ads:
UNIVERSIDADE METODISTA DE PIRACICABA - UNIMEP
FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE - FACIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA
A estimulação elétrica na expressão gênica do myoD, miostatina e
atrogina-1 do músculo gastrocnêmio desnervado de ratos
Silvana Coca Lima
2007
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
10
SILVANA COCA LIMA
A ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA NA EXPRESSÃO
GÊNICA DO MYOD, MIOSTATINA E
ATROGINA-1 DO MÚSCULO GASTROCNÊMIO
DESNERVADO DE RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Fisioterapia da Universidade
Metodista de Piracicaba, para obtenção do Título de
Mestre em Fisioterapia. Área de Concentração:
Intervenção Fisioterapêutica. Linha de Pesquisa:
Intervenção Fisioterapêutica no Sistema
Neuromuscular.
Orientadora: Profª. Drª. Viviane Balisardo Minamoto.
PIRACICABA
2007
ads:
11
Ficha Catalográfica
Lima, Silvana Coca.
A estimulação elétrica na expressão gênica do myoD, miostatina e
atrogina-1 do músculo gastrocnêmio desnervado de ratos. Piracicaba,
2007.
55 p.
Orientadora: Profª. Drª. Viviane Balisardo Minamoto.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em
Fisioterapia, Universidade Metodista de Piracicaba.
1.Músculo esquelético 2. Desnervação 3. Expressão gênica I.
Minamoto, Viviane Balisardo. II. Universidade Metodista de Piracicaba,
Programa de Pós- Graduação em Fisioterapia. III Título.
12
Os membros da Banca Examinadora da Defesa de Dissertação de Mestrado de
SILVANA COCA LIMA apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Fisioterapia, em Sessão Pública realizada no 07 de fevereiro de 2007,
consideraram o(a) candidato(a) aprovado(a).
BANCA EXAMINADORA:
Profa. Dra. Viviane Balisardo Minamoto - UNIMEP
Profa. Dra. Rosangela Verlengia UNIMEP
Profa. Dra. Maria Julia Marques - UNICAMP
13
Dedico este trabalho aos
melhores pais do mundo, os
meus: Veríssimo e Vertudes,
pelo apoio incondicional
sempre, pela paciência, amor e
pelo ensino diário.
14
Agradecimentos
A Deus, pelos inúmeros presentes que me dá a cada dia.
Aos meus pais, pela vida e por abrir as portas diante das oportunidades.
Aos meus queridos irmãos e cunhadas.
Aos meus sobrinhos lindos, Gú, Rafa e Vi, que nos enchem de alegria, barulho e
travessuras.
Aos meus amigos, de longe, de perto, de todas as horas.
À equipe de trabalho, que ajudou na realização dos experimentos, MUITO
OBRIGADA!!!
A todos amigos de mestrado, pela convivência neste período.
À minha orientadora Vivi, pelo conhecimento, confiança e oportunidades.
Aos professores do programa, por estarem sempre dispostos a ajudar e ensinar.
À Profª Drª Rosana, pelo trabalho conjunto e por nos “adotar” por alguns meses.
Ao Prof° Dr Rinaldo, pelo desenvolvimento de trabalhos paralelos.
Aos funcionários da Pós-graduação e laboratórios, em especial à Miriam, pela
disposição e prontidão.
À Profª Drª Tânia Salvini, pelo uso do Laboratório de Plasticidade Muscular da
Universidade Federal de São Carlos.
À Sabrina, pelo imenso auxílio dentro e fora do laboratório.
À Profª Drª Rozângela Verlengia e Profª Drª Maria Júlia Marques pelas sugestões
na redação final do trabalho.
À FAPESP (05/52720-0), FAP-UNIMEP (384-05) e CAPES/Prosup.
15
Epígrafe
“O futuro pertence àqueles que
acreditam na beleza dos seus
sonhos”
Eleanor Roosevelt
16
RESUMO
A lesão do nervo periférico implica em alteração na expressão de genes
específicos do músculo, como o myoD, atuante na ativação de células satélites, a
miostatina, potente reguladora da massa muscular e a atrogina-1, que participa da
degradação protéica. A estimulação elétrica (EE) é um recurso empregado na
prática clínica para tratamento de músculos desnervados. O objetivo do presente
estudo foi analisar se a estimulação elétrica fásica é capaz de minimizar a perda
de massa muscular e diminuir a expressão do myo-D, miostatina e atrogina-1 do
músculo gastrocnêmio (G) desnervado. Além disso, foi analisado se a freqüência
de aplicação (diária ou alternada) resulta em diferentes respostas das variáveis
analisadas. Para isso, 20 ratos Wistar (180 ± 20g) foram igualmente divididos em
grupos: controle (C); desnervado (D), desnervado + eletroestimulado diariamente
(EED) (5x/semana) e desnervado + eletroestimulado em dias alternados (EEA)
(3x/semana). Para procedimento de desnervação, EE e coleta do músculo os
animais foram profundamente anestesiados. A desnervação foi realizada por
esmagamento do nervo isquiático, e após 24 horas iniciou-se a EE utilizando o
aparelho DUALPEX 961 – Quark (corrente bifásica, quadrática, simétrica, T=3ms,
f=10Hz e i=5mA, aumentando 1mA a cada 5min, t=30min). Após 10 dias de EE, o
músculo G foi dissecado, pesado e a porção distal da cabeça medial, mantida em
freezer a -70º C. A quantificação de mRNA do myoD, miostatina e atrogina-1 foi
realizada por amplificação por reação em cadeia de polimerase (PCR) em tempo
real. Para análise estatística utilizou-se o teste Shapiro-Wilk, seguido pela One–
way (ANOVA) e teste de Tukey (α= 5%). Os resultados do presente estudo
mostraram que a massa muscular relativa nos grupos tratados com EE não
diferiram do grupo desnervado (D: 0.159 ± 0.012%; EED: 0.146 ± 0.013%; EEA:
0.152 ± 0.023%, p>0.05). Houve aumento da expressão do myoD nos grupos
eletroestimulados quando comparados ao D (D:18 vezes, EED: 23 vezes, EEA:
27 vezes, p<0.05). A expressão da miostatina nos grupos eletroestimulados foi
maior que no grupo D (D: 2.5 vezes, EED: 4.2 vezes, EEA: 5.6 vezes, p<0.05).
Observou-se grande aumento na expressão da atrogina-1 nos grupos
desnervados quando comparados ao grupo C, e que a EE aplicada diariamente
foi capaz de diminuir a expressão da atrogina-1 (D: 81 vezes; EED: 68 vezes,
EEA: 97 vezes, p<0.05). Diferente dos resultados esperados, a EE aumentou a
transcrição dos genes do myoD, miostatina e atrogina-1 e não influenciou na
massa muscular de músculo desnervado. Conclui-se que a freqüência de
tratamento imposta ao músculo influencia na expressão de genes específicos do
músculo, uma vez que a aplicação de estimulação elétrica em dias alternados
resultou em maior nível de expressão dos genes da miostatina, myoD e atrogina-1
quando comparada com a estimulação aplicada diariamente. O tratamento diário
mostrou ser um protocolo mais efetivo do que o tratamento em dias alternados,
uma vez que o mesmo diminuiu a expressão da atrogina-1, gene relacionado com
a instalação da atrofia muscular.
Palavras chaves: músculo esquelético, denervação, estimulação elétrica,
expressão gênica.
17
ABSTRACT
Peripherical nerve injury causes alterations in the expression of specific muscle
genes as myoD, myostatin and atrogina-1, that are envolved in the satellite cells
activation, muscle mass regulation and protein degradation, respectively. Electrical
stimulation (ES) is used as a treatment form of denervated muscle. The aim of this
study was to analyse if phasic ES can minimize the decrease of muscle mass and
gene expression of myoD, myostatin and atrogin-1 of rat denervated
gastrocnemius muscle (GM). Besides, the treatment frequency was analysed,
comparing the use of daily and alternated ES. Twenty Wistar rats (180 ± 20g)
were equally divided into groups: control (C), denervated (D), denervated + daily
electrical stimulation (DES; 5x/ week) and denervated + alternated electrical
stimulation (AES; 3x/week). For procedures of denervation, electrical stimulation
and muscle colection the animals were deeply anesthetized. Denervation was
performed by sciatic nerve crush, and ES began 24 hour later using a DUALPEX
961 – Quark (symmetrical biphasic quadratic impulse, T=3ms, f=10Hz, i=5mA,
increasing 1mA each 5 min, t=30min). After 10 days of ES, the distal region of
medial GM was dissected, weighted and kept in freezer at –70° C. mRNA
quantification of myoD, myostatin and atrogin-1 was done by polimerase chain
reaction (PCR) amplification in real time. Shapiro-Wilk test, followed by ANOVA
One-way with Tukey test (α= 5%) were used to compare the results. The results of
this study showed that relative muscle mass of ES groups did not differ of D group
(D: 0.159 ± 0.012%; DES: 0.146 ± 0.013%; AES: 0.152 ± 0.023%, p>0.05). MyoD
expression was increased in ES groups when compared to D (D: 18 folds, DES:
23 folds, AES: 27 folds, p<0.05). Myostatin expression was higher on ES groups
when compared to D (D: 2.5 folds, DES: 4.2 folds, AES: 5.6 folds, p<0.05).
Atrogin-1 expression was increased on denervated groups when compared to C
and ES daily applied was able to decrease atrogin-1 expression (D: 81 folds; DES:
68 folds, AES: 97 folds, p<0.05). Different of expected results, it was observed that
ES increased gene transcription of myoD, myostatin and atrogina-1 and did not
influence the muscle mass of denervated muscle. We concluded that treatment
frequency imposed to muscle is related to muscle specific gene expression, once
ES applied on alternated days resulted higher level of expression of myostatin,
myoD and atrogina-1 when compared to daily ES. Daily ES showed to be a more
effective treatment protocol than alternated ES as it decreased the expression of
atrogina-1, gene closed related to muscle atrophy.
Key words: skeletal muscle, denervation, electric stimulation, gene expression.
18
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 9
2 REVISÃO DA LITERATURA 11
2.1
Músculo esquelético e expressão gênica 11
2.1.1 MyoD
2.1.2 Miostatina
2.1.3 Atrogina-1
11
14
20
2.2 Alteração da atividade neuro-muscular e expressão gênica 22
3OBJETIVO 26
4 MATERIAL E MÉTODOS 27
4.1 Animais e grupos experimentais 27
4.2 Protocolo para desnervação por esmagamento do nervo
isquiático
27
4.3 Protocolo para estimulação elétrica 28
4.4 Procedimento para coleta do músculo
4.5 Extração de RNA total
4.6 Transcrição Reversa (RT)
4.7 Primers
4.8 PCR em tempo real
4.9 Análise estadística
30
30
31
31
32
33
5 RESULTADOS 34
19
5.1 Massa muscular 34
5.2 Expressão gênica da miostatina 35
5.3 Expressão gênica da atrogina-1 36
5.4 Expressão gênica da miostatina 37
6 DISCUSSÃO 38
7 CONCLUSÃO 47
REFERÊNCIAS 48
9
1 INTRODUÇÃO
Quando um músculo perde sua inervação, ele deixa de receber
estímulos para contração, necessários para manutenção de suas funções. A
resposta do músculo à desnervação compreende degeneração das fibras
musculares, alteração no balanço entre síntese e degradação protéica, resultando
em atrofia (Eberstein e Eberstein, 1996), proliferação do tecido conjuntivo
intramuscular (Salonen et al., 1985), assim como diminuição ou perda da
capacidade de gerar força (Dow et al., 2006).
A desnervação também promove aumento na expressão de genes
específicos do músculo, como o myoD, miostatina e atrogina-1 (Wing, Haas e
Goldberg, 1995; Ishido, Kami e Masuhara, 2004; Zhang et al., 2005). O myoD
está relacionado ao desenvolvimento e regeneração do músculo esquelético,
atuando na proliferação e diferenciação das células musculares na fase
embrionária e regenerativa (Tapscott, 2005). Já a miostatina, responsável pelo
trofismo muscular, é considerada um potente regulador negativo da massa
muscular (McPherron, Lawler e Lee, 1997). A atrogina-1, presente em casos de
atrofia muscular de diversas origens, tem importante função na degradação de
proteínas, influenciando no balanço entre síntese e degradação protéica (Lecker
et al., 2004).
A estimulação elétrica é um recurso usado por profissionais da
fisioterapia como tratamento de músculos com diminuição e/ou ausência da
atividade contrátil. Apesar da estimulação elétrica crônica (aplicada por período
superior à 6h/dia, normalmente por eletrodos implantados no músculo) ser
comumente estudada após lesão nervosa, pouco se sabe sobre os efeitos da
10
estimulação elétrica fásica (aplicada apenas por alguns minutos/dia, e utilizando-
se de eletrodos de superfície), freqüentemente utilizada na clínica. Assim, o
conhecimento dos efeitos celulares e moleculares decorrente da aplicação desse
recurso poderá ajudar o profissional de reabilitação no esclarecimento da ação da
estimulação elétrica no músculo desnervado.
O presente trabalho teve como objetivo investigar se a estimulação
elétrica fásica é capaz de minimizar a diminuição de massa muscular decorrente
da desnervação, assim como reduzir a transcrição dos genes do myoD,
miostatina e atrogina-1, conhecidos por terem seus níveis elevados após
interrupção da atividade elétrica. Adicionalmente, foi analisado se a freqüência em
que o tratamento é realizado (diariamente ou em dias alternados) interfere nas
variáveis estudadas, a fim de proporcionar subsídios para escolha de parâmetros
da estimulação elétrica no tratamento de músculos desnervados.
11
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Músculo esquelético e expressão gênica
O músculo esquelético é um dos melhores exemplos de tecido que
possui habilidade de adaptação diante de diferentes estímulos impostos. Tal
processo envolve mudanças quantitativa e qualitativa na expressão de genes
específicos do músculo (Goldspink, 2002). A alteração do sinal elétrico regula a
transcrição de alguns genes musculares como o myoD, relacionada com o
desenvolvimento e regeneração (Eftimie, Brenner e Buonanno, 1991; Ishido, Kami
e Masuhara, 2004), a miostatina, reguladora do trofismo (Zhang et al., 2005) e a
atrogina-1, envolvida com a degradação protéica (Wing, Haas e Goldberg, 1995;
Bodine et al., 2001).
2.1.1 MyoD
Os fatores regulatórios miogênicos (MRF, myogenic regulatory factors)
são fatores de transcrição específicos do músculo que, quando expressos, são
capazes de transformar células indiferenciadas em células musculares (Tapscott,
2005). São também chamados de família myoD, e tem como membros a
miogenina, o myoD (myogenic differentiation), o myf-5 (myogenic factor 5) e o
MRF4 (myogenic regulatory factor 4). Em 1987, Davis, Weintraub e Lassar
identificaram e isolaram o primeiro fator miogênico, o qual denominaram myoD.
Os outros três fatores (miogenina, myf-5 e MRF4) foram descritos posteriormente
(Edmonson e Olson, 1989; Wright, Sassoon e Lin, 1989; Braun et al., 1989;
Rhodes e Konieczny, 1989). Segundo Weintraub et al. (1991), uma variedade de
12
células pode ser convertida em mioblastos pela ação do myoD, como fibroblastos,
células adiposas, neuroblastos, hepatócitos, condrócitos, entre outras.
A estrutura dos membros da família myoD é semelhante, com duas
regiões funcionais, um domínio básico que medeia a ligação entre o fator
miogênico e uma região específica do DNA, conhecida como E-box (CANNTG), e
um domínio hélice-alça-hélice (HLH, hélix-loop-helix) necessário para
heterodimerização, ou seja, a combinação dos membros da família myoD com
outras proteínas diferentes. Por esse motivo, tais proteínas são também
conhecidas como proteínas básicas HLH (Carlsen e Gundersen, 2000).
Durante a formação do músculo esquelético ocorre uma série de
eventos como determinação, diferenciação e maturação das células musculares.
O mioblasto é a célula precursora muscular, de origem mesodérmica, que por um
conjunto de alterações moleculares, celulares e morfológicas, forma uma
complexa rede molecular que atua na formação da fibra do músculo esquelético
(Ludolph, 1995; Chargé e Rudnicki, 2004). Estudos referentes aos MRFs
demonstram que a expressão desses genes é diferente espacial e temporalmente
durante a miogênese. O myoD e myf-5, também denominados fatores primários,
são expressas na fase de determinação, onde ocorre o comprometimento das
células proliferativas dos somitos para a linhagem miogênica. A expressão do
myf-5 é observada no somito dorso-medial, que mais tarde dará origem à
musculatura intercostal e do tronco, enquanto que o myoD é expressa no somito
dorso-lateral, que posteriormente formará os músculos da parede corporal e dos
membros. A expressão do myoD e myf-5 é o passo chave que resulta no
comprometimento das células do somitos para a linhagem muscular, uma vez que
13
na ausência de ambos os genes não há formação de mioblastos, e
conseqüentemente, da musculatura esquelética (Berkes e Tapscott, 2005).
As células comprometidas, os mioblastos, podem proliferar-se,
diferenciar-se em miócitos e fundir-se, formando miotubos, e após maturação,
miofibras multinucleadas. A miogenina e o MRF4 aparecem nessa etapa
secundária, de diferenciação (Arnold e Braun, 2000). Após esses eventos, genes
específicos do músculo começam ser expressos, como a cadeia pesada de
miosina (MHC, myosin heavy chain).
Vários são os fatores que regulam a expressão do myoD, como
hormônios (Hughes et al., 1993; Kraus e Pete, 1997), inervação (Eftimie, Brenner
e Buonanno, 1991; Hughes et al., 1993), desnervação (Sakuma et al.,1999;
Walters, Stickland e Loughna, 2000; Hyat et al., 2003; Ishido, Kami e Masuhara,
2004), imobilização (Loughna e Brownson, 1996) e sobrecarga mecânica
(Sakuma et al., 1999).
Além de ter importante papel no desenvolvimento, o myoD também é
fundamental na regeneração do músculo esquelético. Após lesão, o processo de
regeneração muscular tem início com a ativação das células satélites, que são
células indiferenciadas situadas entre a lâmina basal e o sarcolema de fibras
maduras, e que em condições normais permanecem em estado qüiescente
(Schultz e McCormick, 1994). Elas são ativadas em situações onde há a
necessidade de novos mioblastos para crescimento ou regeneração muscular, ou
seja, após traumas, exercícios excessivos (principalmente excêntrico), exposição
à substância tóxica, estiramento, desnervação, doenças degenerativas, entre
outros (Lieber, 2002). Uma vez ativadas, o processo de proliferação e
diferenciação das células satélites é semelhante ao das células musculares no
14
desenvolvimento embrionário, e os MRFs têm função igualmente importante
(Chargé e Rudnicki, 2004). O myoD, assim como a miogenina, está localizado no
núcleo da célula. Eles são conhecidos como marcadores do crescimento
muscular e hipertrofia, pois modulam a divisão das células satélites e sua
incorporação como novo núcleo dentro da fibra adulta (Hyatt et al., 2003).
O papel que os MRFs exercem no músculo esquelético na fase
embrionária é bem estabelecido, porém ainda não estão totalmente esclarecidas
suas funções na fase pós-natal. Os MRFs (principalmente o myoD e a miogenina)
têm sido apontados como responsáveis por influenciar o fenótipo do músculo
esquelético na fase pós-natal (Flück e Hoppeler, 2003). Há evidências que o
padrão de expressão e nível de proteína dos MRFs diferem entre músculos de
diferentes fenótipos, sendo o myoD expresso predominantemente em fibras de
contração rápida, enquanto a miogenina, em fibras de contração lenta (Voytik et
al., 1993; Sakuma et al., 1999).
Em situações de desnervação, a expressão desses genes é
semelhante à de músculos normais, ou seja, maior expressão do myoD em
músculos com predomínio de fibras rápidas e maior expressão da miogenina em
músculos com predomínio de fibras lentas (Walters, Stickland e Loughna (2000).
2.1.2 Miostatina
A super família de fatores de crescimento transformantes beta (TGF-β,
tranforming growth factor beta) é formada por grande número de fatores de
crescimento e diferenciação e tem importante papel na regulação do
desenvolvimento embrionário e manutenção da homeostase de diversos tecidos
(Thomas et al., 2000).
15
A miostatina ou fator do crescimento e diferenciação 8 (GDF-8, growth
and differentiation factor 8) é um dos membros da super família TGF- β, e tem
sido estudada devido à sua relevante função na regulação da massa muscular
esquelética. Esse fator foi descrito pela primeira vez por McPherron, Lawler e Lee
(1997), quando os autores estudaram animais com ausência de GDF-8 e
observaram aumento de 2 a 3 vezes na massa muscular esquelética quando
comparados a animais normais. Esses resultados mostraram que a miostatina
atua especificamente como regulador negativo do crescimento do músculo
esquelético. Tal aumento na massa muscular parecia ser resultado da
combinação de hipertrofia e hiperplasia muscular, e era independente de sexo ou
idade do animal.
A formação do músculo esquelético é dependente de fatores positivos
e negativos de crescimento, e o balanço entre eles resulta na quantidade ideal de
tecido muscular a ser formado. Os MRFs são fatores considerados positivos,
atuam nos processos de determinação e diferenciação muscular e são capazes
de transformar células indiferenciadas em mioblastos, originando assim as fibras
musculares (Weintraub et al., 1991).
Já a miostatina é considerada um fator negativo, pois diminui a
expressão dos reguladores miogênicos myoD, myf-5 e miogenina. Há evidências
que a miostatina é capaz de inibir a miogênese por sua ação na proliferação
(Thomas et al., 2000) e diferenciação dos mioblastos (Rios et al., 2002; Langley et
al., 2002).
O fato da ausência da miostatina ser capaz de aumentar a massa
muscular por hipertrofia e hiperplasia sugere duas ações distintas: regulação do
número de fibras durante o desenvolvimento embrionário e regulação do
16
crescimento muscular na fase pós-natal (Lee, 2004). Thomas et al. (2000)
investigaram o papel da miostatina no controle da proliferação dos mioblastos em
cultura de células da linhagem C2C12 e concluíram que a miostatina inibe a
proliferação dos mesmos e ainda, que o efeito desta inibição é reversível, pois ao
retirá-la do meio de cultura observou-se desenvolvimento celular normal. Os
autores relataram ainda que a ação da miostatina é dose-dependente, pois
diferentes concentrações de miostatina aplicadas ao meio promoveram diferentes
respostas no desenvolvimento dos mioblastos.
Para determinar o efeito da miostatina na diferenciação dos mioblastos,
Langley et al. (2002) realizaram cultura celular com células da linhagem de
fibroblastos C2C12 em meio propício para diferenciação, no qual variadas
concentrações de miostatina foram avaliadas. Após três dias de incubação nesse
meio, as células que receberam altas doses de miostatina não mostraram
formação de miotubos, nem expressão de MHC. O tratamento com baixas
concentrações de miostatina apresentou formação de alguns miotubos, e as
células-controle, não tratadas com miostatina, apresentaram extensa formação de
miotubos multinucleados, positivos para expressão de MHC. Esses resultados
mostram que a miostatina inibe a diferenciação de mioblastos promovido pelo
myoD na linhagem C2C12, e, como no processo de proliferação, a inibição é
dose-dependente.
Ambos os estudos citados anteriormente também avaliaram os efeitos
da miostatina em mioblastos fetais bovinos e mostraram que a ação na
proliferação e diferenciação não é restrita apenas para células C2C12 in vitro,
pois os mesmos efeitos foram verificados em células oriundas de animais
(Thomas et al., 2000; Langley et al., 2002).
17
Já no músculo adulto, a ação da miostatina parece ser via células
satélites. O fato da ausência da miostatina causar aumento no tamanho da fibra
sugere que sua ação ocorre por bloqueio da diferenciação e/ou proliferação das
células satélites, processo semelhante ao observado na formação do músculo no
período embrionário. Uma possível hipótese é que a função da miostatina em
animais adultos é manter as células satélites em estado qüiescente, e em
circunstâncias de crescimento e regeneração, a atividade da miostatina é inibida,
permitindo que as células satélites sejam ativadas (McCroskery et al., 2003).
A ausência de miostatina na fase embrionária resulta em fenótipo de
músculo mais rápido e glicolítico, independente do músculo ter característica
rápida ou lenta, sendo observado maior proporção de isoformas rápida de cadeia
pesada de miosina (MHC) em animais mutantes quando comparados com
normais. Em animais adultos, a inibição da miostatina parece não causar
transformação do músculo para um fenótipo mais rápido e glicolítico. Isso sugere
que a miostatina tem um papel crítico em regular a formação, proliferação e
diferenciação de mioblastos fetais e fibras pós-natal (Girgenrath, Song e
Whittemore, 2005).
A miostatina é expressa quase que exclusivamente no tecido muscular,
embora níveis de mRNA da miostatina também foram detectados no tecido
adiposo (Dominique, 2006). Em estudo prévio, Lee e McPherron (2001),
analisaram a ação da miostatina em animais idosos e verificaram que, além de ter
ação no tecido muscular, a miostatina interfere no metabolismo de gordura e
função dos adipócitos, mesmo em condições normais de temperatura e ingesta
alimentar. Ratos com diminuição da atividade da miostatina tiveram redução
significativa na massa de gordura, mais pronunciada com o aumento da idade.
18
Esses autores ainda demonstraram que a diminuição da atividade da miostatina
tem efeito metabólico benéfico em dois modelos de ratos mutantes, para diabetes
tipo II e obesidade. Os resultados encontrados concluíram que a diminuição da
atividade da miostatina pode suprimir parcialmente o acúmulo de gordura e o
desenvolvimento de hiperglicemia nesses animais transgênicos. Embora o
mecanismo pelo qual a miostatina regula o metabolismo de gordura,
principalmente em humanos, não esteja claro, esses resultados levantam a
possibilidade de que inibidores de miostatina podem ser usados para tratamento
ou prevenção de distúrbios metabólicos, como obesidade e diabetes tipo II.
O conhecimento da função da miostatina tem levantado muitas
questões importantes sobre o controle do crescimento muscular, não só em
relação ao tamanho do tecido muscular em geral, mas também para o
desenvolvimento de novas estratégias para aplicações terapêuticas e para
criação de animais (Lee, 2004).
Mutações na seqüência codificada pelo gene da miostatina foram
encontradas em algumas raças de bovinos (Belgian Blue, Asturiana, Limousine,
Piamontesa, entre outras) conhecidas pelo fenótipo de hipertrofia exacerbada da
massa muscular esquelética. Animais dessas raças representam grande
significância econômica, já que apresentam aumento de aproximadamente 50%
na massa muscular quando comparados com animais sem mutação (Gonzalez-
Cadavid, 2004). O gene da miostatina foi também estudado em várias outras
espécies animais mostrando ter alta homologia, ou seja, a seqüência no domínio
C-terminal é idêntica entre humano, rato, porco, cachorro, galinha e peru.
Também foi identificado em espécies de peixe, porém a seqüência protéica difere
dos vertebrados (Matsakas, 2005).
19
Similar a outros membros da família TGF-β, a miostatina é sintetizada
como uma proteína precursora que, após processos proteolíticos, geram a
molécula ativa. Várias proteínas são conhecidas por sua capacidade de ligação e
inibição à miostatina, entre elas, a folistatina, gene relacionado à folistatina
(FLRG, follistatin like related gene) e propeptídeo. Assim, a análise do mRNA da
miostatina não reflete seguramente a quantidade de proteína funcional (Lee,
2004).
A folistatina é uma proteína que pode ligar-se não só a miostatina,
como também a outros membros da família TGF- β . Estudos sugerem que a
folistatina atua como antagonista da miostatina e tem importante papel na
modulação da atividade da miostatina in vivo. Estudos genéticos em ratos
mostram que o aumento da expressão da folistatina no músculo pode causar
grande aumento no crescimento muscular, podendo ser comparado a animais
nulos de miostatina (Lee e McPherron, 2001).
Devido a miostatina agir como reguladora negativa da massa muscular,
e sua inibição causar explícito aumento na musculatura esquelética e na força
muscular, existe grande interesse na manipulação desse gene em terapias em
casos de doenças crônicas e degenerativas que provocam perda de massa
muscular, como por exemplo, AIDS, caquexia, diabetes mellitus, esclerose, e no
próprio envelhecimento. Também não é surpresa que companhias farmacêuticas
desenvolvam estratégias para inibir a ação da miostatina e utilizá-la para melhora
da performance física nos esportes. O fato da miostatina e seus inibidores serem
expressos naturalmente pelo organismo dificulta a detecção de tal recurso como
doping (Matsakas, 2005).
20
2.1.3 Atrogina
Na célula, a quantidade de proteínas não é determinada apenas pela
síntese, mas também pela taxa de degradação, processo importante para
regulação celular. Algumas proteínas são rapidamente degradadas, enquanto
outras têm meia-vida longa, dependendo de sua função. Além disso, proteínas
danificadas ou que sofreram algum erro na fase de tradução são reconhecidas e
rapidamente degradadas, evitando assim intercorrências durante a síntese
protéica. Em células eucarióticas há duas vias principais que medeiam a
degradação de proteínas: a via ubiquitina-proteossomo e a via da proteólise
lisossomal (Cooper, 2002).
Os proteossomos são complexos protéicos que estão presentes em
grande número na célula e atuam em proteínas que foram marcadas para
degradação pela ubiquitina (Alberts et al., 1997). A ubiquitina é um peptídeo que
pode ser conjugado a substratos protéicos específicos, resultando numa reação
em cadeia: uma segunda ubiquitina é ligada à primeira e uma terceira, ligada à
segunda, e assim é construída uma cadeia de poliubiquitina no substrato protéico.
Essa proteína, marcada pela cadeia de poliubiquitina, é então transportada para o
proteossomo, onde acontece a proteólise, resultando em pequenos peptídeos
(Glass, 2003).
O processo de ubiquitinação ocorre por etapas: primeiro a ubiquitina é
ativada por uma enzima de ativação (E1), posteriormente ela é transferida a uma
segunda enzima, de conjugação (E2), e finalmente a transferência da ubiquitina
para a proteína alvo é mediada pela enzima E3, ou ubiquitina de ligação. As
ubiquitinas de ligação (E3) são quem oferecem especificidade ao substrato
(Cooper, 2002).
21
Figura 1 – Via ubiquitina-proteossomo. Diagrama que ilustra a família de
proteínas que compõe a via e suas interações. Ub, ubiquitina; E1-UBA, proteína
E1 ou ubiquitina de ativação; E2-UBC, proteína E2 ou ubiquitina de conjugação;
E3-UBL, proteína E3 ou ubiquitina de ligação (Fonte: Reid, 2005).
A atrogina-1, também conhecida como MAFbx (muscle atrophy F-box),
apresenta um domínio F-box, o qual caracteriza uma classe de proteínas
ubiquitina-ligase (E3), chamadas de complexo SCF (proteína Skp1, proteína Cal,
proteína Ring Fingers e proteína F-Box) (Deshaies, 1999). O domínio F-box
desempenha papel primordial na ligação da proteína que será ubiquitinada e
posteriormente degradada (Lecker, 2003).
Em casos de atrofia, a síntese de proteínas musculares está diminuída
e a taxa de degradação, elevada consideravelmente, levando ao acelerado
processo de perda de proteína muscular. A via de degradação da ubiquitina-
proteossomo é ativada quando há atrofia decorrente das mais diversas origens,
como câncer (Llovera et al.,1994; Baracos et al., 1995), insuficiência renal crônica
(Lecker et al., 2004), imobilização (Taillandier et al., 1996; Bodine et al., 2001),
desnervação (Medina, Wing e Goldberg, 1995; Bodine et al., 2001), diabetes
(Price et al., 1996), tratamento com corticóides (Auclair et al., 1997), ausência de
22
descarga de peso no membro posterior (Bodine et al., 2001). Em todos esses
casos foi observada atrofia muscular resultante de processo semelhante de
degradação protéica (Lecker et al., 1999).
2.2 Alteração da atividade neuro-muscular e expressão gênica
A atividade elétrica é o primeiro estímulo neural a regular massa
muscular, a expressão dos MRFs e a atividade celular no músculo esquelético
(Hyatt et al., 2003). Mudanças na expressão do myoD e miogenina foram
observadas em várias situações experimentais onde a interação entre nervo e
músculo encontra-se alterada, como desnervação, reinervação e paralisia
induzida por toxina. Isso sugere que a atividade elétrica pode afetar seletivamente
os níveis de mRNA do myoD (Witzemann e Sakmann, 1991).
Com intuito de verificar a influência da inervação na expressão da
miogenina e myoD, Eftmie, Brenner e Buonanno (1991) realizaram estudo do
músculo sóleo de ratos após secção do nervo ciático e aplicação de estimulação
elétrica crônica por eletrodos implantados no músculo. Os resultados encontrados
no grupo desnervado mostrou aumento de aproximadamente 40 vezes para a
miogenina e 15 vezes para o myoD, sendo esses aumentos observados após 8 e
16 horas pós-desnervação, respectivamente. Com a aplicação da estimulação
elétrica crônica muscular, os autores observaram brusca diminuição nos níveis
dos transcritos. Os níveis de mRNA encontrados nos músculos desnervados e
eletricamente estimulados foram 23% para a miogenina e 33% para o myoD,
quando considerado 100% nos músculos apenas desnervados. Concluiu-se,
então, que a atividade elétrica pode regular os níveis de mRNA da miogenina e
myoD após desnervação.
23
Para saber se curtos períodos de estimulação elétrica também afetam
a expressão do myoD após desnervação, foi realizada a secção do nervo
isquiático e posteriormente aplicada estimulação elétrica no músculo tibial anterior
de ratos. Os resultados encontrados após 28 dias de tratamento com estimulação
elétrica fásica foram semelhantes aos do estudo anteriormente citado, ou seja,
diminuição nos níveis de mRNA do myoD (Russo et al., 2007).
Para estudar a ação da miostatina em músculos submetidos à
diferentes cargas, Wehling, Cai e Tidball (2000), realizaram experimento e
avaliaram os músculos sóleo e plantar de ratos em três diferentes situações: (1)
10 dias sem carga; (2) 10 dias sem carga, seguidos de 4 dias de retorno às
atividades normais, e (3) 10 dias sem carga, sendo que, durante esse período, os
animais eram submetidos a exercícios 30 minutos/dia. Os resultados obtidos
foram que, no grupo somente submetidos à ausência de carga houve aumento
significativo (110%) do mRNA da miostatina. Quatro dias de retorno às atividades
foram suficientes para que esses valores retornassem aos níveis controles, e que
exercícios diários durante o período sem carga foram suficientes para não causar
mudanças na expressão da miostatina. Os autores observaram que há mais
mRNA e proteína da miostatina em músculos de contração rápida (plantar) do que
em de contração lenta (sóleo), e maior concentração de miostatina na junção
miotendínea quando comparado com o ventre muscular.
A modificação na expressão de mRNA da miostatina causada por
diferentes cargas impostas ao músculo estão de acordo com a função
previamente encontrada da miostatina, de ser reguladora negativa da massa
muscular.
24
A desnervação é outra situação capaz de aumentar a quantidade de
mRNA e proteína da miostatina. Zhang et al. (2005) avaliaram os níveis de mRNA
e proteína da miostatina no músculo gastrocnêmio após neurotmese do nervo
isquiático e encontraram grande aumento de mRNA no estágio inicial (1 a 7 dias),
com contínua elevação nesses níveis até o 28º dia e leve diminuição após 56 dias
de desnervação, ainda assim, com valor maior que no grupo controle.
Para o estudo da relação da atrogina-1 com a atrofia muscular, o
músculo gastrocnêmio foi analisado em quatro condições de acometimento
muscular: jejum, diabetes mellitus, insuficiência renal e câncer, e em todas as
condições observou-se diminuição do peso muscular (13-29%) e taxa de
degradação protéica de 40 a 63% maior que em músculos normais. Os níveis de
mRNA da atrogina-1 apresentaram-se elevados em todas as condições
analisadas, mostrando a íntima relação desta proteína com a atrofia muscular
(Lecker et al., 2004).
Em outro experimento, com três diferentes modelos de desuso:
desnervação, imobilização e ausência de peso no membro posterior, Bodine et al.
(2001), identificaram 72 genes após desnervação e imobilização, porém após
ausência de peso no membro posterior tais genes não eram expressos.
Entretanto, dois genes, a atrogina-1 e a MuRF1 (Muscle Ring Finger 1), tiveram
seus níveis elevados nos três casos. Além disso, os autores estudaram animais
mutantes, nulos de atrogina-1 (MAFbx
-/-
), que foram sujeitos à desnervação.
Após 14 dias, esses animais apresentaram menor atrofia muscular e manutenção
da área de secção transversa das fibras musculares quando comparados a
animais normais.
25
Sabe-se que em músculos desnervados há aumento da ubiquitina
conjugada à proteína e mRNA da ubiquitina (Medina, Wing e Goldberg, 1995), e
que o aumento na ubiquitina conjugada à proteína após desnervação era
concomitante ao aumento da proteólise (Wing, Haas e Goldberg, 1995).
Em recente estudo, Russo et al. (2007) aplicaram estimulação elétrica
fásica de baixa freqüência em músculo desnervado de rato e constataram
diminuição da expressão da atrogina-1. Esse resultado sugere que o tratamento
com estimulação elétrica, amplamente usado na fisioterapia é efetivo em
minimizar a degradação de proteínas musculares em casos de desnervação.
Contudo, este foi o único estudo encontrado que avaliou a aplicação da
estimulação elétrica fásica por eletrodos percutâneos em músculo desnervado.
26
3 OBJETIVO
A expressão de alguns genes musculares, tais como o myoD, atrogina-
1 e miostatina é regulada pelo impulso elétrico transmitido pelo nervo. Deste
modo, a lesão do nervo periférico acarreta aumento da expressão desses genes,
o que resulta em alterações musculares. Com o objetivo de fornecer estímulo ao
músculo desnervado, a estimulação elétrica é um recurso utilizado pela
fisioterapia, embora sejam raros os trabalhos que analisaram os efeitos deste
recurso na expressão gênica e massa muscular de músculos desnervados.
Frente ao exposto, os objetivos do presente estudo foram:
• Verificar se um curto período de desnervação muscular (10 dias) provoca
aumento do mRNA do myoD, miostatina e atrogina-1 e diminuição da
massa muscular
• Analisar se a estimulação elétrica fásica é capaz de diminuir a expressão
do myo-D, miostatina e atrogina-1 de músculos desnervados
• Analisar se a estimulação elétrica fásica é capaz de aumentar a massa
muscular de músculo desnervado
• Analisar se a expressão gênica e o aumento da massa muscular são
dependentes da freqüência de tratamento. Para tanto, serão comparados
os resultados obtidos com a estimulação elétrica aplicada diariamente e em
dias alternados.
27
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais e grupos experimentais
Foram utilizados 20 ratos Wistar, pesando 180 ± 20g, mantidos no
biotério central da Universidade Metodista de Piracicaba – UNIMEP, em
condições controladas de biotério com ciclo claro-escuro de 12 horas, sob
temperatura de 23 ± 2 ºC. O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da
Universidade Federal de São Carlos. Os animais foram divididos aleatoriamente
em 4 grupos: grupo desnervação (D) (n=5): animais submetidos à lesão do nervo
isquiático; grupo desnervação + eletroestimulação diária (EED) (n=5): animais
submetidos à desnervação e estimulação elétrica diariamente; grupo desnervação
+ eletroestimulação alternada (EEA) (n=5): animais submetidos à desnervação e
estimulação elétrica em dias alternados; grupo controle (C) (n=5): animais sem
desnervação e sem eletroestimulação.
Para os procedimentos de desnervação, estimulação elétrica e coleta
dos músculos, os animais foram anestesiados com injeção intramuscular de
cloridrato de ketamina (50mg/mL) e cloridrato de tiazina (2g/100mL), na proporção
de 1:1, em dose de 0.1 mL/100g de peso corporal. Todos os animais foram
sacrificados após 12 dias do protocolo de desnervação por deslocamento cervical.
4.2 Protocolo para desnervação por esmagamento do nervo isquiático
Os animais, posicionados em decúbito ventral, foram submetidos à
tricotomia da região glútea esquerda, onde foi realizada incisão de 15 mm,
acompanhando o trajeto do nervo isquiático. Os planos musculares foram
afastados para visualização e exposição do nervo. O esmagamento foi realizado
com pinça hemostática, sendo feitos 4 pinçamentos, com duração de 20
28
segundos e intervalos de 1 segundo, sendo que a pressão de pinçamento foi
padronizada para todos animais, utilizando-se como referência o segundo dente
da pinça (Fernandes et al., 2005) (Figura 2). Após esse procedimento, os planos
muscular e cutâneo foram suturados com fio de algodão 6-0 (ETHICON).
Figura 2 – Procedimento de desnervação por esmagamento do nervo isquiático
de rato. A: exposição do nervo; B: esmagamento com pinça hemostática; C:
visualização do nervo esmagado.
4.3 Protocolo para estimulação elétrica
Os animais foram submetidos ao protocolo de estimulação elétrica do
músculo gastrocnêmio esquerdo, que teve início 24 horas após a desnervação.
B
C
AB
C
29
A corrente elétrica foi gerada pelo equipamento DUALPEX 961 –
QUARK com os seguintes parâmetros: forma de pulso quadrática bifásica
simétrica, 3 ms de duração da fase, freqüência de 10 Hz e intensidade inicial de 5
mA, padronizada a partir da visualização de contração vigorosa do músculo,
sendo acrescida de 1 mA a cada 5 minutos para evitar acomodação da contração
muscular. A duração da sessão de estimulação elétrica foi de 30 minutos. As
regiões inguinal e posterior da pata esquerda de cada animal foram
tricotomizadas, e 2 eletrodos percutâneos auto-adesivos, com 1 cm
2
de área,
foram posicionados para a estimulação (Figura 3). Foi utilizado gel hidrossolúvel
como agente de acoplamento e não houve estimulação elétrica aos sábados e
domingos em nenhum grupo.
Figura 3 – Procedimento para estimulação elétrica do
músculo gastrocnêmio de rato. Observe o posicionamento
dos eletrodos na região inguinal e sobre o músculo
gastrocnêmio. 1 - posicionamento do eletrodo na região
inguinal; 2 – posicionamento do eletrodo sobre o músculo
gastrocnêmio.
1
2
30
4.4 Procedimento para coleta do músculo
Após 10 dias de estimulação elétrica, o músculo gastrocnêmio
esquerdo de cada animal foi retirado, pesado, a porção distal da cabeça medial
do músculo foi congelada em nitrogênio líquido e posteriormente armazenada em
freezer a –70°C.
4.5 Extração de RNA total
Para extração do RNA total, a parte distal do músculo gastrocnêmio foi
submetido à homogeneização com 1 mL do reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad,
CA). Após homogeneização, foi acrescentado 0,2 mL de clorofórmio às amostras,
misturado por inversão e incubado por 3 min em temperatura ambiente (15-30°C).
Posteriormente, as amostras foram centrifugadas por 15 min, 12.000 rpm
(centrífuga refrigerada 5417-R, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). A fase aquosa,
contendo o RNA foi coletada e transferida para outro tubo autoclavado,
adicionado 0,5 µL de ácool isopropílico e agitado. A mistura foi mantida em
temperatura ambiente por 10 min visando à precipitação do RNA.
Ao final do período de precipitação, as amostras foram centrifugadas
por 10 min à 12.000 rpm. Em seguida foi realizada a lavagem do RNA precipitado
com 1 mL de etanol (75%, diluído em água DEPC – diethyl pytocarbonate 97%).
Após breve agitação, as amostras foram centrifugadas por 5 min à 7.500 rpm, o
álcool foi removido (sobrenadante), o RNA foi seco ao ar livre e posteriormente foi
resuspendido em 30 µL de tampão TE pH 7.6 (TRIS HCL/EDTA).
A densidade óptica das amostras foi determinada por
espectrofotometria, nos comprimentos de onda de 260 nm e 280 nm. Para avaliar
31
a qualidade do RNA isolado foi determinada a razão entre as absorbâncias a 260
e 280 nm (razão ≥ 1.8).
Além disso, a qualidade do material foi também avaliada por
eletroforese das amostras (25 µg de RNA total) em gel desnaturante de agarose-
formamida (1%), em tampão MOPS (40 mM de ácido morfolinopropanosulfônico)
1x a uma voltagem de 90mV. Posteriormente, os géis foram corados com brometo
de etídeo (Invitrogen, Carlsbad, CA) e fotodocumentadas digitalmente utilizando
câmara “Kodak Digital Science” e o software “Kodak Digital Science 1D”.
4.6 Transcrição Reversa (RT)
Após o procedimento de isolamento do RNA total, foram realizadas
transcrições reversas (RT) para síntese de DNA complementar (cDNA). Para
cada amostra foi utilizado 1µg de RNA total, 1µL de oligo dT e 9,5 µL de H
2
O
MilliQ autoclavada. Incubou-se por 10 min a 70°C e em seguida os tubos foram
reservados em gelo para adição do mix contendo 4µL de 5x Buffer, 1µL de dNTP
mix (Promega, Madison, WI), 2µL de 0,1 M DTT, 0,5µL de enzima RT (Promega,
Madison, WI) e incubadas por 60 minutos a 42ºC e 10 minutos a 94ºC.
A integridade do produto da RT (cDNAs) foi conferida por realização de
gel de agarose (1%) não denaturante, corado com brometo de etídeo.
4.7 Primers
Os oligonucleotídeos, que foram utilizados como primers, para as
reações de polimerase em cadeia, estão descritos na Tabela 1: GAPDH
(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), utilizado como controle interno
(Gauthier et al., 1992), miostatina e atrogina-1, foram construídos utilizando-se o
32
software Primer Express 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA); myoD obtido
de Hill e Goldspink (2003).
Tabela 1 – Sequência nucleotídica dos primers para medir a expressão gênica por PCR
quantitativo em tempo real.
Primer Senso Anti-senso
GAPDH
GATGCTGGTGCTGAGTATGTCG GTGGTGCAGGATGCATTGCTGA
MyoD
GGAGACATCCTCAAGCGATGC AGCACCTGGTAAATCGGATTG
Miostatina
AGTGACGGCTCTTTGGAAGATG AGTCAGACTCGGTAGGCATGGT
Atrogina
TACTAAGGAGCGCCATGGATACT GTTGAATCTTCTGGAATCCAGGAT
Os códigos de acesso no GenBank para os genes GAPDH, miostatina e atrogina-1, são
AF106860, AF019624 e AF441120, respectivamente.
4.8 PCR em tempo real
Em seguida, diferentes frações das RTs foram utilizadas na
amplificação em cadeia por polimerase (PCR) em um equipamento que monitora
a geração de amplicons em tempo real (Rotor Gene 3000, Cobertt Research, San
Francisco, USA).
A amplificação por PCR foi efetuada utilizando-se 50ng/µL de cDNA
adicionado a reação contendo 25µL de SYBR® Green PCR master mix (Applied
Biosystems, Foster City, CA), 50-900nM dos primers (senso e anti-senso) em
solução com volume final de 55 µL , dividido em dois tubos (duplicata). Na Tabela
2 estão descritas as condições da PCR em tempo real para cada um dos genes
analisados.
33
Tabela 2 – Condições das etapas e processamento das reações de PCR para os genes
analisados
Gene Pré-incubação Desnaturação Anelamento Elongamento Nº de
ciclos
GAPDH
95°C/ 10 min 94°C/ 15 seg 56°C/ 30 seg 72°C/ 1 min 35
MyoD
95°C/ 10 min 94°C/ 15 seg 48°C/ 30 seg 72°C/ 1 min 35
Miostatina
95°C/ 10 min 94°C/ 15 seg 60°C/ 30 seg 72°C/ 1 min 35
Atrogina
95°C/ 10 min 94°C/ 15 seg 56°C/ 30 seg 72°C/ 1 min 35
Após a reação de PCR, é possível determinar o início da fase de
amplificação exponencial (Ct, cycle threshold) de cada amostra, que foi utilizado
como dado para a análise da expressão gênica do myoD, miostatina e atrogina-1.
4.9 Análise estatística
Para testar a normalidade entre os grupos foi aplicado o teste Shapiro-
Wilk. O teste de Levene foi usado para testar a homocedasticidade. Em seguida
foi aplicada a análise de variância ANOVA-F (One-Way), seguido do teste de
Tukey HSD. Os dados foram processados no software SPSS/PC, versão 11.0,
considerando nível de significância de 5%.
34
5 RESULTADOS
5.1 Massa muscular
Observou-se diminuição na massa muscular relativa em todos os
grupos desnervados quando comparados ao grupo C (C: 0.287±0.030% vs D:
0.159 ± 0.012%; EED: 0.152 ± 0.023%; EEA: 0.146 ± 0.013%, p<0.05). Não
houve diferença entre os grupos desnervados, submetidos ou não à estimulação
elétrica (Tabela 3).
Tabela 3 - Massa muscular relativa (MMR) do
músculo gastrocnêmio de ratos dos grupos
controle (C), desnervado (D), desnervado e
eletroestimulado diariamente (EED) e
desnervado e eletroestimulado alternadamente
(EEA).
Grupos MMR (%)
C
0.287±0,030
D
0.159±0,012*
EED
0.152±0,023*
EEA
0.146±0,013*
* quando comparado ao controle; p<0.05
35
5.2 Expressão gênica da miostatina
A desnervação provocou aumento na expressão da miostatina em
todos os grupos quando comparados ao C (D: 2.5-vezes, EED: 4.2-vezes e EEA:
5.6-vezes, respectivamente; p<0.05). A estimulação elétrica aplicada ao músculo
desnervado induziu maior expressão do gene da miostatina quando comparado
ao músculo apenas desnervado (EED: 68%, e EEA: 124%, p<0.05). Além disso, o
grupo EEA mostrou a maior expressão do myoD nos grupos analisados (Figura
4).
0
1
2
3
4
5
6
7
C D EED EEA
Unidades arbitrárias
Figura 4 - Expressão de mRNA da miostatina no músculo gastrocnêmio de ratos dos
grupos controle (C), desnervado (D), desnervado e eletroestimulado diariamente (EED) e
desnervado e eletroestimulado alternadamente (EEA).
a,b,c
diferença quando comparado
ao C e entre os grupos (p<0.05).
a
c
b
36
5.4 Expressão gênica da atrogina-1
A análise da atrogina-1 revelou padrão de aumento de mRNA após
desnervação quando comparado a valores normais (D: 81-vezes, EED: 68-vezes,
e EEA: 97-vezes, p<0.05). A estimulação elétrica aplicada diariamente reduziu o
acúmulo da atrogina-1 em 16% quando comparado ao D, e 30% quando
comparado ao EEA (p<0.05). Novamente, no grupo EEA foi observada o maior
aumento da expressão de mRNA da atrogina-1 (Figura 5).
37
0
20
40
60
80
100
120
C D EED EEA
Unidades arbitrárias
Figura 5 - Expressão de mRNA da atrogina-1 no músculo gastrocnêmio de ratos dos
grupos controle (C), desnervado (D), desnervado e eletroestimulado diariamente (EED) e
desnervado e eletroestimulado alternadamente (EEA).
a,b,c
diferença quando comparado
ao C e entre os grupos (p<0.05).
5.5 Expressão gênica do myoD
a
b
c
38
A expressão do myoD teve um comportamento similar em sua
expressão quando comparado à miostatina. Todos os grupos desnervados
apresentaram um aumento na expressão do myoD quando comparados a valores
normais (D: 18-vezes, EED: 23-vezes, e EEA: 27-vezes, p<0.05). A estimulação
elétrica também causou taxas superiores na expressão da miostatina se
comparados com o grupo apenas desnervado (EED: aumento de 21.3%, EEA:
aumento de 33.2%, p<0.05) (Figura 6).
39
0
5
10
15
20
25
30
35
C D EED EEA
Unidades arbitrárias
Figura 6 - Expressão de mRNA do myoD no músculo gastrocnêmio de ratos dos grupos
controle (C), desnervado (D), desnervado e eletroestimulado diariamente (EED) e
desnervado e eletroestimulado alternadamente (EEA).
a,b,c
diferença quando comparado
ao C e entre os grupos (p<0.05).
6 DISCUSSÃO
O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da estimulação elétrica
fásica na massa muscular e na expressão gênica do myoD, miostatina, e
a
b
c
40
atrogina-1 do músculo gastrocnêmio de rato desnervado por esmagamento. O
protocolo de estimulação elétrica utilizado permitiu verificar se este recurso de
tratamento, bem como sua freqüência de aplicação, é capaz de alterar o
comportamento de certos genes musculares.
Dentre os animais usados em pesquisa básica, o rato é o mais utilizado
para o estudo das lesões nervosas periféricas, pois a estrutura de seu nervo é
semelhante ao dos humanos, com exceção de algumas particularidades
(Mackinnon; Dellon; Hunter, 1985; 2).
A desnervação é um modelo de desuso utilizado para melhor entender
os efeitos que a falta de atividade elétrica acarreta no músculo esquelético. A
axoniotmese causa degeneração nervosa total desde o local da lesão até a parte
distal do nervo e permite entender o comprometimento muscular decorrente de
esmagamento e estiramento nervoso, comumente encontrados na clínica. Além
disso, Bridge et al. (1994), comprovaram que a compressão do nervo isquiático
em ratos é um modelo confiável de axoniotmese.
No presente estudo, a massa muscular diminuiu em torno de 47% nos
grupos desnervados, independentes de terem sido tratados (Tabela 3). Este
resultado foi semelhante ao encontrado por Polacow et al. (2003), que
observaram 49% de diminuição da massa muscular nos grupos desnervados,
independente de receberem estimulação elétrica, quando comparado ao controle.
Zhang et al. (2005), analisaram o músculo gastrocnêmio de ratos pós neurotmese
do nervo isquiático em vários períodos e verificaram redução de 50, 65 e 80% da
massa muscular após 14, 28 e 56 dias, respectivamente, quando comparados ao
controle. A diminuição da massa muscular no músculo desnervado pode ter
41
relação com o aumento da expressão de dois genes aqui analisados, a miostatina
e a atrogina-1.
A miostatina é conhecida como reguladora negativa de massa
muscular, podendo agir no controle tanto do número quanto do tamanho da fibra
muscular (McPherron, Lawler e Lee, 1997), e sua expressão é aumentada em
situações de desuso (Zhang et al., 2005; Wehling, Cai e Tidball, 2000).
Os resultados do presente estudo mostraram aumento de 2.5 vezes
(150%) nos transcritos da miostatina no músculo gastrocnêmio após 10 dias de
desnervação (Figura 4), sendo os mesmos condizentes com estudo de Zhang et
al. (2005), que relatam aumento tanto do mRNA quanto da proteína miostatina no
músculo gastrocnêmio de rato analisado após 14 dias de lesão do nervo
isquiático. Do mesmo modo, Baumann et al. (2003) também alisaram o músculo
gastrocnêmio de ratos e já no primeiro dia de desnervação encontraram 31% de
aumento da expressão da miostatina.
Embora os resultados encontrados no grupo D estejam de acordo com
estudos prévios, os resultados dos animais que receberam tratamento com
estimulação elétrica não foram os esperados. Os animais dos grupos EED e EEA
apresentaram, respectivamente, valores 1.7 e 2.4 vezes maiores que do grupo D
(Figura 4), sendo esses dados conflitantes, uma vez que a estimulação elétrica
aumenta a demanda muscular, sendo, portanto esperado diminuição da
expressão da miostatina.
No entanto, resultados similares também foram encontrados por Peters
et al. (2003) e Willoughby (2004), que estudaram a expressão da miostatina após
a realização de exercícios. Esses autores relatam resultados inesperados e
interessantes, uma vez que os níveis desta proteína encontraram-se maiores
42
após aumento da demanda muscular. Peters et al. (2003) submeteram ratos
adultos à exercício excêntrico e observaram que os níveis de mRNA da miostatina
aumentaram muito rápido (30 min) após término do exercícios nos músculos tibial
anterior e EDL, mantendo pico até 12 h e retornando aos níveis normais 24 h
após a execução do exercício. Em um estudo realizado com humanos, Willoughby
(2004) verificou aumento de mRNA da miostatina após 12 semanas de treino de
resistência em voluntários do sexo masculino. O autor também constatou que a
expressão da FLRG (follistatin like gene related) estava aumentada, sugerindo
que a miostatina pode ter sido inibida pela ação da FLRG, uma vez que esta é
conhecida por ligar-se, inibir e regular negativamente a miostatina (Hill et al.,
2002).
Uma possível hipótese para o maior aumento da miostatina nos grupos
eletroestimulados estaria relacionada com o estresse provocado pela
eletroestimulação. Sabe-se que a expressão da miostatina é regulada pelo
hormônio glicocorticóide (Ma et al., 2003), assim, os níveis hormonais desses
animais poderiam estar elevados em decorrência da estimulação elétrica. No
entanto, não foi realizada a dosagem deste hormônio, sendo que esta hipótese
não pôde ser confirmada.
Vale ainda destacar que a avaliação realizada neste estudo foi de
mRNA, e que estes valores não representam precisamente os níveis de proteína
funcional, já que a miostatina sofre alterações pós-transcricional (Langley et al.,
2002; McMahon et al, 2003).
Outro estudo interessante relacionada à miostatina foi realizado em
2003, onde McMahon et al. realizaram estudo com ratos mutantes (-/-) e
observaram que a diminuição da massa corporal e muscular resultante da
43
suspensão do membro posterior foi mais evidente nesses animais que em
animais adultos normais. Esses dados foram contraditórios à hipótese de que a
miostatina regula negativamente a massa muscular, e mostram que em animais
adultos a ausência de miostatina não atenuou a perda da massa corporal e
muscular durante a suspensão do membro. Pelo contrário, tais resultados
sugeriram que animais ausentes de miostatina são mais susceptíveis que os
normais à atrofia muscular induzida por suspensão do membro.
Com base no exposto, pode-se concluir que, embora o efeito da
miostatina esteja bem definido durante a fase embriônica e no desenvolvimento
pós-natal (McPherron, Lawler e Lee, 1997), o seu papel no músculo adulto ainda
é controverso e de difícil interpretação.
A atrogina-1 é uma proteína músculo-específica atuante no processo
de degradação protéica. Em condições normais ela não é expressa no músculo, e
sua presença caracteriza quadro de atrofia muscular (Lecker, et al., 1999). Vários
modelos experimentais que causam atrofia muscular, tais como doenças
metabólicas (Lecker et al., 2004), jejum (Wing, Haas e Goldberg, 1995),
imobilização (Taillandier et al., 1996; Bodine, 2001) e ausência de peso (Bodine,
2001) foram utilizados para o estudo da expressão da atrogina. A presença da
atrogina-1 em todas essas situações deixou clara a forte relação desta proteína
com a atrofia muscular, independente da causa da mesma.
Dentre os modelos de desuso, a desnervação também foi utilizada e os
níveis da atrogina-1 também se mostraram elevados nesse caso. Wing, Haas e
Goldberg (1995) analisaram se a atrofia do músculo sóleo, causada por
desnervação, era associada à via de degradação protéica ubiquitina-
proteossomo. Observou-se que os níveis de ubiquitina conjugada a proteínas
44
aumentaram significantemente no sóleo. Tal análise foi realizada após 2 dias de
intervenção, mostrando que essa via é rapidamente ativada em resposta à
estímulos de desuso.
Bodine et al. (2001), identificaram o aumento da expressão da
atrogina-1 após 3 dias em músculos submetidos à desnervação. Além disso,
realizaram experimento com animais mutantes, ausentes de atrogina-1, e
observaram que esses animais, mesmo quando desnervados, não apresentavam
atrofia muscular, o que comprovou o importante papel dessa proteína no processo
da atrofia.
Os resultados aqui encontrados são condizentes com os citados
anteriormente. O aumento do mRNA da atrogina-1 observado no grupo D foi de
81 vezes. Por outro lado, o grupo EED apresentou níveis de atrogina-1 16%
menor que no grupo D, sugerindo que o tratamento diário com estimulação
elétrica foi benéfico, pois a redução dos níveis de atrogina-1 sugere minimização
da degradação protéica pela via ubiquitina-proteossomo. Por outro lado, o
acúmulo de mRNA da atrogina-1 no grupo EEA foi ainda maior que no D,
mostrando que a quantidade de estímulo influencia na transcrição da atrogina-1,
sendo que a estimulação elétrica aplicada em dias alternados causou aumento na
transcrição desse gene (Figura 5). Os mecanismos envolvidos neste achado não
estão esclarecidos, sendo necessários mais estudos para o entendimento da
regulação desse gene.
Contrário aos resultados encontrados, Russo et al. (2007) verificaram
que os níveis de mRNA da atrogina-1 reduziram significantemente no músculo
tibial anterior desnervado de ratos e submetidos à eletroestimulação (fásica, 20
contrações/sessão a cada 48 h, realizada durante 28 dias). Vale destacar que os
45
parâmetros da corrente utilizada, assim como o múscuo analisado, foram
diferentes aos utilizados neste estudo e ainda que este foi o único trabalho
encontrado que analisou a expressão gênica da atrogina-1 após desnervação e
aplicação de estimulação elétrica.
No estudo aqui realizado, apesar da redução da expressão da atrogina-
1 no grupo EED sugerir menor atrofia, não foi observada diferença na massa
muscular relativa nesse grupo quando comparado aos demais grupos
desnervados. Uma possível hipótese para este resultado é que embora o período
de 10 dias seja suficiente para causar alterações na transcrição deste gene, a
alteração na massa do músculo ocorra em período mais longo.
Outro gene analisado foi o do myoD, relacionado com a miogênese e
ativação de células satélites (Tapscott, 2005). A expressão desse gene é
normalmente aumentada frente à desnervação, indicando que a atividade elétrica
tem efeito regulatório no músculo (Eftimie, Brenner e Buonanno et al., 1991;
Ishido, Kami e Masuhara, 2004; Russo et al., 2007). Além disso, Ishido, Kami e
Masuhara (2004) sugerem que o aumento do myoD após lesão nervosa está
relacionada à prevenção da atrofia muscular causada pela desnervação.
No presente estudo foi observado que no grupo que sofreu
desnervação os níveis dos transcritos do myoD aumentaram 18 vezes (Figura 6),
dados que estão de acordo com os estudos previamente mencionados.
Nos grupos EED e EEA este aumento foi ainda maior, 23 e 27 vezes,
respectivamente, sugerindo que a aplicação de estimulação elétrica fásica nos
parâmetros aqui empregados aumentou ainda mais a ativação de células satélites
no músculo desnervado. Como ocorrido com a miostatina e atrogina-1, a
estimulação elétrica aplicada em dias alternados provocou maior aumento na
46
transcrição do myoD do que quando aplicada diariamente. O estímulo gerado no
grupo EEA foi 40% menor que no EED, no entanto foi capaz de provocar aumento
ainda maior na expressão dos três genes analisados.
Estudos que avaliaram a expressão do myoD em músculos
desnervados e eletroestimulados mostram resultados bastante variados,
entretanto, a comparação desses resultados é difícil, pois os métodos e técnicas
utilizadas foram diferentes entre eles. Eftimie, Brenner e Buonanno et al. (1991),
mostraram que a aplicação de estimulação elétrica crônica (24h) por eletrodos
implantados no músculo sóleo desnervado de rato reduziu significativamente os
níveis de mRNA do myoD após 6 e 10 dias quando comparado com animais
apenas desnervados.
No trabalho de Vissing et al. (2005), a estimulação elétrica foi aplicada
por eletrodos de superfície no músculo tibial anterior de homens paraplégicos. Os
autores avaliaram a expressão gênica do myoD após 2 e 4 semanas. A
estimulação começou com duração de 2h/dia e ao fim do estudo o período
estimulado era de 6h/dia. Não foram relatadas mudanças após 2 semanas,
contudo ao final da 4º semana observaram aumento nos níveis dos transcritos,
sugerindo que o myoD é positivamente regulada em resposta a estimulação
elétrica de músculos paralisados.
No estudo de Russo et al. (2007), a aplicação da corrente elétrica foi
realizada por curto período (20 contrações/sessão) no músculo tibial anterior de
ratos após desnervação. Contudo, diferente dos resultados aqui encontrados, foi
observado diminuição dos níveis de transcrição do myoD no grupo que foi tratado
com estimulação elétrica quando comparado com o grupo desnervado. Vale
destacar que apesar dos autores terem realizado a estimulação elétrica fásica
47
com eletrodos de superfície, como aqui utilizado, o tipo de desnervação, os
parâmetros da corrente elétrica, o músculo analisado e o tempo de análise foram
diferentes, o que possivelmente explica a divergência nos resultados.
Em 2003, Peters et al. estudaram o comportamento da expressão do
myoD após realização de exercício excêntrico no membro posterior de ratos
adultos normais. Os resultados mostraram aumento desse gene 3h após,
atingindo seu pico após 6h e retornando aos níveis basais 120h após a série de
exercícios. Apesar de ter sido analisado músculo normal, esses resultados, assim
como os encontrados no presente trabalho, mostram aumento da transcrição do
myoD após ativação muscular.
Um resultado não esperado aqui encontrado foi o aumento
concomitante nos transcritos da miostatina e do myoD, já que estudos prévios
relatam papel inibitório da miostatina sobre os fatores regulatórios miogênicos
(MRFs) (McPherron, Lawler e Lee, 1997; Langley et al., 2002). Vale salientar que
tais estudos foram realizados in vitro e/ou em embriões, o que difere do aqui
realizado, que avaliou músculo adulto. Os achados de Peters et al. (2003), após
realização de exercício excêntrico em ratos, mostraram resultados semelhantes
ao do presente estudo, isto é, a miostatina não inibiu a expressão do myoD,
levantando a hipótese que a regulação entre a miostatina e myoD no músculo
adulto pode não ser semelhante à do período embrionário.
Os resultados apresentados no presente trabalho mostram que os
mecanismos envolvidos na regulação da expressão do myoD, miostatina e
atrogina-1 em músculos adultos não estão totalmente esclarecidos, sendo
necessários mais estudos para o entendimento dos resultados obtidos.
48
49
7 CONCLUSÃO
• Curto período de desnervação promove aumento dos genes do myoD,
miostatina e atrogina-1, e diminuição da massa muscular, mostrando a
importância da atividade neural para a preservação da característica
muscular normal.
• Diferente dos resultados esperados, a estimulação elétrica fásica, de modo
geral, aumentou a transcrição dos genes do myoD, miostatina e atrogina-1
e não influenciou na massa muscular de músculo desnervado. Esses
resultados podem ser dependentes dos parâmetros de estimulação elétrica
utilizados, uma vez que estudos prévios apresentaram diminuição da
expressão dos genes analisados.
• Uma vez que a aplicação de estimulação elétrica em dias alternados
resultou em maior nível de expressão dos genes da miostatina, myoD e
atrogina-1 quando comparada com a estimulação aplicada diariamente,
conclui-se que a freqüência de tratamento imposta ao músculo influencia
na transcrição de genes específicos do músculo.
• O tratamento diário mostrou ser um protocolo mais efetivo do que o
tratamento em dias alternados, uma vez que o mesmo diminuiu a
expressão da atrogina-1, gene relacionado com a instalação da atrofia
muscular.
50
REFERÊNCIAS
*
Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD. Biologia molecular da
célula. 3ª edição. Editora Artmed, 1997.
Arnold HH, Braun T. Genetics of muscle determination and development. Curr
Topics Develop Biol. 2000; 48: 129-64.
Auclair D, Garrel DR, Zerouala AC, Ferland LH. Activation of the ubiquitin pathway
in rat muscle by catabolic doses of glucocorticoids. Am J Physiol. 1997; 272:
C1007-C1016.
Baracos VE, DeVivo C, Hoyle DHR, Goldberg AL. Activation of the ATP-ubiquitin-
proteassome pathway in skeletal muscle of cachetic rats bearing a hepatoma. Am
J Physiol.1995; 268: E996-E1006.
Berkes CA, Tapscott, SJ. MyoD and the transcriptional control of myogenesis.
Semin Cell Dev Biol. 2005; 16: 585-95.
Bickel CS, Slade J, Mahoney E, Haddad F, Dudley GA, Adams GR. Time course
of molecular responses of human skeletal muscle to acute bouts of resistance
exercise. J Appl Physiol. 2004; 98: 482-88.
Bodine SC, Latres E, Baumhueter S, Lai VKM, Nunez L, Clarke BA, et al.
Identification of ubiquitin ligases required for skeletal muscle atrophy. Science.
2001; 294: 1704-08.
Braun T, Bushhausen-Denker G, Bober E, Tannich E, Arnold HH. A novel humam
muscle factor related to but distinct from MyoD1 induces myogenic conversion in
10T ½ fibroblasts. Eur Molec Biol Org J. 1989; 8: 701-09.
Bridge PM, Ball DJ, Mackinnon SE, Nakao Y, Brandt K, Hunter DA, Hertl C. Nerve
crush injuries – a model for axonotmesis. Exp Neurol 1994; 27: 284-90.
*
Baseadas na norma do International Committee of Medical Journal Editors - Grupo de
Vancouver; 2005. Abreviatura dos periódicos em conformidade com o Medline.
51
Carlsen H, Gundersen K. Helix-loop-helix transcription factors in electrical active
and inactive skeletal muscle. Muscle Nerve. 2000; 23: 1374-80.
Chargé SBP, Rudnicki MA. Cellular and molecular regulation of muscle
regeneration. Physiol Rev 2004; 84(1): 209-38.
Cooper, MC. A célula: uma abordagem molecular. 2ª edição Ed Artmed, 2002.
Davis RL, Weintraub H, Lassar AB. Expression of a single transfected cDNA
converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 1987; 51:987-1000.
Deshaies RJ. SCF and Cullin/Ring H2-based ubiquitin ligases. Annu Rev Cell Dev
Biol. 1999; 15: 435-67.
Dominique JE, Gérard C. Myostatin regulation of muscle development: molecular
basis, natural mutations, physiopathological aspects. Exp Cell Res. 2006;
312:2401-14.
Dow DE, Carlson BM, Hassett CA, Dennis RG, Faulkner JA. Electrical stimulation
of denervated muscles of rats maintains mass and force, but not recovery
following grafting. Restor Neurol Neurosci. 2006; 24(1): 41-54.
Eberstein A, Eberstein S. Electrical stimulation of denervated muscle: is it
worthwhile? Med Sci Sports Exerc. 1996; 28(12): 1463-9.
Edmonson DG, Olson EN. A gene with homology to the myc similarity region of
myoD is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle
differentiation program. Genes Develop. 1989; 3: 628-40.
Eftimie R, Brenner HR, Buonanno A. Myogenin and MyoD join a family of skeletal
muscle genes regulated by electrical activity. Proc Natl Acad Sci USA. 1991; 88:
1349-53.
Fernandes KC, Fuentes CB, Campos GE , Somazz MC, Polacow ML, Guirro RR,
et al. Análise morfométrica dos tecidos muscular e conjuntivo após desnervação e
estimulação elétrica de baixa freqüência. Rev Bras Fisiot. 2005; 9(2): 235-241.
52
Gauthier JM, Theriault R, Theriault G, Geliman Y, Simoneau JA. Electrical
stimulation induced changes in skeletal muscle enzymes of men and women. Med
Sci Sports Exerc. 1992; 24(11): 1252-6.
Girgenrath S, Song Kening, Whittemore L. Loss of myostatin expression alters
fiber-type distribution and expression of myosin heavy chain isoforms in slow- and
fast-type skeletal muscle. Muscle nerve. 2005; 31: 34-40.
Glass DJ. Molecular mechanisms modulating muscle mass. Trends Molec Med.
2003; 9(8): 344-50.
Goldspink G. Gene expression in skeletal muscle. Biochem Soc Trans. 2002;
30(2): 285-90.
Gonzalez-Cadavid NF, Bhasin, S. Role of myostatin in metabolism. Curr Opin Clin
Nutr Metab Care. 2004; 7: 451-7.
Hill JJ, Davies MV, Pearson AA, Wang JH, Hewick RM, Wolfman NM, et al. The
myostatin propeptide and the follistatin-related gene are inhibitory binding proteins
of myostatin in normal serum. J Biol Chem. 2002; 277(43): 40735-41.
Hill M, Goldspink G. Expression and splicing of the insulin-like growth factor gene
in rodent muscle is associated with muscle satellite (stem) cell activation following
local tissue damage. J Physiol 2003; 549(Pt 2): 409-18.
Hughes SM, Taylor JM, Tapscott SJ, Gurley CM, Carter WJ, Peterson CA.
Selective accumulation of MyoD and myogenin mRNA in fast and slow adult
skeletal muscle is controlled by innervation and hormones. Development. 1993;
118: 1137-47.
Hyatt JPK, Roy RR, Baldwin KM, Edgerton R. Nerve activity-independent
regulation of skeletal muscle atrophy: role of MyoD and myogenin in satellite cells
myonuclei. Am J Physiol. 2003; 285: 1161-73.
Ishido M, Kami K, Masuhara M. In vivo expression of myoD, p21, and Rb proteins
in myonuclei and satellite cells of denervated rat skeletal muscle. Am J Physiol
Cell Physiol. 2004; 287:484-93.
53
Kraus B, Pete D. Quantification of MyoD, myogenin, MRF4 and Id-1 by reverse-
transcriptase polymerase chain reaction in rat muscles - Effects of Hypothyroidism
and Chronic Low-Frequency Stimulation. Eur J Biochem. 1997; 247: 98-106.
Langley B, Thomas M, Bishop A, Sharma M, Gilmour S, Kambadur R. Myostatin
Inhibits myoblast differentiation by dow-regulating myoD expression. J Biol Chem.
2002, 277(51): 49831-40.
Lecker SH, Ubiquitin-protein ligases in muscle wasting: multiple parallel
pathways? Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2003; 6(3): 271-5.
Lecker SH, Jagoe RT, Gilbert A, Gomes M, Baracos V, Bailey J, et al. Multiple
types of skeletal muscle atrophy involve a common program of changes in gene
expression. FASEB J. 2004; 18:39-51.
Lecker SH, Solomon V, Mitch WE, Goldberg, AL. Muscle breakdown and the
critical role of the ubiquitin-proteasome pathway in normal and disease state. J.
Nutr. 1999; 129(Suppl):227S-237S.
Lee SJ. Regulation of muscle mass by myostatin. Annu Rev Cell Dev Biol 2004;
20:61-86.
Lee SJ, McPherron AC. Regulation of myostatin activity and muscle growth. u
PNAS. 2001; 98(16): 9306–9311.
Lieber RL. Skeletal muscle structure, function & plasticity: The physiological basis
of rehabilitation. 2 ed. Baltimore-USA, Williams & Wilkins, 2002.
Llovera M, Garcia-Martinez C, Agell N, Marzabal M, Lopez-Soriano FJ, Argiles JM.
Ubiquitin gene expression is increased in skeletal muscle of tumor-bearing rats.
FEBS Lett. 1994, 338: 311-18.
Loughna PT, Brownson C. Two myogenic regulatory factor transcripts exhibit
muscle-specific responses to disuse and passive stretch in adult rats. FEBS Lett.
1996; 390: 304-06.
Ludolph DC, Konieczny SF. Transcriptions factors families: muscling in on the
myogenic program. FASEB J. 1995; 9: 1595-1604.
54
Ma K, Mallidis C, Bhasin S, Mahabadi V, Artaza J, Gonzalez-Cadavid N, et al.
Glucocorticoids-induced skeletal muscle atrophy is associated with upregulation of
myostatin gene expression. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2003; 285: 363-71.
Mackinnon SE, Dellon AL, Hunter DA. Histologic assessment of nerve
regeneration in the rat. Plast Reconstr Surg. 1985; 75: 384-88.
Matsakas A, Diel P. The growth factor myostatin, a key regulator in skeletal
muscle growth and homeostasis. Int J Sports Med. 2005; 26: 83-89.
McCroskery S, Thomas M, Maxwell L, Sharma M, Kambadur R. Myostatin
negatively regulates satellite cell activation and self-renewal. J Cell Biol. 2003;
162(6): 1135-47.
McHanon CD, Popovic L, Oldham JM, Jeanplong F, Smith HK, Kambadur R, et al.
Myostatin-deficient mice lose more skeletal muscle mass than wild-type controls
during hindlimb suspension. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2003; 285: E82–E87.
McPherron AC, Lawler AM, Lee SJ. Regulation of skeletal muscle mass in mice by
a new TGF-β superfamily member. Nature. 1997; 387:83-90.
Medina R, Wing S, Goldberg AL. Increase in levels of polyubiquitin and
proteossome mRNA in skeletal muscle during starvation and denervation atrophy.
Biochem J. 307: 631-37.
Peters D, Barash IA, Burdi M, Yuan PS, Mathew L, Fridén J, et al. Asynchronous
functional, cellular and transcriptional changes after a bout of eccentric exercise in
the rat. J Physiol. 2003; 553(3): 947-57.
Polacow MLO, Silva CA, Guirro RRJ, Campos MR, Borges JP. Estudo
morfométrico do músculo sóleo denervado de ratos tratados pela associação de
metformina e estimulação elétrica. Rev Bras Fisiot 2003; 7(1): 77-84.
Price SR, Bailey JL, Wang X, Jurkovitz C, England BK, Ding X, et al. Muscle
wasting in insulinopenic rats results from activation of the ATP-dependent,
ubiquitin-proteassome proteolytic pathway by a mechanism including gene
transcription. J Clin Invest. 1996; 98: 1703-08.
55
Reid MB. Response of the ubiquitina-proteasome pathway o changes in muscle
activity. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 2005; 288: 1423-31.
Rhodes S, Konieczny SF. Identification of MRF4: a new member of the muscle
regulatory factor gene family. Genes Develop. 1989; 3: 2050-61.
Rios R, Carneiro I, Arce VM, Devesa J. Myostatin is na inhibitor of myogenic
differentiation. Am J Physiol Cell Physiol. 2002; 282: C993-C999.
Russo TL, Peviani SM, Freria CM, Gigo-Benato D, Geuna S, Salvini TF. Electrical
stimulation based on chronaxie reduces atrogin-1 and myoD gene expressions in
denervated rat muscle. Muscle Nerve. 2007; 35:87-97.
Sakuma K, Watanabe K, Sano M, Uramoto I, Kei S, Totsuka T. The adaptative
response of MyoD family proteins in overloaded, regenerating and denervating
muscles. Bioch Biophysic Acta. 1999; 1428: 284-92.
Salonen V, Lehto M, Kalimo H, Penttinem R, Aro H. Changes in intramuscular
collagen and fibronectin in denervation atrophy. Muscle Nerve. 1985; 8: 125-31.
Schultz E, McCormick KM. Skeletal muscle satellite cells. Rev Physiol Biochem
Pharmacol. 1994;123:213-57.
Taillander D, Aurousseau E, Meynial-Denis D, Bechet D, Ferrara M, Cottin P, et al.
Coordinate activation of lysossomal, Ca
2+
-activated and ATP-ubiquitin-dependent
proteinases in the unweighted rat soleus muscle. Biochem J. 1996; 316: 65-72.
Tapscott SJ. The circuitry of a master switch: MyoD and the regulation of skeletal
muscle gene transcription. Development. 2005; 132(12): 2685-95.
Thomas M, Langley B, Berry C, Sharma M, Kirk S, Bass J, et al. Myostatin, a
negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation.
J Biol Chem. 2000; 275 (51): 40235-43.
Vissing K, Andersen JL, Harridge SDR, Sandri C, Hartkopp A, Kjaer M, Schjerling
P. Gene expression of myogenic factors and phenotype-specific markers in
electrically stimulated muscle of paraplegics. J Appl Physiol 2005; 99: 164-72.
56
Voytik SL, Przyborski M, Badlak SF, Konieczny SF. Differencial expression of
muscle regulatory factor genes in normal and denervated adult rat hindlimb
muscles. Dev Dyn. 1993; 198: 214-24.
Walters EH, Stickland NC, Loughna PT. The expression of the myogenic
regulatory factors in denervated and normal muscles of different phenotypes. J
Muscle Res Cell Motil. 2000; 21: 647-53.
Wehling M, Cai B, Tidball JG. Modulation of myostatin expression during modified
muscle use. FASEB J 2000; 14: 103-10.
Weintraub H, Davis R, Tapscott S, Thayer S, Krause M, Benezra R, et al. The
myoD gene family: nodal point during specification of the muscle cell linage.
Science. 1991; 251: 761-66.
Willoughby DS. Effects of heavy resistance training on myostatin mRNA and
protein expression. Med Sci Sports Exerc 2004; 36(4):574-82.
Wing SS, Haas AL, Goldberg AL. Increase in ubiquitin-protein conjugates
concomitant with the increase in proteolysis in rat skeletal muscle during starvation
and atrophy denervation. Biochem J. 1995; 307:639-45.
Witzemann V, Sakmann B. Diferential regulation of MyoD and myogenin mRNA
levels by nerve induced muscle activity. FEBS 1991; 282(2): 259-64.
Wright WE, Sassoon DA, Lin VK. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a
domain homologous to myoD. Cell. 1989; 56: 607-17.
Zhang D, Liu M, Ding F, Gu X. Expression of myostatin RNA transcript and protein
in gastrocnemius muscle of rats sciatic nerve resection. J Muscle Res Cell Motil.
2005; 27(1): 37-44.
57
_________________________________________________________________
Ceccotti HM, Sousa DD. Manual para normalização de dissertações e teses do
Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia, UNIMEP; 2006. Disponível em
http://www.unimep.br/ppgft
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
