( PDF ) Estudo comparativo de isolados de P. brasiliensis em adesão celular. Sinalização celular mediada pela GP 43

Download PDF

ads:

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS

ELAINE TOSCANO MIRANDA

“ESTUDO COMPARATIVO DE ISOLADOS DE

P. brasiliensis EM ADESÃO CELULAR. SINALIZAÇÃO CELULAR

MEDIADA PELA GP 43”.

ARARAQUARA-SP

2006

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS

ELAINE TOSCANO MIRANDA

“ESTUDO COMPARATIVO DE ISOLADOS DE

P. brasiliensis EM ADESÃO CELULAR. SINALIZAÇÃO CELULAR

MEDIADA PELA GP 43”.

Tese apresentada ao programa de Pós-

Graduação em Análises Clínicas da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas –

UNESP – Araraquara como pré-requisito

para obtenção do título de doutor.

ORIENTADORA: Profa. Dra. Maria José Soares Mendes-Giannini

ARARAQUARA-SP

2006

ads:

III

Ficha Catalográfica

Elaborada pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

UNESP – Campus de Araraquara

CAPES: 40300005

Miranda, Elaine Toscano

M672e Estudo comparativo de isolados de Paracoccidioides brasiliensis em adesão

celular. Sinalização celular mediada pela GP 43 / Elaine Toscano Miranda. –

Araraquara, 2006.

104 f.

Tese (Doutorado) –

Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita

Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em

Análises Clínicas.

Orientadora: Maria José Soares Mendes Gianinni.

1. Paracoccidioides brasilienses (Adesão). 2. Paracoccidioides brasilienses

(Sinalização celular) . 3. Via Ras/Raf. 4. AKT. 5. Rho-GTP. I. Gianinni, Maria

José Soares Mendes, orient. II. Título.

CDD: 616.075

Dedico:

A Deus

“Você se fez presente em todos os momentos firmes e trêmulos e, passo a passo,

pude sentir a sua mão na minha, transmitindo-me a segurança necessária para

enfrentar o caminho e seguir. A sua presença é qualquer coisa como a luz e a

vida, e sinto que em meu gesto existe o seu gesto e em minha voz, a sua voz.”

(Vinicius de Moraes)

Aos meus pais Laura e Antonio

Amados pais,

estou realizando um sonho, e minha vitória é fruto do incentivo, amor,

dedicação, carinho e apoio que vocês sempre me oferecem. Vocês são a

peça-chave do meu existir. Através da educação e dos ensinamentos

recebidos, aprendi a ser gente, gente que luta pelo que quer, gente que

procura fazer a diferença, gente que não deixa um sonho morrer. Sou e

serei grata, por toda minha vida, por me encorajar nos momentos de

desânimo e por colaborarem para que conseguisse alcançar meu sucesso.

Esta vitória pertence à vocês

Amo Vocês!!!

À Profa. Dra. Maria José Mendes Giannini

“O educador deve ser não um sábio, mas sim um homem

diferenciado pela sua educação, pela força de seus costumes, pela

maturidade de seus modos, jovial, sócil, acessível, franco, enfim, em

quem se encontre muito que imitar e pouco que corrigir”.

(Simon Bolívar)

Obrigada pelos ensinamentos, paciência, confiança e por mais esta

oportunidade!

À Rosângela (Rô)

“Um amigo fiel é uma poderosa proteção: quem o achou, descobriu

um tesouro”. (Eclo 6,14)

Obrigada pela amizade,coleguismo, e grande contribuição neste trabalho.

Ao Cláudio, Nahieh,Victor e Vinícius

Agradeço pelo momentos de carinho, amizade e paciência.

Paciência que até mesmo quando, sem querer, em vocês descarrego

minhas preocupações e angústias. A presença dos que amo, em todas as

etapas, é a melhor recompensa. Pois, é sabido, ninguém é feliz sozinho.

Ninguém é auto-suficiente. Sem te-los ao meu lado, cada qual com seu

jeito particular de nos transmitir amor, talvez não tivesse tido tanta

força. Aos que amo, dedico este trabalho. Agradeço pelo seu amor.

Aos que amo, enfim, este mérito também é de vocês.

Vocês são a razão do meu viver

Eu amo vocês

Aos meus padrinhos Ada e Valdemício

Pelo apoio e colaboração nesta caminhada.

Aos meus amigos : Vani, Bentão, Naly, Bel, Dorcas, Dona Carol, Rosinha, Eva,

Iracema, Elza Moraes pela força e ajuda nos cuidados com meus filhos.

Aos meus irmãos: Marilda, Clovis, Paulo, Rogério e André e aos meus

cunhados: Ladimir, Marli, Mariza e Marcela

À vocês que muito amo e que compartilharam dos meus ideais, compreenderam-

me, incentivaram-me, mesmo que no silêncio e na distância.

Aos meus sobrinhos

Pela alegria que vocês trouxeram.

À Marcela

Pela grande ajuda nas traduções para o inglês

Aos queridos amigos “da Micologia” Ana Marisa , Fabiana, Lílian, Julhiany,

Marcelo, , Liliana, Aline, Susana, Adriana, Paula, Ana Carolina (Pi), Natália,

Tatiana, José Nelson, Marisa Polezi, Danielli, Fábio, Eliana, Tirene, Márcia,

Luzia, Rita, Angélica, Rosemira, Isabel (cito) e Maxi (Hemato)!

Conviver é uma arte. Arte de saber respeitar e de aceitar os limites

e defeitos do outro. Durante estes anos, aprendemos uns com os outros e isso fez

com que aprendêssemos também sobre nós mesmos.

VII

À Profa. Dra. Christiane Pienna Soares e a Profa. Dra. Márcia Melhem pela

grande colaboração e sugestões valiosas como membros da banca do exame de

qualificação.

À Dra. Patrícia Ferrari Andreotti e a Dra Juliana Leal Monteiro da Silva pelo

apoio durante o trabalho.

À Julhiany e a Pati pelo repique das células e a Ana Carolina (Pi) pelo apoio

técnico.

À Cláudia, Laura, Sônia, Tirene e Eliana pela paciência e trabalho para que no

final de tudo desse certo!

À FAPESP

pelo financiamento deste trabalho.

VIII

Esse trabalho foi realizado no laboratório de Micologia Clínica

do Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista

“Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) – Campus de Araraquara,

São Paulo, Brasil.

LISTA DE ABREVIATURAS

Porcentagem

µµ

µg

Micrograma

µµ

µL

Microlitro

µµ

µm

Micrômetro

ATV

Solução de tripsina-EDTA-versene (Adolfo Lutz)

Banho maria

Centímetro

Célula normal

D.O.

Densidade ótica

fase L

Fase leveduriforme de P. brasiliensis

fase M

Fase miceliana de P. brasiliensis

Grama

GAPDH

Glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

Hora

Peróxido de hidrogênio

FPLC

Fast Performance Liquid Chromatography

IgG

Imunoglobulina G

kDa

Kilodalton

Molaridade

MEC

Matriz extracelular

Miligrama

min

Minuto

Mililitro

Milimolar

NaCl

Cloreto de sódio

NaOH

Hidróxido de sódio

Nanômetro

nº

Número

ºC

Graus Célsius

Paracoccidioides brasiliensis

PBS

Tampão salina fosfato

PBS-T

Tampão salina fosfato com 0,1% de tween-20

PCM

Paracoccidioidomicose

rpm

Rotações por minuto

SDS

Dodecil sulfato de sódio

PMSF

Fenil metil sulfonil fluoride

NP 40

Nonidet P 40 (detergente)

SDS-PAGE

Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio

TEMED

Tetra metil etileno diamino

SFB

Soro fetal bovino

TUNEL

Terminal deoxy-transferase mediated X-dUTP Nick End Labeling

X g

Gravidade

GEF

Guanine nucleotide exchange factor

GAP

GTPase-activating protein

GDI

GDP dissociation inhibitor

Pleckstrin homology

PI3K

Phosphatidyinositol 3- Kinase

PIP3

Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate

GSK

Glycogen synthase Kinase

FAK

Focal Adhesion Kinase

MAPK

Mitogen-activated protein Kinase

IP3

1,4,5-triphosphato Inositol

MEK

MAPK quinase quinase

ERK

Extracellular-signal-regulated quinase

PKB/AKT

Proteína quinase B

XII

RESUMO

A capacidade de Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da

paracoccidioidomicose (PCM), de causar doenças com manifestações clínicas variadas,

depende de seus fatores de virulência, em particular daqueles envolvidos na interação e

invasão celular. Estudos sobre o papel dos componentes do fungo como, por exemplo, a

glicoproteína de 43 kDa (gp 43), estão entre os assuntos abordados na

paracoccidiodomicose. A gp 43 atua como ligante de laminina, e por isso é importante na

adesão celular. Neste trabalho foi realizado um estudo comparativo entre isolados de Pb18

e Pb265, que têm capacidades distintas de adesão às células Hela e Vero, sob influência da

temperatura e diversos fatores químicos. Foram também avaliados eventos em células de

epitélio pulmonar expostas à gp 43 e células de Pb18, antes e após inoculação animal,

representando, respectivamente, isolados menos e mais virulentos. Os resultados mostram

que as adesinas fúngicas são termo-lábeis, sugerindo sua natureza protéica. Os açúcares

aminados glucosamina e galactosamina foram os mais eficientes para inibir a adesão

celular, em relação à manose, glicose e galactose, indicando (ou levantando a hipótese) que

esta atividade envolve mecanismos específicos tipo lectina. O estudo com componente da

matriz extracelular mostrou que a laminina, assim como seus derivados sintéticos, inibiu a

adesão do isolado Pb18, fato não verificado com Pb265, tanto com células Hela, quanto

com a linhagem Vero, mas variável sob influência de fatores químicos. As distintas vias de

sinalização foram demonstradas pelos eventos Ras-Raf, Rho e AKT verificados, sendo que

o isolado menos virulento causou menos estresse citotóxico, comprovado por menor sinal

Ras- Raf e AKT de proliferação. Os sinais intensos de proliferação observados nos

experimentos com o isolado mais virulento e exposição à gp 43 poderiam ser associados à

maior sobrevida do fungo que se internaliza mais facilmente nas células do hospedeiro,

dificultando o seu reconhecimento por células do sistema monocítico-fagocitário, antes de

XIII

causar apoptose, evadir e disseminar-se. As vias Ras-Raf e AKT agiram de modo sinérgico

nos efeitos de sobrevida celular. A diminuição do evento AKT implicou perda parcial de

sinal de sobrevida que se intensificou, a seguir e de modo contrário, com a diminuição de

Ras-Raf. A ativação das vias de sobrevida, associada a sinais citosólicos quando o Pb entra

na célula epitelial, foi demonstrada de modo inédito neste trabalho.

Palavras-chave: Paracoccidiodes brasiliensis; Adesão; Sinalização celular; Via Ras/Raf;

AKT; Rho-GTP.

XIV

ABSTRACT

The capacity of the Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of

paracoccidioidomycosis (PCM), to provoke illnesses with great variety of clinical

manifestations depends on its virulence factors, particularly on those involved in the

cellular interaction and invasion. Studies about the role of the fungus components such as

the 43 kDa glycoprotein (gp 43) are among the subjects broached in the

paracoccidiodomycosis. The gp 43 acts as laminin ligand e for this reason it is important

in the cellular adhesion. In this work it was accomplished a comparative study between

isolates Pb18 and Pb265, which have distinct capacities of adhesion to the cells Hela and

Vero under influence of temperature and several chemical factors. Events in pulmonary

epithelial cells exposed to gp 43 and in Pb18 cells, before and after animal inoculation,

representing, respectively, isolates less and more virulent were evaluated as well. The

results show that the fungal adhesins are term-labels, suggesting its proteical nature. The

aminated sugars glucosamine and galactosamine were the most efficient, in comparison

with manose, glycose and galactose, in inhibiting the cellular adhesion, indicating (or

putting forward the hypothesis) that this activity involves specific mechanisms lectin-type.

The study with extracellular matrix component indicated that the laminin, as well as its

synthetic derivatives, inhibited the adhesion of the isolate Pb18 to the cells Vero and Hela,

what did not occur with Pb265, but it was variable under influence of chemical factors.

The distinct signaling pathways were demonstrated by the Ras-Raf, Rho and AKT events,

considering that the less virulent isolate caused minor cytotoxic stress, proved by minor

Ras-Raf and AKT proliferation signals. The intense proliferation signals observed in the

experiments with more virulent isolate and exposition to gp 43 could be associated to

larger time of survival of the fungus that more easily goes inside the host cells, making it

difficult to the monocyte-macrophage system cells to recognize it before the apoptosis, the

evasion and the dissemination. The Ras-Raf and AKT pathways acted synergetically with

the effects of the cell survival. The decrease of the AKT event implied partial loss of the

survival signal that intensified, following and in a opposite way, with Ras-Raf decrease.

The activation of the survival pathways, associated to citosolic signals when Pb goes inside

the epithelial cell, was for the first time demonstrated in this work.

Palavras-chave: Paracoccidiodes brasiliensis; Adhesion; Cellular signalling; Ras/Raf

pathway; AKT; Rho-GTP.

XVI

SUMÁRIO

1.Introdução ..............................................................................................................

2. Objetivos ............................................................................................................... 25

3. Material e métodos ..............................................................................................

3.1.Isolados estudados ........................................................................................... 26

3.2. Componentes antigênicos de P. brasiliensis ................................................. 26

3.2.1. Filtrado de cultura......................................................................................

3.2.2. Fracionamento e purificação do antígeno de 43 kDa................................

3.2.3. Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio

(SDS- PAGE)......................................................................................................

3.2.4 Coloração dos géis pelo nitrato de prata....................................................

3.2.5.Análise protéica por eletroforese bidimensional.......................................

3.3. Cultura celular .................................................................................................

3.3.1.Cultura de células de linhagem contínua...................................................

3.3.2. Desenvolvimento do teste de adesão........................................................

3.3.2.1.Preparo das células para o teste............................................................. 30

3.3.2.2.Preparo e padronização do inóculo de P. brasiliensis........................... 31

3.3.2.3.Infecção das células Vero e Hela com P.brasiliensis............................ 31

3.3.2.4. Tratamento da suspensão de células leveduriformes de P.

brasiliensis.................................................................................................................

3.3.2.5.Tratamento térmico.................................................................................

3.3.2.6. Tratamento com tripsina a 0,2%............................................................ 33

3.3.2.7.Tratamento com formalina a 4%.............................................................

3.3.2.8.Tratamento com periodato de sódio 10mM.............................................

XVII

3.3.2.9. Tratamento com azida............................................................................ 34

3.3.2.10. Tratamento com Concanavalina A.......................................................

3.3.2.11. Tratamento com açúcares....................................................................

3.3.2.12.Tratamento com quitina a 2,5 %........................................................... 35

3.3.2.13. Tratamento com diferentes pHs............................................................

3.3.2.14. Tratamento com soro humano normal..................................................

3.3.2.15. Tratamento com soro humano normal inativado.................................

3.3.2.16. Tratamento com heparina.....................................................................

3.3.2.17. Tratamento com laminina.................................................................... 36

3.3.2.18. Tratamento com peptídeos .................................................................. 36

3.4. Coloração das lamínulas............................................................................... 37

3.4.1. Coloração de May-Grunwald-Giemsa.......................................................

3.4.2. Coloração por ácido periódico de Schiff (PAS)........................................

3.4.3. Contagem das células e dos fungos aderidos.............................................

3.5. Ensaios de Sinalização. ............................................................................... 38

3.6. Análise estatística......................................................................................... 40

4. Resultados....................................................................................................... 41

4.1. Análise protéica por eletroforese bidimensional........................................... 41

4.2. Resultados da adesão dos isolados de Pb18 e Pb265 às células Vero e

HeLa .........................................................................................................................

4.3- Influência de tratamentos físicos, químicos e de algumas substâncias na

adesão de P. brasiliensis

...........................................................................................

a) Tratamento térmico........................................................................................... 44

b) Tratamento com agentes químicos e lectinas.................................................... 45

c) Ação do pH....................................................................................................... 47

XVIII

d) Ação dos tratamentos com soro, tripsina e heparina......................................... 48

4.4- Papel dos açúcares na aderência de P.brasiliensis às células epiteliais.......... 49

a) Teste por inibição..............................................................................................

b) Teste competitivo...............................................................................................

4.5-Interações proteína-proteína na adesão de P.brasiliensis..................................

4.6-Imunoblot – Evento de Sinalização Celular......................................................

5. Discussão................................................................................................................

6. Conclusões..............................................................................................................

7. Referências bibliográficas................................................................................... 77

8. Anexo .................................................................................................................... 96

1-INTRODUÇÃO e REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.2. P.brasiliensis e Paracoccidioidomicose

O agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM) é um fungo dimórfico

denominado Paracoccidioides brasiliensis, classificado taxonomicamente no Reino

Fungi, Divisão Eumycota, Subdivisão Ascomycota, gênero Paracoccidioides e espécie

brasiliensis (UNTEREINER et al., 2004). Recentemente, foi sugerida a existência de

três diferentes espécies filogenéticas (S1, PS2, and PS3) de P. brasiliensis (MATUTE et

al., 2006).

P. brasiliensis é fungo dimórfico, termo-dependente, apresentando a fase

miceliana (M), saprobiótica, em temperaturas de 25 a 27

C. O aspecto das culturas nesta

fase é cotonoso, esbranquiçado e microscopicamente observa-se a presença de

filamentos hialinos, finos e septados. A fase leveduriforme (L) constitue a forma

parasitária do fungo, sendo reproduzida em cultivos de 35 a 37

C. Apresenta-se com

células arredondadas, de parede dupla e brotamentos múltiplos característicos,

formando a denominada “roda-de-leme” (LACAZ,1994).

Muito pouco se sabe a respeito do habitat do fungo. Achados de P. brasiliensis

foram relatados em solos de áreas endêmicas (Brasil, Colômbia e Venezuela), mais

recentemente em tatus, mas nenhum desses estudos, até o momento, pôde estabelecer

definitivamente seu nicho ecológico (FRANCO et al., 2000; BAGAGLI et al., 2006).

A maioria dos pesquisadores considera a via inalatória como principal meio de

infecção, em que propágulos da fase miceliana (artroconídidos e aleuroconídidos) são

inalados, invadindo vias aéreas terminais (alvéolos e bronquíolos terminais)

transformando-se em formas leveduriformes (RESTREPO, 1985). A doença afeta,

principalmente, agricultores do sexo masculino em idade produtiva. Como

conseqüência, pode-se estabelecer a condição de paracoccidioidomicose-infecção, em

que o indivíduo permanece assintomático ou, alternativamente, a

paracoccidiodomicose-doença. O desenvolvimento de doença pode se dar de duas

formas: aguda ou subaguda e crônica. A forma aguda compromete, preferencialmente, o

sistema monocítico-fagocitário, levando a linfadenomegalia e hepatoesplenomegalia,

enquanto que a crônica, acomete preferencialmente mucosas de via respiratória baixa

até cavidade oral, sendo considerada resultante da reativação do fungo a partir de focos

que permaneceram, provavelmente, quiescentes durante anos (FRANCO, 1986). Sabe-

se ainda que a paracoccidiodomicose-doença pode deixar seqüelas nos órgãos

comprometidos, mesmo após tratamento, como: má absorção intestinal, estenose de

laringe, Doença de Addison, fibrose pulmonar, etc.

A capacidade de P. brasiliensis de provocar doença humana, e causar micose

com grande variedade de manifestações clínicas, desde formas localizadas até doença

disseminada evoluindo para óbito, depende provavelmente da relação entre a

patogenicidade do fungo, e a habilidade deste em interagir com as estruturas superficiais

do hospedeiro, e invasão celular e a resposta imunológica. O conhecimento dos eventos

que ocorrem no processo de interação do fungo com as células do hospedeiro e, ou,

matriz extracelular é essencial para se desenvolver, no futuro, terapias que possibilitem

a inibição do patógeno em sua capacidade de colonizar e estabelecer a infecção; para

isto, o bloqueio da interação é o local ideal. O uso de peptídeos sintéticos ou anticorpos

dirigidos contra as moléculas de adesão ou as que interferem com os mecanismos

usados para internalizar parasitas intracelulares é possibilidade que surge dos

conhecimentos advindos dos estudos de interação celular. Por outro lado, a participação

do sistema imunológico na PCM é evidenciada pelo extenso envolvimento do sistema

monocítico-fagocitário, em casos graves, e pela presença de altos títulos de anticorpos

específicos; o que mas que parecem não apresentar proteção contra o fungo (FRANCO

et al., 1989). Sabe-se, no entanto, da importância da imunidade celular em promover

resistência à infecção por este fungo e por isso, esta se tornou o principal alvo das

investigações imunológicas.

Variações nos diferentes isolados de P.brasiliensis são evidenciadas em relação

a componentes da parede celular (SAN-BLAS & SAN-BLAS, 1977), em determinações

de curvas de crescimento (KASHINO et al., 1985) e patogenicidade e antigenicidade

(KASHINO et al., 1985; BIAGIONI et al., 1986; SINGER-VERMES et al., 1989;

SINGER-VERMES et al., 1994). Em 1989, Singer-Vermes et al., estudando sete

diferentes isolados de P.brasiliensis, Pb265, IVICPb267, Pb192, IVICPb9, PbSN,

Pb2052 e Pb18, quanto aos aspectos de patogenicidade e imunogenicidade, verificaram

que, estes poderiam se comportar como de virulência alta, média e baixa. Os isolados

de virulência baixa apresentavam também capacidade menor de induzir a produção de

anticorpos específicos e que os marcadores de virulência poderiam estar associados a

fatores relacionados à antigenicidade. O isolado Pb18 se mostrou mais virulento que o

isolado Pb265, em relação à sua DL

em camundongos da linhagem B10A. Com

exceção do isolado Pb265, todos os outros induziram uma peritonite granulomatosa

epitelióide que variou em intensidade. O isolado Pb18 disseminou-se em órgãos, como

fígado, baço, pulmões, nódulos linfáticos e coração, enquanto que o isolado Pb265

atingiu fracamente os nódulos linfáticos.

Os isolados de P. brasiliensis variam quanto à virulência, fato este que pode

auxiliar na explicação quanto à existência de diferentes manifestações clínicas da

doença (FRANCO et al., 1989). Os resultados experimentais demonstraram variações

entre os isolados deste fungo quanto à virulência e que esta é também influenciada pela

estocagem e passagem in-vitro dos isolados (ZACHARIAS et al., 1986; BRUMMER et

al., 1990; KASHINO et al., 1990; PERAÇOLI et al., 1992; ANDREOTTI, 2002).

Vários grupos estudam a obtenção e purificação de uma vasta gama de antígenos de P.

brasiliensis (MENDES-GIANNINI et al., 1990; CAMARGO et al., 1991; PUCCIA et

al., 1991; BLOTTA & CAMARGO, 1993). Um dos antígenos mais estudados, a gp43,

foi inicialmente identificada como fração E por Yarzábal et al. (1977) e, posteriormente,

caracterizada por Puccia et al. (1986). A gp43 é o antígeno mais utilizado para o estudo

da resposta imune humoral na PCM, por ser considerado o antígeno imunodominante de

P. brasiliensis, como demonstrado nos primeiros estudos sorológicos realizados pelo

grupo da Micologia da FCF-UNESP Araraquara (MENDES-GIANNINI et al. 1990) e

por Camargo et al. (1991). Esta fração foi majoritariamente reconhecida por

praticamente 100% dos soros de pacientes com PCM (MENDES-GIANNINI et al.

1990; CAMARGO et al., 1991). Por outro lado, tem sido demonstrado que diferentes

isolados deste fungo podem produzir diferentes isotipos de gp43, variando de pI (ponto

isoelétrico) 5,8 a 8,5 (SOUZA et al., 1997) e que estes são diferentemente expressos

entre os isolados.

Com intuito de estudar os passos envolvidos no contato inicial de P. brasiliensis

com a superfície celular até os eventos que culminam em sua entrada na célula, o grupo

da Micologia da FCF-UNESP de Araraquara utilizou o modelo de culturas celulares. P.

brasiliensis pode desenvolver vários fenótipos (crescimento, invasão e metástase)

dependendo do isolado fúngico, hospedeiro e outros fatores (LENZI et al., 2000).

A capacidade de aderência às moléculas específicas da superfície celular,

confere ao patógeno a habilidade para selecionar com qual componente do hospedeiro

vai interagir e, a partir daí, colonizar os tecidos. A interação de adesinas (constituintes

do microrganismo) com receptores celulares, que estão normalmente envolvidos no

contato célula-célula ou célula-matriz (especialmente integrinas), podem ser usados pelo

patógeno para invadir e se manter como parasita intracelular.

No estudo da virulência de P. brasiliensis, Mendes-Giannini et al., (1994)

utilizando culturas de células epiteliais da linhagem Vero (rim de macaco verde da

África), demonstraram que este agente apresenta mecanismos de adesão e de invasão.

Em estudo posterior, foi demonstrado que diferentes isolados do fungo apresentam grau

de adesão diferente a essas células. Correlação entre aderência e virulência para animais

foi mostrada, sendo que o isolado mais patogênico (Pb 18) fosse também mais aderente

em comparação com o menos virulento (Pb 265). Portanto, Hanna et al., 2000

confirmaram estes dados e estabeleceram a correlação entre aderência e virulência.

Perda da capacidade de aderência de isolados altamente aderentes indicou-se

tratar da influência dos (GIANNINI et al.não publicado), fato observado também por

outros autores em modelos animais pela passagem sucessiva (KASHINO et al., 1985;

BRUMER et al., 1990). A capacidade de adesão e de virulência para animais é

restaurada quando se obtém retro-cultivos após inoculação ou a partir de culturas de

células infectadas (MENDES-GIANNINI et al., 2006).

O agente da paracoccidioidomicose, como muitos outros microrganismos,

sintetiza várias substâncias que participam direta ou indiretamente da relação fungo-

hospedeiro. A estrutura antigênica de P. brasiliensis é bastante complexa; cerca de 60

componentes solúveis foram descritos incluindo glicoproteínas e proteínas, com e sem

atividade enzimática (YAZÁRBAL, 1982). Estudos de correlação entre alguns destes

componentes e a patogenicidade estão entre os assuntos abordados de grande

importância na paracoccidiodomicose. A glicoproteína de 43 kDa, ligante de laminina,

tem papel na adesão (VICENTINI et al., 1994); fato este confirmado pela inibição de

85% do processo de adesão, pelo soro anti-gp43 (HANNA et al., 2000).

Provavelmente, outros componentes do fungo tenham papel no processo de adesão

(MENDES-GIANNINI et al., 2000). Recentemente, uma adesina de 30 kDa de P.

brasiliensis foi isolada e demonstrou capacidade de ligação à laminina, mas não a outros

componentes da matriz extracelular (MEC). Esta proteína foi mais expressa num isolado

de P. brasiliensis que apresentava alta capacidade de adesão. O papel destas adesinas

foi investigado e a adesão de P. brasiliensis foi intensamente inibida pelo pré-

tratamento das células epiteliais com as moléculas de 30 e de 43 kDa (ANDREOTTI et

al., 2005). Além disso, P. brasiliensis apresenta, em sua superfície celular, duas

proteínas com massas moleculares de 19 e 32 kDa que interagem com diferentes

proteínas da MEC, tais como laminina, fibronectina e fibrinogênio (GONZALEZ et al.,

2005). A enzima gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase (GAPDH), recombinante, que é

um componente de P. brasiliensis, foi capaz de se ligar à laminina, colágeno tipo I e

fibronectina. O tratamento de formas leveduriformes de P. brasiliensis com anti-

GAPDH e de pneumócitos com GAPDH recombinante promoveu a inibição da infecção

do fungo às células epiteliais (BARBOSA et al., 2006). Coltri et al., 2006 estudaram

uma proteína de 70 kDa , que foi designada como “paracoccin”, ligante de n- acetil

glucosamina (GlcNAc) que se liga à laminina e induz a produção de TNF-α por

macrófagos, com aumento de NO (óxido nítrico), suprimindo as células do sistema

imunológico e, conseqüentemente, favorecendo a adesão e invasão das células do

hospedeiro, sugerindo ser um fator importante na patogênese da PCM.

A maioria das moléculas com funções de ligantes são proteínas-glicomananas,

presentes na parte externa da parede celular. Estas podem ter homologia com receptores

tipo integrina, iC3b, e receptores para fibronectina, laminina e fibrinogênio ou então

tipo lectina reconhecendo resíduos de fucose ou n-acetilglucosamina e em alguns casos

interações ainda não definidas como a secreção de aspartil proteinase e do fator 6

(CALDERONE & FONZI, 2001). Mudanças nas condições e no meio de cultivo

influenciam nas características de superfície celular de P. brasiliensis e

conseqüentemente na adesão a tecidos (BOUCHARA et al., 1990; VESPA et al., 1995).

Assim, polissacarídeos, proteínas e lipídeos da parede celular têm sido implicados como

tendo alguma função adesiva, principalmente, em Candida albicans (MENDES-

GIANNINI et al., 2005).

Há fortes evidências de que a ligação entre a forma de levedura de P.

brasiliensis e células epiteliais é mediada por adesinas da camada externa da parede

celular, denominada de fibrilar-flocular (HOWLET & SQUIER, 1980). Outras

experiências têm sugerido que o grau de desenvolvimento desta camada depende de

nutrientes como galactose ou sacarose (POULAIN et al., 1978). Células de C. albicans

cultivadas em meio suplementado com altas concentrações destes dois açúcares tiveram

um incremento na adesão às células epiteliais. Quando estas leveduras foram inoculadas

em animais houve um aumento na virulência de 5 a 24 vezes, comparados aos isolados

inoculados sem o acréscimo destes açúcares (SAMARANAYAKE & MCFARLANE,

1981). As leveduras cultivadas em meio suplementado com galactose ou sacarose

passaram a apresentar um material polimérico extracelular, composto principalmente

por manose, além de glucosamina e proteínas, que lhes proporcionaram um aumento do

número de sítios adesivos e um aumento do número de determinantes antigênicos

(CALDERONE & BRAUN, 1991).

A parede celular de ambas as formas de P.brasiliensis é composta

principalmente de polissacarídeos (quitinas e hexoses), proteínas e lipídios

(KANETSUNA, 1972). A forma de levedura apresenta hexoses constituídas de longas

cadeias de alfa-1,3 glucana mais externamente e quitina e beta glucana na sua parte

mais interna. A forma miceliar apresenta parede celular constituída de uma única

camada, em que a quitina e beta glucana estão entrelaçadas. (SAN-BLAS & SAN-

BLAS, 2000). Em ambas as formas, uma galactomanana está presente, a qual reage

cruzadamente com estruturas similares de outros fungos dimórficos (AZUMA et al.,

1974).

A parede celular de P.brasiliensis tem sido separada em três frações: a) uma

fração alcali insolúvel, b) outra fração ácido insolúvel e, c) fração alcali e ácido solúvel

(KANETSUNA et al , 1969; KANETSUNA el al., 1972).

A quitina é comum nas duas formas em que P. brasiliensis se apresenta. A

parede celular da forma leveduriforme contém glicose como uma cadeia de açúcar

neutro na fração 1 e 2, como alcali solúvel alfa 1,3 glucana (95%) e uma pequena

quantidade (5%) de um alcali insolúvel beta-1,3glucana (KANETSUNA et al., 1969;

KANETSUNA et al., 1970). Pequenas quantidades (pouco mais de 2%) de galactose e

manose foram encontradas na fração 3. A glicose é a principal hexose na forma

miceliana, ocorrendo quase exclusivamente como beta 1,3 glucana.

1.2. Estudos da interação de P.brasiliensis com células epiteliais in vitro

A aderência aos tecidos do hospedeiro é considerada uma etapa crucial para o

estabelecimento da doença e parece ser mediada pelo reconhecimento de alguns

componentes da matriz extracelular. Várias proteínas da matriz podem ser receptores

potenciais para os microrganismos. A laminina foi a primeira destes componentes a ser

implicada na patogênese da paracoccidioidomicose (VICENTINI et al., 1994).

Nosso grupo vem trabalhando nesta abordagem e outros componentes da matriz

como colágeno tipo I e IV, fibronectina e entactina estão envolvidos na adesão aos

tecidos do hospedeiro. Pela primeira vez, foi demonstrado padrão de reconhecimento

diferencial ao se compararem estes componentes da matriz extracelular (MEC) frente

aos componentes antigênicos das cepas Pb18 e Pb265 (VINCENZI, 2000; MENDES-

GIANNINI et al., 2000). Os ensaios usando Pb18 demonstraram a saturabilidade das

ligações, conferindo características de receptores aos sítios de ligação para as diferentes

proteínas da matriz extracelular analisadas. Também se verificou que há seqüências da

gp43 que mais contribuem para a ligação às células Vero (VINCENZI, 2000;

MENDES-GIANNINI et al., 2006). Por outro lado, os peptídeos RGDS (arginina-

glicina-ácido aspártico-serina) e RGD (arginina-glicina-ácido aspártico), que são parte

da molécula de fibronectina, e as sequências CDPGYIGSR-NH

e YIGSR, partes da

molécula de laminina, reduziram a aderência da gp43 as células Vero. Estes resultados

reforçam a contribuição do processo de adesão às diferentes proteínas da matriz

extracelular na patogênese de P. brasiliensis. Por outro lado, moléculas de adesão de

células eucarióticas são utilizadas por várias células e moléculas extracelulares na

defesa do hospedeiro contra infecção (KERR et al., 1999). Recentemente, o

envolvimento de ICAM-1 foi demonstrado na migração celular e na organização de

lesões granulomatosas causadas por P. brasiliensis (MOREIRA et al., 2006).

Estas proteínas são freqüentemente utilizadas por um grande número de

microrganismos para facilitar a aderência e/ou invasão. Assim, a interação com

receptores celulares, que estão normalmente envolvidos no contato célula-célula ou

célula-matriz (integrinas) são usados pelos patógenos para invadir e coexistir como

parasita intracelular. Desta forma, os microrganismos patogênicos podem ligar-se as

moléculas de adesão do hospedeiro visando sua entrada, promovendo sua própria

sobrevivência e disseminação.

Na disseminação de Candida albicans estão envolvidos componentes da matriz

extracelular como laminina, fibronectina e colágeno tipo IV e as adesinas até agora

identificadas incluem receptores para os fragmentos do complemento iC

e C

(CALDERONE et al., 1988; ALAEI et al., 1993), laminina (BOUCHARA et al., 1990;

LOPEZ-RIBOT et al., 1994), fibrinogênio (BOUALI et al., 1987; CASANOVA et al.,

1992), fibronectina (SKERL et al., 1983; KALO et al., 1988; KLOTZ & SMITH, 1991)

e diferentes componentes da matriz extracelular incluindo colágeno tipo IV (KLOTZ,

1990; KLOTZ et al., 1993) e mais recentemente entactina (LOPEZ-RIBOT &

CHAFFIN, 1994). A maioria destas adesinas são glico(mano)proteínas presentes na

parte externa da parede celular e possuem propriedades similares às lectinas ou

integrinas, reconhecendo nas células hospedeiras glicosídeos com resíduos fucosil ou

peptídeos contendo a seqüência RGD (CALDERONE, 1993).

O parasitismo intraepitelial como mecanismo de infecção em

paracoccidioidomicose humana é um aspecto pouco explorado. Os trabalhos de BRITO

et al., (1972 e 1973) apontaram para a presença de células fúngicas sem parede nas

porções intracelulares dos constituintes ectodermais de embriões de galinha, bem como

a presença de células típicas de P. brasiliensis sobre células epiteliais e dentro delas. Os

autores sugeriram que o fungo se apresenta na forma de protoplasto para penetrar nas

células do hospedeiro e a parede fúngica regenera-se posteriormente, adquirindo sua

morfologia característica.

O P. brasiliensis não é um parasita essencialmente intracelular, contudo pode ser

observado no citoplasma de células epiteliais in vivo (BRITO et al., 1973) e in vitro

(MENDES-GIANNINI et al., 2000). Esta interação pode também ser considerada

importante como mecanismo de escape do sistema imune do hospedeiro, fato este que

tem sido explorado e que pode oferecer outra perspectiva ao estudo da patogênese deste

fungo (MENDES-GIANNINI et al., 1994; HANNA, 1996; MONTEIRO DA SILVA,

2000; HANNA et al., 2000). Um isolado de P. brasiliensis sem qualquer tratamento

prévio foi capaz de aderir e invadir células epiteliais de linhagem contínua (MENDES-

GIANNINI et al., 1992). Inicialmente, pequenos brotos apareceram aderidos às células,

mudando aparentemente sua morfologia e, decorrido algum tempo, estruturas esféricas

foram observadas no citoplasma, com aparente migração para o núcleo (MENDES-

GIANNINI et al., 1994). Estudos posteriores mostraram que a adesão de P. brasiliensis

às células foi feita aparentemente por um pequeno túbulo, semelhante a um tubo

germinativo (HANNA, 1995; UEMURA, 1996) e ao redor da área de adesão do fungo à

célula epitelial puderam observar alterações nas membranas celulares, com presença de

cavitações circunscritas ao redor do elemento fúngico e também vacúolos (MONTEIRO

DA SILVA, 2000; HANNA et al., 2000); provavelmente resultantes dos produtos

extracelulares do fungo ou através de um processo fagocitário da célula hospedeira.

Formas variadas de P. brasiliensis foram observadas, interagindo com as células

epiteliais e formas características do fungo e na forma de protoplasto foram observadas

no interior da célula após 24 horas de incubação. Estas observações apontam que

provavelmente o fungo invada estas células na forma de protoplasto e no citoplasma

celular ocorreria a regeneração da parede celular. Os fungos, que invadiram as células

Vero, foram observados numa forma circunscrita dentro de um vacúolo, sugerindo

processo de fagocitose (MONTEIRO DA SILVA, 2000; HANNA et al., 2000). O P.

brasiliensis não é um parasita essencialmente intracelular, contudo pode ser observado

no citoplasma de células epiteliais in vivo (BRITO et al., 1973) e in vitro (MENDES-

GIANNINI et al., 2000). Esta interação pode também ser considerada importante como

mecanismo de escape do sistema imune do hospedeiro, fato este que tem sido explorado

e que pode oferecer outra perspectiva ao estudo da patogênese deste fungo (MENDES-

GIANNINI et al., 1994; HANNA, 1996; MONTEIRO DA SILVA, 2000; HANNA et

al., 2000).

A habilidade do P. brasiliensis sobreviver intracelularmente pode explicar vários

aspectos da relação parasita-hospedeiro. A invasão de P. brasiliensis às diferentes

linhagens de células epiteliais pode ocorrer pela ativação de um processo fagocitário da

própria célula hospedeira, à semelhança do ocorrido com a invasão de células pelas

enterobactérias (KADURUGAMUWA et al., 1991). Essa invasão ocorre porque as

células epiteliais estudadas apresentam mecanismo de fagocitose forçada e os

metabólitos do fungo podem estimular o rearranjo do citoesqueleto da célula

hospedeira, que passa a se comportar como célula fagocitária.

1.3. Citoesqueleto celular

O citoesqueleto é ligado à superfície da célula por membros da família das

integrinas, por exemplo, receptores para fibronectina, colágeno, laminina, vitronectina,

molécula do complemento C

3bi

e entactina. Há evidências que integrinas estão ligadas

ao sistema de microfilamentos da actina através de várias moléculas incluindo: talina,

vinculina e α-actinina. Estas ligações formam estruturas semelhantes a âncoras,

permitindo à célula eucariótica aderir às outras células ou à matriz extracelular. Assim,

parasitas intracelulares são capazes de utilizar estes sistemas e usar tais receptores para

entrar na célula hospedeira (ALAEI et al., 1993).

Todas as espécies eucarióticas possuem filamentos de actina. Esta proteína é a

mais abundante do citoesqueleto, constituindo, freqüentemente, 5% ou mais do total das

proteínas celulares. A invasão de microrganismos em células epiteliais evidencia-se pela

alteração da membrana da célula hospedeira que fica deformada parecendo enrugada ou

encrespada. A internalização e o efeito de enrugamento são acompanhados por extenso

rearranjo de actina. Durante este processo há um aumento dos níveis de cálcio

intracelular, um sinal que ativa as enzimas para a despolimerização da actina. Após a

entrada da bactéria, a polimerização do filamento da actina retorna ao normal (FINLAY

et al., 1992; SALYERS & WHITT, 1994).

Outros constituintes do citoesqueleto, além dos microfilamentos de actina, têm

sido estudados como os filamentos de citoqueratina, envolvidos na adesão de bactérias

às células epiteliais. Os trabalhos têm sugerido que a aderência a citoqueratina pode ser

importante na manutenção dos sítios de colonização em epitélios queratinizados e

mesmo causar injúrias celulares em outros sítios (TAMURA & NITTAYAJARN,

2000). Por outro lado, foi sugerido que o envolvimento da citoqueratina facilitaria a

translocação de algumas bactérias através das barreiras epiteliais, evadindo-se das

defesas do hospedeiro (SAJJAN et al., 2000).

Algumas evidências têm sugerido que para a ocorrência da internalização de

patógenos em fagócitos não profissionais, são requeridas proteínas ligantes de

fibronectina (FnBPs). Assim, trabalhando-se com mutantes incapazes de expressar as

FnBPs, foi verificada redução significativa de sua entrada em células epiteliais in vitro

(ISBERG & TRAN VAN NHIEU, 1994). Porém, outros trabalhos demonstraram

também que pode haver uma compensação por outras moléculas de superfície, pela

ausência de FnBPs, permitindo ao microrganismo ligar-se às células. A fibronectina

atuaria como molécula bifuncional, que formaria uma "ponte" entre a FnBP e o receptor

celular (provavelmente as integrinas) que se liga a fibronectina ou outros componentes

da matriz extracelular e interagem com o citoesqueleto de actina.

Os mecanismos moleculares de internalização de fungos em células epiteliais

estão sendo explorados. Este aspecto está bem desenvolvido em bactérias como

Salmonella, Shigella e Yersinias em que já se estudaram e caracterizaram as invasinas e

o mecanismo de invasão que envolve alterações do citoesqueleto. As células epiteliais

podem ligar-se a invasina e esta interação envolve várias integrinas (ISBERG &

LEONG, 1990; ISBERG, 1991). Como anteriormente mencionado, integrinas estão

ligadas ao citoesqueleto e, por sua vez, os inibidores do filamento de actina bloqueiam a

entrada da maioria das bactérias patogênicas em células não fagocíticas (FINLAY &

FALKOW, 1989; TRAN VAN NHIEU & SANSONETTI, 1999).

As bactérias Salmonella ou Shigella ao entrarem nas células epiteliais,

promovem grande condensação de actina ao seu redor (SANSONETTI, 1991; FINLAY

et al., 1992), à semelhança do que ocorre na fagocitose. Há também uma grande

condensação de α-actinina, tropomiosina, talina e integrinas, envolvendo a bactéria

(WATARI et al.,1996).

Assim, é provável que os organismos invasores liguem-se diretamente ou via

matriz extracelular às integrinas, ou suas assemelhadas na superfície do hospedeiro.

Após esta ligação, é disparado um sinal na célula hospedeira para que os filamentos da

actina liguem-se ao receptor da membrana, possivelmente, via talina e outras proteínas e

assim possibilitem a entrada do parasito na célula. Uma vez dentro da célula, alguns

microrganismos são capazes de causar significante rearranjo no citoesqueleto (WELLS

et al., 1998; MENDES-GIANNINI et al., 2004).

Estudos realizados com cultura de células endoteliais, incubadas com C.

albicans demonstraram a presença de leveduras intracitoplasmáticas incluídas em

vacúolos e injúria celular concomitantemente à formação de hifas. Este microrganismo

pode induzir fagocitose em células endoteliais através da polimerização dos

microfilamentos e microtúbulos do citoesqueleto (FILLER et al., 1995, ZINK et al.,

1996). Foi sugerido que substâncias citotóxicas secretadas pelas hifas causariam tais

danos. A migração de C. albicans pelo endotélio é considerada etapa crucial para a

invasão do parênquima e estabelecimento da infecção sistêmica (ZINK et al., 1996).

P. brasiliensis é capaz de invadir e induzir rearranjo do citoesqueleto em células

epiteliais (Vero) e na linhagem A

549

de pneumócitos tipo I. Componentes do

citoesqueleto, tais como actina, tubulina e citoqueratina, estão envolvidas no processo

de invasão de P. brasiliensis. Os resultados também mostraram que a interação de P.

brasiliensis com estas células afetou a citoqueratina celular, apontando para a presença

de queratinases. Citocalasina D e colchicina reduziram substancialmente a invasão,

indicando a participação de microfilamentos e microtúbulos neste mecanismo. Gp43 foi

também reconhecida por soro anti-actina e anti-citoqueratina, mas não por anti-tubulina,

sugerindo que esta molécula pode ser um ligante para alguns componentes e pode ser

provável candidata à invasina (MENDES-GIANNINI et al., 2004). Os componentes do

citoesqueleto são partes importantes do sistema celular para transporte citoplasmático de

vesículas e outras organelas. P. brasiliensis pode tirar vantagem deste sistema aderindo

a estes componentes e subvertendo-os. Assim, P. brasiliensis pode induzir a fagocitose

em células epiteliais através da polimerização de microfilamentos e microtúbulos

(HANNA, et al., 2000; MENDES-GIANNINI et al., 2000; MENDES-GIANNINI et al.,

2004).

Células não fagocíticas como as epiteliais e fibroblastos não codificam

receptores CR

e, normalmente, não fagocitam. No entanto, muitos patógenos

intracelulares são capazes de entrar nestas células, talvez, por mecanismos envolvendo

integrinas e o citoesqueleto. Assim, a internalização de conídios de fungos oportunistas

como Aspergillus fumigatus em cultura de células endoteliais estaria também associada

com o mecanismo de escape de fagócitos assim como uma possibilidade para a

disseminação (PARIS et al., 1997). A participação de células epiteliais na

paracoccidioidomicose pode, por outro lado, ser um ponto de transição do fungo para

sua colonização e invasão tecidual. Os efeitos que P. brasiliensis pode induzir nas

várias vias de sinalização entre as células e o genoma através do citoesqueleto são

atualmente desconhecidas.

As integrinas são os principais receptores utilizados pelas células animais para

ligação à MEC. Essas proteínas são heterodímeros e atuam como ligantes

transmembrana que medeiam as interações bidirecionais entre a matriz e o citoesqueleto

de actina (HYNES, 1987).

1.4. Sinalização celular

Coxon et al., (1998) investigaram a hipótese de que a invasão da Legionella

pneumophila à monócitos ativa sinais de fosforilação necessários para induzir o

rearranjo do citoesqueleto requerido no processo de entrada da bactéria e a possibilidade

que esses sinais sejam diferentes entre isolados avirulentos e virulentos durante o evento

de invasão. Quando células infectadas com a bactéria foram observadas por

imunofluorescência utilizando anticorpo anti-fosfotirosina 4G10, houve um aumento da

fluorescência, mostrando a presença dessa proteína durante a infecção.

No processo de invasão celular de Trypanossoma cruzi, a função dos receptores

de superfície celular é disparar a cascata de sinalização que mobiliza vários mensageiros

secundários. A mobilização do íon cálcio promove na célula hospedeira o rearranjo dos

microfilamentos, o recrutamento de lisossomos para o sítio de entrada de T. cruzi e a

internalização do parasito. O resultado da informação da superfície celular para os

componentes intracelulares leva a um aumento da concentração de cálcio livre no

citosol da célula. Esta resposta de cálcio que é requerida na invasão do parasito, não é

provocada em formas não infectantes de T. cruzi (YOSHIDA et al., 2000).

Favoreto et al., (1998) examinaram a necessidade da fosforilação da proteína

tirosina de Trypanossoma cruzi para sua entrada em células de mamífero, e observaram

que o tratamento do parasito com genisteína, um inibidor da atividade tirosina quinase,

inibiu significantivamente a invasão às células Hela.

Como uma das conseqüências da internalização de patógenos em células

epiteliais, a modulação do fenômeno de apoptose, tem sido investigada (JACOBSON &

RALF, 1997; VAUX & KORSMEYER, 1999; MENDES-GIANNINI et al., 2004). Este

fenômeno é essencial na regulação da população de células, homeostase e também em

certas condições patológicas, como câncer.

A indução de apoptose por patógenos foi bem caracterizada para certas infecções

virais (THOMPSOM, 1995), bacterianas (McORIST et al., 1996; MONACK et al.,

1997; GUEIRARD et al., 1998) e por protozoários (KHAN et al., 1996). Como

conseqüência, os patógenos podem alcançar o meio extracelular, evadir-se da resposta

imune ou estimular a resposta inflamatória (MONACK et al., 1996; MULLER et al.,

1996; ZYCHLINSKY et al., 1996).

Staphylococcus aureus, além da persistência em hospedeiros saudáveis, pode

induzir infecções crônicas e resistentes à terapia convencional (MOULDING et al.,

1999). Embora também não seja um patógeno intracelular, foi extensivamente

documentada a entrada em células epiteliais, endoteliais e osteoblastos. Estes

mecanismos foram sugeridos como uma possibilidade de manutenção de um nicho

intracelular, podendo promover a colonização em longo prazo no hospedeiro,

determinando assim, o caráter da infecção crônica. Durante seu ciclo de invasão celular,

esta bactéria induz sua interiorização, através do rearranjo dos microfilamentos de

actina; internalizada, ela escapa da vesícula endossomal; multiplica-se no citoplasma

celular e alcança o meio extracelular, induzindo apoptose na célula hospedeira, através

de toxinas (MENZIES & KOURTEVA, 1998).

A técnica de TUNEL (técnica capaz de detectar DNA apoptótico) foi empregada

e verificou-se a indução de apoptose em células epiteliais por P. brasiliensis

(MENDES-GIANNINI et al.,2004). As mudanças morfológicas nucleares e o número

de células apoptóticas foram dependentes do tempo de exposição à P. brasiliensis. Os

mecanismos de indução de apoptose em células não fagocíticas, que internalizaram P.

brasiliensis, devem ser exploradas para se correlacionar com prováveis achados in vivo.

O papel de células apoptóticas na infecção por P. brasiliensis é desconhecido,

entretanto, ativação nas células ou fagócitos pode favorecer o patógeno, favorecendo

consequentemente sua disseminação.

Fungos e outros organismos vivos são capazes de perceber mudanças no meio e

ajustar suas atividades intracelulares. O crescimento e diferentes respostas dos fungos a

estímulos exógenos estão relacionados com eventos de sinalização celular. O

crescimento de fungos filamentosos e os processos de divisão celular das leveduras

patogênicas, C. albicans e C. neoformans, são regulados por uma cascata de sinais de

transdução (LENGELER et al., 2000). A despeito das diferenças evolucionárias entre

células de mamíferos e fungos, ambos compartilham padrões semelhantes de

sinalização intracelular (LENGELER et al., 2000). Os mecanismos de sinalização

propostos para uma variedade de células demonstram a participação de receptores de

superfície, de proteínas associadas ä membrana e citosólicas para a resposta destas

células frente a estímulos do meio extracelular.

A ativação de proteínas ou fosfolipídios de membrana gera a resposta de um

segundo mensageiro que pode interagir com proteínas quinases de sinalização ou

modular a liberação de cálcio para outros eventos intracelulares.

A flutuação da concentração de cálcio intracitoplasmático é resultante dos sinais

emitidos do fosfolipídio denominado fosfatidilinositol (PI). Sinais de membrana por PI

geram os segundos mensageiros diacilglicerol (DAG) e 1,4,5-trifosfato inositol (IP3).

Assim, IP3 mobiliza cálcio do retículo endoplasmático como resposta ao estímulo dos

fosfolipídios de membrana. O influxo citoplasmático de cálcio pode ser regulado por

eventos extracelulares (LODISH & KONG, 1990).

Há uma notável homologia bioquímica e genética em leveduras, nematóides e

células de mamíferos, quanto à cascata de sinalização celular composta de várias

proteínas com ação seqüencial. Estas proteínas são denominadas de MAP quinase

(MAPK) e são ativadas por um complexo de proteínas ras associadas existente na

membrana celular (LODISH & KONG, 1990). Assim, eventos extracelulares podem

modular resposta intracelular por sinal propagado a partir da membrana a alvos

intracitoplasmáticos específicos. Na dependência do tipo de estímulo, respostas de

sinalização diferentes são desencadeadas. Estímulos de proliferação ou diferenciação

celular ativam receptores de fatores de crescimento, que por sua vez modulam uma

resposta seqüencial autoregulada de proteínas raf, MEK, ERK e resposta nuclear. Por

sua vez, processos inflamatórios, de stress e/ou morte celular tem resposta sinal

diferenciada, ativada por receptores de citocinas na membrana celular e propagadas

consecutivamente pela sinalização de MEKKs, MKKs e JNK/p38 (COOPER, 2000). A

resposta das células frente ao “stress” vai estimular eventos nucleares para síntese de

mediadores de inflamação ou direcioná-la para morte. Além da ativação nuclear, a

sinalização pode ativar alvos do cistoesqueleto celular modulando a interação célula-

célula ou célula à matriz. O modelo atualmente proposto para a interação entre matriz e

propagação de sinal intracelular é a ligação entre integrinas associadas a membrana e

um receptor não tirosina quinase, denominado FAK (focal adhesion kinase). O sinal

emitido pela interação integrina/FAK modula novos sinais intracelulares seqüenciais

associados ao complexo protéico Grb2/Sos, proteína Ras e MAPKs (COOPER, 2000).

Ainda, frente ao estímulo de fatores de crescimento, o sinal intracelular ativa proteínas

de citoesqueleto, como Rho, Rac e Cdc42 e resulta na modificação conformacional da

célula. Rho, Rac e Cdc42 são da família de pequenas proteínas ligadas a GTP que atua

na regulação do citoesqueleto de actina, controlando uma variedade de processos

celulares como motilidade, adesão e citocinese (COOPER, 2000).

Estudos em diferentes fungos, incluindo Ascomicetos e Basidiomicetos, têm

convergido para definir dois sinais de transdução bem conservados que regulam o

desenvolvimento e virulência. Um diz respeito à cascata da MAP quinase que medeia

resposta a feromonas e a segunda sensível a nutrientes (GPCR), cascata G-CAMP-PKA.

As funções dessas vias coordenadamente regulam cruzamentos, filamentação e

virulência.

As diferenças das vias entre os diferentes organismos são poucas, e os

mecanismos de sinalização são bem conservados. Como exemplo, temos a proteína G ∝

(nutriente sensível) que regula a produção de cAMP durante o crescimento pseudohifal

de Schizosaccharomyces pombe, cruzamento e virulência de Cryptococcus neoformans

e do patógeno de plantas Ustilago maydis (ARELLANO, et al., 1999; LENGELER, et

al, 2000; MAHLERT et al, 2006).

Lengeler et al., 2000 observaram que as redes regulatórias são flexíveis e podem

ser adaptadas por organismos bem divergentes às respostas ambientais. MAP quinases

tem sido identificadas em fungos patogênicos e são importantes na formação do

apressório, crescimento hifal invasivo e na patogênese fúngica, assim como nos

processos de crescimento e diferenciação.

Pouco é conhecido das vias de sinalização que controlam as mudanças

morfológicas em P. brasiliensis, assim como os sinais celulares quando da interação

com células do hospedeiro.

Assim em P. brasiliensis ainda são totalmente desconhecidas as prováveis vias

capazes de ativar sinais citosólicos associados ou não durante o processo de invasão

ligada aos receptores tirosina quinase ou outros ou a via de transdução de sinal

envolvendo fosfolipídios de membrana ou sinalização celular envolvendo citoesqueleto

com os receptores Ras/Raf.

Os mecanismos e fatores de virulência dos microrganismos são objetos de

estudo de muitos pesquisadores e no caso de infecções sistêmicas fúngicas, o

conhecimento da interação fungo-célula hospedeira, poderá servir para a melhor

compreensão dos mecanismos de patogenicidade e futuramente no desenvolvimento de

novas estratégias para circunscrever esta infecção fúngica.

É possível que fungos patogênicos induzam modulação de diferentes vias na

célula do hospedeiro para escapar de suas defesas e disseminar. Para um número de

patógenos, a habilidade de se ligar às glicoproteinas da matriz extracelular (MEC),

facilitando a internalização e a indução de apoptose é considerada como fatores

importantes na virulência. Além disso, reação específica dos fungos com as células

alvos do hospedeiro deve ser mediada pela interação carbohidratos ligados às proteínas,

que combinem com açúcares da superfície da célula do hospedeiro. Estas interações

necessitam de modelos de estudo para investigar quais moléculas estão envolvidas entre

adesinas presentes nos fungos e receptores na célula do hospedeiro (MENDES-

GIANNINI et al., 2000). Assim, neste trabalho empregando o modelo de culturas

celulares foram investigados os prováveis componentes envolvidos na adesão de

P.brasiliensis às células, procurando encontrar diferenças neste processo entre os

isolados Pb18 e Pb265, classicamente mais e menos virulentos, respectivamente. Assim

como, o papel dos isotipos da glicoproteína de 43 nos eventos durante adesão e invasão

de P.brasiliensis às culturas celulares.

1.4.1. Proteínas envolvidas em vias de sinalização celular

1.4.1.1. Proteina Raf Serina/treonina quinase

Raf são importantes nos sinais de transdução. Raf 1 é um membro desta família,

e é uma proteína citoplásmatica de massa molecular de 72-76 kDa com atividade

intrínseca de serina/treonina quinase, é expressa em muitos tipos de células e é o

homologo celular da Raf relacionada com a oncogene viral. v-Raf . Outros membros

desta família incluem A-Raf e Raf-B. Raf-1 fosforila e conseqüentemente ativa

MEK(MAP quinase). Proteínas Ras ligam-se a Raf-1, somente quando Ras está na sua

forma ativa (ligada a GTP). Estes resultados de interação em Raf medeiam a ativação de

MEK. Recentemente duas proteínas relacionadas à Raf foram descritas: Ksr-1 e Tak1

(TGFβ- quinase ativada), com função regulatória na cascata de sinalização de Ras

(TRAVERSE et al., 1993; MARAIS & MARSHAL, 1996; MARAIS et al., 1997;

MASON et al 1999).

1.4.1.2. Proteina Akt/PKB (Proteína quinase B)

As Akt são da família “AGC” das proteínas quinases, que incluem proteínas

quinases A, G, e C, que são ativadas em resposta a muitos sinais extracelulares e

participam de diversos processos celulares. Membros da família AGC são ativados pela

fosforilação do ponto T de seu domínio quinase por PDK1 e por fosforilação de um

resíduo localizado no C-terminal do seu domínio quinase na parte hidrofóbica. AKT-1

também conhecida como proteina quinase B ou PKB e a AKT2 relacionada à quinase,

ambas são rapidamente e especificamente ativadas por diversos ligantes como PDGF,

EGF e FGF básico. AKT3 é o terceiro membro da família, também designada como

proteína B gama ou “thyoma viral proto oncogene”, envolvida em adipócitos e

diferenciação muscular, síntese de glicogênio, aumento de glicose, apoptose e

proliferação celular,e ativação de insulina. Um membro da quarta família, é a SGK, que

tem um sitio catalítico similar ao da AKT1 (CHAN et al., 1999; SONG et al., 2005).

Alberts, 4. ed

Figura Ilustrativa da via de sinalização PIP3/PKB( proteína AKT- proteína quinase

1.4.1.3. Proteína Rho

As Rho GTPases, semelhantes à família Src (as quinases da família Src) são

enzimas associadas à membrana que podem reconhecer e ligar-se à seus substratos

específicos e transferir um grupo fosfato no resíduo tirosina da proteína alvo,

retransmite informações durante o estabelecimento e manutenção da morfologia,

polaridade, migração, e divisão celular. Ambas as vias de sinalização podem influenciar

de forma independente ou agir em paralelo. Entretanto Rho atua numa via muito

diferente da família Src quinase. Rho GTPases são moléculas que variam entre o estado

inativo GDP (guanosina difosfato) e o estado ativo GTP(guanosina trifosfato). Existem

20 diferentes Rho GTPases, que podem ser divididas em cinco classes, regulando

muitos aspectos diferentes de dinâmica do citoesqueleto. O ciclo entre a forma ativa e

inativa é regulado por GEFs (guanina nucleotídeo troca de fatores), GTPase ativando

proteinas (GAPs), e guanina nucleotídeo dissociação de inibidores. Ativação da

expressão dos membros Rho, Rac, e Cdc 42 da família Rho GTPases induz rearranjo na

actina do citoesqueleto que resulta na formação de fibras de stress, lamelopódios e

filopodia, respectivamente. O local de indução ou modulação destas mudanças

morfológicas durante a entrada do patógeno nas células do hospedeiro pode trazer

vantagens para a invasão do patógeno e também não é surpreendente que muitos

patógenos tenham desenvolvido mecanismos para interagir com estas e outras vias de

sinalização (MÜNTER . et al., 2006).

Figura ilustrativa da Regulação das Rho GTPases (MÜNTER, et al. 2006).

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVOS GERAIS

• Verificar se existe diferença intra-espécie e os possíveis fatores envolvidos na

adesão celular às duas linhagens de células epiteliais quando se comparam os

isolados de P.brasiliensis Pb18a e Pb265.

• Verificar os eventos de sinalização ocorridos durante invasão de P. brasiliensis às

células epiteliais.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Estudar comparativamente duas linhagens celulares quanto à adesão de dois

isolados de P.brasiliensis (Pb18a e Pb265).

• Avaliar a influência de diferentes tratamentos (térmicos, químicos e de

componente da matriz (laminina) e seus peptídeos sintéticos) no processo de

adesão desses isolados a células epiteliais.

• Avaliar eventos de sinalização relacionados ao citoesqueleto ocorridos

durante invasão de P. brasiliensis às células epiteliais.

• Avaliar eventos de sinalização ocorridos durante o tratamento da gp 43 às

células epiteliais.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Isolados estudados

Os isolados de Paracoccidioides brasiliensis (Pb-18 fungo recentemente

recuperado de inoculação animal , com propriedades adesivas aumentadas (Pb18a) e o

subcultivado (Pb18b), Pb-265, Pb-339), diferentes em seu grau de patogenicidade para

camundongos, foram utilizados no presente trabalho. Estes foram gentilmente cedidas

pela Dra. Vera L. Calich do Instituto de Ciências Biomédicas - USP. Os isolados foram

reisolados de animais e para isso suspensões padronizadas de 10

céls/mL da fase

leveduriforme, de cada isolado, foram inoculadas, via intratesticular em hamster. Após

7 dias, foi feita a retirada dos pulmões, baço e testículos. Os orgãos foram macerados,

semeados em ágar Fava Netto e após o crescimento das colônias, os isolados foram

mantidas em ágar Fava Netto a 35-37

3.2. Obtenção da gp 43

3.2.1. Filtrado de cultura

Os componentes exocelulares foram obtidos a partir do isolado 339 de

P.brasiliensis fase “L”. As leveduras, com 5 dias de crescimento em meio de Fava

Netto, foram inoculadas em 500ml de caldo Sabouraud ,asparagina e tiamina, e

incubado a 35

C por 10 dias, em estufa agitadora. Após este período, as células foram

tratadas com Timerosal na concentração final de 0,2 g/L e foram incubadas nas mesmas

condições durante quatro dias. A partir daí, foi obtido o filtrado de cultura e os extratos

foram analisados quanto aos teores protéicos pelo método de Lowry et al. (1951) e

avaliados por SDS-PAGE. Finalmente, foram aliquotados e congelados a –70

3.2.2. Fracionamento e purificação do antígeno de 43kDa

O filtrado de cultura do isolado 339 foi utilizado para a obtenção do antígeno de

43kDa. Para tanto, foi empregada a técnica de cromatografia de troca iônica, utilizando

a coluna Hitrap

QFF (Q Sepharose Fast Flow – catalogo n

17-5053-01- Amersham

Biosciences - GE Healthcare) no aparellho ÄKTA FPLC System da Amersham

Biosciences- GE Healthcare. Uma alíquota de 100 µL do filtrado de cultura foi aplicada

e a avaliação dos eluatos foi efetuada por SDS-PAGE.

3.2.3. Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio

(SDS-PAGE)

Os componentes protéicos dos antígenos foram separados por eletroforese em

gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio, SDS-PAGE, sob

condições redutoras, usando sistema tampão descontínuo de Laemmli, (1970) e Studier,

(1973).

A separação dos componentes foi efetuada em gel a 10%, e em gel de

empilhamento a 5% de acrilamida. O gel foi preparado a partir de uma solução estoque

contendo 30% por peso de acrilamida e 0,8% por peso de bis-acrilamida. No gel de

separação a polimerização foi feita em solução contendo 1,5 M de Tris-HCl, pH 8,8 e

0,4% de SDS, em presença de 0,1% v/v de N,N,N’,N’-tetrametil-etilenodiamina

(TEMED) e 0,1% de persulfato de amônio. O gel de empilhamento foi polimerizado em

presença de 0,5 M de Tris-HCl pH 6,8 e 0,4% de SDS, além de 0,1% de persulfato de

amônio e 0,05% v/v de TEMED. Para o preparo da amostra foram utilizados 64µL de

antígeno diluído em tampão de amostra (1:4), consistindo de 62,5 mM de Tris-HCl [tris

(hidroxi-metil) aminometano] pH 6,8, 2% de SDS, 10% de glicerol, 0,5 M de

ditiotreitol e 0,002% de azul de bromofenol.

As proteínas foram dissociadas pelo aquecimento da amostra em banho-maria

com água fervente por 3 minutos. Paralelamente à amostra, em cada corrida

eletroforética, uma mistura de proteínas de peso molecular conhecido foi utilizada, a

saber, fosforilase b (94 kDa), albumina bovina (67 kDa), ovoalbumina (43 kDa),

anidrase carbônica (30kDa), inibidor de tripsina (20 kDa) e lactoalbumina (14 kDa). A

partir da análise da migração destes padrões, os pesos moleculares das proteínas

antigênicas foram calculados.

A corrida eletroforética foi realizada a 10 mA (80 V) até que o corante

penetrasse no gel de separação e a 20 mA (120 V) até que atingisse o fim do gel. O

tampão de corrida é constituído de Tris 0,075 M, glicina 0,57 M e SDS 0,1%, pH 8,3.

3.2.4. Coloração dos géis pelo nitrato de prata

Esta coloração foi utilizada segundo o método descrito por Nielsen & Brown

(1984) para o gel de poliacrilamida acrescido de dodecil sulfato de sódio. Para tanto,

após a corrida eletroforética, a fixação do gel foi realizada com solução de ácido

tricloroacético a 10% por 30 minutos a 4°C. Em seguida, foram feitas 3 lavagens de 10

minutos cada, com solução de 10% de etanol mais 5% de ácido acético. Solução

oxidante foi adicionada a seguir, consistindo de 0,0034M de dicromato de potássio e

0,0032 N de ácido cítrico e o gel assim mantido por 5 minutos. Esta solução foi retirada

e após, o gel foi lavado com água milli-Q e a seguir foi adicionada uma solução de

nitrato de prata 0,012 M por 20 minutos no escuro e nova lavagem com água por 1

minuto. Foi então adicionada solução redutora consistindo de 0,28 M de carbonato de

sódio e 0,0185% de formaldeído. Após o desenvolvimento da cor, a coloração foi

bloqueada com solução de ácido acético a 5%, e o gel mantido nessa solução até a

documentação.

3.2.5. Análise protéica por eletroforese bidimensional.

A proteína de 43 kDa foi primeiramente submetida à focalização isoelétrica,

como descrito por O’Farrel, (1975). A segunda dimensão, realizada para a separação de

proteínas de acordo com a massa molecular, foi realizada em gel de poliacrilamida num

gradiente de 5 –15% de acordo com Laemmli, (1970). O gel foi corado com Coomassie

Azul Brilhante G-250, segundo Neuhoff et al. (1988).

3.3. Cultura celular

3.3.1. Cultura de células de linhagem contínua

Neste estudo, foram utilizadas três linhagens de células contínuas:

- células Vero : células epiteliais de rim normal de macaco verde da África

- célula HeLa : adenocarcinoma cervical humano

- células A

549

: células epiteliais respiratórias-pneumócitos

Ambas as linhagens foram obtidas de coleções de cultura. As células foram

cultivadas em garrafas de vidro tipo xarope, em meio 199 (células Vero e Hela) e em

meio HAM F12 (células A

549

) suplementados com 10% de soro fetal bovino, e mantidas

a temperatura de 36,5

Decorridos 3 a 4 dias, as garrafas de células foram submetidas a tripsinização.

Para isso, a monocamada celular formada foi lavada com 1 ml de ATV-solução de

tripsina 0,2% e EDTA 0,02% (Adolfo Lutz) e, após lavagem, esta foi desprezada e

acrescentado mais 1 ml de ATV. Seguidos 1-2 minutos, as células foram

homogeneizadas com volumes variados do meio correspondente acrescido de 10% de

soro fetal bovino (SFB). Nesta etapa, a tripsina (ATV) foi neutralizada pelo soro fetal

bovino presente no meio de cultura. O volume total da suspensão celular obtida foi

transferida para outras garrafas, de modo a se obter uma concentraçào celular de 10

células/ml.

3.3.2. Desenvolvimento do teste de adesão

3.3.2.1. Preparo das células para o teste

Os ensaios de adesão foram realizados em tubos especiais denominados tubos de

Leighton, que apresentam uma depressão achatada na qual se encaixa uma lamínula.

Para os testes realizados nestes tubos, a suspensão celular foi padronizada para 10

células/mL. Assim, após a tripsinização e homogenização da suspensão celular, 0,2mL

desta foi retirada da garrafa e diluída em 1,8mL de meio 199 com 10% soro fetal

bovino (SFB) e feita a contagem em hemocitômetro para que através de diluições

adequadas, fosse ajustada a concentração desejada. Ao término dessa etapa, 1,0mL da

suspensão padronizada de células foi inoculada nos tubos de Leighton e incubadas a

36,5

C por 24 horas, para que a monocamada celular se formasse sobre a lamínula,

sendo a partir daí, utilizada para os testes de adesão.

3.3.2.2. Preparo e padronização do inóculo de P.brasiliensis

P.brasiliensis foi cultivado em meio de Fava Netto por 4 a 5 dias, seguindo-se a

remoção das células e feita suspensão em solução fisiológica tamponada com fosfatos

(PBS) 0,05M, pH 7,2. A suspensão foi ajustada em 10

células/mL através de leitura

em espectrofotômetro (DO=0,5 a 550nm) e na escala 3,0 de MacFarland.

3.3.2.3. Infecção das células Vero e HeLa com P.brasiliensis

Após a formação do tapete celular confluente sobre a lamínula, o sobrenadante

da cultura foi desprezado e as células lavadas por três vezes com 1,0 mL de PBS 0,05M

pH 7,2 estéril. Em seguida cada tubo de Leighton recebeu 1,0 mL de novo meio de 199

com 10% SFB e 1,0 mL da suspensão padronizada de P.brasiliensis.

As células infectadas foram então incubadas a 37

C. A cinética de infecção foi

avaliada e o período de 2 horas foi adotado para todos os testes. Decorrido esse tempo,

as células foram então lavadas 5 vezes com PBS 0,05M pH 7,2 para remover os fungos

não aderidos e o tapete infectado foi então fixado com paraformaldeído a 4%. As

lamínulas foram coradas e após foram feitas as contagens das células leveduriformes

aderidas às células epiteliais.

3.3.2.4. Tratamentos da suspensão de células leveduriformes de

P.brasiliensis

Após padronização em PBS 0,05 M pH 7,2, alíquotas de 1,0mL da suspensão de

P.brasiliensis foram colocadas em condições assépticas em “eppendorfs”, realizando os

seguintes procedimentos:

3.3.2.5. Tratamento térmico

As triplicatas de cada suspensão dos isolados de P.brasiliensis (Pb-18a e Pb-

265) foram submetidas aos seguintes tratamentos térmicos: a) 121

C/10’ em autoclave,

b) 100

C/10’ em banho-maria e c) 56

C/30’ em banho-maria.

Após o tempo de tratamento, foram realizadas três lavagens com PBS 0,05 M,

pH 7,2 estéril com centrifugações a 1.000 x g à 4

Paralelamente os tubos de Leighton foram lavados com PBS 0,05 M, pH 7,2 por

três vezes para remover células mortas ou não aderidas, adicionado novo meio de

MEM com 10% SFB e 1,0mL de suspensão de P.brasiliensis previamente tratado.

Estes tubos foram então levados à estufa de 37

C por 2 horas para que ocorresse

a interação fungo-célula. Após esse prazo, os tubos foram lavados por cerca de 5 vezes

com PBS 0,05M, pH 7,2, para remover as leveduras não aderidas às células. A fixação

foi então feita com paraformaldeido a 4% por no mínimo 2 horas. Decorrido esse

tempo, a lamínula foi retirada do tubo de Leighton, lavada com água destilada, seca e

submetida à coloração. O controle de infecção foi feito com suspensão de P.brasiliensis

livre de tratamento e mantida nas mesmas condições.

3.3.2.6. Tratamento com tripsina a 0,2%

Como descrito anteriormente, a suspensão de P. brasiliensis após padronização

foi centrifugada a 1.000 x g à 4

C e ao sedimento foi adicionado 1,0 mL de tripsina

0,2% (Adolfo Lutz). A suspensão foi homogeneizada e mantida a 37

C em estufa por 60

minutos.

Após esse tempo foi removida a tripsina por centrifugação e as células

leveduriformes foram lavadas e centrifugadas à 1000 x g à 4

C por três vezes com PBS

0,05 M, pH 7,2 estéril, para remoção de qualquer resíduo.

3.3.2.7. Tratamento com formalina a 4%

O mesmo procedimento descrito para o tratamento da tripsina foi feito para a

formalina, sempre mantendo a suspensão de P. brasiliensis por 60 minutos de contato

com o agente químico e removido da mesma forma como descrito no item 3.3.2.6.

3.3.2.8. Tratamento com periodato de sódio 10 mM

Foi utilizado periodato de sódio na concentração de 10 mM em PBS 0,05 M, pH

7,2, sendo este filtrado em membrana de 0,22 µm.

As suspensões de P.brasiliensis, após padronização como descrito no ítem 4,

foram mantidas em contato com o periodato de sódio por 60 minutos a 37

C, no mesmo

procedimento que o item 3.3.2.6.

3.3.2.9. Tratamento com azida sódica 10 mM

Foi também utilizada a azida sódica na concentração de 10 mM/mL em PBS

0,05 M, pH 7,2 e filtrada em membrana de 0,22 µm. O mesmo procedimento do item

3.3.2.6 foi feito.

3.3.2.10. Tratamento com Concanavalina A

Foi utilizada concanavalina A na concentração de 10 µg/mL diluída em PBS

0,05 M, pH 7,2 e filtrada em membrana de 0,22 µm. Repetiu-se o procedimento do item

3.3.2.6.

3.3.2.11. Tratamento com açúcares

Neste teste foram utilizados os seguintes açúcares: D(+) glucosamina, D(+)

galactosamina, alfa-lactose, D(+) manose, mio-inositol, D(+) galactose, D(+)glicose e

maltose. Foram preparadas soluções a 2,5% em PBS 0,05 M, pH 7,2 seguindo-se

esterilização por filtração em membrana 0,22 µm. Para cada isolado de P. brasiliensis e

cada linhagem celular (Vero e HeLa) foi feito o mesmo procedimento descrito no item

3.3.2.6.

Foi também realizado o ensaio do tipo competitivo para alguns açúcares, tais

como: glicose, manose, galactosamina, galactose e glucosamina. Neste caso, os

açúcares e o P.brasiliensis foram adicionados concomitantemente ao tapete celular.

3.3.2.12. Tratamento com quitina a 2,5%

A quitina (Sigma C-9752) foi também preparada na concentração de 2,5%, mas

antes foi tratada com ácido clorídrico por 2 horas a 0

C e por 3 horas a 40

C, sendo

posteriormente neutralizada com NaOH (RUPLEY, 1964; SEGAL et al., 1982). Seguiu-

se esterilização por filtração em membrana filtrante 0,22µm. Após sua esterilização,

utilizou-se no ensaio como descrito no ítem 3.3.2.6.

3.3.2.13. Tratamento em diferentes pHs

As alíquotas de P.brasiliensis acondicionadas em eppendorfs, sofreram a ação

de diferentes pHs e após seguiu-se o mesmo procedimento que o item 3.3.2.6.

3.3.2.14. Tratamento com soro humano normal

Soros de doadores voluntários, com sorologia negativa para a

paracoccidioidomicose foram usados no teste. Estes soros foram diluídos

assepticamente na proporção 1:10 em PBS 0,05 M, pH 7,2 e testados.

3.3.2.15. Tratamento com soro humano normal inativado

Os soros obtidos de doadores voluntários, com sorologia negativa para

paracoccidioidomicose foram inativados, por 30 minutos em banho-maria a 56

Depois foram diluídos na proporção de 1:10 e utilizado conforme o descrito no item

3.3.2.6.

3.3.2.16. Tratamento com heparina

Foi utilizada heparina na concentração de 0,25 mg/mL, preparada de forma

asséptica e diluída em PBS 0,05 M, pH 7,2 e utilizado conforme o descrito no item

3.3.2.6.

3.3.2.17. Tratamento com laminina

A laminina (Sigma L-8263) foi empregada na concentração de 20 µg/mL em

PBS 0,05M, pH 7,2 estéril. A suspensão de P. brasiliensis após padronização no

espectrofotômetro, foi centrifugada a 1.000 x g à 4

C e ressuspensa em um volume de

250 µL junto com a laminina. Em seguida a suspensão foi inoculada no tubo de

Leighton com a cultura de células de escolha, sendo mantida por 2 horas a 37

C para a

realização do teste de infecção. Após esse período, o tubo foi lavado 5 vezes em PBS

0,05M pH 7,2 e a lamínula fixada com paraformaldeido a 4%, lavada em água destilada

e seca para ser posteriormente corada.

3.3.2.18. Tratamento com peptídeos sintéticos

Foram utilizados os seguintes peptídeos: a)Tyr-Ile-Gly-Ser- Arg (YIGSR) Sigma

(T-7154), b)Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH

Sigma (C-1668).

Todos foram preparados na concentração de 100 µg/mL em PBS 0,05 M, pH 7,2

estéril, sendo filtrado em membrana de 0,22 µm. O mesmo procedimento foi feito

conforme descrito no item 3.3.2.17.

3.4. Coloração das lamínulas

3.4.1. Coloração de May-Grunwald/Giemsa

Após fixadas, as lamínulas foram lavadas 5 vezes com tampão PBS, retiradas do

interior dos tubos de Leighton e lavadas em água destilada e secas à temperatura

ambiente. A seguir, as lamínulas foram coradas com solução de May-Grunwald (eosina

e azul de metilo) a 2%, diluído a 1:2 em tampão Sorensen, permanecendo na mesma por

10 a 20 minutos. Após serem lavadas, as lamínulas foram coradas pelo Giemsa por

cerca de 3 minutos. Na sequência, as lamínulas foram lavadas em água destilada, secas,

colocadas em lâminas de vidro com o tapete para cima, e fixadas com esmalte incolor.

A seguir, as lamínulas foram observadas ao microscópio ótico.

3.4.2. Coloração por ácido periódico de Schiff (PAS)

A coloração pelo método de PAS foi feita após a fixação das células infectadas

com solução de paraformaldeio a 4%. O material foi imerso em ácido periódico a 1%,

por 5 minutos, à temperatura ambiente e lavado em água destilada. Em seguida, as

lamínulas permaneceram no reativo de Schiff por 45 minutos, à temperatura ambiente

em câmara escura. A reação foi interrompida com ácido sulfuroso, preparado no

momento de uso, colocando-se as lamínulas em três banhos de imersão de 2 minutos

cada. Para retirar o excesso de corante, as células foram lavadas em água destilada e

coradas no final com verde brilhante por 10 minutos. Após, foram lavadas em água

destilada, secas à temperatura ambiente e montadas em lâmina para observação ao

microscópio.

3.4.3. Contagem das células e dos fungos aderidos

Todos experimentos foram realizados em triplicatas. As lâminulas, após

coloração foram montadas em lâmina e observadas em microscópio ótico em objetiva

de imersão.

As lamínulas foram percorridas em toda a sua extensão, procurando-se anotar o

número de células associadas com o fungo. Estas foram consideradas como contagem

de infecção. A lamínula foi percorrida em “zigue-zague” e observados todos os campos

para a avaliação.

3.5. Ensaio de sinalização

Foram realizados ensaios para testar as diferentes vias de sinalização ativada

durante a interação de P. brasiliensis com células epiteliais. Foram testadas as prováveis

vias capazes de ativar sinais citosólicos associados ou não ao citoesqueleto durante o

processo de invasão:Ras/Raf e Rho.

Para os ensaios, 1x10

células foram cultivadas em garrafas de cultura contendo

meio HAM F-12 acrescido de 10% de soro fetal bovino. Após a confluência do tapete

celular, o sobrenadante foi removido e as células lavadas com 1ml de PBS 0,05 M pH

7,2 estéril. Em seguida, as garrafas foram inoculadas com suspensão padronizada (3 X

cél/mL) de P. brasiliensis isolado com o fungo recentemente recuperado de

inoculação animal, com propriedades adesivas aumentadas (Pb18a) e o subcultivado

(Pb18b), bem como o tratamento com a gp43 purificada do isolado 339, apresentando 6

isotipos, na concentração final de 25µg/mL (concentração escolhida após

padronização), diluída em PBS e meio de cultivo da célula (v/v). Foram testados vários

períodos de tempo: 10 min, 30 min, 1h, 5h, 8h, 24h, 48h e 72h. Como controle do

experimento foram utilizadas células não infectadas ou não tratadas (células normais).

Para as proteínas Raf e Akt após os períodos de infecção, as células foram

lavadas com PBS 0,05 M pH 7,2 gelado para eliminação das células fúngicas não

aderentes às culturas celulares ou remoção da proteína gp43. As células foram

removidas da garrafa com tampão de lise gelado (100 µg/mL fenilmetilsufonil fluoreto

(PMSF) dissolvido em etanol absoluto , NP-40 1%, SDS 0,1 % e aprotinina na

concentração final de 1,0 µg/mL dissolvido em PBS) e em seguida foram centrifugadas

a 8.000 x g à 4

C. Após, foi estimada a quantidade de proteína da amostra através do

método de LOWRY et al., (1951). A detecção da proteína Rho fosforilada foi feita com

Rho Activation Assay kit (USBiological), de acordo com as instruções do fabricante.

Os sobrenadantes dos lisados celulares ( 100 µg de proteina) foram submetidos

ao SDS-PAGE e transferidos para papel de nitrocelulose (TOWBIN et al., 1979) para a

realização da técnica de imunotransferência. Para tanto as membranas foram

bloqueadas com 5% de leite de leite molico em PBS-Tween 20 0,1% por 1 h, lavadas

brevemente com PBS-T e incubadas por 18h com os anticorpos primários: anti-Raf

(1/1000) e anti-Rho (1/200), procedência USBiological, em 2% de leite em PBS-T e o

anticorpo Anti-AKT1/2/3 (1/250), procedência Santa Cruz. Os anticorpos foram

diluídos de acordo com as descrições do fabricante. Após 3 lavagens com PBS-T foi

adicionado o anticorpo secundário marcado com peroxidase, foi utilizado anti-IgG de

coelho (Sigma) à 1/500 para a detecção dos anticorpos anti-Raf e anti-AKT 1/2/3 e para

o anticorpo anti-Rho foi utilizado anti-IgG de camundongo (Sigma) à 1/50. A revelação

foi feita utilizando o Kit ECL – Western Blotting Analysis System (GE Healthcare) ou

pelo reagente preparado no laboratório (10% de Tris 1M ph 8,5, 0,22% de ácido p-

cumárico (Sigma) a 1,47% e 0,5% de solução de luminol (Sigma) a 4,4%. Ao reagente

de detecção preparado no laboratório foi adicionado 0,03% de H

a 30% no momento

do uso. As membranas foram colocadas no cassete em contato com o filme, em seguida

os filmes foram autoradiografados e fotografados. A participação das proteínas

fosforiladas Raf, AKT e Rho durante a interação de P. brasiliensis-célula epitelial foi

observada através da presença de bandas na membrana correspondente a massa

molecular de cada proteína fosforilada investigada.

3.6. Análise estatística

Em cada experimento foram considerados 2 fatores: fator A-fungo e fator B-

tratamento, variável de acordo com o experimento. Foram utilizadas triplicatas para

cada variável analisada.

Foi utilizada a análise de variância para fatorial, inteiramente aleatorizado com

os testes das hipóteses: interação entre os 2 fatores, efeito do fator A e efeito do fator B.

Em cada hipótese testada foi calculada a estatística F que foi considerada significativa

quando p<0,05 (probabilidade de erroneamente admitir a significância). Os contrastes

entre pares de médias foram verificados pelo método de Tukey considerando α=0,05

(ZAR, 1984).

4- RESULTADOS

4.1. Análise protéica por eletroforese bidimensional.

Os filtrados de cultura dos isolados 18a e 339 de P. brasiliensis foram

submetidos à eletroforese bidimensional para verificar a diferença de expressão da gp

43 e seus respectivos pontos isoelétricos (pIs). Os resultados demonstraram que a gp 43

do filtrado de cultura do isolado 18 apresentava três pontos isoelétricos (8,0, 7,73, 7,45)

enquanto que a gp 43 do filtrado do isolado 339 apresentava seis pontos isoelétricos (

7,90, 7,59, 7,30, 7,07, 6,85, 6,63).

Figura 1: Eletroforese bidimensional de antígenos filtrado de culturas dos isolados 339

e 18de P. brasiliensis. Géis corados pelo Coomassie Brilliant Blue. À direita está

indicado a massa molecular correspondente à gp 43 (MM).

4.2. Resultados da adesão dos isolados de Pb18 e Pb265 às células Vero e

HeLa

O processo de adesão dos isolados de P. brasiliensis Pb18 e Pb265 às linhagens

celulares Vero e HeLa foi avaliado inicialmente corando-se as lâminulas pelo método

de May-Grunwald-Giemsa e posteriormente substituído pela coloração de PAS

modificada, pois esta última se mostrou muito mais eficiente na identificação do fungo

aderido às células tanto de linhagem Vero como HeLa .

Os resultados dos testes de aderência dos isolados de P. brasiliensis Pb18 e

Pb265 às células Vero e HeLa estão representados na tabela 1. O isolado de Pb18 é

significativamente (p<0,05) mais adesiva que o isolado de Pb265, independente da

linhagem celular empregada. Por outro lado, quando as duas linhagens celulares, foram

comparadas não há diferença estatisticamente significativa na aderência.

Tabela 1: Resultados dos testes de aderência dos isolados de P.brasiliensis Pb18 e

Pb265 às células Vero e HeLa.

médio ±

±±

± DP de

Isolados

P. brasiliensis aderidos por células

Vero

HeLa

Pb18

33,2±2,7 34, 9±3,0

Pb265

25,2±2,4 25,7±2,6

Dados apresentam as médias mais desvio padrão de 3 experimentos.

a: diferença estatisticamente significante (p<0,05) pela análise de variância da adesão

dos isolados Pb18 e Pb265, em culturas de células Vero.

b: diferença estatisticamente significante (p<0,05) pela análise de variância da adesão

dos isolados de Pb18 e Pb265 em culturas de células HeLa.

4.3. Influência de tratamentos térmicos, químicos e de algumas substâncias

na adesão de P. brasiliensis

a) Tratamento térmico

O tratamento das células leveduriformes de P.brasiliensis de Pb18 e Pb265

frente a diferentes temperaturas, principalmente as mais drásticas, reduziu a aderência

às células Vero e HeLa (Figuras 2 e 3). O efeito mais pronunciado ocorreu com as

temperaturas de 121°C e 100°C e em menor extensão e sem significado estatístico a de

56°C (Tabelas 2 e 3 - em anexo).

100

121 C 100 C 56 C

Temperatura

% de adesão

Pb18

Pb265

Figura 2: Resultados da adesão dos isolados de

P.brasiliensis

Pb18 e

Pb265 às células Vero após tratamento em diferentes temperaturas.

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

100

121 C 100 C 56 C

Temperatura

% de adesão

Pb18

Pb265

Figura 3: Resultados da adesão dos isolados de

P.brasiliensis

Pb18 e Pb265 às

células HeLa após tratamento em diferentes temperaturas.

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

Os isolados de Pb18 e Pb265 sofreram redução na aderência de

aproximadamente 50% quando tratadas a 121°C, mostrando que este fungo tem

estruturas da parede sensíveis a esse tratamento envolvidas no processo de adesão.

O tratamento dos isolados Pb18 e Pb265 a temperatura de 100°C alterou também

adesão em 36,6% e em 22,5%, respectivamente.

O tratamento a 56°C não alterou os resultados da adesão significativamente

(p<0,05); discreta redução na adesão foi observada em torno de 10% e 16% das

amostras Pb18 e Pb265 as células Vero e 24% e 13% às células HeLa, respectivamente.

b) Tratamento com agentes químicos e lectinas

A ação de várias substâncias foi estudada no processo de adesão: formalina,

azida sódica, periodato de sódio e concanavalina A (Figuras 4 e 5).

Os tratamentos com azida sódica, periodato de sódio e concanavalina A

alteraram significativamente a adesão dos isolados de P.brasiliensis às células Vero e

HeLa (Tabelas 4 e 5- em anexo).

100

120

A B C D

Tratamento

% de adesão

Pb18

Pb265

Figura 4: Resultados do efeito de agentes químicos e da lectina na adesão dos isolados de

P.brasiliensis

Pb18 e Pb265 às células Vero.

A- Formalina 4% B- Azida Sódica 10 mM

- Periodato de sódio 10mM

- Concanavalina A

10 ug/mL

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

100

A B C D

Tratamento

% de adesão

Pb18

Pb265

Figura 5: Resultados do efeito de agentes químicos e da lectina na adesão dos isolados

de P.brasiliensis Pb18 e Pb265 às células HeLa.

A- Formalina 4%

B Azida sódica 10 mM C- Periodato de sódio 10 mM D -

Concanavalina A 10 ug/mL

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

O tratamento com formalina por uma hora não alterou significativamente a

adesão dos isolados de P.brasiliensis às linhagens Vero e HeLa.

A oxidação dos carboidratos por periodato de sódio reduziu a aderência dos

isolados Pb18 e Pb265 às células Vero em 51,1% e 41,1%, respectivamente. Em relação

a linhagem HeLa a redução foi de 53,5% para o isolado Pb18 e 52,8% para Pb265. O

tratamento com periodato de sódio reduziu em aproximadamente 50% a adesão deste

fungo às linhagens celulares.

A azida sódica que é inibidor metabólico, reduziu a adesão dos isolados Pb18 e

Pb265 às células Vero em 38,6 e 44,5%, respectivamente e às células HeLa em 35,8% e

35,5%.

Concanavalina A inibiu significativamente a aderência dos isolados Pb18 e

Pb265 às células Vero e HeLa. A maior inibição ocorreu com o isolado Pb265 em

relação às células Vero (50%).

* *

c) Ação do pH

A variação do pH do meio interfere no padrão de aderência. A maior adesão foi

observada em pH próximo de 7,3, enquanto que em pHs ácidos ou alcalinos ocorreu

diminuição da adesão independente da linhagem celular e do isolado (Figuras 6 e 7).

4,5 5 6 7 8 8,5

adesão celular

Pb18

Pb265

Figura 6: Resultado da ação de diferentes pHs na adesão dos

isolados de

P.brasiliensis

Pb18 e Pb265 às células Vero.

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

4,5 5 6 7 8 8,5

adesão celular

Pb18

Pb265

Figura 7: Resultado da ação de diferentes pHs na adesão dos

isolados de

P.brasiliensis

Pb18 e Pb265 às células HeLa.

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

d) Ação dos tratamentos com soro, tripsina e heparina

As figuras 8 e 9 e as tabelas 6 e 7 (em anexo) representam os resultados de

adesão às células Vero e HeLa, respectivamente, quando os isolados de P.brasiliensis

foram tratadas com tripsina, com soro humano normal e inativado e com heparina.

O tratamento de P. brasiliensis com tripsina reduziu significativamente a adesão

às células Vero e HeLa. Os isolados Pb18 e Pb265 apresentaram redução em relação às

células HeLa de 59,0% e 54,5%, respectivamente.

Com relação aos outros tratamentos, como soro humano normal e inativado e o

uso da heparina, as diferenças encontradas não foram estatisticamente significantes.

100

120

A B C D

Tratamento

% de adesão

Pb18

Pb265

Figura 8: Resultados do efeito de diversas substâncias de isolados de

P.brasiliensis

Pb18 e Pb265 às células Vero.

A- Tripsina B- SHN C- SHN inativado D- Heparina

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

100

120

A B C D

Tratamento

% de adesão

Pb18

Pb265

Figura 9: Resultados do efeito de várias substâncias na aderência de isolados

P.brasiliensis

Pb18 e Pb265 às células HeLa.

A- Tripsina B- SHN C- SHN inativado D- Heparina

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

4.4. Papel dos açúcares na aderência de P.brasiliensis às células epiteliais

a) Teste por inibição

Nas figuras 10 e 11 estão representados os resultados de adesão dos isolados

Pb18 e Pb265 às células Vero e HeLa, quando tratados por diferentes açúcares.

Os açúcares aminados glucosamina e galactosamina, seguido de manose

inibiram significativamente a adesão às células Vero (Tabela 8- em anexo). O grau de

inibição com os dois primeiros açúcares foi semelhante, oscilando em torno de 50%. A

glucosamina inibiu em 47,6% e 51,5%; a galactosamina inibiu em 44,7% e 49,9% e a

manose em 34,9% e 44,6%, respectivamente para os isolados Pb18 e Pb265.

Em relação às células HeLa o padrão de inibição foi semelhante (Tabela 9-em

anexo). Assim, foi observado que glucosamina reduziu a aderência dos isolados Pb18 e

Pb265 em 29,9 e 41,9%; respectivamente; enquanto que galactosamina reduziu em

29,3% e 48,6% e manose em 39,7% e 34,8%.

Os outros açúcares não alteraram significativamente o padrão de adesão de

P.brasiliensis às linhagens célulares e a quitina comercial não diminuiu

significativamente a aderência dos isolados às células epiteliais.

100

120

140

A B C D E F g H I

Açúcares/quitina

% de adesão

Pb18

Pb265

Figura 10: Resultado do efeito de vários açúcares e quitina na aderência de

P.brasiliensis

Pb18 e Pb265 às

células Vero por inibição. A- D (+) glucosamina B- D(+) galactosamina C- alfa-lactose

D- D(+) manose

E- mio-inositol F- D(+) galactose G- D(+) glicose

H- maltose

I- quitina

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

100

120

A B C D E F G H I

Açúcares/quitina

% de adesão

Pb18

Pb265

Figura 11: Resultado do efeito de açúcares e quitina na aderência de isolados de

P. brasiliensis

Pb18 e Pb265

às células Hela ensaio por inibição. A- D(+) glucosamina B- D(+) galactosamina

C- alfa- lactose D- D(+) manose E- mio-inositol F- D(+) galactose G- D(+) glicose H- maltose I- quitina

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

b) Teste competitivo

O emprego dos açúcares glicose, manose, galactosamina, galactose e

glucosamina em ensaio competitivo apresentou resultados similares ao teste por

inibição: apenas a glucosamina, a galactosamina e manose interferiram no processo de

adesão de forma significativa, provocando uma inibição em torno de 30% para os

isolados fúngicos, independente da linhagem celular (Figuras 12 e 13).

A manose inibiu a adesão de Pb18 e Pb265 às células Vero em 31,5% e 29,7%

respectivamente, e em relação às células HeLa 37,4% e 28,8% (Tabelas 10 e 11 – em

anexo).

A inibição pela galactosamina foi de 34,5% e 26,3%, respectivamente para os

isolados Pb18 e Pb265 em relação às células Vero, e de 34,4,5% e 29,0% com as

células HeLa.

A glucosamina inibiu a adesão de Pb18 e Pb265 as células Vero em 30,7% e em

30,9%, respectivamente. Em células HeLa a inibição foi de 27,3% para Pb18 e 32,4%

para Pb265.

100

120

A B C D E

% de adesão

Pb18

Pb265

Figura 12: Resultados da influência dos açúcares no processo de adesão de isolados de

P.brasiliensis

Pb18

e Pb265 às células Vero por ensaio competitivo.

A- Glicose B- Manose

- Galactosamina

- Galactose E- Glucosamina

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

100

A B C D E

% de adesão

Pb18

Pb265

Figura 13: Resultados da influência dos açúcares no processo de adesão de isolados

P.brasiliensis

Pb18 e Pb265

às células HeLa por ensaio competitivo.

A- Glicose B- Manose

- Galactosamina D- Galactose

F-

Glucosamina.

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

* *

4.5. Interações proteína-proteína na adesão de P.brasiliensis

Na tentativa de se conhecer o mecanismo molecular envolvido na adesão de

P.brasiliensis às células, foram feitos ensaios com proteínas da matriz extracelular e

peptídeos sintéticos. O potencial de certo peptídeo de agir como antagonista na adesão

do fungo às células foi diretamente avaliado como grau de adesão, tentando assim

estabelecer os tipos de interação deste fungo.

O uso da laminina em ensaio competitivo entre as células e elementos fúngicos

possibilitou melhor avaliação da adesão dos isolados às culturas celulares (Figuras 14 e

15).

A laminina promoveu maior inibição da adesão do isolado Pb18 às células Vero

(41,3%) e HeLa (39,2%), quando comparado com a adesão do isolado Pb265 as mesmas

células.(Tabelas 12 e 13 – em anexo).

Os resultados da adesão dos isolados fúngicos pré-tratadas com peptídeos

sintéticos derivados da laminina nas tabelas 14 e 15 (em anexo) e dependendo do

peptídeo utilizado, foi observada inibição no processo de adesão (Figuras 16 e 17).

O peptídeo sintético CDPGYIGSR-NH

derivado da cadeia B da laminina inibiu

a aderência em 47,2% do isolado Pb18 às células Vero, enquanto que houve redução de

17,2% com o isolado Pb265. Com a linhagem HeLa, este peptídeo inibiu a aderência

em 47,4% e 16,5%, respectivamente os isolados Pb18 e Pb265. O peptídeo YIGSR

inibiu a adesão em 57,0% e 14,2%, respectivamente os isolados Pb18 e Pb265 em

relação as células Vero, e 53,1% e 15,2% para as células HeLa. Assim, os dois

fragmentos inibiram significativamente a aderência do isolado Pb 18 às células Vero e

HeLa (Tabelas 14 e 15). Comparando-se o comportamento dos isolados frente aos

peptídeos sintéticos verificou-se que houve diferença significativa (p<0,05) entre estas

em relação aos peptídeos derivados da laminina.

100

LAMININA

% de adesão

Pb18

Pb265

Figura 14: Resultados da influência da laminina no processo de adesão de amostras

P.brasiliensis

Pb18 e Pb265 às células Vero em ensaio competitivo.

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

100

LAMININA

% de adesão

Pb18

Pb265

Figura 15: Resultados da influência da laminina no processo de adesão de amostras de

P.brasiliensis

Pb18 e Pb265 às células Hela em ensaio competitivo.

*diferença estatisticamente significante (p<0,05)

100

A B

% de adesão

Pb18

Pb265

Figura 16: Resultados da influência de peptídeos sintéticos derivados de laminina na

aderência de amostras de

P.brasiliensis

Pb18 e Pb265 às células Vero. A- YIGSR B-

CDPGYISR *diferença estatisticamente significante (p<0,05)

A B

% de adesâo

Pb18

Pb265

Figura 17: Resultados da influência de peptídeos sintéticos derivados de laminina

aderência de isolados de

P.brasiliensis

Pb18 e Pb265 às células HeLa. A- YIGSR B-

CDPGYIGSR *diferença estatisticamente significante (p<0,05)

4.6. Imunotranferência – Evento de sinalização celular

O anticorpo anti-Raf fosforilado foi testado através de imunotransferência com

os sobrenadantes obtidos das culturas de células A549 não infectadas e também de

células infectadas com P.brasiliensis isolado Pb18a e pb18b, bem como células

tratadas com a proteína gp 43 na concentração de 25 ug/mL, por diferentes períodos (10

min, 30 min, 1h, 5h, 8h, 24h, 48h e 72 h).

Foi detectada uma proteína de 65 kDa correspondente à proteina Raf (Figura

18). No período de 10 min a 8 h foi observado aumento na expressão da proteína Raf

fosforilada tanto em células controle como nas infectadas com P. brasiliensis avirulento

e virulento e nas tratadas com gp43, com exceção de menor ativação com o fungo

avirulento e com a gp43 em 30 minutos. No período de uma hora há nítido aumento da

expressão de Raf com o fungo virulento e a gp43. Até 24 horas foi observada expressão

semelhante da proteína Raf fosforilada nas células controles e nas células infectadas

com o fungo e tratadas com a gp 43. A partir de 24 horas, diminuição na expressão de

Raf foi observada tanto nas células controle como nas infectadas e tratadas, sendo mais

acentuada com o fungo virulento.

Figura 18: Imunotransferência dos sobrenadantes de células A549 lisadas nos

diferentes períodos de tempo. Revelação com o anticorpo anti-Raf fosforilado. A:

células controle; B: células infectadas com P. brasiliensis isolado Pb18b; C: células

infectadas com P. brasiliensis isolado Pb18a ; D: células tratadas com gp43 (25

µg/mL).

A B C D

72h

30 min

48h

24h

10 min

A figura 19 mostra o perfil de expressão da proteína AKT, de 56 kDa, em

diferentes períodos de tempo por imunotransferência, utilizando o anticorpo anti- AKT

1/2/3. No período de 10 min a 5 h foi observado aumento de expressão da proteína AKT

fosforilada nas células infectadas com o fungo Pb18a e Pb18b e nas tratadas com gp 43

em relação às células controles. Diminuição na expressão desta proteína foi observada a

partir de 8 horas, chegando a pouca expressão em 48 horas, principalmente nas células

tratadas com o fungo virulento.

Figura 19 : Imunotransferência dos sobrenadantes de células A549 lisadas nos

diferentes períodos de tempo. Revelação com o anticorpo anti-AKT 1/2/3 fosforilado.

A: células controle; B: células infectadas com P. brasiliensis isolado ( Pb18b); C:

células infectadas com P. brasiliensis isolado (Pb18a); D: células tratadas com gp43 (25

µg/mL).

30 min

A B C D

10 min

48h

24h

O perfil de expressão da proteína Rho fosforilada foi avaliado nos sobrenadantes

dos lisados de culturas de células A549 não infectadas e infectadas com P. brasiliensis

isolado 18 (Pb18b e Pb18a) , bem como células tratadas com gp43 (25 ug/mL) nos

seguintes tempos: 30 min, 8h , 24h, 48h e 72h. Foi revelada uma proteína de 29 kDa

correspondente à proteina Rho. No período de 8 h foi observado aumento na expressão

de Rho nas células infectadas com o fungo e nas células tratadas com gp43. Nas células

infectadas com o fungo Pb18a e tratadas com a gp 43 foi observada diminuição na

expressão desta proteína nos períodos de 24 e 48 h; a expressão foi semelhante a do

período anterior nas células tratadas com o fungo Pb18b. No período de 72 horas, uma

diminuição significativa na expressão de Rho foi observada em todos os tratamentos em

relação às células não tratadas (figura 20).

Figura 20: Imunotransferência dos sobrenadantes de células A549 lisadas nos

diferentes períodos de tempo. Revelação com o Rho Activation Kit (USBiological) A:

células controle; B: células infectadas com P. brasiliensis isolado Pb18b; C: células

infectadas com P. brasiliensis isolado Pb18a; D: células tratadas com gp43 (25 µg/mL).

30 min.

72hs

48hs

24hs

8hs

A B C D

5. DISCUSSÃO

5.1. Bases moleculares no processo de adesão

O processo de infecção envolve duas etapas principais: a entrada do fungo e o

seu estabelecimento com conseqüente colonização do tecido, culminando na produção

de lesões progressivas. A aderência dos microrganismos patogênicos aos tecidos tem

sido apontada como primeiro passo na colonização e disseminação do parasito sendo

até, considerada como pré-requisito para a infecção (LENZI et al., 2000). As bases

moleculares do processo de adesão, aparentemente variam de acordo com a natureza do

patógeno. Essa interação específica é mediada por moléculas referidas como adesinas,

que se combinam com estruturas complementares das células hospedeiras referidas

como receptores. Vários trabalhos têm procurado elucidar os mecanismos e as prováveis

adesinas de fungos como em C. albicans (HOSTETTER, 1994), A. fumigatus

(TRONCHIN et al., 1993), H. capsulatum (McMAHON et al., 1995; GIL et al., 1996;

PEÑALVER et al.,1996) e P. brasiliensis ( VICENTINI, et al.1994; MENDES-

GIANNINI, et al.,1994; HANNA, et al., 2000; MENDES-GIANNINI et al., 2000;

ANDREOTTI et al., 2005; GONZALEZ et al., 2005; BARBOSA et al., 2006).

Em trabalhos anteriores, P. brasiliensis sem qualquer tratamento prévio, foi

capaz de aderir, seguido aparentemente de invasão de células epiteliais de linhagem

contínua (MENDES-GIANNINI, 1994B; HANNA, 1995; UEMURA, 1996). Foi

também observado que isolados de P. brasiliensis são capazes de aderir às células

epiteliais após 30 minutos e que os mais virulentos para animais (SINGER-VERMES et

al., 1989) têm também maior capacidade de adesão (HANNA et al., 2000). Os isolados

com comportamento polar são Pb18, mais virulenta e Pb 265 menos virulenta.

Na continuação desta linha de trabalho, pretendeu-se estudar os fatores

envolvidos na aderência, comparando as duas linhagens celulares Vero e HeLa

utilizando dois isolados de P. brasiliensis Pb18 e Pb265, respectivamente, mais ou

menos virulento, de acordo com estudos em animais e mais e menos aderentes, em

estudos de ligação à células Vero (SINGER-VERMES et al., 1989; HANNA, 1995;

UEMURA, 1996; HANNA et al., 2000).

A adesão de células de P. brasiliensis aos tecidos do hospedeiro deve ser um dos

passos cruciais no estabelecimento da paracoccidioidomicose. A habilidade do fungo

em aderir às células epiteliais pode representar um mecanismo no qual o fungo evitaria

o muco que recobre os ductos respiratórios e o movimento das células ciliares, tendo

então papel na patogenese. Entretanto, pouco é conhecido como este mecanismo ocorre.

Assim, o desenvolvimento de P. brasiliensis requer inicialmente a adesão dos

conídios (formas infectantes) ao epitélio bronco-pulmonar, ou à membrana basal sub-

epitelial bem como a produção de várias enzimas incluindo proteases que mediariam a

subseqüente invasão (GONZALEZ et al., 2005).

Embora nessa parte do estudo as linhagens celulares epiteliais não seja derivadas

de células pulmonares, elas possuem proteínas da matriz extracelular e em conseqüência

receptores que são comuns ao de outras linhagens. Nossos experimentos com células

HeLa e Vero revelaram que a amostra Pb18 aderiu fortemente quando comparada com

Pb265. Estes dados confirmam os achados de Hanna, (1995), Uemura (1996) e Hanna et

al., (2000).

Os tratamentos químicos e físicos das células leveduriformes de P. brasiliensis

influenciaram no processo de adesão. O tratamento prévio das células em diferentes

temperaturas influiu na aderência, sendo esta redução mais acentuada nas células

tratadas a 121°C seguido de 100°C, quando comparadas com células não tratadas de P.

brasiliensis ou tratadas a 56°C. O tratamento térmico deve alterar estruturas da parede

celular de P. brasiliensis que sofrem alterações em altas temperaturas, provavelmente

componentes protéicos. Recentemente, foi verificado que a inativação do soro pelo

calor usado para opsonização e o tratamento com EDTA de duas linhagens de

macrófagos diminuiu a fagocitose (JIMENEZ et al. ,2006).

A formalina, aparentemente, no presente estudo não interferiu no processo de

adesão, deve-se ressaltar, no entanto, que o tratamento de uma hora com formalina não

inviabiliza as células de P. brasiliensis conforme verificado por Shikanai-Yasuda et al,

(1991); e neste caso as estruturas moleculares podem não ter sofrido alterações que

interferissem com a adesão.

A ação inibitória da azida sódica sugeriu que a adesão de P. brasiliensis pode ser

regulada por processo energia-dependente. Neste trabalho, não foi verificado se este

componente interferiu mais na expressão de prováveis receptores de adesão na

superfície da célula epitelial, do que propriamente na célula fúngica. No entanto, nosso

resultado vem de encontro a outros trabalhos como em C. albicans onde parte do

processo de adesão depende da expressão de moléculas de superfície do fungo, sendo,

portanto parcialmente dependente de energia (OLLERT et al., 1993).

Os polissacarídeos da parede celular em P. brasiliensis têm importante papel nas

relações parasita-hospedeiro. A parede celular deste fungo é composta de

polissacarídeos como a quitina e α e β-D-glucana e galactomanana (SAN BLAS &

SAN BLAS, 1994).

O tratamento com concanavalina A mostrou ser esta capaz de inibir parcialmente

a adesão de P. brasiliensis às linhagens celulares Vero e HeLa. Esta lectina tem

afinidade especial com resíduos de manana, portanto, estas moléculas de superfície

devem participar como adesina neste modelo. Em C. albicans tem sido demonstrado

que uma das adesinas é uma manoproteína e, portanto inibida por concanavalina A. Este

sistema tem atividade semelhante à lectina e reconhece os resíduos de fucose ou de n-

acetilglucosamina em células epiteliais (CALDERONE, 1993). Gp 43 e um antígeno de

massa molecular alta e pesadamente glicosilado, sendo estes componentes glicosilados

reconhecidos por soros de pacientes com a doença. Este último foi isolado recentemente

e verificou-se que se liga a n-acetilglucosamina (GlcNAc) e pode ser inibido por

GlcNAc, seguido de D-glicose and D-manana e não por D-galactose, N-acetyl-

galactosamina or L-fucose. Esta fração também se liga a laminina, portanto tem

propriedades adesivas (COLTRI et al., 2006).

Periodato de sódio influenciou no processo, causando redução na aderência. A

oxidação dos resíduos de açúcar alterou a adesão, mostrando que a porção carboidrato

da parede celular deste fungo está envolvida neste processo.

É bem documentado que animais e homens infectados com P. brasiliensis

produzem anticorpos que reagem com vários tipos de antígenos. Em trabalho anterior

foi verificado que soro de paciente com PCM inibia a aderência de P. brasiliensis às

células epiteliais, o mesmo não ocorrendo com soro de indivíduo normal. Confirmando

este achado, neste trabalho foi verificado que soro de indivíduo normal e soro inativado,

sem complemento, não inibiram a aderência deste fungo às células.

Heparina, que é encontrada em grânulos intracelulares de mastócitos, é uma

glicosamina com grande quantidade de resíduos de sulfato. A inibição da aderência pela

adição de glicosaminoglicanos é geralmente a primeira indicação que receptores das

células epiteliais podem ser proteoglicanas. Se heparina inibe adesão e outras

glicosaminoglicanas (ex.: sulfato de condroitina e sulfato de dermatano), não o fazem,

então a adesão é considerada específica para proteoglicanas do tipo sulfato de heparano.

Muitas bactérias, parasitas e vírus utilizam proteoglicanas como receptores de adesão.

Estes aparentemente ligam-se ao sulfato de heparano (ROSTAND & ESKO, 1997). Em

nosso caso, no entanto, heparina não alterou o processo de adesão, indicando que a

interação tipo mucopolissacarídeo (heparina) não ocorreu.

O tratamento das células leveduriformes de P. brasiliensis com tripsina

influenciou significativamente (p < 0,01) no processo de adesão às células Vero e HeLa,

mostrando que a porção protéica é um componente ativo das adesinas deste fungo.

Aparentemente, a cepa Pb18 sofreu mais drasticamente os efeitos deste tratamento do

que a cepa Pb 265.

O uso de mono ou dissacarídeos como inibidores da aderência de P. brasiliensis

às células epiteliais Vero e HeLa sugerem que mecanismos de adesão tipo lectina

podem ocorrer e são de importância nesta interação. Os açúcares aminados glucosamina

e galactosamina seguido de manose foram os que mais eficientemente inibiram a adesão

de P. brasiliensis às células epiteliais. Não foi observada diferença significativa entre as

duas linhagens celulares.

Os padrões de inibição observados com as duas amostras sugerem mecanismos

específicos tipo lectina. O padrão foi semelhante ao observado para C. albicans e

células epiteliais vaginais (SEGAL et al., 1982), em relação aos açúcares aminados.

Enquanto que a inibição com manose foi semelhante aos de Candida no processo de

adesão às células epiteliais bucais. Recentemente, foi verificado que a inativação do

soro pelo calor usado para opsonização e o tratamento com EDTA de macrofagos

diminuiu a fagocitose em duas linhagens avaliadas. O tratamento com Alfa-metil-d-

manosídeo reduziu a fagocitose de macrófagos B10R, sugerindo que o receptor de

manose participa na fagocitose destas células ( JIMENEZ et al., 2006). Por outro lado, o

principal antígeno deste fungo, a GP 43, contém em sua cadeia de carboidratos uma

parte constituída de alto conteúdo em manose (ALMEIDA et al., 1996), e como esta

molécula já foi descrita como adesina, não se exclui que a inibição encontrada com

manose em nosso estudo, possa envolver esta glicoproteína. Aparentemente, à

semelhança do trabalho com macrófagos, o receptor de manose participa da interação P.

brasilensis - células epiteliais. No entanto, para se obter dados mais específicos do papel

das interações tipo lectina no processo de adesão de P. brasiliensis às células epiteliais,

oligossacarídeos mais complexos deverão ser ensaiados.

Adesão de microrganismos à tecidos do hospedeiro é considerado como um

evento essencial no desenvolvimento de infecções. O reconhecimento de células

hospedeiras pelo patógeno requer a presença em sua superfície de moléculas

complementares. Várias proteínas do hospedeiro como laminina, colágeno, fibronectina,

fibrinogênio e o componente C

do complemento são potenciais ligantes celulares de

microrganismos. Estas glicoproteínas normalmente não são expostas na superfície do

epitélio e endotélio. Entretanto, qualquer tipo de trauma que altere o tecido do

hospedeiro pode levar a exposição de membranas basais e tornar acessíveis seus

componentes como laminina, colágeno tipo IV, entactina/nidogem e proteoglicanas

como sulfato de heparano.

Proteínas da matriz extracelular são implicadas na adesão em uma variedade de

patógenos extra e intracelulares à tecidos do hospedeiro ou células. Laminina é uma

glicoproteína da matriz ligada à membrana basal e sua interação com moléculas de

superfície celulares e receptores promove adesão célula–célula, migração das células e

diferenciação celular. Este componente consiste de três grandes cadeias polipeptídicas α

(A); β (B

) e γ (B

), arranjadas em uma estrutura cruciforme (TIMPL & BROWN,

1994). Tem sido postulado que seu reconhecimento pode influenciar na patogenicidade

de vários microrganismos incluindo bactérias, protozoários e fungos (TRONCHIM et

al., 1997). Receptores de laminina são encontrados em células epiteliais, endoteliais,

células musculares e neurônios e também em macrófagos, leucócitos e células tumorais

humanas e animais. Entre os receptores de laminina foi descrito um que pertence à

família das integrinas (CALDERONE & FONZI , 2001).

Estas proteínas transmembranas reconhecem diferentes ligantes por sua

seqüência RGD, que é comum a uma grande variedade de proteínas, incluindo laminina,

fibrinogênio e fibronectina. No entanto, algumas integrinas ligam-se a seqüência

peptídica IKVAV, localizada no fragmento E

. Receptores tipo não integrinas foram

também descritos, principalmente um de 67 kDa que reconhece o pentapeptídeo YIGSR

altamente específico de laminina e localizado no fragmento P

(IWAMOTO et al.,

1987; SAWYER et al., 1992).

Em nosso trabalho, laminina inibiu significativamente a adesão da amostra Pb18

às células Vero e HeLa, o mesmo não ocorrendo com a amostra Pb265. Este resultado

sugere que Pb18 apresenta um padrão de reconhecimento diferente de Pb265 em relação

a esse componente. Em trabalho anterior, Vicentini et al., (1994) demonstraram que P.

brasiliensis é capaz de se ligar à laminina e que a provável adesina seria a gp 43. De

acordo com nosso resultado, isto se confirmou com a amostra Pb18, no entanto a

amostra Pb265 que também produz gp43 não mostrou o mesmo padrão de inibição,

sugerindo que a possível adesina neste caso não seria somente a gp 43, que é comum

para diferentes isolados de P. brasiliensis.

O peptídeo CDPGYIGSR-NH

que é parte da cadeia β da laminina e a sequência

YIGRS correspondente a porção mínima requerida para inibição da metástase de células

tumorais em modelos animais foram usados nesse estudo. Assim, em nossos

experimentos, ambos os peptídeos reduziram significativamente a aderência do isolado

Pb18 às células HeLa e Vero, enquanto que o mesmo não foi observado com o Pb265.

O uso de peptídeos sintéticos derivados da laminina confirmou o achado com

este componente da MEC, mostrando que Pb18 tem padrão diferencial de adesão em

relação à Pb265. Por outro lado, este achado mostra que o padrão de virulência de

determinadas amostras pode estar relacionado à sua maior e menor capacidade de se

ligar a componentes da matriz extracelular.

Fungos como P. brasiliensis (LOPES et al., 1994; VICENTINI et al., 1994;

MENDES-GIANNINI, et al., 2000; HANNA, et al., 2000; ANDREOTTI, et al., 2000;

GONZALEZ, et al., 2005; BARBOSA, et al., 2006), C. albicans (LOPEZ-RIBOT et al.,

1994) e H. capsulatum (MCMAHON et al., 1995) expressam proteínas que se ligam à

laminina que variam em sua massa molecular de 37 a 70 kDa. Em C. albicans, três

polipeptídeos de 37, 60 e 67 kDa tem sido associados à laminina e em H. capsulatum e

P. brasiliensis respectivamente, as frações de 50, 43 e 30 kDa. Em H. capsulatum tem

sido reconhecido que a seqüência peptídica IKVAV, localizada na região carboxil do

domínio α-hélice da cadeia α é reconhecida como uma seqüência de reconhecimento do

receptor tipo integrina (McMAHON et al., 1995).

Em C. albicans, o peptídeo CDPGYGSR-NH

também está envolvido na

redução da aderência de um isolado de C. albicans (4918) à cultura de queratinócitos

(OLLERT et al., 1993).

Os mecanismos de aderência envolvendo a seqüência RGD têm sido

relacionados ao receptor tipo três do complemento (CR

, CD

e CD

) e também a

aderência às células endoteliais e às proteínas da matriz extracelular como a

fibronectina, colágeno e laminina (CALDERONE & FONZI, 2001).

Em C. albicans a adesão com RGD parece ser mais importante em células

endoteliais que as epiteliais (OLLERT et al., 1993). Assim, embora em nosso estudo

fosse observado certo grau de inibição, este poderá ser maior dependendo da linhagem

celular.

Nossos dados sugerem que a interação de P. brasiliensis às células epiteliais é

um mecanismo complexo, envolvendo interações proteína-proteína e lectina-

carbohidrato. Há padrões diferentes de interação entre as amostras Pb18 e Pb265,

sugerindo provável explicação às diferenças observadas no processo de adesão que

poderão implicar num maior ou menor grau de virulência de cada isolado, como

observado nas infecções experimentais. Como em outros microrganismos, múltiplos

mecanismos de interação podem estar envolvidos na aderência de P. brasiliensis às

células epiteliais.

5.2. Sinalização celular

Os patógenos podem estabelecer interações com seus hospedeiros e alguns têm

habilidade para aderir, invadir e ativar numerosas vias de sinalização. O estudo da

interação patógeno/hospedeiro nos fornece dados para a compreensão desta diversidade

biológica. Em P. brasiliensis pouco se sabe sobre quais vias este fungo ativa para

sobreviver e escapar do sistema monocítico-fagocitário. Recentemente, Monteiro da

Silva et al., (2006) observaram uma inibição significativa na invasão do fungo após pré-

tratamento das células epiteliais com genisteína, que é um inibidor específico de

proteínas tirosina-quinase (PTK) localizadas na membrana plasmática das células

epiteliais. Esses resultados sugerem que a inibição de PTK é importante na transdução

de sinal durante os eventos iniciais nos processos de adesão e invasão de P. brasiliensis

em células epiteliais de mamíferos. Neste estudo foram realizados ensaios para avaliar

as vias de sinalização envolvidas na proliferação celular durante a interação de P.

brasiliensis com células epiteliais. As vias Ras/Raf e Rho/Rac disparam sinais

citosólicos que ativam proteínas da família MAPquinase (proteína quinase ativada por

mitógeno) responsáveis por eventos nucleares de proliferação (ALBERTS et al., 2002).

Em relação à via Ras/Raf, foi investigada a proteína Raf fosforilada na serina 338 e foi

observado que o tempo de 10 minutos foi suficiente para sua expressão nas células

infectadas com o fungo recentemente recuperado de inoculação animal, com

propriedades adesivas aumentadas (Pb18a) e o subcultivado 312 vezes (Pb18b), bem

como o tratamento com a gp43, apresentando cinco isotipos. Em 10 minutos há uma

nítida diminuição de raf ativada nas células em contato com o fungo avirulento e

ligeiramente superior em intensidade no fungo virulento (Pb18a) e na gp 43.

Aparentemente esse resultado sugere que em 10 minutos o fungo avirulento (Pb18b)

oferece menor estresse citotóxico, resultando num sinal de proliferação menos intenso.

Em contrapartida, o fungo virulento e a gp 43 poderia oferecer maior estímulo

proliferativo, pois a célula tentaria aumentar sinais de proliferação para manter sua

sobrevida. Quando as células foram tratadas por 30 minutos, somente o tratamento com

gp43 faz com que Raf ativa esteja diminuída, revertendo este processo em período de

uma hora, quando sua expressão foi bem maior. Aparentemente, esta proteína fúngica

tem papel na regulação desta molécula envolvida na sinalização celular. Os sinais

intracelulares de sobrevivência envolvem as vias Ras/Raf e PI3K (phosphoinositide 3-

kinase) / Akt (protein kinase B). Raf é uma serina/treonina quinase que possui três

isoformas com grande similaridade em suas sequências, no entanto, estas têm funções

individuais que ainda estão longe de ser completamente compreendidas (BACCARINI,

2005) Raf é um efetor crítico de Ras (WEBER, et al., 2000) e Raf foi descrito como um

supressor da apoptose, cooperando com Bcl-2 na membrana externa da mitocôndria

(MIKULA et al., 2001; ALGECIRAS et al., 2002 ; BACCARINI, 2002), assim como

influi na resposta celular e na habilidade de Raf ativar o fator de transcrição NF-B, o

principal regulador da resposta inflamatória e nas transições mesenquimal-epiteliais (LI

& SEDIVY et al.,1993; BAUMANN et al., 2000; ; ODABAEI et al., 2004;

BACCARINI, 2005).

No entanto, no tempo de uma até 8 horas houve aumento de sua expressão nas

células infectadas com P. brasiliensis e tratadas com a gp 43, demonstrando que os

sinais proliferativos foram ativados. Porém, depois de 24 h há progressiva diminuição

de sua expressão, com nítida diminuição de intensidade em 48 e 72 horas,

principalmente com o P. brasiliensis virulento. Sabendo que Raf só é ativada por

ativação de Ras e esta sinaliza proliferação, acreditamos que P. brasiliensis utilize esta

via, para que a célula epitelial continue viva e possa alojá-lo, supostamente permitindo

posterior escape do sistema monocítico-fagocitário (ANDRADE & ANDREWS, 2004).

A via Ras/Raf/MEK/ERK é a principal via de sinalização que está associada à

proliferação, diferenciação, sobrevivência da célula bem como apoptose (FEIG &

BUCHSBAUM, 2002; COX & DER, 2003). A superfamília Raf ativa a cascata da Raf

quinase levando a ativação de MAP quinase, que então fosforila e ativa proteínas de

transcrição, proteínas de citoesqueleto, quinases e fosfatases (KOLCH, 2000). Embora

os passos com base regulatória tenham sido elucidados, muitos dos aspectos desta via

estão para serem descobertos. Kolch, 2000 fez uma revisão focalizando o papel das

interações proteínas-proteinas na regulação desta via e como elas contribuem para

coordenar a ativação de proteínas, redistribuição celular, fosforilação do substrato e

cruzar sinais com outras vias de sinalização. A via da MAPquinase é um dos sistemas

primordiais de sinalização que é ativada para executar uma variedade de tarefas e nos

eucarióticos, controla processos como proliferação, diferenciação, sobrevivência e

apoptose (ALBERTS et al., 2002)). Após ativação de ras/raf os sinais são encaminhados

para primeira proteína da via de sinalização MAPquinase, denominada chamada de

uma MAP- quinase- quinase (MEK). Uma vez ativada, sucede-se uma cascata de

ativação de outra proteínas da família MAPkinase até a ativação de ERK, que no núcleo

ativará fatores de transcrição para genes envolvidos com a proliferação celular (Alberts

et al., 2002).

Neste trabalho investigamos uma outra via de transdução de sinal que envolve

sobrevivência celular e crescimento, denominada a PI 3-quinase/proteína quinase B

(AKT). A presença de AKT fosforilada foi observada progressivamente aumentada no

tratamento com fungo virulento e gp 43 a partir do 30 minutos até 5h. Nas células

tratadas com o fungo avirulento os sinais de AKT ativada foram semelhantes ao

virulento nos mesmos tempos de tratamento. A ativação de AKT diminui

progressivamente a partir de 8 até 48h. Embora haja diminuição desses sinais de

sobrevida nos tratamentos entre 8h a 48h, no fungo virulento e na células tratadas com

GP43 os sinais de sobrevida persistem com maior intensidade em comparação ao

avirulento e as células não tratadas. Aparentemente somente a GP43 não induz estresse

celular acentuado como o fungo virulento. Os sinais de sobrevida diminuem mais

rapidamente a partir de 8h enquanto que raf ativada manteria sinais de proliferação até

24h. As vias de sinalização ras/raf e AKT agem sinergicamente para potencializar

efeitos de proliferação e sobrevida (JANSON et al., 2006). Para os sinais de sobrevida

celular, receptores tirosina quinase presentes na membrana recebem sinais

extracelulares de sobrevida e ativam PI3 quinase que irá fosforilar PIP2, resultando na

formação de um novo sinal fosfolipídico – PIP3. Em seguida, PIP3 interage com

proteína AKT inativa e PDK, resultando na ativação de PDK que por sua vez fosforila

AKT, tornando-a ativa. AKT ativa fosforila proteínas alvo responsáveis pela

manutenção da sobrevivência celular. A fosforilação de Bad por AKT inibe sua função

pró-apotótica, impedindo este sinal de apoptose. Caspase 9 fosforilada por AKT

também é inibida, resultando no bloqueio de sinais apoptóticos pela via das Caspases.

Ainda, a ativação por fosforilação de AKT de fatores de transcrição e GSK3 mantém,

respectivamente, a célula transcrevendo genes de proliferação celular e cooordenando o

maior metabolismo e síntese protéica. No presente estudo, a diminuição de AKT

ativada poderia indicar a perda parcial de sinais proliferativos e que se intensificarão

posteriormente com a diminuição de sinais ras/raf. Em trabalho recente (dados não

publicados) foi observado que depois de 24 horas, gp43 levou aumento da expressão de

Bak em relação ao controle e a Bcl-2, sugerindo que o sinal de sobrevivência foi

perdido depois deste período. Quando as células foram tratadas com a gp43 durante 48

horas foi observado um aumento significante em Bak e expressão de Bcl-2 quando

relacionado aos controles, porém, quando foi comparado a expressão entre Bak e Bcl-2

foi observado que expressão de Bak foi superior a Bcl-2 que mostra que o tratamento

com a adesina leva ativação da apoptose em células epiteliais pulmonares, resultado

semelhante a indução de morte celular programada verificada durante a infecção de P.

brasiliensis (MENDES-GIANNINI et al., 2004).

Nossos dados sugerem que inicialmente por duas vias diferentes, o fungo e a gp

43 sinalizaram para a sobrevivência e crescimento celular, onde o fungo procura se

alojar e escapar dos fagócitos por um determinado tempo, para depois sair e invadir

outras células do hospedeiro. Este fato é muito interessante quando contrastamos com

os dados de Andreotti, (2006), que houve um aumento acentuado de proteínas que

sinalizam apoptose a partir de 72 horas.

Neste trabalho conseguimos detectar a proteína Rho ativada após 30 minutos,

tanto nas células tratadas com a gp 43, nas células infectadas com P. brasiliensis

Pb(18a) e Pb(18b) e nas células controles (sem nenhum tratamento). Com oito horas

de incubação, houve um aumento da expressão de Rho nas células infectadas com

Pb(18a) e tratadas com a gp 43. Após 24 horas houve diminuição da expressão e em

72hs, esta diminuição foi mais acentuada. Aparentemente, esses períodos estão

relacionados aos encontrados em trabalho anterior em que o fungo invade células

epiteliais (MENDES-GIANNINI et al.,2004).

No citoesqueleto de actina, ocorre um rerranjo estrutural total em resposta a

sinais externos que são disparados através de diversos receptores da superfície da célula,

mas todos estes sinais parecem converter para o interior da célula, num grupo

relativamente fechado de proteínas, que são as GTPases monoméricas que são membros

da família das proteínas Rho (Cdc 42, Rac e Rho). Semelhante a outros membros da

superfamília Ras, estas proteínas Rho agem como uma chave molecular para controlar

processos entre o estado ativo (GTP) e inativo (GDP). Ativação de CDC 42 dispara

polimerização de actina e empacotamento para formar filopódios ou protusões curtas

nas células chamadas de microespículas. Ativação de Rac promove polimerização de

actina na periferia da célula formando lamelopódios extensos e enrugamento das

membranas. A ativação de Rho promove tanto o empacotamento nos filamentos de

actina com filamentos de miosina II no interior causando estresse das fibras e o

agrupamento de integrinas e proteínas associadas para formar contatos focais. Esta

dramática e complexa mudança estrutural ocorre porque cada uma das três proteínas

citadas tem numerosas proteínas alvos que influenciam na organização e dinâmica de

actina (no mínimo, oito tem sido encontradas para cada uma) e as suas proteínas alvos

vão influenciar na transcrição de genes (ALBERTS, et al., 2002).

Fukata et al., (2003) estudaram as funções da família das proteinas Rho GTPases

na polarização e direcionamento de migração nas células.

Por outro lado, vários trabalhos têm se preocupado em como Raf-1 pode regular

Rho. Tem sido proposto que a formação de um complexo Raf-1–Rok limita a ativação

de Rok, que influenciaria na formação de lamelipódios. A ativação de Rok por Rho

envolve a reorganização da rede de vimentina, que sofre alterações e correlaciona-se

com contratilidade da célula. Esta etapa diminui a afinidade da vimentina a Rok- e

contribui para o colapso dos filamentos intermediários, ou por indução ou através de

uma realimentação positiva envolvendo a ativação de Rok-α

Como pode Raf

antagonizar este processo? A presença de Raf-1 poderia aumentar a afinidade de Rok-α

pela vimentina, ou Raf-1 pode ter um papel mais direto e inibir a atividade de Rok-α

quinase.

Ambas Raf-1 e Rok-α são reguladas por inibição intramolecular nas regiões

em Raf-1, e em COOH em Rok-α, ligando-se ao domínio quinase e inibindo suas

atividades (EHRENREITER et al., 2005).

Por outro lado, estudos prévios demonstraram que Raf Ser338 pode ser

fosforilado por Pak2 que é a molécula alvo de Cdc42 e Rac . Porém, o mecanismo exato

não está claro, porque expressão de Pak sozinho, geralmente não é suficiente para ativar

Raf ou a via de ERK. Além disso, expressão de Cdc42 ativo ou Rac induz ativação de

Raf, enquanto expressão de Ras ativo pode induzir ativação de Raf. Assim, co-

expressão de Pak com Rac ativo pode induzir ativação de Raf, indicando um papel

potencial de Cdc42/Rac e Pak na regulação de Raf.

Um aspecto essencial no ciclo de vida de muitos patógenos é sua habilidade de

entrar e se manter no hospedeiro para facilitar sua contínua infecção. Portanto, vários

patógenos dispõem de mecanismos que utilizam a polimerização de actina a seu favor

para entrar ou sair das células do hospedeiro. Em circunstâncias normais, a

polimerização de actina e a mobilidade celular são reguladas via cascatas de transdução

de sinais. Patógenos não somente usam o citoesqueleto de actina para facilitar sua

entrada, mas desenvolveram também mecanismos para subverter os sistemas

regulatórios normais que controlam a polimerização da actina na célula. Na literatura, o

papel de Rho está ligado à migração e associado à adesão focal que pode aumentar a

adesão e também a invasão, alem da motilidade. Os patógenos com capacidade de

invasão freqüentemente alteram os componentes do citoesqueleto para promover a sua

entrada na célula e isto é feito pelo rearranjo da actina e vários fatores de virulência têm

como alvo a família Rho que envolvem Rho, Rac, e Cdc42 que são reguladores

fundamentais da reorganização de actina. Pouco é conhecido das vias de sinalização que

controlam as mudanças morfológicas em P. brasiliensis, assim como os sinais celulares

quando da interação com células do hospedeiro. A invasão de P. brasiliensis afeta a

estrutura do citoesqueleto das células epiteliais, interferindo em aspectos morfológicos

da actina, tubulina e citoqueratina. O tratamento com citocalasina D e colchicina

reduziu a invasão, indicando a participação funcional dos microfilamentos e

microtúbulos neste mecanismo (MENDES-GIANNINI et al., 2004). Por outro lado,

MARQUES et al., (2004) identificaram quatro genes, RHO1, SEP1, FLB1 e PCK1, que

estão envolvidos na sinalização da célula e polaridade. O gene RHO1 estava expresso

10 a 15 vezes mais em meio mínimo do que em meio completo. Desta maneira, este

trabalho reforça os nossos dados quanto à ativação da família Rho, contribuindo para o

maior conhecimento da interação deste fungo com células epiteliais pulmonares. Assim,

a entrada de P. brasiliensis na célula epitelial pode aparentemente requerer a ativação da

família de pequenas GTPases Rho, como demonstrado neste trabalho. Assim, neste

estudo foi descrito pela primeira vez a participação das vias de proliferação celular,

crescimento e de sinais citosólicos associados ao citoesqueleto durante o processo de

invasão.

6. CONCLUSÕES

Pelos resultados obtidos podemos concluir que no processo de adesão entre

isolados de P.brasiliensis e linhagens epiteliais tem-se:

• Presença de adesinas fúngicas termo-lábeis.

• Parte do processo de interação fungo-hospedeiro foi realizado por adesinas com

forte indício de serem de natureza protéica e estarem ligadas principalmente com

açúcares aminados.

• Existência de frações ou sequências específicas de carboidratos

(aminados/manose) capazes de mediar o processo de adesão.

• Parte do processo de interação fungo -hospedeiro é energia dependente.

• Existem sequência(s) semelhante(s) aos peptídeos derivados da laminina que

reconhecem parte dos sítios adesivos em células de Pb18 e não em Pb265.

• Padrão diferencial de adesão entre Pb18 e Pb265 às células Vero e HeLa quando

tratadas com peptídeos derivados da laminina podem sugerir uma associação

com as diferenças de patogenicidade entre os dois isolados.

• Neste estudo foi descrito pela primeira vez a participação das vias de

proliferação celular, crescimento e de sinais citosólicos associados ao

citoesqueleto (Ras-Raf, AKT e Rho) durante o processo de invasão.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALAEI, S.; LARCHER, C.; EBENBICHLER, C.; PRODINGER, W.M.; JANATOVA,

J.; DIERICH, M.P. Isolation and biochemical characterization of the iC

receptor of

Candida albicans. Infect. Immun, v. 61, p. 1395-1399, 1993.

ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P.

Molecular Biology of the Cell. 4

. ed. 2002. 1462p.

ALGECIRAS-SCHIMNICH, A.; BARNHART, B.C.; PETER, M.E. Apoptosis-

independent functions of killer caspases. Curr. Opin. Cell Biol., v.14, p. 721–726,

2002.

ALMEIDA, I.C.; NEVILLE, D.C.; MEHLERT, A; TREUMANN, A; FERGUSON,

M.A; PREVIATO, J.O; TRAVASSOS, L.R. Structure of the N-linked oligosaccharide

of the main diagnostic antigen of the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis.

Glycobiology

v. 6, p. 507-15, 1996 .

ANDRADE, L.O.; ANDREWS, N.W. Lysosomal fusion is essential for the retention of

Trypanosoma cruzi inside host cells. J. Exp. Med., v. 200, p. 1135-43, 2004.

ANDREOTTI, P.F. Isolamento e caracterização de adesina envolvida na interação

de Paracoccidioides brasiliensis com células epiteliais. Dissertação (Mestrado em

Análises Clínicas) Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual

Paulista, Araraquara, 2002. 121f.

ANDREOTTI, P.F.; MONTEIRO DA SILVA, J.L.; BAILAO, A.M.; SOARES, C.M.;

BENARD, G.; SOARES, C.P.; MENDES-GIANNINI, M..J.S. Isolation and partial

characterization of a 30 kDa adhesin from Paracoccidioides brasiliensis. Microb.

Infect., v. 7, p. 875-881, 2005.

ANDREOTTI, P.F. Interação de Paracoccidioides brasiliensis com células

epiteliais. Caracterização de prováveis fatores de virulência. Tese (Doutorado em

análises clínicas) Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista,

Araraquara, 2006, 124p.

ARELLANO, M.; COLL, P.M.; PÉREZ, P. RHO GTPases in the control of cell

morphology, cell polarity, and actin localization in fission yeast. Microscopy Research

and Technique, v. 47, p.51-60.1999.

AZUMA, I.; KANETSUNA, F.; TANAKA, Y.; YAMAMURA, Y.; CARBONELL,

L.M. Chemical and immunological properties of galactomannans obtained from

Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis and Blastomyces dermatidis.

Mycopath. Mycol., v. 54, p.111-125, 1974.

BACCARINI, M. An old kinase on a new path: Raf and apoptosis.

Cell Death Differ., v.9(8), p. 783-5, 2002.

BACCARINI, M. Second nature: Biological functions of the Raf-1 “kinase. Fe BS

Lett., v.13, p.3271-7, 2005.

BAGAGLI, E.; BOSCO, S.M.G.; THEODORO, R.C.; FRANCO, M. Phylogenetic and

evolutionary aspects of Paracoccidioides brasiliensis reveal a long coexistence with

animal hosts that explain several biological features of the pathogen. Infect. Genet.

Evol., v. 6, p. 344-351, 2006.

BARBOSA, M.S.; BAO, S.N.; ANDREOTTI, P.F.; DE FARIA, F.P.; FELIPE, M.S.;

DOS SANTOS FEITOSA, L.; MENDES-GIANNINI, M.J.S.; SOARES, C.M.

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase of Paracoccidioides brasiliensis is a cell

surface protein involved in fungal adhesion to extracellular matrix proteins and

interaction with cells. Infect. Immun., v. 74, p. 382-389, 2006.

BAUMANN, B.; WEBER, C.K.; TROPPMAIR, J.; WHITESIDE, S.; ISRAEL, A.;

RAPP, U.R.; WIRTH, T. Raf induces NF-KB by membrane shuttle kinase MEKK1, a

signaling pathway critical for transformation. Proc Natl Acad Sci, v. 97, p. 4615-20,

2000.

BIAGIONI, L.; SADATSUNE, T.; FRANCO, M.F.; MATTOS, M.C.F. A comparative

study of the immuno-antigenicity of eight Paracoccidioides brasiliensis isolates.

Rev.Inst.Med.Trop., v.28, p. 281-286, 1986.

BLOTTA, M.H.S.; CAMARGO, Z.P. Immunological response to cell free antigens of

Paracoccidioides brasiliensis: relantionship with the clinical forms of

paracoccidioidomycosis. J. Clin. Microbiol., v. 31, p. 671-675, 1993.

BOUALI, A.; ROBERT, R.; TRONCHIN, G.; SENET, J.M. Characterization of

binding of human fibrinogen to the surface of germ tubes and mycelium of Candida

albicans. J. Gen. Microbiol., v. 133, p. 545-51, 1987.

BOUCHARA, J.P. ; TRONCHIN, G. ; ANNAIX, V. Laminin receptors on Candida

albicans gerin tubes. Infect. Immun., v. 58, p. 48-54, 1990.

BRITO, T. De ; CARVALHO, R.P. de S. ; CASTRO, R.M. ; FURTADO, J.S.

Pathogenesis of experimental paracoccidioidomycosis. PAHO Scient. Publ., v. 254, p.

257-60, 1972.

BRITO, T.; FURTADO, J.S.; CASTRO, R.M.; MANINI, M. Intraepithelial

parasitism as an infection mechanism in human paracoccidioidomycosis. Virch. Arch.

Abt. A. Pat. Anat., v. 36, p. 129, 1973.

BRUMMER, E.; RESTREPO, A.; HANSON, L. H.; STEVENS, D.A. Virulence of

Paracoccidioides brasiliensis: The influence of in vitro passage and storage.

Mycopathologia, v. 109, p. 13-18, 1990.

CHAN, T. O.; RITTENHOUSE, S.E; TSICHLIS, P.N. Akt/Pkb and other D3

phosphoinositide-regulated kinases: kinase activation by phosphoinositide-dependent

phosphorylation. Annu Rev. Biochem ., v. 68, p.965-1014, 1999.

CALDERONE, R.A., LINCHAN, L., WADSWORTH, E., SANDBERG, A.L.

Identification of C

receptors on Candida albicans. Infect. Immun., v. 56, p. 252-258,

1988.

CALDERONE, R.A.; BRAUN, P.C. Adherence and receptor relationship of Candida

albicans. Microbiol. Rev., v. 55, p. 275-279, 1991.

CALDERONE, R.A. Molecular interaction at the interface of Candida albicans and

host cells. Archieve of Medical Research., v. 24, p. 275-279, 1993.

CALDERONE, R.A. Recognition between Candida albicans and host cells. Trends.

Microbiol., v. 1, p. 55-58, 1993.

CALDERONE, R.A.; FONZI, W.A. Virulence factors of Candida albicans. Trends

Microbiol., v.9, p. 327-35, 2001.

CAMARGO, Z.P.; TABORDA, C.P.; RODRIGUES, E.G.; TRAVASSOS, L.R. The

use of cell-free antigens of Paracoccidioides brasiliensis in serological tests. J. Med.

Vet. Mycol., v. 29, p. 31-8, 1991.

CASANOVA, M.; LOPEZ-RIBOT, J.L.; MONTEAGUDO, C.; LLOMBART-

BOSCH, A; SENTANDREU, R.; MARTINEZ, J.P. Identification of a 58-kilodalton

cell surface fibrinogen-binding mannoprotein from Candida albicans. Infect. Immun.,

v. 60, p. 4221- 4229,1992.

COLTRI, K.C.; FORTUNATO, A.S.C.; CARDOSO, M.L.G.; PINZAN, C.F.;

RUAS, L.P.; MARIANO, V.S.; MARTINEZ, J.C.R.; PANUNTO-CASTELO, A.;

ROQUE-BARREIRA, M.C. Paracoccin, a GlcNac-binding lectin from

Paracoccidioides brasiliensis, binds to laminin and induces TNF-

α production by

macrophages. Microb. Infect., v.8, p. 704-713, 2006.

COOPER, G.M. The cell. A molecular approach. 2 ed. ASM Press & Sinaver

Associates Inc. Washington D.C., 2000, 689p.

COX, A.D.; DER, C.J. The dark side of Ras: regulation of apoptosis. Oncogene, v.22,

p. 8999-9006, 2003.

COXON, P.Y.; SUMMERSGILL, J.T.; RAMIREZ, J.A.; MILLER, R.D. Signal

Transduction during Legionella pneumophila Entry into Human Monocytes. Infect.

Immun., v. 66, p. 2905-2913, 1998.

EHRENREITER. K.; PIAZZOLLA, D.; VELAMOOR, V., SOBCZAK, I., SMALL,

J.V.; TAKEDA, J.; LEUNG, T.; BACCARINI, M. M.Raf-1 regulates Rho signaling

and cell migration. J. Cell. Biol., v.168, p. 955-64, 2005.

FAVORETO, S.; DORTA, M.L.; YOSHIDA, N. Trypanossoma cruzi 175 kDa protein

tyrosine phosphorilation is associated with host cell invasion. Exp. Parasitol., v.89, p.

188-194, 1998.

FEIG, L.A.; BUCHSBAUM, R.J. Cell signaling: life or death decisions of ras proteins.

Curr. Biol., v.12 ,p. 259-61, 2002.

FILLER, S.G.; SWERDLOFF, J.N.; HOBBS, C.; LUCKETT, P.M. Penetration and

damage of endothelial cells by Candida albicans. Infect.Immum., v. 3, p. 976-983,

1995.

FINLAY, B.B.; FALKOW, S. Common themes in microbiol pathogenicity. Microbiol.

Rev., v. 53, p. 210-30, 1989.

FINLAY, B.B.; LEUNG, K.Y.; ROSENSHINE, I. Salmonella interactions with the

epithelial cell. ASM News., v. 58, p. 486-490, 1992.

FRANCO, M. Host- parasite relationships in paracoccidioidomycosis. J. Med. Veter.

Micol., v. 25, p. 5-18, 1986.

FRANCO, M.F.; MENDES, R.P.; MOSCARDI-BACCHI, M.; REZZALLAH-WASSO,

M.; MONTENEGRO, M.R. London, Bailliere’s. Clinical Tropical medicine and

Communicable Disease. Paracoccidioidomycosis. p. 18-196, 1989.

FRANCO, M.; BAGAGLI, E.; SCAPOLIO, S.; LACAZ, C.S. A critical analysis of

isolation of Paracoccidioides brasiliensis from soil. Med. Micol., v. 38, p. 185-191,

2000.

FUKATA, M.; NAKAGAWA, M.; KAIBUCHI, K. Roles of Rho-family GTPases in

cell polarisation and directional migration. Curr. Op. Cell Biol., v. 15, p. 590-597,

2003.

GONZALEZ, A.; GOMEZ, B.L.; DIEZ, S.; HERNANDEZ, O.; RESTREPO, A.;

HAMILTON, A.J.; CANO, L.E. Purification and partial characterization of a

Paracoccidioides brasiliensis protein with capacity to bind to extracellular matrix

proteins. Infect. Immun., v. 73, p. 2486-95, 2005.

GUEIRARD, P.; DRUILHE, A.; PRETOLANI, M.; GUISO, N. Role of adenylate

cyclase-hemolysin in alveolar macrophage apoptosis during Bordetella pertussis

infection in vivo. Infect. Immun., v.66, p. 1718-1725, 1998.

HANNA, S.A. Estudo dos mecanismos e fatores de virulência de Paracoccidioides

brasiliensis em culturas de células. Tese de Mestrado - Instituto de Biociências -

UNESP, 1995, 166f.

HANNA, S.A.; UEMURA, M.A.; MORAES, R.; RICCI, L.C.; MENDES-

GIANNINI, M.J.S. Adherence and virulence of Paracoccidioides brasiliensis. In:

Encuentro Internacional sobre Paracoccidioidomicosis, v. 6, p. 81, 1996.

HANNA, S.A.; MONTEIRO da SILVA, J.L.; MENDES-GIANNINI, M.J.S.

Adherence and intracellular parasitism of Paracoccidioides brasiliensis in Vero cells.

Microbes Infect., v. 2, p. 877-884, 2000.

HOSTETER, M.K. Adhesins and ligants involved in the interaction of Candida spp

with epithelial and endothelial surfaces. Clin. Microbiol. Rev., v. 1, p. 29-42, 1994

HOWLET, J.A.; SQUIER, A. Candida albicans ultrastructure: colonization of oral

epithelium. Infect. Immun., v. 29, p. 252-256, 1980.

HYNES, R.O. Integrins: a family of cell surface receptors. Cell., v. 48, p. 549-554,

1987.

ISBERG, R.; LEONG, J.M. Multiple ß

chain integrins are receptor for invasion, a

protein that promotes bacterial penetration into mammalian cells. Cell., v. 60, p. 861-

871, 1990.

ISBERG, R. R., TRAN VAN NHIEU, G. Binding and internalization of

microorganisms by integrin receptors. Trends Microbiol., v. 2, p.10-14, 1994.

IWAMOTO, Y.; ROBEY, J.; GRAF, M.; SASAKI, M., KLEINMAN, H.K.,

YAMADA, Y., MARTIN, G.R. YIGSR, a synthetic lamin pentapeptide, inhibits

experimental metastasis formation. Science, v. 238, p. 1132-1134, 1987.

JACOBSON, M.D.; WEIL, M.; RALF, M.C. Programmed cell death in animal

development. Cell., v. 88, p. 347-354, 1997.

JIMENEZ, M.del P.; RESTREPO, A.; RADZIOCH, D.; CANO, L.E.; GARCIA, L.F.

Importance of complement 3 and mannose receptors in phagocytosis of

Paracoccidioides brasiliensis conidia by Nramp1 congenic macrophages lines. Fems

Immunol. Med. Microbiol., v. 47, p. 56-66, 2006.

KADURUGAMUWA, J.L.; RHODE, M.; WEHLAND, J. Intercellular spread of

Shigella flexneri through a monolayer mediated by membranous protusions and

associated with reorganozation of the cytoskeletal protein vinculin. Infect. Immun., v.

43, p. 3463-3471, 1991.

KALO, A.; SEGAL, E.; SAHAR, E.; DYAN, S. Interaction of Candida albicans with

genital mucosal surfaces: involvement of fibronectin in adherence. J. Infect. Dis., v.

157, p. 1253-1256, 1988.

KANETSUNA, F.; CARBONELL, L.M.; MORENO, R.E.; RODRIGUEZ, J. Cell wall

composition of the yeast and mycelial forms of Paracoccidioides brasiliensis. J.

Bacteriol., v. 97, p. 1036-1041, 1969.

KANETSUNA, F., CARBONELL, L.M. Cell wall glucans of the yeast and mycelial

forms of Paracoccidioides brasiliensis. J Bacteriol., v. 101, p. 675-80, 1970.

KANETSUNA, F. Biochemical characteristics of Paracoccidioides brasiliensis. In: Pan

American Symphosium on Paracoccidioidomicosis. I-Medellin, 1971. Proceedings,

Wahington. PaHo, 1972, Scient Publ., v. 254, p. 31-37, 1972.

KANETSUNA, F.; CARBONELL, L.M.; AZUMA, I.; YAMAMURA, Y. Biochemical

studies on the thermal dimorphism of Paracoccidioides brasiliensis. J. Bacteriol., v.

110, p. 208-218, 1972.

KASHINO, S.S.; CALICH, V. L.; BURGER, E.; SINGER-VERMES, L.M. In vivo

and in vitro characteristics of six Paracoccidioides brasiliensis strains. Mycophatology,

v. 92, p. 173-178, 1985.

KASHINO, S.S.; SINGER-VERMES, L.M.; CALICH, V.L.G.; BURGER, B.

Alterations in the pathogenicity of one Paracoccidioides brasiliensis isolate do not

correlate with its in vitro growth. Mycopathologia, v. 109, p. 173-180, 1990.

KERR, J. R. Cell adhesion molecules in the pathogenesis of and host defense against

microbial infection. Mol. Pathol., v. 52, p. 220-230, 1999.

KHAN, I.A.; MATSURA, T.; KASPER, L.H. Activation-mediated D4+ T cell

unresponsiveness during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Int. Immunol., v.

8, p. 887-896, 1996.

KLOTZ, S.A. Adherence of Candida albicans to components of the extracellular

matrix. FEMS Microbiol.Lett., v. 68, p. 249-54, 1990.

KLOTZ, S.A.; SMITH, R.L. A fibronectin receptor on Candida albicans mediates

adherence of the fungus to extracellular matrix. J. Infect. Dis., v. 163, p. 604-610, 1991.

KLOTZ, S.A.; RUTTEN, M.J.; SMITH, R.L.; BABCOCK, S.R.; CUNNINGHAM,

M.D. Adherence of Candida albicans to immobilized extracellular matrix proteins is

mediated by calcium-dependent surface glycoproteins. Microb.Pathog., v. 2, p. 133-

147, 1993.

KOLCH, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/Raf/MEK/ERK

pathway by protein interactions. Biochem. J.,v. 351, p. 289-305, 2000.

LACAZ, C.S. Historical evolution of the knowledge on paracoccidiodomycosis and its

etiologoc agent, Paracoccidioides brasiliensis. In: FRANCO M.; LACAZ C.S.;

RESTREPO-MORENO A.; DEL-NEGRO G. Paracoccidioidomycosis. Boca Raton,

Florida, EUA, p. 1-11, 1994.

LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature, London, v. 227, p.680-685, 1970.

LENGELER, K.B.; DAVIDSON, R.C.; D`SOUZA, C.; HARASHIMA, T., SHEN,

W. C.; WANG, P.; PAN X.; WAUGH M.; HEITMAN J. Signal transduction cascades

regulating fungal development and virulence. Microbiol. Mol. Biol. Rev., v. 64, p.746-

785, 2000.

LENZI, H.L.; CALICH, V.L.G.; MENDES-GIANNINI, M.J.S.; XIDIEH, C.F.;

MIYAJI, M.; MOTA, E.M.; MACHADO, M.P.; RESTREPO, A. Two patterns of

extracellular matrix expression in experiemental paracoccidioidomycosis. Medical

Mycology, v. 38 , p. 115-119, 2000.

LI, S.; SEDIVY, J.M. Raf-1 protein kinase activates the NF-K B transcription factor by

dissociating the cytoplasmic NF-K B-I K B complex. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 90, p.

9247-9251, 1993.

LODISH, H.F., KONG, N. Perturbation of cellular calcium blocks exit of secretory

proteins from the rough endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem., v. 5, p. 10893-10899,

1990.

LOPES, J.D.; MOURA-CAMPOS, M.C.; VICENTINI, A.P.; GESZTESI, J.L.; DE-

SOUZA, W.; CAMARGO, Z.P. Characterization of glycoprotein gp43, the major

laminin-binding protein of Paracoccidioides brasiliensis. Braz . J. Med. Biol., v. 27, p.

2309-2313, 1994.

LOPEZ-RIBOT, J.L.; CASANOVA, M.; MONTEAGUDO, C.; SEPULVEDA, P.;

MARTINEZ, J.P.

Evidence for the presence of a high-affinity laminin-receptor-like

molecule on the surface of Candida albicans yeast cells. Infect. Immun., v. 62, p. 742-

746, 1994.

LOPEZ-RIBOT, J.L.; CHAFFIN, W.L. Binding of the extracellular matrix component

entactin to Candida albicans. Infect. Immun., v. 62, p. 4564-4571, 1994.

LOWRY, D.H.; ROSEBROUGH, N.J.; FAN, L.; RANDALL, R.J. Protein

measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem., v. 193, p. 265-275, 1951.

MAHLERT, M.; LEVELEKI, L.; HLUBEK, A.; SANDROCK,B.; BÖLKER, M. Rac1

and Cdc42 regulate hyphal growth and cytokinesis in the dimorphic fungus Ustilago

maydis. Molec . Microbiol., v.59, p.567-578, 2006.

McMAHON, J.P.; WHEAT, J.; SOBEL, M.E.; PASULA, R.; DOWNING, J.F.;

MARTIN, W.J. Murine Laminin binds to Histoplasma capsulatum. A possible

mechanism of dissemination. J. Clin. Inv., v. 96, p. 1010-1017, 1995.

MARAIS, R.; MARSHALL, C.J. Control of the ERK MAP Kinase cascade by Ras and

Raf. Cancer Surv., v. 27, p. 101-125, 1996.

MARAIS, R.; LIGHT, Y.; PATERSON, H. F.; MASON, S.C.; MARSHALL, C.J.

Diferential regulation of Raf-1, A-Raf and B-Raf by oncogenic ras and tyrosine kinases.

J. Biol. Chem., v. 272, p. 4378-4383, 1997.

MARQUES, E.R.; FERREIRA, M.E.; DRUMMOND, R.D.; FELIX, J.M.;

MENOSSI,M.; SAVOLDI, M.; TRAVASSOS, L.R.; PUCCIA, R.; BATISTA, W.L.;

CARVALHO, K.C.; GOLDMAN, M.H.; GOLDMAN, G.H. Identification of genes

preferentially expressed in the pathogenic yeast phase of Paracoccidioides brasiliensis,

using suppression subtraction hybridization and differential macroarray analysis. Mol.

Genet. Genomics., v. 271, p. 667-677, 2004.

MASON, C.S.; SPRINGER, C.J.; COOPER, R.G.; SUPERTI-FURGA, G.;

MARSHALL, C.J.; MARAIS, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in

Raf-1, but not B-Raf activation. Embo J., v. 18, p. 2137-2148, 1999.

MATUTE, D.R.; MCEWEN, J.G.; PUCCIA, R.; MONTES, B.A.; SAN-BLAS, G.;

BAGAGLI, E.; RAUSCHER, J.T.; RESTREPO, A.; MORAIS, F.; NIÑO-VEGA, G.;

TAYLOR, J.W. Criptic speciation and recombination in the fungus Paracoccidioides

brasiliensis as revealedby gene genealogies. Mol. Biol. Evol., v. 22, p. 1-9, 2005.

Mc ORIST, S.; ROBERTS, L.; JASNI, S.; ROWLAND, A.C.; LAWSON, G.H.;

GEBHART, C.L.; BOSWORTH, B. Developed and reolving lesions in porcine

proliferative enteropathy: possible pathogenetic mechanisms. J. Comp. Pathol., v. 115,

p. 35-45, 1996.

MENDES-GIANNINI, M.J.S., BUENO, J.P., SHIKANAI-YASUDA, M.A,

FERREIRA, A.W.; MASUDA, A. Antibody response to the 43 kDa glycoprotein of

Paracoccidioides brasiliensis as a marker for the evaluation of patients under treatment.

Am. J. Trop. Med. Hyg. v. 43, p. 200-206, 1990.

MENDES-GIANNINI, M.J.S.; MORAES, R.A.; RICCI, T.A. Proteolytic activity of the

43,000 molecular weight antigen secreted by Paracoccidioides brasiliensis. Rev. Inst.

Med. Trop., v. 32, p. 385, 1990.

MENDES-GIANNINI, M.J.S.; RICCI, L.; UEMURA, M.A.; TOSCANO, E.; ARNS,

C.W. Invasion of Vero cells by Paracoccidioides brasiliensis. Rev. Arg. Micol., v.15,

p. 29, 1992.

MENDES-GIANNINI, M.J.S.; UEMURA, M.A.; HANNA, S.A.; RICCI, T.A. Vero

and HeLa cells infection by different strain of Paracoccidioides brasiliensis. In:

International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division, 7

, and

International Congress of Mycology Division, 7

, Praga, República Theca, 1994. Anais,

p. 352.

MENDES-GIANNINI, M.J.S.; RICCI, L.C.; UEMURA, M.A.; TOSCANO, E.; ARNS,

C.W. Infection and apparent invasion of Vero cells by Paracoccidioides brasiliensis. J.

Med. Vet. Mycol., v. 32, p. 189-197, 1994.

MENDES-GIANNINI, M.J.S.; TAYLOR, M.L.; BOUCHARA, J.B.; BURGER, E.;

CALICH, V.L.G.; ESCALANTE, E.D.; HANNA, S.A.; LENZI, H.L.; MACHADO,

M.P.; MIYAJI, M.; MONTEIRO DA SILVA, J.L.; MOTA, E.M.; RESTREPO, A.;

RESTREPO, S.; TRONCHIN, G.; VINCENZI, L.R.; XIDIEH, C.F.; ZENTENO, C.F.

Pathogenesis II: Fungal responses to host responses: interaction of host cells with fungi.

Med. Mycol., v. 38, p. 113-123, 2000.

MENDES-GIANNINI, M.J.S.; HANNA, S. A.; MONTEIRO DA SILVA, J.L.;

ANDREOTTI, P.F.; VINCENZI, L.R.; BENARD, G.; LENZI, H.L.; SOARES, C. P.

Invasion of epithelial mammalian cells by Paracoccidioides brasiliensis leads to

cytoskeletal rearrangement and apoptosis of the host cell. Microb. Infect., v. 6, p. 882-

891, 2004.

MENDES-GIANNINI, M.J.; SOARES, C.P.; DA SILVA, J.L.; ANDREOTTI, P.F.

Interaction of pathogenic fungi with host cells: Molecular and cellular approaches.

FEMS Immunol. Med. Microbiol., v. 45, p. 383-394, 2005.

MENDES-GIANNINI, M.J.S.; ANDREOTTI, P.F.; VINCENZI, L.R.; MONTEIRO

DA SILVA, J.L.; LENZI, H.L.; BENARD, G.; ZANCOPÉ-OLIVEIRA, R.; GUEDES,

H.L.M.; SOARES, C.P. Binding of extracellular matrix proteins toParacoccidioides

brasiliensis. Microb. Infect., v. 8, p. 1550-1559, 2006.

MENZIES, B.E.; KOURTEVA, I. Internalization of Staphylococcus aureus by

endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun., v. 66, p. 5994-5998, 1998.

MIKULA, M.M.; SCHREIBER, Z.; HUSAK, L.; KUCEROVA, J.; RUTH, R.;

WIESER, K.; ZATLOUKAL, H.; BEUG, E.F.; BACCARINI, M. Embryonic lethality

and fetal liver apoptosis in mice lacking the c-raf-1 gene. EMBO J., v. 20, p. 1952–

1962, 2001.

MONACK, D.M.; RAUPACH, B.; HROMOKYJ, A.E.; FALKOW, S. Salmonella

typhimurium in vasion induces apoptosis in infected macrophages. Proc. Natl. Acad.

Sci., v. 93, p. 9833-9838, 1996.

MONACK, D.M.; MECSAS, J.; BOULEY, D.; FALKOW, S. Yersinia-induced

apoptosis in vivo aids in the establishment of a systemic infection of mice. J. Exp.

Med., v. 188, p. 2127-2137, 1997.

MONTEIRO DA SILVA, J.L. Aderência, ligação à fibronectina e invasão de

Paracoccidoides brasiliensis ás células Vero. Dissertação de Mestrado, 2000, 120f.

MONTEIRO DA SILVA, J.L; ANDREOTTI, P.F.; BENARD, G.; SOARES, C.P.;

MIRANDA, E.T.; MENDES-GIANNINI, M.J.S. Epithelial cell treated with genistein

inhibit adhesion and endocytosis of Paracoccidioides brasiliensis. Antonie Van

Leeuwenhoek, v. 90, 2006.

MOREIRA, A.P; CAMPANELLI, A,P; CAVASSANI , K.A, SOUTO, J.T.,

FERREIRA, B.R., MARTINEZ, R., ROSSI , M.A; SILVA JS. Intercellular adhesion

molecule-1 is required for the early formation of granulomas and participates in the

resistance of mice to the infection with the fungus Paracoccidioides brasiliensis. Am J

Pathol., v. 169, p.1270-81, 2006.

MOULDING, D.A.; WALTER, C.; HART, A.; EDWARDS, S.W. Effects of

staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis. Infect.

Immun., v. 67, p. 2312-2318, 1999.

MULLER, A.; HACKER, J.; BRAND, B.C. Evidence for apoptosis of human

macrophages-like HL-60 cells by Legionella pneumophilia infection. Infect.I mmun.,

v. 64, p. 4900-4906, 1996.

MÜNTER, S.; WAY, M.; FRISCHKNECHT, F. Signaling during pathogen infection.

Sci. Stke, v. 335, p. 517-607, 2006.

NEUHOFF, V.; AROLD, N.; TAUBE, D.; EHRHARDT, W. Improved staining of

proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear

background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.

Electrophoresis, v.9, p.255-262, 1988.

NIELSEN, B.L.; BROWN, L.R. The bases for colored silver protein complex formation

in stained polyacrilamide gels. Anal .Biochem., v. 141, p. 311-315, 1984.

ODABAEI, G.; CHATTERJEE, D.; JAZIREHI, A.R.; GOODGLICK, L.; YEUNG, K.;

BONAVIDA, B. Raf-1 kinase inhibitor protein: structure, function, regulation of cell

signaling and pivotal role in apoptosis. Adv. Cancer. Res. v. 91,p.169-200, 2004.

O'FARRELL, P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.

J. Biol. Chem., v.250, p. 4007-4021, 1975.

OLLERT, M.W.; SÖHNCHEN, R.; KORTING, H.C.; OLLERT, U.; BRÄUTIGAM,

S.; BRÄUTIGAM, W. Mechanisms of Adherence of Candida albicans to cultured

human epidermal keratinocytes. Infec. Immun., v. 61, p. 4560-4568, 1993.

PARIS, S. ; BOISVIEUX-ULRICH, E. ; CRESTANI, B. ; HOUCINE, O. ;

TARAMELLI, D.; LOMBARDI, L. ; LATGÉ, J.P. Internalization of Aspergillus

fumigatus conidia by epithelial and endothelial cells. Infect. Immun., v. 4, p. 1510-

1514, 1997.

PENALVER, M.C.; CASANOVA, M.; MARTINEZ, J.P.; GIL, M.L. Cell wall

protein and glycoprotein constituents of Aspergillus fumigatus that bind to polystyrene

may be responsible for the cell surface hydrophobicity of the mycelium. Microbiology.,

v.142, p.1597-604, 1996.

PERAÇOLI, M.T.S.; SUGIZAKI,M..F.; MENDES, R.P.; NAIFF, R.D.; SARTORI, A.;

MONTENEGRO, M.R. Estudo da virulência de amostra de Paracoccidioides

brasiliensis isolada de tatu (Dasypus novemcinctus). Rev. Argent .Micol., v. 15, p. 41,

1992.

POULAIN, D.; TRONCHIN, G.; BIGUET, J.; DUBREMETZ, J.F. Ultrastructure of

the cell wall of Candida albicans blastospores: study of its constitutive layers by the use

of cytochemical technique revealing polyssaccharides. Ann. Microbiol., .v. 129, p. 10-

16, 1978.

PUCCIA, R.; SCHENKMAN, S.; GORIN, A.J.P.; TRAVASSOS, L.R. Exocellular

components of Paracoccidioides brasiliensis: identification of a specific antigen. Infect.

Immun., v. 53, p. 199-206, 1986.

PUCCIA, R.; TRAVASSOS, L.R. 43 kilodalton glycoprotein from Paracoccidioides

brasiliensis: Immunochemical reactions with sera from pacients with

paracoccidioidomycosis ,histoplasmosis or Jorge Lobo's disease. J. Clin. Microbiol., v.

29, p. 1610, 1991.

RESTREPO, A. The ecology of Paracoccidioides brasiliensis. Apuzzle still unsolved.

J. Med. Vet. Mycol., v. 23, p. 323, 1985.

ROSTAND, K.S.; ESKO, J.D. Microbial adherence to and invasion through

proteoglycans. Infect Immun., v. 65, p. 1-8, 1997.

RUPLEY, J.A. The hydrolisis of chitin by concentrated hydrochloric acid and the

preparation of low molecular weight substrates for lysozyme. Bioch. Biophys. Acta.,

v. 83, p. 245-255, 1964.

SAJJAN, U.S.; SYLVESTER, F.A.; FORSTNER, J.F. Cable-pilited Burkholderia

cepacia binds to cytokeratin 13 of epithelial cells. Infect. Immun., v. 68, p. 1787-1795,

2000.

SALYERS, A.A.; WHITT, D.D. Bacterial pathogenesis: a molecular approach.

ASM Press. Washington, D.C., 418 p, 1994.

SAMARANAYAKE, L.P.; McFARLANE, T.W. The adhesion of the yeast Candida

albicans to epithelial cells of human origin “in-vitro”. Arch. Oral. Biol., v. 26, p. 815-

820, 1981.

SAN-BLAS, G.; SAN-BLAS, F. Paracoccidioides brasiliensis: cell wall structure and

virulence. Mycopathol., v. 62, p. 77-86, 1977.

SAN-BLAS, F.; SAN-BLAS, G. Biochemistry of Paracoccidioides brasiliensis

dimorphism. In Paracoccidioidomicosys. FRANCO, M.; LACAZ, C.S.; RESTREPO-

MORENO, A.; DEL NEGRO, G.(Eds). London: Boca raton, CRC Press, 1994 , p. 49-

66.

SAN-BLAS, G.; SAN-BLAS, F. Paracoccidioides brasiliensis: virulence and host

response. In Fungal pathogenesis: principles and clinical applications. CIHLAR,

R.L.; CALDERONE, R.A. (Eds). New York: Marcel Dekker, Inc, 2000.

SANSONETTI, P.J. Genetic and molecular basis of ephitelial cell invasion by Shigella

species. Rev. Infect. Dis., v. 13, p. 5285-5292, 1991.

SAWYER, R.T.; GARNER, R.E.; HUDSON, J.A. Arg-Gly-Asp(RGD) peptides alter

hepatic killing of Candida albicans in the isolated perfused mouse liver model. Infect.

Immun., v. 60, p. 213-218, 1992.

SEGAL, E.; LEHRER, N.; OFEK, I. Adherence of Candida albicans to human vaginal

epithelial cells, inhibition by amino sugars. Expl.Cell. Biol., v. 50, p.13-17, 1982.

SHIKANAI-YASUDA, M.A.; TAGUCHI, R.T.; SATO, M.K.; MELO,

N.T.; ASSIS, C.M.; NIGRO, R.C.; CAMARGO, E.E.; LACAZ, C.S.; AMATO

NETO, V.; SESSO, A. In vitro action of some disinfectants on Paracoccidioides

brasiliensis yeast forms. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, v. 33, p. 37-43, 1991.

SINGER-VERMES, L.M.; BURGER, E.; FRANCO, M.J.; MOSCARDI-BACHI, M.;

MENDES-GIANNINI, M.J.S.; CALICH, V.L.C. Evaluation of the pathogenicity and

immunogenicity of seven Paracoccidioides brasiliensis isolates in susceptible in bred

mice. J. Med. Vet. Mycol., v. 27, p. 71-82, 1989.

SINGER-VERMES, L.M.; BURGER, E.; CALICH, V.L.G.; MODESTO-XAVIER,

L.H. Pathogenecity and immunogenicity of Paracoccidioides brasiliensis isolates in the

human disease and in experimental murine model. Clin. Exper. Immun., v. 97, p. 113-

119, 1994.

SKERL, K.G.; CALDERONE, R.A.; SEGAL, E.; SREEVALSAN, T; SCHELD,

W.M. In vitro binding of Candida albicans yeast cells to human fibronectin. Can. J.

Microbiol., v. 30, p. 221-227, 1983.

SONG, G.; OUYANG, G.; BAO, S. The activation of AKT/PKB signaling patway and

cell survival. J. Cell. Mol. Med., v.9, p.59-71, 2005.

SOUZA, M.C; GESZTESI, J.L.; SOUZA, A.R.; MORAES, J.Z.; LOPES, J.D.

Differences in reactivity of paracoccidioidomycosis sera with gp43 isoforms. J. Med.

Vet. Mycol., v. 35, p. 13-8, 1997.

STUDIER, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J.

Mol. Biol., v.79, p. 237-248, 1973.

TAMURA, G.S.; NITTAYAJARN, A. Group B streptococci and other gram-positive

cocci bind to cytokeratin 8. Infect .Immun., v. 68, p. 2129-2134, 2000.

THOMPSON, C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science, v.

267, p. 1456-1462, 1995.

TIMPL, R.; BROWN, J.C. The laminins. Matrix Biol., v.14, p. 275-81, 1994.

TOWBIN, H.; STACHELIN, T.; GORDON, J. Eletrophoretic transfer of proteins from

polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proc.

Natl. Acad. Sci., v. 76, p. 4350-4352, 1979.

TRAN VAN NHIEU, G.; SANSONETTI, P.J. Mechanisms of Shigella entry into

epithelial cells. Curr. Opin. Microbiol., v. 2, p. 51-55, 1999.

TRAVERSE, S.; COHEN, P.; PATERSON, H.; MARSHALL, C.; RAPP, U.;

GRAND,R.J. Specific association of activated MAP kinase kinase kinase (Raf) with the

plasma membranes of ras-transformed retinal cells. Oncogene, v. 8, p. 3175-3181,

1993.

TRONCHIN, G.; BOUCHARA, J.P.; FERRON, M.; LARCHER, G.; CHABASSE, D.

Cell surface properties of Aspergillus fumigatus conidia: correlation between adherence,

agglutination and rearrangements of the cell wall. J. Microbiol., v. 41, p. 714-721,

1993.

UEMURA, M.A. Evidências da participação dos mecanismos de adesão e invasão

celular na patogenicidade do Paracoccidioides brasiliensis. Dissertação de Mestrado -

Instituto de Biologia -UNICAMP, 1996, 99p.

UEMURA, M.A.; HANNA, S.A.; RICCI, L.C.; SANDOVAL, M.; MENDES-

GIANNINI, M.J.S. An electron microscopy study of Paracoccidioides brasiliensis

adherence and invasion of culture cells. In: Encuentro Internacional sobre

Paracoccidioidomicosis. Poto Alegre-Rio Grande do Sul, 1996.

UNTEREINER, W.A.; SCOTT, J.A.; NAVEAU, F.A.; SIGLER, L.; BACHEWICH, J.;

ANGUS, A. The Ajellomycetaceae, a new family of vertebrate-associatede Onygenales.

Mycology, v. 96, p.812-861, 2004.

VAUX D. L.; KORSMEYER, S. J. Cell death in development. Cell, v. 96, p. 245-254,

1999.

VESPA, M.N.; LOPEZRIBOT, J.L.; CHAFFIN, W.L. Adherence of germ tubes of

Candida albicans to tissues from immunocompromised mice. FEMS Immun. Med.

Microbiol., v. 11, p. 57-63, 1995.

VICENTINI, A. P.; GESZTESI, J.L.; FRANCO, M.F.; de SOUZA, W.; de MORAES,

J.Z.; TRAVASSOS, L.R.; LOPES, J.D. Binding of Paracoccidioides brasiliensis to

Laminin through surface glycoprotein gp43 leads to enhancement of fungal

pathogenesis. Infect. Immun., v.62, p. 1465-1469, 1994.

VINCENZI, L.R. Bases moleculares do processo de adesão de Paracoccidioides

brasiliensis à proteínas da matriz extracelular. Dissertação (Mestrado)-Instituto de

Química-UNESP, 2000, 103p.

WATARI, M.; FUNATO, S.; SASAKAWA, C. Interaction of Ipa proteins of Shigella

flexneri with α

integrin promotes entry of the bacteria into mammalian cells. J. Exp.

Méd., v. 183, p. 991-999, 1996.

WEBER, C.K.; SLUPSKY, J.R.; HERRMANN, C.; SCHULER, M.; RAPP, U.R.;

BLOCK, C. Mitogenic signaling of Ras is regulated by differential interaction with Raf

isozymes. Oncogene, v. 19, p.169–176), 2000.

WELLS, C. L.; VANDE WESTERLO, E.M.A.; JECHOREK, R.P.; HAINES, H.M.;

ERLANDSEN, S.L. Cytochalasin Induced actin disruption of polarized enterocytes can

augment internalization of bacteria. Infect. Immun., v. 66, p. 2410-2419, 1998.

YARZÁBAL, L.A.; BOUT, D.; NAQUIRA, F.; FRUIT, J.; ANDRIEU, S.

Identification and purification of the specific antigen of Paracoccidioides brasiliensis

responsible for immunoelectrophoretic band E. Sabouraudia, v. 15, p. 79-85, 1977.

YARZÁBAL, L.A. Composición antigênica do Paracoccidioides brasiliensis. In: DEL

NEGRO, G., LACAZ,C.S., FIORILLO, A.M. Paracoccidioidomicose. São Paulo:

Sarvier, 1982.

YOSHIDA, N.; FAVORETO, S.; FERREIRA, A.T.; MANQUE, P.M. Signal

transduction induced in Trypanossoma cruzi metacyclic trypomastigotes during the

invasion of mammalian cells. Braz. J. Med. Biol. Research., v. 33, p. 269-278, 2000.

ZACHARIAS, D.; VEDA, A.; MOSCARDI-BACHI, M.; FRANCO, M.; SAN-BLAS,

G.A. A comparative histopathological, immunological and biochemical study of

experimental intravenous paracoccidiodomycose induced in mice by three

Paracoccidioides brasiliensis isolates. J. Med.Vet. Mycol., v. 24, p. 445-454, 1986.

ZAR, J.H. Bioestatistical Analysis. 2

ed. Englewood Cliffs. Prentice Hall, 1984,

718p.

ZINK, S.; THORSTEN, N.A.; ROSEN, P.; ERNST, F. Migration of the fungal

pathogen Candida albicans across endothelial monolayers. Infect. Immum., v.12, p.

5085-5091, 1996.

ZYCHLINSKY, A.; THIRUMALAI, K.; ARONDEL, J.; CANTEY, R.J.;

ALIPRANTIS, A.O.; SANSONETTI, P.J. In vitro apoptosis in Shigella flexneri

infections. Infect. Immun., v. 64, p. 5357-5365, 1996.

8. ANEXO

Tabela 2 - Influência da temperatura na adesão dos isolados de P.brasiliensis Pb18 e

Pb265 às células Vero.

Aderência relativa % ±

±±

± D.P.

Vero

Amostras

Tratamento térmico Pb18 Pb265 p

Sem Tratamento 100 100 -

121

46,6 ± 6,2 44,2 ± 6,0

P<0,05

100

63,4 ± 9,1 77,5 ± 6,0

P<0,05

89,6 ± 8,6 84,3 ± 6,6

P>0,05

Dados apresentam média mais desvio-padrão de 3 experimentos.

: teste estatístico, considerado significativo (p<0,05).

Tabela 3- Resultados da influência da temperatura na adesão dos isolados de

P.brasiliensis Pb18 e Pb265 às células HeLa.

Aderência relativa % ±

±±

± D.P.

HeLa

Isolados

Tratamento

térmico

Pb18 Pb265 p

Sem tratamento 100 100 -

121

44,6 ± 4,5 48,6 ± 3,8

P<0,05

100

63,2 ± 3,6 77,3 ± 13,4

P<0,05

75,3 ± 7,4 87,6 ± 6,4

P>0,05

Dados apresentam a média e o desvio padrão de 3 experimentos.

: teste estatístico, considerado significativo (p<0,05).

Tabela 4- Resultados do efeito de agentes químicos e de lectinas na adesão dos

isolados de P.brasiliensis Pb18 e Pb265 às células Vero

Aderência relativa % ±

±±

± D.P.

Vero Isolados

pré-tratamento Pb18 Pb265 p

Sem tratamento 100 100 -

Formalina

103,2±4,3 95,0 ± 10,7

p>0,05

Azida sódica

61,4±11,8 55,5 ± 8,3

P<0,05

Periodato de sódio

48,9 ± 1,9 59,0 ± 4,8

P<0,05

Concanavalina A

64,2±7,8 50,2 ± 10,4

P<0,05

-Dados apresentam a média e o desvio padrão de 3 experimentos.

-p

: teste estatístico, considerando efeito dos tratamentos químicos na adesão e sua

significância ao nível de p<0,05

Tabela 5- Resultados do efeito de vários agentes químicos e lectinas na adesão dos

isolados de P.brasiliensis Pb18 e Pb265 às células HeLa.

Aderência relativa % ±

±±

± D.P.

HeLa Isolados

pré-tratamento Pb18 Pb265 p

Sem tratamento 100 100 -

Formalina

88,2 ± 8,6 80,2 ± 11,3

p>0,05

Azida sódica

64,2 ± 3,5 64,5 ± 7,6

p<0,05

Periodato de sódio

46,5 ± 4,4 47,2±13,1

p<0,05

Concanavalina A

58,2 ± 8, 8 60,4 ± 8,3

p<0,05

- Dados apresentam a média mais o desvio padrão de 3 experimentos.

: teste estatístico, considerando efeito dos tratamentos químicos na adesão e sua

significância ao nível de p<0,05

Tabela 6 – Resultados do efeito das várias substâncias na aderência de P.brasiliensis às

células Vero.

Vero

Aderência relativa %±

±±

± DP

Pré-tratamento Pb18 Pb265 p

Sem tratamento 100 100 -

Tripsina

31,6±5,8 45,6±6,2

P<0,05

SHN

100,0±7,7 102,1±21,4

p>0,05

SHN inativado

101,8±10,4 103,7±18,6

p>0,05

Heparina

93,9±7,8 91,1±22,4

p>0,05

- Dados apresentam a média mais o desvio padrão de 3 experimentos.

- p

: teste estatistico, mostrando o efeito dos tratamentos ao nível de significância de

p<0,05.

- SHN - soro humano normal

Tabela 7- Resultados do efeito de várias substâncias na aderência de P.brasiliensis às

células HeLa.

HeLa

Aderência relativa % ±

±±

± DP

Pré-tratamento Pb18 Pb265 p

Sem tratamento 100 100 -

Tripsina

40,5±5,1 45,5±11,2

p<0,05

SHN

89,4±7,7 87,2±6,5

p>0,05

SHN inativado

97,9±3, 7 95,8±3,3

p>0,05

Heparina

91,5±11,8 78,5±8,5

p>0,05

- Dados apresentam a média e mais o desvio padrão de 3 experimentos. -p

: teste

estatistico, ao nível de significância p<0,05.

- SHN - soro humano normal.

100

Tabela 8 – Resultados do efeito de açúcares e quitina na aderência dos isolados de

P.brasiliensis Pb18 e Pb265 às células Vero.

Vero

Aderência relativa % ±

±±

± D.P.

Açúcares Pb18 Pb265 p

Sem tratamento 100 100 -

D(+)glucosamina

52,4±6,7 48,5±1,4

p<0,05

D(+)galactosamina

55,3±7,3 50,1±6,0

p<0,05

alfa-lactose

89,7±8,2 93,4±5,8

p>0,05

D(+)manose

65,1±12,7 55,4±6,2

p<0,05

mio-inositol

97,5±11,7 97,4±10,5

p>0,05

D(+)galactose

98,0±9,0 119,3±5,7

p>0,05

D(+)glicose

101,4±1,2 94,8±21, 6

p>0,05

Maltose

94,3±2,5 104,4±13,8

p>0,05

Quitina

94,7±5,6 90, 8± 16,0

p>0,05

-Dados apresentam a média mais ou menos o desvio padrão de 3 experimentos.

-p

: teste estatístico, mostrando o efeito dos tratamentos e significativo quando ao nível

de p<0,05.

101

Tabela 9- Resultados do efeito de açúcares e quitina na aderência de P.brasiliensis às

células HeLa.

HeLa

Aderência relativa % ±

±±

± D.P.

Açúcares Pb18 Pb265 p

Sem tratamento 100 100 -

D(+)glucosamina

70,1±5,6 58,1±9,0

p<0,05

D(+)galactosamina

70,7±5,5 51,4±1,6

p<0,05

alfa-lactose

91,1±8,5 100,1±5,6

p>0,05

D(+)manose

60,3±6,7 65,2±3,5

P<0,05

mio-inositol

90,4±10,9 92,4±13,8

p>0,05

D(+)galactose

97,1±9,8 108,4±4,8

p>0,05

D(+)glicose

101,0±9,5 97,6±5,7

p>0,05

maltose

91,71±9,0 94,51±8,2

p>0,05

quitina

93,9±4,0 99,6±4,2

p>0,05

-Dados apresentam a média mais ou menos o desvio padrão de 3 experimentos.

- p

: teste estatístico mostrando ser significativo ao nível de p<0,05

102

Tabela 10 – Resultados do efeito de açúcares no processo de adesão de P.brasiliensis às

células Vero por ensaio competitivo.

Aderência relativa % ±

±±

± DP

Vero Isolados fúngicos

Pb18 Pb265 Pª

Controle 100 100 -

Glicose

96,0±1,5 91,3±6,7

p>0,05

Manose

68,5±2,5 60,3±4,7

p<0,05

Galactosamina

65,5±3,9 73,7±4,9

p<0,05

Galactose

88,9±6,2 88,8±6,9

p>0,05

Glucosamina

69,3±2,5 69,1±2,8

p<0,05

- Dados apresentam a média mais ou menos o desvio padrão de 3 experimentos.

- pª: teste estatístico significativo (p<0,05).

103

Tabela 11- Resultados do efeito de açúcares no processo de adesão de P. brasiliensis às

células HeLa por ensaio competitivo.

Aderência relativa % ±

±±

± DP

HeLa Isolados fúngicos

Pb18 Pb265 Pª

Controle 100 100 -

Glicose

90,2±7,9 88,5±9,5

p>0,05

Manose

62,6±5,6 71,2±10,3

p<0,05

Galactosamina

65,6±8,3 71,0±3,9

p<0,05

Galactose

91,3±5,7 89,1±7,7

p>0,05.

Glucosamina

72,7±9,0 67,6±13,2

p<0,05

- Dados apresentam a média mais ou menos o desvio padrão de 3 experimentos.

- pª: teste estatístico significativo (p<0,05).

Tabela 12 – Resultados do efeito da laminina no processo de adesão às células Vero

em ensaio competitivo.

Aderência relativa % ±

±±

± DP

Vero Isolado

Pb18 Pb265

Controle 100 100

Laminina

58,7±7,6

89,6±14,8

Dados estatísticos apresentam a média mais ou menos o desvio padrão de 3

experimentos.

a: teste estatístico significante (p<0,05).

104

Tabela 13 – Resultados do efeito da laminina no processo de adesão às células HeLa

em ensaio competitivo.

Aderência relativa % ±

±±

± DP

HeLa Isolado

Pb18 Pb265

Controle 100 100

Laminina

60,8±9,2

92,7±12,5

Dados estatísticos apresentam a média mais ou menos o desvio padrão de 3

experimentos.

a: teste estatístico significância (p<0,05).

Tabela 14- Resultados do efeito de peptídeos sintéticos derivados da laminina na

aderência de P.brasiliensis às células Vero.

Aderência relativa % ±

±±

± DP

Vero Isolados

Pb18 Pb265

Controle 100 100

YIGSR¹

43,0 ±5,4ª

85,8±5,5

CDPGYIGSR-NH

52,8±5,1ª

82,8±9,4

- Dados apresentam a média mais ou menos o desvio padrão de 3 experimentos.

a: teste estatístico, significante entre tratamentos (p<0,05).

b: teste estatístico significante entre os isolados (p<0,05).

-1-derivados de laminina

105

Tabela 15-Resultados do efeito de peptídeos sintéticos derivados da laminina na

aderência de P.brasiliensis às células HeLa.

Aderência relativa % ±

±±

± DP

HeLa Isolado

Pb18 Pb265

Controle 100 100

YIGSR¹

46,9±8,0ª

84,8±10,1

CDPGYIGSR-NH

52,6±8,5ª

83,5±12,3

Dados apresentam a média mais ou menos o desvio padrão de 3 experimentos.

a: teste estatístico, significativo entre tratamentos (p<0,05).

b: teste estatístico significante entre as amostras (p<0,05).

1- derivados de laminina.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 