( PDF ) Caracterização funcional de uma PERK quinase de Arabidopsis thaliana que interage com a proteína NSP de geminivírus

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LILIAN HASEGAWA FLORENTINO

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE UMA PERK

QUINASE DE Arabidopsis thaliana QUE INTERAGE

COM A PROTEÍNA NSP DE GEMINIVÍRUS

Tese apresentada à

Universidade Federal de Viçosa,

como parte das exigências do

Programa de Pós-Graduação em

Fisiologia Vegetal, para obtenção

do título de Magister Scientiae.

VIÇOSA

MINAS GERAIS - BRASIL

2006

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Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e

Classificação da Biblioteca Central da UFV

Florentino, Lilian Hasegawa, 1981-

F633c Caracterização funcional de uma PERK quinase de

2006 Arabidopsis thaliana que interage com a proteína NSP

de geminivírus / Lilian Hasegawa Florentino. – Viçosa :

UFV, 2006.

x, 59f. : il. ; 29cm.

Orientador: Elizabeth Pacheco Batista Fontes.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de

Viçosa.

Referências bibliográficas: f. 50-59.

1. Ácido desoxirribonucléico - Transporte fisiológico.

2. Proteínas - Análise. 3. Vírus de plantas. 4. Engenharia

genética vegetal. 5. Plantas transgênicas. 6. Arabidopsis

thaliana. I. Universidade Federal de Viçosa. II.Título.

CDD 22.ed. 572.86

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LILIAN HASEGAWA FLORENTINO

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE UMA PERK QUINASE

DE Arabidopsis thaliana QUE INTERAGE COM A

PROTEÍNA NSP DE GEMINIVÍRUS.

Tese apresentada à

Universidade Federal de Viçosa,

como parte das exigências do

Programa de Pós-Graduação em

Fisiologia Vegetal, para obtenção

do título de Magister Scientiae.

APROVADA: 23 de fevereiro de 2006

_________________________________ _________________________________

Prof. Francisco Murilo Zerbini Jr. Prof.ª Maria Cristina Baracat Pereira

(Conselheiro) (Conselheira)

_________________________________ _________________________________

Prof.ª Andréa Miyasaka de Almeida Prof. Marcelo Ehlers Loureiro

_________________________________

Prof.ª Elizabeth Pacheco Batista Fontes

(Orientadora)

À minha amada mãe, meu exemplo de força e

coragem, dedico meu trabalho e minha vida.

iii

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal de Viçosa – UFV, pelo apoio.

Ao Programa de Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal – UFV, pela

oportunidade.

À CAPES, pelo financiamento de meu trabalho, através da concessão de

bolsa.

À Prof.ª Elizabeth Pacheco Batista Fontes, pela ótima orientação, pelo

apoio e companheirismo.

Aos professores Francisco Murilo Zerbini Jr. e Maria Cristina Baracat

Pereira pelo apoio científico e aos professores Andréa Miyasaka de Almeida e

Marcelo Ehlers Loureiro, pela participação na banca de tese.

Aos técnicos e funcionários do Laboratório de Biologia Molecular de

Plantas, em especial ao Serafim, por ser mais que um técnico, mas um amigo

sempre disposto a ajudar.

Aos amigos e companheiros do Laboratório, que contribuíram direta ou

indiretamente para o desenvolvimento deste trabalho, em especial, a Anésia

Aparecida dos Santos e Mariana Rodrigues Fontenelle, amigas para todos os

momentos, sem as quais nada teria sido possível.

Aos amigos e companheiros de todos os momentos, Leonardo Carnevalli

Dias, Eduardo Gusmão Pereira, Letícia Mascarenhas Pereira Barbosa, Fabrízio,

Cândida, Fernanda Segatto e Daí, pela companhia e amizade em todos estes

momentos.

Ao Ricardo, que sempre foi meu maior apoio aqui.

À minha irmã, que apesar de tudo sempre foi minha melhor amiga.

À minha mãe, que mesmo distante sempre me deu forças e inspiração

para continuar meu trabalho.

A essas pessoas que tanto contribuíram para o meu sucesso e a minha

felicidade, muito mais sincero agradecimento e reconhecimento.

ÍNDICE

RESUMO....................................................................................................................... iv

ABSTRACT .................................................................................................................... v

I. INTRODUÇÃO ............................................................................................................1

II. REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................4

2.1. Morfologia, organização genômica e função gênica de geminivírus..............4

2.2. Mecanismo de replicação de geminivírus ......................................................9

2.3. Movimento do genoma viral durante o processo de infecção ......................11

2.4. Interação de proteínas virais com proteínas do hospedeiro.........................13

2.5. Família PERK em plantas ............................................................................15

IIII. OBJETIVO............................................................................................................. 17

IV. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................18

4.1. Material vegetal ............................................................................................18

4.2. Análises de seqüência e filogenética da família AtPERK.............................18

4.3. Construção de plasmídeos pDON................................................................19

4.4. Identificação de proteínas do hospedeiro que interagem com NSP

de geminivírus .....................................................................................................21

4.4.1. Obtenção de biblioteca de cDNA de Arabidopsis thaliana ...............21

4.4.2. Ensaio de Sistema Duplo Híbrido.....................................................22

4.5. Confirmação e caracterização da interação entre NSP e AtNsAK in

vitro......................................................................................................................23

4.5.1. Transcrição e tradução in vitro de NsAK ..........................................23

4.5.2. Expressão heteróloga e purificação da proteína fusionada

GST-NSP....................................................................................................23

4.5.3. Ensaio de interação in vitro ..............................................................24

4.5.4. Ensaio de fosforilação in vitro...........................................................24

4.6. Avaliação da ação de NsAK sobre a infecção viral ......................................25

4.6.1. Obtenção e seleção de plantas knock out homozigotas nsak..........25

4.6.2. Extração de RNA total de Arabidopsis thaliana................................26

4.6.3. Análise da expressão de plantas mutantes knock out por

RT-PCR ......................................................................................................26

4.6.4. Ensaio de infectividade.....................................................................27

4.7. Análise do padrão de expressão de NsAK...................................................28

V. RESULTADOS.........................................................................................................29

5.1. Identificação de uma PERK-like quinase que interage com NSP ................29

5.2. NSP interage estavelmente com o domínio de quinase inativo de

NsAK in vitro e pode atuar como substrato para NsAK.......................................36

5.3. Os transcritos de NsAK são expressos de maneira ubíqua em

Arabidopsis..........................................................................................................40

5.4. A inativação do gene NsAK resulta na atenuação de sintomas e

diminui a eficiência de infecção viral ...................................................................42

VI. DISCUSSÃO...........................................................................................................46

VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................50

vii

RESUMO

FLORENTINO, Lilian Hasegawa, M.S., Universidade Federal de Viçosa, fevereiro de

2006. Caracterização funcional de uma PERK quinase de Arabidopsis

thaliana que interage com a proteína NSP de Geminivírus. Orientadora:

Elizabeth Pacheco Batista Fontes. Conselheiros: Maria Cristina Baracat Pereira e

Francisco Murilo Zerbini Júnior.

Geminivírus constitui um grande grupo de vírus de planta, cujo genoma

é empacotado na forma de DNA circular fita simples em partículas icosaédricas

geminadas e é convertido em uma forma fita dupla no núcleo de células

diferenciadas de plantas. A maioria dos membros do gênero Begomovirus, como o

Cabbage leaf curl vírus (CaLCuV), possuem dois componentes genômicos, DNA-A e

DNA-B. O DNA-A apresenta o potencial para codificar cinco produtos gênicos (AV1,

AC1, AC2, AC3, AC4) e está envolvido na replicação, ativação transcricional de

genes virais e encapsidação do genoma viral. O DNA-B codifica duas proteínas de

movimento, “Movement Protein” MP (BC1) e “Nuclear Shuttle Protein” NSP (BV1),

ambas requeridas para o estabelecimento de uma infecção sistêmica. NSP

transporta o DNA viral entre o núcleo e o citoplasma e então atua cooperativamente

com MP para transportar o DNA viral de célula-a-célula através da parede celular. A

localização de NSP e seu papel proposto no movimento célula-a-célula do DNA viral

predizem que podem ocorrer interações com fatores do hospedeiro tanto no

citoplasma quanto no núcleo. De fato, foi demonstrado que NSP interage com uma

proteína receptora da membrana plasmática, designada NIK, e uma acetiltransferase

nuclear. Através de ensaio de duplo híbrido, foi identificada, uma PERK quinase

(“proline-rich extensin-like receptor protein kinase”) de Arabidopsis thaliana que

viii

interage especificamente com NSP de CaLCuV e, também de geminivírus que

infectam tomate, a qual foi designada NsAK (“NSP-associated kinase”) e é

estruturalmente organizada em um domínio N-terminal rico em prolina seguido de um

segmento transmembrana e de um domínio C-terminal de serina/treonina quinase. A

proteína viral interagiu estavelmente com versões defectivas do domínio de quinase

de NsAK, mas não com a enzima potencialmente ativa em um ensaio de ligação in

vitro. NsAK traduzida in vitro aumentou o nível de fosforilação de NSP, indicando que

NSP atua como substrato de NsAK. Estes resultados demonstram que NsAK é uma

autêntica serina/treonina quinase e sugerem elo funcional para a formação do

complexo NSP-NsAK. Esta interpretação foi corroborada por ensaios de infectividade

in vivo, demonstrando que a perda de função de NsAK reduz a eficiência da infecção

por CaLCuV e atenua o desenvolvimento dos sintomas. Estes dados implicam NsAK

como um contribuidor positivo para a infecção por geminivírus e sugerem que NsAK

pode regular a função de NSP.

ABSTRACT

FLORENTINO, Lilian Hasegawa, M.S., Universidade Federal de Viçosa, February

2006. Functional characterization of an Arabidopsis thaliana PERK-like

kinase that interacts with the Geminivírus NSP protein. Adviser: Elizabeth

Pacheco Batista Fontes. Committee members: Maria Cristina Baracat Pereira and

Francisco Murilo Zerbini Júnior.

Geminiviruses constitute a large group of plant virus whose genome is

packed as single-stranded DNA circles in a small, twinned isometric particle and is

converted to double-stranded forms in nuclei of differentiated plant cells. Members of

the genus Begomovirus, such as Cabbage leaf curl virus (CaLCuV), possess two

genomic components, DNA-A and DNA-B. The DNA-A has the potential to code for

five gene products (AV1, AC1, AC2, AC3, AC4) and is involved in replication,

transcriptional activation of viral genes and encapsidation of the viral genome. The

DNA-B encodes two movement proteins, the movement protein MP (BC1) and the

nuclear shuttle protein NSP (BV1), both required for systemic infection. NSP shuttles

the viral DNA between the nucleus and the cytoplasm and then acts cooperatively

with MP to move the viral DNA cell-to-cell across the wall. The localization of NSP

and its proposed role in cell-to-cell movement of the viral DNA predict that

interactions with host factors may occur in both the cytoplasm and the nucleus. In

fact, NSP has been demonstrated to interact with a plasma membrane receptor

protein, designated NIK, and a nuclear acetyltransferase. A proline-rich extensin-like

receptor protein kinase (PERK) was found to interact specifically with NSP of

CaLCuV and of tomato-infecting geminiviruses, through yeast two-hybrid screening.

The PERK-like protein, which we designated NsAK (NSP-associated kinase), is

structurally organized into a proline-rich N-terminal domain followed by a

transmembrane segment and a C-terminal serine/threonine kinase domain. The viral

protein interacted stably with defective versions of the NsAK kinase domain but not

with the potentially active enzyme in an in vitro binding assay. In vitro translated

NsAK enhanced the phosphorylation level of NSP, indicating that NSP functions as

substrate for NsAK. These results demonstrated that NsAK is an authentic

serine/threonine kinase and suggested a functional link for the NSP-NsAK complex

formation. This interpretation was corroborated by in vivo infectivity assays showing

that loss of NsAK function delays the onset of CaLCuV infection and attenuates

symptom development. Our data implicate NsAK as a positive contributor to

geminivirus infection and suggest it may regulate NSP function.

I. INTRODUÇÃO

A família Geminiviridae compreende um vasto e emergente grupo de vírus

que infecta uma ampla gama de espécies vegetais economicamente relevantes,

incluindo leguminosas, fumo, tomate, trigo e milho. Apesar disso, ainda não foi

caracterizado nenhum mecanismo de resistência, baseado em técnicas

biotecnológicas, o que proporciona forte interesse na área. Os geminivírus possuem

uma morfologia única por apresentar capsídeos icosaédricos geminados, seu genoma

é composto por DNA circular de fita simples (ssDNA), com 2500 a 3000 nucleotídeos

(nt), sendo convertido em DNA de fita dupla (dsDNA), também circular, no núcleo de

células infectadas (Hanley-Bowdoin et al., 1999). A família é subdividida em quatro

gêneros: Mastrevirus, Curtovirus, Topocovirus e Begomovirus (Rybicki et al., 2000).

Esta classificação é baseada no tipo de inseto vetor, gama de hospedeiros

(monocotiledôneas ou dicotiledôneas), número de componentes do genoma viral e

relacionamento filogenético (Van Regenmortel et al., 2000).

Todos os geminivírus encontrados no Brasil estão classificados como

Begomovirus, cujo representante típico é a espécie Bean golden mosaic virus

(BGMV), os quais podem apresentar um ou mais componentes genômicos e são

transmitidos para dicotiledôneas pela mosca-branca (Homoptera: Aleyrodidae).

Membros do gênero Begomovirus possuem predominantemente dois componentes

genômicos, denominados DNA-A e DNA-B. O DNA-A codifica as proteínas

envolvidas com a replicação e encapsidação da progênie viral; enquanto que o

DNA-B contém os genes requeridos para o movimento do DNA viral do núcleo para

o citoplasma e célula-a-célula. Ambos componentes estão envolvidos no

estabelecimento da infecção sistêmica em plantas.

Doenças causadas por Begomovirus têm se tornado uma grande

ameaça para agricultura brasileira, devido ao grande aumento populacional da

mosca-branca, à introdução de um novo biótipo do inseto com grande capacidade

de colonização de tomateiros e à grande capacidade de recombinação do vírus

(Galvão et al., 2003). Como conseqüência, vem sendo constatada no Brasil e, em

particular no Estado de Minas Gerais, uma proliferação crescente e uma grande

diversidade de Begomovirus em tomateiros, provavelmente oriundos de populações

nativas de vírus presentes em plantas silvestres, que se adaptaram ao tomateiro

após terem sido transmitidos pelo inseto vetor (Ambrozevicius et al., 2002; Ribeiro

et al., 1998; 2003). O manejo atual para controle de doenças causadas por

geminivírus é problemático e ineficiente, além de representar um grande risco para

o ambiente e para o consumo humano, uma vez que é baseado no controle da

população do inseto vetor por inseticidas. Sendo assim, o estabelecimento de um

mecanismo de resistência que possa ser introduzido em espécies economicamente

relevantes representaria ganhos não somente financeiros para os produtores, como

também traria benefícios para o meio ambiente e para a saúde pública.

Proteção cruzada, a base conceitual de proteção mediada pela expressão

da proteína do capsídeo de diversos vírus cognatos em plantas transgênicas (Beachy,

1988), não é um fenômeno bem documentado entre geminivírus. De fato, para o caso

específico de geminivírus bipartidos, já foi demonstrado que esta estratégia

aparentemente não produz resultados satisfatórios. Outras estratégias alternativas,

baseadas na biologia molecular do vírus, já foram utilizadas, como a expressão de

genomas virais defectivos em plantas transgênicas para a interferência na replicação

do vírus (Stanley et al., 1990; Frischmuth e Stanley, 1991), e a expressão de genes

anti-senso para a proteína Rep em plantas transgênicas. No entanto, a eficiência

destas estratégias, de uma maneira geral, foi limitada, conseguindo-se no máximo o

retardamento e a atenuação dos sintomas. O desenvolvimento de novas estratégias

moleculares, fundamentadas no conhecimento básico dos mecanismos bioquímicos e

moleculares que governam o ciclo de vida do vírus em células infectadas, torna-se

imprescindível para a produção de plantas transgênicas que eficientemente venham

conferir resistência a geminivírus.

Dentro desse contexto, é extremamente relevante que se detectem as

funções do hospedeiro, moduladoras das atividades bioquímicas codificadas pelo

genoma viral e envolvidas no estabelecimento do vírus na planta. Desta forma, a

caracterização bioquímica e funcional de proteínas da planta hospedeira que

interagem com proteínas virais auxilia na elucidação do mecanismo de infecção viral,

bem como, na estruturação de um modelo da interação planta:patógeno, possibilitando

o estabelecimento de estratégias de resistência. Esta caracterização já foi bem

utilizada na identificação de proteínas do hospedeiro que interagem com proteínas

virais durante o processo de replicação de geminivírus (Gutierrez et al., 2004; Alberter

et al., 2005; Malik et al, 2005). Porém, a maquinaria de transporte do hospedeiro que

possibilita a movimentação de geminivírus pela planta, possibilitando a instalação de

uma infecção sistêmica, ainda é muito pouco elucidada. (Rojas et al., 2001; Zhang et

al., 2001), pois as bases moleculares das interações entre proteínas de movimento

viral e de transporte do hospedeiro ainda não foram bem determinadas. Neste

contexto, a proteína NSP (“Nuclear Shuttle Protein”) que facilita o transporte do DNA

viral do núcleo para o citoplasma e, em cooperação com MP, para as células

adjacentes, consiste em um excelente alvo para elucidação molecular das interações

geminivírus-hospedeiro.

A via fundamental de NSP no movimento viral prediz que esta proteína viral

pode interagir com fatores do hospedeiro em diferentes compartimentos subcelulares.

De fato, foi demonstrado que NSP interage com uma acetilase nuclear de Arabidopsis

thaliana, designada AtNSI (“NSP interactor”) (McGarry et al., 2003), como também

com uma quinase receptora da membrana plasmática, designada NIK (“NSP-

interacting kinase”) de tomate, soja e Arabidopsis (Mariano et al., 2004). Em

Arabidopsis, NSP interage com três membros da família LRR-RLK, NIK1, NIK2 e NIK3,

as quais já foram demonstradas como sendo autênticas serina/treonina quinases com

propriedades bioquímicas consistentes com a função de receptor sinalizador (Fontes

et al., 2004). Dentro deste conceito, o objetivo principal deste trabalho foi a

identificação e caracterização, bioquímica e funcional, de uma quinase, pertencente à

subfamília PERK, a qual demonstrou-se é capaz de interagir com a proteína viral NSP.

II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 – Morfologia, organização genômica e função gênica de geminivírus.

A família Geminiviridae é caracterizada por apresentar seu genoma

composto por um ssDNA circular, com aproximadamente 2,6 até 3,0 kb, o qual

apresenta-se encapsidado em partículas icosaédricas geminadas e pode apresentar-

se mono ou bissegmentado. A partícula viral apresenta uma construção simples, não

sendo envelopado e seu capsídeo é alongado, exibindo uma simetria icosaédrica. Ë

composto por 22 capsômeros, os quais são constituídos por um único tipo de proteína,

denominada CP (“Coat protein”). O genoma viral codifica um único tipo de CP, a qual é

responsável por formar toda a estrutura típica de partícula geminada (Townsend et al.,

1985; Mullineaux et al., 1988; Kallender et al., 1988; Sunter et al., 1990;).

Além da encapsidação, a proteína CP de geminivírus monopartidos facilita

a transferência do DNA viral infeccioso para o interior do núcleo das células do

hospedeiro e é essencial para o movimento sistêmico do vírus (Lazarowitz et al., 1989;

Woolston et al., 1989; Liu et al., 1999; Boulton, 2002). Entretanto, em begomovírus

bipartidos a proteína CP pode ser dispensável durante a transmissão sistêmica em

algumas espécies de plantas (Gardiner et al., 1988; Jeffrey et al., 1996), indicando um

envolvimento da proteína CP de Begomovirus na especificidade do hospedeiro

(Stanley e Townsend, 1986; Gardiner et al., 1988). A proteína CP também determina a

especificidade do vetor (Briddon et al., 1990; Hofer et al., 1997, 2001) e protege o

ssDNA viral contra degradação durante a transmissão pelo inseto vetor (Azzam et al.,

1994) ou inoculação mecânica (Frischmuth e Stanley, 1998).

O genoma dos membros da família Geminiviridae pode ser organizado em

um ou dois componentes genômicos, denominados de DNA-A e DNA-B. Tanto

geminivírus mono quanto bipartidos apresentam uma região intergênica (IR

(“Intergenic Region”) em monopartidos, CR (“Common Region”) em bipartidos), na

qual ocorre o início da transcrição dos genes virais em ambas as fitas (Hamilton et al.,

1984; Lazarowitz et al., 1992; Stanley e Gay, 1993). Assim, a CR ou IR delimita duas

unidades de transcrição divergentes, uma na fita positiva ou viral (V-senso) e outra na

fita complementar ou negativa (C-senso) do vírus (Hanley-Bowdoin et al.,1999). Os

RNAs resultantes da transcrição das ORFs presentes no DNA viral são poliadenilados

e iniciam-se “upstream” da seqüência consenso TATA ou de elementos iniciadores, o

que indica que eles são realmente transcritos pela RNA polimerase II do hospedeiro

(Hanley-Bowdoin et al., 1999).

O gênero Mastrevirus, apresenta o genoma monopartido, o qual contém

uma grande (LIR – large intergenic region) e uma pequena região intergênica (SIR –

small intergenic region), as quais estão localizadas em lados opostos na molécula de

DNA viral circular. Além disso, também é caracterizado por: (1) uma seqüência de

DNA com aproximadamente 80 nt que está presente na partícula, anelada a partir da

SIR; e (2) a ocorrência de eventos de excisão em ambos transcritos (Schalk et al.,

1989; Wright et al., 1997) (Figura 2.1). Os representantes do gênero Mastrevirus (tal

como Maize streak virus, MSV e Wheat dwarf virus, WDV) são transmitidos por

cigarrinhas, insetos do gênero Cidulina, de uma maneira circulativa e não propagativa,

e infectam principalmente espécies de monocotiledôneas. Alguns membros do gênero,

como Tobacco yellow dwarf virus (TYDV) e Bean yellow dwarf virus (BeYDV),

possuem a capacidade de infectar dicotiledôneas.

O membro característico do gênero Curtovirus é um vírus economicamente

importante por infectar beterraba (Beet curly top virus, BCTV), e tem uma ampla gama

de hospedeiros. Também são transmitidos por cigarrinhas de uma maneira circulativa

não-propagativa, infectam dicotiledôneas e possuem o genoma monopartido, porém

sua organização genética diferencia-se de Mastrevirus, sendo que seu DNA codifica

seis ou sete proteínas. A fita viral codifica duas proteínas. A fita complementar contém

quatro genes que estão envolvidos na replicação viral, denter eles o gene C3 codifica

a proteína Ren, análoga à proteína “enhancer” da replicação de begomovírus

(Lazarowitz, 1992; Stenger, 1996) (Figura 2.1).

O gênero Topocuvirus possui apenas um representante, Tomato pseudo-

curly top virus (TPCTV) com componente genômico único, sendo transmitido por

Micrutalis malleifera (Membracidae), infecta dicotiledôneas e representa o mais

recente e o menos caracterizado gênero da família (Pringle, 1999). Sua organização

genética é similar a dos Curtovirus (Gutierrez, 2002). É o mais recentemente

identificado e menos caracterizado dos quatro gêneros, e apresenta características

tanto de mastrevírus quanto de begomovírus (Briddon et al., 1996). A CP apresenta

características mais similares às de mastrevírus, entretanto a organização dos genes

da fita complementar é similar a de begomovírus. Apresenta seis ORFs, sendo que

quatro delas estão na fita complementar, e duas ORFs na fita viral (Figura 2.1).

Figura 2.1: Organização genética dos quarto gêneros da família Geminiviridae. Alguns dos

membros mais estudados de cada gênero são utilizados como exemplo. Mastrevirus: MSV

(Maize streak virus), WDV (Wheat dwarf virus); SSV (Sugarcane streak vírus), BeYDV (Bean

yellow dwarf virus). Curtovirus: BCTV (Beet curly top virus). Topocuvirus: TPCTV (Tomato

pseudo-curly top virus). Begomovirus: BGMV (Bean golden mosaic virus), TGMV (Tomato

golden mosaic virus), ACMV (African cassava mosaic virus), SqLCV (Squash leaf curl virus),

TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus). Os códigos para as proteínas virias são: RepA, proteína

associada com a replicação que interage com retinoblastoma; Rep, proteína de iniciação da

replicação; REn, proteína “enhancer” da replicação; TrAP, proteína de ativação transcricional;

MP, proteína de movimento; CP, proteína do capsídeo. Proteínas com funções não definidas

estão nomeadas de acordo com sua posição no mapa genético. Regiões não codificadoras (ou

parte delas) correspondem à grande região intergênica (LIR) e à pequena região intergênica

(SIR) em mastrevírus, a região intergênica em curtovírus (IR) e à região comum (CR) para

topocuvírus e begomovírus. A seqüência invariável TAATATTAC, localizada na região

intergênica está indicada juntamente com o sítio de iniciação () para a replicação círculo

rolante. Setas vermelhas indicam genes localizados na fita complementar e as setas azuis na

fita viral.

Begomovírus monopartidos, como TYLCV (“Tomato yellow leaf curl virus”),

possuem seis genes, quatro na fita complementar, os quais codificam proteínas

envolvidas na replicação, transcrição e encapsidação do genoma viral, além de C4,

que codifica uma proteína envolvida no desenvolvimento de sintomas sistêmicos

(Jupin et al., 1994; Desbiez et al., 1995), e dois na fita viral, os quais estão envolvidos

com movimento intracelular e célula-a-célula do genoma viral. Na fita viral, encontra-se

o gene CP ou V1 que codifica a proteína do capsídeo. Os quatro genes da fita

complementar são: C1 (proteína Rep - replicação), C2 (TrAP - proteína

transativadora), C3 (REn – “enhancer” da replicação) e C4 (codifica uma proteína de

11 kDa) (Figura 2.1).

Em geminivírus bipartidos, as proteínas de replicação viral, encapsidação e

as de movimento estão separados em dois componentes genômicos, designados

DNA-A e DNA-B, sendo ambos necessários para o estabelecimento da infecção

sistêmica. O DNA-A está envolvido nos processos de replicação e encapsidação do

genoma viral e o DNA-B codifica os genes envolvidos no movimento sistêmico do vírus

pela planta e desenvolvimento de sintomas. Ambos os componentes possuem

tamanhos semelhantes, com cerca de 2600 nt, mas não apresentam homologia,

exceto pela CR, com aproximadamente 200 nt que é altamente conservada, onde está

localizada a origem de replicação e os promotores da síntese dos mRNAs virais

(Lazarowitz et al., 1992; Fontes et al., 1994).

O DNA-A possui o potencial para codificar cinco genes (AV1, AC1, AC2,

AC3 e AC4), sendo que AV1 ou CP é transcrito no sentido viral (Lazarowitz, 1992), e

os genes AC1 (proteína Rep – replicação), AC2 (proteína TrAP – proteína de

transativação) e AC3 (proteína Ren – ativadora da replicação) são transcritos no

sentido complementar (Sunter et al., 1990; 1992; Fontes et al., 1992; Fontes et al.,

1994). Além disso, há também a ORF AC4, transcrita no sentido complementar, que

apresenta função diferenciada. Nos monopartidos, está relacionada com o

desenvolvimento de sintomas sistêmicos (Jupin et al., 1994) e nos bissegmentados

sua função é desconhecida, mas sabe-se que mutações nessa ORF não resultam em

qualquer alteração no fenótipo de plantas infectadas (Gröning et al., 1994). Em alguns

vírus emergentes, como ToCMV (“Tomato chlorotic mottle vírus”), é também verificada

a presença de um novo gene AC5 no DNA-A, que é complementar ao gene AV1, e

cuja função ainda não foi elucidada (Galvão et al., 2003).

O DNA-B apresenta dois genes, BV1, na fita viral, e BC1, na fita

complementar, que expressam proteínas que atuam de maneira cooperativa para

mediar o movimento intra e intercelular do DNA viral (Lazarowitz et al., 1999; Gafni

al., 2002), uma vez que na ausência das mesmas, os vírus são incapazes de se

movimentarem na planta hospedeira (Elmer et al., 1988; Etessami et al., 1988). O

gene BC1 codifica a proteína MP (“Moviment Protein”), responsável pelo movimento

célula-a-célula do vírus via plasmodesmas, e o gene BV1, codifica a proteína NSP

(“nuclear shuttle protein), responsável pelo movimento do DNA viral entre núcleo e

citoplasma, sendo ambas necessárias para a patogenicidade de geminivírus

bissegmentados (Ingham et al., 1995).

Consistente com uma função de proteína de movimento clássica de vírus

de plantas, foi demonstrado que a proteína MP de BDMV (Bean dwarf mosaic virus) é

capaz de aumentar o limite de exclusão do plasmodesma, sendo capaz ainda de

mediar o movimento do genoma viral para a célula adjacente (Noueiry et al., 1994,

Sanderfoot et al., 1996). A proteína MP de SqLCV (Squash leaf curl virus) foi

localizada na membrana plasmática (Pascal et al., 1994). Entretanto, MP de SqLCV

também foi detectada na mesma fração do retículo endoplasmático que a proteína BiP

(“Binding protein”), a qual é residente do retículo endoplasmático (Ward et al., 1997).

Estas observações levaram estes autores a sugerir que MP é capaz de interagir com o

RE, formando canais para o movimento intercelular.

A proteína de movimento NSP realiza o transporte viral através do envelope

nuclear, atuando como “lançadeira” nuclear, apresenta um sinal de transporte nuclear

(NES) e um sinal de localização nuclear (NLS) (Lazarowitz et al., 1999). Experimentos

realizados com a proteína MP e NSP de SqLCV demonstraram que a proteína MP

relocaliza a proteína NSP na periferia da célula, enquanto que, na ausência da

proteína MP, NSP localiza-se no núcleo (Sanderfoot e Lazarowitz, 1995). Em SqLCV,

foi demonstrado que MP e NSP sofrem modificações pós-traducionais, sendo

fosforiladas durante o processo de translocação do genoma viral (Pascal et al., 1994),

e NSP apresenta atividade de ligação com o DNA (Pascal et al., 1994, Rojas et al.,

1998). Entretanto, para o caso de BDMV, foi demonstrado que ambas as proteínas

NSP e MP possuem a capacidade de ligar ao DNA de uma maneira dependente de

forma e tamanho (Rojas et al., 1998). Recentemente, a atividade de ligação ao DNA

dessas duas proteínas virais foi revisada para AbMV (“Abutilon mosaic virus”),

prevalecendo a idéia original de que, enquanto a proteína NSP interage fortemente

com DNA, MP não exibe atividade de ligação ao DNA (Shuo et al., 2001).

A proteína Rep (“Replication associated protein”) é a única proteína viral

essencial para suportar o processo de replicação do genoma viral, na presença de

fatores do hospedeiro (Stanley, 1995; Hanley-Bowdoin, 1996). É uma proteína

multifuncional que tem atividade de ligação seqüência específica ao dsDNA (Fontes et

al., 1992; 1994a, 1994b), catalisa a clivagem e ligação do DNA durante a síntese do

ssDNA (Heyraud-Nitschke et al., 1995; Laufs et al., 1995; Orozco e Hanley-Bowdoin,

1996), possui atividade repressora sobre a transcrição de seu promotor de forma vírus

específica (Eagle et al., 1994) e induz a expressão de proteínas do hospedeiro (Nagar

et al., 1995).

A proteína REn (“Replication Enhancer”) está associada ao acúmulo de

DNA viral durante o processo de infecção, podendo formar multímeros com a proteína

Rep; entretanto, esta proteína não é essencial para a replicação do genoma viral

(Sunter et al., 1990; Settelage et al., 1996). Mutações nesta proteína causam

decréscimo na eficiência de replicação do genoma viral e atenuação de sintomas.

Durante a infecção viral, a proteína REn acumula no núcleo em níveis similares aos

observados para a proteína Rep, sugerindo uma ação conjunta durante o processo de

replicação do genoma viral (Pedersen et al., 1994; Nagar et al., 1995). Consistente

com esta observação, a proteína REn forma oligômeros com a proteína Rep.

A proteína TrAP (“Transactivator Protein”) possui a atividade de ativador

transcricional, sendo importante na regulação da expressão de genes virais NSP e CP

(Hayes e Buck, 1989; Sunter e Bisaro, 1992). Elementos conservados, presentes em

promotores de genes de expressão tardia de muitos geminivírus têm sido identificados

como alvos funcionais da proteína TrAP. Mutações nestes elementos mostram que

eles perdem a capacidade de serem transativados por TrAP (Ruiz-Medrano et al.,

1999). TrAP também mostrou-se capaz de ativar promotores cromossomais

influenciando a expressão de genes do hospedeiro (Sunter e Bisaro, 1994). Sabe-se

que esta proteína tem a capacidade de se ligar a zinco e de sofrer modificações pós-

traducionais como fosforilação (Hartitz et al., 1999). Além disso, TrAP é um

determinante de patogenicidade dos begomovírus e funciona como supressor de

PTGS (“PostTranscriptional Gene Silecing”).

A ORF AC4 é uma pequena ORF contida dentro da seqüência do DNA que

codifica para Rep, porém, em diferente quadro de leitura. A ORF AC4 de begomovírus

bipartidos possui o homólogo C4 em curtovírus, que codifica uma proteína de massa

molecular de 10 kDa (Elmer et al., 1988). Experimentos com plantas transgênicas

contendo genes repórteres fusionados a promotores do gene Rep de TGMV (“Tomato

golden mosaic vírus”) mostraram que a expressão de Rep pode ser regulada por AC4

de begomovírus (Gröning et al., 1994; Eagle et al., 1997). Porém, mutações na ORF

AC4 de TGMV não interferem no processo de infecção viral e, conseqüentemente, a

função biológica da proteína permanece indeterminada (Pooma et al., 1996).

2.2 – Mecanismo de replicação de geminivírus

Os geminivírus replicam seu DNA via mecanismo de replicação círculo

rolante no núcleo das células de plantas infectadas, onde o ssDNA é convertido em

um dsDNA intermediário, também denominado de RF (Forma Replicativa). A RF serve

como molde para síntese de novos ssDNAs e para mRNA virais. O processo de

síntese da fita complementar e conversão do genoma do vírus em dsDNA ainda é

pouco elucidado. Entretanto, as evidências indicam que ela é realizada por fatores do

hospedeiro, não contando, portanto, com a participação de nenhum produto viral

(Palmer e Rybicki, 1998). Este mecanismo de replicação pode ser dividido em três

etapas: a) conversão de ssDNA viral em dsDNA (RF); b) síntese de uma molécula de

ssDNA no sentido viral, contendo várias unidades genômicas (multímero ou

concatâmero), usando como molde a fita complementar da RF; e c) clivagem e

religação das unidades genômicas do multímero, gerando moléculas circulares de

ssDNA correspondentes ao genoma viral (Timmermens et al., 1994; Laufs et al.,

1995).

A análise da seqüência de geminivírus mostra a existência de um

nonanucleotídeo, 5’-TAATATTAC, conservado em todas as espécies, que se localiza

dentro da IR. Esse nonanucleotídeo, também designado por elemento estruturalmente

conservado (SCE – “Structure Conserved Element”), está localizado dentro de uma

seqüência conservada de 30 nt, que correspondem a uma seqüência repetida

invertida, com o potencial para a formação de uma estrutura em forma de grampo. A

manutenção conformacional dessa estrutura conservada é necessária para a função

da origem de replicação (Orozco e Hanley-Bowdoin, 1996). O SCE, flanqueado pelas

seqüências repetidas invertidas ricas em CG, representa a alça (“loop”) da estrutura

em forma de grampo, a qual representa o sítio de início da replicação da fita positiva

(Fontes et al., 1994b; Laufs et al.,1995; Heyraud-Nitshck et al.,1995; Orozco et al.,

1998).

Sendo assim, SCE contém o sítio de ligação específico para a proteína Rep

sobre o qual atua, promovendo a clivagem específica na fita positiva do genoma viral

para iniciar a replicação círculo rolante (Laufs et al., 1995; Stanley, 1995), além de

outros cis-elementos que contribuem para o reconhecimento específico da origem

(Orozco et al., 1998). A proteína Rep reconhece seqüências específicas na região 5’

da estrutura do SCE, ligando-se a elas com alta afinidade e especificidade (Fontes et

al., 1994a; 1994b), sendo que, provavelmente, atinge o sítio de clivagem com o auxílio

da proteína Ren e os fatores do hospedeiro (Hanley-Bowdoin et al., 1999).

A proteína Rep exibe atividade de endonuclease seqüência-específica e

hidrolisa SCE na posição indicada para o início da replicação – 5’-TAATATT

(+1)

AC –

(Laufs et al., 1995). Desse modo, a fita senso é estendida a partir da extremidade 3’-

OH livre pela maquinaria replicativa da célula e uma atividade de helicase parece ser

requerida para o deslocamento da fita senso clivada. Entretanto, a proteína não

apresenta nenhuma homologia com nenhuma DNA polimerase conhecida e todas as

evidências indicam que ela não tem atividade de DNA polimerase, a qual seria

proporcionada por enzimas do hospedeiro (Laufs et al., 1995). Além disso, Rep atua

de maneira vírus-específica, reconhecendo a origem de replicação cognata, através de

interação específica com seu sítio de ligação (Fontes et al., 1994a).

A proteína CP também participa do processo de replicação do genoma viral

(Saunders et al., 1991; Stenger et al., 1991). Os produtos de replicação círculo rolante

são acumulados tanto como dsDNA como ssDNA, porém, a ausência ou inativação de

CP geralmente resulta na redução dos níveis de ssDNA sem que ocorra a redução no

nível de dsDNA (Brough et al., 1988; Briddon et al., 1989). No caso de SqLCV,

mutantes no sinal de localização nuclear (NLS) de CP também reduzem a acumulação

de ssDNA (Qin et al., 1998) e isto está ligado à sua inabilidade de se ligar ao ssDNA

por descompartimentalização (Padidam et al., 1999). Estes resultados claramente

sugerem uma via na qual CP altera a natureza dos produtos da replicação do DNA

viral.

Por causa de sua limitada capacidade codificante, os geminivírus fornecem

apenas os fatores requeridos para iniciar a replicação por círculo rolante e usam a

DNA polimerase da planta para amplificar seus genomas (Egelkorout et al., 2001).

Assim, é necessário que as células infectadas estejam sintetizando DNA, caso

contrário, as enzimas responsáveis pela síntese não estarão presentes em

concentrações suficientes para permitir a replicação dos vírus. Como conseqüência,

esses vírus precisam induzir a síntese de enzimas hospedeiras (responsáveis pela

síntese da RF) e de novas fitas de ssDNA de sentido viral, antes da replicação (Nagar

et al., 1995). Com isso, o processo de replicação de geminivírus contribui para o

estudo dos mecanismos que mediam e regulam a replicação do DNA e o ciclo celular

em plantas (Hanley-Bowdoin et al., 1999).

2.3. Movimento do genoma viral durante o processo de infecção

O movimento do vírus célula-a-célula e o sistêmico são processos

imprescindíveis para o estabelecimento de uma infecção produtiva. O movimento

célula-a-célula é mediado por proteínas virais denominadas proteínas de movimento

que alteram a arquitetura da célula infectada, possibilitando a superação da barreira

intracelular, constituída pela parede celular. Pelo fato dos geminivírus apresentarem

replicação nuclear, o transporte desses vírus requer uma etapa adicional, que é o

deslocamento intracelular dos genomas virais recém replicados do núcleo para o

citoplasma. Conseqüentemente, o transporte intracelular do genoma viral requer uma

proteína de movimento adicional, designada NSP, além da proteína envolvida no

transporte célula-a-célula, designada MP. Assim, o movimento do genoma viral é

facilitado pela ação cooperativa entre as duas proteínas de movimento NSP e MP

(Sanderfoot e Lazarowitz, 1995, 1996).

Nosso entendimento do movimento de geminivírus em plantas infectadas

tem avançado com a caracterização genética e bioquímica das proteínas de

movimento de SqLCV e BDMV. Em SqLCV, as proteínas de movimento NSP (BV1) e

MP (BC1) possuem funções distintas e independentes no mecanismo responsável

pelo movimento viral (Pascal et al., 1993; 1994). As propriedades bioquímicas e

localização subcelular dessas proteínas sugerem que, enquanto NSP participa do

movimento do genoma viral do núcleo para o citoplasma, MP age na membrana

plasmática e parede celular, a fim de facilitar o movimento viral entre células. Foi

demonstrado que a proteína MP se move entre as células, aumentando o limite de

exclusão dos plasmodesmas e facilitando o movimento do genoma viral (Noueiry et al,

1994). As atividades de ligação ao DNA de MP e NSP de BDMV são dependentes da

forma e do tamanho do fragmento de DNA (Rojas et al., 1998).

A proteína de movimento NSP possui a capacidade de interagir

especificamente com o ssDNA viral facilitando o seu transporte do núcleo para o

citoplasma. Já foi demonstrado também que a proteína NSP se liga a ssDNA com alta

afinidade, enquanto que a proteína MP parece ter baixa afinidade por ácidos nucléicos

(Pascal et al., 1994). Em begomovírus, a proteína NSP transporta o DNA viral através

dos poros da membrana nuclear utilizando as vias normais de exportação/importação

usadas por proteínas celulares, RNAs e ribonucleoproteínas.

Dois mecanismos distintos de transporte célula-a-célula do DNA viral, os

quais basicamente diferem na natureza do complexo do DNA viral transportado para

as células adjacentes não-infectadas, são suportados por estudos relevantes até o

presente momento (Noueiry et al., 1994; Sanderfoot e Lazarowitz, 1996). No primeiro

modelo, NSP facilita o movimento intracelular do genoma viral do núcleo para o

citoplasma, onde é substituída por MP que transporta o DNA viral para as células

adjacentes via plasmodesmas (Noueiry et al., 1994; Rojas et al., 1998). No segundo

modelo, como no caso do SqLCV floema-limitado, MP facilita o transporte intracelular

mediado por NSP do DNA viral do núcleo para o citoplasma e então media o

transporte do complexo NSP-DNA para as células adjacentes via túbulos derivados do

ER induzidos pela infecção viral (Sanderfoot e Lazarowitz, 1995; 1996; Sanderfoot et

al., 1996; Ward et al., 1997; Hehnle et al., 2004).

As proteínas CP de geminivírus estão envolvidas principalmente com o

processo de encapsidação do genoma viral. Além disso, em geminivírus monopartidos

esta proteína é absolutamente essencial para o movimento do vírus (Lazarowitz et al.,

1989; Boulton, 2000), mas, em bipartidos é dispensável para a infecção sistêmica em

algumas espécies de plantas hospedeiras, indicando um envolvimento da CP de

begomovírus com a especificidade do hospedeiro (Stanley e Townsed, 1986; Gardiner

et al., 1988; Pooma et al., 1996). O requerimento de CP é de fundamental importância

para o movimento dos vírus pertencentes aos gêneros Mastrevirus e Curtovirus

(Unseld et al., 2001), uma vez que eles são limitados ao floema e dependem

especificamente do fluxo de fotoassimilados para causarem infecção sistêmica no

hospedeiro. Em mastrevírus e curtovírus, as proteínas CP e MP interagem

especificamente realizando funções equivalentes à MP e NSP de begomovírus

bipartidos (Liu et al., 1999; Kotlizky et al., 2000). Assim, CP liga ao ssDNA, transporta-

o através da membrana nuclear e interage com a MP para mediar o movimento do

complexo CP-ssDNA célula-a-célula via plasmodesmas (Palmer e Ribicki, 1998).

Além das proteínas virais, o transporte de geminivírus pode envolver a

formação de microtúbulos em células recém-infectadas. Em células infectadas por

SqLCV, foi observada a formação de túbulos, ausentes em plantas sadias ou

inoculadas com mutantes de MP defectivos em movimento (Ward et al., 1997).

Durante a infecção por SqLCV, ocorre a formação do complexo NSP-ssDNA, o que

propõe que seu genoma se move de uma célula a outra por meio de interações com

túbulos que atravessam a parede de células meristemáticas do floema e cuja

formação é induzida pelo vírus.

2.4. Interação de proteínas virais com proteínas do hospedeiro

Os geminivírus correspondem a vírus de planta que são altamente

dependentes de fatores do hospedeiro para sua proliferação (Liu et al., 1999), e

utilizam a maquinaria celular do hospedeiro para executar as funções básicas de

replicação e movimento para o estabelecimento de uma infecção produtiva. Portanto,

o ciclo de infecção de geminivírus depende extensivamente de interações

intermoleculares vírus-hospedeiro, as quais são requeridas tanto para a

compatibilidade básica (Ach et al., 1997; Kong et al., 2000; McGarry et al., 2003;

Castilho et al., 2003; Bagewadi et al., 2004; Carvalho e Lazarowitz, 2004; Selth et al.,

2005) quanto para modulação da infecção viral pela inativação de respostas de defesa

(Hao et al., 2003; Wang et al., 2003; Fontes et al., 2004; Mariano et al., 2004; Wang et

al., 2005). A descoberta de cada nova interação entre fatores do hospedeiro e

proteínas virais auxilia na elucidação das bases moleculares da patogenicidade

(Whitham e Wang, 2004). É particularmente interessante o aspecto único do ciclo de

infecção de geminivírus que requer uma função de movimento para facilitar o

transporte do DNA viral do núcleo, onde é replicado, para o citoplasma (Lazarowitz e

Beachy, 1999; Gafni e Epel, 2002;).

Experimentos realizados com BGMV demonstraram que esses vírus podem

controlar o ambiente celular em células diferenciadas de maneira a propiciar condições

para a replicação viral (Wang et al., 1996). Com a utilização do sistema duplo-híbrido,

foi possível detectar interações específicas entre a proteína Rep de WDV e a proteína

retinoblastoma humana (Ach et al., 1997), a qual está envolvida na regulação do ciclo

celular, determinando a transição da fase G1 para a fase S. A identificação de

proteínas homólogas a proteínas da família retinoblastoma em plantas, sugere uma

estreita relação entre a regulação do ciclo celular de plantas e animais. Em

Arabidopsis, a proteína Rep é capaz de interagir como a histona H3, o que é

consistente com sua função durante o processo de replicação do DNA viral (Kong e

Bowdoin, 2002). Esta interação pode alterar ou desfazer os nucleossomos, facilitando

assim a replicação e transcrição do genoma viral. Rep também interage com a

proteína GRIMP, a qual apresenta um domínio de quinase e um domínio central de

ligação à ciclina (cdc2), o que sugere sua participação no processo de divisão celular

(Bass et al., 2000).

A via fundamental de NSP no movimento do vírus prediz que esta proteína

viral pode interagir com fatores do hospedeiro em diferentes compartimentos

subcelulares. Já foi demonstrado que NSP possui a capacidade de interagir com uma

acetilase nuclear de Arabidopsis thaliana, designada AtNSI (“NSP interactor”), e

também com uma quinase receptora da membrana plasmática, designada NIK (“NSP-

interacting kinase”) de tomate, soja e Arabidopsis (Mariano et al., 2004; McGarry et al.,

2003). Em Arabidopsis, NSP interage com três membros da família LRR-RLK, NIK1,

NIK2 e NIK3, as quais já foram demonstradas como sendo autênticas serina/treoninas

quinases com propriedades bioquímicas consistentes com a função de receptor

sinalizador (Fontes et al., 2004).

Apesar da interação de NSP com AtNSI e NIK, NSP não funciona como

substrato para nenhuma destas enzimas do hospedeiro. De fato, AtNSI não acetila

NSP, mas acetila CP (McGarry et al., 2003). Durante a replicação círculo rolante do

DNA viral, supõe-se que CP media a partição de ssDNA seqüestrando o ssDNA viral e

o afastando da maquinaria de replicação, e tornando-o disponível para a ligação com

NSP e exportação. A movimentação de CP entre o “pool” de ssDNA seqüestrado e o

complexo de replicação foi proposta como sendo regulada por AtNSI através da

interação com NSP (McGarry et al., 2003). De acordo com este modelo, a

superexpressão de AtNSI aumenta a infecção por CaLCuV (“Cabbage leaf curl virus”),

e a diminuição da capacidade de NSP se ligar com AtNSI gera um defectivo mutante

viral (McGarry et al., 2003; Carvalho e Lazarowitz, 2004;). No caso da quinase

receptora-like NIK, NSP inibe sua atividade de quinase suprimindo a resposta antiviral

mediada por NIK (Fontes et al., 2004), esta interação não é vírus-específica, pois

AtNIK é capaz de interagir com TGMV e TCrLYV (“Tomato crinkle leaf yellows virus”).

A inativação do gene NIK aumenta a susceptibilidade dos mutantes diante da infecção

viral (Fontes et al., 2004).

2.5 – Família PERK em plantas

A família PERK (“Proline-rich Extensin-like Receptor Kinase”) de

Arabidopsis thaliana é composta por 15 receptores transmembrana, que apresentam

um domínio extracelular rico em prolina, cuja função biológica ainda é desconhecida

(Shiu e Bleecker, 2003). Entretanto a supressão anti-senso de muitos membros da

família AtPERK, em plantas transgênicas, resulta em vários defeitos de crescimento. A

família AtPERK é relacionada com a Brassica napus PERK1 e apresenta homologia

com proteínas associadas à parede celular de plantas (Silva e Goring, 2002)

Evidências mostram que a parede celular não contribui somente com a

força mecânica e estruturação da célula. Mudanças na percepção e sinalização da

parede celular ocorrem tanto durante o crescimento e desenvolvimento da planta

quanto durante o ataque de patógenos e insetos (Pilling e Hofte, 2003). De fato, a

BnPERK1 é rapidamente induzida por ferimento (Silva e Goring, 2002), podendo

responder a ataques de insetos (Pilling e Hofte, 2003). Foi demonstrada a influência

de uma via para as quinases associadas à parede celular (WAKs – Wall Associated

Kinases), as quais estão localizadas na membrana plasmática e fortemente

associadas com a parede celular. Estas quinases são covalentemente ligadas à

pectina, e a supressão anti-senso de genes da família WAK leva a uma diminuição da

expansão celular (Kohorn, 2001; Verica e He, 2002).

A família PERK pode representar

um segundo grupo com função similar.

Estudos anteriores referentes à filogenia de quinases em Arabidopsis

indicam que seu genoma codifica 19 quinases com domínios ricos em prolina (Shiu e

Bleecker, 2001; Shiu e Bleecker, 2003), sendo que destas, quatro são RLCK

(“Receptor-Like Cytoplasmic Kinase”) – At1g70450, At5g56790, At1g55200,

At3g13690, enquanto 15 quinases são possíveis proteínas quinases receptoras de

membrana com um domínio extracelular rico em prolina similar ao encontrado em

BnPERK1, designadas AtPERK 1-15 (Silva e Goring, 2002). O comprimento do

domínio extracelular de AtPERK é consideravelmente diferente entre os diferentes

membros, sendo que alguns apresentam regiões ricas em prolina tanto no domínio

extracelular quanto no citoplasmático. AtPERK6 contém uma região rica em

asparagina no domínio extracelular. Nenhum dos membros da família PERK, como

BnPERK1, possui um peptídeo sinal no N-terminal, e possuem um domínio

transmembrana interna, seguido por uma extensão de resíduos de aminoácidos

positivamente carregados. Esta organização possivelmente posiciona o domínio de

quinase no lado citosólico da membrana plasmática. De acordo com estas predições

baseadas na seqüência, foi demonstrado que BnPERK1 está localizada na membrana

plasmática (Silva e Goring, 2002).

III. OBJETIVOS

O estudo dos mecanismos envolvidos na interação planta:patógeno são de

extrema importância para se elucidar o desenvolvimento da doença e os prováveis

mecanismos de resistência que são ativados durante a infecção por geminivírus.

Desta forma, a caracterização de proteínas da planta hospedeira que interagem com

proteínas virais corresponde a uma importante ferramenta na elucidação do

mecanismo de infecção viral, bem como, na estruturação de um modelo da interação

planta:patógeno, possibilitando o estabelecimento de estratégias de resistência. Sendo

assim, o objetivo principal deste trabalho foi a caracterização bioquímica e funcional de

uma serina/treonina quinase pertencente à subfamília de quinases receptoras de

membrana, PERK, a qual interage com a proteína viral NSP, durante o curso da

infecção viral.

IV. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Material vegetal

Em todos os experimentos que envolveram material vegetal, inclusive para

a obtenção de mutantes, foram utilizadas plantas de Arabidopsis thaliana ecotipo

Columbia (Col Ø). As sementes foram esterilizadas e vernalizadas a 4°C por dois dias

no escuro e então expostas à luz branca. As plântulas foram mantidas a 22°C em

placas contendo meio MS ½ força (adaptado de Murashige e Skoog, 1962) por três

semanas, e então transferidas para solo enriquecido com substrato vegetal na

proporção 1:1. Plantas foram crescidas em câmara de crescimento a 22°C, sob

condições de dia-longo (16 horas de luz/8 horas de escuro).

4.2. Análises de seqüência e filogenética da família AtPERK

As comparações de seqüências de nucleotídeos foram realizadas com o

auxílio de programas computacionais encontrados no endereço eletrônico

http://www.genome.ad.jp/SIT/SIT.html

(“Sequence Interpretion Tools”), onde estão os

endereços dos programas: BLAST (http://blast.genome.ad.jp/

) e CLUSTALW

(http://clustalw.genome.ad.jp/

). A predição de domínios foi feita com o auxílio do

programa PSORT (“Prediction of protein Sorting signals in amino acids sequences –

http://psort.nicbb.ac.jp

). As seqüências utilizadas para a análise de homologia

encontram-se listadas na Tabela 4.1. A tradução da seqüência de DNA foi feita com o

auxílio do programa “Translate toll” (encontrado na homepage: Expasy Proteomics

Server – http://www.expasy.org/

). A análise do potencial de fosforilação da proteína

NsAK foi feita com o auxílio do programa NetPhos 2 – Prediction Server

(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos

). As análises filogenéticas foram conduzidas

em matrizes de seqüências alinhadas com o auxílio do software DNAMAN 3.0, com a

opção “neighbor-joining and bootstrap”. As seqüências foram obtidas a partir de TAIR

homepage (http://www.arabidopsis.org

). As fontes e os números de acesso ao

“GenBank” das seqüências utilizadas são fornecidas na Tabela 4.1.

4.3. Construção de plasmídeos baseados no pDONR 201

O cDNA completo de NsAK (

NM_113366) foi obtido do Arabidopsis

Biological Resource Center. Todos os outros plasmídeos recombinantes foram

construídos através do sistema GATEWAY (Invitrogen Life Technologies, Inc.).

Resumidamente, os fragmentos específicos de DNA foram amplificados por PCR

(“Polimerase Chain Reaction”) com oligonucleotídeos específicos que introduziram

extensões adaptadoras apropriadas, necessárias para a recombinação gênica,

mediada pela enzima BP Clonase (Invitrogen Life Technologies, Inc.), que introduziu

estes fragmentos no vetor de entrada pDONR201, a reação foi realizada de acordo

com as especificações do fabricante. O cDNA completo de NsAK, o domínio de

quinase C-terminal de NsAK (KD, codificando os aminoácidos 238-652) e sua versão

truncada (ΔKD

392-652

) foram criados por amplificação por PCR com oligonucleotídeos

específicos, respectivamente, AtNsAKAFG e AtNsAKStG, NsAK712F-GA e

AtNsAKStG, NsAK1174FMet-GA e AtNsAKStG (Tabela 4.2), a partir do cDNA

NM_113366 e inseridos no vetor de entrada pDONR201.

Os plasmídeos obtidos foram transformados em DH5α por choque térmico

(Sambrook et al., 1989). A seleção foi realizada em placa contendo meio LB sólido

com antibiótico seletivo, o vetor pDONR201 contém um gene de resistência a

canamicina. Os transformantes foram confirmados por PCR (Sambrook et al, 1989),

com oligonucleotídeos específicos para a seqüência do gene de interesse

. Os clones

resultantes pDON-NsAK, pDON-KDNsAK e pDON-ΔKDNsAK, foram utilizados para

transferir os respectivos fragmentos em vetores de expressão. A região codificadora

de NSP foi amplificada a partir do DNA-B de CaLCuV (Hill et al., 1998) e inserida no

vetor de entrada, conforme já descrito por Fontes et al. (2004).

Tabela 4.1. Seqüências das proteínas utilizadas nas análises de homologia e filogenética

Abreviação Proteína

Número de

Acesso no

GenBank

BnPERK1

Proteína quinase receptora PERK1 (Proline-rich Extensin-like

Receptor Kinase de Brassica napus)

AY028699

OsPERK1 Putativa proteína quinase receptora PERK1 (Oriza sativa) NP_913464

AtPERK1/

AtNsAK

Putativa proteína serina/treonina quinase receptora

PERK1 (Arabidopsis thaliana) – At3g24550

NM_113366

AtPERK2

Putativa proteína quinase receptora (Arabidopsis thaliana) –

At3g24400

AY536853

AtPERK3

Putativa proteína serina/treonina quinase receptora

(Arabidopsis thaliana) –At3g24540

NM_113365

AtPERK4

Putativa proteína serina/treonina quinase receptora

(Arabidopsis thaliana) – At2g18470

NM_127403

AtPERK5

Putativa proteína serina/treonina quinase receptora

(Arabidopsis thaliana) – At4g34440

NM_119609

AtPERK6

Putativa proteína serina/treonina quinase receptora

(Arabidopsis thaliana) – At3g18810

NM_112767

AtPERK7

Putativa proteína serina/treonina quinase receptora

(Arabidopsis thaliana) – At1g49270

NM_103818

AtPERK8

Putativa proteína serina/treonina quinase receptora

(Arabidopsis thaliana) – At5g38560

NM_123217

AtPERK9

Putativa proteína quinase receptora (Arabidopsis thaliana) –

At1g68690

AY113877

AtPERK10

Putativa proteína serina/treonina quinase receptora

(Arabidopsis thaliana) – At1g26150

NM_102380

AtPERK11

Putativa proteína serina/treonina quinase receptora

(Arabidopsis thaliana) – At1G10620

NM_100938

AtPERK12

Putativa proteína serina/treonina quinase receptora

(Arabidopsis thaliana) – At1g23540

NM_102203

AtPERK13

Putativa proteína serina/treonina quinase receptora

(Arabidopsis thaliana) – At1g70460

NM_105714

AtPERK14

Putativa proteína quinase receptora (Arabidopsis thaliana) –

At4g32710

AY536857

AtPERK15

Putativa proteína serina/treonina quinase receptora

(

Arabidopsis thaliana) – At1g52290

NM_104108

Tabela 4.2. Oligonucleotídeos utilizados em amplificações específicas

Oligonucleotídeo Seqüência

Região de

anelamento

AtNsAKAFG Fwd

5’-AAAAAGCAGGCTTCACAATGtccacagcgccgtc

attB1 parcial

Ponto +1 de

NsAK

AtNsAKStG Rvs

5’-AGAAAGCTGGGTCttaaagagagggtccactata

attB2 parcial

Região

terminal de

NsAK

NsAK712F-GA

5’-AAAAAGCAGGCTTCACAATG

agtagcagtggtgg

attB1 parcial

Nucleotídeo

412 de

NsAK

NsAK1174FMetGA

5’-AAAAAGCAGGCTTCACAATG

cttcatgaagattg

attB1 parcial

Nucleotídeo

1174 de

NsAK

NsAK-Fwd

5'-cagttcctcaactcgatctagtccc

Região

flanqueadora

direita do T-

DNA

NsAK-Rvs

5'-cctccaatggcgattcctacc

Região

flanqueadora

esquerda do

T-DNA

SALK LB1

5'-

ggcaatcagctgttgcccgtctcactggtg

Região

interna do T-

DNA

* Estão indicadas na tabela as seqüências parciais de recombinação.

4.4. Identificação de proteínas do hospedeiro que interagem com NSP de

geminivírus

4.4.1. Obtenção de biblioteca de cDNA de Arabidopsis thaliana

Uma biblioteca de cDNA de Arabidopsis thaliana foi obtida a partir do

mRNA total, o qual foi extraído pelo método TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Inc.).

O cDNA foi sintetizado por reação de RT-PCR por meio do Kit SuperScript RT-PCR

(Invitrogen Life Technologies, Inc.), segundo manual técnico do produto, utilizando-se

oligonucleotídeo poli-dT como iniciador. As condições de reação adotadas consistiram

de 2 horas a 45º C, 15 minutos a 75

C para inativação da transcriptase reversa, 3

minutos a 94

C, seguido de 30 ciclos (45 segundos a 94

C, 1 minuto e 30 segundos a

C e 2 minutos a 72

C), e posteriormente 10 minutos a 72

Esta biblioteca de cDNA foi fusionada ao domínio de ativação de GAL4 no

vetor pEXAD502 Leu

(Invitrogen Life Technologies, Inc.). O clone pBD-NSPCLCV, o

qual contém o domínio de ligação ao DNA de GAL4 fusionado à seqüência de NSP de

CaLCuV, já foi previamente descrito (Fontes et al., 2004). Os plasmídeos

recombinantes pBD-NSPTGMV, pBD-NSPTCrYLC, e pBD-NSPCLCV, contendo o

domínio de ativação GAL4 fusionado a seqüências de NSP de TGMV (Fontes et al.,

1994b), TCrYLC (Galvão et al., 2003) e CaLCuV (Hill et al., 1998), respectivamente, já

foram previamente descritos (Fontes et al., 2004).

4.4.2. Ensaio de Sistema Duplo Híbrido

A levedura utilizada foi Saccharomyces cerevisae da linhagem MaV203

(MATα, leu2-3,112, trp1-901, his3200, ade2-101, gal4, gal80,SPAL10::URA3,

GAL1::lacZ, HIS3UAS GAL1::HIS3@LYS2, can1R, cyh2R), a qual é deficiente na

produção de triptofano, leucina e uracila (Trp

, Leu

, Ura

). Células competentes de

MaV203 foram seqüencialmente transformadas com pBD-NSPCLCV e 25 μg da

biblioteca de cDNA em pEXAD502, juntamente com 3 μg de DNA carreador de

esperma de salmão, pelo método acetato de lítio/polietilenoglicol (PEG). Os

transformantes foram plaqueados em meio seletivo (SD, Synthetic Dropout) com

deficiência em triptofano, leucina, uracila e histidina, mas suplementados com 3-

aminotriazol 25 mM e crescidos por três a cinco dias a 30°C. As interações foram

posteriormente confirmadas por ensaio de atividade de β-galactosidase, a partir de

extratos de levedura, como descrito em Uhrig et al. (1999). As células de leveduras

foram coletadas na fase exponencial e ressuspendidas em tampão de extração

(fosfato de sódio 100 mM pH 7,0; KCl 10 mM; MgSO

1 mM; β-mercaptoetanol 50 mM

e dodecil sulfato de sódio (SDS) 0,05% (p/v)), e a atividade de β-galactosidase foi

medida com o-nitrofenil β-D-galactopiranose (ONPG, Sigma). Foram usados, como

controle negativo, leveduras não transformadas e transformadas apenas com a

construção de DNA e, como controle positivo, leveduras transformadas com pGAL4,

expressando a proteína GAL4 completa.

Células transformadas com o vetor vazio foram usadas como controle

negativo, leveduras transformadas com pGAL4 que expressa o transativador completo

de GAL4 foram usadas como controle positivo. Leveduras transformadas somente

com as construções de cDNA foram usadas para testar se as proteínas codificadas

pelos mesmos seriam capazes de transativar ou promover a complementação de

ligação das proteínas recombinantes. Aproximadamente, foram obtidos 5 x 10

transformantes, estimativa baseada no número de transformantes crescidos por placa

de SD Trp

e Leu

. O DNA plasmidial foi recuperado de levedura e inserido em E. coli

linhagem XL1 Blue (Stratagene) por eletroporação (Sambrook et al., 1989).

4.5. Confirmação e caracterização da interação entre NSP e AtNsAK in vitro

4.5.1. Transcrição e tradução in vitro de NsAK

Para a transcrição e tradução in vitro das proteínas, a região codificadora

de NsAK e os respectivos fragmentos KD

238-652

e ΔKD

392-652

foram transferidos do vetor

de entrada para o vetor de transcrição dependente da T7 RNA polimerase; pDEST14,

por meio de uma reação de recombinação, com o auxílio da enzima LR Clonase

(Invitrogen Life Technologies, Inc.), resultando nos clones pTR-NsAK, pTR-KDNsAK e

pTR-ΔKDNsAK. Para expressar in vitro as versões intacta e truncadas de NsAK, 1 μg

de plasmídeo recombinante, contendo o inserto apropriado em pDEST14 (como

descrito anteriormente) foi expresso em um sistema de transcrição e tradução in vitro,

contendo células lisadas de reticulócitos de coelho, suplementado com [

S]-metionina

e T7 RNA polimerase (Promega).

4.5.2. Expressão heteróloga e purificação da proteína fusionada GST-NSP

Células competentes de Escherichia coli, estirpe BL21::DE3 pLysS, foram

transformadas com o plasmídeo de expressão pGST-NSPCLCV (Fontes et al., 2004),

contendo a seqüência de GST fusionada a região codificadora de NSP de CaLCuV,

por choque térmico (Sambrook et al., 1989). A seleção foi realizada por plaqueamento

em meio de cultura LB sólido contendo antibiótico seletivo (ampicilina). Os

transformantes foram confirmados por PCR (Sambrook et al., 1989) com

oligonucleotídeos específicos para o gene de interesse

O clone pGST-NSPCLCV em bactéria E. coli BL21::DE3 pLysS, que

contém um gene da T7 RNA polimerase sob o controle do promotor lac (NOVAGEN)

foi crescidos em 1 L de meio líquido seletivo LB, contendo ampicilina 100 mg.L

-1

, até

600

= 0,6. O clone foi induzido com isopropilil-β-D-thiogalactopiranosídeo (IPTG) 0,4

mM e incubado a 20°C por 16 horas a 200 rpm. Após o período de indução, o nível de

proteína produzida foi analisado por meio de extração de proteínas totais, solúveis e

insolúveis (segundo manual Novagen), as quais foram analisadas por eletroforese em

gel de poliacrilamida contendo dodecyl sulfato de sódio (Sodium Dodecyl Sulfate-

PolyAcrilamide Gel Electrophoresis SDS-PAGE) (Laemmli, 1970).

A proteína recombinante fusionada GST-NSP foi purificada por

cromotografia de afinidade, utilizando resina de GST-Sepharose (Amersham), de

acordo com instruções do fabricante. A eficiência da purificação foi observada em

SDS-PAGE (Laemmli, 1970).

4.5.3. Ensaio de interação in vitro

A interação específica entre NSP e NsAK foi demonstrada por ensaio de

precipitação com GST (“GST pull-down”). As versões intacta e truncadas, domínio de

quinase ativo, KD, e inativo, ΔKDNsAK, (sem o domínio de ligação a nucleotídeo

(NBS)) traduzidas in vitro e marcadas com [

S]metionina, foram incubadas por 1 hora

a 4°C com 50 μl de resina de Glutationa-Sepharose ligadas a GST e GST-NSP

purificadas roteínas purificadas, GST-NSP ou GST. Os complexos resultantes foram

isolados com resinas de Glutationa-Sepharose (Fontes et al., 2004). As proteínas

ligadas foram analisadas por SDS-PAGE (Laemmli, 1970) e foram visualizadas por

auto-radiografia.

4.5.4. Ensaio de fosforilação in vitro.

Para o ensaio de fosforilação in vitro, 2 μg de plasmídeo recombinante

contendo o inserto apropriado em pDEST14 (como descrito anteriormente) foi utilizado

em um sistema de transcrição e tradução in vitro suplementado com T7 RNA

polimerase (Promega). Uma alíquota (15 μL) da mistura de reação foi incubada

sozinha ou juntamente com GST-NSP por 30 minutos a 25°C em 30 μL de tampão de

quinase, contendo HEPES 18 mM pH 7,4; MgCl

10 mM; MnSO

10 mM; DTT 1 mM;

ATP 10 μM e [γ-

P]ATP 5 μCi. As fosfoproteínas foram analisadas em SDS-PAGE. O

gel foi corado com Coomassie Brilliant blue para verificar o carregamento de proteínas,

seco e submetido à auto-radiografia. A radioatividade incorporada nas bandas de

proteínas foi quantificada por Phosphoimaging. A banda correspondente à

fosfoproteína de maior peso molecular foi utilizada como um controle interno para

normalizar o sinal de radioatividade.

4.6. Avaliação da ação de NsAK sobre a infecção viral

4.6.1. Obtenção e seleção de plantas knock out homozigotas para NsAK

O Salk Institute tem indexado um conjunto de mutantes, cuja seqüência do

lócus mutado é conhecida, e estes mutantes estão disponíveis através do ABRC

(Arabidopsis Biological Resource Center). Dentre estes mutantes foi selecionado o

SALK_008504, no qual o T-DNA está inserido na região 5’ UTR do gene At3g24550

(NsAK). As sementes obtidas foram semeadas em placa contendo meio MS (adaptado

de Murashige e Skoog (1962)) e incubadas a 22

C, com fotoperíodo de 16 horas por

15 dias e depois transplantadas para vaso.

Para a seleção de plantas homozigotas, foi extraído o DNA genômico das

plantas mutantes. Uma folha de cada planta mutante foi macerada em N

líquido, com

adição de 200 μL tampão de extração (Tris-HCl 200 mM pH 7,5; NaCl 250 mM; SDS

0,5% (p/v) e EDTA 25 mM) e a mistura foi homogeneizada em vortex por 5 min. Os

restos celulares foram precipitados por centrifugação a 14.000 x g por 5 min à

temperatura ambiente. O DNA foi precipitado com isopropanol 50% (v/v) por 10 min à

temperatura ambiente, recuperado por centrifugação a 14.000 x g por 6 min e lavado

com etanol 75% (v/v). O pellet foi seco em Automatic Environmental SpeedVac

System AES1010 (Savant) por 5 min e ressuspendido em 30 μL de água mili-Q

autoclavada.

A genotipagem de SALK_008504 foi realizada por PCR. Alelos selvagens

foram identificados com oligonucleotídeos específicos para NsAK (NsAK-Fwd e NsAK-

Rvs) (Tabela 4.2), e para a detecção de alelos nulos foi utilizado o oligonucleotídeo

NsAK-Rvs em combinação com o oligonucletídeo SALK LB1. A reação de PCR foi

confeccionada de acordo com Sambrook et al. (1989), entretanto, foram utilizados os

três oligonucleotídeos na mesma reação. A genotipagem é baseada no número e no

tamanho das bandas resultantes do PCR (Figura 4.1).

Figura 4.1. Exemplo de genotipagem de plantas knock out. Os oligonucleotídeos são

desenhados para possibilitar a diferenciação de plantas selvagens (WT), heterozigotas (HZ) e

knock out homozigotas (HM).

4.6.2. Extração de RNA total de Arabidopsis thaliana

O RNA total foi extraído de plântulas de Arabidopsis utilizando 100 mg de

tecido vegetal macerado em N

líquido e homogeneizado com 1 mL do reagente

TRIzol (SIGMA). Incubou-se a mistura à temperatura ambiente por 5 minutos e

posteriormente foi adicionado 0,2 mL de clorofórmio. A mistura foi homogeneizada

manualmente por 15 segundos, incubada à temperatura ambiente por 3 minutos e

seguida por centrifugação a 12.000 x g por 10 minutos a 4

C. A fase aquosa foi

transferida para um novo tubo, livre de RNAse. O RNA foi precipitado com isopropanol

50% (v/v) à temperatura ambiente por 10 minutos e centrifugado a 12.000 x g por 10

minutos. O RNA precipitado foi lavado com etanol 75% (v/v) (preparado com água livre

de RNAse) e centrifugado a 7.500 x g por 10 minutos. Em seguida, o RNA foi seco à

temperatura ambiente por aproximadamente 5 minutos, e ressuspendido com 20 μL de

água livre de RNAse e estocado a –80

C. A integridade do RNA total isolado foi

avaliada por eletroforese em gel de agarose 1% em TBE 1X (Tris Base 0,089 M, ácido

bórico 0,089 M e EDTA 0,05 M pH 8,0), corado com brometo de etídeo 0,1 μg.mL

-1

4.6.3. Análise da expressão de plantas mutantes knock out por RT-PCR

O RNA total foi quantificado por espectrofotometria em espectrofotômetro

DU 650 BECKMAN em A

260

, e a concentração foi expressa em μg.μL

-1

. A expressão

do gene foi avaliada por RT-PCR. Para síntese do cDNA, foram utilizados 2 μg do

RNA total como molde, 0,5 μM de oligonucleotídeo poli-dT, e 1U da enzima

transcriptase reversa M-MLV (Invitrogen Life Technologies, Inc.), seguindo as

instruções do fabricante.

Para a reação de PCR, foram utilizados 5 μL de cDNA e oligonucleotídeos

específicos para NsAK, NsAK1174FMet-GA e AtNsAKStG (Tabela 3.2). Também

foram utilizados oligonucleotídeos específicos para uma nucleoporina-like para avaliar

a quantidade e qualidade do cDNA. As condições de reação adotadas foram de 3 min

a 94

C, seguido de 30 ciclos (45 s a 94º C, 1 min e 30 s a 55º C e 2 min a 72º C), e

posteriormente 10 min a 72º C. A reação de amplificação foi conduzida em um

termociclador Peltier Thermal Cycler PTC 200 (MJ Research Inc, USA) e os produtos

da reação foram analisados em gel de agarose 1% (p/v) e corado com brometo de

etídeo 0,1 μg.mL

-1

4.6.4. Ensaio de infectividade

Plasmídeos contendo repetições parciais em série do DNA-A, com mutação

no gene que codifica a capa protéica, e do DNA-B de CaLCuV (1 e ½ cópia de cada

um dos componentes) foram extraídos a partir de E. coli, utilizando-se o “Plasmid Midi

Kit” (QIAGEN), segundo as recomendações do fabricante. A qualidade e a integridade

do DNA foram analisadas em gel de agarose 1% (p/v) e a concentração foi avaliada

por espectrofotometria a A

260

Aproximadamente 10 μg de cada componente de DNA foram precipitados

em micropartículas de tungstênio, na presença de CaCl

1 M e espermidina 15 mM, e

lavadas com etanol absoluto. Cada preparação foi distribuída em 5 membranas

carreadoras. As membranas preparadas foram devidamente encaixadas no acelerador

de partículas e lançadas, sob vácuo formado com gás hélio, com uma aceleração de

160 psi, de acordo com Schaffer et al. (1995). Como controle foram utilizadas plantas

de ambas linhagens inoculadas apenas com tungstênio, sem DNA viral.

Logo após o bombardeamento, as plantas foram transferidas para câmara

de crescimento a 22

C, com 16 horas de fotoperíodo e observadas quanto ao

aparecimento de sintomas até 20 dias após a inoculação. Para os experimentos de

análise de infecção, foram utilizadas plantas selvagens Col Ø e mutantes nsak, no

estágio de desenvolvimento correspondente a sete folhas. Em cada repetição, foram

utilizadas 15 plantas de cada linhagem, que foram inoculadas com plasmídeos

contendo repetições parciais em série do DNA-A e B de CaLCuV.

Durante a análise dos sintomas, as plantas inoculadas foram observadas

em intervalos de dois dias e fotodocumentadas. Foram levados em consideração

sintomas como: necrose foliar, clorose foliar, epinastia, enrolamento, enrugamento e

morte de folhas jovens e atraso no desenvolvimento e crescimento. Para confirmar a

presença do genoma viral em plantas sintomáticas, o DNA total das plantas inoculadas

foi extraído (de acordo com método já descrito no item 4.5.1) e usado como molde em

reações de PCR utilizando oligonucleotídeos degenerados (Rojas et al., 1993), que

amplificam fragmentos específicos do DNA-B de geminivírus. Os produtos da reação

foram analisados em gel de agarose 1% (p/v), corado com brometo de etídeo 0,1

μg.mL

-1

4.7. Análise do padrão de expressão de NsAK.

Os diferentes órgãos de Arabidopsis thaliana da planta selvagem Col Ø

(plântulas, flores, folhas e raízes) foram coletadas separadamente. Aproximadamente

200 mg de tecido vegetal foram macerados em N

líquido e o RNA total foi extraído

pelo método TRIzol (SIGMA), descrito anteriormente. O RNA total foi quantificado por

espectrometria em espectrofotômetro DU 650 BECKMAN com A

260

, e a concentração

foi expressa em μg.μL

-1

. A expressão do gene foi avaliada por RT-PCR, utilizando-se 2

μg do RNA total como molde, 0,5 μM de oligonucleotídeo poli-dT, e 1 unidade de

transcriptase reversa M-MLV (Invitrogen Life Technologies, Inc.), seguindo as

instruções do fabricante, para síntese do cDNA..

Para a reação de PCR foram utilizados 2 μL e os mesmos

oligonucleotídeos específicos para o gene NsAK, NsAK1174FMet-GA e AtNsAKStG, e

NSP. A quantidade e qualidade do cDNA foi avaliada, utilizando oligonucleotídeos

específicos para o gene de uma nucleoporina-like na mesma reação de PCR. As

condições de reação foram de 3 min a 94

C, seguido de 30 ciclos (45 s a 94º C, 1 min

e 30 s a 55º C e 2 min a 72º C), seguindo 10 min a 72º C. A reação de amplificação foi

conduzida em um termociclador Peltier Thermal Cycler PTC 200 (MJ Research Inc,

USA) e os produtos da reação foram analisados em gel de agarose 1% (p/v) e corado

com brometo de etídeo 0,1 μg.mL

-1

V. RESULTADOS

5.1. Identificação de uma PERK-like quinase que interage com NSP

Para a identificação de proteínas do hospedeiro que interagem com a

proteína viral NSP foram realizados ensaios de duplo híbrido em levedura, os quais

identificaram diversas proteínas, inclusive a já descrita AtNIK (“NSP-interacting

kinase”) (Fontes et al., 2004; Mariano et al., 2004). A presente investigação descreve a

caracterização de NsAK (“NSP-associated kinase”), uma PERK-like quinase com

conformação característica de receptor transmembrana. De um total de 5 x 10

duplo

transformantes independentes que foram analisados por sua prototrofia para Ura e His

e atividade de β-galactosidade (Figura 5.1), três clones positivos identificados

codificam um domínio truncado de quinase do gene de Arabidopsis At3g24550,

designado NsAK

A proteína NsAK deduzida contém 652 resíduos de aminoácidos (Mr

69,271 e pI 8,51) e é estruturalmente relacionada com a superfamília de receptores

serine/treonine quinases RLK (“Receptor-Like Kinase”). Apresentando um domínio N-

terminal composto por uma região rica em prolina, com repetições de hidroxiprolina

semelhantes às encontradas em extensinas, as quais são caracterizadas pelo

pentapeptídeo Ser(Hyp)

, onde ambos estão glicosilados. Este domínio é seguido por

um segmento de 23 resíduos de aminoácidos, que correspondem a um possível

domínio transmembrana hidrofóbico (

138

TGVVVGTAIGGVAILVILTLICL

160

), e, no C-

terminal, um domínio catalítico de serina/treonina quinase, o qual apresenta os 11

subdomínios típicos da família de proteína quinases eucarióticas (Figura 5.2 e 5.3).

Baseada na organização modular rica em prolina do seu domínio N-terminal, NsAK

pertence à subfamília PERK-like (“Proline-rich Extensin-like Receptor Kinases”) da

superfamília RLK (Shiu e Bleecker, 2001).

Figura 5.1. Interação de NsAK e a proteína NSP de CaLCuV em leveduras. Uma biblioteca de

cDNA de Arabidopsis foi inserida no vetor pEXAD502, que contém o domínio de ativação de

GAL4 e co-transformados em Mva203 com a proteína NSP de CaLCuV previamente fusionada

ao domínio de ligação de GAL4 dentro do vetor pBDLeu. Células de levedura expressando

ambas proteínas recombinantes foram plaqueadas em meio seletivo na ausência de leucina,

triptofano e histidina ou uracila e crescidas por 3-5 dias a 30°C. As interações foram

posteriormente confirmadas pelo ensaio de atividade de β-galactosidase dos extratos protéicos

de levedura com ο-nitrofenil β-D-galactopiranose.

Figura 5.2. Representação esquemática dos domínios conservados de AtNsAK. A região de

interação com NSP, contida dentro do domínio de serina/treonina quinase, está indicada no

diagrama. A estrutura desta proteína foi construída com base em sua anotação gênica, a qual

foi obtida no banco de dados do TAIR web site.

Figura 5.3. Alinhamento da seqüência deduzida de NsAK com proteínas PERK-like. A

seqüência de NsAK (At3g24550), de BnPERK1 e de OsPERK1 foram obtidas a partir de banco

de dados. Os pontos representam identidade com NsAK e os traços e brechas foram

introduzidos pelo CLUSTALW para maximizar a identidade. A região rica em prolina está

representada em negrito e o domínio transmembrana putativo em uma caixa. Os 11

subdomínios típicos da família de proteínas quinases eucarióticas estão sublinhados e

identificados por números romanos.

Entre os 15 membros da subfamília PERK-like RLK de Arabidopsis, NsAK

compartilha a maior identidade de seqüências com o produto do gene At3g24400

(63% de identidade), seguido por At3g24540 (62%) e At1g52290 (54%) cujas funções

são desconhecidas. A análise filogenética desta subfamília, bem como a organização

estrutural deduzida de seus membros está representada na Figura 5.4. Estendendo a

análise para banco de dados de proteínas de plantas em geral, NsAk é mais

relacionada com a Brassica napus PERK1 (BsPERK1, número de acesso no GenBank

AY028699, 85% de identidade de seqüência) (Figura 5.3). Também apresenta uma

conservação significante da estrutura primária com um homólogo em Oriza sativa

(OsPERK1, NP_913464, 57% de identidade) (Figura 5.3). Estas proteínas

correspondem a possíveis proteínas serina/treonina quinases com conformação

característica de receptor transmembrana,sendo que todas apresentam função

desconhecida.

Também foi avaliada a capacidade de NsAK interagir com NSP de dois

geminivírus que infectam tomateiros, TGMV e TCrLYV, pelo sistema duplo-híbrido. As

proteínas-isca foram expressas fusionadas ao domínio de ligação de GAL4 (BD), e as

proteínas-presa foram expressas fusionadas ao domínio de ativação de GAL4 (AD),

em leveduras. Foi utilizado como isca o domínio de quinase C-terminal de NsAK (ΔKD-

NsAK), onde ocorreu a deleção do sítio de ativação (NBS) tornando-o inativo mas

mantandeo sua capacidade de se ligar a um possível substrato. A proteína de ligação

a sacarose de soja, SBP(“Sucrose Binding Protein”), não relacionada com quinases,

foi utilizada como controle negativo no ensaio de sistema duplo híbrido.

As interações foram monitoradas pela ativação dos genes repórteres,

resultando em prototrofia a histidina e uracila e, posteriormente, foram confirmadas

pela determinação da atividade de β-galactosidase em extratos de proteínas de

levedura (Tabela 5.1). O domínio truncado de quinase de NsAK também interage com

NSP de TGMV e TCrLYV indicando que a formação do complexo NsAK-NSP não é

vírus-específica.

Tabela 5.1. Interação de NSP de Geminivírus que infectam Arabidopsis e tomate com NsAK

em levedura

pAD-ΔKD-NsAK

pAD-SBP

Presa

Isca

-H

+3AT

-U

+β-Gal

-H

+3AT

-U

+β-Gal

pBD-NSPCLCV + + + 0.43 ± 0.07 + - - 0.0

pBD-NSPTGMV + + + 0.37 ± 0.11 + - - 0.0

pBD-NSPTCrYLV + + + 0.26 ± 0.05 + - - 0.0

pBD-Leu + - - 0.0 + - - 0.0

Valores para atividade são resultantes de quatro réplicas e são representados juntamente com

seus desvios padrões (±).

(U) uracila; H (histidina); (3AT) 25 mM 3-aminotriazol; (β-Gal) atividade de β-galactosidase

Figura 5.4. Filogenia e organização dos domínios das quinases pertencentes à

subfamília AtPERK. A árvore representa as relações filogenéticas dos diferentes membros da

família. Também está representado o diagrama esquemático da estrutura de cada membro da

família, destacando seus possíveis domínios. Além das quinases da família AtPERK, foram

incluídas na homologia 2 quinases, AtNIK1 e AtSERK1 como seqüências “outgroup”.

Proteínas serina/treonina quinases do tipo receptores formam uma extensa

família em plantas e são altamente conservadas tanto em animais quanto em plantas,

mesmo entre diferentes subfamílias de proteínas quinases. A comparação da

seqüência de aminoácidos do domínio de quinase de AtNsAK com AtPERK, AtPERK2,

AtPERK4, AtPERK5, AtPERK6, pertencentes à família AtPERK, além de AtNIK1 e

AtSERK1, não pertencentes a esta família, comprovou uma grande homologia entre os

domínios destas diferentes quinases, apresentando alguns aminoácidos conservados

em todas as seqüências analisadas e alguns conservados somente dentro da família

(Figura 5.5A).

Uma vez que a interação entre NSP e AtNsAK ocorreu na região carboxi-

terminal de AtNsAK, onde se encontra o domínio de quinase, o potencial de

fosforilação deste domínio também foi avaliado, com o auxílio do software NetPhos

2.0. A análise da seqüência de aminoácidos de AtNsAK demonstrou a ocorrência de

resíduos de serina e treonina, em um contexto favorável para a fosforilação por

quinase do tipo serina/treonina (Figura 5.5B), o que infere que esta quinase é

possivelmente ativada através de fosforilação por outra quinase do mesmo tipo, ou até

mesmo por um processo de autofosforilação. Entretanto esta hipótese não foi avaliada

bioquimicamente.

Figura 5.5. Caracterização dos domínios de NsAK. A. Seqüência de aminoácidos

da proteína NsAK. O domínio rico em prolina está sublinhado e as repetições de prolina

semelhantes a extensinas estão representadas em verde. O domínio transmembrana está

indicado em vermelho e o domínio de serina/treonina quinase está indicado em negrito. O sítio

de ligação a nucleotídeos e de ativação estão indicados pelas caixas. B. Comparação dos

domínios de quinases de diferentes proteínas. Os asteriscos indicam homologia completa e os

pontos representam pequenas variações. O sítio e a alça de ativação (“A-loop”) estão indicados

pelas caixas, o resíduo de treonina conservado em quinases está indicado em vermelho e os

resíduos em verde indicam resíduos conservados somente dentro da família PERK. A análise

do potencial de fosforilação da seqüência de aminoácidos de AtNsAK indicou a existência de

dois resíduos de treonina (T) e três de serinas (S) com potencial de fosforilação, os quais estão

indicados em azul. Há também um resíduo de tirosina(Y) com potencial para fosforilação, o

qual é indicado em laranja.

1 MSTAPSPGTTPSPSPPSPPTNSTTTT

PPAA

SPPPTTT

SSPPPSPSTN

51 STSPPPSSPLPPSLPPPSPPGSLTPPLPQPSPSAPITPSPPSPTTPSNPR

101 SPPSPNQGPPNTPSGSTPRTPSNTKPSPPSDSSDGLSTGVVVGIAIGGVA

151 ILVILTLICLLCKKKRRRRHDDEAAYYVPPPPPSGPKAGGPYGGQQQYWQ

201 QQNASRPSDNHVVTSLPPPKPPSPPRKPPPPPPPPAFMSSSGGSDYSDLP

251 VLPPPSPG

LVLGFSKSTFTYEELSRATNGFSEANLLGQGGFGYVHKGILP

301 SGKEVAVKQLKAGSGQGEREFQAEVEIISRVHHRHLVSLIGYCMAGVQRL

351 LVYEFVPNNNLEFHLHGKGRPTMEWSTRLKIALGSAKGLSYLHEDCNPKI

401 IHRDIKASNILIDFKFEAKVADFGLAKIASDTNTHVSTRVMGTFGYLAPE

451 YAASGKLTEKSDVFSFGVVLLELITGRRPVDANNVYVDDSLVDWARPLLN

501 RASEEGDFEGLADSKMGNEYDREEMARMVACAAACVRHSARRRPRMSQIV

551 RALEGNVSLSDLNEGMRPGHSNVYSSYGGSTDYDTSQYNDDMIKFRKMAL

601 GTQEYGTTGEYSNPTSDYGLYPSGSSSEGQATREMEMGKIKKTGQGYSGP

651 SL-

5.2. NSP interage estavelmente com o domínio de quinase inativo de NsAK in

vitro e pode atuar como substrato para NsAK.

A interação específica entre NSP e NsAK também foi demonstrada por

ensaio de precipitação com GST (“GST pull-down”). Proteínas purificadas, GST-NSP

ou GST, foram incubadas com NsAK intactas traduzidas in vitro e marcadas com [

metionina, bem como o domínio de quinase (KD) ou o domínio de quinase inativo, sem

o domínio de ligação a nucleotídeo (NBS),como indicado na Figura 5.6. Enquanto o C-

terminal ΔKD-NsAK, no qual os subdomínios I e II críticos para serina/treonina

quinases foram deletados, interage estável e fortemente com NSP (linha 8), a

interação da proteína viral tanto com o domínio de quinase potencialmente ativo (linha

5) quanto com a proteína AtNsAK intacta (linha 2) é dificilmente detectada no ensaio in

vitro.

Este mecanismo para a formação do complexo NSP-NsAK se assemelha

a uma interação enzima-substrato sob uma alta eficiência catalítica e pode indicar que

NsAK fosforila a proteína viral. Neste caso, a inabilidade do domínio de quinase em

executar sua atividade catalítica resultaria em uma interação não-produtiva do

complexo enzima-substrato, aumentando a estabilidade da formação do complexo,

como no caso da proteína truncada ΔKDNsAK. Consistente com esta noção,

polipeptídeos truncados de NsAK, os quais foram produzidos pela reação de

transcrição e tradução in vitro de KDNsAK e ΔKDNsAK, ligam-se a GST-NSP (linhas 5

e 8), mas não a GST sozinha, indicando que NSP específica e estavelmente interage

com formas defectivas de NsAK truncada, mas não com o domínio de quinase de

NsAK potencialmente ativo (Figura 5.6).

Alternativamente, esta incapacidade de interação entre a proteína NsAK,

tanto a forma intacta quanto o domínio de quinase ativo, e a proteína viral NSP pode

ser explicada pela presença, nestas construções, de seqüências e/ou domínios

inibitórios; os quais não estariam presentes no domínio de quinase inativo, ΔKDNsAK.

Esta possibilidade não foi adequadamente explorada neste trabalho, representado

uma possibilidade para trabalhos futuros, os quais podem ser baseados na construção

de novas formas truncadas, nas quais estejam ausentes regiões do C-terminal.

Figura 5.6. Interação in vitro de NsAK e NSP. A. Representação esquemática das proteínas

truncadas traduzidas in vitro. Diferentes formas truncadas do cDNA de AtNsAK foram clonados

em um vetor de transcrição dependente da T7 RNA polimerase pDEST14. B. Pull-down da

interação proteína-proteína in vitro. Proteínas transcritas e traduzidas in vitro e marcadas com

S, foram incubadas com GST e GST-NSP expressas em bactérias e ligadas com esferas de

Glutationa-Sepharose. Depois de extensivas lavagens das esferas, as proteínas retidas foram

separadas por SDS-PAGE e visualizadas através de autoradiografia. O gel contém uma

amostra (10% da reação) das respectivas reações de transcrição e tradução.

Para analisar a capacidade de NsAK de fosforilar NSP, inúmeras tentativas

de expressar o domínio de quinase ativo de NsAK em E. coli, utilizando diversos

sistemas de expressão em bactérias, foram realizadas. Similarmente, também

tentativas de superexpressão de NsAK em Arabidopsis, tanto como proteína intacta ou

fusionada a GFP (“Green fluorescence protein”) ou a uma cauda TAP (um

truncamento da proteína A), foram conduzidas. Com exceção do domínio de quinase

truncado e inativo ΔKDNsAK, o qual é bem produzido em E. coli, todas as formas

potencialmente ativas da quinase recombinante não foram produzidas nem em E. coli

nem em plantas. Uma vez que, tanto a NsAK intacta quanto seu domínio de quinase

potencialmente ativo foram eficientemente transcritos e traduzidos in vitro (Figura 5.6),

o sistema de transcrição/tradução in vitro foi ajustado para a realização de ensaios de

fosforilação in vitro (Figura 5.7).

Muitas proteínas endógenas dos reticulócitos são fosforiladas por quinases

do reticulócitos (Figura 5.7A, linha 1), assim como a proteína fusionada GST-NSP

(Figura 5.7A, linha 4), a qual exibiu um nível de marcação por [γ-

P] três vezes maior

em relação a uma banda de 52 kDa (“backgound”), que co-imigra juntamente com

GST-NSP (Figura 5.7B, comparar linhas 1 e 4). Todavia, a inclusão de NsAK transcrita

e traduzida in vitro na reação de fosforilação promove um incremento de três vezes na

marcação de GST-NSP por [γ-

P] (Figura 5.7B, linha 2) comparado com o sinal de

fosforilação de GST-NSP por quinases do reticulócitos (linha 4). Igualmente, na

presença de KDNsAK, a incorporação de sinal radioativo por GST-NSP é 12 vezes

maior em comparação com GST-NSP fosforilada por quinases do reticulócito (Figura

5.7B, linhas 4 e 5) e 14 vezes maior que a correspondente banda de 52 kDa (Figura

5.7B, linha 1). A incorporação do fosfato radioativo ocorre na proteína NSP, pois GST

sozinho não foi fosforilado nem por NsAK ou KDNsAK (Figura 5.7B, linhas 2 e 5). Para

a melhor visualização do nível de fosforilação de NSP por NsAK, a proteína GST-NSP

foi purificada a partir da reação de fosforilação (Figura 5.7C). Conjuntamente, estes

resultados indicam que NsAK possui um domínio de quinase no C-terminal e NSP é

fosforilada por NsAK in vitro.

Figura 5.7. Ensaio de fosforilação in vitro. A. NsAK e KDNsAK foram transcritas e traduzidas in

vitro e as misturas de reação foram incubadas com [γ-P] ATP e GST-NSP ou GST produzidas

em E. coli. Depois da separação em SDS-PAGE, as fosfoproteínas foram visualizadas por

autoradiografia. Na linha 1, uma mistura de reticulócitos lisados foi incubada com [γ-

P] na

ausência de construções de DNA transcritas in vitro. B. Fosfoproteína GST-NSP (linhas 2, 4 e

5) foi quantificada por Phosphoimaging e normalizadas pelo sinal da fosfoproteína de maior

peso molecular (controle interno) indicado pela triângulo em A. As linhas 1 e 6 mostram o sinal

radioativo incorporado na banda de 52 kDa, expressa como porcentagem do sinal do controle

interno. A linha 3 corresponde ao nível de fosforilação relativa das bandas co-imigrantes com

GST. (C) NsAK and NIK were transcribed and translated in vitro, and the reaction mixtures were

incubated with [_-32P]ATP and purified GST-NSP. After the incubation period, the GST-NSP-

phosphorylated protein was isolated on gluthatione-Sepharose beads, separated by SDS-

PAGE, and visualized by autoradiography.

5.3. Os transcritos de NsAK são expressos de maneira ubíqua em Arabidopsis.

Para determinar o padrão de expressão do mRNA de AtNsAK, foi realizado

um RT-PCR semi-quantitativo com o RNA total de diferentes tecidos de Arabidopsis

(Figura 5.8). O mRNA de NsAK foi detectado em todos os tecidos investigados e seu

nível de expressão apresentou variações entre os diferentes tecidos. Quando

normalizados com a banda do controle, podemos inferir que o acúmulo de mRNA de

NsAK é predominante em flores e raízes, apresentando uma menor expressão em

folhas. Porém todos os tecido analisados apresentaram níveis intermediários de

acúmulo de transcrito, inclusive plântulas, demonstrando que NsAK é expresso desde

de o início do desenvolvimento da planta.

Recentemente foi demonstrado que a proteína REn de geminivírus induz a

expressão de uma proteína associada no hospedeiro, da família NAC (Selth et al.,

2005). Desta forma, era de interesse determinar se a expressão de NSP poderia ter

algum efeito sobre o acúmulo de transcritos de NsAK. Para isso, o mRNA total de

folhas de Arabidopsis expressando NSP foi analisado por RT-PCR semiquantitativo

(Figura 5.9A). Expressão NSP de CaLCuV (Figura 5.9A, linhas 2 e 3) ou de TCrLCV

(Figura 5.9A, linhas 4, 5 e 6) induziu um maior acúmulo de transcritos de NsAK em

folhas transgênicas. Entretanto, a infecção por geminivírus parece não afetar a

expressão de NsAK em folhas e raiz de Arabidopsis. (Figura 5.9B).

Figura 5.8. Transcritos de NsAK são expressos de forma ubíqua em Arabidopsis. A

acumulação de transcritos de NsAK foi determinada por RT-PCR semiquantitativo em plântulas

(Pl), flores (Fl), folhas (F) e raízes (R) de Arabidopsis. O controle corresponde ao produto de

PCR do gene de uma nucleoporina-like, AtNAP, usado como padrão interno. As marcas do

DNA padrão estão representadas no lado esquerdo da figura em kb (kilobase).

Figura 5.9. Análise do efeito da expressão de NSP no acúmulo de transcritos de NsAK. A.

Análise da expressão de NsAK em plantas de Arabidopsis superexpressando NSP. O RT-PCR

semiquantitativo foi realizado no mRNA total isolado de folhas de plantas selvagens (1), folhas

de Arabidopsis transformadas com NSP de CaLCuV (2 e 3) e folhas de Arabidopsis

transformadas com NSP de TCrLYV (4, 5 e 6) com oligonucleotídeos específicos para NsAk e

NSP. O mRNA de uma nucleoporina-like foi utilizado como controle. B. Expressão de NsAK em

plantas de Arabidopsis infectadas. O RT-PCR semiquantitativo foi realizado com RNA de folhas

e raízes preparados a partir de plantas não infectadas (linha 1), infecção simulada (sem vírus)

(2) ou infectadas (3) e oligonucleotídeos específicos para NsAK. O mRNA de uma

nucleoporina-like foi utilizado como controle interno.

5.4. A inativação do gene NsAK resulta na atenuação de sintomas e diminui a

eficiência de infecção viral.

Para examinar diretamente o significado biológico da interação de NsAK-

NSP in vivo, foram obtidas sementes de plantas contendo uma inserção mutacional de

T-DNA no gene At3g24550 (NsAK) (Figura 5.10A). Para a identificação de plantas

homozigotas para a inserção do T-DNA, foi realizada uma genotipagem por PCR,

(Figura 5.10B). A amplificação, com oligonucleotídeos específicos para as regiões

flaqueadoras do T-DNA, produziu dois fragmentos pequenos (0,4 e 0,5 kb) nas plantas

homozigotas, indicando que possivelmente houve a inserção de dois T-DNA muito

próximos neste gene. Como controle foi utilizada uma planta selvagem, onde a

amplificação produziu um fragmento de 0,9 kb. As plantas homozigotas identificadas

tiveram suas sementes reunidas e estas foram utilizadas nos demais experimentos

Figura 5.10. Identificação de mutantes nsak. A. Anotação genômica do locus

NsAK e diagrama da inserção do T-DNA. O gene está indicado na orientação 5’-3’. As caixas

pretas representam os éxons. A inserção de T-DNA está indicada pelo triângulo e não está sob

a escala. B. Seleção de linhagens homozigotas para a inserção do T-DNA em NsAK. O DNA

isolado, a partir de plântulas de genótipo SALK_008504 foi analisado por PCR para monitorar a

presença do T-DNA. Col Ø corresponde às plantas selvagens. As marcas do DNA padrão

estão representadas no lado esquerdo da figura em kb (kilobase).

Com a finalidade de comprovar o bloqueio da expressão de NsAK, foram

conduzidos ensaios de RT-PCR com amostras de RNA de folhas de plantas de

linhagens selvagens (Col Ø) e mutantes nsak (KO), utilizando oligonucleotídeos

específicos para o gene NsAK (Figura 5.11). Enquanto o acúmulo dos transcritos de

NsAK foi corretamente detectado nas linhagens Col Ø, não foram detectados nas

plantas homozigotas para a inserção do T-DNA, confirmando a seleção do mutante

knock out com os alelos nsak nulos.

Figura 5.11. Análise dos transcritos de NsAK. O RT-PCR foi realizado com amostras de RNA

de folhas de plantas Col Ø e mutnates nsak com oligonucleotídeos gene específicos. O mRNA

de AtNAP, uma nucleoporina-like, foi utilizado com controle interno.

Plantas selvagens Col Ø e mutantes nsak foram inoculadas com o DNA-A e

DNA-B de CaLCuV. Tanto plantas Col-Ø quanto nsak desenvolveram os sintomas

típicos de infecção por CaLCuV, porém com intensidade distinta. De fato, os sintomas

da infecção variaram grnademente na severidade, de extrema redução no crescimento

com clorose severa, evoluindo pra necrose sistêmica em Col Ø; para um moderado

retardamento no crescimento com epinastia e clorose moderada, com pouca ou

nenhuma incidência de necrose, em linhagens nsak (Figura 5.12A). Para a

confirmação da infecção, o acúmulo do DNA viral foi detectado em plantas

sintomáticas por PCR com oligonucleotídeos degenerados para begomovírus (Figura

5.12B).

O curso da infecção refletiu o fenótipo atenuado da infecção nas plantas

nsak. De acordo com o aparecimento dos sintomas, a inativação dos alelos NsAK

atrasa o curso da infecção viral em comparação com plantas Col Ø, nas quais a taxa

de infecção evoluiu rapidamente, atingindo o nível total de infecção em 10 dias, em

média (Figura 5.13A). Os dados de infectividade também foram expressos como

DPI50% (dias pós-inoculação necessários para atingir 50% de plantas infectadas),

onde as plantas selvagens apresentaram um DPI50% de 2.5 dias e plantas mutantes

de 3,9 dias, confirmando os resultados da atenuação (Figura 5.13B).

Figura 5.12. Linhagens knock out de nsak exibem um aumento na tolerância a infecção por

CaLCuV. A.Sintomas associados com a infecção por CaLCuV em linhagens knock out.

Repetições em tandem do DNA-A e DNA-B virais foram introduzidos nas plantas por

biobalística. Acima, Col-Ø (esquerda) e nsak (direita) são plantas falsamente inoculadas,

bombardeadas somente com partículas de tungstênio (W). Abaixo, Col-Ø e nsak são plantas

infectadas por CaLCuV com 15 DPI (dias pós inoculação). B. Acúmulo do DNA viral em plantas

infectadas. O DNA total foi isolado de plantas Col-Ø e nsak com 7 DPI e diagnosticado por

PCR com oligonucleotídeos gene específicos. IN refere-se às plantas inoculadas com DNA

viral e NI à plantas inoculadas somente com W.

Figura 5.13 O processo de infecção é atrasado em plantas nsak knock out. A. Ecótipo Col-Ø e

knock out nsak foram infectadas com DNA de CaLCuV pelo método de biobalística. Os valores

representam a porcentagem de plantas sistematicamente infectadas em diferentes dias pós

inoculação (DPI) e é determinado o desvio padrão (±) de três experimentos independentes. Os

asteriscos indicam diferenças significativas em P ≤ 0,05. B. Taxa de infecção em alelos nulos

nsak. A taxa de infecção está expressa com dias pós inoculação (DPI) para atingir 50% de

plantas infectadas. Estes resultados diferem siginificativamente em P≤ 0,05. Os dados

representam o desvio padrão de três experimentos independentes.

VI. DISCUSSÃO

A proteína NSP de begomovírus transporta o DNA viral entre o núcleo e o

citoplasma e coopera com MP para mover o DNA viral célula-a-célula através da

parede celular. O tráfego facilitado de NSP indica que esta proteína viral interage

extensivamente com fatores do hospedeiro para usurpar a maquinaria de transporte

endógena do hospedeiro. Na presente investigação, é apresentada a identificação de

NsAK, um novo parceiro de interação de NSP. A interação de NSP com um domínio

de quinase inativo de NsAK foi identificada em levedura pelo sistema duplo-híbrido e,

posteriormente, confirmada em um ensaio de interação in vitro. Este resultado in vitro

sugere que a interação entre NSP e o domínio quinase inativo de NsAK seja estável e

direta. Apesar disso, não foi possível detectar in vitro a interação de NSP com a

proteína NsAK intacta. Como NsAK, transcrita e traduzida in vitro, foi capaz de

fosforilar NSP, torna-se provável que uma alta eficiência catalítica (K

cat

) de NsAK

sobre NSP como substrato poderia estar prevenindo a formação de um complexo

enzima-substrato suficientemente estável para ser detectado no ensaio in vitro. Entre

muitas outras possíveis razões, isto poderia explicar também porque não foi possível

demonstrar a interação in vivo por um ensaio clássico de co-imunopreciptação.

Já foi demonstrado que a proteína NSP se liga especificamente com três

membros da família RLLII-RLK, designados NIK, através de seu domínio de

serina/treonina quinase. Entretanto, ela se liga tanto em quinases ativas quanto em

defectivas e não é fosforilada por estas proteínas, mas inibe fortemente a atividade

destas quinases (Fontes et al., 2004). A perda de função do gene NIK aumenta a

suscetibilidade à infecção por geminivírus sugerindo que NSP atua com um fator de

virulência para suprimir as defesas antivirais mediadas por NIK. Os resultados aqui

apresentados sugerem que a ligação de NSP com o domínio de quinase resulta em

uma interação enzima-substrato produtiva que, em contraste com a interação NSP-

NIK, pode regular a função de NSP. Consistentemente com esta hipótese, foi

demonstrado que NSP de SqLCV é modificada pós-traducionalmente por fosforilação

(Pascal et al., 1994). Além disso, os resultados dessa investigação forneceram

evidências para uma ligação funcional entre NSP e NsAK, uma vez que a perda de

função de NsAK leva à atenuação da infecção por geminivírus. Este fenótipo mutante

nsak implica que NsAK seria um contribuidor positivo para a infecção por geminivírus

que provavelmente atua na regulação da função de NSP. Evidências na literatura

indicam que o estado de fosforilação da proteína de movimento (MP) de vírus de

plantas regula o transporte célula-a-célula do genoma viral (Citovsky et al., 1993;

Waigmann et al., 2000). Estas proteínas de movimento são fosforiladas por uma

proteína quinase associada aos plasmodesmas (Citovsky et al., 1993). No caso de

NSP, entretanto, como uma auxiliar tanto do movimento intracelular quanto do

transporte intercelular mediado por MP do DNA viral, eventos de fosforilação podem

igualmente ocorrer no núcleo, no envelope nuclear, citoplasma ou membrana

plasmática. Assim, a determinação precisa da localização de NsAK fornecerá uma

informação valiosa sobre o significado funcional da interação entre NsAK e NSP.

A análise de seqüência da proteína deduzida revela que NsAK pertence à

subfamília PERK-like RLK e, como tal, é estruturalmente organizada em um domínio

C-terminal de serina/treonina quinase. Nessa investigação, foi demonstrado que NsAK

é uma autêntica serina/treonina quinase, pois a proteína traduzida in vitro, ou seu

domínio carboxi, aumenta o nível de fosforilação de NSP no ensaio de tradução in

vitro. Isto é consistente com a organização estrutural de NsAK, contendo na sua região

C-terminal todos os 11 subdomínios conservados de proteínas quinases, além da

presença de características específicas de serinas/treoninas quinases (Hanks e

Hunter, 1995, Diévart e Clark, 2003). Isto inclui o possível sítio de ativação

HrDvKssNxLLD no subdomínio VIb, o motivo DFG no sudomínio VII, o qual pode

quelar íons Mg

e o motivo APE no subdomínio VIII, o qual está envolvido no

reconhecimento do substrato e na autofosforilação.

Como um membro da família PERK-like RLK, a porção N-terminal de NsAK

é rica em prolina e apresenta similaridade de seqüência com proteínas da parede

celular da família de extensinas (Shiu e Bleecker, 2001). O homólogo de PERK-like

RLK encontrado em Brassica napus está localizado na membrana plasmática e já foi

demonstrado ser rapidamente induzido por estresses mecânicos (Silva e Goring,

2002). Por se tratar de uma proteína membro da família RLK, que tem sido

amplamente implicada em uma via de transdução de sinal, e, ainda, por estar

localizada na membrana plasmática e ser induzida por ferimento, tem sido proposto

que o homólogo de Brassica napus esteja envolvido em um via de transdução de sinal

estimulada por ferimento (Shiu e Bleecker, 2001; Silva e Goring, 2002). Vários

estímulos de ferimento são gerados durante o processo de infecção de plantas por

patógenos. Isto é particularmente verdadeiro no caso de geminivírus, transmitidos por

insetos. Foi demonstrado aqui, entretanto, que o nível de transcritos de NsAK não se

altera durante o curso da infecção por geminivírus, apesar de o método de inoculação

por biobalística gerar estímulos de ferimento por injuriar mecanicamente às folhas. A

taxa de expressão constitutiva e ubíqua de NsAK indica que esta serina/treonina

quinase deva estar funcionalmente envolvida em processos celulares básicos e

constitutivos.

Embora um knock out completo de nsak pela mutação por inserção de T-

DNA resulte na atenuação na infecção por geminivírus, a inativação do gene não

bloqueia totalmente a infecção, como seria esperado se NsAK fosse essencial na

regulação da função de NSP. Todavia, este resultado não é totalmente inesperado, já

que o genoma de Arabidopsis codifica 14 homólogos de NsAK da subfamília PERK-

like RLK (Shiu e Bleecker, 2001; Silva e Goring, 2002), de forma que alguns poderiam

substituir parcialmente a função de NsAK na infecção viral. Se tal dependência rígida

de NSP por um gene específico contido em uma família de fatores do hospedeiro de

fato existe, é razoável assumir que NSP evoluiu de forma a acomodar um certo grau

de promiscuidade ao recrutar a atividade chave de quinase para regulação de sua

função.

A interação específica de NSP com membros da subfamília RLLII-RLK,

como supressor da atividade de quinase e defesas antivirais (Fontes et al., 2004), e

com um membro da subfamília PERK-like RLK, como substrato de quinase, sugere

que a ligação de NSP com o domínio de serina/treonina quinase é uma propriedade

inerente da proteína viral para suprir tanto funções de virulência quanto de

compatibilidade básica. Funcionalmente, a ligação de NSP com NIK1 (RLLII-RLK)

antagoniza a ligação com NsAK (PERK-like), uma vez que NSP inibe a atividade de

quinase de NIK mas atua como substrato de NsAK. O sítio de ligação de NSP foi

mapeado em NIK1 e corresponde a uma extensão de 80 resíduos de aminoácidos que

contém o possível sítio de ativação de serina/treonina quinase (subdomínio VIb –

HrDvKssNxLLD) e a volta de ativação (A-Loop) (subdomínio VII – DFGAk/rx, mais o

subdomínio VIII – GtxGyiaPEY) (Fontes et al., 2004).

Como um substrato potencial para NsAK, pode-se antecipar que NSP se

associa com NsAK através do sítio de ligação ao substrato que conceitualmente

sobrepõe-se à região correspondente de interação de NSP com NIK (Hanks e Hunter,

1995; Johnson et al., 1998). Todavia, a presença dos subdomínios conservados Vb,

VII e VIII, por si, não é suficiente para promover uma ligação específica de quinase

com NSP, porque NSP não interage estavelmente com outras serina/treonina

quinases receptoras-like que contém estes subdomínios conservados, como BRI1

(“Brassinosteroid Insensitive 1”), e SERK (“Somatic Embryogenesis Recptor-like

Kinase”) (Fontes et al., 2004). É mais provável, que contatos discretos com resíduos

divergentes do domínio catalítico de RLKs conferem a requerida especificidade para a

ligação. Enquanto a identificação dos sítios de interação entre NsAK e NSP permitiria

a construção de mutantes defeituosos para interação, a possível redundância

funcional dos membros da família PERK-like RLK e o efeito antagônico da ligação de

NSP com NIK ou NsAK complicarão o uso destes mutantes para avaliar o significado

da interação NsAK-NSP no ciclo da infecção de geminivírus. Em contraste, a

identificação e subseqüente alteração dos sítios de fosforilação de NSP por

mutagênese permitirão que se aborde a interação NSP-NsAK separadamente e,

conseqüentemente, elucidar o papel da fosforilação na função de NSP

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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source leaves as detected by green fluorescent protein tagging. Virology 290,

249–260, 2001.

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