcanoatos detectados no sobrenadante 3HA/Ram – relação 3-hidroxialcanoatos e ramnose detectados

no sobrenadante NC – não cresceu

Resultados e Discussão

5.5. Inter-relação na síntese de PHA e ramnolipídios

Com o objetivo de avaliar a inter-relação metabólica entre a síntese de PHA

e de ramnolipídios, os dados de teor de PHA acumulado intracelularmente foram

plotados contra a concentração de 3HA (Figura 17) ou ramnose (Figura 18)

detectadas no sobrenadante. Nenhuma relação direta, seja positiva ou negativa,

entre o teor de PHA acumulado e a concentração de 3HA ou ramnose no

sobrenadante pode ser estabelecida. Entretanto, duas observações devem ser

destacadas. Quando o teor de PHA acumulado foi lançado contra a concentração

de 3HA no sobrenadante, as linhagens que apresentaram as maiores

concentrações de 3HA (>150 mg/L) apresentavam sempre teores de PHA

superiores a 10% da massa seca celular. Comparando-se o teor de PHA

acumulado e a concentração de ramnose detectada no sobrenadante, as

linhagens que apresentaram as maiores concentrações de ramnose (>150 mg/L)

apresentavam teores de PHA sempre inferiores a 15% da massa seca celular.

Estes resultados sugerem que bactérias capazes de sintetizar 3HA eficientemente

podem incorporá-los tanto em PHA como em ramnolipídios. Por outro lado,

somente bactérias com capacidade reduzida de produção de PHA podem

direcionar eficientemente parte da fonte de carbono para a produção de ramnose.

Resultados e Discussão

200

400

600

800

1000

1200

0 5 10 15 20 25 30

PHA (%MSC)

HA (mg/L)

Glicose e Frutose Óleo de Soja

Figura 17.. Relação entre o teor de PHA

MCL

acumulado e a quantidade de 3HA

detectado no sobrenadante.

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25 30

PHA (%MSC)

Ramnose (mg/L)

Glicose e Frutose Óleo de Soja

Figura 18. Relação entre o teor de PHA

MCL

acumulado e a quantidade de ramnose

detectada no sobrenadante.

Uma vez que esta família de compostos tensoativos podem apresentar

Resultados e Discussão

composição muito diversa (duas ramnoses e dois 3HA, uma ramnose e dois 3HA,

duas ramnoses e um 3HA, uma ramnose e um 3HA, ou apenas dois 3HA), neste

trabalho foi analisado tanto o 3HA como a ramnose presente no sobrenadante

como forma de avaliar o tipo de composto produzido (Figura 19). Dentre as

linhagens bacterianas que apresentaram maior concentração de ramnose ou 3HA

no sobrenadante, apenas a linhagem IPT 634 quando cultivada em carboidratos

apresentou uma proporção entre esses componentes indicando a produção de

dirramnolipídio. Para as demais linhagens, quando cultivadas em óleo de soja,

observou-se uma quantidade de 3HA que excede em muito aquela de ramnose

tanto para a produção de monorramnolipídio como de dirramnolipídio. Por outro

lado, quando cultivadas em carboidratos, as melhores linhagens indicaram uma

quantidade de ramnose que excede àquela necessária para a produção de mono

ou dirramnolipídios. Estes resultados sugerem que o óleo de soja é um bom

precursor para a síntese do 3HA, mas não da ramnose e que carboidratos são

bons precursores para a síntese de ramnose, mas não de 3HA.

As propriedades de atividade de tensão superficial de ramnolipídios podem

ser influenciadas pela relação entre dirramnolipídios e monorramnolipídios

presentes, bem como pela presença de 3-hidroxiácidos contendo insaturações,

entre outros fatores ( Nitschke et al., 2005). Assim, no futuro, uma das estratégias

para modular a composição de tensoativos da família dos ramnolipídios

produzidos, bem como suas propriedades, seria a utilização de diferentes fontes

de carbono ou misturas de fontes de carbono.

Resultados e Discussão

100

200

300

400

500

600

0 200 400 600 800 1000 1200

HA (mg/L)

Ramnose (mg/L)

Glicose e Frutose Óleo de Soja

Figura 19. Relação entre a quantidade de 3HA e ramnose nosobrenadante

doscultivos. A linha contínua indica valores esperados para

monorramnolipídio e a linha pontilhada para dirramnolipídios.

5.6. Produção de L-ramnosil-L-ramnose?

Com o objetivo de confirmar a produção de um L-ramnosil-L-ramnose pelo

isolado IPT 648, foi realizado um novo cultivo em MM contendo glicose e frutose

como fonte de carbono. As células foram retiradas por centrifugação e o

sobrenadante foi analisado diretamente por cromatografia líquida quanto à

presença de carboidratos ou foi previamente tratado por metodologia que envolve

a acidificação da amostra e hidrólise de carboidratos a 60-70

C. Após o

tratamento, a amostra foi neutralizada com NaOH e também analisada por

cromatografia líquida. As Figuras 20 e 21 apresentam os resultados da análise por

cromatografia liquida quanto à presença de ramnose. Na amostra não tratada

Resultados e Discussão

não se observou qualquer pico na região correspondente a ramnose,

entretanto, na amostra tratada observa-se claramente um pico com tempo de

retenção para esse carboidrato. Este resultado sugere que a linhagem IPT 648

produz L-ramnosil-L-ramnose ou oligômero ou ainda polímero contendo ramnose

como unidade monomérica.

Estudos futuros que determinem mais detalhadamente as propriedades de

tensão superficial deste material produzido pela linhagem IPT 648 deverão

esclarecer se realmente se trata de um biossurfactante, que comporia a família de

ramnolipídios e 3HAA.

Figura 20. Análise do sobrenadante do cultivo da linhagem IPT 648 após

tratamento ácido.

Resultados e Discussão

Figura 21. Análise do sobrenadante do cultivo da linhagem IPT 648 sem

tratamento ácido.

5.7. Obtenção de mutante afetado no metabolismo de biossíntese de PHA

A linhagem IPT 634 apresentou maior capacidade de produção de

ramnolipídios e assim foi submetida à radiação ultravioleta com o objetivo de obter

mutantes afetados no metabolismo de PHA e ramnolipídios.

Foi detectado um mutante, denominado 15A, que apresentava menor

opacidade em meio mineral contendo excesso de carboidratos (glicose 10 g/L) e

limitação na fonte de nitrogênio (Figura 21). O cultivo desse mutante nesse meio

mineral contendo o corante lipofílico Nile Red (Spiekermann et al., 1999)

demonstrou que este não apresentou fluorescência, enquanto a linhagem

selvagem apresentou (Figura 22). Estes resultados sugerem fortemente que o

Resultados e Discussão

mutante 15A é deficiente no acúmulo de PHA.

Figura 22. Cultivo de IPT 634 e seu mutante 15A em meio mineral probre em

nitrogênio contendo excesso de carboidratos.

Figura 23. Cultivo de IPT 634 e seu mutante 15A em meio mineral pobre em

nitrogênio contendo excesso de carboidratos e corante Nile Red.

Resultados e Discussão

O mutante 15A (Figura 24) e a linhagem selvagem IPT 634 (Figura 25)

foram ainda cultivadas em meio PPSW para avaliar sua capacidade de produção

de ramnolipídios. As duas linhagens apresentaram halos após 3 dias de

incubação, indicando que a produção de ramnolipídios não foi afetada.

Este mutante, bem como outros, poderão ser avaliados no futuro com o

objetivo de verificar a quantidade e composição de ramnolipídios produzidos.

Figura 24. Cultivo de Mutante 15A em meio PPSW

Figura 25. Cultivo da linhagem selvagem IPT 634 em meio PPSW

Conclusões

6. CONCLUSÕES

Neste trabalho, foram isoladas 293 bactérias de amostra de solo de Mata

Atlântica. Estes isolados foram avaliados quanto à produção de PHA e

ramnolipídios em meio mineral contendo carboidratos ou óleo de soja como fonte

de carbono. Os experimentos permitiram as seguintes conclusões.

• A composição do PHA produzido dependeu da fonte de carbono

utilizada, sendo que óleo de soja determina comparativamente a

incorporação de quantidades maiores de 3HO e 3HHx e os

monômeros 3HD e 3HDD foram incorporados comparativamente em

maiores quantidades nos cultivos em carboidratos.

• Diferenças na composição de 3HA presentes em ramnolipídios

também foram observadas depedendo da fonte de carbono

oferecida.

• A proporção de ramnose e 3HA presente no ramnolipídio também

variou com a fonte de carbono oferecida, sendo que óleo de soja

privilegia a síntese de 3HA, enquanto carboidratos levaram a

incorporação de maiores quantidades de ramnose

• Assim, a composição de ramnolipídios pode ser modulada tanto

do ponto de vista da composição do 3HA como da proporção

ramnose/3HA;

• Para uma linhagem isolada (IPT 648) foi detectada apenas

ramnose no sobrenadante. Estudos futuros poderão esclarecer se

Conclusões

este material apresenta propriedades tensoativas e deve ser

considerado como mais um membro da família dos ramnolipídios e

3HAA.

Referências Bibliográficas 83

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AAGOT, N.; NYBROE, O.; NILSEN, P. & JOHNSEN, K. An altered Pseudomonas diversity

is recovered from soil by using nutrient-poor Pseudomonas-selective soil extract media.

Appl. Environ. Microbiol.. v. 67, p. 5233-5239. 2001.

ANDERSON, A.J. & DAWES, E.A. Occurrence, metabolism, metabolic role and industrial

uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiol. Rev. v. 54, p. 450-472. 1990.

ARINO, S.; MARCHAL, R. & VANDECASTEELE, J.P. Involvment of a rhamnolipids-

producing strain of Pseudomonas aeruginosa in the degradation of polycyclic aromatic

hydorcarbons by a bacteial community. J. Appl. Microbiol. v.84, p.769-776. 1998.

BABU, G. N.; HAMMAR, W.J.; RUTHERFORD, D.R.; LENZ, R.W.; RICHARDS, R. &

GOODWIN, S.D. Poly-3-hydroxyalkanoates as pressure sensitive adhesives. In:

EGGINK, G.; STEINBÜCHEL, A.; POIRIER, Y. & WITHOLT, B (eds). International

Symposium on Bacterial Polyhydroxyalkanoates. NRC Research Press. Ottawa, p. 48-

45.1996.

BANAT, I.M. Biosurfactants Production and Possible Uses in Microbial Enhanced oil

Recovery and oil pollution Remediation: a Review. Bioresource Technology. v.51, p 1-

12. 1995.

BANAT, I.M.; MAKKAR, R.S. & CAMEOTRA, S.S. Potential commercial applications of

microbial surfactants. Appl. Microbiol. Biotechnol. v.53, p. 495-508. 2000.

Referências Bibliográficas 84

BARBOSA, H.R. Estudo da hemolisina de Pseudomonas aeruginosa . Tese apresentada

ao Instituto de Ciências Biomédicas para obtenção do título de Doutor em Ciências

Biológicas (Bioiquímica). 1972.

BARNUM, S. Biotechnology: an Introduction. Wadsworth Publishing Company – Beolmont.

225 p. 1998.

BEAL, R & BETTS, W.B. Role of rhamnolipid biosurfactants in the uptake and

mineralization of hexadecane in Pseudomonas aeruginosa . J. Appl. Microbiol. v.

89,p.158-168. 2000.

BECHER, P. Emulsion. Theory and Practice. second ed. Reinhold Publising . New York.

1965.

BENINCASA, M.; ABALOS, A. ; OLIVEIRA, I. & MANRESA, A. Chemical structure, surface

properties and biological activities of biosurfactant produced by Pseudomonas

aeruginosa LBI from soapstock. Antonie van Leewenhoek. v.85, p.1-8.2004.

BONILLA, M.; OLIVARO, C., CORONA, M. VASQUEZ, A. and SOUBES, M. Production and

characterization of a new bioemulsifier from Pseudomonas putida ML2. Journal of

Applied Microbiology. v.98, p. 456-463.2005.

BERGSTRÖM, S.; THEORELL, H. & DAVIDE, H. On a metabolic product of P. pyocyanea,

pyolipidic acid, active agains Myobacter tuberculosis. Ark. Kem. Mineral. Geol. v.23

p,1-12. 1946.

Referências Bibliográficas 85

BRANDL, H.; GROSS, R.A.; LENZ, R.W. & FULLER, R.C. Plastics from bacteria and for

bacteria: Poly(β-hydroxyalkanoates) as natural, biocompatible and biodegradable

polyesters. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. v. 41, p. 77-93. 1990.

BRINT, J.M. & OHMAN, D.E. Synthesis of multiple exoproducts in Pseudomonas

aeruginosa is under the control of RhlR-RhlI, another set of regulators in strain PAO1

with homology to the autoinducer responsive LuxR-LuxI family. J. Bacteriol. v. 177, p.

7155-7163. 1995.

BUISMAN, G.J.H.; CUPERUS, F. P. & WEUSTHUIS, R. A. G. Poly (3-hydroxyalkanoates)

paint and method for the preparation thereof. US Patent 6.024.784. 2000.

BULL, A. T., WARD, A.C.; GOODFELLOW, M. Search and discovery strategies for

biotechnology: the paradigma shift. Microbiol. Mol. Biol. Rev. v. 64, p. 573-606. 2000.

BURGER, M. M.; GLASER, L. & BURTON, R. M. The enzymatic synthesis of rhamnose-

containing glycolipids by extracts of Pseudomonas aeruginosa. J. Biol. Chem. v. 238, p.

2595-2602. 1963.

CAMPOS-GARCÍA, J.; CARO, A.C.; NÁJERA, R.; MILLER-MAIER, R.M.; AL-TAHHAN,

R.A. & SOBERÓN-CHÁVEZ, G. The Pseudomonas aeruginosa rhlG gene encodes an

NADPH-dependent -ketoacyl reductase which is specifically involved in rhamnolipd

synthesis. J. Bacteriol.. v. 180, p. 4442-4451. 1998.

CHAYABUTRA, C.; WU, J. & JU, LK. Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa

under denitrification : effects of limiting nutrients and carbon substrates. Biotechnol.

Bioeng. v.72, p.25-33. 2001.

Referências Bibliográficas 86

CHOI, j. & LEE, S.Y. Process analysis and economic evaluation for poly(3-hydroxyburate)

production by fermentation. Bioprocess. Eng.v. 17, p. 335-342. 1997.

CHOI, j. & LEE, S.Y. Factors affecting the economics of polyhydroxyalkanoates production

by bacterial fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. .v.51, p. 13-21. 1999.

CHOI, j. & LEE, S.Y. Economics considerations in the production of poly(3-hydroxyburate-

co-3-hydroxyvalerate) by bacterial fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. v.53, p.

646-649. 2000.

COMCIÊNCIA. Biodiversidae: valor econômico e valor social. col. 22- junho de 2001.

Revista Eletrônica de jornalismo científico (www.comciência.br). 2001.

COOPER, D.G. & GOLDBERG, B.G. Surface active agents from two Bacillus species. Appl.

Environ. Microbiol. v. 53, p. 224-229. 1987.

DE KONING, G.J.M.; KELLERHALS, M.; VAN MEURS, C. & WITHOLT, B. A process for

the recovery of poly(3-hydroxyalkanoates) from pseudomonas. Process development

and economic evaluation. Bioprocess Engineering, v.17, p. 15-21.1997.

DE MORAES, B. A.; CRAVO, C.A.N.; LOUREIRO, M. M.; SOLARI, C. A. & ASENSI, M.D.

Epidemiological analysis of bacterial strains involved in hospital infection an university

hospital from Brazil. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo. v. 42, p. 201-207. 2000.

DESAI, J. D.; DESAI, A. J. Production of Biosurfactants. IN. Kosaric (ed) Biosurfactants:

production. properties. applications. Marcel Dekker. Inc. New York. N.Y.1993.

DESAI, J. D. & BANAT, I. M. Microbial production of surfactants and their commercial

potencial. Microbiol. Mol. Biol. Rev.. v. 61, p. 47-64. 1997.

Referências Bibliográficas 87

DÉZIEL, E.; LÉPINE, F.; DENNIE, D.; BOISMENU, D.; MAMERO, A. & VILLEMUR, R.

Liquid chromatography/mass spectrometry analysis of mixtures of rhamnolipids

produced by pseudomonas aeruginosa strain 57RP grown on mannitol or naphtalene.

Biochim. Biophys. Acta.v.1440, p.244-252. 1999.

DÉZIEL, E.; LÉPINE, F.; MILOT, S. & VILLEMUR. R. Mass spectrometry monitoring of

rhamnolipidis form a growing culture of Pseudomonas aeruginosa strain 57RP.. Biochim.

Biophys. Acta.v.1485, p.145-152. 2000.

DÉZIEL, E.; LÉPINE, F.; MILOT, S. & VILLEMUR. R. rhlA is required for the production of a

novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosaÇ 3-(3-

hydroxyalkanoykoxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids.

Microbiology. v. 149, p. 2005-2013. 2003.

DONABEDIAN, H. Quorum Sensing and its Relevance to Infectious Diseases. J. Infect. v.

46, p. 207-214. 2003.

DUARTE, M. S.; LIMA, G. M. S.; .ARAUJO, J. M. & GOUVEIA, E. R. Produção de

Ramnolipídios por linhagens de Pseudomonas aeruginosa Isoladas de Petróleo. XIV

Simpósio Nacional de Fermentações. SINAFERM 2003. 5 a 8 de agosto 2003.

Florianópolis. SC.

DUBOIS, M.; GILLES, J. K.; HAMILTON, P. A.; REBERS, & SMITH, F. Colorimetric Method

for determination of sugars and Related Substances. 1956.

EDWARDS, JR. & HAYASHI, JÁ. Structure of a rhamnolipid from Pseudomonas

aeruginosa. Arch. Biochem. Biophys. v. 111, p.415-421. 1965.

Referências Bibliográficas 88

FIEDLER, SILKE.; STEINBÜCHEL, A. & REHM, B. H. A. PhaG-mediated Synthesis of

poly(3-hydroxyalkanoates) consisting of Medium-Chain-lenght Consituents from

Nonrelated Carbon Sources in Recombinant Pseudomonas fragi. Appl. Envirom.

Microbiol. v. 66, p.2117-2124. 2000.

FÜCHTENBUSCH, B.; WULLBRANDT, D. & STEINBÜCHEL, A. Production of

polyhydroxyalkanoic acids by Ralstonia eutropha and Pseudomonas oleovorans from

an oil remaining from biotechnological rhamnose production. Appl. Microbiol.

Biotechnol. v. 53, p. 167-172.2000.

GALLI, E.; BARBIERI, P.; BELTRAMETTI; F.; BERTONI; G.B. ; BOLOGNESE; G.;

GENNARO, P. & ZENNARO, E. Alternative pathways for biodegradation of alkyl and

alkylbenzenes. IN. NAKAZAWA, T.; FURUKAWA, K.; HAAS, D. & SILVER, S. (Ed.)

Molecular Biology of Pseudomonads. ASM Press – Washington DC. p. 48-57. 1996.

GEORGIOU, G.; LIN, S. & SHARMA, M.M. Surface active compounds from microrganisms.

Biotech.Technol. v.10, p.60-5.1992.

GIANE, C. ; WULLBRANDT, D.; ROTHERT, R. & MEIWES, J. Pseudomonas aeruginosa

and its use in process for the biotechnological preparation of L-rhamnose. United States

Patent; 5,658,793. 1997.

GOMEZ, J.G.C.; RODRIGUES, M.F.A.; ALLI, R.C.P.; TORRES, B.B.; BUENO NETTO,

C.L.; OLIVEIRA, M.S. & SILVA, L.F. Evaluation of soil gram-negative bacteria yielding

polyhydroxyalkanoic acids from carbohydrates and propionic acid. Appl. Microbiol.

Biotechnol. v. 45, p. 785-791. 1996.

Referências Bibliográficas 89

GOMEZ, J.G.C. Produção por Pseudomonas sp de polihidroxialcanoatos contendo

monômeros de cadeia média a partir de carboidratos: Avaliação da eficiência.

modificação da composição e obtenção de mutantes. Tese apresentada ao Instituto de

Ciências Biomédicas para obtenção do título de Doutor em Microbiologia. pp. 155.2000.

GOVAN, J.R.W. & DERETIC, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid

Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. v. 60, p. 539-574.

1996.

GUERRA-SANTOS, L.H.; KAPELLI, O. & FIECHTER, A . Pseudomonas aeruginosa

biosurfactant production in continuous culture with glucose as carbon source. Appl.

Environ. Microbiol. v. 48,301-305.1984.

GUERRA-SANTOS, L.H.; KAPELLI, O. & FIECHTER, A. Dependence of Pseudomonas

aeruginosa continuous culture biosurfactant production on nutritional and environmental

factors. Appl. Microbiol. Biotechnol. v. 24, p. 443-448. 1986.

HAUSER, G. & KARNOVSKY, M.L. Studies on the production of glycolipide by

Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. v.68, p.645-654. 1954.

HAUTHAL, H.G. L-Rhamnose als Zucherbaustein. Nachr Chem Technol Lab. v.42 , p. 285.

1994.

HAYWOOD, G.W.; ANDERSON, A.J.; EWING, D.F. & DAWES, E.A. Accumulation of

polyhydroxyalkanoate containing primarily 3-hydroxy-decanoate from simple

carbohydrate substrates by Pseudomonas sp. strain NCIMB 40135. Appl. Environ.

Microbiol. v. 56, p. 3354-3359. 1990.

Referências Bibliográficas 90

HAZENBERG, W. & WITHOLT, B. Efficient production of medium-chain-lenght poly(3-

hydroxyalkanoates) from octane by Pseudomonas oleovorans: economic considerations.

Appl. Microbiol. Biotechnol. v. 48, p. 588-596. 1997.

HERBERT, RA. A perspective on the biotechnological potential of extremophiles. Trends

Biotechnol. v.10, p. 395-402. 1992.

HERMAN, D.C.; ZHANG, Y. and MILLER, R.M. Rhamnolipids (Biosurfactant) Effects on

Cell Aggregation and Biodegradation of Residual hexadecane under Satured Flow

Conditions. Appl. Envirom. Microbiol. p. 3622-3627.1997.

HESTER, A. IB market forecast. Industrial Processing. 23 (5). 3.2001.

HOFFMANN,N.; STEINBÜCHEL, A. & REHM, B.H.A. The Pseudomonas aeruginosa phaG

gene product is involved in the synthesis of polyhydroxyalcanoic acid consisting of

medium-chain-lenght constituents from non-related carbon sources. FEMS Microbiology

Letters. v.184, p. 253-259. 2000

a .

HOFFMANN, N.; STEINBÜCHEL, A. & REHM, B.H.A. Homologous functional expression of

cryptic phaG from Pseudomonas oleovorans estabilishes the transacylase-mediated

polyhydroxyalkanoate biosynthetic pathway. Appl. Microbiol. Biotechnol. v.54, p. 665-

670. 2000b.

HOFFMAN, N.; AMARAL, A.A.; BEERMAN, B.B.; QI, Q.; HINZ, H. & REHM, B.H.A.

Biochemical Characterization of the Pseudomonas putida 3-hidroxyacyl ACP:CoA

Referências Bibliográficas 91

Transacylase. eich Diverts Intermediates of Fatty Acid de Novo Biosynthesis. The

Journal of Biological Chemistry. v.45, p. 42926-42936. 2002.

HOMMEL, R.K.; WEBER, L.; WEISS, A.; HIMELREICH, U.; RILKE, O. & KLEBER, H.P.

Production of sophorose lipid by Candida (Torulopsis) apicola grown on glucose. J.

Biotechnol.. v.33, p. 147-155. 1994.

HORI, K.; S, MARSUDI. & UNNO, H. Simultaneous production of polyhydroxyalkanoates

and rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa. Biotechnol. Bioeng. v.78, p. 699-707.

2002.

HUIJBERTS, G.N.M.; EGGINK. G.; DE WAARD. P.; HUISMAN. G.W. & WITHOLT, B.

Pseudomonas putida KT2442 cultivated on glucose accumulates poly(3-

hydroxyalkanoates) consisting of saturate and unsaturated monomers. Appl. Environ.

Microbiol. v. 58, p. 536-544. 1992.

HUIJBERTS, G.N.M.; DE RIJK, T.C.; DE WAARD, P. & EGGINK, G.

C Nuclear magnetic

resonance studies of Pseudomonas putida fatty acid metabolic routes involved in poly(3-

hydroxyalkanoate) synthesis. J. Bacteriol. v. 176, p. 1661-1666. 1994.

HUISMAN, G.W.; LEEUW, O.; EGGINK, G. & WITHOLT, B. Synthesis of poly-

hydroxyalkanoates is a commom feature of fluorescent pseudomonads. Appl. Environ.

Microbiol. v. 55, p. 1949-1954. 1989.

INOUYE, S. Plasmids. IN: ATKINSON. T. & SHERWOOD. R.F. (eds) Biotechnology

Handbooks 10 – Pseudomonas. Plenum Press – New York and London. pp 1-34. 1998.

Referências Bibliográficas 92

JARVIS, F.G. & JOHNSON, M.J. A glyco-lipid produced by Pseudomonas aeruginosa.

J.Am.Chem.Soc. v.71, p.4124-4126. 1949.

KIM,S.H.; LIM, E.J.; LEE, S.O.; LEE, J.D. & LEE, T.H. Purification and characterization of

biosurfactants from Nocardia sp. L-417. Biotechnol. Appl. Biochem.v 31, 249-253. 2000.

KOSARIC, N.; GRAY, N.C.C. & CAIRNS, W.L. Biosurfactants and Biotechnology,

Surfactant Science Series. Marcel Dekker. New York .v. 25, 1-19. 1983.

KRAAK, M.N.; KESSLER, B. & WITHOLT, B. In vitro activities of granule-bound poly[(R)-3-

hydroxyalkanoate] polymerase C1 of Pseudomonas oleovorans - Development of an

activity test from medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoate) polymerases. Eur. J.

Biochem. v. 250, p. 432-439. 1997.

LANG, S. & WULLBRANDT,D. Rhamnose lipids--biosynthesis. microbial production and

application potential. Appl. Microbiol. Biotechnol. v.51, p.22-32. 1999.

LANGENBACH, S.; REHM, B.H.A. & STEINBÜCHEL, A. Functional expression of the

PHA synthase gene phaC1 from Pseudomonas aeruginosa in Escherichia coli results in

poly(3-hjydroxyalkanoate) synthesis. FEMS Microbiol. Let. v. 150, p.303-309. 1997.

LEE, S.Y. & CHOI, J. Effect of fermentation performance on teh economics of poly (-

hydroxyabutyrate-co--hydroxyvalerate) by a mutant strain of Alcaligenes eutrophus. J.

Ferm. Bioeng. v.81, p. 255-258, 1996.

LEE, S.Y.; CHOI, J. & CHANG, H.N. Process developement and economic evaluation for

the production of polyhydroxyalkanoates by Alcaligenes eutrophus. In: EGGINK, G.;

Referências Bibliográficas 93

STEINBÜCHEL, A.; POIRIER, Y. & WHITHOLT, B. (eds) 1996 International Symposium

on Bacterial Polyhydroxyalkanoates, NRC Research Press , Ottawa, 1997, P. 127-136.

LIEBERGESELL, M.; MAYER, F. & STEINBÜCHEL, A. Analysis of polyhydroxyalkanoic

acid-biosynthesis genes of anoxygenic phototrophic bacterial reveals synthesis of

polyester exhibiting na unusual composition. Appl. Microbiol. Biotechnol. v. 40, p. 292-

300. 1993.

LIN, S.C.; CARSWELL, K.S.; SHARMA, M.M. & GEORGIOU, G. Continuous production of

the lipopeptide biosurfactant of Bacillus licheniformis JF-2. Appl. Microbiol. Biotechnol.

v.41, p. 281-285.1994.

LOBATO, A.K.C.L.; MACEDO, G.R.; MAGALHÃES, M.M.; ALMEIDA, A.F. & JÚNIOR,

L.M.B. Síntese de Biossurfactantes por Microrganismos Isolados de Poços de Petróleo.

XIV Simpósio Nacional de Fermentações. SINAFERM 2003. 5 a 8 de agosto 2003.

Florianópolis. SC.

MAIER, R. M. & SOBERON-CHAVEZ, G. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids:

biosynthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. v. 54, p.625-633.

2000.

MAKKAR, R.S. & CAMEOTRA, S.S. Production of biosurfactant at mesophilic and

thermophilic conditions by a strain of Bacillus subtilis. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.

v.20, p. 48-52. 1998.

MAKKAR, R.S. & CAMEOTRA, S.S. An update on the use of unconventional substrates for

biosurfactant production and their new applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. v. 58,

Referências Bibliográficas 94

428-434. 2002.

McCOOL, G.J. & CANNON, M.C. PhaC and PhaR are required for Polyhidroxialcanoic Acid

Synthase Activity in Bacillus megaterium. J. Bacteriol. v.13, p. 4235-4243. 2001.

MULLIGAN, C. N.; YONG, R. N. & GIBBS, B.F. Factors influencing the economics of

biosurfactants. In: Kosaric. N. (Ed.). Biosurfactants. Production, Properties,

Aplications. Marcel Dekker. New York. pp. 329-371. 1993.

MULLIGAN, C. N. ; YONG, R.N. & GIBBS, B. F. Heavy metal removal from sediments by

biosurfactants. J. Hazard. Mater. v. 85, p. 111-125.2001.

MULLIGAN, C. N. Enviromental aplications for biosurfactants. Envirom. Pollution. v .133 p.

183-198. 2005.

NITSCHKE, M.; SIDDAHARTA, COSTA, G.V.A.O. & CONTIERO, J. Rhamnolipid

Surfactants: An Update on the General Aspects os these Remarkable Biomolecules.

Biotechnol. Prog. v.21, p. 1593-1600.2005a.

NITSCHKE, M.; SIDDAHARTA, COSTA, G.V.A.O.; HADDAD, R.; GONÇALVES, L. A. G.;

EBERLIN, M.N. & CONTIERO, J. Oil Wastes as Unconventional Substrates for

Rhamnolipid Biosurfactant Production by Pseudomonas aeruginosa LBI. Biotechnol.

Prog. v. 21, p. 1562-1566. 2005b.

O’SULLIVAN, D.J. & O’GARA, F. Traits of fluorescent Pseudomonas spp. Involved in

suppression of plant root pathogens. Microbiol. Rev. v. 56, p. 662-676. 1992.

Referências Bibliográficas 95

OCHSNER, U.A. ; KOCH, A.K.; FIECHTER, A. & REISER, J. Isolation and characterization

of a regulatory gene affecting rhamnolipid biosurfactant synthesis in Pseudomonas

aeruginosa. J. Bacteriol.v. 176, p. 2044-2054. 1994a.

OCHSNER, U.A.; FIECHTER, A. & REISER, J. Isolation. characterization and expression in

Escherichia coli of the Pseudomonas aeruginosa rhlAB genes encoding a

rhamnosyltransferase involved in rhamnolipid biosurfactant synthesis. J. Biol. Chem. v.

269, p. 19787-19795. 1994b.

OCHSNER, U.A. & REISER, J. Autoinducer-mediated regulation of rhamnolipid

biosurfactant synthesis in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. v. 92,

p. 6424-6428. 1995.

OLVERA, C., J. B. GOLDBERG, R. SANCHEZ, AND G. SOBERON-CHAVEZ. The

Pseudomonas aeruginosa algC gene product participates in rhamnolipid biosynthesis.

FEMS Microbiol. Lett. v.179, p.85-90.1999.

ORNSTON, L.N. Regulation of catabolic pathways in Pseudomonas. Bacteriol. Rev. v. 35,.

p. 87-116. 1971.

PALEJWALA, S. & DESAI, J.D. Production of extracellular emulsifier by a Gram-negative

bacterium. Biotehcnol. Lett. v.11, p.115-118. 1989.

PARK, S.J.; PARK, J.P; LEE, S.Y.. Metabolic engineering of Escherichia coli for the

production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates rich in specific monomers.

FEMS Microbiology Letters.v. 214, p. 217-222. 2002

Referências Bibliográficas 96

PARK, S.J.; CHOI, J.; LEE, S.Y. Engineering of Escherichia coli fatty acid metabolism for

the production of polyhydroxyalkanoates. Enzyme and Microbial Technology. v..36:,p.

579-588. 2005.

PELCZAR, Jr.; CHAN, E.C.S. & KRIEG, N.R. Microbiology – Concepts and Applications.

McGraw Hill – New York. p. 896. 1993.

PHAM, T.H.; WEBB, J.S. & REHM, B.H. 2004. The role of polyhydroxyalcanoate

biossynthesis by P.aeruginosa in rhamnolipid ans alginate production as well as stress

tolerance and biofilm formation. Microbiology. v.150, p. 3405-3413. 2004.

PREUSTING, H.R. Pseudomonas oleovorans as a source of bioplastics: Production and

characterization of poly(3-hydroxyalkanoates). The Netherlands: 1992 (PhD Thesis –

University of Gröningen).

QI, Q.; STEINBÜCHEL, A. & REHM, B.H.A. Metabolic routing towards polyhydroxyalkanoic

acid synthesis in recombinant Escherichia coli (fadR): inhibition of fatty acid -oxidation

by acrylic acid. FEMS Microbiol. Lett. v. 167. p. 89-94. 1998.

QUEIROZ, S.R.S & SILVA, L.F. Biossíntese de polihidroxialcanoatos de cadeia média (

PHmcl) por bactérias a partir de óleos vegetais. Dissertação apresentada para obtenção

do Título de Mestre em Biotecnologia. pp.99. 2003

RAHIM, R.; OCHSNER, U.A.; OLVERA, C.; GRANINGER, M.; MESSNER, P.; LAM, J.S. &

SOBERÓN-CHÁVEZ, G. Cloning and functional characterization of the Pseudomonas

Referências Bibliográficas 97

aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2. an enzyme responsible for

di-rhamnolipid biosynthesis. Mol. Microbiol. v. 40. p. 708-718. 2001.

REHM, B.H.A.; KRÜGER, N. & STEINBÜCHEL, A. A new metabolic link between fatty acid

de novo synthesis and polyhydroxyalkanoic acid synthesis. J. Biol. Chem. v. 273.,

p.24044-24051. 1998.

REHM, B.H.A.; MITSKY, T.A. & STEINBÜCHEL, A. Role of fatty acid de novo biosynthesis

in polyhydroxyalkanoic acid (PHA) and rhamnolipid synthesis by pseudomonads:

establishment of the transacylase (PhaG)-mediated pathway for PHA biosynthesis in

Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. v. 67, p. 3102-3109. 2001.

REHM, B.H.A. Polyester synthases: natural catalysts for plastics. Biochem. J. v.376, p. 15-

33.2003.

REN, Q.; KESSLER, B.; VAN DER LEIJ, F. & WITHOLT, B. Mutants of Pseudomonas

putida affected in poly-3-hydroxyalkanoate synthesis. Appl. Microbiol. Biotech. v. 49, p.

743-750. 1998.

REN, Q.; SIERRO, N.; KELLERHALS, M.; KESSLER, B. & WITHOLT, B. Properties of

engineered poly-3-hydroxyalkanoates produced in recombinant Escherichia coli strains.

Appl. Environ. Microbiol. v. 66, p. 1311-1320. 2000.

REN, Q.; GRUBELNIK, A.; HOERLER, M.; RUTH, K.; HARTMAN, R.; FELBER,H. & ZINN,

M. Bacterial Poly (hydroxyalknoates) as a Source of Chiral hydroxialkoic Acids.

Biomacromolecules. v.6, p. 2290-2298. 2005.

Referências Bibliográficas 98

RIIS, V. & MAI, W. Gas chromatography determination of poly-β-hydroxybutyric acid in

microbial biomass-esther hydrochloric acid propanolisis. J. Chromatogr. v. 445, p. 285-

289. 1988.

RON, E.Z. & ROSENBERG, E. Biosurfactants and oil bioremediation. Cur. Op. Biotech. v.

13, p. 249-252. 2002.

SANTA ANNA, L.M., SEBASTIAN, G.V.; PEREIRA, N.; ALVES, T.L.; MENEZES, E.P. &

FREIRE, D.M. Production of biosurfactant from a new and promising strain of

Pseudomonas aeruginosa PA1. Appl.Biochem.Biotechnol. v.91, p.459-467. 2001.

SANTOS, A.S.; SAMPAIO, A.P.W.; VASQUEZ, G.S.; SANTA ANNA, L.M.; JR, N.P.;

FREIRE, D.M.G. Evaluation of Different Carbon and Nitrogen Sources in Production of

Rhamnolipids by a Strain of Pseudomonas aeruginosa. Appl. Biochem.Biotechnol. v.98,

p. 1025-1034. 2002.

SCHROTH, M. N.; HILDEBRAND, D.C. & PANOPULOS, N. Phytopathogenic

pseudomonads and related plant-associated pseudomononads, p. 3104-3131. In: A.

BALOWS, H. G., TRÜPER, M., DWORKIN, W. HARDER, & H. SCHLIEFER (ed.), The

prokaryotes. Springer- Verlag, Berlin, Germany. 1991.

SILVA, L.F.; GOMEZ, J.G.C.; OLIVEIRA, M.S. & ALTERTHUM, F. Freeze-drying of

industrial yeast strains: influence of growth condition. cooling rates and suspending

media on the viability of recovered cells. Rev. Microbiol. (São Paulo). v. 23, n. 2, p. 117-

122. 1992.

SIM, L.; WARD, O P. & LI, Z.Y. Production and characterisation of a biosurfactant isolated

Referências Bibliográficas 99

from Pseudomonas aeruginosa UW-1. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. v. 19, p.232-

238.1997.

SOBERÓN-CHÁVEZ, G. & AGUIRRE-RAMÍREZ, M. Is Pseudomonas aeruginosa Only

“Sensing Quorum”? Critical Reviews in Microbiology. v. 31, p.171-1782. 2005a.

SOBERÓN-CHAVEZ, G.; LÉPINE, F. & DÉZIEL, E. Production of rhamnolipids by

Pseudomonas aeruginosa. Appl. Microbiol. Biotech. 1-8. 2005b.

SPIECKERMANN, P.; REHM, B.H. A., KALSCHEUER, R.; BAUMEISTER, D. &

STEINBÜCHEL, A. A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct

screenig of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage

compounds. Arch.Microbiol. v.171, p. 73-80. 1999.

STANGHELINI, M.E. & MILLER, R.M. Biosurfactants: Their Identity and Potential Efficacy in

the Biological Control of Zoosporic Plant Pathogens. Plant Disease. v. 81, p. 4-12.

1997.

STANISLAVSKY, E.S. & LAM, J.S. Pseudomonas aeruginosa antigens as potential

vaccines. FEMS Microbiol Rev . v. 21, p. 243-277. 1997.

STEINBÜCHEL, A. Polyhydroxyalkanoic acids. IN: BYROM. D. (ed) Biomaterials. Novel

materials from biological sources. Macmillan Publishers. Basingstoke. p. 123-213. 1991.

STEINBÜCHEL, A. & VALENTIN, H.E. Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids.

FEMS Microbiol. Lett. v. 128, p. 219-228. 1995.

Referências Bibliográficas 100

SYLDATK, C.; LANF, S.; WAGNER, F.; WRAY, V. & WITTE, L. Chemical and physical

characterization of four interfacial-active rhamnolipids from Pseudomonas spec. DSM

2874 grown on n-alkanes. Z. Naturforsch. [C. ]. v.40, p.51-60.1985.

TAGUCHI, K.; AOYAGI, Y.; MATSUSAKI, H.; FUKUI, T. & DOI, Y. Co-expression of 3-

ketoacyl-ACP reductase and polyhydroxyalkanoate synthase genes induces PHA

production in Escherichia coli HB101 strain. FEMS Microbiol. Lett. v. 176, p. 183-190.

1999.

TIMM, A. & STEINBÜCHEL, A. Formation of polyesters consisting of medium-chain-length

3-hydroxyalkanoic acids from gluconate by Pseudomonas aeruginosa and other

fluorescent pseudomonads. Appl. Environ. Microbiol. v. 5, p. 3360-3367. 1990.

TRABULSI, L.R. & ALTHERTHUM, F. Microbiologia. Ed. Atheneu, 4º ed., p. 364. 2004.

TSUGE, T.; FUKUI, T.; MATSUSAKI, H.; TAGUCHI, S.; KOBAYASHI, G.; ISHIZAKI, A. &

DOI, Y. Molecular cloning of two (R)-specific enoyl-CoA hydratase genes from

Pseudomonas aeruginosa and their use for polyhydroxyalkanoate synthesis. FEMS

Microbiol. Lett. v. 184, p. 193-198. 2000.

VALENTIN, H.E.; LEE, E.Y.; CHOI, C.Y. & STEINBÜCHEL, A. Identification of 4-

hydroxyhexanoic acid as a new constituent of biosynthetic polyhydroxyalkanoic acids

from bacteria. Appl. Microbiol. Biotech. v. 40, p. 710-716. 1994.

VALENTIN, H.E.; SCHÖNENBAUN, A. & STEINBÜCHEL, A. Identification of 5-

hydroxyhexanoic acid. 4-hydroxyheptanoic acid and 4-hydroxyoctanoic acid as new

Referências Bibliográficas 101

constituents of bacterial polyhydroxyalkanoic acids. Appl. Microbiol. Biotechnol. v. 46, p.

261-267. 1996.

VAN DER WALLE, G.A.M.; BUISMAN, G.J.H.; WEUSTHUIS, R.A. et al. Development of

environmentally friendly coatings and paints using medium-chain-length poly(3-

hydroxyalkanoates) as the polymer binder. Int. J. Biol. Macromol. v. 25, p. 123-128.

1999.

VAN DYKE, M. I.; COUTURE, P.; BRAUER, M.; LEE, H. & TREVORS, J. T. Pseudomonas

aeruginosa UG2 rhamnolipid biosurfactants: structural characterization and their use in

removing hydrophobic compounds from soil. Can. J. Microbiol. v. 39, p.1071-1078.1993.

WILD, M.; CARO, A.D.; HERNÁNDEZ, A.L.; MILLER, R.M. & SOBERÓN-CHÁVEZ, G.

Selection and partial characterization of a Pseudomonas aeruginosa mono-rhamnolipid

deficient mutant. FEMS Microbiol. Lett. v. 153, p. 279-285. 1997.

WILLIAMS, S.F.; MARTIN, D.P.; HOROWITZ, D.M. et al. PHA applications: addressing the

price performance issue I. Tissue engineering. Int. J. Biol. Macromol. v. 25, p. 111-121.

1999.

WITHOLT, B. & KESSLER, B. Perspective of medium-chain-length poly(hydroxyalkanoates)

a versatile set of bacterial bioplastics. Cur. Op.Biotechnol. v. 10, p. 279-285. 1999.

WUBBOLTS, M.G. & WITHOLT, B. Selected industrial biotransformations. IN: ATKINSON.

T. & SHERWOOD. R.F. (eds) Biotechnology Handbooks 10 – Pseudomonas. Plenum

Press – New York and London. p. 271-329. 1998.

Referências Bibliográficas 102

ZHANG, Y. & MILLER, R.M. Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a

Pseudomonas rhamnolipid surfactant (biosurfactant). Appl. Environ. Microbiol. v. 58, p.

3276-3282. 1992.

ZHANG, Y. & MILLER, R.M. Effect of a Pseudomonas rhamnolipid biosurfactant on cell

hydrophobicity and biodegradation of octadecane. Appl. Environ. Microbiol. v. 60, p.

2101-2106. 1994.

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