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Cecilia Claudia Romero Delgado
Estudo da Biossíntese de Poli-3-
hidroxibutirato (P3HB) a partir de Óleo de Soja
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação Interunidades em
Biotecnologia USP – IPT – I. Butantan,
para obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia.
São Paulo - 2006
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2
Cecilia Claudia Romero Delgado
Estudo da Biossíntese de Poli-3-
hidroxibutirato (P3HB) a partir de Óleo de Soja
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação Interunidades em
Biotecnologia USP – IPT – I. Butantan,
para obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia.
Área de concentração Biotecnologia
Orientador:
Dr. José Geraldo da Cruz Pradella
São Paulo - 2006
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3
Dedico este trabalho a Deus, meu esposo
César, meus pais Guillermina e Raúl e os
meus irmãos Raúl e Fernando, por todo o
amor, apoio, dedicação e paciência.
4
AGRADECIMIENTOS
A Deus, por tudo o que Ele deixa acontecer na minha vida.
Ao meu orientador Dr. José Geraldo da Cruz Pradella, pela oportunidade da
realização deste trabalho, paciência, colaboração e valiosa ajuda na elaboração do
mesmo.
Ao meu amado esposo César Augusto Zúñiga Delgado, pelo amor incondicional, a
imensa paciência e apoio em todo momento da realização deste mestrado.
Aos meus amigos pela motivação, força e valiosos conselhos: Rafael Costa Santos
Rocha, Adriana Quintero Torres, Ivan Ávila León e Beatriz Guilarte Maresma.
Aos meus amigos pesquisadores do Centro de Tecnologia de Produtos e
Processos especialmente a Marilda Keico Taciro e Rosane A. Moniz Piccoli, pela
ajuda, colaboração e amizade.
À todos os pesquisadores do Centro de Tecnologia de Produtos e Processos pela
ajuda e colaboração.
Aos funcionários do Laboratório de Biotecnologia Industrial pela grande ajuda e
colaboração
A minha família pela força e incentivo em mais esta etapa da minha vida.
À secretaria de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP-IPT-
BUTANTAN pelo auxilio e agilidade nas questões burocráticas.
Ao Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo AS, IPT, e ao
ensino público e gratuito concedido pela universidade de São Paulo, USP, o qual
viabilizou a realização deste mestrado.
Ao CNPQ por ter cedido bolsa para a realização deste mestrado.
5
RESUMO
ROMERO, C. Estudo da Biossíntese de Poli-3-hidroxibutirato (P3HB) a partir de
Óleo de Soja. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia)-Instituto de Ciências
Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
O presente trabalho teve por finalidade estudar o processo de produção do
polímero biodegradável, poli-3-hidroxibutirato (P3HB) em biorreator, utilizando óleo
de soja como fonte de carbono. Inicialmente foram testadas quatro linhagens
visando selecionar as de melhor desempenho: IPT-26 (Cupriavidus necator), IPT-
29 (Alcaligenes latus), IPT-48 (Burkholderia cepacia) e IPT-64 (Burkholderia
cepacia) cultivadas em dois meios minerais diferentes, um com limitação em
nitrogênio e outro com limitação em fósforo, com concentrações iniciais de óleo de
soja de 15 g/L. Estas quatro bactérias foram cultivadas em frascos agitados a 200
min
-1
, 30 ˚C e pH inicial 7,0. Os melhores resultados foram alcançados com a B.
cepacia. IPT-48 seguida da C. necator IPT-26 em meio mineral limitado em
nitrogênio. Após esta seleção de linhagens foram realizados ensaios em biorreator
de 7 L de volume útil, aerado e agitado mecanicamente com as linhagens B.
cepacia. IPT-48 e C. necator IPT-26 com o objetivo de se obter alta densidade
celular e alto teor de polímero. Para tanto, estudou-se a influência da concentração
de óleo de soja na produção de P3HB, utilizando um processo descontinuo-
alimentado. No procedimento adotado duas bateladas de óleo de soja, necessárias
para atingir concentração no biorreator de 10, 20 ou 40 g/L cada uma, foram
alimentadas ao tanque que continha quantidades proporcionais dos componentes
do meio de cultura suficientes para indução da biossíntese. Constatou-se que tanto
o crescimento quanto o acúmulo de P3HB foram favorecidos com o aumento da
concentração de óleo de soja para ambas as linhagens. A análise dos resultados
apontou para limitação de crescimento e conseqüente acúmulo de P3HB,
fortemente influenciados pelos íons fósforo e provavelmente ferro. Os melhores
valores de desempenho foram observados para C. necator IPT-26, que com duas
bateladas de 40g/L, alcançou valores de biomassa total de 87,2 g/L, teor de P3HB
de 84% e produtividade em P3HB de 2,36 g/Lh. Também foram calculados os
fatores de conversão de óleo de soja a polímero e a biomassa celular, com valores
de Y
P3HB/óleo
= 1,17 g/g e Y
Xr/óleo
= 0,45 g/g, respectivamente. Os resultados obtidos
indicaram que o protocolo estabelecido é bastante eficiente e que este pode ser
otimizado, evitando que o crescimento celular seja limitado pelo meio de cultura e
que a condição de suficiência de fonte de carbono seja observada na fase de
acúmulo para máximo teor de P3HB na biomassa.
Palavras-chave: poli-3-hidroxibutirato,óleo de soja, Cupriavidus necator, alta
densidade celular, biossíntese, fermentação.
6
ABSTRACT
ROMERO, C. Study of Poly-3-hydroxybutyrate (P3HB) biosynthesis from soybean
oil. (Master thesis)-Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, São
Paulo, 2006.
The objective of the present work was to study the biodegradable
polymer (P3HB) production process in bioreactor using soybean oil as a carbon
source. First we tested four strains attempting to select those which have the best
results: IPT-26 (Cupriavidus necator), IPT-29 (Alcaligenes latus), IPT-48
(Burkholderia cepacia) and IPT-64 (Burkholderia cepacia) cultivated in two different
mineral salt medium, one limited in nitrogen and the other one limited in
phosphorus, using initial concentrations of soybean oil of 15 g/L. These four
bacteria were cultivated in flask shakes at 200 min
-1
, 30 ˚C and initial pH 7.0. The
best results were reached with B. cepacia. IPT-48 followed by C. necator IPT-26 in
nitrogen-limited mineral salt medium. After this strain selection, there were done
assays in 7.0 litters aerated stirred tank bioreactor, using B. cepacia. IPT-48 and C.
necator IPT-26 in order to obtain a high cells concentration and a high poly-3-
hydroxybutyrate (P3HB) content per dry cells. We studied the influence of the
concentration of soybean oil in a P3HB production with a discontinuous feeding
process. Two batch of soybean oil, in order to attempt concentrations in the
bioreactor of 10, 20 or 40 g/L each one, were fed into the bioreactor, which was
previously fed with balanced quantities of mineral salt medium to induce the
polymer biosynthesis. Both, cell growth and P3HB content were increased with the
increasing of soybean oil concentration in the culture medium, for the two strains.
The analysis of the results showed a cell growth limitation and consequently a
P3HB accumulation; this behavior was strongly influenced by phosphorous ion and
probably iron. The best results were for C. necator IPT-26, reaching values of dry
cell weight of 87 g/L and P3HB content per dry cell of 84%, and 2,36 g/Lh of
polymer productivity, using two batch of 40 g/L of soybean oil. P3HB production
yield from soybean oil and dry cell weight yield were also calculated, with values of
Y
P3HB/oil
= 1.17 g/g e Y
Xr/oil
= 0.45 g/g, respectively. The results obtained in this work
suggest that the used protocol is very efficient and it could be optimized, avoiding
the medium limitation factor during the cell growth phase and ensuring that the
carbon source been feed in an enough quantity in the P3HB accumulation phase, to
maximize the P3HB production in the cell.
Key-words: poly-3-hydroxybutyrate, soybean oil, Cupriavidus necator, high cell
density, biosynthesis, fermentation.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Possíveis destinos do plástico convencional. ....................................... 18
Figura 2 - Ciclo da degradação dos plásticos biodegradáveis. .............................19
Figura 3 - Estrutura básica dos polihidroxialcanoatos...........................................21
Figura 4 - Acúmulo de PHA em Cupriavidus necator............................................22
Figura 5 - Produção nacional de soja. (F) Previsão – 4 de setembro 2006 .......... 30
Figura 6 - evolução da produção de grãos de soja no Brasil ................................ 30
Figura 7 - Cisão de triglicerídeos provenientes de óleos vegetais. ....................... 31
Figura 8 - Via catabolica do glicerol ...................................................................... 32
Figura 9 - Via metabólica de formação de Acetil-CoA a partir de ácidos graxos. .32
Figura 10 - Diferentes destinos da Acetil-CoA proveniente do catabolismo do
glicerol e dos ácidos graxos..................................................................................34
Figura 11 - Evolução da concentração de nitrogênio N (A), evolução da
concentração de óleo de soja (B), evolução da concentração de biomassa total
Xt (C) e porcentagem de acúmulo de P3HB (D) para os ensaios F29(N), F64(N),
F48(N), F26(N), utilizando as linhagens A. latus IPT-29, B. cepacia IPT-64, B.
cepacia IPT- 48 e C.necator IPT-26, cultivados em meio mineral limitado em
nitrogênio (MM1) em frascos agitados, utilizando óleo de soja como fonte de
carbono. ................................................................................................................ 49
Figura 12 - Evolução da concentração de nitrogênio N (A), evolução da
concentração de óleo de soja (B), evolução da concentração de biomassa total
Xt (C) e porcentagem de acúmulo de P3HB (D) para os ensaios F29(P), F64(P),
F48(P), F26(P), utilizando as linhagens A. latus IPT-29, B. cepacia IPT-64, B.
cepacia IPT- 48 e C.necator IPT-26, cultivados em meio mineral limitado em
fósforo (MM2) em frascos agitados, utilizando óleo de soja como fonte de
carbono ................................................................................................................. 51
Figura 13 -Variação do pH com o tempo para os ensaios F29(N), F64(N),
F48(N), F26(N), F29(P), F64(P), F48(P), F26(P) utilizando as linhagens A. latus
IPT-29, B. cepacia IPT-64, B. cepacia IPT- 48 e C.necator IPT-26, cultivados em
meio mineral limitado em nitrogênio (MM1) e meio mineral cultivado em fósforo
(MM2) em frascos agitados, utilizando óleo de soja como fonte de carbono........ 53
Figura 14 -Evolução da concentração de nitrogênio N (A) e evolução da
concentração de óleo de soja (B), para os ensaios B48-20, B48-40 cultivados
em meio mineral limitado em nitrogênio MM3 e o ensaio B48-80 cultivado em
8
meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem Burkholderia
cepacia IPT-48 em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte de carbono.....58
Figura 15 - Consumo total da massa de NH
4
OH (A) e consumo a diferentes
tempos da massa de NH
4
OH (B), para os ensaios B48-20, B48-40 cultivados
em meio mineral limitado em nitrogênio MM3 e o ensaio B48-80 cultivado em
meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem Burkholderia
cepacia IPT- 48 em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte de carbono....60
Figura 16 - Evolução da concentração de biomassa total Xt (A) e evolução da
concentração de biomassa residual Xr (B), para os ensaios B48-20, B48-40
cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM3 e o ensaio B48-80
cultivado em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem
Burkholderia cepacia IPT-48 em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte
de carbono. ........................................................................................................... 62
Figura 17 -Evolução da concentração de P3HB acumulado expresso em g/L (A)
e evolução da concentração de P3HB acumulado expresso em porcentagem
(B), para os ensaios B48-20, B48-40 cultivados em meio mineral limitado em
nitrogênio MM3 e o ensaio B48-80 cultivado em meio mineral limitado em
nitrogênio MM4, utilizando a linhagem Burkholderia cepacia IPT-48 em
biorreator, utilizando óleo de soja como fonte de carbono....................................63
Figura 18 -Evolução das produtividades em P3HB para os ensaios B48-20, B48-
40 cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM3 e o ensaio B48-80
cultivado em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem
Burkholderia cepacia IPT-48 em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte
de carbono. ........................................................................................................... 65
Figura 19 -Evolução da concentração de nitrogênio N (A) e evolução da
concentração de óleo de soja (B), para os ensaios B26-20, B26-40 cultivados
em meio mineral limitado em nitrogênio MM3 e os ensaios B26-80 e B26-80*
cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem
Cupriavidus necator IPT-26 em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte de
carbono. ................................................................................................................ 67
Figura 20 -Evolução da concentração de biomassa total Xt (A) e evolução da
concentração de biomassa residual Xr (B), para os ensaios B26-20, B26-40
cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM3 e os ensaios B26-80 e
B26-80* cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a
linhagem Cupriavidus necator IPT-26 em biorreator, utilizando óleo de soja
como fonte de carbono. ........................................................................................71
Figura 21 -Evolução da concentração de P3HB acumulado expresso em g/L (A)
e evolução da concentração de P3HB acumulado expresso em porcentagem
(B), para os ensaios B26-20, B26-40 cultivados em meio mineral limitado em
nitrogênio MM3 e os ensaios B26-80 e B26-80* cultivados em meio mineral
limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem Cupriavidus necator IPT-26
em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte de carbono.............................. 72
9
Figura 22 -Velocidades de crescimento bacteriano para os ensaios B26-20,
B26-40 cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM3 e os ensaios
B26-80 e B26-80* cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM4,
utilizando a linhagem Cupriavidus necator IPT-26 em biorreator, utilizando óleo
de soja como fonte de carbono............................................................................. 76
Figura 23 -Comparação das velocidades de crescimento bacteriano com a
velocidade de consumo de oxigênio para o ensaio B26-40 cultivado em meio
mineral limitado em nitrogênio MM3 (A), o ensaio B26-80 (B) e o ensaio B26-
80* (C), ambos cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM4,
utilizando a linhagem Cupriavidus necator IPT-26 em biorreator, utilizando óleo
de soja como fonte de carbono............................................................................. 78
Figura 24 -Balanço gasoso para os ensaios B26-40 cultivados em meio mineral
limitado em nitrogênio MM3 (A), os ensaios B26-80 e B26-80* cultivados em
meio mineral limitado em nitrogênio MM4 (B), utilizando a linhagem Cupriavidus
necator IPT-26 em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte de carbono. .... 79
Figura 25 -Evolução das concentrações de micronutrientes para o ensaio B26-
80 cultivado em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando linhagem
Cupriavidus necator IPT-26 em biorreator e óleo de soja como fonte de carbono..82
Figura 26 -.Variação da velocidade especifica de consumo de oxigênio (QO
2
),
comparada com concentração de óleo de soja, concentração de biomassa
residual (Xr) e concentração de P3HB com a concentração de fósforo em
função do tempo durante a primeira batelada de óleo para o ensaio B26-80
cultivado em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem
Cupriavidus necator IPT-26 em biorreator ............................................................86
Figura 27 - Evolução das produtividades em P3HB para os ensaios B26-20 e
B26-40 cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM3, e os ensaios
B26-80 e B26-80* cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM4,
utilizando a linhagem Cupriavidus necator IPT-26 em biorreator, utilizando óleo
de soja como fonte de carbono............................................................................. 87
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Produção de PHAs a partir de biomassa renovável.............................23
Tabela 2 - Características físicas e químicas de polipropileno e P3HB ................ 24
Tabela 3 - Resultados de produção de PHAs encontradas na literatura...............26
Tabela 4 - Composição de óleo de soja................................................................ 29
Tabela 5 - Oferta e demanda de óleo de soja no Brasil (1000 TONELADAS) ......29
Tabela 6 - Meio Sólido Agar Nutriente (AN)..........................................................36
Tabela 7 - Meio Caldo Nutriente (CN)...................................................................36
Tabela 8 - Meio Mineral limitado em nitrogênio (MM1), Meio Mineral limitado em
Fósforo (MM2) – (Ramsay et.al., 1990, modificado) - para cultivo em frascos
agitados ................................................................................................................38
Tabela 9 - Solução de Elementos-Traço............................................................... 38
Tabela 10 - Resumo dos ensaios realizados em frascos agitados ....................... 38
Tabela 11 - Meio Mineral limitado em nitrogênio modificado para cultivo em
biorreator...............................................................................................................39
Tabela 12 - Resumo dos ensaios realizados em biorreator. ................................. 40
Tabela 13 - Produção de P3HB em frascos agitados (200 rpm, 30
o
C, pH inicial =
7, % P3HB inicial = 0) para diferentes linhagens em meios minerais limitados
em nitrogênio MM1e fósforo MM2, contendo óleo de soja como fonte de
carbono ................................................................................................................ .54
Tabela 14 - Comparação de crescimento celular Xr e acúmulo de P3HB ao final
de cada batelada de óleo de soja suministrada para os ensaios realizados em
biorreator empregando a linhagem IPT-48. ..........................................................65
Tabela 15 – Fatores de conversão de elementos a biomassa residual Y
Xr/elemento
para o ensaio B26-80 em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, contendo
óleo de soja
,
comparados com os encontrados na literatura.................................84
Tabela 16 - Produção de P3HB em biorreator para as linhagens IPT-48 e IPT-26
em meios minerais limitados em nitrogênio MM3 e MM4, contendo óleo de soja...89
Tabela 17 - Comparação de resultados utilizando C. necator para produção de
P3HB a partir de diversas fontes de carbono........................................................90
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
3HV.....................Unidades 3-hidroxivalerato
ABIOVE...............Associação Brasileira das Indústrias de Óleos Vegetais
AN.......................Agar nutriente
ºC ........................Grau celsius
CN.......................Caldo nutriente
CER ....................Carbon dioxyde evolution rate (velocidade de emissão de dióxido
de carbono)
Coodetec.............Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola
DHAP..................Diidroxiacetona fosfato
EMBRAPA ..........Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EuropaBio ...........Associação Européia das Industrias de Biotecnologia
g..........................Grama
GP.......................Gliceraldeido 3-fosfato
h..........................Hora
ICB......................Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de São Paulo
ICI .......................Imperial Chemical Industries
IPT ......................Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo
IPTS....................Instituto para Estudos de Prospectiva Tecnológica
L..........................Litro
LBI/IPT ................Laboratório de Bioprocessos Industriais do Instituto de Pesquisas
Tecnológicas do Estado de São Paulo
mg.......................Miligrama
min ......................Minuto
MM1....................Meio mineral limitado em nitrogênio para frascos agitados
MM2....................Meio mineral limitado em fósforo para frascos agitados
MM3....................Meio mineral limitado em nitrogênio para biorreator
MM4....................Meio mineral modificado limitado em nitrogênio para biorreator
OUR....................Oxigen uptake rate (Velocidade de consumo de oxigênio)
P3HB...................Poli-3-hidroxibutirato
P3HB-co-3HV......Poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato
pH .......................Potencial hidrogeniônico
PHAs...................Polihidroxialcanoatos
PLA .....................Polilactato
p/v .......................Peso/volume
rpm......................Revoluções por minuto
RQ.......................Quociente de respiração
TRIS....................Tampão Tris(hidroximetil) aminometano
Xr ........................Biomassa residual
Xt.........................Biomassa total
µ
Xr ..................................
Velocidade específica de crescimento celular
v/v .......................Volume/volume
vvm .....................Volume de ar/volume meio. min
Y..........................Fator de conversão
12
SUMARIO
1 INTRODUÇÃO...............................................................................................17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................................21
2.1 Polihidroxialcanoatos (PHAs).......................................................................21
2.2 Poli-3-hidroxibutirato (P3HB)........................................................................23
2.2.1 Usos e Demanda........................................................................................27
2.3 Lipídios.........................................................................................................28
2.3.1 Catabolismo de lipídios e síntese de PHAs................................................31
3 OBJETIVOS...................................................................................................35
4 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................36
4.1 Microrganismos............................................................................................36
4.2 Cultura Estoque ...........................................................................................36
4.3 Preparação do Inóculo .................................................................................37
4.4 Esterilização.................................................................................................37
4.5 Descrição dos ensaios .................................................................................37
4.5.1 Seleção de linhagem e forma de limitação - ensaios em frascos agitados ....
...................................................................................................................37
4.5.2 Influência da concentração do substrato – ensaios em biorreator .............39
4.6 Metodologias Analíticas ...............................................................................40
4.6.1 Concentração celular .................................................................................40
4.6.2 Concentração de óleo de soja....................................................................41
4.6.3 Concentração de nitrogênio .......................................................................41
4.6.4 Concentração e teor de polímero...............................................................42
4.6.5 Composição dos gases de saída (CO
2
e O
2
) .............................................42
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .....................................................................47
5.1 Seleção de linhagem....................................................................................47
5.1.1 Comportamento das bactérias utilizando meio mineral com limitação em
nitrogênio: MM1..........................................................................................48
5.1.2 Comportamento das bactérias utilizando meio mineral com limitação em
fósforo: MM2 ..............................................................................................50
5.1.3 Variação do pH...........................................................................................52
5.1.4 Escolha das linhagens ...............................................................................53
5.2 Influência da Concentração de Substrato: Ensaios em Biorreator...............56
5.2.1 Ensaios com Burkholderia cepacia IPT-48.................................................56
5.2.1.1 Consumo das fontes de nitrogênio e de carbono ...................................56
5.2.1.2 Variação da biomassa total, da biomassa residual e do teor de P3HB ..61
5.2.1.3 Produtividade..........................................................................................65
5.2.2 Ensaios com Cupriavidus necator IPT-26 ..................................................66
13
5.2.2.1 Consumo das fontes de nitrogênio e de carbono ...................................66
5.2.2.2 Variação da biomassa total, da biomassa residual e do teor de P3HB ..68
5.2.2.3 Velocidade de Crescimento e Balanço Gasoso......................................73
5.2.2.4 Concentrações de micronutrientes .........................................................80
5.2.2.5 Produtividade..........................................................................................87
5.2.3 Comparação entre as linhagens.................................................................88
6 CONCLUSÕES..............................................................................................91
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................93
ANEXOS .............................................................................................................100
17
1 INTRODUÇÃO
O alto consumo de plásticos na sociedade atual e os aumentos sucessivos
nos preços do petróleo, atualmente acima de US$ 50/barril
(www.men.gob.ve/preciopetroleo), têm despertado grande preocupação devido ao
encarecimento do seu custo de produção e aos custos associados à sua
reciclagem e disposição final. Uma das principais conseqüências do uso
indiscriminado deste material e o problema relacionado ao meio ambiente devido à
dificuldade de sua degradação. Apesar do plástico não ser tóxico, ele demora
aproximadamente 100 e 400 anos para ser decomposto no meio ambiente quando
descartado em aterros sanitários. O transporte de gases e líquidos no seu interior
de aterros sanitários fica comprometido, dificultando assim a degradação de outros
materiais constituintes do lixo, retardando a estabilização destas áreas. A
reciclagem e a incineração são apresentadas como soluções para minimizar tais
problemas (Figura 1). A reciclagem, mesmo sendo amplamente utilizada,
apresenta um custo elevado e deprecia o material polimérico. Por outro lado, a
incineração libera, durante o seu processo, gases tóxicos que são nocivos ao meio
ambiente (COSTA, 1995).
18
Figura 1 – Possíveis destinos do plástico convencional.
O desenvolvimento tecnológico atual tem permitido identificar novos
materiais que possuem propriedades termoplásticas e características de
desempenho semelhantes as dos plásticos petroquímicos, e que são rapidamente
degradados pela ação de microrganismos no meio ambiente. Dentre estes
materiais que reúnem características de termoplasticidade e biodegradabilidade,
destacam-se os polihidroxialcanoatos (PHAs). (SQUIO e ARAGÃO, 2004).
Dentre os PHAs, o poli-3 hidroxibutirato (P3HB) e o poli-3 hidroxibutirato-
co-3-hidroxivalerato (P3HB-co-3HV) têm despertado interesse científico,
tecnológico e industrial em diversos países, porque podem ser sintetizados por
fermentação utilizando derivados da agricultura como fonte de carbono. Após sua
produção e uso, microrganismos presentes na natureza, nas usinas de
compostagem ou nos aterros sanitários são capazes de degradar os PHAs a gases
como CO
2
e H
2
O em condições aeróbias e CH
4
em condições anaeróbias.
(BARBOSA et al., 2005; ALMEIDA et al., 2004), (Figura 2).
19
Figura 2 - Ciclo da degradação dos plásticos biodegradáveis.
O P3HB tem sido produzido a partir de carboidratos, já existindo em nosso
país um processo de produção deste plástico fruto de trabalhos desenvolvidos no
Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo (IPT) em conjunto
com o Centro de Tecnologia Coopersucar e o Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo (ICB – USP) (Patente PI 9103116-8; NONATO et al.,
2001).
Um dos problemas de comercialização deste produto é o seu alto custo de
produção devido, entre outros fatores, ao custo da matéria-prima e aos baixos
fatores de conversão de matéria-prima no produto de interesse. O rendimento
máximo teórico de conversão de sacarose a P3HB é de 0,43g/g (GOMEZ et al.,
1997) e na prática industrial tem se encontrado algo em torno de 0,33 g/g
(NONATO et al., 2001). Por este motivo, muitas das pesquisas realizadas sobre
PHAs tem tido enfoque na redução dos custos de produção e o aumento da
produtividade utilizando diversas estratégias. Dentre estas descrevem-se o uso de
cepas mais produtivas, a otimização de processos de cultivo, utilização e,
fundamentalmente, a procura de fontes de carbono de menor custo utilizadas para
sua produção. (ALMEIDA et al., 2004), uma vez que a fonte de carbono pode
contribuir com 40% do custo de produção deste bioproduto (CHOI e LEE, 1999).
20
Os óleos vegetais se colocam como alternativa de fonte de carbono para
produção de P3HB, pois, segundo Kahar et al., 2004, o rendimento máximo teórico
de conversão de óleos vegetais a P3HB é da ordem de 1,00 g/g.
O Brasil é um dos maiores produtores mundiais de óleo de soja. No ano
2005 o Brasil produziu 5,7 milhões de toneladas de óleo de soja, dos quais cerca
de 2,6 milhões foram exportados, estimando-se haver um excedente anual de
cerca de 272.000 toneladas desta matéria-prima. O preço de venda de óleo de soja
tem variado entre US$ 500 a 600/tonelada (www.abiove.com.br).
Desta maneira, a utilização de óleos vegetais, especificamente o óleo de
soja, pode ser uma alternativa bastante interessante para produção de P3HB a
partir de uma matéria-prima renovável, disponível a preço competitivo e com alto
fator de conversão a P3HB.
Neste sentido, o presente projeto teve como objetivo iniciar o estudo de
produção de P3HB a partir de óleo de soja no Laboratório de Bioprocessos
Industriais (LBI) do IPT, onde tem-se desenvolvido tecnologias para produção de
polímeros biodegradáveis a partir de matérias-primas renováveis.
21
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Polihidroxialcanoatos (PHAs)
Os polihidroxialcanoatos (PHAs) são polímeros lineares de (R)-3-
hidroxiácidos nos quais o grupo carboxila de um monômero forma um ligação tipo
éster com o grupo hidroxila do monômero seguinte (Figura 3).
Figura 3 - Estrutura básica dos polihidroxialcanoatos.
A produção de PHAs por microrganismos ocorre através do acúmulo
intracelular de grânulos de PHAs em diversas bactérias, em geral, quando há
excesso de fonte de carbono e energia disponíveis, e limitação de, pelo menos, um
nutriente essencial à multiplicação celular (BRANDL et al., 1990). A função
atribuída a esses materiais dentro da célula (Figura 4) é a de reserva de carbono,
energia ou equivalentes redutores (ANDERSON e DAWES, 1990). Os grânulos
podem representar até 90% da massa seca celular (MADISSON e HUISMAN,
1999). Os PHAs também foram detectados como constituintes da membrana
celular citoplasmática, complexados a cálcio e polifosfato, ou, ainda, associados a
proteínas (BUENO NETTO e GOMEZ, 2001).
22
Figura 4 - Acúmulo de PHA em Cupriavidus necator (ALLI, et al., 1993)
A descoberta desse grupo de polímeros (PHAs) é atribuída ao
microbiologista Maurice Lemoigne do Instituto Pasteur de Paris e data de 1926,
quando a presença de P3HB foi observada em bactérias do gênero Bacillus
(LEMOIGNE, 1926).
Durante décadas esse grupo de polímeros não passou de uma
curiosidade acadêmica, sendo que somente em 1962 foram publicadas as
primeiras patentes apresentando suas propriedades termoplásticas (BAPTIST,
1962).
O P3HB permaneceu durante muitos anos como único constituinte dos
PHAs conhecido. Em 1964, Davis identificou o ácido 3-hidroxi-2-butenóico como
constituinte dos PHAs produzido por Nocardia, e, posteriormente em 1974, a partir
de estudos com lodo de esgoto, a presença de novos constituintes, ácidos 3-
hidroxivalérico, 3-hidroxihexanóico e 3-hidroxiheptanóico, foi verificada (WALLEN e
DAVIS, 1972; WALLEN e ROHWEDDER, 1974).
A composição monomérica de PHAs depende da linhagem microbiana e
da fonte de carbono fornecida durante o acúmulo (STEINBÜCHEL e VALENTIN,
1995).
A seguir são apresentados alguns dos microrganismos estudados na
produção de PHAs e as fontes de carbono utilizadas (Tabela 1).
23
Tabela 1 - Produção de PHAs a partir de biomassa renovável (PAGE, 1997).
Microrganismo Substrato
Azotobacter vinelandi UWD
R. eutropha
E. coli recombinante
melaço de cana-de-açúcar e
beterraba, xarope de milho e
açúcar não refinado
Pseudomonas pseudoflava
Pseudomonas cepacia
R. eutropha e Lactococcus lactis
hemicelulose e xilose
Haloferax mediterranei
amido
Azotobacter chroococcum
alpechin
E. coli recombinante
R. eutropha
Pseudomonas cepacia
soro de leite
A. vinelandii
E. coli recombinante
R. eutropha
peptonas e aminoácidos
P. putida
P. fluorescens
P. oleovorans
óleos vegetais
2.2 Poli-3-hidroxibutirato (P3HB)
O poli-3-hidroxibutrato é um biopolímero que apresenta propriedades
mecânicas similares as do polipropileno com a vantagem dele ser biodegradável.
(ROZSA et al., 2004)
A seguir algumas diferenças entre o plástico petroquímico e o
biodegradável (Tabela 2).
24
Tabela 2 - Características físicas e químicas de polipropileno e P3HB.
Parâmetro Polipropileno (pp) P3HB
Temperatura de fusão Tm [
0
C] 171-186 171-182
Cristalinidade [%] 65-70 65-80
Densidade [g cm
-3
] 0.905 - 0.94 1.23 – 1.25
Peso molecular Mw (x10
-5
) 2.2 – 7 1 – 8
Distribuição do peso molecular 5 – 12 2.2 – 3
Módulo de flexãol [GPa] 1.7 3.5 – 4
Força de tensão [MPa] 39 40
Extensão na ruptura [%] 400 6 – 8
Resistência ao UV pouca boa
Resistência a solventes boa pouca
Permeabilidade ao oxigênio
[cm
3
m
-2
atm
-1
d
-1
]
1700 45
Biodegradabilidade - boa
Outros
Devido à baixa
densidade, flutua em
sistemas aquáticos.
Devido à maior
densidade, sedimenta
em sistemas aquáticos.
Fonte: (BUCCI, 2003)
A primeira tentativa de produção de P3HB ocorreu em 1962 pela empresa
W. R. Grace Co. que, devido à baixa eficiência dos processos de produção e
extração, e conseqüente alto custo, não obteve sucesso (HOLMES, 1985). Em
1976, a empresa Imperial Chemical Industries (ICI) retomou a avaliação da
produção do P3HB como uma alternativa aos plásticos gerados a partir de
matérias-primas derivadas do petróleo. Entretanto, observou-se que o P3HB
apresentava-se muito duro e quebradiço, limitando suas aplicações (HOLMES,
1985). A partir da constatação de que a incorporação de unidades 3HV
possibilitava modular gradativamente as propriedades físicas e mecânicas do
polímero produzido e, deste modo, ampliar o espectro de aplicações possíveis,
iniciou-se em 1981 o segundo grande empreendimento para a produção de PHAs,
empregando-se Ralstonia eutropha (na atualidade Cupriavidus necator), com a
comercialização do homopolímero P3HB, bem como dos copolímeros poli-3-
hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (P3HB-co-3HV), com o nome comercial de
Biopol® (BYROM, 1990).
No início da década de 90, iniciaram-se estudos no Brasil para a produção
de P3HB a partir de açúcar de cana (RODRIGUES et al., 1995, GOMEZ et al.,
1996, GOMEZ et al., 1997; TACIRO et al., 1997; SILVA et al., 2000). Como
25
resultado, no final da década de 90, obteve-se um processo de produção de P3HB
e seu copolímero P3HB-co-3HV, utilizando como fonte de carbono principal
açúcares da cana-de-açúcar, resultando na patente (PI9193116-8) “Processo para
produzir polihidroxialcanoatos a partir de açúcares extraídos da cana-de-açúcar”,
caracterizada pelo fato do mosto de fermentação ser preparado a partir de
carboidratos extraídos de cana-de-açúcar.
O baixo custo de produção do açúcar e o excedente energético das usinas
de açúcar e álcool viabilizaram economicamente a produção integrada destes
polímeros no Brasil, e em setembro de 2000 foi inaugurada a PHB Industrial S. A.,
empresa constituída para produzir e comercializar a produção brasileira de plástico
biodegradável com capacidade inicial de 50 toneladas/ano e já em fase de
ampliação (NONATO et al., 2001).
Outro resultado relevante foi a descoberta de uma nova espécie bacteriana,
que foi denominada Burkholderia sacchari (BRÄMER et al., 2001), que teve sua
capacidade produtora aumentada através de melhoramento genético (SILVA et al.,
2000).
A produção de P3HB e seu copolímero P3HB-co-3HV por microrganismos
pode ser realizada de duas formas: em uma só etapa, na qual a síntese de P3HB
ocorre associada à multiplicação celular; ou em duas etapas, das quais a primeira
tem por objetivo a multiplicação celular e a segunda o acúmulo de quantidades
expressivas destes polímeros (DOI, 1990).
Deve-se enfatizar que para a produção técnica e economicamente viável de
PHAs, alguns objetivos devem ser perseguidos. Há necessidade de se conseguir
um processo que atinja altas densidades celulares (acima de 80 g/L), alto teor de
biopolímero intracelular (acima de 60% da biomassa) e alta produtividade de PHAs
(acima de 1 g/Lh) (LEE et al., 1997). A Tabela 3 mostra alguns exemplos de
produção de PHAs utilizando processo descontínuo alimentado a partir de diversas
fontes de carbono. Os maiores valores de produtividade, acima de 4 g/Lh, foram
26
obtidos com glicose ou sacarose utilizando Escherichia coli modificada ou
Alcaligenes latus.
Produtividades obtidas quando foram usados outros substratos como
metanol e ácidos graxos foram substancialmente menores, não excederam 2,0
g/Lh. A limitação por fósforo foi mais efetiva do que a de nitrogênio para acúmulo
de poli-3-hidroxioctanoato (P3HO) a partir de ácido oléico utilizando bactérias do
gênero Pseudomonas (LEE et al., 2000) ou para produção de P3HB a partir de
xilose utilizando B. cepacia (SILVA et al., 2004). A forma de adição de substrato ao
biorreator também influenciou o valor deste parâmetro. (PATAQUIVA, 2003;
KAHAR et al., 2004; LEE et al., 1997).
Tabela 3 - Resultados de produção de PHAs encontradas na literatura.
P3HB: poli-3-hidroxibutirato; P3HO: poli-3-hidroxioctanoato; GM:geneticamente modificada.
Além disso, é importante destacar que o fator de conversão de fonte de
carbono a produto deve ser maximizado, já que a matéria-prima exerce peso
apreciável na composição do custo de produção (LEE et al., 1997; NONATO et al.,
2001). Segundo Choi e Lee, 1999 aproximadamente 40% do total dos custos de
Organismo
PHA
Fonte
de C
Tempo
(h)
Xt
(g/L)
PHA
(g/L)
PHA
(%)
P
P3HB
(g/Lh)
Referência
Ralstonia
eutropha
P3HB Glicose 74 281 232 82 3,14
Ryu et al.,
1997
Ralstonia
Eutropha
P3HB Glicose 40 141 105 74 2,63
Lee et al.,
1997
Escherichia.
coli GM
P3HB Glicose 30,6 194,1 141,6 73 4,63
Choi et al,
1998
Alcaligenes
latus
P3HB Sacarose
20 111,7 98,7 88 4,94
Wang &
Lee, 1997
Burkholderia
sacchari
P3HB Sacarose
37,5 150,1 63,0 42 1,68
Pataquiva,
2003
Ralstonia
eutropha
P3HB
Óleo de
soja 96 130 90 69 0,94
Kahar et al.,
2004
Methylobacteriu
m organophilum
P3HB Metanol 70 250 130 52 1,86
Kim et al.,
1996
Pseudomonas
putida
P3HO
Ácido
oléico 26 92 41,4 45 1,59
Huijberts et
al., 1996
Pseudomonas
putida
P3HO
Ácido
oléico 38 141 72,6 51 1,91
Lee et al.,
2000
27
produção de PHAs são devidos aos custos dos substratos. Assim, para se
conseguir reduzir os custos de produção é necessária a utilização de fontes de
carbono mais baratas. Segundo Akiyama et al., 2003 os óleos vegetais poderiam
apresentar fatores de produção de P3HB maiores quando comparados aos fatores
de produção de P3HB utilizando glucose ou sucrose como fonte de carbono, já que
os óleos contém maior quantidade de carbono que os açúcares, reduzindo assim
os custos de produção e consumo de energia. Por isso o óleo de soja se coloca
como um excelente candidato por seu alto valor de conversão de óleo a P3HB e
por sua boa disposição no mercado.
Os valores dos fatores de conversão de fonte de carbono em produto
reportados na literatura para ácidos graxos são da ordem de 0,6 a 0,7 g/g (LEE et
al., 2000; KAHAR et al., 2004) e da ordem de 0,3 a 0,4 g/g para carboidratos
(PATAQUIVA, 2003; RYU et al., 1997).
2.2.1 Usos e Demanda
O polímero P3HB pode ser usado como matéria-prima em um amplo
campo de aplicações, principalmente naqueles setores em que características
como pureza e biodegradabilidade são necessárias. Ele pode ser usado na
fabricação de embalagens para produtos de limpeza, higiene, cosméticos e
produtos farmacêuticos. Também serve para produzir sacos e vasilhames para
fertilizantes e defensivos agrícolas, vasos para mudas e produtos injetados, como
brinquedos e material escolar. Além disso, por ser biocompatível e facilmente
absorvido pelo organismo humano, pode ser empregado na área médico-
farmacêutica, prestando-se à fabricação de fios de sutura, próteses ósseas e
cápsulas que liberam gradualmente medicamentos na corrente sanguínea. Graças
às propriedades de barreira a gases, o bioplástico pode ainda ser usado em
embalagens de alimentos de papel cartonado do tipo “longa vida” para o envase de
sucos naturais, leite pasteurizado e bebidas isotônicas, (PACIFIC DAYLIGHT
TIME).
28
A Associação Européia das Industrias de Biotecnologia (EuropaBio) indica
que a produção através de processos biotecnologicos da industria química
européia poderia avançar dos atuais 5% para 10-20% no ano 2010. Segundo Mario
Demicheli, do Instituto para Estudos de Prospectiva Tecnológica (IPTS)
pertencentes à Comissão Europeia, vários estudos tem coincidido na previsão de
uma taxa de crescimento anual para os plásticos biodegradáveis de origem natural
de aproximadamente 30% para esta década na Europa e nos Estados Unidos.
(MUERZA, 2006).
O Brasil é um produtor de P3HB e o mercado externo é, no momento, o
principal consumidor do produto. A PHB Industrial vende o Biocycle para Europa,
Japão, Estados Unidos, Venezuela e Chile, entre outros. Nos EUA, a Dow-Cargill
produz o polilactato (PLA) a partir do hidrolisado de milho, entretanto seu custo e
de cerca de 40% maior, se comparado ao Biocycle (OLIVEIRA, 2003).
O preço do petroleo cada vez mais elevado e seu futuro esgotamento, e a
necessidade das instituições e os cidadões em usar produtos ecológicos são duas
das principais razões que prometem uma demanda futura garantida a estes
materiais biodegradáveis (MUERZA, 2006).
2.3 Lipídios
Os lipídios constituem uma classe de compostos com estrutura bastante
variada e caracterizam-se por sua baixa solubilidade em água. Exercem diversas
funções biológicas, como componentes de membranas, isolantes térmicos e
reservas de energia. Ácidos graxos livres são pouco encontrados nos organismos,
mais freqüentemente estão ligados a um álcool, que pode ser o glicerol ou a
esfingosina. Os lipídios resultantes no primeiro caso são os triacilgliceróis e os
glicerofosfolipídios; no segundo caso, são os esfingolipídios. Os triacilgliceróis são
uma forma de armazenamento de ácidos graxos; os glicerofosfolipídios e os
esfingolipídios, juntamente com o colesterol fazem parte das membranas celulares.
(MARZZOCO e TORRES, 1999).
29
O óleo de soja corresponde, em média, a 20% da matéria seca dos grãos
de soja e sua composição é detalhada na Tabela 4.
Tabela 4 - Composição de óleo de soja
Ácido Graxo
Número de
Carbonos
Número
de
ligações
duplas
% do total de
ácidos graxos
do óleo de soja
Acido Palmítico 16 0 11
Ácido Esteárico 18 0 4
Ácido Oléico 18 1 25
Ácido Linoléico 18 2 54
Ácido Linolênico 18 3 7
Fonte: Coodetec (SCHUSTER, I. 2005).
A Tabela 5 mostra a evolução da produção de óleo de soja em nosso
país, destacando-se uma produção crescente desde os anos de 97/98 até o
presente.
Tabela 5 - Oferta e demanda de óleo de soja no Brasil (1000 TONELADAS)
ÓLEO
2006/07
(P)
2005/
06
2004/
05
03/04 02/03 01/02 00/01 99/00 98/99 97/98
Estoque
Inicial 272 275 202 170 114 253 195 208 131 164
Produção 5 300 5 709 5 549 5 349 4 959 4 369 4 111 4 142 4 157 3 559
Importação 10 53 14 47 110 66 111 133 190 154
Consumo
Interno 3 150 3 120 3 050 2 962 2 936 2 935 3 015 2 820 2 826 2 682
Exportação 2 200 2 595 2 442 2 402 2 076 1 639 1 148 1 468 1 444 1 064
Estoque
Final 232 272 275 202 170 114 253 195 208 131
(P) PREVISÃO 04 de setembro 2006 (*) O valor se refere somente aos estoques em poder
das Indústrias de Óleos Vegetais
Fonte/Elaboração: ABIOVE.
A produção nacional de soja cresceu a taxa média de 6% nos últimos 6
anos e tem potencial para continuar crescendo a taxas elevadas nos próximos
anos.
30
55,700
53,053
50,085
51,875
42,769
39,058
34,127
0
10,000
20,000
30,000
40,000
50,000
60,000
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 (F)
ano
1000 toneladas
Figura 5 - Produção nacional de soja. (F) Previsão – 4 de setembro 2006
Fonte: ABIOVE.
As projeções de evolução da produção de grãos de soja no Brasil também
tem mostrado crescimento. (Figura 6).
105
102
99
97
94
92
87
82
78
72
66
6162
59
57
58
50
60
70
80
90
100
110
2004 2006 2008 2010 2012 2014 2016 2018 2020 2022
ano
Produção de grão de soja
(milhões t)
Figura 6 - Evolução da produção de grãos de soja no Brasil
Fonte: ABIOVE.
A soja é um grão muito versátil que dá origem a produtos e subprodutos
muito usados pela agroindústria, indústria química e de alimentos. Seu uso mais
conhecido, no entanto, é como óleo refinado, obtido a partir do óleo bruto.
Recentemente, a soja vem crescendo também como fonte alternativa de
combustível. Mesmo assim na atualidade existe um excedente de 232 mil
31
toneladas de óleo de soja no Brasil (Associação Brasileira das Indústrias de Óleos
Vegetais, ABIOVE). E segundo a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
(EMBRAPA) existe a previsão de que a produção de grão de soja seja ampliada,
em que será feita uma integração do cultivo de soja com a pecuária.
2.3.1 Catabolismo de lipídios e síntese de PHAs
Embora não completamente descrito na literatura, pode-se propor que a
biossíntese de PHAs a partir de óleos vegetais por microrganismos seja
representada pelas vias metabólicas descritas nas Figuras 7, 8, 9 e 10. Neste caso,
inicialmente, na utilização de lipídios como fonte de carbono, ocorreria a cisão dos
triglicerídeos por ação de lipases bacterianas produzindo os ácidos graxos
correspondentes e glicerol (Figura 7).
Figura 7: Cisão de triglicerídeos provenientes de óleos vegetais.
O glicerol formado na hidrólisie seria fosforilado e depois oxidado a
diidroxiacetona fosfato (DHAP) (Figura 8). Este último composto é um intermediário
da via da glicólise. A DHAP pode se converter por isomerização em gliceraldeido 3-
fosfato (GP), composto pertencente à via glicolítica que seria posteriormente
convertido a ácido pirúvico. O ácido piruvico é descarboxilado até acetil-CoA.
32
Figura 8 - Via catabólica do glicerol
Os ácidos graxos formados na hidrólisis dos triacilglicerois são
degradados por uma via catabólica conhecida por β-oxidação (Figura 9).
Figura 9 - Via metabólica de formação de Acetil-CoA a partir de ácidos graxos.
(modificada a partir de PARK et al., http://mbel.kaist.ac.kr/research/pha_ko.html
)
(S)-3-Hidroxiacil-CoA
fabD
Acil-CoA
3-Cetoacil-CoA
Enoil-CoA
Via da
β
ββ
β
-oxidação
Ácidos graxos
Acil-CoA
deshidrogenase
3-hidroxiacil-CoA
desidrogenase
Enoil-CoA
hidratase
β
-cetotiolase
acil-CoA
sintase
Acetil-CoA
Glicerol
Glicerol 3 fosfato
Diidroxiacetona fosfato
Glicose
Ácido
pirúvico
Acetil
-
CoA
Glicólise
glicerol
quinase
glicerol 3 –
fosfato
desidrogenase
descarboxilação
oxidativa
33
Para que os ácidos graxos de cadeias longas (Tabela 4) sejam oxidados
por esta via primeiro há sua ativação ao acil-CoA através da acil CoA sintase.
O acil-CoA saturado é degradado através de quatro reações. A primeira
reação em cada ciclo de degradação é a oxidação do acil-CoA por uma acil-CoA
desidrogenase para dar um enoil-CoA com uma dupla ligação trans entre os
carbonos C-2 e C-3. A segunda reação é a hidratação da dupla ligação entre C-2 e
C-3 através da enoil-CoA hidratase para formar 3-hidroxiacil-CoA. A terceira reação
é a oxidação do 3-hidroxiacil-CoA a 3-cetoacil-CoA por uma 3-hidroxiacil-CoA
desidrogenase, gerando um NADH. A etapa final é a cisão do 3-cetoacil-CoA
produzindo acetil-CoA e um acil-CoA encurtado em dois átomos de carbono,
catalisada pela
β
-cetotiolase. O acil-CoA encurtado experimenta depois outro ciclo
de oxidação que reinicia com a reação catalizada por acil-CoA desidrogenase.
A oxidação dos ácidos graxos com uma insaturação (no óleo de soja:
ácido oléico) requerem uma enzima isomerase adicional às requeridas no processo
já explicado da oxidação de ácidos graxos saturados e para a oxidação de ácidos
graxos poliinsaturados (no óleo de soja: linoléico e linolênico) é requerida alias de
uma isomerase, uma redutase. (QUEIROZ, 2003; STRYER, et al., 2004).
As unidades de acetil-CoA formadas a partir do glicerol e os ácidos graxos
possuem três destinos: o ciclo de Krebs, a biossíntese de P3HB e a biossíntese de
ácidos graxos (Figura 10). No caso da biossíntese de P3HB partir de óleo de soja é
provável que estes dois mecanismos produtores do intermediário acetil-CoA hajam
concomitantemente. Em face da composição ponderal do óleo de soja é bem
provável que o mecanismo prevalecente deva ser o mostrado na figura 9.
Enquanto o meio de cultura possui uma composição ilimitada em nutrientes, acetil-
CoA é desviado principalmente para o ciclo de Krebs para produção e energia e
intermediários que serão utilizados na produção de biomassa celular. Quando uma
limitação nutricional ocorre no meio de cultura, o crescimento celular diminui ou
mesmo cessa e o acetil-CoA produzido é desviado para biossíntese de P3HB.
Neste caso, duas moléculas de acetil CoA são convertidas a uma molécula de
acetoacetil-CoA por uma β-cetotiolase. Posteriormente, esta molécula é reduzida a
34
(R)-3-hidroxibutiril-CoA por uma 3-cetoacil-CoA redutase NADPH-dependente que
é em seguida polimerizada a P3HB por meio de uma PHA sintase.
È possível também a transformação de acetil CoA a malonil CoA, que
entra na via de biossíntese de ácidos graxos.O intermediário desta via de síntese,
3-hidroxiacil-ACP, pode ser convertido a um (R)-3-hidroxiacil CoA por meio de uma
transferase (Figura10).
Figura 10 – Diferentes destinos da Acetil-CoA proveniente do catabolismo do glicerol e dos
ácidos graxos.
Ácidos graxos Glicerol
Ciclo
de
Krebs
fabD
Malonil-
CoA
Acetoacetil-CoA
β
-cetitiolase
(R)-3-hidroxibutiril-CoA
3-cetoacil-CoA
redutase NADPH
dependente
P3HB
PHA sintase
Acil-ACP
3-Hidroxiacil-
ACP
Bioss
í
ntese
de ácidos
graxos
Enoil-ACP
CO2 + ACP
Malonil
-
ACP
3-Cetoacil-ACP
(R)-3-Hidroxiacil-CoA
Acetil-CoA
35
3 OBJETIVOS
O objetivo geral do projeto foi o desenvolvimento de um protocolo em
biorreator de bancada para produção de P3HB a partir de óleo de soja a alta
densidade celular e alto teor de polímero.
As seguintes etapas foram cumpridas no presente trabalho:
a) Seleção de microrganismos para produção de P3HB a partir de óleo de soja
entre linhagens dos gêneros Burkholderia, Cupriavidus e Alcaligenes,
b) verificação de qual limitação, nitrogênio (N) ou fósforo (P), foi a mais
favorável ao acúmulo de P3HB a partir de óleo de soja em frascos agitados,
c) estudo da influência da concentração do substrato óleo de soja nas fases de
crescimento e de acúmulo, visando atingir alta densidade celular e alta
produtividade no processo de formação de P3HB.
36
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Microrganismos
Foram utilizadas as linhagens IPT-26 (Cupriavidus necator), IPT-29
(Alcaligenes latus), IPT-48 (Burkholderia cepacia) e IPT-64 (Burkholderia cepacia)
pertencentes à coleção de cultura do LBI-IPT. Estas culturas foram preservadas
por liofilização e conservadas em geladeira. As linhagens utilizadas foram
escolhidas em base aos seus bons rendimentos de produção de biopolímero
utilizando como fonte de carbono outros carboidratos conforme indica a literatura.
(NONATO et al, 2001; GOETHE et al., 1999; RODRIGUES et al., 2000 e SILVA et
al., 2004).
4.2 Cultura Estoque
A partir das culturas de células liofilizadas armazenadas foram incubados
tubos de ágar inclinado das culturas bacterianas em meio Ágar Nutriente (AN)
(Tabela 6) em estufa a 30ºC.
Tabela 6 - Meio Sólido Ágar Nutriente (AN)
Componente Concentração (g/L)
Extrato de carne 3
Peptona bacteriológica 5
Ágar bacteriológico 20
A cultura destes tubos foi reativada em meio Caldo Nutriente (CN) (Tabela
7) em erlenmeyer, levado a agitador rotativo 200 rpm e 30ºC por 15h. Após o
cultivo, volumes iguais de cultura e glicerol foram dispostos em tubos de
Eppendorfs esterilizados, 0,5 mL da solução de glicerol 10% e 0,5 mL do caldo de
cultura, e armazenados em freezer a -80ºC.
Tabela 7 - Meio Caldo Nutriente (CN)
Componente Concentração (g/L)
Extrato de carne 3
Peptona bacteriológica 5
37
4.3 Preparação do Inóculo
Foi retirado cerca de 0,5 mL da cultura estoque mantida em freezer a -
80ºC e inoculado em meio CN em frascos erlenmeyer, em agitador rotativo a 200
rpm e 30ºC por 22h. Em seguida, transferiu-se esta suspensão para CN na base
de 10% do seu volume, incubando-se novamente em agitador rotativo a 200 rpm e
30ºC por 22h. A cultura resultante foi utilizada como inóculo para os ensaios
realizados.
4.4 Esterilização
Soluções e meios de cultura foram esterilizados em autoclave por 20
minutos. O óleo de soja foi esterilizado em forno Pasteur a 180ºC por 1 hora.
4.5 Descrição dos ensaios
4.5.1 Seleção de linhagem e forma de limitação - ensaios em frascos
agitados
Foram testadas 4 linhagens dos gêneros Cupriavidus, Burkholderia e
Alcaligenes, pertencentes à coleção de cultura do LBI-IPT em meios limitados em
nitrogênio ou fósforo (MM1 e MM2, Tabelas 8 e 9). Todos os ensaios tiveram uma
concentração inicial de óleo de soja de 15 g/L, temperatura de 30 ˚C, pH inicial 7,0
e tempo de cultivo de 72 horas. Os ensaios foram realizados em agitador rotativo a
200 rpm (Tabela 10).
38
Tabela 8 - Meio Mineral limitado em nitrogênio (MM1), Meio
Mineral limitado em Fósforo (MM2) – (RAMSAY et.al.,
1990, modificado) - para cultivo em frascos agitados
Concentração (g/L)
Componente
MM 1 MM 2
Óleo de Soja 15 15
KH
2
PO
4
1,5 0,2
Na
2
HPO
4
3,54 ----
(NH
4
)
2
SO
4
1,74 3,0
MgSO
4
.7H
2
O 0,2 0,2
CaCl
2
.2H
2
O 0,01 0,01
Citrato Férrico Amoniacal 0,06 0,06
Solução de Elementos Traço* 1 mL/L 1 mL/L
TRIS ---- 12 g/L
TRIS: Tampão Tris(hidroximetil) aminometano, marca MERCK.
Tabela 9 - Solução de Elementos-Traço
Componente Concentração
(g/L)
H
3
BO
3
0,3
CoCl
2
.6H
2
O 0,2
ZnSO
4
.7H
2
O 0,1
MnCl
2
.4H
2
O 30,0 mg/L
NaMoO
4
.2H
2
O 30,0 mg/L
NiCl
2
.6H
2
O 20,0 mg/L
CuSO
4
.5H
2
O 10,0 mg/L
Tabela 10 - Resumo dos ensaios realizados em frascos agitados
Grupo de
Ensaio
Bactéria Ensaio Limitação
F48(N) N
Burkholderia
cepacia
F48(P) P
F64(N) N
Burkholderia
cepacia
F64(P) P
F26(N) N
Cupriavidus necator
F26(P) P
F29(N) N
Seleção de
linhagem e
forma de
limitação
Alcaligenes latus
F29(P) P
39
4.5.2 Influência da concentração do substrato – Ensaios em biorreator
Foram realizados ensaios em biorreator com 7 L de volume útil (Biostat
Braun modelo ED), com as linhagens Burkholderia cepacia (IPT-48) e Cupriavidus
necator (IPT-26) selecionadas nos ensaios em frascos agitados. Neste estudo
foram testadas diversas concentrações iniciais de óleo vegetal para
estabelecimento de níveis limitantes e/ou inibitórios de óleo de soja, tanto para a
fase de crescimento quanto para a de acúmulo. A concentração do substrato no
cultivo das duas linhagens eleitas, para ambas as fases, foi de 10, 20 e 40 g/L, e
as demais condições de cultivo foram: temperatura de 30 ˚C, pH 7,0 e oxigênio
dissolvido acima de 15% da saturação. Os meios (MM3 e MM4) utilizados nos
cultivos estão descritos nas Tabelas 9 e 11. O resumo das condições destes
ensaios estão apresentados na Tabela 12.
Tabela 11 - Meio Mineral limitado em nitrogênio modificado para
cultivo em biorreator (modificado a partir de RAMSAY
et al., 1990).
Concentração (g/L)
Componente
MM3 MM4
Óleo de Soja 10 – 20 40
KH
2
PO
4
0,35 0,7
(NH
4
)
2
SO
4
2,0 4,0
MgSO
4
7H
2
O 0,28 0,56
CaCl
2
2H
2
O 0,01 0,02
Citrato Férrico Amoniacal 0,06 0,12
Solução de Elementos Traços* 2 mL/L 4 mL/L
NaCl 1,0 1,0
Os valores limitantes de nitrogênio dados pela concentração do composto
(NH
4
)
2
SO
4
nos meios MM1, MM2 e MM3 foram calculados baseados em os fator
de conversão de nitrogênio à biomassa residual (Y
Xr/N
) de ensaios realizados no
IPT utilizando açúcares como fonte de carbono (TAVARES et al. 2004).
40
Tabela 12 - Resumo dos ensaios realizados em biorreator.
Concentração de óleo
de soja (g/L)
Grupo de
Ensaio
Bactéria Ensaio
Crescimento
Acúmulo
Meio
Mineral
B48-20
10 10 MM3
B48-40
20 20 MM3
Burkholderia
cepacia
B48-80
40 40 MM4
B26-20
10 10 MM3
B26-40
20 20 MM3
B26-80
40 40 MM4
Influência da
concentração
de substrato
Cupriavidus
necator
B26-80*
40 40 MM4
Ensaio B26-80*: inóculo realizado no meio mineral MM3 com 10g/L de óleo de soja.
4.6 Metodologias Analíticas
Amostras dos ensaios foram coletadas periodicamente para determinação
de concentração de biomassa total (Xt), concentração de biomassa residual (Xr),
teor de polímero acumulado (%P3HB), concentração de nitrogênio (N) e estimativa
de óleo de soja consumido, bem como realização do balanço dos gases de entrada
e efluente (CO
2
e O
2
) nos ensaios realizados em biorreatores.
Nos ensaios realizados em frascos agitados (Tabela 10) a amostragem foi
feita utilizando uma micro pipeta de 10 ml, marca Eppendorf Research, e nos
ensaios realizados em biorreator (Tabela 12) a amostragem foi realizada
empregando-se o dispositivo de amostragem do próprio biorreator.
4.6.1 Concentração celular
A concentração da biomassa total foi determinada centrifugando-se
alíquotas de 10 mL do cultivo (10.000 rpm, 10 min, 4ºC). Como nos cultivos foi
empregado óleo de soja, as células foram resuspensas em solução salina
contendo cloreto de sódio (10%) e TWEEN 80 (0,1%) e novamente centrifugadas
(10.000 rpm, 10 min, 4ºC). Posteriormente as células desta segunda centrifugação
foram suspensas em água e filtradas em membranas de poro 0,45 µm (Millipore). A
membrana com as células foram secas a 105ºC até massa constante, resfriadas
em dessecador por 20 min e pesadas em balança analítica, obtendo-se assim
massa seca, presente no volume amostrado.
41
A concentração de biomassa residual (Xr) foi definida como:
Xr = Xt – P3HB (1)
Em que:
Xt : concentração da biomassa total (g/L)
P3HB: concentração do polímero (g/L)
4.6.2 Concentração de óleo de soja
A estimativa da concentração do óleo de soja foi realizada por
procedimento proposto por Kahar et al., (2004), que consiste em extração dos
solúveis de uma amostra do meio de cultivo em hexano, onde 10 mL de meio de
cultura é misturado com 10 mL de hexano e agitado vigorosamente por 1 min.
Depois de separadas as duas fases, orgânica e inorgânica, 5 mL da fase orgânica
(superior) é transferida a um tubo pré-pesado e submetida à evaporação do
solvente a temperatura ambiente para posterior pesagem do resíduo, expressando-
se o valor em massa de óleo de soja/volume da amostra.
4.6.3 Concentração de nitrogênio
As concentrações de nitrogênio foram determinadas pela análise do
sobrenadante filtrado proveniente das amostras da cultura, em potenciômetro
(Procyon – mod. SA720) com eletrodo específico para a detecção de amônia
(Orion – mod. 95-12) após alcalinização da amostra com NaOH 10M, onde o íon
NH4
+
proveniente do (NH
4
)
2
SO
4
existente no meio de cultura é deslocado sob a
forma de NH
3
. A calibração deste foi realizada com o uso de soluções de
(NH
4
)
2
SO
4
contendo aproximadamente 10, 25, 50, 100, 250 e 500 ppm de
nitrogênio.
42
4.6.4 Concentração e teor de polímero
A determinação de P3HB foi realizada por cromatografia gasosa (GOMEZ
et al, 1996) utilizando-se uma coluna capilar HP5, operando na faixa de 100 a
210ºC, utilizando gás hélio como gás de arraste a uma vazão de 0,8 mL/min.
A amostra, cerca de 20 mg de célula liofilizada, foi previamente submetida
a propanólise. A propanólise consistiu no tratamento de células liofilizadas com
0,20 mL de uma solução de ácido benzóico (40 g/L), 2,0 mL de solução de ácido
clorídrico em propanol (1:4 v/v) e 0,20 de 1,2-dicloroetano. Os tubos foram
fechados, agitados vigorosamente e mantidos em banho-maria por 3 horas a
100ºC. Após o resfriamento, foram adicionados 4,0 mL de água destilada,
agitando-se novamente. A fase orgânica contendo os propil-ésteres foi injetada no
cromatógrafo para qualificação e composição dos polihidroxialcanoatos (RIIS e
MAI, 1988). O mesmo procedimento foi feito para determinar as curvas padrões,
utilizando desta vez padrões conhecidos contendo 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0
mg de P3HB com 100% de pureza.
O teor do polímero foi calculado pela relação:
)100(
3
3%
Xt
HBP
HBP = (2)
e expresso em porcentagem do peso da biomassa total (%P3HB)
Em que:
P3HB: concentração de polímero (g/L)
Xt : concentração da biomassa total (g/L)
4.6.5 Composição dos gases de saída (CO
2
e O
2
)
A composição dos gases de saída do biorreator foi medida “on line” por
analisadores de gases acoplados à saída do biorreator: analisador paramagnético
43
de oxigênio marca Hartman Braun, modelo 6G e analisador infravermelho de gás
carbônico marca Hartman Braun, modelo Uras.
O cálculo da velocidade de consumo de O
2
(OUR - oxygen uptake rate) e
velocidade de produção de CO
2
(CER - carbon dioxyde evolution rate) foram
calculados pelo balanço gasoso, durante os experimentos em biorreator com o
auxílio das seguintes equações, conforme procedimento utilizado. (AUGUSTO,
1998).
R
se
V
oo
OUR
)()(
000.60
22
φ
φ
−
=
(4)
Em que:
OUR : velocidade de consumo de oxigênio (m mol/Lh)
(
φ
o
2
)
e
: vazão molar de oxigênio na entrada (mol/h)
(
φ
o
2
)
s
: vazão molar de oxigênio na saída (mol/h)
V
R
: volume do biorreator (L)
Para o cálculo de (
φ
o
2
)
e
:
e
Ar
e
T
R
p
o )
.
.
(2095,0)(
2
Φ
=
φ
(5)
Em que:
p : pressão total do biorreator (atm)
Φ
Ar e
: vazão volumétrica de aire na entrada (L/h)
R : constante universal dos gases (atm.L/mol.K)
T : temperatura do biorreator (K)
Para o cálculo de (
φ
o
2
)
s
:
44
−−
Φ
=
s
e
Ar
s
coo
TR
p
o
o
)
100
%%100
(
)
.
.
(79,0
100
%
)(
22
2
2
φ
(6)
Em que:
%O
2
: porcentual de oxigênio no gás efluente do biorreator (%)
%CO
2
: porcentual de dióxido de carbono no gás efluente do biorreator
(%)
A velocidade de produção de gás carbônico foi igualmente obtida do
balanço gasoso, como mostrado a seguir:
R
se
V
coco
CER
)()(
000.60
22
φ
φ
−
=
(7)
Em que:
CER : velocidade de produção de gás carbónico (m mol/Lh)
(
φ
co
2
)
e
: vazão molar de gás carbónico na entrada (mol/h)
(
φ
co
2
)
s
: vazão molar de gás carbónico na saída (mol/h)
V
R
: volume do biorreator (L)
Para o cálculo de (
φ
co
2
)
e
:
e
Ar
e
T
R
p
o )
.
.
(0005,0)(
2
Φ
=
φ
(8)
Em que:
p : pressão total do biorreator (atm)
Φ
Ar e
: vazão volumétrica de ar na entrada (L/h)
R : constante universal dos gases (atm.L/mol.K)
T : temperatura do biorreator (K)
45
Para o cálculo de (
φ
o
2
)
s
:
−−
Φ
=
s
e
Ar
s
coo
TR
p
co
co
)
100
%%100
(
)
.
.
(79,0
100
%
)(
22
2
2
φ
(9)
Em que:
%O
2
: porcentual de oxigênio no gás efluente do biorreator (%)
%CO
2
: porcentual de dióxido de carbono no gás efluente do biorreator
(%)
A velocidade especifica de consumo de O
2
foi calculada pela equação a
seguir:
Xr
OUR
QO2 = (10)
Em que:
QO
2
: velocidade especifica de consumo de O
2
(mmol/g h)
OUR : velocidade de consumo de oxigênio (m mol/Lh)
Xr : concentração de células residuais (g/L)
Os fatores de conversão de substratos a polímero e a células foram
definidos respectivamente, como sendo:
Scons
P3HBo-P3HB
YP3HB/S = (11)
Scons
Xro-Xr
YXr/S = (12)
Em que:
P3HB
o
: concentração inicial de polímero (g/L)
Xr
o
: concentração inicial de células residuais (g/L)
Scons : quantidade de substrato consumido (g).
46
A velocidade de crescimento celular (µ
Xr
) foi analisada pela correlação
entre o ln da concentração de biomassa residual (ln Xr) e o tempo de cultivo. A
correlação linear entre estas grandezas identifica uma fase de crescimento
exponencial e o coeficiente angular desta correlação é a velocidade específica de
crescimento celular que é uma constante durante a fase exponencial deste
crescimento. Esta correlação está representada pela equação 13, a seguir:
ln Xr = µ
Xr
. t + ln Xo (13)
47
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste capítulo são apresentados e discutidos os 8 ensaios realizados em
frascos agitados entre linhagens dos gêneros Burkholderia, Cupriavidus e
Alcaligenes, e os 7 ensaios realizados em biorreator com as linhagens dos
gêneros Burkholderia e Cupriavidus. Estes oito primeiros ensaios tiveram por
objetivo selecionar os microrganismos com maior produtividade na produção de
P3HB a partir de óleo de soja verificando qual limitação, nitrogênio (N) ou fósforo
(P), é a mais favorável ao acúmulo de P3HB a partir deste óleo vegetal.
Os sete ensaios conduzidos em biorreatores tiveram por objetivo estudar
a influência da concentração de substrato na fase de crescimento e de acúmulo do
biopolímero, utilizando duas linhagens previamente selecionadas dos oito primeiros
ensaios que foram realizados em frascos agitados.
Todas as Figuras apresentadas neste capítulo representam valores
experimentais e os calculados a partir deles.
Embora a produção de P3HB tenha sido descrito na literatura, a maioria
dos trabalhos citados utilizaram carboidratos diversos como fonte de carbono
(SILVA et al., 2004; RYU et al., 1997; LEE et al., 1997, WANG e LEE, 1997;
PATAQUIVA, 2003; TAVARES et al., 2004), e mesmo alguns autores tenham
apresentado resultados utilizando óleos vegetais ou algum dos seus componentes
como fonte de carbono (KAHAR et al., 2004; TSUGE et al., 2004a, FUKUI e DÓI,
1998; EGGINK et al., 1993), as informações são muito limitadas.
5.1 Seleção de linhagem
Os resultados apresentados nas Figuras 11 A, B, C e D e Figuras 12 A, B,
C, D se referem aos grupos de ensaios realizados em frascos agitados (Tabela 10).
Estes oito ensaios tiveram por objetivo selecionar os microrganismos com maior
produtividade no processo de produção de P3HB a partir de óleo de soja entre as
linhagens Burkholderia cepacia IPT-48, Burkholderia cepacia IPT-64, Cupriavidus
48
necator IPT-26 e Alcaligenes latus IPT-29, verificando qual limitação, nitrogênio (N)
ou fósforo (P), é a mais favorável ao acúmulo de P3HB a partir deste óleo vegetal.
Neste grupo de ensaios foi utilizada uma concentração inicial de óleo de
soja não inibitória de 15 g/L. Este valor da concentração inicial foi baseado em
dados reportados na literatura Tsuge et al., 2004a utilizaram uma concentração
inicial de óleo de soja para produção de PHAs de 20 g/L em frascos agitados, e
Fukui e Dói, 1998 utilizaram uma concentração de óleo de oliva de 5 e 10 g/L para
produção de PHAs.
5.1.1 Comportamento das bactérias utilizando meio mineral com limitação
em nitrogênio: MM1
A concentração de nitrogênio em MM1 para as linhagens IPT-48, IPT-26 e
IPT-64, mostrou um decréscimo desde o início do cultivo, atingindo-se valores de
24,52 mg/L para IPT-48, 2,62 mg/L para IPT-26 e 3,80 mg/L para IPT-64 em 48 h
de cultivo (Figura 11 A). Estes valores de concentração de nitrogênio podem ser
considerados limitantes. A Figura 11 C, mostra que é exatamente em 48 horas que
cessou o aumento de Xt para a IPT-26 e IPT-64. Já o valor de Xt da linhagem IPT-
48 continuou crescendo ate 72 h, devido a possível acúmulo de P3HB entre 48 e
72 horas (Figura 11 D). Para a linhagem IPT-29 nenhum consumo de nitrogênio foi
observado.
Observou-se o consumo de óleo de soja (Figura 11 B), para as três
linhagens que tiveram consumo de nitrogênio. A IPT-48 e a IPT-64 apresentaram
consumo de óleo de soja até 72 horas; já o consumo de óleo para a IPT-26 cessou
em 48 horas, mesmo tempo onde se deu a limitação de nitrogênio (Figura 11 A).
Este fato seguramente teve influência no acúmulo de P3HB para a IPT-26, onde
entre 48 a 72 horas observou-se diminuição de teor de P3HB de 34,8% para 24%
(Figura 11 D). Embora a IPT-64 tenha consumido óleo de 48 a 72 horas, também
houve queda de acúmulo de P3HB. Aparentemente as linhagens IPT-64 e IPT-26
têm metabolismo mais rápido quando comparada à IPT-48, e em 48 horas,
limitadas em óleo de soja com valores em torno de 5g/L, mobilizariam as reservas
49
deP3HB como fonte de energia para sua manutenção. A queda de pH observada,
apresentada a seguir (Figura 13), em conjunto com a exaustão de nitrogênio pode
ter contribuído também para este mecanismo.
O consumo de óleo de soja para a linhagem IPT-29 foi extremamente
baixo, comparado às outras linhagens (Figura 11 B). Também não mostrou
crescimento de Xt e nem acúmulo de P3HB.
0
100
200
300
400
500
600
0 24 48 72
t (h)
N (mg/L)
F29-(N) F64-(N)
F48-(N) F26-(N)
0
10
20
30
40
50
0 24 48 72
t (h)
Óleo (g/L)
F29-(N) F64-(N)
F48-(N)
F26-(N)
0
2
4
6
8
10
0 24 48 72
t (h)
Xt (g/L)
F29-(N) F64-(N)
F48-(N)
F26-(N)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
48 72
t (h)
P3HB (%)
F64-(N) F48-(N) F26-(N)
Figura 11. Evolução da concentração de nitrogênio N (A), evolução da concentração de
óleo de soja (B), evolução da concentração de biomassa total Xt (C) e
porcentagem de acúmulo de P3HB (D) para os ensaios F29(N), F64(N), F48(N),
F26(N), utilizando as linhagens A. latus IPT-29, B. cepacia IPT-64, B. cepacia
IPT- 48 e C.necator IPT-26, cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio
(MM1) em frascos agitados, utilizando óleo de soja como fonte de carbono.
A B
C D
50
5.1.2 Comportamento das bactérias utilizando meio mineral com limitação
em fósforo: MM2
Também foi verificado o consumo de nitrogênio no MM2, com
concentrações residuais acima de 50 mg/L ate 72 horas de cultivo (Figura 12 A).
Nesta mesma Figura se observa que os dados experimentais das concentrações
iniciais oscilam entre 50 e 340 mg/L de nitrogênio, devido à interferência do óleo na
análise de nitrogênio especificamente para este meio. Na teoria os valores devem
estar na ordem de 317 mg/L, se forem calculados tomando como referência o valor
prático de (NH
4
)
2
SO
4
utilizado na preparação do MM2 (Tabela 8).
Quanto ao óleo de soja, as linhagens IPT-64, IPT-48 e IPT-26 mostraram
maior consumo quando comparadas à IPT-29 (Figura 12 B); se observa também
que para essas três linhagens a concentração de óleo de soja de 48 a 72 horas
não apresentou muita variação que possa ter afetado o crescimento de Xt. Como
se observa na Figura 12 C, a concentração de biomassa estabilizou-se em 48
horas para as três linhagens. Embora o consumo de óleo nos dois meios minerais
MM1 e MM2 tenha sido similar, a concentração de Xt é diferente. No melhor dos
resultados a IPT-48 conseguiu uma concentração final de Xt de 6,71 g/L no MM1 e
4,08 g/L no MM2 com 72 horas de cultivo, as linhagens IPT-64 e IPT-26 mostram
valores de cerca de 5,0 g/L no MM1 e não superam 3,5 g/L no MM2 em 48 horas
de cultivo. Por dificuldade metodológica a concentração de fósforo não pode ser
realizada. A Figura 12 A mostra uma concentração de nitrogênio acima de 50 mg/L
para as linhagens testadas. Observa-se também um platô de Xt a partir de 48
horas. Desta maneira acredita-se ter havido uma limitação em fósforo a partir de 48
horas.
O maior acúmulo de P3HB em MM2 é de 37,18% para a linhagem IPT-48,
valor que fica constante de 48 a 72 horas de cultivo (Figura 12 D). As linhagens
IPT-64 e IPT-26 apresentaram o mesmo comportamento quando foram cultivadas
em MM1. No período de 48 a 72 horas de cultivo observa-se um decréscimo na
concentração de P3HB de 14% a 13% e de 24% a 20%, respectivamente. A
51
linhagem IPT-29 também não apresentou crescimento nem acúmulo de P3HB no
MM2.
0
100
200
300
400
500
600
0 24 48 72
t (h)
N (mg/L)
F29-(P) F64-(P)
F48-(P) F26-(P)
0
10
20
30
40
50
0 24 48 72
t (h)
Óleo (g/L)
F29-(P) F64-(P)
F48-(P) F26-(P)
0
2
4
6
8
10
0 24 48 72
t (h)
Xt (g/L)
F29-(P) F64-(P)
F48-(P)
F26-(P)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
48 72
t (h)
P3HB (%)
F64-(P) F48-(P) F26-(P)
Figura 12. Evolução da concentração de nitrogênio N (A), evolução da concentração de
óleo de soja (B), evolução da concentração de biomassa total Xt (C) e
porcentagem de acúmulo de P3HB (D) para os ensaios F29(P), F64(P), F48(P),
F26(P), utilizando as linhagens A. latus IPT-29, B. cepacia IPT-64, B. cepacia
IPT- 48 e C.necator IPT-26, cultivados em meio mineral limitado em fósforo
(MM2) em frascos agitados, utilizando óleo de soja como fonte de carbono.
C D
A B
52
5.1.3 Variação do pH
Foi proposto que o pH ideal que favorece tanto o crescimento como o
acúmulo de bactérias produtoras de P3HB, é da ordem de 7,0 (GOMEZ et al.,
1997). Nos ensaios realizados com as linhagens IPT-48, IPT-26 e IPT-64, o pH
decresce rapidamente desde um valor de 7,0 no início do ensaio, estabilizando-se
depois de 48 h de cultivo em um valor médio de 4,0 (Figura 13). O decréscimo do
pH pode ser atribuído ao consumo dos íons amônio bem como o metabolismo dos
ácidos graxos livres provenientes da quebra do óleo de soja por ação das lípases
bacterianas (STRYER et al., 2004). Nestes oito ensaios foram utilizados dois
tampões como foi indicado na Tabela 8, tampão fosfato para o MM1 composto de
KH
2
PO
4
(1,5 g/L) e Na
2
HPO
4
(3,54 g/L), e tampão TRIS (12,0 g/L) para o MM2,
neste último meio mineral foram testadas inicialmente concentrações de TRIS com
6,0 g/L, e o pH teve a mesma tendência de decréscimo (dados não mostrados).
A concentração de Na
2
HPO
4
utilizado como tampão no meio mineral
limitado em nitrogênio MM1 de 3,54 g/L não foi suficiente para manter o pH em 7
quando se utiliza óleo de soja como fonte de carbono. Ramsay et al., 1990
utilizaram 6,7 g/L de tampão fosfato Na
2
HPO
4
.7H
2
O, e Yamane et al., 1996 utilizou
9,0 g/L de Na
2
HPO
4
ambas referências da literatura utilizaram açúcares como fonte
de carbono, o pH nestes casos foi mantido em torno de 7. Ficou claro que tanto o
tampão fosfato utilizado no meio MM1, quanto o uso de TRIS no meio MM2 nas
concentrações empregadas, não foram suficientes para a estabilização do valor de
pH para níveis adequados à síntese do polímero.
Embora tenha havido consumo elevado das fontes de carbono e
nitrogênio, provavelmente o teor de P3HB e os valores de biomassa total
alcançados poderiam ter sido maiores, se o pH, entre outros fatores difíceis de
controlar em frascos agitados, fossem mantidos em níveis mais adequados, como
observado nos ensaios em biorreator.
53
3
4
5
6
7
8
0 24 48 72
t (h)
pH
F29-(N) F29-(P) F64-(N) F64-(P)
F48-(N) F48-(P) F26-(N) F26-(P)
Figura 13 - Variação do pH com o tempo para os ensaios F29(N), F64(N), F48(N), F26(N),
F29(P), F64(P), F48(P), F26(P) utilizando as linhagens A. latus IPT-29, B.
cepacia IPT-64, B. cepacia IPT- 48 e C.necator IPT-26, cultivados em meio
mineral limitado em nitrogênio (MM1) e meio mineral cultivado em fósforo
(MM2) em frascos agitados, utilizando óleo de soja como fonte de carbono.
5.1.4 Escolha das linhagens
Foram cultivadas um total de 4 linhagens utilizando-se óleo de soja como
fonte de carbono, em dois meios minerais diferentes: um limitado em nitrogênio
(MM1) e outro limitado em fósforo (MM2). A linhagem IPT-29 (Alcaligenes latus),
nas condições testadas, exibiu baixo consumo de substratos e baixos valores de
crescimento celular e acúmulo de polímero. Ensaios complementares realizados
para esta linhagem com a concentração inicial de óleo de 6,0 g/L, para verificar
possível inibição por substrato, também não conduziram a resultados significativos
em termos de crescimento e acúmulo de polímero (dados não mostrados). Já na
literatura se reporta valores de crescimento e acúmulo de P3HB para A. latus,
utilizando carboidratos com fonte de carbono. Segundo Ramsay et al., 1990 A.
latus consegue um teor de P3HB de 43% em meio limitado em nitrogênio
54
alimentada com sacarose, ao contrário da C.necator que nas mesmas condições
de cultivo acumulou só 33% de P3HB.
Por outro lado, as linhagens IPT-48, IPT-26 e IPT-64 mostram
crescimento celular e acúmulo de P3HB maiores. Os crescimentos das linhagens
IPT-48, IPT-26 e IPT-64 no meio mineral limitado em fósforo, MM2, foram menores
quando comparados ao MM1.
Os fatores de conversão de óleo de soja a biomassa total (Y
X/S
) e de óleo
de soja a P3HB, (Y
P3HB/S
), foram calculados e os maiores valores foram observados
para a IPT-48 cultivada em meio mineral limitado em nitrogênio, MM1, (Tabela 13).
Tabela 13 - Produção de P3HB em frascos agitados (200 rpm, 30
o
C, pH inicial = 7,
% P3HB inicial = 0) para diferentes linhagens em meios minerais
limitados em nitrogênio MM1e fósforo MM2, contendo óleo de soja
como fonte de carbono.
ND = não determinado.
Nestes oito ensaios evidenciou-se a possibilidade de se usar linhagens
bacterianas, originalmente empregadas na produção de P3HB a partir de
carboidratos, como agentes de biossíntese deste biopolímero a partir de óleo
vegetal como fonte de carbono, demonstrando a grande flexibilidade destes
microrganismos. O estudo indicou que as linhagens mais promissoras foram IPT-
48 e IPT-26, seguida de IPT-64. Somente a linhagem IPT-29, do gênero
LIMITAÇÃO EM NITROGÊNIO: MM1
Biomassa total (g/L)
Concentração de
óleo de soja (g/L)
Linhagem
Tempo
cultivo
(h)
inicial final
pH
final
inicial final
P3HB
(%)
Y
P3HB/S
Y
X/S
IPT-48 72 0,34 6,71 4,26 16,94 5,54 37,08 0,22 0,56
IPT-64 48 0,79 4,62 4,01 18,54 5,32 22,80 0,08 0,29
IPT-26 48 0,07 4,58 5,02 17,24 5,10 33,88 0,13 0,37
IPT-29 48 0,15 0,29 6,90 20,85 10,80 ND ND 0,01
LIMITAÇÃO EM FÓSFORO: MM2
Biomassa total (g/L)
Concentração de
óleo de soja (g/L)
Linhagem
Tempo
cultivo
(h)
inicial final
pH
final
inicial final
P3HB
(%)
Y
P3HB/S
Y
X/S
IPT-48 72 0,44 4,08 4,00 14,50 3,62 37,18 0,14 0,33
IPT-64 48 0,36 1,99 4,01 16,52 3,16 13,07 0,02 0,12
IPT-26 48 0,26 3,45 4,91 16,64 10,40 22,21 0,12 0,51
IPT-29 48 ND 0,16 6,91 20,02 10,58 ND ND 0,001
55
Alcaligenes latus, mostrou pouco consumo dessa fonte de carbono. O valor
máximo de teor de acúmulo de P3HB foi de 37% (IPT-48) em meios limitados em
nitrogênio e fósforo alcançando-se valores de Xt de 6,71 e 4,08 g/L
respectivamente, seguido de IPT-26, com 34% de teor de P3HB com produção de
Xt de 4,58 g/L, em meio limitado em nitrogênio. Alias e Tan, 2005 isolaram
bactérias de efluente de fabricação de óleo de palma, que utilizam diretamente o
óleo de palma para síntese de PHA. Os autores relatam que dois desses isolados
foram capazes de produzir P3HB e um deles denominado FLP1, é uma bactéria
gram negativa, com um 80% de similitude à Burkholderia cepacia. Este isolado
conseguiu valores de Xt=4,2 g/L e 50% de P3HB com 1% (p/v) (10 g/L) de
concentração inicial de óleo aproximadamente. Este valor é menor que o
conseguido no presente trabalho, mas o acúmulo de P3HB é superior. Com
respeito a linhagem IPT-26 os valores obtidos neste primeiro grupo de ensaios de
seleção de linhagem foi similar a os obtidos na literatura com relação à Xt, mas o
teor de acúmulo foi bem menor. Fukui e Dói, 1998 estudando C. necator cultivada
em diversos óleos vegetais (oliva, milho, palma e ácido oléico) como fonte de
carbono em meio mineral limitado em nitrogênio, reportaram valores de Xt de 3,6 –
4.3 g/L com 79 – 80% de P3HB acumulado. Tsuge et al., 2004a apresentaram um
valor de Xt de 3,2 g/L e 83% de teor de PHA utilizando também C.necator e óleo
de soja como fonte de carbono Os resultados mostraram que o fator de conversão
Y
P3HB/S
é muito baixo (máximo de 0,22 g/g), mostrando possibilidades para a sua
otimização em direção ao valor máximo teórico, apontado na literatura como sendo
de cerca de 1,0 g/g (KAHAR et al., 2004). Eggink et al., 1993 conseguiram um fator
de conversão Y
P3HB/S
igual a 0,59 g/g utilizando ácido oléico como única fonte de
carbono em C. necator. A queda do valor do pH para cerca de 4,0 e a baixa
capacidade de transferência de oxigênio encontrada nos frascos agitados devem
ter contribuído negativamente para o desempenho das linhagens testadas.
Como se verá a seguir, os ensaios realizados em biorreator confirmaram
esta hipótese.
56
5.2 Influência da Concentração de Substrato: Ensaios em Biorreator
Os resultados apresentados nas Figuras seguintes referem-se aos grupos
de ensaios feitos em biorreator (Tabela 12) com as linhagens Burkholderia cepacia
IPT-48 e Cupriavidus necator IPT-26 (escolhidas do grupo de ensaios seleção de
linhagens, item 5.1), em meio mineral limitado em nitrogênio (MM3 e MM4, Tabela
11), através de um processo descontinuo alimentado em duas bateladas
sucessivas. Estes sete ensaios tiveram por objetivo estudar a influência da
concentração de óleo de soja na fase de crescimento celular e de acúmulo do
biopolímero.
5.2.1 Ensaios com Burkholderia cepacia IPT-48
5.2.1.1 Consumo das fontes de nitrogênio e de carbono
Como relatado anteriormente, um dos pré-requisitos para o acúmulo de
PHAs é a limitação de uma das fontes essenciais ao crescimento. Nestes ensaios
pretendeu-se provocar uma limitação da fonte de nitrogênio através da mudança
da solução de controle de pH, de NH
4
OH aquosa 1:3 para NaOH 4N, procedimento
largamente empregado em nosso laboratório e transferido para a indústria de
produção de P3HB que opera em nosso país (PRADELLA, comunicação pessoal
1
).
Este procedimento foi realizado no momento em que a fonte carbono, dado pela
concentração de óleo vegetal do meio de cultura da primeira batelada, estivesse
abaixo de 5,0 g/L. Para o ensaio B48-20 (Figura 14 B) este momento se deu a 14
horas de cultivo. A partir deste instante, observou-se diminuição da concentração
de nitrogênio. Em seguida, isto é, imediatamente após dar-se início ao controle de
pH com NaOH, realizou-se a alimentação da segunda batelada de óleo de soja,
para favorecer ao acúmulo de polímero. A mesma estratégia foi utilizada para os
ensaios B48-40 e B48-80, nos quais se cessou a alimentação de NH
4
OH (Figura
14 A) e se alimentou a segunda batelada de óleo a 21h e 18 hr do cultivo,
respectivamente (Figura 14 B). Para os três ensaios, observou-se o decréscimo da
concentração de óleo da segunda batelada havendo consumo total do substrato a,
respectivamente, 32 e 45 h para os ensaios B48-20 e B48-40. No ensaio B48-80 a
1
PRADELLA, J. G. C, São Paulo, 2006 (comunicação pessoal)
57
partir de 30 horas não foi possível realizar o análise de óleo de soja (Figura 14 B)
porque o meio de cultivo apresentou formação de muco que não propiciava a
separação de fases durante a metodologia de análise. Quando foram feitos os três
ensaios com esta linhagem IPT-48, os meios de cultivo apresentaram muitas
variações durante o processo de fermentação. Se observou, a cerca de 10 horas
de cultivo a presença de flocos de cor alaranjada, que duas horas depois foram se
dispersando no próprio meio de cultivo. Acredita-se que esses flocos formados são
compostos a base de ácidos graxos livres que foram formados pelo metabolismo
dessa linhagem. Os meios de cultivo também apresentaram uma coloração
alaranjada a qual se intensificou ao longo do processo. Outra característica destes
três ensaios é a consistência gomosa do meio, bastante intensa no ensaio B48-80.
58
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 10 20 30 40 50
t (h)
N (mg/L)
B48-20 B48-40
B48-80
0
10
20
30
40
50
0 10 20 30 40 50
t (h)
Óleo (g/L)
B48-20 B48-40 B48-80
Figura 14 - Evolução da concentração de nitrogênio N (A) e evolução da concentração de
óleo de soja (B), para os ensaios B48-20, B48-40 cultivados em meio mineral
limitado em nitrogênio MM3 e o ensaio B48-80 cultivado em meio mineral
limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem Burkholderia cepacia IPT-
48 em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte de carbono.
A
B
59
Os comportamentos das curvas de nitrogênio dos três ensaios B48-20,
B48-40 e B48-80 (gráfico 14 A), mostraram-se crescentes até o instante em que a
fonte de NH
4
OH foi cortada, isto é a 14, 21 e 18 horas respectivamente. A
explicação para este comportamento é que neste processo de produção de P3HB
com a linhagem IPT-48 (Burkholderia cepacia), o meio de cultura no biorreator
ficou mais acidificado, e a quantidade de OH
-
necessária para manutenção do pH
em 7 estava desbalanceada em relação a quantidade de NH4
+
que a célula utiliza
para seu crescimento. Desta maneira verificou-se no meio de cultura, acúmulo de
nitrogênio.
Uma vez trocada a solução de NH
4
OH para NaOH para manter o pH em
7, o nitrogênio no meio decresce. No ensaio B48-40 não se observou essa
tendência de decréscimo devido à troca de soluções ter sido feita atrasada. No
intento de ver consumido todo o óleo adicionado, houve acúmulo excessivo de
nitrogênio no meio, nitrogênio que não foi mais consumido pela bactéria porque
estava limitada em óleo de soja (concentração de 3,5 g/L) (Figura 14 A).
O consumo total e parcial de NH
4
OH em gramas para cada um dos três
ensaios estão representados nas Figuras 15 A e B, em que se corrobora que a
troca de soluções devia ter sido feita em 16 horas de cultivo para o ensaio B48-40
e não em 21 horas como efetivado.
60
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 10 20 30 40 50
t(h)
consumo total de NH
4
OH (g)
B48-20 B48-40 B48-80
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 10 20 30 40 50
t(h)
consumo NH
4
OH (g)
B48-20 B48-40
B48-80
Figura 15 - Consumo total da massa de NH
4
OH (A) e consumo a diferentes tempos da
massa de NH
4
OH (B), para os ensaios B48-20, B48-40 cultivados em meio
mineral limitado em nitrogênio MM3 e o ensaio B48-80 cultivado em meio
mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem Burkholderia
cepacia IPT- 48 em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte de carbono.
B
A
61
5.2.1.2 Variação da biomassa total, da biomassa residual e do teor de P3HB
Para o ensaio B48-20 a formação de biomassa total (Xt) alcançou-se um
valor máximo de cerca de 15 g/L e de biomassa residual (Xr), de cerca de 10 g/L
(Figuras 16 A e B) em 22 h de cultivo. Neste tempo houve um acúmulo de polímero
de 4,3 g/L (Figura 17 A). Comportamento similar de crescimento foi observado para
o ensaio B48-40, onde com 45 horas de cultivo obtiveram-se máximos valores de
concentração de Xt igual a 24,3 g/L e de Xr igual a 15,6 g/L (Figura 16 A e B) e de
P3HB de cerca de 9 g/L (Figura 17 A).
A estratégia de se utilizar concentração de óleo de soja mais elevada no
ensaio B48-80 (duas bateladas de 40 g/L cada) para atingir valores da biomassa
total maiores que as obtidas nos ensaios B48-20 e B48-40, não logrou resultados
muito melhores. Foram observados os seguintes valores: Xt = 37g/L, Xr = 19,87 g/L
(Figura 16 A e B) e um teor de P3HB = 55% (Figura 17 B).
62
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
t (h)
Xt (g/L)
B48-20 B48-40 B48-80
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50
t (h)
Xr (g/L)
B48-20 B48-40 B48-80
Figura 16 - Evolução da concentração de biomassa total Xt (A) e evolução da
concentração de biomassa residual Xr (B), para os ensaios B48-20, B48-40
cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM3 e o ensaio B48-80
cultivado em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a
linhagem Burkholderia cepacia IPT- 48 em biorreator, utilizando óleo de soja
como fonte de carbono.
B
A
63
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 10 20 30 40 50
t (h)
P3HB (g/L)
B48-20 B48-40 B48-80
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
t (h)
P3HB (%)
B48-20 B48-40 B48-80
Figura 17 - Evolução da concentração de P3HB acumulado expresso em g/L (A) e
evolução da concentração de P3HB acumulado expresso em porcentagem
(B), para os ensaios B48-20, B48-40 cultivados em meio mineral limitado
em nitrogênio MM3 e o ensaio B48-80 cultivado em meio mineral limitado
em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem Burkholderia cepacia IPT-48 em
biorreator, utilizando óleo de soja como fonte de carbono.
A
B
64
É interessante destacar que aparentemente houve crescimento celular
durante boa parte do cultivo até praticamente o ponto de esgotamento da fonte de
nitrogênio a 20 horas para os ensaios B48-20 e B48-40. A biossíntese do polímero
aparentemente estava associada a este crescimento (Figuras 16 e 17), diferente
dos resultados que foram obtidos anteriormente na produção de PHAs por diversas
linhagens a partir de carboidratos (SÁNCHEZ, et al.,2003; DU et al., 2001; KIM, et
al, 1994).
Na Figura 17 A e B se observa que para os três ensaios B48-20, B48-40 e
B48-80, o maior acúmulo de P3HB ocorreu a partir de 10 horas de cultivo até 15,
21 e 18 horas respectivamente. É a partir de 10 horas também que na Figura 16 B,
se observa o crescimento da bactéria. Destaca-se que nesses intervalos de tempo
o meio de cultivo ainda estava provido de nitrogênio. Segundo Doi, 1990, o P3HB
acumulado deveria ser pequeno quando comparado à segunda etapa do processo
de produção, onde com o meio limitado em nitrogênio a bactéria pararia de crescer
e o acúmulo de P3HB seria efetuado em maiores quantidades, comportamento que
não ocorre nestes ensaios. O valor de Xt cessou de aumentar em torno de 24
horas com valores de 10 g/L para os ensaios B48-20 e B48-40 e em torno de 20
g/L para o ensaio B48-80 quando o nitrogênio se encontrou limitado no meio com
valores menores a 200 mg/L (Figura 14 A), mas o acúmulo de P3HB acumulado
depois destas 24 horas não é muito superior quando comparado ao acúmulo de
P3HB observado no intervalo de tempo entre 10 e 24 horas aproximadamente
(Tabela 14). Segundo Ramsay et al., 1990 concentrações de amônia abaixo de
200 mg/L são consideradas limitantes.
Tabela 14 - Comparação de crescimento celular Xr e acúmulo de P3HB ao final de
cada batelada de óleo de soja adicionada para os ensaios realizados
em biorreator empregando a linhagem IPT-48.
ND=não determinado
Final do intervalo de
tempo onde o meio de
cultivo tem fonte de
nitrogênio (até 24 h)
Final do intervalo de
tempo onde o meio de
cultivo está limitado em
nitrogênio (após 24 h)
Ensaio
Xr
inicial
(g/L)
P3HB
inicial
(%)
Xr (g/L) P3HB (%) Xr (g/L) P3HB (%)
B48-20 ND ND 6,79 18,9 10,64 29,0
B48-40 0,09 4,67 10,08 30,13 15,62 35,77
B48-80 0,23 15,0 13,59 31,89 19,87 55,00
65
5.2.1.3 Produtividade
A produtividade do biorreator é uma medida da eficiência do sistema e
sua evolução com o tempo permite indicar quando o processo deve ser
interrompido para coleta do produto (BAILEY, 1986). Para o ensaio B48-20,
observa-se a produtividade máxima de 0,20 g/Lh de formação de produto com 22
horas de cultivo. Para o ensaio B48-40, a produtividade máxima é observada com
32 horas de cultivo com um valor de 0,26 g/Lh e no B48-80 a 27 horas de cultivo
com uma produtividade de 0,40 g/Lh (Figura 18).
Como se pode depreender os valores obtidos são muito baixos se
comparados aos da literatura (Tabela 3) e ainda muito aquém do considerado
necessário para uma produção comercialmente exeqüível de P3HB, que deve ser
superior a 1 g/Lh segundo Lee et al. 1998. A estratégia adotada para incrementar
os valores de produtividade dos ensaios B48-20 e B48-40 foi trabalhar com
concentrações mais elevadas de óleo de soja, para garantir o aumento da
biomassa total e, desta maneira o aumento da concentração de P3HB. Entretanto,
não logramos bons resultados como já discutido.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 10 20 30 40 50
t(h)
P (g/Lh)
B48-20 B48-40 B48-80
Figura 18. Evolução das produtividades em P3HB para os ensaios B48-20, B48-40
cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM3 e o ensaio B48-80
cultivado em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem
Burkholderia cepacia IPT-48 em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte
de carbono.
66
Embora os resultados obtidos no ensaio B48-80, utilizando óleo de soja
como fonte de carbono, não alcançaram os valores teóricos esperados de teor de
P3HB de 90%, fator de conversão de óleo a P3HB de 1,00 g/g (KAHAR et al.,2004)
e uma produtividade de cerca de 1,0 g/Lh como obtido por Kahar, et al, 2004, são
mesmo assim, melhores do que os valores encontrados quando se utiliza outras
fontes de carbono. Segundo Silva et al., 2004 utilizando a linhagem IPT-48
empregando bagaço de cana-de-açúcar hidrolisado como fonte de carbono
obtiveram-se os seguintes resultados: P3HB = 53%, Y
P3HB/S
= 0,29 g/g, P = 0,01
g/Lh, e empregando xilose mais glucose como fonte de carbono P3HB = 60%,
Y
P3HB/S
= 0,19 g/g, P = 0,46 g/Lh. No presente trabalho os melhores resultados com
a linhagem IPT-48 empregando óleo de soja como fonte de carbono são P3HB =
55%, Y
P3HB/S
= 0,23 g/g e P = 0,40 g/Lh, superior, portanto em produtividade e
semelhante aos outros parâmetros aos obtidos com hidrolisado.
5.2.2 Ensaios com Cupriavidus necator IPT-26
5.2.2.1 Consumo das fontes de nitrogênio e de carbono
Seguindo o procedimento adotado para os ensaios B48-20, B48-40 e
B48-80, nos ensaios B26-20, B26-40, B26-80 e B26-80* a alimentação de NH
4
OH
foi cortada e substituída por NaOH, em 14 h, 19 h, 23 h e 22 h respectivamente
(Figura 19 A), exatamente quando a primeira batelada de óleo administrada foi
consumida (Figura 19 B), em seguida adicionou-se a segunda batelada de óleo.
67
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50
t (h)
N (mg/L)
B26-20 B26-40
B26-80 B26-80*
(a)
0
10
20
30
40
50
0 10 20 30 40 50
t (h)
Óleo (g/L)
B26-20 B26-40
B26-80 B26-80*
Figura 19 - Evolução da concentração de nitrogênio N (A) e evolução da concentração de
óleo de soja (B), para os ensaios B26-20, B26-40 cultivados em meio mineral
limitado em nitrogênio MM3 e os ensaios B26-80 e B26-80* cultivados em
meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem Cupriavidus
necator IPT-26 em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte de carbono.
A
B
68
5.2.2.2 Variação da biomassa total, da biomassa residual e do teor de P3HB
Como foi discutido no item 5.2.1.2 acredita-se que a linhagem B. cepacia
IPT-48 apresenta uma característica de processo de produção de P3HB onde o
crescimento bacteriano está associado ao acúmulo de polímero. Aparentemente
para C. necator IPT-26 também se caracterizou um processo no qual a síntese de
P3HB ocorreu associada à multiplicação celular. Segundo Madison e Huisman,
1999, C. necator empregando glucose como fonte de carbono não começou o
acúmulo de P3HB ate que o seu crescimento tenha sido cessado. Por outro lado,
A. latus empregando sacarose como fonte de carbono produziu P3HB associado
ao crescimento bacteriano. Ishizaki et al., 2001 confirma este comportamento de
crescimento associado ao acúmulo para A. latus.
Analisando a Figura 21 B, observa-se para o ensaio B26-20 que o
acúmulo de P3HB encerrou-se em um tempo de 22 horas de cultivo com 48,9% de
P3HB acumulado na biomassa total. Este fato ocorreu devido ao esgotamento do
óleo de soja da segunda batelada: 10 g/L deste substrato adicionado foi consumido
e a 22 horas de processo foi observada uma concentração de 1,22 g/L (Figura 19
B). Assim, a limitação imposta pela exaustão da fonte de carbono foi a razão da
cessação do acúmulo de P3HB. A concentração de células residuais foi de cerca
de 15 g/L, a despeito do consumo total do óleo colocado nas duas bateladas, de
cerca de 20 g/L.
No ensaio B26-40 a concentração de biomassa residual (Xr) alcançada
não foi muito superior ao ensaio anterior, da ordem de 20 g/L. No entanto, foram
adicionadas ao sistema 40 g/L de óleo divididas em duas bateladas de 20 g/L
cada. Este maior aporte de fonte de carbono provavelmente deve ter sido a razão
do maior acúmulo de P3HB na biomassa com valor de 61,9% ao final do ensaio
(Figura 21 B). Novamente, para o ensaio B26-80, o acúmulo de P3HB foi
beneficiado positivamente por um maior aporte de óleo de soja, 80 g/L em duas
bateladas sucessivas de 40 g/L cada, para uma população de célula residual que
alcançou valores semelhantes aos ensaios anteriores, de cerca de 20 g/L. Neste
ensaio foram obtidos cerca de 83,88 % de P3HB em 31 horas de cultivo, havendo
69
ainda uma concentração de óleo remanescente de cerca de 9 g/L. Após 6 horas, a
37 horas de cultivo, o óleo foi consumido até uma concentração remanescente
estimada em cerca de 2 g/L. Entretanto, aparentemente não houve benefício
adicional significativo à biossíntese uma vez que o acúmulo de polímero foi
praticamente o mesmo, 83,92 %. O prolongamento da fase de acúmulo até 48 h de
cultivo não propiciou nenhum ganho adicional de acúmulo de polímero (Figuras 21
A e B). Pode-se especular se uma massa adicional de óleo tivesse acrescentado
nesse instante ao biorreator, a biomassa teria atingido a sua máxima capacidade
de acúmulo, 90% da biomassa segundo Madisson & Huisman, 1999.
Ao contrário de quando se utilizam açúcares como fonte de carbono que
podem ser diretamente utilizadas pelas células bacterianas, muitos ácidos graxos
são liberados no meio de cultura ao serem hidrolisados pelas lípases bacterianas
quando se utiliza óleos vegetais como fonte de carbono para produção de PHAs.
Segundo Kahar et al., 2004 a presença destes ácidos graxos no meio poderia
afetar o crescimento bacteriano. Os autores reportam que C. necator tem um bom
crescimento em ácido palmítico, acido oléico e acido linoléico, mas em ácido
linolênico a bactéria não apresenta bom crescimento. Estes autores reportaram
que durante o processo de fermentação existe acúmulo de ácidos graxos libres. O
uso de outros óleos vegetais com menor percentagem de acido linolênico poderia
dar como resultado maior crescimento bacteriano e por conseqüência maior
acúmulo de P3HB. Confirmando esta hipótese Loo et al., 2005 utilizaram óleo de
semente de palma como fonte de carbono com C. necator e obteve valores
maiores de Xt e PHA que quando utilizou óleo de palma, sendo que a diferença
entre os dois óleos é que o primeiro tem ácidos graxos saturados de 12 e 14
carbonos, enquanto o segundo tem ácidos graxos insaturados de 18 carbonos com
1, 2, 3 insaturações. Esta poderia ser uma possível explicação do motivo pelo qual
o crescimento bacteriano no presente trabalho não ultrapassou os 20 g/L em geral
obtido para os 4 ensaios realizados em biorreator com a linhagem C. necator IPT-
26.
Por outro lado, o acúmulo de P3HB pode ter sido beneficiado já que
amônia estava presente durante a fase de acúmulo de polímero. Bitar e Underhills,
70
1990 estudaram o efeito da alimentação de amônia na fase de produção de P3HB
por C. necator; os autores relatam que a alimentação de amônia durante a fase de
produção de P3HB pode aumentar o acúmulo de polímero. Estes autores lograram
incrementar de um teor de P3HB de 42,5% (em ausência de amônia) a 62%
(alimentado com amônia), confirmando os resultados anteriormente obtidos por
Suzuki et al., 1986 em que a alimentação com pequena quantidade de amônia
durante a fase de acúmulo em culturas de Protomonas extorquens resultou em
mais rápido aumento do conteúdo de P3HB que em culturas com deficiência de
amônia.
71
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
t (h)
Xt (g/L)
B26-20 B26-40
B26-80 B26-80*
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50
t (h)
Xr (g/L)
B26-20 B26-40
B26-80 B26-80*
Figura 20 - Evolução da concentração de biomassa total Xt (A) e evolução da
concentração de biomassa residual Xr (B), para os ensaios B26-20, B26-40
cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM3 e os ensaios B26-
80 e B26-80* cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM4,
utilizando a linhagem Cupriavidus necator IPT-26 em biorreator, utilizando
óleo de soja como fonte de carbono.
A
B
72
0
20
40
60
80
0 10 20 30 40 50
t(h)
P3HB (g/L)
B26-20 B26-40
B26-80 B26-80*
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
t (h)
P3HB (%)
B26-20 B26-40
B26-80 B26-80*
Figura 21 - Evolução da concentração de P3HB acumulado expresso em g/L (A) e
evolução da concentração de P3HB acumulado expresso em porcentagem
(B), para os ensaios B26-20, B26-40 cultivados em meio mineral limitado
em nitrogênio MM3 e os ensaios B26-80 e B26-80* cultivados em meio
mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem Cupriavidus
necator IPT-26 em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte de
carbono.
B
A
73
Analisando-se os resultados obtidos em todos os ensaios, observou-se o
acúmulo de P3HB bem antes da exaustação do nitrogênio (vide Figuras 19 A e 21).
Segundo Ramsay et al., 1990 concentrações abaixo de 0,2 g/L de nitrogênio já
permitem o acúmulo de P3HB durante a fase de crescimento. Em todos os ensaios
em biorreator as concentrações de nitrogênio estavam acima de 0,2 g/L quando
iniciou-se o acúmulo de P3HB. Neste ponto foi levantada a hipótese de existir outro
fator limitante que causava a diminuição no crescimento de Xr e o incentivo do
acúmulo de P3HB em um meio não limitado em nitrogênio nem em fonte de
carbono. A discussão desta hipótese está realizada no item 5.2.2.4, apresentada a
seguir.
Além disso, para alguns ensaios realizados em biorreator (Figura 29 B)
notou-se que os valores de Xr continuaram a crescer após a limitação em
nitrogênio. Uma possível explicação para este aumento durante a fase de acúmulo
pode ser atribuída ao acúmulo de material celular, particularmente componentes da
parede celular como fosfolipídios, peptideoglicano e lipopolissacarídeos na
biomassa (FIORESE, 2006
2
) (comunicação pessoal). O mesmo foi observado por
Aragão, 1996.
5.2.2.3 Velocidade de Crescimento e Balanço Gasoso
Neste processo de produção de P3HB empregando C.necator com óleo
de soja como fonte de carbono observaram-se duas etapas na fase de crescimento
(Figura 22), uma exponencial caracterizada por um valor µ
Xr1
, que para os três
ensaios B26-20, B26-40 e B26-80 acaba com 10 horas de cultivo, seguida de uma
fase exponencial com velocidade específica (µ
Xr2
) inferior que termina quando o
óleo da primeira batelada é consumido.
As velocidades de crescimento bacteriano (calculadas segundo a equação
13) para a primeira fase exponencial µ
Xr1
, apresentaram os seguintes valores:
µ
Xr1
ensaio B26-20 = 0,34 h
-1
R
2
=0,994
µ
Xr1
ensaio B26-40 = 0,43 h
-1
R
2
=0,98
µ
Xr1
ensaio B26-80 = 0,42 h
-1
R
2
=0,992
2
FIORESE, M,L. Estrategies de cultivo, recuperação e caracterização de poli(3-hidroxibutirato) por
Ralstonia Eutropha, Florianópolis, 2006 (comunicação pessoal).
74
Na primeira fase do crescimento, o acúmulo de P3HB é baixo (Figuras 21
A e B), o consumo de óleo é baixo (Figura 19 B) e o nitrogênio se encontra em uma
condição não limitante (Figura 19 A).
A diminuição de µ
Xr
é confirmada nos ensaios B26-40 e B26-80 (Figuras
23 A e B), pela diminuição da velocidade de consumo de oxigênio OUR, que
também apresenta uma “quebra” em sua evolução em cerca de 10 h de cultivo. A
partir deste momento também há uma diminuição na velocidade de OUR até o
consumo total da primeira batelada de óleo.
Esta segunda fase exponencial de crescimento apresenta valores de µ
Xr
inferiores e uma correlação dos dados, utilizando a equação 13, nos permitiu
calcular valores característicos de µ
Xr2
ao menos para dois ensaios:
µ
Xr2
ensaio B26-40 = 0,17 h
-1
R
2
=0,96
µ
Xr2
ensaio B26-80 = 0,18 h
-1
R
2
=0,93
Ao término desta segunda etapa de crescimento, o ensaio B26-40
apresentou um acúmulo de P3HB de 54,34%, a concentração de óleo era de 1,48
g/L (Figura 19 B) e o nitrogênio começou a ser limitado no meio (Figura 19 A). No
ensaio B26-80, ao final desta etapa, o acúmulo de P3HB foi de 68,87%, a
concentração de óleo era de 8,3 g/L (Figura 19 B) e o meio também se limitou em
nitrogênio.
É importante observar que a concentração de células residuais – porção
da biomassa que detém a capacidade catalítica de biossíntese e de
armazenamento do produto - não ultrapassou cerca de 20 g/L independente dos
meios de cultura utilizados (MM3 e MM4). É importante frisar este aspecto porque
os ensaios tiveram valores crescentes de aporte de óleo para os ensaios B26-20,
B26-40 e B26-80 (respectivamente 10, 20 e 40 g/L na primeira batelada) e valores
crescentes de oligo e micronutrientes para o ensaio B26-80. (o dobro da
concentração e sais de P, Mg, Ca entre outros, Tabela 11).
75
Para tentar explicar o comportamento da “quebra” nas velocidades de
crescimento bacteriano foi levantada a hipótese que durante a primeira fase
exponencial de crescimento, um nutriente e/ou fator de crescimento não
identificado do meio de cultura pudesse ter estado sendo produzido ou introduzido
no biorreator, por exemplo, como remanescente do caldo nutriente utilizado na
preparação do inóculo. Foi por isso que foi realizado o ensaio B26-80*, em que o
inóculo foi cultivado em meio mineral (RAMSAY et al, 1990) utilizando óleo de soja
como fonte de carbono, todas as demais condições foram as mesmas adotadas no
ensaio B26-80 (Tabela 12).
Nas Figuras 19 A e B, no ensaio B26-80*, observou-se um
comportamento similar ao ensaio B26-80, relativo ao consumo de nitrogênio e
consumo de óleo de soja, o mesmo aconteceu com o crescimento de Xt que a 40 h
de cultivo alcançou valores de 82,45 g/L, frente aos 86,5 g/L do ensaio B26-80. O
crescimento de Xr oscilou também em torno de 20 g/L como nos ensaios B26-40 e
B26-80 (Figura 20 A e B). Os comportamentos em base ao acúmulo de biopolímero
apresentaram também uma tendência similar, ambos ensaios atingiram um
acúmulo de P3HB em torno de 82% (Figura 21 B). Nesta mesma Figura observa-se
que no início do ensaio da B26-80*, houve um acúmulo de 40% de P3HB na célula,
que representa 0,14 g/L de P3HB devido à baixa concentração de Xt inicial de 0,33
g/L. Por outro lado no ensaio B26-80, o teor de P3HB inicial é menos de 8%. Esta
diferença pode ser explicada porque o acúmulo de P3HB já foi iniciado no inóculo
que tinha óleo de soja como fonte de carbono.
Observou-se para este último ensaio também uma ”quebra” da velocidade
de crescimento (Figura 22), só que diferente dos ensaios B26-20, B26-40 e B26-
80, esta ocorreu com 8 horas de cultivo e não com 10 h como já foi discutido. Esta
”quebra” se observa com mais detalhe na Figura 23 C, em que é apresentada a
velocidade de consumo de oxigênio.
As velocidades específicas de crescimento bacteriano (calculadas
segundo a equação 13) para a primeira e segunda fase exponencial µ
Xr1
e µ
Xr2
apresentaram os seguintes valores:
76
µ
Xr1
ensaio B26-80* = 0,39 h
-1
R
2
= 0,9992
µ
Xr2
ensaio B26-80* = 0,19 h
-1
R
2
= 0,97
É neste tempo de 8 h de cultivo que foi induzido o acúmulo de P3HB na
célula, que continuou a ocorrer durante todo o período relativo ao crescimento
exponencial até que a primeira batelada de óleo fosse consumida. Em 8 horas de
cultivo foi medido 19,61 % de P3HB e Xr de 1,02 g/L. Às 22 h, tempo em que foi
consumida a primeira batelada de óleo, encontrou-se 66 % de P3HB acumulado e
Xr de 13,07 g/L. Esse tipo de comportamento também denota que estaria
acontecendo um crescimento celular associado à formação de P3HB.
Em face de todos estes resultados descartou-se a hipótese da influência
do meio de cultura utilizado na preparação do inóculo.
-2
-1
0
1
2
3
4
0 10 20 30 40 50
t (h)
ln Xr
B26-20 B26-40
B26-80 B26-80*
Figura 22 - Velocidades de crescimento bacteriano para os ensaios B26-20, B26-40
cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM3 e os ensaios B26-80
e B26-80* cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando
a linhagem Cupriavidus necator IPT-26 em biorreator, utilizando óleo de soja
como fonte de carbono.
77
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50
t(h)
OUR (m mol/Lh)
-2
-1
0
1
2
3
4
ln Xr
OUR B26-40 ln Xr B26-40
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50
t(h)
OUR (m mol/Lh)
-2
-1
0
1
2
3
4
ln Xr
OUR B26-80 ln Xr B26-80
B
A
78
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50
t (h)
OUR (m mol/Lh)
-2
-1
0
1
2
3
4
ln Xr
OUR B26-80* ln Xr B26-80*
Figura 23 - Comparação das velocidades de crescimento bacteriano com a velocidade de
consumo de oxigênio para o ensaio B26-40 cultivado em meio mineral limitado
em nitrogênio MM3 (A), o ensaio B26-80 (B) e o ensaio B26-80* (C), ambos
cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem
Cupriavidus necator IPT-26 em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte
de carbono.
Outro ponto interessante a ser discutido é o valor do quociente de
respiração RQ dado pela relação CER/OUR, em que CER é a velocidade de
produção de CO
2
e OUR é a velocidade de consumo de O
2
. Estequiometricamente,
este valor está em torno de 1,0 para o metabolismo de carboidratos e nos
presentes ensaios este valor está em torno de 0,2. Este fato torna o processo muito
mais eficiente em termos de aproveitamento da fonte de C. Isto se deve ao fato de
que a perda de carbono durante a oxidação dos ácidos graxos é muito menor que
para os carboidratos por conta do uso da via da β-oxidação para os lipídios
(STRYER et al., 2004). Segundo Eggink et al., 1993 os óleos vegetais com cadeias
longas de ácidos graxos utilizados em processos de fermentação trazem com eles
problemas diversos, um deles é a alta demanda de oxigênio e necessidade de
adequação da transferência de massa do sistema. De fato, nos valores de pico de
OUR, aproximadamente 100 m mol/Lh (Figura 24 B), houve necessidade de se
utilizar a máxima capacidade de agitação do biorreator ao redor de 1200 rpm. A
aeração entre tanto não pode ser elevada a valores mais altos em virtude da
C
79
dificuldade de se controlar a formação de espuma. Neste caso, a aeração não
pode superar 2 L/min, de cerca de 0,3 vvm (volume de ar/volume meio. min).
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50
t (h)
OUR (m mol/Lh) e CER (m mol/Lh)
OUR B26-40 CER B26-40
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50
t(h)
OUR (m mol/Lh) e CER (m mol/Lh)
OUR B26-80 CER B26-80
OUR B26-80*
CER B26-80*
Figura 24 - Balanço gasoso para os ensaios B26-40 cultivado em meio mineral limitado em
nitrogênio MM3 (A), os ensaios B26-80 e B26-80* cultivados em meio mineral
limitado em nitrogênio MM4 (B), utilizando a linhagem Cupriavidus necator
IPT-26 em biorreator, utilizando óleo de soja como fonte de carbono.
A
B
80
5.2.2.4 Concentrações de micronutrientes
Com o propósito de tentar esclarecer o por quê da presença destas duas
fases crescimento celular, levantou-se uma outra hipótese: de que os meios
minerais MM3 e MM4, estivessem tendo limitação de algum micronutriente que
estaria causando a diminuição de velocidade de crescimento celular, induzindo o
acúmulo de P3HB. As concentrações adequadas de micronutrientes são muito
importantes, desde que afetam diretamente o crescimento e acúmulo de PHA nas
bactérias. Melaço de cana-de-açúcar foi usado como suplemento nutricional na
produção de P3HB por C.necator crescida em glicose. O melaço contêm elementos
traços e vitaminas que poderiam ser usados como potencializadores do
crescimento (BEAULIEU et al., 1995). Os autores concluíram que a suplementação
com melaço de cana maximizou a produção de P3HB, pois contribuiu para a
formação de biomassa na fase de crescimento não limitada, resultando em maior
quantidade de células para acúmulo de polímero. Liu et al., 1998 estudaram a
produção de P3HB com E. coli utilizando melaço de beterraba hidrolizado e
relataram que a concentração de melaço teve efeito significante na síntese de
P3HB e no crescimento das células.
Os elementos traços essenciais para o crescimento das bactérias
segundo Pirt, et al., 1975 são Ca, Mn, Fe, Cu e Zn. Por outro lado o P, K e Mg não
são considerados microelementos, mas sim elementos importantes no crescimento
celular. Fósforo é alimentado ao meio em forma de fosfato inorgânico e em sua
maioria é incorporado dentro dos ácidos nucléicos, fosfolipídios e polímeros da
parede celular; o potássio é requerido para o crescimento microbiano desde que se
une ao RNA e seu requerimento aumenta por fatores como a taxa de crescimento
celular e o conteúdo de RNA na biomassa. Os íons potássio atuam como
coenzimas e provavelmente atuam como cátions na estrutura do RNA e outras
estruturas aniônicas na célula. O cálcio é o manganes atuam como co-fatores de
diversas enzimas (ZABRISKIE et al., 1980). O ferro é requerido em diversos
cofatores de enzimas com funções de oxido-redução na célula; o cobre está
presente nas oxidases terminais da via respiratória na bactéria; as peptidases
podem conter íons de cobre ou zinco como cofatores.
81
Tendo conhecimento da importância destes elementos, foram feitas
análise dos seguintes elementos: fósforo (P), potássio (K), magnésio (Mg), ferro
(Fe), cobre (Cu), cálcio (Ca), zinco (Zn) e manganês (Mn) a 4, 10, 20 e 31 horas de
cultivo para o ensaio de melhores resultados, isto é o B26-80. As concentrações
iniciais de cada elemento foram calculadas teoricamente pela formulação do meio
mineral MM4 (Tabela 11). Os resultados destas análises são apresentados na
Figura 25.
82
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0 5 10 15 20 25 30 35
P, K, Mg (g/L)
P
K
Mg
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0 5 10 15 20 25 30 35
Fe, Cu, Ca (g/L)
Fe
Ca
0.0E+00
2.0E-05
4.0E-05
6.0E-05
8.0E-05
1.0E-04
0 5 10 15 20 25 30 35
t (h)
Zn, Mn (g/L)
Zn
Mn
Cu
Figura 25 - Evolução das concentrações de micronutrientes para o ensaio B26-80 cultivado
em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando linhagem
Cupriavidus necator IPT-26 em biorreator e óleo de soja como fonte de
carbono.
83
A diminuição de velocidade de crescimento bacteriano para o ensaio B26-
80 acorre às 10 horas de cultivo como já foi discutido. Analisando a Figura 25
nessas 10 horas de cultivo se observa que um dos elementos que apresenta
decréscimo é o fósforo, com concentração de 0,02 g/L a 10 horas de cultivo.
Segundo Fiorese, 2006
2
(comunicação pessoal) o meio está limitado em fósforo
com concentrações de 0,15 g/L, o que estaria indicando que o meio mineral usado
MM4, estaria já limitado em fósforo desde o inicio do ensaio, já que sua
concentração inicial seria de 0,08 g/L. O mesmo autor relata que a concentração
inicial de fósforo no meio de cultura por ele utilizado foi de 1,12 g/L. Kahar, et al.,
2004 reporta uma concentração inicial de fósforo de 1,22 g/L, por outro lado
Marangoni et al., 2002 utiliza uma concentração constante limitante de fósforo de
0,019 g/L na fase de acúmulo do polímero. No presente trabalho a concentração
inicial foi de 0,08 g/L e após 14 horas de cultivo foi agregado ao meio outros 0,08
g/L de fósforo, fazendo um total de 0,16 g/L de fósforo colocado no meio ao longo
do processo. Os sais que contém o fósforo (KH
2
PO
4
) e magnésio (MgSO
4
.7H
2
O)
foram alimentadas no biorreator em duas partes razão pela qual Mg e K
apresentaram um ligeiro incremento (Figura 25). Isto foi efetuado para prevenir sua
precipitação no meio. Segundo Pirt, 1975 MgSO
4
apresenta tendência a precipitar
em complexo com o fosfato.
Segundo Pirt, 1975, o fósforo contido na bactéria é de 1,5% da biomassa
seca, o que dá um fator de conversão Y
Xr/P
= 66,67 g/g. Sun et al., 2006 reportaram
Y
Xr/P
= 41,98 g/g trabalhando com açúcares e Pseudomonas putida, Lee et al.,
2000 reportaram Y
Xr/P
=48,49 g/g utilizando glicose e também Pseudomona putida
e Aragão, 1996, Y
Xr/P
= 100 g/g utilizando C. necator. No presente trabalho foi
calculado Y
Xr/P
= 75 g/g. Este valor foi calculado em um tempo de 20 horas de
cultivo, que segundo a Figura 25 é o tempo em que o fósforo é praticamente
esgotado. Estes fatores de conversão variam de acordo com a bactéria utilizada e
com a temperatura do processo (PIRT, 1975). Kahar, et al., 2004 utilizou 1,22 g/L
de fósforo inicial reportando um valor de Xr = 30 g/L. Em nosso caso para
incrementar o valor de Xr a 30 g/L deveria ser utilizada uma concentração inicial de
0,4 g/L de fósforo.
84
O ferro e o zinco são outros dois elementos que aparentemente
apresentaram exaustão ainda antes das 10 horas de cultivo, o ferro com
concentrações de 0,0023 g/L em 4 horas de cultivo e o zinco com uma
concentração abaixo de 2x10
-5
g/L após 4 horas de cultivo. Embora em
concentrações baixas, os dados experimentais não foram suficientes para apontar
limitação de crescimento bacteriano por estes elementos, tendo em consideração o
que foi discutido no parágrafo anterior com respeito ao fósforo. Kahar, et al., 2004
reportaram valores iniciais de Fe de 0,0034 g/L, e não reportam presença do zinco
no seu meio mineral.
Foram calculados os fatores de conversão para alguns elementos e
microelementos a biomassa resídual e foram comparados a outros fatores de
conversão encontrados na literatura (Tabela 15).
Tabela 15 – Fatores de conversão de elementos a biomassa residual Y
Xr/elemento
para o ensaio B26-80 em meio mineral limitado em nitrogênio MM4,
contendo óleo de soja
,
comparados com os encontrados na literatura.
Y
Xr/elemento
(g/g)
Elemento
Presente trabalho (em
Cupriavidus. necator e
óleo de soja)
PIRT, et al., 1975 (valores
asumidos para Klebsiella
aerogenes)
SUN, et al., 2006 (em
Psedomonas putida)
N 7,31 8,75 7,12
P 75,00 39,1 39,84
K 87,45 59,5 ND
Mg 417,83 430,0 236,0
Fe 510,66 6,7 x 10
3
ND
Ca 4,13 x 10
3
3,33 x 10
3
ND
Zn 1,54 x 10
5
2,0 x 10
4
ND
Mn 6,2 x 10
5
2,0 x 10
4
ND
Cu 1,31 x 10
5
1,0 x 10
5
ND
Sendo este um processo de fermentação aeróbio, decidiu-se observar o
comportamento da bactéria em relação à sua velocidade específica de respiração
celular, QO
2
, que foi calculada com base na equação 10. Esta grandeza representa
a característica biológica do sistema, pois ela depende do microrganismo
empregado, da composição do meio e das condições de cultivo (FIORESE, 2006
2
)
85
(comunicação pessoal). Na Figura 26, apresenta-se a evolução da QO
2
e das
concentração de óleo de soja, de Xr, de P3HB e de fósforo durante a etapa do
processo que não estava limitada em nitrogênio. Nota-se que a QO
2
decresce
como o consumo de óleo de soja a partir de 10 horas de cultivo, nesse tempo
ainda se tem concentrações de óleo de soja acima de 20 g/L, o que indica que a
cultura não estava limitada em fonte de carbono. Também se observa que a partir
dessas 10 horas a quantidade de fósforo no meio é extremamente baixa com
valores inferiores a 0,02 g/L, concluindo-se que o meio estava limitado em fósforo,
sendo provavelmente o fator principal que tenha afetado o decréscimo na
velocidade de crescimento da bactéria e incentivando o acúmulo de P3HB quando
o meio não estava limitado em nitrogênio.
86
Figura 26 – Variação da velocidade especifica de consumo de oxigênio (QO
2
), comparada
com concentração de óleo de soja, concentração de biomassa residual
(Xr) e concentração de P3HB com a concentração de fósforo em função do
tempo durante a primeira batelada de óleo para o ensaio B26-80 cultivado
em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando a linhagem
Cupriavidus necator IPT-26 em biorreator.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 5 10 15 20 25 30 35
QO
2
(m mol/g h)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Óleo (g/L)
QO2 "Xr" "P3HB" Óleo
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
0 5 10 15 20 25 30 35
t (h)
P (g/L)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35
Xr (g/L)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
P3HB (g/L)
87
Baseado nestes resultados conclui-se que o aumento de Xr e P3HB no
biorreator deve necessariamente passar pela otimização da composição do meio
de cultura principalmente em relação ao elemento fósforo, não se descartando, a
princípio, os elementos ferro e zinco. Os resultados apresentados na figura 25
podem servir como base também para balanceamento do meio em relação aos
outros elementos como Mg, K e Ca.
5.2.2.5 Produtividade
Para o ensaio B26-20, observa-se a produtividade máxima de 0,51 g/Lh
de formação de produto com 20 horas de cultivo. Para o ensaio B26-40, a
produtividade máxima é observada com 32 horas de cultivo com um valor de 1,16
g/Lh. Para o ensaio B26-80 é observada uma produtividade máxima de 2,36 g/Lh
com 31 horas de cultivo e para o ensaio B26-80* uma produtividade máxima de
1,87 g/Lh as 29 horas de cultivo (Figura 27). O aumento da produtividade é um
reflexo do maior aporte da fonte de carbono sendo igual ou superior aos
encontrados na literatura de produção de PHAs para esta fonte de carbono.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 10 20 30 40 50
t (h)
P (g/Lh)
B26-20 B26-40
B26-80
B26-80*
Figura 27 - Evolução das produtividades em P3HB para os ensaios B26-20 e B26-40
cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM3, e os ensaios B26-80
e B26-80* cultivados em meio mineral limitado em nitrogênio MM4, utilizando
a linhagem Cupriavidus necator IPT-26 em biorreator, utilizando óleo de soja
como fonte de carbono.
88
5.2.3 Comparação entre as linhagens
A Tabela 16 reúne os principais resultados obtidos em todos os ensaios
realizados em biorreator. Nestes ensaios, as produtividades em P3HB da linhagem
IPT-26 foram superiores as da linhagem IPT-48; diferente do observado nos
ensaios em frascos agitados. Os melhores rendimentos também foram alcançados
com a linhagem IPT-26 com valores característicos de produtividade ao redor de 2
g/Lh, teor de P3HB na biomassa de 80% e Xt de 80 g/L. Segundo a literatura a C.
necator é capaz de acumular altos níveis de PHA, excedendo os 80% de teor de
acúmulo, mas a partir de óleos vegetais ela só produz P3HB (TSUGE et al.,
2004b), comportamento que foi comprovado no presente trabalho. Ramsay et al.,
1990 também reportou um valor de produtividade de P3HB de 2 g/Lh utilizando C.
necator, em meio limitado em nitrogênio.
O fator de conversão de óleo de soja a P3HB, Y
P3HB/S
calculado, variou
entre 0,91 e 1,17 g/g para os melhores ensaios, valor que supera os dados da
literatura de 0.72 - 0.76 g/g (KAHAR et al., 2004) e 0,7 - 0,8 g/g (AKIYAMA et al.,
2003), Os valores de Y
P3HB/S
, para óleos vegetais são muito gerais desde que a
composição de os diversos óleos vegetais varia com respeito aos seus ácidos
graxos e dependendo das bactérias utilizadas eles não são somente transformados
a P3HB e sim em outros copolímeros (AKIYAMA et al., 2003). Nota-se que estes
fatores de conversão são muito superior ao encontrado para a produção de P3HB
a partir de sacarose que é de cerca de 0,33 g/g (NONATO et al. 2001).
Akiyama, 2003 apresentou os valores teóricos de conversão de glicose e
de acido linoléico (o principal ácido graxo do óleo de soja) a P3HB segundo as
seguintes equações estequiométricas:
C
6
H
12
O
6
+ 1.5 O
2
C
4
H
6
O
2
+ 2 CO
2
+ 3 H
2
O (14)
C
18
H
32
O
2
+ 4.75 O
2
4.5 C
4
H
6
O
2
+ 2.5 H
2
O (15)
89
Nestas ecuações, C
4
H
6
O
2
denota uma unidade de monômero 3HB. No
caso da glicose (equação 14) uma molécula de glicose é metabolizada pela via
Entner Doudoroff para formar duas moléculas de acetil-CoA, eliminando duas
moléculas de CO
2
. As duas moléculas de acetil-CoA são então convertidas a uma
unidade de 3HB. Já na equação 15, uma molécula de ácido linoléico é oxidada
repetidas vezes na via da β-oxidação, para formar nove moléculas de acetil-CoA
sem eliminação de CO
2
, as quais resultariam na formação de 4,5 unidades do
monômero 3HB. Considerando estas equações, o valor máximo teórico do fator de
conversão de glicose a P3HB Y
P3HB/glicose
é de 0,48 g/g e Y
P3HB/acc. linoléico
é de 1,38
g/g. Esta explicação poderia justificar o Y
P3HB/S
=1,17 g/g calculado para o ensaio
B26-80. Considerando todos os fatores de conversão tendo em conta todas as
equações estequiométricas dos ácidos graxos e as porcentagens que representam
no óleo de soja (Tabela 4) e considerando que esses ácidos graxos são 90% do
óleo e que o outro 10% é glicerol, calculou-se o fator de conversão teórico de óleo
de soja a P3HB obtendo-se 1,16 g/g.
Tabela 16 - Produção de P3HB em biorreator para as linhagens IPT-48 e IPT-26
em meios minerais limitados em nitrogênio MM3 e MM4, contendo óleo
de soja.
Os valores de Y
Xr/S
foram calculados após o consumo da primeira batelada de óleo.
Os melhores resultados obtidos neste trabalho pertencentes ao ensaio B26-
80 foram comparados em relação ao custo de substrato utilizado por unidade de
P3HB produzido (R$ Substrato/Kg P3HB) com trabalhos realizados utilizando a
mesma linhagem empregando como fonte de carbono óleo de soja e sacarose;
Concentração de
óleo de soja (g/L)
Ensaio
Cresci-
mento
Acúm
u- lo
Biomassa
total Xt
(g/L)
Biomassa
residual
Xr
(g/L)
P3HB
(%)
Y
P3HB/S
Y
Xr/S
P
(g/Lh)
t (h)
B48-20
10 10
14,9 10,7 29,00
0,27 ND 0,20 22
B48-40
20 20 21,2 12,8 39,8 0,22 0,43 0,26 32
B48-80
40 40 30,8 19,87 35,49
0,23 0,36 0,40 27
B26-20
10 10 21,5 10,1 47,3 0,69 0,49 0,51 20
B26-40
20 20 57,0 20,4 64,2 0,98 0,55 1,16 32
B26-80
40 40 87,2 14,1 83,9 1,17 0,45 2,36 31
B26-80*
40 40 68,65 14,32 79,13
0,91 0,45 1,87 29
90
esta última fonte de carbono é utilizada atualmente na produção de P3HB pela
PHB Industrial.
A Tabela 17 mostra que a produção de P3HB a partir de óleo de soja,
levando-se em conta somente o preço de fonte de carbono parece ser mais
competitiva que a partir de sacarose.
Tabela 17 - Comparação de resultados utilizando C. necator para produção de
P3HB a partir de diversas fontes de carbono.
Fonte
P3HB
(%)
Biomassa
total Xt
(g/L)
kg subs/
kg P3HB
R$/
Kg P3HB
P
(g/Lh)
t (h) Referência
Óleo de soja
83,9 87,2 0,85 1,09 2,36 31 Presente trabalho
Óleo de soja
69 130 1,35 1,54 0,94 96 Kahar et al., 2004
Sacarose
65-70 120-150 3,10 2,34 1,44 45-50 Nonato et al., 2001
Preço da sacarose=R$ 756/TN. Fonte: www.cepea.esalq.usp.br
Preço do óleo: R$ 1 285/TN. Fonte: ABIOVE.
Além disso, supondo que o custo da matéria prima equivale a 40% do custo
da produção de P3HB (CHOI E LEE, 1999), então nossos resultados apontam para
um custo de cerca de R$ 2,73/kg.
Este valor é competitivo com o custo de polipropileno praticado no mercado
brasileiro que é da ordem de US$ 1,5/kg.
91
6 CONCLUSÕES
As principais conclusões do presente estudo são:
a) a limitação mais eficaz para a produção de P3HB nos ensaios em frascos
agitados foi a de nitrogênio;
b) as melhores linhagens escolhidas na seleção de microrganismos nos
ensaios em frascos agitados foram Burkholderia cepacia IPT-48 e
Cupriavidus necator IPT-26;
c) nos ensaios em biorreator foi observado que a linhagem Cupriavidus
necator IPT-26 é muito superior à Burkholderia cepacia IPT-48. O melhor
resultado com as condições estudadas foi obtido com a linhagem
C.necator IPT-26, com alimentação em duas bateladas de óleo de soja de
40 g/L cada uma, indicou produtividade de 2 g/Lh, biomassa total de 80
g/L, teor de P3HB na biomassa de 80%, Y
Xr/S
=0,45 g/g e Y
P3HB/S
=1,0 g/g,
em um tempo de cultivo entre 31 e 35 horas;
d) os melhores valores para a Burkholderia cepacia IPT-48 cultivada em
biorreator com duas bateladas de óleo de soja de 40 g/L cada uma,
indicaram P= 0,40 g/Lh, Xt= 30,8 g/L, P3HB =35,5%, Y
Xr/S
=0.36 g/g e
Y
P3HB/S
=0,23 g/g em um tempo aproximado de 27 horas de cultivo;
e) o valor do quociente de respiração (RQ) indicou um valor em torno de 0,2
ao longo do ensaio, este valor é baixo comparado ao obtido quando se
utiliza carboidratos como fonte de carbono, que fica em torno de 1. Se
conclui que na biossíntese de lipídios a demanda de oxigênio requerida é
maior que a necessária para oxidar carboidratos, e que a perda de
carbono durante a oxidação dos lipídios é muito menor que para os
carboidratos por conta do uso da via da β-oxidação para os lipídios;
92
f) a velocidade específica de crescimento para C.necator IPT-26, no melhor
dos ensaios foi de 0,42h
-1
nas 10 primeiras horas de cultivo, após esse
tempo ocorreu limitação em fósforo, a célula continuou crescendo a 0,18
h
-1
até que a primeira batelada de óleo foi consumida e o meio foi limitado
em nitrogênio;
g) o valor máximo de QO
2
foi de 12,2 m mol/g h para um Xr de 2,35 g/L em
10 horas de cultivo em C.necator; e valores de OUR de cerca de 100
mmol/Lh entre 16 e 28 horas de cultivo.
h) os resultados das análises das concentrações de micronutrientes a
diferentes tempos para o ensaio de melhores rendimentos B26-80,
demonstraram que o meio MM4 estava limitado em fósforo, a pesar de ter
sido utilizado no meio MM4 o dobro das concentrações de sais do que o
MM3;
i) os valores de custo de produção de P3HB obtidos no presente trabalho
levando em conta somente o preço da fonte de carbono são menores
quando comparados aos obtidos na literatura correspondentes aos custos
de produção de P3HB, 1,09 R$/Kg P3HB frente a 2,34 R$/Kg P3HB
respectivamente.
93
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41.
100
ANEXOS
ENSAIO F26-(N)
Data : 21/02/05/ ao 24/02/05
Linhagem : IPT-26 (Cupriavidus necator)
Objetivo : testar o crescimento bacteriano e o acúmulo de P3HB em meio
mineral limitado em nitrogênio.
Condições de ensaio:
Fermentador : frascos agitados
Fonte de carbono : Óleo de soja 15g/L
Volume inicial : 500 mL
pH inicial : 7.0
T : 30°C
tempo
Xt PHB Xr óleo N pH
(h) (g/L) (%) (g/L) (g/L) (mg/L)
0 0,07 ND ND 17,24 217,87 6,97
24 2,95 ND ND 12,56 115,56 6,32
48 4,58 33,88 3,03 5,1 2,62 5,02
72 4,39 23,19 3,37 6,4 0,20 4,96
101
ENSAIO F26-(P)
Data : 21/02/05/ ao 24/02/05
Linhagem : IPT-26 (Cupriavidus necator)
Objetivo : testar o crescimento bacteriano e o acúmulo de P3HB em meio
mineral limitado em fósforo.
Condições de ensaio:
Fermentador : frascos agitados
Fonte de carbono : Óleo de soja 15g/L
Volume inicial : 500 mL
pH inicial : 7.0
T : 30°C
tempo
Xt PHB Xr óleo N pH
(h) (g/L) (%) (g/L) (g/L) (mg/L)
0 0,26 ND ND 16,64 51,29 7,43
24 1,86 ND ND 14,86 190,02 6,55
48 3,45 22,21 2,68 10,4 86,46 4,91
72 3,26 18,75 2,64 6,98 40,49 4,86
102
ENSAIO F29-(N)
Data : 28/01/05/ ao 31/01/05
Linhagem : IPT-29 (Alcaligenes latus)
Objetivo : testar o crescimento bacteriano e o acúmulo de P3HB em meio
mineral limitado em nitrogênio.
Condições de ensaio:
Fermentador : frascos agitados
Fonte de carbono : Óleo de soja 15g/L
Volume inicial : 500 mL
pH inicial : 7.0
T : 30°C
tempo
Xt PHB Xr óleo N pH
(h) (g/L) (%) (g/L) (g/L) (mg/L)
0 1,15 ND
ND
20,85 298,03 6,94
24 0,13
ND ND
10,98 329,76 6,88
48 0,29
ND ND
11,50 328,40 6,90
72 0,20
ND ND
10,80 333,89 6,90
103
ENSAIO F29-(P)
Data : 28/01/05/ ao 31/01/05
Linhagem : IPT-29 (Alcaligenes latus)
Objetivo : testar o crescimento bacteriano e o acúmulo de P3HB em meio
mineral limitado em fósforo.
Condições de ensaio:
Fermentador : frascos agitados
Fonte de carbono : Óleo de soja 15g/L
Volume inicial : 500 mL
pH inicial : 7.0
T : 30°C
tempo
Xt PHB Xr óleo N pH
(h) (g/L) (%) (g/L) (g/L) (mg/L)
0 0,79 ND
ND
20,02 333,89 6,99
24 0,17
ND ND
12,98 180,05 6,95
48 0,16
ND ND
10,58 195,61 6,91
72 0,21
ND ND
13,48 149,42 6,89
104
ENSAIO F48-(N)
Data : 21/02/05/ ao 24/02/05
Linhagem : IPT-48 (Burkholderia cepacia)
Objetivo : testar o crescimento bacteriano e o acúmulo de P3HB em meio
mineral limitado em nitrogênio.
Condições de ensaio:
Fermentador : frascos agitados
Fonte de carbono : Óleo de soja 15g/L
Volume inicial : 500 mL
pH inicial : 7.0
T : 30°C
tempo
Xt PHB Xr óleo N pH
(h) (g/L) (%) (g/L) (g/L) (mg/L)
0 0,34 ND ND 16,94 259,30 7,0
24 3,13 ND ND 4,76 110,41 5,8
48 5,16 33,88 3,41 8,26 24,52 4,4
72 6,71 37,68 4,22 5,54 0,55 4,3
105
ENSAIO F48-(P)
Data : 21/02/05/ ao 24/02/05
Linhagem : IPT-48 (Burkholderia cepacia)
Objetivo : testar o crescimento bacteriano e o acúmulo de P3HB em meio
mineral limitado em fósforo.
Condições de ensaio:
Fermentador : frascos agitados
Fonte de carbono : Óleo de soja 15g/L
Volume inicial : 500 mL
pH inicial : 7.0
T : 30°C
tempo
Xt PHB Xr óleo N pH
(h) (g/L) (%) (g/L) (g/L) (mg/L)
0 0,44 ND ND 14,50 221,51 7,45
24 2,43 ND ND 7,08 101,20 5,4
48 4,05 36,95 2,55 6,40 83,64 3,7
72 4,08 37,18 2,55 3,62 78,92 4
106
ENSAIO F64-(N)
Data : 16/02/05/ ao 19/02/05
Linhagem : IPT-64 (Burkholderia cepacia)
Objetivo : testar o crescimento bacteriano e o acúmulo de P3HB em meio
mineral limitado em nitrogênio.
Condições de ensaio:
Fermentador : frascos agitados
Fonte de carbono : Óleo de soja 15g/L
Volume inicial : 500 mL
pH inicial : 7.0
T : 30°C
tempo
Xt PHB Xr óleo N pH
(h) (g/L) (%) (g/L) (g/L) (mg/L)
0 0,79 ND ND 18,54 239,66 6,94
24 2,95 ND ND 6,64 60,79 5,53
48 4,62 22,80 3,56 5,32 3,80 4,01
72 4,09 20,98 3,23 2,00 0,96 4,13
107
ENSAIO F64-(P)
Data : 16/02/05/ ao 19/02/05
Linhagem : IPT-64 (Burkholderia cepacia)
Objetivo : testar o crescimento bacteriano e o acúmulo de P3HB em meio
mineral limitado em fósforo.
Condições de ensaio:
Fermentador : frascos agitados
Fonte de carbono : Óleo de soja 15g/L
Volume inicial : 500 mL
pH inicial : 7.0
T : 30°C
tempo
Xt PHB Xr óleo N pH
(h) (g/L) (%) (g/L) (g/L) (mg/L)
0 0,36 ND ND 16,52 154,45 7,01
24 1,74 ND ND 6,88 123,99 4,24
48 1,99 13,07 1,73 3,16 81,25 4,01
72 1,89 11,6 1,66 1,26 104,18 3,93
108
ENSAIO B48-20
Data : 19/04/05/ ao 20/04/05
Linhagem : IPT-48 (Burkholderia cepacia)
Objetivo : analisar cinética de crescimento com NH
4
OH até que a primeira
batelada de óleo de soja tenha sido consumida (15 horas
aproximadamente), limitar em nitrogênio e testar acúmulo de
P3HB, controle de pH com Na OH.
Condições de ensaio:
Fermentador : Biorreator Braun
Fonte de carbono : Óleo de soja 10g/L na fase de crescimento + 10 g/L na fase de
acúmulo
Volume inicial : 7.0 L
pH : 7.0
T : 30°C
tempo
Xt PHB Xr óleo
N
(h) (g/L) (%) (g/L) (g/L)
(mg/L)
0 0,21 ND ND 9,08 348,4
2 0,14 ND ND 6,94 393,9
4 0,19 ND ND 6,54 403,8
6 0,30 ND ND 2,14 436,5
8 0,75 5,75 0,71 3,1 415,5
10 1,91 4,34 1,83 6,34 489,5
12 3,47 6,77 3,24 7,2 512,1
14 7,03 17,86
5,77 4,6 600,9
15 2,7
15 8,37 18,91
6,79 7,24 402,1
17 11,12
24,1 8,44 ND 315,7
19 13,14
26,77
9,62 7,26 157,9
22 14,97
28,93
10,64
0,52 42,2
26 14,25
27,69
10,30
4,42 42,7
30 11,03
28,29
7,91 0,56 33,0
32 14,10
27,62
10,21
0,44 29,8
109
ENSAIO B48-40
Data : 17/05/05 ao 19/04/05
Linhagem : IPT-48 (Burkholderia cepacia)
Objetivo : analisar cinética de crescimento com NH
4
OH até que a primeira
batelada de óleo de soja tenha sido consumida (21 horas
aproximadamente), limitar em nitrogênio e testar acúmulo de
P3HB, controle de pH com Na OH.
Condições de ensaio:
Fermentador : Biorreator Braun
Fonte de carbono : Óleo de soja 20g/L na fase de crescimento + 20 g/L na fase de
acúmulo
Volume inicial : 7.0 L
pH : 7.0
T : 30°C
tempo
X PHB Xr óleo N
(h) (g/L) (%) (g/L) (g/L) (mg/L)
0 0,09 4,67 0,09 20,92
394,20
2 0,10 9,67 0,09 20,52
409,20
4 0,16 8,78 0,15 16,26
421,20
6 0,29 7,82 0,27 13,58
457,60
8 0,69 6,95 0,64 12,86
481,00
10 2,16 6,01 2,03 18,14
509,70
12 4,36 9,73 3,94 14,38
565,30
14 7,45 20,45
5,93 5,20 672,80
16 10,19
26,24
7,52 3,60 743,20
18 12,29
ND ND 2,30 1172,47
20 14,40
33,60
9.56 0,10 ND
21 3,70
21 14,43
30,13
10,08
27,23
1177,33
23 15,04
32,39
10,17
26,15
1305,87
25 19,64
27,08
14,32
16,26
1344,30
27 18,36
31,88
12,51
13,44
1101,79
29 14,00
31,91
9,53 12,14
1258,06
32 21,20
39,82
12,76
7,76 ND
35.5 21,72
ND ND 3,32 ND
38 22,58
34,13
14,87
4,84 1079,20
40 23,50
36,13
15,01
3,50 941,20
45 24,32
35,77
15,62
0,90 884,50
110
ENSAIO B48-80
Data : 30/11/05 al 02/12/05
Linhagem : IPT-48 (Burkholderia cepacia)
Objetivo : analisar cinética de crescimento com NH
4
OH até que a primeira
batelada de óleo de soja tenha sido consumida (18 horas
aproximadamente), limitar em nitrogênio e testar acúmulo de
P3HB, controle de pH com Na OH.
Condições de ensaio:
Fermentador : Biorreator Braun
Fonte de carbono : Óleo de soja 40g/L na fase de crescimento + 40 g/L na fase de
acúmulo
Volume inicial : 7.0 L
pH : 7.0
T : 30°C
tempo
Xt PHB Xr Óleo N O2 OUR CER RQ
(h) (g/L)
(%) (g/L) (g/L) (mg/L)
(m
mol/Lh)
(m
mol/Lh)
0 0,27 15,74
0,23 31,3 445,82
21 0.00 0,23
2 0,32 16,25
0,27 34,2 449,26
21 -0,67 0,23 -0,35
4 0,66 12,15
0,58 31,8 468,67
20,8
1.11 0,85 0,76
6 0,9 9,08 0,82 27,1 449,26
20,3
5,61 2,40 0,43
8 1,39 7,87 1,28 19 470,48
19 17,73 6,41 0,36
10 4,06 9,22 3,69 19,9 525,98
15,8
45,16 16,86 0,37
12 8,65 12,20
7,59 5,66 532,08
11,7
77,70 32,08 0,41
14 14 25,28
10,42
ND 570,22
11,9
76,87 25,99 0,34
16 17,9 32,87
11,98
0,22 680,55
12,7
70,85 22,64 0,32
17.5
0,18
17.5 20 31,89
13,59
29,16
751,24
12,8
57,87 20,39 0,35
20 23,7 ND ND 27,92
425,23
12,1
71,42 25,67 0,36
22 26,2 27,63
18,96
13,10
282,88
13 64,05 22,36 0,35
24 28,3 34,08
18,66
11,78
165,76
13,6
58,88 21,79 0,37
27 30,8 35,49
19,87
10,84
17,35 15,8
41,45 17,17 0,41
30 37 31,07
ND ND 6,20 16,7
36,28 12,94 0,36
34 30,1 41,54
17,57
ND 13,58 17,8
26,27 9,49 0,36
38 ND 37,12
ND ND 29,32 18,2
22,69 8,89 0,39
46 34,8 55,00
15,66
ND 0.00 ND 19,89 8,79 0,44
111
ENSAIO B26-20
Data : 05/05/05 ao 06/05/05
Linhagem : IPT-26 (Cupriavidus necator)
Objetivo : analisar cinética de crescimento com NH
4
OH até que a primeira
batelada de óleo de soja tenha sido consumida (14 horas
aproximadamente), limitar em nitrogênio e testar acúmulo de
P3HB, controle de pH com Na OH.
Condições de ensaio:
Fermentador : Biorreator Braun
Fonte de carbono : Óleo de soja 10g/L na fase de crescimento + 10 g/L na fase de
acúmulo
Volume inicial : 7.0 L
pH : 7.0
T : 30°C
tempo
Xt PHB
Xr Óleo
N
(h) (g/L) (%) (g/L) (g/L)
(mg/L)
0.5 0,12 ND ND 8,22 469,9
2 0,81 ND ND 7,78 483,5
4 0,26 ND ND 7,14 485,5
6 0,38 10,7
0,34 6,78 451,0
8 0,66 14,3
0,57 5,98 469,9
10 1,24 12,2
1,09 4,42 469,9
12 2,81 8,75
2,56 3,4 438,2
14 2,74
14 5,52 15,9
4,64 9,68 471,8
16 9,32 31,1
6,43 12,1 354,1
18 14,73
39,5
8,91 6,48 241,9
20 21,48
47,3
11,32
3,84 133,0
22 25,93
ND ND 1,22 51,2
26 17,75
48,9
9,08 1,88 6,6
29 26,54
48,6
13,65
1,24 3,2
112
ENSAIO B26-40
Data : 01/06/05 ao 02/06/05
Linhagem : IPT-26 (Cupriavidus necator)
Objetivo : analisar cinética de crescimento com NH
4
OH constante até que a
primeira batelada de óleo de soja tenha sido consumida (19
horas aproximadamente), limitar em nitrogênio e testar acúmulo
de P3HB, controle de pH com NaOH.
Condições de ensaio:
Fermentador : Biorreator Braun
Fonte de carbono : Óleo de soja 20g/L na fase de crescimento + 20 g/L na fase de
acúmulo
Volume inicial : 7.0 L
pH : 7.0
T : 30°C
tempo
Xt PHB Xr óleo N O2 OUR CER RQ
(h) (g/L) (%) (g/L) (g/L) (mg/L)
(m
mol/Lh)
(m
mol/Lh)
0 0,1 6,21 0,09 11,5 327,7 ND 0.00 0,25
2 0,18 7,32 0,17 6,34 337,0 20,95
-0,10 -0,08 0,75
4 0,21 9,15 0,19 13,78
326,3 20,85
0,79 0,23 0,29
6 0,48 11,73
0,42 16,96
337,0 20,60
3,07 0,85 0,28
8 0,95 10,59
0,85 17,40
346,7 19,80
10,34 3,02 0,29
10 2,6 9,60 2,35 15,04
342,5 18,00
26,38 8,39 0,32
12 5,28 19,73
4,24 10,64
333,0 17,30
32,97 9,48 0,29
14 9,53 37,89
5,92 11,30
322,4 17,00
36,65 5,90 0,16
16 14,46
46,27
7,77 7,04 333,0 16,60
40,94 4,84 0,12
18 20,9 52,85
9,86 3,36 343,9 16,05
46,12 5,77 0,13
19 1,480
19 23,52
54,34
10,74
20,16
346,7 18,30
24,35 5,65 0,23
21 28,8 ND ND 14,72
201,2 15,70
48,73 5,99 0,12
23 30,28
57,10
12,99
6,80 201,2 15,35
51,49 9,70 0,19
25 42,92
61,87
16,37
4,06 135,0 15,35
52,19 8,86 0,17
27 49,12
ND ND 3,55 78,2 15,50
50,83 9,53 0,19
29 45,26
62,32
17,05
3,10 36,4 19,75
10,20 7,75 0,76
31
ND ND ND ND ND
18,05
27,73 7,65 0,28
31.5 57,04
64,22
20,41
4,0 16,1 19,90
9,12 6,34 0,69
113
ENSAIO B26-80
Data : 29/06/05 ao 02/07/05
Linhagem : IPT-26 (Cupriavidus necator)
Objetivo : analisar cinética de crescimento com NH
4
OH constante até que a
primeira batelada de óleo de soja tenha sido consumida (23
horas aproximadamente), limitar em nitrogênio e testar acúmulo
de P3HB, controle de pH com NaOH.
Condições de ensaio:
Fermentador : Biorreator Braun
Fonte de carbono : Óleo de soja 40g/L na fase de crescimento + 40 g/L na fase de
acúmulo
Inóculo : preparado em Caldo nutriente CN (Tabela 7)
Volume inicial : 7.0 L
pH : 7.0
T : 30°C
tempo X PHB Xr Óleo N O2 OUR CER RQ
(h) (g/L) (%) (g/L) (g/L) (mg/L)
(m
mol/Lh)
(m
mol/Lh)
0 0,10 ND ND 32,68 434,6 20,95
0 0,23
2 0,17 ND ND 30,88 439,7 20,95
-0,18 0,23 -1,26
4 0,22 8,91 0,20 31,46 459,0 20,85
0,71 0,54 0,76
6 0,44 15,93
0,37 34,18 455,5 20,55
3,50 1,17 0,33
8 1,14 ND ND 32,42 342,3 19,75
10,79 3,34 0,31
10 2,79 15,66
2,35 32,68 464,5 17,75
28,72 8,85 0,31
12 5,59 30,19
3,90 29,88 422,8 17,35
32,68 8,87 0,27
14 10,21
33,15
6,83 22,20 378,9 12,15
76,82 23,85 0,31
16 17,19
49,25
8,72 22,30 373,0 12,85
72,36 13,57 0,19
18 26,96
63,74
9,77 15,38 358,7 11,70
82,59 12,5 0,15
20 38,50
68,87
11,98
8,30 368,7 10,70
91,13 13,05 0,14
22 41,60
71,85
11,71
2,60 365,8 15,50
49,73 13,72 0,28
23 ND
23 58,60
74,41
14,99
36,82 381,9 18,30
21,66 14,61 0,67
25 55,60
79,71
11,28
29,82 268,5 16,95
90,58 14,78 0,16
27 65,50
80,72
12,63
21,46 119,4 16,75
94,88 18,64 0,20
29 74,70
82,14
13,34
15,60 17,0 16,85
92,59 20,25 0,22
31 87,25
83,88
14,07
9,46 1,5 17,50
78,34 19,78 0,25
34 88,35
83,82
14,30
2,94 3,7 14,95
37,01 28,82 0,78
37 93,70
83,92
15,07
1,94 3,2 17,70
20,25 16,83 0,83
40 86,50
80,70
16,69
0,76 3,7 18,60
14,65 12,74 0,87
42.5 93,25
79,67
18,96
2,98 2,3 18,90
12,89 11,12 0,86
47 88,45
81,46
16,40
2,54 2,5 19,00
12,16 11,48 0,94
114
ENSAIO B26-80*
Data : 26/10/05 ao 28/10/05
Linhagem : IPT-26 (Cupriavidus necator)
Objetivo : analisar cinética de crescimento com NH
4
OH constante até que a
primeira batelada de óleo de soja tenha sido consumida (22
horas aproximadamente), limitar em nitrogênio e testar acúmulo
de P3HB, controle de pH com NaOH.
Condições de ensaio:
Fermentador : Biorreator Braun
Fonte de carbono : Óleo de soja 40g/L na fase de crescimento + 40 g/L na fase de
acúmulo
Inóculo : preparado em Meio mineral MM3 (Tabela 11)
Volume inicial : 7.0 L
pH : 7.0
T : 30°C
tempo
X PHB Xr Óleo N O2 OUR CER RQ
(h) (g/L) % g/L (g/L) mg/L
(m
mol/Lh)
(m
mol/Lh)
0 0,33 43,07
0,19 28,74
367,9 20,95
0,00 0,38
2 0,48 40,48
0,29 31,04
381,1 20,95
-0,22 0,39 -1,72
4 0,72 30,79
0,50 31,96
370,8 20,55
3,54 0,84 0,24
6 1,36 24,84
1,02 34,2 376,7 19,75
10,93 2,55 0,23
8 2,90 19,61
2,33 32,48
375,2 18,00
26,29 8,69 0,33
10 4,97 22,18
3,87 31,32
337,3 15,30
50,12 14,60 0,29
12 9,74 28,07
7,01 26,32
349,5 12,05
77,48 25,05 0,32
14 15,78
36,99
9,94 12,94
356,5 10,80
87,73 27,47 0,31
16 22,35
51,41
10,86
7,94 393,3 10,35
90,80 28,23 0,31
18 37,05
55,73
16,40
6,44 385,7 10,80
88,05 23,59 0,27
20 38,40
65,97
13,07
2,06 365,0 13,15
68,17 26,81 0,39
21,5 ND
21,5 30,25
66,79
10,04
43,78
349,5 18,05
23,03 18,60 0,81
23 43,40
69,52
13,23
25,68
217,9 16,75
93,44 23,50 0,25
25 49,80
71,55
14,17
20,4 75,3 16,65
95,62 25,87 0,27
27 61,95
83,19
10,42
17,96
1,3 16,20
109,07 23,13 0,21
29 68,65
79,13
14,32
15,66
1,1 17,45
77,09 31,99 0,42
31,5 74,65
70,95
21,64
4,84 1,7 18,05
63,71 30,45 0,48
35 79,80
78,77
16,94
ND 2,6 19,00
41,22 29,40 0,71
40 82,45
81,31
15,41
ND 2,8 19,20
38,74 33,07 0,85
46 76,15
79,29
15,77
ND 3,3 20,00
35,51 31,17 0,88
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