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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação
Centro de Biotecnologia
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola
Dissertação
Caracterização de Leptospira spp. quanto à presença e conservação dos
genes da família lig: alvos potenciais para utilização em vacina e testes de
diagnóstico
Gustavo Maia de Cerqueira
Pelotas, 2006
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GUSTAVO MAIA DE CERQUEIRA
Caracterização de Leptospira spp. quanto à presença e
conservação dos genes da família lig: importantes alvos
para utilização em vacina e testes de diagnóstico
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Biotecnologia
A
grícola da Universidade Federal de
Pelotas, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em
Ciências (área de conhecimento:
Biologia Molecular).
Orientador: Odir Antônio Dellagostin
Pelotas, 2006
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Banca examinadora:
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4
À minha querida avó materna
À toda minha família
À Deus
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AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Pelotas na figura do Centro de
Biotecnologia pela oportunidade de realizar o curso de Pós-Graduação.
À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudos.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) e ao Instituto Biomanguinhos pelo suporte financeiro ao projeto
de pesquisa que resultou nessa dissertação.
Ao Professor Odir Antônio Dellagostin por sua orientação e
conduta exemplares, sua amizade e confiança depositada durante a execução deste
trabalho, o qual sempre foi um modelo para meu amadurecimento e formação
profissional.
Aos demais professores do Centro de Biotecnologia pela
amizade e ensinamentos transmitidos.
Ao Dr. Alan J.A. McBride e Dr Albert I. Ko pelo fornecimento de
material biológico indispensável à realização deste trabalho e ainda pela
oportunidade e ensinamentos transmitidos.
Aos amigos da pós-graduação e colegas do laboratório de
Biologia Molecular Ângela Moreira, Daiane D. Hartwig, Éverton F. da Silva, Fabiana
K. Seixas, Fabrício R. Conceição, Luciano S. Pinto, Sibele Borsuk, Simone
Simionatto, Vanusa P. da Hora e aos amigos da iniciação científica do mesmo
laboratório Michel, Robson, Tessália, Michele. Também aos amigos do laboratório
de Biologia celular Andrea, Janaína, Natália, Suse, e aos amigos do laboratório de
Imunologia Aplicada, laboratório de Bacteriologia, laboratório de Biopolímeros,
laboratório de Reprodução Animal pela amizade, carinho, incentivo e auxílio em
todos os momentos.
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram de alguma
forma para a realização deste trabalho.
6
RESUMO
CERQUEIRA, Gustavo Maia. Caracterização de Leptospira spp. quanto à
presença e conservação dos genes da família lig: importantes alvos para
utilização em vacina e testes de diagnóstico. 2006. 52f. Dissertação (Mestrado) –
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola. Universidade Federal de
Pelotas. Pelotas.
Leptospiras patogênicas carregam um ou mais genes lig, os quais codificam para
proteínas da família Lig. As proteínas Lig (“Leptospiral immunoglobulin-like”) são
importantes fatores de virulência, e acredita-se que estejam envolvidos na
penetração do tecido e na adesão da Leptospira às células do tecido hospedeiro. Até
o presente momento, as proteínas Lig são apontadas como um dos principais fatores
envolvidos na patogênese de
Leptospira spp. Três genes, ligA, ligB e ligC são
conhecidos, os quais codificam para proteínas com o mesmo nome. O interesse pela
caracterização dos genes que codificam para as proteínas Lig surgiu pelo fato
destas apresentarem potencial imunoprotetor e como antígenos para testes de
diagnóstico. Frente a esta constatação, fez-se necessário conhecer o grau de
conservação destes genes para inferir se a utilização de uma destas proteínas como
antígeno vacinal seria capaz de induzir uma imunidade de amplo espectro. Dentre as
espécies patogênicas de
Leptospira, 4 tiveram seus genes lig seqüenciados neste
estudo, as quais compreendem
L. interrogans, L. noguchii, L. weilli e L. borgpetersenii. Entre
as proteínas Lig seqüenciadas até o momento, LigB oriunda de
L. interrogans
Copenhageni FIOCRUZ L1-130 aparece como a mais conservada quando
comparada com LigB de outras espécies. Com o alinhamento da seqüência dos
genes lig das diversas espécies, foi possível desenhar primers capazes de amplificar
por PCR um fragmento interno de cada um dos três genes. Esta abordagem permitiu
comprovar a presença do gene ligB em todas as espécies patogênicas, enquanto
ligA aparece apenas em
L. interrogans e L. kirschneri, e ligC é encontrado nas espécies
L. interrogans, L. kirschneri, L. weilli e alguns sorovares de L. noguchii. O seqüenciamento
do fragmento de ligB amplificado por PCR a partir do DNA de 33 sorovares de 6
espécies, e sua análise comparativa juntamente com o fragmento correspondente
pertencente aos genes ligB depositados no GenBank, possibilitou uma análise
filogenética onde verificou-se que é possível diferenciar as espécies pela seqüência
deste fragmento.
7
ABSTRACT
CERQUEIRA, Gustavo Maia. Characterization of Leptospira spp. regarding the
presence and conservation of genes belonging to the lig family: important
targets for vaccines and diagnostic tests. 2006. 52f. Dissertation (Mestrado) –
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola. Universidade Federal de
Pelotas. Pelotas.
Pathogenic
Leptospira species contain one or more genes of the lig family, which code
for Lig-family proteins. Lig proteins (“Leptospiral immunoglobulin-like proteins”) are
considered important virulence factors, and they may be involved in tissue
penetration and adhesion to host cells. Lig proteins have been implicated as the main
factors involved in pathogenesis of
Leptospira spp. Three genes, ligA, ligB and ligC are
known, which code for proteins with the same name. The increasing interest in the
characterization of the genes code for Lig proteins is due to their strong
immunoprotective and diagnosis potential. Thus, it was necessary to evaluate the
degree of conservation among Lig genes and proteins in order to predict their
usefulness as antigens for the induction of a broad range protection. Four of the
pathogenic species of
Leptospira had the lig genes sequenced in this study,
comprising
L. interrogans, L. noguchii, L. weilli and L. borgpetersenii. Among the LigB
proteins sequenced so far, LigB from
L. interrogans Copenhageni FIOCRUZ L1-130
appears as the most conserved when compared to LigB from other species. The
sequencing and comparative analysis of lig genes and proteins demonstrated a low
identity among the different genomospecies of
Leptospira spp. The alignment of lig
genes sequences from all the genomospecies enabled us to design primers that
allowed the amplification of a fragment from each gene. Such approach
demonstrated that ligB gene is present in all the pathogenic species, while ligA gene
is only found in
L. interrogans and L. kirschneri and ligC gene is present in L. interrogans, L.
kirschneri
, L. weilli and some serovars of L. noguchii. The sequencing of the amplified
fragment, derived from 33 serovars which comprise 6 genomospecies, and their
comparative analysis together with the corresponding region from ligB sequences
available in GenBank, enabled a phylogenetic analysis. It was possible to
differentiate pathogenic species based on the DNA sequence of this ligB fragment.
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Caracterização in silico dos genes lig. p.30.
Figura 2 – Plot demonstrando o nível de conservação ao longo da proteína LigB
entre os diferentes sorovares e espécies genômicas, contra LigB de
L. interrogans
Copenhageni FIOCRUZ L1-130. p.33, 34 e 35.
Figura 3 – Localização das regiões mais variáveis dentro da seqüência de
aminoácidos de LigB. p.35, 36 e 37.
Figura 4 – Detecção dos genes lig por PCR em cepas patogênicas. p.38.
Figura 5 – Análise por Southern blot demonstrando a presença dos genes lig nas
cepas de
L. interrogans e L. kirschneri virulentas. p.41.
Figura 6 – Árvore filogenética montada com base em LigB. p.43 e 44.
9
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Cepas usadas no estudo. p. 20.
TABELA 2 – Conjunto de primers usados no estudo. p. 21 e 22.
TABELA 3 – Cepas usadas no seqüenciamento completo dos genes lig. p. 27.
TABELA 4 – Genes detectados por PCR e análise comparativa dada pelo
seqüenciamento. p. 28.
TABELA 5 – Conservação de LigA no nível de nucleotídeos e aminoácidos entre
vários sorovares e espécies. p. 31.
TABELA 6 – Conservação de LigB no nível de nucleotídeos e aminoácidos entre
vários sorovares e espécies. p. 32.
TABELA 7 – Conservação de LigC no nível de nucleotídeos e aminoácidos entre
vários sorovares e espécies. p. 33.
TABELA 8 – Caracterização da presença ou ausência dos genes lig nas diferentes
espécies. p. 40.
10
LISTA DE ABRVIATURAS, NOMENCLATURAS E SÍMBOLOS
Big “Bacterial Immunoglobulin-like”
BLAST “Basic Local Alignment Search Tool”
cm centímetro(s)
DNA “Desoxi-ribonucleic acid”
EPEC “Enteropathogenic E.coli”
kb kilo par(es) de base(s)
LB Luria-Bertani
Lig “Leptospiral Immunoglobulin-like”
LPS Lipopolissacarídeo
ml mililitro(s)
pb par(es) de base(s)
PCR “Polymerase Chain Reaction”
rDNA Gene que codifica para RNA ribossomal
RV Região variável
Sph “Sphingomyelinase”
Tir “Translocated intimin receptor”
µg micrograma(s)
µl microlitro(s)
ºC grau(s) Célcius
11
SUMÁRIO
Caracterização de Leptospira spp. quanto à presença e conservação dos genes da família lig:
alvos potenciais para utilização em vacina e testes de diagnóstico..................................... 1
AGRADECIMENTOS....................................................................................................................5
RESUMO.......................................................................................................................................6
ABSTRACT...................................................................................................................................7
LISTA DE FIGURAS.....................................................................................................................8
LISTA DE TABELAS....................................................................................................................9
LISTA DE ABRVIATURAS, NOMENCLATURAS E SÍMBOLOS..............................................10
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................................12
1.1. Leptospirose ...................................................................................................................12
1.2. Patogênese e papel das proteínas Lig.........................................................................13
1.3. Outros fatores de virulência e elementos envolvidos na patogenia.........................14
1.4. Estudos filogenéticos ....................................................................................................16
1.5. Potencial das proteínas Lig na vacinologia e diagnóstico ........................................16
2. OBJETIVO GERAL.................................................................................................................18
2.1. Objetivos específicos.....................................................................................................18
3. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................................19
3.1. Cepas usadas no estudo e cultivo................................................................................19
3.2. Extração de DNA genômico...........................................................................................19
3.3. Desenho de primers, amplificação por PCR, clonagem e seqüenciamento............ 19
3.4. Detecção dos genes lig por Southern blot ..................................................................24
3.5. Análise dos genes e alinhamento.................................................................................25
3.6. Análise filogenética........................................................................................................26
4. RESULTADOS........................................................................................................................27
4.1. Seqüenciamento dos genes ligA, ligB
e ligC de isolados de Leptospira spp. ........ 27
4.2. Caracterização in silico dos genes e proteínas LigA, LigB e LigC ...........................29
4.3. Desenvolvimento de um método de detecção dos genes lig por PCR.....................37
4.4. Análise filogenética........................................................................................................42
5. DISCUSSÃO...........................................................................................................................45
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................................49
12
1. INTRODUÇÃO
1.1. Leptospirose
Leptospira é um gênero clinicamente importante dentro do grupo das
espiroquetas. Esta bactéria é o agente causador da leptospirose, doença que
acomete humanos e animais pelo mundo todo e que é transmitida por meio de água
ou outros fluídos contaminados (KO et al., 1999). Esta doença é a zoonose mais
dispersa no mundo e que aparece como uma das doenças infecciosas emergentes
(KO et al., 1999; LEVETT, 2001; McBRIDE et al., 2005).
O principal vetor para o homem é o roedor, o que define a doença como uma
antropozoonose. Além dos roedores, também outros animais e o próprio homem
podem ser fontes de transmissão horizontal (LEVETT, 2001). A doença produz como
sintomas dores de cabeça, dores musculares (principalmente na panturrilha), febre,
icterícia, deficiências renal e cardíaca, podendo evoluir, nos casos mais graves, para
hemorragia pulmonar e morte. Estes sintomas aproximam-se aos de uma gripe forte,
o que dificulta sua identificação inicial e o correto tratamento (KO et al., 1999;
LEVETT, 2001).
Com relação à classificação do agente causador de Leptospirose, análises de
hibridização DNA-DNA (RAMADASS et al., 1992; BREENER et al., 1999;
LEETOCART et al., 1999) subdividiram a espécie patogênica,
Leptospira interrogans,
em diferentes espécies genômicas (FAINE et al., 1999). Na classificação atual,
aparecem como as espécies genômicas mais importantes dentro do grupo das
patogênicas,
L. interrogans, L. kirschneri. L. noguchii, L. borgpetersenii, L. weilli e L. santarosai
(FAINE et al.,1999; HAAKE et al., 2004).
Epidemiologicamente, no Brasil, leptospirose apresenta uma incidência de 1,6
casos para cada 100 mil habitantes. Este dado é do ano de 2004 e aparece
associado a eventos como distribuição de chuvas e temperaturas, nível de sanidade
básica e pobreza (KO et al., 1999; MINISTÉRIO DA SAÚDE / VIGILÂNCIA
SANITÁRIA, 2005). Em países de primeiro mundo, por outro lado, a doença está
associada com atividades ocupacionais e recreacionais (LEVETT, 2001)
13
1.2. Patogênese e papel das proteínas Lig
Acredita-se que as proteínas Lig (“Leptospiral immunoglobulin-like”) sejam
importantes fatores de virulência, os quais estão envolvidos na penetração do tecido
assim como na adesão da
Leptospira às células do tecido hospedeiro. Até o presente
momento, as proteínas Lig têm sido pré-supostas como importantes fatores de
virulência envolvidos na patogênese de
Leptospira spp. (MATSUNAGA et al., 2003)
por conferirem a esta espiroqueta, a capacidade de penetrar, se disseminar e
persistir nos tecidos dos mamíferos hospedeiros, aderindo-se às células eucarióticas
e proteínas da matriz extracelular (TSUCHIMOTO et al., 1984; VINH et al., 1984;
BALLARD et al., 1986; THOMAS e HIGBIE, 1990). Além disso, acredita-se que as
proteínas Lig sejam capazes de conferir às espécies patogênicas a habilidade de
rapidamente se translocar através de camadas de células, sem romper as junções
intercelulares, como um mecanismo para invadir os órgãos do hospedeiro
(BAROCCHI et al., 2002).
Sabe-se que as proteínas Lig são osmoreguladas e expressas in vivo no
hospedeiro, justamente onde aparecem ser positivamente reguladas
(PALANIAPPAN et al., 2002; MATSUNAGA et al., 2005). Porém, in vitro, elas são
pobremente expressas devido provavelmente à instabilidade protéica ou ao baixo
nível de expressão. No nível de transcrição, ligA e ligB, foram detectadas por RT-
PCR, tanto in vivo quanto in vitro (PALANIAPPAN et al, 2002; MATSUNAGA et al.,
2003). Em ambas as proteínas de
L. interrogans, LigA e LigB, foi identificada a
presença de repetições em “tandem” de domínios Big2. Estes são assim
denominados por se assemelharem àqueles presentes nas imunoglobulinas, os
quais são compostos por 80-100 aminoácidos (PALANIAPPAN et al., 2002;
MATSUNAGA et al 2003; KOIZUMI e WATANABE, 2004). Tal motivo repetido é
encontrado em fatores de virulência bacterianos os quais mediam a aderência com a
célula hospedeira e a invasão, como no caso de intiminas de
Escherichia coli (LUO et
al., 2000) e invasinas de
Yersinia pseudotuberculosis (HAMBURGER et al, 1999). Estas
importantes bactérias Gram negativas baseiam sua adesão, às células eucarióticas,
em proteínas de membrana externa estruturalmente similares às proteínas Lig
(FRANKEL et al., 1995).
As análises realizadas sobre as intiminas de
E. coli e invasinas de Yersinia spp.
revelaram uma estreita similaridade com os domínios Big2 encontrados em ambas
14
as proteínas LigA e LigB, com relação à distribuição destes domínios regularmente
ao longo de ambas as proteínas e à presença de uma estrutura carboxiterminal em
todas as proteínas LigB (FRANKEL et al., 1995; PALANIAPPAN et al., 2002;
MATSUNAGA et al., 2003). Ainda em relação à sua estrutura, LigA e LigB
compartilham uma região idêntica que compreende os primeiros 719 aminoácidos e
vem seguida por uma porção não-idêntica de 596 aminoácidos em LigA e 484 em
LigB, respectivamente. Em LigA, a soma de ambas regiões constitui a proteína
inteira enquanto LigB apresenta ainda a mencionada cauda carboxiterminal de 779
aminoácidos (MATSUNAGA et al., 2003).
Entre as espécies genômicas de
Leptospira, 6 espécies são encontradas
constituindo um cerne de leptospiras patogênicas (HAAKE et al., 2004). Dentre
estas, todas demonstram a presença do gene ligB (MATSUNAGA et al., 2003).
Outra proteína presente em cepas patogênicas do gênero
Leptospira é a proteína
LigC. Esta também apresenta estrutura composta por domínios Big2 semelhante às
proteínas LigA e LigB e um domínio carboxiterminal como àquele presente na
proteína LigB (MATSUNAGA et al., 2003).
Um aspecto intrigante é o fato de o gene ligC ser um pseudogene em
L.
interrogans
Copenhageni Fiocruz L1-130 e L. kirschneri Grippotyphosa RM52. Porém,
nos sorovares Lai 56601 e Pomona Kennewicki de L. interrogans, este gene codifica
a proteína LigC integralmente (MATSUNAGA et al., 2003).
Até o momento, LigC foi identificada apenas em cepas das espécies
L. interrogans
e
L. kirschneri e em função de sua estrutura semelhante às adesinas já mencionadas,
tanto de
Leptospira quanto de outras bactérias Gram negativas, especula-se sua
possível participação na patogênese deste gênero, ao lado das outras proteínas Lig
(MATSUNAGA et al., 2003).
1.3. Outros fatores de virulência e elementos envolvidos na patogenia
A grande variedade de células hospedeiras reconhecidas pelas leptospiras
sugere a presença de diversas adesinas nesta espiroqueta. Estas adesinas atuam
supostamente como fatores de virulência, os quais se ligam à fibronectina purificada
(MERIEN et al., 1997).
Outras proteínas expostas na superfície estão provavelmente envolvidas na
adesão de
Leptospira spp. às células hospedeiras. Assim como outras espiroquetas,
15
Leptospira
spp. tem um vasto repertório de lipoproteínas (GUERREIRO et al., 2001;
CULLEN et al., 2002; CULLEN et al., 2004; CULLEN et al., 2005), as quais vêm
sendo testadas para o desenvolvimento de vacinas como uma tentativa de impedir o
estabelecimento da doença. Anteriormente, a proteína integral de membrana
OmpL1, as lipoproteínas LipL41 e LipL32, proteína periférica de membrana
P31
LipL45 e outros alvos foram testados para essa mesma finalidade demonstrando
sua participação na patogênese (HAAKE et al., 1993; SHANG et al., 1996;
BARNETT et al., 1999; HAAKE, 2000; GAMBERINI et al., 2005).
Recentemente, o seqüenciamento do genoma de 2 sorovares de
L. interrogans
revelou a existência de outros alvos potenciais para o desenvolvimento de novas
estratégias vacinais (GAMBERINI et al., 2005). A análise comparativa dos dois
genomas demonstrou seu alto grau de similaridade, o que reforça a possibilidade de
uma vacina comum a todos os sorovares de
Leptospira spp. (NASCIMENTO et al.,
2004).
Outros elementos foram vistos contribuindo para a virulência desta espiroqueta,
como o flagelo periplasmático, o qual está envolvido no movimento propulsor,
penetração ativa do tecido e mobilidade através de fluidos altamente viscosos
(GREENBERG e PAROLA 1977; TOWERS et al., 2003; LIN et al., 2004);
quimiotaxia, uma vez que
Leptospira demonstrou ser atraída por superfícies
danificadas da pele (YURI et al., 1993); hemolisinas, uma vez que elas secretam
esfingomielinase C (SphA) e hemolisinas formadoras de poros (SphH); e o próprio
lipopolisacarídeo (LPS), o qual é o determinante antigênico principal deste gênero
(FAINE et al., 1999).
Ainda não está claro se as diferentes espécies de
Leptospira spp. necessitam do
elemento Tir (“Translocated intimin receptor”), assim como outras bactérias Gram
negativas como
Escherichia coli EPEC, para a aderência à superfície da célula
hospedeira, por meios de suas adesinas. O elemento Tir é codificado pela própria
bactéria, incorporando-se na membrana da célula hospedeira ao mesmo tempo que
se expõe para o exterior (NOGAYRÈDE et al., 2003). Uma vez posicionado na
membrana torna-se o domínio ao qual as adesinas se ligarão. Tal elemento parece
ser de grande importância na virulência e sua ausência resultaria na perda de
patogenicidade de
E. coli. Alternativamente outras rotas podem estar envolvidas na
adesão, não requerendo assim a presença de Tir (NOGAYRÈDE et al., 2003).
16
1.4. Estudos filogenéticos
O estudo da diversidade genética das adesinas de bactérias Gram negativas
resultou em informações de grande valia para o desenvolvimento de vacinas e
estudos de evolução molecular (TARR e WHITTAM, 2002; ZHANG et al., 2002;
TOWERS et al., 2003). A recente publicação da seqüência do genoma de dois
sorovares de
L. interrogans revelou características peculiares, como por exemplo, a
inversão de uma grande região correspondente entre o genoma de Lai e
Copenhageni e a alta identidade entre os genes que codificam para a rota de síntese
do LPS com os de
E. coli, que demonstram ter sido provavelmente adquiridos por
eventos de transferência gênica horizontal (Ren et al., 2003; NASCIMENTO et al.,
2004).
O estudo da diversidade genética de
Leptospira spp. pode auxiliar na elaboração
de vacinas mais eficazes, considerando o alto número de sorovares existentes para
as diversas espécies. Análises filogenéticas com base nas seqüências das regiões
codificadoras das lipoproteínas ompL1, lipL41 e lipL32 tentaram correlacionar os
diversos sorovares em função do grau de similaridade que há entre as seqüências
codificadoras desses alvos vacinais, como uma medida para o desenvolvimento de
vacinas de amplo espectro (HAAKE et al., 2004).
1.5. Potencial das proteínas Lig na vacinologia e diagnóstico
O diagnóstico molecular mediante a amplificação por PCR das regiões
codificadoras dos genes lig foi testado, tanto por PCR convencional quanto por real-
time PCR, e em ambos os casos a detecção de leptospiras em estágio inicial de
infecção foi bem sucedida (PALANIAPPAN et al., 2005).
No campo da medicina preventiva, vacinas do tipo bacterinas estão disponíveis.
Porém, estas apresentam imunidade pouco duradoura e são sorovar-específicas, o
que vem a se tornar problemático uma vez que
Leptospira spp. apresenta-se
constituída por mais de 250 sorovares e assim diversas formulações vacinais seriam
necessárias para se alcançar uma proteção completa (LEVETT, 2001).
As proteínas LigA e LigB já foram avaliadas quanto ao seu potencial na proteção
contra o desafio em camundongos (KOIZUMI e WATANABE, 2004) e quanto ao seu
uso no imunodiagnóstico (PALANIAPPAN et al., 2004). Em ambos os estudos
mostraram-se promissoras para as finalidades desejadas.
17
Atualmente, novos estudos vêm sendo desenvolvidos com a finalidade de
comprovar o potencial protetor das proteínas Lig mediante o desafio em Hamsters.
Interessantemente, a proteína LigA tem demonstrado eficiente proteção no desafio
com a cepa homóloga e possibilidade na proteção de amplo espectro
(PALANIAPPAN et al., 2006; SILVA et al., comunicação pessoal).
18
2. OBJETIVO GERAL
O objetivo do presente estudo foi caracterizar os genes lig quanto ao
polimorfismo da seqüência de DNA e quanto a presença ou ausência em sorovares
patogênicos de
Leptospira spp, com o propósito de subsidiar estudos que visam a
utilização destes antígenos como vacina de amplo espectro, bem como possibilitar a
realização de estudos filogenéticos deste importante gênero de bactérias.
2.1. Objetivos específicos
- Seqüenciar os genes ligA, ligB e ligC de sorovares das espécies
L. interrogans, L.
noguchii
, L. weilli e L. borgpetersenii e alinhar as seqüências geradas com aquelas
depositadas no GenBank, tanto em nível de nucleotídeos quanto de aminoácidos,
para avaliar sua conservação.
- Desenvolver um método baseado em PCR para identificar a presença dos genes
lig nas diferentes espécies de
Leptospira, por meio da amplificação de um fragmento
interno aos respectivos genes.
- Seqüenciar o fragmento interno do gene ligB, dos sorovares das espécies
patogênicas, e utilizar as seqüências geradas na análise filogenética das espécies
genômicas de
Leptospira spp.
19
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Cepas usadas no estudo e cultivo
As cepas de
Leptospira spp. foram cultivadas à 30ºC em meio EMJH
suplementado com 10% de albumina (Difco). O crescimento e motilidade foram
acompanhados por microscopia de campo escuro. Cepas de baixa e alta passagem
foram cultivadas. Foram utilizados diferentes sorovares, listados na Tab. 1, os quais
cobrem as diversas espécies genômicas. As amostras foram cedidas pelo Dr. Alan J.
A. McBride e Dr. Albert I. Ko do Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz (FIOCRUZ-BA)
e pelo Dr. David A. Haake (University of California at Berkley).
3.2. Extração de DNA genômico
O DNA genômico das cepas de
Leptospira spp. foi extraído segundo o protocolo
de extração de DNA genômico de bactérias gram negativas do kit “GFX Genomic
Blood DNA purification Kit” (Amesham - GE Healthcare). O DNA extraído foi
submetido a eletroforese em gel de agarose 0,8% a fim de avaliar a sua qualidade.
O DNA extraído foi mantido a -20ºC.
3.3. Desenho de primers, amplificação por PCR, clonagem e
seqüenciamento
Primers foram desenhados com a finalidade de amplificar e seqüenciar as
regiões codificadoras dos genes lig na sua totalidade (Tab. 2). Os primers usados
para o seqüenciamento completo das regiões codificadoras dos genes lig foram
degenerados com a finalidade de servirem ao seqüenciamento dos genes oriundos
das diferentes espécies de leptospira. Para tal fim foi realizado um alinhamento das
regiões codificadoras dos genes lig disponíveis no GenBank usando o software
AlignX (Invitrogen), parte do pacote que contém o software Vector NTi 8.0
(Invitrogen). Todos os primers foram construídos e analisados mediante o uso do
software Vector NTI 8.0 (Invitrogen).
20
Código Espécie Sorogrupo Sorovar Cepa/Isolado Origem/Fonte
Pom L. interrogans Pomona Pomona P10637-46 Suíno/USA
Can L. interrogans Canicola Canicola Kito
Canino/Brasil
Can2 L. interrogans Canicola Canicola Mex1 Bovino/México
Nog L. noguchii Bataviae ND Cascata
Humano/Brasil
- L. noguchii Australis ND Hook Canino/Brasil
Har L. borgpetersenii Hardjo ND USDA Bovino/USA
Heb L. weilli Hebdomadis ND Ecochallenge Humano/USA
Cop L. interrogans Icterohaemorragie Copenhageni L1130 Humano/USA (NCBI)
Gri L. kirschneri Grippotyphosa Grippotyphosa RM52 Suíno/USA (NCBI)
Lai L. interrogans Icterohaemorragie Lai 56601 Humano/China (NCBI)
Man L. interrogans ND Manilae
UP-MMC-NIID
Humano/Japão (NCBI)
PomC L. interrogans Pomona Pomona Kennewicki Equine/USA (NCBI)
- L. interrogans Autumnalis Autumnalis AkiyamiA Humano/Japão (OMS)
- L. interrogans Sejroe Hardjo Hardjoprajitno Humao/Indonésia (OMS)
- L. interrogans Pomona Kennewicki LT1026 Bovino/USA (OMS)
- L. interrogans Australis Bratislava Jez Bratislava Porco-espinho/Rep Tcheca (OMS)
- L. interrogans Australis Muenchen Muenchen C90 Humano/Alemanha (OMS)
- L. interrogans Pomona Pomona Pomona Humao/Austrália (OMS)
- L. interrogans Canicola Canicola Hond Utrech IV Canino/Holanda (OMS)
- L. interrogans Hebdomadis Hebdomadis Hebdomadis Humano/Japão (OMS)
- L. interrogans Icterohaemorragie Icterohaemorragiae RGA Humano/Bélgica (OMS)
- L. interrogans Icterohaemorragie Copenhageni M20 Humano/Dinamarca (OMS)
- L. interrogans Australis Australis Ballico Humano/Austrália (OMS)
- L. interrogans Bataviae Bataviae Van Tienem Humano/Indonésia (OMS)
- L. interrogans Sejroe Wolffi 3705 Humano/Indonésia (OMS)
- L. interrogans Icterohaemorragie Lai Lai Humano/China (OMS)
- L. interrogans Pyrogenes Manilae LT398 Rato/Filipinas (OMS)
- L. kirschneri Australis Ramisi Musa Humano/Quênia (OMS)
- L. kirschneri Bataviae Djatzi HS26 Humano/Porto Rico (OMS)
- L. kirschneri Pomona Mozdok 5621 Veado/Rússia (OMS)
- L. kirschneri Autumnalis Erinaceiauriti EA670 Porco-espinho/Rússia (OMS)
- L. kirschneri Hebdomadis Kambale Kambale Humano/Zaire (OMS)
- L. noguchii Louisiana Orleans LSU2580 Nutria/USA (OMS)
- L. noguchii Panama Panama CZ214K Opossum/Panama (OMS)
- L.borgpetersenii Mini Mini Sari (OMS)
- L.borgpetersenii Tarassovi Tarassovi Perepelicin (OMS)
- L. borgpetersenii Javanica Poi Poi (OMS)
- L. borgpetersenii Javanica Ceylonica Piyasena Humano/Sri Lanka (OMS)
- L. borgpetersenii Javanica Javanica Veldrat Batavia 46 (OMS)
- L. weilli Celledoni Celledoni Celledoni Humano/Austrália (OMS)
- L. weilli Tarassovi Vughia LT89-68 Humano/Vietnan (OMS)
- L. santarosaii Sejroe Trinidad TRVL34056 Humano/Trinidade (OMS)
- L. santarosai Pyrogenes Alexi HS616 Humano/Porto Rico (OMS)
- L. fainei Hurstbridge Hurstbridge But6 Suíno/Austrália (OMS)
-
L. meyeri Semaranga Semaranga Veldrat 173 Rato/USA (OMS)
- L. biflexa Semaranga Patoc Patoc1
Á
gua/Itália (OMS)
Tabela 1 - Cepas usadas no estudo
ND - Informação não disponível
21
Tabela 2 - Conjunto de primers usados no estudo
lig
AF
lig
AR
lig
BF
5'CTTTATTACGAATTCATTGAGTTATTT3'
lig
BR
5'TTATTGATTCTGTTGTCTGTAAATTTTG3'
lig
CF
lig
CR
lig
BAF
lig
BAR
ID A F-2000
5'TTCTGTAGATTTTACCGTCACAC3'
lig
A F-2500
5'(G/A)(A/G)(A/G)TATTAA(A/G)GCGACATTGGG3'
lig
A F-3000
5'C(T/G)(G/A)ATCCGAA(T/A)(G/A)T(T/C)GCATC3'
lig
A F-3500
5'C(G/T)GA(T/A)CTTGT(G/A)AC(C/T)TGGA(A/G)(G/T)TC(C/T)TC3'
lig
A R-3500
5'(A/G)GAGGAACCTAC(A/G)GAAAG(C/A)G3'
lig
A R-3000
5'TGTT(T/A)TC(T/G)A(C/T)(T/C)GATGC(G/A)A(T/C)(T/A)TTC3'
lig
A R-2500
5'CTTACATTTCCCAATGTCGC3'
lig
A R-2000
5'CCTGTGTGACGGTAAAATCTAC3'
lig
A R-1500
5'AGAAGGATTTACAGGATTGATTTG3'
lig
B R-1000
5'G(G/A)T(C/T)(G/C/T)GT(A/G)ATATC(C/T)(G/A)A(G/A)TT(T/C)G3'
lig
B R-500
5'GGA(A/G)GACCAAA(C/T)(G/C)(A/G)TCA(G/A)TG3'
ID F-500
5'CCA
Tabela 2 - Continua
ç
ão
TTGATCGTTTGGTC(T/C)TCCAG3'
ID F-1000
5'CGGATAT(T/C)AC(C/G/A)(G/A)A(C/T)CA(A/G)GTTAC3'
ID F-1500
5'TTACGGCTA(C/G)(T/G)GG(G/A)ATCTACTC3'
ID F-2000
5'TTGC(C/G/A)GTAAC(A/G)CC(T/G)A(T/C/G)(A/T)AATCC3'
lig
B F-2500
5'CCC(A/G)ATT(C/T)CGAT(T/C/G)AC(A/G)GT(C/T)AC3'
lig
B F-2980
5'AACCAAGGGAAAAGCGACCGC3'
lig
B F-3500
5'ATTCCAATTCTCAAACC(G/A)(C/G)AG3'
lig
B F-4000
5'ACGGAGACGG(C/A)TTTGACAAC3'
lig
B F-4500
5'GCTTCAA(C/T)TATCTCTATTA(T/C)TC(C/T)TC3'
li
g
B F-5000
5'CCAAATTC(A/C)(C/T)TACATAATGGAAG3'
5'CAAAGTTGTATGTCTTGGCCACT3'
5'GGTCTAGATGCATATTATTGATTCTGTTGTCTG3'
Primers para seqüenciamento dos genes lig
ligA forward primers
ligA reverse primers
Primers para clonagem dos genes lig inteiros
5'CAATTAAAGATCGTTATACGATAC3'
5'AAGAAGAAACGATCACAAGGTC3'
5'GTCTTCATTTAGGATTTTATAA3'
5'TAACATTCTACCTCCAAGGT3'
ligB forward primers
lig
B R-5500
5'TCCGTTTTCGTT(A/G)TCAAAACC3'
lig
B R-5000
5'TTATGTA(G/A)(T/G)GAATTTGGAAATCC(T/C)C3'
lig
B R-4500
5'(C/T)TGAGGA(A/G)TAATAGAGATA(G/A)T(C/T)(G/C)AA(T/G)C3'
lig
B R-4000
5'GTCAAA(G/T)CCGTCTCCGT(T/C)C3'
lig
B R-3500
5'AATTGAA(G/A)TCCG(T/C)(A/G)TTATC(T/C/G)(G/A)AAC3'
lig
B R-2980
5'CGGTCGCTTTTCCCTTG3'
lig
B R-2500
5'GT(A/G/C)ATCG(G/A)AAT(T/C)GG(G/A)GA(G/A)C3'
lig
B R-2000
5'GGATT(T/A)(A/G/C)T(A/C)GG(T/C)GTTAC(G/T/C)GCAA3'
lig
B R-1500
5'TAGCCG(T/A)AAA(T/G)TTTT(G/T)(A/C)(G/T)TTAA(C/G)C3'
lig
B R-1000
5'G(G/A)T(C/T)(G/C/T)GT(A/G)ATATC(C/T)(G/A)A(G/A)TT(T/C)G3'
lig
B R-500
5'GGA(A/G)GACCAAA(C/T)(G/C)(A/G)TCA(G/A)TG3'
ligC forward primers
CF500
5'CGT(C/T)ACATC(C/T)GCTGTTTTGTCCG3'
CF1000
5'GCAACGTTAGGCGGAATTAC(C/T)3'
CF1500
5'GAGAAATA(C/T)AATCTCCTTCTTCCG3'
CF2000
5'GGATTCTTCCAT(C/T)G(C/T)TTCCGTAGAC3'
CF2500
5'TGCAACCGGAGTTTA(C/T)TC(A/G)GATG3'
CF3000
5'T(C/T)TCTCCAGC(A/G)GACATTAG(C/T)GTA(G/T)CC3'
CF3500
5'GCGACTTTGGGAAGTATCAG(C/T)GGAAAC3'
CF4000
5'GCAGAATGTACCGGTTCT(A/G)CAGAATG3'
CF4500
5'GCGACTAACGTAAGTTC(A/T)AACT(C/T)AGCTTC3'
CF5000
5'GCGTT(C/T)GA(C/T)GGAACCAAAGG3'
CF5500
5'GAAG(A/G)GCACAACTTTGGAAATGTGATC3'
ligC reverse primers
CR5250
5'GAACAAGA(A/G)TC(C/T)GGTCCGGTACAAGC3'
CR4750
5'G(G/T)GTCTGC(A/G)GAGTAATACAGATAATC3'
CR4250
5'AAGAATTTCGGATTGATCCCC3'
CR3750
5'AC(A/G)AACACAGATCCGCTTCCAC3'
CR3250
5'GGCGGC(C/T)GTAACCGT(C/T)AAAC3'
CR2750
5'GTTGAA(A/G)GAAGAGGTGGGAGC3'
CR2250
5'CCAAA(C/T)AACTTG(A/G)TCACTAAT(A/G)TTC3'
CR1750
5'CCT(A/G)TTCGTGTTGGA(A/G)GAATTCC3'
CR1250
5'GT(A/G)CTACC(A/G)AC(C/T)CCGACTCC3'
CR750
5'AAGTG(C/T)T(A/G)CC(A/T)GGAGAAAG(C/T)CC3'
ligB reverse primers
22
Primers usados para gene walking
Lep150
5'CTAATAGCTACGGGAATCTATT3'
Lep151
5'ATAACGTAGAAACCGGACTA3'
Lep152
5'CAAAGGTGAGTAACGCATCT3'
Lep153
5'GGTTTGAGAATTGGAATTGA3'
Lep154
5'CTCCTCGATCAACTGGGGTT3'
Lep155
5'CCTCACAAGGACTAGGATTT3'
Lep156
5'CGGATGGTTCTCATCAGGAT3'
Lep157
5'AGAACCGCAGGAACTACAGT3'
Lep158
5'CTGGTACCGTTTGCGATAGA3'
NBF1
5'CCTATCTCGTCTCACAAAGCAAAG3'
NBF2
5'GCGATGGAATCTATACAGATCATTC3'
NBF3
5'AGTTAAGCTGTCCGAATAACGCC3'
NBR1
5'CCGAATAAACTCCATACGCGG3'
NBR2
5'GTTGCAAATACTCCTCTTCCGTC3'
JF
5'ATTTGATATATTTTGTTTTTCCCG3'
JsignalR
5'GTGGAAGACCCCAACGAA3'
JB1F
5'ATTCGATCCAAGTTACGAGTTTAGAT3'
JB1R
5'TTTCCCAAAGGAAGATTCGA3'
JB2F
5'CCGTTTTGGCTTCCATCG3'
JB2R
5'ATCGAAACCAAAGACGCCTG3'
JB3F
5'TCGGTCACTTGGACTTCTTCTTC3'
JB3R
5'GGAACTGGAATTGTCCGAATAAAT3'
JB4F
5'GGATATTACGGAACAAGTCACTTG3'
JB4R
5'GCAGTGATGTTTGCACTTCCG3'
JB5F
5'GCGTTCGGTGTTTATTCGGA3'
JB5R
5'AAAATTCGCCCTATCTTTCGG3'
lig
A KAF
5'AATCTTCCAATACAGCCTACGC3'
lig
A KAR
5'CCAAACCAGCTGATCCGAAG3'
lig
B ATG F
5'CTCAATAAATAAACACAGCAAATACAC3'
lig
B ATG R
5'GTACTGGTACCGTTTGCGATA3'
lig
B G6 F
5'GGTCACTTGGACTTCTTCTTC3'
lig
B G6 R
5'CTTTGCGAGAGTGGTAGTATTCATC3'
lig
C ATG F
5'TTATGATAGTTTGCTATTTAGGATGTTA3'
lig
C ATG R
5'TCTAACTCTGTCTCGGATGGTTC3'
lig
C G1 F
5'TCAATCTTCTATCGCAGGTGTAAAC3'
lig
C G1 R
5'CTTGGGTTTGCAGGAGTGAT3'
lig
C G2 F
5'GTAGCCAAAGGAAACAGCAAGG3'
li
Tabela 2 - Continuação Tabela 2 - Continuação
g
C G2 R
5'AAACAGTAATCACAGAAGAGGTAGAAG3'
Primers para detecção por PCR
PSAF
5'C(G/T)GA(A/T)CTTGT(A/G)AC(C/T)TGGA(A/G)(G/T)TC(C/T)TC3'
PSAR
5'TTGTTAATGTTTTCAT(A/G)TTA(C/T)GGC3'
PSBF
5'CGGGATCCAAGGTAACTCCGGCACAATTGATTTCCA3'
PSBR
5'GT(A/G/C)ATCG(G/A)AAT(T/C)GG(G/A)GA(G/A)C3'
PSB2F
5'GGATATTACGGAACAAGTCACTTG3'
PSB2R
5'CCGAATAAACTCCATACGCGG3'
PSCF
5'GAGAAATA(C/T)AATCTCCTTCTTCCGG3'
PSCR
5'CCT(A/G)TTCGTGTTGGA(A/G)GAATTCC3'
Primers para amplificação dos controles internos
lip
L32F
5'CGCTTGTGGTGCTTTCGGTGGT3'
lip
L32R
5'CTCACCGATTTCGCCTGTTGGG3'
16SF
5'GGCGGCGCGTCTTAAACATG3'
16SR
5'TTCCCCCCATTGAGCAAGATT3'
Obs.: Os nucleotídeos marcados em vermelho representam pontos de “mismatch”
os quais não foram degenerados.
23
As reações de PCR com a finalidade de amplificar os genes inteiros (5 a 7 kb)
foram realizadas em termociclador Mastercycler gradient (Eppendorf) utilizando a
seguinte programação: 94ºC por 2 minutos seguido de 35 ciclos que incluem 94ºC
por 30 segundos, 48ºC por 30 segundos e 68ºC por 5 a 7 minutos. Uma etapa final
de 68ºC por 7 minutos foi incluída.
Os componentes que fazem parte desta reação são: 1,5µl de 5X buffer A, 3,5µl
de 5X buffer B, 0,5 µl de 10 mM dNTPs, 1,0 µl de 10 pmol.µl
-1
conjunto de primers,
200 ng de DNA genômico e 0,5 µl (2,5 unidades) da enzima Elongase, para um
volume final de reação de 25 µL.
As regiões codificadoras inteiras dos genes lig foram submetidos à avaliação em
gel de agarose 0,8%. Os produtos gerados foram clonados nos vetores pCR2.1, o
qual é parte do sistema de clonagem rápida “Topo-TA cloning Kit” (Invitrogen).
Os primers usados na amplificação dos respectivos genes, oriundos dos
sorovares de
L. interrogans, não foram os mesmos utilizados na amplificação dos
genes derivados dos sorovares de
L. noguchii e L. weilli. Para as últimas os primers são
denominados ligB alternativo – ligBAF e ligBAR (Tab. 2).
A cepa Top10 F’ de
Escherichia coli (Invitrogen) foi cultiva em meio LB líquido à
37ºC e tornada competente segundo protocolo de preparação de células
eletrocompetentes (SAMBROOK e RUSSELL, 2001). Essa cepa foi transformada
por eletroporação e semeada em meio LB sólido suplementada com 50µg.ml
-1
de
canamicina ou 100 µg.ml
-1
de ampicilina quando necessário. E. coli Top10 F’
contendo os plasmídeos recombinantes foram cultivadas em LB líquido, da mesma
forma já mencionada, sendo o cultivo suplementado com 50µg.ml
-1
de canamicina
ou 100 µg.ml
-1
de ampicilina quando conveniente. Os plamídeos recombinantes
foram extraídos segundo protocolo do “GFX microplasmid prep kit” (Amersham – GE
Healthcare) e submetido à eletroforese em gel de agarose 0,8% a fim de que fossem
quantificados.
Ainda, alguns dos primers degenerados anteriormente descritos foram usados
para a amplificação de produtos internos aos genes lig (Tab. 2). Além destes,
primers para a amplificação de um fragmento interno ao gene ligB nas espécies
L.
noguchii
, L. weilli, L. borgpetersenii e L. santarosai, e primers para amplificação dos
controles, foram desenhados e analisados conforme anteriormente descrito (Tab. 2).
Os produtos internos aos genes lig foram amplificados por PCR segundo as
condições mencionadas: uma etapa de desnaturação inicial de 94ºC por 3 minutos
24
seguido de 35 ciclos que incluem 94ºC por 30 segundos, 52-54ºC por 30 segundos e
72ºC por 1 minuto. Uma etapa final de 72ºC por 7 minutos foi incluída.
Os componentes que fazem parte desta reação são: 2,5 µl de 10X tampão, 0,75
µL de 50 mM de MgCl
2
, 0,5 µl de 10 mM dNTPs, 2,0 µl de 10 pmol.µl
-1
conjunto de
primers, 50 ng de DNA genômico e 0,25 µl (2,5 unidades) da enzima Taq DNA
polimerase.
Os produtos de PCR amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de
agarose 1,5%. Os fragmentos derivados do gene ligB foram seqüenciados.
Os genes ligA, ligB e ligC foram seqüenciados na sua totalidade mediante o uso
de primers degenerados desenhados para a estratégia de “primer walking” (Tabela
2). Um mínimo de 4 leituras por base foi gerada com o uso de primers em ambos os
sentidos, a fim de confirmar com exatidão cada base componente dos genes em
questão. O seqüenciamento foi realizado em equipamento MegaBace 500
(Amersham – GE Healthcare) mediante a tecnologia Dyenamic ET-terminator de
incorporação de dideoxi-nucleotídeos. A montagem das “contigs” e análise das
seqüências foi efetuada no programa ContigExpress que faz parte do pacote que
contém o software Vector NTi (Invitrogen). As seqüências das contigs foram
inseridas no programa Vector NTi 8.0 (Invitrogen) e utilizadas para a montagem dos
genes lig.
A região codificadora do rDNA 16S foi também amplificada a partir de todas as
cepas usadas no estudo, usando os primers universais fD1 e rP2. Os produtos foram
purificados e seqüenciados com o intuito de confirmar a identidade das cepas e
descartar a possibilidade de contaminação.
3.4. Detecção dos genes lig por Southern blot
Os fragmentos internos mencionados anteriormente, oriundos dos genes ligA e
ligB das cepas virulentas de
L. interrogans e L. kirschneri, foram amplificados por PCR e
submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% a fim de que fosse verificada a
correta amplificação de um produto de 536pb. Após, foram purificados segundo
protocolo de purificação de DNA em solução do “GFX PCR DNA and Gel Band
purification kit” (Amersham – GE Healthcare) e utilizados como sonda para a
detecção dos genes ligA e ligB nas amostras de DNA genômico de
L. interrogans e L.
kirschneri
. 2µg de DNA genômico foram tratados com a enzima BamHI até a completa
25
digestão do DNA. O DNA digerido foi submetido a eletroforese “overnight” em gel de
agarose 1% a 30V. Como controle foi adicionado também DNA genômico de
L.
biflexa
, sabidamente uma saprófita e que não apresenta os genes lig. O DNA foi
visualizado em transiluminador ultravioleta e em seguida transferido para uma
membrana de nitrocelulose carregada positivamente seguindo o protocolo descrito
no “ECL direct labelling and detection kit” (Amersham – GE Healthcare). A sonda foi
marcada com peroxidase e incubada juntamente com a membrana em garrafa de
hibridização, “overnight” a 42ºC. O procedimento foi realizado em forno de
hibridização em um carrossel rotatório. Vinte mililitros de tampão foram utilizados
para a membrana produzida, a qual apresentava dimensões de 15X15cm. Após a
hibridização, a membrana foi submetida a sucessivas lavagens com tampão
apropriado descrito no manual do kit mencionado (ECL – Amersham – GE
Healthcare). A detecção das bandas foi realizada em sala escura. Sobre a
membrana produzida foi adicionado luminol, o qual é formado pela mistura em
partes iguais dos reagentes de detecção 1 e 2 do kit mencionado (ECL – Amersham
– GE Healthcare). As bandas puderam ser observadas mediante a exposição do
filme de raio-X (Kodak) à membrana de nitrocelulose por 3 horas.
3.5. Análise dos genes e alinhamento
Os genes montados foram analisados por softwares de bioinformática com
relação ao tamanho da região codificadora, peso molecular e tamanho da proteína.
Para tal foi utilizado o software Vector NTi 8.0, (Invitrogen). O mesmo foi utilizado
para fazer a tradução in silico das proteínas LigA, LigB e LigC e efetuar as análises
mencionadas. Programas de bioinformática disponíveis na internet como SMART
(
www.smart.embl-heidelberg.de) e Pfam (www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) foram
utilizados com a finalidade de verificar o número, tamanho e distribuição dos
domínios Big2, a partir das seqüências das proteínas geradas in silico. Por fim, o
alinhamento entre as seqüências de lig geradas e aquelas disponíveis no GenBank,
tanto no nível de nucleotídeos quanto de aminoácidos, foi efetuado no programa
AlignX (Invitrogen). Além disso, o programa BLAST (
www.ncbi.nlm.nih.gov/blastT), o
qual serve à finalidade de alinhar seqüências de genes e proteínas contra as
seqüências depositadas no GenBank, foi utilizado durante o curso deste estudo.
26
3.6. Análise filogenética
As seqüências de nucleotídeos geradas foram utilizadas para a montagem de
árvores filogenéticas. Para isso, o software Mega3 (Grisoft) foi utilizado. As
seqüências de LigB, no nível de nucleotídeos, foram organizadas no formato FASTA,
as quais receberam como identificação a primeira letra da espécie genômica a que
pertenciam seguida pelo nome do sorovar e por fim o nome da cepa ou isolado. As
árvores montadas foram construídas pelo método de Neighbor-joining, tendo como
modelo a distância de P. Foram testadas 500 e 1000 bootstraps durante a análise.
Porém, a árvore finalmente construída assume o valor de 1000 bootstraps. A árvore
demonstrada leva em consideração uma escala de variação de 10% entre os genes
e proteínas.
27
4. RESULTADOS
4.1. Seqüenciamento dos genes ligA, ligB e ligC de isolados de Leptospira
spp.
Os genes ligA, ligB e ligC foram amplificados dos diferentes sorovares de
Leptospira spp. patogênicas. A existência de polimorfismo entre as seqüências das
diferentes espécies impediu que os primers utilizados para
L. interrogans fossem
também utilizados para as demais espécies. Os primers forward utilizados para
amplificar os genes ligA e ligB anelam em uma posição anterior ao início da região
codificadora, uma vez que a porção idêntica entre ligA e ligB se estende pela região
reguladora. Entretanto, em
L. noguchii e L. weilli, a região reguladora não foi incluída.
Os primers capazes de amplificar ligB nestas espécies anelam em uma posição logo
antes do primeiro sítio ATG.
Todos os genes lig amplificados foram clonados antes de serem submetidos ao
seqüenciamento. Esta abordagem foi necessária, pois são fragmentos grandes,
acima de 3kb, o que limita a eficiência do seqüenciamento direto do produto de
PCR. Após a clonagem, os genes ligA, ligB e ligC foram seqüenciados na sua
totalidade (Tab. 3).
Tabela 3 - Cepas usadas no seqüenciamento completo dos genes
lig
Código Espécie Sorovar Cepa/Isolado Virulência
Gene
seqüenciado
Pom
L. interrogans
Pomona P10637-46 Virulento ligA, ligB e ligC
Can
L. interrogans
Canicola Kito Virulento ligA, ligB e ligC
Can2
L. interrogans
Canicola Mex1 Virulento ligB
Nog
L. noguchii
ND Cascata Virulento ligB
Har
L. borgpetersenii
ND USDA Virulento ligB
Heb
L. weilli
ND Ecochallenge Virulento ligB
ND - Informação não disponível
O gene ligA das cepas
L. interrogans Canicola Kito e L. interrogans Pomona P10637-
46 foram amplificados e completamente seqüenciados (Tab. 4).
28
ligA lig B lig C ligA ligB lig C LigA LigB LigC
Can + + + 3675 5670 5865 1225 1890 1955
Can2 + + + NS 5670 NS NS 1890 NS
Pom + + + 3672 5670 5865 1224 1890 1955
Nog - + - - 5805 - - 1935 -
Heb - + + - 5694 NS - 1898 NS
Har - + - - 5739 - - 1913 -
Cop* + + + 3675 5670 1494 1225 1890 498
Lai* - + + - 5670 5865 - 1890 1955
Gri* + + + 3681 5661 1008 1227 1887 336
Man* + + - 3675 3573 - 1225 1191 -
PomC* + + + 3678 5670 5871 1226 1890 1957
NS - Gene não seqüenciado
* Genes depositados no GenBank
Código
Característica do DNA
Tabela 4 - Genes detectados por PCR e análise comparativa dada pelo
seqüenciamento.
Detecção por PCR
Característica da Proteína
Tamanho do gene (pb) Tamanho (aa)
Os genes ligA dos sorovares Canicola e Pomona seqüenciados neste estudo
apresentaram uma pequena diferença de tamanho. Enquanto que Canicola possui
ligA com 3.675pb, Pomona possui 3pb a menos, o que corresponde a um códon.
Esta diferença está no aminoácido lisina, o qual só está presente na seqüência sinal
de LigA do sorovar Canicola. As tentativas para amplificar o gene ligA das demais
espécies não foram bem sucedidas. Testes subseqüentes revelaram que este gene
não está presente em
L. noguchii, L. weilli e L. borgpetersenii.
Com relação ao gene ligB, ao contrário de ligA, este pode ser amplificado e
seqüenciado a partir de todas as espécies em estudo. Este gene mostrou maiores
diferenças de seqüência e estrutura quando comparado entre as diferentes espécies
(Tab. 4). Entre os sorovares da espécie
L. interrogans, ligB apresentou o mesmo
tamanho, exceto na cepa do sorovar Manilae (Man). Porém entre as espécies
L. weilli
(Heb),
L. borgpetersenii (Har) e L. noguchii (Nog), ligB demonstrou um tamanho variável.
L. weilli, L. borgpetersenii e L. noguchii apresentam um gene ligB com 24, 69 e 135
nucleotídeos a mais que as cepas de
L. interrogans, respectivamente (Tab. 4). A
seqüência do gene ligB de
L. borgpetersenii foi gentilmente cedida pelo Dr Richard L.
Zuerner (USDA/ USA).
Dois genes ligC foram amplificados e seqüenciados, os quais derivam das
cepas Canicola Kito e Pomona P10637-46. O gene ligC de ambas as cepas de
L.
29
interrogans
seqüenciadas apresentaram o mesmo tamanho (Tab. 4) e ao contrário dos
genes ligC de
L. interrogans FIOCRUZ L1-130 e L. kirschneri RM52, os quais estão
depositados no GenBank, nenhum códon de terminação foi encontrado truncando a
região codificadora. Esses resultados demonstram uma maior similaridade entre as
seqüências dos genes ligC geradas e aquelas derivadas de
L. interrogans Pomona e L.
interrogans
Lai, as quais também encontram-se depositadas no GenBank. Estas
últimas também não apresentam qualquer códon de terminação nas seqüências dos
genes ligC.
4.2. Caracterização in silico dos genes e proteínas LigA, LigB e LigC
Por meio de ferramentas de bioinformática, todas as ORFs correspondentes aos
genes lig foram analisadas e caracterizadas segundo a presença e distribuição dos
domínios Big2 nas proteínas codificadas. As ORFs foram caracterizadas ainda com
relação à presença de um motivo C-terminal dentro dos genes ligB e ligC, bem como
nas respectivas proteínas por estes codificadas.
As proteínas LigB de Canicola Kito, Pomona P10637-46 e Canicola Mex1,
demonstraram ser estreitamente similares, tanto em relação ao número de
aminoácidos quanto ao peso molecular desta proteína (Tab. 4). Estas características
parecem ser um consenso entre LigB das cepas de
L. interrogans.
Análises usando o programa SMART revelaram a presença de uma seqüência
sinal de 21 aminoácidos (MKKIFCISIFLSMFFQS/GCMSW) na extremidade N-
terminal de ambas as proteínas LigA e LigB, das cepas de
L. interrogans. A seqüência
encontrada em LigA é quase idêntica àquela de LigB, exceto pela substituição de um
resíduo de serina por um de glutamina na posição 17 em LigB e pela ausência de
uma lisina em LigA do sorovar Pomona P10637-46.
Análises por SMART e Pfam revelaram a presença de 13 domínios de Big2,
dentro da proteína LigA, estendendo-se pelas regiões idêntica e não-idêntica (Fig. 1
Painel A). Por outro lado, a análise da proteína LigB revelou a presença de 12
domínios de Big2 nos sorovares da espécie
L. interrogans e interessantemente
também nos sorovares das espécies
L. weilli, L. borgpetersenii e L. noguchii, além do
motivo C-terminal já descrito (Fig. 1 Painel B). Os domínios Big2 variam de 80 a 86
aminoácidos em todas as proteínas, LigA e LigB, analisadas.
30
FIGURA 1. Caracterização in silico dos genes lig. Painel A. Estrutura do gene
ligA. Painel B. Estrutura do gene ligB. Painel C. Estrutura do gene ligC. Painel
D. Estrutura do gene ligB nas espécies L. borgpetersenii, L. noguchii e L. weilli.
Região idêntica (verde claro); Região não-idêntica (azul); Motivo C-terminal
(amarelo); Motivo C-terminal de ligC (verde escuro); ligB inteira (laranja); ligC
inteira (vermelho). As setas contendo linhas correspondem aos domínios Big2.
A
seqüência sinal é codificada pela pequena linha azul posicionada a frente de
cada gene. As linhas tracejadas posicionadas acima de cada gene demonstram
a posição e o tamanho correspondente a cada fragmento interno amplificado na
detecção por PCR.
O motivo C-terminal de
L. noguchii demonstrou ser marcantemente maior que
aquele de outras espécies de
Leptospira spp, contendo 809 aminoácidos. Este motivo
C-terminal carrega 45, 17, 17 e 11 aminoácidos mais do que a C-terminal de
L.
interrogans
Canicola Kito, L. borgpetersenii Hardjo USDA, L. weilli Hebdomadis
Ecochallenge e
L. interrogans Pomona P10637-46, respectivamente.
A análise da proteína LigC revelou a presença 12 domínios de Big2 e uma região
C-terminal com 789 aminoácidos. Uma seqüência sinal consenso foi observada, a
qual compreende 35 aminoácidos
(MKKIFSIFLSLFFQGCMVWPLVVGAVGLSTGNKGD). Estruturalmente, a proteína
LigC demonstrou uma grande similaridade com as proteínas LigB, no que diz
31
respeito ao número de domínios Big2 e à presença da região C-terminal (Fig. 1
Painéis B e C).
Para avaliar o grau de conservação entre os genes e as proteínas Lig foi
realizado um alinhamento entre as regiões codificadoras completamente
seqüenciadas e aquelas oriundas do GenBank, bem como entre as proteínas por
elas codificadas. Estas últimas compreendem os genes lig disponíveis para
Leptospira
interrogans Copenhageni FIOCRUZ L1-130, Leptospira interrogans Lai 56601, Leptospira
kirschneri Grippotyphosa RM52, Leptospira interrogans Manilae e Leptospira interrogans
Pomona. O software AlignX foi utilizado para realizar os alinhamentos comparativos
e avaliar o grau de conservação dos genes e proteínas Lig. Conforme esperado,
quando apenas genes de
L. interrogans foram alinhados, a identidade mínima no nível
de nucleotídeos e aminoácidos foi 87% e 84% respectivamente, para LigA (Tab. 5).
TABELA 5 – Conservação de LigA no nível de nucleotídeos e aminoácidos entre vários sorovares
e espécies.
ligA DNA Cop PomC Pom Can Man Gri
L. interrogans copenhageni L1-130
100 90 87 90 97 92
L. interrogans pomona Chang
100 96 99 89 86
L. interrogans pomona P10637-46
100 98 86 83
L. interrogans canicola Kito
100 89 86
L. interrogans manilae
100 92
L. kirschneri grippotyphosa RM52
100
LigA proteína
Cop PomC Pom Can Man Gri
L. interrogans copenhageni L1-130 100 84 85 87 97 91
L. interrogans pomona Chang 100 95 96 84 81
L. interrogans pomona P10637-46 100 98 85 82
L. interrogans canicola Kito 100 86 83
L. interrogans manilae 100 91
L. kirschneri grippotyphosa RM52 100
LigB demonstrou ser mais conservada entre as cepas de
L. interrogans, com 94% e
93% de identidade, respectivamente (Tab. 6). Uma exceção ocorreu quando a
seqüência de LigB do sorovar Manilae foi adicionada ao alinhamento, onde a
identidade com outras cepas de
L. interrogans foi de 65% e 63%, em nível de
nucleotídeos e aminoácidos, respectivamente. Isso é devido à falta de parte do
motivo C-terminal na proteína LigB oriunda da cepa deste sorovar.
Interessantemente, a comparação interespecífica de ligB no nível de nucleotídeos
32
demonstrou que a identidade mínima foi 64% entre ligB de L. interrogans FIOCRUZ
L1-130 e
L. borgpetersenii e no nível de aminoácidos foi de 61%.
TABELA 6 – Conservação de LigB no nível de nucleotídeos e aminoácidos entre vários
sorovares e espécies.
ligB DNA (%) Cop Lai PomC Pom Can Man Gri Nog Heb Har Can2
L. interrogans copenhageni L1-130
100 96 97 94 96 64 93 74 69 65 96
L. interrogans lai 56601
100 100 95 97 65 94 74 69 65 97
L. interrogans pomona Chang
100 95 97 65 94 74 69 65 97
L. interrogans pomona P10637-46
100 97 62 92 73 68 64 97
L. interrogans canicola Kito
100 64 93 74 68 65 99
L. interrogans manilae
100 63 49 66 41 64
L. kirschneri grippotyphosa RM52
100 74 68 65 93
L. noguchii Australis* Cascata
100 69 64 74
L. weilli Hebdomadis* Ecochallenge
100 91 68
L. borgpetersenii Hardjo* USDA
100 65
L. interrogans canicola UCLA
100
LigB proteína (%) Cop Lai PomC Pom Can Man Gri Nog Heb Har Can2
L. interrogans copenhageni L1-130
100 97 96 93 96 63 93 69
73
64 96
L. interrogans lai 56601
100 100 93 96 63 94 69
70
64 96
L. interrogans pomona Chang
100 93 96 63 94 69
70
64 96
L. interrogans pomona P10637-46
100 96 60 91 67
69
62 96
L. interrogans canicola Kito
100 63 94 69
69
64 99
L. interrogans manilae
100 61 44
58
39 63
L. kirschneri grippotyphosa RM52
100 69
70
63 94
L. noguchii Australis* Cascata
100
71
61 69
L. weilli Hebdomadis* Ecochallenge
100
93 69
L. borgpetersenii Hardjo* USDA
100 64
L. interrogans canicola UCLA
100
* Sorogrupo
Ainda, o alinhamento incluindo a seqüência parcial de nucleotídeos e
aminoácidos, oriunda da amplificação de parte da ligB de
L. santarosai Alexi HS616,
reforçou que a conservação de LigB é relativamente alta, quando se pensa na
comparação de genes entre espécies genômicas diferentes. No nível de
nucleotídeos, a identidade se manteve superior a 65% enquanto a identidade da
seqüência de aminoácidos foi de 59% (Não demonstrado).
Com base no alinhamento de LigC, no nível de nucleotídeos e aminoácidos, foi
possível ser verificado seu grau de conservação. Para ambos os níveis, as
identidades foram de pelo menos 98%, exceto quando o gene ligC de
L. kirschneri foi
incorporado na análise (Tab. 7). Isto se deve à presença de um códon de terminação
motivado por uma alteração de fase de leitura nesta espécie, o que interrompe a
33
expressão da segunda metade da proteína LigC. Ainda, apenas a região anterior ao
códon de terminação, presente no gene ligC de
L. interrogans Copenhageni FIOCRUZ
L1-130, foi considerada no alinhamento.
TABELA 7 – Conservação de LigC no nível de nucleotídeos e aminoácidos entre
vários sorovares e espécies.
ligC DNA (%) Cop Gri PomC Pom Can Lai
L. interrogans copenhageni L1-130
100 90 99
99 98
99
L. kirschneri grippotyphosa RM52
100 90
90 90
90
L. interrogans pomona Chang
100
99 98
100
L. interrogans pomona P10637-46
100 99
99
L. interrogans canicola Kito
100
98
L. interrogans lai 56601
100
LigC protein (%) Cop Gri PomC Pom Can Lai
L. interrogans copenhageni L1-130
100 90 100
99 98
100
L. kirschneri grippotyphosa RM52
100 90
90 89
90
L. interrogans pomona Chang
100
99 98
100
L. interrogans pomona P10637-46
100 99
99
L. interrogans canicola Kito
100
98
L. interrogans lai 56601
100
A comparação entre todas as proteínas LigB seqüenciadas neste estudo e
aquelas oriundas do GenBank permitiu identificar qual proteína apresenta a maior
conservação com as outras na seqüência de aminoácidos. Entre todas, LigB de
L.
interrogans
Copenhageni FIOCRUZ L1-130 mostrou a maior identidade cruzada (Fig.
2).
Painel A Painel B
Fiocruz L1-130 Fiocruz L1-130
1 225 449 673 897 1121 1345 1569 1793189
0
1
181
361
541
721
901
1081
1261
1441
1621
1889
1 225 449 673 897 1121 1345 1569 1793189
0
1
181
361
541
721
901
1081
1261
1441
1621
1888
Kito 56601
34
Painel C Painel D
Fiocruz L1-130 Fiocruz L1-130
23 129 235 341 447 553 659 765 877
1
85
169
253
337
421
505
589
673
757
882
304 414 524 634 744 854 964 1074 1184 126
7
311
399
487
575
663
751
839
927
1015
1103
1191
1238
RM52 Cascata
Painel E Painel F
Fiocruz L1-130
671 795 919 1043 1167 1291 1415 1539 169
2
655
755
855
955
1055
1155
1255
1355
1455
1555
1699
gp
Fiocruz L1-130
972 1072 1172 1272 1372 1472 1572 1672 177
0
922
1002
1082
1162
1242
1322
1402
1482
1562
1642
1759
Hardjo Hebdomadis
35
Painel G
HS616
Fiocruz L1-130
1 55 109 163 217 271 325 379 436
1
45
89
133
177
221
265
309
353
397
447
FIGURA 2. Plot demonstrando o nível de conservação ao longo da Proteína
LigB entre os diferentes sorovares e espécies genômicas, contra LigB de
L.
interrogans
Copenhageni FIOCRUZ L1-130. Painel A. LigB de L1130 vs Canicola
Kito. Painel B. LigB de L1130 vs Lai 56601. Painel C. LigB de L1130 vs
L.
kirschneri
RM52. Painel D. LigB de L1130 vs L. noguchii Cascata. Painel E. LigB
de L1130 vs
L. borgpetersenii USDA. Painel F. LigB de L1130 vs L. weill
i
Ecochallenge. Painel G. LigB de L1130 vs L. santarosai HS616. As diagonais
indicam posições que contém aminoácidos mais conservados.
A maior variabilidade interespecífica na proteína LigB foi vista ocupando a
porção final da região não-idêntica e o início da C-terminal. Esta porção contém
inserções e deleções cuja presença varia de acordo com a espécie genômica de
Leptospira spp. Duas regiões foram encontradas com base no alinhamento das
seqüências das proteínas LigB das diferentes espécies, as quais foram
denominadas de região variável 1 e 2 (RV1 e RV2) (Fig. 3).
A
+0.9 83
1
500 1000 15 0 0
Similarit
y
RV
RV
12
+0.9 83
1
500 1000 15 0 0
Similarit
y
RV
RV
12
36
B
Posi ção 2
1360
LigBCan (1349) SWGAIRDSLDQENLQPSPKDRINFIGCGNSPLNFMDGPIVSDPFGDGSDFGS LVDYNN QIYL
G
LigBCan2 (1349) SWGAIRDSLDQDNLQPSPKDRINFIGCGNSPLNFMDGPIVSDPFGDGSDFGSLVDYNNQIYL
G
LigBCop (1349) SWGAIRDSFDQENLQSSPKDRINFIGCGNSPLNFMDGPIMSDPFGDGSDFGFLVDYNNQIYL
G
LigBGri (1346) SWGAIRDSFDQENLQPSPKDRINFIGCGNSPLNFMDGPIVSDPFGDGSDFGS LVDYNN QIYL
G
LigBHar (1352) VWGAISDSSGQEALQPSPKDRANFVGCGGSPVNFADGPVISDPFGDGSSFASLTNYRYQVYL
G
LigBHeb (1337) VWGAISDSSGQENLQSSPKDRANFVGCGGSPVNFADGPVIS DPFGDG SSFGSLTNYNYQVYL
G
LigBLai (1349) SWGAIRDSFDQENLQSSPKDRINFIGCGNSPLNFMDGPIMSDPFGDGSDFGFLVDYNNQIYL
G
LigBMan (1192) --------------------------------------------------------------
-
LigBNog (1357) SWGAIRGSLDQEN LQSSPKDRSNFIGCGNSPVNFVDGPVVSNPLGDDSDFGALIDYNNQIYL
G
LigBPom (1347) SWGAIRDSFDQENLQPSPKDRINFIGCGNSPLNFMDGPIVSDPFGDGSDFGS LVDYNN QIYL
G
LigBPomC (1349) SWGAIRDSFDQENLQSSPKDRINFIGCGNSPLNFMDGPIVSDPFGDGSDFGFLVDYNNQIYL
G
LigB alexi (248) --------------------------------------------------------------
-
1450
LigBCan (1439) DINATNRAS---SRDGGIPVPNYVTIGHTGCTLNTADITTGCGPDNENGRGVFATGSLNKKS
H
LigBCan2 (1439) DINATNRAS---SRDGGIPVPNYVTIGHTGCTLNTADITTGCGPDNENGRGVFATGSLNKKS
H
LigBCop (1439) DINADNRAS---SRDGGIPVPNYVTIGHTGCTLNSADITTGCGPDNEDGRGVFAIGSLNKKS
H
LigBGri (1436) DKNATNRAS---SRDGGIPVPNYVTIGHTGCTLNSADITTGCGPDNEDGRGVFATGSLDKKS
H
LigBHar (1442) DAVGEQSSN---TALSGISAN-YVTMGHAGCTRNSADIVAG CGPDNE DGRGV FATGLLGGRP
H
LigBHeb (1427) DAVGEQSSN---TALSGISAN-YVTMGHAGCTRNSADIVVG CGPDNE DGRGV FATGSLGGRP
H
LigBLai (1439) DINADNRAS---SRDGGIPVPNYVTIGHTGCTLNSADITTGCGPDNEDGRGVFAIGSLNKKS
H
LigBMan (1192) --------------------------------------------------------------
-
LigBNog (1447) DTMGDKSRNNALSRDGGIPVPNYVTIGHKGCTFNTADITTGCGPDNEDGRGVFATGTLGGIP
H
LigBPom (1437) DINATNRAS---SRDGGIPVPNYVTIGHTGCTLNTADITTGCGPDNENGRGVFATGSLNKKS
H
LigBPomC (1439) DINATNRAS---SRDGGIPVPNYVTIGHTGCTLNSADITTGCGPDNEDGRGVFATGSLDKKS
H
LigB alexi (248) --------------------------------------------------------------
-
1540
LigBCan (1521) NLDFKYIDMGEITGLATAGTSSIAVLDDRIHVGFAKRNQNL NAPDFG KITFN TSEQNRCAAG
N
LigBCan2 (1521) NLDFKYIDMGEITGLATAGTSSIAVLDDRIHVGFAKRNQNL NAPDFG KITFN TSEQNRCAAG
N
LigBCop (1521) NLNFKYIDMGEITGTATAGTSSIAVIDDRIHVGFAKKNKNLNAPDFGKITFNTSDQNRCAAG
N
LigBGri (1518) NLNFKYISMGKITGLATAGTSSIAVLDDRIHVGFAKKNQNLNAPDFGKITFNTSEHNRCAIV
N
LigBHar (1524) DLDFKYIDMGTITGELTAGASSMAVFDNRVYVGFAKKNNRSNAPDFGKITFHTSDSTRCVIG
S
LigBHeb (1509) GLDFKYIDMGTITGALTAGASSIAVFDNRVYVGFAKKNNRSNAPDFGRITFHTSDSTRCVIG
S
LigBLai (1521) NLNFKYIDMGEITGTATAGTSSIAVIDDRIHVGFAKKNKNLNAPDFGKITFNTSDQNRCAAG
N
LigBMan (1192) --------------------------------------------------------------
-
LigBNog (1537) GLDFKYIDMGAVTGNLTAGTSAINVFADRIYIGFAKRNNHSNAPDFNKITFHSSDTNRCQIG
S
LigBPom (1519) NLDFKYIDMGEITGLATAGTSSIAVLDDRIHVGFAKRNQNL NAPDFG KITFN TSEQNRCAAG
N
LigBPomC (1521) NLNFKYISMGKITGLATAGTSSIAVLDDRIHVGFAKKNQNLNAPDFGKITFNTSEHNRCAIV
N
LigB alexi (248) --------------------------------------------------------------
-
1630
LigBCan (1608) ------------------SVDAV---------NYRTYKSDNSSINWG YYVGI DSLFVF KEKL
Y
LigBCan2 (1608) ------------------SVDAV---------NYRTYKSDNSSINWG YYVGI DSLFVF KEKL
Y
LigBCop (1608) -----------------SVEDAD---------NYETYTSDNSSINWG YYVGI DSLFVF KEKL
Y
LigBGri (1605) ------------------SVDAV---------NYKTHKSDNSSINWG YYVGI DSLFVF KEKL
Y
LigBHar (1613) DEEYKGRVGSTARLIRTLAAKNN---------GNKPNQLGDSTINWGYYVGIDSLFVFKGTL
Y
LigBHeb (1599) DEYKGRVGSTARFIRTL-AAGNN---------GNKLDQLGGSTANWGYYVGIDSLFVFKEKL
Y
LigBLai (1609) ------------------VEDAD---------NYETYTSDNSSINWG YYVGI DSLFVF KEKL
Y
LigBMan (1192) --------------------------------------------------------------
-
LigBNog (1627) IITVERTKKVLRRLGSLDLAPGNRPFIEKKVKNKKLNNLNNSSINWAYFVES ILCLCLTVNF
M
LigBPom (1607) ----------------------------VDAVNYRTYKSDNSSINWG YYVGI DSLFVF KEKL
Y
LigBPomC (1609) ----------------------------VDVVNYRSYKSDNSSINWGYYVGIDSLFVFKEKL
RV
RV2
Posição 1
698 787
LigBCan (693) KATGT DH VQ V ALAT NPRK MVN VTGS---V TVAT NT K TIDSIS-G SVLN P L T I TINSITH L
RV
RV1
QF YT S D T WSSS A N T G NI A S VT A L SIE TP G T
LigBCan2 (693) KATGT DH VQ V ALAT NPRK MVN VTGS---V TVAT NT K TIDSIS-G SVLN P L T I TINSITH L QF YT S D T WSSS A N T G NI A S VT A L SIE TP G T
LigBCop (693) KATGT DH VQ V ALAT NPGK MVN VTGS---V TVAT NT K TIDSIS-G SVLN P L T I TINSITH L QF YT S D T WSSS A N T G NI A S VT A L SIE TP G T
LigBGri (693) KATGT DH VQ V ALAT NPRK MVN VTGS---V TVAT NT K TIDSIS-G SVLN P L T I TINSITH L QF YT S D T WSSS A N T G NI A S VT A L SIE TP G T
LigBHar (693) KATAT DN TA I SMVS NSNK LVG DILSGGLV AVAT SA T RYENLS-G SAVN P T T V VFPSVAK L QF YT S D T WSSS A N T G NI A S VT A L SIE TP G T
LigBHeb (677) KATAT DN T SAV DSNK LVS DILSGGLV AIAS SA T RYENLS-G STLN P T IPSSVAK L QF YT S GDIT SWSSS A N T G NI A S VT ATL SIEVTP G T
LigBLai (693) KATGT DH VQ V ALAT NPGK MVN VTGS---V TVAT NT K TIDSIS-G SVLN P L T I TINSITH L QF YT S D T WSSS A N T G NI A S VT A L SIE TP G T
LigBMan (693) KATGT DH VQ V ALAT NPRK MVN VTGS---V TVAT ST K TIDSIS-G SVLN S L T I TINSITH L QF YT S D T WSSS A N T G NI A S VT A L SIE TP G T
LigBNog (696) QSDGI XH KT V DQVV NSPI LAD TFGSAGLI TIDS ST T TLSDTVSG FVLN P F I V VYTTINK Y QF YT S D T WSSS A N T G NI A S VT A L SIE TP G T
LigBPom (693) KATGT DH VQ V ALAT NSRK MVN VTGS---V TVAT NT K TIDSIS-G SVLN P L T I TINSITH L QF YT S D T WSSS A N T G NI A S VT A L SIE TP G T
LigBPomC (693) KATGT DH VQ V ALAT NPGK MVN VTGS---V TVAT NT K TIDSIS-G SVLN P L T I TINSITH L QF YT S D T WSSS A N T G NI A S VT A L SIE TP G T
LigB alexi (1) KATAV DN TM I SMVS DSNK SVN DLVYGGLA AIAT KT T KYENLS-S STLH P T T V IFSSVAK L
788 877
QF YT S D T WSSS A N T G NI A S VT A L SIE TP G T
LigBCan (779) K K T IFS K QN QL I P KIE TS KK-GIATA KL SSN K V KFI S IPI TDLK K TI SSSSIAKG QF A G D ST LT VTW SSD S IEN G S G I A Y QS P TV L SI SP
LigBCan2 (779) K K T IFS K QN QL I P KIE TS KK-GIATA KL SSN K V KFI S IPI TDLK K TI SSSSIAKG QF A G D ST LT VTW SSD S IEN G S G I A Y QS P TV L SI SP
LigBCop (779) K K T IFS K QN QL I P KIE TS KK-GIATA KL SSN K V KFI S IPI TDLK K TI SSSSIAKG QF A G D ST LT VTW SSD S IEN G S G I A Y QS P TV L SI SP
LigBGri (779) K K T IFS K QN QL I P KIK NS ----IATA AL SSN T I KFV S IPI TDLK K TI SSSSIAKG QF A G D ST LT VTW SSD S IEN G S G I A Y QS P TV L SI SP
LigBHar (782) E T T IYS K QD QV I S RVA TA KK-GLALA TL SSN R T NSI S ISM TEAK V TV EFTSKALG QF A G D ST LT VTW SSD S IEN G S G I A Y QS P TV L SI SP
LigBHeb (766) E T T IYS K QD Q T S RVA T KK-CLALA TF STN K T NSI S VS TEAK TV ESTSKALG QF A G D ST LT VVTW SSD S IEN AG S G I A Y QS P MTV LASI SP
LigBLai (779) K K T IFS K QN QL I P KIE TS KK-GIATA KL SSN K V KFI S IPI TDLK K TI SSSSIAKG QF A G D ST LT VTW SSD S IEN G S G I A Y QS P TV L SI SP
LigBMan (779) K K T IFT N QN QL I P KIE TS KK-GIATA AL SSN T I KFV S IPI TGLK K TI SSSSIAKG QF A G D ST LT VTW SSD S IEN G S G I A Y QS P TV L SI SP
LigBNog (786) K S I TYS R KD ED F P SVV TP KKGLALAS DL EPD T DSI L TPV VETG V DI SSISKAKG QF A G D ST LT VTW SSD S IEN G S G I AFY QS P TV L SI SP
LigBPom (779) K K T IFS K QN QL I P KIE TS KK-GIATA KL SSN K V KFI S IPI TDLK K TI SQ-VNSQR QF A G D ST LT VTW SSD S IEN G S G I A Y QS P TV L SI SP
LigBPomC (779) K K T IFS K QN QL I P KIE TS KK-GIATA KL SSN K V KFV S IPI TDLK K TI SSSSIAKG QF A G D ST LT VTW SSD S IEN G S G I A Y QS P TV L SI SP
LigB alexi (90) E S T IYS K QD QV T S RVA TD KK-GLALA TL SSN T T KSV A IEM KEAK V TV DSTSKALG
QF A G D ST LT VTW SSD S IEN G S G I A Y QS P TV L SI SP
878 946
LigBCan (868) LTQ FNAIGTFI S QEI N V Y KSDVAPIN AANEK TALSI SSDIYAI NSIS KINQ DG E T L TW SS N GLA G Y SN F
LigBCan2 (868) LTQ FKAIGTFI S QEI N V Y KSDVAPIN AANEK TALSI SSDIYAI NSIS KINQ DG E T L TW SS N GLA G Y SN F
LigBCop (868) LTQ FKAIGTFI S QEI N V Y KSDVAPIN AANAK TALSI SSNISAI NSIS KINQ DG E T L TW SS N GLA G Y SN F
LigBGri (865) LTQ FKAIGTFI S QEI N V Y KSDIVPIN SAGKK TALSI SSNISAI NSIS KINQ DG E T L TW SS N GLA G Y SN F
LigBHar (871) LTQ FKAKGIFT S RDI N V F EPLVADAI ADENR VSHSI STEIHAY DSVE SVNQ DG E T L TW SS N GLA G Y SN F
LigBHeb (855) LTQ FKAKGTF S RDI D V KPLVAYTI AGENR VAHSV ATEIHA DSVE SVNQ TDG E T L TWSSS N GLA G YY SN F
LigBLai (868) LTQ FKAIGTFI S QEI N V Y KSDVAPIN AANAK TALSI SSNISAI NSIS KINQ DG E T L TW SS N GLA G Y SN F
LigBMan (868) LTQ FKAIGTFI S QEI N V Y KSDVAPIN SAGKK TALSI SSNISAI NSIS KINQ DG E T L TW SS N GLA G Y SN F
LigBNog (876) STH LKAIGKFR T EDL E V H DPKVVSIS ADDNR NALSV SSKIFVD YAIH SIDQ DG E T L TW SS N GLA G Y SN F
LigBPom (867) IDQ FKRS-ELI S QEI N V Y KSDVAPIN AANEK TALSI SSDIYAI NSIS KINQ DG E T L TW SS N GLA G Y SN F
LigBPomC (868) LTQ FKAIGTFI S QEI N V Y KSDVAPIN AANAK TALSI SSNISAI NSIS KINQ DG E T L TW SS N GLA G Y SN F
LigB alexi (179) LTQ FKAKGIFT S RDI N A F EPLVAYVS VYNER ISHIV STNVHAY DSVT SVNQ DG E T L TW SS N GLA G Y SN F
Y
LigB alexi (248) --------------------------------------------------------------
-
37
FIGURA 3. Localização das regiões mais variáveis dentro da seqüência de
aminoácidos de LigB. Painel A. Histograma da variabilidade interespecífica de
ligB e posicionamento das duas regiões com maior polimorfismo. Painel B.
A
linhamento entre as regiões mais variáveis de LigB nas diferentes espécies. As
cepas e os códigos referentes as amostras usadas podem ser melho
r
visualizadas na Tab. 1.
4.3. Desenvolvimento de um método de detecção dos genes lig por PCR
Um método de detecção dos genes lig por PCR foi desenvolvido de forma a
permitir a rápida caracterização dos sorovares de Leptospira spp. quanto à presença
dos genes ligA, ligB e ligC. Nesta abordagem, um fragmento de DNA foi amplificado,
a partir de cada gene, como um marcador, usando um conjunto específico de
primers.
Mediante o uso de um controle interno da amplificação, um fragmento de 770pb
do gene lipL32, pode ser afirmado que o DNA genômico derivava de amostras de
leptospiras patogênicas. Pela amplificação e seqüenciamento do 16S rDNA, a
identidade das amostras usadas no método de detecção por PCR e a presença de
DNA genômico, no caso das amostras saprófitas, puderam ser certificadas.
Primeiramente foi validado o teste utilizando as cepas cujos genes lig haviam sido
amplificados e seqüenciados. Posteriormente, este teste foi utilizado para outras
amostras.
Os produtos de PCR amplificados correspondem a um fragmento de 211pb para
ligA (Fig. 4 painel A), 536pb para ligB dos sorovares pertencentes às espécies
L.
interrogans
e L. kirschneri (Fig. 4 painel B), 1076pb para ligB das demais espécies (Fig.
4 painel D) e 248pb para ligC (Fig. 4 painel C). O produto de 1076pb, derivado de
ligB, foi amplificado por um par de primers alternativo denominado PSB2 (Tab. 2).
38
A B
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
1 2 3 4 5 6
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
1 2 3 4 5 6
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
ligA (211 bp)
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
1 2 3 4 5 6
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
1 2 3 4 5 6
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
ligA (211 bp)
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
ligB (536 bp)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
ligB (536 bp)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
C
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
ligC (248 bp)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
lipL32 (760 bp)
16S rDNA (330 bp)
ligC (248 bp)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
D
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ligB (1076 pb)
lipL32 (770 pb)
16S rDNA (330 pb)
ligC (248 pb)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ligB (1076 pb)
lipL32 (770 pb)
16S rDNA (330 pb)
ligC (248 pb)
FIGURA 4. Detecção dos genes lig em cepas patogênicas, por PCR. Painel A.
Detecção de ligA. Painel B. Detecção de ligB. Painel C. Detecção de ligC. 1. L.
biflexa
Patoc1. 2. L. interrogans FIOCRUZ L1-130. 3. L. kirschneri RM52. 4. L. interrogan
s
Canicola Mex1. 5. L. interrogans Canicola Kito. 6. L. interrogans Pomona P10637-46.
Painel D. Detecção dos genes lig nas cepas patogênicas de L. noguchii Bataviae e
L.
weilli
Hebdomadis. 1. L. biflexa Patoc1. 2. L. noguchii Hook ligA. 3. L. noguchii Hook ligB. 4.
L. noguchii Hook ligC. 5. L. noguchii Cascata ligA. 6. L. noguchii Cascata ligB. 7. L. noguchi
i
Cascata ligC. 8. L. weilli Ecochallenge ligA. 9. L. weilli Ecochallenge ligB. 10. L. weill
i
Ecochallenge ligC. As amostras referentes ao controle sem DNA não foram
demonstradas.
Para confirmar a amplificação dos genes ligA, ligB e ligC, alguns dos produtos
amplificados foram seqüenciados e as seqüências geradas foram submetidas a
39
alinhamento por BLAST (NCBI, USA) e AlignX (Invitrogen). Dessa forma, foi
descartada a possibilidade de amplificação inespecífica.
Nenhum resultado foi obtido usando o BLAST para a seqüência dos produtos
amplificados a partir de
L. weilli Ecochallenge. Isto se deve ao fato de que esta
espécie apresenta bastante divergência na seqüência de DNA em relação aos
genes lig depositados no GenBank, os quais pertencem às espécies
L. interrogans e L.
kirschneri
.
Segundo análise por bioinformática dos genes lig de
L. interrogans e L. kirschneri
disponíveis no GenBank, o par de primers escolhido para ligA amplifica um produto
que corresponde ao início da região não-idêntica. Já aqueles selecionados para ligB
amplifica um produto que se estende desde o final da região não-idêntica até o início
da C-terminal. Os fragmentos gerados a partir da ligB das cepas virulentas de
L.
noguchii
demonstram ser maiores que aquele de L. weilli. Isto é um reflexo inicial da
variabilidade da seqüência justamente no fragmento amplificado (Fig. 4 painel D).
Para o gene ligC, a amplificação gera um produto que, com base nas seqüências
das regiões codificadoras de ligC de
L. interrogans FIOCRUZ L1-130 e L. kirschneri
RM52, cobre a região que contém o códon de terminação. Assim, mediante
amplificação e seqüenciamento deste fragmento, qualquer cepa poderia ser
facilmente caracterizada com relação ao possível status de ligC como um
pseudogene. Os fragmentos internos amplificados de cada gene podem ser melhor
observados na Fig. 1.
Uma vez confirmada a aplicabilidade dos conjuntos de primers escolhidos para
as diferentes espécies genômicas, os resultados foram extrapolados para um grande
painel de amostras compreendendo 9 espécies genômicas de
Leptospira. Entre estas,
6 são consideradas como o grupo central de espécies patogênicas, 1 é considerada
como intermediária (
L. fainei) e 2 outras pertencem ao grupo das saprófitas (L. biflexa e
L.
meyeri).
Conforme esperado, pelo método de detecção por PCR, a presença dos genes
ligA, ligB e ligC pode ser confirmada nos sorovares das diferentes espécies
patogênicas de
Leptospira. Espécies saprófitas não apresentam genes lig (Tab. 8).
40
Tabela 8 - Caracterização da presença ou ausência dos genes lig nas diferentes espécies
genômicas.
Species Serovar Strain 16S ligA ligB ligC
L. interrogans
Copenhageni L1130 + + + +
L. interrogans
Lai Lai + + + +
L. interrogans
Pomona Pomona + + + +
L. interrogans
Canicola Hond Utrech IV + + + +
L. interrogans
Hardjo Hardjoprajitno + + + +
L. kirschneri
Cynopteri 3522C + + + +
L.borgpetersenii
Mini Sari + - + -
L.borgpetersenii
Tarassovi Perepelicin + - + -
L.borgpetersenii
Javanica Veldrat Bataviae 46 + - + -
L. noguchii
Panama CZ214K + - + +
L. noguchii
Orleans LSU2580 + - + -
L. weilli
Coxi Cox + - + +
L. weilli
Ughia LT8968 + - + +
L. santarosaii
Alexi HS616 + - + -
L. santarosaii
Trinidad TRVL34056 + - + -
L. fainei
Hurstbridge But6 + - + -
L. meyeri
Semaranga Veldrat 173 + - - -
L. biflexa
Semaranga Patoc1 + - - -
O gene ligB aparece como o único presente entre todas as cepas de
Leptospira. O
gene ligA aparece com exclusividade nas cepas de
L. interrogans e L. kirschneri (Tab. 8).
Interessantemente, o gene ligC aparece também em número restrito de cepas.
Porém, a presença deste gene parece ser sorovar-dependente, uma vez que dentre
as amostras patogênicas que tiveram seus genes completamente seqüenciados,
apenas aquelas de
L. noguchii não apresentaram este gene (Fig. 4 Painel C e Tab. 4).
Entretanto, outras cepas de
L. noguchii, pertencente ao painel de amostras da OMS,
demonstraram amplificação positiva para ligC e também o seqüenciamento do
fragmento amplificado demonstrou alta identidade com outros genes de ligC
depositados no GenBank (Tab. 5). Na cepa patogênica de
L. weilli, o gene ligC pode
ser amplificado por PCR (Fig. 4 painel D).
Como forma de validar o método de detecção por PCR, os produtos amplificados
foram marcados e usados como sonda na hibridização por Southern blot. As sondas
usadas na detecção dos genes ligA e ligB são oriundas da mistura de todos os
produtos gerados na detecção por PCR de cada respectivo gene, os quais foram
amplificados das cepas mencionadas na Tab. 8 e que aparecem na Fig. 4. As
41
hibridizações por Southern blot dos genes ligA e ligB foram realizadas apenas para
as cepas virulentas das espécies
L. interrogans e L. kirschneri e nos permitem confirmar
a presença ou ausência destes genes nestas espécies bem como validar o método
de caracterização por PCR desenvolvido. Conforme esperado, todos os sorovares
das espécies
L. interrogans e L. kirschneri demonstraram a presença dos genes ligA e
ligB (Fig. 5). Em
L. interrogans Copenhageni FIOCRUZ L1-130, ligA aparece com um
tamanho de 4.751pb. Já nos sorovares Canicola e Pomona, as bandas aparecem
um pouco mais altas, correspondendo a aproximadamente 4.850pb. Por outro lado,
L. kirschneri Grippotyphosa RM52 apresentou a banda esperada de 2.761pb. os
fragmentos esperados foram estipulados por simulação da análise de restrição dos
genes lig “in silico”, com a enzima BamHI. Com relação à presença do gene ligB,
todos os sorovares das espécies
L. interrogans e L. kirschneri apresentaram
praticamente o mesmo tamanho, o que já era esperado para este gene (Fig. 5).
Tanto ligA quanto ligB apresentam-se como genes de cópia única nos sorovares de
L. interrogans e L. kirschneri.
Painel A Painel B
4072
3054
2036
5090
M B 1 2 3 4 5 6
4072
3054
2036
5090
M 1 2 3 4 5 6
4072
3054
2036
5090
M B 1 2 3 4 5 6
4072
3054
2036
5090
M 1 2 3 4 5 6
4072
3054
2036
5090
M B 1 2 3 4 5 6
4072
3054
2036
5090
M 1 2 3 4 5 6
4072
3054
2036
5090
M B 1 2 3 4 5 6
4072
3054
2036
5090
M 1 2 3 4 5 6
7 87 87 87 8
3054
4072
5090
6108
8144
3054
4072
5090
6108
8144
3054
4072
5090
6108
8144
M 1 2 3 4 5 6 7 8
7 87 87 87 8
3054
4072
5090
6108
8144
3054
4072
5090
6108
8144
3054
4072
5090
6108
8144
M 1 2 3 4 5 6 7 8
FIGURA 5. Análise por Southern blot demonstrando a presença dos genes lig nas
cepas de
L. interrogans e L. kirschneri virulentas. Painel A. Detecção de ligA. Painel
B. Detecção de ligB. M. 1kb DNA Ladder (invitrogen). 1.
L. biflexa Patoc1. 2. L.
interrogans
FIOCRUZ L1-130. 3. L. kirschneri RM52. 4. L. interrogans Canicola Kito. 5. L.
interrogans
Canicola Mex1. 6. L. interrogans Pomona P10637-46 7.
42
4.4. Análise filogenética
A construção de árvores filogenéticas baseadas nas seqüências geradas (tanto
oriundas do seqüenciamento dos genes inteiros quanto do seqüenciamento do
produto da caracterização por PCR) e naquelas depositadas no GenBank revelou
resultados interessantes com relação aos aspectos evolutivos do gênero
Leptospira. A
montagem de uma árvore filogenética baseada em ligA e ligC seria pouco
informativa em função da ausência destes genes em algumas cepas. Assim, árvores
filogenéticas foram construídas com base apenas nas seqüências do gene ligB e na
proteína por ele codificada (Fig. 6), uma vez que este gene foi encontrado em todas
as cepas de
Leptospira spp.
43
i hardjo Hardjoprajitno
i pomona Pomona
i canicola Kito(ws)
i kennewicki LT1026
i autumnalis AkiyamiA
i australis Ballico
i bratislava Jez Bratislava
i muenchen Muenchen C90
i canicola Hond Utrech IV
i bataviae Van Tinen
i canicola Mex1(ws)
i hebdomadis Hebdomadis
i copenhageni L1130(gb)
i copenhageni M20
i icterohaemorragiae RGA
i pomona Kennewicki(gb)
i wolffi 3705
i lai 56601(gb)
i lai Lai
i pomona P1063746(ws)
i manilae UPMMCNIID(gb)
i manilae LT398
k grippotyphosa RM52(gb)
k ramisi Musa
k djatzi HS26
k erinaceiauriti Erinaceus Auritus 670
k mozdok 5621
k kambale Kambale
n Bataviae(sg) Cascata(ws)
n orleans LSU2580
s alexi HS616
b Hardjo(sg) USDA(ws)
b poi Poi
b ceylonica Piyasena
b javanica Veldrat batavia 46
w Hebdomadis(sg) Ecochallenge(ws)
w celledoni Celledoni
w vughia LT89-68
0.1
44
FIGURA 6.
Á
rvore filogenética montada com base na seqüência de nucleotídeos
de ligB. As amostras usadas estão identificadas pela primeira letra do nome da
espécie a que pertencem (minúsculo,) seguida pelo nome do sorovar e o nome
da cepa. Quando a informação sobre o nome do sorovar não estava disponível,
então o nome do sorogrupo foi utilizado (sg). Genes oriundos do GenBank, bem
como as proteínas por eles codificadas, estão representados por (gb) enquanto
as regiões codificadoras completamente seqüenciadas neste estudo estão
representadas por (ws).
Pela análise da árvore filogenética construída, pode-se observar uma intensa
aproximação entre as cepas de
L. interrogans, as quais formam um grupo monofilético
separado das demais (Fig. 6). Porém, pode ser notado que mesmo dentro do grupo
das
L. interrogans, as cepas do sorovar Manilae formam um subgrupo, provavelmente
em função de diferenças pontuais dentro do gene ligB neste sorovar.
Dentro do ramo formado por
L. kirschneri, todas também aparecem como um
grupo monofilético. Porém, a cepa RM52 aparece mais próxima do grupo de
L.
interrogans
. As demais espécies também aparecem como grupos monofiléticos, tanto
em nível de nucleotídeos quanto de aminoácidos (Fig. 6).
45
5. DISCUSSÃO
As proteínas Lig, por se tratarem de adesinas de
Leptospira spp., têm um
importante papel na patogênese deste gênero de bactérias, pois acredita-se que
mediem a adesão às células do tecido hospedeiro (BAROCCHI et al., 2002;
GUERREIRO et al., 2001; MATSUNAGA et al., 2003). Assim, estas constituem-se
em importantes alvos para o sistema imune durante o período em que estão
posicionadas na superfície e expostas para o exterior da bactéria. Assim como as
adesinas de outras bactérias Gram-negativas, como
E. coli e Yersinia spp., as
prováveis adesinas, Lig, de
Leptospira spp. apresentam domínios Big2 distribuídos
uniformemente ao longo da seqüência da proteína. Estes domínios parecem ter
papel fundamental na adesão bacteriana e são também encontrados na espiroqueta
Treponema pallidum (FRASER et al., 1998).
Neste estudo, os 3 genes lig, (ligA, ligB e ligC), oriundos de 6 diferentes
sorovares e 4 espécies genômicas foram completamente seqüenciados. O
levantamento da seqüência completa dos genes lig em cepas patogênicas de
Leptospira spp. e sua análise comparativa com outros genes disponíveis no banco de
dados permite uma investigação sobre a conservação que há entre estes genes, nas
diversas espécies em que estão presentes.
A proteína LigC apresentou numericamente o maior grau de conservação entre
as espécies
L. interrogans e L. kirschneri, espécies em que está presente. Porém, em
Leptospira interrogans Lai 56601 e L. kirschneri Grippotyphosa RM52, esta proteína
parece ser expressa na forma truncada, em função de um códon de terminação no
meio da região codificadora. Diferentemente, este gene aparece com o status de um
gene íntegro e expresso na sua totalidade em todas as outras cepas onde foi
completamente seqüenciado. Ainda, o gene ligC parece estar presente entre as
cepas de outras espécies, onde foi detectado por PCR, as quais compreendem
L.
noguchii
e L. weilli. Porém, dentro da espécie L. noguchii, nem todos os sorovares
demonstraram a presença deste gene. O sorovar Manilae de
L. interrogans, cuja ligA e
ligB estão depositadas no GenBank, parece não conter ligC. Assim, pode ser
concluído que tanto o status de pseudogene quanto a sua presença são sorovar-
dependentes.
46
Por sua vez, a proteína LigA apresentou alto nível de conservação. Porém, no
caso desta proteína, a situação parece ser ainda mais intrigante uma vez que o gene
ligA parece estar presente apenas em sorovares de
L. interrogans e L. kirschneri, com
exceção da cepa 56601 do sorovar Lai de
L. interrogans. Mesmo entre as cepas de L.
interrogans
, o gene ligA parece não se fazer presente em todos os sorovares,
conforme já mencionado para o sorovar Lai.
Sendo assim, os esforços maiores devem ser racionalmente concentrados sobre
a proteína LigB, a qual se faz presente em todas as espécies estudadas até o
momento e apresenta um bom nível de conservação, com identidade em nível de
aminoácidos nunca inferior a 63%, comparando-se LigB de
L. interrogans
Copenhageni FIOCRUZ L1-130 com LigB de espécies como
L. borgpetersenii, L. weilli e
L. noguchii.
Dentre todas as LigB conhecidas e seqüenciadas até o momento, aquela oriunda
de
L. interrogans Copenhageni FIOCRUZ L1-130 aparece como a que conserva a
maior identidade entre todas as espécies. Diversas análises comparativas foram
testadas, porém LigB de FIOCRUZ L1-130 foi a que manteve o mais alto nível de
conservação entre espécies diferentes. Entre as cepas de
L. interrogans, todas as LigB
mostraram uma elevada identidade, e mesmo entre espécies diferentes, porções
foram vistas contendo seqüências de aminoácidos mais conservadas, as quais
podem vir a conter importantes epitopos vacinais.
Um ponto interessante diz respeito à porção que carrega a maior variabilidade
nas diferentes LigB. Foi evidenciado que a porção da proteína que contém a maior
diversidade de seqüência se estende desde os últimos 420 aminoácidos da região
que contém os domínios Big2 até aproximadamente a metade da região C-terminal.
A detecção de cada um destes genes por PCR se constitui numa ferramenta
importante a qual possibilita a caracterização de isolados de
Leptospira spp. A
informação referente à presença ou ausência destes genes pode ser usada como
justificativa racional quando do desenvolvimento de uma vacina de amplo espectro.
Pelo método desenvolvido neste estudo, apenas o gene ligB pode ser detectado em
todas as cepas. Tal informação não inviabiliza a utilização das outras proteínas Lig
na construção de uma vacina, uma vez que ligA e ligC foram detectados em todas
as cepas de
L. interrogans e L. kirschneri, a exceção de L. interrogans Lai 56601. Estas
espécies genômicas representam aquelas mais prevalentemente distribuídas pelo
mundo e a maioria dos humanos e animais acometidos por leptospirose são na sua
47
maioria contaminados com sorovares destas espécies (FAINE et al., 1999; KO et al.,
1999; LEVETT, 2001). Porém, quando se pensar em uma vacina única e de amplo
espectro, deve-se levar em consideração a representatividade da proteína LigB.
Mecanismos evolutivos que conduzem à produção de polimorfismos de
nucleotídeo único e possivelmente à transferência horizontal de DNA foram vistos
ocorrendo dentro da seqüência codificadora de ligB, nos mesmos moldes do que
ocorre com outras importantes lipoproteínas de
Leptospira spp. (HAAKE et al., 2004) e
ainda em proteínas de adesão em outras bactérias Gram negativas como
Escherichia
coli
e Gram positivas como Streptococcus pyogenes (TOWERS et al., 2003; ZHANG
et al., 2002; TARR et al., 2002).
Interessantemente, as deleções, inserções e substituições evidenciadas ocupam
uma região com uma notável hidrofilicidade, a qual é predita de formar a alça mais
exposta para o exterior da proteína. Nesse caso, a pressão positiva que conduz à
intensa variabilidade neste ponto pode indicar uma maior adaptação à hospedeiros
específicos ou ainda sugerir que as alterações de aminoácidos são melhor toleradas
em alças na superfície. Assim, estas alterações teriam papel fundamental no
adequado dobramento da proteína (TOWERS et al., 2003).
A análise filogenética com base na seqüência de LigB, tanto em nível de
nucleotídeos quanto de aminoácidos, permitiu traçar a relação evolutiva e o grau de
parentesco entre as cepas de
Leptospira spp. Em função das diferenças
interespecíficas de ligB, este gene, por meio da porção utilizada para a montagem
da árvore filogenética, pode servir como um alvo na diferenciação de espécies, o
que até então é alcançado com precisão apenas por ensaios de hibridização DNA-
DNA (LEETOCART et al., 1999) ou pelo seqüenciamento do rDNA 16S (Woese,
2000). A análise da seqüência dos gene ompL1, lipL32 e lipL41 (HAAKE et al., 2004)
não permitiu essa diferenciação entre espécies, como foi visto para a região
seqüenciada do gene ligB.
Diferentemente da situação encontrada para lipL32, cuja diferenciação entre
L.
borgpetersenii
e L. weilli se mostrou ineficiente (HAAKE et al., 2004), o método baseado
em ligB apresentou um grande poder de diferenciação. Um fragmento de
aproximadamente 450 pb foi seqüenciado a partir dos produtos de PCR gerados
durante a detecção de ligB por PCR e, aparentemente, tal região apresenta
polimorfismo suficiente para permitir a correta classificação taxonômica do gênero
48
Leptospira
no nível de espécie. A seqüência obtida apresentou-se bastante robusta,
tanto com relação à facilidade de sua amplificação quanto ao seu seqüenciamento.
A identidade de seqüência entre
L. interrogans e L. kirschneri é bastante alta e
nenhum ponto de intensa variabilidade foi evidenciado. Em
L. interrogans, um
agrupamento que se destacou foi formado por duas cepas do sorovar Manilae,
sendo uma isolada de rato e outra de humanos. Outro agrupamento de
L. interrogans,
porém menos destacado, foi formado pelos sorovares Icterohaemorragiae,
Copenhageni e Lai. Estes formaram também um ramo separado, porém
demonstraram uma distância menor em relação aos outros sorovares do que aquela
vista para Manilae. Alguns sorovares de
L. kirschneri, encontram-se próximos dos de
L. interrogans, como é o caso do Grippotyphosa RM52, o que pode ser indicativo de
um ancestral evolutivo comum.
A diferenciação de espécies, baseada em ligB, aparece como um método que
pode ser empregado para as cepas de leptospiras patogênicas. Porém,
evidentemente apresenta restrições quanto à sua aplicação para cepas de espécies
saprófitas.
A grande maioria das amostras empregadas na montagem da árvore filogenética
deste estudo já havia sido anteriormente testada quanto ao potencial de lipL32 como
um loci diferenciador de espécies, usando o gene 16S como um padrão (HAAKE et
al., 2004). Interessantemente, a árvore montada com base em ligB obteve resultados
similares àquela montada anteriormente para o gene do rDNA 16S, sobre as
mesmas amostras. O seqüenciamento do rDNA 16S é uma abordagem padrão para
a análise filogenética (WOESE, 2000) e até o momento nenhum gene de
Leptospira
spp. havia sido capaz de substituir a altura o poder discriminatório do 16S.
Mediante as análises comparativas deste estudo foi possível demonstrar ainda a
possibilidade de se basear o desenvolvimento de uma vacina contra leptosirose nas
proteínas Lig, as quais aparecem como potenciais antígenos protetores em função
de sua exposição na superfície, regulação no hospedeiro, estrutura e participação na
patogênese molecular de
Leptospira spp.
Em função dos achados deste estudo, LigB surge como um candidato em
potencial a ser explorado na produção de uma vacina por apresentar-se amplamente
distribuída e ser relativamente conservada entre as diferentes espécies e sorovares
de
Leptospira spp.
49
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BALLARD, S.A., SEGERS, WILLIAMSON, M., ADLER, B., VINH, T., AND FAINE, S.
(1986) Interactions of virulent and avirulent leptospires with primary culture of renal
epithelial cells. Journal Medical Microbiology 21: 69-67.
BARNETT, J.K., BARNETT, D., BOLIN, C.A., SUMMERS, T.A., WAGAR, E.A.,
CHEVILLE, N.F., HARTSKEERL, R.A., AND HAAKE, D.A. (1999). Expression and
distribution of leptospiral outer membrane components during renal infection of
hamsters. Infection and Immunity. 67: 853-861.
BAROCCHI, M.A., KO, A.I., REIS, M.G., MCDONALD, K.L., AND RILEY, L.W. (2002)
Rapid translocation of polarized MDCK cell monolayers by Leptospira
interrogans, an
invasive but nonintracellular pathogen. Infection and Immunity 70: 6926-6932.
BREENER, D.J., KAUFMANN, A.F., SULZER, K.R., STEIGERWALT, A.G.,
ROGERS, F.C., WEYANT, R.S. (1999) Further determination of DNA relatedness
between serogroups and serovars in the family Leptospiraceae with a proposal for
Leptospira alexanderi sp. nov, and four new
Leptospira genomospecies. International
Journal of Systematics and Bacteriology. 49: 839-858.
CULLEN, P.A., CORDWELL, S.J., BULACH, D.M., HAAKE, D.A., ADLER, B. (2002)
Global analysis of outer membrane proteins from Leptospira
interrogans serovar Lai.
Infection and Immunity. 70: 2311-2370.
CULLEN, P.A., HAAKE, D.A., AND ADLER, B. (2004). Outer membrane proteins of
pathogenic spirochetes. FEMS Microbiology Reviews 28(3): 291-318.
CULLEN, P.A., XU, X., MATSUNAGA, J., SANCHEZ, Y., KO, A.I., HAAKE, D.A.,
ADLER, B. (2005). Surfaceome of Leptospira spp. Infection and Immunity. 73: 4853-
4863.
FAINE, S., ADLER, B., BOLIN, C., PEROLAT, P. (1999) Leptospira and
Leptospirosis. Melbourne, Australia. MediSci.
FRANKEL, G., CANDY, D.C.A, FABIANI, E., ADU-BOBIE, J., GIL, S., NOVAKOVA,
M., PHILLIPS, A.D., DOUGAN, G. (1995) Molecular characterization of a carboxy-
terminal eukaryotic-cell-binding domain of intimin from enteropathogenic
Escherichia
coli
. Infection and Immunity 63: 4323-4328.
FRASER, C.M., NORRIS, S.J., WEINSTOCK, G.M., et al. (1998) Complete genome
sequence of Treponema pallidum, the syphilis spirochete. Science. 281. 375-388.
GAMBERINI, M., GÓMEZ, R.M., ATZIGEN, M.V., MARTINS, E.A.L.,
VASCONCELLOS, S.A., ROMERO, E.C., LEITE, L.C.C., HO, P.L., NASCIMENTO,
A.L.T.O. (2005) Whole-genome analysis of Leptospira
interrogans to identify potential
vaccine candidates against leptospirosis. FEMS Microbiology letters 244(2):305-313.
50
GUERREIRO, H., CRODA, J., FLANNERY, B., MAZEL, M., MATSUNAGA, J., REIS,
M.G., LEVETT, P.N., KO. A.I., AND HAAKE, D.A. (2001). Leptospiral proteins
recognized during the humoral immune response to leptospirosis in humans.
Infection and Imunnity. 69: 4958-4968.
GREENBERG, E.P., AND PAROLA, C. (1977). Motility of flagellated bacteria in
viscous environments. Journal of Bacteriology 132: 356-358.
HAAKE, D.A. (2000). Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology 146:
1491-1504.
HAAKE, D.A., CHAMPION, C.I., MARTINICH, C., SHANG, E.S., BLANCO, D.R.,
MILLER, J.N., AND LOVETT, M.A. (1993) Molecular cloning and sequence analysis
of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of
pathogenic Leptospira spp. Journal of Bacteriology. 175: 4225-4234.
HAAKE, D.A, SUCHARD, M.A., KELLEY, M.M., DUNDOO, M., ALT, D.P. AND
ZUERNER, R.L. (2004) Molecular evolution and mosaicism of leptospiral outer
membrane proteins involves horizontal DNA transfer. Journal of Bacteriology 186 (9):
2818-2828.
HAMBURGER, Z.A., BROWN, M.S., ISBERG, R.R., AND BJORKMAN, P.J. (1999)
Crystal structure of invasin: a bacterial integrin-binding protein. Science 286: 291-
295.
KO, A.I., GALVÃO REIS, M., RIBEIRO DOURADO C.M., JOHNSON, W.D., JR,
RILEY L.W., AND GROUP T.S.L.S. (1999) Urban epidemic of severe leptospirosis in
Brazil. Lancet 354: 820-825.
KOIZUMI, N. AND WATANABE, H. (2004) Leptospiral immunoglobulin-like proteins
elicit protective immunity. Vaccine 22: 1545-1552.
LEETOCART, M., BOERLIN, P., BOERLIN-PETZOLD, F., GOUDET, J.,
BARANTON, G., PEROLAT, P. (1999) Genetic structure of the genus
Leptospira by
multilocus enzyme electrophoresis. International Journal of Systematics And
Bacteriology. 49: 231-238
LEVETT, P.N. (2001) Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews 14 (2): 296-326.
LIN, M., DAN, H., LI, Y. (2004). Identification of a second flagellin gene and functional
characterization of a σ
70
-like promoter upstream of a Leptospira borgpetersenii flaB
gene. Current microbiology. 48: 145-152.
LUO, Y., FREY, E.A., PFUETZNER, R.A., CREAGH, A.L., KNOECHEL, D.G.,
HAYNES, C.A., et al. (2000) Crystal structure of enteropathogenic
Escherichia coli
intimin-receptor complex. Nature 405: 1073-1077.
MATSUNAGA, J., BAROCCHI, M.A., CRODA, J., YOUNG, T.A., SANCHEZ, Y.,
SIQUEIRA, I., BOLIN, C.A., REIS, M.G., RILEY, L.W., HAAKE, D.A., KO, A.I. (2003)
51
Pathogenic Leptospira species express surface-exposed proteins belonging to the
bacterial immunoglobulin superfamily. Molecular Microbiology 49: 929-945.
MATSUNAGA, J., SANCHEZ, Y., XU, X., AND HAAKE, D.A. (2005) Osmolarity, a
key environmental signal controlling expression of leptospiral proteins LigA and LigB
and the extracellular release of LigA. Infection and Immunity 73: 70-78.
MATSUNAGA, J., YOUNG, T.A., BARNETT, J.K., BARNETT, D., BOLIN, C.A., AND
HAAKE, D.A. (2002) Novel 45-kilodalton leptospiral protein that is processed to a 31-
kilodalton growth-phase-regulated peripheral membrane protein. Infection and
immunity 70: 323-334.
MCBRIDE, A.J.A., ATHANAZIO, D.A., REIS, M.G., KO, A.I. (2005). Leptospirosis.
Current opinion in infectious diseases. 18: 376-386.
MERIEN F., BARANTON, G., AND PEROLAT, P. (1997) Invasion of Vero cells and
induction of apoptosis in macrophages by pathogenic Leptospira
interrogans are
correlated with virulence. Infection and Immunity. 65: 729-738.
NASCIMENTO, A.L.T.O., KO, A.I., DELLAGOSTIN, O.A. et al (2004). Comparative
genomics of two Leptospira
interrogans serovars reveals novel insights into physiology
and pathogenesis. Journal of Bacteriology 186: 2164-2172.
NOGAYRÈDE, J.P., FERNANDES, P. J., DONNENBERG, M. S. (2003) Adhesion of
enteropathogenic
Escherichia coli to host cells. Cellular Microbiology 5(6) 359-372.
PALANIAPPAN, R.U.M., CHANG, Y.F., JUSUF, S.S.D., TIMONEY, A.J.F.,
MCDONOUGH, S.P., BARR, S.C., DIVERS, T.J., SIMPSON, K.W., MCDONOUGH,
P.L., MOHAMMED, H.O. (2002) Cloning and molecular characterization of an
immunogenic LigA protein of Leptospira
interrogans. Infection and Immunity 70: 5924-
5930.
PALANIAPPAN R.U., CHANG Y.F., CHANG C.F., PAN M.J., YANG C.W.,
HARPENDING P., MCDONOUGH S.P., DUBOVI E., DIVERS T., QU J., ROE B.
(2005). Evaluation of lig-based conventional and real time PCR for the detection of
pathogenic leptospires. Molecular and Cellular Probes. 19(2): 111-117.
PALANIAPPAN R.U., CHANG Y.F., HASSAN F., MCDONOUGH S.P., POUGH M.,
BARR S.C., SIMPSON K.W., MOHAMMED H.O., SHIN S., MCDONOUGH P.,
ZUERNER R.L., QU J., ROE B. (2004). Expression of leptospiral immunoglobulin-like
protein by Leptospira
interrogans and evaluation of its diagnostic potential in a kinetic
ELISA. Journal of Medical Microbiology. Oct;53(Pt 10):975-84.
PALANIAPPAN R.U., MCDONOUGH S.P., DIVERS T.J., CHEN C.S., PAN M.J.,
MATSUMOTO M., CHANG Y.F.
(2006). Immunoprotection of Recombinant
Leptospiral Immunoglobulin-Like Protein A against Leptospira
interrogans Serovar
Pomona Infection. Infection and immunity 74(3): 1745-1750.
52
RAMADASS, P., JARVIS, B.D.W., CORNER, R.J., PENNY, D., AND MARSHALL
R.B. (1992) Genetic characterization of pathogenic Leptospira species by DNA
hybridization. International Journal of Systematics and Bacteriology. 42: 215-219
REN, S.X., FU, G., JIANG, X.G., et al. (2003). Unique physiological and pathogenic
features of Leptospira
interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature 422:
888-893.
SAMBROOK J. and RUSSEL D.W. Molecular cloning – A laboratory manual. 3.ed.
New York: Spring Harbour, 2001.
SHANG, E.S., SUMMERS, T.A., AND HAAKE, D.A. (1996). Molecular cloning and
sequence analysis of the gene encoding LipL41, a surface-exposed lipoprotein of
pathogenic Leptospira species. Infection and Immunity. 64: 2322-2330.
TARR, C.L., AND WHITTAM, T.S. (2002). Molecular evolution of the intimin gene in
O111 clones of pathogenic
Escherichia coli. Journal of Bacteriology 184: 479-487.
THOMAS, D.D., AND HIGBIE, L.M. (1990) In vitro association of leptospires with
host cells. Infection and Immunity 58: 581-585.
TOWERS, R.J., FAGAN, P.K., TALAY, S.R., CURRIE, B.J., SRIPRAKASH, K.S.,
WALKER, M.J., CHHATWAL, G.S. (2003). Evolution of sfbI encoding streptococcal
fibronecting-binding protein I: Horizontal genetic transfer and gene mosaic structure.
Journal of Clinical Microbiology. 41: 5398-5406.
TRUEBA, G.A., BOLIN, C.A., AND ZUERNER, R.L. (1992). Characterization of the
periplasmic flagellum proteins of Leptospira
interrogans. Journal of Bacteriology 174:
4761-4768.
TSUCHIMOTO, M., NIIKURA, M., ONO, E., KIDA, H., AND YANAGAWA, R. (1984)
Leptospiral attachment to cultured cells. Zentralbi Bakteriol Mikrobiol Hyg [a] 258:
268-274.
VINH, T., FAINE, S., AND ADLER, B. (1984) Adhesion of Leptospires to mouse
fibroblasts (L929) and its enhancement by specific antibody. Journal of Medical
Microbiology 18: 73-85.
WOESE, C.R. (2000) Interpreting the universal phylogenetic tree. PNAS. 97: 8392-
8396.
YURI, K., TAKAMOTO, Y., OKADA, M., HIRAMUNE, T., KIKUCHI, N., AND
YANAGAWA, R. (1993). Chemotaxis of leptospires to hemoglobin in relation to
virulence. Infection and Immunity 61: 2270-2272.
ZHANG, W.L., KÖHLER, B., OSWALD, E., BEUTIN, L., KARCH, H., MORABITO, S.,
CAPRIOLI, A., SUERBAUM, S., AND SCHMIDT, H. (2002). Genetic diversity of
intimin genes of attaching and effacing
Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology
40: 4486-4492.
53
Dados de catalogação na fonte:
Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901
Biblioteca de Ciência & Tecnologia – UFPel
C416c Cerqueira, Gustavo Maia de
Caracterização de Leptospira spp. quanto à presença e
conservação dos genes da família lig : alvos potenciais para
utilização em vacina e testes de diagnóstico / Gustavo Maia
de Cerqueira ; orientador Odir Antônio Dellagostin. – Pelotas,
2006. – 52f. : il. color. – Dissertação (Mestrado). Programa de
Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola. Centro de
Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas,
2006.
1.Biotecnologia. 2.Leptospirose. 3.Sequenciamento.
4.Vacina. 5.Diagnóstico. I.Dellagostin, Odir Antônio. II.Título.
CDD: 614.56
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