( PDF ) Estudo sobre a restrição protéica e seus efeitos no plexo mioentérico de ratos em envelhecimento

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FERNANDO CARLOS DE SOUSA

ESTUDO SOBRE A RESTRIÇÃO

PROTÉICA E SEUS EFEITOS NO PLEXO

MIOENTÉRICO DE RATOS EM

ENVELHECIMENTO

MARINGÁ-PR

2006

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FERNANDO CARLOS DE SOUSA

ESTUDO SOBRE A RESTRIÇÃO PROTÉICA E

SEUS EFEITOS NO PLEXO MIOENTÉRICO DE

RATOS EM ENVELHECIMENTO

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas (Área

de Concentração – Biologia Celular), da

Universidade Estadual de Maringá, para

obtenção do grau de Mestre em Ciências

Biológicas.

Orientador: Prof. Dr. Marcílio Hubner de Miranda Neto

Maringá-PR

2006

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Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)

Sousa, Fernando Carlos de

S725e Estudo sobre a restrição protéica e seus efeitos no

plexo mioentérico de ratos em envelhecimento /

Fernando Carlos de Sousa. – Maringá, PR : [s.n.],

2006.

98 f. : il.

Orientador : Prof. Dr. Marcílio Hubner de Miranda

Neto.

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de

Maringá. Programa de Pós-graduação em Ciências

Biológicas, 2006.

1. Desnutrição protéica - Envelhecimento -

Deficiência. 2. Desnutrição - Pobreza -

Envelhecimento. 3. Desnutrição protéica - Plexo

mioentérico. 5. I. Universidade Estadual de Maringá.

Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas. II.

Título.

CDD 21.ed.611.018

Aos meus cúmplices,

Edimara Rodrigues de Castro e Vinícius Castro Sousa.

AGRADECIMENTOS

Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular da Universidade Estadual

de Maringá, pela oportunidade de realização deste curso de Mestrado.

À professora Dra Sonia Lucy Molinari, quem primeiro fez nascer em mim o

amor pela anatomia, e ao meu orientador, professor Dr. Marcílio Hubner de Miranda

Neto. Agradeço especialmente por não terem me ensinado somente “ciência”, mas

cidadania e ética. A sua conduta pessoal e profissional me influenciará por toda vida.

Às professoras Sonia Tranin de Mello, Dra Maria Raquel Marçal Natali e Dra

Célia Regina Gomes Godoy, por me ensinarem que o mérito de um cientista deve ser

dado por sua capacidade e esforço para alcançar o conhecimento e não pela posse de um

dado conhecimento nem pelo domínio de uma técnica; o conhecimento em si é livre e

deve ser compartilhado.

À professora Larissa Renata de Oliveira que gentilmente me enviou anotações

pessoais de seus estudos sobre o estômago do rato. Obrigado, pelo apoio no início dos

meus estudos sobre o Sistema Nervoso Entérico, por me familiarizar ao Laboratório de

Neurônios Entéricos da UEM, e pela amizade verdadeira.

Aos professores, Dr. Sergio Zucoloto (USP), Dr. David Torralardona (Itália) e

Dra Liliana Luciano (Alemanha), que gentilmente me enviaram artigos científicos.

Obrigado por sua colaboração e generosidade. O artigo clássico da Dra Luciano que

recebi autografado vai ser sempre motivo de orgulho.

À Cleonira Sarro e José Antonio de Souza pelo suporte técnico necessário para

produção deste trabalho e pelos quase dez anos de convivência.

Aos amigos do Laboratório de Neurônios Entéricos da Universidade Estadual de

Maringá, João Paulo Schoffen e Priscila de Freitas, pelo companheirismo, suporte e

amizade ao longo de vários anos.

Ás professoras Caroline Rosa Fillaneli e Vilma Balielo e toda equipe do Campus

Maringá da PUCPR, pela amizade e apoio.

Aos meus pais e irmãos, que mesmo com todas as dificuldades apoiaram o meu

sonho de criança de ser cientista. O sonho virou projeto e esta é mais uma etapa.

Obrigado por acreditarem em mim.

Agradeço a Deus que além da vida e de toda provisão me deu Yeshua Ha

Mashiach (Jesus o Messias) a Torá, a BritChadashá e demais escrituras que nos ensinam

o caminho.

O que é mais difícil? O que parece mais simples: ver

com os olhos o que está diante deles.

Goethe

APRESENTAÇÃO

Em consonância com a Resolução Nº 01/2003-CCPBC do Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Maringá, esta

dissertação de mestrado é composta por um artigo científico completo e um de revisão

na forma exigida pelas revistas científicas em que pretendemos publicá-los, assim

sendo:

SOUSA, F.C.; MIRANDA-NETO, M.H. Desnutrição: inter-relações entre os aspectos

celulares e sociais. Este artigo será submetido à apreciação do corpo editorial da revista

Arquivos da APADEC (ISSN 1414-7149), visando sua publicação........................Pág. 15

SOUSA, F.C.; MIRANDA-NETO, M.H. Efeitos da alimentação hipoprotéica sobre os

neurônios NADH-diaforase positivos do estômago de ratos em envelhecimento / Effects

of hypoproteic feeding on the NADH-diaphorase positive neurons of the stomach of

aging rats. Este artigo será submetido à apreciação do corpo editorial da revista

Autonomic Neuroscience: Basic and Clincal (ISSN 1566-0702), visando sua

publicação................................................................................................................Pág. 35

Normas para publicação da revista Arquivos da APADEC (ISSN 1414-7149)......Pág. 90

Normas para publicação da revista Autonomic Neuroscience: Basic and Clincal (ISSN

1566-0702)..............................................................................................................Pág. 93.

RESUMO

A desnutrição protéico-calórica é o tipo mais comum de desnutrição no mundo e

afeta milhares de pessoas. Existem dois extremos de desnutrição protéico-calórica: o

marasmo e o kwashiorkor. O marasmo é um quadro de redução total na oferta de

alimento; enquanto o kawshiorkor é caracterizado pela maior deficiência de proteínas

em relação aos carboidratos.

O maior custo dos alimentos ricos em proteínas em relação aos carboidratos

acarreta uma maior prevalência de desnutrição por deficiência de proteínas em

populações com baixa renda, as quais já são mais vulneráveis a muitos outros

problemas e geralmente menos amparadas pelo Estado, tornando o problema da

desnutrição uma questão social.

Neste trabalho, refletimos sobre como os altos índices de pobreza e concentração

de renda historicamente tem contribuído para altos índices de desnutrição no Brasil.

Acreditamos que os conhecimentos sobre a dimensão social e fisiológica da desnutrição

não devem ficar restritos ao meio acadêmico e por isso nos empenhamos em produzir

um trabalho com uma linguagem voltada para educadores e pessoas da comunidade em

geral, a fim de levar para fora dos muros da universidade a discussão sobre pobreza,

desnutrição e seus efeitos.

O aumento na população de idosos é um fenômeno que está ocorrendo em

muitos países, inclusive no Brasil, e muitos estudos têm sido realizados buscando

compreender os mecanismos de envelhecimento e subsidiar práticas e ações para

promover o envelhecimento saudável. Devido às alterações metabóblicas e fisiológicas

do envelhecimento, como menor eficiência na absorção e utilização dos nutrientes e

redução na massa muscular, os idosos são predispostos a sofrerem desnutrição protéica.

Também é comum os idosos apresentarem queixas de problemas gastrointestinais, como

esvaziamento gástrico retardado, acalasia, etc. Como o sistema nervoso entérico é o

principal sistema de controle das atividades do trato gastrointestinal, realizamos um

estudo experimental, utilizando como modelo o plexo mioentérico do estômago de

ratos, a fim de realizar um paralelo entre a desnutrição protéica e o envelhecimento.

O modelo de restrição protéica utilizado neste trabalho tem sido empregado por

vários anos no Laboratório de Neurônios Entéricos da Universidade Estadual de

Maringá. Em animais jovens, esse modelo tem se mostrado eficiente em promover um

quadro de carência de proteínas semelhante ao kwashiorkor encontrado em humanos

submetidos a dietas com redução de proteínas e oferta de carboidratos. Atualmente, o

modelo está sendo utilizado em animais em fase mais avançada de envelhecimento.

Para a realização desta pesquisa, utilizamos 10 ratos (Rattus norvegicus) da

linhagem Wistar, machos, distribuídos em dois grupos. O grupo controle foi formado

por cinco animais que, ao longo do período experimental (entre os 210 e 345 dias de

vida), foram alimentados com dieta comercial para roedores, contendo 22% de

proteínas. No grupo restrição protéica, foram utilizados cinco animais que, durante o

período experimental, foram alimentados com dieta hipoprotéica (8% de proteínas),

obtida a partir de adição de amido de milho na dieta comercial. Durante o período

experimental, foi controlada a evolução do ganho de peso e o consumo de ração dos

animais. Ao final do período experimental, os animais tiveram seu peso e seu

comprimento mensurados; então foram mortos, e seus estômagos coletados. Os

estômagos foram preparados para estudo neuronal.

Para evidenciação dos neurônios, utilizou-se a técnica histoquímica da NADH-

diaforase. Através de microdissecção, foram obtidos preparados totais das regiões

aglandular e glandular do estômago de cada um dos animais. Esses preparados foram

utilizados para estudo quantitativo e morfométrico dos neurônios NADH-diaforase

positivos. No estudo morfométrico, foi mensurada a área do perfil do corpo de 100

neurônios por animal – 50 da região aglandular e 50 da região glandular – utilizando-se

um sistema computadorizado. Para quantificação dos neurônios, lâminas com os

preparados totais de estômago foram observadas em microscópio de luz, e contou-se o

número de neurônios em 80 campos de visualização (19 mm

) por animal – 40 na região

aglandular e 40 na região glandular.

Nossos resultados sugerem que a oferta de dieta com 8% de proteínas, quando

comparada com a alimentação por ração padronizada (22% de proteínas), causa

modificações em parâmetros corporais, alimentares e neuronais de ratos em

envelhecimento.

Nos parâmetros corporais, encontramos alterações no padrão de crescimento dos

animais alimentados com dieta hipoprotéica, com redução de 5,5% no ganho de peso

médio e aumento na formação de gordura retroperitoneal e periepididimal, com média

de 19%, sugerindo redução na massa muscular e aumento na massa adiposa.

Observamos que os animais alimentados com a ração hipoprotéica apresentaram

hipofagia, em relação aos animais alimentados com a ração padrão. O tratamento

também levou à redução das proteínas totais e das globulinas no plasma, mas não

reduziu a albumina plasmática. Essas alterações sugerem que a dieta oferecida levou à

redução na disponibilidade tecidual de aminoácidos, indicando que o teor de 8% de

proteínas encontra-se abaixo do requerimento nutricional de ratos entre os 210 e 345

dias de vida.

Com relação aos parâmetros neuronais analisados, observamos que a restrição

protéica intensifica a redução no número de neurônios NADH-diaforase positivos em

animas em envelhecimento. Os animais submetidos à restrição protéica, em relação aos

animas controle, apresentaram menor número de neurônios no plexo mioentérico das

regiões aglandular (20%) e glandular (10%) do estômago. O estudo morfométrico

revelou que os animais submetidos à restrição protéica apresentaram redução no

tamanho do perfil do corpo dos neurônios mioentéricos NADH-diaforase positivos. A

redução no número e tamanho dos neurônios NADH-diaforase positivos indica redução

na atividade metabólica mitocondrial desses neurônios e redução na atividade e/ou

expressão da enzima NADH-diaforase.

A população de neurônios NADH-diaforase positivos tem sido relatada em

alguns estudos como resistente à redução por envelhecimento em animais com dieta

padrão. Discute-se a possibilidade de que dietas com redução no teor de proteínas

podem alterar esse padrão por induzirem alterações sistêmicas e intracelulares.

Palavras-chave: pobreza, envelhecimento, restrição protéica, sistema nervoso entérico.

ABSTRACT

Protein malnutrition is the commonest type of undernutrition and affects

thousands of individuals worldwide. There are two extremes of protein-caloric

undernutriton: marasmus and kwashiorkor. Marasmus is a picture of total reduction of

food offer, while kwashiorkor is characterized by greater protein than carbohydrate

deficiency.

The higher costs of protein-rich foods compared to carbohydrates leads to a

greater prevalence of malnutrition due to protein deficiency in low-income populations,

which are already more vulnerable to many other problems and often less supported by

the State. This makes of malnutrition a social issue.

In this work, we consider how the high indexes of poverty and income

concentration have historically contributed to the high prevalence of malnutrition in

Brazil. We believe that the awareness about the social and physiological dimensions of

malnutrition should not be restricted to academic circles and thus we made efforts to

produce manuscript accessible to educators and the community in general, so as to bring

the discussion about poverty, malnutrition and their effects out of the walls of the

university.

The increase of the elderly population is a phenomenon occurring in many

countries, Brazil included, and many studies have been undertaken to understand the

aging mechanisms and give support to practices and actions towards healthy aging. Due

to the metabolic and physiological changes of aging, such as lower absorption

efficiency and nutrient utilization, and decreased muscle mass, older people are prone to

suffer from protein malnutrition. It is also common that the elderly complain of

gastrointestinal problems, such as delayed gastric emptying, achalasia, etc. As the

enteric nervous system is the major controlling system of the gastrointestinal tract

activities, we carried out an experimental study, using the myenteric plexus of the rat

stomach as a model, to trace parallels between protein malnutrition and aging.

The model of protein restriction used in this work has been employed for several

years in the Laboratory of Enteric Neurons of the State University of Maringá. In young

animals, this model was shown to be effective in promoting a picture of protein lack

similar to the kwashiorkor found in humans subjected to low-protein diets and

carbohydrate offer. At present, the model is being used in animals at an advanced stage

of aging.

For this research, 10 male rats (Rattus norvegicus) were allotted to two groups.

The control group was composed of five animals that, during the experimental period

(from 210 to 345 days of life) were fed with commercial rodent chow, containing 22%

protein. In the protein restriction group, it was used five animals that, during the

experimental period, were fed with hypoproteic chow (8% protein), obtained from the

addition of corn starch to the commercial chow. Throughout this period, body weight

gain and food ingestion were recorded. At the end of the experiment, the animals were

weighted and measured, then killed and the stomachs collected. These were prepared for

neuronal study.

For the staining of the neurons, it was used the histochemical technique of the

NADH-diaphorase. Through microdissection, whole-mounts were obtained from the

forestomach and glandular stomach of each of the animals. These whole-mounts were

used for the quantitative and morphometric assessment of the NADH-diaphorase

positive neurons. In the morphometric study, the area of the cell body profile of 100

neurons per animal – 50 from the forestomach and 50 from the glandular stomach – was

measured using a computerized system. For neuronal counts, the laminae of the whole-

mounts were observed under light microscope and the number of neurons in 80 visual

fields (19 mm

) per animal – 40 from the forestomach and 40 from the glandular

stomach – was counted.

Our results suggest that the offer of an 8%-protein diet, when compared to

standard chow feeding (22% protein), causes changes in body, feeding and neuronal

parameters in aging rats.

As for the body parameters, we found changes in the growth pattern of the

animals fed with hypoproteic diet, with reduction of 5.5% in the mean weight gain and

increase in the formation of retroperitoneal and periepididymal fat pads of 19% on

average, suggesting reduction in the muscle mass and increase in the adipose mass. We

observed that the animals fed with hypoproteic chow were hypophagic, compared to the

animals fed with standard chow. The treatment also reduced total proteins and globulins

from the plasma, but did not decrease plasma albumin. These changes suggest that the

diet led to a decreased tissue availability of aminoacids, indicating that the 8%-protein

level is below the nutritional requirement of rats aging from 210 and 345 days.

As for the neuronal parameters investigated, we observed that protein restriction

intensifies the decrease in the number of NADH-diaphorase positive neurons in aging

animals. The animals subjected to protein restriction, relative to the controls, showed

smaller number of neurons in the myenteric plexus of the forestomach (20%) and

glandular stomach (10%). The morphometric study revealed that the animals subjected

to protein restriction showed decreased size of the cell body profile of the NADH-

diaphorase positive neurons. The decreased number and size of these neurons points to

a decreased mitochondrial metabolic activity and decreased activity and/or expression

of the NADH-diaphorase enzyme.

The population of NADH-diaphorase positive neurons has been reported in

some studies as being resistant to reduction due to aging in animals with standard chow.

It is discussed the possibility that diets with reduced protein levels can modify this

pattern by inducing systemic and intracellular changes.

Key words: poverty, aging, protein restriction, enteric nervous system.

Desnutrição: inter-

relações entre os

aspectos celulares

e sociais

Desnutrição: inter-relações entre os aspectos celulares e

sociais

Fernando Carlos de Sousa*, Marcílio Hubner de Miranda Neto**

* Professor – Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR)

**Professor – Departamento de Ciências Morfofisiológicas,

Universidade Estadual de Maringá (UEM)

Correspondência para:

Fernando Carlos de Sousa

Rua Olímpio Mendes da Rocha, 206B, Vila Esperança, Maringá-PR.

CEP 87020-780

Fone: 44 3263-9637

Fax: 44 3028-8400

e-mail: [email protected]

DESNUTRIÇÃO: INTER-RELAÇÕES ENTRE OS ASPECTOS CELULARES E

SOCIAIS

Resumo. No presente artigo, buscou-se reunir informações sobre a desnutrição no

tocante a fisiopatologia e estatísticas sobre indicadores nutricionais e sociais no Brasil.

Percebe-se que a desnutrição protéico-calórica possui causas e conseqüências variadas e

complexas que infelizmente são estudadas de maneira fragmentada, comprometendo a

real compreensão da dimensão do problema. Isto nos motivou à produção deste artigo,

que busca reunir reflexões sobre as múltiplas questões que envolvem a desnutrição,

desde o nível social ao nível microscópico, uma vez que as alterações celulares, sejam

elas fisiológicas ou morfológicas, decorrem de uma ingestão inadequada de alimentos

associada a diferentes fatores: fisiológicos, sociais, culturais ambientais, políticos, éticos

e morais.

Palavras-Chave: desnutrição; pobreza; fisiopatologia.

Malnutrition: interrelations between cellular and social aspects

Abstract. In the present paper we seek to gather information concerning malnutrition

on its physiopathology and statistical data about nutritional and social indicators in

Brazil. In face of the data, could be perceived that protein-caloric malnutrition has

diverse and complex causes and consequences that unfortunately are studied in a

fragmented manner hindering the real understanding of this problem’s dimension. This

point of view had motivated the production of this paper that aimed to gather reflections

concerning the varied subjects involving malnutrition from social to the microscopic

level since both morphological and physiological cellular alterations are due the

inadequate food intake associated to many different factors, such as: physiological,

social, cultural, environmental, political, ethical and moral ones.

Key words: malnutrition; poverty; physiopathology

INTRODUÇÃO

A célula é a unidade funcional dos seres vivos. Isso quer dizer que a vida de um

organismo é a somatória do trabalho de todas as suas células. Toda atividade biológica,

desde processos de defesa contra agentes agressores até o pensamento e os sentimentos

tão complexos dos seres humanos se apóiam sobre uma base celular, o que implica um

gasto constante de energia por parte de cada uma das células que constituem o

organismo humano. Pode-se inclusive afirmar que viver é consumir energia para

reproduzir. Portanto, desde a concepção até a morte, ocorre um processo contínuo de

reprodução celular que permite ao organismo crescer, enquanto jovem, reparar tecidos

lesados, repor células mortas, substituir células envelhecidas por células jovens, bem

como sintetizar neurotransmissores, enzimas diversas, hormônios, proteínas estruturais,

anticorpos e vários outros compostos que formam a matéria viva ou que são

indispensáveis para a sua manutenção.

O substrato requerido pelas células para obtenção de energia, bem como a

matéria prima para a síntese de todos os compostos celulares vêm da dieta. Assim, uma

dieta adequada deve considerar fatores qualitativos (tipos necessários de nutrientes) e

quantitativos (quantidade necessária de cada nutriente).

Existe uma ampla gama de estudos nutricionais capazes de indicar a “dieta

ideal” para cada faixa etária ou até mesmo para cada indivíduo, de acordo com as suas

condições de saúde. Noções básicas de nutrição são oferecidas desde a pré-escola,

entretanto, no Brasil e em todo o mundo, o número de desnutridos é muito expressivo.

As carências nutricionais resultam da ingestão inadequada de carboidratos,

proteínas, vitaminas e minerais, originando com freqüência quadros de desnutrição

protéica ou desnutrição protéico-calórica.

A oxidação intracelular dos carboidratos e dos lipídios é a principal fonte de

energia para manutenção das atividades celulares. Pelo fato de essa energia – fornecida

pelos carboidratos e lipídios, e em certas ocasiões por outros compostos celulares – ser

medida laboratorialmente na unidade de calorias, é que se denomina de desnutrição

calórica ou déficit calórico a deficiência de carboidratos e lipídios.

A ingestão de alimentos ricos em açúcares (carboidratos) como arroz, biscoito,

pão macarrão, rapadura, mandioca, batata-doce, entre outros, garante ao organismo

fontes baratas de energia, pois esses alimentos, ao serem digeridos, liberam moléculas

de açúcares simples, como a glicose e a frutose, que são transportadas pelo sangue até

as células, onde servem à respiração celular, ou seja, são oxidadas (queimadas),

liberando a energia necessária à vida celular e à vida de todo o organismo,

possibilitando, dessa maneira, a realização das atividades físicas e mentais

características do fazer humano. Portanto falar em deficiência de calorias é falar em

redução na disponibilidade de energia pelas células e, conseqüentemente, em redução da

capacidade humana para produzir trabalho físico e mental, comprometendo a

capacidade dos sujeitos de interagirem com o mundo.

Por outro lado, as proteínas – que também são moléculas energéticas, mas em

humanos normalmente não são usadas como fonte primária de energia – possuem

atividades muito diversas: atuam como elemento estrutural, conferindo consistência,

dureza e resistência ao corpo; estão presentes na composição de muitos hormônios;

formam anticorpos que são elementos do nosso sistema imunológico, e também as

enzimas que compõem a maquinaria celular, ou seja, o conjunto de estruturas

responsáveis pelo funcionamento e pela regulagem do metabolismo em cada célula do

organismo.

Mesmo quando não são utilizadas como fonte de energia, as proteínas

desempenham papéis fundamentais na respiração celular, pois são as proteínas dos

alimentos que, após serem digeridas, fornecem aminoácidos que serão utilizados para a

produção de enzimas que atuam na cadeia respiratória. Por causa disso, a carência de

proteínas pode comprometer seriamente a captação, o transporte e a utilização do

oxigênio, elemento fundamental para a utilização dos alimentos energéticos na

respiração celular. Em outras palavras, a utilização dos alimentos energéticos de

maneira eficaz é diretamente dependente do acesso do sujeito ao oxigênio do ar e de

seu transporte até as células, onde, no nível mitocondrial, atuará como “comburente” na

reação de queima (oxirredução) característica da respiração celular.

É importante que cada cidadão compreenda que a função dos pulmões é

promover a hematose, enquanto a verdadeira respiração é um fenômeno celular, cuja

função é a liberação da energia contida nas ligações químicas dos alimentos energéticos

como a glicose, obtida principalmente a partir da digestão do amido presente em

diversos alimentos como pão, arroz, macarrão, batata, etc. É também interessante que

cada indivíduo reflita sobre a seguinte questão: o que é mais caro para ser obtido,

glicose ou oxigênio? Realizamos essa pergunta numerosas vezes durante aulas na

graduação, cursos para professores do ensino fundamental e médio e para profissionais

da saúde e, na maioria das vezes, as pessoas respondiam que a glicose é mais difícil de

ser obtida, já que deve ser comprada com os alimentos, enquanto o oxigênio está

disponível no ar. Verifica-se por tal resposta um grande engano decorrente do ensino

fragmentado praticado em todos os níveis de escolarização. Cabe relembrar que a

glicose é encontrada geralmente em alimentos de baixo custo. Por outro lado, o

transporte do oxigênio dos pulmões até as células depende da existência de um número

ideal de hemácias no sangue, e que essas hemácias sejam ricas em hemoglobina

(combinação de proteína com ferro), que transporta o oxigênio em direção às células e

traz o gás carbônico por elas produzido. Acontece que as hemácias vivem cerca de 120

dias. Após esse período, são destruídas pelo fígado e pelo baço e substituídas por novas

hemácias produzidas pela medula óssea vermelha. Para a produção de novas hemácias

ser eficaz, faz-se necessária uma ingestão adequada de proteínas e ferro, pois a proteína,

ao ser digerida nos intestinos, transforma-se em aminoácidos que são lançados na

corrente sangüínea e distribuídos para diferentes órgãos e tecidos, onde podem ser

utilizados para produção de enzimas, anticorpos, partes de células e novas células que

garantem a renovação dos tecidos. A baixa ingestão de proteínas, portanto, compromete

todos os processos citados, podendo resultar em maior incidência de infecções - devido

à redução das defesas do organismo – retardo no crescimento de crianças,

envelhecimento precoce dos adultos, redução na quantidade e na qualidade das

hemácias com comprometimento do transporte de gases.

Nas classes sociais em que dinheiro para comprar alimento não é um problema,

o excesso de ingestão de alimentos ricos em amido e/ou gordura em detrimento

daqueles que contém vitaminas, minerais e proteínas está geralmente vinculado a maus

hábitos alimentares. Já entre os mais pobres, a tendência a ingerir muito carboidrato é,

em princípio, uma decorrência da questão financeira, pois os alimentos ricos em

carboidratos são geralmente mais baratos e mais fáceis de serem obtidos do que aqueles

ricos em proteína. Concorrem, portanto, para uma alimentação distorcida: questões

culturais; questões ambientais (seca prolongada); questões políticas (falta de uma

política adequada de distribuição de alimentos); questões econômicas e sociais

(concentração de renda, baixos salários e desemprego); e questões éticas e morais

(desvios do dinheiro público, roubo da merenda escolar).

Portanto a desnutrição protéico-calórica tem causas e conseqüências variadas e

complexas, as quais infelizmente são estudadas de maneira fragmentada,

comprometendo a real compreensão da dimensão do problema. Esse fato nos motivou à

produção deste artigo, que busca reunir reflexões quanto às múltiplas questões sobre a

desnutrição, desde o nível social ao nível microscópico.

DESNUTRIÇÃO PROTÉICO-CALÓRICA

CONCEITO DE DESNUTRIÇÃO E FORMAS EXTREMAS DE DESNUTRIÇÃO

PROTÉICO-CALÓRICA (marasmo e kwashiorkor)

A desnutrição é definida como um estado patológico de diferentes graus de

intensidade e variadas manifestações clínicas. Ela é produzida pela deficiente

assimilação dos componentes dos diferentes grupos de nutrientes. O conceito de

desnutrição compreende desde formas graves de desnutrição protéico-calórica, como o

marasmo e o kwashiorkor, bem como formas intermediárias ou moderadas, além da

deficiência de outros nutrientes (vitaminas e/ou minerais), que pode ocorrer

separadamente ou, como é comum, associada ao déficit protéico-calórico.

Os quadros clínicos denominados de marasmo e o kwashiorkor representam dois

extremos da desnutrição protéico-calórica. Entretanto, independentemente da forma

clínica encontrada, há deficiência protéica. Mesmo nos casos em que a ingestão protéica

é adequada, a deficiência calórica faz as proteínas serem utilizadas para fins energéticos.

A desnutrição protéico-calórica pode ser encontrada em todas as partes do mundo e em

todas as idades, sendo mais comum em crianças pobres dos países em desenvolvimento

(OLIVEIRA & MARCHINI, 1998).

MARASMO

Marasmo é uma deficiência crônica de energia. Em estados avançados,

caracteriza-se por perda da massa muscular e ausência de gordura subcutânea.

A glicose, um carboidrato, é fonte primária de energia para o tecido nervoso, as

hemácias, os leucócitos e outros tecidos que dela dependem. Para manter a função, o

nível de glicose deve ser mantido dentro de uma faixa normal em todos os momentos.

Para isso, após as refeições, parte da glicose absorvida dos alimentos é armazenada na

forma de glicogênio e utilizada durante o jejum. Nos seres humanos as reservas de

glicose na forma de glicogênio duram cerca de 24 horas.

O organismo pode sintetizar glicose a partir de outros compostos, processo

chamado de neoglicogênese ou gliconeogênese, sendo o principal substrato para isso os

aminoácidos, moléculas que formam as proteínas. Todos esses processos estão sujeitos

a mecanismos de controle, principalmente controle hormonal. Durante o jejum o

hormônio insulina tem sua secreção diminuída, e os hormônios catabólicos – epinefrina,

tiroxina, hormônio do crescimento e glucagon – têm sua liberação aumentada. Tais

hormônios estimulam a quebra do glicogênio e a liberação de aminoácidos das proteínas

musculares e outros substratos disponíveis para a gliconeogênese. Conforme a inanição

prossegue, o corpo se adapta, e no fígado, a gliconeogênese diminui da produção de

90% de glicose para menos de 50%. Simultaneamente a isso aumenta sua produção

pelos rins, para suprir a redução da produção ocorrida no fígado.

Além de glicose, durante o jejum, a gordura armazenada no tecido adiposo é

usada como fonte de energia primariamente pelos músculos, inclusive o músculo

cardíaco. A liberação e o uso de ácidos graxos das gorduras armazenadas no tecido

adiposo requerem que os níveis de insulina sejam mantidos baixos e que haja um

aumento dos hormônios glucagon, cortisol, epinefrina e do hormônio do crescimento.

Esses hormônios estimulam a liberação de ácidos graxos do tecido adiposo. Tais ácidos

graxos viajam pela corrente sanguínea, ligados às proteínas presentes no plasma, e são

captados pelo fígado. Nas mitocôndrias hepáticas, os ácidos graxos podem dar origem a

compostos denominados de corpos cetônicos.

A adaptação à inanição depende da produção de corpos cetônicos. Conforme se

eleva o nível de corpos cetônicos durante o jejum, o tecido nervoso adapta-se

aumentando a síntese das enzimas necessárias para a utilização dos corpos cetônicos

como fonte primária de energia. Como o tecido nervoso, principal consumidor de

glicose, está utilizando um combustível alternativo para a glicose, a demanda de

proteína muscular para gliconeogênese diminui. Dessa forma, em um indivíduo que está

adaptando-se à inanição, as perdas de proteína são minimizadas, e a massa muscular

poupada. Apesar de a gordura não poder ser transformada em glicose, ela fornece

corpos cetônicos para o tecido nervoso e para os músculos. Enquanto a água estiver

disponível, o indivíduo de peso normal pode jejuar por um mês – são mantidos índices

nutricionais relativamente normais, função imunológica e outros sistemas. Porém, após

esse tempo, quando as reservas de gordura esgotam-se, a proteína será utilizada e o

indivíduo morrerá (WAITZBERG & MOREIRA-JÚNIOR, 2001; MAHAN &

ESCOTT-STUMP, 2005).

KWASHIORKOR

O kwashiorkor é um quadro que se instala quando a dieta é muito mais

deficiente de proteínas do que de calorias. Esse quadro foi primeiro descrito por Cicely

D. Willians, em 1933, quando trabalhava como médica voluntária na África. O termo

kwashiorkor vem de um dialeto africano e quer dizer “a doença do primeiro filho

quando nasce o segundo”.

Cicely observou que as mulheres africanas, ao terem seus filhos, alimentavam-

nos com o leite materno, uma boa fonte de nutrientes. Entretanto como elas logo

engravidavam novamente, quando o próximo filho nascia, o precedente deixava de ser

alimentado com leite materno e passava a receber uma dieta monotonamente à base de

farinha de milho, capaz fornecer os carboidratos necessários para o fornecimento de

calorias, mas incapaz de suprir as necessidades protéicas de um organismo em

crescimento (MAHAN & ESCOTT-STUMP, 2005).

A adaptação não é possível para os doentes de kwashiorkor porque a ingestão de

carboidratos estimula a liberação de insulina.

A insulina é um hormônio de armazenamento que impede as reservas de gordura

de serem empregadas para combustível. Ela também inibe a transformação de gordura

em corpos cetônicos. A secreção de insulina impede a quebra de proteína muscular, e

esta não pode ser utilizada para produzir albumina e outras proteínas necessárias aos

órgãos e ao sangue. Dessa forma, por ser a albumina importante para a retenção de água

no sangue, quando reduzida, ocorre acúmulo de água nos tecidos e edema. A função

neural e a absorção intestinal ficam comprometidas, ocorre redução da capacidade

cardíaca, fadiga e redução da função imunológica.

A desnutrição protéico-calórica não adaptada é perigosa não apenas porque a

perda de proteína ininterrupta pode se tornar prejudicial à vida, por comprometer os

músculos do coração e o sistema respiratório, mas também porque compromete o

sistema nervoso e o imunológico. Limitando a defesa do indivíduo, ela o torna

suscetível a um ciclo vicioso de infecções, diarréia, mais perda de nutrientes, infecções

oportunistas e morte (RIELLA, 2001; MAHAN & ESCOTT-STUMP, 2005).

MARASMO-KWASHIORKOR

O quadro misto marasmo-kwashiorkor é uma combinação de deficiência calórica

crônica com deficiência protéica crônica ou aguda. Isso ocorre, por exemplo, quando

um paciente marasmático é submetido a um estresse agudo, como trauma cirúrgico ou

infecção, de forma que o kwashirokor se adiciona à desnutrição calórica prévia. O

marasmo-kwashiorkor apresenta uma mistura da sintomatologia dos dois estados

comentados anteriormente (OLIVEIRA & MARCHINI, 1998; WAITZBERG &

MOREIRA-JÚNIOR, 2001).

ALTERAÇÕES NA ALTURA E NO PESO

Além das alterações fisiológicas já descritas para os quadros de marasmo e de

kwashiorkor, é importante ressaltar as alterações na altura e no peso provocadas pela

desnutrição protéico-calórica, uma vez que essas alterações, por serem mais fáceis de

aferir, são largamente utilizadas em estudos do estado nutricional de grandes

populações.

Para avaliação da desnutrição infantil, são utilizados os índices de peso relativo à

idade (peso/idade) e altura relativa à idade (altura/idade), pois a desnutrição crônica

afeta o desenvolvimento e leva à redução da altura e do peso de crianças. Admite-se

como padrão de altura e peso para determinada idade os dados coletados em extensos

estudos na população dos Estados Unidos. A partir daqueles dados, considera-se que a

ocorrência de crianças com baixa altura/idade, com freqüência maior do que 2,3%, e a

ocorrência de crianças com baixo peso/idade, com freqüência maior do que 5% da

população infantil, indicam severo impedimento do desenvolvimento, porque tais

freqüências são extremamente raras em populações consideradas bem nutridas.

Para a população adulta, utiliza-se o índice de massa corporal (IMC), expresso

pelo peso em quilos dividido pela altura em metros ao quadrado. Segundo o Comitê de

Especialistas da Organização Mundial da Saúde, valores de IMC inferiores a 18,5 kg/m

indicam nível mínimo de reservas energéticas no adulto. Esse valor pode ser encontrado

em populações que não apresentam restrição alimentar, mas em um índice percentual

limitado entre 3 a 5% das pessoas. Essa fração representaria o contingente de indivíduos

constitucionalmente magros em uma população. Admite-se que indivíduos com IMC

menor que 18,5 kg/m

, presentes em freqüência superior a 5% da população, indiquem

exposição da população a déficits protéico-calóricos que levam ao déficit de

crescimento e/ou à redução da massa corporal, caracterizando o quadro de desnutrição

protéico-calórica (MONTEIRO, 1995; NÓBREGA, 1998).

POBREZA, FOME E DESNUTRIÇÃO NO BRASIL

Estudos estatísticos sobre pobreza, a fim de simplificar dos resultados,

consideram apenas a situação monetária, utilizando o conceito de linha de pobreza, que

no caso brasileiro baseia-se no valor do salário-mínimo.

O salário-mínimo foi precedido pela criação da “ração essencial mínima”, em

1938, a qual seria composta dos alimentos necessários para a manutenção da saúde de

um trabalhador adulto. Criado em 1º de maio de 1940, o salário-mínimo, anunciado à

nação pelo discurso do presidente Vargas, seria capaz de garantir o indispensável para o

sustento do trabalhador e de sua família, segundo afirmação daquele presidente

(VASCONCELOS, 2005).

Considera-se como pobre a pessoa com renda individual per capita abaixo de 0,5

(meio) salário-mínimo, e como indigente aqueles com renda inferior a 0,25 (um quarto)

salário-mínimo; mas o uso de uma linha de pobreza fixa pode gerar problemas. Algo

que pode ser citado como exemplo é o fato de no Brasil haver um grande contingente de

aposentados, cujo piso da aposentadoria é o salário-mínimo. Se estabelecermos uma

linha de pobreza um centavo abaixo do valor de um salário-mínimo, esses aposentados

não serão incluídos como pobres; por outro lado, se estabelecermos uma linha de

pobreza um centavo acima do salário-mínimo, todos ele serão contados como pobres.

Outro problema é que para compor as estatísticas oficiais são coletados apenas dados da

população residente, excluindo-se uma massa de pessoas que moram na rua.

No período de 1977 a 1998, o porcentual de pobres manteve-se em relativa

estabilidade oscilando entre 40 e 45% da população. Atingiu seu ápice na recessão

econômica do início dos anos de 1980, entre 1983 e 1984, quando ultrapassou os 50%

da população, e reduziu significativamente com o início do plano Cruzado, em 1986, e

no plano Real em 1994. Entretanto o número total de pobres aumentou de 10 milhões

em 1977 para 50 milhões em 1998 devido ao aumento na população (BARROS et al.,

2000).

De acordo com HOFFMANN (1995) o número de pobres nesse período cresceu

mais na área urbana do que na rural, em função do processo de urbanização da

população do país.

A tendência de queda nos índices de pobreza sofreu novo retrocesso em 2003,

segundo dados da Pesquisa Nacional de Amostragem de Domicílios (PNAD), e

conforme análise realizada pelo Instituto de Pesquisa Econômica Aplicada (IPEA), em

2002, eram 49 milhões de pessoas em 10 milhões de domicílios em situação de pobreza,

representando 29% da população e 22% de todos os domicílios daquele ano (IPEA –

BRASIL: O ESTADO DE UMA NAÇÃO 2005). Em 2003, os pobres foram 53,9

milhões de pessoas, representando 31,7% da população pesquisada. A maior incidência

de pobres na zona rural do que na zona urbana e os índices mais elevados de pobreza

nas regiões Norte e Nordeste, quando comparados com os das regiões Sul, Sudeste e

Centro-Oeste, já haviam sido demonstrados no primeiro grande estudo oficial sobre

pobreza, em 1974, e se mantém até hoje. Em 2003, a proporção de pobres no meio rural

era mais do que o dobro da observada no meio urbano – 57,1% contra 27% (IPEA –

RADAR SOCIAL 2005).

Além da desigualdade entre as regiões Norte, Nordeste e Sul, Sudeste e Centro-

Oeste e entre zona rural e zona urbana, outros contrastes marcam a situação da pobreza

no Brasil. A porcentagem de pessoas com renda per capita abaixo de 0,5 salário-mínimo

vária 12,1% em Santa Catarina a 62,3% em Alagoas. Outro contraste é que 44,1% dos

negros vivem em domicílios com renda per capita inferior a meio salário-mínimo, a

proporção de brancos que sobrevivem com o mesmo valor é de 20,5% (IPEA – RADAR

SOCIAL 2005). Afora isso, segundo os dados de 2003, 1% dos brasileiros mais ricos,

que correspondem a apenas 1,7 milhão de pessoas, apropria-se de 13% do total das

rendas domiciliares, sendo esse percentual bastante próximo da somo dos recursos

apropriados pelos 50% mais pobres, que equivalem a 86,9 milhões de pessoas. Nesse

contexto, BARROS et al. (2000) afirma que o Brasil é um país de pobres e não um país

pobre, pois o país gera muita riqueza, mas a desigualdade gerada na distribuição da

riqueza é o verdadeiro motor da pobreza.

Segundo MONTEIRO (2003), por serem mais vulneráveis as crianças são um

bom indicativo da situação nutricional de uma região ou de um país. Crianças

desnutridas ou com baixa estatura correspondiam, em 1996, a 10,4% da população

infantil brasileira.

É interessante notar que há uma tendência histórica nos dados para desnutrição,

sobretudo quanto à desnutrição infantil, sobreporem-se aos dados da pobreza, ou seja, a

desnutrição é maior na área rural e principalmente na região Nordeste, locais onde

também é maior a quantidade de pessoas vivendo abaixo da linha da pobreza.

A relação direta entre pobreza e desnutrição já havia sido demonstrada por dados

disponíveis em 1989, quando se verificou que crianças em famílias com renda per capita

inferior 0,25 salário-mínimo apresentavam quase cinco vezes mais chances de sofrerem

de desnutrição do que crianças em famílias com renda per capita igual ou superior a um

salário-mínimo. Para os adultos, a ocorrência de desnutrição entre aqueles com renda

per capita inferior a 0,25 salários-mínimos era mais que o dobro do que para aqueles

com renda per capita maior ou igual a um salário-mínimo.

Para adultos, no Brasil como um todo, os dados da Pesquisa de Orçamentos

Familiares (POF) 2002-2003 indicam haver apenas baixa ocorrência de desnutrição em

mulheres (IBGE, 2004). Entretanto, a estratificação dos dados dessa pesquisa revela que

a situação da desnutrição no Brasil passou de um mal generalizado, como observado na

década de 1970, para um fenômeno mais localizado, refletindo outras desigualdades do

país, em especial aquelas para a distribuição de renda. Por exemplo, o índice de

desnutrição entre mulheres adultas é maior para aquelas com renda per capita de até

0,25 salário-mínimo, 8,5%, e maior para aquelas residentes na área rural do Nordeste,

7,2%, sendo que o maior índice de desnutrição adulta ocorre em mulheres na cidade de

Salvador, 10,3%. Mesmo quando toma-se os dados para todo o país, o índice de

desnutrição feminina em mulheres entre 20 e 24 anos é de 12,2%, e de 7,3% entre as de

25 e 29 anos. Para homens acima de 75 anos de idade, chega-se ao índice de 8,9% de

desnutrição.

Alguns dados recentes revelam outras faces dos problemas nutricionais no

Brasil. WAITZBERT et al. (2001) estudaram 4.000 pacientes maiores de 18 anos de

idade, em hospitais do sistema público de saúde brasileiro, no ano de 1996. Os autores

concluíram que: 1) 48,1% apresentavam desnutrição, sendo 12,6% dos casos

considerados graves; 2) a maior incidência de pacientes desnutridos encontra-se nas

regiões Norte e Nordeste, onde a renda per capita é menor (em Belém-PA, 78,8% dos

pacientes eram desnutridos; 76% é o percentual de desnutridos em Salvador-BA; e

67.6% em Natal-RN); 3) os pacientes desnutridos tinham tempo de hospitalização maior

em relação aos não desnutridos, gerando maior custo para o Estado; 4) é deficiente o

conhecimento dos profissionais dos hospitais estudados sobre a necessidade de

acompanhamento nutricional dos pacientes.

Após cinco anos, um estudo realizado por MELLO et al. (2003), com pacientes

do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, não encontrou grande melhora. Segundo os

autores, o custo de tratamento de um paciente desnutrido é quatro vezes maior do que o

de um paciente não desnutrido.

A associação pobreza e restrição alimentar crônica gera um processo que

extrapola a dimensão da fisiologia celular e se estende até a dimensão psicológica e

social. GUIBU (1998) relata um aumento de 20 a 30% na procura por atendimento

psiquiátrico na região de Crato, sul do Ceará, durante o período de estiagem e escassez

de alimento, e afirma que os famintos desenvolviam um quadro de “loucura de fome”.

HARPHAM (2000), em um editorial da Revista Brasileira de Psiquiatria, afirma que a

associação entre pobreza e saúde mental em países em desenvolvimento é hoje bem

demonstrada por estudos que enfatizam a alta prevalência de saúde mental precária,

especialmente em áreas geográficas de população de baixa renda, como favelas,

assentamentos e bairros miseráveis. BLUE (2000), analisando dados coletados em três

bairros da cidade de São Paulo, demonstrou que no bairro Brasilândia, onde há maior

proporção de migrantes, maior número médio de pessoas por cômodo da casa, menor

número médio de anos na escola e menor renda familiar, a incidência de distúrbios

psicóticos e neuróticos chegava a 22% da população; enquanto no bairro Aclimação,

onde todos os fatores mencionados eram melhores, a incidência era de 11%. MAIA et

al. (2004), estudando a saúde mental de idosos em uma região metropolitana de Montes

Claros-MG, encontrou uma prevalência de 29,3% de pessoas com transtorno na

população em geral, enquanto a prevalência em idosos favelados era de 57,1%.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A desigualdade na distribuição de renda é o motor dos elevados índices de

pobreza no Brasil. As parcelas mais pobres da população, historicamente, estão entre os

mais afetados pela desnutrição protéico-calórica. O tratamento paliativo dessas pessoas

onera o Estado e não melhora sua condição de vida. Por isso, o Estado deve usar a

pesada carga tributária paga pelos cidadãos para prover meios de distribuição da renda

gerada no país e acesso igual a saneamento básico, educação, saúde e outros direitos

previstos pela constituição.

Acreditamos que as mudanças na atual situação não virão somente de ações do

Estado, nem serão conquistadas por meio da violência, como sugerem alguns

movimentos sociais. Faz-se necessária uma mudança de cultura em relação ao que é

público, pois enquanto prevalecer a idéia de que os recursos públicos não são de

ninguém em detrimento da idéia de que eles são de todos, os desvios, e a má utilização

de tais recursos, bem como a roubalheira prevalecerão sobre o bom senso, e, ao lado de

uns poucos abastados, conviverão legiões de miseráveis. Nesse processo, a educação,

seja ela formal ou não, tem um papel fundamental. Portanto, para mudar a situação

atual, é preciso que as instituições públicas (escolas, universidades, poder judiciário,

etc.), a sociedade civil (ONG´s, associações, etc.) e cada cidadão sejam conscientes dos

seus direitos, deveres e atitudes.

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Efeitos da alimentação

hipoprotéica sobre os

neurônios NADH-

diaforase positivos do

estômago de ratos em

envelhecimento

Efeitos da alimentação hipoprotéica sobre os neurônios

NADH-diaforase positivos do estômago de ratos em

envelhecimento

Fernando Carlos de Sousa*, Marcílio Hubner de Miranda Neto**

* Professor – Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR)

**Professor – Departamento de Ciências Morfofisiológicas,

Universidade Estadual de Maringá (UEM)

Correspondência para:

Fernando Carlos de Sousa

Rua Olímpio Mendes da Rocha, 206B, Vila Esperança, Maringá-PR.

CEP 87020-780

Fone: + 55 44 3263-9637

Fax: + 55 44 3028-8400

e-mail: [email protected]

EFEITOS DA ALIMENTAÇÃO HIPOPROTÉICA SOBRE OS NEURÔNIOS

NADH-DIAFORASE POSITIVOS DO ESTÔMAGO DE RATOS EM

ENVELHECIMENTO

Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da restrição no teor de

proteínas na dieta sobre o plexo mioentérico do estômago de ratos Wistar (Rattus

norvegicus) em envelhecimento. Dois grupos de animais foram alimentados ad libitum:

um com ração padrão (22% de proteína); e o outro com a ração hipoprotéica (8% de

proteína), entre os 210 e 345 dias de vida. Em comparação com os animais alimentados

com dieta padrão, os animais alimentados com ração hipoprotéica apresentaram:

hipofagia (consumo em média 30% menor); ganho médio de peso 4,46% menor; maior

quantidade de gordura retroperitoneal e periepididimal (19% em média); menor índice

de Lee; redução nas proteínas totais plasmáticas e globulinas; e manutenção da

albumina. A análise quantitativa e morfométrica dos neurônios mioentéricos NADH-

diaforase positivos, visualizados em preparados totais das regiões glandular e aglandular

do estômago, evidenciou nos animais submetidos à dieta hipoprotéica maior número de

neurônios pequenos e menor número de neurônios médios, demonstrando que o

crescimento dos neurônios foi afetado pela dieta. A quantificação dos neurônios em 80

campos de visualição microscópicos (19 mm

) – 40 na região aglandular e 40 na região

glandular – foi ajustada para a área de cada região do estômago do animal

correspondente. Nos animais alimentados com dieta hipoprotéica, observou-se redução

de 20% nos neurônios NADH-diaforase positivos na região aglandular e de 10% na

região glandular.

Palavras-chave: dieta hipoprotéica, envelhecimento, estômago, neurônios

mioentéricos NADH-diaforase positivos.

1 - INTRODUÇÃO

Indivíduos jovens em crescimento apresentam necessidade proporcionalmente

elevada de proteínas na dieta, à medida que organismo reduz sua velocidade de

crescimento, diminui proporcionalmente sua necessidade nutricional de proteínas.

Entretanto a transição da fase adulta para a velhice é caracterizada por alterações na

composição corporal e na atividade metabólica com marcante efeito sobre os aspectos

nutricionais.

Devido ao expressivo aumento da população de idosos em muitos países, as

diferentes condições em que essas pessoas vivem e os elevados custos para os governos

para a assistência dessa população, muitos estudos tem tentado determinar indicadores

para avaliação e promoção da saúde de populações em envelhecimento.

Baseando-se na literatura sobre as alterações decorrentes do envelhecimento, o

Comitê de Especialistas da FAO/WHO/ONU (1998), em seu relato técnico sobre as

necessidades de energia e proteína, publicado originalmente em 1985, aconselha não

reduzir o teor de proteínas na dieta dos indivíduos em envelhecimento, mantendo-se os

0,75 g/kg/dia recomendados para adultos. O Comitê de Avaliação Científica das

Referências Nutricionais Diárias do Instituto de Medicina das Academias Nacionais dos

Estados Unidos (2005), revisando as necessidades de proteínas, recomenda para

indivíduos em envelhecimento o consumo de proteínas na proporção de 0,8 g/kg/dia.

Ambas as orientações se basearam principalmente em estudos de balanço de nitrogênio,

e os dois os comitês concordam que a adequação dessas indicações carece de análises

por meio de outras abordagens de pesquisa.

Como o sistema nervoso tem importância vital e possui um alto requerimento

metabólico, muitos estudos têm abordado os efeitos da desnutrição protéico-calórica

sobre os diferentes componentes do sistema nervoso. Pollitt (2000), que por mais de 30

anos tem conduzido pesquisas sobre os efeitos da desnutrição protéico-energética e da

deficiência de ferro sobre o desenvolvimento intelectual de crianças, fazendo uma

revisão da literatura sobre o assunto, afirma que tanto em modelos animais quanto em

estudos com humanos fica evidente que a desnutrição protéico-energética durante a

infância causa prejuízos das funções cognitivas, das emoções e do desenvolvimento

motor.

Visando a avaliar os efeitos da restrição protéica sobre o sistema nervoso

autonômico, muitos autores têm utilizado o sistema nervoso entérico como modelo de

estudo. O sistema nervoso entérico está localizado na parede do trato gastrointestinal,

desde o esôfago até o ânus, e atua no controle da motricidade, secreção e absorção. É

formado por corpos de neurônios e por fibras nervosas. Os corpos dos neurônios

entéricos podem ocorrer isolados, mas a grande maioria se organiza em grupos cercados

pela glia entérica e por uma capa de tecido conjuntivo, formando duas redes de gânglios

interconectados por fibras nervosas, ou seja, dois plexos nervosos ganglionados. Cada

um desses plexos está disposto como uma camada bidimensional de gânglios

interconectados, tendo ainda fibras que intercomunicam os dois plexos. Os plexos são

denominados de acordo com sua localização na parede do trato gastrointestinal. O plexo

submucoso está localizado no tecido conjuntivo da túnica submucosa, e o plexo

mioentérico entre as camadas da túnica muscular externa. Os neurônios entéricos fazem

sinapse com neurônios simpáticos e parassimpáticos. Esse arranjo morfológico mais

simples do que o do sistema nervoso central, a grande complexidade bioquímica, sua

importância funcional, a facilidade de acesso e a disponibilidade de várias técnicas de

evidenciação neuronal tornam o sistema nervoso entérico uma ferramenta valiosa em

várias linhas de pesquisa em neurociência.

O envelhecimento leva à neurodegeneração no sistema nervoso entérico, de

forma muito mais intensa do que no sistema nervoso central, contribuindo para o

aumento dos problemas gastrointestinais em idosos (Wade e Cowen, 2004). Entretanto

Schoffen et al. (2005) comentam que a despeito de haverem muitos estudos sobre os

efeitos da restrição protéica sobre o sistema nervoso entérico de animais em fases

iniciais de desenvolvimento (desde a gestação até a fase adulta), são escassos os estudos

em animais em período mais avançado de envelhecimento.

Nesta pesquisa foram analisados parâmetros corporais, consumo de ração e

realizado um estudo quantitativo e morfométrico dos neurônios mioentéricos NADH-

difaforase positivos do plexo mioentérico do estômago de ratos em envelhecimento

submetidos à dieta hipoprotéica.

2 - MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Design do experimento

Todos os procedimentos deste estudo envolvendo o uso de animais estão de

acordo com os princípios éticos adotados pelo Colégio Brasileiros de Experimentação

Animal (COBEA) e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal

da Universidade Estadual de Maringá (UEM).

Dez (10) ratos (Rattus norvegicus) machos, da linhagem Wistar, foram

utilizados neste experimento. Os animais foram aleatoriamente divididos em dois

grupos: Controle – alimentados com ração padronizada para roedores NUVILAB-

NUVITAL® (recomendada pelo National Research Council & National Health Institute

– EUA), com teor de proteínas de 22%; Restrição Protéica – alimentados com ração

com teor de 8% de proteínas, produzida a partir da adição de amido de milho na dieta

NUVILAB® (Natali et al., 2000). Essa ração foi suplementada com vitaminas

hidrossolúveis do complexo B e mistura salina (American Institute of Nutrition, 1977;

Natali e Miranda-Neto, 1996). Ração e água foram oferecidas ad libitum durante toda a

duração do experimento.

Os animais permaneceram por 135 dias – entre os 210 e 345 dias de vida – em

gaiolas individuais, sob condições constantes de temperatura e ciclo claro/escuro de

12/12 horas. O peso corporal foi controlado quinzenalmente, e o consumo de ração

controlado por uma semana (sete dias) a cada mês. Esse controle consistia na oferta de

100 gramas de ração diariamente para cada animal e pesagem da sobra.

Aos 345 dias de idade, os animais foram pesados. Foi mensurado o comprimento

naso-anal (CNA), e coletadas amostras de sangue para análise de: proteínas totais

(Método de Biureto – LABTEST); albumina (Verde de Bromocresol – LABTEST); e

globulinas (obtidas pela diferença entre proteínas totais e albumina). Após inalação de

éter etílico, os animais foram mortos e laparotomizados. A gordura retroperitoneal e a

gordura periepididimal foram removidas por dissecção e pesadas. Os estômagos foram

lavados, pesados e decalcados.

2.2 – Evidenciação dos neurônios NADH-diaforase positivos e obtenção dos

preparados totais

Os estômagos foram preenchidos com solução de Krebs (pH 7,3), lavados duas

vezes nessa solução (10 minutos cada lavagem), imersos por 5 minutos em solução

0,3% de Triton X-100; em seguida, passaram por mais duas lavagens de 10 minutos

cada em solução de Krebs. Para marcação dos neurônios através da atuação da enzima

NADH-diaforase, os estômagos permaneceram imersos por 45 minutos em um banho

de incubação, contendo para cada 100 mL: 25 mL a 0,5% de solução estoque de Nitro

Blue Tetrazolium (NBT – Sigma); 25 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 7,3; 50 mL de

água destilada; e 50 mg de ß-NADH (Sigma).

Para obtenção dos preparados totais, os estômagos foram primeiro seccionados

ao longo das curvaturas gástricas maior e menor, obtendo-se uma face ventral e outra

dorsal. Depois foram seccionados ao longo da prega limitante, para separação entre as

regiões aglandular e glandular (figura 1). Preparados totais contendo a túnica muscular

externa, túnica serosa e o plexo mioentérico foram obtidos por microdissecção sob

esteromicroscópio com remoção das túnicas mucosa e submucosa. Os preparados foram

desidratados em sério crescente de concentração de álcool etílico, diafanizados em xilol

e montados entre lâmina e lamínula com resina sintética.

2.3 – Estudo morfométrico e quantitativo

Para estudo morfométrico, imagens das lâminas foram capturadas através de

sistema computadorizado de captura de imagens (Image-Pro Plus® 4.5 – Media

Cibernetics), acoplado ao microscópio de luz (OLYMPUS BX40), utilizando-se

objetiva de 40X. Nas imagens obtidas, foram mensurados o perfil do corpo de 100

neurônios por animal – 50 da região aglandular e 50 da região glandular – utilizando-se

o software Image Tool 3.0 – uma ferramenta produzida e distribuída gratuitamente

(freeware) pelo Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em Santo

Antonio (UTHSCSA – EUA). Para o estudo quantitativo neuronal, as lâminas foram

visualizadas em microscópio de luz (OLYMPUS BX40) com objetiva de 40X. Contou-

se o número de neurônios em 80 campos de visualização por animal (19 mm

) – 40

(9,50 mm

) da região aglandular e 40 (9,50 mm

) da região glandular. A captura de

imagem e a contagem neuronal foram realizadas por amostragem aleatória de campos

localizados junto à prega limitante para a porção aglandular do estômago e região junto

à prega limitante e curvatura gástrica menor para a porção glandular.

Os decalques dos estômagos foram digitalizados, e a área do perfil estomacal foi

mensurada, utilizando-se o software Image Tool 3.0 – UTHSCSA.

2.4 – Análise estatística

Os resultados foram tabelados, e a análise estatística realizada com auxílio do

software GraphPad Prisma® 4, através do teste t de Student, com 95% de confiança.

3 - RESULTADOS

3.1 – Parâmetros corporais e consumo de ração

As tabelas 1, 2 e 3 agrupam os parâmetros corporais, o consumo de ração e a

análise de proteínas plasmáticas dos animais.

3.1 – Análise neuronal

A marcação através da técnica da NADH-diaforase evidenciou o plexo

mioentérico, tanto da região aglandular quanto da região glandular, com a maioria de

seus neurônios organizados em glânglios de tamanho e formato variados e com uma

menor quantidade de neurônios ocorrendo de forma isolada. A intensidade de marcação

varia consideravelmente entre os neurônios. O formato do corpo celular varia,

ocorrendo neurônios com contorno arredondado, periforme e estrelado.

Os glânglios marcados pela técnica da NADH-diaforase não se distribuem

uniformemente por todo o estômago. Na região aglandular, estão concentrados na

região central e próximo à prega limitante; enquanto na região glandular, concentram-se

principalmente ao longo da curvatura gástrica menor.

Por meio da quantificação do número de neurônios mioentéricos NADH-

diaforase positivos em 40 campos de visualização (9,50 mm

) da região aglandular,

obtivemos média de 697,3 ± 25,45 nos animais do grupo controle e de 628,4 ± 53,51 no

grupo restrição protéica. A quantificação de 40 campos de visualização (9,50 mm

) da

região glandular do estômago revelou média de 724,8 ± 71,87 nos animais dos grupos

controle e de 697,0 ± 88,08 no grupo restrição protéica.

Para a análise dos dados de contagem neuronal, os valores obtidos a partir da

contagem do número de neurônios em 40 campos de visualização, equivalentes a 9,50

em cada região do estômago de cada animal, foram extrapolados para a área de

cada uma das regiões do estômago do animal correspondente, para obtermos um valor

especulativo sobre o número total de neurônios em cada região do estômago de cada

animal. A área de cada região do estômago foi obtida a partir da área total do estômago

do animal e atribuindo-se à região aglandular 1/3 da área total e à região glandular 2/3

(Luciano e Reale, 1992). Obteve-se, assim, uma extrapolação do número total de

neurônios em cada uma das regiões do estômago de cada um dos animais. Na região

aglandular, obteve-se, nos animais controle uma média de 13.450 ± 623,4 neurônios; e

nos do grupo restrição protéica média de 10.700 ± 768,5. Na região glandular dos

animais do grupo controle obteve-se média de 26.780 ± 3.269; e no grupo restrição

protéica média de 23.930 ± 3.155 (figura 2).

Os dados da mensuração de 50 neurônios em cada uma das regiões do estômago

de cada um dos animais foram tabelados, e computou-se o número de neurônios em

classes com intervalos arbitrários de 100 µm

. Dessa forma evidencia-se o leque de

variação na área neuronal. As figuras 3 e 4 representam os dados da análise da área do

perfil do corpo celular de 250 neurônios por grupo experimental, em cada região do

estômago.

4 - DISCUSSÃO

4.1 – Efeitos sobre os parâmetros corporais e consumo de ração

Ao longo de todo período experimental, os animais do grupo restrição protéica

comeram em torno de 30% menos do que os animais do grupo controle. Entretanto, a

diferença no ganho médio de peso foi pequena, pois o grupo controle ganhou em média

5%, enquanto o grupo com restrição protéica ganhou 0,54%.

Molinari et al. (2002) verificaram que ratos jovens – dos 90 aos 210 dias de

idade – submetidos à dieta com teor protéico de 8%, quando comparados com animais

que receberam dieta com teor protéico de 22%, ganharam 30,33% menos peso,

demonstrando que nessa faixa etária a restrição protéica possui efeitos mais drásticos do

que os verificados no presente experimento. Segundo White (2000), dietas muito

próximas ao requerimento de proteínas ou no limite dele, estimulam a hiperfagia em

ratos; por outro lado, dietas com quantidade de proteína muito acima ou muito abaixo

do requerimento dos animais levam à hipofagia. Portanto são fortes as evidências que,

nesta fase da vida desses roedores, 8% de proteínas é um teor situado abaixo dos

requerimentos nutricionais.

Quando se compara o ganho médio de peso nos dois grupos, observa-se que as

diferenças são pequenas, e também que os ratos submetidos à restrição protéica,

embora tenham ingerido menor quantidade de alimento, não perderam peso na mesma

proporção. Isto sugere que esses animais sofreram redução na sua taxa metabólica. Por

outro lado, uma análise individualizada revelou que o ganho de peso foi relativamente

homogêneo entre os animais alimentados com dieta com teor de 22% de proteína,

variando de 0,45% a 11,29 %. Já entre os animais submetidos à restrição de proteínas,

constatou-se que um animal perdeu 14,12 % do peso, enquanto outro ganhou 12,9%; os

demais tiveram pequenos ganhos de peso.

Ao final do experimento, os animais do grupo restrição protéica apresentaram

índice de Lee médio 6% menor do que os animais do grupo controle. Isso demonstra

que os animais do grupo restrição protéica possuíam, proporcionalmente, menor massa

corporal para o tamanho do seu corpo, pois o índice de Lee, expresso pela raiz cúbica do

peso dividido pelo comprimento naso-anal multiplicando-se o resultado por 1.000,

demonstra uma relação entre o tamanho do animal e o seu peso de forma semelhante ao

Índice de Massa Corporal (IMC), amplamente utilizado em humanos. Apesar do menor

índice de Lee, da hipofagia e de apresentarem em média menor ganho de peso ao longo

do experimento, os animais do grupo restrição protéica apresentavam peso de gordura

abdominal em média 19% maior. Mesmo o rato que perdeu 14,12% de seu peso

corporal apresentou 1,83 gramas dessa gordura por 100 gramas de peso corporal. O rato

do grupo restrição protéica que mais ganhou peso (12,9% de ganho) apresentou 3,42

gramas de gordura abdominal por 100 gramas de peso corporal; e o que mais ganhou

peso, no grupo controle (11,29% de ganho), apresentou 2,15 gramas por 100 gramas de

peso corporal. Houve, portanto, uma diferença de 62,86 %. Esses dados indicam que a

redução de proteínas associada à elevação do teor de carboidratos tende a promover a

formação de acúmulos de tecido adiposo e redução da massa magra, mesmo quando há

menor ingestão de alimentos e ganho ou perda de peso.

Verifica-se, portanto, que o modelo experimental utilizado neste estudo

assemelha-se mais ao quadro de kwashiorkor, caracterizado por dieta

predominantemente pobre em proteínas, mas com oferta de carboidratos. Essa condição

é tão freqüentemente achada em populações humanas devido ao baixo custo de

alimentos ricos em carboidratos e maior custo de alimentos ricos em proteínas o que

predispõe populações pobres a situações de carência de proteínas. Tal condição também

é muito encontrada em indivíduos hospitalizados, devido a distúrbios na capacidade do

de eles controlarem o balanço protéico e/ou à inadequação da dieta. Nessa condição, a

absorção de glicose estimula a secreção de insulina e inibe a secreção dos hormônios

catabólicos. A insulina desloca o metabolismo para a utilização de carboidratos e inibe a

lipólise e a proteólise, dificultando, dessa forma, a mobilização das proteínas das

reservas musculares e viscerais para a síntese de compostos nitrogenados em outros

tecidos. Assim, o kwashiorkor é um tipo de desnutrição protéico-calórica não adaptável

que leva a alterações nas funções neuronais e imunológicas (Mahan e Escott-Stamp,

2005).

A redução das proteínas plasmáticas totais e das globulinas suporta a hipótese

de que a dieta oferecida expôs os animais do grupo restrição protéica a um quadro de

carência de proteínas com redução da disponibilidade tecidual de aminoácidos. A não

observação de edema em ratos submetidos à restrição protéica é um dado comum na

literatura (Saint’Ana, 2001), e a não redução da albumina plasmática pode explicar a

resistência desses animais à formação de edema (Natali et al., 2005).

4.2 – Análise quantitativa dos neurônios NADH-diaforase positivos

Tomando-se como referência o número de neurônios dos animais do grupo

controle, verifica-se, nos animais do grupo restrição protéica, menor densidade

neuronal, em torno de 9,88% para a região aglandular e de 3,83% para a região

glandular. Essas diferenças, embora pequenas, acentuam-se ao considerarmos que os

animais do grupo restrição protéica apresentaram estômagos com área do perfil em

média 6% menor e peso médio em torno de 10% menor do que os animais controle com

a mesma idade. Essa redução na área do estômago foi levada em consideração na

análise quantitativa neuronal. Se não ocorrer redução no número de neurônios, a

redução na área do estômago leva a uma maior compactação dos gânglios, levando a

valores maiores na contagem neuronal ou, no caso de perda neuronal, a compactação

dos gânglios pode mascarar a redução. Assim, se não houve redução no número de

neurônios marcados, esperava-se que essa redução na área estomacal levasse a um

maior agrupamento dos gânglios, resultando em valores proporcionalmente maiores nas

análises de contagem neuronal, ou seja, esperava-se que os animais com restrição de

proteínas apresentassem 6% a mais no número de neurônios. Ao estimarmos o número

total de neurônios do estômago, com base nas densidades verificadas (figura 2), nota-se

que os animais com restrição protéica possuem menor número de neurônios do que os

do grupo controle – em torno de 20% para região aglandular e 10% para região

glandular. Essa projeção revela dados compatíveis com as conclusões de autores que

constataram que o número e o tamanho dos neurônios entéricos guardam uma estreita

relação com a massa do órgão por eles inervados (Saffrey e Burnstock, 1994, Molinari

et al., 2002).

Estudos com o intestino delgado demonstraram que em ratos em envelhecimento

a restrição alimentar apresenta efeito protetor, prevenindo a perda neuronal decorrente

do envelhecimento em diversas subpopulações neuronais no plexo mioentérico. A

população de neurônios NADH-diaforase positivos, por outro lado, apresentou redução

em torno de 15%, indicando que, com relação à enzima NADH-diaforase, a restrição

alimentar leva à redução na atividade e/ou expressão (Johnson et al., 1998; Cowen et al.,

2000). Paradoxalmente, já foi observado que em animais em envelhecimento,

alimentados ad libitum, a população de neurônios NADH-diaforase positivos sofreu

menor redução (43% comparado com 52%) do que a população de neurônios marcados

por imunoistoquímica para proteína do gene 9.5, que marca a grande maioria dos

neurônios mioentéricos (Cowen et al., 2000).

Nossos dados (figura 2) mostram que a redução na oferta de proteínas para 8%

intensifica a redução no número de neurônios NADH-diaforase positivos no estômago

de ratos em envelhecimento, indicando que a atividade e/ou expressão dessa enzima é

sensível à redução no nível de proteínas da dieta, o que pode interferir diretamente na

atividade mitocondrial dos neurônios que a expressam. Olowookere et al. (1990),

estudando mitocôndrias hepáticas de ratos alimentados entre 21 e 51 dias de vida com

uma ração com 3,47% de proteínas, demonstraram intensa deterioração mitocondrial

com redução na atividade enzimática – 25% para isocitrato, ß-hidroxibutirato e

succinato desidrogenases, e 50% para NADH-citocromo c redutase – e redução na

eficiência de síntese de ATP.

A marcação dos neurônios NADH-diaforase positivos baseia-se na formação de

grânulos de formazana a partir da redução enzimática do receptor artificial de elétrons

(NBT) com que o tecido é incubado. Segundo Fang et al. (1995), a enzima ou as

enzimas que catalisam essa reação ainda não foram completamente estudadas, mas

sabe-se que possuem localização mitocondrial, e sua análise revela dados sobre a

atividade metabólica da célula. Esses autores demonstraram a co-localização da enzima

NADH-diaforase com a enzima manganês superóxido dismutase (Mn SOD) no

compartimento mitocondiral de vários tipos celulares, inclusive neurônios mioentéricos,

postulando que essas duas enzimas participam do controle do estresse oxidativo.

A expressão e a atividade da enzima NADH-diaforase não pode ser

correlacionada com a expressão de um dado neurotransmissor. Assim, a marcação por

histoquímica para NADH-diaforase não se relaciona a uma população neuronal restrita,

mas relaciona-se com o nível de metabolismo dos neurônios.

Neste trabalho, o tempo de incubação dos estômagos para marcação dos

neurônios NADH-diaforase positivos foi fixado em 45 minutos, possibilitando-nos

avaliar o nível de atividade metabólica dos neurônios mioentéricos entre os diferentes

estômagos – aqueles com maior atividade, exibindo maior marcação nesse tempo, e

aqueles com menor atividade metabólica, exibindo menor marcação. Portanto a menor

quantificação de neurônios nos animais do grupo restrição protéica revela menor

atividade metabólica, menor adaptação ao estresse oxidativo e/ou menor atividade ou

expressão da enzima. Alguns autores não fixam o tempo de incubação, permitindo que

diferentes preparados permaneçam tempos diferentes no meio de incubação, buscando

apenas obter o maior contraste entre os elementos neuronais e outros elementos dos

tecidos adjacentes; Cowen et al. (2000), por exemplo, utilizou essa metodologia. A

utilização de tempos maiores de incubação permite que mesmo neurônios com menor

atividade enzimática possam tornar-se marcados, aumentando a estimativa de neurônios

NADH-diaforase positivos e dificultando a comparação da atividade metabólica entre

diferentes preparados.

4.3 – Análise morfométrica dos neurônios NADH-diaforase positivos

Nos histogramas de distribuição da freqüência de neurônios, de acordo com seu

tamanho (figuras 2 e 3), observa-se que nos animais do grupo restrição protéica ocorre

um deslocamento para a esquerda, indicando acentuado predomínio de neurônios

pequenos (neurônios com até 200 µm

) e redução dos neurônios de tamanho médio

(neurônios entre 200,1 e 300 µm

), em comparação com os animais controle.

Em um trabalho clássico, Gabella (1971), utilizando a mesma técnica de

marcação neuronal e histogramas semelhantes aos utilizados neste trabalho, já havia

demonstrado que na medida em que ratos recém-nascidos atingem a fase adulta, ocorre

no plexo mioentérico aumento no tamanho dos neurônios. Postulou que esse processo

de neroplasticidade poderia ser importante para compensar o aumento no território de

inervação dos neurônios, causado pelo aumento no tamanho dos seguimentos do trato

gastrointestinal. Phillips et al. (2003) observaram aumento na área de neurônios

mioentéricos, tanto nos NADPH-diaforase positivos quanto nos marcados pelo Azul

Cuprolínico, no cólon e no reto de ratos com 24 meses, e atribuíram a hipertrofia a um

mecanismo compensatório para a perda neuronal; na porção aglandular do estômago,

observaram neurônios com média de tamanho similar aos descritos por Gabella (1971),

com manutenção do tamanho dos neurônios entre 3 e 24 meses.

Santer e Baker (1988), marcando neurônios NADH-diaforase positivos e

utilizando histogramas de classificação dos neurônios por tamanho, de forma

semelhante ao utilizado neste trabalho, descreveram que, apesar de haver perda

neuronal no jejuno, íleo, cólon e reto de ratos ente os 6 e 24 meses de vida, não foram

observadas alterações estatisticamente significantes na distribuição dos neurônios em

classes de tamanho com ambos os grupos, apresentando predomínio de neurônios de

tamanho médio e grande.

Cowen et al. (2000), comparando a freqüência de neurônios, de acordo com seu

diâmetro, entre ratos com 6 e 24 meses, alimentados ad libitum, e animais com 24

meses, submetidos à restrição de 50% na oferta de alimento, afirmaram que os

neurônios mioentéricos continuam a crescer após os 6 meses de vida. Nos animais

submetidos à restrição alimentar, os neurônios marcados imunistoquimicamente para

proteína do gene 9.5, apesar de poupados da redução neuronal, sofreram redução no seu

crescimento com redução no número de neurônios grandes e aumento no número de

neurônios pequenos.

Nossos resultados (figuras 3 e 4) sugerem que ratos em envelhecimento,

alimentados com dieta hipoprotéica (8%), retêm um padrão de distribuição dos

neurônios NADH-diaforase positivos no plexo mioentérico das regiões aglandular e

glandular do estômago mais semelhante ao descrito por Gabella (1971) para animais

mais jovens, isto é, com predomínio de neurônios pequenos. Esse padrão também é

encontrado em um histograma de distribuição de neurônios, de acordo com seu

tamanho, no trabalho de Schoffen et al. (2005), que compararam os neurônios

mioentéricos marcados imunoistoquimicamente para proteína miosina V do cólon de

ratos alimentados com dieta hipoprotéica (8%), entre os 210 e 360 dias de idade, com os

de ratos nesse mesmo intervalo de envelhecimento, alimentados com ração padrão (22%

de proteínas).

Levando em consideração as conclusões de Phillips et al. (2001), El-Salhy

(1999) e outros, relatadas por Saffrey (2004), de que ocorre uma significativa redução

no número de neurônios mioentéricos com o envelhecimento, ainda que em estágios

tardios, e do proposto por Phillips et al. (2003) de que paralelamente à redução neuronal

ocorre hipertrofia nos neurônios restantes, nossas observações de que ratos em

envelhecimento, alimentados com dieta hipoprotéica, apresentam redução no número de

neurônios metabólicamente ativos e maior quantidade de neurônios pequenos, permite-

nos inferir que, nessas condições, esses animais falham em invocar um processo de

neuroplasticidade de hipertrofia dos neurônios a fim de compensar a perda neuronal.

Em síntese, os animais em envelhecimento tratados com dieta com 8% de

proteína apresentaram hipofagia (30%), entretanto não ocorreu perda de peso

correspondente. Por outro lado, apresentaram menor área e perfil estomacal e redução

no índice de Lee associado à maior proporção de gordura abdominal, indicando perda

de massa magra e acúmulo de tecido adiposo. A redução da proteína plasmática total

suporta a hipótese de que a dieta oferecida expôs os animais do grupo restrição protéica

a uma redução na disponibilidade tecidual de aminoácidos.

A redução na população e na área do perfil do corpo dos neurônios mioentéricos

NADH-diaforase positivos indica redução na atividade e/ou expressão da enzima

NADH-diaforase.

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Figura 1 – Estômago do rato (Rattus norvegicus). E – esôfago; A – região aglandular;

PL – prega limitante; G – região glandular; D – dueodeno. Secção longitudinal ao longo

das curvaturas gástricas maior e menor. Vista interna da face dorsal

Tabela 1 – Consumo de Ração e parâmetros corporais dos animais dos grupos controle

periepididimal. Média ± desvio padrão. Médias seguidas de letras diferentes diferem

estatisticamente (teste t Student, p<5%)

GRUPOS

PARÂMETROS

C RP

Consumo de ração (g/dia) 27,5 ± 1,57

20,0 ± 0,97

Peso inicial (g) 437,9 ± 7,55

432,9 ± 20,41

Peso final (g) 459,4 ± 12,09

435,2 ± 30,32

Ganho de peso (%) 5% 0,54%

Índice de Lee 316,2 ± 3,05

297,6 ± 5,33

Gordura abdominal (g) 9,64 ± 0,88

11,83 ± 2,14

Tabela 2 – Proteínas plasmáticas (g/dL) dos animais dos grupos controle (C) e restrição

protéica (RP). Média ± desvio padrão. Médias seguidas de letras diferentes diferem

estatisticamente (teste t Student, p<5%)

GRUPOS

PROTEÍNA

TOTAL

ALBUMINA GLOBULINAS

C 6,76 ± 0,14

3,19 ± 0,10

3,57 ± 0,12

RP 6,23 ± 0,09

4,12 ± 0,17

2,11 ± 0,21

Tabela 3 – Peso e área do perfil estomacal dos animais dos grupos controle (C) e

restrição protéica (RP). Média ± desvio padrão

GRUPOS PESO (g) ÁREA (mm

)

C 2,33 ± 0,10 521,5 ± 28,82

RP 2,11 ± 0,12 488,9 ± 17,29

Diferença 10% 6%

C RP C RP

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Região Aglandular

Região Glandular

Número de neurônios

Figura 2 – Número total de neurônios mioentéricos NADH-diaforase positivos nas

regiões aglandular e glandular do estômago. Grupos controle (C) e restrição protéica

(RP). * estatisticamente significante (teste t Student, p<5%)

100,1-200

200,1-300

300,1-400

400,1-500

>500,1

Figura 3 – Distribuição por tamanho dos neurônios mioentéricos NADH-diaforase

positivos da região aglandular do estômago, classificados em intervalos de 100 µm

Grupos controle ( ) e restrição protéica ( )

100,1-200

200,1-300

300,1-400

400,1-500

500,1-600

600,1-700

700,1-800

800,1-900

>900,1

Figura 4 – Distribuição por tamanho dos neurônios mioentéricos NADH-diaforase

positivos da região glandular do estômago, classificados em intervalos de 100 µm

Grupos controle ( ) e restrição protéica ( )

Effects of hypoproteic

feeding on the NADH-

diaphorase positive

neurons of the stomach of

aging rats

Effects of hypoproteic feeding on the NADH-diaphorase

positive neurons of the stomach of aging rats

Fernando Carlos de Sousa*, Marcílio Hubner de Miranda Neto**

* Professor – Pontifical Catholic University of Paraná (PUCPR)

**Professor – Department of Morphophysiological Sciences, State

University of Maringá (UEM)

Address to correspondence:

Fernando Carlos de Sousa

Street Olímpio Mendes da Rocha, 206B, Vila Esperança, Maringá-PR.

ZIPCODE 87020-780

Phone: + 55 44 3263-9637

Fax: + 55 44 3028-8400

e-mail: [email protected]

EFFECTS OF HYPOPROTEIC FEEDING ON THE NADH-DIAPHORASE

POSITIVE NEURONS OF THE STOMACH OF AGING RATS

Abstract: The purpose of this work was to evaluate the effects of restricting the protein

level in the diet on the myenteric plexus of the stomach of aging Wistar rats (Rattus

novergicus). Two groups of animals were fed ad libitum, one with standard chow (22%

protein) and the other with hypoproteic chow (8% protein), from the 210

to the 345

day of life. Compared to the animals fed with standard chow, the animals fed with

hypoproteic chow exhibited hypophagia (ingestion about 30% lower), mean weight gain

4.46% lower, greater amount of retroperitoneal and periepididymal fat (19% on

average), lower Lee index, decrease of total plasma proteins and plasma globulins and

maintenance of plasma albumin. The quantitative and morphometric analysis of the

NADH-diaphorase positive myenteric neurons, observed in whole-mounts of the

glandular stomach and forestomach, yielded a larger number of small neurons and a

smaller number of medium neurons in the animals subjected to the hypoproteic chow,

demonstrating that the neuronal growth was affected by the diet. The counting of the

neurons in 80 microscopic fields (19 mm

), 40 on the forestomach and 40 on the

glandular stomach, was adjusted to the area of each region of the stomach of the

corresponding animal. In the animals fed with hypoproteic chow it was observed a 20%

decrease in the NADH-diaphorase positive neurons of the forestomach and a 10%

decrease in those of the glandular stomach.

Key words: hypoproteic chow, aging, stomach, NADH-diaphorase positive myenteric

neurons.

1 – INTRODUCTION

Growing young individuals have a relatively high protein requirement in the

diet; as the organism slows down its growth rate, its nutritional needs of proteins

decreases accordingly. Nevertheless, the transition from adulthood to old age is

characterized by changes in body composition and metabolic activity with marked

effects on the nutritional aspects. Due to the expressive increase in the population of old

people in many countries, to the different conditions in which these persons live, and to

the high costs for the governments to provide assistance to this population, many studies

have been trying to determine indices for assessment and promotion of health in aging

populations.

Based on the literature on the changes due to aging, the Specialists Committee of

the FAO/WHO/ONU (1998), in its technical report on energy and protein needs,

originally published in 1985, recommended that there should not be a decrease in the

protein level of the diet for aging individuals, and that the 0.75 g/kg/day for adults

should be maintained instead. The Committee of Scientific Evaluation of the Daily

Nutritional References of the Medical Institute of the National Academy of the United

States (2005), reviewing the protein needs, recommended that aging individuals should

consume 0.8 g protein/kg/day. Both recommendations were based primarily on nitrogen

balances and both Committees agree that the adequacy of these recommendations lacks

analyses through other research approaches.

As the nervous system has a vital importance and a high metabolic requirement,

many studies have assessed the effects of protein-calorie malnutrition on the different

components of the nervous system. Pollitt (2000), that for over 30 years has been

conducting research about the effects of protein-energy malnutrition and iron deficiency

on the intellectual development of children, in a literature review on the issue states that,

both in animal models and in human studies, it becomes evident that protein-energy

malnutrition during childhood impairs cognitive functions, emotions and motor

development.

Aiming at investigating the effects of protein restriction on the Autonomic

Nervous System, many authors have been using the Enteric Nervous System as a model.

The Enteric Nervous System is located in the wall of the gastrointestinal tract from the

esophagus to the anus and acts in the control of motility, secretion and absorption. It is

formed by neuronal cell bodies and nerve fibers. The bodies of the enteric neurons may

be isolated, but most of them are organized in groups surrounded by the enteric glia and

a sheath of connective tissue, forming two nets of ganglia interconnected by nerve

fibers, that is, two ganglionated nerve plexuses. Each of these plexuses is arranged as a

bidimensional layer of interconnected ganglia; nerve fibers linking the two plexuses

also occur. The plexuses are named according to their location in the gastrointestinal

wall. The submucous plexus is located in the connective tissue of the submucosa and

the myenteric plexus between the layers of the muscularis externa. Sympathetic and

parasympathetic neurons synapse on the enteric neurons. This morphological

arrangement, simpler than that of the Central Nervous System, the great biochemical

complexity, the functional importance, the easy access and the availability of many

techniques of neuronal staining, make the Enteric Nervous System a valuable tool in

several research lines in Neuroscience.

Aging leads to a neurodegeneration of the Enteric Nervous System which is

much more severe than that of the Central Nervous System and contributes to the

increased incidence of gastrointestinal dysfunctions in the elderly (Wade & Cowen,

2004). Nevertheless, Schoffen et al. (2005) comment that, despite many studies about

the effects of protein restriction on the Enteric Nervous System of animals in early

stages of development (from gestation to adulthood), the investigations in animals of

advanced age are scarce.

In this study it was analyzed body parameters, food ingestion, and quantitative

and morphometric aspects of the NADH-diaphorase positive myenteric neurons of the

myenteric plexus of the stomach, of aging rats subjected to hypoproteic diet.

2 - MATERIAL AND METHODS

2.1 – Experimental design

All the procedures of this study concerning the use of animals are in accordance

with the ethical principles adopted by the Brazilian College of Animal Experimentation

(COBEA) and were approved by the Ethics Committee in Animal Experimentation of

the State University of Maringá (UEM).

Ten male rats (Rattus norvegicus) were used in this investigation. The animals

were randomly divided into two groups: Control – fed with standard chow for rodents

NUVILAB-NUVITAL® (recommended by the National Research Council & National

Health Institute – USA), with protein level of 22%; Protein Restriction – fed with chow

having protein level of 8%, manufactured through the addition of corn starch to the

NUVILAB® chow (Natali et al., 2000). This chow was supplemented with

hydrosoluble vitamins of the B complex and saline mixture (American Institute of

Nutrition, 1977; Natali & Miranda-Neto, 1996). Chow and water were supplied ad

libitum during the whole experimental period.

The animals were kept for 135 days, from the 210

to the 345

day of age, in

individual cages under constant conditions of temperature and light/dark cycles of 12/12

hours. Body weight was recorded each fifteen days and chow ingestion recorded during

seven days per month. This record consisted in supplying 100g of chow to each animal

daily and weighting the leftovers.

At the age of 345 days the animals were weighted, the naso-anal length (NAL)

was measured and blood samples were collected for the analysis of total protein (Biuret

Method – LABTEST), albumin (Bromocresol Green – LABTEST) and globulins

(obtained through total protein minus albumin). After inhalation of ethylic ether the

animals were killed and laparotomized. The retroperitoneal and periepididymal fat pads

were dissected out and weighted. The stomachs were washed, weighted and outlined on

cardboard.

2.2 – Staining of the NADH-diaphorase positive neurons and preparation of

the whole-mounts.

The stomachs were filled with Krebs solution (pH 7.3), washed twice in this

solution (10 min each wash), immersed for 5 min in 0.3% Triton X-100 solution, and

again doubly washed (10 min each wash) in Krebs solution. For staining of the neurons

through the activity of the NADH-diaphorase enzyme, the stomachs were immersed for

45 min in an incubation medium containing, for each 100 mL: 25 mL of 0.5% stock

solution of Nitro Blue Tetrazolium (NBT – Sigma), 25 mL of phosphate buffer 0.1M,

pH 7.3, 50 mL of distilled water, and 50 mg of ß-NADH (Sigma).

For the preparations of the whole-mounts, the stomachs were first sectioned

along the greater and lesser gastric curvatures, so that a ventral and a dorsal face were

obtained, then sectioned along the limiting ridge for separation of the forestomach from

the glandular stomach (figure 1). Whole-mounts containing the muscularis externa,

serosa and the myenteric plexus were obtained through microdissection under

stereomicroscope with removal of both the mucosa and submucosa. The whole-mounts

were dehydrated in a series of ethylic alcohol of increasing concentration, cleared in

xylol and mounted between glass and coverglass with synthetic resin.

2.3 – Morphometric and quantitative study.

For the morphometric study, images of the whole-mounts laminae were captured

through a computerized system of image capture (Image-Pro Plus® 4.5 – Media

Cibernetics) coupled to the light microscope (OLYMPUS BX40) using 40X objective.

In the images obtained it was measured the profile of 100 neurons per animal, 50 from

the forestomach and 50 from the glandular stomach, using the software Image Tool 3.0,

a tool produced and freely delivered (freeware) by the Health Sciences Center of the

University of Texas at San Antonio (UTHSCSA – EUA). For the quantitative study the

laminae were observed under light microscope (OLYMPUS BX40) with 40X objective

and the number of neurons in 80 fields per animal (19 mm

) was counted, 40 fields (9.5

) in the forestomach and 40 fields (9.5 mm

) in the glandular stomach. Image

capture and neuronal counts were made through random sampling of fields near the

limiting ridge on the forestomach and near the limiting ridge and lesser gastric curvature

on the glandular stomach.

The outlines of the stomachs were digitalized and the area of the stomach profile

was measured with the software Image Tool 3.0 – UTHSCSA.

2.4 – Statistical analysis.

The results were fed into tables and the statistical analysis was carried out with

the aid of the software GraphPad Prism® 4 using Student’s t test for a 95% confidence

interval.

3 - RESULTS

3.1 – Body parameters and chow ingestion.

Tables 1, 2, and 3 group the body parameters, chow ingestion and analysis of the

plasma proteins of the animals.

3.1 – Neuronal analysis.

The staining with the NADH-diaphorase technique highlighted the myenteric

plexus, both of the forestomach and the glandular stomach, with most of its neurons

arranged in ganglia of varied sizes and shapes and a smaller amount of isolated neurons.

The intensity of staining varies markedly among the neurons. So varies the cell body

shape, which can be round, pyriform or stellate.

The ganglia stained with NADH-diaphorase were not uniformly distributed on

the stomach. At the forestomach they are clustered at the central region and near the

limiting ridge, while at the glandular stomach they are clustered along the lesser gastric

curvature.

The counting of NADH-diaphorase positive myenteric neurons in 40 fields (9.50

) of the forestomach yielded a mean of 697.3 ± 25.45 neurons in the animals of the

control group and of 628.4 ± 53.51 neurons in the protein restriction group. The

counting of 40 fields (9.50 mm

) of the glandular stomach revealed a mean of 724.8 ±

71.87 neurons in the animals of the control group and of 697.0 ± 88.08 neurons in the

protein restriction group.

For the analysis of the neuronal counts, the values obtained from 40 fields,

corresponding to 9.50 mm

of each gastric region, were projected to the area of each

region, so that we could obtain an speculative value of the total number of neurons in

each region of the stomach of each animal. The area of each region was obtained from

the total area of the stomach of the animal and considering the forestomach as

representing one-third of the total area and the glandular stomach as the remaining two

thirds (Luciano & Reale, 1992). Thus, it was obtained a projection of the total number

of neurons in each region of the stomach of each animal. In the forestomach a mean of

13,450 ± 623.4 neurons was obtained in the control animals and of 10,700 ± 768.5

neurons in the protein restriction group. In the glandular stomach the mean was 26,780

± 3,269 in the animals of the control group and in the protein restriction group the mean

was 23,930 ± 3,155 (figure 2).

The data on the measurements of 50 neurons of each gastric region of each

animal were fed into tables and the number of neurons in size groups of 100 µm

arbitrary intervals was established. This procedure highlights the range of variation of

neuronal areas. Figures 3 and 4 represent the data on the analysis of the area of the cell

body profile of 250 neurons per group in each region of the stomach.

4 - DISCUSSION

4.1 – Effects on body parameters and chow consumption.

During the whole experimental period the animals of the protein restriction

group ate about 30% less than the animals of the control group. However, the difference

of the mean weight gain was small, once the control group gained 5% on average while

the protein restriction group gained 0.54%. Molinari et al. (2002) verified that young

rats – from 90 to 210 days old – subjected to a 8%-protein diet, when compared to

animals receiving 22%-protein diet, gained 30.33% less weight, demonstrating that at

this age range protein restriction has more drastic effects than those of the present

experiment. According to White (2000), diets very close to or at the limit of protein

requirement stimulate hyperphagia in rats; on the other hand, diets with protein amounts

well above or well below the requirement of the animals lead to hypophagia. Therefore,

the evidence is strong that at this life stage of these rodents, 8% protein is a level below

the nutritional requirements.

When the mean weight gain of the two groups is compared, it is observed that

the differences are small and also that the rats subjected to protein restriction, although

eating less food, did not lose weight at the same rate. This suggests that these animals

had a reduced metabolic rate. On the other hand, an individual analysis revealed that the

weight gain was relatively homogeneous among the animals fed with diet of 22%

protein, varying from 0.45% to 11.29%. Of the animals subjected to protein restriction,

one lost 14.12% of its weight, another gained 12.9%, and the others had small weight

gains.

At the end of the experiment the animals of the protein restriction group showed

a mean Lee index 6% lower than that of the animals of the control group. This

demonstrates that the animals of the protein restriction group had, proportionately, less

body mass relative to the size of their bodies, once the Lee index, expressed as the cubic

root of the weight divided by the naso-anal length, multiplied by 1,000, is a relation

between the size of the animal and its weight, similar to the Body Mass Index (BMI)

widely used in humans. In spite of the lower Lee index, the hypophagia, and the smaller

weight gain during the experiment, the animals of the protein restriction group had an

abdominal fat weight 19% greater on average. Even that rat that lost 14.12% of its body

weight showed 1.83 g of this fat/100 g body weight. The rat of the protein restriction

group that gained more weight (12.9%) showed 3.42 g of abdominal fat/100 g body

weight and that of the control group that gained more weight (11.29%) showed 2.15 g

of fat/100 g body weight; therefore, the difference was of 62.86%. These data indicate

that the protein reduction together with the increased level of carbohydrates tends to

promote adipose tissue accumulation and reduction of the lean mass, even when there is

less food ingestion and weight gain or loss.

It is verified, then, that the experimental model used in this investigation

resembles kwashiorkor, which is characterized by a diet particularly poor in proteins but

plenty of carbohydrates. This condition is frequently found in human populations due to

the low cost of carbohydrate-rich foods rich and the greater cost of protein-rich foods,

predisposing poor populations to situations of protein lack. This condition is also

frequently found in hospitalized individuals, due to disturbances in the patient’s ability

to control protein balance and/or inadequate diet. In this situation glucose absorption

stimulates insulin secretion and inhibits the secretion of the catabolic hormones. Insulin

shifts metabolic pathways towards the use of carbohydrates and inhibits lipolysis and

proteolysis, in this way hindering protein mobilization from the muscle and visceral

reservoirs to the synthesis of nitrogenous compounds in other tissues. Therefore,

kwashiorkor is a non-adaptable type of protein-calorie malnutrition that leads to

changes in neuronal and immunological functions (Mahan & Escott-Stamp, 2005).

The reduction of total plasma proteins and plasma globulins sustains the

hypothesis that the diet offered exposed the animals of the protein restriction group to a

situation of protein lack with reduction in the tissue availability of aminoacids. The

absence of edema in rats subjected to protein restriction is a common observation in the

literature (Sant’Ana, 2001), and the maintenance of plasma albumin can explain the

resistance of these animals to edema formation (Natali et al., 2005).

4.2 – Quantitative analysis of the NADH-diaphorase positive neurons.

Taking the number of neurons of the animals of the control group as a reference,

it is noticed a smaller neuronal density in the animals of the protein restriction group, of

about 9.88% for the forestomach and 3.83% for the glandular stomach. These

differences, although small, are magnified when it is considered that the animals of the

protein restriction group had stomachs with profiles about 6% smaller and mean weight

about 10% lower than the age-matched control animals. This decreased gastric area was

taken into account in the neuronal quantitative analysis. If there is no decrease in the

number of neurons, the decreased gastric area leads to a greater proximity of the ganglia

and greater values of neuronal counts; in the case of neuronal loss the proximity of the

ganglia can mask the reduction in the neuron numbers. Thus, if there was no decrease in

the number of stained neurons, it was expected that the decreased gastric area led to a

greater grouping of the ganglia, resulting in values of neuronal counts proportionately

greater; in other words, it was expected that the animals under protein restriction

showed 6% more neurons. When it is observed the estimate of the total number of

neurons of the stomach with basis on the verified densities (figure 2), it is seen that the

animals under protein restriction have less neurons than those of the control group –

about 20% in the forestomach and 10% in the glandular stomach. This projection

reveals data compatible to those of other authors, who verified that the number and size

of the enteric neurons keep an intimate relation with the mass of the organ innervated by

them (Saffrey & Bunstock, 1994; Molinari et al., 2002).

Studies with the small intestine demonstrated that in aging rats food restriction

had a protective effect, preventing neuronal loss due to aging in several neuronal

subpopulations of the myenteric plexus. The population of NADH-diaphorase positive

neurons, on the other hand, had a decrease of approximately 15%, indicating that, as far

as the NADH-diaphorase enzyme is concerned, food restriction leads to decreased

activity and/or expression (Johnson et al., 1998; Cowen et al., 2000). Paradoxically, it

was observed that in aging rats fed ad libitum the population of NADH-diaphorase

positive neurons suffered a smaller reduction (43% compared to 52%) than the

population of neurons immunohistochemically stained for the 9.5 gene protein, which

stains most of the enteric neurons (Cowen et al., 2000).

Our data (figure 2) show that the reduction in the offer of proteins to 8%

intensifies the reduction in the number of NADH-diaphorase positive neurons in the

stomach of aging rats, indicating that the activity and/or expression of this enzyme is

sensitive to the dietary protein level reduction, which could interfere directly with the

mitochondrial activity of the neurons that express it. Olowookere et al. (1990), studying

the hepatic mitochondria of rats fed with a 3.47%-protein chow from the 21

to the 51

days of age, demonstrated an intense mitochondrial deterioration with reduced

enzymatic activity, 25% for isocitrate dehydrogenase, β-hydroxybutyrate

dehydrogenase and succinate dehydrogenase, and 50% for NADH-cytochrome c

reductase, and reduced efficiency of the ATP synthesis.

The staining of NADH-diaphorase positive neurons is based on the formation of

formazan granules from the enzymatic reduction of an artificial electron acceptor (NBT)

the tissue is incubated with. According to Fang et al. (1995), the enzyme or enzymes

that catalyze this reaction were not still completely studied, but it is known that they

have mitochondrial location and their analysis reveals data on the metabolic activity of

the cell. These authors demonstrated the co-localization of the NADH-diaphorase

enzyme with the enzyme manganese superoxide dismutase (Mn SOD) in the

mitochondrial compartment of several cell types, including myenteric neurons, and

postulated that these two enzymes participate of oxidative stress control.

The expression and activity of the NADH-diaphorase enzyme cannot be

correlated with the expression of a given neurotransmitter. Therefore, the histochemical

staining for NADH-diaphorase is not related to a discrete neuronal population, but is

related to the metabolic level of the neurons.

In this work the incubation time of the stomachs for the staining of the NADH-

diaphorase positive neurons was set at 45 minutes, which allows the evaluation of the

level of metabolic activity of the myenteric neurons between the different samples,

those with greater activity exhibiting greater staining at this time and those with lower

metabolic activity exhibiting lower staining. In this way, the smaller number of neurons

in the animals of the protein restriction group reveals lower metabolic activity, smaller

adaptation to oxidative stress and/or lower activity or expression of the enzyme. Some

authors do not set the incubation time, allowing different samples to remain in the

incubation medium for different time intervals, aiming only at obtaining the greatest

contrast between the neuronal elements and other elements of the underlying tissues; for

example, Cohen et al. (2000) used this methodology. The use of larger incubation times

allows even neurons of lower enzymatic activity to be stained, increasing the estimates

of NADH-diaphorase positive neurons and making it difficult the comparison of the

metabolic activity between different whole-mounts.

4.3 – Morphometric analysis of the NADH-diaphorase positive neurons.

In the frequency distribution histograms of the neurons according to their size

(figures 3 and 4) it is observed that in the animals of the protein restriction group there

is a leftward displacement, indicating a marked predominance of small neurons (of up to

200 µm

) and a diminishment of the medium neurons (those between 200.1 and 300

µm

), in comparison with the control animals.

In a classic work Gabella (1971), using the same technique of neuronal staining

and histograms similar to those of this investigation, already demonstrated that as

newborn rats reach adulthood there is an increase in the size of the neurons in the

myenteric plexus, and postulated that this process of neuroplasticity could be important

to compensate for the increased innervation territory of the neurons caused by the

increase on the size of the segments of the gastrointestinal tract. Phillips et al. (2003)

observed an increase in the area of the myenteric neurons, both NADPH-diaphorase

positive and those stained with Cuprolinic Blue, in the colon and rectum of 24-month

old rats, and attributed the hypertrophy to a compensatory mechanism to neuronal loss.

At the forestomach, they observed neurons of mean size similar to those described by

Gabella (1971), with maintenance of the neuronal size between the third and 24

month

of age.

Santer & Baker (1988) stained NADH-diaphorase positive neurons and used

histograms of neuron classification by size, in a way similar to that used in this work,

and described that, despite there being a neuronal loss in the jejunum, ileum, colon and

rectum of rats between the sixth and the 24

month of life, statistically significant

changes were not observed in the size distribution of the neurons, with both groups

presenting predominance of medium and large neurons.

Cowen et al. (2000), comparing the incidence of neurons according to their

diameter between six- and 24-month old rats fed ad libitum and 24-month old animals

subjected to a 50% food restriction, stated that the myenteric neurons continue to grow

after the sixth month of age. In the animals subjected to food deprivation, the neurons

immunohistochemically stained for the 9.5 gene protein, despite spared from neuronal

loss, suffered decreased growth with resultant reduction in the number of large neurons

and increase in the number of small ones.

Our results (figures 2 and 3) suggest that the aging rats fed with hypoproteic diet

(8%) keep a pattern of distribution of the NADH-diaphorase positive neurons in the

myenteric plexus of the forestomach and glandular stomach similar to that described by

Gabella (1971) for younger animals, that is, with predominance of small neurons. This

pattern is also found on an histogram of distribution of neurons according to size in the

work of Schoffen et al. (2005), which compares the myenteric neurons

immunohistochemically stained for myosin V of the colon of rats fed with hypoproteic

diet (8%) between the 210

and the 360

day of age, with those of age-matched rats fed

with standard chow (22% protein).

Taking into account the reports of Phillips et al. (2001), El-Salhy (1999) and

others, as mentioned in Saffrey (2004) that there is a significant reduction in the number

of myenteric neurons with aging, albeit in late stages; and the proposal of Phillips et al.

(2003) that in addition to neuronal decrease there is a hypertrophy of the remaining

neurons; our observations that aging rats fed with hypoproteic diet show reduction in

the number of metabolically active neurons and greater amounts of small neurons allow

us to state that in these conditions these animals fail at triggering a neuroplasticity

process of neuronal hypertrophy to compensate for the neuronal loss.

In summary, aging animals treated with 8%-protein diet showed hypophagia

(30%), but a corresponding weight loss did not take place. On the other hand, they

showed smaller gastric area and profile and lower Lee index together with greater

proportion of abdominal fat, indicating loss of lean mass and accumulation of adipose

tissue. The decreased total plasma protein sustains the hypothesis that the diet offered

exposed the animals of the protein restriction group to a reduction in the tissue

availability of aminoacids.

The reduction on the population and area of the profile of the cell body of the

NADH-diaphorase positive myenteric neurons indicates decrease on the activity and/or

expression of the NADH-diaphorase enzyme.

BIBLIOGRAPHIC REFERENCES

American Institute of Nutrition, 1977. Report of the American Institute of Nutrition ad

hoc committee on standards for nutritional studies. J Nutr. 107, 1340-1348.

Cowen, T., Johnson, R.J.R., Soubeyre, V., Santer, R.M., 2000. Restricted diet

rescues rat enteric motor neurons from age related cell death. Gut 47, 653-

660.

El-Salhy, M., Sandström, Holmlund, F., 1999. Age-induced changes in the enteric

nervous system in the mouse. Mechanisms of Ageing and Development 107, 93-

103.

EUA. Institute of Medicine of the National Academies - Food and Nutrition Board.

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Figure 1 – Stomach of rat (Rattus norvegicus). E – esophagus, A – forestomach, PL –

limiting ridge, G – glandular stomach and D – duodenum. Longitudinal section along

the greater and lesser gastric curvatures. Inner view of the dorsal face.

Table 1 – Chow ingestion and body parameters of the animals of the control group (C)

and protein restriction group (RP). Abdominal fat = retroperitoneal fat + periepididymal

fat. Mean ± standard deviation. Means followed by different letters differ statistically

(Student’s t test, p<5%).

GROUPS

PARAMETERS

C RP

Chow ingestion (g/day) 27.5 ± 1.57

20.0 ± 0.97

Initial weight (g) 437.9 ± 7.55

432.9 ± 20.41

Final weight (g) 459.4 ± 12.09

435.2 ± 30.32

Weight gain (%) 5% 0,54%

Lee index 316.2 ± 3.05

297.6 ± 5.33

Abdominal fat (g) 9.64 ± 0.88

11.83 ± 2.14

Table 2 – Plasma proteins (g/dL) of the animals of the control group (C) and protein

restriction group (RP). Mean ± standard deviation. Means followed by different letters

differ statistically (Student’s t test, p<5%).

GROUPS

TOTAL

PROTEIN

ALBUMIN GLOBULINS

C 6.76 ± 0.14

3.19 ± 0.10

3.57 ± 0.12

RP 6.23 ± 0.09

4.12 ± 0.17

2.11 ± 0.21

Table 3 – Weight and profile area of the stomach of the animals of the control group

GROUPS WEIGHT (g) AREA (mm

)

C 2.33 ± 0.10 521.5 ± 28.82

RP 2.11 ± 0.12 488.9 ± 17.29

Difference 10% 6%

C RP C RP

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Forestomach

Glandular Stomach

Amount of Neurons

Figure 2 – Total number of NADH-diaphorase positive myenteric neurons of the

forestomach and glandular stomach. Groups: Control (C) and protein restriciton (RP). *

statistically significant (Student’s t test, p<5%).

100,1-200

200,1-300

300,1-400

400,1-500

>500,1

Figure 3 – Distribution by size of the NADH-diaphorase positive myenteric neurons of

the forestomach, grouped at 100 µm

intervals. Groups control ( ) and protein

restriction ( ).

100,1-200

200,1-300

300,1-400

400,1-500

500,1-600

600,1-700

700,1-800

800,1-900

>900,1

Figure 4 – Distribution by size of the NADH-diaphorase positive myenteric neurons of

the glandular stomach, grouped at 100 µm

intervals. Groups control ( ) and protein

restriction ( ).

ARQUIVOS DA APADEC (ISSN: 1414-7149)

INSTRUÇÕES PARA OS AUTORES

Submissão

O periódico Arquivos da Apadec publica artigos de interesse para professores do Ensino

Fundamental e Médio, abordando as Ciências em geral. Poderão ser submetidos artigos originais,

artigos de revisão, artigos contendo jogos matemáticos ou práticas de laboratório e notas não

submetidos a outros periódicos relacionados a Ciências, Matemática e Educação. Os artigos

deverão ser enviados aos Editores: Arquivos da Apadec – Programa Museu Dinâmico

Interdisciplinar da Universidade Estadual de Maringá. Av. Colombo, 5790 – Bloco H-79 – sala 023

– CEP 87020-900 – Maringá-PR. Os artigos serão submetidos ao Conselho Científico do periódico

que avaliará os artigos, podendo sugerir modificações para aprimorar o conteúdo dos mesmos;

adotar modificações para aperfeiçoar a estrutura, clareza e redação do texto e recusar artigos. Os

artigos serão publicados obedecendo, preferencialmente, a ordem cronológica de recebimento.

Artigos publicados são de responsabilidade exclusiva dos autores.

Estilo e forma

Os artigos devem ser digitados utilizando-se o editor de textos Winword 7.0, com letra Times New

Roman tamanho 12, espaço 2 e margens de 2,5 cm, não excedendo 16 páginas incluindo ilustrações,

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em disquete. Os artigos deverão, obrigatoriamente, apresentar uma Página de rosto, contendo o título

do trabalho, sugestão de título resumido (“título curto”), nome(s) do(s) autor (es), identificação

profissional e endereço para correspondência; Corpo do trabalho; Referências bibliográficas, obedecendo

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Artigos originais (trabalho experimental ou pesquisa de campo):

- Página de rosto, contendo: título, sugestão de título curto, autores, filiação, autor para

correspondência;

- Corpo do trabalho: Título; Resumo (no máximo 250 palavras); Palavras-Chave (em número de

3); Title; Abstract; Key words; Introdução; Material e Método; Resultados (este capítulo pode conter,

além de texto, tabelas, figuras, ilustrações e fotografias); Discussão; Conclusão;

- Referências Bibliográficas.

Artigos de revisão:

- Página de rosto, contendo: título, sugestão de título curto, autores, filiação, autor para

correspondência;

- Corpo do trabalho: Título; Resumo (no máximo 250 palavras); Palavras-Chave (em número de

3); Title; Abstract; Key words; Introdução; Desenvolvimento; Considerações Finais;

- Referências Bibliográficas.

Artigos contendo jogos matemáticos ou práticas de laboratórios:

- Página de rosto, contendo: título, sugestão de título curto, autores, filiação, autor para

correspondência;

ÓRGÃO OFICIAL DA ASSOCIAÇÃO PARANAENSE PARA O DESENVOLVIMENTO

DO ENSINO DA CIÊNCIA E DO PROMUD – PROGRAMA MUSEU DINÂMICO

INTERDISCIPLINAR DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

- Corpo do trabalho: Título; Resumo (no máximo 250 palavras); Palavras-Chave (em número de

3); Title; Abstract; Key words; Introdução com objetivo; Fundamentação Teórica (opcional);

Procedimentos;

- Sugestão de leitura e/ou referências bibliográficas.

Notas:

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correspondência;

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3); Title; Abstract; Key words; Desenvolvimento (máximo 4 páginas);

- Sugestões de leitura (máximo 6).

Ilustrações:

Serão aceitas no máximo 2 (duas) fotos de 10x15 ou 5x8 ou pranchas de 16cm x 24cm em preto e

branco. Ilustrações coloridas serão custeadas pelo autor do trabalho. Cada figura deve ser

enviada em arquivo separado. Cada arquivo deve ser denominado como “Figura n.ext”, onde n é o

número de ordem da figura e ext é a extensão, de acordo com o formato da figura (jpg, gif, tif etc.).

As imagens devem ser enviadas na melhor resolução possível (imagens com resolução menor que

300 dpi podem comprometer a qualidade final do trabalho). As indicações nas figuras devem

utilizar fontes sans-serif, como Arial ou Helvética, para maior legibilidade. Figuras compostas por

várias outras devem ser enviadas, cada parte, em arquivos separados identificados por letras

(figura1a.gif, figura1b.gif etc). As legendas devem estar em arquivo separado. É imprescindível que

o autor abra os arquivos que preparou para submissão e verifique, cuidadosamente, se as figuras, os

gráficos ou tabelas estão, efetivamente, no formato desejado. As ilustrações deverão ser

limitadas (em número e tamanho), ao perfeito entendimento do texto. O Editor reserva-se

o direito de descartar ilustrações que não atendam a este requisito.

Citações:

Todas as citações deverão fazer parte das Referências Bibliográficas. As citações dos autores no texto deverão ser feitas com letras

maiúsculas seguidas do ano de publicação da seguinte forma:

- Citação direta – quando é feita a transcrição literal do texto original, esta deverá ser indicada

entre aspas. Ex.: “arbusto originário da América Tropical...” (BALIANE, 1982); BALIANE

(1982) registra “arbusto originário da América Tropical...”

- Citação indireta – quando se exprime a idéia do autor. Ex: ...segundo KLOCKNER (1997) a...;

- Citação de uma citação – quando for impossível obter uma referência, poderá ser utilizada a

citação de citação. Este recurso deve ser evitado, devendo ser utilizado somente quando for

impossível obter o artigo original. Nestes casos, no texto deverá ser indicado o sobrenome do

autor original (em minúsculo), seguindo-se da expressão apud, então, o sobrenome do autor

que o citou (todo maiúsculo) e o ano de publicação. Ex: Souza apud SILVA (1998). Apenas o

trabalho de SILVA (1998) deverá fazer parte das referências bibliográficas.

- Dois autores (NATALI & MOLINARI, 1995).

- Mais de dois autores: cita-se o nome do primeiro autor seguido da expressão et al. (SILVA et

al., 1995).

Apresentação das Referências Bibliográficas/Sugestões de Leitura:

Artigos de periódico

ARAÚJO, E.J.A.; FERREIRA, J.R.; NASCIMENTO, D.S.; NASCIMENTO, M.O. I EXPOBIO,

uma estratégia de saída para situações de perigo eminente na coletividade: a exclusão social. Arq.

Apadec, 7(1):12-17, 2003.

Livro – autor de todo o livro

SILVA, P. Farmacologia. 5.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1998. p.53-60.

Livro – autor de capítulo dentro de um livro editado por outro autor principal

CIPOLLA-NETO, J.; CAMPA, A. Ritmos biológicos. In: AIRES, M.M. Fisiologia. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 1991. p.17-19.

Teses, Dissertações e Monografias

SANT’ANA, D.M.G. Estudo morfológico e quantitativo do plexo mientérico do colo ascendente de ratos adultos

normoalimentados e submetidos à desnutrição protéica. 1996. 30f. il. Dissertação (Mestrado em Biologia

Celular), Universidade Estadual de Maringá, Maringá, 1996.

Resumo de Congresso

CONEGERO, C.I.; MIRANDA-NETO, M.H. Estudo comparado do sistema pelve-ureteral de

humanos e suínos. In: ENCONTRO CIENTÍFICO DA UEM, 4., 1992, Maringá. Anais... Maringá,

1992. p.132.

Resumo de Eventos em Periódicos

STALLONE, T.; PRADO, I.M.M.; CAMBONI, A.; DI DIO, L.J.A.; MACCHIARELLI, G.;

CORRER, S. Distribution of collagen in the mucosa and submucosa of the terminal ileum in swine.

In: LV CONGRESSO SOCIETÀ ITALIANA DI ANATOMIA, 2001, Florença. Italian Journal of

Anatomy and Embryology, Florença, Itália, 106(3):256, 2001. Resumo.

Entidade Coletiva

BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE, INSTITUTO DO CÂNCER, COORDENAÇÃO DE

CONTROLE DE CÂNCER (Pro-ONCO), DIVISÃO DA EDUCAÇÃO. Manual de orientação

para o “Dia Mundial Sem Tabaco”. Rio de Janeiro: Instituto Nacional de Câncer. 1994. 19p.

Documentos Eletrônicos Disponíveis na Internet

1- Com indicação de autoria:

Nome do autor, título do trabalho. Mês e ano. Disponível: endereço eletrônico. Data em que foi

capturado o trabalho. Ex:

SANCHEZ-CABALLERO, H.J.; REFOJO-DE-BRUNO, M.L. El "heredocomplejo morbido" y

otros determinante de la psoriasis. Revision sobre 584 casos. Jul.-Sept. 1981. Disponível:

http://www.bireme.br/cgi-bin/IAH2. Acesso em: 18/09/99.

2- Sem indicação de autoria:

Título do trabalho. Mês e ano. Disponível: endereço eletrônico. Data em que foi capturado o

trabalho.

3- Entidades Coletivas:

Nome da entidade. Título do trabalho. Mês e ano. Disponível: endereço eletrônico. Data em que foi capturado o trabalho. Ex:

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO. Núcleo de Processamento de Dados.

Cursos - NPD/UFES. 1997. Disponível: http://npd1.ufes.br/~cursos/. Acesso em: 02/03/1997.

Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical

ISSN: 1566-0702

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type articles; clinical reports and book reviews. The Editor-in-Chief should be consulted

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which carry a risk of harm must include a statement (a) that the experiments were

conducted with the understanding and the consent of each subject, and (b) a statement

that the responsible Ethical Committee has approved the experiments. Animal

Experiments. Papers describing experiments on living animals should provide (a) a full

description of any anaesthetic and surgical procedure used, and (b) evidence that

adequate steps were taken to ensure that animals did not suffer unnecessarily at any

stage of the experiment, and comply with the existing national and international

guidelines on the conduct of animal experiments.

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once, the order is as follows: (1) single author: chronological sequence; (2) author and

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author: chronological sequence (as in the text these will be referred to as "et al.").

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publication, title of article, title of the journal, volume, first and last page number of the

article cited. Title abbreviations should conform to those adopted by List of Serial Title

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Bachaumont, 75002 Paris, France, ISBN 2-904938-02-8).

Examples: Paintal, A.S., 1973. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol.

Rev. 53, 159-227. Birdsall, N.J.M., Hulme, B.C., Hamner, R., Stockton, J.R., 1980.

Subclasses of muscarinic receptors. In: Yamamura, H.I., Olsen, R.W., Usdin, E. (Eds.),

Psychopharmacology and Biochemistry of Transmitters and Receptors. Elsevier,

Amsterdam, pp. 97-100. Leiblich, I., 1982. Genetics of the Brain. Elsevier, Amsterdam,

492 pp.

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