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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS
TESE DE DOUTORADO
AVALIAÇÃO DE MUTAGENICIDADE, CITOTOXICIDADE E
EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS A APOPTOSE,
BAK, BCL-2 E P53 FOSFORILADO, EM CÉLULAS TRATADAS
COM FULIGEM E PARTICULADO TOTAL DE QUEIMA DE
CANA-DE-AÇÚCAR
DOUTORANDA: Mariana Cristina Caloni Peron
ORIENTADORA: Christiane Pienna Soares
2006
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LISTA DE ABREVIAÇÕES
ACN – acetonitrila
CV – Coeficiente de variação
DCM – diclorometano
DNA – ácido desoxirribonucleico
DMSO – dimetilssulfóxido
ED/XRE – energia dispersiva por fluorescência de raio X
FITIC – isotiocianato de fluoresceina
Flu – fluorescência
GC/MS – cromatografia gasosa/ espectometria de massa
HPAs – hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
HPLC – high performance liquid chromatography (cromatografia líquida de alta eficiência)
IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry
KDa – quilodalton
m - metro
mg - miligrama
mL - mililitro
MeOH – metanol
Min - minuto
MN – micronúcleo
MTT – 3-(4,5 – dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H – tetrazolium bromide
NaCl – cloreto de sódio
NCEs- eritrócitos normocromáticos
nm – nanômetro
PBS – tampão salina fosfato
PCEs – eritrócitos policromáticos
PTS – particulado total
R
2
– coeficiente de correlação
ROFA – Residual Oil Fly Ash
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ROFA/PE - Residual Oil Fly Ash, isolado de um precipitador eletrostático
ROFA/HU - Residual Oil Fly Ash, isolado do incinerador do Hospital das Clínicas de São
Paulo
RQCA – Material particulado de queima de cana-de-açúcar
SFB – soro fetal bovino
Trad MCN – teste do micronúcleo em Tradescantia pallida
% - porcentagem
λex – comprimento de onda de excitação
λem – comprimento de onda de emissão
µL – microlitro
°C – graus Célsius
4
ÍNDICE
___ Revisão de Literatura e Introdução
Poluição Atmosférica .............................................................................................09
Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs).................................................10
Queima de Cana-de-Açúcar (RQCA).....................................................................11
Residual Oil Fly Ash...............................................................................................13
Poluição Atmosférica e Mutagenicidade................................................................14
Teste do Micronúcleo (MN)...................................................................................15
Teste do Micronúcleo em Planta............................................................................18
Citotoxicidade e Apoptose.....................................................................................20
___ Justificativa.................................................................................................................24
___ Objetivos ....................................................................................................................27
___ Materiais e Métodos
Caracterização das partículas da biomassa de cana-de-açúcar e ROFA................29
Coleta da fuligem depositada e ROFA..................................................................30
Coleta do material particulado total através do filtro (PTS)..................................30
Análise cromatográfica dos extratos......................................................................31
Animais..................................................................................................................34
Coleta e processamento do material biológico......................................................35
Coleta e exposição da Tradescantia pallida..........................................................36
Cultura de células..................................................................................................37
Ensaio de MTT.....................................................................................................38
Citometria de fluxo (bak, bcl-2 e p53 fosforilado).............................................. 39
Análise Estatística................................................................................................ 40
___ Resultados................................................................................................................. 42
___ Discussão................................................................................................................... 61
___Conclusões.................................................................................................................. 68
___ Referências Bibliográficas......................................................................................... 70
___ Anexo Artigo 1.......................................................................................................... 90
Artigo 2...........................................................................................................116
5
ABSTRACT
6
Ethanol obtained from sugar cane has been considered an alternative fuel.
However, in developing countries, the handly harvesting is usually done after to sugar cane
burning which is responsible for seasonal emission of air pollutants. The genotoxicity of
sugar cane burning residues (SCBRs) and particle surrogates of residual oil fly ash (ROFA)
were observed in micronuclei (MN) assay in mouse peripheral blood and bone marrow
cells as well as in the pollen mother cells of Tradescantia pallida (TRAC-MCN). The
micronucleus frequency in peripheral blood was higher 48 hr after administration of the
samples and the highest micronucleus frequency was observed in animals receiving 0.03
mg/ml SCBR. The total suspended particulate (TSP) was sampled in harvesting and non-
harvesting sugar cane periods, PHAs was extracted and particulate was resuspended. The
study also verified cytotoxicity and genotoxicity of cells treated with polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAHs) and suspension, in harvesting and non-harvesting particulated
biomass. Residues burning and total suspended particulated (TSP) induced high frequency
of MN in mouse red cells and in the TRAD-MCN bioassay. In contrast, MN frequency in
bone marrow cells did not show effect at the 24 hr and 48 hr and no time-dose interaction.
Cell death and apoptosis signal was verified by MTT assay and flow cytometry of Bak,
Bcl-2 and p53 phosporylated expression were performed in lung carcinoma cell line
(A549). Higher frequency of MN was observed in harvesting TSP than non-harvesting and
the cell death was higher in cells treated with PHAs in both particulates. Bcl-2
overexpression of p53 phosphorylated low expression was verified in the cells treated with
PHAs in harvesting and non-harvesting in 24 and 48 hours after treatment. We can
conclude that PHAs presenting in harvesting time, which represents burning sugar cane
biomass and non-harvesting time (fuel fossil combustion) are cytotoxic and genotoxic.
7
Public politics should be discussed to found alternatives which could decrease air pollution
emissions.
RESUMO
8
O etanol obtido da cana-de-açúcar tem sido considerado um combustível
alternativo. Entretanto, em países em desenvolvimento, a colheita de cana é realizada
manualmente depois da queima, sendo responsável pela emissão sazonal de poluentes
atmosféricos. A mutagenicidade dos resíduos de queima de cana (RQCA) e as partículas
presentes na ROFA (residual oil fly ash) foram observados nos ensaios de micronúcleo em
células sanguíneas de camundongos e de células mãe de grão de pólen de Tradescantia
pallida (TRAC-MCN). A freqüência de micronúcleo foi maior em sangue periférico em
48h pós-tratamento e a mais alta freqüência foi observada em animais que receberam 0.03
mg/ml de RQCA. O particulado total (TSP) foi coletado no período de safra (queima de
cana) e entressafra (combustão de combustível fóssil), os hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos (HPAs) extraídos e o particulado. O estudo também verificou a citotoxicidade,
apoptose e genotoxicidade nas células tratadas com extrato orgânico contendo grande
quantidade de HPAs e suspensão na biomassa do período de safra e entressafra. TSP
induziu alta frequência de MN em células sanguíneas de camundongo e no ensaio TRAD-
MCN . Por outro lado, a freqüência de MN, em células da medula óssea, não demonstrou
efeito em 24 e 48 h após o tratamento e sem efeito dose-resposta. A morte celular e sinais
de apoptose foram verificados pelo ensaio de MTT e por expressão de Bak, Bcl-2 e p53
fosforilado (por citometria de fluxo) em linhagens celulares de carcinoma pulmonar
(A549). Uma alta freqüência de MN foi observada no TSP do período de safra que na
entressafra e a porcentagem de células mortas foi maior em células tratadas com extrato
orgânico contendo grande quantidade de HPAs e particulado. Elevada expressão de Bcl-2 e
baixa expressão de p53 fosforilado foi verificado em células tratadas com extrato orgânico
contendo grande quantidade de HPAs no período de safra e entressafra e em 24 e 48h pós-
tratamento. É possível concluir que os HPAs presentes no período de safra e entressafra
9
são genotóxicos e citotóxicos. Políticas públicas deveriam ser discutidas para se buscar
alternativas que diminuam a emissão desse poluente.
REVISÃO DE LITERATURA E INTRODUÇÃO
10
Poluição Atmosférica
A poluição do ar tem sido foco, por séculos, de diversas discussões sobre seu
impacto na saúde humana. A população das cidades da antigüidade usava madeira como
fonte de energia e o uso do carvão contribuiu para a Revolução Industrial, constituindo-se a
base da nossa atual sociedade tecnológica. Infelizmente, em associação íntima com os
benefícios advindos dos avanços tecnológicos, convivemos com uma proporcional
degradação do meio ambiente (BLIMBESCOMBE, 1999; WARK et al., 1998).
Atualmente o ar nas grandes cidades é comumente contaminado por uma variedade
de poluentes originados de fontes fixas e móveis, principalmente por queima de
combustível fóssil. O mais importante poluente emitido no ar é o material particulado com
composição variada, incluindo metais pesados e gases, como carbono, nitrogênio, óxido
sulfúrico e hidrocarbonetos. Esses particulados emitidos têm ação genotóxica sobre os
organismos vivos, contribuindo usualmente para mutagenicidade celular (SCARPATO et
al., 1993). Associações entre concentrações de partículas e os efeitos na saúde humana têm
sido bastante pesquisadas e presume-se que a mutagênese presente nas células possa
contribuir para o desenvolvimento do câncer (CURY et al., 2000; SOARES et al., 2003).
Essas moléculas de vários tamanhos são inaladas e alcançam diferentes regiões do trato
respiratório e algumas doenças respiratórias e pulmonares estão associadas, e podem ser
agravadas, por inalação de material particulado ou gases poluentes do meio ambiente
(BUSCHINI, et al., 2001; DOCKERY et al., 1994; KLEEBERGER et al., 1998 e
SCHWARTZ et al., 1993).
Embora a percepção sobre os malefícios da poluição atmosférica seja observada
desde o século XIII, a elaboração de leis que minimizem o seu impacto ao meio ambiente
11
somente aconteceu em anos recentes (considerando a história da humanidade), quando o
problema passou a ser documentado.
Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs)
Dentre as moléculas consideradas mutagênicas e/ou carcinogênicas, os
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) ocupam lugar de destaque nos estudos
ambientais e biológicos.
Os HPAs constituem uma família de compostos caracterizada por possuírem dois ou
mais anéis aromáticos condensados. Essas substâncias, bem como seus derivados nitrados
e oxigenados, têm ampla distribuição e são encontrados como constituintes de misturas
complexas em todos os compartimentos ambientais (WHO, 1998; PEREIRA NETTO et al.,
2000). Os HPAs podem ser encontrados em plantas terrestres e aquáticas, solos,
sedimentos, águas naturais e marinhas e, particularmente, na atmosfera (TAO et al., 2004).
Os HPAs representam uma classe importante de poluentes ambientais, que são
conhecidos por sua ação mutagênica e/ou carcinogênica, cujas lesões são resultantes das
ligações com o DNA. As principais fontes desses compostos nocivos são provenientes da
emissão de material particulado da queima de plantações agrícolas ou da madeira queimada
em fogão a lenha, combustão do carvão, incêndio de florestas e motores de veículos
(LEWTAS et al., 1992). A partir dos estudos de Miller e Miller (1971), houve a expansão
do conhecimento sobre o metabolismo dos HPAs, estabelecendo-se que esses compostos
não são ativos na forma em que são ingeridos ou inalados, tornando-se reativos apenas após
serem convertidos enzimaticamente, por meio de reações específicas do metabolismo.
12
Queima da cana-de-açúcar (RQCA)
A queima da cana-de-açúcar tem sido considerada como um poluente atmosférico
das regiões canavieiras de São Paulo. Trata-se de uma prática antiga, realizada no passado
por agricultores primitivos, a fim de agilizar e facilitar o trabalho de corte e desponte
manual da cana na época da colheita. Na colheita de cana verde (não queimada), as folhas
são muito densas, aumentando os riscos de acidentes entre os trabalhadores e estes ficam
também suscetíveis a ataques de abelhas, cobras, aranhas e escorpiões. A prática agrícola
da queima é um procedimento ainda utilizado nos dias atuais, principalmente em regiões de
grande desnivelamento de solo, onde a colheita mecânica não é utilizada pelo risco de
tombamento das máquinas (GONÇALVES, 2000; MAGALHÃES e BRAUNBECK, 2001).
Em Araraquara, a queima ocorre anualmente no período de safra, e os produtos de
combustão ficam dispersos no ar atmosférico sob a forma de fuligem e gases. Segundo
UNEP et al. 1995; os resíduos de cana-de-açúcar representam 11% da produção mundial de
resíduos agrícolas, cuja queima produz substancial liberação de CO2 e, durante o processo
de combustão, são liberados também outros gases. Os gases N2O e NOx são gerados na
fase de combustão com a chama, sendo que e os gases CO e CH4 são formados sob
condições de queima com predomínio de fumaça. Ainda, a alta emissão de gases COx,
NOx e SOx é responsável pela poluição atmosférica e a diminuição da qualidade do ar na
região (ALMEIDA-FILHO, 1995).
Em função das pressões sociais e do entendimento que o produto de queima de
cana, quando inalado, causa transtornos à saúde dos indivíduos expostos, em 06 de agosto
de 1997, foi regulamentado o decreto n.º42.056 que institui o Plano de Eliminação de
Queima (PEQ). Esse plano surgiu de pressões sociais alusivas às condições desfavoráveis
13
da qualidade do ar com a prática de queima de cana, instituindo a legal obrigatoriedade da
coleta mecanizada. Entretanto, tal medida provocou enorme insatisfação entre os
produtores de cana-de-açúcar do estado de São Paulo, culminando na aprovação de novo
projeto de lei em 02 de maio de 2002. Esta nova lei possui proposições mais tolerantes em
relação
às áreas de restrição à queima e garantiu a dilatação do prazo para implementação
da colheita mecanizada para 15 anos (GONÇALVES, 2000).
Em face à insatisfação de determinados segmentos da sociedade e o não
cumprimento da lei pelos produtores sucro-alcooleiros, proliferam-se ações judiciais contra
a prática da queima da cana no estado de São Paulo (GONÇALVES, 2000). Questões de
ordem sócio-econômica são os principais argumentos para a manutenção da queima de cana
em Araraquara, embora a cidade seja classificada como área adequada à mecanização, pois
os canaviais estão distribuídos em terrenos planos. Em contrapartida, a adoção da colheita
mecanizável poderá alterar
todo sistema de produção da cana-de-açúcar, tradicionalmente
conhecida pelo grande número de empregos gerados no período de safras. Estima-se que
somente para as áreas potencialmente mecanizáveis, o número de desempregados somaria
cerca de 90.000, apenas no estado de São Paulo, caso a prática de queima fosse substituída
pela mecanização da cana crua (ORPLANA, 1996; SILVA, 1997). Outro problema,
com a
implantação da colheita mecanizada é o desempenho do maquinário, possibilitando menor
quantidade de cana colhida quando comparada à obtida após a queima. Dessa forma, o
baixo volume do material recolhido na colheita mecanizada de cana verde não garante boa
produtividade, deixando os produtores pouco estimulados (MAGALHÃES e
BRAUNBECKER, 2001). Diante do exposto, a prática de queima de cana é ainda uma
realidade, bastando observar a deposição de fuligem por toda a cidade de Araraquara e
regiões adjacentes.
14
Diversos trabalhos têm apontado efeitos nocivos dos poluentes atmosféricos sobre a
saúde dos indivíduos expostos, principalmente sobre o trato respiratório, o qual sofre ação
direta desses efeitos da poluição atmosférica (ARBEX, 2000; BERALDI, 1999;
FERREIRA, 1999; MAZZINI, 2002; e MORETI, 1998). A relação entre o aumento da
concentração atmosférica de material particulado e a necessidade de terapia inalatória foi
observada. Os indivíduos submetidos à exposição à fuligem de queima de cana-de-açúcar
procuravam com maior freqüência hospitais e postos de saúde para terapia inalatória
(ARBEX et al., 2000). Estudos anteriores de nosso laboratório demonstraram a relação
entre processos inflamatórios agudos, com aumento de bactérias e leveduras, em esfregaços
citológicos corados do lavado nasal de indivíduos expostos à fuligem da queima de cana-
de-açúcar em Araraquara (BERALDI, 1999; FERREIRA, 1999; MAZZINI, 2002;
MORETI, 1998 e TELLAROLLI et al., 2003).
Residual Oil Fly Ash (ROFA)
Um outro poluente é a ROFA (Residual Oil Fly Ash), um material particulado rico
em metais e outras substâncias, as quais são oriundas de diferentes processos de combustão,
podendo ser encontradas em caldeiras de siderúrgicas ou incineradores. Esse material é
freqüentemente utilizado como controle positivo para estudos de genotoxicidade, uma vez
que a sua composição rica em metais pesados é, em geral, altamente mutagênica aos
organismos vivos expostos, comparadas a outras fontes de poluição (CHEN et al., 2003).
Estudos prévios demonstraram que a ROFA ocasiona danos pulmonares agudos,
inflamação e fibrose em roedores expostos (DREHER et al., 1997; JASKOT et al., 1996).
O potencial mecanismo pelo qual a ROFA induz esses efeitos nocivos pode estar envolvido
15
com o desenvolvimento de uma sobrecarga oxidativa, gerada pelos metais pesados
existentes nesse poluente e pela perda das defesas antioxidantes de células e tecidos alvos
(HAUSER et al., 1998; JIANG et al., 1999).
Poluição Atmosférica e Mutagenicidade
O material particulado, oriundo de poluentes atmosféricos, contém um grande
número de substâncias genotóxicas capazes de induzir efeitos deletérios no homem por via
inalatória (BRUNEKREEF et al., 2002). Centenas de componentes têm sido identificados
no material orgânico veiculado no ar atmosférico, o que dificulta a avaliação do efeito
individual mutagênico ou carcinogênico dos elementos no ser humano. Entre as partículas
dispersas no ar, as menores e aquelas que conseguem atingir os pulmões são geralmente as
mais mutagênicas (CERNÁ et al., 1999).
Dependendo do sítio de deposição dos poluentes inalados e da solubilidade dessas
partículas, as células do trato respiratório ficam diretamente expostas por tempo
significativo. Desta forma, os agentes mutagênicos, contidos nestas partículas permanecem
aderidos às células epiteliais, favorecendo sua ação genotóxica sobre as mesmas (ARBEX
et al., 2004). Quando inaladas, as maiores partículas mutagênicas podem ser literalmente
engolidas e, devido à sua propriedade de solubilidade, são posteriormente absorvidas pelo
intestino e alcançam a circulação sistêmica. Esse risco poderá ser iminente na dependência
da susceptibilidade do tecido alvo (TOKIWA e OHNISHI, 1986).
Vários ensaios biológicos com animais de laboratório têm sido realizados e muitos
desses estudos sugerem o potencial mutagênico e/ou carcinogênico do ar atmosférico
urbano (BUSCHINI et al., 2001; MEDEIROS JR et al., 2004; SEATON et al., 1995 e
16
SWENBERG e BEAUCHAMP, 1997). Agentes mutagênicos ou pró-mutagênicos podem
ser ativados ou desativados pelo metabolismo de animais expostos. A forma ativada pode
ligar-se ao DNA ou a outras macromoléculas em órgãos alvos, causando alterações
genéticas (ONG et al., 1985). Estudos prévios têm demonstrado que uma ampla extensão de
íons metais pesados, incluindo cromo, ferro, cobre e níquel, são sabidamente mutagênicos
(CHEN and THILLY, 1994; REID et al., 1994). A maioria destes íons não forma aductos
com o DNA, e seus efeitos mutagênicos são provavelmente similares àqueles ocasionados
pela presença de espécies reativas de oxigênio, ocasionando danos genômicos e
mitocondriais (BORM, 1997; HEBERT e LUIKER, 1996 e MENZIES et al., 2001). O
biomonitoramento de população humana exposta a altos níveis de poluentes urbanos revela
risco genotóxico, com aumento na incidência de danos cromossômicos (BOLOGNESI et
al., 1997; HEMMINKI et al., 1994). Entretanto, até o momento, são escassos os estudos
avaliando efeitos genotóxicos do material particulado da queima de cana-de-açúcar
(RQCA) e de ROFA, em especial, utilizando a técnica de micronúcleo (MN).
Teste do Micronúcleo (MN)
O teste do micronúcleo (MN) foi utilizado pela primeira vez em plantas por EVANS
et al. (1959) e, posteriormente, em medula óssea de ratos, sendo idealizado como um
método citogenético quantitativo para avaliar a freqüência de danos cromossômicos “in
vivo” em células nucleadas (HEDDLE, 1973; SCHMIDT et al., 1975; VANPARYS et al.,
1992). Este teste permite a correlação entre a formação de MN, na medula óssea ou em
eritrócitos periféricos, e os danos genéticos nas células expostas ao agente genotóxico
(RODGERS e BAKER, 2000).
17
O micronúcleo é literalmente um núcleo pequeno, considerado um produto de
quebra do DNA genômico de células eucarióticas. Durante a divisão celular, o material
genético é duplicado e igualmente distribuído entre as duas células filhas. As radiações e as
substâncias químicas podem ocasionar quebras ou dano cromossômicos, afetando a
distribuição do material genético entre as células filhas. Partes ou fragmentos de
cromossomos resultantes desse dano podem ser distribuídos a qualquer uma das células
filhas. Não sendo incorporados ao novo núcleo, estes podem se apresentar sob a forma de
micronúcleo claramente observável à microscopia óptica comum.
Heddle et al. (1991) afirmaram que os micronúcleos são originados de fragmentos
acêntricos de cromossomos ou danos cromossômicos os quais são ocasionados por: a)
perda mitótica de fragmento acêntrico; b) ação mecânica ocasionando quebra
cromossômica; c) danos cromossômicos ocasionados por falha no filamento mitótico
durante a anáfase ou d) apoptose.
Davies et al. (1998) postularam que no momento da identificação da freqüência de
micronúcleos de células nucleadas, alguns critérios devem ser seguidos: a) ser
morfologicamente idênticos, porém menor do que o núcleo da célula e com refração
similar; b) ter diâmetro entre 1/3 a 1/6 do tamanho do núcleo; c) ter a forma ovalada ou
arredondada. A freqüência de MN depende do tipo de células avaliadas, por exemplo, em
células epiteliais da mucosa oral e vaginal de seres humanos, estima-se que possa ocorrer
de 0 a 1 MN por 2000 células analisadas (GÁTTAS et al.,1992; RAMIRES et al., 1999).
Em contrapartida, a quantidade espontânea de micronúcleos em células de medula óssea é
um evento raro, com freqüência de 1 a 3 MN/1000 células em homens, 0 a 6 MN/1000
células em mulheres (BOLOGNESI et al., 1997; FENECH, 1998; TOMETSKO et al.,
1995).
18
Devido a sua simplicidade, confiabilidade e sensibilidade, o teste tem sido adequado
para a avaliação de mutagenicidade de compostos químicos oriundos do meio ambiente, os
quais podem exercer atividade clastogênica (capacidade de indução de quebra
cromossômica), aneugênica (capacidade de alterar o fuso mitótico resultando na perda de
cromossomo), ou ambas (TOROUS, et al., 1998). Assim, o teste do MNs é recomendado
pelo OECD (Organization for Economic CO-Operation & Economic Development) como
requerimento para testar a genotoxicidade de novos produtos químicos (VANPARYS, et
al., 1992).A presença de MN em células vegetais, medula óssea ou em eritrócitos
periféricos é indicativo de danos genéticos nas células expostas a poluentes (BATALHA et
al., 1999; RODGES e BAKER, 2000).
De acordo com MAVOURNIN et al. (1990), o período mínimo de aparecimento de
MN é de 6 h, tempo em que deve transcorrer a absorção do agente mutagênico no
camundongo, sua metabolização no estágio final do ciclo celular, a eliminação do núcleo
do eritroblasto e o aparecimento dos micronúcleos nos eritrócitos da medula óssea,
incluindo o atraso que pode ocorrer no ciclo de divisão. Cerca de 12-24 h depois do
tratamento com o agente mutagênico os eritrócitos presentes na medula óssea
correspondem aos descendentes das células que foram expostas antes da divisão celular
(HAYASHI et al., 2000).
Inúmeros estudos toxigenéticos baseiam-se em avaliar danos cromossômicos
em eritroblastos de camundongos e ratos, podendo ser facilmente visualizados em
eritrócitos policromáticos (células jovens). Contudo, Schlegel e Macgregor (1982)
posteriormente demonstram que o pico de incidência de micronúcleos em eritrócitos
normocromáticos em sangue periférico (eritrócitos maduros, anucleados) são similares aos
da medula óssea. Estes resultados trouxeram avanços para os estudos relacionados à
19
mutagenicidade, pois além de não haver necessidade do sacrifício dos animais de
laboratório, pode servir como técnica de biomonitoramento em seres humanos (HAYASHI
et al., 2000).
Teste do MN em Plantas
As plantas são reconhecidas como excelentes indicadoras de efeitos genotóxicos
induzidos por compostos químicos do meio ambiente, sendo aplicáveis na avaliação de
mutagênese ocasionada por fatores ambientais. Os testes são altamente confiáveis com alta
sensibilidade para o monitoramento da mutagenicidade de compostos químicos, incluindo o
material particulado de poluição atmosférica (SUMITA et al., 2003). Estudos prévios sobre
a atividade mutagênica de compostos químicos e agentes físicos utilizaram várias espécies
e clones do gênero Tradescantia. Essa planta é, em geral, eleita para estudos de
mutagenicidade por apresentar uma série de características genéticas favoráveis, como por
exemplo, apenas seis pares de cromossomos grandes e facilmente observáveis, bem como a
presença de células passíveis de observação em quase todas as partes da planta, da raiz ao
tubo polínico (MA e GRANT, 1982).
A Tradescantia, família Commelinaceae, geralmente chamada de erva-da-fortuna, é
uma planta herbácea que se encontra amplamente distribuída em todo o mundo, crescendo
em campos de regiões subtropicais ou em estufas. É uma planta pequena (algumas espécies
têm menos que 50 cm de altura), sendo um modelo favorável para estudos citogenéticos,
pois tem a capacidade de sustentar seu estado reprodutivo e aumentar o brotamento e as
flores para suplementar a falta de luz durante os dias curtos de inverno (MA, 1981). No
estado de São Paulo, a Tradescantia pallida (Rosa) cv. purpurea é largamente distribuída
20
em jardins de ornamentação, margens de estrada e ruas, devido a sua natural resistência e
fácil propagação (BATALHA et al.; 1999). Esta mesma planta também pode ser encontrada
em jardins de parques públicos e ruas de Araraquara. Pelo menos quatro características são
selecionadas como indicadores em bioensaios de avaliação de toxicidade genética. Dois
desses ensaios, o da mitose em ponta de raiz e o do tubo polínico, permitem avaliar as
frequências de aberrações cromossômicas (MA, 1982). Um terceiro ensaio, o da mutação
para célula cor-de-rosa do pelo estaminal (Trad-SHM) é um teste de mutação gênica em
células mitóticas, que se baseia na expressão fenotípica de um gene recessivo para a cor da
flor em plantas heterozigotas (UNDERBRINK et al., 1973). O quarto ensaio é um teste
citogenético que se baseia na formação de micronúcleos (Trad-MCN) que resultam da
quebra cromossômica nas células meióticas geradoras do pólen (MA, 1979).
Alguns sistemas indicadores têm definido o teste de MN em plantas como teste de
mutagênese de tipo II (ENNEVER et al.; 1998), ou seja, que apresentam alta sensibilidade
e baixa especificidade. Os bioensaios que empregam sistemas vegetais são consideradas
testes do tipo II, com especial freqüência para ensaios do micronúcleo e de pêlo estaminal
em Tradescantia, bem como o ensaio do grão de pólen ceroso em milho (ENNEVER et al.;
1998). A abundante informação básica sobre a genética e o desenvolvimento de
Tradescantia oferece uma sólida estrutura de suporte para o seu uso como bioindicador
para ensaios de toxicidade genética ambiental (MA e GRANT, 1982). Micronúcleos nas
células-mãe dos grãos de pólen são facilmente observáveis, permitindo um baixo grau de
incerteza nas avaliações. Adicionalmente, os ensaios com Tradescantia têm se mostrado
valiosos nos estudos de agentes químicos e físicos e outros agentes genotóxicos, como por
exemplo, as radiações, sendo importantes na avaliação de riscos da exposição (SHIMA e
ICHIKAWA, 1995).
21
Estudos prévios demonstram que o bioensaio Trad-MCN pode ser uma ferramenta
útil na avaliação de danos genômicos de células expostas a poluentes atmosféricos (ALVES
et al, 2003). O número de MN em plantas é diretamente proporcional a altas concentrações
de poluentes urbanos, demonstrando que o teste Trad-MCN pode avaliar o potencial
mutagênico de poluentes atmosféricos (GUIMARÃES et al, 2000). Entretanto, até o
presente não existem estudos utilizando a análise de MN em Tradescantia pallida e
material particulado oriundo de queima de cana-de-açúcar e ROFA.
Citoxicidade e Apoptose
A avaliação dos elementos traços da fuligem de queima de-cana-de-açúcar indicam
considerável quantidade de metais pesados e de transição (PERON et al, submetido em
Junho de 2005). Estudos prévios demonstram que os metais induzem mutagenicidade e
poderiam contribuir para a carcinogênese (SUMITA et al., 2003, MORISHITA et al.,
2004). A exposição celular aumentada a certos metais (Cr, Cu) pode induzir dano ao DNA,
enquanto a exposição à Zn e Cd pode inibir a apoptose, sugerindo um aumento na
sobrevida de células geneticamente mutadas e alto risco de câncer nas populações expostas
(CHUKLOVIN et al., 2001). Ainda, a presença de diversos compostos, incluindo metais e
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos presentes na poluição atmosférica, induz
toxicidade nas células expostas, resultando em aumento de apoptose dependente das
concentrações utiizadas (ZAMPERLINI, et a.,, 2000; HETLAND et al, 2004).
O evento de morte celular pode ocorrer por necrose e apoptose, que podem ser
diferenciado pela morfologia e vias bioquímicas celulares (COTRAN, et al., 2000). A
necrose é uma forma metabolicamente passiva de morte e ocorre quando a célula não pode
22
manter a homeostase. Há em seguida, a liberação de componentes intracelulares e resposta
inflamatória, as quais promovem o intumescimento celular, digestão aleatória do DNA,
cariólise, perda da integridade da membrana, e por fim lise celular (SARASTE 2000,
PULKKI 2000; MELLO et al., 2001). Em contrapartida, a apoptose é uma forma
energeticamente ativa de morte celular, caracterizada por alterações no citoesqueleto, com
contração celular, sem perda de integridade da membrana e sem resposta inflamatória
(LAVIN, 1993).
A apoptose é ativada por vias normais ou por vários estímulos (COTRAN et al.,
2000) e sua ativação por compostos químicos pode ocorrer por via extrínseca e intrínseca.
Os sinais pró-apoptóticos convergem para uma única via central, por meio da ativação de
caspases sinalizadoras que, por ação proteolítica, atuam sobre caspases efetoras, clivando
proteínas celulares vitais e levando a morte celular (AUBERT 2001; BLAHO 2001). A via
intrínseca é a mais comum de apoptose, sendo ativada pela própria célula como uma
resposta ao estresse gerado pelo dano, envolvendo a liberação do citocromo c, que é um
cofator essencial para ativação das caspases e é regulada pela família das proteínas Bcl-2
que ativa a cascata de caspases (SÁNCHES-ALONSO et al, 2004). Bcl-2 é uma proteína de
26 KDa, produto de um proto-oncogene localizado no cromossomo 18, que faz parte da
família de proteínas bcl-2, a qual possui cerca de vinte membros identificados até o
momento, sendo que cada uma delas apresenta duas ou mais isoformas. Todas essas
proteínas estão associadas à face interna da membrana plasmática, retículo endoplasmático
e mitocôndrias
(HOCKENBERY et al., 1990). O mecanismo de apoptose é regulado pela
expressão de proteínas com função antagônica, denominadas pró-apoptóticas e anti-
apoptóticas. As proteínas bax, bak, bcl-Xs, bad, bid têm função pró-apoptótica, enquanto as
23
proteínas bcl-2, bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, PARP-1 (poli-ADP-ribose polymerase) têm função
anti-apoptótica (KORSMEYER, 1999).
Até o presente, nenhum estudo foi realizado anteriormente para avaliar apoptose e
necrose, bem como, a expressão quantitativa de apoptose da via intrínseca, em linhagem
celular de pneumócitos humana (A549), expostas aos extratos aquoso e orgânico (DCM :
MeOH) extraídos da queima de cana-de-açúcar.
24
JUSTIFICATIVA
25
A cana-de-açúcar era predominantemente produzida no Nordeste, havendo no Brasil
duas colheitas anuais: uma no Norte-Nordeste e outra no centro-Sul. Na década de 70, com
a crise do petróleo, o Brasil, iniciou o Programa Proálcool (desenvolvimento do álcool,
extraído da cana-de-açúcar como combustível alternativo). Tal programa que recebeu
grande incentivo, com a produção de 4 milhões de carros movidos a álcool, tendo o
declínio nos anos 1990 e com maior incentivo no governo . A necessidade de ampliar a
produção de cana-de-açúcar para atender o programa Proálcool, iniciou o deslocamento
paulatino da produção na direção Centro-Sul. A cultura de cana expandindo-se por todos os
estados brasileiros, principalmente em São Paulo, Pernambuco e Alagoas. No estado de São
Paulo, para atender a demanda de produção de álcool, houve o aumento de produção de
cana-de-açúcar seguida de expansão e modernização das usinas, aumento da área plantada,
agilização da colheita e o transporte do produto.
Ocorre em todo Centro-Sul do Brasil, a prática conhecida como queima da cana, no
período de safra (maio a outubro) no qual o ar atmosférico recebe material particulado que
se deposita sobre os carros e casas. Embora haja legalmente a proibição da queima de cana
em distâncias inferiores a um quilômetro do perímetro urbano, esta ainda é uma realidade
em Araraquara. A questão é: distâncias superiores ou limítrofes garantiriam a ausência ou
menor disseminação dos poluentes pelo vento aos centros urbanos? E se disseminados, tais
poluentes ocasionariam realmente distúrbios de saúde nos indivíduos expostos? Acredita-se
que os produtos de combustão do álcool sejam comprovadamente menos tóxicos que os
emitidos pela combustão da gasolina. Porém, deve-se ponderar que o uso do álcool como
combustível menos poluente pode representar uma melhor condição atmosférica nos
grandes centros urbanos e um decréscimo da higidez dos locais de colheita de cana-de-
açúcar. Isto poderia significar cerca de 1 milhão de trabalhadores incapacitados no Brasil
26
com o processo de queima da cana. Além disso, estes poluentes são transportados, por
deslocamento das massas de ar, a locais distantes da produção, influenciando assim regiões
remotas.
Ainda são escassos os trabalhos que avaliam o efeito da queima de cana, entretanto
existem evidências de seus efeitos nocivos, demonstrados por estudos que encontraram
relação direta entre o número de intercorrências respiratórias e aumento da terapia
inalatória durante o período de safra. A emissão de gases tóxicos durante a queima e sob a
ação dos raios ultravioleta, resulta na liberação de grandes quantidades de ozônio, cuja
toxicidade potencializa os efeitos perniciosos desse poluente. Ainda, a presença de
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos e uma variedade de compostos químicos na
biomassa de queima de cana-de-açúcar aponta para a possibilidade de mutagênese e/ou
carcinogênese nos indivíduos expostos.
A ação mutagênica do material particulado de queima de cana-de-açucar alerta para
seu potencial efeito carcinogênico, considerando que os danos de DNA e a instabilidade
genômica são capazes de induzir transformação maligna. A caracterização de ação
mutagênica da biomassa de queima retoma a preocupação com medidas de
biomonitoramento e políticas para regular os níveis de emissão, ou alternativas para evitá-
la. Dessa forma, o presente estudo poderá contribuir com informações importantes sobre a
mutagenicidade dos poluentes oriundos da queima de cana. Uma vez que a associação entre
queima de cana e mutagenicidade em modelos experimentais se torne consistente, faz-se
necessário caracterizar a variabilidade de efeitos entre os indivíduos de um mesmo nicho,
buscando-se marcadores de susceptibilidade. Com isso, abordagens preventivas e
terapêuticas serão dirigidas de acordo com a particularidade individual dos indivíduos
expostos.
27
OBJETIVOS
28
OBJETIVO GERAL
Verificar a mutagenicidade de material particulado oriundo da queima de cana-de-
açúcar (RQCA), utilizando a metodologia de micronúcleo em células animais e vegetais.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Comparar o potencial mutagênico da fuligem depositada e o material particulado de
incinerador e caldeira (ROFAS), utilizando o ensaio de micronúcleo em células de
sangue periférico e de medula óssea de camundongos Balb-c, bem como, células mãe
de grão de pólen de T.pallida.
2) Verificar a freqüência de micronúcleos induzida por fuligem depositada e o material
particulado de incinerador e caldeira (ROFAS), em função da concentração e do tempo
de exposição a esses poluentes.
3) Avaliar a viabilidade celular e citotoxicidade do extrato de particulado total, contendo
os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, nos períodos de entressafra e colheita de
cana-de-açúcar, em função da concentração e do tempo de exposição.
4) Avaliar a expressão quantitativa das proteínas pró-apoptóticas (Bak) e anti-apoptótica
(Bcl-2) e de checkpoint p53 fosforilado, na célula A549 exposta ao extrato do
particulado total, contendo os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, em função da
concentração e do tempo de exposição.
29
MATERIAIS E MÉTODOS
30
Coleta da Fuligem Depositada e ROFA (Residual Oil Fly Ash)
O material particulado depositado da queima de cana-de-açúcar (RQCA) foi
coletado em recipientes de plástico cilíndrico com 16 cm de diâmetro que foram instalados
a 50 m do solo em um edifício localizado no centro da cidade de Araraquara. Os recipientes
ficaram expostos durante todo o período de junho a novembro de 2003 sendo a fuligem
recolhida a cada 24 horas. Estes recipientes continham aproximadamente 2 cm de água para
evitar que a fuligem depositada fosse ressuspendida. Para o presente estudo foram também
utilizados material particulado obtido, respectivamente, do precipitador eletrostático de
uma usina siderúrgica, aqui denominada ROFA/PE e do incinerador do Hospital da
Universidade de São Paulo (USP) movido a óleo combustível, denominado ROFA/HU.
Coleta do Material Particulado Atmosférico Total – através de filtro (PTS)
Para a coleta do material particulado do ar atmosférico através do filtro de fibra de
vidro (Energética) com 5 cm de diâmetro, o equipamento portátil HANDI_VOL foi
instalado em ponto estratégico no centro da cidade de Araraquara na sacada de um edifício
a 50m do solo (Figura 1) longe de outros edifícios e com altura superior a das árvores
(Figura 2) e aproximadamente 8 a 10 quilômetros dos canaviais (Figura 3), durante o
período de janeiro a novembro de 2005 sendo recolhido 1 filtro a cada 24 horas.
31
Local da
coleta
Figura 1 – Imagem obtida por satélite do centro da cidade de Araraquara, a seta aponta o
edifício onde o aparelho para coleta do material particulado ficou instalado.
Figura 2 – Aparelho portátil HANDI-VOL instalado na sacada do edifício localizado no
centro da cidade.
32
Figura 3 - Imagem obtida por satélite de Araraquara e os canaviais que circundam a cidade,
a seta aponta o local onde os filtros foram coletados.
Os filtros foram pesados antes e depois da amostragem para a determinação da
massa do particulado que foi aspirada. O volume de ar amostrado, corrigido pelas
condições padrão (25ºC, 760 mmHg), foi determinado a partir da vazão medida e do tempo
de amostragem. A concentração do material particulado em suspensão no ar ambiente foi
obtida, dividindo-se a massa de partículas coletadas pelo volume de ar amostrado expressa
em microgramas por metro cúbico (µg/m
3
). O equipamento HANDI-VOL é capaz de medir
a concentração de partículas na faixa de 2 a 750 µg/m
3
.
33
Os filtros foram processados de duas formas diferentes, com intuito de verificar o
potencial mutagênico deste material extraído em solução salina e diclorometano (DCM):
metanol (MeOH) (4:1).
Para extração em solução salina ¼ de cada filtro foi cortado em pedaços pequenos e
colocados em um Erlenmeyer com 50ml de solução salina 0,85% de NaCl. Em seguida o
Erlenmeyer foi colocado em banho de ultrassom (Unique, modelo T50220) por 30 minutos.
Os pedaços de filtro foram removidos e a suspensão obtida foi diluída para as exposições.
Para extração em diclorometano (DCM): metanol (MeOH) (4:1) os ¾ restante dos
filtros utilizados para extração em solução salina foram também cortados em pedaços
pequenos e colocados em um Erlenmeyer com 50ml DCM : MeOH 4:1 (RÉ-POPPI;
SANTIAGO-SILVA,2002). O Erlenmeyer foi colocado no banho de ultrassom por 30
minutos e posteriormente foi realizada a filtração em filtro de seringa 0,45 µm (Corning). O
filtrado foi concentrado em rotaevaporador à 40ºC até volume aproximado de 5 ml, sendo
posteriormente evaporado até secura sob fluxo leve de nitrogênio. O resíduo obtido foi
ressuspendido em dimetilssufóxido (DMSO) e diluído para a exposição.
Caracterização das partículas da biomassa (depositado) de cana-de-açúcar e ROFA
A composição das partículas coletadas foi determinada por análise de ativação de
nêutrons. Esta técnica foi realizada no IPEN (Instituto de Pesquisa Energética e Nuclear -
USP de São Paulo) e consiste basicamente em preparar as soluções diluídas simples ou
multi-elementares, utilizando as soluções padrão certificadas de Spex Certiprep. As
alíquotas destas soluções padrão foram pipetadas sobre tiras de papel de filtro Whatman
n.°40. Após a secagem à temperatura ambiente, em um dessecador, estas tiras de papel
34
foram colocadas em invólucros de polietileno. As massas dos elementos nestes padrões
variaram de 0,6 a 1000 microgramas.
O procedimento de análise por ativação consistiu em irradiar cerca de 100 mg da
amostra pesados em invólucro de polietileno, juntamente com os padrões sintéticos no
reator IEA-R1 do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN) por 8 horas e sob
fluxo de nêutrons térmicos de 4 x10
12
n cm
-2
s
-1
. As medições das atividades gama foram
realizadas após 4 dias de decaimento, usando um detector de Ge hiperpuro Modelo
GX2020 acoplado a um processador integrado de sinais, Modelo 1510, ambos da Canberra.
A resolução do sistema utilizado foi de 0,99 keV para o pico de 121,97 keV do
57
Co e de
1,89 keV para o pico de 1332,97 keV do
60
Co. Os espectros gama obtidos foram
processados, utilizando o programa de computação VISPECT2, o qual foi desenvolvido no
próprio laboratório. Os radioisótopos formados foram identificados pela meia vida e
energia dos raios gama e as concentrações dos elementos foram calculadas pelo método
comparativo (De SOETE et al., 1972). Os resultados foram calculados na base seca do
material. A percentagem de perda de peso obtida na secagem da RQCA e ROFA por cerca
de 15 horas a 85
o
C foi de 4,5%.
Análise cromatográfica dos extratos orgânicos
• HPLC/Fluorescência
Foi utilizado o equipamento HPLC Pro Star com injetor automático (Model 400) e
detector de fluorescência (Model 360)da Varian (Walnut Ceek, USA). As curvas de
calibração foram construídas após a injeção da mistura dos 13 HPAs estudados. Os limites
de detecção (LD) e quantificação (LQ) do sistema analítico utilizado podem ser vistos na
35
Tabela 1. Estes limites foram calculados segundo o preconizado pela IUPAC (CURRIE,
1999). As curvas analíticas para todos os HPAs apresentaram R
2
> 0,99 e CV do fator de
resposta menor que 10%.
Tabela 1: Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) para o sistema HPLC/Flu
(Andrade,2000)
HPA
LD (pg) LQ (pg)
Fenantreno 16,2 54
Antraceno 0,94 3,1
Fluoranteno 58,7 196
Pireno 4,41 14,7
Benzo[a]antraceno 5,67 18,9
Criseno 33,3 111
Benzo[e]pireno 3,43 11,4
Benzo[e]acefenantrileno 3,63 12,1
Benzo[k]fluoranteno 0,56 1,87
Benzo[a]pireno 10,2 34
Dibenzo[a,h]antraceno 120 400
Benzo[g,h,i]perileno 107 357
Indeno[1,2,3-cd]pireno 33,2 111
Foram obtidas as equações das retas, nas quais se interpolou as áreas dos picos obtidos
nos cromatogramas dos extratos do material particulado ressuspensos em volume adequado
de solvente. As condições cromatográficas utilizadas para determinação analítica dos HPAs
foram as seguintes (ANDRADE, 2000):
36
Coluna: Supelcosil LC-PAH (C18) (25 cm X 4,6 mm, 5 µm) da Supelco (Milwaukee,
USA).
Eluente: Acetonitrila (ACN) e água
Gradiente: 40%
5
40%
ACN
25
15
100%
ACN
90%
ACN
2
ACN
100%ACN
Vazão: 1,5 mL .min
-1
Volume de injeção: 30 µL
λ
ex
240 nm (Todos os HPAs, exceto o indeno [1,2,3- cd]pireno que utiliza λ
ex
300nm)
λ
em
398 nm (Todos os HPAs, exceto o indeno [1,2,3- cd]pireno que utiliza λ
em
466nm)
• GC/MS
Para a confirmação da presença de HPAs nos extratos foi utilizado o equipamento GC
(3800) com injetor automático (8200 cx) acoplado a um espectrômetro de massas (Satum
2000) da Varian, considerando que a sensibilidade do GC/MS é muito menor que a
sensibilidade do HPLC/Fluorescência para quantificação dos HPAs (ESCRIVÁ et al.,
1994). O resíduo foi ressuspendido em volume adequado de acetonitrila (ACN) e o extrato
foi injetado nas seguintes condições (ZAMPERLINI et al., 1997):
Coluna: CP Sil 8 CB (30 m X 0,25 mm, 25 µm) (5% difenil e 95% dimetil polisiloxano)
(Chrompack-Varian)
Gás de arraste: Hélio
Vazão: 1,0 mL. min
-1
Rampa de aquecimento do forno: 90 ºC (1min) 120 ºC 310 ºC (20 min)
10 4
37
Temperatura do trap: 210 ºC
Volume de injeção: 1µL
Animais
No presente estudo foram utilizados 120 camundongos machos do biotério da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - USP, tratados com ração
(NUVITAL) e água estéril, mantidos em gaiolas com maravalha também estéril. Esses
animais foram separados em doze grupos: dois grupos controle negativo, dois grupos
controle positivo e oito grupos teste. No grupo controle negativo foi injetado 0,2mL de
salina estéril por via intraperitoneal e nos grupos controle positivo foi injetado 0,2 mL de
ciclofosfamida em concentração de 25mg/Kg (CSGMT, 1995; MACGREGOR et al.,
1983). Nos grupos testes foram injetados 0,2ml de material particulado RQCA de 0,3
mg/ml e 0,03 mg/ml de salina e material particulado de ROFA/HU e ROFA/PE na
concentração de 3,0 mg/ml de salina, todos materiais depositados.
Cada grupo de animais (n= 12) recebeu as soluções por via intraperitonial, sendo a
metade deles sacrificados em 24 h após a injeção e a outra metade após 48 h, segundo
protocolo modificado de MAVOURNIN et al., (1990).
Coleta e processamento do material biológico
• Teste de MN em Eritrócitos do Sangue Periférico
Sangue periférico (10 µl) de cada camundongo foi coletado de por punção caudal e
em seguida foram confeccionados os esfregaços de cada animal. Esses esfregaços foram
fixados em metanol absoluto (Merck) por 10 minutos e hidrolisados em ácido clorídrico
(HCl- Merck) 1N por mais 10 minutos. Após esse procedimento, os mesmos foram corados
38
pelas técnicas de Feulgen e Fast Green (Merck) e os micronúcleos foram avaliados por
microscopia óptica comum.
As lâminas foram codificadas e avaliadas em teste cego com objetiva de imersão. A
freqüência de micronúcleos foi obtida através da quantificação de 3.000 eritrócitos por
lâmina, em cada animal, nos seis grupos avaliados.
• Teste de MN em Eritrócitos de Medula Óssea
Os animais dos seis grupos foram sacrificados após 24 e 48 horas pós-tratamento e
tiveram o fêmur retirado, a epífise proximal cortada e a medula óssea removida segundo
protocolo modificado por ZAMBRANO et al., (1982). A medula óssea foi lavada com soro
fetal bovino, centrifugada a 1000 rpm, por 5 minutos, o sobrenadante descartado e o
sedimento ressuspendido. Uma gota do sedimento foi transferida para uma lâmina, o
esfregaço confeccionado por distensão e, corado pelo método de Giemsa. Os esfregaços
foram observados em microscópio óptico comum e o número de micronúcleos foi
estabelecido em 1.000 eritrócitos por lâmina, em cada animal, nos seis grupos avaliados.
Coleta e exposição da Tradescantia pallida
As plantas foram coletadas dos jardins da Faculdade de Medicina da Universidade
São Paulo – USP e os talos contendo as inflorescências jovens foram coletados 24 horas
antes do início do tratamento. Nesse período, os talos permaneceram em Beckers, contendo
água deionizada sob constante aeração com ar filtrado para um período de adaptação. Todas
as plantas que murcharam foram eliminadas nesse momento, e somente os talos túrgidos e
com inflorescências em expansão foram tratados. As exposições foram realizadas, com o
39
material particulado diluído em solução nutriente de Hoagland triplamente diluída (DOWS
e HELLMERS, 1975). Como controle negativo foram utilizados talos mantidos em solução
salina e talos tratados com formol 10.000 ppm foram utilizados como controle positivo.
Para os grupos teste, as concentrações foram similares àquelas utilizadas em eritrócitos de
camundongos. O tempo de exposição foi de 8 horas, segundo o protocolo proposto por MA
(1988). Após o tratamento, as inflorescências foram removidas dos talos, fixadas em
solução de ácido acético/etanol por 24 horas e então preservadas em etanol 70%. Num
primeiro momento foram testados os materiais depositados, coletados pelo depósito da
fuligem em baldes. Na continuidade do estudo novos testes foram realizados, agora
expondo os talos ao material extraído do filtro com DCM:MeOH e com salina.
• Teste de MN em Inflorescência de Tradescantia pallida
Para contagem de micronúcleos, os botões jovens abertos foram removidos das
inflorescências, e as anteras maceradas com solução corante aceto-carmim. Somente
lâminas contendo tétrades intactas, com um máximo de 20% de células rompidas, foram
avaliadas. A contagem foi realizada em aumento de 400X, e a freqüência de micronúcleos
foi obtida após a quantificação de um grupo aleatório de 300 tétrades/ planta nos diferentes
tratamentos, e posterior análise estatística (MA, 1979; MA, 1981).
Cultura de células
Para os ensaios biológicos foi utilizada a linhagem de célula epitelial respiratórias-
pneumócitos tipo I (A549), obtidas do Banco de Células do Rio de Janeiro. As células
foram cultivadas em meio Ham´s F12, acrescido de 100 µL de penicilina e estreptomicina,
40
bicarbonato de sódio e 10% de soro fetal bovino (Cultilab). As células foram cultivadas em
garrafas e mantidas a 5% de CO
2
e a temperatura de 37 ºC até a formação de monocamada
celular, depois as células foram submetidas à tripsinização. Para isso foram lavadas com
1ml de solução ATV de tripsina (diluição 1:250, Instituto Adolfo-Lutz de São Paulo), que
foi descartada e as linhagens submetidas à nova tripsinização com 1 mL de ATV até que
houvesse o desprendimento do fundo das garrafas. As células foram homogeneizadas com
4 a 5 mL de meio acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB) para a neutralização da
tripsina. O volume da suspensão celular obtido em uma garrafa foi transferido para outras
duas garrafas, de modo a obter quantidade celular adequada para os experimentos. As
células foram tratadas com os 3 mg e 0,3 mg/mL de RQCA filtrado. Como controle
positivo, todas as linhagens celulares foram tratadas com doxorubicina na concentração de
15 µg/mL. Como controle negativo, as linhagens não foram expostas aos poluentes
propostos no presente estudo. E como controle de veículo. As células foram tratadas com
meio acrescido de DMSO 3%.
• Viabilidade Celular
Os materiais particulados de RQCA filtrado foram submetidos a ensaios
preliminares para estabelecimento de curva dose resposta na indução de morte celular
avaliada pelo teste de viabilidade (GABLER, et al, 2002). O ensaio de viabilidade celular
foi realizado utilizando método de coloração supravital Azul de Trypan, após o tratamento
das linhagens celulares e dos controles nos tempos de 12, 24 e 48 horas de exposição. O
número de células mortas (coradas em azul) foi quantificado em Câmara de Neubauer e
expressa em porcentagem de morte celular.
41
2.5. Ensaio de MTT
A citotoxicidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT, que mede a habilidade
das células vivas de reduzirem 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium
bromide (MTT) a sais de formazana de cor violeta após o tratamento. As células foram
cultivadas em placas de 96-well plates, a 2.5 ×10
4
células/well e cultivado com Ham’s F12
contendo 10% de soro fetal bovino (SFP) até a aderência das células (24 h). As células
foram então tratadas com os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) isolados do
particulado total do período de safra e entressafra em diferentes concentrações (0,3 e 3,0
mg/mL) e tempos de tratamento (12, 24 e 48 h) em meio sem soro. O meio livre de soro foi
removido e as células foram lavadas uma vez com PBS. Em seguida, as células foram
incubadas com 10 µL de MTT por 3 h, a 37ºC, o meio foi removido e os cristais de
formazana foram solubilizados com dimetilssulfóxido (DMSO), 3%. O ensaio de MTT foi
realizado em triplicata e a absorbância medida a 540nm no leitor de placas Bio-Tek
Powerwave X (BioTek Instruments, Inc.,USA). Cada tratamento (0.3 e 3.0mg/mL) e tempo
de tratamento (12, 24 and 48 h) foram acompanhados de um controle positivo
(doxorrubicina 15 µg/ml), controle negativo (células não-tratadas) e controle de veículo
(DMSO 3%). A viabilidade celular, em cada tratamento, foi calculada a partir da fórmula
matemática abaixo:
Células mortas (%) = Absorbância do Controle Negativo – Absorbância do Testes
_________________________________________________ X 100
Absorbância do Controle Negativo
42
Citometria de Fluxo (Bak, Bcl-2 e p53 fosforilado)
A expressão quantitativa (Bak, Bcl-2 e p53 fosforilado) foi avaliada por citometria
de fluxo, estabelecida através da intensidade de fluorescência verde, utilizando o
equipamento FACScalibur (Becton Dickinson, USA). As células A549 (2.5 x
10
4
cell/1.0mL/well) foi cultivada em placas de 24 wells, em meio de cultura Ham’s F12
com 10% de SFB, por 24 h. As células foram tratadas com duas diferentes concentrações
de extrato orgânico contendo grande quantidade de HPAs (0,3 e 3,0mg/mL), isolados de
particulado total no período de safra e entressafra e nos tempos de 12, 24 e 48 h. Após o
tratamento, o meio de cultura foi substituído por um meio novo e as células foram
incubadas por mais 24 horas. Em seguida, as células foram tripsinizadas, transferidas para
microtubos estéreis e incubadas com saponina 0,5% em PBS, por 30 min, a temperatura
ambiente. Depois da incubação, as células foram lavadas por 3 vezes em PBS e
centrifugadas a 10 000 rpm, 4 °C (p53 fosforilado) ou a temperatura ambiente (Bak e Bcl-
2), por 15 min. As células foram incubadas com anticorpo monoclonal anti-Bcl-2 (diluído
para 1:200, DAKO, Glostrup, Denmark), anti-Bak (diluído para 1:200 DAKO), e p53
fosforilado (diluído para1:3000, Santa Cruz Biotecnology, CA, USA), a 4 ºC, overnight.
As células foram lavadas cuidadosamente por várias vezes com PBS e centrifugadas a 10
000 rpm, 4 °C (p53 fosforilado) ou a temperatura ambiente (Bak e Bcl-2), por 15 min. Em
seguida, as células foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com FITC
(diluído para 1:60, SIGMA), por 1 h, a temperatura ambiente. A seguir, as células foram
lavadas 3 vezes em PBS e fixadas em paraformaldeído 1% in PBS. Como controle positivo,
as células foram tratadas com 15µg/mL de doxorrubicina (Bak e Bcl-2) ou 10 µg/mL de
metotrexato (p53). Como controle negativo, as células não foram tratadas e como controle
43
de veículo, as células foram tratadas com DMSO 3%. Todos os controles foram realizados
para cada tratamento (0,3 e 3,0mg/mL) e tempo (12, 24 e 48 h).
Análise estatística
A avaliação estatística foi realizada através da análise da freqüência absoluta de MN
em eritrócitos de sangue periférico, medula óssea e células mãe do grão de pólen de
Tradescantia pallida. Foi utilizado o teste de Student-Newman-Keuls para análise pos-hoc,
em nível de significância de 5%, utilizando o programa estatístico SPSS v10.0. Os
resultados da frequência de MN em células de Tradescantia pallida tratadas com material
particulado total contendo grande quantidade de HPA , foram analisados utilizando-se o
software Instat Mac 2.01 (GraphPad, San Diego, CA, EUA). Para avaliação da proporção
da expressão imunocitoquímica para Bak, Bcl-2 e p53 foi utilizado o teste z entre os
grupos de células expostas e não expostas a RQCA utilizando o programa Sigmastat.
44
RESULTADOS
45
A composição de elementos traço contidos no material particulado de RQCA,
ROFA/HU e ROFA/PE depositado estão representados pelos valores médios e desvio
padrão e demonstrados na tabela 2. Comparando-se os elementos encontrados entre os
particulados, é possível observar que o particulado de RQCA possui alta quantidade de Ti,
Mn, Na, Zn, enquanto a ROFA/HU apresenta maior quantidade de La, Zn, Ce, Nd e a
ROFA/PE de Br, Rb, Zn e Cr. Ainda, os elementos Ti, Mn e V foram observados apenas no
particulado de RQCA e, por sua vez, Zn, Rb e La foram detectados em todos os
particulados analisados no presente estudo. Estudos anteriores foram realizados substâncias
contendo estes elementos para testar a o potencial carcinogênico ou a toxicidade em
diferentes modelos experimentais (HEBERT et al., 1996; ROTH, ZECHLINSKI e
MARTINO-ROTH, 2002). Material particulado, contendo alto teor metal, é
reconhecidamente agentes causadores de danos oxidativos do DNA, resultando na
mutagenicidade e/ou carcinogênese de células e organismos expostos (KIM et al, 2004).
Ainda, particulados oriundos de produtos de combustão contribuem para a dispersão de V,
S, e Se associados a alta mortalidade dos indivíduos expostos (GRAHAME e HIDY, 2004).
46
Tabela 2 - Concentrações de elementos traço obtidas pelo método de análise instrumental
por ativação com nêutrons.
Samples
Elements
SCBR (n=3)* ROFA/UH (n=1) ROFA/EP (n=1)
Detection Limit
Values
As, µg kg
-1
601 ± 27 9.3± 1.0 61.0 ± 1.0
5.2
Br, µg g
-1
6.6 ± 0.7 8.7 ± 0.6 1482 ± 19
0.020
Ca (%)
6.9 ± 0.3 0.59 ± 0.04 5.4 ± 0.2
0.077
Cl, (%)
0.34 ± 0.05
ND ND 0.005
Co, µg kg
-1
2039 ± 196 122.9 ± 3.1 9.96 ± 0.25
2.1
Cr, µg g
-1
8.1 ± 0.5 32.4 ± 0.4 107.7 ± 1.4
0.014
Cs, µg kg
-1
846 ± 24 0.58 ± 0.04 9.96 ± 0.25
0.28
Fe (%)
8.7 ± 0.6 3.28 ± 0.07 44.6 ± 0.1
0.0016
K (%)
5.6 ± 0.1
ND ND 0.04
La, µg g
-1
33 ± 1 972 ± 12 10.3 ± 0.1
0.04
Mg, (%)
2,2 ± 0.2
ND ND 0.12
Mn, µg g
-1
1728 ± 123
ND ND 0.7
Mo, µg g
-1
2.6 ± 0.4
ND ND 1.5
Na, µg g
-1
365 ± 46
NA NA 0.10
Rb, µg g
-1
57 ± 1 11.4 ± 1.1 719.7 ± 1.0
2.7
Sb, µg kg
-1
305 ± 112 39.8 ± 0.7 2.27 ± 0.09
1.0
Sc, µg kg
-1
2487 ± 192 1.111 ± 0.007 1.91 ± 0.01
0.33
Se, µg kg
-1
540 ± 65 20.5 ± 0.2 154.4 ± 0.8
15.7
Ti, µg g
-1
2144 ± 6
ND ND 50
V, µg g
-1
29 ± 3
ND ND 14
Zn, µg g
-1
101 ± 5 115.7 ± 1.5 491.9 ± 3.1
3.1
Hf, µg g
-1
NA
1.64 ± 0.03 0.62 ± 0.07
0.10
Th, µg g
-1
NA
3.07 ± 0.03 1.50 ± 0.06
0.09
U, µg g
-1
NA ND
2.28 ± 0.14
0.30
Ce, µg g
-1
NA
51.1 ± 0.4 16.3 ± 0.3
0.35
Nd, µg g
-1
NA
33.1 ±.2.9 9.3 ± 1.6
4.5
Sm, µg g
-1
NA
2.69 ± 0.08 2.30 ± 0.07
0.008
ND -Não detectado nas condições de análise.
NA – Não analisado.
(*) – As incertezas das análises foram calculadas considerando erros nas medidas das taxas de contagens da
amostra e corrosão.
47
Os resultados da freqüência de micronúcleos em sangue periférico de camundongos
entre os diferentes grupos e nos diferentes tempos de tratamento estão demonstrados na
tabela 3. Os micronúcleos são observados nos eritrócitos normocromáticos corados pelo
método de Feulgen - Fast Green (figura 4A). Efeito significativo (p< 0, 001) foi observado
entre os diferentes tempos de tratamento e o tempo de tratamento associado à interação
entre os grupos (p = 0,01). Para os três grupos a freqüência de micronúcleos foi maior após
48 horas de administração das partículas tóxicas. Embora os resíduos de queima indoor
estejam associados ao desenvolvimento do câncer de pulmão (SMITH e LIU, 1993) e
laringe (CLIFFORD, 1972), pouco se conhece sobre os efeitos desses particulados em
ambientes cujo nível de poluentes é resultante de queimas esporádicas. A maioria do
conhecimento sobre o risco carcinogênico e potencial mutagênico da poluição atmosférica
foram desenvolvidos a partir de estudos de emissão de combustíveis fósseis (BUSCHINI et
al., 2001; BURGAZ et al., 2002 e CARVALHO-OLIVEIRA et al, 2004).
Interessantemente, a maior freqüência de MN em sangue periférico foi de camundongos
tratados com RQCA de menor concentração (0,03 mg/ml). A partir desse resultado
poderíamos sugerir que em menor concentração as partículas de RQCA apresentariam
menor agregação, tornando a resposta imune celular do animal incapaz de retirar o
particulado, aumentando o impacto mutagênico desse poluente (ARBEX et al., 2004). De
fato, partículas ultrafinas são capazes de se organizar em pequenos grupamentos, resultando
na deposição do particulado nos pulmões de ratos expostos (KAPP et al., 2002).
48
Tabela 3: Média (± desvio padrão) da freqüência de MN em células de sangue periférico
Tempo de
Tratamento
Tratamentos
Frequência de MN ± DP
Células analisadas
Tempo 0 Controle Negativo
0.111 ± 0.010
9000
a
Controle Positivo
0.500 ± 0.024
10 000
RQCA 0.3
0.400 ± 0.163
10 000
RQCA 0.03
0.444 ± 0.176
9 000
a
ROFA PE
0.250 ± 0.250
8000
b
ROFA HU
0.222 ± 0.147
9000
a
24 hr Controle Negativo
0.222 ± 0.222
9000
a
Controle Positivo
1.400 ± 0.427
10 000
RQCA 0.3
1.625 ± 0.625
8000
b
RQCA 0.03
0.889 ± 0.351
9000
a
ROFA PE
1.000 ± 0.327
8000
b
ROFA HU
0.888 ± 0.260
9000
a
48 hr Controle Negativo
0.600 ± 0.221
10 000
Controle Positivo
1.700 ± 0.700
10 000
RQCA 0.3
1.400 ± 0.636
10 000
RQCA 0.03
3.500 ± 0.108
10 000
ROFA PE
1.556 ± 0. 280
9 000
a
ROFA HU
2.111 ± 0.735
9 000
a
.RQCA = Resíduo de queima de cana-de-açúcar; ROFA/HU = Resíduo do incinerador do Hospital das
Clínicas – SP; ROFA/PE = Resíduo do precipitador eletrostático. Tempo de exposição: p<0,001; Tempo de
exposição x Grupo: p=0.01.
a
um animal do grupo morreu
b
dois animais do grupo morreram
49
A freqüência de micronúcleos em células em eritrócitos policromáticos da medula
óssea dos camundongos está demonstrada na tabela 4. Na figura 4B é possível observar o
MN em eritrócito policromático de medula óssea corado pelo Giemsa. Não foi observado
efeito dose-resposta (p > 0,05) e, esse comportamento, não é muito fácil de caracterizar
visto que ambos os particulados, RQCA e ROFA possuem vários elementos químicos.
Dessa forma, fica difícil concluir quais desses vários elementos químicos poderiam ser
responsáveis pelos efeitos mutagênicos observados nesse estudo. Entretanto, a detecção de
resultados positivos nos outros ensaios utilizando partículas de RQCA depositadas, sujeitas
a procedimentos mínimos de extração, merece ser notificada, visto que esses poluentes
poderiam representar um risco de desenvolvimento de câncer nas populações
continuamente expostas.
50
Tabela 4: Média (± desvio padrão) da freqüência de MN (expressa em porcentagem) em
células de medula óssea tratada com material particulado depositado.
Tempo de
Tratamento
Tratamento PCEs/
NCEs (%)
Média (MN/PCEs) ±
DP
Células
analisadas
24 hr (*) Controle Negativo 0.49
0.222 ± 0.147
9000
a
Controle Positivo 0.39
1.200 ± 0.327 *
10 000
RQCA0.3 0.55
0.875 ± 0.441 *
8000
b
RQCA 0.03 0.52
1.222 ± 0.434 *
9000
a
ROFA PE 0.45
0.750 ± 0.250 *
8000
b
ROFA HU 0.47
0.875 ± 0.330 *
9000
a
48 hr (**) Controle Negativo 0.83
0.600 ± 0.221
10 000
Controle Positivo 0.39
1.500 ± 0.477 **
10 000
RQCA0.3 0.51
0.900 ± 0.433 **
10 000
RQCA 0.03 0.53
2.400 ± 0.686 **
10 000
ROFA PE 0.55
1.111 ± 0.261 **
9 000
a
ROFA HU 0.46
1.444 ± 0.530 **
9 000
a
RQCA = Resíduo de queima de cana-de-açúcar; ROFA/HU = Resíduo do incinerador do Hospital
das Clínicas – SP; ROFA/PE = Resíduo do precipitador eletrostático. Não houve diferença
significativa entre o tempo de exposição e entre os grupos em relação tempo. (*) e (**) p<0,0001,
salina versus RQCA (0.3 e 0.03), ROFA/HU E ROFA/PE.
a
um animal do grupo morreu ,
b
dois
animais do grupo morreram
A freqüência de micronúcleos observados em células mãe dos grãos de pólen de
Tradescantia pallida está demonstrada na tabela 5. Nas tétrades selecionadas e coradas com
aceto-carmim é possível observar vários micronúcleos (figura 4C) e em maior aumento na
figura 4D. Foi observada diferença significante de freqüência de MN entre os grupos (p <
51
0,001) e na análise pelo teste Student-Newman-Keul post hoc essa diferença foi
principalmente entre os grupos: salina e RQCA 3,0 mg/ml, RQCA 3,0 mg/ml e ROFA/HU
e, finalmente, RQCA 0,3 e ambos os tipos de ROFA. Esses resultados demonstram que os
particulados (RQCA e ROFA) possuem ação mutagênica também observado no ensaio de
MN em Tradescantia pallida (TradMCN). No Brasil, o monitoramento da mutagenicidade
de vários agentes pelo método TradMCN tem sido utilizado com sucesso (SUMITA et al.,
2003). Comparativamente, o bioensaio com Trad MCN poderia ser mais fácil de ser
realizado, visto que os modelos animais exigem grande quantidade, maior tempo de
tratamento, estratégia de manipulação e sacrifício dos camundongos e maior número de
MN/animal/esfregaço devem ser contados para a validação do teste (CSGMT, 1995)
Tabela 5: Freqüência de MN (± desvio padrão) observada em células mãe do grão de pólen
de Tradescantia pallida.
Tratamentos
Média ± DP
N
Controle Negativo
0.14 ± 0.06
13
Controle Positivo
4.70 ± 1.05*
10
RQCA 0.3
2.18 ± 0.35*
13
RQCA 0.03
5.53 ± 1.04*
15
ROFA PE
4.90 ± 1.07*
10
ROFA HU
3.43 ± 0.70*
11
RQCA = Resíduo de queima de cana-de-açúcar; ROFA/HU = Resíduo do incinerador do Hospital das
Clínicas – SP; ROFA/PE = Resíduo do precipitador eletrostático. (*) p < 0,001.
52
Figura 4 – Micronúcleos observados em células sanguíneas de camundongo e de células mãe de
grão de pólen de Tradescantia pallida. A) Micronúcleo (seta) em eritrócitos de sangue periférico de
camundongo tratado com material particulado de RQCA 0,3 mg/ml (Barra de escala 33µm); B)
Micronúcleo (seta) em células de medula óssea de camundongo tratado com material particulado de
RQCA 0,3 mg/ml (Barra de escala 100µm); C) Tétrades de inflorescência de Tradescantia pallida
tratada com material particulado de RQCA 0,3 mg/ml contendo 3 micronúcleos (setas) em 400X
(Barra de escala 4µm); D) Tétrades de inflorescência de Tradescantia pallida tratada com material
particulado de ROFA/HU 3,0 mg/ml, apresentando micronúcleo (seta) em 1000X (Barra de escala
0,1µm).
Através dos ensaios realizados, pode-se observar que a RQCA exibiu propriedades
mutagênicas na mesma ordem de magnitude que as ROFAs avaliadas no presente estudo. A
53
avaliação do potencial carcinogênico dos resíduos da queima de cana-de-açúcar é de
extrema importância para os países que possuem regularmente essa prática agrícola.
Entretanto a maioria do conhecimento sobre os efeitos nocivos da poluição
atmosférica foi obtida de estudos com combustíveis fósseis (Medeiros et al., 2004).
A partir desse resultado de que a RQCA é, ao menos, tão genotóxica quanto os
particulados derivados de combustíveis fósseis, para melhor avaliar o efeito mutagênico
desse poluente na população exposta, foram realizadas mais análises da amostra de
poluente de Araraquara, porém agora com o material filtrado do ar. A Figura 5 apresenta os
cromatogramas obtidos nas análises por HPLC/Flu dos extratos das amostras de material
particulado atmosférico nas épocas de queima e não queima de cana-de-açúcar. A
identidade dos analitos foi confirmada pela análise por GC/MS. Os analitos encontrados na
queima são característicos de processos de combustão tanto de material vegetal quanto de
combustível automotivo. Perfil semelhante para os HPAs presentes no material particulado
atmosférico foi encontrado em outros trabalhos desenvolvidos no IQ/UNESP (Zamperlini,
1997; Zamperlini, 2000; Godoi, 2004, Andrade, 2004). É possível avaliar a grande
influência da época da coleta no perfil de HPAs encontrado, uma vez que os HPAs que
ocorrem na amostra de não queima são característicos apenas de queima de combustíveis
automotivos “leves” como a gasolina (Andrade, 2004).
54
A
Figura 2: Cromatogramas obtidos nas análises por HPLC/Flu dos extratos das amostras de material
particulado atmosférico nas épocas de não queima (A) e de queima (B) de cana-de-açúcar.
Figura 5: Cromatogramas obtidos nas análises por HPLC/Flu dos extratos das amostras de
material particulado atmosférico nas épocas de entressafra (A) e de safra (B) de cana-de-
açúcar.
B
55
As concentrações de HPA encontradas no material particulado estão apresentadas
na Tabela 6. Nota-se que para os três HPAs encontrados nas duas épocas de coleta (pireno,
benzo(e)acenenantrileno e benzo(k)fluoranteno), as concentrações são no mínimo 10 vezes
superiores na época da safra quando comparado com a entressafra.
Tabela 6: Concentração média (µg g
-1
) de HPAs no material particulado atmosférico
Concentração (ng g
-1
)*
HPA
Entressafra Safra
Fenantreno ND 0,53
Antraceno ND 4,11
Fluoranteno ND 1,29
Pireno 0,10 1,34
Benzo[a]antraceno ND 0,52
Criseno ND NQ
Benzo[e]pireno ND 0,72
Benzo[e]acefenantrileno 0,079 0,74
Benzo[k]fluoranteno 0,28 3,30
Benzo[a]pireno NQ 3,24
Dibenzo[a,h]antraceno ND NQ
Benzo[g,h,i]perileno ND 0,27
Indeno[1,2,3-cd]pireno ND ND
* determinação feita em extrato obtido do material particulado contido em 5 filtros, coletados em dias
distintos
ND = não detectado, abaixo do limite de detecção (LD), veja tabela 1
NQ = não quantificado, abaixo do limite de quantificação (LQ), veja tabela 1
56
Os resultados da determinação das concentrações de elementos traço de PTS, feitas
através da espectrometria de fluorescência de raios-X são apresentados na tabela 7 e 8. No
período de safra, onde ocorre a emissão dos particulados de queima de cana-de-açúcar,
houve um aumento de todos os elementos traço, com exceção do Sr, no período de safra
(Tabela 7 e Tabela 8), demonstrado pelo diminuição de reflectância e análise de variância
diferente entre as amostras de safra e entressafra. Esse aumento indicaria, que durante o
período de safra pela emissão de particulados de queima de cana-de-açúcar, a atmosfera
apresenta modificação de sua composição. A presença desses elementos estão
possivelmente associado a bioaerossois, de componentes bioinorgânicos (S), solo(Al, Si,
Fé,Ca) componentes derivados dos fluídos de folhas de planta (Cu, Pb, Zn) (GODOI et al.,
2004 a ). No período de entressafra (Tabela 7), possivelmente associado ao maior teor de
emissão de poluentes provenientes da queima de combustiveis fósseis e outros, observa-se
um aumento Al, Si, K, Cu, Zn, Sr, Zr, Ba e Pb. Esses elementos foram diferentes dos
elementos traços observados nos particulados de veículos automotivos de São Paulo
(BATALHA, et al., 1999).
57
Tabela 7 – Análise descritiva dos resultados (média, desvio padrão e erro padrão das
médias) para determinação comparativa dos elementos traço por fluorescência de raio-X
em (%)
e porcentagem de elementos carbon black determinado por reflectância (%) em particulado
total ressuspendido (PTS).
N Média Desvio Padrão Erro Padrão
Entressafra 24 27.8792 3.91763 0.79968 Reflectância
Safra 24 11.3833 1.50323 0.30685
Entressafra 24 0.00200 0.001103 0.000225 Al
Safra 24 0.00113 0.000338 0.000069
Entressafra 24 0.00367 0.000482 0.000098 Si
Safra 24 0.00200 0.00000 0.00000
Entressafra 24 7.93163 2.933136 0.598724 S
Safra 24 13.27563 2.766955 0.564802
Entressafra 24 0.00367 0.000482 0.000098 K
Safra 24 0.00200 0.00000 0.00000
Entressafra 24 0.00625 0.004683 0.000956 Ca
Safra 24 0.18538 0.264475 0.053986
Entressafra 24 12.99217 2.502561 0.510833 Fe
Safra 24 46.55863 6.988752 1.426573
Entressafra 24 4.13604 1.573624 0.321215 Cu
Safra 24 3.09729 1.361492 0.277913
Entressafra 24 0.00367 0.000482 0.000098 Zn
Safra 24 0.00200 0.00000 0.00000
Entressafra 24 0.00950 0.013075 0.002669 Sr
Safra 24 0.00800 0.012998 0.002653
Entressafra 24 0.00367 0.000482 0.000098 Zr
Safra 24 0.00200 0.00000 0.00000
Entressafra 24 0.00367 0.000482 0.000098 Ba
Safra 24 0.00200 0.00000 0.00000
Entressafra 24 0.73008 0.382086 0.077993 Pb
Safra 24 0.36246 0.171378 0.034982
58
Tabela 8 – Análise estatística dos resultados da determinação comparativa dos elementos traço por
análise espectrométrica por flurescência de raio-X (ED-XRF) em (%) e porcentagem de elementos
carbon black determinado por reflectância (%) em particulado total resuspendido.(PTS)
abaixo acima
Variância assumida
como igual
14.667 0.000 19.259 46 0.000 16.9583 0.85653
14.771772 18.21994
Variância assumida
como diferente 19.259 29.629 0.000 16.9583 0.85653
14.74564 18.24602
Variância assumida
como igual
16.276 0.000 3.715 46 0.001 0.000875 0.000236
0.000401 0.001349
Variância assumida
como diferente 3.715 27.275 0.001 0.000875 0.000236
0.000392 0.001358
Variância assumida
como igual
184.000 0.000 16.956 46 0.000 0.001667 0.000098
0.001469 0.001865
Variância assumida
como diferente 16.956 23.000 0.000 0.001667 0.000098
0.001463 0.001870
Variância assumida
como igual
0.479 0.492 -6.493 46 0.000 -5.344000 0.823087
-7.000788 -3.687212
Variância assumida
como diferente -6.493 45.844 0.000 -5.344000 0.823087
-7.000940 -3.687060
Variância assumida
como igual
184.000 0.000 16.956 46 0.000 0.001667 0.000098
0.001469 0.001865
Variância assumida
como diferente 16.956 23.000 0.000 0.001667 0.000098
0.001468 0.001870
Variância assumida
como igual
13.627 0.001 -3.317 46 0.002 -0.179125 0.053994
-0.287809 -0.070441
Variância assumida
como diferente -3.317 23.014 0.003 -0.179125 0.053994
-0.290816 -0.067434
Variância assumida
como igual
22.709 0.000 -22.152 46 0.000 -33.566458 1.515.276
-36.6166 -30.5164
Variância assumida
como diferente -22.152 28.803 0.000 -33.566458 1.515.276
-36.6665 -30.4664
Variância assumida
como igual
0.072 0.790 2.446 46 0.018 1.038750 0.424753
0.183768 1.893732
Variância assumida
como diferente 2.446 45.068 0.018 1.038750 0.424753
0.183290 1.894210
Variância assumida
como igual
184.000 0.000 16.956 46 0.000 0.001667 0.000098
0.001469 0.001865
Variância assumida
como diferente 16.956 23.000 0.000 0.001667 0.000098
0.001463 0.001870
Variância assumida
como igual
0.002 0.963 0.399 46 0.692 0.001500 0.003763
-0.006075 0.009075
Variância assumida
como diferente
0.399 45.998 0.692
0.001500 0.003763
-0.006075 0.009075
Variância assumida
como igual
184.000 0.000 16.956 46
0.000 0.001667 0.000098
0.001469 0.001865
Variância assumida
como diferente
16.956 23.000
0.000 0.001667 0.000098
0.001463 0.001870
Variância assumida
como igual
184.000 0.000 16.956 46
0.000 0.001667 0.000098
0.001469 0.001865
Variância assumida
como diferente
16.956 23.000
0.000 0.001667 0.000098
0.001463 0.001870
Variância assumida
como igual
9.950 0.003 4.301 46
0.000
0.367625 0.085479 0.195564 0.539686
Variância assumida
como diferente
4.301 31.894
0.000
0.367625 0.085479 0.193487 0.541763
Pb
Zn
Sr
Zr
Ba
K
Ca
Fe
Cu
Reflectância
Al
Si
S
Teste de Levene para
igualdade de variância
Teste T para igualdade de médias
FSig.tdf
Sig. (2
caudas)
Diferença da
média
Diferença do erro
padrão
95% de diferença do intervalo
de confiança
59
Na figura 6 podemos observar uma maior freqüência de micronúcleos no período de
safra em relação ao período de entressafra em ambos os tratamentos.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
Tratamentos
Micronúcleo (%)
Controle positivo
Controle negativo
Controle veículo
DCM:MeOH 0,3 mg/ml
DCM:MeOH 3 mg/ml
Salina 0,3 mg/ml
Salina 3 mg/ml
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
Tratamentos
Micronúcleo (%)
Controle positivo
Controle negativo
Controle veículo
DCM:MeOH 0,3 mg/ml
DCM:MeOH 3 mg/ml
Salina 0,3 mg/ml
Salina 3 mg/ml
B
A
Figura 6 - Frequência de micronúcleo (%) em células mãe do grão de pollen de Tradescantia
pallida tratadas com hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (extrato orgânico contendo grande
quantidade de HPAs) nas concentrações de 0.3 e 3.0 mg/mL, bem como extratos solubilizados em
salina (0.3 and 3.0 mg/mL). A) Não Queima B) Queima. One Way ANOVA (p<0.0001) com pos-
teste de Tukey para múltiplas comparações entre queima e não queima; p< 0.001 - Controle
Negativo versus controle de veículo versus DCM:MeOH 0.3mg/mL versus Salina 0.3mg/mL versus
Salina 3.0mg/mL; p<0.05 – DCM:MeOH 3.0mg/mL queima e não queima.
60
Na figura 7 podemos verificar um aumento na porcentagem de morte celular em
relação ao tempo de exposição em ambos os tratamentos (extraídos em DCM:MeOH e em
salina), independente das concentrações. A morte celular é progressivamente maior durante
em relação ao tempo de tratamento, apresentando, entretanto, similar porcentagem de morte
celular em relação as diferentes concentrações.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
CV CP Q 3.0 Q 0.3 NQ 3.0 NQ 0.3
Morte Celular (%)
12 H
24 H
48 H
Figura 7 – Porcentagem de morte celular (colunas) e erro padrão (barras) depois do
tratamento in vitro com biomassa oriunda de queima de cana-de-açúcar; (CV) controle de
veículo, (CP), controle positivo, (Q) queima, (NQ) não queima.
61
Os sinais de apoptose de via intrínseca avaliados no presente estudo e representada
pela expressão de Bak e Bcl-2, bem como a avaliação da ativação de p53 (Figura 8B),
indica que quanto o menor o tempo de tratamento, a expressão de Bcl-2 foi maior, a
diminuição da expressão acontece com o maior tempo de tratamento. Quando se compara a
expressão de bcl-2 em 12 horas das células tratadas com diferentes concentrações de
extratos da biomassa de queima (Q 0,3 e Q 3,0) e não queima (NQ 0,3 e NQ 3,0) e o
controle positivo, observou-se que Q 0,3, Q 3,0 e NQ 3,0 (respectivamente, P=0,113;
P=0,060; P=0,696) tiveram expressão similar. Esses resultados possivelmente indicam que
esses particulados tem ao menos a mesma atividade do controle sabidamente indutor de
apoptose. Em contrapartida, em 24h e 48h, foi observado diferença de expressão de Bcl-2
entre o controle positivo e todas as concentrações de extrato do particulado de queima (P =
0,001) e não queima (P = 0,001). Aparentemente, esses resultados poderiam indicar que
em tempos maiores de tratamento, independente da concentração e do tratamento com os
diferentes extratos de particulado no período de queima e não queima, os sinais anti-
apoptóticos mediados por bcl-2 estariam diminuídos.
A expressão de Bak nas células tratadas com os extratos do particulados de queima
e não queima apresentam diferença, principalmente em relação ao tempo de tratamento
(Figura 8A). Essa expressão está aumentada em progressivamente nos tempos de 12, 24 e
48h para as células na queima 0,3 mg/ml que acontece progressivamente em relação ao
tempo, enquanto em queima 3,0 mg/ml observou-se um aumento expressivo em 24 horas
sugerindo que com o aumento da concentração o sinal de morte se evidencia mais
rapidamente. Entretanto, nos diferentes tempos de tratamento com queima 0,3 mg/mL , a
expressão de Bak é similar àquela encontrado no controle positivo somente em 48h
(P=1,000), o que indicaria sinal apoptótico ao menos semelhante a doxorrubicina (controle
62
postivo). Quando a cocnetração de queima foi 3,0 mg/ml, observou-se aumento de Bak
similar ao controle positivo em 12h (P =0,164) e menor expressão nos tempos de 24h e 48h
de tratamento (ambos, P=0,001). Dessa forma, o aumento da concentração de queima
aparentemente resulta no maior sinal apoptótico mediado por Bak. Quando a expressão de
Bak é avaliada com o tratamento de extrato de não queima nas diferentes concentrações e
tempo, é possível observar que essa expressão é similar ao controle positivo na
concentração de 3,0mg/mL e em 12h e 48h (respectivamente, P=0,555 e P = 0,911). Em
contrapartida, na concentração de não queima de 0,3 mg/mL, não foi encontrada uma
expressão similar ao controle positivo em todos os tempos de tratamento (P = 0,001). Dessa
forma, esses resultados poderiam indicar que somente a maior concentração de não queima
teria o mesmo comportamento de queima na mesma concentração somente no tempo de
12h (P = 0,505).
A avaliação da expressão de p53 fosforilado demonstrou que a ativação de p53
responsável por sinal nuclear de apoptose foi o diferente do controle positivo em todos os
tratamentos, independente da concentração, e no tempo de 12h (P=0,001). Em 24h,
somente não queima 0,3mg/mL é similar ao controle positivo (P=0,188) e em 48h, somente
queima 0,3mg/mL é similar ao controle positivo (P =0,362). Assim, os sinais de p53
ativado para apoptose foi observado em tempos superiores a 24h e nas concentrações
menores, possivelmente indicando que esse sinal é disparado em principalmente em função
do tempo de tratamento e que os componentes de combustão de fósseis induzem sinais de
apoptose p53 mediado da mesma forma que o particulado de queima.
63
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
CN
CP
CS
Q 0
,3
Q
3
,0
N
Q
0
,3
NQ 3,
0
Bcl-2 (%)
12 horas
24 horas
48 horas
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
C
N
C
P
C
S
Q
0
,3
Q
3
,0
NQ 0
,
3
NQ 3
,
0
Bak (%)
12 horas
24 horas
48 horas
h
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
CN
C
P
C
S
Q 0
,3
Q 3,
0
NQ
0
,3
NH
3
,
0
p53 fosforilado (%)
12 hooras 24 horas 48 horas
B
C
A
Figura 8 – Sinalização celular de apoptose em células A549 tratadas com hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos (HPAs) no período de queima (Q) e não queima (NQ), obtida pelo
método de citometria de fluxo. A), B) e C) expressão das proteínas Bak, Bcl-2 e p53
fosforilado. Controle Negativo (CN) = células sem tratamento; Controle Positivo (CP) =
células tratadas com doxirrubicina (15µg/mL) e Controle de Veículo (CS) = células tratadas
com DMSO 3%.
64
DISCUSSÃO
65
A queima de cana é uma pratica comumente empregada na agricultura de países em
desenvolvimento. Mesmo em seguimentos organizados da área rural, tal como a produção
de cana-de-açúcar no Brasil, a queima é usualmente utilizada, por facilitar a colheita
manual, visto que é inviável aos trabalhadores manipularem a cana sem a queima prévia. A
colheita manual é um processo que garante emprego a centena de brasileiros e a utilização
de colheita mecanizada é em parte evitada em função dos problemas sociais.
Por não alcançar altas temperaturas, durante a queima de cana ocorre a combustão
incompleta, a qual gera vários compostos orgânicos, incluindo os hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos e aldeídos (CHEN et al., 2003). Assim sendo, estudos sobre o
potencial mutagênico de particulados oriundos da queima de cana são necessários para
determinar o risco das populações expostas. Embora a queima de biomassa indoor tenha
sido associada com o desenvolvimento de câncer do pulmão (SMITH and LIU, 1993) e
câncer de laringe (CLIFFORD, 1972), pouco se conhece sobre os efeitos da queima
outdoor, provavelmente porque o nível ambiental desses poluentes depende da geração de
incêndios esporádicos, uma característica que interfere nos estudos em larga-escala por
longos períodos. Ainda, a maioria do conhecimento sobre o risco do câncer e o potencial
mutagênico de poluentes particulados ambientais é resultante de estudos de emissões de
combustíveis fósseis (BUSCHINI et al., 2001; BURGAZ et al., 2002).
Entretanto, considerando que a prática de queima regular de biomassa é comum em
países que se cultiva a cana-de-açúcar, é importante avaliar o potencial do particulado de
queima depositado para induzir danos no DNA. O presente estudo comparou a
mutagenicidade do particulado de queima de cana depositado (RQCA) com aquele
produzido por combustíveis fósseis, que foi previamente avaliado em sua composição
tóxica e citotóxica (MEDEIROS JR et al., 2004). Os resultados indicaram que a
66
mutagenicidade de RQCA é similar aos das amostras de ROFA (Residual Oil Fly Ash).
Esses efeitos foram observados independentemente nos dois ensaios utilizando
camundongos e Tradescantia. De forma interessante, não foi observado um efeito dose-
resposta claro em RQCA. A razão para esse resultado não é fácil determinar, uma vez que
ambos os poluentes testados – ROFA e RQCA – são compostos por várias espécies
químicas, tornando quase impossível tirar conclusões sobre qual componente seria
responsável pelos efeitos observados e quais são os perfis de dose-resposta individuais.
Entretanto, partículas brutas de RQCA que estão sujeitas a procedimentos mínimos de
extração foram mutagênicas em plantas e camundongos, indicando que as partículas podem
representar um risco em potencial para a saúde de populações continuamente expostas.
No presente estudo, a maior freqüência de micronúcleo foi observada nas menores
concentrações de RQCA (0,03 mg/ml) no ensaio de TRAD-MCN e nas células do sangue
periférico e medula de camundongos, especialmente no tempo de 48h. Esses danos
cromossômicos que estão sendo detectados é uma causa da morte celular, espera-se que os
níveis significativos dos micronúcleos encontrados estejam somente em níveis tóxicos ou
próximo-tóxicos (HEDDLE, 1973). A toxicidade produzida pela concentração mais elevada
de RQCA poderia ter reduzido a freqüência de micronúcleo produzida por esta dose.
A resposta relativamente baixa em medula óssea 24 horas após o tratamento
também pode ter sido conseqüência da absorção limitada das suspensões com particulado
uma vez que os tratamentos não resultaram em citotoxicidade, conforme avaliado pela
freqüência de PCEs em animais tratados e não tratados. A maioria dos ensaios de
mutagenicidade são conduzidos com os agentes do teste na solução e a resposta atrasada em
medula poderia ser devido ao tempo, e as necessidades de absorção e metabolização dos
constituintes do particulado. Embora tais ensaios não sejam realizados freqüentemente, a
67
mutagenicidade das suspensões com particulado foram avaliadas previamente usando os
ensaios de micronúcleo e de Ames (BORM, 1997; CARVALHO-OLIVEIRA et al., 2005).
Estudo prévio demonstrou que tamanhos diferentes das fibras do asbesto influenciam na
mobilidade e o mutagenicidade de agentes particulados (VARGA et al., 1996).
A composição dos elementos da amostra de RQCA indicou níveis relativamente
elevados de Ti, Mn e V, que pode ter contribuído para a freqüência de micronúcleo medido
nos testes. Em contraste, ROFA/HU e ROFA/PE tiveram concentrações não detectadas
destes elementos. Estudos prévios demonstraram diferenças significativas dos elementos
traço na poluição urbana das regiões com tráfego automotivo mais intenso em comparação
com amostras de regiões não poluídas (SUMITA et al., 2003). Assim, a avaliação de
elementos traço parece ser útil para caracterizar quais elementos contribuem para a
mutagenicidade. É possível que os metais presentes em RQCA possam induzir a
fragmentação do DNA, que poderiam ser envolvidos em processos carcinogênicos ou
mutagênicos. Os compostos que contêm o Ti, Mn, e o V foram associados com
genoxicidade e carcinogenicidade (KARTZER et al., 2003; MORISHITA et al., 2004;
WEVER et al., 1997). Foi sugerido que os níveis elevados de material particulado contendo
metal promovem a carcinôgenese devido à indução de dano oxidativo no DNA (KIM et al.,
2003). Além de contribuir à dispersão de V, de S, e de Se, a combustão de carvão é
associada com a mortalidade elevada em indivíduos expostos (GRAHAME e HIDY, 2004).
A indução dos danos oxidativos pelos particulados também pode ter contribuído
para a dose-resposta negativa para RQCA nos testes de mutagenicidade. Provavelmente,
uma das concentrações mais baixas de suspensão de biomassa pôde conter poucos
agregados das partículas. Os níveis mais baixos de agregação puderam resultar em uma
resposta imune provocada por macrófagos, tendo por resultado uma indução mais eficiente
68
dos danos do DNA (ARBEX et al., 2004). Além disso, as partículas ultrafinas podem dar
forma a conjuntos pequenos com formas arredondadas, que resulta no meio de deposição
mais rápido como ocorre nos pulmões dos ratos, especialmente quando as partículas
contêm compostos de Ti (KAPP et al., 2004).
Surpreendentemente, as freqüências de micronúcleo no tempo da amostragem do
tempo-zero eram mais elevadas para os grupos do teste do que o controle negativo (Tabela
III). Aparentemente, uma absorção parcial e rápida da biomassa particulada ocorreu,
explicando diferenças entre o teste e o controle positivo contra grupos de controle negativos
bem como uma freqüência mais elevada de micronúcleos. Em resumo, os resultados do
estudo atual indicam que RQCA são ao menos tão genotóxicos como o combustível fóssil
que originou os outros particulados usados neste estudo. Considerando estes resultados,
seria importante a condução de estudos epidemiológicos nos locais onde a população geral
e os trabalhadores estão expostos continuamente a RQCAs.
Um número de elementos traços compostos essencialmente de metais (por
exemplo zinco manganês, cobre e cromo) são conhecidos pelo seu potencial tóxico,
dependente dos seus níveis, e que causam efeitos adversos a saúde de indivíduos expostos
(CHUKHLOVIN et al., 2001). Em particular, a excessiva exposição a metais pesados in
vitro e in vivo, causa distintos efeitos tóxicos, alterando a proliferação e sobrevivência
celular (CHUKHLOVIN et al., 2001). Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) e
vários compostos, incluindo os elementos traço são encontrados na biomassa oriunda da
queima de cana-de-açúcar, como encontrado no presente estudo (GODOI et al., 2004a;
GODOI et al., 2004b; ZAMPERLINI et al., 2000). Em concordância com estes estudos,
encontramos uma alta concentração de pireno, benzo(e)acefenantrileno e benzo[k]
69
fluoranteno, os quais são relacionados com a morte celular, apoptose e danos de DNA
(PLISKOVA et al., 2005, ISKANDER et al., 2004, ARIF , SMITH and GUPTA, 1999) .
Como outros HPAs, certos metabólitos dos benzoantracenos são reconhecidos como
potentes substâncias carcinogênicas e seus efeitos parecem ocorrer por ligação covalente
dessas espécies com grupos nucleofílicos das bases do DNA, conhecido como aductos
(ARIF , SMITH and GUPTA, 1999). Biomarcadores da resposta, as aberrações
cromossômicas e micronúcleos, são amplamente utilizados em ensaios de mutagenicidade.
O ensaio de micronúcleo e a freqüência de trocas entre cromátides irmãs em leucócitos do
sangue periférico são também adequados como biomarcador de exposição aos HPAs
(BRANDT and WATSON, 2003). No presente estudo verificamos uma associação positiva
entre a alta freqüência de micronúcleos em células mãe de grão de pólen de Tradescantia
pallida tratadas em diferentes tempos e concentrações de extrato orgânico contendo grande
quantidade de HPAs. O ensaio de micronúcleo em T.pallida é um método sensível para a
avaliação de mutagênese e pode ser empregado em condições laboratoriais e de
campo.Estudos prévios demonstraram que o dano de DNA pode ser monitorizado com
sucesso utilizando o teste de micronúcleo em Tradescantia pallida (CARVALHO-
OLIVEIRA et al., 2005). A alta frequência de micronúcleos observada na época da colheita
de cana-de-açúcar representa a mutagenicidade potencial da biomassa oriunda da sua.
Estudos prévios demonstraram que a poluição atmosférica aumenta o risco de
desenvolvimento do câncer pulmonar. Emissões de poluentes ricos em HPAs poderia ser
considerado, por diferentes mecanismos, um importante risco para a carcinogênse do tecido
pulmonar (VIENEIS e HUSGAFVEL-PURSIAINEN, 2005). Assim, a citotoxicidade e a
morte celular poderiam causar processos inflamatórios, potencializando o dano celular. No
presente estudo, encontramos maior freqüência de morte celular em linhagem pulmonar
70
(A549) tratada com HPAs isolados do particulado total do período de safra e entressafra de
cana-de-açúcar. Foi relatado que a presença de vários compostos, incluindo os metais e
HPAs na poluição atmosférica induz toxicidade nas células expostas, resultando no
aumento de apoptose dependente da concentração do poluente (HETLAND et al, 2004). No
presente trabalho, o aumento da expressão da proteína Bcl-2, observado nas células tratadas
com as maiores concentrações e nos tempos de 24 e 48h, indicando, especialmente no
particulado do período de safra, que a queima de cana dispara sinais apoptóticos. Nossos
resultados indicam uma baixa expressão de p53 fosforilado em todos os tratamentos e nos
diferentes tempos, possivelmente indicando uma inibição da via de apoptose dependente de
p53. A substância phitrina alfa, uma inibidora sintética da atividade de p53, aboliu a parada
do ciclo celular em fase S e a apoptose induzida por HPAs (PLISKOVA et al., 2005). A
modulação da morte celular programada (apoptose) por diferentes metais pesados parece,
em parte, determinar a imunotoxicidade de linfócitos. Normalmente, um suficiente dano
genômico mostra um aumento de apoptose dependente de p53, a qual previne a
transformação e proliferação tumoral. Alguns metais pesados como o Cu (II) e Cr (VI)
podem aumentar a apoptose in vitro de linfócitos. Por outro lado, a presença de Zinco e
Cádmio poderia inibir a apoptose in vitro. A supressão de apoptose pode prevenir a
eliminação natural de células alteradas geneticamente e promover efeitos carcinogênicos na
população afetada. (Chukhlovin et al., 2001).
É possível concluir que há uma correlação entre a presença de HPAs no período de
safra e entresafra e o aumento de citotoxicidade e sinais de apoptose, indicando que a
biomassa de queima de cana-de-açúcar apresenta o potencial de risco à saúde da população
exposta.
71
CONCLUSÕES
72
1) A partir deste estudo foi possível concluir que a RQCA proveniente de material
depositado é tão mutagênica quanto os particulados derivados de combustíveis fósseis
(ROFAS).
2) A maior mutagenicidade foi verificada em relação ao tempo de exposição em todos os
bioensaios realizados independente da concentração ou do particulado (depositado e PTS).
3) A RQCA do particulado depositado exibiu propriedades mutagênicas similares em
ambos os modelos, animais e vegetais.
4) A morte celular, medida pelos ensaios de viabilidade e citotoxicicidade (MTT), foi maior
em relação ao tempo e quase similar nas diferentes concentrações de particulados de safra
e entressafra, possivelmente indicando a citotoxicidade de ambos os extratos dos PTS.
5) A expressão entre Bak e Bcl-2 foi inversamente proporcional, onde as células
apresentaram aumento de Bak e diminuição de Bcl-2 em função, principalmente do tempo
de tratamento. Esses resultados aparemente sugerem que independente da concentração e
dependente do tempo de tratamento sinais de apoptose da via intríseca são disparados.
6) Poucas células demonstraram expressão de p53 ativado, embora um evidente aumento
tempo resposta tenha sido observado no período de safra e entressafra, possivelmente
indicando que não houve tempo/concentração suficientes para a sua ativação.
73
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Particles derived from biomass burning induce micronuclei in plant and mouse
bioassays
Short running title: Sugar cane biomass burning and micronuclei
Mariana C.C. Peron
1
, Heloisa M. Bueno-Guimarães
2
, Dolores H.R.F. Rivero
2
, Ana Júlia
F.C. Lichtenfels
2
, Debora-Jã A. Lobo
2
, Maísa P.Giocondo
1
, Mariangela Macchione
2
,
Mitiko Saiki
3
, Paulo Hilário N. Saldiva
2
, Christiane P. Soares
1*
1
Laboratory of Clinical Cytology, Department of Clinical Analysis, School of
Pharmaceutical Sciences, UNESP, São Paulo State University. R. Expedicionários do
Brasil, 1621, CEP 14 801 902, Araraquara, São Paulo, Brazil.
2
Laboratory of Experimental Air pollution, Faculty of Medicine, Department of Pathology,
School of Medicine, University of São Paulo (USP), Av. Dr Arnaldo, 455, SP, CEP 01246-
903, São Paulo, Brazil.
3
Neutron Activation Analysis Laboratory, Av. Professor Lineu Prestes 2242, CEP 05508-
000, São Paulo, SP,Brazil.
*Corresponding author:
Christiane Pienna Soares
School of Pharmaceutical Sciences, UNESP, São Paulo State University, R.
Expedicionários do Brasil, 1621, CEP 14 801 902, Araraquara, São Paulo,Brazil.
fax: +55-16- 3301-6547; Email address: so[email protected] (C.P. Soares).
96
Abstract
The genotoxic potential of sugar cane burning residues (SCBRs at 0.3 and 0.03
mg/ml) and particle surrogates of residual oil fly ash (ROFA 0.3 mg/ml) were evaluated in
assays measuring micronuclei (MN) in mouse bone marrow and peripheral red blood cells
and in the pollen mother cells of Tradescantia pallida. Both test coumpounds induced MN
in mouse red cells and in the plant bioassay. The micronucleus frequency in peripheral
blood was higher 48 hr after administration of the samples and the highest micronucleus
frequency was observed in animals receiving 0.03 mg/ml SCBR. Micronucleus induction in
bone marrow cells showed no effect of time at the 24 hr and 48 hr sampling times and no
time-dose interaction (repeated measures ANOVA). In conclusion, SCBR was at least as
genotoxic as the fossil fuel derived particles. The results suggest that epidemiological
studies should be conducted at sites where large population groups are continuously
exposed to SCBRs.
Keywords: pollution, micronuclei, blood cells, Tradescantia pallida.
97
Introduction
Biomass is a major source of domestic energy for half of the world’s population;
90% of the rural regions in developing countries utilize energy derived from wood, coal,
animal excrement, and agricultural residues (WHO, 2000). The emissions generated during
biomass burning produce high levels of indoor air pollution and are believed to be
responsible for deleterious health effects in exposed populations (Arbex et al., 2000;
Buschini et al., 2001; Riedl and Diaz-Sanches, 2005). Ethanol, which is produced in Brazil
from sugar cane, is widely used as automotive fuel. The production of sugar cane in Brazil
involves the burning of sugar cane plantations before harvesting, and this represents a
seasonal source of environment biomass burning emissions (Arbex et al., 2004). A recent
study detected polycyclic aromatic hydrocarbons in residues of sugar cane burning
(SCBRs), indicating that SCBRs are potentially mutagenic (Zamperlini et al., 2000).
Considering that petroleum resources will become scarce and ethanol can be an alternative
fuel, we anticipate that burning sugar cane biomass could become a world problem in the
future.
The induction of micronuclei (MN) in dividing cells is used as a biomarker to
characterize the mutagenic potential of complex substances. MN are cytoplasmic
chromatin-containing bodies that are formed when acentric chromosome fragments or
whole chromosomes lag during anaphase and fail to become incorporated into daughter cell
nuclei during cell division (CSGMT, 1995; Soares et al., 2003; Russo et al., 2004). Thus,
the genetic damage that results in chromosome breaks, structurally abnormal chromosomes,
and spindle abnormalities leads to micronucleus formation and the incidence of MN in
animal or plant cells could serve as biomarker of genotoxicity caused by air pollutants
(Alves et al., 2003; Medeiros-Jr et al., 2004; Carvalho-Oliveira et al., 2005). Although the
98
measurement of MN in blood cells of mice is commonly used for hazard identification, the
evaluation of MN in polen mother cells of Tradescantia pallida (TRAD-MCN) has been
described as an efficient and inexpensive bioassay for monitoring the genotoxic effects of
air pollutants (Carvalho-Oliveira et al., 2005). T. pallida potentially can accumulate DNA
damage via in situ exposure, which could be useful for air pollution biomonitoring and
outdoor pollution control (Sumita et al., 2003).
In the present study, we evaluated the mutagenicity of SCBR in animals and plants
by measuring analyzing the frequency of MN in mouse peripheral erythrocytes and bone
marrow cells, as well as in pollen mother cells of Tradescantia pallida. In addition, the
mutagenicity of SCBR was compared with that of particles derived from industrial
processes powered by fossil fuels.
99
Materials and Methods
Test particles
SCBRs were collected over a period of 24 hr by dry deposition in several plastic
receptacles with an area of 177 cm
2
and filled with 1.5 L of water. The receptacles were
placed close to where sugar cane burning was occurring, as described by Arbex et al.
(2000). The openings of the receptacles were protected to avoid contamination by leaves
and large insects. The contents of the receptacles were centrifuged at 256 x g for 10 min,
and the pellet was stored at room temperature.
Two samples of particles representative of fossil fuel burning were assayed for
comparison. The particles were generated by the combustion of different types of residual
oil fly ash (ROFA). One of them was collected from the solid waste incinerator of the
University Hospital of the University of São Paulo (ROFA/UH), which is powered by
combustibles; the other was collected by an electrostatic precipitator installed in one of the
chimneys of a large steel plant in Brazil (ROFA/EP).
Characterization of particles
Suspensions of test particles were produced by ultrasonication in saline, at
concentrations of 0.03 and 0.3 mg/ml for the SCBR, and at 0.3 mg/ml for the ROFA/UH
and ROFA/EP. The elemental composition of the SCBR samples was determined by
neutron activation analysis. The evaluation of the ROFA/UH and ROFA/EP samples was
previously reported by Medeiros et al. (2004). Basically, the procedure involved short
irradiations of 1 min for the determination of Cl, K, Mg, Mn, Na, Ti, and V, using a
pneumatic transfer system under a thermal neutron flux of 1.4 x 10
12
n cm
-2
s
-1
. Longer
irradiations of 16 hr under a thermal neutron flux of about 10
12
n cm
-2
s
-1
were performed
100
for determinations of As, Ba, Br, Ca, Ce, Co, Cr, Cs, Fe, Hf, K, La, Mn, Mo, Na, Nd, Rb,
Sb, Sc, Se, Sm, Th, U, V, and Zn. After appropriate decay times, the irradiated samples and
standards were measured using a hyperpure Ge detector Model GX2020 coupled to Model
1510 integrated signal processor (both from Canberra, Australia). Counting times from 200
to 50,000 sec were used, depending on the half-lives or activities of the radioisotopes
measured in three independent assays. The radioisotopes were identified according to their
half-lives and γ-ray energies. The concentrations of the elements were calculated using a
comparative method (Saiki et al., 1997).
Exposure protocol
Mice:
The experimental protocol was approved by the Ethics Committee for Animal
Experimentation (protocol number 10/2003) and was conducted in accordance with
national guidelines for animal protection. The gender and the number of animals per group,
the treatment schedule, dose levels, and the administration of the test compounds were
performed as recommended by Hayashi et al. (2000). Male 8-10-week-old Balb/c mice,
obtained from the School of Medicine, University of São Paulo, Brazil, were divided into
five groups of 20 animals each. The animals received 0.2 ml of the following substances by
intraperitoneal injection: (1) saline; (2) 0.3 mg/ml ROFA/EP; (3) 0.3 mg/ml ROFA/UH; (4)
0.03 mg/ml SCBR; or (5) 0.3 mg/ml SCBR. The groups were further divided into 2
subgroups of 10 animals each; one group was sampled at 24 hr (n=12) and and the other at
48 hr (n=12) after injection. Blood and bone marrow were sampled after deep anesthesia
with tiopenthal.
101
Plants:
The Tradescantia micronucleus assay (TRAD-MCN) was performed in early
tetrads of Tradescantia pallida (Ma, 1979; Batalha et al., 1999; Carvalho-Oliveira et al.,
2005). The assay contained a positive control (formaldeyide 1000 ppm), a negative control
(Hoagland solution), and test groups treated with SCBR, ROFA/EP or ROFA/UH.
Individual groups contained 15 plants, each having a single inflorescence. The plants were
obtained from the School of Medicine’s gardens and kept in the laboratory for 24 hr in
Hoagland's solution before treatment. After this period, cuttings were transferred to Becker
jars containing the same concentrations of the test compounds used for treating mice, and
maintained for 8 hr at room temperature. After the treatment, the plants were allowed to
recover for 24 hr in Hoagland's solution. Young inflorescences were collected and fixed in
1:3 acetic acid/ethanol, as described below.
Micronucleus assays
Mice:
Blood was collected from the caudal aorta and smeared on glass slides, fixed with
absolute methanol for 10 min, dried in air, and stained with Feulgen and Fast Green. Bone
marrow cells were obtained from the femur immediately following sacrifice. The cellular
suspension was centrifuged at 169 x g for 10 min, the pellet homogenized, and smears
prepared and stained with Giemsa staining solution (Hayashi et al., 2000).
All the slides from peripheral blood and bone marrow were randomized and coded for scoring. The slides were analyzed at a
magnification of 1000x. For each animal, 3000 peripheral blood erythrocytes and 1000 bone marrow polychromatic erythrocytes
(PCEs) were examined in order to evaluate the presence of MN. All slides were scored by one person to avoid interobserver
variability, as recommended by Davies et al. (1998).
102
Plants:
Fifteen plants, each with a single inflorescence, were evaluated for each group. The
inflorescences were dissected and young anthers squashed in a solution of acetocarmine
stain on a glass slide as described by Ma (1981). MN were counted on coded slides. Only
preparations containing early tetrads were considered and the number of MN in 300 tetrads
from each of the fifteen plants from each group was counted at 400x magnification. The
results were expressed as the percentage of tetrads containing MN (frequency of MN).
Statistical analysis
Data analysis was performed by repeated measures One-Way ANOVA, using either
the mean frequency of MN in each assay (mean of data from 10 mice or 15 plants), or the
square root of the mean, as the dependent variable in the models. The Student-Newman-
Keuls test was employed for post-hoc analysis. The level of significance was set at 5%.
Statistical analysis was conducted with the aid of SPSS v10.0 statistical software (SPSS,
Chicago, IL).
103
Results
Table I presents elemental concentrations obtained from the analysis of the SCBR,
ROFA/UH, and ROFA/EP samples, and the detection limit values obtained according to
the criteria Currie (1968). The data for ROFA/UH and ROFA/EP were previously reported
(Medeiros et al., 2004) and are shown in the table for comparison with the elemental
composition of SCBR. Neutron activation analysis was appropriate for characterizing this
type of matrix due to its ability to analyze several elements using small samples, the quality
of the results, and the low detection limits. The precision of the results determined for the
SCBR is illustrated by standard deviations of less than 10% for most of elements. The
accuracy of the analysis also was evaluated by analyzing NIST 1633b Coal Fly Ash and
IAEA Soil-7 standards. The results that were obtained agreed with certified values (data not
presented).
Results obtained in these analyses demonstrated differences between the elemental
composition of the different combustion particle samples. The SCBR sample had 10- to
100-times higher concentrations of As, Co, Cs, Mn, Ti, and V than were found in
ROFA/UH or ROFA/EP. In contrast, ROFA/EP had 5- to 50-times higher Br, Cr, Fe, Rb
and Zn then, respectively, SCBR or ROFA/UH. Otherwise, the highest concentrations of
lanthanide elements were found in ROFA/UH, followed by ROFA/EP and then SCBR.
Table II shows the means (± standard deviations) of the micronucleus frequency in
circulating red blood cells. Significant effects of time (p<0.001) and a time x group
interaction (p=0.01) were detected (repeated measures ANOVA). The frequency of MN
produced by the test samples generally was higher at the 48 hr than at the 24 hr sampling
time. The highest micronucleus frequency was observed in the animals receiving 0.03
104
mg/ml SCBR. Post-hoc analysis indicated that all the test agent treatments resulted in
significantly increased frequencies of MN, but there were no significant differences
between the micronucleus frequencies in the different treatment groups.
Table III presents descriptive statistics for the micronucleus scoring in bone marrow
cells and the percentage of polychromatic erythrocytes (PCEs) and normochromatic
erithrocytes (NCEs) determined by counting 1000 bone marrow cells/animal/group. No
significant effects of time or time x group were observed for bone marrow cells (repeated
measures ANOVA). Greater differences between the % PCE frequencies were observed
between saline group and all other groups (SCBR, ROFA/UH and ROFA/EP) for the 48-hr
than the 24-hr samples (repeated measures ANOVA, p<0.0001), indicating all particulates
induced some bone narrow cytoxicity. No significant differences were observed between
negative control and the other groups for the 24-hr sampling.
Table IV shows descriptive statistics for the micronucleus frequencies measured in
TRAD-MCN assay. Significant differences were detected among the groups (p < 0.001).
Student-Newman-Keuls post hoc analysis identified 3 groups, with some overlap among
them: saline and 0.3 mg/ml SCBR; 0.3 mg/ml SCBR and ROFA/UH; and, finally, 0.03
mg/ml SCBR and both types of ROFA.
105
Discussion
Biomass burning is still commonly employed for agricultural purposes in
developing countries. Even in organized rural settings, such as is the case with sugar cane
production in Brazil, burning is commonly used. This procedure of provides jobs for
thousands of Brazilians, and is used instead of mechanized processes, in part, to avoid
social problems.
Since the burning procedure cane does not result in high temperatures, there is
incomplete combustion of the biomass, which results in the generation of several organic
compounds, including polycyclic aromatic hydrocarbons and aldehydes (Chen,Hsieh,Chiu,
2003). Studies on the evaluation of the genotoxic potential of SCBRs are important to
assess the potential risk of human exposure. Although indoor biomass burning has been
associated with the development of lung cancer (Smith and Liu, 1993) and laryngeal cancer
(Clifford, 1972), there is no information about the effects of outdoor biomass burning,
probably because the levels of such pollution in the environment depend upon the
generation of sporadic fires, a requirement that is not conducive to conducting large-scale
population studies over extended periods of time. Indeed, most of the knowledge about the
cancer risk and mutagenic potential of air pollution comes from studies with fossil fuel
derived emissions (Bernstein et al., 2004; Buschini et al., 2001; Burgaz et al., 2002). The
purpose of the present study was to compare the muyagenicity of SCBR with particles
produced by fossil fuel combustion that have previously been evaluated for chemical
composition and toxicity (Medeiros et al., 2004).
The results indicated that the mutagenicity of SCBR is similar to that of the ROFA
samples. These effects were detected independently in two different assays employing mice
106
and Tradescantia. Interestingly, no clear dose-responses were observed for the SCBR; it
rather showed in a positive-negative pattern. This is difficult to determine, since both test
agents – ROFA and SCBR – are composed by several chemicals, making it almost
impossible to draw conclusions about which components are responsible for the observed
effects and what are their individual dose-response profiles. However, raw SCBR particles
that were subjected to minimal extraction procedures were mutagenic to mice and plants,
indicating that the test particles may impose a potential healthy risk in populations under
continuous exposure.
In the present study, mutagenic effects was observed for the lower concentration of
SCBR (0.03 mg/ml) than the higher concentration in the TRAD-MCN assay, as well as in
peripheral blood and bone marrow cells of mice, particularly at the 48 hr sampling time.
Since the chromosomal damage being detected itself is a cause of cellular death, it is
expected that significant levels of aberrations and MN only will be found at toxic or near-
toxic levels (Heddle, 1973). After treatments in mice or rats, bone marrow should be
collected no latter than 24 hr after treatment, while peripheral blood should be collected no
later than 40 hr after treatment (Hayashi et al, 2000; Soares et al, 2003). Toxicity induced
by the highest concentration of SCBR could reduce the frequency of MN.
The relatively low bone marrow response at 24 hr also might be due to limited
absorption of the particulate suspensions since the treatments did not result in cytoxicity, at
least as measured by the frequency of PCEs in treated and untreated animals. Most
genotoxicity assays are conducted with test agents in solution and the delayed bone marrow
response could be due to the time the particulate needs for absorption and metabolism.
Although such assays have not be conducted frequently, particulate suspensions were
evaluated previously for mutagenicity using the MN and Ames assays (Borm, 1997;
107
Carvalho-Oliveira et al., 2005). A previous study has shown that the different sizes of
asbestos fibers great influence the mobility and genotoxicity of particulate agents (Varga et
al. , 1996).
The components of the SCBR sample indicated relatively high levels of Ti, Mn, and
V, which might have contributed to the MN measured in the assays. In contrast, ROFA/UH
and ROFA/EP had undetectable concentrations of these elements. Previous studies
demonstrated significant differences in trace elements in urban pollution from regions with
heavier diesel-powered truck traffic in comparison with samples from clean regions
(Sumita et al., 2003). Thus, the evaluation of trace elements seems to be useful for
characterizing the elements effectively contribuing to genotoxicity. It is possible that the
metals present in SCBR might be able to induce high levels of DNA breakage, which could
be involved in carcinogenic or mutagenic processes. Compounds containing Ti, Mn, and V
were associated with genoxicicity and carcinogenicity (Katzer et al., 2003; Morishita et al.,
2004; Wever et al., 1997). High levels of metal-containing particulate matter are believed to
promote carcinogenesis because of their ability to cause oxidative DNA injury (Kim et al.,
2003). In addition, coal combustion contributes to the dispersion of V, S, and Se, and it is
associated to high mortality in exposed individuals (Grahame and Hidy, 2004).
Induction of oxidative damage by particulates may also have contributed to the
negative dose-response for SCBR in mutagenicity assays. We hypothesize that lower
concentrations of biomass suspensions might contain fewer aggregates of particles. The
lower levels of aggregation might result in a week an immune response triggered by
macrophages, resulting in a more efficient induction of DNA damage (Arbex et al., 2004).
Moreover, ultrafine particles are able to form small clusters with rounded shapes, which
108
migh result in faster deposition, as occurs in rat lungs, especially when the particles contain
Ti compounds (Kapp et al., 2004).
Surprisingly, MN frequencies observed in erythrocytes at the time-zero sampling
time were higher for the test groups than the negative control (Table II). Increased influx
could reflect and increase vascular permeability after intraperitoneal injection of
particulates fluorescein-labeled and they were fast drained by lymphatic system, with
higher drenage rate and tracer disappearance from the peritoneum (Nagy, 1992).
Apparently, a partial and fast absorption of particulate biomass occurred, explaining
differences among test and positive control versus negative control groups as well as a
higher micronuclei frequency.
In conclusion, the results of the present study indicate that SCBRs presented
genotoxic effects, as much as the fossil fuel derived particles assayed in this study.
Considering this information is relevant in the sense that epidemiological studies should be
conducted with human populations exposed to SCBRs.
Acknowledgments
The authors are thankful to CNPq and FAPESP for financial support.
Funding Sources:
- Laboratory of Clinical Cytology and Cellular Biology, Department of Clinical
Analysis, School of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo State (UNESP).
- Laboratory of Experimental Air pollution, Faculty of Medicine, Department of Pathology,
School of Medicine, University of São Paulo (USP).
- CNPq and FAPESP, for scientific Brazilian Foundations Research.
109
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115
Table I. Concentrations of chemical element in combustion particle samples determined by
neutron activation analysis. (Fe, Ca, Cl, K and Mg concentrations are given as percentages).
Samples
Elements
SCBR (n=3)* ROFA/UH (n=1) ROFA/EP (n=1)
Detection Limit
Values
As, µg kg
-1
601 ± 27 9.3± 1.0 61.0 ± 1.0
5.2
Br, µg g
-1
6.6 ± 0.7 8.7 ± 0.6 1482 ± 19
0.020
Ca (%)
6.9 ± 0.3 0.59 ± 0.04 5.4 ± 0.2
0.077
Cl, (%)
0.34 ± 0.05
ND ND 0.005
Co, µg kg
-1
2039 ± 196 122.9 ± 3.1 9.96 ± 0.25
2.1
Cr, µg g
-1
8.1 ± 0.5 32.4 ± 0.4 107.7 ± 1.4
0.014
Cs, µg kg
-1
846 ± 24 0.58 ± 0.04 9.96 ± 0.25
0.28
Fe (%)
8.7 ± 0.6 3.28 ± 0.07 44.6 ± 0.1
0.0016
K (%)
5.6 ± 0.1
ND ND 0.04
La, µg g
-1
33 ± 1 972 ± 12 10.3 ± 0.1
0.04
Mg, (%)
2,2 ± 0.2
ND ND 0.12
Mn, µg g
-1
1728 ± 123
ND ND 0.7
Mo, µg g
-1
2.6 ± 0.4
ND ND 1.5
Na, µg g
-1
365 ± 46
NA NA 0.10
Rb, µg g
-1
57 ± 1 11.4 ± 1.1 719.7 ± 1.0
2.7
Sb, µg kg
-1
305 ± 112 39.8 ± 0.7 2.27 ± 0.09
1.0
Sc, µg kg
-1
2487 ± 192 1.111 ± 0.007 1.91 ± 0.01
0.33
Se, µg kg
-1
540 ± 65 20.5 ± 0.2 154.4 ± 0.8
15.7
Ti, µg g
-1
2144 ± 6
ND ND 50
V, µg g
-1
29 ± 3
ND ND 14
Zn, µg g
-1
101 ± 5 115.7 ± 1.5 491.9 ± 3.1
3.1
Hf, µg g
-1
NA
1.64 ± 0.03 0.62 ± 0.07
0.10
Th, µg g
-1
NA
3.07 ± 0.03 1.50 ± 0.06
0.09
U, µg g
-1
NA ND
2.28 ± 0.14
0.30
Ce, µg g
-1
NA
51.1 ± 0.4 16.3 ± 0.3
0.35
Nd, µg g
-1
NA
33.1 ±.2.9 9.3 ± 1.6
4.5
Sm, µg g
-1
NA
2.69 ± 0.08 2.30 ± 0.07
0.008
SCBR (sugar cane burning residues), ROFA/UH (residual oil fly ash from University Hospital of the
University of São Paulo), and ROFA/EP (residual oil fly ash collected from an electrostatic precipitator). ND
=Not detected under analysis conditions. NA = not analyzed. Number n indicates number of determinations
and in the case of n=1 the uncertainty of the result was evaluated considering statistical counting errors of
standard and sample.
116
Table II: Mean (± standard deviation) frequencies of micronucleus (expressed as
percentage micronucleated cells) in peripheral blood cells erythrocites of mice treated with
combustion particles. One thousand cells were analyzed per animal.
Sampling
time
Treatment
Frequency of MN ± SD
Number of analyzed
cells
Time 0 Negative Control
0.111 ± 0.010
9000
a
Positive Control
0.500 ± 0.024
10 000
SCBR 0.3
0.400 ± 0.163
10 000
SCBR 0.03
0.444 ± 0.176
9 000
a
ROFA EP
0.250 ± 0.250
8000
b
ROFA UH
0.222 ± 0.147
9000
a
24 hr Negative Control
0.222 ± 0.222
9000
a
Positive Control
1.400 ± 0.427
10 000
SCBR 0.3
1.625 ± 0.625
8000
b
SCBR 0.03
0.889 ± 0.351
9000
a
ROFA EP
1.000 ± 0.327
8000
b
ROFA UH
0.888 ± 0.260
9000
a
48 hr Negative Control
0.600 ± 0.221
10 000
Positive Control
1.700 ± 0.700
10 000
SCBR 0.3
1.400 ± 0.636
10 000
SCBR 0.03
3.500 ± 0.108
10 000
ROFA EP
1.556 ± 0. 280
9 000
a
ROFA UH
2.111 ± 0.735
9 000
a
SCBR (sugar cane burning residues), ROFA/UH (residual oil fly ash from University Hospital of the
University of São Paulo), and ROFA/EP (residual oil fly ash collected from an electrostatic precipitator).
Positive control (Cyclophosphamide), Negative control (saline). n = number of cells assayed (1000
cells/mouse). Significant effects of treatment time (p<0.001); treatment time versus group: p=0.01.
a
One
animal died.
b
Two animals died
117
Table III: Means ± standard deviations of micronucleus frequency (expressed as percent
micronucleated cells) in bone marrow cells of mice treated with combustions particles.
Sampling
time
Treatment PCEs/
NCEs (%)
Mean (MN/PCEs)
± SD
Analyzed
cells (n)
24 hr * Negative Control 0.49
0.222 ± 0.147
9000
a
Positive Control 0.39
1.200 ± 0.327*
10 000
SCBR 0.3 0.55
0.875 ± 0.441*
8000
b
SCBR 0.03 0.52
1.222 ± 0.434*
9000
a
ROFA EP 0.45
0.750 ± 0.250*
8000
b
ROFA UH 0.47
0.875 ± 0.330*
9000
a
48 hr * Negative Control 0.83
0.600 ± 0.221
10 000
Positive Control 0.39
1.500 ± 0.477 **
10 000
SCBR 0.3 0.51
0.900 ± 0.433 **
10 000
SCBR 0.03 0.53
2.400 ± 0.686 **
10 000
ROFA EP 0.55
1.111 ± 0.261 **
9 000
a
ROFA UH 0.46
1.444 ± 0.530 **
9 000
a
SCBR (sugar cane burning residues), ROFA/UH (residual oil fly ash from University Hospital of the
University of São Paulo), and ROFA/EP (residual oil fly ash collected from an electrostatic precipitator).
PCE = Polychromatic Erithrocytes. Positive control (Cyclophosphamide), Negative control (saline). n =
number of cells assayed (1000 cells/mouse). MN/PCE = Micronuclei in 100 bone marrow PCEs.
a
One
animal died.
b
Two animals died. (*) and (**) ANOVA, p<0.0001, saline versus SCBR (0.3 and 0.03),
ROFA/UH and ROFA/EP.
118
Table IV - Micronucleus frequencies (expressed as percent micronucleated tetrads)
measured in 300 pollen mother cells from each of fifteen Tradescantia pallida
inflorescences exposed to combustion particles.
Treatment
Mean ± SE
N
Negative Control
0.14 ± 0.06
13
Positive Control
4.70 ± 1.05 *
10
SCBR 0.3
2.18 ± 0.35 *
13
SCBR 0.03
5.53 ± 1.04 *
15
ROFA EP
4.90 ± 1.07 *
10
ROFA UH
3.43 ± 0.70 *
11
SCBR (sugar cane burning residues), ROFA/UH (residual oil fly ash from University Hospital of the
University of São Paulo), and ROFA/EP (residual oil fly ash collected from an electrostatic precipitator).
Positive control (Cyclophosphamide), Negative control (saline). N = Number of the plants treated with one
inflorescence. Significant effects of time (p<0.001). (*) Mean MN in 300 tetrads from each of at least 15
plants/group (one inflorescence/plant)
119
ARTIGO 2
120
Organic fraction isolated from TSP on harvesting and non-harvesting sugar cane
culture seasons induce clastogenic effects, cytotoxicity and apoptosis signals.
Peron M.C.C.
a
, Giocondo M.P.
a
, Oliveira A.M.
a
, Caliri, C.M.
a
, Marchi M. R.R.
b
, Silva F.
S.
b
, Arbex M.A.
c
, Carvalho-Oliveira, R
d
, P.H.N. Saldiva
d
, C.P. Soares
a*
a
Laboratory of Cytology and Cellular Biology, Department of Clinical Analysis, School of
Pharmaceutical Sciences, UNESP, São Paulo State University. R. Expedicionários do
Brasil, 1621, CEP 14 801 902 Araraquara, São Paulo, Brazil.
b
Analytical Chemistry Department, Institute of Chemistry, UNESP, P.O. Box 355,
Araraquara(SP), Brazil
c
Department of Medicine, School Paulista of Medicine, UNIFESP, University Federal of
São Paulo, Rua Botucatu 740, 04023-062 – São Paulo – SP
d
Laboratory of Experimental Air pollution, Faculty of Medicine, Department of Pathology,
School of Medicine, University of São Paulo (USP), Av. Dr Arnaldo, 455, SP, CEP 01246-
903, São Paulo, Brazil.
*Corresponding author:
Christiane Pienna Soares
School of Pharmaceutical Sciences, UNESP, São Paulo State University, R.
Expedicionários do Brasil, 1621, CEP 14 801 902, Araraquara, São Paulo,Brazil. fax: +55-
16- 3301-6547; Email address: soares[email protected] (C.P. Soares).
121
Abstract
Ethanol obtained from sugar cane has been considered an alternative fuel,
considering that petroleum reserves could be scarced in few years. However, in Brazil, the
harvesting is done handly, usually after sugar cane burning which is responsable for
seasonal emission of air pollutants. The aim of the study was verify the in vitro cytotoxicity
and genotoxicity behaviour, of the TSP in harvesting and non-harvesting seasons. The total
suspended particulated (TSP) was sampled and was submmited to two treatments: 1)
extracted with organic solvets (DCM:methanol, 4:1); 2) suspended ina a saline solution
(0,85 % NaCl). Micronuclei (MN) was quantified in polen mother cells exposed to both,
organic extract and suspension, to verify genotoxicity. To verify cell death and apoptosis
signal, MTT assay and Bak, Bcl-2 and p53 phosporylated expression were performed in
lung carcinoma cell line. Higher frequency of MN was observed in harvesting than non-
harvesting TSP, indicating that the season are closely associated with DNA damage of the
TSP. Dose-response and time-response were verified and cell death was high in cells
exposed to organic extract in both harvesting and non-harvesting material. Higher
expression of Bcl-2 and p53 phosphorylated was verified in the cells treated with organic
extract in harvesting (3.0 mg/mL) and non-harvesting (0.3 and 3.0 mg/mL) in 24 and 48
hours of treatment. We can conclude that extracted organic compounds from harvesting
season, which represents burning sugar cane biomass and non-harvesting time (fuel fossil
combustion) are cytotoxic and genotoxic. Public politics should be discuss to found
alternatives which could deacrese air pollution emissions.
Key Words: sugar cane biomass, genotoxicity, cytotoxicity, apoptosis, lung cell lines
122
Introduction
Ethanol produced from sugar cane has been successfully used as an alternative fuel
in Brazil since 1970´s. The annual burning of sugar cane plantations (crops) is an usual
practice during harvesting time, representing an important seasonal source of
environmental burning biomass emissions (Arbex et al, 2004). The emissions produce high
levels of respirable pyrogenic particles, which is deleterious to the health of exposed
population (Arbex et al, 2000; Buschini et al, 2001; Riedl and Diaz -Sanches, 2005).
The pyrolisis of sugar cane foliage under high temperatures emits carbonaceous
particles and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) derived from recombination of
acetylene units (Godoi et al., 2004a; Godoi et al., 2004b; Zamperlini et al., 2000). PAHs
together with aromatic amines, halogenated compounds, aliphatic compounds, aldehydes,
ketones, nitrogen dioxide, carbon monoxide, volatile organic compounds and ozone
represent the most common outdoor pollutants (Castell et al, 2005). These compounds
when inhaleted may be absorbed and interact with lung cells or the surrounding tissues.
Therefore, the respiratory tract is the primary target organ for the harmful properties of
these pollutants. Short-term effects of outdoor air pollution include changes in lung
function, respiratory symptoms and mortality due to respiratory failure (Annesi-Maesano
and Dab, 2006).
Various studies have shown that air pollution leads to DNA damage specially
‘bulky’ DNA adducts, which are related to exposure to aromatic compounds, including
PAHs (Vienis and Husgafvel-Pursiainen, 2005). The mutagenic potential of PAHs can be
revealed by the presence of micronuclei (MN), which are cytoplasmic chromatin-
containing bodies formed when acentric chromosome fragments or delayed chromosomes
fail to become incorporated into daughter cell nuclei during cell division (Soares, et al,
123
2003; Russo et al, 2004). Thus, the incidence of micronuclei in animal or plant cells can be
used as a biomarker of genotoxicity caused by air pollutants (Alves et al., 2003; Medeiros-
Jr et al, 2004; Carvalho-Oliveira et al, 2005).
Moreover, since there is a correlation between DNA damage and cell death,
apoptosis has been used as a marker of cell injury induced by urban atmospheric pollution
as it represents the cellular response stress and damage (Alfaro-Moreno et al., 2002,
Karlsson et al., 2004).
In the present study we evaluated the effects of particulate air pollutants in DNA
damage, cytotoxicity and induction of apoptosis signals. Moreover, we investigated the
seasonal variation of these biological effects and chemical air pollutants in sugar cane
harvesting and non-harvesting periods.
2. Materials and Methods
2.1. Total suspended particles (TSP) sampling
Total suspended particles (TSP) samples were collected at Araraquara city, for 24h
during 10 days in March 2003, corresponding to the non-harvesting season and during 10
days in September 2003, corresponding to the harvesting season. The samples were
obtained by a high-volume sampler (Handi-vol, Energética, Brazil) operating with an
average flow rate of 1.1 to 1.7m
3
min
-1
, which was placed at 4 m height in a sampling site
located in a suburban area of the Araraquara city.
The equipment was placed in Araraquara
downtown under protection from the rain.
Araraquara is situated in the so-called “sugar
cane belt”, a region in the center of the São Paulo state which is responsible for most of the
sugar cane business in Brazil. Araraquara is located at latitude 21
0
48’11’’S and longitude
48
0
08’25’’W and with a population of about 200,000 inhabitants. The closest sugar cane
124
crop is at a distance of approximately 5 km. Particles were collected in glass fiber filters
(Energética, Brazil) which were dried during 24 hours at 50ºC before and after particle
collection for weighting. After this, the filters were stoked in refrigerator at 4ºC for
posterior analyses.
2.2. Chemical analysis
Chemicals and apparatus
Organic solvents (dichloromethane, methanol and acetonitrile, HPLC grade) were
purchased from JT Baker (Xalostoc, México). Water was produced by a Milli-Q (Waters,
Midford, MA, USA). All solvents were tested for possible contamination by performing
procedural blanks. PAHs standards (purity grade > 99%) were purchased from Aldrich
(Milwaukee, USA), except indene[(1,2,3-cd) pyrene] purchased from Dr. Ehrenstorfer
(Augsburg, Germany).
HPLC/Fluorescence analyse were performed with HPLC Pro Star and Fluorescence
detector Model 360 (Varian, Walnut Creek, USA) equipped with a Supelcosil
TM
LC-PAH
column (25 cm x 4.6 mm, 5µm) (Supelco, Bellefonte, USA) . A gradient acetonitrile/water
was used [40% Acetonitrile (5 min) → (25 min) → 90% Acetonitrile → (15 min) → 100%
Acetonitrile (2 min)], as mobile phase, at a rate of 1.5 mL min
-1
. The volume sample
injected was 10 µL. The fluorescence detector was operated at λ
excitation
of 240 nm and
λ
emission
of 398 nm, except for indene [(1,2,3-cd) pyrene (300 and 466 nm, respectively).
The analyse by GC/MS was performed using a Varian gas chromatograph (CP
3800) coupled with a mass spectrometer detector (Varian, Saturn 2000), with a CP-Sil 8
CB - low bleed/MS) (Chrompack-Varian) capillary column (30 m x 0.25 mm I.D. and film
125
thickness 0.25 µm). The oven temperature was programmed from 90
0
C (1 min) to 120
0
C at
a rate of 10
0
C min
-1
, and then from 120 to 310
0
C at 4
0
C min
-1
, and holding at 310
0
C for 20
min. Helium at a flow-rate of 1 mL min
-1
was used as the carrier gas. The injector
temperature was 250
0
C in the splitless mode. The transferline and trap temperature were
both 250
0
C. The analysis was performed by electron ionisation (70 e V), with ion-trap as
ion analyzer, scanning from 40 to 650 mass units. The volume injected was 1.0 µL.
Table 1 - TSP PAHs’ average concentration (µg g
-1
). Detection Limit (DL) and
Quantification Limit (LQ) in HPLC/Flu system (Andrade,2000)
PAH
DL (pg) LQ (pg)
Phenanthrene 16,2 54
Anthracene 0,94 3,1
Fluorantthene 58,7 196
Pyrene 4,41 14,7
Benzo[a]anthracene 5,67 18,9
Chrysene 33,3 111
Benzo[e]pyrene 3,43 11,4
Benzo[e]acephenantrilene 3,63 12,1
Benzo[k]fluoranthene 0,56 1,87
Benzo[a]pyrene 10,2 34
Dibenzo[a,h]anthracene 120 400
Benzo[g,h,i]perilene 107 357
Indeno[1,2,3-cd]pyrene 33,2 111
126
Trace Elemental Comparative determination
The comparative determination of the trace elements in TSP was made from the 24
samples to both the non-harvesting season and harvesting season collected filters, by using
a energy dispersive X-ray fluorescence spectrometer analysis(ED-XRF) (EDX 700,
Shimadzu Corporation Analytical Instruments Division, Kyoto, Japan). It used a low
power Rh-target tube, voltage 5 to 50kV, current 1 to 1000µA. The characteristic X-ray
radiation was detected by a Si (Li) detector. The analysis were made in vacuum
atmosphere, for the element range Na to U, on the 10mm filter surface. The non-exposed
filters was used as a blank and its contribution was discounted of the results. The elemental
carbon black concentration in the filters was determined by a smoke stain reflectance
method (reflectance) using a digital reflectometer da (EEL, Smokestain Reflectometer,
mod M43D, UK).
The results are showed terms of the element percent .
TSP samples treatment
One-third of each filter was cut in small parts and extracted by 50 mL of
dichloromethane: methanol (DCM:MeOH 4:1, v/v) in ultrasonic bath, during 30 minutes.
The solvent was evaporated in an evaporator-concentrator at 40-45
0
C until 5 mL,
approximately, and after by means of a gentle flow of nitrogen until almost dryness. The
residues were re-dissolved in 1.0 mL acetonitrile and then analyzed by HPLC/Fluorescence
and GC/MS. The PAHs were quantified (HPLC/Fluorescence) and confirmed (GC/MS) by
comparison with authentic standards. Under the fluorescence wavelength used, it was not
possible the quantification of naphthalene, acenaphtene e acenaphtylene. Method detection
and quantification limits are showed on Table 1.
127
The other set of filters were also cut in small one-third parts, they were resuspended
in 50 mL of 0.85% saline solution and shaking in ultrasound bath for 30 minutes. The
filters slices were removed and the suspension was diluted to 0.3 and 3.0 mg/mL.
2.3. Plants
Mutagenesis of pollutants suspension was determined by means of the Tradescantia
micronucleus assay (TRAD-MCN) in early tetrads of Tradescantia pallida (Ma, 1979,
Batalha et al., 1999, Carvalho-Oliveira, 2005). Plants were obtained from School of
Pharmaceutical’s gardens and kept in laboratory for 24 hours in Hoagland's solution before
treatment. After this period, cuttings were transferred to Becker jars containing the test
solutions, in DCM:MeOH and saline extracts (3.0 and 0.3 mg/ml) from harversting and
non-harversting TSP. How positive control were used formaldehyde 1000 ppm, negative
control Hoagland solution and vehicle control DMSO 3%. for 8h. After the treatment, the
were allowed to recover during 24 hours in Hoagland's solution, after that young
inflorescences were collected and fixed in 1:3 acetic acid/ ethanol solution. The fixed
inflorescences were coded, micronuclei were counted and those codes were revealed only
after the completion of the experiment.
2.3.1. Micronucleus test (MN)
Fifteen plants, each with a single inflorescence, were evaluated for each group. The
inflorescences were dissected and young anthers squashed in a solution of acetocarmine
stain on a glass slide as described by Ma (1981). MN were counted on coded slides, and the
code was revealed only after the completion of the experiment. Only preparations
containing early tetrads were considered and the number of MN in 300 tetrads from each of
128
the fifteen plants from each group was counted at 400x magnification. The results were
expressed as the percent of tetrads containing MN (frequency of MN).
2.4. Cell Culture and Viability
Lung carcinoma cell line (A549), gently provide by Dr Maria José Soares Mendes
Giannini, School of Pharmaceutical Sciences (UNESP), Brazil, was maintained in F12
medium suplemmented with 10% fetal bovine serum and 100U/mL penicillin-
streptomycin, 25ng/mL amphotericin B, 10ng/mL kanamicin, 200ng/mL ciprofloxacin. The
cell line was plated into 25cm
2
flasks and maintained in microenvironment at 37ºC in a
humidified atmosphere with 5% of CO
2
, until 90 to 100 % of cellular confluence. Then,
cells were trypsinizated and 5x10
4
cell/1mL/well were seeded in to 12-well plates. After 24
hours incubation, the cells were treated with different concentrations of particulate obtained
in Araraquara city in same season. The cells were treated for 12, 24 and 48 hours,
quantitative evaluation of cell viability (%) was assayed by Trypan blue staining method in
three independent experiments.
2.5. MTT Assay
Cellular cytotoxicity was determined by MTT assay,
as a measurement of the live
cell’s ability to reduce 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide
(MTT) to violet-coloured formazan after treatment. Cells were seeded into 96-well plates at
2.5 ×10
4
cells per well and cultured in Ham’s F12 containing 10% fetal bovine serum
(FBS) until the cells attached (24 hours). Then cells were treated with PHAs isolated from
harvesting and non-harvesting TSP at two different concentrations (0.3 and 3.0 mg/mL) and
129
for 12, 24 and 48 hours in serum-free medium. The medium was removed and the cells
were washed with PBS. After, the cells were incubated with MTT for another 3 h at 37ºC.
Medium was removed and dye crystal formazan was solubilized in 100 µL of dimethyl
sulphoxide (DMSO). The MTT assay was performed in triplicate and the absorbance was
measured at 540 nm by use of a Bio-Tek Powerwave X microplate reader (BioTek
Instruments, Inc.,USA). Each treatment (0.3 and 3.0mg/mL) and time (12, 24 and 48 hours)
was followed by positive control (doxorrubicin 15 µg/ml), negative control (non-treated
cells) and vehicle control (DMSO 3%). As negative control results are necessary to
calculated (below) cell death (%), negative control is considered equal to zero:
Cell Death (%) = negative control absorbance – test absorbance
_________________________________________ X 100
negative control absorbance
2.6. Flow cytometry (Bak, Bcl-2 and p53 phosphorylated)
Bak, Bcl-2 and p53 phosphorylated expression were evaluated by flow cytometry
method and 2.5 x 10
4
cell/1.0mL/well of the both cell lines were cultivated in 24-well plates
with Ham’s F12 with 10% FBS, in 24 hours. The cells were treated with two different
concentrations of PHAs (0.3 and 3.0mg/mL), isolated from harvesting and non-harvesting
TSP. After treatment for 12, 24 and 48 hours, a fresh medium was replaced and the cell
lines were incubated for more 24 hours. Then, cell lines were trypsinized, placed in sterile
eppendorfs and incubated with saponin 0,5% in PBS, for 30 minutes, at room temperature.
After incubation, the cells were washed 3 times with PBS and centrifugated to 10 000 rpm
4 °C (p53 phosphorylated) or room temperature (Bak and Bcl-2), for 15 minutes. The cells
130
were incubated with the monoclonal antibody anti-Bcl-2 (diluted to 1:200, DAKO,
Glostrup, Denmark), anti-Bak (diluted to 1:200 DAKO), and p53 phosphorylated (diluted
to 1:3000, Santa Cruz Biotecnology, CA, USA) 4 ºC overnight. Carefully, the cells were
washed several times with PBS and centrifugated to 10 000 rpm , 4 °C (p53 phosporylated)
or room temperature (Bak and Bcl-2) for 15 minutes. After, the cells were incubated, with
secundary antibody conjugated with FITC (diluted to 1:60, SIGMA) for 1 hour, at room
temperature.Following, the cells was washed 3 times with PBS and fixed with para
formaldehyde 1% in PBS. The quantitative expression of Bcl-2, Bak and p53
phosphorilated, established as the intensity of green fluorescence, was determined by
FACScalibur flow cytometry (Becton Dickinson, USA). As positive control the cells were
treated with 15µg/mL of doxorrubicin (Bak and Bcl-2) or 10 µg/mL of methotrexate (p53).
As negative control, the cells lines were not treated and as vehicle control the cell lines
were treated with DMSO 3%. All controls were performed to each treatment (0.3 and
3.0mg/mL) and time (12, 24 and 48 hours).
2.7. Statistical analysis
Data analysis was done by repeated measures, using either the absolute frequency
of MN, cytotoxicity measured by MTT assay and apoptosis signal (Bak, Bcl-2 and p53
phosphorilated) or their square root as the dependent variable in the models. The Tukey test
was employed for post-hoc analysis. The level of significance was set at 5%. Statistical
analysis was done with the aid of the Instat Mac 2.01 statistical software (GraphPad
software, San Diego, CA, USA). The one-way ANOVA on ranks was performed to
compare trace element results in TSP sampled in harversting and non-harversting period.
131
Levene tests for equality variance were also employed (least significance difference) for
multiple comparisons among the elements and reflectance and site. Statistical analyses were
performed with the aid of the SPSS v13.0 computer package. The level of significance was
set at 5%.
3. Results
PAHs concentrations for colleted samples are showed in Table 2. Only three PAHs
are found in both sampling seasons: pyrene, benzo(e)acephenantrilene and
benzo(k)fluoranthene. For these compounds the concentrations are at least ten times higher
at harvesting than at no-harvesting season. Table 2 and 3 demonstrate the comparative
determination of trace elements (%) by energy dispersive X-ray fluorescence spectometer
analysis (ED-XRF) and elemental carbon black (%) determined by reflectance in TSP
samples both non-harvesting and harvesting seasons. Trace elemental concentrations were
significant by different between harvesting and non-harvesting TSP samples (Table 3).
Trace element Al,Si, K,Cu, Zn, Sr, Zr, Ba, Pb were observed in 1 to 2 times more
concentrated were non-harvesting. In contrast, S, Ca, Fe in 2 to 4 times higher in harvesting
TSP. Although some elements were observed in lower concetration, in the harvesting TSP
sample three main groups could be distinguished among the different samples (table 3). The
first group is constituted of Al, Si, Fe, Ca, representing soil aerosol particules, the second
group is associated with biomassa burning aerosol and S and K indicates the presence of
bioorganic aerosol components, the third group is characterized by the presence of Cu, Zn,
Sr, Zr, Ba, Pb may indicating elements present in the circulation of superior plants and
released during burning of sugar cane.
132
Figure 1 presents the chromatograms obtained for HPLC/FLU analysis from TSP
extracts on harvesting and no-harvesting seasons for sugar cane culture. PAHs found for
harvesting season are inespecific for vegetal or fossil biomass (as diesel ou gasoline)
burning. Similar PAHs profile as found in other studies on sugar cane burning process
(Zamperlini, 1997; Zamperlini, 2000; Godoi, 2004, Andrade, 2004). Nowever it is possible
to evaluate a significative influence of the harvesting season on PAHs profile, because the
compounds found on no-harvesting season are characteristics of gasoline combustion
(Andrade,2004).
Figure 2 presents the frequency of micronuclei (%) in polen mother cells of
Tradescantia pallida, exposed to PAHs and inorganic compounds isolated from harvesting
and non-harvesting TSP. Higher frequency of micronuclei (p<0.0001) was observed
between both extracts (DCM:MeOH and saline) in harvesting and non-harvesting samples.
Figure 3 shows cellular cytotoxicity evaluated by MTT assay in A549 cell line
treated with PAHs isolated from TSP in harvesting and non-harvesting period. Dose-
response (P = 0.001) and time-response cell death were observed in all treatments. Higher
cell death was observed in non-harvesting 3.0 mg/mL and harvesting 0.3 mg/mL (p<0.05).
Moreover, the cell death was higher in 24 and 48h (p<0.001).
Apoptosis cell signals for Bak, Bcl-2 and p53 phosphorylated expressions evaluated
by flow cytometry were demonstrated in Figure 4. Dose-response and time-response were
observed in Bcl-2 expression (respectively, P = 0.0091 and P = 0.0001) and p53
phosphorylated (respectively, P = 0.0335 and P = 0.0003). No significant difference was
observed in Bak expression in dose-response and time-response results (respectively P=
0.6176 and P = 0.1380). Despite moderate expression have been observed (0 to 41%), Bcl-
2 expression was higher in harvesting 3.0 mg/mL (p <0.05) and non-harvesting 0.3 and 3.0
133
mg/mL (respectively, p<0.01 and p<0.05). In addition, Bcl-2 expression was higher in 12
and 24 hours in all treatments (respectively p<0.001 and p<0.01). Although p53 expression
have presented low levels (0 to 15%), higher expression was dependented by time of the
treatment, mainly in 24 and 48h (respectively p<0.01 and p<0.001).
Table 2 - TSP PAHs’ average concentration (µg g
-1
). Detection Limit (DL) and
Quantification Limit (LQ) in HPLC/Flu system (Andrade,2000)
Concentration (ng g
-1
)* PAH
Non Harvesting Harvesting
Phenanthrene ND 0.53
Anthracene ND 4.11
Fluorantthene ND 1.29
Pyrene 0.10 1.34
Benzo[a]anthracene ND 0.52
Chrysene ND NQ
Benzo[e]pyrene ND 0.72
Benzo[e]acephenantrilene 0.079 0.74
Benzo[k]fluoranthene 0.28 3.30
Benzo[a]pyrene NQ 3.24
Dibenzo[a,h]anthracene ND NQ
Benzo[g,h,i]perilene ND 0.27
Indeno[1,2,3-cd]pyrene ND ND
* Extract obtained from TSP of a blend 5 filtres collected in different days for the same season.
ND = not detected, below detection limit (Table 1)
NQ =detected but not quantificated, below quantification limit (Table 1)
134
Table 3 - Descriptive analyses of the results (means, std derivation and std error of means)
of the comparative determination of the trace elements by a energy dispersive X-ray
fluorescence spectrometer analysis (ED-XRF) in (%) and elemental carbon black
determined by a reflectance (%) in TSP samples both non-harvesting and harvesting
season.
24 27,8792 3,91763 ,79968
24 11,3833 1,50323 ,30685
24 ,00200 ,001103 ,000225
24 ,00113 ,000338 ,000069
24 ,00367 ,000482 ,000098
24 ,00200 ,000000 ,000000
24 7,93163 2,933136 ,598724
24 13,27563 2,766955 ,564802
24 ,00367 ,000482 ,000098
24 ,00200 ,000000 ,000000
24 ,00625 ,004683 ,000956
24 ,18538 ,264475 ,053986
24 12,99217 2,502561 ,510833
24 46,55863 6,988752 1,426573
24 4,13604 1,573624 ,321215
24 3,09729 1,361492 ,277913
24 ,00367 ,000482 ,000098
24 ,00200 ,000000 ,000000
24 ,00950 ,013075 ,002669
24 ,00800 ,012998 ,002653
24 ,00367 ,000482 ,000098
24 ,00200 ,000000 ,000000
24 ,00367 ,000482 ,000098
24 ,00200 ,000000 ,000000
24 ,73008 ,382086 ,077993
24 ,36246 ,171378 ,034982
site
non-harvesting
harvesting
non-harvesting
harvesting
non-harvesting
harvesting
non-harvesting
harvesting
non-harvesting
harvesting
non-harvesting
harvesting
non-harvesting
harvesting
non-harvesting
harvesting
non-harvesting
harvesting
non-harvesting
harvesting
non-harvesting
harvesting
non-harvesting
harvesting
non-harvesting
harvesting
Reflectance
Al
Si
S
K
Ca
Fe
Cu
Zn
Sr
Zr
Ba
Pb
N Mean Std. Deviation
Std. Error
Mean
135
Table 4 - Statistical analysis the results of the comparative determination of the trace
elements by a energy dispersive X-ray fluorescence spectrometer analysis (ED-XRF) in
(%) and elemental carbon black determined by a reflectance (%) in TSP samples.
14,887 ,000 19,259 46 ,000 16,49583 ,85653 14,77172 18,21994
19,259 29,629 ,000 16,49583 ,85653 14,74564 18,24602
16,276 ,000 3,715 46 ,001 ,000875 ,000236 ,000401 ,001349
3,715 27,275 ,001 ,000875 ,000236 ,000392 ,001358
184,000 ,000 16,956 46 ,000 ,001667 ,000098 ,001469 ,001865
16,956 23,000 ,000 ,001667 ,000098 ,001463 ,001870
,479 ,492 -6,493 46 ,000 -5,344000 ,823087 -7,000788 -3,687212
-6,493 45,844 ,000 -5,344000 ,823087 -7,000940 -3,687060
184,000 ,000 16,956 46 ,000 ,001667 ,000098 ,001469 ,001865
16,956 23,000 ,000 ,001667 ,000098 ,001463 ,001870
13,627 ,001 -3,317 46 ,002 -,179125 ,053994 -,287809 -,070441
-3,317 23,014 ,003 -,179125 ,053994 -,290816 -,067434
22,709 ,000 -22,152 46 ,000 -33,566458 1,515276 -36,6166 -30,5164
-22,152 28,803 ,000 -33,566458 1,515276 -36,6665 -30,4664
,072 ,790 2,446 46 ,018 1,038750 ,424753 ,183768 1,893732
2,446 45,068 ,018 1,038750 ,424753 ,183290 1,894210
184,000 ,000 16,956 46 ,000 ,001667 ,000098 ,001469 ,001865
16,956 23,000 ,000 ,001667 ,000098 ,001463 ,001870
,002 ,963 ,399 46 ,692 ,001500 ,003763 -,006075 ,009075
,399 45,998 ,692 ,001500 ,003763 -,006075 ,009075
184,000 ,000 16,956 46 ,000 ,001667 ,000098 ,001469 ,001865
16,956 23,000 ,000 ,001667 ,000098 ,001463 ,001870
184,000 ,000 16,956 46 ,000 ,001667 ,000098 ,001469 ,001865
16,956 23,000 ,000 ,001667 ,000098 ,001463 ,001870
9,950 ,003 4,301 46 ,000 ,367625 ,085479 ,195564 ,539686
4,301 31,894 ,000 ,367625 ,085479 ,193487 ,541763
Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Reflectance
Al
Si
S
K
Ca
Fe
Cu
Zn
Sr
Zr
Ba
Pb
F Sig.
Levene's Test for
Equality of Variances
t df Sig. (2-tailed)
Mean
Difference
Std. Error
Difference
Lower Upper
95% Confidence
Interval of the
Difference
t-test for Equality of Means
136
A
Figure 1 - Chromatograms obtained for HPLC/FLU analysis from TSP extracts on (A) no-
harvesting and (B) harvesting seasons for sugar cane culture
B
137
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
Treatments
Micronuclei (%)
Positive Control
Negative Control
Vehicle Control
DCM:MeOH 0,3 mg/ml
DCM:MeOH 3 mg/ml
Saline 0,3 mg/ml
Saline 3 mg/ml
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
Treatments
Micronuclei (%)
Positive Control
Negative Control
Vehicle Control
DCM:MeOH 0,3 mg/ml
DCM:MeOH 3 mg/ml
Saline 0,3 mg/ml
Saline 3 mg/ml
B
A
Figure 2 - Frequency of micronuclei (%) in polen mother cells of Tradescantia pallida treated with
polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) at concentrations of 0.3 and 3.0 mg/mL, as well as
extracts solubilized in saline (0.3 and 3.0 mg/mL). A) Non- Harvesting B) Harvesting. One Way
ANOVA (p<0.0001) with Tukey’s pos-test to multiple comparison between harvesting and non-
harvesting; p< 0.001 - Negative control versus Vehicle control versus DCM:MeOH 0.3mg/mL
versus Saline 0.3mg/mL versus Saline 3.0mg/mL; p<0.05 – DCM:MeOH 3.0mg/mL harvesting and
non-harvesting.
138
0
5
10
15
20
25
30
35
40
VC PC H 3.0 H 0.3 NH 3.0 NH 0.3
Death cell (%)
12 H
24 H
48 H
Figure 3 – Percentage of death cell (A549) after in vitro treatment with biomass from burns
of sugar-cane; vehicle control (VC), positive control (PC), harvesting (H) in the
concentrations of 0,3 and 3,0 mg/mL, as well as no harvesting (NH) 0,3 mg/mL and 3,0
mg/mL.
139
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
NC
P
C
V
C
H
0,3
H 3
,
0
NH
0,
3
N
H 3,0
Bcl-2 (%)
12 hours
24 hours
48 hours
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
N
C
P
C
V
C
H 0,3
H 3,
0
NH 0,3
NH 3,0
Bak (%)
12 hours
24 hours
48 hours
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
NC
P
C
V
C
H
0
,
3
H 3,
0
NH 0,3
N
H3,0
p53 phosphorilated (%)
12 hours 24 hours 48 hours
B
C
A
Figure 4 – Apoptosis cell signaling in A549 cell line treated with polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAHs) in harvesting (H) and non-harvesting (NH) TSP, assessed by flow
cytometry assay. A), B) and C) Bak, Bcl-2 and p53 phosphorilated proteins expression.
Negative Control (NC) = Cell line were not treated; Positive control (PC) = Cell lines
treated with doxorrubicin (15µg/mL) and Vehicle control VC = cell lines were treated with
DMSO 3%.
140
4. Discussion
A number of essential trace metals, e.g. zinc, manganese, copper and chromium is
known as potential toxicants, depending on their levels and causing adverse health effects
in the exposed individuals (Chukhlovin et al., 2001). In particular, excessive exposure to
heavy metals in vivo and in vitro causes distinct toxic effects, due to altered growth and
cellular survival (Chukhlovin et al., 2001). Polycyclic aromatic hydrocarbons (PHAs) and
several compounds, including trace elements have been also found in sugar cane burning
biomass such as we found in the present study (GODOI et al., 2004a; GODOI et al., 2004b;
Zamperlini et al., 2000). In accordance with those studies we also found high concentration
phenanthrene, fluoranthrene, benzopyrene an diabenzoanthracene, which are related to cell
death, apoptosis and DNA damage (PLISKOVA et al., 2005, ISKANDER et al., 2004,
ARIF , SMITH and GUPTA, 1999) .
Like other polycyclic aromatic hydrocarbons, certain metabolites of
benzo[a]anthracene have been implicated as potent carcinogens and these effects are
thought to be caused by the covalent binding of these species to nucleophilic groups on the
bases of DNA - adduct (ARIF, SMITH and GUPTA, 1999).
As biomarkers of response,
cytogenetic analysis determining chromosome aberrations or micronuclei has been widely
used
. Although, micronuclei and sister chromatid exchanges measured in peripheral white
blood cells are satisfactory biomarkers for PAHs exposure (BRANDT and WATSON,
2003) in the present study we could found a close association between high micronuclei
frequency in polen mother cells of Tradescantia pallida treated with different times and
concentrations of PAHs and collected at different tme point.
The micronucleus evaluation
in T. pallida is a sensitive bioassay for mutagenesis that may be employed both under field
141
and laboratory conditions. Previous study has demonstrated that air pollution mutagenicity
could be monitorized successfully by micronuclei in polen mother cells of T.pallida
(CARVALHO-OLIVEIRA et al., 2005). Increased frequency of micronuclei observed in
harvesting season seems to represent a potential mutagenicity coused by burning sugar cane
biomass.
Previous studies have demonstrated that air pollution is likely to increase the risk to
lung cancer. Emissions rich in PAHs have been considered an important risk factor to lung
cell carcinogenesis (VIENEIS and HUSGAFVEL-PURSIAINEN, 2005). In the present
study, we found high rates of cell death in lung carcinoma cell line treated with PAHs
isolated from TSP of sugar cane harvesting and non-harvesting period. The presence of
several components, including metals and polycyclic aromatic hydrocarbons, in the
pollutant of the air induces toxicity in the exposed cells resulting in increase of
concentration-dependent cellular apoptosis (HETLAND et al, 2004). Morover higher
bcl-2 protein expression was observed in high harvesting and non harvesting PAHs and in
24 and 48h of treatment, indicating, especially in harvesting particulate, that sugar cane
burning biomass triggers apoptosis signals. Our findings demonstrated a low expression of
p53 phosporylated in all treatment and at different times, may indicating a inhibition of
apoptosis p53-dependent pathway. Pifithrin-alpha, a synthetic inhibitor of p53 activity,
abolished both S-phase arrest and apoptosis induced by genotoxic PAHs (PLISKOVA et
al., 2005). Modulation of programmed cell death (apoptosis) by different heavy metals
seems, at least in part, to determine the lymphocyte immunotoxicity. Normally, the cells
with sufficient genomic damage show increased p53-dependent apoptosis which prevents
possible malignant transformation and tumor growth. Some heavy metal ions, e.g. Cu (II)
and Cr (VI) may enhance apoptosis of lymphoid cells. By contrast, zinc and cadmium ions
142
are shown to inhibit apoptosis in vitro. Suppression of apoptosis may prevent natural
elimination of genetically altered cells, thus conserving DNA mutations and promoting
carcinogenic effects in affected cell populations (Chukhlovin et al., 2001).
We can conclude that PAHs present in harvesting and in non-harvesting induces
DNA damage, high cytotoxicity and apoptosis signals, indicating that sugar cane burning
biomass could be deleterious to the health of the population exposed.
Acknowledgments
The authors are thankful to FAPESP and CNP by financial support, allowing the
performance of this study.
143
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