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Universidade de São Paulo
Programa de Pós Graduação Interunidades em
Biotecnologia USP/ Inst. Butantan/ IPT
LEONARDO PAIVA FARIAS
Avaliação de Candidatos Vacinais Potenciais
Identificados no Transcriptoma do Schistosoma
mansoni através de vacinas de DNA
São Paulo
2006
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LEONARDO PAIVA FARIAS
Avaliação de Candidatos Vacinais Potenciais
Identificados no Transcriptoma do Schistosoma
mansoni através de vacinas de DNA
Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo pelo Programa de Pós
Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/ Inst.
Butantan/ IPT para obtenção do título de Doutor.
Área de Concentração: Biotecnologia
Orientador: Profa. Dra. Luciana Cezar de Cerqueira
Leite
São Paulo
2006
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DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
© reprodução total
Farias, Leonardo Paiva.
Avaliação de candidatos vacinais potenciais identificados no
transcriptoma do Schistosoma mansoni através de vacinas de DNA /
Leonardo Paiva Farias. -- São Paulo, 2006.
Orientador: Luciana Cézar de Cerqueira Leite.
Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de
Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação Interunidades em
Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT. Área de concentração:
Biotecnologia. Linha de pesquisa: Genoma funcional de Shistosoma
mansoni.
Versão do título para o inglês: Evaluation of potencial vaccine
candidates identified in the Schistosoma mansoni transcriptome
through DNA vaccines.
Descritores: 1. Schistosoma mansoni 2. Vacinas de DNA 3.
Genomas 4. Imunohistoquímica 5. Resposta imune I. Leite,
Luciana Cézar de Cerqueira II. Universidade de São Paulo. Instituto
de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia. III. Título.
ICB/SBIB073/2006
FOLHA DE APROVAÇÃO
LEONARDO PAIVA FARIAS
Avaliação de Candidatos Vacinais Potenciais Identificados no Transcriptoma do
Schistosoma mansoni através de vacinas de DNA
Tese apresentada ao Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Doutor.
Área de Concentração: Biotecnologia.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr.: ___________________________________________________________________
Instituição: ___________________________ Assinatura: ____________________________
Prof. Dr.: ___________________________________________________________________
Instituição: ___________________________ Assinatura: ____________________________
Prof. Dr.: ___________________________________________________________________
Instituição: ___________________________ Assinatura: ____________________________
Prof. Dr.: ___________________________________________________________________
Instituição: ___________________________ Assinatura: ____________________________
Prof. Dr.: ___________________________________________________________________
Instituição: ___________________________ Assinatura: ____________________________
Tese defendida e aprovada em: ____/____/____
Aos meus pais, Marcelo e Meire, e a
minha irmã Marcela pelo imenso amor.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Luciana, pelo apoio incondicional em todos os momentos deste
trabalho. Agradeço também por acreditar, muitas vezes mais do que eu mesmo, que as coisas
dariam certo. Finalmente, agradeço pelo exemplo de pragmatismo, praticidade e leveza com
que encara seus desafios dia a dia.
Aos Profs. Drs. Alan Wilson e Patricia Coulson por terem me recebido de maneira tão
amável em seus laboratórios. Pelas severas críticas e por compartilharem de maneira tão
generosa seus conhecimentos sobre a biologia do Schistosoma mansoni comigo.
Ao Prof. Dr. Sérgio Verjovski e a todo seu grupo de pesquisa, em especial (Julio
Garcia, Renato, Kátia, Giuliana e Ricardo), pela colaboração ao longo do projeto.
Aos participantes do Projeto Transcriptoma do Schistosoma em especial aos
bioinformatas João Paulo Piazza e Milton Yutaka Nishiyama.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo apoio financeiro para
a realização desse trabalho (processo no. 01/13099-8).
À CAPES, pelo apoio financeiro no exterior para realização de parte desse trabalho
(processo no. BEX3247/04-0).
Aos funcionários do Instituto Butantan, que de alguma maneira fizeram esse trabalho
possível. Em especial, ao pessoal do Infectório Central, sempre acessíveis e bem-humorados no
convívio diário.
Aos grupos dos Drs. Paulo Lee Ho, Elizabeth Martins e Ana Lucia Nascimento, pelos
anos de convívio e pelo acesso das dependências de seus laboratórios. Aos colegas de
laboratório. Obrigado por participarem dessa etapa, cada um de uma forma única.
À Dra. Eliane Miyaji pelo auxílio nas clonagens das vacinas de DNA e preparação das
mesmas, além das imunizações, transfecções e sangrias.
À Dra. Maria Eleonor pela ajuda nas imunizações e sangrias de centenas de
camundongos ao longo do projeto. Além da calma e leveza que transmite na manipulação dos
roedores.
Ao Dr. Inácio pela amizade e ajuda na montagem da biblioteca de cDNA de vermes
adultos.
À Me. Patrícia Aoki pela ajuda incansável nos desafios e perfusões dos animais. Pela
amizade, bom humor e alto astral com que sempre encarou o duro trabalho de ficar cheirando
sangue dias e dias. Valeu Pati!!!
Ao Henrique pela amizade sincera e carinhosa ao longo dos anos de convívio. Pelas
discussões desde renovelamento de proteínas até esquema tático de futebol.
A Karina Aires pela serenidade e postura exemplar dentro e fora do laboratório. Pelos
anos de convívio desde os tempos que almoçávamos no bandejão da USP, e por amar cebola.
Aos Bocas Pretas Marcelo e Ivan, pela amizade e companheirismo ao longo desses
anos, pelos almoços no feijão de corda e conversas filosóficas sobre a vida e a ciência, e pelo
exemplo de determinação.
À Adriana pela amizade e bom fluídos que transmite e à Ana Paula pela amizade e por
ser tão insuportavelzinha.
Ao Omar Boguitar pela amizade, pela ajuda inestimável e pelo exemplo de disciplina,
dedicação e empenho. Boguitar você faz pesquisa com a mesma raça com que joga bola.
Aos penitentes, Paula, Patrícia Aoki, Henrique, Márcia Rocha, Omar, Cibele, que
escolheram o Schistosoma como modelo de estudo de vacinas.
À Cibele e Ivone por me agüentarem e pela ajuda diária no dia a dia do laboratório.
À Samantha, Nábia e Isaura pelo período que estiveram no laboratório, pela dedicação e
auxílio em vários de meus experimentos.
À Daniela Ferreira pela amizade e ajuda ao longo do projeto, em especial nos
experimentos finais e durante a redação da tese, e pelo apoio incondicional nos momentos mais
difíceis.
Aos meus amigos do peito distantes − Douglinhas, Maurício Baiano e Cassinho.
Apesar da distância, vocês foram super importantes nessa fase.
A galera do pólo aquático pelos jogos e rachões que fazem a vida ficar mais leve.
Aos amigos Frazão, Carol, Mulan, Fritz, Lia, Tati, Nina, Gabi, Glau, Marcelões por
aqueles momentos de sossego, de divertimento, de abobrinhas, de gargalhadas, de comilança, e
de tudo de bom que ainda está por vir. Que venha !!!
À Dani pelo carinho, amor e compreensão que não tenho como descrever ou
mensurar... você sabe melhor que ninguém a sua importância nesta etapa da minha vida.
Obrigado !!!
À Isabel, Daniel e Luiza por fazerem parte da minha família do coração.
À minha família, também por tudo, em especial à minha mãe, meu pai e minha irmã,
pelo amor e confiança pra vida inteira, a qualquer hora.
RESUMO
FARIAS, L.P. Avaliação de Candidatos Vacinais Potenciais Identificados no
Transcriptoma do Schistosoma mansoni através de vacinas de DNA. 2006. 173f. Tese
(Doutorado) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo.
A esquistossomose atinge em média 200 milhões de pessoas em 76 países. Existe um consenso
que novos candidatos vacinais devem ser investigados. Minerando o banco de dados gerado
pelo Transcriptoma do S.mansoni utilizando a categorização por “Gene Ontology”,
identificamos novas proteínas potencialmente expostas na superfície ou exportadas; também
selecionamos genes com expressão aumentada no estágio de esquistossômulo. Um total de 31
genes foram clonados em vetores de vacinas de DNA e seu potencial protetor avaliado. Seis
candidatos vacinais (Apirase, Estomatina, rVLDL, Dife5, Antígeno5 e Lin-7) se demonstraram
mais promissores apresentando de 12 a 49% de proteção. Estes antígenos foram expressos em
E.coli e purificados como proteínas recombinantes. A resposta imune induzida pelas vacinas de
DNA foi caracterizada, e algumas das proteínas foram imunolocalizadas. Nossos resultados
confirmam que a seleção in silico seguida pela avaliação do potencial protetor usando vacinas
de DNA é uma estratégia eficiente para selecionar candidatos vacinais a partir de dados
genômicos.
ABSTRACT
FARIAS, L.P. Evaluation of Potencial Vaccine Candidates Identified in the Schistosoma
mansoni Transcriptome through DNA vaccines. 2006. 173f. Thesis (Doctoral) – Instituto de
Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo.
Schistosomiasis affects an estimated 200 million people in 76 countries; development of a
vaccine is warranted and novel vaccine candidates should be investigated. Mining the database
generated from S. mansoni Transcriptome using Gene Ontology categorization, potentially
surface-exposed or exported novel proteins were identified; genes up-regulated in the
schistosomulum stage were also selected. We have cloned a set of 31 genes into DNA vaccine
vectors and evaluated their protective potential against experimental challenge in mice. The six
more promising vaccines candidates (Apyrase, Stomatin, rVLDL, Dife5, Antigen 5 and Lin-7)
showed protection ranging from 12 to 49%. These antigens were expressed in E.coli and
purified as recombinant proteins. The immune response elicited by the DNA vaccines was
characterized, and immunolocalization was established for some of these proteins. Our results
confirm that in silico selection followed by evaluation of protective potential using DNA
vaccines is an efficient strategy to select potencial vaccine candidates from genomic data.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
aa aminoácido
ASP-2 Proteína Secretada de Ancilostoma 2
BSA Soro albunina bovina
cDNA DNA complementar
CMV Citomegalovirus
ConA Concanavalina A
CpG Dinecleotídeos citosina-guanina, seqüências CG imunomodulatórias
ELISA Ensaio imunoenzimático
EST Seqüêcias Expressas Etiquetadas
GO Gene Ontology
id identidade
IFA Adjuvante incompleto de Freund
IFN-γ
γγ
γ Interferon gama
IgG Imunoglobulina G
IgE Imunoglobulina E
IL Interleucina
MHC Moléculas do complexo principal de histocomatibilidade
ODN Oligodesoxinucleotídeos
OMS Organização Mundial de Saúde
ORF “Open Reading Frame” - Quadro Aberto de Leitura
PBS Solução salina tamponada
PLGA Co-polímero derivado dos ácidos poli-láctico e glicólico
RNAm RNA mesageiro
SCP Proteína de revestimento espermático
SmAE Schistosoma mansoni Assembled EST
Th1 Célula T auxiliar tipo 1
Th2 Célula T auxiliar tipo 2
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................................1
1.1. SITUAÇÃO DO PROBLEMA................................................................................................1
1.2. ESTRATÉGIAS PARA O DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA CONTRA A ESQUISTOSSOMOSE
.............................................................................................................................................3
1.3. O PARADIGMA DA VACINA DE CERCÁRIA ATENUADA E O MECANISMO PROTETOR TH1
VERSUS TH2 NO MODELO MURINO DA ESQUISTOSSOMOSE ......................................................5
1.4. BIBLIOTECAS DE EXPRESSÃO IMUNIZADORAS ..................................................................6
1.5. A ANÁLISE GENÔMICA PARA A IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS VACINAIS ........................7
1.6. TRANSCRIPTOMA E PROTEOMA DO S. MANSONI COMO BASE DE DADOS PARA A BUSCA DE
CANDIDATOS VACINAIS..........................................................................................................8
1.6.1. Transcriptoma ........................................................................................................8
1.6.2. Proteoma ................................................................................................................9
1.6.2.1. Secreções cercáriais .........................................................................................9
1.6.2.2. Tegumento.......................................................................................................9
1.6.2.3. Tubo Digestivo – “Gut” .................................................................................10
1.7. VACINAS DE DNA ........................................................................................................11
1.7.1. Respostas celular e humoral das vacinas de ácidos nucléicos ...............................11
1.7.2. Vias de imunização Intramuscular e Gene Gun.....................................................13
2. OBJETIVOS.......................................................................................................................................14
3. MATERIAIS E MÉTODOS. ............................................................................................................15
3.1. ANIMAIS E PARASITAS ..................................................................................................15
3.2. SELEÇÃO DOS CANDIDATOS VACINAIS IN SILICO .............................................................15
3.2.1. Análise das categorias GO (Gene Ontology).........................................................15
3.2.2. Análise das proteínas hipotéticas ..........................................................................16
3.2.3. Genes diferencialmente expressos.........................................................................16
3.2.4. Paralógos .............................................................................................................16
3.3. ANÁLISE DA COBERTURA DOS CANDIDATOS VACINAIS FRENTE À MONTAGEM DO GENOMA
DO S. MANSONI (ASSEMBLY DATA). ......................................................................................17
3.4. CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA DE CDNA DE VERMES ADULTOS .....................................17
3.5. VETORES DE EXPRESSÃO UTILIZADOS. ..........................................................................17
3.5.1. Construção das vacinas de DNA...........................................................................17
3.5.2. Vetores de expressão bacterianos .........................................................................19
3.5.3. Vetor de expressão para Pichia pastoris. ..............................................................19
3.6. TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS BHK E EXPRESSÃO TRANSIENTE .........................................20
3.7. IMUNIZAÇÕES...............................................................................................................20
3.7.1. Vacinas de DNA ...................................................................................................20
3.7.1.1. Via Intradérmica (Gene Gun).........................................................................20
3.7.1.2. Via Intramuscular...........................................................................................21
3.7.1.3. DNA encapsulado na forma de Microesferas (Intramuscular).........................21
3.7.2. Proteínas. .............................................................................................................22
3.8. DESAFIO.......................................................................................................................24
3.8.1. Desafio subcutâneo e Perfusão .............................................................................24
3.8.2. Desafio por penetração através da pele e Perfusão...............................................24
3.8.3. Ensaio de inibição de penetração pela pele ..........................................................25
3.9. EXPRESSÃO DE ANTÍGENOS CANDIDATOS EM E.COLI ......................................................26
3.10. EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS ANTÍGENO 5, FOSFATASE ALCALINA E FOSFODIESTERASE
EM PICHIA PASTORIS.............................................................................................................26
3.11. PURIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES: ESTOMATINA, LIN-7, DIFE5, ANTÍGENO
5, FOSFODIESTERASE, FOSFATASE ALCALINA E FRAGMENTO DA EQUICETINA. ......................27
3.11.1. rEstomatina (Ponto Isoelétrico – 5.83) ...............................................................27
3.11.2. rLin-7 (Ponto Isoelétrico – 8.57).........................................................................28
3.11.3. rEquicetina (Ponto Isoelétrico 5.61) ...................................................................28
3.11.4. rDife5 (Ponto Isoelétrico – 6.12, Peso molecular – 9,7 kDa) ..............................29
3.11.5. rAntigeno 5 (Ponto Isoelétrico 8.04) ...................................................................29
3.11.6. rFosfatase Alcalina (Ponto Isoelétrico – 6.10) ....................................................30
3.11.7. rFosfodiesterase (Ponto Isoelétrico – 6.28).........................................................31
3.12. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS. .......................................................................................31
3.13. REMOÇÃO DO TEGUMENTO E ENRIQUECIMENTO DAS MEMBRANAS DE SUPERFÍCIE.........32
3.13.1. Extração Diferencial do Tegumento....................................................................32
3.14. RESPOSTA IMUNE HUMORAL.......................................................................................32
3.14.1. Western blotting..................................................................................................32
3.14.2. Análise de indução de anticorpos e isotipagem ...................................................33
3.15. AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE CELULAR INDUZIDA EM ANIMAIS IMUNIZADOS........33
3.15.1. ELISPOT ............................................................................................................34
3.16. IMUNOLOCALIZAÇÃO ..................................................................................................35
3.17. ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................35
4. RESULTADOS ..................................................................................................................................36
4.1. PROJETO PILOTO...........................................................................................................36
4.1.1. Seleção de antígenos in silico usando uma base de dados com 23 mil ESTs ..........36
4.1.2. Clonagem dos candidatos vacinais e construção das vacinas de DNA - Projeto
Piloto .............................................................................................................................38
4.1.3. Expressão transiente em células de mamífero BHK...............................................39
4.1.4. Avaliação da atividade protetora dos candidatos vacinais através de vetores de
imunização gênica (Vacinas de DNA).............................................................................41
4.1.4.1. Desmembramento dos grupos protetores do Projeto Piloto e comparação das
vias intramuscular e intradérmica (Gene Gun) ............................................................43
4.1.5. Clonagem, expressão e purificação parcial dos antígenos em E. coli. ...................47
4.1.6. Avaliação da indução de resposta humoral...........................................................48
4.1.6.1. Polarização das respostas Th1 e Th2: Vias de imunização Intramuscular e Gene
Gun ............................................................................................................................48
4.1.7. Reavaliação das técnicas de desafio e perfusão utilizadas ....................................50
4.2. TRANSCRIPTOMA DO S. MANSONI: SELEÇÃO DE ANTÍGENOS IN SILICO E AVALIAÇÃO DE SEU
POTENCIAL PROTETOR USANDO UMA BASE DE DADOS COM 125 MIL ESTS .............................51
4.2.1. Seleção de antígenos in silico usando dados completos do Projeto Transcriptoma
do S. mansoni (125 mil ESTs) .........................................................................................51
4.2.1.1. SmAEs selecionados pelas categorias de Gene Ontology (GO). .....................51
4.2.1.2. Parálogos de candidatos vacinais....................................................................53
4.2.1.3. Hipotéticos.....................................................................................................54
4.2.1.4. Genes diferencialmente expressos ..................................................................55
4.2.2. Clonagem dos candidatos vacinais e construção das vacinas de DNA ..................56
4.2.3. Expressão transiente em células de mamífero BHK...............................................59
4.2.4. Avaliação da atividade protetora dos candidatos vacinais através de vetores de
imunização gênica (Vacinas de DNA).............................................................................60
4.3. INVESTIGAÇÃO DOS CANDIDATOS VACINAIS SELECIONADOS PELO TRANSCRIPTOMA E
PROTEOMA DO SCHISTOSOMA MANSONI.................................................................................64
4.3.1. Seleção e clonagem de candidatos vacinais pela estratégia de Proteoma..............68
4.4. AVALIAÇÃO DETALHADA DOS CANDIDATOS VACINAIS SELECIONADOS DO
TRANSCRIPTOMA E PROTEOMA DO S. MANSONI. ....................................................................69
4.4.1. Lin-7.....................................................................................................................69
4.4.1.1. Expressão e purificação da proteína LIN-7 em E. coli. ...................................71
4.4.2. Antígeno 5 ............................................................................................................72
4.4.2.1. Clonagem e expressão da proteína Antígeno 5 em E. coli e Pichia pastoris.....77
4.4.2.2. Avaliação da resposta humoral em animais imunizados com a vacina de DNA
pTARGET-Antigeno 5. ..............................................................................................81
4.4.3. Estomatina (SLP-2)...............................................................................................81
4.4.3.1. Expressão e purificação da proteína Estomatina em E. coli.............................82
4.4.3.2. Avaliação da resposta humoral em animais imunizados com a vacina de DNA
pDEST12.2 - Estomatina. ...........................................................................................85
4.4.3.3. Avaliação da resposta celular em animais imunizados com pDEST12.2-
Estomatina..................................................................................................................86
4.4.3.4. Produção de Anticorpos Anti-Estomatina.......................................................86
4.4.3.5. Detecção da proteína Estomatina no tegumento do Schistosoma mansoni.......88
4.4.3.6. Imunolocalização ...........................................................................................89
4.4.4. Dife5.....................................................................................................................91
4.4.4.1. Clonagem, expressão e purificação do domínio Upar LY6 em E.coli..............92
4.4.4.2. Avaliação da resposta humoral em animais imunizados com a vacina de DNA
pTARGET-Dife5........................................................................................................96
4.4.5. Receptor para VLDL (“Very Low Density Lipoproteins”).....................................96
4.4.6. Anexina.................................................................................................................97
4.4.7. Fosfatase Alcalina ................................................................................................98
4.4.7.1. Clonagem, expressão e purificação da Fosfatase Alcalina.............................100
4.4.8. Fosfodiesterase (NPP 5 – pirofosfatase nucleotídica 5) ......................................103
4.4.8.1. Clonagem expressão e purificação da Fosfodiesterase..................................105
4.4.9. Apirase ...............................................................................................................110
4.4.9.1. Avaliação da resposta humoral em animais imunizados com a vacina de DNA
pTARGET-Apirase...................................................................................................112
4.4.9.2. Avaliação da resposta celular em animais imunizados com pTARGET-Apirase
(ELISPOT)...............................................................................................................112
4.4.9.3. Primeiro experimento com a Proteína Apirase: Resposta humoral e ensaios
funcionais.................................................................................................................114
4.4.9.4. Ensaio de inibição de penetração pela pele...................................................114
4.4.9.2. Segundo experimento com a Proteína Apirase..............................................116
4.4.9.3. Terceiro experimento com a Proteína Apirase – investigando os pólos Th1 e
Th2...........................................................................................................................118
5. DISCUSSÃO.....................................................................................................................................123
5.1. GENOMA FUNCIONAL DE HELMINTOS ? .......................................................................123
5.2. PROJETO PILOTO.........................................................................................................124
5.3. TRANSCRIPTOMA........................................................................................................129
5.3.1. Seleção de candidatos por GO............................................................................129
5.3.2. Antígeno 5 ..........................................................................................................129
5.3.3. Estomatina..........................................................................................................132
5.3.4. Dife5...................................................................................................................134
5.3.5. Enzimas envolvidas no Metabolismo de Nucleotídeos .........................................135
5.3.5.1. Apirase ........................................................................................................136
6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS.............................................................................................141
6.1. PROJETO PILOTO.........................................................................................................142
6.2. TRANSCRIPTOMA........................................................................................................143
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................................146
ANEXO 1 – ALINHAMENTOS DA SEQÜÊNCIA DAS VACINAS DE DNA TESTADAS COM
AS PROTEÍNAS SIMILARES ENCONTRADAS NOS ESTUDOS DE PROTEOMA ...............155
___________________________________________________________________Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Situação do problema
A esquistossomose é uma doença endêmica parasitária de grande importância, sendo
responsável por 500.000 mortes anualmente (Dupré et al., 1999). Estima-se que cerca de 200
milhões de pessoas estejam infectadas e mais de 600 milhões residem em áreas de risco no
mundo, sendo a doença endêmica em 76 países, incluindo o Brasil (Bergquist, 1995) (Figura
1).
No Brasil, apresenta ampla distribuição, atingindo Estados do Norte (Pará, Rondônia),
todo o Nordeste brasileiro, região Sudeste (Rio de Janeiro, São Paulo, Minas Gerais, Espírito
Santo), a região Sul (Paraná e Santa Catarina) e no Centro-Oeste (Goiás e Distrito Federal). No
Brasil a estimativa é de que mais de seis milhões de casos ocorram anualmente. Em São Paulo,
os casos são assintomáticos e não se encontra muitos ovos nas fezes. Nos últimos dez anos
foram notificados mais de duzentos mil casos. A maioria desses casos foi classificada como
importados, sendo apenas 10% do total classificados como autóctones. As principais áreas de
transmissão no Estado ficam na Grande São Paulo, Baixada Santista, Vale do Ribeira, Vale do
Paraíba, Região de Campinas, Região de Ribeirão Preto e Região de Marília (Divisão de
Orientação Técnica - DOT – SUCEN, 2002).
Esta é uma doença típica de países em desenvolvimento, para a qual não há muito
interesse de grandes companhias farmacêuticas e de biotecnologia, de forma que este problema
de saúde pública pode ser visto como uma janela de oportunidades para a comunidade
científica do terceiro mundo.
Uma espécie deste parasita sangüíneo em particular, o Schistosoma mansoni, causa
morbidade e mortalidade significante. O ciclo deste parasita consiste em uma fase assexuada
de crescimento e diferenciação em um caramujo hospedeiro do gênero Biomphalaria,
caracterizada por duas gerações de esporocistos (primários e secundários). Os esporocistos
secundários dão origem às cercárias, fase larval infectante, que são liberadas do caramujo
hospedeiro na água. Em seguida ocorre a infecção do hospedeiro definitivo, o homem, no qual
a fase sexuada do ciclo ocorre. Dentro deste hospedeiro, o esquistossômulo migra do seu ponto
de entrada natural (a pele) para os pulmões e depois para o fígado, onde os jovens
esquistossômulos maturam. Os vermes adultos vivem na rede de capilares de órgãos
abdominais, e evitam o ataque pelo sistema imune do hospedeiro por vários mecanismos, dos
quais um dos mais importantes é a absorção de antígenos do hospedeiro na superfície do verme
(Bergquist, 1995). Após atingirem a maturidade sexual, pares de S. mansoni adultos (macho e
fêmea) cruzam e produzem ovos dentro das vênulas do mesentério (Figura 2). Estes ovos são
excretados nas fezes ou ficam presos dentro dos órgãos viscerais como o fígado, resultando em
granulomas, fibrose extensiva, e em casos de infecções severas podem levar à morte (Hota-
Mitchell et al., 1999).
___________________________________________________________________Introdução
2
Figura 1 – Distribuição global da esquistossomose causada pelo Schistosoma mansoni, S. intercalatum, S.
haematobium, S. japonicum e S. mekongi.
A quimioterapia constitui a principal medida terapêutica, porém tem a desvantagem de
não prevenir a reinfecção (um fato comum em regiões endêmicas), acarretando a necessidade
de muitos tratamento seqüênciais. Além disto, existe a possibilidade de seleção de uma
população de Schistosoma resistente à droga. A resistência aos esquistossomicídeos no campo
foi reportada pela primeira vez no Brasil por Katz et al. (1973). Estudos posteriores no Quênia,
onde uma dose mais alta de oxamniquina é requerida, mostraram a presença de vermes
resistentes mesmo após um extenso tratamento com este quimioterápico (Coles et al., 1987).
Cioli et al. (1993) apontam à ocorrência de resistência, tanto no campo como em laboratório,
contra os esquistossomicídeos da família da oxamniquina. Linhagens de S. mansoni resistentes
ao Praziquantel (PZQ), droga de preferência para o tratamento da esquistossomose (OMS,
___________________________________________________________________Introdução
3
1993), já foram isoladas no Egito e no Senegal (Fallon et al., 1995; Ismail et al., 1996, 1999).
Desta maneira, a estratégia mais eficiente e de menor custo para prevenir doenças severas e
mortes decorrentes deste parasita seria a vacinação dos indivíduos em áreas endêmicas (Hota-
Mitchell et al., 1999). Adicionalmente, a existência de imunidade protetora parcial em
humanos expostos, torna uma vacina um complemento lógico à quimioterapia (Bergquist &
Colley, 1998).
Figura 2 – Ciclo de vida do Schistosoma mansoni. Imagens de microscopia eletrônica de varredura dos seis
estágios do S. mansoni: cercária, esquistossômulo com 7 dias de cultivo, vermes adultos, ovos, miracídio, e “germ
balls” dissecadas a partir de esporocistos. (extraído e modificado da Figura suplementar 1 de Verjovski et al.,
2003).
1.2. Estratégias para o desenvolvimento de uma vacina contra a Esquistossomose
A maioria das vacinas atuais contra vírus e micróbios foram desenvolvidas
empiricamente, partindo da informação de que uma primeira exposição ao patógeno é capaz de
gerar uma forte imunidade contra a reinfecção. Porém, para os parasitas a situação é mais
___________________________________________________________________Introdução
4
complexa, porque eles desenvolveram mecanismos eficientes de evasão ao sistema imune
resultando em uma infecção crônica debilitante que pode persistir por mais de 30 anos no
hospedeiro (Harris et al., 1984).
Adicionalmente, o desenvolvimento de vacinas contra infecções parasitárias constitui
um desafio difícil e excitante em função da complexidade do ciclo de vida dos parasitas dentro
de seus hospedeiros, bem como pela diversidade de respostas imunes que eles geram (Dupré et
al., 2001). A maior dificuldade no desenvolvimento de uma vacina contra a esquistossomose
tem sido a escolha de antígenos definidos que estimulem uma resposta imune apropriada
induzindo a resistência (Yang et al., 2001).
Para antígenos protéicos a abordagem clássica é produzir anti-soro contra, por exemplo,
as secreções de cercária ou esquistossômulos, e usá-lo para varrer bibliotecas de expressão
(cDNA) construídas com mRNA do estágio do ciclo de vida apropriado. Entretanto, quando
esta estratégia foi realizada com os estágios larvais ela revelou uma população muito pobre de
novos antígenos. Por outro lado, o soro reconheceu o mesmo painel de antígenos citosólicos ou
de citoesqueleto altamente imunogênicos, descritos em outras varreduras de bibliotecas de
expressão, dentre os quais estão alguns dos candidatos vacinais eleitos pela OMS (Wilson et
al., 2004). Nossa conclusão é que novas abordagens são necessárias para identificar antígenos
alvos mais adequados.
Alguns antígenos foram identificados como protetores contra a esquistossomose
experimental, sendo considerados pela OMS como candidatos vacinais contra esta doença.
Estes antígenos incluíam a enzima glicolítica triose-fosfato-isomerase (SmTPI), uma
glutationa-S-transferase (Sm28), uma proteína de miofibrila - paramiosina (Sm97), uma
proteína homóloga à miosina humana (rIrV-5), e uma proteína de ligação a ácidos graxos
(Sm14) (Abath et al., 1998). Outros antígenos potenciais incluíam uma proteína integral de
membrana (Sm23), uma protease neutra ativada por cálcio (Smcalpain) (Yang et al., 2001) e
uma superóxido dismutase (SmSOD) (Shalaby et al., 2003). Diversos autores concordam que a
escolha destas moléculas para os testes iniciais não deve inibir a busca por novos antígenos
candidatos (Bergquist, 1995; Doenhoff, 1998; Wilson & Coulson, 1998), mesmo porque,
apesar destes antígenos apresentarem resultados inicialmente promissores, nenhum deles
atingiu nível de proteção superior a 40% quando testados por dois laboratórios independentes
em um ensaio encomendado pela OMS em 1995 (Bergquist & Colley, 1998).
Uma das principais razões pelas quais estas moléculas foram escolhidas para estes
estudos iniciais, é o fato de elas apresentarem alto grau de imunogenicidade, sendo algumas
delas identificadas utilizando soro de pacientes infectados. Entretanto, de acordo com o
postulado de Waksman (1988), ao invés de examinarmos antígenos parasíticos com alto
potencial imunogênico, deveríamos olhar para aquelas moléculas às quais pouca ou nenhuma
resposta imune é direcionada. Esta lógica é baseada no fato que o esquistossoma e muitos
outros parasitas são de vida longa no hospedeiro, de forma que qualquer um de seus antígenos
que induzam uma forte resposta imune não parecem ser importantes no contexto de vacinação,
___________________________________________________________________Introdução
5
uma vez que a sobrevivência do parasita é aparentemente inafetada por esta imunidade
(Doenhoff, 1998).
O desenvolvimento satisfatório de uma vacina contra a esquistossomose dificulta-se
ainda pela falta de consenso sobre o tipo de resposta imune que promove maior proteção.
Diferentes trabalhos em ratos e humanos sugerem que uma vacina contra S. mansoni deva
gerar mecanismos efetores do tipo Th2 (T-helper 2), enquanto estudos de vacinação em
camundongos indicam que a imunidade mediada pelas células-T, envolvendo mecanismos
dependentes de IL-12 e IFN-γ, Th1 (T-helper 1), seja a mais importante. Desta maneira
diferentes argumentos existem para ambos os lados do paradigma Th1-Th2 (Wynn
&Hoffmann, 2000).
1.3. O Paradigma da Vacina de Cercária Atenuada e o Mecanismo protetor Th1
versus Th2 no modelo murino da Esquistossomose
No caso específico da esquistossomose, os mecanismos de imunidade protetora têm
sido muito estudados após a imunização de camundongos com cercárias atenuadas, e os
resultados demonstram claramente um papel essencial das células T CD4
+
na aquisição desta
resistência. Camundongos recebendo uma única dose de cercárias irradiadas desenvolvem uma
imunidade parcial dependente da produção de IFN-γ a partir de células CD4
+
. A imunidade é
reduzida pela deficiência de células T CD4
+
, células B, IFN-γ ou IL-12, o que sugere o
envolvimento de uma resposta antiparasitária do tipo Th1. Embora o mecanismo efetor
antiparasitário operando no pólo Th1 seja muito discutido, existem fortes evidências que os
macrófagos e / ou as células endoteliais do pulmão ativadas por IFN-γ e TNF-α tenham um
papel central.
Curiosamente, quando camundongos recebem reforços (2x) da vacina contendo
cercárias irradiadas, desenvolve-se uma resposta mista Th1-Th2 e anticorpos específicos
contra o parasita são capazes de proteger passivamente camundongos não imunizados. Estes
resultados sugerem que as respostas efetoras mediadas por Th1 ou Th2 podem contribuir para
a proteção em animais imunizados múltiplas vezes (Wynn & Hoffmann, 2000).
A observação da proteção induzida por estas vacinas e especulações de como o verme
induz imunossupressão durante a infecção, levou Wilson et al. (1999) a propor a hipótese de
imunidade do “Vale Feliz”. De acordo com esta hipótese, o esquistossoma parece provocar
uma resposta “T helper” ineficiente com um perfil de citocinas mista Th1-Th2 ou Th0. Um
protocolo de vacinação com os antígenos relevantes, por exemplo, vacina de cercárias
irradiadas, o qual consiga uma polarização da resposta imune na direção Th1 ou Th2, seria
capaz de promover uma certa proteção. Quanto maior a polarização para um ou outro pólo,
maior o nível de proteção atingido, o que presumivelmente reflete o aumento de células T
responsivas, ou a concentração de anticorpos efetores. O camundongo nocaute para IFN-γ R (-
/-) representa o pólo extremo Th2 de uma proteção mediada por anticorpos. Por analogia, um
___________________________________________________________________Introdução
6
camundongo nocaute para IL-10 (-/-) e IL-4 R (-/-) deve representar o pólo Th1 extremo. Até o
momento, a estratégia mais próxima para atingir este pólo foi realizada com camundongos
C57BL/6 recebendo a vacina de cercária irradiada juntamente com IL-12 (Figura 3).
Figura 3 - Hipótese do Vale Feliz (Happy Valley), extraído e modificado de Wilson & Coulson (1999).
Com relação aos antígenos responsáveis por esta proteção, diversos autores postulam
que estes deverão estar presentes no estágio pulmonar de esquistossômulos. Isto pode ser
afirmado, uma vez que os parasitas não conseguem progredir além deste estágio, quando
injetados no hospedeiro na forma de cercárias irradiadas. Desta maneira as proteínas expressas
exclusivamente em adultos podem ser desconsideradas como indutoras importantes da
imunidade neste modelo. Adicionalmente, quando esquistossômulos atenuados do estágio
pulmonar são administrados via intradérmica, estes são capazes de elicitar altos níveis de
proteção frente ao desafio com cercárias. Fato que nos leva a concluir, que os antígenos
específicos de cercária também não são necessários para a indução de imunidade protetora
(Harrop et al., 1999).
1.4. Bibliotecas de expressão imunizadoras
Independente da estratégia vacinal utilizada, a questão central em um protocolo de
imunização é a escolha dos antígenos a serem utilizados (Johnston & Barry, 1997).
Atualmente, as bibliotecas de expressão imunizadoras (ELI - expression library immunization)
constituem uma das alternativas para análise funcional de genomas de patógenos em busca de
seqüências antigênicas. O método envolve a construção de bibliotecas de expressão em vetores
de imunização gênica a partir do genoma do patógeno. Estas bibliotecas são testadas quanto ao
seu potencial imunogênico e aquelas com maior capacidade de imunização são divididas em
___________________________________________________________________Introdução
7
sub-bibliotecas, as quais são novamente testadas quanto seu grau de imunização, e assim
sucessivamente até o isolamento de um ou mais clones imunogênicos (Johnston & Barry,
1997).
Esta metodologia foi utilizada pela primeira vez para proteger camundongos contra
Mycoplasma pulmonis através da vacinação com clones de DNA genômico em "pools"
(grupos) de 3.000 a 27.000 plasmídeos; uma dose acumulativa de menos de 1 ng de cada
plasmídeo foi suficiente para induzir uma resposta protetora (Barry et al., 1995).
Posteriormente este sistema foi utilizado para varrer os genomas de Leishmania major
(Piedrafita et al., 1999), Plasmodium chabaudi (Smooker et al., 2000) e Mycoplasma
hyopneumoniae (Moore et al., 2001) em busca de antígenos potenciais. Uma modificação
desta metodologia denominada cDELI (cDNA expression library immunization), baseada na
utilização de um grande número de clones de cDNA (2 x 10
4
) foi utilizada para imunizar
camundongos contra cisticercose, conferindo uma redução no número de parasitas de 65%. O
uso das cDELI pode ser particularmente interessante para patógenos com ciclo de vida
complexos e genomas grandes, já que essas bibliotecas podem ser montadas com genes
expressos em fases específicas do ciclo de vida do patógeno (Manoutcharian et al., 1998).
As ELI e cDELI são certamente boas abordagens para se localizar seqüências
antigênicas, porém apresentam algumas restrições. Um ponto crítico na utilização destas
bibliotecas é sua sensibilidade, que diminui à medida que se aumenta o tamanho do genoma
analisado, em função da diluição dos clones antigênicos (Johnston & Barry, 1997). Um outro
problema desta metodologia é a necessidade de se varrer as sub-bibliotecas até que estas
atinjam um número de clones factíveis à análise por seqüenciamento, o que a torna
demasiadamente lenta e trabalhosa.
O processo de identificação de seqüências antigênicas utilizando ELI ou cDELI pode
ser otimizado através do uso de ferramentas de bioinformática e bancos de dados. Estes
recursos permitem reduzir o número de seqüências potencialmente antigênicas através de uma
triagem prévia in silico (no computador), seguida da análise funcional por vetores de expressão
imunizadores.
1.5. A análise Genômica para a identificação de Antígenos Vacinais
Os recentes esforços em seqüenciamento genômico têm produzido uma quantidade
enorme de dados que necessitam ser analisados funcionalmente. No momento, nos bancos de
dados públicos já existem pelo menos 770 genomas totalmente seqüenciados (sendo 500 de
bactérias, 28 de arqueobactérias, 200 de vírus e 42 de eucariotos) e outros 248 projetos estão
em andamento (http://wit.integratedgenomics.com/GOLD/). A maioria destes genomas é de
patógenos humanos ou de animais comerciais, de forma que uma aplicação potencial destas
seqüências genômicas é o desenvolvimento de vacinas (Sykes & Johnston, 1999).
___________________________________________________________________Introdução
8
Em 2000, com o seqüenciamento de Neisseria meningitidis se inicia a era genômica
como nova estratégia para o desenho de vacinas, surgindo o termo vacinologia reversa. Nesta
estratégia utilizam-se algoritmos para minerar o genoma inteiro de um patógeno em busca de
proteínas com características desejadas. Seu poder reside na capacidade de selecionar entre
milhares de genes um subconjunto muito menor contendo aqueles mais promissores para
serem testados experimentalmente. A identificação de candidatos vacinais através da análise da
seqüência genômica já foi realizada para Neisseria meningitidis (Pizza et al., 2000),
Streptococcus pneumoniae (Wizemann et al., 2001) e mais recentemente em nossos
laboratórios para Leptospira interrogans (Nascimento et al., 2004). Para a busca de seqüências
específicas, foram utilizados algoritmos públicos baseados em motivos envolvidos no
transporte, exportação, ou ligação de proteínas à superfície celular. Em seguida os antígenos
potenciais foram expressos em E. coli e testados quanto à indução de imunidade protetora.
1.6. Transcriptoma e Proteoma do S. mansoni como base de dados para a busca de
candidatos vacinais.
1.6.1. Transcriptoma
O desenvolvimento da pesquisa sobre esquistossomose, até recentemente, carecia de
informações genômicas. Este quadro foi alterado significativamente em outubro de 2003 com a
publicação simultânea dos transcriptomas do Schistosoma mansoni (Verjovski et al., 2003) e
Schistosoma japonicum (Hu et al., 2003). Um total de 45.000 ESTs (Expressed Sequence
Tags) foram obtidas a partir de vermes adultos e de ovos do S. japonicum. Por outro lado,
125.000 ESTs derivados dos seis diferentes estágios do ciclo de vida do S. mansoni foram
analisadas, estimando-se que cerca de 92 % dos 14.000 genes preditos para este parasita foram
amostrados (Verjovski et al., 2003) (http://verjo18.iq.usp.br/schisto/). Estes novos dados
permitem “insights” sobre a biologia dos esquistossomos, abrindo a possibilidade para
identificação de potenciais candidatos vacinais e alvos para drogas esquistossomicidas
(Verjovski et al., 2004 e MacManus et al., 2004).
Através da análise do transcriptoma de um parasita é possível identificar genes cuja
função sugere estarem expostos na superfície do verme ou serem secretados, e ainda expressos
nos estágios que infectam o hospedeiro mamífero, todas as características importantes para um
candidato vacinal. De especial interesse são as toxinas, receptores de superfície para adesão
celular, proteínas de superfície expostas e receptores para fatores do hospedeiro.
Entretanto, a predição de candidatos vacinais com base apenas na informação de sua
seqüência é em certa medida especulativa, restando à tarefa considerável da análise funcional
de cada novo gene para identificar os potencias candidatos importantes para o desenvolvimento
de uma vacina (McManus et al., 2004).
___________________________________________________________________Introdução
9
1.6.2. Proteoma
Uma série de trabalhos recentes tem analisado o proteoma do esquistossoma utilizando
diferentes estratégias tentando caracterizar novos candidatos vacinais. Os alvos óbvios seriam
as proteínas secretadas ou expostas nos epitélios superficiais do parasita, que entram em
contato com o sistema imune do hospedeiro.
1.6.2.1. Secreções cercáriais
Com relação aos estudos de proteoma sobre o estágio larval de cercária, Knudesen e
colaboradores (2005) identificaram uma série de proteínas secretadas que podem estar
envolvidas no mecanismo de penetração através da pele e evasão imune. Posteriormente,
Curwen e colaboradores (2006), descreveram novas proteases e imunomoduladores que podem
facilitar a entrada da cercária no hospedeiro.
1.6.2.2. Tegumento
Vermes adultos (macho e fêmea) do Schistosoma mansoni com aproximadamente 1 cm
de comprimento, vivem nos vasos sanguíneos do sistema porta hepático, onde eles podem
sobreviver por décadas driblando a resposta imune. A superfície inteira do verme é recoberta
por uma camada sincicial denominada de tegumento, o qual é ligado por estreitas conexões
citoplasmáticas aos corpos celulares nucleados (Figura 4).
A maquinaria de exportação protéica, composta por ribossomos, retículo
endoplasmático e aparato de Golgi está situada nos corpos celulares, produzindo dois tipos de
inclusão, corpos discóides e vesículas multilaminadas. As membranas apicais do tegumento,
interface de contato entre o parasita e o hospedeiro, onde os mecanismos de evasão imune
residem, apresentam uma aparência heptalaminada. Esta estrutura é descrita como uma
membrana plasmática normal recoberta por uma dupla camada secretada, denominada de
membranocalíce. O membranocalíce é formado quando vesículas multilaminadas se fundem
com a membrana plasmática do tegumento, liberando seu conteúdo na sua superfície; o
membranocalíce é continuamente reposto, com tempo de meia vida in vivo de cinco dias.
Proteínas com funções diversas devem estar presentes na superfície do tegumento, incluindo
transportadores de açúcar e aminoácidos, enzimas e receptores. Alguns destes são conhecidos
por promover respostas de anticorpos em hospedeiros infectados, apesar dos parasitas
residentes aparentemente não serem afetados por estes anticorpos circulantes.
___________________________________________________________________Introdução
10
Figura 4 – Representação esquemática do tegumento, gentilmente cedida por Wilson (2005).
A principal interface do parasita com o hospedeiro é o tegumento, uma estrutura única
composta por uma dupla membrana que é crucial para modulação da resposta imune do
hospedeiro e sobrevivência do parasita. Embora muitas proteínas do tegumento tenham sido
identificadas por abordagens de bioquímica clássica, o conhecimento completo da composição
molecular do tegumento, até então era limitado. O seqüenciamento do genoma e do
transcriptoma do Esquistossoma, juntamente com o recente desenvolvimento das técnicas de
proteoma e lipidoma, permitiram estudos detalhados sobre as proteínas e lipídeos das
membranas tegumentares (Van Hellemond et al. 2006; Braschi et al., 2005a; van Balkom et
al., 2005). Adicionalmente, através de estudos de biotinilação das proteínas de superfície do
tegumento, Braschi e colaboradores (2005b) descreveram uma série de proteínas descritas
como as mais expostas na superfície de vermes adultos.
1.6.2.3. Tubo Digestivo – “Gut”
Outro epitélio de superfície de vermes adultos que vem sendo explorado pela
proteômica é o tubo digestivo ou “gut”; as secreções e as proteínas expostas no tubo digestivo
de vermes adultos podem ser consideradas como uma segunda fonte de proteínas que estão
acessíveis ao sistema imune do hospedeiro. Os esquistossômulos têm um tubo digestivo em
fundo-cego, pegando o sangue e depois regurgitando os dejetos. Enzimas digestivas e outros
componentes do tubo digestivo estão presentes no vômito juntamente com os produtos de
degradação do sangue (Figura 5).
Camada Muscular
Corpos celulares
nucleados
Membranocalice
Membrana
plasmática
“Surface pits”
Corpos
discóides
Vesículas
mutilaminadas
Tegumento
___________________________________________________________________Introdução
11
Figura 5 – Representação esquemática do tubo digestivo, gentilmente cedida por Wilson (2005).
Os resultados obtidos com a caracterização do vômito de vermes adultos, realizada pelo
grupo da Universidade de York, sugerem que algumas das proteínas identificadas podem ser os
alvos da resposta de imunidade protetora observada no modelo de auto-cura de macacos
Rhesus (Wilson 2005, comunicação pessoal).
Desta forma, a interpretação e integração do dados de genoma, transcriptoma, e
proteoma se tornou central para o entendimento da complexa relação parasita-hospedeiro, e
conseqüente delineamento de drogas candidatas e alvos vacinais (Liu et al., 2006).
1.7. Vacinas de DNA
1.7.1. Respostas celular e humoral das vacinas de ácidos nucléicos
Um dos maiores problemas da utilização de vacinas com organismos atenuados é o
risco de que alguns organismos escapem ou revertam da atenuação originando a forma
patogênica. As vacinas de ácidos nucléicos não apresentam este risco, sendo ainda capazes de
induzir as mesmas respostas imunes incluindo CTLs (cytotoxic T-lymphocytes), Th (T helper)
celular e humoral (anticorpos). Estas características tornam estas vacinas mais vantajosas do
que as vacinas baseadas em proteínas recombinantes ou peptídeos, as quais são geralmente
incapazes de induzir respostas CTL específicas. Outras vantagens importantes são a
simplicidade de produção do DNA plasmidial comparada com a purificação de proteínas
nativas ou recombinantes; a expressão eucariótica pelo hospedeiro vacinado; e o potencial de
se gerar uma imunidade por longos períodos de tempo em função da expressão continuada no
hospedeiro (Waine & McManus, 1997).
O mecanismo pelo qual células T citotóxicas são geradas, quando ácidos nucléicos são
introduzidos e expressos de forma endógena na célula hospedeira é o mesmo utilizado para a
identificação e destruição de células infectadas por vírus (Figura 6). Sinteticamente, células T
Hemoglobina
Vesículas
Glicocalice
Citoplasma
Golgi
Membrana Basal
Lamelas
Hematina
Membrana Plasmática
Núcleo
___________________________________________________________________Introdução
12
CD8
+
restritas, cuja principal função é reconhecer e matar células infectadas por vírus,
percebem o antígeno através dos peptídeos apresentados via molécula de MHC classe I da
célula hospedeira. Os peptídeos que se associam às moléculas do MHC-I são geralmente
derivados de uma síntese endógena no citoplasma. Em seguida, esses peptídeos são
transportados até o lúmen do retículo endoplasmático onde se associam a uma molécula de
MHC classe I. O complexo montado é depois translocado para a membrana plasmática, onde é
exposto como alvo para as células CD8
+
CTL.
A hipótese mais provável para explicar a geração de células Th (T helper) (CD4
+
restritas) e respostas de anticorpos (células B), seria que pequenas quantidades do peptídeo
sintetizado endogenamente poderiam extravasar continuamente das células transfectadas, ou
serem liberados após a morte da célula. De forma que a proteína extracelular poderia ser
endocitada por células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs), e subseqüentemente
processada e apresentada via moléculas de MHC classe II, sendo exposto como alvo para as
células do sistema imune CD4
+
restritas, as quais por sua vez estimulariam células B para a
produção de anticorpos (Waine et al., 1995). Uma das vantagens das vacinas de DNA é a
presença de motivos CpG não metilados no DNA plasmidial, os quais podem atuar como
adjuvantes e estimular diretamente as células do sistema imune a produzir citocinas pro-
inflamatórias e direcionar uma resposta imune do tipo Th1 (Da'dara et al., 2002).
As vacinas de ácidos nucléicos foram inicialmente avaliadas em modelos de infecções
virais, onde a replicação do patógeno ocorre no interior das células. A base da imunidade
protetora neste modelo é a geração de uma resposta CTL (T-citotóxica) contra as células
infectadas. Entretanto, estas vacinas também podem ser efetivas contra parasitas, cujo ciclo de
vida ocorre predominantemente ou completamente no meio extracelular. A imunidade
protetora contra estas infecções parece envolver anticorpos específicos e células Th (T helper),
as quais também são elicitadas com vacinas de DNA (Waine et al., 1995).
Vários candidatos vacinais de S. mansoni estão sendo estudados, entretanto a vacinação
de camundongos com estes antígenos individuais na forma de proteínas recombinantes ou de
vacina de DNA não tem demonstrado níveis de proteção satisfatórios nos desafios
experimentais. Pode-se questionar que a resposta imune induzida pela vacinação com um único
antígeno pode não ser forte o suficiente para combater um parasita tão grande e complexo. De
forma que o uso de vacinas multivalentes talvez seja capaz de induzir níveis mais altos de
proteção (Zhang et al., 2001).
___________________________________________________________________Introdução
13
Figura 6 - Modelo proposto para indução de imunidade protetora pelas vacinas de ácidos nucléicos (extraído de
Waine et al., 1995).
1.7.2. Vias de imunização Intramuscular e Gene Gun.
Vários estudos com vacinas de DNA mostram que imunizações intramusculares ativam
preferencialmente respostas do tipo Th1, caracterizadas pela produção de IFN-γ e IgG2a, o que
contrasta com as imunizações via intradérmica por gene gun, caracterizadas por baixa atividade
CTL (T citotóxica) e a predominância de anticorpos IgG1, os quais são marcadores para uma
resposta Th2. Estes resultados nos levam a conclusão que o sítio de injeção do DNA determina
o tipo de resposta imune. Adicionalmente, a polarização observada na resposta imune pode
ocorrer em função da quantidade de DNA utilizado em cada sistema. No caso da via
intramuscular, até 100 µg de DNA são usados, isto é 50 vezes mais do que no gene gun (1-2 µg
por tiro).
____________________________________________________________________Objetivos
14
2. OBJETIVOS
Com o início da era genômica e a grande quantidade de informações geradas a partir do
seqüenciamento de diferentes organismos, houve uma mudança no instrumental disponível
para identificação e classificação dos genes. Atualmente as ferramentas de bioinformática
permitem aos pesquisadores passar rapidamente da seqüência genômica para o
desenvolvimento de vacinas. Os genes são selecionados in silico utilizando algoritmos que
podem predizer antígenos potenciais, por exemplo, proteínas secretadas ou associadas à
superfície da membrana, fatores de virulência ou ainda epítopos reconhecidos por células T e
B (Grandi, 2001; Groot et al., 2001).
Nossa proposta foi selecionar in silico novas seqüências de S. mansoni com
características que indicassem algum potencial como candidato vacinal, através da análise do
Transcriptoma e do Proteoma deste parasita, em combinação com outros bancos disponíveis;
(GenBank e TIGR Índice), e testar este potencial através da avaliação da proteção induzida
pela imunização de camundongos com vetores de imunização gênica. O projeto teve 8 fases
com objetivos específicos:
1 - Avaliar o delineamento experimental com a realização de um projeto piloto contendo 9
antígenos vacinais.
2 - Selecionar cerca de 30 candidatos vacinais através da análise de Bioinformática utilizando
o banco de dados do Transcriptoma.
3 - Clonagem dos genes ou fragmentos gênicos e construção das vacinas de DNA.
4 - Avaliação da proteção induzida pelas vacinas de DNA visando caracterizar os antígenos
protetores.
5 - Caracterização detalhada dos antígenos protetores, incluindo buscas em bancos de dados de
Proteoma.
6 - Clonagem, expressão e purificação das proteínas descritas com maior potencial como
antígenos vacinais.
7 - Produção de anticorpos para ensaios de imunolocalização.
8 - Avaliação da resposta imune induzida pelos antígenos protetores.
___________________________________________________________Materiais e Métodos
15
3. MATERIAIS E MÉTODOS.
3.1. Animais e parasitas
A linhagem BH de Schistosoma mansoni foi mantida no laboratório da Dra. Toshie
Kawano (Dept. Parasitologia - Instituto Butantan) utilizando caramujos Biomphalaria glabrata
e camundongos BALB/c. As cercárias foram preparadas pela exposição de caramujos
infectados a luz por uma hora. O número e a viabilidade das cercárias foi determinado com
auxílio de uma lupa.
Camundongos fêmeas C57BL/6, 8-10 semanas de idade, foram adquiridas do Biotério
de Camundongos Isogênicos do Departamento de Imunologia ICB/USP para o primeiro
experimento de imunização. Para o segundo ensaio comparando as vias intradérmica (gene
gun) e intramuscular utilizamos camundongos fêmeas BALB/c, 5-6 semanas de idade,
adquiridas do Biotério de Central do Instituto Butantan. Para os ensaios da segunda fase do
projeto camundongos C57BL/6 (SPF – “specific pathogen free”), foram adquiridas do
Simonsen Laboratories, Gilroy, Califórnia, EUA.
3.2. Seleção dos candidatos vacinais in silico
Em um primeiro momento do projeto foi realizada uma busca sobre um conjunto de
23.000 seqüências (aproximadamente 1/6 do tamanho final do banco), agrupadas através do
programa Cap3 (Huang and Madan, 1999) em 7.505 SmAEs (Schistosoma mansoni
“Assembled Sequence” - montagem de uma ou mais seqüências). Este conjunto de dados havia
sido anotado automaticamente por BlastX nr (Altschul et al., 1997) com base no GeneBank,
ficando vinculado ao melhor alinhamento encontrado, isto é a seqüência com maior
similaridade encontrada. Na ocasião, como não possuíamos ainda um sistema de categorização
implementado no banco de dados, optamos por realizar buscas com os seguintes descritores:
“Receptor, Membrane, Surface, Tegument, Toxin, Antigen, Transporter, Unknown”.
Ao final do projeto do transcriptoma, foram feitas buscas sobre um conjunto de dados
contendo 126.787 seqüências. A montagem deste último conjunto de seqüências resultou na
formação de 30.990 SmAEs, dos quais 12.324 compostos por duas ou mais seqüências e
18.666 seqüências únicas (Verjovski et al., 2003). Como a seleção de candidatos vacinais não é
um processo trivial em helmintos, julgamos necessário adotar diferentes abordagens que
pudessem enriquecer o conjunto de genes selecionados.
3.2.1. Análise das categorias GO (Gene Ontology)
A categorização do banco por Gene Ontology (GO) (The Gene Ontology Consortium,
2000) permitiu olharmos os SmAEs de um modo “funcional” quanto ao Processo biológico, a
Função Molecular e ao Compartimento Celular que estes genes estivessem envolvidos. Desta
___________________________________________________________Materiais e Métodos
16
maneira conseguimos refinar nosso sistema de busca (http://cancer.lbi.ic.unicamp.br/cgi-
bin/schisto6/cap3/cteditor.pl?pkt_date=2001-10-01&todraw=browse).
3.2.2. Análise das proteínas hipotéticas
Em função da grande quantidade de SmAEs "no match" 51%, isto é, sem seqüência
similar descrita em outro organismo. Decidimos fazer um seleção deste conjunto de SmAEs
segundo os seguintes critérios:
- Ser formado por pelo menos 4 seqüências (“reads”)
- Possuir entre 600 e 2000 nucleotídeos (nt)
- Apresentar domínio PFAM ou SMART e sem BlastX nr <= 1e-5.
- Maior quadro aberto de leitura ORF (começando ATG, GTG, TTG e terminando com TAA,
TAG, TGA), tendo este entre 150 e 600 aa.
- Para achar as ORFs foi utilizando um programa do LBI, que marca sempre o maior quadro de
leitura.
Essas análises foram feitas in silico pelo Dr. João Paulo Piazza na época aluno do Prof.
Dr. João Setubal (Laboratório de Bioinformática - UNICAMP).
3.2.3. Genes diferencialmente expressos
Para avaliar genes diferencialmente expressos entre os diversos estágios do parasita
(ovo, miracídio, “germ balls”, cercária, esquistossômulo e adulto), bibliotecas de cDNA
(ORESTES) (Dias-Neto et al., 2000) foram construídas utilizando 6 iniciadores para cada um
dos estágios. O seqüenciamento de pelo menos duas placas por biblioteca resultou em pelo
menos 140 seqüências por estágio por iniciador (primer). Estas seqüências foram montadas, e o
número de seqüências por estágio de cada SmAEs foi considerado como uma inferência
indireta do nível de expressão dentro de cada estágio. Essas análises foram realizadas pelo
grupo de bioinformática do projeto. Adicionalmente, solicitamos que fosse feita uma
comparação apenas entre os estágios de cercária e esquistossômulo, respeitando os critérios
eqüitativos acima descritos, porém representados por um número maior de bibliotecas.
3.2.4. Paralógos
Comparações do banco de dados com seqüências protéicas conhecidas de S. mansoni
revelaram a existência de 149 novos genes paralógos. Para avaliar se a indução de uma
resposta imune contra ambos os antígenos aumentaria a proteção observada selecionamos
alguns paralógos de candidatos vacinais já descritos.
___________________________________________________________Materiais e Métodos
17
3.3. Análise da cobertura dos candidatos vacinais frente à montagem do Genoma
do S. mansoni (Assembly data).
O seqüenciamento completo do genoma do parasita está sendo realizado pelo Sanger
Institute (Wellcome Trust Sanger Institute Pathogen Sequencing Unit).
Visando obter mais informações sobre os genes previamente investigados como vacinas
de DNA, realizamos buscas em montagens parciais do genoma do S. mansoni
(http://www.genedb.org/genedb/smansoni/blast.jsp). As buscas foram feitas sobre uma base de
dados contendo uma cobertura de mais de 6 vezes dos 270Mb estimados para genoma do S.
mansoni.
3.4. Construção da Biblioteca de cDNA de vermes adultos
O RNA total foi extraído de vermes adultos (cerca de 1g) utilizando o reagente TRIzol
(Invitrogen) e o mRNA purificado utilizando colunas contendo oligo (dT) (Pharmacia), de
acordo com as recomendações do fabricante.
A síntese do cDNA foi conduzida com auxílio do kit "SuperScript
TM
Plasmid System
with Gateway
TM
Technology for cDNA Synthesis and Cloning" proveniente da GibcoBRL
.
3.5. Vetores de Expressão utilizados.
3.5.1. Construção das vacinas de DNA
Em função da grande quantidade de clonagens a serem realizadas, e tendo em vista
futuros desdobramentos deste projeto utilizando outros sistemas de expressão, acabamos por
escolher o sistema Gateway de clonagem e expressão (Invitrogen). Baseado no sistema bem
caracterizado de recombinação do fago I, a tecnologia Gateway permite a transferência de
segmentos de DNA entre diferentes vetores de clonagem mantendo a orientação e o quadro de
leitura, eliminando o uso de endonucleases de restrição e ligase. O sistema permite ainda a
clonagem direcional a partir de produtos de PCR em fundo cego. A estratégia de clonagem
pode ser resumida nas seguintes etapas:
- Amplificação dos candidatos vacinais por PCR utilizando como molde a biblioteca de cDNA,
clones do projeto que contivessem o gene completo, ou cDNA obtidos por RT-PCR. Os
iniciadores foram desenhados de modo a conter a seqüência de início de tradução de Kozak na
região 5' caccatg (a/g) e um códon de terminação na região 3' (taa/tag). As reações foram
realizadas com a polimerase de alta fidelidade Platinum Pfx (Invitrogen).
- Os fragmentos foram separados em gel de agarose 1% e purificados com o kit "GFX PCR
DNA and Gel Band purification kit" (Amersham Pharmacia Biotech).
___________________________________________________________Materiais e Métodos
18
- Os produtos purificados foram clonados de modo direcional no vetor de entrada "pENTR
Directional TOPO". Os recombinantes foram triados quanto à presença e orientação dos
insertos por PCR e seqüenciamento automático.
- Em seguida os insertos foram transferidos para o vetor de expressão em células de mamíferos
pDEST12.2 (contendo o promotor CMV), e para o vetor pDEST 17 (contendo o promotor T7)
para expressão em E. coli (Figura 7). Os recombinantes foram novamente triados quanto à
presença e orientação do inserto por reações de PCR e seqüenciamento automático.
Figura 7 - Representação esquemática da estratégia de clonagem utilizada.
Como controle da estratégia de clonagem utilizamos o vetor pENTR-Gus (controle do
kit) que foi recombinado com o vetor pDEST12.2. Adicionalmente, utilizamos o vetor
pTARGET (Figura 8) para o controle positivo Sm23, e para alguns antígenos analisados na
segunda fase do projeto. Para os experimentos de expressão transiente e imunizações, o DNA
plasmidial foi preparado utilizando o kit "Concert High Purity Plasmid Midiprep System"
(GibcoBRL) ou “QIAfilter Plasmid Maxi Kit” (QIAGEN).
Figura 8 – Representação esquemática dos vetores de expressão de células de mamíferos utilizados no projeto
pDEST12.2 e pTARGET.
pDEST 12.2
pDEST 17
Produto de PCR
___________________________________________________________Materiais e Métodos
19
3.5.2. Vetores de expressão bacterianos
Para expressão das proteínas recombinantes em E. coli, utilizamos os vetores pDEST17
(Invitrogen), pAE (Ramos et al., 2004) e pET28a (Novagen) (Figura 9).
Figura 9 – Representação esquemática dos vetores de expressão bacterianos utilizados no projeto pDEST17, pAE
e pET28a.
3.5.3. Vetor de expressão para Pichia pastoris.
Paralelamente à clonagem e expressão das proteínas recombinantes em E. coli,
clonamos o gene do Antígeno 5, da Fosfatase Alcalina e da Fosfodiesterase no vetor de
expressão secretório para Pichia pastoris pPICZα-A (Figura 10).
Figura 10 – Representação esquemática do vetor de expressão eucariótico secretório para a levedura Pichia
pastoris pPICZα A (Invitrogen).
___________________________________________________________Materiais e Métodos
20
3.6. Transfecção de células BHK e expressão transiente
A expressão dos diferentes candidatos vacinais foi testada in vitro, através da
transfecção transiente de células BHK (“Baby Hamster Kidney”), utilizando o reagente
“lipofectamine” (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante. Resumidamente,
as células BHK foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco BRL) suplementado com soro
fetal bovino 10% e 2mM de glutamina. Culturas semi-confluentes contendo cerca de 10
6
células foram incubadas com 3µg do DNA (previamente misturado com lipofectamine) durante
4 h a 37°C e 5% de CO
2
em meio sem soro. Após este período o meio de transfecção foi
removido e adicionou-se meio completo. Decorridas 24-48 h de incubação, as células foram
lavadas com PBS e procedeu-se à extração do RNA utilizando o reagente TRIzol (Gibco). Para
o controle da eficiência de transfecção, as células foram transfectadas com o vetor pEGFP, que
contem o gene repórter GFP sob controle do promotor CMV, e estas analisadas após 24-48 h
em microscópio de fluorescência.
A presença dos mRNAs específicos foi analisada por RT-PCR utilizando-se o kit
“SuperScript
TM
Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis” (Invitrogen). Para
estes ensaios o RNA total foi previamente quantificado e tratado com DNAse (livre de
atividade de RNAse) (Invitrogen); este procedimento foi realizado visando remover o DNA
plasmidial proveniente da transfecção.
3.7. Imunizações
3.7.1. Vacinas de DNA
3.7.1.1. Via Intradérmica (Gene Gun)
As partículas de ouro contendo DNA foram preparadas de acordo com as
recomendações do fabricante do equipamento "Helios-Gene-Gun" (Bio-Rad, Hercules, CA,
USA). Resumidamente, as partículas de ouro (1,6 µm) foram revestidas com 0,05 M de
espermidina através da agitação em vortex seguida de breve sonicação. O DNA plasmidial foi
precipitado nas partículas tratadas com espermidina na proporção de 2,8 µg de DNA por 1 mg
de partícula. O precipitado resultante (aderido às partículas) foi lavado três vezes com etanol
100%, e depois ressuspendido em etanol absoluto contendo 0,05 mg/ml de PVP
(polyvinylpyrolidone). A suspensão foi distribuída em um tubo de Tefzel com auxílio da
"Tubing Prep Station" (BioRad). Após a deposição das partículas no tubo, o etanol foi
removido e o material foi seco com um fluxo de nitrogênio por 5 min. O tubo foi cortado em
pedaços de 0,5 polegadas, cada um contendo 0,5 mg de partículas de ouro (1,4 µg de DNA), e
armazenados em um dessecador a 4°C. A qualidade das balas foi checada através da eluição do
DNA precipitado em 20 µl de TE e corrido em gel de agarose 1%. O aparelho de biobalística
foi gentilmente cedido pelo Dr. Célio Silva (Faculdade de Medicina – USP – Ribeirão Preto).
___________________________________________________________Materiais e Métodos
21
Um dia antes da inoculação, camundongos fêmeas BALB/c, de 5-6 semanas de idade,
tiveram seus abdomens depilados com creme depilatório (Veet). O DNA foi inoculado via
intradérmica com o aparelho de biobalística "Helios-Gene-Gun" a uma pressão de gás hélio de
350 psi. Os animais receberam dois reforços com intervalos de 15 dias (Figura 11).
3.7.1.2. Via Intramuscular
Camundongos fêmeas BALB/c ou C57BL/6 com 5-6 semanas de idade, receberam 50
µl em cada músculo tibial anterior, de uma solução 10 µΜ de cardiotoxina (Latoxan).
Decorridos cinco dias da injeção de cardiotoxina, o DNA plasmidial (50 µg) foi injetado
intramuscularmente com uma seringa de 1 mL e agulha com calibre de 29g. O volume total
injetado foi de 100 µl, com 50 µl sendo injetado em cada músculo tibial anterior. Os animais
receberam um reforço 21 dias após a primeira dose (Figura 11).
3.7.1.3. DNA encapsulado na forma de Microesferas (Intramuscular)
Em uma tentativa de simplificar o processo de vacinação, as vacinas de DNA contendo
os antígenos Estomatina e Antígeno 5 foram coencapsuladas com dimicolato de trealose
(TDM) em microesferas biodegradáveis de poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA) (Nanocore).
Camundongos fêmeas C57BL/6, 5-6 semanas, receberam uma dose única de 100 µl (50 µl
injetado em cada músculo quadríceps) de uma solução salina contendo 30 µg de DNA
plasmidial coencapsulado com 7.8 µg de TDM (Lima et al., 2003).
___________________________________________________________Materiais e Métodos
22
Figura 11 - Cronogramas dos experimentos de imunização com vacinas de DNA (Gene Gun e intramuscular).
3.7.2. Proteínas.
Para os experimentos com as proteínas recombinantes contamos com a colaboração do
doutorando Julio Garcia, aluno do Dr. Sérgio Verjovski-Almeida (Dept. Bioquímica – IQ –
USP – SP), que produziu a proteína recombinante Apirase enovelada (purificada e tendo
sofrido processo de renovelamento). No primeiro e segundo, experimento, a proteína foi
formulada com hidróxido de alumínio (Instituto Butantan – Divisão de Produção), com 10 µg
da proteína adsorvida em 1000 µg de hidróxido de alumínio. Camundongos (fêmeas) BALB/C,
5-6 semanas, foram imunizadas subcutaneamente com 10 µg da proteína recombinante. Na
Figura 12 encontra-se uma representação esquemática do regime de imunização empregado.
Sangria
Pré-imune
Dia 1
1° dose
Dia 28
3° dose
Dia 14
2° dose
Dia 54
Desafio
130 cercárias
Dia 103 Perfusão
Dia 13
Sangria 1
Dia 27
Sangria 2
Dia 49
Sangria 3
Gene Gun
(intradérmica)
Sangria
Pré-imune
Dia 1
1° dose
Dia 21
2° dose
Dia 50
Desafio
130 cercárias
Dia 99
Perfusão
Dia 20
Sangria 1
DNA intramuscular
___________________________________________________________Materiais e Métodos
23
Figura 12 - Cronogramas dos experimentos de imunização com proteínas recombinantes.
No terceiro experimento com a proteína Apirase, visando aumentar os títulos de
anticorpos obtidos e montar respostas Th1, Th2 e mista Th1/Th2, alteramos o regime de
imunização para 30 µg da proteína/dose (3 doses subcutâneas – intervalos de 15 dias) nas
seguintes formulações:
1 - Proteína Apirase (30 µg) + Oligonucleotídeos* (ODN – contendo motivos CpG – 30 µg) +
IFA (Adjuvante incompleto de Freud – 20% do volume total), visando obter um perfil de
resposta com características deslocadas para Th1 (formulação 1).
2 – Proteína Apirase (30 µg) + Hidróxido de Alumínio (3000 µg)– visando obter um perfil de
resposta com características deslocadas para Th2 (formulação 2).
3 - Para obtenção das respostas mistas, um grupo de animais foi primado com a formulação 1 e
recebeu dois reforços da formulação 2, enquanto outro grupo foi primado com a formulação 2
e recebeu dois reforços da formulação 1.
A lógica para utilizar este regime de imunização foi extraída dos trabalhos de Kumar
(2004).
Dia 70
Desafio
110 cercárias
Sangria
Pré-imune
Dia 1
1° dose
Dia 14
3° dose
Dia 7
2° dose
Dia 119 Perfusão
Dia 6
Sangria 1
Dia 13
Sangria 2
Dia 60
Sangria 3
Primeiro e Segundo
Ensaio
Dia 50
Desafio
110 cercárias
Sangria
Pré-imune
Dia 1
1° dose
Dia 30
3° dose
Dia 15
2° dose
Dia 100 Perfusão
Dia 14
Sangria 1
Dia29
Sangria 2
Dia 49
Sangria 3
Terceiro Ensaio
___________________________________________________________Materiais e Métodos
24
* Seqüência dos oligonucleotídeos utilizados em itálico os sítios dos dinucleotídeos CpG
TCCATGACGTTCCTGACGTT.
3.8. Desafio
Para a realização destes experimentos contamos com a colaboração da Me. Patrícia
Aoki Miyasato, aluna da Dra. Toshie Kawano.
3.8.1. Desafio subcutâneo e Perfusão
Os animais imunizados foram desafiados quatro semanas após o último reforço através
da injeção subcutânea (agulha 26G
1/2
) de 100 ou 130 cercárias, dependendo do ensaio. Sete
semanas após a infecção, os animais foram sacrificados por inalação de CO
2
, e os vermes
adultos removidos das veias do mesentério por perfusão do sistema porta hepático. O número
de vermes adultos foi contado com auxílio de uma lupa. A porcentagem de redução foi
calculada pela formula:
% de proteção = 100 –
As diferenças entre os grupos foi analisada estatisticamente através da análise de
variância (ANOVA) e com auxílio do teste-t de Student.
3.8.2. Desafio por penetração através da pele e Perfusão
Esta metodologia foi recomendada pelo grupo do Dr. Alan Wilson. Quatro semanas
após o último reforço, os animais tiveram seus abdomens raspados com auxílio de um tosador
(Oster Golden 45, lâmina cirúrgica cryotech 40), em seguida foram anestesiados com (55
mg/Kg de peso) de pentobarbital. Depois de acomodados em um “rack” de acrílico com os
anéis de metal sobre o abdômen, os animais foram desafiados (através de penetração pela pele)
com 130 cercárias (contadas por estimativa*) em cerca de 1mL de água declorada, durante 30
min (Figuras 13A e B).
Número médio de vermes recuperados dos animais imunizados
Número médio de vermes recuperados nos animais controles
x 100
___________________________________________________________Materiais e Métodos
25
Figura 13 – A - Anéis de metal confeccionados para o desafio através da penetração pela pele. B – Vista de topo
dos animais durante o desafio.
* O número de cercárias foi determinado em 1 mL de água “saturada” com cercárias; em
seguida foi feito o cálculo de que volume deveria ser adicionado para que se atingisse uma
“concentração” de 130 cercárias/mL. Para paralisar as cercárias para a contagem utilizamos
algumas gotas do corante "neutral red" (4%). Após o ajuste do volume, três alíquotas diferentes
foram contadas para verificar se a “concentração” estava correta.
Sete semanas após a infecção, os animais foram anestesiados com pentobarbital, e os
vermes adultos removidos das veias do mesentério por perfusão do sistema porta hepático a
partir da artéria aorta.
3.8.3. Ensaio de inibição de penetração pela pele
O ensaio de inibição de penetração foi adaptado de Goud et al., 2005. Resumidamente,
100-130 cercárias (em 100 µl) foram incubadas com 50 µl de soro de camundongos
imunizados com a proteína Apirase, ou 50 µl de soro de animais não imunizados. Após 1 h de
incubação a 37°C , as cercárias juntamente com o anti-soro foram aplicadas em 850 µl de água
declorada, para penetração pelo método do anel em camundongos anestesiados que tiveram
seus abdomens previamente depilados. As cercárias foram deixadas penetrar durante 30 min a
temperatura ambiente, após este período as larvas que não penetraram foram removidas da
superfície dos animais e contadas. Para determinar se houve diferenças entre os grupos
realizamos o teste-t de Student.
(A)
(B)
___________________________________________________________Materiais e Métodos
26
3.9. Expressão de antígenos candidatos em E.coli
Paralelamente à construção das vacinas de DNA, alguns dos genes selecionados foram
transferidos por recombinação para o vetor de expressão bacteriano pDEST 17, ou clonados
com auxílio de endonucleases de restrição nos vetores pAE ou pET28a, os quais possuem uma
cauda com seis histidinas na sua porção N-terminal (Figura 9). Os plasmídeos recombinantes
foram introduzidos na linhagem de E.coli BL21(SI), a qual possui o gene da T7 RNA
polimerase sob controle do promotor induzido osmoticamente proU. Um pré-inoculo foi
incubado durante 16 h, a 30°C, sob agitação (150 rpm) em 1ml de meio 2YT (sem NaCl)
contendo o antibiótico seletivo. Decorrido este período, o pré-inoculo foi lançado em 10 ml de
meio 2YT (sem NaCl), contendo o antibiótico seletivo e crescido até uma D.O. (densidade
ótica) de 0,5-0,6. Para indução da expressão das proteína recombinantes, foi adicionado à
cultura NaCl (300 mM concentração final) e esta incubada por mais 6 h. Após este período, as
culturas foram centrifugadas e as bactérias ressuspendidas em tampão PBS (1x). Em seguida,
as bactérias foram lisadas com auxílio de um sonicador por 2 min com pulsos de 60 Hz e
novamente centrifugadas a 10.000 rpm 10 min; o pelete foi então ressuspendido em uma
solução de Uréia 8M, Tris 20 mM pH 8.0 e 150 mM NaCl. Posteriormente, o sobrenadante
(proteínas solúveis) e o pelete (corpúsculos de inclusão – proteínas insolúveis) foram
analisados quanto à presença e quantidade da proteína recombinante em géis de SDS-PAGE 12
e 15 %.
3.10. Expressão das proteínas Antígeno 5, Fosfatase Alcalina e Fosfodiesterase em
Pichia pastoris.
As leveduras (Pichia pastoris cepa GS115) foram transformadas por eletroporação e os
clones positivos selecionados em meio YPDS acrescido de 100 µg/mL de zeocina. Em seguida,
foram selecionados vinte clones para cada construção, os quais foram testados quanto ao
fenótipo Mut
+
ou Mut
s
, isto é, capacidade de metabolizar metanol normalmente ou de modo
lento. Os clones com o fenótipo Mut
+
foram então selecionados pela possível presença de
múltiplas cópias integradas no genoma da levedura; para tanto foram plaqueados em
concentrações crescentes de zeocina (200, 500, 1000 e 2000 µg/mL). A presença do gene de
interesse integrada ao genoma da levedura foi confirmada por PCR, utilizando como molde
para reação um lisado das colônias de leveduras. Os clones que apresentaram melhor
crescimento nas maiores concentrações de zeocina, foram então testados quanto à capacidade
de expressar a proteína recombinante.
Para avaliar a capacidade dos clones selecionados em expressar a proteína
recombinante, uma colônia isolada de cada clone (10 no total) foi lançada em 10 mL de meio
BMGY em tubos de 50 mL, após 20 h de cultivo a 28°C e agitação a 300 rpm, as culturas
foram centrifugadas (3000 x g) por 5 min e ressuspendidas em 10 mL de meio de indução
___________________________________________________________Materiais e Métodos
27
BMMY. A indução foi mantida através da adição de metanol 100% para uma concentração
final de 0,5% a cada 24 h. Alíquotas de 1 mL da cultura foram retiradas a cada 24 horas para se
monitorar o nível de expressão da proteína recombinante.
3.11. Purificação das proteínas recombinantes: Estomatina, Lin-7, Dife5, Antígeno
5, Fosfodiesterase, Fosfatase Alcalina e fragmento da Equicetina.
Após o período de indução, cada cultivo de E. coli (600 mL ou 300 mL) foi
centrifugado (10.000 rpm durante 10 minutos, a 4°C), o pelete de bactérias foi ressuspendido
em tampão de lise (40 mL ou 30 mL) e lisado no aparelho French Press (1500 psi – 2
passagens), e novamente centrifugado (10.000 rpm, 30 min, 4°C). As proteínas recombinantes
contidas na fração dos corpúsculos de inclusão ou fração solúvel (sobrenadante) foram
processadas e purificadas pelos seguintes protocolos:
3.11.1. rEstomatina (Ponto Isoelétrico – 5.83)
Os corpúsculos de inclusão contendo a proteína recombinante foram ressuspendidos e
lavados 2 vezes com 20 mL de uma solução (tampão de lise + Triton 2% + 2M uréia + 5mM
beta-mercaptoetanol) e posteriormente 1 vez com apenas tampão de lise, sendo centrifugados
10.000 rpm, 30 min, 4°C, após cada lavagem.
Após a lavagem dos corpúsculos estes foram ressuspendidos em 20 mL de uma solução
(Fosfato de Sódio 50mM p.H. 8.3, NaCl 300mM, Imidazol 20mM, 5mM beta-mercaptoetanol,
8M uréia). A proteína foi renovelada por diluição lenta em uma solução (Fosfato de Sódio
50mM p.H. 8.3, NaCl 300mM, Imidazol 20mM, 5mM beta-mercaptoetanol) na proporção de
10 ml dos corpúsculos ressuspendidos para 1L de solução de renovelamento. Após o
renovelamento a solução diluída da proteína foi filtrada e purificada por cromatografia de
afinidade em resina “Chelating-Sepharose” com Ni
+2
imobilizado. Esta purificação se baseia
na afinidade do metal a cauda de histidina N-terminal inserida à proteína pelo plasmídeo. O
processo foi realizado com auxílio do aparelho “Äkta Prime” (Amersham Pharmacia).
Parâmetros da cromatografia:
- Tampão de lise – Fosfato de Sódio 50 mM p.H. 8.3, NaCl 300 mM
- Coluna HisTrap HP 5 mL (Amersham Pharmacia).
- Tampão de equilíbrio - Fosfato de Sódio 50mM p.H. 8.3, NaCl 300mM, Imidazol
20mM, beta-mercaptoetanol 5mM.
- Tampão de eluição - Fosfato de Sódio 50mM p.H. 8.3, NaCl 300mM, Imidazol
500mM, beta-mercaptoetanol 5mM.
___________________________________________________________Materiais e Métodos
28
- Amostra – Proteína diluída enovelada (1L) em Fosfato de Sódio 50mM p.H. 8.3, NaCl
300mM, Imidazol 20mM, 5mM beta-mercaptoetanol, ligada à coluna em um fluxo de 5
mL/min.
- Lavagem da coluna com 50 mL (fluxo 2,5 mL/min) de tampão de equilíbrio.
- Gradiente 0 – 100% de tampão de eluição em 50 mL (fluxo de 2,5 mL/min).
- Frações coletadas 2 mL.
Após a cromatografia as frações com maior grau de pureza, foram dialisadas 24 horas
em tampão Fosfato de Sódio 50 mM p.H. 8.3 ou PBS 1X pH 7.4 para a produção de anticorpos
em ratos.
3.11.2. rLin-7 (Ponto Isoelétrico – 8.57)
O protocolo similar ao anterior, apenas alterando o pH do tampão Fosfato de Sódio para
pH 6.5.
3.11.3. rEquicetina (Ponto Isoelétrico 5.61)
Os corpúsculos foram processados seguindo o mesmo protocolo da estomatina, sendo
ressuspendidos após a lavagem em uma solução (Tris 50mM p.H. 8.0, NaCl 300mM, Imidazol
20mM, beta-mercaptoetanol 5mM, uréia 8M). Entretanto, ao invés de fazermos o
renovelamento da proteína por diluição antes da cromatografia, optamos por purificar a
proteína desnaturada e fazer seu renovelamento por diálise lenta após a purificação. A
purificação foi realizada com auxílio do aparelho “Äkta Prime” (Amersham Pharmacia).
Parâmetros da cromatografia:
- Tampão de lise – Tris 50mM p.H. 8.0, NaCl 300 mM.
- Coluna HisTrap HP 5 mL (Amersham Pharmacia).
- Tampão de equilíbrio - Tris 50mM p.H. 8.0, NaCl 300mM, Imidazol 20mM, beta-
mercaptoetanol 5mM, Uréia 8M.
- Tampão de eluição – Tris 50mM p.H. 8.0, NaCl 300mM, Imidazol 500mM, beta-
mercaptoetanol 5mM, Uréia 8M.
- Amostra – Proteína desnaturada (12 mL) em Tris 50mM p.H. 8.0, NaCl 300mM,
Imidazol 20mM, beta-mercaptoetanol 5mM, Uréia 8M, ligada à coluna através de três
injeções utilizando um “superloop” de 5 mL, fluxo de 2 mL/min.
- Lavagem da coluna com 50 mL (fluxo 2,5 mL/min) de tampão de equilíbrio.
- Gradiente 0 – 100% de tampão de eluição em 50 mL (fluxo de 2,5 mL/min).
- Frações coletadas 2 mL.
Após a cromatografia as frações com maior grau de pureza, foram dialisadas por 2
horas em tampão Tris 50 mM p.H. 8.0 com concentrações decrescentes de uréia (6M uréia,
___________________________________________________________Materiais e Métodos
29
5M, 4M, 3.5M, 3.0M, 2.5M, 2.0M, 1.5M, 1.0M e zero). As proteínas utilizadas para produção
de anticorpos em ratos foram dialisadas adicionalmente em PBS 1X pH 7.4, por 24 horas.
3.11.4. rDife5 (Ponto Isoelétrico – 6.12, Peso molecular – 9,7 kDa)
Os corpúsculos de inclusão contendo a proteína recombinante foram ressuspendidos e
lavados 2 vezes com 20 mL de uma solução Tris 100mM p.H. 8.0, NaCl 300mM, Triton 2%,
2M uréia, e posteriormente 1 vez com apenas tampão de lise, sendo centrifugados 10.000 rpm,
30 min, 4°C após cada lavagem.
Após a lavagem dos corpúsculos estes foram ressuspendidos em 20 mL de uma solução
(Tris 100mM p.H. 8.0, NaCl 300mM, Imidazol 5mM, 5mM beta-mercaptoetanol, 8M uréia). A
proteína foi renovelada por diluição lenta em uma solução (Tris 100mM p.H. 8.0, NaCl
300mM, Imidazol 5mM, 5mM beta-mercaptoetanol) na proporção de 10 ml dos corpúsculos
ressuspendidos para 1L de solução de renovelamento. Após o renovelamento a solução diluída
da proteína foi filtrada e purificada por cromatografia de afinidade em resina “Chelating-
Sepharose” com Ni
+2
imobilizado. Esta purificação se baseia na afinidade do metal a cauda de
histidina N-terminal inserida à proteína pelo plasmídeo. O processo foi realizado com auxílio
do aparelho “Äkta Prime” (Amersham Pharmacia). Parâmetros da cromatografia:
- Tampão de lise – Tris 50mM p.H. 8.0, NaCl 300 mM.
- Coluna HisTrap HP 5 mL (Amersham Pharmacia).
- Tampão de equilíbrio - Tris 100mM p.H. 8.0, NaCl 300mM, Imidazol 5mM, beta-
mercaptoetanol 5mM.
- Tampão de eluição - Tris 100mM p.H. 8.0, NaCl 300mM, Imidazol 500mM, beta-
mercaptoetanol 5mM.
- Amostra – Proteína diluída enovelada (1L) em Tris 100mM p.H. 8.0, NaCl 300mM,
Imidazol 5mM, beta-mercaptoetanol 5mM, foi ligada à coluna em um fluxo de 5
mL/min.
- Lavagem da coluna com 50 mL (fluxo 2,5 mL/min) de tampão de equilíbrio.
- Gradiente 0 – 100% de tampão de eluição em 50 mL (fluxo de 2,5 mL/min).
- Frações coletadas 2 mL.
Após a cromatografia as frações com maior grau de pureza, foram dialisadas 24 horas
em tampão Tris 20mM p.H. 8.0, NaCl 150 mM ou PBS 1X pH 7.4 para a produção de
anticorpos em ratos.
3.11.5. rAntigeno 5 (Ponto Isoelétrico 8.04)
Os corpúsculos de inclusão contendo a proteína recombinante foram ressuspendidos e
lavados 2 vezes com 20 mL de uma solução Tris 100mM pH 6.4, NaCl 300 mM, Uréia 2 M,
___________________________________________________________Materiais e Métodos
30
Triton 2% e posteriormente 1 vez com apenas tampão de lise, sendo centrifugados 10.000 rpm,
30 min, após cada lavagem.
Após a lavagem dos corpúsculos estes foram ressuspendidos em 10 mL de uma solução
Tris-HCl 100mM p.H. 6.4, NaCl 300mM, 5 mM Imidazol, 6M Cloreto de Guanidina. Optamos
por purificar a proteína desnaturada e fazer seu renovelamento por diálise após a purificação. A
purificação foi realizada com auxílio do aparelho “Äkta Prime” (Amersham Pharmacia).
Parâmetros da cromatografia:
- Tampão de lise – Tris 100mM p.H. 6.4, NaCl 300 mM.
- Coluna HisTrap HP 5 mL (Amersham Pharmacia).
- Tampão de equilíbrio - Tris 100mM p.H. 6.4, NaCl 300mM, Imidazol 5mM, beta-
mercaptoetanol 5mM, Cloreto de Guanidina 6M.
- Tampão de eluição – Tris 100mM p.H. 6.4, NaCl 300mM, Imidazol 500mM, beta-
mercaptoetanol 5mM, Cloreto de Guanidina 6M.
- Amostra – Proteína desnaturada (10 mL) em Tris 100mM p.H. 6.4, NaCl 300mM,
Imidazol 5mM, Cloreto de Guanidina 6M, ligada à coluna com fluxo de 2 mL/min.
- Lavagem da coluna com 50 mL (fluxo 2,5 mL/min) de tampão de equilíbrio.
- Gradiente 0 – 100% de tampão de eluição em 50 mL (fluxo de 3,0 mL/min).
- Frações coletadas 2,5 mL.
Após a cromatografia as frações com maior grau de pureza, foram dialisadas 24 horas
em tampão Tris 20mM p.H. 8.0, NaCl 150 mM ou PBS 1X pH 7.4 para a produção de
anticorpos em ratos.
3.11.6. rFosfatase Alcalina (Ponto Isoelétrico – 6.10)
Os corpúsculos de inclusão contendo a proteína recombinante foram ressuspendidos e
lavados 2 vezes com 20 mL de uma solução (tampão de lise + Triton 2% + 4M uréia) e
posteriormente 1 vez com apenas tampão de lise, sendo centrifugados 10.000 rpm, 30 min,
após cada lavagem.
Após a lavagem dos corpúsculos estes foram ressuspendidos em 20 mL de uma solução
Tris-HCl 100mM p.H. 8.0, NaCl 300mM, Imidazol 20mM, 6M Cloreto de Guanidina.
Optamos por purificar a proteína desnaturada e fazer seu renovelamento por diálise após a
purificação. A purificação foi realizada com auxílio do aparelho “Äkta 100” (Amersham
Pharmacia). Parâmetros da cromatografia:
- Tampão de equilíbrio - Tris-HCl 100mM p.H. 8.0, NaCl 300mM, Imidazol 20mM,
cloreto de guanidina 6M.
- Tampão de eluição – Tris-HCl 100mM p.H. 8.0, NaCl 300mM, Imidazol 500mM,
cloreto de guanidina 6M.
___________________________________________________________Materiais e Métodos
31
- Amostra – Proteína desnaturada (10 mL) em Tris-HCl 100mM p.H. 8.0, NaCl 300mM,
Imidazol 20mM, cloreto de guanidina 6M, ligada à coluna através de uma injeção
utilizando um “superloop” de 10 mL, fluxo de 2 mL/min.
- Lavagem da coluna com 50 mL (fluxo 2,5 mL/min) de tampão de equilíbrio.
- Gradiente 0 – 100% de tampão de eluição em 50 mL (fluxo de 2,5 mL/min).
- Frações coletadas 2 mL.
3.11.7. rFosfodiesterase (Ponto Isoelétrico – 6.28)
Os corpúsculos de inclusão contendo a proteína recombinante foram ressuspendidos e
lavados 2 vezes com 20 mL de uma solução (tampão de lise + Triton 2% + 4M uréia) e
posteriormente 1 vez com apenas tampão de lise, sendo centrifugados 10.000 rpm, 30 min,
após cada lavagem.
Após a lavagem dos corpúsculos estes foram ressuspendidos em 20 mL de uma solução
Tris-HCl 100mM p.H. 8.0, NaCl 300mM, Imidazol 20mM, 6M Cloreto de Guanidina.
Optamos por purificar a proteína desnaturada e fazer seu renovelamento por diálise após a
purificação, ou dentro da coluna durante a purificação. A purificação foi realizada com auxílio
do aparelho “Äkta 100” (Amersham Pharmacia). Parâmetros da cromatografia:
- Tampão de equilíbrio - Tris-HCl 100mM p.H. 8.0, NaCl 300mM, Imidazol 20mM,
cloreto de guanidina 6M.
- Tampão de eluição – Tris-HCl 100mM p.H. 8.0, NaCl 300mM, Imidazol 500mM,
cloreto de guanidina 6M.
- Amostra – Proteína desnaturada (10 mL) em Tris-HCl 100mM p.H. 8.0, NaCl 300mM,
Imidazol 20mM, cloreto de guanidina 6M, ligada à coluna através de uma injeção
utilizando um “superloop” de 10 mL, fluxo de 2 mL/min.
- Lavagem da coluna com 50 mL (fluxo 2,5 mL/min) de tampão de equilíbrio.
- Gradiente 0 – 100% de tampão de eluição em 50 mL (fluxo de 2,5 mL/min).
- Frações coletadas 2 mL.
3.12. Produção de anticorpos.
A proteína recombinante Estomatina, foi formulada com o adjuvante TiterMax (CytRx
Corporation), conforme as recomendações do fabricante. Ratos Wistar (dois indivíduos) foram
primados com 100 µg de proteína formulada com o adjuvante e receberam 3 reforços da
proteína (100 µg) formulada em PBS 1X pH 7.4.
Amostras de sangue dos ratos imunizados foram coletadas pela veia lateral da cauda no
dia anterior de cada reforço, e o soro preparado para avaliarmos os títulos de anticorpos por
ELISA. A sangria final foi realizada através de punção cardíaca em animais anestesiados com
uma dose letal do anestésico pentobarbital.
___________________________________________________________Materiais e Métodos
32
3.13. Remoção do Tegumento e enriquecimento das membranas de superfície.
O tegumento foi removido pelo método de congelamento/descongelamento e as
membranas de superfície enriquecidas através de centrifugação em gradiente de sacarose,
conforme descrito em Braschi (2005a).
3.13.1. Extração Diferencial do Tegumento
As proteínas foram seqüencialmente extraídas do precipitado do gradiente (resultante
da etapa anterior) em três etapas utilizando reagentes com poder de solubilidade crescente, do
seguinte modo:
Extrato 1 – o precipitado do gradiente foi ressuspendido em 200 µl de Tris 40 mM, pH 7.4, a
4°C, vortexado por 2 min, e deixado repousar no gelo por 20 min, em seguida o material
insolúvel foi removido por centrifugação a 100.000 g por 1 h, 4°C, e o sobrenadante
recuperado. O processo todo foi repetido 2 vezes, e os sobrenadantes contendo as proteínas
solúveis foram combinados.
Extrato 2 – o precipitado da etapa anterior foi depois submetido a um processo similar a 25 °C,
utilizando desta vez três extrações com uréia 5M, tiouréia 2M em Tris 40 mM, pH 7.4,
originando um sobrenadante e um precipitado.
Extrato 3 – o precipitado residual foi tratado três vezes com o tampão de extrato 3 (tampão de
extrato 2 contendo CHAPS 4% e N-decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propane sulfate (SB 3-
10; Sigma) 2%, originando um terceiro sobrenadante e um precipitado final.
3.14. Resposta Imune Humoral
Amostras de sangue foram coletadas retro-orbitalmente de todos os animais no dia
anterior a cada reforço e antes do desafio, e o soro preparado. “Pools” de soro de cada grupo
foram preparados misturando-se volumes iguais do soro de cada animal e estes utilizados nos
ensaios de ELISA e Western blotting.
3.14.1. Western blotting
Os ensaios de Western blotting foram realizados segundo Sambrook (1989). 50 mg de
vermes adultos foram sonicados e fervidos por 5 min em 500 µl de tampão de eletroforese
(2x), contendo 4% SDS, 10% glicerol, 0,1M Tris-HCl (pH 6.8) e 50 mg/ml de azul de
bromofenol. A eletroforese foi realizada em géis de SDS-poliacrilamida de 12 e 15%. As
proteínas foram depois transferidas para uma membrana de nitrocelulose com uma solução
___________________________________________________________Materiais e Métodos
33
Tris-HCl 0,025M, glicina 0,168M e metanol 25%. A membrana foi saturada contra anticorpos
não específicos com uma solução de PBS (1x), Tween 0,05% e leite 5% durante pelo menos 4
h. Tiras da membrana foram cortadas e incubadas durante 1 hora com soro dos animais
vacinados e não vacinados a uma diluição de 1:250 no mesmo tampão. Após este período as
membranas foram lavadas 3 vezes por 10 min com a mesma solução. Para imunodetecção,
utilizou-se anticorpos anti-mouse IgG conjugados a uma peroxidase, na diluição de 1:1000,
incubados por 1 h em uma solução de PBS (1x) e Tween 0,05%. A atividade da peroxidase foi
detectada com ECL (Armesham Pharmacia).
3.14.2. Análise de indução de anticorpos e isotipagem
Resumidamente, microplacas de fundo chato foram revestidas com 0,5 µg/poço das
proteínas recombinantes em tampão carbonato - bicarbonato 0,05 M (pH 9,6), durante 16 h a
4°C. As placas foram lavadas em seguida 3 vezes com tampão fosfato salina (PBS) contendo
0,05% de Tween 20, e bloqueadas com 200 µl de uma solução de 10% leite em PBS, por pelo
menos 1 h a 37°C. Depois de lavadas com PBS Tween 20 0,05%, 100 µl de uma diluição
seriada do soro dos animais imunizados ou controles foram adicionados em cada poço, sendo a
diluição inicial 1:20. As placas foram incubadas a 37°C durante 2 horas e depois lavadas três
vezes com PBS Tween 20 0,05%. A seguir, 100 µl do anticorpo secundário conjugado a
peroxidase de "horseradish" foram adicionados em uma diluição 1:15000 e incubados por 1 h a
37°C, para a determinação da razão dos isótipos IgG1:IgG2a foram utilizados anticorpos
monoclonais anti-IgG1 e anti-IgG2a (Sigma) na diluição 1:1000, seguida da incubação com
anticorpo conjugado com peroxidase. As placas foram então lavadas três vezes com PBS
Tween 20 0,05%, e 100 µl do substrato OPD foi adicionado em cada poço. A absorbância a
492 nm foi medida em um leitor de ELISA Labsystem. O título de anticorpos foi determinado
como a última diluição registrando D.O. ≥ 0,1.
3.15. Avaliação da Resposta Imune Celular induzida em Animais Imunizados
Grupos de três camundongos C57BL/6 (fêmeas) foram imunizados via intramuscular
com a vacina de DNA contendo o gene da Estomatina, e o controle negativo (vetor sem
inserto) (50 µg/dose, com três imunizações em intervalos de 15 dias). Após 3 semanas, os
baços foram removidos. As células foram suspensas em meio RPMI 1640 (Sigma)
suplementado com L-glutamina 2 mM (Merck, Darmstad, Germany), 50 µg/mL de sulfato de
gentamicina (Schering-Plough, Rio de Janeiro, Brasil), polimixina B 10 µg/mL e tampão
HEPES 10 mM (Sigma).
As células foram lavadas duas vezes e ressuspendidas como descrito acima em meio
RPMI, complementado com 10% de soro fetal bovino – Cultilab, Campinas, São Paulo, Brasil
e 2-mercaptoetanol 0,05 mM - Pharmacia LKB Biotecnology AB, Uppsala, Suíça). As células
___________________________________________________________Materiais e Métodos
34
(1x10
6
/mL) foram cultivadas em placas de cultura com 24 poços e volume total de 1 mL.
Utilizou-se rEstomatina (em concentrações de 5, 10 e 30 µg/mL) como antígeno de estímulo e
concavalina A (5 µg/mL; Sigma) como controle positivo para reatividade celular. Células
controle foram incubadas em meio completo, sem antígeno. A cultura foi incubada por três
dias em estufa humidificada, 37
0
C e atmosfera saturada a 5% de CO
2
. O sobrenadante foi
recolhido 24, 48 e 72 h após o estímulo com rEstomatina, para determinação do tempo ótimo
para a produção de citocinas, e estocado a – 20
0
C para posterior quantificação de IFN-γ por
ELISA, utilizando-se o Kit para a detecção desta citocinas da Pharmingen.
Anticorpos monoclonais purificados anti-IFN-γ de camundongo (6 µg/mL) foram
utilizados como anticorpos de captura, aplicados em placa e incubados por 16 h a 4
0
C em um
volume de 50 µL de NaHCO
3
0,1 M, pH 8,2. As lavagens em cada etapa (3 a 6 vezes) foram
feitas com tampão PBS-T (PBS-Tween 20 0,1%). As placas foram bloqueadas com PBS
contendo 10% de soro fetal bovino e incubadas por 16 h conforme já descrito. O sobrenadante
da cultura de linfócitos foi adicionado diluído a 1/5 em quadriplicata e incubado por 16 h a
4
0
C.
A curva padrão foi gerada com citocina recombinante (IFN-γ) de camundongo.
Anticorpos monoclonais biotinilados anti-IFN-γ de camundongo (1 µg/mL) foram adicionados
em 50 µL de PBS-T e incubados por 1 h a temperatura ambiente. Os anticorpos ligados foram
detectados por estreptoavidina conjugado com peroxidase (Sigma). Foi adicionado o substrato
contendo 0,2% (m/v) de OPD, e 0,015% (v/v) de H
2
O
2
diluídos em tampão contendo 24,3%
(v/v) de ácido cítrico 0,1 M e 25,7% (v/v) de NaHPO
4
0,2 M. A reação ocorreu por 15-30 min
e foi bloqueada com H
2
SO
4
4,5M. A medida de absorbância a 492 nm foi feita em leitor de
ELISA e a concentração da amostra bem como a curva padrão foram obtidas por regressão não
linear.
3.15.1. ELISPOT
O procedimento para isolamento dos linfócitos foi idêntico ao citado acima. Para os
ensaios de ELISPOT utilizamos reagentes da “BD Biosciences”, seguindo as recomendações
do fabricante. Resumidamente as placas de microtitulação com membranas de nitrocelulose
foram cobertas com anticorpos de captura contra as citocinas de interesse (IL-4 e IFN-γ). Em
seguida os sítios não ocupados pelos anticorpos foram bloqueados com 10% de soro fetal
bovino. Após o bloqueio os linfócitos (10
4
, 10
5
e 5X10
5
células/poço) foram adicionados à
placa e estimulados com a proteína de interesse (Apirase ou Estomatina nas concentrações de 5
e 15 µg/mL). As células T estimuladas sobre as membranas foram incubadas por 20 h,
secretando as citocinas que se ligam aos anticorpos de captura. Posteriormente, as células
foram removidas e realizada uma incubação com um anticorpo de detecção biotinilado anti-IL-
4 e anti-IFN-γ. Em seguida foi adicionado Avidina conjugada com HRP, e finalmente o
substrato para revelação. Depois de um período de incubação variável (5-40 min), a reação foi
___________________________________________________________Materiais e Métodos
35
interrompida, ficando o complexo citocinas-anticorpos pigmentado. Em seguida as manchas ou
pontos “spots” foram contados no microscópio estereoscópico.
3.16. Imunolocalização
Para determinar a localização das proteínas no verme foram feitos ensaios de
imunolocalização. Resumidamente, vermes adultos recém perfundidos com meio RPMI foram
emblocados em líquido de inclusão O.C.T. (Tissue-Tek Sakura), com o auxilio de tubos
plásticos (3 mm de diâmetro e 7 mm de comprimento), e congelamento em isopentano
arrefecido em nitrogênio líquido; os blocos foram armazenados a – 80°C até o momento de
fazer as secções. Os cortes histológicos (0,7 µm) foram realizados em um criostato Leica
CM1900; as secções foram aderidas em lâminas sensibilizadas com polilisina e fixadas em
acetona por 3 min. Os sítios não específicos foram bloqueados cobrindo as secções com PBS
1x pH 7.4 contendo 10% de soro normal de cabra por 1 h a temperatura ambiente. Após o
bloqueio, as secções foram cobertas com soro de rato contendo os respectivos anticorpos:
- anti-estomatina
- anti-equicetina
- soro de ratos com infecção crônica
- soro de ratos naive
Todos os soros foram diluídos 1:100 ou 1:50 em PBS 1X contendo 10% de soro de
cabra naive. Após 1 h de incubação a temperatura ambiente, as secções foram lavadas 5 vezes
com PBS 1X, pH 7.4. Em seguida adicionou-se o anticorpo secundário anti-IgG de rato (1:500)
Alexa Fluor 488 produzido em cabra, diluído em PBS 1X pH 7.4 10% soro de cabra naive,
após 1 h de incubação, as secções foram lavadas 5 vezes com PBS 1X pH 7.4. Finalmente as
lâminas foram montadas com meio para imunofluorescência VECTASHIELD
®
Mounting
Medium (H-1000) para serem observados ao microscópio de fluorescência, sendo o registro
feito com câmera digital.
3.17. Análise estatística
Os dados do número de vermes recuperados pela perfusão foram analisados quanto à
sua normalidade e homogeneidade de variância, e comparados através do teste de análise de
variância (ANOVA) e teste-t de Student. Para tanto utilizamos o programa STATISTICA
versão 5.0.
___________________________________________________________________Resultados
36
4. RESULTADOS
4.1. Projeto Piloto
Existem vários parâmetros que podem influenciar a eficiência de uma imunização via
DNA, incluindo as características dos antígenos, a própria natureza estrutural do plasmídeo, a
linhagem dos camundongos, e até mesmo técnicas de injeção (Zhou et al., 2000). Nesta
primeira fase de trabalho avaliamos nosso delineamento experimental com a realização de um
projeto piloto contendo 9 antígenos vacinais selecionados a partir de uma base de dados
contendo 23 mil ESTs. Os principais parâmetros estudados foram:
1 - Eficácia da estratégia de clonagem por PCR e moldes utilizados (biblioteca de cDNA,
clones do projeto e mRNA de vermes adultos).
2 - Integridade dos vetores utilizados e expressão transiente em células de mamífero.
3 - Resposta de anticorpos contra os respectivos antígenos induzidos pela imunização com a
vacina de DNA, detectada por Western blotting e ELISA contra extrato do verme e contra
alguns destes antígenos expressos em E. coli.
4 - Comparação das vias de imunização intradérmica (Gene Gun) e intramuscular, tendo em
vista o tipo de resposta imune elicitada Th2 ou Th1 e as dificuldades de realizarmos estes
ensaios em maior escala (30 antígenos).
5 – Avaliar o protocolo de desafio experimental com cercárias e níveis de proteção induzida
através da contagem do número de vermes recuperados.
4.1.1. Seleção de antígenos in silico usando uma base de dados com 23 mil ESTs
Foi construído um banco de dados contendo as primeiras 23 mil seqüências, as quais
foram agrupadas em SmAEs (Schistosoma mansoni Assembled ESTs). Buscando genes
completos que poderiam estar expostos à interação com o sistema imune, realizamos buscas
neste banco de dados por genes descritos como: “Receptor (52), Membrane (26), Surface (8),
Tegument (6), Toxin (2), Antigen (41), Transporter (23), Unknown (12)”. Um total de 170
SmAEs foram analisados, gerando um lista de 8 candidatos vacinais a serem inicialmente
explorados. Segue-se abaixo uma breve descrição sobre os candidatos selecionados.
Miofilina (Mio) - Proteína similar (79% de identidade – id.) a uma miofilina localizada
na musculatura de Echinococcus (helminto cestódeo - agente da hidatidose) (Martin et al.,
1995). Esta proteína seria similar a calponinas de S. japonicum 49% e S. mansoni 45% devido
à presença de um domínio CH (calponin homology domain). As calponinas são proteínas de
___________________________________________________________________Resultados
37
filamento que estão envolvidas na regulação e modulação da contração da musculatura lisa,
sendo capazes de se ligarem a actina, calmodulina, troponina C e tropomiosina.
STT3 proteína similar a uma oligosacaril transferase - A região clonada (carboxi-
terminal) é descrita como fonte de peptídeos imunodominantes associados ao MHC de classe I
em Mus musculus. Estes peptídeos disparam uma resposta potente de células-T citotóxica
quando apresentados a animais alogênicos (geneticamente diferentes porém da mesma
espécie). As oligosacaril transferases são proteínas integrais de membrana envolvidas na
glicosilação de proteínas no lúmen do retículo endoplasmático. A subunidade STT3 faz parte
do complexo oligosacaril transferase, sendo necessária para sua atividade.
Proteína integral de membrana CII-3 (CII-3) - Parte do complexo succinato
desidrogenase, o qual liga o ciclo de Krebs a cadeia de transporte de elétrons. Parte do cDNA
deste gene foi depositado no Gene Bank como um antígeno secretado por vermes adultos de S.
mansoni (gi|2623836).
Lin-7 – Parte do cDNA deste gene foi inicialmente clonado em um varredura de uma
biblioteca de expressão, utilizando soro de animais imunizados com proteínas secretadas pelo
estágio pulmonar de esquistossômulo. Esta proteína foi imunolocalizada em vários tecidos do
verme, porém foi mais abundantemente localizada no tegumento. A análise da resposta imune
celular de camundongos vacinados com esta proteína, demonstrou sua capacidade de induzir a
secreção de grandes quantidades da citocina IFN-γ, do tipo T-helper 1 (Th1), (Harrop et al.,
1999). Entretanto, seu potencial imunogênico nunca foi avaliado em desafio experimental com
cercárias.
Proteína de Choque térmico de 70kDa (HSP70) - Tem sido proposto que as respostas a
choque térmico desempenham um papel importante na sobrevivência dos esquistossomos;
durante o seu desenvolvimento, o parasita experimenta mudanças extremas de temperatura
quando sai do caramujo para infectar seu hospedeiro vertebrado. As proteínas de choque
térmico de 70 kDa são consideradas uma das moléculas mais abundantes e imunogênicas em
muitos organismos parasitários, incluindo os esquistossomos. Em vermes adultos de S.
japonicum esta proteína está localizada predominantemente no sistema nervoso e no
tegumento. Suas características são típicas de uma chaperona molecular, incluindo uma
seqüência líder hidrofóbica amino-terminal, uma seqüência sinal RDEL na porção carboxi-
terminal de retenção no retículo endoplasmático e três seqüências características da família das
HSP70 (Scott e McManus, 1999).
Catepsina L (Cat) – cisteína protease da superfamília das papaínas. Similar a uma
catepsina L de Sarcophoga peregrina, portanto ainda não descrita em S. mansoni. As
___________________________________________________________________Resultados
38
catepsinas L de Esquistossoma tem sido associadas à digestão de hemoglobina, síntese da parte
externa dos ovos e como componentes do fluído seminal dos vermes.
Proteína Hipotética 1 (Hip1) - Sem ortólogo caracterizado, apresenta 1 domínio
transmembrana na sua porção N-terminal. A composição do SmAE nos chamou a atenção para
uma possível expressão diferencial no estágio de esquistossômulo (114 seqüências de
esquistossômulo, 9 de ovos, 4 de adultos, 3 de cercárias e 12 de miracídios).
Uma nova Dineína de cadeia leve (Dlc) – as dineínas de cadeia leve são componentes
das dineínas, um complexo enzimático envolvido em vários aspectos da motilidade baseada em
microtúbulos e desta maneira parecem ser essenciais para a manutenção e reparo do
tegumento. Essas proteínas já foram imunolocalizadas no tegumento de vermes adultos e em
cercárias, atuando no tráfego celular entre organelas ou na superfície externa do tegumento
heptalaminado. Em função disto, estas moléculas constituem um alvo para desenvolvimento de
uma vacina ou droga antiparasitária (Yang et al., 1999).
Proteína integral de membrana de 23 kDa (Sm23) - Antígeno selecionado pela OMS
como um possível candidato vacinal. Pertence à superfamília de proteínas com 4 domínios
transmembrânicos (TM4SF) hidrofóbicos. Selecionado como controle positivo de nossos
grupos experimentais de vacina de DNA, por conferir uma proteção de 21-44%, quando
administrado pela via intramuscular e 18% pela via intradérmica (Gene Gun) (Da'dara et al.,
2002a e 2002b).
Esses nove antígenos foram clonados em vetor de imunização gênica e utilizados no
projeto piloto.
4.1.2. Clonagem dos candidatos vacinais e construção das vacinas de DNA - Projeto Piloto
A partir das seqüências consenso dos “contigs” foram desenhados oligonucleotídeos
para a amplificação dos genes de interesse. Alguns destes não possuíam a seqüência completa e
estas foram obtidas com auxílio do kit 5´ RACE (Invitrogen) (dados não apresentados). Para
outros, não foi possível obter a seqüência completa, sendo selecionados os fragmentos gênicos
contendo os domínios extracelulares. Estes genes foram clonados por RT-PCR a partir do
mRNA de vermes adultos, ou PCR a partir de clones do projeto ou de uma biblioteca de
cDNA.
Os candidatos vacinais selecionados foram amplificados com uma polimerase de alta
fidelidade, Pfx, e clonados no vetor pENTR-D-Topo. Após a checagem dos recombinantes por
ensaios de restrição e seqüenciamento, estes foram recombinados com os vetores de expressão
em células de mamífero, pDEST12.2. Estes novos recombinantes foram triados quanto à
presença, integridade e orientação do inserto, tanto por PCR quanto por seqüenciamento (dados
___________________________________________________________________Resultados
39
não apresentados). A Tabela 1 apresenta o tamanho dos genes clonados, a porcentagem de
identidade e o tamanho do gene ortólogo já descrito, a estratégia utilizada bem como os
estágios do parasita para quais foram encontrados mRNA destes genes.
Tabela 1 – Genes investigados no Projeto Piloto.
Proteína ortóloga (tamanho)
[Organismo] (identidade/cobertura)
Número de acesso no banco de dados
Estratégia de clonagem
Estágios contendo
mRNA
Mio – Miofilina (190 aa)
[Echinococcus granulosus] (79% / 190 aa)
SmAE 606688
RT-PCR E, A, O, G
STT3 - Oligosacaril transferase (823)
[Mus musculus] (69% / 278 aa)
SmAE 610850
Clone do Projeto E, A, M, G
CII-3 - Parte do complexo succinato desidrogenase (169 aa)
[Rattus norvegicus] (41% / 135 aa)
SmAE 609117
Clone do Projeto E, A, M, G, C
Lin-7 (197 aa)
[Xenopus laevis] (69% / 172 aa)
SmAE 606011
5´race, RT-PCR E, A
HSP70 (648 aa)
[Schistosoma japonicum] (92% / 609 aa)
SmAE 602270
RT-PCR E, A, O, M, G, C
Cat - Catepsina L (339 aa)
[Sarcophaga peregrina] (51% / 339 aa)
SmAE 601590
Biblioteca de cDNA de Vermes
Adultos
E, A, O, M, G
Hip 1 - Proteína Hipotética 1 (323 aa)
SmAE 609541
Biblioteca de cDNA de Vermes
Adultos
E, A, O, M, G, C
DLC - Uma nova Dineína cadeia leve (105 aa)
[Schistosoma japonicum] (45% / 85 aa)
SmAE 608608
Clone do Projeto E, A, M, G
Sm23 - Proteína integral de membrana de 23 kDa (218 aa)
[Schistosoma mansoni] (100% / 218 aa)
SmAE 601295.1
RT-PCR E, A, O, M, G, C
(a.a.) - aminoácidos, E – esquistossômulo, A – vermes adultos, O – ovos, M – miracídio, G – “germ balls”,
C – cercária.
4.1.3. Expressão transiente em células de mamífero BHK
Visando validar a capacidade de expressão dos vetores construídos baseados em
pDEST12.2, células BHK foram transfectadas com estes vetores contendo os genes
selecionados. O RNA total foi extraído, tratado com DNAse (livre de atividade de RNAse) e
analisado por RT-PCR para detecção dos mRNAs dos antígenos candidatos. Para comprovar a
___________________________________________________________________Resultados
40
ausência de DNA molde proveniente da transfecção, foram feitas amplificações a partir do
RNA tratado com DNAse com Taq DNA polimerase.
Na Figura 14, podem-se observar as bandas referentes à amplificação dos transcritos
STT, Sm23, CII-3, LIN-7 e HSP70. Avaliamos ainda a atividade transcricional dos genes LIN-
7 e HSP70 a partir do vetor pCDNA3.1(+), amplamente utilizado em vacinas de DNA.
Figura 14 – Eletroforese em gel de agarose dos ensaios de RT-PCR utilizando 1 µg do RNA total de células
transfectadas com as construções em pDEST12.2 e pCDNA3.1. As setas apontam os fragmentos esperados para a
STT, Sm23, CII-3, LIN-7 e HSP70.
Os resultados da Figura 14 demonstram que células de mamífero transfectadas com os
vetores de expressão pDEST12.2 e pCDNA3.1, contendo os genes dos antígenos vacinais,
apresentam transcritos com o tamanho esperado para os respectivos genes/fragmentos gênicos
(STT, Sm23, CII-3, LIN-7 e HSP70).
Taq RT
pDEST12.2
-
STT
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
Taq RT
pDEST12.2
-
CII
-
3
2000
1650
1000
850
Taq RT
pDEST12.2
-
Sm23
1000
850
650
500
RT Taq RT Taq RT Taq
pCDNA
-
LIN
-
7
pDEST
-
LIN
-
7
pCDNA
-
HSP70
2000
1650
1000
850
650
500
400
___________________________________________________________________Resultados
41
4.1.4. Avaliação da atividade protetora dos candidatos vacinais através de vetores de
imunização gênica (Vacinas de DNA)
Nesta fase do projeto foram avaliadas as limitações e dificuldades em se analisar uma
grande quantidade de antígenos através de vacinas de DNA. Efeitos como a diminuição da
resposta imune à medida que se aumenta o número de antígenos utilizados, ou mesmo o
incremento da resposta protetora através da associação de dois antígenos descritos como
imunogênicos. Diante deste racional decidimos montar os seguintes grupos experimentais
apresentados na Tabela 2.
Tabela 2 – Grupos experimentais de imunização montados com os candidatos vacinais do Projeto
Piloto.
Controle
Positivo
Controle
negativo
Antígenos
individuais
Pares de
Antígenos
Todos antígenos
Miofilina Miofilina
HSP70
HSP70
Catepsina L
STT3 + Hip1
Proteína
Hipotética 1
Catepsina L
Dineína cadeia
leve - Dlc
STT3
Proteína
Hipotética 1
CII-3
LIN-7
Sm23
pDEST12.2 sem
inserto (Vetor ∅)
Dineína cadeia
leve
CII-3 + LIN-7
Sm23
Para determinar se as Vacinas de DNA contendo os antígenos selecionados no Projeto
Piloto seriam capazes de induzir uma resposta imune protetora, camundongos fêmeas
C57BL/6 foram imunizados pela via intradérmica (Gene Gun) e posteriormente desafiados
com 110 cercárias (injeção subcutânea) e os vermes adultos foram recuperados por perfusão
após sete semanas. A Figura 15 apresenta um gráfico de dispersão do número de vermes
recuperados por animal nos diferentes grupos experimentais; os resultados foram expressos
pelo "número médio de vermes recuperados" (NMV ± DP), onde DP é o desvio padrão; para
análise estatística utilizamos o teste de análise de variância (ANOVA) e o teste-t de Student
(Tabela 3).
___________________________________________________________________Resultados
42
Figura 15 - Gráfico de dispersão do número de vermes recuperados em camundongos C57BL/6 imunizados com
as Vacinas de DNA contendo os genes assinalados e desafiados com 110 cercárias. (
__
) média do número de
vermes recuperados em cada grupo; (∗) grupo com significância estatística (p < 0,057) com relação ao grupo
Vetor vazio.
Tabela 3 – Desafio de camundongos C57BL/6 imunizados com Vacinas de DNA contendo os genes
dos antígenos selecionados no Projeto Piloto.
Grupo (n) Vermes recuperados
(média
±
±±
±
DP)
Redução
(%)
p
(ANOVA)
Vetor Vazio (8)
35 ± 13
- -
Sm23 (10)
25 ± 16
28,0 0,176
LIN-7 + CII-3 (10)
22 ± 20
36,7 0,135
STT + Hip1 (10)
23 ± 11
33,2
*0,057
Mio (10)
27 ± 22
22,5 0,395
Catepsina (10)
31 ± 15
11,0 0,579
Dineína (10)
31 ± 11
10,4 0,527
HSP70 (10)
31 ± 19
9,6 0,675
Hip1 (10)
41 ± 22
-17,5 0,502
Todos (10)
23 ± 20
32,9 0,178
(n) - número de animais.
A análise da Figura 15 e da Tabela 3 aponta para uma tendência de redução da carga
parasitária nos grupos Sm23, LIN-7 + CII-3, STT + Hip1 e “Todos antígenos”. Pode-se
observar que a imunização com o antígeno Sm23 induziu uma redução de 28% na carga
parasitária, o que concorda com dados da literatura para este antígeno. As combinações dos
antígenos LIN-7 + CII-3, STT + Hip1 e Todos, apresentaram reduções na carga parasitária
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Vazio Sm23 LIN-7 + CII-
3
STT + Hip1 Mio Cat Dlc HSP70 Hip1 Todos
Número de vermes recuperados
*
Lin-7 +
CII-3
___________________________________________________________________Resultados
43
superiores ao obtido com Sm23, 36,7%, 33,2% e 32,9%, respectivamente. Deve-se ressaltar
que o grupo STT + Hip1 apresentou um valor de (p) muito próximo da significância (0,057).
Apesar de não termos observado diferenças estatísticas significativas entre o grupo
Vetor Vazio e o controle positivo Sm23, podemos fazer algumas ponderações sobre os
resultados apresentados. Curiosamente, as maiores tendências de redução da carga parasitária
foram observadas nos grupos experimentais com dois candidatos vacinais ou a combinação de
todos os antígenos (Todos). No caso do grupo LIN-7 + CII-3, não podemos descartar a
existência de um efeito aditivo entre os antígenos utilizados. Porém no grupo STT + Hip1
(p<0,057) a atividade protetora se deve provavelmente ao antígeno STT, uma vez que os
resultados obtidos com o antígeno Hip1 individualmente, não mostraram redução e até
sugerem um aumento da carga parasitária. Tentando solucionar estas questões, estes grupos
foram desmembrados para a avaliação individual dos antígenos.
4.1.4.1. Desmembramento dos grupos protetores do Projeto Piloto e comparação das vias
intramuscular e intradérmica (Gene Gun)
Uma vez que os resultados preliminares haviam indicado um possível potencial protetor
das vacinas de DNA contendo alguns dos genes selecionados, foi realizado um novo ensaio no
qual os grupos LIN-7 + CII-3 e Hip + STT foram desmembrados, visando determinar o papel
individual de cada antígeno, com exceção do antígeno Hip1, que já havia sido testado
individualmente. Neste ensaio foram utilizados camundongos fêmeas BALB/c, pela
indisponibilidade de camundongos C57BL/6. Outro ponto que queríamos esclarecer era o
desempenho do vetor pDEST12.2 como vacina de DNA. Apesar de termos demonstrado sua
capacidade transcricional em células de mamíferos, o ponto que nos parecia mais importante
era se esta expressão seria suficiente, e se o plasmídeo seria estável dentro da célula do
hospedeiro. Dada a dificuldade da obtenção de um dado quantitativo da expressão destes
vetores in vivo, fizemos uma análise comparativa dos níveis de proteção obtidos usando o
plasmídeo pTARGET (já testado no laboratório, Miyaji et al., 2003) ou o plasmídeo
pDEST12.2, ambos expressando o antígeno Sm23 (Tabela 4).
Visando estabelecer a melhor estratégia para testarmos funcionalmente os candidatos
vacinais na próxima fase do projeto, realizamos ensaios comparando as vias de imunização
intradérmica e intramuscular, descritas por dispararem respostas polarizadas Th2 e Th1,
respectivamente. A idéia destes experimentos era tentar estabelecer uma correlação entre os
níveis de proteção obtidos e o perfil de resposta imune elicitada.
___________________________________________________________________Resultados
44
Tabela 4 – Grupos experimentais montados com os candidatos vacinais individuais do Projeto
Piloto, avaliados em imunizações via intradérmica (Gene Gun) e intramuscular.
Os camundongos BALB/c imunizados com as vacinas de DNA segundo a Tabela 4,
foram desafiados com 130 cercárias (injeção subcutânea) e os vermes adultos recuperados por
perfusão do sistema porta-hepático após 7 semanas. A Figura 16 apresenta um gráfico de
dispersão do número de vermes recuperados por animal nos dois ensaios independentes (Gene
Gun e Intramuscular). Os resultados destes ensaios foram expressos pelo "número médio de
vermes recuperados" (NMV ± DP), onde DP é o desvio padrão (Tabela 5).
Figura 16 - Gráfico de dispersão do número de vermes recuperados nos diferentes grupos experimentais em
ensaios independentes utilizando a via intradérmica (Gene Gun) ou intramuscular. (--) média do número de
vermes recuperados em cada grupo, Sm23T (pTARGET-Sm23), Sm23D (pDEST12.2-Sm23), (*) grupos
experimentais que apresentaram diferenças estatísticas significantes (p < 0,05) em relação ao grupo não
imunizado (naive).
Controle negativo Antígenos individuais Controle Positivo
Lin-7 pTARGET-Sm23
CII-3
pDEST12.2 (vazio)
Stt
pDEST12.2-Sm23
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Naive Vazio CII-3 STT Lin-7
Número de vermes recuperados
*
0
10
20
30
40
50
60
Naive Vazio CII-3 Lin-7 STT Sm23T Sm23D
*
Gene Gun (intradérmica) Intramuscular
___________________________________________________________________Resultados
45
Tabela 5 – Desafio de camundongos BALB/c imunizados com vacinas de DNA contendo os genes
dos antígenos selecionados no Projeto Piloto.
Intradérmica (Gene Gun)
Grupo (n)
Média de Vermes
recuperados
(NMV ±
±±
± DP)
Redução
(%)
P
(teste-t)
Redução
corrigida (%)
Naive (10)
57 + 26
Vazio (9)
40 + 27 30,0 0,213
CII-3 (9)
35 + 16 38,4 0,049 * 23,4
Lin-7 (9)
34 + 24 40,0 0,067 25,0
STT (10)
36 + 21 36,2 0,070 21,2
Intramuscular
Grupo (n)
Média de Vermes
recuperados
(NMV ±
±±
± DP)
Redução
(%)
p
(teste-t)
Redução
corrigida (%)
Naive (10)
30 ± 14
Vazio (9)
22 ± 13
28,1 0,188
CII-3 (9)
23 ± 17
22,5 0,347 7,5
Lin-7 (9)
24 ± 10
19,6 0,316 4,6
STT (10)
19 ± 17 35,3 0,140 20,3
Sm23T (9)
15 + 9 49,2 0,015 * 34,2
Sm23D (9)
20 + 10 33,0 0,087 18,0
(n) - número de animais, (*) diferença estatísticas (p < 0,05), Redução corrigida (%) = Redução (%) –
15%.
Analisando a Figura 16 e a Tabela 5 (Gene Gun) pode-se observar uma redução na
carga parasitária de 36-40% em média nos grupos imunizados com as vacinas de DNA
contendo CII-3, LIN-7 e STT individualmente, com valores de p próximo à significância,
quando estes são comparados com camundongos não imunizados (Naive). Estes resultados
confirmam os dados anteriormente obtidos que sugeriam um efeito protetor dos antígenos STT,
LIN-7 e CII-3. O desmembramento dos grupos aponta para um efeito protetor mais acentuado
dos antígenos LIN-7 e CII-3 (40 % e 38% de proteção, respectivamente), embora apenas o
gene CII-3 apresente diferença estatística significativa (p=0,049). Já o grupo STT apresentou
uma redução de 36,2 % da carga parasitária confirmando seu efeito protetor, porém desta vez
dissociado do antígeno Hip1.
Surpreendentemente, nestes ensaios o grupo imunizado com o vetor vazio apresentou
uma redução da carga parasitária de 30,0%, quando o esperado seria em torno de 12-15%
(Da´Dara et al., 2003). Este efeito protetor inespecífico se deve à atividade adjuvante dos
___________________________________________________________________Resultados
46
motivos CpG não metilados presentes no vetor que ativam uma resposta imune inata, porém
como estes valores estavam muito altos, resolvemos investigar a estrutura de nosso controle
negativo (vetor vazio). De fato, percebemos que este se tratava de uma molécula de
pDEST12.2 que não sofreu recombinação, permanecendo com sua estrutura íntegra como
apresentado na Figura 8. A única explicação plausível para o efeito adjuvante exacerbado deste
plasmídeo seria a existência de motivos CpG na região (cm
r
/ccdB contendo 1.683 pb), a qual é
perdida no processo de recombinação para clonagem dos candidatos vacinais. A presença desta
seqüência de 1.683 pb pode ser responsável pelo elevado efeito protetor observado no controle
negativo, isto por dois possíveis fatores. Primeiro pelo próprio tamanho desta seqüência, maior
que qualquer um dos genes clonados, podendo assim apresentar um número maior de motivos
CpG. Em segundo lugar, e certamente o fator mais relevante, a origem bacteriana destes genes
(cm
r
- gene de resistência a cloranfenicol / ccdB – proteína citotóxica ccdB). Isto porque, os
quatro hexâmeros mais estimulatórios contendo motivos CpG (GACGTC, GACGTT,
AACGTC e AACGTT) aparecem em uma freqüência 3,7 maior em genomas bacterianos
(Krieg et al., 1995), alguns motivos chegando a estar 20 vezes mais representados do que em
genomas de eucariotos superiores (Klinman et al., 1996). Para verificar o efeito aditivo desta
região utilizamos o programa CpGreport (http://bioweb.pateur.fr/seqanal/tmp/cpgreport), que
mapeia motivos CpG em seqüências de DNA. De fato, o controle negativo (contendo os genes
cm
r
e ccdB) apresentou 10% mais motivos CpG do que o vetor pDEST12.2 contendo os genes
Sm23, LIN-7, STT e CII-3. Com base nestes resultados passamos a utilizar nos próximos
experimentos um controle negativo com a região cm
r
/ccdB deletada. Baseados nestas
observações resolvemos calcular a porcentagem de proteção dos grupos vacinados frente ao
grupo naive e posteriormente estes valores foram subtraídos em 15 unidades para obtenção de
uma porcentagem de proteção corrigida (Tabela 5). Mesmo considerando esta porcentagem de
proteção corrigida, ainda se obtém uma proteção de 21-25% nos grupos imunizados com as
vacinas de DNA contendo os antígenos individuais.
Os mesmos antígenos foram avaliados administrando-se as vacinas de DNA por via
intramuscular, visando uma polarização para uma resposta Th1. Pode-se observar no gráfico de
dispersão (Figura 16) e na Tabela 5, que estes induziram uma redução na carga parasitária em
média de 20-35% em relação ao grupo não imunizado. Embora a tendência tenha sido
confirmada, estes resultados apresentaram uma baixa significância (p ≈ 0,15-0,35).
Novamente, observamos uma redução elevada na carga parasitária no grupo controle “vetor
vazio”, confirmando a necessidade da utilização de um controle mais adequado.
Neste ensaio também foi avaliada a utilização de outro vetor de imunização gênica, o
pTARGET, contendo o controle positivo Sm23. Os dados sugerem que o vetor pTARGET-
Sm23 foi ligeiramente superior ao vetor pDEST12.2 contendo o mesmo antígeno. Sendo o
único a apresentar redução de carga parasitária significativa (p=0,015)
Ao compararmos os mesmos antígenos administrados com vacinas de DNA por via
intramuscular e intradérmica, os resultados sugerem que uma resposta polarizada para Th2
___________________________________________________________________Resultados
47
contra CII-3 e LIN-7 poderia ser mais protetora, enquanto contra STT parece que ambas Th1 e
Th2 teriam efeito semelhante. No entanto, é importante lembrar que esses resultados são
indicativos de uma tendência, uma vez que não foram observadas diferenças estatísticas
significativas (p<0,05). De uma foram geral, fica evidente a necessidade de se reduzir a
dispersão observada nestes experimentos e utilização de um outro controle negativo.
Ainda com referência à comparação das vias de imunização intradérmica (Gene Gun) e
intramuscular, e tendo em vista que deveríamos aumentar a escala dos nossos ensaios de
imunização na próxima etapa do projeto, optamos por utilizar a via intramuscular.
Adicionalmente, não dispúnhamos do equipamento de biobalística em nosso laboratório (este
foi emprestado gentilmente pelo Dr. Célio Silva) e o protocolo para preparação das balas não
se demonstrou muito reprodutivo (dados não apresentados).
4.1.5. Clonagem, expressão e purificação parcial dos antígenos em E. coli.
Paralelamente à construção das vacinas de DNA, alguns dos genes selecionados no
Projeto Piloto foram transferidos por recombinação para o vetor de expressão bacteriana
pDEST17. Células de E. coli BL21 (SI) foram transformadas com estes vetores, cultivadas e
induzidas com NaCl 300 mM (concentração final). O crescimento dos cultivos foi
acompanhado (λ=600nm) e a expressão das proteínas verificada por SDS-PAGE (Figura 17).
Figura 17 – Géis de SDS-PAGE 12-15%. (A) lisado de bactérias E. coli BL21(SI) transformadas com os vetores
de expressão de LIN-7 e Sm23L (alça hidrofílica da proteína Sm23). Foram analisadas as frações: S – solúvel, L-
lavagem dos corpúsculos com 4 M Uréia, e C - corpúsculos ressuspendidos em 8 M Uréia; (B) Corpúsculos de
inclusão das proteínas recombinantes expressas em E. coli: HSP70, Catepsina L (Paralóga), Hip1, LIN-7,
proteína Sm14 purificada e E.V. – Extrato total de vermes adultos.
(A)
LIN-7 Sm23L
S L C S L C
(B)
97.0
66.0
45.0
30.0
20.1
14.4
E.V. 20 10 5 HSP Hip
BSA (ug)
Cat LIN-7
___________________________________________________________________Resultados
48
A Figura 17A demonstra que as proteínas LIN-7 e Sm23L (alça hidrofílica - Da´dara et
al., 2002) encontram-se em maior parte na forma de corpúsculos de inclusão. O mesmo foi
observado para as proteínas HSP70, Catepsina L (Paralóga) e Hipotética 1 (Figura 17B). As
proteínas recombinantes obtidas foram utilizadas para avaliar a indução de resposta imune
humoral.
4.1.6. Avaliação da indução de resposta humoral
Investigamos o potencial das vacinas de DNA induzirem uma resposta de anticorpo
contra os respectivos antígenos. Para tanto, o soro dos animais imunizados com diferentes
grupos foi analisado em Western-blots contra extratos totais de vermes adultos (20 µg) e contra
algumas proteínas recombinantes expressas em E.coli.
Na análise por Western blot não foi possível detectar anticorpos contra as respectivas
proteínas nos extratos totais de verme adulto na diluição analisada (1:250) (dados não
apresentados). Os animais dos grupos Hsp70, Lin-7, Hip1, Cat e Dlc tiveram ainda seu soro
ensaiado, por Western blot e ELISA, contra as respectivas proteínas expressas em E. coli;
nestes experimentos também não foi possível detectar anticorpos específicos contra estas
proteínas (dados não apresentados).
Como a expressão transiente em células de mamíferos dos vetores vacinais só foi
observada para os antígenos Sm23, Lin-7, CII-3, Stt e Hsp-70, não podemos concluir se nos
demais grupos de animais imunizados, a ausência de indução de anticorpos deve-se à não
expressão dos antígenos ou à indução de uma resposta imune tipo Th1, que levaria a uma baixa
formação de anticorpos.
4.1.6.1. Polarização das respostas Th1 e Th2: Vias de imunização Intramuscular e Gene Gun
O soro dos animais imunizados com as vacinas de DNA Lin-7 e Sm23 foi analisado por
ELISA (Figura 18) contra as proteínas recombinantes LIN-7 e a alça hidrofílica da proteína
Sm23. Infelizmente, não conseguimos expressar as proteínas CII-3 e STT em E. coli, o que
inviabilizou a análise do soro dos animais imunizados com as Vacinas de DNA contendo estes
antígenos. Pode-se observar a presença de anticorpos específicos no soro dos animais
imunizados com vacina de DNA contendo o antígeno Sm23, administrado tanto pela via
intradérmica como intramuscular (Figura 18). Os níveis de anticorpos são comparáveis, com
títulos >5x10
3
. No entanto, não foi observada produção de anticorpos anti-LIN-7,
adicionalmente os níveis de anticorpos observados no grupo Vetor Vazio podem ser explicados
pela reatividade cruzada com proteínas contaminantes presentes nos corpúsculos de inclusão
contendo as proteínas rSM23 e rLIN-7 utilizadas no ELISA.
___________________________________________________________________Resultados
49
Figura 18 – Produção de anticorpos IgG anti-Sm23 e anti-Lin-7. Os níveis de anticorpos IgG totais foram
analisados em amostras do soro coletadas 48 dias após a primeira dose da vacina de DNA. (A) anticorpos anti-
Sm23 (Gene Gun), (B) anticorpos anti-Sm23 (intramuscular), (C) anticorpos anti-Lin-7 (Gene Gun) e (D)
anticorpos anti-Lin-7 (intramuscular). Como “coating” nos ELISAS foram utilizados os corpúsculos de inclusão
contendo as proteínas LIN-7 e SM23L.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
2,4
2,6
40 80 160 320 640 1280 2560 5120
Diluições
DO (492 nm)
Vazio Gene Gun
Sm23 pDEST Gene gun
Sm23 pTARGET Gene gun
(A)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
2,4
2,6
2,8
40 80 160 320 640 1280 2560 5120
Diluições
DO (492 nm)
Vazio IM
Sm23 pDEST IM
Sm23 pTARGET IM
(B)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
40 80 160 320 640 1280 2560 5120
Diluições
DO (492 nm)
Vazio Gene Gun
Lin-7 Gene Gun
(C)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
40 80 160 320 640 1280 2560 5120
Diluições
DO (492 nm)
Vazio IM
Lin-7 IM
(D)
___________________________________________________________________Resultados
50
Visando caracterizar o perfil de resposta imune induzido por estas vias de imunização,
analisamos os isótipos de anticorpos IgG1 e IgG2a destes animais. A razão entre estas
subclasses de anticorpos pode ser utilizada como uma medida do balanço da resposta imune
entre os pólos Th1 e Th2. Os valores da razão IgG1 / IgG2a acima de 1 sugerem uma resposta
com perfil mais Th2, enquanto valores abaixo de 1 indicam uma resposta com perfil mais Th1.
Pode-se observar que os animais imunizados pela via intramuscular apresentam um
perfil de resposta polarizada para Th1, com anticorpos predominantemente IgG2a, enquanto
animais imunizados com Gene Gun apresentaram um perfil de resposta mais polarizada para
Th2, com predominância de anticorpos IgG1 (Figura 19). Estes resultados corroboram os
dados descritos na literatura (Da´dara et al., 2002a e b).
Figura 19– Razão dos isótipos de anticorpos anti-Sm23 IgG1/IgG2a do soro de camundongos imunizados com
Vacina de DNA contendo o gene do antígeno Sm23, pelas vias intramuscular e intradérmica (Gene Gun – GG).
4.1.7. Reavaliação das técnicas de desafio e perfusão utilizadas
Uma preocupação constante em nosso trabalho foi minimizar erros procedimentais, e
conseqüentemente diminuir a dispersão intra-grupo dos dados obtidos do desafio experimental.
De fato, a literatura não apresenta um protocolo consensual tanto para o desafio, quanto para as
perfusões, de modo que existem diferenças nos procedimentos adotados de laboratório para
laboratório, sem a devida descrição.
A apresentação de parte destes resultados no 9° Simpósio Internacional sobre
Esquistossomose (Novembro de 2003), permitiu reavaliarmos a metodologia que vínhamos
empregando, bem como iniciarmos uma colaboração com o grupo do Dr. Alan Wilson
(Universidade de York). Os principais pontos levantados pelo grupo de York foram a via pela
qual estávamos desafiando os animais (injeção subcutânea) e o método de perfusão do sistema
porta hepático utilizado (a partir de animais sacrificados por inalação de CO
2
, e perfusão a
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
pTARGET-Sm23
Gene Gun
pDEST12.2-Sm23
Gene Gun
pTARGET-Sm23
Intramuscular
pDEST12.2-Sm23
Intramuscular
Log
2
do Título
IgG1
IgG2a
2,0 0,250,122,0
___________________________________________________________________Resultados
51
partir do coração). Segundo estes pesquisadores, com algumas modificações experimentais
diminuiríamos a dispersão de nossos resultados. Deste modo, foi realizado um estágio de 20
dias na Universidade de York para aprendizagem dos detalhes experimentais.
4.2. Transcriptoma do S. mansoni: Seleção de antígenos in silico e avaliação de seu
potencial protetor usando uma base de dados com 125 mil ESTs
Esta segunda fase do projeto caracterizou-se pela mineração do banco de dados
completo do transcriptoma do S. mansoni, utilizando diferentes estratégias para a escolha de
candidatos vacinais, seguida da clonagem dos genes alvos e teste de seu potencial protetor
frente ao desafio experimental. O que ficou evidente desde o início é que se tornaram
disponíveis antígenos muito mais adequados como candidatos vacinais.
4.2.1. Seleção de antígenos in silico usando dados completos do Projeto Transcriptoma do S.
mansoni (125 mil ESTs)
Para a seleção de novos antígenos candidatos a serem testados na segunda fase do
projeto, adotamos diferentes estratégias visando enriquecer nosso poder de análise do banco de
dados do projeto. Primeiramente, os SmAEs foram avaliados por diversas categorias funcionais
de GO (Gene Ontology). Uma segunda estratégia adotada foi selecionar genes já descritos
como potenciais candidatos vacinais e seus parálogos encontrados no transcriptoma do
parasita. Analisamos ainda proteínas hipotéticas consideradas completas (“full-length”) e que
possuíssem peptídeos sinais, um indicativo de proteínas secretadas. Finalmente foram feitas
análises para selecionar genes diferencialmente expressos no estágio de esquistossômulo.
4.2.1.1. SmAEs selecionados pelas categorias de Gene Ontology (GO).
Primeiramente, os SmAEs foram classificados por diversas categorias funcionais de
GO (Gene Ontology - F- função molecular, C - componente celular, P - processo biológico).
Uma análise do banco revelou uma série de fragmentos gênicos (17) cuja função atribuída
indicava estarem expostos na superfície do verme ou serem secretados, e ainda expressos nos
estágios que infectam o hospedeiro mamífero, todas características importantes para um
candidato vacinal. De especial interesse foram encontradas toxinas, receptores de superfície,
proteínas de superfície expostas e receptores para fatores do hospedeiro (Tabela 6).
___________________________________________________________________Resultados
52
Tabela 6 - Genes selecionados por Gene Ontology como potenciais antígenos vacinas.
Proteína ortóloga (tamanho)
[Organismo] (identidade/cobertura)
Número de identificação
Provável Função
Estágios
com ESTs
Antígeno 5 (202 aa)
[Vespa mandarinia] (33% / 202 aa)
SmAE 607733
Exotoxina/Alergênico - Superfamília de proteínas
extracelulares, relacionadas a processos patogênicos,
componentes de venenos, ou produzidas em órgãos ou
células reprodutivas. Similaridade com candidatos vacinais
de Necator americanus e outros parasitas
O, M
Equicetina–subunidade alfa (177 aa)
[Echis carinatus ] (36% / 74 aa)
SmAE 712286
Inibe a aglutinação de plaquetas através da ligação com a
proteína GPIb
E
Esfingomielinase
Fosfodiesterase 2, neutra (419 aa)
[Mus musculus] (35% / 101 aa)
SmAE 607255
Catabolismo de esfingomielina (constituintes da membrana
lipídica) produzindo intermediários lipídicos (ceramidas)
em resposta a TNF-α , IL-1β , INF-γ
E
Receptor CD36 (509 aa)
[B. taurus] (30%, 509 aa)
SmAE 600716 SmAE 611319.1
Adesão celular; receptor classe B tipo 1; adesão de
plaquetas e leucócitos; transdução de sinal
E, A, O,
M, G
CD18 Beta-integrina (771 aa)
[M. musculus] (40%, 289 aa)
SmAE 602256
Glicoproteína de adesão na superfície celular, proteína de
adesão de leucócitos, receptor C3 do complemento
A, O, M, G
Receptor para FGF (877 aa)
[Halocynthia roretz] (32%, 112 aa)
SmAE 703516
Receptor para fator de crescimento de fibroblastos,
membro da superfamília das imunoglobulinas,
reconhecimento de superfície celular
E
Receptor para VLDL (869 aa)
[Xenopus laevis] (43% / 97 aa)
SmAE 600934
Metabolismo de ácidos graxos , receptor para lipoproteínas
de baixa densidade
M, O
Estomatina – (356 aa)
[Homo sapiens] (62% / 201 aa)
SmAE 606856
Possivelmente envolvida na formação de “lipid rafts” ;
mecanorecepção e ancoragem de lipídeos; no transporte de
cálcio; captação de fosfolipídios exógenos; ligação de
HDL, organização e biogênese de organelas
G, E, M, A
Receptor para TGF-beta/ Activin IIB (512 aa)
[Bos taurus] (38% / 80 aa)
SmAE 602729 / SmAE 700977
Proteína quinase serina/treonina, possível receptor para o
TGF-β
A
Carboxipeptidase N (458 aa)
[Mus musculus] (45%, 239 aa)
SmAE 602834 / SmAE 608649
Metalopeptidase regulando a atividade biológica de
quininas e anafilotoxinas no plasma humano
A, C
Receptor de Insulina (1749 aa)
[Equinococus multioculares] (34% / 153 aa)
SmAE 600474
Receptor para insulina descrito no platelminto
Echinococcus multilocularis
M, E
___________________________________________________________________Resultados
53
Leishmanolisina peptidase (630 aa)
[Homo sapiens] (37% / 243 aa)
SmAE 710539
Metaloendopeptidase; ancora de GPI; proteína mais
abundante na superfície celular de promastigotas
(Leishmania)
G
Esterase, beta-lactamase (429 aa)
[C. elegans] (34% / 210 aa)
SmAE 609556
Possivelmente secretada ou extracelular,
Proteína ligadora de penicilina
G, E, A, O
Proteína de Superfície Circunsporozoite-CSP
(368 aa)
[Plasmodium simium] (44% / 181 aa)
CSP (388 aa)
[Plasmodium reichnowi] (36% / 109 aa)
SmAE 604900
Proteína externa majoritária de Plasmodium, rica em
prolinas
O
Protéina de parede celular (1161aa)
[Saccharomyces cerevisiae] (42% / 113 aa)
Promastigote surface antigen P2 (371 aa)
[Leishmania major] (36% / 115 aa)
SmAE 600436
Proteína de membrana responsiva a estresse, rica em
treoninas
G, C
Apirase, ATP difosfohidrolase (306 aa)
[H. sapiens] (37%, 132 aa)
SmAE 608449
Proteína integral de membrana, localizada no tegumento,
possível envolvimento na inibição da agregação plaquetária
E, A
Fosfatase Alcalina (524aa)
[Mus musculus] (36% / 332aa)
SmAE 607243
Glicoproteína com ancora de GPI, anticorpos anti-FA em
soro de indivíduos infectados
E, A
(aa) - aminoácidos, G – “germ ball”, C – cercária, E – esquistossômulo, A – vermes adultos, O – ovos, M –
miracídio. Extraído e modificado a partir da Tabela 5 de Verjovski et al., 2003.
4.2.1.2. Parálogos de candidatos vacinais
A elevada quantidade de genes parálogos encontrados (149) utilizando os (116) genes
previamente descritos para Esquistossoma, levanta a possibilidade de estes comporem um
mecanismo de evasão antigênica do parasita. A utilização de proteínas parálogas com esta
finalidade está bem descrita em bactérias (Sasaki et al., 2002), bem como sua participação no
processo de transmissão e infecção (Hefty et al., 2002).
Existe ainda a possibilidade que estes genes parálogos desempenhem papéis muito
similares, com apenas algumas pequenas especializações funcionais. Como é o caso, por
exemplo, dos transportadores de glicose de Esquistossoma (SGTP1 e SGTP4). SGTP1
localiza-se nas membranas basais do tegumento e sobre a musculatura do verme, ao passo que
SGTP4 está presente apenas na porção apical da membrana da dupla camada lipídica do
tegumento, caracterizando assim uma distribuição assimétrica destes dois transportadores.
Adicionalmente, SGTP4 parece ser expresso apenas nos estágios do ciclo de vida que ocorrem
dentro do hospedeiro mamífero, localizando-se preferencialmente na interface do verme com o
hospedeiro. Esta distribuição sugere que SGTP4 transporta glicose para o tegumento a partir do
___________________________________________________________________Resultados
54
soro do hospedeiro, e que posteriormente SGTP1 transporta esta glicose para os tecidos abaixo
do tegumento (Skelly et al., 1996).
Dentro deste contexto escolhemos (2) genes já descritos por seu potencial imunogênico
e seus respectivos parálogos para serem analisados, sendo eles Catepsina L e Catepsina L-like,
Calponina e Calponina-like (Tabela 7).
Tabela 7 - Genes Parálogos investigados como potenciais antígenos vacinas.
Proteína
[Organismo] (identidade/tamanho)
Provável Função
Estágios
com
ESTs
Catepsina L
[Schistosoma mansoni] (100% / 202 aa)
Associadas a digestão de hemoglobina, síntese da parte
externa dos ovos e como componentes do fluído seminal
dos vermes.
C, E, A, G
Catepsina L Paralóga (44% / 340 aa)
[Schistosoma mansoni]
SmAE 601590
O, M, G,
E, A
Calponina
[Schistosoma mansoni] (100% /361 aa)
Proteína de citoesqueleto; transdução de sinal e contração
muscular; ligação a actina, calmodulina; troponina C e
tropomiosina.
E, A, G
Calponina Paralóga
[Schistosoma mansoni] (63% / 361 aa)
SmAE 603448 / SmAE 604248
O, M, G,
E, A
(aa) - aminoácidos, G – “germ ball”, C – cercária, E – esquistossômulo, A – vermes adultos, O – ovos, M -
miracídio. Extraído e modificado a partir da Tabela 5 de Verjovski et al., 2003 - material suplementar).
4.2.1.3. Hipotéticos
O grande número de SmAEs (51%) obtidos no projeto sem seqüências similares nos
bancos de dados públicos, pode ser atribuído à divergência dos platelmintos com os
organismos já seqüenciados. A exclusividade destes genes pode estar associada a funções
únicas do parasita, como por exemplo, mimetismo molecular, imunomodulação e nutrição. Em
função do potencial destes novos dados, julgamos importante uma análise mais detalhada deste
conjunto de genes. Para tanto, foi feita uma análise in silico por vários critérios (ver Materiais e
Métodos), resultando em 114 SmAEs que foram triados manualmente pelos seguintes critérios:
- Possuir > de 10 seqüências compondo o agrupamento “cluster”
- Ter seqüências da biblioteca normalizada que marcassem a cauda poli-A corretamente.
- Possuir um códon de terminação antes do códon de iniciação.
- Apresentar peptídeos sinais putativos, identificados pelo banco de domínios protéicos
SMART.
___________________________________________________________________Resultados
55
- Não possuir seqüências repetitivas (“repeats”), o que pode levar a montagem incorreta do
SmAE.
Após esta avaliação, escolhemos (3) proteínas hipotéticas completas (sem seqüência
similar em outro organismo), porém contendo domínios Pfam e/ou peptídeos sinais, para serem
testadas como vacinas de DNA. A síntese destas análises encontra-se na Tabela 8.
Tabela 8 – Genes sem função conhecida investigados como potenciais antígenos vacinas.
Gene Hipotético (tamanho) Seqüência do peptídeo sinal
Estágios
com
ESTs
Hip2 - SmAE 605717
PVCFDFQLLLTGLIIVLLSHKSQAD
A, O, C
Hip3 – SmAE 607465 SmAE 602499
Hipotética (430 aa)
MLWNLYSIYTLVTTLLNVLRYTSSS
E, A, M
Hip4 - SmAE 609754
Hipotética (410 aa)
MVSILAFL
E, A, C
(aa) - aminoácidos, G – “germ ball”, C – cercária, E – esquistossômulo, A – vermes adultos, O – ovos, M –
miracídio.
4.2.1.4. Genes diferencialmente expressos
Genes com expressão aumentada na transição do estágio de cercária para
esquistossômulo, poderiam ser essenciais para a sobrevivência do parasita no hospedeiro
definitivo e portanto seriam de especial interesse como potenciais candidatos vacinais. Com
base neste racional foram realizados experimentos de expressão virtual (ver Materiais e
Métodos); foram encontrados 110 SmAEs diferencialmente expressos comparando-se os
diferentes estágios. Foram analisados particularmente os genes com expressão aumentada em
esquistossômulos com relação a cercárias, uma vez que estes também poderiam ser
responsáveis pela imunidade protetora conferida pela imunização com cercárias irradiadas
(Harrop et al., 1999). Esses SmAEs foram inspecionados manualmente, sendo selecionados (8)
(Tabela 9).
Tabela 9- Genes Diferencialmente Expressos investigados como potenciais antígenos vacinas.
Gene Diferencialmente expresso
Função / Tamanho aa
Estágio com expressão aumentada em relação a
cercária e/ou vermes adultos
Estágios
com
ESTs
Dife-1 – SmAE 604371
Hipotética / 350 aa
Esquistossômulo e Adultos E, A, G, C
Dife2 – SmAE 607425
Cdc42 – transdução de sinal / 195 aa
Esquistossômulos
E, A, O,
G,
___________________________________________________________________Resultados
56
Dife3 – SmAE 605704
Proteína putativa de origem bilateral / 219 aa
Esquistossômulos
E, A, O,
M, G
Dife4 – SmAE 600216
Hipotética / 394 aa
Esquistossômulos
E, A, O,
M, G, C
Dife5 – SmAE 611133
CD59 - Glicoproteína de superfície celular,
inibe a formação do complexo de ataque a
membrana (MAC), prevenindo a lise mediada
pelo complemento / 126 aa
Esquistossômulos E, O
Dife6 – SmAE 602523
Hipotética / 148 aa
Esquistossômulos
C, E, A,
M, G
Dife7 – SmAE 609023
Hipotética / 190 aa
Esquistossômulos
E, A, O,
M, G, C
Dife8 – SmAE 609541
Hipotética / 330 aa
Esquistossômulos
E, A, O,
M, G, C
(aa) - aminoácidos, G – “germ ball”, C – cercária, E – esquistossômulo, A – vermes adultos, O – ovos, M –
miracídio. Extraído e modificado a partir da Figura 3 de Verjovski et al., 2003.
4.2.2. Clonagem dos candidatos vacinais e construção das vacinas de DNA
A partir das seqüências consenso dos agrupamentos (“contigs ou clusters”), foram
desenhados oligonucleotídeos para a amplificação dos genes de interesse. Alguns destes não
possuíam a seqüência completa e estas foram obtidas com auxílio do kit 5´ RACE (Invitrogen)
(dados não apresentados). Para outros, não foi possível obter a seqüência completa, sendo
selecionados os fragmentos gênicos contendo domínios extracelulares. Estes genes foram
clonados por diferentes estratégias.
Primeiramente, utilizamos clones do projeto de seqüenciamento que contivessem os
genes completos, para tanto contamos com a colaboração do Laboratório do Dr. Sérgio
Verjovski-Almeida, onde se encontra um estoque de todos os 125 mil clones seqüenciados pelo
projeto. Na ausência de um fragmento molde completo, porém dispondo da seqüência
completa do gene, foram desenhados iniciadores para amplificação do cDNA correspondente
por RT-PCR ou a partir de uma Biblioteca de cDNA construída. Após a amplificação dos
genes e/ou fragmentos gênicos de interesse, estes foram clonados nos vetores de expressão
pDEST12.2 ou pTARGET, e sua seqüência confirmada por sequenciamento (dados não
apresentados).
___________________________________________________________________Resultados
57
Tabela 10 – Genes / fragmentos gênicos avaliados na forma de vacina de DNA.
Genes selecionados por Gene Ontology
Proteína ortóloga (tamanho)
[Organismo] (identidade/cobertura)
Estratégia de
clonagem
Laboratório
responsável
pela
clonagem
Vetor base da
vacina de DNA /
tamanho do
fragmento gênico
(aa)
Gene
completo /
Fragmento
gênico
Antígeno 5 (202 aa)
[Vespa mandarinia] (33% / 202 aa)
Clone do projeto
L pTARGET / 221 aa
Gene
completo
Equicetina subunidade alfa (177 aa)
[Echis carinatus ] (36% / 74 aa)
Clone do Projeto
L
pDEST12.2 / 141 aa
Fragmento
Receptor para VLDL (869 aa)
[Xenopus laevis] (43% / 97 aa)
Clone do Projeto
L pTARGET / 93 aa Fragmento
Estomatina (356 aa)
[Homo sapiens] (62% / 201 aa)
Biblioteca de
cDNA
L
pDEST12.2 / 358 aa
Gene
completo
Receptor de Insulina (1749 aa)
[Equinococus multioculares] (68% / 173 aa)
(28% / 508 aa)
RT-PCR L
pDEST12.2 / 153 aa
Fragmento
(domínio
extracelular)
Leishmanolisina peptidase (630 aa)
[Homo sapiens] (37% / 243 aa)
Clone do Projeto
L pTARGET / 237 aa Fragmento
Carboxipeptidase N (458 aa)
[Mus musculus] (45%, 239 aa)
Clone do Projeto
L pDEST12.2 / 239 aa
Gene
completo
Proteína de Superfície Circunsporozoite- CSP
(368 aa)
[Plasmodium simium] (44% / 181 aa)
CSP (388 aa)
[Plasmodium reichnowi] (36% / 109 aa)
Clone do Projeto
V pTARGET / 191 aa Fragmento
Apirase, ATP difosfohidrolase (306 aa)
[H. sapiens] (37%, 132 aa)
RT-PCR V pTARGET / 545 aa
Gene
completo
Fosfatase Alcalina (524aa)
[Mus musculus] (36% / 490aa)
5´Race, RT-PCR
V pTARGET / 536 aa
Gene
completo
Genes Parálogos
Proteína
[Organismo] (identidade/tamanho)
Estratégia de
clonagem
Laboratório
responsável
pela
clonagem
Vetor base da
vacina de DNA
Gene
completo /
Fragmento
gênico
Catepsina L
[Schistosoma mansoni] (100% / 202 aa)
RT-PCR L pDEST12.2
Gene
completo
Catepsina L Paralóga (33% / 340 aa)
[Schistosoma mansoni]
Clone do Projeto
L pDEST12.2
Gene
completo
___________________________________________________________________Resultados
58
Calponina
[Schistosoma mansoni] (100% /361 aa)
RT - PCR L pDEST12.2
Gene
completo
Calponina Paralóga
[Schistosoma mansoni] (63% / 361 aa)
Biblioteca de
cDNA
L pDEST12.2
Gene
completo
Proteínas Hipotéticas com peptídeo sinal
Gene Hipotético
(tamanho)
Estratégia de
Clonagem
Laboratório
responsável
pela
clonagem
Vetor base da
Vacina de DNA
Gene
completo /
Fragmento
gênico
Hip2
Surface protein-related (275 aa)
[Plasmodium yoelii yoelii] (26%, 105 aa)
RT-PCR M
pTARGET
Gene
completo
Hip3
Hipotética (430 aa)
Clone do
Projeto
L
pDEST12.2
Gene
completo
Hip4
Hipotética (410 aa)
Clone do
Projeto
L
pTARGET
Gene
completo
Genes Diferencialmente Expressos
Gene Diferencialmente expresso
Função / Tamanho (aa)
Estratégia de
clonagem
Laboratório
responsável
pela
clonagem
Vetor Base da
Vacina de DNA
Gene
completo /
Fragmento
gênico
Dife2
Cdc42 – transdução de sinal / 195 aa
Clone do Projeto
L pTARGET
Gene
completo
Dife3
Proteína putativa da origem bilateral / 219 aa
Clone do Projeto
L pTARGET
Gene
completo
Dife4
Hipotética / 394 aa
RT-PCR M pTARGET
Gene
completo
Dife5 – Similar a CD59 glicoproteína de
superfície celular, inibe a formação do
complexo de ataque a membrana (MAC),
prevenindo a lise mediada pelo complemento /
126 aa
RT-PCR M pTARGET
Gene
completo
Dife6
Hipotética / 148 aa
Clone do Projeto
L pTARGET
Gene
completo
Dife7
Hipotética / 190 aa
Clone do Projeto
L pTARGET
Gene
completo
(aa) - aminoácidos, Laboratórios responsáveis pela clonagem L – Dra. Luciana Leite (Instituto Butantan), V – Dr.
Sérgio Verjovski (IQ-USP, São Paulo), M – Dr. Carlos F. Menck (ICB-USP, São Paulo).
___________________________________________________________________Resultados
59
4.2.3. Expressão transiente em células de mamífero BHK
Visando validar a capacidade de expressão dos vetores construídos baseados em
pTARGET ou pDEST12.2, células BHK foram transfectadas com estes vetores contendo os
genes selecionados. O RNA total foi extraído e analisado por RT-PCR para detecção dos
mRNAs dos antígenos candidatos. Pode-se observar as bandas referente à amplificação dos
transcritos do Antígeno 5, Vldl, Fosfatase Alcalina (FA), Apirase, Dife5, Dife7, Estomatina e
Dife2 na Figura 20.
Figura 20 - Ensaios de RT-PCR utilizando RNA total (1 µg) de células transfectadas com as construções em
pTARGET - Antígeno 5, rVLDL, Fosfatase Alcalina (FA), Apirase, Dife5, Dife7, Dife2, e pDEST12.2-
Estomatina. As setas apontam os fragmentos esperados para os respectivos mRNAs, marcadores de tamanho de
fragmentos de DNA em pares de base (pb).
Os resultados da Figura 20 demonstram que células de mamífero transfectadas com os
vetores de expressão pTARGET ou pDEST12.2, contendo os genes dos antígenos vacinais,
apresentam transcritos com o tamanho esperado para os respectivos genes.
RT Taq
FA
2000
1650
Taq RT RT
Antígeno5
VLDL
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
RT Taq
Dife5
400
300
200
100
RT Taq
Estomatina
RT T
aq
Dife7
2000
1650
1000
850
650
500
RT Taq
Dife2
1000
850
650
500
RT Taq
Apirase
2000
1500
___________________________________________________________________Resultados
60
4.2.4. Avaliação da atividade protetora dos candidatos vacinais através de vetores de
imunização gênica (Vacinas de DNA)
Visando obter dados funcionais dos candidatos vacinais propostos na Tabela 10,
avaliamos a proteção induzida, pela imunização de camundongos com vetores de imunização
gênica contendo os genes / fragmentos gênicos de interesse. Realizamos o desafio através da
penetração pela pele, sendo as cercárias contadas por estimativa; as perfusões foram realizadas
com o animal anestesiado, e utilizando como sítio de bombeamento de salina a artéria aorta.
No total foram testados 27 antígenos ou combinações desses antígenos, Tabela 11.
___________________________________________________________________Resultados
61
Tabela 11 – Grupos experimentais de imunização montados com os candidatos vacinais.
Grupos experimentais Antígenos Analisados
Grupo 1
Naive
Vazio
Catepsina L
Catepsina L Paralóga
Catepsina L + Catepsina L Paralóga
Biblioteca de expressão imunizadora (10
3
clones randômicos)
Grupo 2
Naive
Vazio
Equicetina
Apirase
Calponina
Calponina Paralóga
Calponina + Calponina Paralóga
Grupo 3
Naive
Vazio
Lin-7
Estomatina
Receptor de Insulina
Hipotética 3
Grupo 4
Naive
Vazio
Antígeno 5
Leishmanolisina
Carboxipeptidase
Hipotética 4
Dife4
Dife6
Grupo 5
Naive
Vazio
Hipotética 2
Dife2
Dife3
Dife5
Dife7
Grupo 6
(Microesferas)
Naive
Vazio
Antígeno 5
Estomatina
Carboxipeptidase
Grupo 7
Naive
Vazio
Circunsporozoito - CSP
Receptor para Vldl
Fosfatase Alcalina
___________________________________________________________________Resultados
62
Ao observarmos a Figura 21, constatamos que, de fato as modificações descritas nos
protocolos de desafio e perfusão (Materiais e Métodos, item 3.8.2.) sortiram efeito sobre a
dispersão dos dados obtidos, isto pode ser confirmado pelos valores de desvio padrão da
Tabela 12. A Figura 21 apresenta os seis antígenos com maior atividade protetora de um total
de 24 analisados (18 com seqüência completa).
Figura 21 – Gráfico de dispersão do número de vermes recuperados de camundongos imunizados com vacina de
DNA contendo os genes dos antígenos selecionados. Camundongos fêmeas C57BL/6 foram imunizadas com 50
µg de DNA plasmidial, os animais receberam um reforço 21 dias após a primeira dose e depois de 28 dias foram
desafiados com 130 - 200 cercárias e o número de vermes recuperados após 7 semanas foi analisado. (--) média do
número de vermes recuperados em cada grupo; a redução da carga parasitária está expressa em porcentagem,
sobre cada grupo protetor e os valores de p (teste t-student) estão apresentados abaixo.
17%
0,069
24%
0,015
12%
0,068
21%
0,032
21%
0,019
31%
0,002
12%
0,058
18%
0,014
___________________________________________________________________Resultados
63
Tabela 12 – Redução de carga parasitária induzida pelas Vacinas de DNA contendo os genes dos
antígenos protetores identificados na segunda fase do projeto: sete ensaios.
Grupo (n)
Média de Vermes
recuperados
(NMV ±
±±
± DP)
Redução
(%)
P
(teste-t)
Naive 155 + 22
Vetor Vazio 162 + 30
Catepsina L 158 + 12 3 -
Catepsina L Paralóga 164 + 16 - -
Catepsina L + Catepsina L
Paralóga
161 + 22 - -
Grupo 1
Biblioteca de expressão
imunizadora
143 + 18 12 -
Naive 115 + 16
Vetor Vazio 112 + 22
Apirase 95 + 14 18% 0,014
Equicetina 110 + 22 5 -
Calponina 103 + 27 11 -
Calponina Paralóga 104 + 23 9 -
Grupo 2
Calponina + Calponina
Paralóga
103 + 19 11 -
Naive 74 + 11
Vetor Vazio 65 + 6
Lin-7 56 + 16 24% 0,015
Estomatina 61 + 17 17% 0,069
Stt-3 69 + 15 7 -
Receptor de Insulina 70 + 10 6 -
Grupo 3
Hip3 72 + 11 3 -
Naive 68 + 19
Vetor Vazio 67 + 15
Carboxipeptidase 63 + 20 - -
Antígeno5 68 + 10 - -
Leishmanolisina 65 + 16 - -
Dife4 71 + 10 - -
Hip4 73 + 6 - -
Grupo 4
Dife6 67 + 7 - -
Vetor Vazio 72 + 8
Dife2 63 + 10 12% 0,068
Dife5 57 + 15 21% 0,032
Dife7 64 + 14 12% 0,184
Dife3 65 + 22 9% -
Grupo 5
Hip2 73 + 14 - -
Naive 76 + 7,5
Vetor Vazio 67 + 6,9
Carboxipeptidase 70 + 19 8% -
Estomatina 60 + 14 21% 0,019
Ensaio 6
(Microesferas)
Antígeno 5 53 + 14 31% 0,002
___________________________________________________________________Resultados
64
Naive 95 + 15
Vetor Vazio 94 + 15
Vldl 83 + 6 12% 0,058
Ensaio 7
Circunsporozoito 85 16 10% -
Naive 42 + 8
Vetor Vazio 38 + 6
Ensaio 8
Fosfatase Alcalina 37 + 5 12% -
(-) não significativo
Pode-se observar que a imunização com o Antígeno 5 formulado para apresentação na
forma de microesferas apresentou a maior redução na carga parasitária, de 31%, enquanto os
antígenos Lin-7, Dife5 e Estomatina (também em microesferas) apresentaram reduções
intermediárias 21-24%. Já os antígenos Apirase e Estomatina reduziram a carga parasitária em
cerca de 18% e 17-21%, respectivamente. Finalmente, com 12% de proteção observamos os
antígenos rVldl e Dife2. Deve-se ressaltar que se comparado com os experimentos anteriores
estes resultados possuem uma maior significância estatística, isto pode ser observado pelos
valores de (p) apresentados por estes grupos na Tabela 12. Adicionalmente, podemos afirmar
que estes ensaios apresentam maior significado biológico, uma vez que os animais foram
desafiados pela via natural de penetração do parasita (penetração pela pele), ao contrário do
que foi realizado nos ensaios do Projeto Piloto.
4.3. Investigação dos candidatos vacinais selecionados pelo Transcriptoma e
Proteoma do Schistosoma mansoni
Visando obter informações sobre a localização e distribuição dos candidatos vacinais
selecionados (Projeto Piloto e Transcriptoma Completo) foram feitas comparações destas
moléculas com os bancos de proteoma, obtidos no laboratório do Dr. Alan Wilson, gerados a
partir de:
- Tegumento de vermes adultos purificado por duas estratégias distintas (van Balkom et
al., 2005 e Braschi et al., 2005a).
- Proteínas localizadas na superfície do tegumento (Braschi et al., 2005b).
- Secreções cercáriais (Knudsen et al., 2005 e Curwen et al., 2006)
- Secreções de esquistossomulos (Curwen, 2005, comunicação pessoal)
- Proteínas secretadas no tubo digestivo (“gut”) de vermes adultos (Hall, 2005,
comunicação pessoal).
- Vermes adultos desnudos, isto é, que tiveram seu tegumento removido (van Balkom et
al., 2005).
___________________________________________________________________Resultados
65
A Tabela 13 apresenta um resumo destas análises, bem como dados referentes à
expressão diferencial de alguns destes genes por análises de “microarray”, comparando 7
estágios do ciclo de vida do parasita (ovos, estágio intra-molusco “germ ball”, cercária,
esquistossômulo de 2 dias, estágio pulmonar com 7 dias, vermes presentes no fígado com 21
dias e vermes adultos) (Garry Dillon, 2005, comunicação pessoal).
Dentre as vacinas de DNA que demonstraram uma redução na carga parasitária,
podemos observar que a Apirase (18% de proteção) foi identificada em três estudos de
proteoma distintos, sendo caracterizada como uma proteína exclusiva de tegumento por van
Balkom (2005), como uma proteína exposta na superfície do verme por Braschi (2005b) e
como uma proteína presente nas secreções cercáriais por Knudsen (2005). Todas estas
características seriam importantes para um bom candidato vacinal, isto porque elas
demonstram que esta molécula deve estar mais acessível ao sistema imune do hospedeiro, tanto
no momento da penetração, quanto após a fixação do parasita, que deve viver longos períodos
dentro do hospedeiro.
___________________________________________________________________Resultados
66
Tabela 13 – Comparação dos candidatos vacinais identificados no Transcriptoma do S. mansoni e
a presença da proteína correspondente em diferentes estudos do Proteoma do parasita e análise
por microarranjos.
Estudos do Proteoma do S.mansoni % de
Proteção
Vacina
de DNA
Genes
Selecionados
Tegumento
Projeto Piloto
Todo
(
van Balkom
et al., 2005)
Superfície
(Braschi et
al., 2005b)
Vermes sem
Tegumento
(van Balkom
et al., 2005)
Secreções
Esq. (0–3) h
(Curwen et al.,
2006)
Secreções
da “gut”
Vômito
(Hall,
2005)
Secreções
cercáriais
(Knudsen et
al., 2005)
Microarranjos
(Dillon et al.,
2006)
Sm23 X
Miofilina X X X
HSP70 Similar Similar
Similar
DLC Similar
Similar
21 STT3 X X
23
Succinato
Desidrogenase
subunidade CII-3
Subunid
B
Subunid
A
24 Lin-7
Transcriptoma
(Verjovski et al.,
2003)
31 Antígeno 5 (M) Similar
21 Estomatina X X
Leishmanolisina Similar
18 Apirase XX X X D7↓
12 Receptor VLDL
Anexina X D7↑
Fosfodiesterase XX X
Fosfatase Alcalina XX X X
Antígeno CD36 X X
Integrina beta-2 X X
Catepsina L X X D21↑ A↑
Catepsina L Paralóga
Similar E↓ G↓ C↑ D2↑
Calponina X X
Calponina Paralóga
Hip-1 G↓ C↑ A↑
12 Dife2 X X
21 Dife5 Similar D2↑ D7↑
Dife6 D2↑ D7↑
X – presente no estudo de Braschi (2005a e b), X – presente nos estudos de van Balkom (2005). Similar –
proteínas similares, o alinhamento encontra-se no material suplementar. E – ovos, G – “germ ball”, C – cercária,
D2, D7 e D21 – esquistossomulos com 2, 7 e 21 dias, A – vermes adultos.
___________________________________________________________________Resultados
67
Com relação aos candidatos vacinais avaliados no projeto piloto, chamam a atenção
dois dos antígenos identificados, CII-3 e STT3, que foram encontrados em estudos de
proteoma no tegumento. Dentre as proteínas que aparecem tanto no tegumento como em
vermes desnudos (sem tegumento), encontramos a Miofilina, STT3 (Oligosacaril transferase) e
a Integrina beta-2. Adicionalmente, foram encontradas as subunidades A e B da succinato
desidrogenase no tegumento e em secreções da “gut”.
As informações referentes à proteína Estomatina (21% de proteção) apontam para a
presença desta proteína no tegumento de vermes adultos. Nas análises feitas por van Balkom
(2005), esta proteína também foi encontrada em vermes desnudos (sem tegumento), entretanto
a metodologia utilizada neste trabalho para a remoção do tegumento e posterior análise dos
vermes desnudos não garante que estes estejam totalmente livres de proteínas do tegumento.
Com relação às moléculas que demonstraram algum efeito protetor, observamos que a
proteína codificada pelo gene Dife2 (12% de proteção) foi encontrada tanto na “gut”, como no
tegumento de vermes adultos. Já para a vacina de DNA codificada pelo Antígeno 5 (31 % de
proteção), encontramos apenas uma proteína similar secretada por esquistossomulos (0-3
horas). Não foi possível detectar em nenhum dos bancos de proteoma analisados, informações
sobre as proteínas r-VLDL (12% de proteção), Dife5 (21% de proteção) e Lin-7 (24% de
proteção).
Para os demais candidatos vacinais selecionados pelo transcriptoma do S. mansoni
(Verjovski et al., 2003), merece destaque a detecção das proteínas Fosfodiesterase e Fosfatase
Alcalina como proteínas expostas na superfície do verme. Isto confere a estas moléculas uma
maior probabilidade de interação com o sistema imune do hospedeiro, reforçando sua seleção
como antígenos vacinais.
Deve-se enfatizar que, se o parasita apresenta proteínas exclusivas de tegumento, estas
devem ter sofrido pressão seletiva ao longo do tempo por desempenhar funções específicas do
tegumento como evasão imune, nutrição e transporte. Dentre as proteínas inicialmente
selecionadas pela análise do transcriptoma “completo”, as proteínas Apirase, Fosfodiesterase e
Calponina aparecem como exclusivas de tegumento. Curiosamente, nenhuma destas proteínas
foi investigada até hoje como candidato vacinal, talvez pelo fato delas serem pouco
imunogênicas, e nunca terem sido reconhecidas em varreduras (“screenings”) de sorologia.
Analisando os dados de “microarray”, obtidos no Laboratório do Dr. Alan Wilson, elas
confirmaram nossa predição de expressão diferencial para os genes Dife5 e Dife6, sendo estes
mRNAs mais expressos no estágio de esquistossômulo. Infelizmente, apenas uma parcela dos
nossos genes estava presente na lâmina analisada (Dillon, 2005, comunicação pessoal), de
modo que não foi possível uma comparação completa.
___________________________________________________________________Resultados
68
4.3.1. Seleção e clonagem de candidatos vacinais pela estratégia de Proteoma
Investigamos também, em colaboração com o Dr. Alan Wilson, potencias candidatos
vacinais identificados por análises de proteoma. Nosso ponto de partida foram as moléculas
identificadas por Braschi (2005b), descritas como as proteínas mais expostas na superfície de
vermes adultos. Esta caracterização foi feita através da marcação das proteínas na superfície do
verme com biotina, seguida de extração e purificação em coluna de estreptoavidina e análise
dos produtos por espectrometria de massa. A comparação dos peptídeos identificados por
espectrometria de massa e os bancos de dados do transcriptoma e genoma do S. mansoni,
revelaram uma série de novas proteínas.
Uma síntese destas análises bem como uma proposta da localização destas proteínas no
tegumento do verme encontra-se apresentada na Figura 22. Dentre as proteínas caracterizadas,
os genes da Fosfatase Alcalina, Fosfodiesterase e Anexina apresentavam seqüência completa e
foram escolhidos para serem melhor investigados como candidatos vacinais.
Figura 22 – Representação diagramática do tegumento e proposta de localização das proteínas identificadas. As
proteínas em azul foram marcadas pelas moléculas de biotina de cadeia longa e curta, enquanto as proteínas em
vermelho foram marcadas apenas pela biotina de cadeia curta, desta maneira devem ter uma localização mais
críptica. Sublinhado estão as proteínas selecionadas para serem investigadas como candidatos vacinais em
colaboração com o laboratório do Dr. Alan Wilson (extraído e modificado de Braschi et al., 2005b).
Phosphodiesterase
Host blood
Membranocalyx
Plasma
membrane
Diphosphohydrolase
Alkaline
phosphatase
Dysferlin
Annexin
Tetraspanin D
Sm29
Anion
channel
Calpain
“Surface
protein”
HSP 70
GAPDH
Tetraspanin
B
Actin,
Severin &
Fimbrin
SNaK1
Carbonic
anhydrase
Tegument
Spine
IgM
(Mus)
Complement C3
fragment
(Mus)
IgG3
(Mus)
IgG1
(Mus)
___________________________________________________________________Resultados
69
Os genes completos da Fosfatase Alcalina, Anexina e Fosfodiesterase foram
amplificados por RT-PCR (kit Omni-Script RT - Qiagen) a partir do RNA total de vermes
adultos (Figura 23). Os produtos de PCR foram clonados no vetor pGEM-T e as seqüências
conferidas por ensaios de digestão e seqüenciamento (dados não apresentados).
Figura 23 – Eletroforese em gel de agarose 1%, contendo fragmentos amplificados por RT-PCR a partir do RNA
total de vermes adultos, sendo eles: (1) – fragmento do gene do antígeno 5, sem o peptídeo sinal, (2) – cDNA da
anexina, (3) –cDNA da fosfodiesterase e (4) – cDNA da fosfatase alcalina.
4.4. Avaliação detalhada dos candidatos vacinais selecionados do Transcriptoma e
Proteoma do S. mansoni.
4.4.1. Lin-7
Parte do cDNA deste gene foi inicialmente clonado em um varredura de uma biblioteca
de expressão, utilizando soro de animais imunizados com proteínas secretadas pelo estágio
pulmonar de esquistossômulo. Esta proteína foi imunolocalizada em vários tecidos do verme,
porém foi mais abundantemente localizada no tegumento (Figura 24, extraída de Harrop et al.,
1999). A análise da resposta imune celular de camundongos vacinados com esta proteína,
demonstrou sua capacidade de induzir a secreção de grandes quantidades da citocina IFN-
γ, característica tipo (Th1) (Harrop et al., 1999). Entretanto, seu potencial imunogênico nunca
havia sido avaliado em desafio experimental com cercárias. O gene estudado na forma de
vacina de DNA conferiu um redução na carga parasitária de 24%.
1 2 3 4
1500
1200
1000
900
800
700
600
___________________________________________________________________Resultados
70
Figura 24 - Imunolocalização do clone A26 (seqüência parcial do gene Lin-7). Estágio pulmonar de
esquistossômulo, mostrando a presença da proteína de modo difuso em diferentes tecidos e mais intensamente
localizada no tegumento do parasita (extraído de Harrop et al., 1999).
Após a obtenção do cDNA completo deste gene (combinando seqüências do nosso
banco de dados e da TIGR - http://www.tigr.org/tigr-scripts/tgi/T_index.cgi
?species=s_mansoni - gene index), percebemos que esta proteína era ortóloga à proteína LIN-
7. De fato, a análise da seqüência de aminoácidos no banco de dados de domínios protéicos
SMART (Letunic et al., 2004), revelou a existência de um domínio L27 e um PDZ, domínios
estes característicos da proteína LIN-7 (Figura 25).
Uma série de trabalhos indicam que a proteína LIN-7 atua como uma proteína estrutural
“scaffold”, organizando juntamente com outras proteínas, o tráfego, a montagem e a
polarização de receptores nas células. A densidade pós-sináptica em neurônios, as fortes
junções em células epiteliais e as sinapses imunológicas, são exemplos de vias de sinalização
coordenados por este tipo de proteína estrutural (Petrosky et al., 2005).
Pelas funções descritas para este complexo protéico e a localização desta proteína no
tegumento, acreditamos que a proteína LIN-7 possa estar envolvida no processo de
organização e reciclagem do tegumento, atuando no transporte e fusão das vesículas
multilaminadas contendo proteínas e membranas que vão compor o tegumento.
1 gaatcattaagtttgcaaagagatattaattgagtattggagttattgcaaatacttcag
E S L S L Q R D I N * V L E L L Q I L Q/M
61 agatgtcccgaaatacaaccatcaaagttagcagctctacagcgtatactgcagtcagac
R C P E I Q P S K L A A L Q R I L Q S D
121 ttttgcgacatgattcgtgaagtttatgaacatatatacacaactgttgatattaatggg
F C D M I R E V Y E H I Y T T V D I N G
181 tcagaagaggtgaaagcaagtgcaacagctaaagctactgtcgcagcttttgccgcaagt
S E E V K A S A T A K A T V A A F A A S
241 gagggacacgctcatccacgtgttatagaactaccaaaaactaatgaaggtctaggtttc
(A)
(B)
___________________________________________________________________Resultados
71
E G H A H P R V I E L P K T N E G L G F
301 aatgttatgggtggtaaagaacaaaactcacctatttacataagtcggattattcctggt
N V M G G K E Q N S P I Y I S R I I P G
361 ggtgttgcagatcgtcatggtggtttaaaacgtggtgatcagttgctttcagttaatgga
G V A D R H G G L K R G D Q L L S V N G
421 atttctgtggagagtgaacatcatgaaagagctgttgaacttttgaaattagcacaaggt
I S V E S E H H E R A V E L L K L A Q G
481 actgtgaaacttgtcgtaaggtatacaccacgtattcttgaagagatggaagcacgcttt
T V K L V V R Y T P R I L E E M E A R F
541 gacaaacagaaagctcgacgtcgacaacttaattaacagaaatttagagacgtgtgtgca
D K Q K A R R R Q L N * Q K F R D V C A
601 taatgctgtgctgttataattcactaaattatttagactaacatacttccattatacagc
* C C A V I I H * I I * T N I L P L Y S
661 acagattaagttttcgaactcttttttccccaactctttacatcctcattagaatctgta
T D * V F E L F F P Q L F T S S L E S V
721 aataatttgttgtttatattagtttttgaacatttcgtcgattttgaattctttattgta
N N L L F I L V F E H F V D F E F F I V
781 atttgctttatcatgctgtagtcatatagacaaaatatttaatttttatgcaacaataat
I C F I M L * S Y R Q N I * F L C N N N
841 tttgatgacttagaatataatttttgtcaaactat 875
F D D L E Y N F C Q T
Figura 25 – (A) - Representação esquemática dos domínios protéicos encontrados no gene Lin-7, as setas
representam os iniciadores utilizados para amplificação do fragmento para expressão da proteína recombinante.
(B) – cDNA deste gene e correspondente seqüência de aminoácidos. Sublinhado – seqüência clonada na vacina de
DNA, em itálico região de anelamento dos iniciadores, Domínio L27 (E-value 4.10e-03), domínio PDZ (E-value
5.28e-23). * - sinais possíveis para parada de tradução, M e L – sinais possíveis para início de tradução.
4.4.1.1. Expressão e purificação da proteína LIN-7 em E. coli.
Células de E. coli BL21 DE3 transformadas com o vetor pDEST17 contendo o cDNA
completo do gene Lin-7 foram cultivadas e induzidas com IPTG 1mM, conforme descrito em
Materiais e Métodos. O crescimento dos cultivos foi acompanhado (λ=600nm) e a expressão
das proteínas verificada por SDS-PAGE (Figura 26A).
Após a expressão das proteínas recombinantes, os cultivos foram processados e os
corpúsculos preparados conforme descrito em Materiais e Métodos (item 3.11.2.). A proteína
foi purificada por cromatografia em resina quelante de Ni
++
, sendo a eluição feita com 0,5 M
de imidazol. A Figura 26B apresenta um gel de SDS-PAGE contendo algumas das frações
coletadas durante a purificação; podemos observar nestas frações um grande enriquecimento da
proteína Lin-7 e ausência de contaminantes visíveis. Após a cromatografia, as diferentes
frações foram dialisadas em tampão Fosfato de sódio 50 mM, pH 6,5 por 24 horas. No
momento, estamos otimizando esta etapa final de diálise, uma vez que nas condições utilizadas
a proteína tem se demonstrado instável, precipitando quase que totalmente.
___________________________________________________________________Resultados
72
Figura 26 – Géis de SDS-PAGE 12-15%. (A) lisado de bactérias BL21 SI expressando a proteína LIN-7. Foram
analisadas as frações: S – solúvel, L-lavagem dos corpúsculos com 4 M Uréia, e CI – corpúsculos de inclusão
ressuspendidos em 8 M Uréia; (B) LIN-7 (1,2,3 e 4) diferentes frações da proteína LIN-7 eluída com 0,5 M de
imidazol.
Os soros dos animais imunizados com a vacina de DNA contendo o antígeno Lin-7 foi
analisado por ELISA (Figura 18), utilizando como “coating” os corpúsculos de inclusão da
proteína recombinante Lin-7 expressa em E. coli. Como não observamos produção de
anticorpos (IgG total) pretendemos investigar o envolvimento do braço de resposta celular
nestes animais; para tanto a proteína recombinante Lin-7 encontra-se em processo de
purificação.
4.4.2. Antígeno 5
Dentre os antígenos testados na forma de vacina de DNA, este gene apresentou o maior
índice de proteção, 31%. A análise mais detalhada deste gene/proteína revelou uma série de
informações que suportam e reforçam a escolha desta molécula como um candidato vacinal
contra a esquistossomose.
O gene estudado codifica uma proteína similar a candidatos vacinais de Necator
americanus, parasita que provoca o “amarelão”, Haemonchus contortus, Ostertagia ostertagi e
Onchocerca volvulus. Dentre estes organismos, o candidato vacinal mais bem caracterizado até
o momento é a proteína ASP-2 (“Ancylostoma secreted protein-2”) de Necator americanus. A
Figura 27 mostra o alinhamento da seqüência protéica do Antígeno 5 de Schistosoma mansoni
e da proteína ASP-2 de Necator americanus, bem como os modelos estruturais das duas
proteínas.
LIN
-
7
(IM 0,5 M)
1 2 3 4
(B)
(
A)
LIN-7
S L C
97.0
66.0
45.0
30.0
20.1
14.4
___________________________________________________________________Resultados
73
Identities = 49/159 (30%)
Positives = 68/159 (42%)
Antigen5 130 MDNATREKLLKLHNNARISVMHGQLE-----GQPIAKSIKPLKWNMELEKKAQMLADTCY 294
M R+K L+LHN+ R SV GQ + P A +K + ++ E+EK A A C
ASP-2 26 MSEEARQKFLELHNSLRSSVALGQAKDGAGGNAPKAAKMKTMAYDCEVEKTAMNNAKQCV 85
Antigen5 295 FGPDSAIERKVPG---FTNVGQNWAGASTVDIGFQRWLNEYKNYDFFNRLCLVGRCI--- 456
F +RK G F + A + + W E L L G
ASP-2 86 FKHSQPNQRKGLGENIFMSSDSGMDKAKAAEQASKAWFGELAEKGVGQNLKLTGGLFSRG 145
Antigen5 457 --HYTQIVWENTTDIGCGVATCPHSPFKLSIVCNYGPGG 567
HYTQ+VW+ T +GC V C + + +VC YGP G
ASP-2 146 VGHYTQMVWQETVKLGCYVEACSNMCY---VVCQYGPAG 181
Figura 27 – (A) – Alinhamento da seqüência de aminoácidos das proteínas ASP-2 (Necator americanus) e
Antígeno 5 (S. mansoni). (B) – Modelos estruturais das proteínas de ASP-2 e Antígeno 5.
Apesar da similaridade da seqüência linear não ser muito alta (42%), quando
observamos os modelos estruturais nota-se uma grande similaridade estrutural.
Adicionalmente, a posição das cisteínas nos dois modelos estruturais reforça esta similaridade
(dados não apresentados).
A análise da seqüência de aminoácidos no banco de dados de domínios protéicos
SMART (Letunic et al., 2004), revelou a existência de um peptídeo sinal, e de um domínio
SCP (“Sperm Coating Glycoprotein) (Figura 28). Este último de função desconhecida, está
presente em uma série de proteínas extracelulares.
ASP-2 Antígeno 5
Necator Americanus
Schist
osoma mansoni
(B)
(A)
___________________________________________________________________Resultados
74
1 ggtacacgtctaatttattcatcaagttattggaaggcaatccatttcgagatgactgtg
G T R L I Y S S S Y W K A I H F E M T V
61 aaatgtcagtcatcattaacagcgctgacgacactatgccttcttgtatgttgtggtgtt
K C Q S S L T A L T T L C L L V C C G V
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I S V M H G Q L E G Q P I A K S I K P L
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K W N M E L E K K A Q M L A D T C Y F G
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P D S A I E R K V P G F T N V G Q N W A
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G A S T V D I G F Q R W L N E Y K N Y D
421 ttcttcaaccgactgtgtcttgttggtcggtgtattcactacacacagatcgtgtgggag
F F N R L C L V G R C I H Y T Q I V W E
481 aacactacagatatcggatgtggtgttgctacatgtcctcattccccattcaaactaagc
N T T D I G C G V A T C P H S P F K L S
541 attgtgtgcaattatggtccaggaggtggatgcccacgccaatttccgtatagtgtaaag
I V C N Y G P G G G C P R Q F P Y S V K
601 ggtctatacagacaatggactataaagtatggcagaaaatggtatagctggagatacgga
G L Y R Q W T I K Y G R K W Y S W R Y G
661 agaagatgtcgtcccgtatacgtgaaacaaaggtgtaatcatacaaacgaaagataa 714
R R C R P V Y V K Q R C N H T N E R *
Figura 28 – (A) - Representação esquemática dos domínios protéicos encontrados no gene Antígeno 5, as setas
representam os iniciadores utilizados para amplificação do fragmento para expressão da proteína recombinante.
(B) – cDNA do gene Antígeno 5 e correspondente seqüência de aminoácidos. Sublinhado - seqüência clonada na
vacina de DNA, em itálico região de anelamento dos iniciadores, peptídeo sinal, domínio SCP (E-value 5.00e-04),
sítios possíveis para N-glicosilação - asparaginas (N) em vermelho. * - sinais possíveis para parada de tradução,
M e L – sinais possíveis para início de tradução.
A existência de um peptídeo sinal (Figura 28) e a descrição de vários ortólogos como
proteínas secretadas, levantaram a hipótese de que a proteína de Schistosoma mansoni também
pudesse ser excretada/secretada. Visando esclarecer esta questão, realizamos buscas no banco
de dados de proteoma da Universidade de York por genes similares ao Antígeno 5. O resultado
desta análise revelou a presença de uma proteína similar contendo um domínio SCP,
identificada como secretada por esquistossomulos nas primeiras 3 horas após a transformação.
A Figura 29 mostra o alinhamento de aminoácidos destes genes, para tanto utilizamos o
programa T-COFFEE (http://www.ch.embnet.org/software/TCoffee.html) (Notredame et al.,
2000). Apesar de se tratarem de proteínas distintas codificadas por genes diferentes, o
alinhamento revela uma alta similaridade entre as duas proteínas (91 de 100 possíveis).
(B)
(A)
___________________________________________________________________Resultados
75
T-COFFEE, Version_1.41(Fri Jun 28 14:24:48 MDT 2002)
Notredame, Higgins, Heringa, JMB(302)pp205-217,2000
CPU TIME:0 sec.
SCORE=91
*
BAD AVG GOOD
*
Antígeno 5 : 91
Sm09319 : 91
Antígeno 5 TTGHCTRLIYSSSYWKAIHFEMTVKCQSSLTALTTLCLLVCCGVHAAMDNATREKLLKLHNNA
Sm09319 ---------------KIVLVSCLLFLFTSLYVETKL-------------SEGQRAIYNFHKKV
Cons * : .. : :** . *.* . :. : ::*::.
Antígeno 5 RISVMHGRLEGQPIAKSIKPLKWNMELEKKAQMLADTCYFGPDSAIERKVPGFTNVGQNWAGA
Sm09319 RKDVKNCRIPGQPPAKNLTKLKWNKLLANKAKQQAKRCKYDSNDPNDFIIGDFESIGQNLADY
Cons * .* : *: *** **.:. **** * :**: *. * :..:.. : : .* .:*** *.
Antígeno 5 STVDIGFQRWLNEYKNYDFFNRLCLVGRCIHYTQIVWENTTDIGCGVATCPHSPFKLSIVCNY
Sm09319 PTIEGAMKDWLEEYKNYNFEKNQC-NGDCKNYKQMVWNTTEEIGCGYEKCGKN---YLIVCNY
Cons .*:: .:: **:*****:* :. * * * :*.*:**:.* :**** .* :. *****
Antígeno 5 GPGGGCPRQFP-YSVKGLYRQWTIKYGRKWYSWRYGRRCRPVYVKQRCNHTNER
Sm09319 APGDSEDRPYEGYSV---------------------------------------
Cons .**.. * : ***
Figura 29 – Alinhamento das seqüências do Antígeno 5 e uma proteína secretada (Sm09310) por Esquistossômulo
(0-3 horas) identificada no banco de dados de proteoma. (:) – substituições conservativas, (.) – substituições
semiconservativas e (*) - aminoácidos idênticos.
No caso de Necator americanus, sabe-se que o parasita apresenta um série de genes
codificando proteínas com domínios SCP, sendo estas expressas em diferentes fases do ciclo
de vida do parasita (vermes adultos, larva 1, larva 3) (Peter Hotez, comunicação pessoal). O
ponto crítico para escolha das proteínas ASP-1 e ASP-2, foi o fato de elas serem secretadas
pelo estágio L3 (intra-hospedeiro mamífero). Visando caracterizar o número e a distribuição
destes genes no Schistosoma mansoni, realizamos buscas no genoma do Esquistossoma por
proteínas com domínios SCP (sperm-coating-protein). No total foram encontrados 13 genes (5
com seqüência completa) codificando proteínas com este domínio (Tabela 14).
___________________________________________________________________Resultados
76
Tabela 14 – Genes potencias encontrados no genoma do S. mansoni contendo domínios SCP
(http://www.genedb.org/genedb/smansoni/blast.jsp).
G – “germ ball”, C – cercária, E – esquistossômulo, A – vermes adultos, A3 – mRNA pouco expressos de vermes
adultos (biblioteca normalizada), O – ovo e M – miracídio.
Número de identificação no genoma
Estágios com EST´s no
transcriptoma /
genes completos
SCP –
E-value
% id
% sim com
ASP-2
Sm03335
A, A3 / incompleto 3.42e-12
33%
44%
Sm00806
O, G / completo 6.81e-30
26%
39%
Sm12388
G, C, E, A / completo
3.19e-12
26%
41%
Sm04660
A3, E / incompleto 4.54e-17
25%
49%
Sm12843
A3, A, O / completo 4.27e-13
24%
46%
Sm12775
A3, E / completo
expressão aumentada
esquistossomulos 7 dias
2.75e-25
2.43e-26
26%
43%
Sm19656
O / incompleto
2.03e-28
32%
47%
Sm20047
O / incompleto 1.93e-29
25%
39%
Sm00763
O, M / incompleto 9.49e-09
24%
38%
Sm09319
G / incompleto 8.27e-20
26%
39%
Sm07850
O, M / incompleto 2.66e-23
30%
42%
Sm22849
G / incompleto 7.38e-05
45%
54%
Phat04660
Presente apenas no Genoma
/ completo
1.72e-08
26%
42%
___________________________________________________________________Resultados
77
Apesar da grande quantidade de genes encontrados, apenas quatro destes apresentam
seqüências com peptídeos sinais; um deles é o gene testado como vacina de DNA (Sm07850),
um outro se trata da proteína encontrada nas secreções de esquistossomulos (Sm09319),
discutido anteriormente (Curwen, comunicação pessoal, 2005) e outros dois, para os quais não
temos nenhuma informação funcional (Sm00806 e Sm00763).
A presença do peptídeo sinal em apenas quatro dos treze genes encontrados e a
detecção de uma destas proteínas em secreções de esquistossomulos, reforça a hipótese que
estas seriam as proteínas com maior similaridade funcional ao candidato vacinal ASP-2 de
Necator americanus, devendo ser melhor investigadas como alvos vacinais.
4.4.2.1. Clonagem e expressão da proteína Antígeno 5 em E. coli e Pichia pastoris.
Como não foi possível expressar a proteína contendo a seqüência completa do gene
Antígeno 5 em E. coli (dados não apresentados), realizamos uma nova construção removendo o
peptídeo sinal da porção 5´ do gene, porém as bactérias transformadas com esta construção
também não foram capazes de expressar a proteína recombinante em níveis satisfatórios (dados
não apresentados).
Visando otimizar a produção da proteína recombinante, Antígeno 5, e tomando como
base os trabalhos de expressão e purificação da proteína ASP-2 de Necator americanus (Goud
et al., 2004 e 2005), decidimos avaliar a expressão desta proteína no sistema de Pichia
pastoris. Este sistema de expressão apresenta como principais vantagens o processamento de
seqüências sinais do tipo pre e prepro, o renovelamento, a formação de pontes disulfeto e
glicosilações tanto do tipo O (oxigênio em resíduos de serina e treonina) quanto N (nitrogênio
em resíduos de asparagina).
Toda estratégia de clonagem teve como modelo os trabalhos de Goud (2004 e 2005),
que expressou as proteínas ASP-1 e ASP-2 de Ancylostoma ceylanicum e Necator americanus
no sistema secretório de Pichia pastoris.
Para a clonagem de parte do gene do Antígeno 5 de S. mansoni em Pichia pastoris,
foram desenhados iniciadores de modo a remover a seqüência sinal (N-terminal) e gerar uma
fusão C-terminal com a cauda de histidina presente no vetor pPICZαA. A presença do gene do
antígeno 5 integrada ao genoma da levedura foi confirmada por PCR, utilizando como molde
um lisado das colônias de leveduras. Os clones que apresentaram melhor crescimento nas
maiores concentrações de zeocina, devido a presença de múltiplas cópias integradas ao genoma
da levedura, foram então testados quanto à capacidade de expressar a proteína recombinante.
Esperávamos que a proteína fosse secretada para o meio de cultura, uma vez que o
cassete de expressão utilizado apresenta um seqüência sinal secretória específica para levedura
(fator sinal α); entretanto, só conseguimos detectar a proteína recombinante na fração
intracelular dos clones analisados (Figura 30).
___________________________________________________________________Resultados
78
Figura 30 - Western blot para avaliação da expressão da proteína Antígeno 5 em diferentes clones (1, 2, 3, 4, 5, 6,
9 e 10) de Pichia pastoris na fração intracelular, após 96 horas de indução. Anticorpo Anti-His (1: 4.000). PM –
Peso Molecular.
Nota-se na Figura 30 que a proteína recombinante detectada no Western blot (clones 1,
2, 5 e 9) apresenta 40 kDa, tamanho superior ao esperado de 25.1 kDa, se a proteína fosse
secretada. Isto pode ser explicado uma vez que a proteína encontra-se fusionada com o
peptídeo sinal de levedura (α- signal factor 9.3 kDa) que não deve estar sendo processado,
gerando uma proteína de 34.4 kDa. Uma outra característica deste sistema de expressão
eucariótico que pode contribuir para o aumento da massa molecular da proteína em questão, é
sua capacidade de glicosilar proteínas. Como observamos no diagrama da Figura 28, a
seqüência de aminoácidos da proteína Antígeno 5 apresenta 3 sítios possíveis para N-
glicosilação. No caso da proteína estar sendo hiperglicosilada, isto poderia interferir no
processo de secreção.
Para a expressão da proteína recombinante, utilizamos o clone recombinante 5 de
Pichia pastoris (Figura 30). A expressão foi realizada em pequena-média escala, isto é, 80 mL
de cultura foram fermentados durante 180 horas, sendo a indução mantida através da adição de
metanol a cada 24 h a uma concentração final de 0,5 %.
Após a expressão da proteína recombinante, os cultivos foram processados para avaliar
se a proteína estava sendo expressa de forma solúvel ou insolúvel (corpúsculos de inclusão). A
Figura 31A demonstra que a proteína recombinante está sendo expressa majoritariamente sobre
a forma de corpúsculos de inclusão. Os ensaios de solubilidade indicaram a necessidade da
utilização do agente denaturante cloreto de guanidina 6M para a solubilização da proteína a
partir dos corpúsculos de inclusão (Figura 31B).
1 2 3
4 5 6 9 10 PM
66
45
30
___________________________________________________________________Resultados
79
Figura 31 - (A) Gel de SDS 12% corado com “InVision” para visualização da proteína recombinante contendo
cauda de histidina; ao lado, o mesmo gel corado com comassie, a seta aponta a banda da proteína recombinante.
(B) Gel de SDS 12% corado com “InVision” mostrando a solubilização dos corpúsculos de inclusão em 8M uréia
e 6M guanidina. S – fração solúvel, CI – corpúsculos de inclusão.
A proteína foi purificada por cromatografia em resina quelante de Ni
++
(Figura 32A),
sendo a eluição feita por gradiente de imidazol. A Figura 32 (B e C) apresentam géis de SDS-
PAGE contendo algumas das frações coletadas durante a eluição da proteína da coluna.
Analisando as frações (5-7) da cromatografia, observamos que a maior parte dos
contaminantes é eluída da coluna entre 150 mM e 250 mM de imidazol. Ao passo que a
proteína Antígeno 5 começa a ser eluída com 325 mM de imidazol (fração 11). Esta diferença
de afinidade, permitiu que a proteína fosse eluída praticamente livre de contaminantes. A única
banda visível que é eluída nestas condições, tem aproximadamente 58 kDa, mas aparece em
uma concentração bem menor que o Antígeno 5.
(A)
S C.I.
S C.I.
97
66
45
30
20
(B)
Gua Uréia
6M 8M
C.I.
Gua Uréia
6M 8M
97
66
45
30
20
14
___________________________________________________________________Resultados
80
Figura 32 – Purificação da proteína Antígeno 5 em coluna Ni
++
- Sepharose por gradiente de imidazol (0-500
mM). (A) Cromatografia de afinidade em coluna de níquel (Sepharose), em azul, absorbância da amostra
(280nm), em vermelho, porcentagem do tampão de eluição (0-500 mM de imidazol); (B e C) SDS-PAGE das
frações coletadas da cromatografia (3-9 e 11-17), C.I. – corpúsculos de inclusão que foram adsorvidos à coluna
após solubilização, F.T. – “Flow throw” – amostra de proteínas que não se ligou na coluna.
(A)
C.I. F.T. 3 4 5 6 7 8 9
Frações
97
66
45
30
(B)
C.I. F.T. 11 12 13 14 15 16 17
Frações
97
66
45
30
(C)
___________________________________________________________________Resultados
81
4.4.2.2. Avaliação da resposta humoral em animais imunizados com a vacina de DNA
pTARGET-Antigeno 5.
Os soros dos animais imunizados com a vacina de DNA contendo o Antígeno 5 foram
analisados por ELISA (dados não apresentados), utilizando como “coating” a proteína
purificada expressa em Pichia pastoris. Não observamos a presença de anticorpos IgG total
nos animais imunizados com a vacina de DNA (pTARGET-Antígeno 5); resta ainda investigar
a indução de resposta imune celular nestes animais imunizados.
4.4.3. Estomatina (SLP-2).
O gene estudado na forma de vacina de DNA, que conferiu uma redução na carga
parasitária de 21%, apresenta como ortólogo mais similar, a proteína SLP-2 (Stomatin Like
Protein 2) de humanos. A principal diferença entre este gene (SLP-2) e os outros homólogos de
estomatinas é a perda de um domínio hidrofóbico (transmembrana) na região N-terminal.
Wang e colaboradores (2000), hipotetizam que a função da SLP-2 seja ligar a estomatina ou
outras proteínas integrais de membrana ao citoesqueleto periférico, desta maneira desempenhar
um papel na regulação da condutância dos canais iônicos ou organização de esfingolipídeos e
“rafts” lipídicos ricos em colesterol.
Baseada na homologia com a estomatina, a SLP-2 está provavelmente localizada no
citoplasma. Apesar da perda de sua região transmembrana N-terminal, a presença de sítios para
miristilação N-terminal sugerem que ela seja uma proteína associada a membrana (Owczarek
et al., 2001).
A análise da seqüência de aminoácidos no banco de dados de domínios protéicos
SMART (Letunic et al., 2004), revelou a existência de um domínio PHB (Proibitina) (Figura
33). Uma variedade de proteínas pertencem a esta família, estas incluem as proibitinas,
proteínas citoplasmáticas anti-proliferativas e estomatinas.
3 acgagactgtaggtcgcagtcaacatgattcgtagtatcattggtcgttcaagttgtcga
T R L * V A V N M I R S I I G R S S C R
63 ctttccagggtatatgctagcagtcgtgactacacatcacaagcacccataaatttaggg
L S R V Y A S S R D Y T S Q A P I N L G
123 gtattgatcgttccagagaaagaagcttgggttattgaaaggttaggaaaatttcacagg
V L I V P E K E A W V I E R L G K F H R
183 acgctggaaccaggactcaatttttgtatacccattctagatcgcgtcgcttatgtacag
T L E P G L N F C I P I L D R V A Y V Q
243 tcattgaaagaagtggccattgaaattccagatcagtctgccattacctcagataatgtc
S L K E V A I E I P D Q S A I T S D N V
(B)
(A)
___________________________________________________________________Resultados
82
303 gttttacaattgaacggtgttctcttccttaaagtcaaaaatccttatttagcatcatat
V L Q L N G V L F L K V K N P Y L A S Y
363 ggggtgtccgaggctgaatttgcaattactcagttagctcaaacaattatgcgatcagaa
G V S E A E F A I T Q L A Q T I M R S E
423 atcgggaagataattctggacaatgtttttaaagaacgagaagcattaaattttcaaatc
I G K I I L D N V F K E R E A L N F Q I
483 gtacaagctttaggcaaagcatcagaaccttggggtattgagtgtttgcgttatgaaatt
V Q A L G K A S E P W G I E C L R Y E I
543 cgcgatgtccaggtgccacaaaaaatcaaagaagctatgcaaatgcaagtcgaagcagaa
R D V Q V P Q K I K E A M Q M Q V E A E
603 cgaaaaaaacgtgcatccattttagagtcggaaggacaacgtgaggctgctattaatcga
R K K R A S I L E S E G Q R E A A I N R
663 gctgagggtttaaaacgtagccaggtattagagtcagagggtcaccagattgaaattgta
A E G L K R S Q V L E S E G H Q I E I V
723 aataaagcttcaggtgaagctgaagctatccaacgtctagcagaagctcgagctcagtct
N K A S G E A E A I Q R L A E A R A Q S
783 attcaaatcattgcccgtgcgatcggtagtaagcgtggagcagatgcagtacagcttaca
I Q I I A R A I G S K R G A D A V Q L T
843 gtagctgaacagtacatagaagctttcagtgctttagcgaagacaactaatacagtgtta
V A E Q Y I E A F S A L A K T T N T V L
903 ttaccatctcatagtggtgatgttgcgtcgatggttactcaagcattgactatatttaaa
L P S H S G D V A S M V T Q A L T I F K
963 agtttagatcaaccgaaaaccgacatcggtaatgataataatgacggtggatgtaatgat
S L D Q P K T D I G N D N N D G G C N D
1023 gaatctcattcagaagtagtggctgaccatcagttaaatcccaatattattaataataat
E S H S E V V A D H Q L N P N I I N N N
1083 gatagcgataaacaagaatagaaaccattacatatcctaacaaatccagattattgtcaa
D S D K Q E * K P L H I L T N P D Y C Q
1143 aaaccaattcaaagctatatacagaaaataatgaatttaatggtttttcaaaacaatttt
K P I Q S Y I Q K I M N L M V F Q N N F
1203 gaaaagaacgtacaaaaaatacgaaagaatataggcatagtatgtcctagttttctgctt
E K N V Q K I R K N I G I V C P S F L L
1263 ttccactatgtatattattgctcattgttttctccagtatgatcagacaactttgatgtg
F H Y V Y Y C S L F S P V * S D N F D V
1323 aataaaatatatatcctgtttg 1344
N K I Y I L F
Figura 33 – (A) - Representação esquemática dos domínios protéicos encontrados no gene da Estomatina, as setas
representam os iniciadores utilizados para amplificação do fragmento para expressão da proteína recombinante.
(B) – cDNA deste gene e correspondente seqüência de aminoácidos. Sublinhado - seqüência utilizada na vacina
de DNA, em itálico região de anelamento dos iniciadores, Domínio PHB (E-value 6.69e-52). * - sinais possíveis
para parada de tradução, M e L – sinais possíveis para início de tradução.
4.4.3.1. Expressão e purificação da proteína Estomatina em E. coli.
Células de E. coli BL21 DE3 transformadas com o vetor pDEST17 contendo o cDNA
completo da estomatina foram cultivadas e induzidas com IPTG 1mM. O crescimento dos
cultivos foi acompanhado (λ=600nm) e a expressão das proteínas verificada por SDS-PAGE.
Na Figura 34A, observamos a presença da proteína recombinante na altura de 45 kDa nos
clones induzidos.
Após a expressão das proteínas recombinantes, os cultivos foram processados e os
corpúsculos preparados conforme descrito em Materiais e Métodos. A proteína foi purificada
por cromatografia em resina quelante de Ni
++
(Figura 34B), sendo a eluição feita por gradiente.
A Figura 34C apresenta um gel de SDS-PAGE contendo algumas das frações coletadas durante
a purificação, podemos observar nestas frações um grande enriquecimento da proteína
___________________________________________________________________Resultados
83
estomatina e a presença de contaminantes visíveis apenas nas frações 19, 20 e 21. Após a
cromatografia, as diferentes frações foram dialisadas em PBS 1X ou tampão Fosfato de sódio
50 mM, por 24 horas. Em seguida, foi realizada a dosagem de proteína das frações eluídas e
dialisadas, utilizando o Método de Bradford (Kit Bio Rad)).
A purificação da proteína recombinante rEstomatina, permitiu avaliarmos as respostas
humoral e celular dos animais imunizados com a vacina de DNA pDEST12.2-Estomatina, bem
como produzir anticorpos para os ensaios de imunolocalização desta proteína.
___________________________________________________________________Resultados
84
Figura 34 – Purificação da proteína Estomatina em coluna Ni
++
- Sepharose por gradiente de imidazol (0-500
mM)em resina. (A) lisado bacteriano E. coli BL21 DE3: ∅ - sem plasmídeo, NI – não induzido, 1-5 – (clones 1-
5), transformadas com o plasmídeo pDEST17-Estomatina e induzidas com IPTG 1mM (concentração final); o
pedaço removido do gel foi utilizado para análises de espectrometria de massa. (B) Cromatografia de afinidade
em coluna de níquel (Sepharose); em azul, a absorbância da amostra (280nm), em vermelho, a porcentagem do
tampão de eluição; (C) SDS-PAGE das frações coletadas da cromatografia (17-23, 27 e 30), C.I. – corpúsculos de
inclusão, S – Fração solúvel.
∅
N.I. 1 2 3 4 5
200
150
100
75
50
37
25
20
15
(A)
S C.I. 17 18 19 20 21 22 23 27 30
Frações
200
150
100
75
50
37
25
20
15
(C)
(B)
17
18
19
20
21
22
23
30
27
___________________________________________________________________Resultados
85
4.4.3.2. Avaliação da resposta humoral em animais imunizados com a vacina de DNA
pDEST12.2 - Estomatina.
Os soros dos animais imunizados com a vacina de DNA contendo o antígeno
Estomatina foram analisados por ELISA (Figura 35A), utilizando como “coating” os
corpúsculos de inclusão da proteína recombinante Estomatina, ou a proteína purificada (Figura
35B) expressas em E. coli.
Figura 35 – Produção de anticorpos IgG anti-Estomatina. Os níveis de anticorpos IgG totais foram analisados em
amostras do soro coletadas 60 dias após a imunização com as vacinas de DNA. (A) – “coating” corpúsculos de
inclusão da proteína estomatina, (B) – “coating” – proteína estomatina purificada.
Como não observamos produção de anticorpos (IgG total – Figura 35) nos animais
imunizados com a vacina de DNA (pDEST12-Estomatina), decidimos investigar o
envolvimento do braço de resposta celular nestes animais.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120
Diluições
D.O. (492 nm)
Vazio
Estomatina
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
40 80 160 320 640 1280 2560 5120
Diluições
D.O. (492 nm)
Vazio
Estomatina
(A)
(B)
___________________________________________________________________Resultados
86
4.4.3.3. Avaliação da resposta celular em animais imunizados com pDEST12.2-Estomatina.
Grupos de três camundongos C57BL/6 foram imunizados com a vacina de DNA-
Estomatina ou com o vetor vazio (controle negativo) (3 doses de 50 µg com intervalos de 15
dias). Após 21 dias, os animais foram sacrificados e os esplenócitos separados. As células
foram colocadas em cultura em cinco condições: sem estímulo, estimuladas com 5, 10 e 30
µg/mL de rEstomatina, ou estimuladas à proliferação com concavalina A (controle positivo).
Após 24 horas da estimulação com a proteína recombinante, o sobrenadante do meio de cultura
dos linfócitos foi coletado e a concentração de IFN-γ determinada por ELISA.
A Figura 36 apresenta os resultados obtidos, onde nota-se que os esplenócitos dos
animais imunizados com a vacina de DNA-Estomatina apresentaram uma produção de IFN-γ
superior aos animais imunizados com o vetor vazio, após serem estimuladas com diferentes
concentrações da proteína recombinante rEstomatina.
Figura 36 - Secreção de IFN-γ no sobrenadante de esplenócitos de camundongos imunizados com a vacina de
DNA-Estomatina e Vetor vazio, após estimulo com rEstomatina. Os baços foram extraídos após 21 dias da última
dose, o sobrenadante foi coletado 24 horas após a adição da rEstomatina (5, 10 e 30 µg/mL). As citocinas foram
dosadas por ELISA de captura. Os valores das células não estimuladas foram subtraídos.
4.4.3.4. Produção de Anticorpos Anti-Estomatina
Visando obter anticorpos para os experimentos de imunolocalização e caracterização da
distribuição da proteína em diferentes extratos do verme, produzimos anticorpos anti-
Estomatina em ratos Wistar (4 semanas); os animais receberam 4 doses (s.c.) de 100 µg da
proteína recombinante purificada, sendo a primeira dose administrada com o adjuvante
TiterMax (conforme recomendações do fabricante). Os níveis de anticorpos IgG totais contra a
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
Vazio Stomatina
5 ug/mL
Vazio Stomatina
10 ug/mL
Vazio Stomatin
30 ug/mL
Con A 5
ug/mL
IFN-gama (pg/mL)
___________________________________________________________________Resultados
87
proteína foram determinados por ELISA, utilizando como “coating” a proteína purificada
(Figura 37).
Figura 37 – Produção de anticorpos IgG totais anti-Estomatina. Os níveis de anticorpos totais IgG foram
analisados em amostras do soro coletadas: Sangria 1 – dezessete dias após o prime, Sangria 2 – trinta e oito dias
após o prime e sangria 3 – sessenta dias após o prime.
A comparação entre as sangrias 2 e 3 mostra que com três doses de rEstomatina a
produção de anticorpos já estava saturada, apresentando título superior a 1:80.000. Os animais
receberam ainda uma quarta dose para a manutenção do título de anticorpos antes da sangria
final realizada 80 dias após a primeira dose.
Para verificar a especificidade dos anticorpos detectados no ELISA acima, realizamos
um Western blot hibridando o soro (sangria final) dos animais imunizados com a proteína,
contra o extrato total de vermes adultos e esquistossomulos (10 dias). Estes extratos foram
preparados de modo a separar as proteínas solúveis em 40 mM Tris e àquelas solubilizadas
após a adição de 2% SDS (Figura 38). Para as análises de Western blot fizemos um ajuste
visual, tentando igualar as quantidades de proteína das duas frações analisadas.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Dilution 1/80 - 1/81920
D.O. (492 nm)
Pre-Imune
Sangria 1
Sangria 2
Sangria 3
___________________________________________________________________Resultados
88
Figura 38 - (A) Gel de SDS-PAGE 4-12%, contendo: V.A.- vermes adultos, Esq.- esquistossomulos (10 dias).
Frações: sol – proteínas solúveis em tampão Tris 40 mM, sds – proteínas solubilizadas em 2% SDS. (B) Western
blot das amostras apresentadas em (A) hibridado com o soro contendo anticorpos anti-estomatina (sangria final,
diluição 1:10.000), (+) – controle positivo – 100 ng de rEstomatina.
A análise da Figura 38 demonstra que os anticorpos produzidos foram capazes de
reconhecer a proteína estomatina na fração “insolúvel”, isto é, solúvel em 2% SDS, tanto de
vermes adultos como de esquistossomulos com 10 dias. A detecção desta proteína na fração
solubilizada com 2% SDS sugere que Estomatina seja uma proteína de membrana ou uma
proteína associada à membrana, o que concorda com os dados da literatura para o ortólogo
SLP-2.
4.4.3.5. Detecção da proteína Estomatina no tegumento do Schistosoma mansoni.
Buscando informações adicionais sobre a localização e distribuição da proteína
Estomatina no parasita, realizamos ensaios de Western blot hibridando os anticorpos anti-
Estomatina com diferentes frações do tegumento do verme, gentilmente cedidas pelo
doutorando Simon Braschi (Universidade de York).
A Figura 39 mostra que os anticorpos foram capazes de reconhecer a proteína
Estomatina na fração 2 (Uréia / Tiouréia) do tegumento. O tratamento com estes agentes
caotrópicos solubilizaria as proteínas mais firmemente associadas às membranas do tegumento,
mas não covalentemente ligadas a ele, as quais poderiam ser classificadas como proteínas de
citoesqueleto (Braschi et al., 2005a).
(+) sol sds sol sds
Esq. V.A.
200
150
100
75
50
37
25
20
sol sds sol sds
V.A. Esq.
200
150
100
75
50
37
25
20
(A) (B)
___________________________________________________________________Resultados
89
Este conjunto de informações reforça a hipótese de que a SLP-2 possa ser uma proteína
associada à membrana, cuja função seria fazer uma ponte de ligação entre “rafts” lipídicos e a
rede de citoesqueleto.
Figura 39 - Western blot contendo diferentes frações do tegumento: (2) proteínas associadas a membrana
extraídas com uréia / tiouréia, (3) proteínas com ancoras de GPI ou com um único domínio transmembrana
extraídas com CHAPS / SB 3-10, (4) proteínas integrais de membrana com múltiplos domínios transmembrana
extraídas com 2% SDS.
4.4.3.6. Imunolocalização
A detecção da proteína estomatina no tegumento de vermes adultos (fração 2), nos
levou a questionar em que região do tegumento esta proteína estaria (corpos celulares,
citoplasma, membrana basal ou membrana apical do tegumento). Apesar da fração (2) ter sido
caracterizada como composta majoritariamente por proteínas de citoesqueleto (Braschi et al.,
2005), não podemos excluir desta fração proteínas associadas à membrana (Braschi, 2005,
comunicação pessoal), de modo que uma investigação mais detalhada se fazia necessária; para
tanto realizamos ensaios de imunolocalização.
Resumidamente, anticorpos anti-Estomatina foram incubados com secções de vermes
adultos (7 µm) e revelados com anticorpo secundário conjugado com marcador fluorescente
Alexa fluor 488, sendo o registro fotográfico feito com câmera digital em microscópio de
fluorescência (Figura 40). As imagens mostram claramente que a proteína está no tegumento, a
espessura e intensidade do padrão de marcação sugere uma distribuição muito mais
citoplasmática, do que de membrana (Wilson, 2005, comunicação pessoal).
No momento, estamos realizando ensaios de imunolocalização através de microscopia
confocal, em colaboração com a Dra. Toshie Kawano (Instituto Butantan – Laboratório de
Parasitologia), com os quais acreditamos obter uma melhor resolução da distribuição da
proteína Estomatina no tegumento de vermes adultos.
Frações - Tegumento
2 3 4 (+)
200
150
100
75
50
37
25
20
15
10
___________________________________________________________________Resultados
90
Figura 40 – Imunolocalização da proteína Estomatina. (A-B) contraste de fase - corte transversal de macho adulto
e fêmea; (C-D) microscopia de fluorescência das secções apresentadas em (A-B), evidenciando a marcação no
tegumento do verme; (E-F) detalhamento das marcações encontradas no tegumento, em maior aumento; (G-H)
contraste de fase e fluorescência - controle negativo.
(A)
(B)
(D)
(C)
(E)
(F)
(H)
(G)
___________________________________________________________________Resultados
91
4.4.4. Dife5
Os animais imunizados com a vacina de DNA contendo este gene apresentaram uma
redução na carga parasitária de 21%. Este gene é similar ao Antígeno 6 de linfócitos, o qual
pertence a uma família de glicoproteínas de superfície de baixo peso molecular com âncora de
GPI. Outras análises revelaram similaridade com a proteína CD59 de humanos, a qual inibe a
formação do complexo de ataque à membrana (MAC), protegendo assim as células da lise
mediada pelo complemento. A CD59 se associa com a proteína C9, inibindo a ligação na C5b-
8 prevenindo assim os passos finais na polimerização do MAC nas membranas plasmáticas
(Figura 41).
Figura 41 – Representação esquemática da via do complemento, mostrando a etapa em que a proteína CD59 atua
inibindo a formação do complexo de ataque à membrana.
Adicionalmente, a análise da seqüência de aminoácidos deste gene no banco de dados
de domínios protéicos SMART (Simple Modular Architecture Research Tool -
http://smart.embl.de/) (Letunic et al., 2004), revelou a existência de um peptídeo sinal, um
domínio UPAR LY6 e um domínio transmembrana. Foi possível ainda detectar um sítio
putativo para âncora de GPI, com o auxílio dos algoritmos disponíveis em Kronegg e Buloz
(1999) (http://129.194.185.165/dgpi/index_en.html) (Figura 42).
Análises deste gene frente a montagens parciais do genoma
(http://www.genedb.org/genedb/smansoni/blast.jsp) revelaram que a região 3´ do gene foi
completamente amostrada pelo Transcriptoma do S. mansoni, entretanto a região 5´ foi
estendida em cerca de 12 aminoácidos, ampliando assim, a seqüência do peptídeo sinal (Figura
42B).
Superfície de ligação do complemento – célula
própria, microorganismo ou parasita
CD59
Bb
(C3b)n
C5b
C6
C7
C8
C7
C9
___________________________________________________________________Resultados
92
1403 ttgtaaagaggccagtgaattgtatactcactcactatagggcgaattgggccctctaga
L * R G Q * I V Y S L T I G R I G P S R
1343 tgcatgctcgagcggccggccgccagtgtgctggaaagcattctcaacgattaacactat
C M L E R P A A S V L E S I L N D * H Y
1283 agattctatcctgccaacaacaccaggtcaacagaattcataatgaaagtattgggaatt
R F Y P A N N T R S T E F I M K V L G I
1223 tgtgttatacttacattaatattcaatggaataaattgtataaaaaataagaaagtcaaa
C V I L T L I F N G I N C I K N K K V K
1163 tgttatcgatgttccgattgtcctaatccattcgataagacacaaataactgaattaggt
C Y R C S D C P N P F D K T Q I T E L G
1103 aattgtaacttttgtcgaacagtttacacttatcgtgatgaagataattatagaattgcg
N C N F C R T V Y T Y R D E D N Y R I A
1043 aaagattgtgtagcaagttgtgttccacaagatcgtcgtggtggtaaagctggcttagta
K D C V A S C V P Q D R R G G K A G L V
983 actgaatgttgtgatgaagattattgtaatgcatcacctaaacattattccatttcattt
T E C C D E D Y C N A S P K H Y S I S F
923 ctattaattactagttttacaatttttattacatatactaataaattcatatattgaacg
L L I T S F T I F I T Y T N K F I Y * T
863 gttaactcgatctctcccgctcgatcacccgcccgctcgctcgctcgcttattacattta
V N S I S P A R S P A R S L A R L L H L
803 tttttaagtctcatcaaactatttgctttcaatatccatctatctctcacaaaatattaa
F L S L I K L F A F N I H L S L T K Y *
Figura 42 – (A) - Representação esquemática dos domínios protéicos encontrados no gene Dife5, as setas
representam os iniciadores utilizados para amplificação dos fragmentos para expressão da proteína recombinante.
(B) – cDNA do gene Dife5 e correspondente seqüência de aminoácidos. Sublinhado - seqüência utilizada na
vacina de DNA, em letras cinza seqüência obtida a partir do genoma do Esquistossoma, em itálico - região de
anelamento dos iniciadores, peptídeo sinal, domínio Upar LY6 (E-value 5.00e-04), sítio possível para âncora de
GPI, domínio transmembrana. * - sinais possíveis para parada de tradução, M e L – sinais possíveis para início de
tradução.
4.4.4.1. Clonagem, expressão e purificação do domínio Upar LY6 em E.coli.
Como não foi possível expressar a proteína contendo a seqüência completa do gene
Dife5 (dados não apresentados), utilizamos duas estratégias para obter esta proteína
recombinante.
Em uma primeira tentativa realizamos uma deleção na porção 3´ do gene para a
remoção do domínio transmembrana (Figura 43A), porém as bactérias transformadas com esta
construção também não foram capazes de expressar a proteína recombinante (dados não
apresentados).
Na segunda estratégia removemos tanto o domínio transmembrana, quanto o peptídeo
sinal da região 5´, o que resultou na expressão do domínio Upar LY6 (Figura 43B). Após a
expressão da proteína recombinante, os cultivos foram processados para avaliar se a proteína
estava sendo expressa na forma solúvel ou insolúvel (corpúsculos de inclusão). A Figura 43C,
(A)
(B)
___________________________________________________________________Resultados
93
demonstra que a proteína recombinante está sendo expressa majoritariamente sob a forma de
corpúsculos de inclusão.
Figura 43 - (A) Eletroforese em gel de agarose 1%, contendo fragmentos amplificados por PCR a partir do clone
da vacina de DNA, sendo eles: 1 – fragmento do gene Dife5 sem a ancora de GPI e domínio transmembrana, 2 –
fragmento do gene Dife5 sem a âncora de GPI, domínio transmembrana e sem peptídeo sinal. (B) Expressão do
domínio Upar LY6 (9,7 kDa) da proteína Dife5, lisado bacteriano de E. coli BL21 DE3: ∅ - sem plasmídeo, 1, 2,
3 - clones 1-3 transformados com o plasmídeo pAE-Dife5 (I - induzidas com IPTG 1mM (concentração final), NI
– não induzidas). (C) Localização da proteína, S – Fração solúvel, C.I. – corpúsculos de inclusão.
Células de E. coli BL21 DE3 transformadas com o vetor pAE contendo o cDNA do
domínio Upar LY6 foram cultivadas e induzidas com IPTG 1mM, conforme descrito em
Materiais e Métodos. O crescimento dos cultivos foi acompanhado (λ=600nm) e a expressão
das proteínas verificada por SDS-PAGE (Figura 43B). Após a expressão das proteínas
recombinantes, os cultivos foram processados e os corpúsculos preparados conforme descrito
em Materiais e Métodos. Pode-se observar uma proteína com cerca de 12,5 kDa nos cultivos
induzidos com IPTG.
Apesar de observamos que a proteína recombinante encontrava-se majoritariamente
expressa na fração insolúvel (Figura 43C), decidimos investigar a possibilidade de
enriquecimento da fração solúvel realizando a expressão da proteína recombinante a uma
temperatura mais baixa (25°C) durante um período mais longo, 16 horas de indução. De fato,
estas modificações levaram a um aumento na quantidade de proteína detectada na fração
solúvel evidenciada após a cromatografia em resina quelante de Ni
++
(dados não apresentados).
Entretanto, o rendimento apresentado nestas condições ainda não se demonstrou satisfatório.
1 2
(A)
S. C.I.
(C)
200
150
100
75
50
37
25
20
15
10
(B)
N.I. I N.I. I N.I. I
∅
200
150
100
75
50
37
25
20
15
10
1
2
3
___________________________________________________________________Resultados
94
Assim sendo, passamos a investir nossos esforços na purificação da proteína desnaturada e
posterior renovelamento in vitro.
A Figura 44B apresenta um gel de SDS-PAGE contendo algumas das frações coletadas
durante a purificação da proteína denaturada por cromatografia de afinidade (Figura 44A).
Observa-se praticamente a ausência de proteínas contaminantes nestas frações. Após a
cromatografia, as frações (3-10) contendo a proteína Dife5 foram combinadas e renoveladas
por diluição lenta (10mL : 1L) em tampão de renovelamento. Em seguida esta solução foi
filtrada e a proteína concentrada através de uma nova cromatografia em resina quelante de
Ni
++
, sendo a eluição feita por “step” com 400 mM de imidazol (Figura 44C e D). Após a
cromatografia, as diferentes frações foram dialisadas em PBS ou tampão Tris 20 mM pH 8.0,
NaCl 150 mM por 24 horas. Em seguida, foi realizada a dosagem de proteína das frações
eluídas e dialisadas.
O cultivo de um litro de meio de cultura forneceu cerca de 3,3 mg de proteína
purificada na forma denaturada, após o renovelamento e nova cromatrografia foi possível
recuperar 2,1 mg de proteína/L de cultura. Esta quantidade foi reduzida para 1,9 mg/L de
cultura após a diálise.
A purificação da proteína recombinante Dife5, permitiu avaliarmos a resposta humoral
dos animais imunizados com a vacina de DNA pTARGET-Dife5. A obtenção desta proteína
permitirá ainda investigarmos a resposta celular contra este antígeno, bem como produzir
anticorpos para ensaios de imunolocalização desta proteína.
___________________________________________________________________Resultados
95
Figura 44 – Purificação da proteína Dife5 denaturada. (A) Cromatografia de afinidade em coluna de níquel
(Sepharose), em azul, absorbância da amostra (280nm), em vermelho, a porcentagem do tampão de eluição
(gradiente de 0 - 500mM de imidazol). (B) SDS-PAGE das frações coletadas na cromatografia (3-9), C.I. –
corpúsculos de inclusão, F.T. – “Flow through” fração não adsorvida à coluna. (C) Concentração da proteína
Dife5 após o renovelamento através de cromatografia de afinidade em coluna de níquel (Sepharose), a proteína foi
eluída em único passo (“step”) com 400mM de imidazol. (D) SDS-PAGE das frações coletadas (6 e 7) na
cromatografia. PM – peso molecular.
(A)
(B)
PM 6 7
Frações
(D)
C.I. F.T. 3 4 5 PM 6 7 8 9
Frações
97
66
45
30
20
14
(B)
(C)
___________________________________________________________________Resultados
96
4.4.4.2. Avaliação da resposta humoral em animais imunizados com a vacina de DNA
pTARGET-Dife5.
Os soros dos animais imunizados com a vacina de DNA contendo o antígeno Dife5
foram analisados por ELISA (dados não apresentados), utilizando como “coating” a proteína
purificada expressa em E. coli. Não observamos a produção de anticorpos IgG total nos
animais imunizados com a vacina de DNA (pTARGET-Dife5); resta investigar o envolvimento
do braço de resposta celular nestes animais.
4.4.5. Receptor para VLDL (“Very Low Density Lipoproteins”).
O gene estudado codifica uma proteína similar a um receptor para VLDL. Os parasitas
poderiam empregar este receptor para aquisição de LDL e VLDL do plasma do hospedeiro,
tanto para sua nutrição como para o mascaramento de sua superfície (Fan et al., 2003). A
vacina de DNA com este fragmento gênico conferiu uma proteção de 12%, e estes dados são
reforçados por um estudo recente, no qual um receptor para VLDL é descrito como candidato
vacinal para Schistosoma japonicum.
Na forma de proteína recombinante este antígeno foi capaz de conferir uma redução na
carga parasitária de 33.4% e uma redução na carga de ovos de 47,6% (Gan et al., 2005).
Infelizmente, os autores não revelaram o número de acesso da seqüência utilizada, de modo
que não podemos calcular a porcentagem de similaridade entre nosso candidato vacinal e a
proteína de S. japonicum.
A análise da seqüência de aminoácidos no banco de dados de domínios protéicos
SMART (Letunic et al., 2004), revelou a existência de dois domínios LDLa. Análises frente a
montagens parciais do genoma não estenderam este fragmento gênico (Figura 45).
___________________________________________________________________Resultados
97
297 tgtcctgcagcttcaataatcaatgtagttccagatcgatgtggtttaggatactttatg
C P A A S I I N V V P D R C G L G Y F M
237 tgttatgacggaagttgtatacaacaatctcagagatgtgatggacaaactcaatgtccc
C Y D G S C I Q Q S Q R C D G Q T Q C P
177 gatggatctgatgaaattaaatgtgtttgccaaccacctcgcattctttgttcttctggt
D G S D E I K C V C Q P P R I L C S S G
117 gagtgtattactcctgaaatgcgatgtgacggtatacaacattgtcgagacggctcagat
E C I T P E M R C D G I Q H C R D G S D
taa
57 gaaatcgcttgccctcctcgttgtcgtcctggtcaatatcagtgttcttctggtgaa 1
E I A C P P R C R P G Q Y Q C S S G E
Figura 45 – (A) - Representação esquemática dos domínios protéicos encontrados no gene rVLDL, as setas
representam os iniciadores utilizados para amplificação do fragmento para expressão da proteína recombinante.
(B) – cDNA do fragmento rVLDL e correspondente seqüência de aminoácidos. Sublinhado - seqüência clonada p/
expressão na vacina de DNA, em itálico região de anelamento dos iniciadores, Domínios LDLa – (E-value 3.90e-
07 e 4.02e-09). * - sinais possíveis para parada de tradução, M e L – sinais possíveis para início de tradução.
Até o momento, não foi possível expressar esta parte do rVLDL em E. coli (dados não
apresentados). Atualmente, a caracterização deste gene envolvendo a clonagem do gene
completo e expressão da proteína recombinante está sendo coordenada pelo Dr. Vanderlei
Rodrigues (Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Departamento de Bioquímica – USP –
Ribeirão Preto).
4.4.6. Anexina
As anexinas são uma grande família de proteínas ligadoras de fosfolipídios dependentes
de cálcio, largamente distribuídas em eucariotos. As proteínas desta família têm sido
relacionadas a uma larga faixa de processos biológicos importantes, como trafego e fusão de
membranas, anticoagulação, inibição de fosfolipase A2 e interação com proteínas de
citoesqueleto. Entretanto, a maioria destes experimentos foram realizados in vitro, de modo
que a função fisiológica real das anexinas in vivo permanece desconhecida. (Hongli et al.,
2002).
Dentre os ortólogos similares ao gene de S. mansoni, encontramos uma anexina de
Cysticercus cellulosae (fase larval de Taenia solium), originalmente clonada através da
varredura de uma biblioteca de expressão utilizando soro de suínos e humanos infectados. Uma
vacina de DNA expressando este gene demonstrou uma alta eficiência contra a cisticercose em
camundongos e suínos (Hongli et al., 2002).
(B)
(A)
___________________________________________________________________Resultados
98
Este conjunto de informações e a caracterização desta anexina como uma proteína
exposta na superfície do tegumento de vermes adultos (Braschi et al., 2005), balizaram a
escolha desta proteína para investigação como candidato vacinal. Recentemente, Perez-Sanchez
et al. (2006), detectaram um ortólogo desta proteína analisando os produtos secretados e as
proteínas expostas na superfície de vermes adultos de Schistosoma bovis.
A análise da seqüência de aminoácidos no banco de dados de domínios protéicos
SMART (Simple Modular Architecture Research Tool - http://smart.embl.de/) (Letunic et al.,
2004), revelou a existência de quatro domínios Anexina.
Para a sub-clonagem do gene da Anexina no vetor de expressão bacteriano pET28a,
foram desenhados iniciadores contendo os sítios EcoRI e XhoI. Os fragmentos foram
amplificados por PCR, utilizando uma enzima de alta fidelidade e as construções foram
checadas por seqüenciamento.
Para a expressão da proteína recombinante células de E. coli BL21 DE3 transformadas
com o vetor pET28a – Anne, contendo o gene da Anexina, foram cultivadas e induzidas com
IPTG 1mM, conforme descrito em Métodos (item 3.2.). O crescimento dos cultivos foi
acompanhado (λ=600nm) e a expressão das proteínas verificada por SDS-PAGE.
A análise do extrato total destas bactérias revelou que a proteína não estava sendo
expressa, ou estava sendo expressa em baixa quantidade, uma vez que não conseguíamos
visualizar a proteína em géis de SDS-PAGE (dados não apresentados). Tentou-se ainda
expressar a proteína recombinante nas cepas bacterianas Códon “Plus” e Rosetta (Novagen),
que expressam t-RNAs raros. Entretanto, não conseguimos visualizar a proteína recombinante
em nenhum dos casos (dados não apresentados).
Análises posteriores por Western blot utilizando anticorpos anti-his revelaram que a
proteína estava sendo expressa, majoritariamente na forma de corpúsculos de inclusão, mas
também na forma solúvel. A purificação desta proteína está sendo continuada em nossos
laboratórios, pela aluna de Doutorado Cibele Aparecida Tararam.
4.4.7. Fosfatase Alcalina
Os animais imunizados com esta vacina de DNA apresentaram uma redução na carga
parasitária de 12%, porém sem diferença estatística. Esta proteína foi identificada pelo
Laboratório do Dr. Alan Wilson como uma das proteínas mais expostas na superfície de
vermes adultos (Braschi et al., 2005b). Os peptídeos identificados pela espectrometria de
massa sugeriam que se tratava da proteína contida no agrupamento (“cluster”) SmAE 607243.
Como a região N-terminal da proteína não estava completa, utilizamos o “kit 5´race” para
clonagem e seqüenciamento da região 5´ deste gene (dados não apresentados), que após a
montagem com o “cluster” SmAE 607243 originou a seqüência de cDNA da Figura 46B. Em
seguida foram desenhados iniciadores para a clonagem do cDNA completo deste gene por RT-
___________________________________________________________________Resultados
99
PCR para ser utilizado como vacina de DNA (Figura 46A). Estas clonagens contaram com a
colaboração do laboratório do Dr. Sérgio Verjovski (IQ-USP-São Paulo).
1 tgattcgccagctatttagcgtgacactatagaatactcaagctatgcatccaacgcgtt
* F A S Y L A * H Y R I L K L C I Q R V
61 gggagctctcccatatggtcgacctgcaggcggccgcgaattcactagtgattctactac
G S S P I W S T C R R P R I H * * F Y Y
121 tactaggccacgcgtcgactagtacgggggggggttgtaaacctcgtaagacaaaatatg
Y * A T R R L V R G G V V N L V R Q N M
181 cttccaactgtcttatcgacagcttcaaaacccttattatttttcatagcagtcatacta
L P T V L S T A S K P L L F F I A V I L
241 tcactgtataaaattgagtgcaaatcgtccttattgaatgtagcagatcctgaaacttgg
S L Y K I E C K S S L L N V A D P E T W
301 aagaaatcagcagatgagagatttaataagtttgaaaaatcattatcctacttattactc
K K S A D E R F N K F E K S L S Y L L L
361 aaacgaccaaaaaatgtcatcttatttattggtgatggtatgagcttgaacactgttact
K R P K N V I L F I G D G M S L N T V T
421 ggagcaagatatttgaaagcggagaagatggattttttaggtggtgatgtacaactagta
G A R Y L K A E K M D F L G G D V Q L V
481 tgggagaactggcctgttgcatcacttgtccgtacattcaactcagatagactcacaaca
W E N W P V A S L V R T F N S D R L T T
541 gattcaggttctgcagcgactgcctttatgtcaggtgtgaaagggccatttaataccgtt
D S G S A A T A F M S G V K G P F N T V
601 ggtattacgggaacagtgaagtgctgtgaatgtactgagttaaaagaattggaaagggcg
G I T G T V K C C E C T E L K E L E R A
661 aaatcttctatcatgtacgcctctaaagcaggattttccgctggaatagttacaactacg
K S S I M Y A S K A G F S A G I V T T T
721 agagttactcatgcaacacccgcagcagcatatgcaaatatgttacatcgagattgggag
R V T H A T P A A A Y A N M L H R D W E
781 tcaaaagttccatcaaacgagcacgcattccactgcacagacgccgctgcacaactacta
S K V P S N E H A F H C T D A A A Q L L
841 actaacgcttctcatgtcaacgtcataatgggaggaggagcagccgaattctatggtcca
T N A S H V N V I M G G G A A E F Y G P
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H L A Y R L E N Q D Q P T L A E M T E A
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I D H G N H Q N Q A Q Y A L T E T L E L
(B)
(A)
___________________________________________________________________Resultados
100
1261 gaaaaagccgtcgagaaagcattgtcacttgttgatcaacaagaaacgttactattagta
E K A V E K A L S L V D Q Q E T L L L V
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Y Y L L F L S I I L Y T F I H * C I F C
1801 ggt 1803
G
Figura 46 – (A) - Representação esquemática dos domínios protéicos encontrados no gene da Fosfatase Alcalina,
as setas representam os iniciadores utilizados para amplificação do gene para expressão da proteína recombinante
em E. coli (→) e Pichia pastoris (→) . (B) – cDNA do gene da Fosfatase Alcalina e correspondente seqüência de
aminoácidos. Sublinhado – seqüência clonada na vacina de DNA, em itálico região de anelamento dos iniciadores,
Domínio alKPPc (E-value 1.41e-110), Sítio possível para âncora de GPI, Domínio transmembrana. * - sinais
possíveis para parada de tradução, M e L – sinais possíveis para início de tradução.
A análise da seqüência de aminoácidos no banco de dados de domínios protéicos
SMART (Simple Modular Architecture Research Tool - http://smart.embl.de/) (Letunic et al.,
2004), revelou a existência de um domínio alKPPc (Fosfatase alcalina) e um domínio
transmembrana. Foi possível ainda detectar um peptídeo sinal e um sítio putativo para âncora
de GPI com o auxílio dos algoritmos disponíveis em Kronegg e Buloz (1999)
(http://129.194.185.165/dgpi/index_en.html) (Figura 46B).
4.4.7.1. Clonagem, expressão e purificação da Fosfatase Alcalina.
Para a expressão da proteína recombinante deste gene utilizamos duas estratégias, a
primeira utilizando a seqüência completa da proteína, isto é, a mesma região contida no clone
da vacina de DNA. A segunda contendo deleções nas porções 5´e 3´e baseada na expressão
bem caracterizada da proteína ortóloga de humanos utilizando o sistema de Pichia pastoris
(Chen et al., 2004; Heimo et al., 1998).
Células de E. coli BL21 DE3 transformadas com o vetor pDEST17 contendo o cDNA
completo da Fosfatase Alcalina foram cultivadas e induzidas com IPTG 1mM, conforme
descrito em Métodos (item 3.2.1.). O crescimento dos cultivos foi acompanhado (λ=600nm) e
a expressão das proteínas verificada por SDS-PAGE (Figura 47A).
___________________________________________________________________Resultados
101
Após a expressão da proteína recombinante, os cultivos foram processados e os
corpúsculos de inclusão preparados conforme descrito em Materiais e Métodos. Encontramos,
porém, uma grande dificuldade no processo de solubilização da proteína. Inicialmente,
tentamos solubilizar os corpúsculos em 8M uréia, entretanto apenas uma fração muito pequena
da proteína foi solubilizada (Figura 47C), em seguida tentamos aumentar a solubilidade com a
adição do detergente não iônico Triton X-100 nas concentrações finais de 1% e 2%, limites
compatíveis com a resina que se pretendia utilizar no processo de purificação. Finalmente,
trocamos o agente denaturante utilizado para cloreto de guanidina, nas concentrações de 6M e
8M. De fato estes modificações aumentaram gradativamente a solubilidade da proteína, o que
nos permitiu iniciar o processo de purificação. Em função da compatibilidade com a resina
utilizada e enriquecimento da fosfatase alcalina em relação às outras proteínas presentes na
amostra, escolhemos a preparação em cloreto de guanidina 6M como amostra para iniciarmos a
cromatografia.
Tentamos purificar a proteína por cromatografia em resina quelante de Ni
++
(Figura
47B), sendo a eluição feita por gradiente. Porém, não observamos um aumento significativo da
absorbância (280 nm) nas frações eluídas da coluna, o que nos levou a questionar se a proteína
havia ligado na coluna ou se havia saído na fração não adsorvida (“flow through”). De fato, a
Figura 47E apresenta um gel de SDS-PAGE contendo o “flow through”, e se compararmos esta
fração com a amostra que foi injetada na coluna (Figura 47C - proteína em guanidina 6M), elas
apresentam quantidades equivalentes da proteína fosfatase alcalina, o que indica que a proteína
não se ligou à coluna.
___________________________________________________________________Resultados
102
Figura 47 – Purificação da proteína Fosfatase Alcalina pelo método de gradiente. (A) lisado bacteriano E. coli
BL21 DE3: N.I.- não induzidas, (clones 1-3) transformadas com o plasmídeo pDEST17-FA e induzidas com
IPTG 1mM (concentração final); (B) Localização da proteína na fração de corpúsculos de inclusão: ET – extrato
total, S – fração solúvel, CI – corpúsculos de inclusão solubilizados com SDS 2%. (C) tratamentos seqüenciais
com diferentes agentes denaturantes para tentar solubilizar a proteína dos CI: Uréia 8M, Uréia 8M mais Triton X-
100 1% e 2 %, cloreto de guanidina 6M e 8M. (D) Cromatografia de afinidade em coluna de níquel (Sepharose),
em azul absorbância da amostra (280nm), em verde porcentagem do tampão de eluição; (E) SDS-PAGE do FT -
“flow through” (amostra que passou pela coluna sem se ligar a ela).
Os resultados acima indicavam que o sistema de expressão, solubilização e purificação
da proteína não estavam otimizados, sendo necessárias modificações no protocolo. Poderíamos
tentar aumentar a solubilidade da proteína utilizando o detergente CHAPS (zwitterionic) na
200
150
100
75
50
37
25
20
N.I. 1 2 3
E.T. S C.I. (sds)
1% 2%
C.I. Uréia 8M
Triton
C.I.
Uréia 8M
6M 8M
Guanidina-HCl
200
150
100
75
50
37
25
20
15
10
F.T
(A) (B)
(C)
(D)
(E)
___________________________________________________________________Resultados
103
concentração final de 1%, a qual ainda é compatível com a resina utilizada no processo de
purificação. Em relação ao processo de purificação, poderíamos, por exemplo, abaixar a
concentração de imidazol utilizada no momento de ligação da proteína à coluna de 20mM para
5 mM. Essas seriam as primeiras modificações a serem testadas no protocolo inicial.
Entretanto, consultando a literatura avaliamos que o sistema de E. coli para expressão
desta enzima talvez não fosse o ideal; existem alguns trabalhos na literatura descrevendo a
expressão e purificação da fosfatase alcalina de placenta humana (ortólogo mais similar à
proteína de S. mansoni – 56% de similaridade) no sistema de Pichia pastoris (Chen et al.,
2004; Heimo et al., 1998). Adicionalmente, a expressão da proteína neste sistema eucariótico
apresenta uma série de vantagens, como glicosilações e modificações pós-traducionais, o que
torna a proteína funcionalmente mais “parecida” com a do Esquistossoma. Baseado nestas
informações e na dificuldade de utilizarmos o sistema de expressão procariótico de E. coli,
passamos a utilizar o modelo de Pichia pastoris.
Toda estratégia de clonagem teve como modelo o trabalho de Chen (2004), que
expressou o domínio funcional da fosfatase alcalina de placenta humana no sistema secretório
de Pichia pastoris. Para a clonagem de parte do gene da Fosfatase Alcalina de S. mansoni em
Pichia pastoris, foram desenhados novos iniciadores de modo a amplificar apenas o domínio
funcional da enzima, sendo removidas a seqüência sinal (N-terminal) e a região hidrofóbica
(carboxi-terminal). Os fragmentos foram amplificados por PCR, utilizando uma enzima de alta
fidelidade e as construções foram checadas por seqüenciamento.
Após a transformação das leveduras e seleção dos clones positivos (Materiais e
Métodos). Os clones (24 no total) foram checados por Western blot (anticorpos anti-His) e pela
atividade enzimática de Fosfatase Alcalina (BCIP/NBT Gibco-BRL), porém não conseguimos
detectar a presença da proteína recombinante nos clones analisados (dados não apresentados).
4.4.8. Fosfodiesterase (NPP 5 – pirofosfatase nucleotídica 5)
Dentre as proteínas descritas como mais expostas na superfície do verme pela análise de
proteoma do tegumento (Braschi et al., 2005b), a segunda proteína investigada foi a
Fosfodiesterase. Na realidade, o ortólogo mais próximo da proteína de Schistosoma mansoni é
uma pirofosfatase nucleotídica 5 (NPP-5) de Rattus norvegicus (38% de identidade, 58% de
similaridade).
As NPPs são enzimas que hidrolisam ligações 5´ fosfodiester dos nucleotídeos e de seus
derivados. Ao contrário das demais NPPs, a NPP-5 é uma proteína de membrana do tipo I,
apresentando seu sítio catalítico na região extracelular e uma cauda citoplasmática muito curta.
Os trabalhos com a proteína de rato demonstraram que esta se trata de uma glicoproteína, que
possivelmente possui resíduos de α-manose terminais (Ohe et al., 2003). Dentre as funções
preditas para as NPPs podemos citar a reciclagem de nucleotídeos e a regulação dos níveis
extracelulares de pirofosfato, que influenciam uma série de processos biológicos (Goding et al.,
___________________________________________________________________Resultados
104
2003). Os nucleotídeos extracelulares, e em particular o ATP e a adenosina, estão envolvidos
em diversos processos biológicos como a neurotransmissão, neuroproteção em hipóxia e
isquemia, regulação das funções cardiovasculares, agregação plaquetária, contração da
musculatura lisa, secreção de hormônios, modulação da resposta imune e controle da
proliferação celular, diferenciação e apoptose (Goding et al., 2003).
A análise da seqüência de aminoácidos no banco de dados de domínios protéicos
SMART (Simple Modular Architecture Research Tool - http://smart.embl.de/) (Letunic et al.,
2004), revelou a existência de um domínio Fosfodiesterase e um domínio transmembrana. Foi
possível ainda detectar um peptídeo sinal e um sítio putativo para âncora de GPI com o auxílio
dos algoritmos disponíveis em Kronegg e Buloz (1999)
(http://129.194.185.165/dgpi/index_en.html) (Figura 48).
1 atgattatcctactattgatttgtttctttccttatattgaaagaatctatgcatctggt
M I I L L L I C F F P Y I E R I Y A S G
61 gttgttgggaaggaacagttttctaaagtaatacttatttctcttgatggatttcgttat
V V G K E Q F S K V I L I S L D G F R Y
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D Y F D M A K Q R N I N M S A F D K I I
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N Q G V Y I R R I E N E F P T L T F P S
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H F S I V T G L H P G S H G I V D N V F
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Y D P I I N A T F S S R N Q S T A T D S
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R F Y D V G A E P I W V T N Q F H G H K
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S G V T F W I G S E A I I K G E R P T H
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Y L T P Y N E S I T F T Q R I D I L M D
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W F E H E N I N L G L M Y Y H Q P D R A
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G H I H G A A S D E V F K A I E E I N H
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G L E Y L L T S I E M R P S L S C C L N
721 ctgattataacaagtgatcatggaatgacgaacatcagttcagacagagttatatatctt
(A)
(B)
___________________________________________________________________Resultados
105
L I I T S D H G M T N I S S D R V I Y L
781 catgattacatacatccaaatgagtatatatctgctcctaagaagtcagcagaaatctgg
H D Y I H P N E Y I S A P K K S A E I W
841 acactttggccaaagcaaggctatactgtgcgatcattatacaacaaattgaaagatcga
T L W P K Q G Y T V R S L Y N K L K D R
901 cacttcaggttaaatgtctatttgaaggaggaactgccaacacgtttcttttatggttca
H F R L N V Y L K E E L P T R F F Y G S
961 agtgatcgagtcggtcctgttgttgtatatgcagatattggatggacgattattgctgac
S D R V G P V V V Y A D I G W T I I A D
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R T S G I T L K N K G A H G Y D P D Y K
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1201 gaacctgctcctaataatggtagtgtttgtcgagttcttcccttattgagtcaaggaagc
E P A P N N G S V C R V L P L L S Q G S
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F A N I N R L S I I F I I K F I I L S I
1321 ttcatggtacacaatggattatattattgaaataataataataaactgttctaatgaatg
F M V H N G L Y Y * N N N N K L F * * M
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C N D I L L I Y N I V F A Y Y L H A * V
1621 agtagtaagtacattat 1637
S S K Y I
Figura 48 – (A) - Representação esquemática dos domínios proteícos encontrados no gene da Fosfodiesterase, as
setas representam os iniciadores utilizados para amplificação do gene para expressão da proteína recombinante.
(B) – cDNA deste gene e correspondente seqüência de aminoácidos. em itálico região de anelamento dos
iniciadores, Peptídeo sinal, Domínio Fosfodiesterase (E-value 1.20e-57), Sítio possível para âncora de GPI,
Domínio transmembrana. * - sinais possíveis para parada de tradução, M e L – sinais possíveis para início de
tradução.
4.4.8.1. Clonagem expressão e purificação da Fosfodiesterase
Foram desenhados novos iniciadores para a sub-clonagem de parte do gene da
Fosfodiesterase no vetor de expressão bacteriano pET28a utilizando os sítios EcoRI e XhoI. Os
fragmentos foram amplificados por PCR, utilizando uma enzima de alta fidelidade e as
construções foram checadas por seqüenciamento.
Para a expressão da proteína recombinante, células de E. coli BL21 DE3 transformadas
com o vetor pET28a–Fosfo, contendo parte do gene da Fosfosdiesterase foram cultivadas e
___________________________________________________________________Resultados
106
induzidas com IPTG 1mM. O crescimento dos cultivos foi acompanhado (λ=600nm) e a
expressão das proteínas verificada por SDS-PAGE (Figura 49A). Podemos observar a banda da
proteína recombinante com cerca de 45 kDa nos clones analisados, chama a atenção o escape
de expressão antes da indução.
Após a expressão das proteínas recombinantes, os cultivos foram processados e os
corpúsculos separados. Os ensaios de solubilidade apontaram para a utilização do agente
denaturante cloreto de guanidina 6M (Figura 49B).
A proteína foi purificada por cromatografia em resina quelante de Ni
++
(Figura 49B),
sendo a eluição feita por gradiente de imidazol. A Figura 49D apresenta um gel de SDS-PAGE
contendo algumas das frações coletadas durante a eluição da proteína da coluna. Comparando
estas frações com a amostra injetada na coluna (C.I. 6M guanidina) observamos um
enriquecimento da proteína Fosfodiesterase; porém nota-se ainda a presença de muitos
contaminantes nestas frações.
___________________________________________________________________Resultados
107
Figura 49 – Purificação parcial da proteína Fosfodiesterase: (A) lisado bacteriano E. coli BL21 DE3: ∅ - sem
plasmídeo, (clones 1-5) transformadas com o plasmídeo pET28a-Fosfo e induzidas com IPTG 1mM
(concentração final), NI – não induzido; (B) Localização da proteína na fração de corpúsculos de inclusão: S –
fração solúvel, CI – corpúsculos de inclusão solubilizados 8M uréia e 6M guanidina, um pedaço do gel foi
removido e utilizado para análises de espectrometria de massa. (C) Cromatografia de afinidade em coluna de
níquel (Sepharose), em azul escuro absorbância da amostra (280nm), em verde porcentagem do tampão de
eluição; (D) SDS-PAGE das frações coletadas da cromatografia em coluna carregada com níquel (6-10). PM –
peso molecular.
PM 10 9 8 7 6
(D)
(B)
Gua Uréia
6M 8M S PM
C.I.
200
150
100
75
50
37
25
20
15
10
(A)
N.I. 1 2 N.I. 3 PM N.I. 4 5
∅
200
150
100
75
50
37
25
20
15
10
(C)
6 7 8 9 10
___________________________________________________________________Resultados
108
Tentando utilizar frações mais enriquecidas com a proteína Fosfodiesterase, realizamos
uma segunda purificação partindo de corpúsculos de inclusão que foram lavados com soluções
de uréia 2M e 4M acrescida de 2% Triton X-100, e depois solubilizados com 6M e 8M de
cloreto de guanidina. A amostra injetada na coluna nesta segunda purificação foi a solubilizada
com 8M guanidina (Figura 50A).
Figura 50 – Purificação parcial da proteína Fosfodiesterase pelo método de gradiente. (A) SDS-PAGE das frações
coletadas da cromatografia em coluna carregada com níquel (6-11), C.I. – corpúsculos de inclusão (amostra
injetada na coluna), F.T. – “Flow-through”, amostra que não ligou na coluna de níquel; a seta aponta a presença
de dímeros da proteína Fosfodiesterase (B) Cromatografia de afinidade em coluna de níquel (Sepharose), em azul
escuro absorbância da amostra (280nm), em verde porcentagem do tampão de eluição. PM – peso molecular.
C.I. F.T. 6 7 8 9 10 11 PM
Frações
200
150
100
75
50
37
25
20
15
10
(A)
(B)
6 7 8 9 10 11
___________________________________________________________________Resultados
109
Os resultados apresentados na Figura 50 demonstram que partindo de preparações mais
enriquecidas com a proteína Fosfodiesterase, foi possível obter frações eluídas mais puras desta
proteína. A principal proteína contaminante foi eliminada no “flow through”, porém ainda resta
uma quantidade de contaminantes significativa.
Analisando as Figuras 49D e 50A notamos a presença de duas bandas na altura de 100
kDa, o que nos fez questionar se estas proteínas não seriam dímeros ou agregados da proteína
Fosfodiesterase, para tanto, estas bandas (proteínas) foram analisadas por espectrometria de
massa (dados não apresentados), sendo confirmado se tratarem de dímeros da Fosfodiesterase.
Visando polir o processo de purificação desta proteína foi realizada uma cromatografia
de filtração em gel após a cromatografia de afinidade ao níquel. A Figura 51 mostra alguma
das frações obtidas após a filtração em gel.
Figura 51 – Purificação da proteína Fosfodiesterase por filtração em gel, SDS-PAGE das frações coletadas da
cromatografia em resina Sephacryl S-200 HR, PM – peso molecular.
Podemos observar que após a filtração em gel os dímeros da proteína foram separados
dos monômeros, entretanto ainda observamos uma banda ao redor de 30 kDa provavelmente
produto da degradação da proteína.
Tentamos realizar o renovelamento desta proteína por diluição antes da cromatografia;
por diálise lenta após a purificação da proteína; e com a proteína ligada a coluna (“on-column
refolding”), entretanto nenhuma destas estratégias se demonstrou efetiva resultando sempre na
precipitação da proteína.
Em virtude da dificuldade de obtermos a proteína solúvel, investimos nossos esforços
na expressão da proteína no sistema secretório de Pichia pastoris. Para a clonagem de parte do
gene da Fosfodiesterase de S. mansoni em Pichia pastoris, foram desenhados novos iniciadores
PM 1 2 3
Frações
97
66
45
30
20
14
___________________________________________________________________Resultados
110
de modo a amplificar apenas o domínio funcional da enzima, sendo removidas a seqüência
sinal (N-terminal) e a região hidrofóbica (carboxi-terminal). Os fragmentos foram amplificados
por PCR, utilizando uma enzima de alta fidelidade e as construções foram checadas por
seqüenciamento.
Após a transformação das leveduras foram selecionados 15 clones para análise quanto à
expressão da proteína recombinante por Western blot com auxílio de um anticorpo anti-cauda
de histidina. A proteína recombinante não foi detectada nas culturas de levedura, tanto no meio
de cultura (proteínas secretadas) como na fração intracelular.
Uma explicação para a ausência da proteína recombinante seria uma incompatibilidade
entre os códons codificantes utilizados pelo Schistosoma mansoni e pela levedura. Uma análise
da seqüência nucleotídica utilizando o códon “usage” de Pichia pastoris revelou que a proteína
Fosfodiesterase apresenta 96 aminoácidos codificados por trincas de nucleotídeos raros e 16
aminoácidos codificados por trincas de nucleotídeos muito raros (Fuhrmann et al., 2004). A
escassez de t-RNAs que codifiquem aminoácidos para estas trincas raras pode gerar o término
precoce durante a tradução da proteína, o que poderia justificar não termos detectado sua
expressão, já que a cauda de histidina encontra-se fusionada à porção C-terminal da proteína.
4.4.9. Apirase
Este gene foi selecionado por se tratar de uma proteína integral de membrana,
localizada no tegumento de vermes adultos e por seu possível envolvimento no processo de
inibição da agregação plaquetária pelo parasita (Vasconcelos et al., 1993; DeMarco et al.,
2003).
A Figura 52 apresenta uma representação esquemática dos domínios protéicos desta
proteína; podemos observar a presença de dois domínios transmenbrânicos nas porções N e C-
terminal e um domínio similar ao CD39 na região central da proteína. A proteína
CD39/ATPDase1 foi localizada na membrana plasmática de células vasculares, atuando na
hidrólise de ATP e ADP extracelular, prevenindo assim a agregação de plaquetas (DeMarco et
al., 2003).
___________________________________________________________________Resultados
111
1 atggtttttggaaaacgcaacttatctcaattatttgattttacc
M V F G K R N L S Q L F D F T
46 aaacttgttactataagtaacatttcattaactcctcgaagaatc
K L V T I S N I S L T P R R I
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M E R N T N L H K I L T I L A
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V L Y I L S S N I P D V Y S V
226 gtgattgatgcaggatcaacttcttcaaaacttcatttatataaa
V I D A G S T S S K L H L Y K
271 tggatcgatgaaccatttcgatcaaatggaaaagttgatgaagtg
W I D E P F R S N G K V D E V
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T N E K L S P G I S D Y I N D
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T I K A Y D T L K P K L L K L
406 acgaatagtttaacatttgaacaaaaacagcatacaccaatttat
T N S L T F E Q K Q H T P I Y
451 ttggctgcaactgctggtatgcgattaaaactaattgaagatcca
L A A T A G M R L K L I E D P
496 ttaggaagtttagatttattctcagtaattcgtcaatatttaaaa
L G S L D L F S V I R Q Y L K
541 cagtctggttttcaaattgagacaccaaatgagcgtattcgttta
Q S G F Q I E T P N E R I R L
586 ttgtatggatcagaagaaggactttatggttgggtatcagtgaat
L Y G S E E G L Y G W V S V N
631 tatattttaggtattattaaagaaggtaaacaaacaaatccttct
Y I L G I I K E G K Q T N P S
676 gatacagttggttctttggatcttggcggagctagtacacaaatc
D T V G S L D L G G A S T Q I
721 gcatttattcccaaagtatattcaaatataccaaaagaaaaatta
A F I P K V Y S N I P K E K L
766 gacttttatccactccgattatatggaaatgatttttcagtatat
D F Y P L R L Y G N D F S V Y
811 agtcatagtttcttatgctatggaaaatcggaatttgaaagacgt
S H S F L C Y G K S E F E R R
856 gtaataacttcaattgcagcagcatctttgttacaaagtaaaatt
V I T S I A A A S L L Q S K I
901 cctaatccatgctttcttcaaggctataaatcggatttgtacaat
P N P C F L Q G Y K S D L Y N
946 gcatttgaatggttctctggaagttgtttatctggaacttatgta
A F E W F S G S C L S G T Y V
991 aagaaaacatttgctgaggaaattttccgacctcctaatatgaat
K K T F A E E I F R P P N M N
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S F S F N G T G Q P N E C V N
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Y I L K H F Q T K C D H S S C
1126 tcattcaataatgtttttcaaccagctccatttggaaagtttatg
S F N N V F Q P A P F G K F M
1171 gcatattctggattttcgtatgtgatgcgttatttatttcctaat
A Y S G F S Y V M R Y L F P N
1216 aagaacacaggatttacactaacagaagtcactgatgccgttatg
(A)
(B)
___________________________________________________________________Resultados
112
K N T G F T L T E V T D A V M
1261 aagttttgcaaaaaaccatggaaagatgtggctaaaattacaaaa
K F C K K P W K D V A K I T K
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L S D Q G F T A K Y C F D G L
1351 tacattattactttattgaaaatgtatggttttactacagatgaa
Y I I T L L K M Y G F T T D E
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S W K T I T F D S K V N G K S
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P S E S P K V S V S T Q L F V
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C L F I L L L L L I I G S I I
1576 ggattattactaactagaaatttcttgtcgaaatcgaaaaaatca
G L L L T R N F L S K S K K S
1621 actagtcaggtataa 1635
T S Q V *
Figura 52 – (A) - Representação esquemática dos domínios protéicos encontrados no gene Apirase, as setas
representam os iniciadores utilizados para amplificação do fragmento para expressão da proteína recombinante.
(B) – cDNA do gene Apirase e correspondente seqüência de aminoácidos. Sublinhado - seqüência utilizada na
vacina de DNA, em itálico região de anelamento dos iniciadores, domínio CD39 (E-value 1.00e-52), , domínio
transmembrana. * - sinais possíveis para parada de tradução, M e L – sinais possíveis para início de tradução.
A vacina de DNA contendo o cDNA completo da Apirase, uma ATP-difosfohidrolase,
conferiu uma redução na carga parasitária de 18%. A construção desta vacina de DNA foi
realizada em colaboração com o doutorando Julio Cesar Levano Garcia aluno do Dr. Sérgio
Verjovski (IQ – USP - São Paulo), que realiza estudos sobre a caracterização bioquímica desta
proteína. Posteriormente, estabelecemos uma colaboração para testar o efeito protetor da
proteína recombinante Apirase, produzida em E. coli.
4.4.9.1. Avaliação da resposta humoral em animais imunizados com a vacina de DNA
pTARGET-Apirase.
Os soros dos animais imunizados com a vacina de DNA contendo o antígeno Apirase
foram analisados por ELISA; como não observamos produção de anticorpos (IgG total) (dados
não apresentados), decidimos investigar o envolvimento do braço de resposta celular nestes
animais.
4.4.9.2. Avaliação da resposta celular em animais imunizados com pTARGET-Apirase
(ELISPOT).
O ensaio de Imunospot com uma enzima conjugada (ELISPOT) é uma técnica utilizada
para detectar e analisar in vitro células individuais que secretam, por exemplo, uma citocina.
Comparando-se a freqüência de células que secretam uma dada citocina frente a um
determinado estímulo com os respectivos controles, podemos inferir o tipo de resposta imune
instruída por estes linfócitos.
___________________________________________________________________Resultados
113
Grupos de quatro camundongos C57BL/6 foram imunizados com a vacina de DNA
pTARGET-Apirase ou com o vetor vazio (controle negativo) (3 doses de 50 µg com intervalos
de 15 dias). Após 21 dias, os animais foram sacrificados e os esplenócitos separados. A
capacidade dos linfócitos produzirem as citocinas IFN-γ e IL-4 foi analisada por ELISPOT nas
seguintes condições: sem estímulo ou estimulados com 5 µg/mL de proteína Apirase. Após 20
horas de incubação das células com estímulo procedeu-se ao processamento da placa e a
análise do número de células (“spots”) secretando as citocinas para cada tratamento (Figura
53).
Figura 53 – Determinação do número de células produtoras de IFN- , a partir da cultura de esplenócitos de
camundongos imunizados com a vacina de DNA pTARGET-Apirase e Vetor Vazio, após estimulo com rApirase
(5 µg/ml) no ensaio de ELISPOT. Os baços foram extraídos após 21 dias da última dose. (**) diferença estatística
significativa (p < 0,00001) em relação ao vetor vazio, (⊥) desvio padrão.
Os resultados obtidos mostram que os esplenócitos dos animais imunizados com a
vacina de DNA pTARGET-Apirase apresentam uma quantidade de linfócitos que secretam a
citocina IFN-γ cinco vezes superior aos animais imunizados com o vetor vazio, após o estímulo
com a proteína recombinante Apirase.
Com relação ao número de linfócitos que secretam a citocina IL-4, não observamos
diferença entre os animais imunizados com a vacina de DNA-Apirase e o grupo imunizado
com o vetor vazio (controle negativo) (dados não apresentados). A capacidade de secretar
IFN-γ pelos linfócitos dos animais imunizados com a vacina de DNA, quando estes são
estimulados in vitro com a proteína recombinante, sugere a indução de uma resposta imune
celular nestes animais.
Em função dos resultados positivos com a vacina de DNA e de posse da proteína
recombinante purificada a partir de E. coli, realizamos vários ensaios visando testar o efeito
protetor da proteína Apirase.
0
50
100
150
200
250
IFN-gama Apirase "spots" / 5X10
5
células
Vetor Vazio
Vacina de DNA
**
___________________________________________________________________Resultados
114
4.4.9.3. Primeiro experimento com a Proteína Apirase: Resposta humoral e ensaios funcionais
Camundongos BALB/c foram imunizados com a proteína recombinante Apirase (10
µg/dose contendo 1000 µg de AlOH
3
- 3 doses com intervalos de 7 dias). Os níveis de
anticorpos IgG totais induzidos contra a proteína Apirase foram determinados por ELISA,
através da análise do soro dos animais imunizados. Pode-se observar que o soro dos animais
imunizados reconheceu a proteína recombinante, sendo titulado na diluição de 1:1280. No
entanto, não foi detectada a presença de anticorpos anti-Apirase no soro de animais imunizados
com cercárias irradiadas e animais com infecção crônica (Figura 54).
Figura 54 – Produção de anticorpos IgG anti-Apirase em camundongos imunizados com a proteína Apirase
recombinante. Os níveis de anticorpos IgG total foram analisados em amostras do soro coletadas 60 dias após a
primeira dose da proteína Apirase. Foram analisados ainda soros de animais imunizados com cercárias irradiadas
(Cer. Irr) e soro de animais com infecção crônica (Inf. Crônica).
4.4.9.4. Ensaio de inibição de penetração pela pele
Para verificar se os anticorpos produzidos contra a proteína Apirase recombinante
teriam algum efeito sobre a penetração do parasita através da pele, realizamos um ensaio
adaptado dos trabalhos de Williamson (2003) e Goud (2005), como descrito em Materiais e
Métodos.
0
2
4
6
8
10
12
Al(OH)3 Apirase Exp1 Cerc.Irr. Inf. Crônica
Log
2
do Título
___________________________________________________________________Resultados
115
Figura 55 - Inibição da penetração de cercárias pela pele de camundongos, mediada pelo anti-soro anti-Apirase.
Para estes ensaios, 100 cercárias de S. mansoni foram incubadas com os anti-soros (Naive ou Apirase) ou água e
depois diluídas em água e deixadas para penetrar a pele de camundongos anestesiados. O número médio de
parasitas que não penetraram foi tomado como uma medida de inibição da penetração. * Estatisticamente
diferente da Água; ** estatisticamente diferente do soro naive (p < 0,04), (⊥) desvio padrão.
Para determinar se a proteína foi capaz de produzir imunidade protetora, os
camundongos imunizados foram desafiados com 110 cercárias (pela via subcutânea) e o
número de vermes recuperados após 7 semanas foi analisado. Os resultados deste ensaio foram
expressos pelo "número médio de vermes recuperados" (NMV ± DP), onde DP é o desvio
padrão (Tabela 15).
Tabela 15 – Desafio de camundongos BALB/c imunizados com a proteína recombinante Apirase.
Grupo (n)
Média de Vermes
recuperados
(NMV
±
±±
±
DP)
Redução
(%)
p
(teste-t)
Salina (9)
34 ± 21,4
AlOH
3
(8)
35 ± 21,7
Apirase (9)
28 ± 18,2
19,05 0,48
(n) - número de animais.
Podemos observar que a imunização dos camundongos com a proteína Apirase induziu
uma redução da carga parasitária de 19% em relação aos animais não imunizados, porém como
não observamos diferenças estatísticas significativas (p=0,48), podemos apenas apontar para
uma tendência de redução da carga parasitária dos animais imunizados com a proteína Apirase.
Apesar de não termos observado diferenças estatísticas significativas na redução da
carga parasitária dos animais imunizados com a proteína Apirase (Tabela 15), investigamos a
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
Agua Soro naive Soro Anti-Apirase
Média do número de cercárias que não
penetraram
*
**
*
___________________________________________________________________Resultados
116
hipótese de que os níveis de anticorpos anti-Apirase pudessem estar correlacionados com o
número de vermes recuperados. Para estabelecer como estes animais responderam às
imunizações, analisamos o soro destes individualmente. De fato, analisando a Figura 56
observamos que quanto maior os níveis de anticorpos anti-Apirase no camundongo, menor é o
número de vermes recuperados, isto é, existe uma correlação entre o os níveis de anticorpos em
cada animal e o número de vermes recuperados neste mesmo animal.
Figura 56 – Gráfico de correlação entre o nível de anticorpos anti-Apirase de cada animal (Log
2
do título) e o
número de vermes recuperados nesses animais.
4.4.9.2. Segundo experimento com a Proteína Apirase
Visando repetir as condições de imunização descritas por Ramos (2003), utilizamos o
coxim plantar como via de imunização neste segundo experimento. Entretanto, apenas a
primeira e a segunda dose foram aplicadas no coxim plantar, o que resultou em um acentuado
processo inflamatório no sítio da injeção; como conseqüência a terceira dose foi administrada
subcutaneamente, o intervalo entre as doses foi de 7 dias, sendo administrados 10 µg de
proteína /dose formulada com 1000 µg de AlOH
3
.
Uma segunda modificação em relação ao primeiro experimento foi a utilização de
camundongos C57BL/6. Uma vez que estes animais apresentam um perfil genético que resulta
em uma tendência de resposta imune polarizada para citocinas do tipo Th1, investigamos como
seria a resposta frente à imunização com a proteína Apirase nestes animais. A última
modificação com relação ao primeiro experimento foi o modo como realizamos o desafio,
através da penetração pela pele e não mais através da injeção subcutânea das cercárias.
Os níveis de anticorpos IgG totais induzidos contra a proteína Apirase foram
determinados por ELISA, através da analise do soro ("pool") dos animais imunizados com esta
proteína (Figura 57).
0
10
20
30
40
50
60
70
Camundongos
Carga Parasitária /
Camundongo
0
2
4
6
8
10
12
14
Log
2
do título
Log2 do título
Carga parasitária
___________________________________________________________________Resultados
117
Os níveis de anticorpos IgG totais anti-Apirase nos dois experimentos demonstrou-se
similar, como evidenciado pela Figura 57. Restava ainda investigar a influência do perfil
genético destes animais (BALB/c e C57BL6), na proporção das subclasses IgG1 e IgG2a, uma
vez que estes anticorpos apresentam funções efetoras distintas. Além disso, a mudança na via
de imunização subcutânea do experimento 1, para coxim plantar no experimento 2 poderia
também influenciar o tipo de resposta imune elicitada.
Figura 57 – Produção de anticorpos IgG anti-Apirase em camundongos imunizados com a proteína Apirase
recombinante analisados por ELISA. Os níveis de anticorpos IgG total foram analisados em amostras do soro
coletadas 47 dias após a última dose com a proteína Apirase.
De fato, após a titulação dos isótipos IgG1 e IgG2a e cálculo desta razão, os resultados
(Figura 58) sugerem os animais BALB/c do primeiro experimento apresentam maior produção
de anticorpos da subclasse IgG1 em relação a subclasse IgG2a, o que pode ser inferido como
uma resposta polarizada para Th2. Por outro lado, os animais C57BL/6 do segundo
experimento apresentam uma razão inversa, com proporção maior de anticorpos IgG2a, o que
pode ser um indicativo de uma resposta com predominância Th1.
Figura 58 - Razão das subclasses de anticorpos anti-Apirase IgG1/IgG2a do soro de camundongos BALB/c
(primeiro experimento) e C57BL/6 (segundo experimento) imunizados com a proteína Apirase formulada com
hidróxido de alumínio.
0
2
4
6
8
10
BALB/C C57BL/6
log
2
do título
IgG1
IgG2a
2,0
0,5
0
2
4
6
8
10
12
Al(OH)3 Experimento 1
Apirase-BALB/c
Experimento 2
Apirase-C57BL/6
Log
2
do Título
___________________________________________________________________Resultados
118
Para determinar se a proteína foi capaz de produzir imunidade protetora, os
camundongos foram desafiados com 110 cercárias através da penetração pela pele. O número
de vermes recuperados por perfusão do sistema porta hepático após 7 semanas foi analisado.
Os resultados deste experimento foram expressos pelo "número médio de vermes
recuperados", indicando que não houve redução da média da carga parasitária (dados não
apresentados). Esta observação poderia ter origem na mudança da linhagem de camundongos,
ou modificação da via de imunização utilizada, porém achamos que a mudança mais
significativa implementada foi a realização do desafio por penetração pela pele. De modo que,
ao contrário do primeiro experimento, os parasitas tiveram tempo de sofrer uma série de
modificações durante o processo de penetração das camadas da epiderme e derme, estando
mais preparados para invadir o hospedeiro. A exemplo do que foi feito no experimento 1,
analisamos o soro destes animais individualmente, buscando correlacionar os níveis de
anticorpos anti-Apirase de cada animal com o número de vermes recuperados, porém não
observamos a mesma correlação do experimento anterior, novamente podendo refletir a
mudança no método pelo qual desafiamos os animais neste segundo experimento (através da
penetração pela pele).
4.4.9.3. Terceiro experimento com a Proteína Apirase – investigando os pólos Th1 e Th2
Visando aumentar os níveis de anticorpos anti-Apirase produzidos, e
concomitantemente modular o tipo de resposta imune induzida através do uso de diferentes
adjuvantes, montamos um terceiro experimento com camundongos C57BL/6, alterando o
regime de imunização para 3 doses subcutâneas de 30 µg da proteína Apirase, administradas
em intervalos de 15 dias. Adicionalmente, testamos diferentes adjuvantes visando polarizar as
resposta imunes para Th2, Th1 ou mistas Th1/Th2, contra a proteína Apirase. Os grupos
experimentais com as respectivas tendências imunológicas esperadas, foram:
- Apirase Alumínio (3 doses) – Api Alum - Th2
- Apirase Alumínio (Prime) - Apirase CpG (2 doses) – Api Alum-Api CpG - Th2/Th1
- Apirase CpG (Prime) - Apirase Alumínio (2 doses) – Api CpG-Api Alum - Th1/Th2
- Apirase CpG (3 doses) – Api CpG - Th1
Os níveis de anticorpos IgG totais induzidos contra a proteína Apirase foram
determinados por ELISA, através da analise do soro dos animais imunizados com esta proteína
e respectivos adjuvantes. De fato, o nível de anticorpos IgG total anti-Apirase neste terceiro
experimento se demonstrou mais elevado, de 2-4 logs, quando comparado com os dois
primeiros ensaios. Os grupos que apresentaram maiores títulos de anticorpos neste terceiro
experimento foram Api CpG e Api CpG-Api Alum (Figura 59).
___________________________________________________________________Resultados
119
Figura 59 – Titulação de anticorpos anti-Apirase. Estão plotados os logaritmos dos títulos de anticorpos dos
diferentes grupos experimentais. Apirase Exp1 e 2 – 3 doses 10 µg/dose de proteína Apirase; Demais grupos - 3
doses de 30 µg/dose de proteína Apirase.
Visando caracterizar o perfil de resposta imune induzido nestes grupos, analisamos as
subclasses de anticorpos IgG1 e IgG2a destes animais. A razão entre estas subclasses de
anticorpos pode ser utilizada como uma medida do balanço da resposta imune entre os pólos
Th1 e Th2 (Figura 60).
Figura 60 - Razão das subclasses de anticorpos IgG1/IgG2a do soro de camundongos imunizados com a proteína
Apirase formulada com diferentes adjuvantes.
Pode-se observar que os animais que receberam como 1° dose a proteína acrescida de
hidróxido de alumínio, apresentam um perfil de resposta polarizada para Th2 (razão 4 e 2),
com maior indução de anticorpos IgG1. Animais primados com a proteína com CpG e
reforçados com a proteína formulada em alumínio apresentaram uma resposta mais Th1 (razão
0,5) com maior produção de anticorpos IgG2a. O grupo que recebeu 3 doses da proteína com
oligos CpG, apresentou uma resposta equilibrada Th1/Th2 (razão 1), embora não se possa
afirmar que uma razão de 0,5 e 1,0 sejam significativamente diferentes. Estes resultados
corroboram os dados descritos na literatura que associam o adjuvante hidróxido de alumínio
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Apirase
Exp1 e 2
Api Alum Api Alum -
Api CpG
Api CpG Api CpG -
Api Alum
Log
2
do título
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Api Alum Api Alum -
Apira CpG
Api CpG Api CpG - Api
Alum
Log
2
do título
IgG1
IgG2a
4,0 2,0 1,0 0,5
___________________________________________________________________Resultados
120
com uma resposta polarizada para Th2, enquanto os oligonucleotídeos contendo motivos CpG
são classicamente associados a uma resposta Th1.
Para determinar se as diferentes formulações da proteína foram capazes de produzir
imunidade protetora, os camundongos foram desafiados com 110 cercárias através da
penetração pela pele. O número de vermes recuperados por perfusão do sistema por hepático
após 7 semanas foi analisado. A Figura 61 apresenta um gráfico de dispersão do número de
vermes recuperado por animal nos diferentes grupos experimentais.
Figura 61 - Gráfico de dispersão do número de vermes recuperados nos diferentes grupos experimentais. (
__
)
média do número de vermes recuperados em cada grupo, nenhum dos grupos experimentais apresentou diferença
estatística significante (p < 0,05).
Tabela 16 – Desafio de camundongos C57BL/6 imunizados com a proteína recombinante Apirase.
Grupo (n)
Média de
Vermes
recuperados
(NMV ±
±±
± DP)
Proteção frente
ao Naive
(%)
p
(teste-t)
Proteção
específica
(%)
Naive (6)
42 ± 10
Alumínio (11) 35 + 11,8 16,7 0,28
Apirase Alumínio (11) 33 + 11,5 22,1 0,11 6,5
Apirase Alumínio – Apirase CpG IFA (10) 36 + 7,8 13,8 0,24 -3,4
CpG IFA
(12)
41 ± 7,8
1,8 0,89
Apirase CpG IFA (12)
41 ± 9,1
2,6 0,86 0,9
Apirase CpG IFA – Apirase Alumínio (11)
39 ± 18,4
8,2 0,67 6,7
(n) - número de animais.
A análise dos dados do desafio deste terceiro experimento (Tabela 16), revela que
houve redução da média da carga parasitária em alguns grupos quando estes são comparados
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
NAIVE Alum Api Alum Api Alum -
CpG
CpG Api CpG Api CpG -
Alum
Carga Parasitária
Th2/Th1
Th1
+Th2
Th2
___________________________________________________________________Resultados
121
aos animais naive (Figura 61). Infelizmente, não observamos diferenças estatísticas
significativas (Tabela 16), podemos portanto, apenas apontar para uma tendência de redução da
carga parasitária dos animais imunizados com a proteína Apirase nas diferentes formulações.
Podemos observar que a imunização dos camundongos com a proteína Apirase formulada em
hidróxido de alumínio se demonstrou a mais efetiva, com uma redução de 22,1 % na média da
carga parasitária e com menor valor de p (0,11). O grupo primado com Apirase em hidróxido
de alumínio e reforçado com Apirase mais oligos CpG apresentou uma redução média de 13,8
%. Deve-se ressaltar que o grupo que recebeu a proteína apenas com oligos CpG, praticamente
não apresentou efeito protetor algum (2,6 %).
Apesar de não termos observado diferenças estatísticas significativas na redução da
carga parasitária entre os grupos testados, investigamos a hipótese de que o tipo de resposta
montada pudesse estar correlacionada com os níveis de proteção observados. Isto porque,
sabemos que em humanos e camundongos existem quatro subclasses de anticorpos IgG (IgG1,
IgG2a, IgG2b e IgG3), os quais possuem diferentes funções efetoras. Para tanto, plotamos a
porcentagem de redução da carga parasitária observada, pela razão das subclasses IgG1/IgG2a,
que indiretamente é um indicativo do tipo de resposta imune induzida (Figura 62). Podemos
observar que a redução da carga parasitária foi maior no pólo Th2.
Figura 62 – Gráfico de correlação entre a porcentagem de redução da carga parasitária em função da polarização
da resposta imune obtida. Os valores próximos aos pontos se referem as razões entre os isótipos IgG1 /IgG2a.
A razão das subclasses de anticorpos IgG1/IgG2a é apenas uma medida indicativa do
tipo de resposta imune induzida pelo antígeno nas diferentes formulações. Uma maneira mais
direta de caracterizar este tipo de resposta é através da dosagem de diferentes citocinas
secretadas pelos linfócitos T destes animais, in vitro, frente ao estímulo com o antígeno.
Para tanto, grupos de três camundongos C57BL/6 foram imunizados com a proteína
Apirase formulada em hidróxido de alumínio (pólo Th2) ou formulada com oligos CpG
(resposta mista Th1/Th2) (3 doses subcutâneas de 30 µg da proteína Apirase, administradas em
intervalos de 15 dias), ou ainda com a vacina de DNA pTARGET-Apirase (pólo Th1) (3 doses
0,5
1
2
4
0
5
10
15
20
25
Razão IgG1/IgG2a - "Polarização da resposta imune"
% de redução da carga parasitária
Th1 Th1/Th2 Th2 +Th2
___________________________________________________________________Resultados
122
de 50 µg com intervalos de 15 dias). Após 21 dias da última dose, os animais foram
sacrificados e os esplenócitos separados. A capacidade dos linfócitos produzirem as citocinas
IFN-γ e IL-4 foi analisada por (ELISPOT) nas seguintes condições: sem estímulo e
estimulados com 5 µg/mL de proteína Apirase (Figura 63).
Figura 63 – Gráfico de correlação entre a porcentagem de redução da carga parasitária e o número de células
secretoras das citocinas IL-4 e IFN-γ determinadas pelo ensaio de ELISPOT.
Os resultados apresentados na Figura 63 confirmam que foi possível modular o tipo de
resposta imune induzida com o uso de adjuvantes. Os animais imunizados com a vacina de
DNA pTARGET-Apirase apresentam linfócitos-T que secretam majoritariamente IFN-γ e
muito pouco IL-4, o que poderia explicar o fato de não termos observado a formação de
anticorpos anti-Apirase com esta vacina. Já os animais que receberam a proteína formulada
com hidróxido de alumínio, apresentam, não só um número maior de células-T secretoras de
IL-4 em relação aos demais grupos, mas também uma proporção entre células-T que secretam
IL-4 e IFN-γ mais favorável a uma resposta Th2. Este resultado é concatenado com a razão 4
observada entre os isótipos IgG1/IgG2a. Para o grupo de animais imunizados com a proteína
formulada com oligonucleotídeos CpG, observamos uma proporção inversa entre as
quantidades de células secretando as citocinas IL-4 e INF-γ , com um predominância desta
última citocina, o que é indicativo de uma resposta Th1, mas ainda com um componente Th2
significativo.
Ao compararmos a porcentagem de redução da carga parasitária com o número de
células secretoras de IL-4 e IFN-γ, podemos observar que os grupos mais protetores estão nos
pólos da resposta imune Th1 ou Th2 (Figura 63). Vale lembrar que, apesar dos valores de
redução de carga parasitária nos pólos Th1 e Th2 serem semelhantes, 18% e 22%,
respectivamente, apenas para a vacina de DNA esta redução foi significativa, onde esta
polarização mostrou-se mais acentuada.
0
5
10
15
20
25
Vacina de DNA Apirase Proteína Apirase CpG Proteína Apirase Alum
% de redução da carga
parasitária
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
Apirase "spots" / 5 x 10
5
células
IL-4 INF-gama % de Redução da Carga Parasitária
____________________________________________________________________Discussão
123
5. DISCUSSÃO
5.1. Genoma Funcional de Helmintos ?
Os trabalhos de análise funcional de genomas bacterianos se encontram em um estágio
mais adiantado do que as análises funcionais de genomas de protozoários e helmintos.
Diversos fatores são responsáveis por esta diferença, dentre os quais podemos destacar: o
tamanho destes genomas e conseqüente número de genes; o número de organismos totalmente
seqüenciados; e o conhecimento mais aprofundado sobre os mecanismos de invasão, infecção e
evasão imune destes organismos. Entretanto, o fator que parece ser preponderante é a
complexidade crescente apresentada por estes organismos (Procariotos, Protozoários e
Helmintos). O maior desafio que se apresentou neste trabalho era como selecionar moléculas
alvos a partir do transcriptoma de um metazoário tão complexo como o Schistosoma mansoni.
Uma estratégia que pode ser frutífera em identificar potenciais candidatos vacinais é
definir aqueles cDNAs que codificam proteínas que são: (1) secretadas pelo parasita, e desta
maneira encontradas em produtos secretados/excretados pelo parasita; ou (2) expressas na
superfície do parasita como proteínas transmembranas ou com âncoras de GPI. As proteínas
secretadas e de superfície podem ser consideradas chaves para a evolução e manutenção do
modo de vida parasitário através de sua interação molecular com células e moléculas do
hospedeiro. Peptídeos sinais são encontrados em proteínas secretadas e proteínas de superfície
de membrana tipo I. Nos eucariotos, a exportação das proteínas é iniciada no retículo
endoplasmático, a partir de onde elas são direcionadas para uma via secretória. Os peptídeos
sinais são estruturalmente caracterizados por uma região N-terminal carregada positivamente,
um centro hidrofóbico, e uma porção C-terminal polar; durante o processo de exportação, o
peptídeo sinal é clivado por uma peptidase. Desta forma, a presença de um peptídeo sinal pode
ser utilizada para se inferir a provável localização de uma proteína como secretada ou exposta
na superfície. Esta análise em procariotos é direta. Entretanto, no caso do esquistossoma a
situação é mais complexa, já que este parasita possui tecidos diferenciados em órgãos
rudimentares como tubo digestivo (“gut”), sistema nervoso, sistema excretor e musculatura.
Esta diversidade de tecidos dificultou a análise do transcriptoma, uma vez que moléculas
preditas como expostas na superfície celular, secretadas ou de adesão, não necessariamente
estariam voltadas para o meio externo, já que podem estar atuando na comunicação
(sinalização) entre diferentes tecidos (“órgãos”) do verme. Não poderíamos saber, por
exemplo, se a proteína Beta-integrina 2 (Tabela 6) estaria atuando de modo similar à proteína
expressa na superfície de leucócitos, voltada para o meio externo do parasita, compondo um
mecanismo de evasão imune, ou se estaria agindo na adesão célula-célula voltada para o
interior do Esquistossoma.
A melhor estratégia para investigar estas questões seria através de ensaios de
imunohistoquímica, onde anticorpos produzidos contra a proteína de interesse são utilizados
____________________________________________________________________Discussão
124
para localizar a proteína no(s) tecido(s) onde esta é expressa ou desempenha sua função.
Entretanto, esta abordagem como passo inicial do projeto seria extremamente laboriosa e
demorada devido ao grande número de candidatos vacinais a serem testados e dada à
dificuldade de obtenção das proteínas recombinantes. Em média apenas 50% destas é expressa
com êxito, sem citar a dificuldade de purificação na conformação adequada (Pizza et al., 2000;
Nascimento et al., 2004).
Visando contornar parcialmente o problema da localização das proteínas, tentamos
explorar os bancos de proteomas de Esquistossoma disponíveis, que apesar de não
apresentarem uma amostragem tão abrangente como o Transcriptoma (por limitação das
técnicas de detecção das proteínas em géis de uma e duas dimensões), permitem uma
localização indireta das proteínas. Por exemplo, podem ser identificadas proteínas presentes ou
exclusivas do tegumento de vermes adultos; proteínas secretadas por cercárias,
esquistossômulos ou ovos; e ainda proteínas expostas na superfície de vermes adultos.
5.2. Projeto Piloto
A principal limitação para análise e utilização direta das seqüências contidas no banco
de dados, na primeira fase do projeto, foi fruto da própria técnica de ORESTES utilizada para
geração dos cDNAs e posterior seqüenciamento. Esta estratégia tende a amostrar
preferencialmente a região central dos mRNAs (Dias-Neto et al., 2000), o que pode ser
considerado uma vantagem, já que eliminamos as regiões 5´ e 3´ não traduzidas. No entanto,
para a obtenção dos genes completos, esta estratégia foi pouco vantajosa, uma vez que tivemos
que estender por “Race” as porções 5’ e 3’ para muitos dos SmAEs selecionados, devido ao
tamanho reduzido dos fragmentos de ORESTES amplificados.
Nesta etapa do projeto foram clonados nove genes e a capacidade de expressão
(transcricional) de cinco desses vetores construídos foi validada através da transfecção de
células BHK e ensaios de RT-PCR. Esse conjunto de investigações indicou a viabilidade da
utilização destes vetores como vacina de DNA. Durante as clonagens desta etapa do projeto
encontramos alguns problemas na utilização do sistema Gateway, sendo o principal deles a
perda de atividade da enzima responsável pela recombinação dos fragmentos para os vetores de
destino pDEST12.2 e pDEST17. Visando testar uma estratégia alternativa de clonagem,
utilizamos também o plasmídeo pTARGET. Nossos resultados demonstram que os vetores
pDEST12.2 e pTARGET são expressos em células de mamíferos (transcricionalmente) para as
construções testadas. A análise comparativa dos níveis de proteção induzidas pela imunização
com os plasmídeos pTARGET e pDEST12.2 contendo o gene do antígeno Sm23, demonstrou
que estes seriam semelhantes.
Alguns dos vetores de DNA utilizados nos experimentos de imunização foram
avaliados quanto a capacidade de indução de resposta imune humoral por Western blot e os
resultados demonstram que não foi possível detectar no soro dos animais imunizados,
____________________________________________________________________Discussão
125
anticorpos específicos contra proteínas do extrato de vermes adultos (dados não apresentados).
Iniciamos nossos ensaios para detecção de anticorpos no soro a uma diluição de 1:500,
passando em seguida a utilizar 1:250; como nesta diluição já notamos o aparecimento de
bandas inespecíficas, não realizamos ensaios com soros mais concentrados. Entretanto, em
uma consulta minuciosa à literatura verificamos em diversos, trabalhos a utilização de soros
mais concentrados para detecção em ensaios de Western blot. Waine (1999), por exemplo,
utilizou soros de animais imunizados com Gene Gun ou pela via intramuscular a uma diluição
de 1:20 para detectar o antígeno Sj22 (S. japonicum 22 kDa) em extratos do verme. Em um
outro trabalho, este mesmo autor analisou diluições de até (1:10) para confirmar a ausência de
anticorpos induzidos contra diferentes antígenos expressos na forma de vacinas de DNA
(Waine et al., 1997). Zhou (2000) utilizou soros de animais imunizados via intramuscular com
uma diluição de 1:50 para detectar anticorpos contra o antígeno paramiosina em extratos de
vermes adultos. Anticorpos específicos também foram detectados somente em diluições de
soro (1:100), contra proteínas recombinantes (Yang et al., 2001) e contra extratos do verme
(Zhang et al., 2001). Baseado nestas informações realizamos novos ensaios com diluições de
soro menores (1:100, 1:50 e 1:20), entretanto, mesmo assim, não conseguimos detectar a
presença de anticorpos específicos nos grupos vacinados. É possível que os genes selecionados
sejam pouco expressos em vermes adultos, sendo difícil a detecção destas proteínas nestes
extratos.
Em uma tentativa de tornar nosso método de detecção de anticorpos mais sensível,
clonamos os diferentes genes selecionados no vetor de expressão de E. coli pDEST17. Foi
possível obter a expressão das proteínas recombinantes dos antígenos HSP70, LIN-7, Hip1,
Sm23L (alça hidrofílica) e Catepsina L (Figura 17). Purificações parciais da proteína
recombinante Dineína cadeia leve, gentilmente cedidas pela mestranda Márcia de Oliveira
Rocha de nossos laboratórios, foram incluídas nestes ensaios. Nessas condições, foi possível
detectar através de ELISA anticorpos específicos apenas no soro dos animais imunizados com
vacina de DNA expressando o gene Sm23 (Figura 18). É importante salientar que a maioria
destes antígenos não se demonstrou protetor (HSP70, Hip1, Cat e Dlc), e como não validamos
a atividade transcricional de todas estas vacinas, não sabemos se algumas destas estão
realmente sendo expressas. Evidentemente, nos grupos em que se observou uma certa proteção,
não podemos descartar que o braço da resposta celular esteja atuando nestes animais.
Entretanto, não dispúnhamos das proteínas recombinantes purificadas para a realização de
ensaios que avaliassem esse tipo de resposta, neste momento do projeto.
Analisamos também a imunogenicidade das proteínas expressas em E. coli frente ao
soro de animais imunizados com cercárias irradiadas; nas condições analisadas, as proteínas
HSP70, Catepsina, Dineína cadeia leve, LIN-7 e Hipotética 1 não foram reconhecidas por
anticorpos presentes no soro de animais imunizados 3 vezes com 200 cercárias atenuadas (20
Krad de raios gama) (dados não apresentados). Evidentemente não esperávamos que todas as
proteínas analisadas fossem imunogênicas, porém, baseados em dados da literatura, prevíamos
____________________________________________________________________Discussão
126
a detecção de uma resposta positiva para LIN-7 e HSP70. A primeira por ser reconhecida pelo
soro de animais imunizados com proteínas secretadas de esquistossômulos (Harrop et al.,
1999). E a segunda, tanto por sua abundância e alta imunogenicidade (Scott et al., 1999),
quanto por sua expressão diferencial no estágio de esquistossômulo (dados não apresentados).
Esperávamos ainda uma resposta positiva para CII3, entretanto, não foi possível testá-la pois,
não possuíamos a proteína recombinante de E.coli.
Além da natureza do antígeno utilizado, múltiplos fatores influenciam o perfil da
resposta imune induzida pelas vacinas de DNA, incluindo adição de diferentes adjuvantes e
vias de imunização, portanto, comparamos imunizações por Gene Gun (intradérmica) com
imunizações intramusculares. Tipicamente, injeções intramusculares induzem uma resposta de
anticorpos polarizada para Th1 com indução de níveis elevados de IgG2a, ao passo que o DNA
aplicado usando o Gene Gun produz predominantemente IgG1, caracterizando uma resposta
mais polarizada para Th2 (Da´dara et al., 2002 a e b). Conforme os resultados apresentados,
observamos este perfil de resposta imune, pelo menos para o antígeno Sm23.
Comparando os níveis de redução de carga parasitária nos grupos imunizados pelas vias
Intradérmica e Intramuscular, observamos que para alguns antígenos como CII-3 e LIN-7, a
imunização intradérmica foi mais efetiva, já para STT a redução foi comparável nas duas vias.
Isto está de acordo com os dados da literatura em que cada antígeno requer a indução de um
determinado tipo de resposta imune para apresentar nível de proteção máximo, sendo esta
resposta influenciada ou determinada pela forma de imunização (Haddad et al., 2004).
O modelo experimental murino de desafio foi avaliado sob diferentes aspectos. Em
relação à linhagem de camundongo utilizada, fizemos um levantamento na literatura e
percebemos que a maioria dos trabalhos realizados como o modelo murino de S. mansoni
utiliza a linhagem C57BL/6. Alguns autores chegaram inclusive a fazer experimentos
comparativos, descrevendo que o "background" genético de diferentes linhagens de
camundongos tem aparentemente um efeito na eficiência da imunidade. Zhou e colaboradores
(2000), apresentam resultados que apontam para um efeito protetor do antígeno paramiosina
(97 kDa) em camundongos da linhagem C57BL/6, e não protetor na linhagem BALB/c. Além
disso, a maioria dos estudos realizados com vacinas de DNA utilizam a linhagem C57Bl/6,
portanto nossos ensaios foram realizados principalmente com esta linhagem.
Observando o primeiro ensaio de imunização do projeto piloto (Figura 15), notamos
uma tendência de redução da carga parasitária nos grupos Sm23, LIN7 + CII-3, STT + Hip1 e
Todos Antígenos, sendo que o grupo STT + Hip1 apresenta um valor de (p) muito próximo da
significância (0,057). A análise do gráfico de dispersão mostra que este grupo (STT + Hip1) é
o que apresenta menor dispersão dos dados e por conseqüência menor variância em
comparação com os demais tratamentos.
O que podemos questionar a partir destas análises e através de comparações com dados
da literatura, é se não observamos diferenças estatísticas, porque nossos antígenos não foram
realmente protetores, ou pela elevada dispersão dos dados.
____________________________________________________________________Discussão
127
Chama a atenção que o grupo controle positivo Sm23, apresenta um valor de redução
da carga parasitária semelhante ao descrito na literatura, porém sem significância estatística.
Um dos fatores que poderiam estar gerando este aumento da variância seria o método de
desafio. Sabe-se que o modelo de desafio experimental para Schistosoma mansoni é permeado
de muitas variáveis no desafio, perfusão e contagem do número de vermes, o que faz com que
os dados obtidos ao final do experimento apresentem uma variação muito grande. Portanto,
todas as medidas possíveis foram tomadas para minimizar as variações experimentais, de modo
que as cercárias foram contadas por um único experimentador e todas as injeções subcutâneas
foram aplicadas por um segundo experimentador. O mesmo critério foi adotado para as
perfusões, inspeção, coleta, e contagem do número de vermes.
Mesmo assim, ao observarmos os grupos salina ou naive desafiados (Figuras 15 e 16),
nota-se uma variação muito grande no número de vermes recuperados. Segundo o Dr. Alan
Wilson e a Dra. Patrícia Coulson, esta variação poderia ocorrer devido à via pela qual
estávamos desafiando os animais (injeção subcutânea), e o método de perfusão utilizado
(animais sacrificados por inalação de CO
2
e perfusão a partir do coração). A contagem e
injeção subcutânea das cercárias poderia ser uma etapa de aumento de variabilidade e
conseqüente aumento de dispersão dos resultados. Uma vez que, no processo de contagem
pode ocorrer um dano físico às cercárias, tornando-as menos viáveis, e levando a uma menor
recuperação de vermes em todos os grupos experimentais, justificando a dificuldade de se
observar o efeito protetor de um dado grupo. Adicionalmente, o experimentador não injeta
todos os animais da mesma forma, existe uma variação na força empregada sobre o embolo da
seringa, que se reflete em uma variação de pressão a qual as cercárias são submetidas ao serem
forçadas a passar pelo buraco da agulha, além dos sítios de injeção poderem extravasar um
pouco do conteúdo injetado. Desta forma, a melhor opção seria realizar o desafio através da
penetração pela pele ou pela cauda, sendo as cercárias contadas por estimativa (Coulson &
Wilson, comunicação pessoal).
Ainda com relação ao desafio através da penetração pela pele, deve-se ressaltar que
desta maneira, estaríamos repetindo no modelo murino o processo de infecção natural. Neste
sentido cabe aqui uma pequena discussão sobre os dados da literatura descrevendo o efeito
protetor de diferentes candidatos vacinais contra a esquistossomose. Vários autores (Jankovic
et al., 1996; Hota-Mitchell et al., 1999; Ramos et al., 2003, entre outros) avaliam o efeito
protetor de suas vacinas desafiando os animais através da injeção subcutânea ou intraperitonial
do parasita. Entretanto, esta forma de desafio beneficia o hospedeiro em detrimento do
parasita, isto porque quando as cercárias são injetadas subcutaneamente o experimentador não
permite uma etapa de maturação do parasita, que ocorre quando este atravessa as camadas da
epiderme e da derme (Wilson, 2005, comunicação pessoal). A pele é uma barreira importante
para a migração do parasita e para o hospedeiro, sendo a primeira oportunidade de
reconhecimento do parasita pelo sistema imune. Mais de 90% das larvas de S. mansoni deixam
a pele dos camundongos dentro dos primeiros 5 a 7 dias; resultados semelhantes foram obtidas
____________________________________________________________________Discussão
128
usando um modelo de infecção em babuínos. Apenas alguns poucos parasitas deixam a pele
dentro dos dois primeiros dias após a infecção em ambos os hospedeiros. Aparentemente o
grande obstáculo para a migração do parasita é a membrana basal, onde algumas larvas
permanecem por até 48 horas antes de passar para a derme.
Durante esta fase, uma série de modificações deve ocorrer, permitindo que os
esquistossômulos invadam posteriormente de modo eficiente um vaso sanguíneo ou um
linfonodo. Por exemplo, a remoção do glicocálice durante a penetração é imperativa para
limitar o dano às membranas superficiais do parasita, uma vez que isto pode iniciar a ativação
da complemento pela via alternativa; durante a penetração, a cauda é também liberada entrando
apenas a porção final da cabeça na pele do hospedeiro. A Figura 64 apresenta um corte
histológico (secção transversal) da pele de um camundongo, mostrando um esquistossômulo
após 48 horas de exposição deste tecido às cercárias.
Figura 64 – (A) Secção transversal da pele (orelha) de camundongo 48 horas após a penetração do parasita,
mostrando um esquistossômulo na epiderme. Escala da barra = 50 µm. Abreviações: CC – cartilagem central; E –
epiderme; D – derme; SC – extrato córneo. Extraído e modificado de Mountford & Trottein (2004). (B)
Representação esquemática da pele humana, mostrando as regiões da epiderme, derme e subcutânea.
Com relação ao método de perfusão utilizado, as fontes de variabilidade residiriam na
utilização de animais sacrificados, os quais no momento da perfusão estariam com a pressão
(A)
(B)
____________________________________________________________________Discussão
129
arterial mundo baixa, permitindo que vermes ficassem presos nas vênulas do mesentério. Um
outro ponto crítico seria realizar a perfusão a partir do coração, uma vez que nem sempre a
agulha penetra corretamente no ventrículo esquerdo, ocasionando uma variação de pressão no
fluxo empregado no sistema circulatório do animal para a remoção dos vermes. Possíveis
soluções para estes problemas seriam iniciar as perfusões com o animal anestesiado, porém
ainda vivo e utilizar como sítio de bombeamento de salina, a artéria aorta e não o coração
(Coulson & Wilson, comunicação pessoal). Segundo estes pesquisadores, com estas
modificações deveríamos obter resultados muito mais homogêneos.
Pelo discutido anteriormente, fica claro que o projeto piloto foi de fundamental
importância para definirmos um série de parâmetros para a segunda fase do projeto.
5.3. Transcriptoma
5.3.1. Seleção de candidatos por GO.
Uma estratégia possível para mineração de novas seqüências de um organismo é sua
categorização por Ontologia de Genes (GO). Este sistema de categorização foi criado na
tentativa de gerar uma descrição consistente dos produtos gênicos em diferentes bancos de
dados. Desta maneira, um pesquisador interessado em alvos vacinais contra um parasita
helminto especifico, por exemplo, pode realizar buscas com palavras chave usando as
informações de GO para localizar seqüências de genes/proteínas anotadas que apresentem
funções ou localizações putativas de seu interesse. Utilizando esta abordagem foram
selecionadas três toxinas, duas proteínas de adesão de superfície celular, duas proteínas de
membrana expostas na superfície, cinco receptores para fatores do hospedeiro e cinco enzimas
expostas na superfície (Tabela 6), todas estas funções putativas e inferidas com base na sua
categorização por GO, que é atribuída a partir do grau de similaridade com proteínas já
descritas.
Após as clonagens dos genes/fragmentos gênicos e construções das vacinas de DNA,
validamos a atividade transcricional de oito destas vacinas através da transfecção de células de
mamíferos em cultura, seguida da extração do mRNA e amplificação dos respectivos cDNAs
por RT-PCR (Figura 20). A capacidade das vacinas de DNA em promover uma redução da
carga parasitária foi avaliada para 22 antígenos selecionados, através da imunização de
camundongos seguida de desafio experimental com cercárias. Estes experimentos revelaram
dentro desta categoria, os antígenos: Antígeno 5, Estomatina, rVLDL e Apirase, como os mais
promissores, e confirmaram o efeito protetor de Lin-7 (Figura 21).
5.3.2. Antígeno 5
No caso do Antígeno 5, é interessante notar que, utilizando uma estratégia
completamente diferente, acabamos chegando a uma proteína similar à ASP-2 selecionada pelo
____________________________________________________________________Discussão
130
grupo do Dr. Peter Hotez (“The George Washington University”), como candidato líder a uma
vacina contra outro helminto, o Necator americanus (responsável pelo “Amarelão” ou
“Hookworm”).
A liberação desta proteína (ASP-2) em Necator acontece durante a mudança do estágio
de vida livre para o parasitário (L3), sugerindo que a ASP-2 tenha alguma função no processo
infeccioso e desta maneira tenha um papel chave no estabelecimento do parasitismo. A ASP-2
foi a primeira vacina recombinante a apresentar níveis de proteção similares à vacina de larvas
irradiadas (irL3) contra “Hookworm”. Estes resultados, além de extremamente encorajadores
no desenvolvimento de uma vacina contra Necator, nos fez questionar se não seria possível
atingirmos tais níveis de proteção com o Antígeno 5 para esquistossomose.
Estudos cristalográficos da proteína ASP-2 mostram uma similaridade estrutural e de
cargas com quimiocinas, o que sugere que a proteína possa ser um ligante extracelular para um
receptor desconhecido, talvez explicando seu potencial como imunomodulador. Os autores
ainda discutem uma possível função de protease para a ASP-2 (Asojo et al., 2005).
Em função dos resultados da proteína ASP-2 em hamsters e do seu ortólogo Hc24 em
ovelhas, a ASP-2 foi produzida em uma planta piloto para manufatura em condições de boas
práticas (GMP – “Good Manufacturing Practices”). Foi realizado um ensaio clínico de fase 1,
utilizando a proteína ASP-2 como candidato vacinal líder, e esta se mostrou não tóxica e
imunogênica em humanos voluntários (Peter Hotez, comunicação pessoal).
Apesar da distância evolutiva entre o Schistosoma mansoni (Platelminte) e Necator
americanus (Nematoda), existem algumas similaridades entre estes helmintos, quando
comparamos seus ciclos de vida. Ambas as espécies infectam seus hospedeiro definitivos
através da penetração da pele por uma forma larval; após a entrada no hospedeiro, as larvas
entram no sistema circulatório, sendo carregadas para o coração e depois para os pulmões.
Uma vez nos pulmões, as larvas de Necator, ao contrário dos esquistossômulos, são muito
grandes para passar através da rede de capilares, ficando aprisionadas e depois sendo expulsas
do epitélio capilar, passando assim para o espaço aéreo no interior dos pulmões. Em seguida,
estas larvas migram pelos brônquios, traquéia e faringe, e são engolidas. Uma vez engolias, as
larvas se fixam à parede do intestino através de um aparelho bucal, pelo qual o verme adquire
seus nutrientes a partir do sangue. Os vermes jovens se desenvolvem em vermes adultos que
cruzam e começam a produzir os ovos, os quais são eliminados com as fezes.
No caso da vacina com a proteína ASP-2 de N. americanus o mecanismo protetor deve
operar em algum ponto entre a penetração da pele e a chegada dos parasitas aos pulmões,
mesmo trajeto em que se atribui atuar o mecanismo protetor da vacina de cercária atenuada
contra S. mansoni. Apesar das diferenças entre os parasitas, acreditamos que algumas
particularidades do ciclo de vida e o mecanismo protetor proposto para a proteína ASP-2 deve
ser olhado com cuidado, o que pode ser útil para uma melhor compreensão e delineamento das
próxima etapas de caracterização do Antígeno 5 de S. mansoni.
____________________________________________________________________Discussão
131
Apesar de não termos encontrado a proteína Antígeno 5 nos bancos de proteínas
secretadas (Tabela 13), acreditamos que a detecção de uma proteína muito similar (secretada
por esquistossômulos) pode ser um indicativo de que a proteína Antígeno 5 também seja
secretada. Deve-se ressaltar, que a análise por proteoma encontra como fator limitador a
separação e detecção inicial das proteínas presentes nas amostras através de géis de uma ou
duas dimensões. Desta forma, existe a possibilidade do Antígeno 5 estar presente nas secreções
de cercárias ou esquistossômulos, porém não ter sido detectado nas análises de proteoma. O
efeito protetor observado com a vacina de DNA expressando este antígeno reforça esta
possibilidade.
Um ponto crítico na seleção do “cluster” a ser amplificado e utilizado como antígeno
vacinal, era o número de genes diferentes contendo domínios SCP (“Sperm coating protein”)
amostrados pelo transcriptoma, na época quatro, sendo dois “clusters” e dois “singlets”. Nossa
escolha se baseou na confiabilidade da montagem do “cluster”, isto é, utilizando apenas os
dados do Transcriptoma, o agrupamento SmAE 607733 era o mais consistente (dados não
apresentados), apesar de apresentar transcritos apenas nos estágios de ovo e miracídio. De fato,
as análises posteriores no banco genômico “Gene DB”, que agrupa seqüências do
transcriptoma com as do genoma, revelaram uma diversidade muito grande de genes com
domínios SCP (Tabela 14). Um destes genes particularmente interessante, SmAE 12775,
descrito por apresentar expressão aumentada em esquistossômulos por análises de
microarranjos (Dillon et al., 2006), está sendo investigado pela aluna de doutorado Cibele
Tararam em nossos laboratórios.
A presença do peptídeo sinal em apenas quatro dos treze genes encontrados e a
detecção de uma destas proteínas em secreções de esquistossômulos, reforça a hipótese que
estas seriam as proteínas com maior similaridade funcional ao candidato vacinal ASP-2 de
Necator americanus, devendo ser melhor investigadas como alvos vacinais.
Um dos obstáculos que tivemos que superar para dar continuidade à caracterização
deste antígeno, foi a obtenção da proteína recombinante Antígeno 5. A dificuldade de se
expressar proteínas recombinantes pertencentes à família das SCP está bem descrita na
literatura, principalmente devido ao seu alto conteúdo de cisteínas, que causa, desde um
enovelamento incorreto, até formação aberrante de pontes disulfeto (Goud et al., 2005). A
proteína ASP-2, por exemplo, contem 11 cisteínas, ao passo que o Antígeno 5 apresenta 9
cisteínas. De fato, encontramos uma grande dificuldade em expressar a proteína Antígeno 5 em
E. coli, sendo esta detectada apenas em ensaios de Western blot (dados não apresentados). Em
função desta dificuldade passamos a utilizar o sistema de Pichia pastoris, que se demonstrou
mais eficiente que o de E. coli, porém acreditamos que algumas otimizações ainda serão
necessárias. O maior problema encontrado com este sistema foi que o peptídeo sinal não foi
processado pela levedura, e portanto, a proteína não foi exportada para o meio de cultura. A
proteína foi expressa intracelularmente na forma de corpúsculos de inclusão (Figuras 30 e
31A). Ainda não temos dados sobre a viabilidade e eficiência do renovelamento da proteína
____________________________________________________________________Discussão
132
Antígeno 5 purificada na forma denaturada (Figura 32), entretanto acreditamos que novos
esforços devem ser realizados para a obtenção da proteína expressa de forma solúvel.
Dados da literatura sobre a expressão da proteína ASP-1 de Necator americanus em
Pichia pastoris, indicam que os clones com um única cópia do cassete de expressão são
capazes de secretar a proteína para fora célula. Ao passo que, aumentando o número de cópias
do cassete de expressão parece haver uma saturação da capacidade secretória da levedura,
diminuindo a quantidade de proteína secretada em clones com múltiplas cópias. A solução
encontrada por estes pesquisadores para contornar este problema, foi co-expressar uma
disulfeto isomerase, também em alto número de cópias, aumentando assim a quantidade de
proteína secretada pelos clones multicópias (Inan et al., 2006).
No caso do Antígeno 5, avaliamos apenas os clones possivelmente contendo múltiplas
cópias, selecionados pela capacidade de crescer em concentrações de 1000-2000 µg/mL de
Zeocina; como não realizamos ensaios de Southern blot, podemos apenas supor que estes
clones eram multicópias. De qualquer modo, seria interessante investigar se clones
selecionados em apenas 100 µg/mL de Zeocina, ou caracterizados por Southern blot como
cópia única, seriam capazes de secretar a proteína Antígeno 5.
Com relação ao mecanismo protetor elicitado pela vacina de DNA apresentada na
forma de microesferas, nossos resultados são bastante preliminares e, de fato, só podemos
descartar o envolvimento de anticorpos (IgG total) anti-Antígeno 5, restando analisar o
envolvimento do braço de resposta celular. Adicionalmente, como a proteína apresenta
similaridade com proteínas alergênicas, talvez o envolvimento de anticorpos da classe IgE
mereça ser investigado.
5.3.3. Estomatina
A segunda molécula, selecionada por categoria de GO que demonstrou um efeito na
redução da carga parasitária, foi a Estomatina. Esta proteína adquiriu este nome na literatura
por causa da aparente associação da proteína da banda 7 de eritrócitos com a doença
estomatocitose, caracterizada pelo aumento da permeabilidade de cátions monovalentes em
células vermelhas do sangue. Entretanto, apesar de seu nome, a estomatina não está
relacionada a estomatocitose. Embora, múltiplos ortólogos da estomatina tenham sido
identificados e associados à regulação de canais iônicos em Caenorhabditis elegans,
a função
precisa da estomatina permanece desconhecida (Hiller et al., 2003).
Inicialmente, esta proteína foi investigada mais como um alvo para ação de drogas, do
que propriamente como um candidato vacinal. Este racional se baseou nos trabalhos que
descrevem a interação desta proteína com drogas antimaláricas, que seriam transferidas ao
parasita intracelular por uma via usada para a aquisição de fosfolipídios exógenos (Foley et al.,
1997).
____________________________________________________________________Discussão
133
Durante a caracterização deste antígeno, a purificação da proteína recombinante solúvel
foi fundamental na avaliação da resposta imune induzida pela vacina de DNA pTARGET-
Estomatina. E adicionalmente, permitiu a produção de anticorpos anti-Estomatina, utilizados
na localização imunohistoquímica da proteína no parasita.
Existe um consenso de que linfócitos Th1 são importantes na imunidade protetora
contra a infecção pelo esquistossoma em camundongos. Trabalhos anteriores demonstraram
que camundongos imunizados com cercárias atenuadas (por raios gama) apresentam uma
redução na carga parasitária de 60 – 80 %. Várias linhas de evidência apontam para respostas
envolvendo células efetoras ativadas por IFN-γ, como o principal mecanismo protetor
mediado pelas cercárias atenuadas (Zhang et al., 2001). Embora o mecanismo efetor
antiparasitário operando no pólo Th1 seja muito discutido, existem fortes evidências de que os
macrófagos e / ou as células endoteliais ativadas por IFN-γ e TNF-α tenham um papel central
(Wynn et al., 2000).
Com relação à resposta imune induzida pela vacina de DNA-Estomatina, responsável
pela redução da carga parasitária após o desafio, não foi possível detectar uma resposta
humoral. Nossos resultados indicam que a imunização com a vacina de DNA-Estomatina induz
uma resposta celular caracterizada pela produção de IFN-γ por linfócitos T, quando estes são
estimulados in vitro pela proteína rEstomatina (Figura 36). Acreditamos que esta estimulação
também ocorra no momento do desafio experimental dos camundongos imunizados com a
vacina de DNA, sendo o estímulo realizado pela proteína Estomatina do parasita. Caso este
seja o mecanismo protetor, a proteína deve estar ou ficar acessível ao sistema imune em algum
momento durante a invasão do hospedeiro.
Os resultados mostrando a localização da proteína no tegumento de vermes adultos
(Figuras 39 e 40), sugerem que a proteína possa estar acessível ao sistema imune do
hospedeiro, principalmente se levarmos em consideração que o tegumento apresenta um tempo
de meia vida in vivo de cinco dias, sendo constantemente reciclado. Adicionalmente, a
detecção da proteína na fração “insolúvel” de esquistossômulos com 10 dias (Figura 38),
levanta a questão de como seria o padrão de distribuição desta proteína nos tecidos deste
estágio.
Tomando emprestado o modelo de imunidade proposto para a Paramiosina,
acreditamos que um mecanismo parecido possa estar ocorrendo. A Paramiosina, por exemplo,
uma proteína miofibrilar de 97 kDa, aparece localizada em regiões logo abaixo do tegumento e
do sincício do tubo digestivo de vermes adultos de S. mansoni. A imunização com a proteína
Paramiosina induz a produção de IFN-γ e ativação de macrófagos. Neste modelo de vacinação,
tem sido postulado que a paramiosina induz uma resposta imune em animais vacinados como
um resultado de sua liberação das larvas que estão migrando após o desafio. Considerando o
conceito de vacinação baseado na imunidade celular Th1, é importante perceber que
macrófagos ativados efetores não precisam reconhecer os antígenos na superfície dos parasitas.
____________________________________________________________________Discussão
134
Ao contrário, IFN-γ produzido localmente por linfócitos T em respostas aos antígenos
liberados pelos parasitas poderiam estimular macrófagos citotóxicos não específicos através da
liberação de óxido nítrico ou outras moléculas efetoras (Dunne & Mountford, 2001).
5.3.4. Dife5
Uma outra estratégia para selecionar potenciais alvos vacinais foi avaliar, com base nos
dados do transcriptoma, genes com “expressão aumentada” no estágio de esquistossômulo. A
idéia era procurar genes que pudessem estar envolvidos com a adaptação e sobrevivência do
parasita no hospedeiro mamífero, principalmente na transição de cercárias para
esquistossômulos.
Este racional baseou-se nas informações de que o estágio pulmonar parece ser o
principal alvo de ataque do sistema imune em camundongos C57BL/6 imunizados uma vez
com a vacina de cercárias irradiadas. Adicionalmente, o envolvimento de linfócitos T-CD4
+
nas respostas efetoras do pulmão, indicam que os antígenos do parasita devem ser secretados
ou expostos (S/E) na superfície para serem processados por células acessórias e serem
apresentados ao complexo de histocompatibilidade de classe II. Apesar da dificuldade em
definir os antígenos S/E dos esquistossômulos pulmonares, é razoável imaginar que eles serão
o produto de genes altamente expressos neste estágio (Dillon et al., 2006).
Um outro trabalho da literatura nos encorajou a testar esta estratégia. Em 2002,
Almeida et al., realizaram um estudo com Leishmania major, onde 1.094 genes únicos, dos
quais 70% com função desconhecida, foram avaliadas por expressão diferencial (através de
Microarranjos), comparando-se os estágios de promastigota (hospedeiro-inseto) e amastigota
(hospeiro-homem). Foram encontrados 147 genes com expressão aumentada em amastigota, os
quais foram avaliados em “pools” (grupos) como vacina de DNA. Os dados demonstraram que
a estratégia de “pools” pode funcionar para identificar novas vacinas protetoras, porém também
foi demonstrado que antígenos potencialmente protetores são mascarados pela presença de
antígenos no “pool” que exacerbam a doença. Um total de 100 novos candidatos vacinais
contra Leishmania estariam no momento sendo testados separadamente e em “pools” para
aperfeiçoar as análises anteriores.
Dentre os genes selecionados com expressão aumentada em esquistossômulos, o
antígeno Dife5 apresentado na forma de vacina de DNA, foi capaz de reduzir a carga
parasitária após o desafio em camundongos imunizados. Uma possível explicação para esta
redução seria o envolvimento deste gene na inibição da cascata do complemento. Durante a
penetração do parasita no hospedeiro mamífero e logo após esta, a larva (cercária) passa de
uma condição sensível à morte mediada pelo complemento para uma condição resistente
(esquistossômulos com 3 horas) (Deng et al., 2003). O gene Dife5 foi inicialmente selecionado
por ter sua expressão aumentada na transição do estágio de cercária para esquistossômulo,
justamente no momento em que a larva do verme passa, de uma condição de sensibilidade, à
____________________________________________________________________Discussão
135
resistência ao ataque do complemento; a similaridade deste gene com a proteína CD59 e seu
potencial papel na inibição da cascata do complemento merece ser melhor investigada.
Até o momento, existem duas menções na literatura sobre proteínas do Esquistossoma
que poderiam desempenhar uma função similar a proteína CD59. Uma delas é a Paramiosina
(Deng et al., 2003) e a outra foi descrita no trabalho de Van Balkom (2005), porém o
alinhamento linear destas duas proteínas com a proteína CD59 de humanos apresenta uma
menor similaridade, do que o alinhamento da proteína Dife5 com esta mesma proteína (dados
não apresentados).
A seqüência linear de aminoácidos sugere fortemente que esta seja uma proteína de
superfície (Figura 42), evidenciado pela presença de um peptídeo sinal N-terminal, de um sítio
para ancora de GPI e de um domínio transmembrana na região C-terminal. A obtenção da
proteína recombinante solúvel (Figura 44D) será novamente de fundamental importância, tanto
para a produção de anticorpos visando ensaios de imunolocalização em esquistossômulos e
vermes adultos, quanto para a caracterização da resposta imune elicitada pela vacina de DNA
e/ou proteína recombinante. Com relação a este último tópico só podemos antecipar que não
detectamos anticorpos anti-Dife5 no soro dos animais imunizados com a vacina de DNA, e que
a resposta imune celular será caracterizada em futuro próximo.
5.3.5. Enzimas envolvidas no Metabolismo de Nucleotídeos
Durante a comparação dos candidatos vacinais selecionados através do Transcriptoma
com as proteínas caracterizadas como mais expostas na superfície de vermes adultos por
estudos de Proteoma (Braschi et al., 2005b), a existência de três enzimas envolvidas no
metabolismo de nucleotídeos nos chamou a atenção. Levantamos a hipótese de que estas
enzimas, Apirase (ATP-difosfohidrolase), Fosfatase Alcalina e a Fosfodiesterase, possam
desempenhar um papel importante para a sobrevivência do parasita. Com base neste racional,
foi idealizado, em colaboração com os Drs. Alan Wilson e Sérgio Verjovski, um ensaio
visando testar o efeito protetor destas três enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos
isoladamente e em combinação. Como estas proteínas estão entre as mais expostas na
superfície do tegumento, nós acreditamos que os anticorpos pudessem se ligar a superfície dos
vermes adultos (talvez esquistossômulos), aonde ocorreria a opsonização do parasita para
ataque posterior pelo complemento e/ou por um mecanismo de citotoxidade celular dependente
de anticorpos.
Para tanto, tentamos expressar as proteínas Fosfatase Alcalina e Fosfodiesterase em
E.coli, porém, como não conseguimos obter as proteínas purificadas de forma solúvel,
passamos a utilizar o sistema de expressão secretor de Pichia pastoris. Porém, neste sistema
também não foi possível obter as proteínas recombinantes. Uma explicação para isso pode
residir na diferença da abundância de t-RNAs para os códons utilizados pela levedura e pelo
Esquistossoma. Como um exemplo desta dificuldade, a expressão do gene L1 de HPV só foi
____________________________________________________________________Discussão
136
possível com a utilização de um gene sintético com o códon otimizado para Pichia pastoris
(Silvia Bazan, comunicação pessoal 2006). Se tomarmos este gene como comparativo, vemos
que o gene L1 nativo apresentava 19,7 % de a.a. codificados por códons raros e 2,7 % de a.a.
codificados por códons muito raros. Ao passo que o gene da Fosfodiesterase apresenta 24,3 %
a.a. codificados por códons raros e 4,0 % de a.a. codificados por códons muito raros. Podemos
utilizar estas porcentagens para afirmar, de uma maneira indireta, que o gene da
Fosfodiesterase teria uma menor chance de ser expresso quando comparado com o gene L1
nativo, que por sua vez não é expresso neste sistema sem a otimização dos códons. O gene da
Fosfatase Alcalina, que também tentamos expressar em Pichia pastoris, porém sem sucesso,
apresenta 19,2% de códons raros e 6% de códons muito raros codificados pela levedura.
Novamente, estes valores, se comparados ao gene L1 de HPV podem justificar a não obtenção
da proteína no sistema de Pichia pastoris.
Portanto, a obtenção da Fosfatase Alcalina e da Fosfodiesterase recombinantes em
quantidade suficiente e na forma nativa se mostrou não trivial, mas está sendo ativamente
perseguida por diversas abordagens. Uma vez que o laboratório do Dr. Sérgio Verjovski já
havia obtido a Apirase recombinante, foi possível avançar na avaliação deste antígeno
candidato.
5.3.5.1. Apirase
Dentre todas as moléculas selecionadas ao longo do projeto, a que mais preencheu os
requisitos de ser um antígeno vacinal promissor foi a Apirase. Além de seu potencial
envolvimento no processo de inibição da agregação plaquetária e imunomodulação, a
localização desta proteína como uma das proteínas mais expostas na superfície do verme
(Braschi et al., 2005b), e sua detecção em secreções cercariais por Knudsen (2005), reforçaram
a idéia de que ela esteja acessível ao sistema imune do hospedeiro durante a invasão e
estabelecimento do parasitismo. Adicionalmente, os estudos de Van Balkom apontam esta
proteína como exclusiva de tegumento, uma vez que ela não foi encontrada em vermes
desnudos (sem tegumento). Esta presença exclusiva no tegumento pode estar associada a uma
função essencial para a sobrevivência do parasita, uma vez que esta é a interface de contato
com o hospedeiro.
Um outro fato que nos chamou atenção com relação a proteína Apirase foi a ausência
de anticorpos contra esta proteína no soro de animais imunizados com cercárias irradiadas ou
com infecção crônica (Figura 54). Isto pode ser explicado de duas maneiras: a primeira seria
que a proteína, apesar de estar acessível ao sistema imune, é pouco imunogênica, o que
resultaria na ausência de anticorpos nos soros mencionados; uma outra hipótese seria que
apesar de poder ser marcada in vivo com biotina, de fato a proteína não está tão exposta ao
sistema imune como imaginamos, já que ela pode estar recoberta pelo membranocálice, como
no modelo proposto da Figura 22.
____________________________________________________________________Discussão
137
Segundo o postulado de Waksman, ao invés de examinarmos antígenos parasíticos com
alto potencial imunogênico, deveríamos olhar para aquelas moléculas às quais pouca ou
nenhuma resposta imune é direcionada. Esta lógica é baseada no fato de que o Esquistossoma e
muitos outros parasitas são de vida longa no hospedeiro, de forma que qualquer um de seus
antígenos que induzam uma forte resposta imune não parecem ser importantes no contexto de
vacinação, uma vez que a sobrevivência do organismo é aparentemente inafetada por esta
imunidade (Doenhoff, 1998). Trabalhando com a primeira hipótese e com o postulado de
Waksman, chegamos à conclusão que esta proteína seria do ponto de vista teórico um
excelente candidato vacinal.
De fato, a vacina de DNA-Apirase demonstrou um efeito de redução da carga
parasitária de 18 %, após o desafio com cercárias de S. mansoni. Não foi detectada a indução
de uma resposta humoral, mas uma forte resposta imune celular foi demonstrada em linfócitos
isolados de camundongos imunizados ao serem estimulados in vitro com a proteína
recombinante (Figura 53).
Em função dos resultados promissores com a vacina de DNA e um conjunto de
informações favoráveis à utilização deste antígeno, decidimos testá-lo na forma de proteína
recombinante, em colaboração com o Dr. Sérgio Verjovski.
A proteína Apirase demonstrou-se imunogênica, e nas concentrações testadas não
observamos grandes respostas inflamatórias no sítio de imunização. Existia uma certa
apreensão em utilizar esta proteína, pela sua similaridade com a proteína de camundongos
(53% de identidade) e sua potencial atividade anticoagulante.
A imunização de camundongos com a proteína recombinante Apirase induziu a
formação de anticorpos anti-Apirase, que se demonstraram efetivos em inibir a penetração das
cercárias (Figura 55). A hipótese para explicar a diferença observada, é que a presença de
anticorpos anti-Apirase poderia mediar a deposição do complemento pela via clássica na
superfície das cercárias, causando o dano ou mesmo a lise do parasita, que não conseguiria
penetrar. O problema deste ensaio é que as cercárias normalmente são sensíveis a lise mediada
pela via alternativa do complemento (independente da presença de anticorpos); podemos notar
que o soro naive já é capaz de inibir consideravelmente a penetração do parasita, o que já está
bem descrito na literatura (Samuelson & Caulfield, 1986). O principal alvo para deposição de
complemento é o glicocálice, uma superfície rica em carboidratos que é normalmente liberada
durante a penetração antes da entrada na corrente sangüínea (Knudsen et al., 2005). A função
deste glicocálice é proteger o organismo de um choque osmótico durante a fase aquática do
parasita.
De maneira que, o ensaio mais adequado seria testar a capacidade destes anticorpos em
mediar a morte in vitro de esquistossômulos (3 horas após a transformação), momento em que
o glicocálice já foi liberado, o que também está bem descrito na literatura (Arnon et al., 2000;
Deng et al., 2003; Wang et al., 2005). Adicionalmente, este ensaio reflete melhor o que ocorre
em um processo de infecção natural, uma vez que o estágio que vai encontrar os anticorpos na
____________________________________________________________________Discussão
138
corrente sanguínea é o de esquistossômulos e não o de cercárias. Como não possuíamos um
grande volume de soro anti-Apirase, estes experimentos estão sendo padronizados com soros
controles, para então testarmos o soro anti-Apirase.
Com relação aos dados dos desafios experimentais, não observamos diferenças
estatísticas significativas em nenhum dos três experimentos realizados que confirmasse um
efeito protetor da proteína Apirase. Entretanto, quando realizamos o desafio pela injeção
subcutânea das cercárias (experimento 1), observamos uma certa correlação entre o número de
vermes recuperados e o título de anticorpos por animal (Figura 56). Esta correlação não foi
observada quando mudamos a forma de desafio dos animais (experimentos 2 e 3) (dados não
apresentados). Estes dados confirmam o que foi discutido anteriormente, que a forma pela qual
os animais são desafiados tem uma grande influência no modo como o parasita e o hospedeiro
vão interagir.
Um dado que chama a atenção, é que os níveis de anticorpos (IgG total) do primeiro e
do segundo experimento são similares (Figura 57), ao passo que as razões IgG1/IgG2a
aparecem invertidas, refletindo talvez o perfil genético dos animais BALB/c (razão 2,0 – perfil
Th2) e C57BL/6 (razão 0,5 – perfil Th1) (Figura 58).
Esta diferença de perfil de resposta imune pode ter alguma influência na forma como os
animais do primeiro e segundo experimento com Apirase responderam ao parasita, isto porque,
as diferentes subclasses de anticorpos IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3) possuem diferentes
funções efetoras por diferenças em suas regiões Fc. Sabe-se que anticorpos da subclasse IgG1
são mais neutralizantes e fracamente opsonizantes. Já anticorpos da subclasse IgG2a são
opsonizantes, tendo como principal função se ligarem à patógenos extracelulares para que estes
possam ser fagocitados ou reconhecidos por células efetoras. Entretanto, não podemos
correlacionar estas diferentes funções efetoras com os dados de redução da carga parasitária
nos experimentos 1 e 2, uma vez que mudamos a forma como os animais foram desafiados.
No terceiro experimento com a proteína Apirase, tentamos não só aumentar os níveis de
anticorpos totais elicitados, mas também modular o tipo de resposta imune induzida com o uso
de adjuvantes, uma vez que os resultados da vacina de DNA com 18% de proteção sugeriam o
papel de uma resposta Th1 protetora. De fato, conseguimos aumentar o título de anticorpos
anti-Apirase de (1:1280) do primeiro e segundo experimento para (1:4000, 1:8000 e 1:16000)
no terceiro experimento, dependendo do adjuvante utilizado (Figura 59). Adicionalmente, foi
possível modular o tipo de resposta imune induzida pelo uso de diferentes adjuvantes (Figura
60 e 63). Apesar de não termos observado reduções de carga parasitária com diferenças
estatísticas, ao correlacionarmos os dados do desafio com o tipo de resposta imune induzida,
nossas análises sugerem que os pólos extremos das respostas Th1 e Th2 apresentariam maior
efeito “protetor”.
Os resultados apresentados nas Figuras 62 e 63 revelam um quadro que lembra a
proposta de imunidade do “Vale Feliz” proposta por Wilson (1999) (Figura 3). Segundo esta
proposta, o verme viveria “feliz” em um vale caracterizado por uma resposta imune do
____________________________________________________________________Discussão
139
hospedeiro Th0 ou Th1/Th2, modulada pelo verme durante a doença. Ao passo que respostas
polarizadas para Th1 ou Th2 teriam um efeito protetor, pelo menos para o modelo da vacina de
cercária irradiada. Obviamente, é extremamente ousado neste momento do trabalho e de posse
dos nossos resultados, afirmar que estamos observando o mesmo mecanismo para as respostas
montadas contra a proteína Apirase. Entretanto, a similaridade dos padrões nos chamou muito
a atenção e deve ser melhor investigada, tentando aumentar a modulação para os pólos da
resposta imune Th1 ou Th2.
A publicação recente de um trabalho descrevendo o potencial protetor de duas
Tetraspaninas (proteínas com 4 domínios transmenbrana) TSP-1 e TSP-2 (Tran et al., 2006),
nos levou a reavaliar o potencial da proteína Apirase sobre outros aspectos, isto porque a TSP-
2 também foi descrita nos estudos de Braschi (2005 b) como uma das proteínas mais expostas
na superfície do tegumento do verme (Figura 22). O trabalho apresenta dois grandes méritos,
primeiro demonstra que a proteína TSP-2 é reconhecida apenas pelo soro de indivíduos
potencialmente resistentes de regiões endêmicas, e não é reconhecida pelo soro dos indivíduos
com infecção crônica. Notavelmente, a resposta de anticorpos montada pelos indivíduos
resistentes contra TSP-2 consiste exclusivamente de anticorpos citofilicos IgG1 e IgG3, não
sendo detectados nenhuma outra subclasse de IgG ou IgE. O segundo achado, e talvez o mais
importante para repensarmos os experimentos com a proteína Apirase, foram os elevados
níveis de proteção observados, 57% para TSP-2 e 34% para TSP-1. Observando os níveis de
anticorpos produzidos pelos camundongos contra estas proteínas antes do desafio, percebemos
uma massiva quantidade de IgG1 (1:1.600.000) e IgG2a (1:400.000). Esses altos títulos de
anticorpos são cerca de 200 vezes maior para a subclasse IgG1, e 50 vezes mais alto para a
subclasse IgG2a, quando comparados aos níveis de anticorpos produzidos pelo regime de
imunização com a proteína Apirase que realizamos. Obviamente, o fato dos autores terem
utilizado adjuvante completo de Freund na primeira dose, seguido de dois reforços com
adjuvante incompleto de Freund (IFA), pode ser considerado o fator determinante para a
obtenção de títulos tão altos; vale lembrar que o único adjuvante liberado para uso em humanos
é o hidróxido de alumínio. A questão que se apresenta é como seria o desempenho da vacina de
proteína Apirase com níveis de anticorpos equivalentes a estes montados contra as
tetraspaninas.
Como discorrido na introdução, os vários achados em diferentes modelos experimentais
e no homem levam a um vigoroso debate sobre a natureza da imunidade protetora contra o
esquistossoma. Durante as primeiras 4-5 semanas após a exposição às cercárias, a resposta
imune é principalmente de natureza Th1, e direcionada principalmente contra antígenos do
estágio adulto, conhecida como fase aguda da doença. No decorrer da infecção, com os
primeiros ovos sendo produzidos pelos vermes maduros, a resposta imune muda
completamente, tornando-se fortemente polarizada para Th2 (8 semanas após a infecção). Esta
resposta Th2 é específica aos antígenos dos ovos, e seu desenvolvimento é acompanhado pela
perda da resposta Th1 prévia associada aos antígenos dos vermes adultos. Após 3 meses de
____________________________________________________________________Discussão
140
infecção, ocorre uma certa diminuição da resposta Th2, e este estado persite pelo resto da
infecção, conhecida como fase crônica da doença.
Um tema central deste debate se refere ao significado funcional de uma resposta imune
Th2-associada (IgE elevada e eosinofilia) contra a infecção do esquistossoma ou outros
helmintos. A visão tradicional é a de que estas respostas são uma manifestação primária da
resistência adquirida, um conceito que encontra suporte na evidência da associação de altos
níveis de IgE com taxas decrescentes de reinfecção em humanos. A hipótese alternativa é que
apesar da elicitação de uma resposta Th2, a infecção pelo esquistossoma persiste, de modo que
esta resposta Th2 não é necessariamente protetora e sim induzida para baixar a regulação de
uma resposta Th1 que pode ser potencialmente nociva para o parasita e/ou hospedeiro. Os
proponentes desta visão argumentam que as estratégias de vacinação baseadas na indução de
respostas Th1 podem ser mais frutíferas e citam como prova deste principio a alta efetividade
da imunidade Th1 induzida em camundongos pela vacina de cercária irradiada. Também dando
suporte a este ponto de vista, está a falha de demonstrar, de maneira convincente, um
mecanismo de proteção Th2-dependente em um modelo animal totalmente susceptível. Na
ausência de uma demonstração direta, a associação entre IgE e imunidade no homem pode ser
vista meramente como correlativa.
Como todos os debates muito polarizados, ambos os lados devem estar parcialmente
corretos e a verdade deve residir em algum ponto intermediário. Desta maneira, em termos de
vacinação, os esquistossomas devem ser susceptíveis, tanto a uma resposta dependente de
mecanismos Th1 como Th2, dependendo do alvo antigênico específico. Novamente, como
mencionado acima, o ponto critico não é qual mecanismo opera durante a aquisição de
resistência natural, mas sim qual protege efetivamente quando induzido artificialmente.
Finalmente, é muito simplista tentar explicar um processo tão complexo como a eliminação de
um verme em termos de um único braço do sistema imune. Estudos no modelo murino com a
vacina de cercária irradiada ilustram isto. Por causa da importância da resposta Th1 em
camundongos que receberam uma única dose imunizante da vacina de cercária atenuada e a
falha de transferir esta proteção pelo soro destes animais, assumiu-se que o mecanismo efetor
de resistência neste modelo era puramente mediado por uma resposta celular. Entretanto,
camundongos deficientes em linfócitos B (mMT) desenvolvem apenas metade dos níveis de
resistência observados nos animais selvagens. Estes achados combinados com estudos prévios
de hospedeiros Th1 deficientes indicam que os altos níveis de proteção atingidos pela vacina
atenuada dependem de ambos os mecanismos de imunidade humoral e celular (Sher &
Mahmoud, 2001). Desta maneira, uma imunização efetiva em humanos talvez requeira a
indução concomitante dos dois braços distintos do sistema imune não tipicamente associados
um com o outro durante uma infecção natural por helmintos.
_______________________________________________________Conclusões e Perspectivas
141
6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Aproximadamente 15 anos atrás, a Organização Mundial de Saúde organizou um teste
independente dos seis candidatos vacinais mais promissores, todos originados de S. mansoni.
Isto pode ser visto como um reflexo dos avanços alcançados em biologia molecular durante a
década de oitenta, que permitiram a seleção e purificação de moléculas de esquistossoma, as
quais poderiam ser usadas para testar sua capacidade protetora em modelos animais de
laboratório. Como reportado por Bergquist e Colley (1998), estes ensaios não identificaram
nenhum antígeno candidato com efeito protetor acima de 40%. Entretanto, ensaios clínicos de
Fase I/Fase II foram realizados para o antígeno de 28 kDa (glutationa-S-transferase; Bilhvax)
de S. hematobium (Capron et al., 2002), enquanto a Paramiosina, triose fosfato isomerase e
Sm14 (proteína ligadora de ácidos graxos), ainda estão sendo pesquisados como candidatos
vacinais.
Uma visão pessimista poderia encontrar na falha, até o momento, de se identificar um
candidato vacinal líder, como uma evidência de que é impossível desenvolver uma vacina
contra a esquistossomose. No entanto, uma desvantagem desta visão reducionista é a noção de
que a imunidade protetora poderia ser atingida utilizando uma única proteína / peptídeo / gene.
Considerando a complexidade do desenvolvimento do esquistossoma no hospedeiro mamífero,
nós seriamos muito afortunados em descobrir seu “calcanhar de Aquiles” apenas com estas
estratégias.
O sucesso em se analisar funcionalmente genomas bacterianos em busca de candidatos
vacinais, é exemplificado pelos trabalhos em Neisseria meningitidis sorogrupo B. Quarenta
anos de estudos baseados em estratégias clássicas de desenvolvimento de vacinas falharam em
produzir uma vacina eficaz contra este patógeno humano. Recentemente seu genoma foi
totalmente seqüenciado (Tettelin et al., 2000) e analisado usando ferramentas de
bioinformática, de modo a selecionar quadros abertos de leitura (ORFs) que codificassem
proteínas secretadas ou expostas na superfície (Pizza et al., 2000). Esta varredura identificou
cerca de 600 ORFs putativas, que foram clonadas para expressão em E.coli; 350 proteínas
foram expressas, purificadas e usadas para imunizar camundongos; o soro obtido foi analisado
por diferentes ensaios funcionais. Foram caracterizados 91 proteínas positivas em pelo menos
um ensaio e 28 positivas por atividade bactericida mediada pelo complemento. Dentre estas,
cinco candidatos foram selecionados para estudos posteriores e se demonstram altamente
efetivos, sendo produzidos em larga escala em condições de boa prática de manufatura para
ensaios clínicos em humanos.
A análise de genoma funcional também já foi realizada para Plasmodium falciparum.
Um total de 303 ORFs foram selecionadas utilizando uma série de critérios, incluindo estágio
de expressão e estrutura secundária das proteínas. Após a clonagem dos genes alvos utilizando
o sistema Gateway, a expressão funcional de 95 genes foi avaliada em camundongos, através
_______________________________________________________Conclusões e Perspectivas
142
da capacidade das vacinas de DNA gerarem anticorpos contra os vários estágios do parasita.
Destas vacinas, 19 induziram títulos de anticorpos contra o estágio eritrocítico e 3 contra o
estágio de esporozoito (Aguiar et al., 2004). A imunização de camundongos com estes
plasmídeos, no modelo murino de Plasmodium yoelii yoelii, revelou 5 genes capazes de reduzir
a carga de parasitas de 68-95% , estudos adicionais para confirmar este efeito protetor estão em
curso (Haddad et al., 2004).
Até onde temos conhecimento, este é o primeiro trabalho objetivando aplicar a
vacinologia reversa para identificar funcionalmente novos candidatos vacinais em Schistosoma
mansoni, a partir da análise de seu Transcriptoma.
6.1. Projeto Piloto
A realização do Projeto Piloto nas fases iniciais do seqüenciamento, foi extremamente
importante para definirmos os modelos experimentais a serem utilizados com os candidatos
vacinais selecionados a partir do banco de dados com 125 mil ESTs.
Obviamente, esperávamos que os resultados mais promissores do projeto surgissem dos
desafios experimentais, permitindo assim a caracterização de novos antígenos protetores.
Entretanto, devemos salientar que a própria clonagem dos antígenos vacinais apresenta
informações relevantes. Na primeira fase de trabalho foi possível identificar uma série de
novos antígenos a partir de um banco de dados preliminar do transcriptoma de S. mansoni e
validar a existência destes genes através da clonagem dos mesmos. Foram clonados os genes
da HSP70, Miofilina, Catepsina L e Hip1 (proteína hipotética 1). E ainda parte do gene STT3
(oligosacaril transferase), ainda não descrito em S. mansoni, e dos genes dos antígenos já
descritos, CII-3 (similar a parte do complexo succinato desidrogenase) e LIN-7 (similar à uma
proteína envolvida na exocitose em vesículas sinápticas), além do gene da proteína integral de
membrana, Sm23, utilizada como controle positivo.
Em relação aos antígenos selecionados, após o desafio experimental com 9 candidatos
vacinais, chegamos a três novos antígenos que apresentaram um efeito na redução da carga
parasitária, quando administrados por via intradérmica (Gene Gun) ou intramuscular e
comparados aos animais naive: Lin-7 (40% e 20%), CII-3 (38% e 22%), STT (36% e 35%)
respectivamente. Devido à dispersão observada na recuperação dos vermes, alguns destes
resultados apresentaram baixa significância estatística. A eficiência de expressão das proteínas
recombinantes em E.coli (55% dos genes), ilustra uma das principais vantagens em se utilizar
vacinas de DNA para análise de candidatos vacinais em média-larga escala.
Decidimos não mais utilizar a estratégia de combinar antígenos em um mesmo grupo
experimental para verificar efeitos aditivos por dois motivos. Primeiramente, por relatos da
literatura que apontam para uma diminuição do efeito protetor quando um ou mais candidatos
vacinais são administrados (Sedegah et al., 2004), e também pelo fato de que certamente os
antígenos teriam que ser testados isoladamente.
_______________________________________________________Conclusões e Perspectivas
143
Uma decisão importante tomada a partir da análise destes ensaios, foi a substituição do
controle negativo (pDEST12.2 integro) pelo controle negativo deletado (eliminando os genes
cm
r
e ccdB). Com isto foi possível reduzir o efeito adjuvante inespecífico.
Um aspecto positivo da realização deste protejo piloto foi reavaliar as técnicas de
desafio e perfusão utilizadas no modelo murino. Em função da grande dispersão observada no
número de vermes recuperados por animal e principalmente por ser um modelo que não
reproduz no laboratório o que de fato ocorre na natureza, concluímos que o modelo de desafio
por injeção subcutânea não é o mais adequado e este foi substituído pelo modelo de penetração
pela pele.
A possibilidade de obter as respectivas proteínas recombinantes acabou sendo de suma
importância na decisão de prosseguir os ensaios com os antígenos, uma vez que esta será
essencial para aprofundar os estudos, como por exemplo, caracterizar o tipo de resposta imune
induzida. Foi este fator que nos levou à decisão, após o Projeto Piloto, de levar adiante os
estudos apenas com antígeno LIN-7.
Em suma no Projeto Piloto foram definidos parâmetros como os vetores a serem
utilizados, a linhagem de camundongos, a via de imunização e o modelo experimental de
desafio e perfusão. Foram também implementadas diversas modificações nas técnicas de
desafio e perfusão, que resultam na redução da variação observada nos ensaios iniciais,
permitindo uma caracterização mais clara e bem fundamentada dos novos antígenos protetores.
Em relação aos antígenos selecionados, dos 8 candidatos vacinais testados inicialmente, 3
apresentaram proteção (Lin-7, STT e CII-3).
6.2. Transcriptoma
Na segunda fase do projeto, ficou logo evidente que a ampliação do banco de dados e a
anotação por “Gene Ontology” tornaram disponíveis gene/proteínas mais interessantes. Foram
selecionados ~30 candidatos potenciais, dos quais foi possível realizar as construções das
vacinas de DNA contendo os genes ou fragmentos gênicos e testar o potencial protetor de 22
destes antígenos. Após o desafio experimental, chegamos a cinco moléculas que mereciam
uma melhor investigação em função de seu efeito protetor: Apirase, Estomatina, Dife5,
Antígeno 5 e rVLDL. Adicionalmente, confirmamos o efeito protetor de Lin-7. Com base nos
dados do desafio experimental foi feito um depósito de patente nos EUA, referente à utilização
destes antígenos como vacina contra a esquistossomose (US patent provisional number
60/502,277, September 2003). Foi realizada uma análise detalhada dos domínios protéicos
destas proteínas, bem como uma compilação de informações sobre a função e localização de
ortólogos destas proteínas em outros organismos, tentando esclarecer qual o papel destes
genes/proteínas na fisiologia do Schistosoma mansoni.
A vacina de DNA-Estomatina apresentou um efeito protetor de 21% de proteção e a
caracterização das respostas humoral e celular induzidas nos animais imunizados, apontam
_______________________________________________________Conclusões e Perspectivas
144
para um possível envolvimento do braço de resposta celular nestes animais. Isto pode ser
afirmado pelos baixos títulos de anticorpo anti-estomatina observados e pelos altos níveis de
IFN-γ secretado por esplenócitos estimulados com a proteína recombinante. A
imunolocalização da proteína no tegumento de vermes adultos, fornece argumentos para
acreditarmos que esta proteína deve ser apresentada ao sistema imune do hospedeiro em algum
momento durante a infecção. Este conjunto de dados deve compor um manuscrito a ser
apresentado à comunidade científica.
Com relação ao Antígeno 5, destacamos a redução da carga parasitária em 31%, sua
similaridade com o candidato vacinal de Necator americanus, e a localização de um parálogo
descrito como proteína secretada pelo estágio de esquistossômulo (0-3 horas). Nós
consideramos este antígeno extremamente promissor.
O gene Dife5 conferiu uma redução na carga parasitária de 21%. A similaridade
encontrada com a proteína CD59 humana (inibidora da cascata do complemento), e a
expressão diferencial deste gene em um momento que o parasita passa de uma condição de
sensibilidade para uma condição de resistência à lise mediada pelo complemento (cercária –
esquistossômulo), podem explicar este efeito protetor.
Após a identificação dos antígenos vacinais mais promissores, passamos a investir
nossos esforços na obtenção das respectivas proteínas recombinantes expressas em E. coli e/ou
Pichia pastoris. Isto nos permitirá avaliar tanto a presença de anticorpos específicos contra
estes antígenos, quanto o nível de resposta celular induzido por estas vacinas. As proteínas Lin-
7, Antígeno 5 e Dife5 encontram-se em fase de purificação.
A colaboração com o grupo de York (UK) permitiu que comparássemos nossas
predições feitas in silico, com dados funcionais sobre a localização e distribuição das proteínas
no parasita. Essas comparações validaram o critério de escolha utilizado na análise do
transcriptoma (moléculas expostas à superfície ou secretadas), uma vez que foi possível
detectar algumas destas moléculas nos bancos de proteoma. Dentre as moléculas em comum
encontradas, merecem destaque a Apirase, a Fosfatase Alcalina e a Fosfodiesterase, todas
descritas como moléculas expostas na superfície do verme. Adicionalmente, encontramos
proteínas similares ao Antígeno 5 em amostras secretadas por esquistossômulos (0-3 horas), o
que levanta a possibilidade destas proteínas desempenharam um papel similar ao candidato
vacinal ASP-2 de Necator americanus.
A investigação das proteínas expostas na superfície do verme deve ser concluída nos
próximos meses. Após o término da purificação da Fosfosdiesterase, o grupo de York realizará
ensaios de imunização com esta proteína, seguida de desafio experimental com cercárias. Desta
maneira, poderemos avaliar de maneira funcional se os anticorpos anti-fosfodiesterase são
capazes de bloquear ou prejudicar a atividade desta enzima na superfície dos vermes,
resultando na redução da carga parasitária em relação a animais não imunizados.
Adicionalmente, o grupo de York deve testar em um outro ensaio, se o bloqueio das três
enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos, Apirase, Fosfodiesterase e Fosfatase
_______________________________________________________Conclusões e Perspectivas
145
Alcalina, tem um efeito na viabilidade e sobrevivência do parasita. Para tanto serão realizados
ensaios de imunização com as três proteínas seguidas de desafio experimental.
Em suma, foi possível avançar significativamente na avaliação dos antígenos vacinais
identificados no transcriptoma do Schistosoma mansoni, a obtenção das respectivas proteínas
recombinantes vai permitir completar os estudos de imunolocalização e avaliação da resposta
imune induzida contra estes candidatos vacinais.
É importante perceber que estes seriam apenas os estudos iniciais de avaliação destes
antígenos. Existe uma variedade enorme de formas de apresentação de antígenos, vias de
imunização, e adjuvantes, cada um induzindo um tipo de resposta imune distinta com
vantagens e desvantagens na tentativa de alcançar um efeito protetor elevado. Os estudos
apresentados com a proteína Apirase recombinante ilustram quanto a utilização de adjuvantes
pode influenciar na resposta imune e proteção observada.
Um ponto critico, quando analisamos os mecanismos protetores montados pela vacina
de cercárias atenuadas, são os sítios de estimulação e apresentação dos antígenos da pele até os
pulmões. A utilização de lipossomos ou microcarregadores para liberação controlada em
diferentes sítios e a apresentação dos antígenos através de vetores vivos de apresentação
também devem ser investigadas. Após a caracterização dos antígenos quanto à sua melhor
forma de apresentação, será ainda importante continuar os estudos investigando a combinação
destes.
A vacina ideal seria aquela que atingisse um ou mais pontos fracos do parasita, seu
calcanhar de Aquiles. Como discutido anteriormente, esta molécula não deve ser reconhecida
normalmente pelo sistema imune durante a infecção e desta maneira não deve compor o quadro
de antígenos vacinais identificados previamente. A análise do Transcriptoma do Esquistossoma
associado a estudos de Proteoma aparece como uma estratégia para a identificação destas
moléculas, em conjunto com informações sobre as funções críticas para o parasita.
Infelizmente, o desenvolvimento destas novas tecnologias ocorreu simultaneamente, e às
vezes, às espenças do trabalho em fisiologia básica sobre este helminto. Neste sentido,
sentimos uma lacuna entre a quantidade de informações que pudemos extrair do Transcriptoma
do parasita e o significado fisiológico funcional que podíamos atribuir a estas informações.
Assim sendo, acreditamos que somente com a integração da Genômica, dos estudos
imunológicos, tanto no modelo animal como no homem, juntamente com um maior
conhecimento sobre a fisiologia do parasita, tendo em foco algumas moléculas, possamos
encontrar o calcanhar de Aquiles deste organismo tão complexo.
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paramyosin of Chinese Schistosoma japonicum. Vaccine 18 (2000) 3196-3204.
__________________________________________________________Material Suplementar
155
ANEXO 1 – Alinhamentos da Seqüência das Vacinas de DNA testadas com
as proteínas similares encontradas nos estudos de Proteoma
Leishmanolisina
T-COFFEE, Version_1.41(Fri Jun 28 14:24:48 MDT 2002)
Notredame, Higgins, Heringa, JMB(302)pp205-217,2000
CPU TIME:1 sec.
SCORE=99
BAD AVG GOOD
Vacina de DNA : 99
Secretada : 99
DNA ---------------------------------------------------------------
Rachel MIPCSRNLLLLLCFISLLGFTYTEYICQIMPNISMNFGILGEPIDKRQYGGNRLKFIVIYRES
Cons
DNA ---------------------------------------------------------------
Rachel IQRHSLFGRFKSEIVEKALNFWERTLSVRRPPNRKLLIDRGCVEPVFYTDGRTGKKFCKSQCK
Cons
DNA ---------------------------------------------------------------
Rachel QKALCYDHPVPDQYASGCAMGGGGGDIRDVYQDGPGFAPNEYVLFVESENKQGCLSGATLAYA
Cons
DNA ----------------------------------------------GFQLGSFQIYASRAGNP
Rachel GPCEMHPTTDRPIMGSINFCPQKMEIQEPGKTMLIGTAIHELGHALGFVKSNFALMRDPEGNP
Cons ** ..* : . ***
DNA RTIRERVLNEPILXDPLGYRIPDKSVLSNVTRVXMSAKTTIYRYLTALKXPMILKMAKEYFNC
Rachel RTPRDPKSGRPPLNNERQYSASENTV-RIINRPWVTAAGTFSKPFMSFVTPALLEEARKHFNC
Cons ** *: ..* * : * .:::* :.* ::* *: : : :: * :*: *:::***
DNA PELDGVELDNSDQMYARG-HFEKRLIDNELMTPLLSSRSYISKITLGFFEDTGWYQVNYAGAN
Rachel PNLDGLDIENEGGQGTIGTHFEKRVVGDETMAGVTGVKSVLSRLTLAFFTDSGWWDVDYSLAE
Cons *:***::::*.. : * *****::.:* *: : . :* :*::**.** *:**::*:*: *:
DNA PMGYGKHLGCDFVMKSCYEYMLIQRRKRQSFYPYCDQIGFSNTLCLKHENAYGFCDLRHYLRP
Rachel PWYYGKNLGCSFVMESCYAYMMRMKQAGKSTEPYCDE---PDTLKCYHQKAFGICAVGRFTQR
Cons * ***:***.***:*** **: :: :* ****: .:** *::*:*:* : :: :
DNA LPLEFQYFEDPRLGSADRFRDYCPAYVPF----------------------------------
Rachel LPPTEQYFNDPTQGGTSVLNDRCPLIQPMRSFFNEPLVTYCDHQLNIPVAQRGNMFAQDFGNN
Cons ** ***:** *.:. :.* ** *:
DNA ---------------------------------------------------------------
Rachel SMCIIHKGAWRAEMNGRATNDPRVKATCHQYSCSGGLQVIINGKPFQCNSGVAKIQTKQIQGE
Cons
DNA -------------------
Rachel IICPNPNIACRNRRRSIKQ
Cons
__________________________________________________________Material Suplementar
156
HSP 70 – Proteína de choque térmico 70
T-COFFEE, Version_1.41(Fri Jun 28 14:24:48 MDT 2002)
Notredame, Higgins, Heringa, JMB(302)pp205-217,2000
CPU TIME:0 sec.
SCORE=98
*
BAD AVG GOOD
*
Sm00325 : 98
Glimmer11688 : 98
Sm00325 IVETLRRNMFSYLLLLSCILCLTSCEEKKEDYGTVIGIDLGTTYSCVGVFQGGRVEI
Glimmer11688 -------------------------------MPNAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEI
Cons ..**************** *:***
Sm00325 IANDQGNRITPSYVAFTPEGERLIGDAAKNQLTSNPENTVFDVKRLIGRKFDESTVQ
Glimmer11688 IANDQGNRTTPSYVAFT-DSERLIGDGAKNQVAMNPTNTVFDAKRLIGRRFDDPSVQ
Cons ******** ******** :.******.****:: ** *****.******:**:.:**
Sm00325 NDITHFPFSVVNKKNKPYVEVHVGSEVKTFAPEEISAMVLGKMKEFAEAYLGKKVTH
Glimmer11688 SDMKHWPFEVTQVGGKLKICVEYKGEKKMFSAEEISSMVLTKMKEVAESYLGRTVSD
Cons .*:.*:**.*.: .* : *. .* * *:.****:*** ****.**:***:.*:.
Sm00325 AVVTVPAYFNDAQRQATKDAGTIAGLNILRIINEPTAAAIAYGLDKK-DGEKNILIF
Glimmer11688 AVITVPAYFNDSQRQATKDAGAIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDKKVGGERNVLIF
Cons **:********:*********:*****:******************* .**:*:***
Sm00325 DLGGGTFDVSLLTIENGVFEVVATNGDTHLGGEDFDQRVIDHFAKLILEKKGKDIKV
Glimmer11688 DLGGGTFDVSILTIEDGIFEVKSTAGDTHLGGEDFDNRMVDHFVKEFQKKYNKDIRG
Cons **********:****:*:*** :* ***********:*::***.* : :* .***:
Sm00325 NKRAVQKLRREVEKAKRMLSKRPSTTVEIESLIDGEDFSETLTRATFEKLNIDLFLK
Glimmer11688 NKRALRRLRTACERAKRTLSSSAQTNLEIDSLCDGIDFYTVITRARFEELNADLFRG
Cons ****:::** *:*** **. ..*.:**:** ** ** .:*** **:** ***
Sm00325 TLEPVKKVLEDAGMKKEDIDEIILVGGSTQIPKVQELLRSFFE-KELNTGVNPDEAV
Glimmer11688 TLDPVEKALRDAKMDKSQIHDIVLVGGSTRIPKVQKLLQDFFNGKELNKSINPDEAV
Cons **:**:*.*.** *.*.:*.:*:******:*****:**:.**: ****..:******
Sm00325 AYGAAVQGGVIGG--VENTGGVVLLDVCPLTLGIETVGGVMTKLIPRNTVIPTKKSQ
Glimmer11688 AYGAAVQAAILSGDKCEAVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTALIKRNTTIPTKQTQ
Cons *******..::.* * . .::****.**:**:**.***** ** ***.****::*
Sm00325 IFSTAADNQPTVTIQVFEGERAMTKFNHFLGKFDLTGIPPALRGVPQIEVTFEIDVN
Glimmer11688 TFTTYSDNQPGVLIQVFEGERALTKDNNLLGKFELSGIPPAPRGTPQIEVTFDIDAN
Cons *:* :**** * *********:** *::****:*:***** **.*******:**.*
Sm00325 GILRVSAEDKGTGSKNKIEINKDQHRLDAEEIEKMINDAEQFAASDKKLKERVDARN
Glimmer11688 GILNVSAVDKGTGKQNKITITNDKGRLSKEEIERMVADADKYKAEDEKQRDRVSAKN
Cons ***.*** *****.:*** *.:*: **. ****:*: **::: *.*:* ::**.*:*
Sm00325 EFESSAYTLKSQIADKGQLGEKLSADDKKKIEKAIEEAISYLDGNPQAEVEELKQKK
Glimmer11688 SLESYVYTMKQQV--EGELKEKIPESDRQVIVSKCEDTISWLDVHQSAEKHEYESKR
Cons .:** .**:*.*: :*:* **:. .*:: * . *::**:** : .** .* :.*:
Sm00325 KAFDDIVQPIISSLYQQSGAPPPAQPETER----------DEL-
Glimmer11688 EELEKVCAPIITKVYQAGGMPGGMHEASGAGGGSGKGPTIEEVD
Cons : ::.: ***:.:** .* * : : :*:
__________________________________________________________Material Suplementar
157
Antígeno 5
T-COFFEE, Version_1.41(Fri Jun 28 14:24:48 MDT 2002)
Notredame, Higgins, Heringa, JMB(302)pp205-217,2000
CPU TIME:0 sec.
SCORE=91
*
BAD AVG GOOD
*
Antígeno 5 : 91
Sm09319 : 91
Antígeno 5 TTGHCTRLIYSSSYWKAIHFEMTVKCQSSLTALTTLCLLVCCGVHAAMDNATREKLLKLHNNA
Sm09319 ---------------KIVLVSCLLFLFTSLYVETKL-------------SEGQRAIYNFHKKV
Cons * : .. : :** . *.* . :. : ::*::.
Antígeno 5 RISVMHGRLEGQPIAKSIKPLKWNMELEKKAQMLADTCYFGPDSAIERKVPGFTNVGQNWAGA
Sm09319 RKDVKNCRIPGQPPAKNLTKLKWNKLLANKAKQQAKRCKYDSNDPNDFIIGDFESIGQNLADY
Cons * .* : *: *** **.:. **** * :**: *. * :..:.. : : .* .:*** *.
Antígeno 5 STVDIGFQRWLNEYKNYDFFNRLCLVGRCIHYTQIVWENTTDIGCGVATCPHSPFKLSIVCNY
Sm09319 PTIEGAMKDWLEEYKNYNFEKNQC-NGDCKNYKQMVWNTTEEIGCGYEKCGKN---YLIVCNY
Cons .*:: .:: **:*****:* :. * * * :*.*:**:.* :**** .* :. *****
Antígeno 5 GPGGGCPRQFP-YSVKGLYRQWTIKYGRKWYSWRYGRRCRPVYVKQRCNHTNER
Sm09319 APGDSEDRPYEGYSV---------------------------------------
Cons .**.. * : ***
DLC – Dineína Cadeia leve
T-COFFEE, Version_1.41(Fri Jun 28 14:24:48 MDT 2002)
Notredame, Higgins, Heringa, JMB(302)pp205-217,2000
CPU TIME:0 sec.
SCORE=99
*
BAD AVG GOOD
*
Vomitus : 99
Vacina de DNA : 99
Vomitus MSEQKAVIKNADMSEDMQQDAVDCATQALEKYNIEKDIAAFIKKEFDKKYNPTWHCIVGRNFG
DNA MENRRALMKSTDMQAPLQKIVVDTCVVATEQYDEERDVAAYVKKHMDKYDGGVWHCVLGKDFG
Cons *.:::*::*.:**. :*: .** .. * *:*: *:*:**::**.:** . .***::*::**
Vomitus SYVTHETKHFIYFYLGQQAILLFKSG
DNA CYVSHLDGYFSYFQYQGKSMIVFRTQ
Cons .**:* :* ** :::::*::a
__________________________________________________________Material Suplementar
158
ANEXO 2 – Pedido de Patente – (WO/2005/023979) ISOLATED S.
MANSONI NUCLEIC ACID MOLECULES AND USES THEREOF
Publication
Number:
WO/2005/023979
International Application No.:
PCT/BR2004/00017
0
Publication Date:
17.03.2005
International Filing Date:
10.09.2004
Int. Class.: C07H 21/04 (2006.01), C12N 15/00 (2006.01), C12P 21/06 (2006.01)
Applicants: FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO [BR/BR]; Rua Pio XI,
1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (All Except US).
VERJOVSKI-ALMEIDA, Sergio [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US
Only).
LEITE, Luciana C. C. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US Only).
FARIAS, Leonardo, P. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US Only).
MIYASATO, Patricia, A. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US Only).
KAWANO, Toshie [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US Only).
DEMARCO, Ricardo [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US Only).
GARCIA, Julio Cesar Levano [PE/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US
Only).
MARTINS, Elizabeth A. L. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US Only).
HO, Paulo, L. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US Only).
NASCIMENTO, Ana L. T. O. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US
Only).
DIAS-NETO, Emmanuel [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US Only).
SETUBAL, João, C. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US Only).
MENCK, Carlos, F. M. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US Only).
MADEIRA, Alda, M. B. N. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US Only).
RODRIGUES, Vanderlei [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US Only).
GARGIONI, Cybele [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR) (US Only).
Inventors: VERJOVSKI-ALMEIDA, Sergio [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
LEITE, Luciana C. C. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
FARIAS, Leonardo, P. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
MIYASATO, Patricia, A. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
KAWANO, Toshie [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
DEMARCO, Ricardo [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
GARCIA, Julio Cesar Levano [PE/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
MARTINS, Elizabeth A. L. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
HO, Paulo, L. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
NASCIMENTO, Ana L. T. O. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
DIAS-NETO, Emmanuel [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
SETUBAL, João, C. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
MENCK, Carlos, F. M. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
MADEIRA, Alda, M. B. N. [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
RODRIGUES, Vanderlei [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
GARGIONI, Cybele [BR/BR]; Rua Pio XI, 1500, 05468-901 São Paulo - SP (BR).
Agent: ADVOCACIA PIETRO ARIBONI; Rua Guararapes, 1909 - 7o Andar, Brooklin Novo, 04561-004
São Paulo - SP (BR).
Priority Data:
60/502,277
11.09.2003
US
Title: ISOLATED S. MANSONI NUCLEIC ACID MOLECULES AND USES THEREOF
Abstract: The invention relates to S. Mansoni proteins, and the nucleic acid molecules which encode them.
Various uses are described, including immunoprophylactic, diagnostic and therapeutic methods.
Designated
States:
AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CN, CO, CR, CU, CZ, DE,
DK, DM, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP,
KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NA, NI, NO, NZ, OM,
PG, PH, PL, PT, RO, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SY, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ,
VC, VN, YU, ZA, ZM, ZW.
African Regional Intellectual Property Org. (ARIPO) (BW, GH, GM, KE, LS, MW, MZ, NA, SD, SL,
SZ, TZ, UG, ZM, ZW)
Eurasian Patent Organization (EAPO) (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM)
European Patent Office (EPO) (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE,
__________________________________________________________Material Suplementar
159
IT, LU, MC, NL, PL, PT, RO, SE, SI, SK, TR)
African Intellectual Property Organization (OAPI) (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML,
MR, NE, SN, TD, TG).
Publication Language:
English (EN)
Filing Language: English (EN)
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( http://www.livrosgratis.com.br )
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