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Estudo da Resposta Imunológica
induzida por Arnica montana L.
Márcia Faria Marques
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2
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
JÚLIO DE MESQUITA FILHO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Câmpus de Araraquara
Estudo da Resposta Imunológica induzida por
Arnica montana
L.
Márcia Faria Marques
Orientadora: Profa. Dra. Iracilda Zeppone Carlos
Tese apresentada à Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Araraquara,
Universidade Estadual Paulista-UNESP
para a obtenção do título de Doutor
em Análises Clínicas.
Araraquara/2006
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3
SUMÁRIO
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
RESUMO
ABSTRACT
I- INTRODUÇÃO-------------------------------------------------------------------------11
1.1- Fitoterapia -----------------------------------------------------------------------12
1.2-Homeopatia------------------------------------------------------------------------13
1.3- Arnica montana Linné----------------------------------------------------------16
1.4- Resposta Imunológica----------------------------------------------------------19
II- OBJETIVOS----------------------------------------------------------------------------28
III- MATERIAIS E MÉTODOS----------------------------------------------------------30
3.1- Arnica montana------------------------------------------------------------------31
3.2 -Animais ---------------------------------------------------------------------------31
3.3 –Obtenção do exsudato peritoneal------------------------------------------32
3.4- Obtenção de células esplênicas --------------------------------------------32
3.5 – Determinação da viabilidade celular -------------------------------------33
3.6 - Determinação de H
2
O
2
-------------------------------------------------------34
3.7 - Determinação de NO ---------------------------------------------------------35
3.8 - Determinação de citocinas---------------------------------------------------37
3.9 - Análise estatística--------------------------------------------------------------39
IV- RESULTADOS-------------------------------------------------------------------------40
V- DISCUSSÃO---------------------------------------------------------------------------56
VI- CONCLUSÕES -----------------------------------------------------------------------76
VII- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS----------------------------------------------78
VIII- ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------106
4
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AM - Arnica montana L.
AM1 - Tintura-mãe de arnica
BH
4
- Tetrahidrobiopterina
CH - Centesimal Hahnemaniana
Con-A - Concanavalina A
ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay
IFNγ - Interferon-γ
iNOS - Óxido Nítrico Sintase
LPS - Lipopolissacarídeo de E. coli sorotipo 0111:B4
MLC - Meio Livre de Células
MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio
NF- κβ - Fator Nuclear-κβ
NO - Óxido Nítrico
PBS - Phosphate Buffered Saline
PEC - Células do Exsudato Peritoneal
PMA - Phorbol Myristate Acetate
RNI - Reativo Intermediário do Nitrogênio
ROI - Reativo Intermediário do Oxigênio
RPMI-1640 - Roswell Park Memorial Institute - série 1640
TNF-α - Fator de Necrose Tumoral-α
5
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1-Christian Friedrich Samuel Hahnemann
Figura 2- Exemplos de plantas conhecidas popularmente como Arnica. A) Arnica montana
Linné; B) Lychnophora ericoides Less; C) Heterotbeca inuloides Cass.
Figura 3 –Estrutura química do ácido cafeico. R
3
=OH
Figura 4 e 5 – Estrutura química da quercetina. R=OH e R’ =H
Figura 6 – Viabilidade das células do exsudato peritoneal (PEC) de camundongos Swiss
frente às preparações fitoterápicas de Arnica montana.
Figura 7 - Viabilidade das células do exsudato peritoneal (PEC) de camundongos Swiss
frente às preparações homeopáticas de Arnica montana.
Figura 8- Produção de peróxido de hidrogênio por células do exsudato peritoneal (PEC)
cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana.
Figura 9- Inibição da produção de peróxido de hidrogênio por células do exsudato
peritoneal (PEC) cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica
montana.
Figura 10- Produção de óxido nítrico (NO) por células do exsudato peritoneal (PEC)
cultivadas com preparações fitoterápicas de Arnica montana.
Figura 11- Produção e inibição de óxido nítrico (NO) por células do exsudato peritoneal
(PEC) cultivadas com preparações homeopáticas de Arnica montana.
Figura 12- Produção de TNF-α por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com
preparações fitoterápicas de Arnica montana L.
6
Figura 13- Produção de TNF-α por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com
preparações homeopáticas de Arnica montana L.
Figura 14- Produção de interferon gama (IFN-γ) por células esplênicas cultivadas com
preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana L.
Figura 15- Produção de interleucina 4 (IL-4) por células esplênicas cultivadas com
preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana L.
Figura 16- Produção de IL-6 por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com
preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana L.
Figura 17- Produção de IL-1 por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com
preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana L.
Figura 18- Produção de IL-12 por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com
preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana.
Tabela 1. Efeito inibitório das preparações homeopáticas de Arnica montana na produção
de NO em cultura de macrófagos estimulados por LPS.
Tabela 2. Efeito inibitório das preparações homeopáticas de Arnica montana na produção
de TNF-α em cultura de macrófagos estimulados por LPS.
7
RESUMO
8
A resposta imunológica engloba amplo contexto envolvendo várias células,
sendo o macrófago uma das mais importantes na resposta imune-celular. Os macrófagos
peritoneais quando ativados liberam mais de cem compostos ao meio extracelular, entre
eles os compostos reativos de oxigênio e de nitrogênio, além das citocinas: fator de necrose
tumoral-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ) e interleucinas (IL-1, 4, 6 e 12). Existem vários
estímulos à membrana macrofágica que podem desencadear a liberação de NO,
contribuindo para uma ação antimicrobiana, inflamatória, vasodilatadora,
neurotransmissora, ou até mesmo de citotoxicidade ou inibição/ativação linfocitária e da
agregação de plaquetas. Atualmente há uma forte tendência em se estudar produtos naturais
quanto à capacidade de atuação no sistema imunológico. Os medicamentos homeopáticos,
conhecidos há mais de 210 anos, visam à ativação das próprias defesas do organismo para
eliminar a doença. Estudos baseados em cultivos obtidos de macrófagos podem ser úteis
para um melhor entendimento da resposta imunológica. Considerando a importância
farmacológica de Arnica montana L. (Asteraceae), planta originária das regiões
montanhosas do norte da Europa, este estudo avaliou a liberação de H
2
O
2
, NO, TNF-α,
IFN-γ e IL-1, 4, 6 e 12 no sistema imunológico através de macrófagos peritoneais expostos
a preparações fitoterápicas e homeopáticas desta planta. Os resultados mostraram que a
Arnica montana L. foi capaz de promover a liberação de NO, TNF-α, IFN-γ e IL-6. As
preparações homeopáticas também apresentaram um efeito inibitório na produção de NO e
TNF-α induzida pelo LPS. A análise dos resultados deste trabalho sugere que a Arnica
montana L. pode modular a ativação dos macrófagos.
9
ABSTRACT
10
The immunological response includes wide context involving
several cells, being the macrophage one of the most important in the cellular immune
response. The peritoneal macrophages when activated they liberate more than a hundred
compound to the environment extracellular, among them compound reactive of the oxygen
and nitrogen and the tumoral necrosis factor -α (TNF-α), gamma-interferon and
interleukynes. The nitric oxide (NO) it is synthesized by several cellular types through
isoforms of the enzyme nitric oxide synthase (NOS). The enzyme inducible nitric oxide
synthase (iNOS) it produces NO starting from activators mechanisms macrophages. Several
incentives to the membrane macrophagical that can unchain the liberation of NO,
contributing to actions antibacterial, inflammatory, vasodilatation, neurotransmission, or
even of citotoxicity or inhibition/activation of lymphocytes. Now there is a strong tendency
in studying natural products with relationship to the capacity of performance in the immune
system. Macrophages are involved in many different processes but their main function is to
provide a defense line against microbial invasion and tumor cells. Once homeopathic
medications are aimed at activation of the body’s own defense mechanisms to fight an
existing disease, assays based in macrophages culture may be useful to enlighten some
questions. Considering the pharmacological importance of Arnica montana L. this study
evaluated the action of NO in the immune system through peritoneal macrophages exposed
to the preparations of this plant. The results showed that some of the tested preparations
were capable to promote the liberation of NO, TNF-α, INF-γ e IL-6 in cultures of
peritoneal macrophages murine. A relationship among the synthesis of NO and TNF-α was
observed. Analyzing the results, it is suggested that preparations of Arnica montana L. can
modulate macrophage activation.
11
I -
INTRODUÇÃO
12
1.1 FITOTERAPIA
A palavra fitoterapia é derivada do grego, onde phytos significa planta. Esse
termo foi introduzido mundialmente, pelo médico francês Henry Leclerc. O uso das plantas
para tratar diversos transtornos da saúde é uma das formas terapêuticas mais antigas e de
maior tradição. Os fitoterápicos têm sido, no caso do Brasil e de muitos países, o suporte
da indústria farmacêutica genuinamente nacional de pequeno e médio porte (DI STASI,
1996).
Multiplicam-se a cada dia o interesse e o consumo de medicamentos
naturais, sobretudo os de origem vegetal. Esta crescente utilização das plantas medicinais,
por vezes de forma indiscriminada e até mesmo abusiva, exige estudos farmacológicos e
toxicológicos para melhorar a forma de utilização dos medicamentos fitoterápicos a serem
empregados no tratamento de inúmeras patologias (PANIZZA, 1997). O interesse em
relação às plantas medicinais favorece a valorização dessa forma de terapêutica popular que
serve de modelo para muitos fármacos sintetizados (PRANDO & COLATRELLA, 1984).
O uso de produtos naturais como matéria prima para a síntese de fármacos
tem sido amplamente relatado ao longo do tempo. A etnofarmacologia está inserida no
contexto da etnobiologia, estudando o complexo conjunto de relações das plantas e animais
com a sociedade humana, do presente e do passado. A abordagem etnofarmacológica
oferece a oportunidade de descobrir protótipos, ou seja, novas estruturas com novas
atividades (MALONE, 1983).
13
1.2 HOMEOPATIA
A busca por analgésicos e antinflamatórios mais eficazes e menos tóxicos
tem sido uma constante no meio científico. Várias terapias têm sido avaliadas com
diferentes resultados. Entre estas terapias encontra-se a Homeopatia, descrita
primeiramente pelo filósofo Hipócrates na antiga Grécia, que em 450 a.C. acreditava no
princípio da similitude, no qual semelhante pode curar semelhante. Mas foi em 1796 que
Christian Friedrich Samuel Hahnemann (Figura 1), um médico alemão decepcionado com a
medicina da época, criou os princípios de um novo tipo de medicamento, publicando a obra
“Ensaios sobre um novo princípio para descobrir as virtudes curativas das substâncias
medicamentosas”, onde descreveu os fundamentos desta especialidade da Medicina. Sendo
esta obra o marco de fundação da Homeopatia (REBOLLO, 1994).
Figura 1-Christian Friedrich Samuel Hahnemann
A palavra homeopatia também deriva do grego, língua em que “homoios”
quer dizer “igual” e “pathos” significa doença. A homeopatia foi introduzida no Brasil por
um discípulo francês de Hahnemann, Benoit-Jules Mure, que aqui chegou em 1840.
A homeopatia é a arte de curar doentes por meio de medicamentos que,
dados ao homem são, em doses ponderáveis, provocam sintomas semelhantes aos que se
14
propõe a curar no doente. Esta terapêutica baseia-se em três princípios: a lei dos
semelhantes, a experimentação no homem são e o emprego das pequenas doses.
A Lei dos Semelhantes ou "Similia similibius curantur ou curentur", ou seja,
o semelhante tratado pelo semelhante. Assim, um determinado medicamento dado a
indivíduos aparentemente sadios, produz um conjunto de sinais e sintomas. Este mesmo
medicamento, em pequenas doses, produzirá a cura em doentes que tenham os sinais e
sintomas semelhantes àqueles apresentados anteriormente (BERNSTEIN, 1998).
O segundo princípio baseia-se na Experimentação no Homem Sadio ou
"Experientia in homine sano", que corresponde à experimentação no homem são, utilizado
por Hahnemann. Ela é a base para se escolher um medicamento, possibilitando dessa forma
que as manifestações sintomáticas do doente e da droga se combinem fortalecendo e
excitando os mecanismos de defesa do organismo em direção ao restabelecimento da saúde.
O outro princípio está na desconcentração da matéria-prima de origem do medicamento
homeopático (Doses Mínimas ou "Doses minimae"). As doses mínimas atuam suavemente,
sem agredir, estimulando os mecanismos naturais de defesa (BERNSTEIN, 1998).
A idéia das dinamizações e diluições altas se tornaria um dos principais
alvos de estudo no sistema homeopático. Hahnemann e outros cientistas precursores
entendiam que deveria haver um limite físico para a diluição de uma substância original, a
partir do qual não haveria mais qualquer resíduo da substância original. Contudo, diluições
altíssimas, foram usadas na medicina homeopática com sucesso. A questão acerca da
diluição e da dinamização não só se tornaria um dos principais pontos de controvérsia entre
a homeopatia e a medicina convencional moderna, como ainda é uma das principais áreas
de conflito dentro da comunidade homeopática propriamente dita (JONHNNAS, 1996).
15
Assim, Hahnemann passou a pesquisar substâncias que provocassem os
mesmos sintomas da doença que se pretendia curar, administrando-as em seus pacientes e
com o intuito de evitar os efeitos da agravação medicamentosa ao diminuir a toxicidade das
drogas através da diluição das mesmas, Hahnemann passou a notar que, após agitações
vigorosas e ritmadas, os medicamentos passavam a ter seus efeitos potencializados,
surgindo assim o princípio da dinamização homeopática.
Reconhecida como especialidade médica há 25 anos, há 13 pela área
farmacêutica e há cinco anos pela medicina veterinária e odontologia, a homeopatia
enfrenta nos dias de hoje o desafio de provar em bases científicas o seu funcionamento,
apesar de não haverem dúvidas a respeito de sua efetividade clínica por parte dos pacientes
e médicos.
Isso se justifica pelo fato de seus princípios de diagnóstico e tratamento
diferirem do modelo químico-farmacológico convencional. A pesquisa clínica usual para
avaliação dos efeitos medicamentosos não funciona para medicamentos homeopáticos, uma
vez que burla um princípio homeopático que é tratar o indivíduo em vez da doença.
Desde a sua criação, o tratamento homeopático procura tratar a pessoa como
um todo, buscando um conjunto de sintomas existentes no paciente, procurando promover
o auto-equilíbrio, ou seja, a equalização da homeostasia.
Através da física quântica é possível comprovar que a conformação das
moléculas de solvente é alterada quando uma insignificante porção de soluto é adicionada a
uma solução que é dinamizada. Com a dinamização algum tipo de informação existente na
substância ativa diluída é transferida para o solvente usado no preparo do remédio, o que
atribui a este solvente característica do soluto, justificando o efeito de um remédio tão
16
pouco concentrado. Assim, a dinamização pode alterar pontes de hidrogênio, ligações
dipolo-dipolo além de forças intermoleculares mais fracas, podendo formar grupos de
moléculas de solvente denominadas “clusters”, o que pode confirmar a teoria
Hahnemaniana de que informações do soluto podem ser repassadas para o solvente na
dinamização do medicamento.
As indicações do medicamento homeopático Arnica montana estão bem
estabelecidas nas Matérias Médicas Homeopáticas, por ser um dos mais conhecidos
remédios homeopáticos. KINOUCHI (1986) como exemplo, a emprega externamente na
forma de tintura-mãe e, internamente em várias dinamizações.
1.3 ARNICA
Planta originária das regiões montanhosas do norte da Europa, de terras
silicosas, o cultivo da Arnica montana L. no Brasil é de adaptação muito difícil. Por aqui,
existem muitas plantas chamadas popularmente de arnica, mas na verdade são espécies
diferentes (Figura 2) e não têm a mesma aplicação terapêutica. Desde a Idade Média, os
efeitos antinflamatórios da Arnica montana L. são conhecidos, bem como sua aplicação na
cicatrização de ferimentos graças às suas propriedades regeneradoras de tecidos
(VALENTOVA, 1990).
17
A B
C
Figura 2-
Exemplos de plantas conhecidas popularmente como Arnica. A) Arnica montana Linné;
B) Lychnophora ericoides Less; C) Heterotbeca inuloides Cass.
Arnica montana Linné pertence à família das Asteraceae e apresenta como
sinonímia Caltha alpina, Chrysanthemun latifoliun, Doronicum austricum quartum,
Nardus celtica, Panacea lepsorum, Ptarnica Montana. Popularmente, a arnica recebeu
diversos nomes: quina-dos-pobres, tabaco-dos-alpes, tabaco-da-montanha, erva-dos-
pregadores, veneno de leopardo, etc (VESSLY, 2000).
Arnica montana é um arbusto perene com rizomas (caules subterrâneos) e
raízes perenes, com caules (talos) aéreos que se renovam a cada ano. Sua altura varia de 20
a 70 cm. As folhas chegam a ter 7cm de comprimento com quatro folhas ovais agrupadas
em roseta. As flores são abundantes, de cor amarelo-ouro ou alaranjada, com pétalas
ovaladas e pontudas que exalam um suave perfume. Os frutos são pardos e aquênio
(LASRWAL, 1998).
A arnica é o grande remédio do traumatismo, com ação sobre músculos,
tecido celular, cérebro e vasos sanguíneos (partes do corpo mais sujeitas a traumatismos),
está indicada para tratar machucados, contusões musculares, artrite, dores reumáticas, no
tratamento das varizes e no pós-operatório por reduzir o edema. Em aplicações mais
específicas, é também indicada para combater febres, hemorragias, desinterias, infecções
18
renais, inflamações oculares, problemas circulatórios e cardíacos. No tratamento à
oleosidade e queda excessiva dos cabelos, rachaduras e hematomas na pele; o uso externo
de tinturas e cataplasmas de arnica está limitado à pele íntegra.
A variedade dos produtos a base de arnica existentes no mercado explica a
diversa empregabilidade desta planta, como sabonetes para limpeza de partes contundidas,
conservando a pele macia e elástica, fazendo desaparecer as rachaduras e asperezas; pasta
dental e água dentifrícia; óleo tônico capilar; óleo e pomada para fricção muscular; etc.
Apresenta em sua composição química lactonas sesquiterpênicas como
helenalina sob a forma de ésteres (acetato, metacrilato, isobutirato) e dihidrohelenalina,
seus ésteres (arnicolídeos) e tetrahidrohelenalina. Além de flavonóides, óleo essencial que
contém timol e derivados como timolmetileter, hidroxitimolmetileter e o isobutirato de
timol, ácidos fenólicos, polifenóis, ácido cafeico (Figura 3) e um complexo formado por
caroteno e manganês (POZETTI, 1991).
A eficiência da arnica para tratar ferimentos, especialmente aqueles com
hematomas, é comprovada pela presença de uma substância chamada quercetina (Figura 4),
capaz de aumentar a resistência dos vasos e a irrigação sangüínea nos locais feridos,
diminuindo o coágulo e eliminando o hematoma. Outra substância, a inulina, funciona
como um analgésico, aliviando a dor.
19
Figura 3 –Estrutura química do ácido cafeico. R
3
=OH
Figura 4 –Estrutura química da quercetina. R=OH e R’ =H
1.4 RESPOSTA IMUNOLÓGICA
A inflamação é fundamentalmente uma resposta de defesa do organismo,
visando destruir, amenizar ou circunscrever a ação do agente agressor. Nesse processo
encontramos o macrófago em estado ativado, onde sua capacidade de fagocitar e exercer
atividades antimicrobianas e citotóxicas está aumentada por sofrer uma série de alterações
morfo-funcionais (ROITT et al.,1999; SELIGMANN, 2003).
A interação celular entre macrófagos e linfócitos durante a resposta
imunológica desencadeia nos macrófagos, mudanças bioquímicas e alterações na expressão
de genes, por estímulos inflamatórios sucessivos à membrana macrofágica; alterando suas
propriedades de locomoção, aderência, fagocitose e de síntese de enzimas e substâncias
antimicrobianas, citotóxicas, pró-inflamatórias, vasodilatadoras e imunomoduladoras.
(NATHAN & HIBBS, 1991).
20
Em resposta à ativação por mediadores inflamatórios, os macrófagos
aumentam o seu conteúdo enzimático e a secreção de produtos biologicamente ativos no
meio extracelular, liberando mais de 100 compostos; entre os numerosos produtos
secretados, além de várias citocinas, estão também compostos inorgânicos com alto grau de
reatividade química como os intermediários reativos do oxigênio (ROI), incluindo o
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e do nitrogênio (RNI), incluindo o óxido nítrico (NO)
(BABIOR, 1978; FRIEDL et al., 2004).
O ânion superóxido (O
2
-
), produzido a partir da redução do oxigênio, é
subseqüentemente convertido a peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) com a ajuda da enzima
superóxido dismutase (SOD). Nos locais de atividade fagocítica e inflamação, quando há
biossíntese excessiva, o H
2
O
2
,
em altas concentrações, pode destruir estruturas biológicas,
ocasionando lesões irreversíveis como a quebra de fita de DNA e/ou perturbação no
citoesqueleto da membrana, levando à morte celular (PICK & KEISARI, 1980;
HAMPTON et al., 1998).
No processo inflamatório, os macrófagos ativados sintetizam nitrito (NO
2
-
) e
nitrato (NO
3
-
), formas estáveis oxidadas do NO, cuja produção reflete o grau de inflamação,
e conseqüentemente indica uma medida dos efeitos de drogas na terapia antiinflamatória. O
óxido nítrico é formado através da oxidação do átomo de nitrogênio do aminoácido L-
arginina pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) que é dependente dos cofatores NADPH,
FMN, FAD, Ca
+2
e tetrahidrobiopterina (BH
4
), formando como reação intermediária a N
G
-
Hidroxil-L-arginina e como produtos finais a L-citrulina e o NO (IYENGAR et al., 1987).
O óxido nítrico (produto celular) é um radical livre altamente solúvel que
exerce efeito fisiológico e proteção imunológica. Está envolvido em uma ampla série de
21
processos fisiológicos: como fator de relaxamento derivado do endotélio concede
resistência vascular e controle da pressão sanguínea, diminui a resistência renal e aumenta a
filtração glomerular; também transmite os sinais nervosos de um neurônio a outro em
diversas áreas do cérebro, além de atuar como vasodilatador nas terminações nervosas
parassimpáticas do pênis, produzindo a ereção e possivelmente pode também estar
envolvido em alguns dos mecanismos de memória (RANG et al., 1997; XIE et al., 2002).
Como molécula reguladora no sistema imunológico, o NO sinaliza em
diversos tecidos, é um mediador citotóxico/citostático para as células tumorais e agentes
infecciosos intracelulares, contribuindo para a manutenção da homeostasia imunológica,
devido ao seu papel no fenômeno de supressão da célula T (MONCADA et al., 1991).
A produção de NO por diferentes células durante a resposta imunológica é
controlada por diversos mecanismos (BASU, 2006). Em adição ao papel protetor do NO, há
um mecanismo dependente da liberação de citocinas com função autócrina, tal como o fator
de necrose tumoral-α (TNF-α) e parácrina, como o interferon-γ (IFN-γ), que regulam a
ativação de macrófagos, modulando sua função fagocitária e a síntese de mediadores pró-
inflamatórios, assim como também a indução da enzima óxido nítrico sintase induzível
(iNOS) (NUSSLER & BILLIAR, 1993).
A expressão da isoforma NO induzível pode ocasionar na superprodução de
NO, que exerce efeitos citotóxicos potentes em células normais por afetar o metabolismo
energético, alterando o sistema redox e danificando o DNA, implicando assim, em
patologias imunoinflamatórias em que altos níveis deste óxido são tecido-destrutivos
(VANE et al., 1994).
22
O NO é altamente reativo e reage com muitas macromoléculas e, também,
com o ânion superóxido (O
2
-
) (produto do sistema de redução do oxigênio), formando o
radical peroxinitrito (ONOO
-
), um oxidante potente que medeia alguns dos efeitos
citotóxicos do NO em locais de atividade fagocítica e inflamação, quando há biossíntese
excessiva (ABBAS et al., 2000). O NO aumenta a produção mitocondrial de espécies
reativas de oxigênio, esses radicais reagem entre si, podendo formar outros oxidantes com
capacidade para nitrar resíduos fenólicos de proteínas, como a enzima succinato
desidrogenase e conduzir à disfunção mitocondrial (PODEROSO et al., 1998).
A capacidade dos macrófagos ativados em liberarem mediadores tóxicos
consome grandes quantidades de energia e muitas vezes provocam dano tecidual, mas é
importante na defesa do hospedeiro porque lhe permite destruir grandes patógenos
extracelulares que não consegue ingerir. A estreita regulação da atividade dos macrófagos
pelas células Th1 possibilita a distribuição específica e efetiva desse potente meio de defesa
do hospedeiro, ao mesmo tempo em que minimiza a agressão tecidual e o consumo de
energia (JANEWAY et al., 2000).
A ativação dos macrófagos requer um sinal indutivo inicial a partir de
linfócitos T, identificado como IFN-γ que particularmente em combinação com a
interleucina-2 (IL-2) e/ou TNF-α, participam do mecanismo que desencadeia a produção de
NO. Por outro lado, o próprio NO atua como um inibidor da produção das citocinas
liberadas pelas células Th1 (TNF-α, IL-2, IL-12 e IFN-γ), ou seja, o NO é capaz de inibir a
sua própria produção, por interferir na liberação das citocinas que promovem a sua
produção. Efeito esse não observado sobre as células Th2 que liberam principalmente TGF-
β, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, sugerindo que este mecanismo de regulação pode, em alguma
23
circunstância, modular a resposta imune, contribuindo para a manutenção da homeostasia
imunológica (BINGISSER et al., 1998).
Citocinas são frequentemente agrupadas em famílias de acordo com suas
funções similares ou de acordo com a sua estrutura proteica (HOLLOWAY, 2001). São
elas as hematopoietinas, os interferons (IFN), as quimiocinas, e a família do fator de
necrose tumoral (TNF). Membros da família TNF atuam como trímeros, a maioria dos
quais ligados à membrana e muito distintos das outras citocinas por suas propriedades.
Apesar disso, eles compartilham algumas propriedades importantes com as citocinas
solúveis: eles são sintetizados de novo no momento do reconhecimento do antígeno pela
célula T, afetando o comportamento da célula-alvo (JANEWAY et al., 2000).
A partir do perfil das células Th0 existe uma dicotomia que se efetua seja no
sentido de um perfil Th1, seja no sentido de um perfil Th2. O perfil Th1 está
essencialmente implicado na resposta imunológica celular caracterizada por um infiltrado
rico em neutrófilos e em macrófagos e pela formação de granulomas. O perfil Th2 está
implicado nas respostas imunológicas alérgicas e é caracterizado por infiltrados ricos em
eosinófilos e pelo aumento da síntese da IgE (REINHERZ & SCHOLOSSMAN, 1981).
TNF-α, produzido por macrófagos, é uma citocina que apresenta efeito
estimulante no crescimento de fibroblastos, aumenta a capacidade do interferon-γ em
induzir a expressão de antígeno em algumas células tumorais, suprime a atividade da lipase
lipoproteica, ativa neutrófilos, ativa células Natural Killer (NK) em humanos e facilita a
proliferação de células B humanas (SHALABY et al., 1985).
24
O TNF-α estimula os fagócitos mononucleares a secretarem quimiocinas
que contribuem para a resposta inflamatória. O TNF reduz a perfusão tecidual por relaxar o
tônus da musculatura lisa vascular, atuando diretamente sobre as células dos músculos lisos
e por agir também na produção de vasodilatadores como o NO, por indução da NOS.
Diversas ações específicas do TNF-α podem contribuir para seus efeitos letais nas
concentrações extremamente elevadas. A super produção de TNF-α em vários processos
inflamatórios agudos, causa disfunção em órgãos como o fígado; por outro lado, a
diminuição nessa produção ou a neutralização da ação do TNF-α ou da IL-12 e IFN-γ leva
a um aumento na suscetibilidade para infecções (GANTINER et al., 1996).
A interleucina-12 (IL-12), descoberta em 1989, é um heterodímero que
apresenta em sua estrutura cadeias polipeptídicas, a p-40 e a p-35. A IL-12 é liberada por
células B ativadas, monócitos, células dendríticas, neutrófilos e macrófagos.
A atividade de IL-12 abrange múltiplos efeitos sobre as células NK
(proliferação celular, liberação de citocinas e aumento da citotocixidade) e exerce
importante função na ativação da resposta Th1(resposta imune-celular) por favorecer a
diferenciação das células Th em Th1, com conseqüente indução da produção de IFN-γ.
IFN-γ é um importante mediador na resistência viral, fúngica, bacteriana e parasitária, por
estimular as funções efetivas dos macrófagos nos momentos iniciais da invasão do
patógeno, controlando rapidamente a infecção (TRINCHIERI, 1995).
Estudos recentes demonstram que a IL-12 é uma chave promotora da
imunidade celular e da resistência inicial a infecções, um potente estimulador da defesa do
organismo contra uma variedade de patógenos. A síntese de IL-12 pode resultar em uma
resposta excessiva do sistema imunológico, causando dano tecidual e morte, como
25
observado em doenças autoimunes e no choque séptico. Identificar e caracterizar os
produtos envolvidos na indução e na inibição da síntese de IL-12 é uma importante área de
investigações constantes que possibilita a produção de imunoterápicos.
A interleucina-12 (IL-12) é o principal mediador da resposta imune inata a
microorganismos intracelulares e um indutor chave da imunidade mediada por células, a
resposta adaptativa contra estes microorganismos. É produzida principalmente por
macrófagos ativados e células dendríticas (GAZZINELLI et al., 1993). É uma proteína
heterodimérica composta por duas subunidades denominadas p35 e p40 (o que representa
aproximadamente seus pesos moleculares).
A IL-12 é muito importante para a iniciação de uma seqüência de respostas
envolvendo macrófagos, células NK e linfócitos T, e participa de uma ligação importante
entre a imunidade natural e adaptativa. A IL-12, juntamente com o TNF-α, são co-
estimuladores para a produção de IFN-γ (TRIPP et al., 1993), direcionando para uma
resposta Th1.
Na rede de mediadores que constitui a resposta imunológica, o IFN-γ,
produzido pelos linfócitos, é a principal citocina ativadora de macrófagos e possui funções
essenciais na imunidade inata e na imunidade específica mediada por células. O IFN-γ
aumenta a ação microbicida de macrófagos pela estimulação da síntese de intermediários
reativos do oxigênio e de óxido nítrico (DRAPIER et. al., 1988).
As células Th1 possuem marcadores de membrana CCR5 e LAK3 e as Th2
possuem o CCR3, elas apresentam função regulatória uma sobre as outras. O IFN-γ inibe a
expressão das citocinas produzidas por células Th2 (FUSS & STROBER, 1998).
26
A regulação dos perfis Th1/Th2 ainda é pouco conhecida, existe um
equilíbrio com sobreposição dos dois perfis, pois um perfil Th1 pode estar implicado em
uma resposta alérgica e um perfil Th2 pode provocar a formação de granulomas. Existe
também um equilíbrio entre as citocinas inflamatórias e as antiinflamatórias (SALEM,
2005).
A IL-6, liberada pelos macrófagos, é uma citocina multifuncional, envolvida
na regulação da resposta imune, na hematopoese, na inflamação (AKIRA et al., 1990), na
produção de plaquetas, na ativação dos osteoclastos, na produção de imunoglobulinas, na
diferenciação de células T e de células neuronais, na proliferação de queratinócitos e das
células mesangiais (NAKA et al., 2002); tem funções tanto na imunidade inata quanto na
adaptativa (TRIPP et al., 1993). A IL-6 foi originalmente identificada como fator de
diferenciação das células B e uma de suas principais funções é a indução da produção de
anticorpos por estas células (AKIRA et al., 1990).
A IL-1 é produzida por macrófagos ativados e atua juntamente com o TNF-
α como um mediador da resposta inflamatória e da imunidade inata. Existem duas formas
de IL-1, denominadas de IL-1α e IL-1β, que têm homologia de menos de 30% entre si, mas
ligam ao mesmo receptor celular e medeiam as mesmas atividades biológicas. Também
atua como pirogênio endógeno (DINARELLO, 1988). A IL-1 é o protótipo de citocina
multifuncional. É uma citocina pró-inflamatória potente, que pode gerar a síntese de PGE
2
,
atua em células B ativadas por antígenos para induzir sua proliferação e/ou diferenciação
em células produtoras de anticorpos, sinergisticamente com outros fatores como IL-6 e IL-2
(AKIRA et al., 1990).
27
A ativação dos macrófagos é um fenômeno complexo e quando ativados
apresentam capacidade aumentada de destruir certos microrganismos. Os macrófagos
respondem a vários microrganismos pela secreção de IL-12, que induz a produção local de
IFN-γ pelas células NK e linfócitos T. O IFN-γ ativa os macrófagos a destruir os
microrganismos fagocitados por estimular a síntese de intermediários reativos do nitrogênio
e oxigênio (STARK et al., 1998).
A importância do sistema imunológico para a sobrevivência humana, aliada
à grande utilização de plantas medicinais pela população e à procura de substâncias naturais
pelas indústrias farmacêuticas motivam o desenvolvimento de estratérgias, tanto químicas
quanto biológicas, para a descoberta de novas substâncias ativas.
28
II -
OBJETIVOS
29
Devido à ampla empregabilidade de Arnica montana tanto como
medicamento fitoterápico, como homeopático no tratamento de diversas patologias, o
objetivo geral deste estudo foi avaliar a resposta imunológica frente as preparações
fitoterápicas e homeopáticas de arnica a partir de sua tintura-mãe e ainda, avaliar o cultivo
de macrófagos como modelo biológico para o estudo de outros medicamentos
homeopáticos.
Os objetivos específicos são:
Determinar a citotoxicidade de Arnica montana L.
Avaliar a resposta do efeito das dinamizações homeopáticas 6CH,
12CH e 30CH da arnica sobre culturas de macrófagos e, de células
esplênicas de camundongos, através da determinação de citocinas
(TNF-α, IFN-γ, IL-1, IL-4, IL-6 e IL-12) e dos reativos
intermediários de oxigênio (H
2
O
2
) e de nitrogênio (NO).
Caracterizar uma atividade moduladora dos mecanismos de
amplificação e/ou supressão dessa resposta.
30
III –
MATERIAIS E MÉTODOS
31
3.1. Arnica montana
As preparações dos medicamentos homeopáticos 6CH, 12CH e 30CH
seguiram rigorosamente a 2ª edição da Farmacopéia Homeopática Brasileira de 1997. (ver
anexo) Através de múltiplos frascos para as diluições e o emprego das 100 sucussões
manuais ou mecânicas, obtém-se a dinamização e a cada etapa concluída, uma potência.
Para as três primeiras dinamizações, para a escala centesimal, foi empregado etanol com o
mesmo título etanólico da tintura-mãe. E, para as preparações intermediárias, assim como
para as de estoque, foi empregado etanol 70% (p/p). Para as potências aqui estudadas, 6CH,
12CH e 30CH foi utilizado etanol 5% (p/p).
As preparações fitoterápicas foram obtidas por diluições em meio de cultura
RPMI-1640, a partir da tintura-mãe AM1, obtendo-se AM2 (1:2), AM3 (1:10), AM4
(1:100), AM5 (1:10
4
), AM6 (1:10
6
), AM7 (1:10
12
), AM8 (1:10
24
) e AM9 (1:10
60
).
3.2. Animais
Foram utilizados camundongos Swiss, machos, pesando entre 25 e 30
gramas com 6-8 semanas de idade, provenientes do Biotério da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Araraquara – UNESP. Os animais receberam ração e água ad libitum,
mantidos em gaiolas com condições estáveis de ambiente 23°C, ±56% de umidade relativa
do ar e ciclos de 12 horas claro/escuro.
32
3.3. Obtenção das células do Exsudato Peritoneal (PEC)
Os animais foram inoculados previamente com 3,0 mL de tioglicolato de
sódio (Difco) a 3%, por via intraperitoneal, 3 dias antes da coleta das células. Após 72
horas de estímulo, os animais foram mortos individualmente através da inalação de
clorofórmio, e seu peritôneo exposto, em fluxo laminar horizontal (Veco), para a retirada
do lavado peritoneal, injetando 5 mL de tampão fosfato (PBS) estéril, pH 7,0 a 4
o
C, na
porção mediana superior do abdomem, após leve massagem manual. O material obtido foi
dispensado em tubo cônico estéril (Corning, Inc.) para o preparo da suspensão celular. As
células do exsudato peritoneal foram lavadas três vezes, sucessivamente, com 5 mL de PBS
em centrífuga (Fanem) a 200 x g/5 minutos. As células foram ressuspendidas em RPMI-
1640 (Sigma) contendo 5% de soro fetal bovino, 2-Mercaptoetanol a 2x10
-5
M, Penicilina
100 U/mL, Estreptomicina 100 U/mL e L-Glutamina 2mM; designado como meio
completo RPMI-1640-C. Para contagem celular, 10µL da suspensão celular foi diluída em
90µl de líquido de Lazarus em câmara hemocitométrica de Neubauer (Boeco, Germany). A
suspensão celular foi ajustada à concentração de 2x10
6
células/mL para a determinação do
peróxido de hidrogênio ou a 5x10
6
células/mL de RPMI-1640C para os demais testes.
33
3.4 Obtenção das células esplênicas
Os animais foram mortos individualmente através da inalação de
clorofórmio, e seu peritôneo exposto, em fluxo laminar horizontal (Veco), para a retirada
do baço que foi pinçado em placa de Petri estéril contendo 3,0 mL de BSS (Balanced Salt
Solution), pH 7,0 a 4
o
C. O material obtido foi dispensado em tubo cônico estéril (Corning,
Inc.) para o preparo da suspensão celular. As células esplênicas foram lavadas 3 vezes com
5 ml de BSS em centrífuga (Fanem) a 200 x g/5 minutos. As células foram resuspendidas
em RPMI-1640 (Sigma) contendo 5% de soro fetal bovino, 2-Mercaptoetanol a 2x10
-5
M,
Penicilina 100 U/ml, Estreptomicina 100 U/ml e L-Glutamina 2mM, designado como meio
completo RPMI-1640-C. Para contagem celular, em câmara hemocitométrica de Neubauer
(Boeco, Germany), foi utilizado azul de Trypan 0,04%. A suspensão celular foi ajustada à
concentração de 5x10
6
células/mL para a determinação do IFN-γ e da IL-4.
3.5 Determinação da viabilidade celular
O potencial tóxico das preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica
montana L., foi determinado segundo a capacidade que têm as células vivas de clivar o anel
tetrazólio presente no sal brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio (MTT)
pela ação de enzimas desidrogenases presentes na mitocôndria, formando cristais de
formazana (MOSMANN, 1983). Após o contato por 24 horas de 100µL da cultura de
macrófagos peritoneais a 5x10
6
células/mL (item 3.3) com 100µl de cada preparação
medicamentosa de Arnica montana L. (6CH, 12CH, 30CH, AM1, AM2, AM3, AM4, AM5,
34
AM6, AM7, AM8 e AM9), o meio livre de células (MLC) foi desprezado e 100µl de uma
solução de MTT a 0,5mg/mL diluído em RPMI-1640 foram adicionados à placa de cultura
e incubados por 3 horas em estufa (Forma Scientific, Inc.) com tensão constante de 5% de
CO
2
a 37
o
C ± 1°C. Após incubação, os cristais de formazana formados pelas células viáveis
foram solubilizados com 100µL de isopropanol. A leitura da absorbância foi feita a 540nm,
utilizando um filtro de referência de 620nm, em espectrofotômetro UV/visível automático
(Multiskan Ascent, Labsystems).
3.6 Determinação da Liberação do Peróxido de Hidrogênio
A produção de H
2
O
2
foi determinada segundo o método descrito por Pick &
Keisari (1980), e adaptado por Pick & Mizel (1981).
A suspensão de células do exsudato peritoneal foi ajustada na concentração
de 2x10
6
células /ml em solução de vermelho de fenol 0,56 mM; peroxidase de raiz forte,
tipo II (0,01 mg/mL, Sigma); tampão fosfato de potássio 10 mM a pH 7,0; NaCl 140 mM e
dextrose 5,5 mM.
Dessa suspensão celular, 100µL foram transferidos para as escavações de
uma placa de cultura de fundo plano com 96 cavidades (Corning, Inc.). A seguir foram
acrescentados 50µl das preparações medicamentosas de Arnica montana L. a serem
testadas. As amostras foram ensaiadas em quadruplicata para cada animal, com controle
negativo constituído somente por meio RPMI – 1640-C e com controle positivo contendo
50 µl de zymosan a 10mg/ml (parede celular do fungo Saccharomyces cerevisae). A placa
foi incubada por uma hora a 37
o
C ± 1°C em atmosfera úmida com tensão constante de 5%
35
de CO
2
. Após esse tempo, a reação foi interrompida pela adição de 50 µl de NaOH 5 N. A
absorbância foi determinada em leitor de ELISA automático, com filtro de 620 nm, contra
branco constituído de solução de vermelho de fenol e NaOH 5 N.
Os resultados foram expressos em nanomoles de H
2
O
2
/2x10
5
células
peritoneais/cavidade, a partir de uma curva padrão previamente estabelecida, constituída de
concentrações molares conhecidas de H
2
O
2
em tampão vermelho de fenol.
Para a determinação do efeito inibitório da produção de H
2
O
2
foram
utilizadas as células do exsudato peritoneal na concentração de 2 x 10
6
células/mL. Após a
aderência, os macrófagos foram incubados na presença de 50µL de Phorbol Myristate
Acetate (PMA) (0,2µM) e 50µL das preparações fitoterápicas e homeopáticas, durante 1
hora em estufa à 37
o
C± 1°C com tensão constante de 5% de CO
2
. A produção de H
2
O
2
foi
medida espectrofotometricamente através do método de Pick e Keisari (1980) como
descrito anteriormente.
3.7 Determinação da Liberação de Óxido Nítrico
O óxido nítrico foi quantificado pelo acúmulo de nitrito (NO
2
-
) em meio de
cultura, medido espectrofotometricamente usando o reagente de Griess (GREEN et al.,
1982), composto por dicloro N-(1-Naftil)-etilenodiamino (Merck), sulfanilamida (Merck) e
ácido ortofosfórico (Mallinckrodt Chemical). Da suspensão de células do exsudato
peritoneal ajustada a 5x10
6
células/ml de RPMI – 1640-C, foram retirados 100µl e
acondicionados em placa estéril de fundo plano com 96 cavidades (Corning, Inc.). A seguir
foram acrescentados 100µl das preparações medicamentosas de Arnica montana L. a serem
36
testadas. Em outras cavidades foram adicionados 100µl da solução de lipopolissacarídeo
(LPS) de E. coli sorotipo 0111:B4 a 10µg/ml (Sigma) como controle positivo, ou 100µl de
meio RPMI-1640-C como controle negativo.
A placa foi incubada em estufa (Forma Scientific, Inc.) a 37
0
C ± 1°C com
tensão constante de 5% CO
2
por 24 horas. Após esse período foram transferidos 50µL de
MLC para uma nova placa e adicionados 50 µL do reagente de Griess.
Após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, a leitura foi feita em
espectrofotômetro UV/visível automático (Multiskan Ascent, Labsystems), com filtro de
540 nm. Os resultados foram expressos em micromoles de NO/5x10
5
células
peritoneais/orifício, a partir de uma curva padrão previamente estabelecida, constituída de
concentrações molares conhecidas de NaNO
2
(Merck) em RPMI – 1640.
Para a realização do teste de inibição da produção de NO, foram utilizadas
as células do exsudato peritoneal, na concentração de 5 x 10
6
células/mL. Após a aderência,
os macrófagos foram incubados em presença de 100µL de solução de LPS (1µg/mL) e
100µL das preparações fitoterápicas e homeopáticas. A incubação foi feita por 24 horas em
estufa a 37
o
C ± 1°C com tensão constante de 5% de CO
2
. A produção de NO foi medida
espectrofotometricamente através do acúmulo de nitrito no meio de cultura com a utilização
do reagente de Griess de acordo como descrito anteriormente.
37
3.8 Determinação da liberação de citocinas
A partir das suspensões de células peritoneais e esplênicas ajustadas a 5x10
6
células/ml, obtidas conforme itens 3.3 e 3.7, foram distribuídas alíquotas de 1,0 mL em
placas de cultura de tecidos de 24 cavidades e adicionado 34 µl de cada preparação
medicamentosa ou do controle positivo (LPS a 10 µl/mL ou ConA a 0,5 µg/mL) ou ainda
de meio de cultura como controle negativo. As placas foram incubadas em estufa (Forma
Scientific, Inc.) a 37
0
C com tensão constante de 5% CO
2
por 24 horas. Após esse período,
as placas sofreram centrifugação refrigerada (Hettich, Inc.) a 4°C por 10 min a 4000 rpm.
Os sobrenadantes obtidos foram aliquotados em ependorffs e armazenados em frezzer -
80°C para posterior dosagens das citocinas.
As citocinas IFN-γ e IL-4 foram quantificadas nos sobrenadantes das
culturas de células esplênicas e as citocinas TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-12 (p-40) foram
quantificadas nos sobrenadantes das culturas de células peritoneais, através do teste
imunoenzimático ELISA (Kit DuoSet®, R&D Systems) de captura para cada citocina.
As placas de 96 cavidades (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, Va)
foram adsorvidas com um anticorpo de captura monoclonal, obtido de rato, anti-citocina de
camundongo, na concentração adequada para cada citocina em solução salina tamponada de
fosfatos, pH 7,2 (PBS) (100 µl/cavidade) e incubadas “overnight” à temperatura ambiente.
Após este período as placas foram lavadas com solução salina tamponada de fosfatos, pH
7,2 contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-T) e bloqueadas com 300 µl/cavidade de soro
albumina bovina (BSA) a 1% em PBS (PBS/BSA), à temperatura ambiente por 60 minutos
e lavadas 3 vezes com PBS-T. Após lavagem foram adicionados 100 µL do padrão de
38
citocinas ou dos sobrenadantes das culturas de células a serem testados. As placas foram
incubadas à temperatura ambiente novamente por 120 minutos, lavadas 3 vezes com PBS-
T. Em seguida, foram adicionados 100 µl do anticorpo monoclonal anti-citocina de
camundongo marcado com biotina (1,5 µg/cavidade; Phar Mingen) diluído à concentração
adequada para cada citocina em diluente de reagente (1% BSA, 0,05% tween 20 em PBS,
pH 7,2). As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 120 minutos e lavadas 3
vezes com PBS-T e adicionados 100 µl/cavidade do conjugado peroxidase-estreptavidina
diluído 1/200 em diluente reagente e as placas foram incubadas novamente à temperatura
ambiente por 20 minutos. Após este tempo as placas foram então lavadas 3 vezes com PBS-
T e em seguida foi adicionado 100µl do substrato (tetrametilbenzidina a 0,4 mM em
tampão fosfato cítrico 10 mM, pH 5,5 e 1,2 mM de H
2
O
2
) a cada cavidade. A reação foi
interrompida adicionando-se 50µl de H
2
SO
4
2N em cada cavidade. A absorbância foi lida a
450nm em espectrfotômetro UV/visível para microplacas (Multiskan Ascent, Labsystems),
e as concentrações das citocinas foram quantificadas utilizando-se uma curva padrão
previamente estabelecida com quantidades conhecidas dos padrões de cada citocina,
obtendo os resultados em pg/mL.
39
3.9 Análise estatística
Todos os resultados obtidos nesse estudo foram submetidos à análise
estatística. Para a análise neste trabalho, utilizou-se média de cinco animais divididos em
experimentos independentes. O programa estatístico Microcal Origin 5.0 foi utilizado
através do teste-t de Student para amostras não paramétricas em todos os testes,
considerando o nível de significância de 5% (α=0,05) para pesquisas biológicas, ou seja, as
diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
Os resultados foram expressos como média±desvio padrão de no mínimo
cinco experimentos realizados em triplicatas para a análise da produção de todas as
citocinas e compostos reativos.
40
IV -
RESULTADOS
41
4.1 Determinação da viabilidade celular
A determinação da viabilidade celular foi realizada em células do exsudato
peritoneal de camundongos. As células foram mantidas em cultivo por 24 horas em meio de
cultura RPMI-1640C. Os resultados obtidos foram expressos em percentual de viabilidade
como média ± desvio padrão de 5 animais.
A Figura 6 mostra que as três primeiras diluições da tintura-mãe de Arnica
montana L. AM1, AM2 e AM3 apresentam elevada citotoxicidade, apresentando índices
baixos de viabilidade celular quando comparadas ao controle negativo de meio RPMI-
1640C (100%). A porcentagem de viabilidade dos macrófagos em contato com a tintura-
mãe de Arnica montana L. (AM1) foi de apenas 5%; as diluições seguintes AM2 (1:2) e
AM3 (1:10) ainda apresentaram citotocixidade, onde 8% e 29% dos macrófagos
permaneceram viáveis na presença dessas diluições, respectivamente. Enquanto que as
demais preparações fitoterápicas AM4 (1:100), AM5 (1:10
4
), AM6 (1:10
6
), AM7 (1:10
12
),
AM8 (1:10
24
) e AM9 (1:10
60
) obtiveram índices entre 69% a 98% de viabilidade.
Entretanto, todas as preparações homeopáticas apresentaram índices altos de viabilidade,
todos superiores a 96% como mostrados na Figura 7.
42
0
25
50
75
100
125
AM1
AM2
AM3
AM4
AM5
AM6
AM7
AM8
AM9
RPMI
Viabilidade celular (%)
Figura 6 – Viabilidade das células do exsudato peritoneal de camundongos
Swiss frente às preparações fitoterápicas de Arnica montana L. As células do
exsudato peritoneal foram cultivadas em presença das diluições (AM1, AM2,
AM3, AM4, AM5, AM6, AM7, AM8 e AM9) provenientes da tintura-mãe de
Arnica montana. RPMI equivale a 100% de viabilidade. Os valores obtidos
referem-se a 5 experimentos realizados em triplicata e expressos em percentual
(%) como média ± desvio padrão.
*p<0,05 comparado com o RPMI.
0
25
50
75
100
125
6 CH
12 CH
30 CH
LPS
Sol.
H idroal.
RPM I
Viabilidade celular (% )
Figura 7 - Viabilidade das células do exsudato peritoneal de camundongos
Swiss frente às preparações homeopáticas de Arnica montana. As células do
exsudato peritoneal foram cultivadas em presença das preparações homeopáticas
(6CH, 12CH e 30CH) provenientes da tintura-mãe de Arnica montana L., ou na
presença de LPS, bem como do meio RPMI contendo 5% de álcool etílico. Os
valores obtidos referem-se a 5 experimentos realizados em triplicata e expressos em
percentual (%) como média ± desvio padrão.
*p<0,05 comparado com RPMI.
*
*
*
*
*
*
*
43
4.2 Determinação de H
2
O
2
A determinação da liberação de peróxido de hidrogênio H
2
O
2
foi realizada
em sobrenadantes obtidos da cultura de células do exsudato peritoneal, após 1 h de
incubação com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7, AM8 e AM9) e
homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica montana L., onde o controle
negativo é constituído por solução de vermelho de fenol e o controle positivo por zymosan
a 10µg/ml.
Embora o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) proveniente da explosão oxidativa
mitocondrial dos macrófagos realize papel fundamental na atividade bacteriana destas
células; as células do exsudato peritoneal dos camundongos Swiss em contato com as
preparações fitoterápicas e homeopáticas não apresentaram capacidade de produção de
H
2
O
2
quando comparado ao zymosan (157,63 ± 12,91), dados mostrados na Figura 8. A
Figura 9 também mostra que nenhuma das preparações fitoterápicas e homeopáticas
exerceram influência na produção do peróxido de hidrogênio induzido pelo PMA.
Foram calculadas as porcentagens de inibição, através de comparação com o
controle positivo, nos experimentos onde as preparações fitoterápicas e homeopáticas
apresentaram efeitos inibitórios sobre a produção de H
2
O
2.
A equação abaixo foi utilizada
para o cálculo:
% inibição = 100 – (A . 100/B), onde A é o valor obtido pela preparação teste e B
representa o valor obtido pelo controle positivo da reação.
44
0
50
100
150
200
ZM
CN
AM4
AM5
AM6
AM7
AM8
AM9
6 CH
12 CH
30 CH
Concentração de H2O2
(nmols/2x10 células)
------------fitoterápica------- --homeopática-
Figura 8- Produção de peróxido de hidrogênio por células do exsudato peritoneal
cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana L. As
células peritoneais obtidas de camundongos Swiss foram cultivadas em placas de
microtitulação. Como controle positivo usou-se zymosan (ZM a 10µg/ml). A concentração
de H
2
O
2
foi obtida através de uma reta padrão previamente estabelecida. Os resultados
foram expressos em nmols como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco
experimentos. p<0,05 comparado ao ZM.
0
10
20
30
40
50
PMA
CN
AM4 + PMA
AM5 + PMA
AM6 + PMA
AM7 + PMA
AM8 + PMA
AM9 + PMA
6 CH + PMA
12 CH + PMA
30 CH + PMA
Concentração de H2O2
(nmols/2x10células)
--------fitoterápica-------- --homeopática-
Figura 9- Verificação do efeito inibitório da produção de peróxido de hidrogênio
por células do exsudato peritoneal cultivadas com preparações fitoterápicas e
homeopáticas de Arnica montana L. As células peritoneais obtidas de camundongos
Swiss foram cultivadas em placas de microtitulação. Como controle positivo usou-se
o PMA 0,2µM. A concentração de H
2
O
2
foi obtida através de uma reta padrão
previamente estabelecida. Os resultados foram expressos em nmols como a média ±
desvio padrão de triplicata de cinco experimentos p<0,05 comparado ao PMA.
45
4.3 Determinação de NO
A determinação do NO pelo reagente de Griess foi realizada em
sobrenadantes obtidos da cultura de células do exsudato peritoneal com as preparações
fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7, AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e
30CH) obtidas de Arnica montana L., onde o controle negativo é constituído por meio
RPMI-1640C e LPS 10µg/ml como controle positivo da reação. Das preparações
fitoterápicas, apenas AM4 (32,09±0,97), AM5 (29,21±0,87) e AM6 (11,49±0,43) foram
capazes de promover liberação de óxido nítrico, com valores significativos quando
comparado ao LPS (67,07 ± 3,63) (Figura 10).
A Figura 11 mostra que não houve liberação de NO pelas preparações
homeopáticas 6CH, 12CH e 30CH, mas quando em adição ao LPS foram capazes de
reduzir a produção de NO em 13,91%; 11,85%; 7,26%; respectivamente em cultura de
células do exsudato peritoneal de camundongos (Tabela 1).
46
0
25
50
75
LPS
CN
AM4
AM5
AM6
AM7
AM8
AM9
Concentração de NO
(mmols NO/5x10 células)
Figura 10- Produção de óxido nítrico por células do exsudato peritoneal cultivadas
com preparações fitoterápicas de Arnica montana L. As células peritoneais obtidas de
camundongos Swiss foram cultivadas em placas de microtitulação. O meio RPMI-1640-C
foi usado como controle negativo da reação (CN), como controle positivo usou-se LPS a
10µg/ml. A concentração de NO foi obtida através de uma reta padrão previamente
estabelecida. Os resultados foram expressos em µmols como a média ± desvio padrão de
triplicata de cinco experimentos.
*p<0,05 comparado ao LPS
0
25
50
75
LPS
CN
6 CH
12 CH
30 CH
6 CH + LPS
12 CH + LPS
30 CH + LPS
Concentração de NO
(mmols NO/5x10 células)
---------------produção---------- ---inibição---
Figura 11- Produção e inibição de óxido nítrico por células do exsudato
peritoneal cultivadas com preparações homeopáticas de Arnica montana. As
células peritoneais obtidas de camundongos Swiss foram cultivadas em placas de
microtitulação com meio RPMI-1640-C, usado também como controle negativo da
reação (CN). Como controle positivo usou-se LPS a 10µg/ml. A concentração de
NO foi obtida através de uma reta padrão previamente estabelecida. Os resultados
foram expressos em µmols como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco
experimentos. * p<0,05 comparado ao LPS
*
*
*
*
*
*
47
Tabela 1. Efeito inibitório das preparações homeopáticas de Arnica montana na produção
de NO em cultura de macrófagos estimulados por LPS.
Preparações média ± desvio padrão
a
% de inibição
RPMI + LPS
6CH + LPS
67,07 ±3,63
57,74 ±2,61
0
13,91%
12CH + LPS 59,12±3,25 11,85%
30CH + LPS 62,20± 2,68 7,26%
a
p<0,05 comparado à média ± desvio padrão de LPS (67,07±3,63)
Foram calculadas as porcentagens de inibição, através de comparação com
os controles, nos experimentos onde as preparações homeopáticas apresentaram efeitos
inibitórios sobre a produção de NO. A equação abaixo foi utilizada para o cálculo:
% inibição = 100 – (A . 100/B), onde A é o valor obtido pela preparação teste e B
representa o valor obtido pelo controle positivo da reação.
4.4 Determinação de TNF-α
48
A determinação do Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α) foi realizada em
sobrenadantes obtidos da cultura de células do exsudato peritoneal com as preparações
fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7, AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e
30CH) obtidas de Arnica montana; onde o controle é constituído por meio RPMI-1640C e
LPS 10µg/ml como controle positivo da reação. Das preparações fitoterápicas, apenas
AM4 (53,50±5,17), AM5 (49,97±6,05) e AM6 (44,82±3,88) foram capazes de promover
liberação de TNF-α, com valores significativos quando comparado ao LPS (172,48 ± 5,59),
conforme mostrado na Figura 12.
A Figura 13 mostra que houve baixa liberação de TNF-α pelas preparações
homeopáticas 6CH (11,09 ±0,83), 12CH (9,87±0,96) e 30CH (9,22± 0,78), mas quando em
adição ao LPS foram capazes de reduzir a produção de TNF-α em cultura de células do
exsudato peritoneal de camundongos (Tabela 2).
49
0
50
100
150
200
250
LPS
CN
AM4
AM5
AM6
AM7
AM8
AM9
Concentração de TNF
(pg/mL)
Figura 12- Produção de TNF-α por células do exsudato peritoneal cultivadas
com preparações fitoterápicas de Arnica montana L. As células peritoneais obtidas
de camundongos Swiss foram cultivadas em placas de microtitulação com meio
RPMI-1640-C, usado também como controle negativo da reação (CN). Como
controle positivo usou-se LPS a 10µg/ml. A concentração de TNF-α foi obtida
através de uma reta padrão previamente estabelecida. Os resultados foram expressos
em pg/mL como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco experimentos.
*p<0,05 comparado ao LPS
0
50
100
150
200
250
LPS
CN
6 CH
12 CH
30 CH
6 CH + LPS
12 CH + LPS
30 CH + LPS
Concentração de TNF
(pg/mL)
-----------------produção---------- -----inibição---
Figura 13- Produção de TNF-α por células do exsudato peritoneal cultivadas com
preparações homeopáticas de Arnica montana L. As células peritoneais obtidas de
camundongos Swiss foram cultivadas em placas de microtitulação com meio RPMI-
1640-C, usado também como controle negativo da reação (CN). Como controle positivo
usou-se LPS a 10µg/ml. A concentração de TNF-α foi obtida através de uma reta padrão
previamente estabelecida. Os resultados foram expressos em pg/mL como a média ±
desvio padrão de triplicata de cinco experimentos.
*p<0,05 comparado ao LPS (159,62 ± 5,59)
*
*
*
*
*
*
50
Tabela 2. Efeito inibitório das preparações homeopáticas de Arnica montana na produção
de TNF-α em cultura de macrófagos estimulados por LPS.
Preparações média ± desvio padrão
% de inibição
RPMI + LPS
159,62 ± 5,59
0
6CH + LPS 131,33 ±7,64
a
17,70
b
12CH + LPS 127,48±6,21
a
20,10
b
30CH + LPS 132,76± 7,90
a
16,80
b
a
p<0,05 comparado à média ± desvio padrão de RPMI+LPS
b
Resultado comparado aos valores do controle positivo LPS
51
4.5 Determinação do IFN- γ
A determinação de IFN-γ foi realizada nos sobrenadantes das culturas de células
esplênicas de camundongos Swiss com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5, AM6,
AM7, AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica montana;
onde o controle é constituído por meio RPMI-1640C e ConA 0,5µg/ml como controle
positivo da reação. Das preparações fitoterápicas, apenas AM4 (4,88±0,86), AM5
(3,74±1,35) e AM6 (1,68±0,61) foram capazes de promover liberação de IFN-γ. As
preparações homeopáticas 6CH (1,39 ±0,93), 12CH (1,30±0,62) e 30CH (2,79± 0,58)
também promoveram pequena liberação de IFN-γ, com valores significativos quando
comparado a ConA 0,5µg/ml (10,53 ± 1,41), dados mostrados na Figura 14.
0
5
10
15
ConA
CN
AM4
AM5
AM6
AM7
AM8
AM9
6 CH
12 CH
30 CH
Concentração de IFN-g
(pg/mL)
--------fitoterápica-------- --homeopática-
Figura 14- Produção de interferon gama (IFN-γ) por células
esplênicas cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de
Arnica montana L. As células esplênicas foram obtidas de camundongos
Swiss e cultivadas em placas de microtitulação com meio RPMI-1640-C,
usado também como controle negativo da reação. Como controle positivo
usou-se ConA a 0,5µg/ml. A concentração de IFN-γ foi obtida através de
uma reta padrão previamente estabelecida. Os resultados foram expressos
em pg/mL como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco
experimentos. *(p<0,05 comparado com ConA)
*
*
*
*
*
*
52
4.6 Determinação da IL-4
A determinação de IL-4 foi realizada nos sobrenadantes das culturas de
células esplênicas de camundongos Swiss com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5,
AM6, AM7, AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica
montana L.; onde o controle é constituído por meio RPMI-1640C e ConA 0,5µg/ml como
controle positivo da reação. Conforme Figura 15, o contato com as preparações
fitoterápicas e homeopáticas não induziu a liberação de IL-4.
0
3
6
9
12
ConA
CN
AM4
AM5
AM6
AM7
AM8
AM9
6CH
12CH
30CH
Concentração IL-4 (pg/mL)
--------fitoterápica-------- --homeopática-
Figura 15- Produção de interleucina-4 por células esplênicas
cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica
montana. As células esplênicas foram obtidas de camundongos Swiss e
cultivadas em placas de microtitulação com meio RPMI-1640-C, usado
também como controle negativo da reação (CN). Como controle positivo
usou-se ConA a 0,5µg/ml. A concentração de IFN-γ foi obtida através de
uma reta padrão previamente estabelecida. Os resultados foram expressos
em pg/mL como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco
experimentos.
*p<0,05 comparado com ConA
53
4.7 Determinação de IL-6
A determinação de IL-6 foi realizada nos sobrenadantes das culturas de
células peritoneais aderentes com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7,
AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica montana L.; onde o
controle é constituído por meio RPMI-1640C e LPS 10µg/ml como controle positivo da
reação. Das preparações fitoterápicas, apenas AM4 (209,74±86,12), AM5 (162,36±39,86),
AM6 (87,94±43,00) e AM7 (69,74±31,26) foram capazes de promover liberação de IL-6.
As preparações homeopáticas 6CH (51,16 ±16,79), 12CH (52,44±17,38) e 30CH (48,23±
14,04) também promoveram a liberação de IL-6, quando comparado a LPS 10µg/ml
(428,12 ± 81,82), dados mostrados na Figura 16.
0
120
240
360
480
600
LPS
CN
AM4
AM5
AM6
AM7
AM8
AM9
6 CH
12 CH
30 CH
Concentração de IL-6
(pg/mL)
--------fitoterápica-------- --homeopática-
Figura 16- Produção de IL-6 por células do exsudato peritoneal (PEC)
cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica
montana. As células peritoneais foram obtidas de camundongos Swiss. O
meio RPMI-1640-C foi usado como controle negativo da reação (CN) e como
controle positivo usou-se LPS a 10µg/ml. Os resultados foram expressos em
pg/mL como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco experimentos.
*p<0,05 comparado com LPS
54
4.8 Determinação de IL-1
A determinação de IL-1 foi realizada nos sobrenadantes das culturas de
células peritoneais aderentes com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7,
AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica montana L.; onde o
controle é constituído por meio RPMI-1640C e LPS 10µg/ml como controle positivo da
reação. Nenhuma das preparações testadas é capaz de promover a liberação de IL-1 (Figura
17).
0
50
100
150
200
LPS
CN
AM4
AM5
AM6
AM7
AM8
AM9
6CH
12CH
30CH
Concentração IL-1 (pg/mL)
--------fitoterápica-------- --homeopática-
Figura 17- Produção de IL-1 por células do exsudato peritoneal (PEC)
cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica
montana. As células peritoneais foram obtidas de camundongos Swiss. O
meio RPMI-1640-C foi usado como controle negativo da reação (CN) e
como controle positivo usou-se LPS a 10µg/ml. Os resultados foram
expressos em pg/mL como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco
experimentos.
*p<0,05 comparado com LPS
55
4.9 Determinação de IL-12
A determinação de IL-12 foi realizada nos sobrenadantes das culturas de
células peritoneais aderentes com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7,
AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica montana; onde o
controle é constituído por meio RPMI-1640C e LPS 10µg/ml como controle positivo da
reação. Nenhuma das preparações testadas foi capaz de promover a liberação de IL-12
(Figura 18).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
LPS
CN
AM4
AM5
AM6
AM7
AM8
AM9
6CH
12CH
30CH
Concentração IL-12(pg/mL)
Figura 18- Produção de IL-12 por células do exsudato peritoneal
(PEC) cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de
Arnica montana. As células peritoneais foram obtidas de camundongos
Swiss. O meio RPMI-1640-C foi usado como controle negativo da reação
(CN) e como controle positivo usou-se LPS a 10µg/ml. Os resultados
foram expressos em pg/mL como a média ± desvio padrão de triplicata de
cinco experimentos.
*p<0,05 comparado com LPS
56
V -
DISCUSSÃO
57
A pesquisa laboratorial com medicamentos homeopáticos é muito escassa e
enfrenta ainda questionamentos sobre a metodologia aplicada. O uso de modelos com
plantas ou animais permite a observação de respostas diretas, as quais eliminam a
subjetividade em relação ao efeito placebo, sendo esta a principal crítica aos estudos com
humanos (HAMMAN, 2003).
O emprego de plantas medicinais de ação supostamente inofensiva à saúde
pode muitas vezes ser responsável por resultados desastrosos, já que, ocasionalmente, uma
mesma planta pode apresentar tanto uma ação terapêutica quanto tóxica, conforme dose e
modo de preparo (ANKE et al., 2004).
O não cumprimento dos limites de uso dos fitoterápicos representa cada vez
mais um risco para a saúde humana. Estudos multidisciplinares, associando fitoquímicos e
farmacológicos, tornam-se cada vez mais importantes para a definição dos potenciais
terapêuticos e tóxicos de extratos vegetais (MACIEL et al., 2002).
A ativação de macrófagos e células T por estresse oxidativo e a secreção de
citocinas pró-inflamatórias contribuem significativamente para a progressão da ativação do
sistema imunitário e inflamação (HULLAN et al., 2003). A resposta inflamatória consiste
da liberação seqüencial de mediadores e do recrutamento de leucócitos circulantes
(HANADA, 2002).
Durante o processo inflamatório as células apresentadoras de antígenos
como macrófagos e células dendríticas exercem um papel principal nos mecanismos pró-
inflamatórios, garantindo a eliminação da causa infectiva, tóxica ou alérgica, sendo muito
importante para a homeostase e integridade do tecido (GOERDT, 1999).
58
No entanto, é obrigatório que o processo inflamatório, uma vez induzido,
não aumente progressivamente, mas sim, seja regulado e diminuído para permitir a cura. A
ação descontrolada de enzimas proteolíticas e o processamento de mediadores químicos e
radicais livres podem agravar a situação em alguns casos. Há muito tempo que pesquisas
sobre a biologia da inflamação têm sido focadas sobre ações pró-inflamatórias de fagócitos
mononucleares, incluindo processamento e apresentação de antígeno e secreção de
citocinas (GOERDT, 2004).
Os ensaios de citotoxicidade medem a concentração de substâncias capazes
de interagir com estruturas e vias bioquímicas celulares que podem ter algum reflexo in
vivo. Nesse trabalho, determinou-se a viabilidade dos macrófagos peritoneais após contato
com as preparações de Arnica montana L. A definição da viabilidade celular, nos ensaios
realizados, tem como conseqüência assegurar a capacidade de uma resposta imune-celular.
Entre as preparações testadas, utilizando 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
brometo de difenil-tetrazólio (MTT), as que apresentaram maior potencial de toxicidade, ou
seja, menor porcentagem de viabilidade celular foram a tintura-mãe AM1 (5%) e as
menores diluições estudadas AM2 (8%) e AM3 (29%) (Figura 6). Esta metodologia é
baseada na redução de um sal de tetrazólio amarelo solúvel por enzimas microssomais e
também pela enzima succinato desidrogenase mitocondrial das células viáveis. Essa
redução gera a formazana, um produto insolúvel de cor púrpura que se acumula nas células
devido à sua incapacidade de atravessar a membrana celular (MOSMANN, 1983).
Esse dado é justificado na literatura pela presença de compostos como
lactonas sesquiterpênicas (helenalina), que possuem conhecida atividade alergizante e
tóxica conferida pela dupla ligação no núcleo β-lactona de helenalina (CAPASSO et al.,
59
2000; SIEDLE, 2003; JOHANSSON, 2002), óleos esssencias, taninos e alcalóides
pirrolizidínicos (tusilagina, isotusilagina) com conhecida ação citotóxica e carcinogênica
(MARTINS et al, 2000; AGRAWAL, 1985), são responsáveis por causarem dermatite de
contato, hepatotoxicidade, irritação gastrintestinal (SIMÕES et al., 1986), dispnéia e falha
cardíaca (a helenalina apresenta efeito inotrópico por ação simpaticomimética indireta)
(PERIS et al., 1995).
Diversas substâncias isoladas de vegetais considerados medicinais possuem
atividades citotóxica ou genotóxica e mostram relação com a incidência de tumores
(AMES, 1983). Estudos farmacológicos mostraram que os diterpenos transformados pelo
citocromo P450 em metabólitos hepatotóxicos, podem causar apoptose em hepatócitos de
ratos pela captura de tióis e aumento da concentração de cálcio, com ativação das enzimas
transglutaminase e endonuclease dependentes de cálcio (FAU et al., 1997).
Como exemplo de planta que contém substâncias com conhecidos efeitos
tóxicos pode ser citada o confrei (Symphytum officinale L.), utilizada na medicina
tradicional como cicatrizante, devido à presença da alantoína, mas também possui
alcalóides pirrolizidínicos os quais são comprovadamente hepatotóxicos e carcinogênicos
(BUCKEL, 1998).
A arruda (Ruta graveolens L.), que pode provocar aborto, fortes
hemorragias, irritação da mucosa bucal e inflamações epidérmicas, é outro importante
exemplo. Estudos também apontam um possível efeito adverso abortivo da espinheira-santa
(Maytenus ilicifolia L.), planta medicinal de comprovada baixa toxicidade e ação anti-
ulcerogênica, antiinflamatória e antinoniceptiva
(OLIVEIRA, 1991).
60
Com relação à determinação de viabilidade celular com as preparações
homeopáticas, foi observado um perfil não citotóxico (Figura 7), como pressuposto por
essas preparações derivarem de diluições infinitesimais, sendo esta a intenção original de
Hahnemann: usar o processo de diluição para reduzir os efeitos tóxicos dos medicamentos
(JONAS, 1996). Assim, o tratamento homeopático permite ao indivíduo restabelecer a
saúde e prevenir a doença sem, no entanto, produzir os efeitos colaterais experimentados
por muitos dos tratamentos convencionais (ULLMAN, 1995).
Vários estudos utilizando culturas de macrófagos peritoneais frente a
produtos naturais como Davilla elliptica St. Hill. (CARLOS et al., 2005), Echinacea
purpurea N. (BURGER et al., 1997), Platycodon grandiflorum H. (CHUL et al., 2001),
Panax ginseng L. (SONG et al., 2002), demonstraram eficácia quanto à capacidade de
resposta dessa célula. O macrófago é uma célula que se encontra presente em todos os
tecidos do organismo e apresenta funções importantes no sistema imunológico. A ingestão
de partículas estranhas e seu processamento levam à ativação do sistema imunológico
através da apresentação de antígenos aos linfócitos (outra célula de grande importância na
resposta imunológica), da secreção de substâncias (como citocinas e quimiocinas) capazes
de regular o sistema imunológico e da elaboração de substâncias capazes de destruir outras
células e organismos (ABBAS et al., 2000).
Nosso estudo investigou o efeito de Arnica montana L. em preparações
fitoterápicas e homeopáticas de acordo com o grau de citotoxicidade de todas as
preparações testadas. Nesse sentido foram utilizadas as diluições AM4, AM5, AM6, AM7,
AM8, AM9 e as homeopáticas 6CH, 12CH e 30CH para verificar os efeitos sobre as células
61
mediadoras da resposta imunológica, macrófagos e linfócitos, através da determinação da
liberação de H
2
O
2
, NO, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-6, IL-1e IL-12.
O sistema imunológico é um considerável mecanismo de defesa no
organismo. Seu papel não é apenas o de proteger contra infecções microbianas, mas
também atua na prevenção do câncer, inibindo o crescimento de células tumorais
(HUANG, 1999).
Os macrófagos ativados são capazes de secretar mais de cem produtos
biologicamente ativos, dentre eles enzimas, componentes do complemento, fatores de
coagulação, espécies reativas de nitrogênio como o NO, citocinas, etc (PARSLOW et al.,
2000).
Entre os produtos secretados pelos macrófagos, estão os reativos
intermediários do oxigênio e nitrogênio (ZWILLING E EISENSTEIN, 1994). Espécies
reativas do oxigênio podem ter papéis diferentes na célula, dependendo de suas
concentrações relativas e também do acesso aos sítios celulares (RAMASARMA, 1990).
Um severo “stress” oxidativo está associado com disfunções celulares, resultando na
ativação de mecanismos de reparo, apoptose e até necrose das células (FORMAN e
TORRES, 2001).
A determinação de H
2
O
2
liberado nos sobrenadantes das culturas de células
do exsudato peritoneal baseou-se na oxidação do vermelho de fenol mediado pela
peroxidase de raiz forte. As principais vantagens desse método são as pequenas quantidades
de reagentes e células utilizados, a sensibilidade e reprodutibilidade, o grande número de
materiais possíveis de serem testados e especialmente a velocidade e conveniência
oferecida pelo leitor de ELISA automático.
62
A enzima NADPH oxidase presente na membrana plasmática e responsável
pela conversão do oxigênio (O
2
) ao ânion superóxido (O
2.
-
) e depois a H
2
O
2
pela SOD
(HAMPTON et al., 1998), pode ser rapidamente ativada por estímulos como os agonistas
que interagem com receptores específicos na superfície celular de macrófagos, como
partículas opsonizadas, cadeias de peptídeos de microrganismos (zymosan) e também pode
ser ativada pelos agonistas de proteína quinase C como o PMA (“phorbol myristate
acetate”).
Os ensaios imunológicos realizados neste trabalho mostraram a não
produção de H
2
O
2
quando comparada ao controle positivo da reação (zymosan) para as
preparações fitoterápicas e homeopáticas (Figura 8). Este estudo também mostrou que
nenhuma das preparações teve ação na produção ou inibição do peróxido de hidrogênio
induzida pelo PMA (Figura 9).
O H
2
O
2
é gerado em condições fisiológicas, em pequenas quantidades e é
rapidamente utilizado ou degradado, mas longas exposições a altas concentrações deste
mediador podem destruir estruturas biológicas e levar a um dano celular irreversível. O
H
2
O
2
é tóxico para as células e é também responsável pela morte das bactérias fagocitadas
(RAMASARMA, 1990).
Estudos mostram que o H
2
O
2
suprime a resposta imunológica, levando à
atividade imunossupressora de linfócitos esplênicos de ratos quando induzidos por LPS
(LEE & YEA, 2000). Por outro lado, Nascimento et al. (1998) verificaram que a atividade
antitumoral de macrófagos não depende da liberação de H
2
O
2
. Estudos sobre a ativação de
macrófagos peritoneais pela determinação da liberação de H
2
O
2
frente a diversos produtos
naturais obtidos de plantas como Paepalanthus sp (MOREIRA el al., 2000), Styrax
63
camporum Pohl (MARQUES, 2003), Alchornea ssp (BARROS, 2004), Davilla elíptica St.
Hill (CARLOS, 2005) são cada vez mais freqüentes e categorizados como potentes agentes
moduladores da resposta imunológica.
A ativação de macrófagos é acompanhada pelo aumento de diversas
propriedades, como aumento da capacidade de aderência, fagocitose e produção de
compostos reativos e citocinas (SELIGMANN, 2003), o que lhes confere poder
microbicida e tumoricida (BASU, 2006). Macrófagos podem executar esta função de uma
maneira direta, envolvendo a liberação de produtos como radicais de oxigênio e nitrogênio
e TNF-α que são prejudiciais aos microrganismos e para células tumorais. Ou ainda, eles
podem ter uma ação indireta nestas atividades pela secreção de citocinas, as quais sinalizam
outras células como os linfócitos T, ou por processamento e apresentação de antígenos,
regulando o sistema imunológico e envolvendo-se no processo infeccioso, na modulação da
resposta imune e na inflamação (HONG et al., 2005).
O NO é uma molécula mensageira envolvida na regulação de diversos
processos fisiológicos, incluindo a contração da musculatura lisa, a reatividade plaquetária,
a neurotransmissão central e periférica e as ações citotóxicas de células imunológicas. Essa
molécula é crucial para muitas funções fisiológicas e a sua liberação inapropriada está
ligada a numerosas patologias (HOBBS et al., 1999).
Embora a produção e ação do NO sejam evidentes durante o processo
inflamatório, a rede de seus efeitos é ainda parcialmente conhecida. Sabe-se que o tempo da
sua síntese em resposta a diversos estímulos, bem como os níveis de sua produção, seu
estado de oxidação e a presença ou não de certos mediadores definem um efeito citotóxico
pró-inflamatório ou antiinflamatório (ROTTERBERG & ÖRN, 1997).
64
A determinação de NO foi realizada nesse trabalho, segundo a capacidade
que o NO tem de sofrer rápida degradação oxidativa em solução aquosa, formando nitrito
(NO
2
-
), que é determinado pelo reagente de Griess. A reação acontece primeiramente com a
sulfanilamida (reação de diazotização) em meio ácido, formando um composto que reage
com o naphtiletilenodiamino, formando em seguida um derivado azo colorido prontamente
monitorado em espectroscopia de UV/Visível com absorbância máxima em 548nm a pH
2.0. O meio ácido favorece a reação de diazotização, melhorando o rendimento na leitura
espectrofotométrica (MALINSKI, 1996).
Os resultados obtidos nesse trabalho (Figura 10) mostram que as
preparações fitoterápicas AM4, AM5 e AM6 foram capazes de promover a liberação de NO
em cultura de macrófagos peritoneais, resultado este não obtido pelas preparações
homeopáticas. Portanto foi verificada a presença de inibição das mesmas em presença de
LPS (Figura 11). As preparações fitoterápicas e homeopáticas notoriamente atuam de
maneira diferente, enquanto que a primeira estimula, a segunda inibe.
Portanto, na estimulação de macrófagos por essas diferentes preparações de
arnica nota-se que as preparações homeopáticas agem exatamente ao contrário das
preparações fitoterápicas (mas de acordo com o seu princípio de similitude), reduzindo,
mesmo que discretamente, níveis altos de NO produzido pela estimulação do LPS. Segundo
este princípio, uma droga atua de forma terapêutica quando produz em uma pessoa
saudável, sintomas semelhantes aos de uma pessoa doente. Assim, uma pessoa intoxicada
com arsênico, por exemplo, pode ser tratada com arsenicum, preparação homeopática
derivada de diluições deste mesmo mineral (BOERICKE, 1997).
65
O objetivo da homeopatia é estimular os mecanismos de cura do próprio
corpo. A meta da terapia homeopática é promover e orientar a reação de autocura inata do
corpo. Os remédios não são dados para eliminar a causa de uma doença ou para vencer um
determinado agente patológico. Não é o medicamento em si que cura a doença, mas a
reação dos mecanismos de cura do corpo ao medicamento que leva à melhora.
Portanto, agentes que modulem a atividade do NO podem ser de
considerável valor terapêutico. Em particular aqueles capazes de reduzir a formação de NO,
podem ser benéficos em estados patofisiológicos onde a produção excessiva de NO é um
fator contribuinte, como é o caso das doenças inflamatórias (HOBBS et al., 1999).
O conhecimento existente do papel do NO nos estados fisiológicos e
patofisiológicos abriu uma gama de possibilidades, especialmente no entendimento dos
mecanismos de ação de medicamentos que modulam a ação desse mediador. A ativação da
iNOS leva à produção de níveis micromolares de NO, quantidade muito maior do que o
nível nanomolar gerado pela enzima constitutiva eNOS ou nNOS (ACHIKE e KWAN,
2003).
Grande atenção tem sido dada à molécula de óxido nítrico atualmente, sendo
que vários experimentos utilizando extratos, frações ou substâncias puras obtidas de plantas
mostraram interferir com a produção de óxido nítrico. O extrato padronizado de Gingko
biloba L. (EGb 761) inibiu a produção de NO e a expressão da iNOS em macrófagos RAW
264.7 estimulados com LPS e IFN-γ (KOBUCHI et al., 1997). Alicina e ajoeno, dois
composto obtidos do alho (Allium sativum L.) inibiram a produção de NO e a expressão da
iNOS em macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS (DIRSCH et al., 1998; PAN,
2000).
66
Resultados de diversos experimentos indicam a possibilidade de que a
produção de NO em excesso diminui a expressão da proteína iNOS para prevenir
autotoxicidade celular. Um possível mecanismo para esse “feedback” inibitório da síntese
da proteína iNOS pelo NO pode ser atribuído a fosforilação mediada por NO de uma
molécula regulatória chave na maquinaria transducional, o NF-κB (HAN et al,2001).
Os flavonóides como o picnogenol extraído da Pinus maritma apresentam
efeitos biológicos na modulação da síntese de iNOS ou mesmo de espécies reativas de
nitrogênio (PAKER et al, 1999). De forma semelhante os flavonóides presentes em Silybum
marianum L. são capazes de ativar uma resposta inflamatória, mas promovem supressão da
função dos linfócitos T quando baixas doses são administradas em camundongos
(JOHNSON et al., 2003).
Diterpenóides de Sideritis javalambrensis foram isolados por Heras & Hoult
(1994), que atribuíram a esses compostos a propriedade antiinflamatória e gastroprotetora
desta planta utilizada tradicionalmente na Espanha. Em trabalho semelhante, o extrato
aquoso de Spiraea prunifolia, largamente usado na medicina chinesa, também apresentou a
capacidade de promover um efeito inibitório sobre a síntese de NO (HONG-SEOB el al.,
1999).
Outros estudos mostram que extratos obtidos de Polygonum tinctorium
Aiton são capazes de inibir a síntese de NO em macrófagos peritoneais murinos
(ISHIHARA et al., 2000). Resultados semelhantes foram obtidos por Kim et al. (2001),
onde compostos extraídos de Scutellaria baicalensis N. apresentaram efeitos
antiinflamatórios também por inibir a produção de NO e prostaglandina E2 em macrófagos.
A inibição da produção de NO foi acompanhada pela supressão da iNOS.
67
O produto natural epigallocatequina gallate, obtido do chá verde com
atividade antiinflamatória, antioxidativa e anticarcinogênica tem se mostrado um eficiente
inibidor da expressão do gene de iNOS (CHAN et al. 1997). Da mesma maneira alguns
efeitos antiinflamatórios dos extratos do fruto de Evodia rutaecarpa Hook foram
examinados por Chiou et al. (1997) através da produção de NO em macrófagos murinos,
cujos resultados indicaram uma inibição na produção de NO mesmo em presença de IFN-γ
e LPS, que são considerados potentes ativadores dessa molécula, indicando assim uma
interferência na síntese da iNOS.
Atualmente, existe uma forte tendência em se estudar compostos naturais
que possam participar na modulação do sistema imunológico, demonstrado pela liberação
de mediadores por macrófagos. Diferentes classes de substâncias têm sido relatadas como
sendo agentes imunoestimulantes.
Outro dado aqui obtido, mostra a liberação de TNF-α por macrófagos
peritoneais induzidos pelas preparações fitoterápicas de Arnica montana L. AM4, AM5 e
AM6; as mesmas responsáveis pela liberação de NO (Figura 12). Assim, observa-se uma
relação entre as sínteses de NO e TNF-α. Pois o aumento da produção de NO se deve, entre
outros fatores, à indução de mediadores pró-inflamatórios como TNF-α. Por outro lado, as
preparações homeopáticas, apesar de não promoverem a liberação de NO, conseguiram
influenciar na produção de TNF-α, liberando baixas concentrações deste mediador e,
quando em associação ao LPS, diminuíram sua produção estabelecida por esse agente
estimulante, portanto inibindo-o (Figura 13). Deste modo, as preparações homeopáticas
podem atuar no equilíbrio da produção de TNF-α. E como já detalhado anteriormente, as
68
preparações homeopáticas apresentam características que divergem do mecanismo de ação
farmacológica de um fitoterápico.
No início da cascata de ativação, duas quinases conhecidas como IκKα e
IκKβ são ativadas para formar um dímero (IκK) que fosforila uma proteína inibidora
conhecida como IκB. Essa proteína está ligada em um complexo no citosol, com o fator de
transcrição NFκB e inibe sua ação, retendo-o naquele local. Quando o dímero IκB é
fosforilado, ele dissocia-se do complexo e é rapidamente degradado por proteossomas.
Após a remoção de IκB, o NFκB entra no núcleo e liga-se a vários promotores, ativando
genes que contribuem para a imunidade adaptativa e para a secreção de citocinas pró-
inflamatórias. O próprio gene para o IκB também é ativado, sendo rapidamente sintetizado,
inativando o sinal NFκB (JANEWAY et al., 2000). Isso explica porque muitos genes que
respondem a ativações por LPS, incluindo TNF-α, compartilham seqüências gênicas
reconhecidas por NFκB para a ativação da expressão de algum outro gene como o da iNOS.
Um grande número de compostos naturais parece interferir com a cascata
que leva à ativação do NF-κB. O efeito de muitos extratos brutos obtidos de fontes naturais
pode ser agora explicado baseando-se no fato dessas plantas conterem agentes reguladores
do NF-κB, como os diterpenóides e as lactonas sesquiterpênicas. A sinalização envolvida
na inibição da síntese de citocinas é complexa e existem muitas abordagens que podem
efetivamente regular a expressão de TNF-α (PALLADINO et al., 2003).
O efeito antiinflamatório do extrato aquoso de Lonicera japonica Thumb.
foi investigado por Lee et al. (2001). Os autores verificaram inibição das sínteses de iNOS,
TNF-α e NF-kappaBp65 e da degradação de l-kappaBalfa; sugerindo que esta planta possa
69
atuar como agente terapêutico em doenças inflamatórias através de uma regulação seletiva
da ativação de NF-kappaB.
A redução na produção de TNF-α e de NO em cultura de macrófagos
tratados com curcumina, uma substância extraída da planta Curcuma longa L., foi
observada por Chan et al. 1998 que atribuíram esse fato à inibição do fator de transcrição
nuclear NF-kβ, através da prevenção da degradação do IκB que possui papel chave na
expressão de muitos genes relacionados com a inflamação. Rao & Ghosh (1999) também
atribuíram a não produção desses mediadores à inibição do mecanismo de transcrição
comum aos seus genes, para isso utilizaram cultura de macrófagos murinos tratados com
quercetina, o principal componente ativo da planta Rhododendron cinnabarium N.
O TNF-α atua em sinergismo com o IFN-γ na ativação macrofágica,
especialmente na indução de NO (JANEWAY et al, 2000). A produção de NO por
macrófagos peritoneais de ratos tratados com rIFN-γ ocorreu concomitantemente com a
liberação de TNF-α favorecida por Sinomenium acutum Rehder (KIM et al., 1999) e por
Taraxacum officinale Weber (KIM & CHUNG 1999). Do mesmo modo, resultados
condizentes foram observados em estudo do extrato de Ulmi radicis, onde os dados
sugerem que a capacidade do extrato em aumentar a produção de NO em macrófagos
peritoneais de ratos primeiramente tratados com IFN-γ é devido à liberação de TNF-α
induzida pelo próprio extrato (KIM & LEE, 1999).
Interação de proteínas de membrana com proteínas solúveis como as
citocinas, anticorpos, complemento e receptores sobre as células, representam os elementos
de comunicação da conversa cruzada das células do sistema imunitário (TRINCHERI,
1997).
70
O IFN-γ foi originalmente definido como um agente com ação antiviral, mas
suas propriedades incluem a regulação de vários aspectos da resposta imune, como a
estimulação da atividade microbicida dos macrófagos, estimulação da apresentação de
antígenos pelas moléculas do complexo de histocompatibilidade principal, coordenação e
as interações entre os leucócitos e o endotélio, efeitos na proliferação celular e na apoptose,
bem como na estimulação e repressão de vários genes cuja significância funcional ainda
permanece obscura (BOEHM et al., 1997).
As citocinas presentes durante a expansão de células T influenciam na
capacidade das células Th em diferenciar-se em células Th1 ou Th2 (TRINCHERI, 1997).
Esta dicotomia na resposta imune pode ser classificada didaticamente em resposta celular
ou humoral. A produção de citocinas como IFN-γ e IL-12 leva à resposta celular tipo Th1,
enquanto a IL-4, por exemplo, leva a resposta humoral do tipo Th2 (DREDGE et al., 2002).
Os macrófagos podem influenciar características Th1/Th2 da imunidade e responder a
ativação das células T e B através de interação celular e produtos solúveis como IFN-γ, IL-
4 e anticorpos que regulam atividades fagocíticas e microbicidas (GORDON, 1998).
O IFN-γ e IL-4 têm papéis importantes na efetivação das respostas Th1 e
Th2 respectivamente, e essas citocinas possuem ainda a função de serem antagonistas uma
da outra (PALUDAN et al., 1999). O desequilíbrio da resposta imune Th1/Th2 muitas
vezes é responsável pelo agravamento de uma doença (GOERDT, 1999).
Os resultados aqui apresentados revelam que as preparações fitoterápicas
AM4, AM5 e AM6 e homeopáticas 6CH, 12CH e 30CH são capazes de promover a
liberação de IFN-γ em cultura de células esplênicas (Figura 14). Resultado semelhante não
71
foi obtido nos ensaios de liberação da IL-4 (Figura 15), onde não foi detectada presença
desta interleucina.
As preparações fitoterápicas capazes de induzir a produção de NO por
macrófagos, também induzem a liberação de IFN-γ em cultura de células esplênicas. De
fato, IFN-γ estimula a indução da transcrição da óxido nítrico sintase (iNOS) e
conseqüentemente leva a uma indução na produção de NO (PALUDAN, 1999). Dessa
forma, a interação entre macrófagos e linfócitos e a liberação de citocinas e NO são
controles críticos nas reações imunes (HOLÁN et al., 2001).
Existem vários estudos laboratoriais sobre as diluições da homeopatia.
Preparações homeopáticas de interferon e hormônios podem aumentar a taxa de glóbulos
brancos e outras funções imunológicas em animais (JONAS, JACOBS, 1996). Existem
ainda minerais como silício, zinco e cálcio que, quando em preparações homeopáticas,
apresentam efeitos indutores no sistema imunitário (HARISCH; 1988; 1989).
A interleucina 4 (IL-4) é uma citocina pleiotrópica que exerce uma grande
variedade de efeitos sobre diferentes tipos de células do sistema imunitário. Ela afeta
granulócitos, fibroblastos, células endoteliais e células B, além de ter um importante papel
na hematopoiese, inflamação e no desenvolvimento de respostas células T efetoras
(GORDON, 1998). Esta citocina é um fator de crescimento para células T, B e NK e induz
a secreção tardia das imunoglobulinas IgG1 e IgE. Ela leva a uma resposta imune tipo Th2
(PALUDAN, 1999). No entanto, esta citocina também exerce profundo efeito
antiinflamatório sobre monócitos/macrófagos, inibindo a produção de citocinas pró-
inflamatórias e outros mediadores (CHOMARAT, 1998).
72
A regulação e expressão de genes e moléculas associadas à inflamação
acontecem de forma antagônica por IL-4 e IFN-γ, por exemplo, moléculas produzidas por
macrófagos alternativamente ativados são induzidas por IL-4 e inibidas por IFN-γ,
enquanto moléculas produzidas por macrófagos classicamente ativados são induzidas por
IFN-γ e inibidas IL-4 (ORFANOS, 1999).
Outro dado pertinente a este estudo foi a liberação de IL-6 por macrófagos
peritoneais em resposta à ativação pelas preparações fitoterápicas AM4, AM5, AM6 e AM7
e também pelas preparações homeopáticas 6CH, 12CH e 30CH (Figura 16) que não
apresentaram valores significativamente diferentes entre si. Todos os valores obtidos neste
ensaio, incluindo o do controle positivo, apresentaram o valor de desvio padrão alto, o que
pode ser explicado pelo fato que a cultura das células do exsudato peritoneal não são
originárias de camundongos isogênicos, provocando deste modo uma resposta não
condizente a média dos valores.
Os níveis fisiológicos de IL-6 são geralmente muito baixos, entretanto se
elevam rapidamente em resposta a vários estímulos como infecções bacterianas ou virais,
danos tissulares induzidos pela inflamação e outros tipos de traumas (POLI, 1998). Embora
a resposta ótima à infecção e lesão pareça ser mediada somente em presença da IL-6, sua
importância relativa varia em cada caso, possivelmente como resultado da interação com
outros mediadores também liberados (RAMSAY e KOPF, 1998).
A produção de IL-6 é rapidamente induzida durante a resposta infamatória
aguda, fase inicial. A IL-6 é um dos exemplos típicos de citocinas multifuncionais, uma vez
que atua regulando a resposta imune, hematopoiese, proteínas de fase aguda, entre outras
73
funções, indicando que a IL-6 desempenha papel central nos mecanismos de defesa
(KISHIMOTO, 1989).
Outras interleucinas também podem atuar na resposta pró-inflamatória como
a IL-1 e IL-12, mas apesar disso os resultados obtidos nesse trabalho mostram a não
produção desses mediadores frente às preparações fitoterápicas e homeopáticas (Figura 17
e 18). A IL-1 é produzida por macrófagos ativados e atua juntamente com o TNF-α como
um mediador da resposta inflamatória e da imunidade inata. A IL-12 é um heterodímero e
seu papel biológico é a ativação da resposta Th
1,
através da indução da produção de IFN-γ,
proliferação de células T e citotoxicidade mediada por células NK.
A produção de citocinas está entre as mais precoces marcas detectáveis de
ativação de macrófagos quando uma resposta imune é ativada (PENNANEN et al, 1995).
Echinacea purpurea tem sido largamente utilizada como um estimulante do sistema imune
e estudos in vitro mostraram que essa planta pode aumentar a produção de IL-1, IL-6 e
TNF-α pelos macrófagos (BURGER et al., 1997). Fato semelhante ocorre com Platycodon
grandiflorum J. uma planta da medicina tradicional considerada como um potente
estimulante da função macrofágica. (CHUl et al., 2001).
Albert Robin, em 1905, escreveu: “O medicamento não age pela sua massa e
sim pelo seu dinamismo”. Embora ainda não se saiba exatamente como a homeopatia
funciona, tem-se que o processo de dinamização é a liberação da energia dinâmica nos
medicamentos por intermédio de vibração molecular (sucussão) (NOGUEIRA et al., 1986).
Atualmente, sabe-se muito bem que a água e as misturas de água/álcool não
são simplesmente dispersões uniformes de moléculas e átomos, mas muitas vezes se
organizam em determinados padrões chamados padrões de coerência. Há uma série de
74
formas possíveis através das quais esses padrões podem ser estabilizados e propagados
através de diluições subseqüentes durante o processo de sucussão ou agitação. Entre esses
mecanismos possíveis encontram-se: (1) formação de clatratos (na qual as moléculas de
água formam “aglomerados” em padrões específicos que imitam as substâncias químicas
que dissolvem) (Anagnostatos, 1994 apud JONAS, JACOBS, 1996); (2) efeitos de auto-
organização isotópica de isótopos de oxigênio (nas quais as moléculas de água “pesada”
canalizam informações específicas, pois seus “spins” moleculares são únicos em
comparação às moléculas de água regulares) (BEREZIN, 1990, 1994 apud JONAS;
JACOBS, 1996); (3) campos de polarização eletrodinâmicos (nos quais a energia
eletromagnética, com a luz, organiza outras moléculas com as quais entra em contato)
(DEL GIUDICE, 1990, 1994 apud JONAS, JACOBS, 1996); (4) excitação coerente na
qual as moléculas que vibram em uma freqüência “ativam” outras moléculas. (RUBIK,
1990 apud JONAS, JACOBS, 1996).
Assim como a descoberta dos antibióticos revolucionou nossa capacidade de
tratar muitas doenças infecciosas, a descoberta do que acontece quando um preparado é
feito e como influencia o corpo pode revolucionar nosso conhecimento de química,
biologia e medicina. Se for apenas uma reação ao placebo, ainda oferecerá informações
importantes sobre como nossa mente e nosso corpo operam. De qualquer maneira, a
exploração de como a homeopatia funciona beneficiaria a ciência moderna (JONAS,
JACOBS; 1996).
O desenvolvimento de terapias capazes de modular o processo de
inflamação, sem suprimir o efeito desejável dos seus aspectos fisiológicos, poderia ser uma
interessante alternativa para se obter melhor eficácia da resposta tecidual contra agressores
75
externos. Hoje em dia, medicamentos homeopáticos são constantemente usados no
tratamento de processos inflamatórios. As defesas próprias do organismo e inerentes à cura
são induzidas por medicamentos homeopáticos, visando mobilizar a reação natural do
corpo debilitado (PEDALINO, 2004).
A definição de moléculas envolvidas na ativação de macrófagos durante a
modulação através dos medicamentos homeopáticos pode nos fornecer uma definição mais
clara de alvos terapêuticos. O entendimento do mecanismo de transcrição do gene das
citocinas é de interesse fundamental para estratégias futuras no desenvolvimento de drogas
para o tratamento de doenças relatadas com o sistema imunológico.
Os resultados expostos nesse trabalho contribuem para o estudo da resposta
inflamatória, mostrando que a continuidade das investigações de substâncias derivadas de
plantas abre uma enorme possibilidade em se conhecer os mecanismos de ativação/inibição
do sistema imunológico, para a obtenção de um total efeito benéfico dos mediadores pró-
inflamatórios no organismo.
76
VI -
CONCLUSÕES
77
A análise dos resultados permite concluir:
a) As preparações fitoterápicas de arnica não apresentaram capacidade em ativar
macrófagos para liberar H
2
O
2
, IL-1 e IL-12 e linfócito para liberar IL-4.
b) As preparações AM4, AM5 e AM6 estimulam macrófagos a liberarem NO, TNF-α
e IL-6 e linfócitos a liberar IFN-γ.
c) As preparações homeopáticas mostraram ser capazes de induzir a liberação das
mesmas citocinas que as preparações fitoterápicas, mas em concentrações menores.
d) As preparações homeopáticas apresentaram efeito inibitório discreto sobre a
produção de NO e TNF-α em cultura de macrófagos induzidos por LPS.
e) As preparações de arnica apresentaram ação estimulante sobre a ativação de
macrófagos.
f) O estudo da atividade imunológica das preparações de Arnica montana L. sugere
que a capacidade de ativar macrófagos, com conseqüente liberação de NO, TNF-α,
IFN-γ e IL-6 pode modular a resposta imunológica através da relação entre esses
mediadores.
g) O efeito imunoestimulatório observado pode ser benéfico no aumento da imunidade
em doenças infecciosas. Além de contribuir para o avanço da pesquisa fitoterápica e
homeopática.
78
VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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como especialidade médica no Brasil. Disponível em: Acesso em Fevereiro de 2006.
106
VIII - ANEXOS
107
CONTROLE DE QUALIDADE
A tintura-mãe de Arnica montana L. (Laboratório Schraiber) foi obtida por
maceração das flores secas em etanol a 45%, apresentando cor castanho-esverdeado, com
odor característico. A cromatografia em camada delgada revela a qualidade da tintura-mãe
obtida. Através da diferença de migração da amostra comparada à distância de migração da
solução padrão é possível calcular o Rf (fator de relação) que é a relação entre as distâncias
percorridas pelo composto e pela frente do solvente.
Rf =
sendo:
a = distância de migração da substância (centro da mancha à linha de partida)
b = distância percorrida pela fase móvel (frente do eluente, a partir do ponto de saída)
A solução padrão é o ácido cafeico a 1% que apresenta em seu
cromatograma uma banda com fluorescência azul a 0,75; duas bandas azul esverdeada a
0,35 e 0,45; duas bandas azuis a 0,75 e 0,95 e uma banda vermelha na altura do “front” do
solvente (POZETTI, 1999).
a
b
108
MÉTODO HAHNEMANNIANO
- Escalas Centesimal e Decimal
A – Drogas Solúveis
- Ponto de Partida: forma farmacêutica básica (tintura-mãe), dinamização anterior ou
droga solúvel em insumo inerte hidroalcóolico a 20%, no mínimo, sendo obedecidas as
escalas centesimal e decimal, respectivamente.
- Insumo Inerte: etanol em diferentes graduações. Nas três primeiras dinamizações, para
a escala centesimal e nas seis primeiras para a escala decimal, será empregado etanol com
mesmo titulo etanólico da tintura-mãe. No caso específico de drogas de origem mineral ou
químico-farmacêutica será empregado etanol no mesmo titulo etanólico de seus
dissolventes iniciais.
Nas preparações intermediárias, assim como para as de estoque, será empregado etanol
70% (p/p). Para a dispensação, quer na escala centesimal, quer na escala decimal, será
utilizado etanol 30% (p/p).
- Número de Frascos: tantos quantas forem as dinamizações a serem preparadas.
- Volume: o liquido a ser dinamizado deverá ocupar 2/3 da capacidade do frasco utilizado
na preparação.
109
- Número de Sucussões: 100
- Processo: diluição e sucussão. Manual ou mecânico.
- Processo Manual: a sucussão será executada através de movimento continuo e ritmado,
no sentido vertical, com o antebraço, de modo que produza choque do fundo do frasco
contra um anteparo semi-rígido.
- Processo Mecânico: a sucussão será feita em maquina que mantenha as características
do processo manual.
- Técnica:
1. Dispor sobre a bancada tantos frascos quantos forem necessários para atingir a
dinamização desejada.
2. Colocar em cada frasco volume de insumo inerte na proporção indicada,
respectivamente nas escalas centesimal e decimal.
3. Acrescentar no 1º frasco 1 parte do ponto de partida e sucussionar 100 vezes. Obtém-
se assim 1 CH ou 1 DH.
4. Transferir para o 2º frasco 1 parte da 1CH ou 1 DH e sucussionar 100 vezes. Obtém-
se assim 2 CH ou 2 DH.
5. Transferir para o 3º frasco 1 parte da 2 CH ou 2 DH e sucussionar 100 vezes. Obtém-
se assim a 3 CH ou 3 DH.
110
6. Proceder de forma idêntica para as preparações subseqüentes até atingir a
dinamização desejada.
- Conservação:
Recipiente de vidro âmbar, bem fechado, protegido do calor e da luz direta.
B – Drogas Insolúveis
- Ponto de Partida: drogas insolúveis, quando sua solubilidade for inferior a 10% no
insumo inerte liquido, e qualquer droga na preparação da LM.
- Insumo Inerte: lactose para a fase sólida e etanol, em diferentes graduações, para a fase
liquida.
- Processo: trituração para a fase sólida, diluição e sucussão para a fase liquida. Manual
ou mecânica.
- Técnica:
1. Dividir a quantidade total de lactose a ser utilizada, em 3 partes iguais. Uma terça
parte de lactose será colocada em gral de porcelana e triturada para tapar os poros do
gral.
2. Sobre este terço de lactose, coloca-se 1 parte do insumo ativo a ser triturado,
obedecendo a escala centesimal ou decimal.
111
3. Homogeneizar com espátula de porcelana ou de aço inox.
4. Triturar, vigorosamente, durante 6 minutos.
5. Raspar, com espátula de porcelana ou de aço inox, o triturado aderido ao gral e ao
pistilo, durante 4 minutos, homogeneizando-o.
6. Triturar, vigorosamente, durante 6 minutos, sem acréscimo de lactose.
7. Raspar o triturado durante 4 minutos.
8. Acrescentar a segunda terça parte de lactose.
9. Triturar, vigorosamente, durante 6 minutos.
10. Raspar o triturado durante 4 minutos.
11. Triturar, vigorosamente, durante 6 minutos, sem acréscimo de lactose.
12. Raspar o triturado durante 4 minutos.
13. Acrescentar o ultimo terço de lactose.
14. Triturar, vigorosamente, durante 6 minutos.
15. Raspar o triturado durante 4 minutos.
16. Triturar, vigorosamente, durante 6 minutos.
17. Raspar o triturado durante 4 minutos.
18. Este triturado será acondicionado em frasco bem fechado e protegido da luz solar
direta, recebendo o nome da substancia medicinal e a designação de primeiro
triturado: 1/100 ou 1/10. Ex: Petroleum 1 CH trit. Ou Petroleum 1 DH trit.
19. Para obtenção do segundo triturado, 1/10.000 ou 1/100, usar como insumo ativo 1
parte do primeiro triturado, para 100 ou 10 partes de lactose (respectivamente escala
centesimal ou decimal) repetindo-se o procedimento anterior (itens de 3 a 17).
112
20. Este triturado será acondicionado em frasco bem fechado e protegido da luz solar
direta, recebendo o nome da substância medicinal e a designação de segundo triturado
1/10.000 ou 1/100. Ex: Petroleum 2 CH trit. Ou Petroleum 2 DH trit.
21. Para Obtenção do terceiro triturado, 1/1.000.000 ou 1/1.000, usar como insumo ativo
1 parte do segundo triturado para 100 ou 10 partes de lactose (respectivamente escala
centesimal ou decimal) repetindo-se o procedimento anterior (itens 3 a 17).
22. Este triturado será acondicionado em frasco bem fechado e protegido da luz solar
direta, recebendo o nome da substância medicinal e a designação de terceiro triturado
1/1.000.000 ou 1/1.000. Ex: Petroleum 3 CH trit. ou Petroleum 3 DH trit.
23. No caso de trituração na escala decimal (DH), para obtenção das triturações
subseqüentes, repetir o procedimento anterior ate a obtenção da 6º trituração (itens 3 a
17).
24. Para solubilizar a 3º trituração CH ou a 6º trituração DH, dissolver 1 parte da
trituração em 80 partes de água destilada. Completar com 20 partes de álcool 96%
(V/V) e sucssionar 100 vezes, obtendo assim, a 4 CH ou 7 DH em solução
hidroalcoólica a 20% (p/p). A preparação com este grau de dinamização não será
estocada. As demais dinamizações serão preparadas em solução hidroalcoólica a 70%
(p/p) para estocar e solução hidroalcoólica a 30% (p/p) para dispensar.
- Conservação
Recipiente de vidro âmbar, bem fechado, protegido do calor, umidade e da luz direta.
- Prazo de Validade
A ser determinado, caso a caso.
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