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Dawidson Assis Gomes
Funções do cálcio nuclear e
citosólico na sinalização celular
Orientadores: Prof. Marcus Vinícius Gomez
Profª. Maria de Fátima Leite
Belo Horizonte
Minas Gerais – Brasil
2006
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
“O que sabemos é uma gota, o que ignoramos é um oceano.”
Isaac Newton
ii
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Suporte Financeiro Dawidson A. Gomes
Este trabalho foi realizado com o auxílio das seguintes instituições:
- Conselho Nacional do Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
- Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Superior (CAPES)
- Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP)
- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)
- NIH-RO1, NIH-R03 e NIH-PO1
- Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (PADCT)
- Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX)
iii
Agradecimentos Dawidson A. Gomes
Agradeço primeiramente a minha mãe, que abdicou os seus próprios sonhos para
realizar os sonhos de seus filhos.
À Michele pelo amor, paciência, dedicação e também pelas inúmeras horas de
discussões, é claro que científicas.
Aos meus avós Jair e Terezinha pelo exemplo de honestidade, simplicidade e
responsabilidade.
À minha irmã Tatiane e meu irmão Vinicius por terem sempre me apoiado.
Aos meus primeiros orientadores Dr
.
Maria Aparecida Gomes e Dr. Edward
Felix pelos primeiros ensinamentos, que foram fundamentais para mim até aqui.
A todos os meus amigos do Instituto de Ciências Biológicas e do Michael’s Lab
pelo companheirismo.
Aos meus orientadores Dr. Marcus Vinícius Gomez, Dr
a
. Maria de Fátima Leite
e o Dr. Michael H. Nathanson pelos ensinamentos, conselhos, confiança e acima de
tudo pela amizade.
iv
Sumário Dawidson A. Gomes
Índice
v
Sumário Dawidson A. Gomes
Índice
Lista de Abreviaturas..............................................................................................vi
Lista de Figuras e Tabelas.......................................................................................vii
Resumo......................................................................................................................viii
Abstract.....................................................................................................................ix
1. Introdução
1.1 Aspectos básicos da sinalização do Ca
2+
intracelular..............................2
1.2 Sinalização de Ca
2+
nuclear.....................................................................4
1.3 Sinalização de Ca
2+
pode ocorrer em regiões subnucleares.....................7
1.4 Ca
2+
regula processos específicos dentro do núcleo................................10
2. Objetivos...............................................................................................................13
3. Materiais e Métodos
3.1 Cultura celular e transfecção ...................................................................16
3.2 Geração das construções de parvalbumina e calretinina em vetores de
expressão........................................................................................................16
3.3 Geração dos adenovírus de parvalbumina ...............................................17
v
Sumário Dawidson A. Gomes
3.4 Geração das construções de InsP
3
Sponge...............................................18
3.5 Wersten Blot ............................................................................................19
3.6 Imunofluorescência .................................................................................20
3.7 Detecção do aumento de Ca
2+
citosólico ................................................20
3.8 Análise estatística.....................................................................................21
4. Resultados.............................................................................................................22
5. Discussão e Conclusões........................................................................................55
Conclusões.....................................................................................................62
6. Referências bibliográficas...................................................................................64
7. Participação em eventos e Produção Bibliográfica...........................................71
v
Lista de Abreviaturas Dawidson A. Gomes
Lista de Abreviaturas
Ad................................................................Adenovírus
ATP.............................................................Adenosina trifosfato
AVP ............................................................Arginina vasopressina
BSA.............................................................Soro albumina bovina
Ca
2+
.............................................................Cálcio
[Ca
2+
]
i
..........................................................Concentração intracelular de Ca
2+
CICR...........................................................Liberação de Ca
2+
induzida por Ca
2+
cm................................................................Centímetro(s)
cm
2
..............................................................Centímetro(s) quadrado(s)
CR...............................................................Calretinina
DAG............................................................Diacilglicerol
DMEM........................................................Meio mínimo essencial de Dulbecco
DMSO.........................................................Dimetilsulfóxido
DSR.............................................................Proteína fluorescente de Discosoma sp
EGF.............................................................Fator de crescimento epidermal
EGTA..........................................................Ácido etileno glicol-bis (β-aminoetil éter)
N,N,N’,N’-tetraacético
EPM............................................................Erro padrão da média
ERK ............................................................Quinase regulada por sinal extracelular
Fluo-4/AM .................................................Fluo-4 aceto-metil-éster
g ..................................................................Gravidade(s) – força
GFP.............................................................Proteína fluorescente verde
g/L...............................................................grama(s) por litro
HEPES........................................................(N-[2-hidroxietil]piperazina-N’-[2-ácido
etanosulfônico])
HGF ............................................................Fator de crescimento hepático
InsP
3
............................................................Inositol 1,4,5 trifosfato
InsP
3
R .........................................................Receptor de inositol 1,4,5 trifosfato
K
D
................................................................Constante de dissociação
MAPK.........................................................Proteína quinase ativada por mitógenos
vi
Lista de Abreviaturas Dawidson A. Gomes
mg ...............................................................Miligrama(s)
mL...............................................................Mililitro(s)
mM..............................................................Milimolar
ms................................................................Mili segundo(s)
NES.............................................................Nuclear exclusion signal
NLS.............................................................Nuclear localization signal
µg/mL .........................................................Micrograma(s) por mililitro
µL................................................................Microlitro(s)
µm...............................................................Micrômetro(s)
µM...............................................................Micromolar
µs.................................................................Microsegundo(s)
nm ...............................................................Nanômetros
nM...............................................................Nanomolar
PLC.............................................................Fosfolipase C
PKC.............................................................Proteína quinase C
PMCA.........................................................Ca
2+
ATPase da membrana plasmática
PV ...............................................................Parvalbumina
p/v ...............................................................Peso/volume
RE ...............................................................Retículo endoplasmático
ROC............................................................Canais operados por receptores
Ry................................................................Rianodina
RyR.............................................................Receptores de rianodina
RS................................................................Retículo sarcoplasmático
RTKs...........................................................Receptores de tirosina quinases
s...................................................................Segundo(s)
SERCA........................................................Ca
2+
ATPase do retículo sarco-endoplasmá-
tico
SSHT...........................................................Solução salina HEPES tamponada
u.a................................................................Unidades arbitrárias
UV...............................................................Ultravioleta
VOC............................................................Canais operados por voltagem
v/v ...............................................................Volume/volume
W.................................................................Watt(s)
vi
Lista de Figuras e Tabelas Dawidson A. Gomes
Lista de Figuras
Figura 1. Mecanismo de ativação de InsP3Rs via recepotores acoplados a
proteína G .................................................................................................................3
Figura 2. Sinalização de Ca
2+
no citoplasma e núcleo..............................................6
Figura 3. O núcleo de células contém retículo endoplamático que estoca Ca
2+
.......9
Figura 4. Ações múltiplas do Ca
2+
nuclear...............................................................12
Figura 5. Representação esquemática e expressão da parvalbumina e calretinina
fusionadas com DSR..................................................................................................24
Figura 6. Localização subcelular das construções de calretinina.............................25
Figura 7. Localização subcelular das construções de parvalbumina........................26
Figura 8. Supressão dos sinais de Ca
2+
em células SkHep1 por expressão de
calretinina...................................................................................................................30
Figura 9. Supressão dos sinais de Ca
2+
em células SkHep1 por expressão de
parvalbumina .............................................................................................................32
Figura 10. Localização subcelular das construções de adenovírus de
parvalbumina .............................................................................................................34
Figura 11. HGF fosforila c-met em células SkHep1 ................................................35
Figura 12. HGF fosforila Erk 1.................................................................................37
Figura 13. Ad-PV-NES bloqueia a fosforilação de Erk 1 induzida por HGF ..........38
Figura 14. Ad-PV-NES bloqueia a expressão de p38...............................................40
Figura 15. Ad-PV-NLS bloqueia a fosforilação de CDK1.......................................42
Figura 16. Tratamento com HGF induz translocação de c-met para o núcleo de
células SkHep1 ..........................................................................................................45
vii
Lista de Figuras e Tabelas Dawidson A. Gomes
Figura 17. Receptor c-met transloca para o núcleo de células SkHep1....................46
Figura 18. PLCγ localiza-se no núcleo de células SkHep1 ......................................48
Figura 19. Representação esquemática das construções de InsP
3
Sponge
fusionadas a mRFP ....................................................................................................49
Figura 20. Localização subcelular das construções de InsP
3
Sponge.......................50
Figura 21. InsP
3
Sponge NES suprime aumento de Ca
2+
induzido por AVP...........53
Figura 22. InsP
3
Sponge NLS suprime aumento de Ca
2+
induzido por HGF...........54
Lista de Tabelas
Tabela 1. Fluorescência da linha de base não é alterada em células expressando as
proteínas quelantes de Ca
2+
........................................................................................31
Tabela 2. Efeito da parvalbumina e calretinina na sinalização do Ca
2+
....................33
vii
Resumo Dawidson A. Gomes
Resumo
viii
Resumo Dawidson A. Gomes
O cálcio (Ca
2+
) citoplasmático e nucleoplasmático podem ser regulados
independentemente. A relativa contribuição do Ca
2+
citoplasmático e nucleoplasmático
em processos biológicos tais como transcrição gênica, apoptose e proliferação celular
ainda é matéria de especulação. Com a finalidade de explorar esta questão, utilizamos o
aumento da expressão de parvalbumina (PV) e calretinina (CR) como ferramentas
moleculares para tamponar seletivamente Ca
2+
tanto no nucleoplasma quanto no
citoplasma. Nossos dados mostram que tanto a PV quanto a CR foram eficazes em
tamponar os sinais de Ca
2+
em cada um destes compartimentos subcelulares. Para
maximizar o número de células que expressam a PV, estas construções foram entregues
às células SkHep1 por adenovírus (ad) permitindo assim, investigar funções celulares
mediadas pelo Ca
2+
nuclear e citosólico. A construção ad-PV-NES (Nuclear Exclusion
Signal) foi eficaz no bloqueio da fosforilação da proteina Erk 1 e da expressão da
proteína p38. Em contraste, a construção ad-PV-NLS (Nuclear Localization Signal) foi
capaz de bloquear a fosforilação da ciclina dependente de quinase 1 (CDK1). Para
estudar os mecanismos responsáveis pela geração de InsP
3
nuclear, utilizamos
construções que tamponam InsP
3
seletivamente no núcleo ou no citosol, denominadas
de InsP
3
Sponge NLS e NES, respectivamente. As células transfectadas com InsP
3
Sponge NLS mostraram-se eficazes em bloquear o aumento de Ca
2+
induzido pelo fator
de crescimento hepático (HGF), mas não por arginina vasopressina (AVP). Em
contraste, a construção InsP
3
Sponge NES bloqueou o aumento de Ca
2+
, induzido por
AVP, mas não por HGF. Demostramos que o receptor de HGF, c-met, pode translocar
para o núcleo de células SkHep1 após estimulação com HGF. Além disso, observamos
que células SkHep1 possuem fosfolipase Cγ (PLCγ) no núcleo. Em conjunto, estes
resultados sugerem que através de PLCγ, HGF pode gerar sinais de InsP
3
e
consequentemente Ca
2
nuclear. Assim, sinais de Ca
2+
no núcleo ou no citoplasma têm
efeitos distintos na expressão e ativação de quinases e fatores de transcrição. Estas
observações sobre o tráfego e função de c-met revelam um mecanismo pelo qual os
sinais de Ca
2+
podem ser compartimentalizados para obter efeitos celulares distintos.
viii
Abstract Dawidson A. Gomes
Abstract
ix
Abstract Dawidson A. Gomes
Nucleoplasmic and cytoplasmic calcium (Ca
2+
) can be regulated independently. The
relative contribution of nucleoplasmic and cytoplasmic Ca
2+
to biological processes
such as gene transcription, cell growth, apoptosis and cell cycle control remain to be
fully defined. In order to address this question, we target the Ca
2+
-binding proteins
parvalbumin (PV) or calretinin (CR), to either the nucleus or cytoplasm as a molecular
tool to selectively buffer either nucleoplasmic or cytoplasmic Ca
2+
. These data showed
that expression of targeted PV or CR was sufficient to buffer Ca
2+
signals in these
respective sub-cellular compartments. The PV constructs were delivered by adenovirus
(ad) to explorer the functions of nuclear and cytosolic Ca
2+
. The construct ad-PV-NES
(Nuclear Exclusion Signal) blocked the phosphorylation of Erk1 and expression of p38.
In contrast, the construct ad-PV-NLS (Nuclear Localization Signal) blocked the
phosphorylation of cyclin dependent kinase 1 (CDK1). We also investigated the
mechanisms responsible for InsP
3
generation within the nucleus. In order to address this
question, we employed an InsP
3
binding protein (“InsP
3
Sponge”) as a molecular tool to
selectively buffer either nucleoplasmic or cytoplasmic InsP
3
. SkHep1 cells expressing
InsP
3
Sponge in the nucleus blocked the Ca
2+
response induced by Hepatocyte Growth
factor (HGF), while the Ca
2+
response in the cells was not affected by stimulation with
arginine vasopressin (AVP). In contrast, expression of InsP
3
Sponge in the cytoplasm
blocked the Ca
2+
response induced by AVP, but the Ca
2+
response induced by HGF was
not affected. In addition, stimulation with HGF induced translocation of c-met to the
nucleus and let to the presence of phospholipase Cγ (PLCγ) as well within the nucleus.
In summary, these results show that HGF can generate nuclear InsP
3
and Ca
2+
signals,
and that this likely results from translocation of c-met and PLCγ to the nucleus. Since
Ca
2+
signals in the nucleus and cytoplasm have distinct effects on expression and
activation of kinases and transcription factors, these observations about c-met
trafficking and function reveal one mechanism by which Ca
2+
signals can be
compartmentalized to obtain these distinct cellular effects.
ix
Introdução Dawidson A. Gomes
1. Introdução
1
Introdução Dawidson A. Gomes
1.1 Aspectos básicos da sinalização do Ca
2+
intracelular
O Ca
2+
controla grande variedade de funções celulares abrangendo respostas de
curta duração como a contração muscular e a secreção, bem como respostas de longa
duração tais como a transcrição, divisão e morte celular (Clapham 1995; Berridge et al.
2003). Embora não seja estabelecido como um único segundo mensageiro coordena tal
diversidade de efeitos celulares, evidências sugerem que padrões espaciais de sinais de
Ca
2+
podem determinar sua especificidade (revisado por Berridge et al. 2003).
A principal organela responsável em estocar e liberar Ca
2+
nas células é o
retículo endoplasmático (RE). O RE contém canais especializados em liberar Ca
2+
que
podem ser divididos em duas famílias: os receptores de inositol 1,4,5-trifosfato
(InsP
3
Rs) e os receptores de rianodina (RyRs). Cada uma destas famílias parece conter
três diferentes isoformas. Tanto os InsP
3
Rs quanto os RyRs formam grandes estruturas
oligoméricas por associação de suas quatro subunidades (revisado por Berridge et al.
2003). As estruturas dos InsP
3
Rs e RyR apresentam grande homologia, que é marcante
especialmente nas regiões que dão origem ao poro dos canais (Mignery et al. 1989;
Takeshima 1993; Shah and Sowdhamini 2001).
O RE é sensível a mensageiros intracelulares tais como: o inositol 1,4,5-
trifosfato (InsP
3
), o próprio íon Ca
2+
, ADP-ribose cíclico, nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato (NAADP) (revisado por Rizzuto and Pozzan 2006), entre outros
que são capazes de disparar a liberação de Ca
2+
dos estoques intracelulares. Os InsP
3
Rs
requerem a presença de InsP
3
para serem estimulados (Figura 1), mas podem ser
modulados pelo Ca
2+
e por proteínas quinases (revisado por Leite and Nathanson 2001).
Os RyRs por sua vez são ativados pelo próprio Ca
2+
e este processo de Ca
2+
induzindo a
liberação de Ca
2+
(CICR) pode ser desencadeado de diversas maneiras: através do
acoplamento entre canais operados por receptores, canais operados por voltagem e
2
Introdução Dawidson A. Gomes
canais liberadores do RE, como acontece em miócitos cardíacos e nos neurônios
(revisado por Berridge 2002). Entretanto, cada um destes canais liberadores de Ca
2+
do
RE tem sua característica funcional distinguível.
Figura 1: Mecanismo de ativação de InsP
3
Rs via receptores acoplados a proteína
G. Os receptores de membrana acoplados a proteína G, quando ativados por ligantes,
induzem a hidrólise de fosfatidil inositol 4,5 bifosfato (PIP
2
) para formar diacilglicerol
(DAG) e InsP
3
, através da fosfolipase C (PLC). Os InsP
3
ligam-se aos InsP3Rs,
presentes na membrana do retículo endoplasmático, ao qual induzem a liberação de
Ca
2+
para o citosol (Leite and Nathanson 2001).
Em contraste com a intrigante variedade de mecanismos para a indução do
influxo de Ca
2+
extracelular, a extrusão do Ca
2+
para o espaço extracelular é limitada a
duas famílias de proteínas: o trocador Na
+
/Ca
2+
e o Ca
2+
ATPase da membrana
plasmática. Além disso, o Ca
2+
intracelular pode ser removido do citoplasma através de
uma variedade de bombas e transportadores organelas específicas. A recaptação do Ca
2+
para o RE é regulada por uma família de Ca
2+
ATPases do retículo sarco-
endoplasmático (SERCA). A recaptação pela mitocôndria é mediada pelo Ca
2+
3
Introdução Dawidson A. Gomes
“uniporter” mitocondrial enquanto a recaptação pelo Golgi é mediada pelo transportador
- Ca
2+
ATPase do tipo P (PMR1/ATP2C1). Além de captar Ca
2+
, a mitocôndria pode
tambem liberá-lo através do trocador Na
+
-H
+
/ Ca
2+
e em algumas circunstâncias, pelo
poro de permeabilidade transitória (Nowycky and Thomas 2002).
Como descrito, existe uma enorme variedade de estoques intracelulares de Ca
2+
que podem auxiliar na compartimentalização e na especificidade das respostas celulares
controladas pelo Ca
2+
. Os mecanismos através dos quais o Ca
2+
pode regular diversas
funções celulares continuam controversos, desse modo resolvemos estudar como o
aumento de Ca
2+
citosólico ou nuclear pode especificamente desencadear funções
celulares distintas.
1.2 Sinalização de Ca
2+
nuclear
Os padrões de sinalização de Ca
2+
podem variar em diferentes regiões e o
aumento do Ca
2+
no núcleo tem efeitos biológicos específicos que diferem dos efeitos
dos aumentos de Ca
2+
citosólico (Hardingham et al. 1997; Hardingham et al. 1998;
Carrion et al. 1999; Pusl et al. 2002; Echevarria et al. 2003; Leite et al. 2003; Thompson
et al. 2003). Entretanto, os mecanismos e as vias que promovem aumentos localizados
nos níveis de Ca
2+
nuclear ainda não estão totalmente esclarecidos.
O núcleo é um compartimento funcionalmente distinto da célula. Ele é
fisicamente separado do citosol por uma bicamada lipídica, nomeada de envelope
nuclear (Lee et al. 1998; Perez-Terzic et al. 1996). Este envelope contém poros que
permitem o transporte de moléculas e íons entre o citosol e o núcleo. Foi inicialmente
proposto que a sinalização de Ca
2+
poderia ocorrer por difusão do Ca
2+
citosólico para o
envelope nuclear (Brini et al. 1993; Allbritton et al. 1994; Hennager et al. 1995; Lipp et
al. 1997). Este mecanismo explica o aumento do Ca
2+
nuclear observado sobre certas
4
Introdução Dawidson A. Gomes
condições, mas isto não suporta ou exclui a idéia de regulação independente de sinais de
Ca
2+
nucleares independentes dos sinais de Ca
2+
citosólicos.
Outra possível fonte de Ca
2+
no núcleo é o envelope nuclear. É sabido que o
lúmen do envelope nuclear é contínuo com o lúmen do RE (Bachs et al. 1992;
Bustamante 1994). Tal como o RE, o envelope nuclear é capaz de estocar Ca
2+
(Rogue
et al. 1998). Observou-se que em núcleo isolado, os InsP
3
Rs estão envolvidos na
liberação de Ca
2+
(Gerasimenko et al. 1995) e também em células intactas nas quais os
InsP
3
Rs foram bloqueados (Hennager et al. 1995). Esses dados sugerem que as
atividades dependentes de Ca
2+
nuclear podem ser reguladas de maneira indepedente
dos estoques e sinais de Ca
2+
citosólicos.
Os componentes envolvidos na sinalização de Ca
2+
mediada por InsP
3
Rs são
encontrados não somente na membrana plasmática, mas também no envelope nuclear
(Figura 2). Demonstrou-se que a membrana nuclear contém a enzima PLC, que
hidrolisa PIP
2
para formar InsP
3
e diacilglicerol (DAG) (Berridge 1993; Martelli et al.
2000). Além disso, foi encontrado InsP
3
Rs funcionais na membrana nuclear que está em
contato com o núcleo (Koppler et al. 1993; Mak and Foskett 1994; Malviya 1994;
Stehno-Bittel et al. 1995a). Estes dados sugerem que InsP
3
pode ser gerado no núcleo e
mais, que InsP
3
nuclear pode levar a aumentos localizados de Ca
2+
indepedentes dos
aumentos dos níveis de InsP
3
no citosol (Figura 2). Deve-se salientar que alguns relatos
sugerem que PIPK e PIP
2
não estão associados com estruturas da membrana nuclear,
incluíndo as invaginações do envelope nuclear, mas a subdomínios nucleares
denominados “speckle domains” (Boronenkov et al. 1998; Osborne et al. 2001;
Tabellini et al. 2004).
5
Introdução Dawidson A. Gomes
Figura 2. Sinalização de Ca
2+
no citoplasma e núcleo. Ca
2+
citoplasmático é elevado
quando PLC hidrolisa PIP
2
para formar InsP
3
, ao qual atual nos receptores de InsP
3
para
liberar Ca
2+
do retículo endoplasmático dentro do citoplasma. Diferentes isoformas de
PLC podem ser ativadas por estimulação de receptores acoplados a proteína Gq ou
receptores de tirosina quinases (RTKs). Isoformas nucleares de PLC hidrolisam PIP
2
para formar InsP
3
dentro do núcleo, ao qual atuam nos receptores de InsP
3
intranucleares para gerar Ca
2+
dentro do núcleoplasma. RTKs podem ativar PLC
intranucleares, embora o mecanismo não esteja completamente estabelecido.
Existem várias evidências que o InsP
3
pode liberar Ca
2+
diretamente do envelope
nuclear. Foi demostrado que a presença de InsP
3
induz a liberação de
45
Ca
2+
dentro de
núcleos isolados de hepatócitos (Malviya et al. 1990) e aumento do Ca
2+
livre mesmo
quando os núcleos isolados são perfundidos por quelantes de Ca
2+
(Gerasimenko et al.
1995; Santella and Kyozuka 1997). Observou-se que a injeção direta de InsP
3
dentro do
núcleo de oócitos de Xenopus laevis resulta em aumento do Ca
2+
intranuclear, mesmo
quando os InsP
3
Rs citosólicos foram bloqueados (Hennager et al. 1995). Além disso,
InsP
3
Rs associados com o núcleo liberam Ca
2+
de núcleos isolados de Xenopus laevis
6
Introdução Dawidson A. Gomes
(Stehno-Bittel et al. 1995b) e fotoliberação de “caged InsP
3
” em núcleos isolados de
oócitos de “starfish” aumenta a liberação Ca
2+
nuclear (Santella and Kyozuka 1997).
Desse modo, diversas são as evidências que InsP
3,
uma vez dentro do núcleo, pode
aumentar Ca
2+
no nucleoplasma de maneira independente de eventos citoplasmáticos.
1.3 Sinalização de Ca
2+
pode ocorrer em regiões subnucleares
A compartimentalização de Ca
2+
intranuclear foi inicialmente relatado utilizando
uma sonda de alta afinidade ao Ca
2+
, fluo-3/AM (Lui et al. 1998). Além disso,
observou-se que o núcleo de células animais (Fricker et al. 1997) e de plantas (Collings
et al. 2000) quando em interfase contém estruturas reticulares que são contíguas com o
retículo endoplasmático e o envelope nuclear (Figura 3). Esta estrutura reticular foi
posteriormente caracterizada e denominada de retículo nucleoplasmático (Echevarria et
al. 2003). Demonstrou-se que, assim como o retículo endoplasmático, o retículo
núcleoplasmático pode estocar e liberar Ca
2+
. A relação do retículo núcleoplasmático na
sinalização de Ca
2+
foi recentemente caracterizada em células SkHep1 (Echevarria et al.
2003). As células foram marcadas com a sonda de membrana de retículo
endoplasmático, ER-tracker, e posteriormente examinadas usando microscopia de dois
fótons para minimizar a perda de fluorescência pela ação do laser. Uma rede de
estruturas intranucleares que são contíguas com o retículo endoplasmático e o envelope
nuclear foram observadas (Figura 3a e b) (Echevarria et al. 2003). A relação destas
estruturas com o retículo endoplasmático foi examinada posteriormente investigando a
distribuição intracelular da calreticulina, proteína de retículo endoplasmático, através de
imunofluorescência. A marcação com calreticulina foi encontrada não somente no
citosol, mas também no núcleo (Figura 3c). Além disso, em células SkHep1 marcadas
com a sonda de baixa afinidade ao Ca
2+
, Mag-fluo-4/AM, uma distribuição similar a da
7
Introdução Dawidson A. Gomes
CR e do ER-tracker foi observada (Figura 3d) (Echevarria et al. 2003), demostrando
assim que estas estruturas intranucleares estocam Ca
2+
.
Os InsP
3
Rs medeiam a sinalização de Ca
2+
em células SkHep1 (Pusl et al. 2002)
e estes receptores são encontrados ao longo do retículo endoplasmático destas células.
(Echevarria et al. 2003). Demonstrou-se por fotoliberação de “caged InsP
3
” dentro do
núcleo que os InsP
3
Rs intranucleares são funcionais (Echevarria et al. 2003). A
fotoliberação de InsP
3
dentro do núcleo resultou em aumento gradual de Ca
2+
neste
compartimento. Investigou-se a funcionalidade dos InsP
3
Rs nucleares pela estimulação
das células SkHep1 com fator de crescimento de hepatócitos (HGF). Este fator de
crescimento é conhecido por preferencialmente ativar sinalização de Ca
2+
associado
com a maquinaria nuclear (Clark and Brugge 1995). Observou-se que a sinalização de
Ca
2+
nuclear induzida por HGF geralmente precede aos aumentos de Ca
2+
citosólicos
(Echevarria et al. 2003). É sabido que tanto o receptor do fator de crescimento
epidermal bem como o receptor do fator de crescimento de fibroblasto podem translocar
para o núcleo (Reilly and Maher 2001; Lin et al. 2001). A translocação dos receptores
de tirosina quinase sugere uma rota potencial pelos quais estes receptores podem
seletivamente ativar as vias de sinalização nuclear.
O envelope nuclear contém todos os sistemas necessários que controlam a
homeostase de Ca
2+
no núcleoplasma. Isto inclui não somente InsP
3
R e a maquinaria
para produzir InsP
3
, mas também “SERCA pumps” (Gensburger et al. 2003). Uma
questão intrigante é como os sinais originados da membrana plasmática induzem
mudanças de Ca
2+
no núcleo. Apesar desta pergunta não ser inteiramente sabida, alguns
trabalhos mostram que receptores de tirosina quinases estão envolvidos na geração de
Ca
2+
nuclear. Foi demostrado, que bombesina ao interagir com um receptor ligado a
proteína G, causa a hidrólise de PIP
2
na membrana plasmática. Em contraste, observou-
8
Introdução Dawidson A. Gomes
Figura 3. O núcleo de células contém um reticulo endoplasmático que estoca Ca
2+
.
(a) Diferentes campos de células SkHep1 marcadas com a sonda de membrana de
retículo endoplasmático, “ER-tracker” e visualizadas por microscopia de dois fótons
mostra a presença de estruturas reticulares dentro do núcleo (setas). (b) Diferentes
planos focais da mesma célula mostram que uma destas estruturas reticulares atravessa
o núcleo (setas). (c) Imagens de imunofluorescência de três diferentes células SkHep1
marcadas com anticorpo anti-calreticulina também mostra a presença de estruturas
reticulares no núcleo (setas). (d) Diferentes células SkHep1 marcadas com a sonda de
baixa afinidade ao Ca
2+
, Mag-fluo-4/AM, e visualizadas por microscopia confocal
demonstram que o retículo endoplasmático estoca Ca
2+
(setas). Barra = 5 µm
9
Introdução Dawidson A. Gomes
se que o fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) e integrinas, que ativaram
proteínas tirosina quinase, causaram a hidrólise de PIP
2
no núcleo (Divecha et al. 1991;
Plevin et al. 1990). Martelli et al. (1992) também observaram que a sinalização de Ca
2+
nuclear pode ser disparada por ativação de receptores de tirosina quinase através de
peptídeos sintéticos. Em conjunto estes trabalhos mostram que receptores de tirosina
quinase estão envolvidos na geração de Ca
2+
nuclear.
1.4 Ca
2+
regula processos específicos dentro do núcleo
A sinalização de Ca
2+
nuclear regula diretamente importantes funções celulares
tais como translocação de proteínas quinases (Echevarria et al. 2003) e transcrição
gênica (Hardingham et al. 1997; Hardingham et al. 1998; Chawla et al. 1998; Pusl et al.
2002; Thompson et al. 2003) (Figura 4). Os efeitos do Ca
2+
nuclear na translocação de
proteínas quinases são distintas dos efeitos do Ca
2+
citosólico. Isso foi demonstrado
através de monitoramento da translocação de proteína quinase C gama fundida com a
proteína fluorescente verde (GFP) em células na qual o “caged Ca
2+
” foi fotoliberado
somente no núcleo ou citosol. O aumento localizado de Ca
2+
no núcleo causou
redistribuição de proteína quinase C no envelope nuclear sem afetar a distribuição da
proteína quinase no citosol (Echevarria et al. 2003).
Os sinais de Ca
2+
podem regular a expressão gênica e evidências recentes
sugerem que os sinais de Ca
2+
nuclear e citosólico afetam a expressão de genes de
maneira distinta. Por exemplo, vias de sinalização ativadas por Ca
2+
citoplasmático
ativam o “serum response element” (SRE), enquanto o Ca
2+
nuclear controla a
expressão de genes através do “cAMP response element” (CRE) (Hardingham et al.
1997). Além disso, a contribuição dos sinais de Ca
2+
nuclear e citosólico foram
estudados durante estimulação de Elk1 mediada por EGF (Pusl et al. 2002). Neste
10
Introdução Dawidson A. Gomes
trabalho, os sinais de Ca
2+
em ambos os compartimentos foram seletivamente
bloqueados através da expressão de uma proteína quelante de Ca
2+
, parvalbumina, no
citosol ou no núcleo. Foi encontrado que a supressão do Ca
2+
nuclear, mas não do Ca
2+
citosólico inibiu a ativação de Elk 1 por EGF. Entretanto, supressão de sinais de Ca
2+
nuclear não afetaram a abilidade de ERK ser fosforilada ou de translocar-se para o
núcleo em resposta ao EGF (Pusl et al. 2002). Assim, propriedades espaciais dos sinais
de Ca
2+
são importantes determinantes para o tipo de resposta transcricional, fornecendo
um mecanismo para a regulação diferenciada por um único segundo mensageiro
(revisado por Hardingham et al. 1998).
Como exemplificado, o Ca
2+
nuclear possui funções distintas do Ca
2+
citosólico.
Assim serão explorados neste trabalho as funções do Ca
2+
citosólico e nuclear bem
como vias intracelulares que podem contribuir para a geração do Ca
2+
nuclear. Para
responder essas questões utilizamos construções moleculares que tamponam o Ca
2+
ou o
InsP
3
seletivamente no núcleo ou no citosol. Para estes estudos utilizamos células
SkHep1, que quando estimuladas com HGF ativam a sinalização de Ca
2+
que é
associada com a maquinaria nuclear (Echevarria et al. 2003).
11
Introdução Dawidson A. Gomes
Figura 4. Ações múltiplas do Ca
2+
nuclear. Aumento do Ca
2+
dentro do núcleoplasma
regula a atividade de vários fatores de transcrição e quinases, como na figura e descrito
no texto.
12
Objetivos Dawidson A. Gomes
2. Objetivos
13
Objetivos Dawidson A. Gomes
Objetivo Geral
Investigar vias intracelulares que podem ser controladas especificamente por
sinais de Ca
2+
citosólico ou nuclear e identificar as vias que podem contribuir para a
geração de Ca
2+
nuclear.
Objetivos Específicos
1) Caracterizar as propriedades das construções de parvalbumina e calretinina na
sinalização do Ca
2+
citosólico e nuclear.
Para esta finalidade, as construções de parvalbumina e calretinina foram fundidas às
sequências de localização nuclear (NLS) ou a sequências de exclusão nuclear (NES) e
suas propriedades foram estudadas em células SkHep1.
2) Investigar funções do Ca
2+
nuclear e citosólico.
As contruções de parvalbumina entregues por adenovírus foram utilizadas para explorar
a ativação de MAPKs e fatores de transcrição em células SkHep1 estimuladas com o
fator de crescimento hepático (HGF).
3) Investigar a geração de InsP
3
nuclear.
Utilizamos construções que podem quelar InsP
3
tanto no núcleo quanto no citosol para
investigar a geração de InsP
3
no núcleo de células SkHep1 estimuladas com HGF.
14
Materiais e Métodos Dawidson A. Gomes
4. Materiais e Métodos
15
Materiais e Métodos Dawidson A. Gomes
3.1 Cultura celular e transfecção
Células SkHep1 foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e
cultivadas em Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Invitrogen), suplementado com
100 unit/ml penicilina, 0,1 mg/ml streptomicina (Invitrogen), 10% de soro fetal bovino
(Invitrogen), a 37
0
C em 5% CO
2
. As células SkHep1 foram transfectadas usando
lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.
3.2 Geração das construções de parvalbumina e calretinina em vetores
de expressão
As construções de PV direcionadas para o núcleo (PV-NLS-GFP) ou citosol (PV-NES-
GFP) foram previamente descritas (Pusl et al. 2002). Para gerar as construções em fusão
com proteína fluorescente derivada do coral Discosoma sp (DSR), a GFP das
construções previamente publicadas foram substituídas por DSR como descrito a seguir:
A sequência de DSR foi amplificada por PCR do plasmídio pDSR2-N1 (Clonetech)
usando primers ao qual foram introduzidos os sites da enzima de restrição NotI na
regiao 5’ e 3’. O produto de PCR foi digerido com NotI e subclonado nos plasmídios de
expressão PV-NLS-GFP e PV-NES-GFP, previamente digeridos com NotI para liberar
o inserto da GFP. As construções resultantes foram nomeadas de PV-NLS-DSR e PV-
NES-DSR. Construiu-se o plasmídio controle por subclonagem do gene do DSR no
plasmídio pCMV-Myc-Cyto (Invitrogen). Cada vetor de expressão foi confirmado por
análise de enzima de restrição e também por sequênciamento automático.
Os vetores de expressão de CR direcionados tanto para o núcleo quanto para o
citosol foram construídos através do cDNA completo da CR de rato, o qual foi
generosamente fornecido pelo Dr. Jacek Kuznicki (International Institute of Molecular
and Cell Biology, Warsaw, Poland) no plasmídio pCMV-Myc-Nuc (Invitrogen).
16
Materiais e Métodos Dawidson A. Gomes
Subsequentemente, a região codificante do DSR derivado do plasmídio pDSR2-N1
(Clontech) foi amplificada por PCR e sub-clonada através dos sitíos de NotI para
produzir o plasmídio pCMV-CR-DSR-Myc-Nuc, designado como CR-NLS-DSR. O
vetor de expressão da CR direcionada para o citoplasma foi gerado por amplificação do
cDNA através da PCR usando os primers 5'-GGG GTC GAC GCA TTA CAA AAA
AAA TTA GAA GAA TTA GAA TTA GAT GAA ATG GCT GGC CCG CAG-3'
(contendo a sequência de exclusão nuclear amino terminal derivada da MEK1) e 5'-
ATA AGA ATG CGG CCG CCA GGA ACA GGT GGT GGC GGC CC-3'. O produto
da PCR foi sub-clonado no vetor pCMV-Myc-Cyto vector (Invitrogen). A DSR foi sub-
clonada usando os sites da NotI para criar o vetor pCMV-CR-NES-DSR-Myc-Cyto,
designado como CR-NES-DSR.
3.3 Geração dos Adenovírus de Parvalbumina
As construções de PV em fusão com DSR foram amplificados por PCR e subclonados
em pShuttle-CMV (Bert Vogelstein, John Hopkins Oncology Center, Baltimore, MD)
por análise de restrição enzimática com XhoI e XbaI para gerar o pShuttle-CMV-PV-
NLS-DSR. Adenovírus recombinantes foram gerados por transformação de pShuttle-
CMV-PV-NLS-DSR em células AdEaseier-1 (Vogelstein), derivada da bactéria BJ5183
contendo o plamídio “backbone” pAdEasy-1. Os adenovírus positivos foram
selecionados por resistência a kanamicina e análise por restrição enzimática usando a
enzima Pacl. Os adenovírus de PV foram amplificados usando células HEK-293 como
descrito em He et al, 1998.
17
Materiais e Métodos Dawidson A. Gomes
3.4 Geração das construções de InsP
3
Sponge
As construções InsP
3
Sponge e InsP
3
Sponge NLS em fusão com mRFP foram
gentilmente doadas pelo Dr. Tamas Balla (Endocrinology and Reproduction Research
Branch, NICHD, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) e foram geradas
como descrito anteriormente (Varnai et al. 2002; Lin et al. 2005). Em resumo, o
domínio de ligação ao InsP
3
do InsP
3
R humano do tipo I (número de acesso no
GenBank D26070) foi amplificado de cDNA de cérebro humano (Quickclone,
CLONTECH) com os seguintes pares de primers 5’ GCA ACA GAG TGC CTG ACC
CAG GTC AG-3 e 5- CTT TCG CAC CAG GCT GAC AAA TGT GTC 3’. O produto
de PCR foi subclonado no plasmídio de clonagem pGEM-Easy T/A (Promega,
Madison, WI). Após sequenciamento, dois clones foram identificados, um contendo
(SHII+) e o outro faltando (SHII-) a região de ligação localizada entre os dois domínios
envolvidos na ligação ao InsP
3
. O “splice variant” SHII+ foi usado como “template”, o
domínio de ligação ao InsP
3
(resíduos 224–605) foi amplificado com “nested primers”
contendo os sítios de restrição para as enzimas XhoI e EcoRI, e o produto de PCR foi
subclonado no vetor pEGFP-C1. Subsequentemente a EGFP foi substituída por proteína
fluorescente monomérica vermelha (mRFP) para que os experimentos de Ca
2+
pudessem ser realizados com as sondas para Ca
2+
com excitação no comprimento de
onda de 488 nm, como o fluo-4/AM. O vetor mRFP-C1-InsP
3
(224-605)
foi designado de
InsP
3
Sponge. Para geração da construção InsP
3
Sponge NES oligonúcleotídeos
sintéticos contendo a sequência de exclusão nuclear amino terminal derivada da MEK1
(5’ CCG GTA TGG CTC TGC AGA AAA AGT TGG AAG AGC TTG AGC TGG
ATG AGG CA 3’ e 5’ CCG GTG CCT CAT CCA GCT CAA GCT CTT CCA ACT
TTT TCT GCA GAG CCA TA 3’) e os sítios de restrição para a enzima AgeI foram
hibridizados in vitro e ligados ao plamídio InsP
3
Sponge previamente digeridos com a
18
Materiais e Métodos Dawidson A. Gomes
enzima AgeI. A orientação foi confirmada por sequênciamento e a correta localização
subcelular por expressão em células SkHep1.
3.5 Western Blot
Os western blots das células SkHep1 foram feitos de acordo com métodos descritos
(Leite et al. 2003; Echevarria et al. 2003). As células cultivadas em placas de cultura de
35mm foram lavadas três vezes com PBS e a estas foram adicionados 1% de um
coquetel contendo inibidores de proteases (Sigma, St. Louis, USA) e 1% de um
coquetel de inibidores de fosfatases (Sigma, St. Louis, USA) dissolvido em M-PER
(Pierce, Rockford, USA), para obtenção de lisados totais. As frações citosólicas e
nucleares foram obtidas utilizando o kit NE-PER (Pierce, Rockford, USA), ao qual
foram adicionados em todas as soluções 1% de um coquetel contendo inibidores de
proteases (Sigma, St. Louis, USA) e 1% de um coquetel de inibidores de fosfatases
(Sigma, St. Louis, USA), o protocolo foi realizado de acordo com o manual do
fabricante. A concentração de proteínas foi determinada por espectrofotômetro e 15-40
µg de proteínas foi separada por eletroforese usando um gel de poliacrilamida de
gradiente 5-20%. Em seguida, foi feita transferência durante 90 min em sistema semi
seco (BioRad, Hercules, CA) das proteínas para uma membrana de PDVF (BioRad,
Hercules, CA). Então, a membrana foi bloqueada usando-se PBS 0.1% tween-20
(PBST), mais 5% de leite desnatado por 60 min. Os anticorpos usados foram: anti c-met
monoclonal (1:500) (Upstate, Charlottesville, USA), anti fosfo c-met policlonal
(1:1000) (Biosource, California, USA), anti Na
+
/K
+
ATPase monoclonal (1:250) (Santa
Cruz), anti lamin B policlonal (1:1000) (Santa Cruz), anti Erk1 monoclonal (1:1000)
(Cell Signaling), anti fosfo Erk 1/2 monoclonal (1:1000) (Cell Signaling), anti p38
monoclonal (1:1000) (Cell Signaling), anti fosfo p38 monoclonal (1:1000) (Cell
19
Materiais e Métodos Dawidson A. Gomes
Signaling), anti PLCγ monoclonal (1:500) (BD Pharmingen, CA, USA) e anti-actina
monoclonal (1:4000) (Sigma, St. Louis, USA). A incubação com anticorpo primário foi
feita overnight a 4
o
C. Após três lavagens com PBST, a membrana foi incubada com
anticorpo secundário conjugado com peroxidase (Amersham Biosciences) (1:5000) por
1 h a temperatura ambiente. As bandas foram reveladas por reação de
quimioluminescência (ECL plus, from Amersham Biosciences). O filme foi escaneado
com um densitômetro GS-700 (Bio-Rad, Hercules, CA) e a análise quantitativa foi
realisada usando o Multi-Analyst software (Bio-Rad).
3.6 Imunofluorescência
A imunofluorescência foi realizada como descrito (Leite et al. 2003; Echevarria et al.
2003). As células foram fixadas com paraformaldeído 4% em PBS por 10 min, e
lavadas três vezes com PBS. As células foram incubadas em uma solução de bloqueio
(PBS contendo 1% BSA, 0.5% triton, 5% soro de cabra) por 1 h. Após o bloqueio, as
células foram incubadas por 12 horas em PBS 1% BSA contendo um dos seguintes
anticorpos primários: c-met monoclonal (1:50) (Upstate, Charlottesville, USA) e anti
PLCγ monoclonal (BD Pharmingen, CA, USA) (1:100) à 4
o
C. As células foram lavadas
três vezes em PBS e incubadas por 1 h em PBS 1% BSA contendo anticorpo secundário
conjugado Alexa 488 (1:500). Controles negativos foram incubados apenas com
anticorpo secundário. As células foram lavadas três vezes, e as lamínulas foram
montadas usando solução de montagem antifade. Imagens de imunofluorescência foram
obtidas em microscópio confocal Zeiss LSM 510 meta usando a objetiva de imersão a
óleo com aumento de 63X (1,4 AN). Foi usando o laser argon 488 nm para excitar, e a
emissão foi coletada entre 505 and 530 nm. As imagens das imunofluorescência foram
adquiridas mantendo-se um íris sempre inferior a um micromêtro.
20
Materiais e Métodos Dawidson A. Gomes
3.7 Detecção do aumento de Ca
2+
citosólico
Na detecção do aumento de Ca
2+
citosólico usou-se o fluo-4 aceto-metil-éster (Fluo/4
AM). Quarenta e oito horas após as células terem sido plaqueadas ou transfectadas, as
mesmas foram incubadas com a solução salina de HEPES tamponada (SSHT) 6 µM de
fluo-4/AM durante 30 min (37ºC). Em seguida as células foram transferidas para uma
câmara de perfusão acoplada a um microscópio Zeiss (Axiovert 200). As imagens e as
medidas da fluorescência das células foram obtidas com o sistema a laser confocal
(Zeiss LSM 510 META) utilizando-se uma objetiva de imersão em água (63X, 1,2 AN)
acoplada ao microscópio Zeiss. As células foram excitadas com 488 nm e a intensidade
de emissão da fluorescência acima de 515 nm foi coletada utilizando-se a modalidade
de decurso temporal. Em todos os experimentos, cada célula foi analisada
individualmente e utilizada como seu próprio controle (Kushmerick et al, 1999).
As células marcadas com fluo-4/AM foram inicialmente perfundidas com SSHT
até o estabelecimento de uma linha de base. Em seguida as células foram perfundidas
por 1 min com SSHT contendo 100 ng/mL de HGF por 7 minutos ou 5 nM de AVP por
2 minutos. As imagens foram analisadas e processadas utilizando os seguintes
softwares: LSM 510, Windows Excel, Prism 4.0, Image J 3.2, Sigma Plot 9.1 e Adobe
Photoshop CS2.
3.8 Análise Estatística
Todos os dados apresentados representam pelo menos três experimentos independentes
e foram expressos pela média ± erro padrão da média (EPM). A análise estatística foi
realizada com o Programa PRISM statistical software (GraphPad, San Diego, CA). Os
grupos de dados foram comparados usando one-way ANOVA. Valores de p<0.05 foram
considerados estatisticamente significantes.
21
Resultados Dawidson A. Gomes
4. Resultados
22
Resultados Dawidson A. Gomes
1. Expressão e localização das construções de parvalbumina e
calretinina
.
Demonstrou-se anteriormente que a expressão da PV no núcleo ou citosol foi capaz de
atenuar tanto o aumento de Ca
2+
induzido por ATP quanto aquele induzido por EGF
nestes compartimentos subcelulares (Pusl et al. 2002). Anteriormente, foram descritas
construções de PV fundidas a GFP. Embora a GFP seja compatível com alguns
indicadores de Ca
2+
, ela pode interferir com o espectro dos indicadores de Ca
2+
(Bolsover et al. 2001). Desse modo as construções com PV foram otimizadas,
substituindo a GFP por DSR. Similarmente, CR foi fundida com a DSR e a sequências
de exclusão nuclear (NES) ou sequências de localização nuclear (NLS) com o objetivo
de direcioná-las tanto para o citosol quanto para o núcleo (Figura 5). A expressão da PV
e CR fusionadas com DSR foram confirmadas por expressão transiente em células
SkHep1. Devido ao fato das construções de PV e CR terem sido fundidas ao epítopo
Myc, os níveis relativos de expressão puderam ser comparados. As construções CR-
NLS-DSR, CR-NES-DSR, PV-NLS-DSR ou PV-NES-DSR quando transientemente
expressas, em células SkHep1, apresentaram seus corretos pesos moleculares (Figura
5B). CR-NLS-DSR e PV-NLS-DSR foram expressos na mesma extensão (Figura 5B).
CR-NES-DSR e PV-NES-DSR foram semelhantemente expressos quando comparados
com as construções de PV e CR, fundidas às sequências de localização nuclear (Figura
5B).
Para confirmar a localização subcelular das construções de PV e CR fundidas ao
DSR, células SkHep1 foram transientemente transfectadas com as construções CR-
NES-DSR e CR-NLS-DSR. Como esperado, o vetor controle que expressa somente
DSR foi expresso tanto no núcleo quanto no citosol (Figura 6A). Marcação nuclear com
23
Resultados Dawidson A. Gomes
TO-PRO-3 confirmou que a construção CR-NES-DSR foi excluída do núcleo, quando
expressado em células SkHep1 (Figura 6B). Em contraste, CR-NLS-DSR foi
direcionada somente para o núcleo (Figura 6C). Similarmente, PV-NES-DSR também
se localizou no citosol, mas não no núcleo. Enquanto, a construção PV-NLS-DSR se
localizou no núcleo, mas não no citosol (Figuras 7A e 7B).
Figura 5: Representação esquemática e expressão da parvalbumina e calretinina
fusionadas com DSR. (A) Representação esquemática da PV e CR ligadas ao epítopo
myc e DSR. NLS representa a sequência de localização nuclear e NES representa a
sequência de exclusão nuclear. (B) Expressão das construções de PV e CR em células
SkHep1 foram detectadas usando anticorpos anti-myc. O painel inferior representa o
imunoblot anti-actina, usado como controle para normalizar a relativa expressão dos
níveis de PV e CR. Dados representativos de três experimentos.
24
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 6. Localização subcelular das construções de calretinina. Células SkHep1
foram transientemente transfectadas tanto com os vetores de expressão (A) controle
DSR, (B) CR-NES-DSR ou (C) CR-NLS-DSR. As células foram então examinadas por
microscopia confocal. As proteínas calretina fundidas a DSR ligadas tanto a NLS
quanto a NES localizam-se no núcleo ou citosol, respectivamente (vermelho).
Localização nuclear foi confirmada com o marcador nuclear específico TO-PRO-3
(Azul). Imagem representativa de quatro experimentos. Barra = 10 µm
25
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 7. Localização subcelular das construções de parvalbumina. Células SkHep1
foram transientemente transfectadas tanto com os vetores de expressão (A) PV-NES-
DSR ou (B) PV-NLS-DSR como indicadas e então examinadas por microscopia
confocal. As proteínas PV fundidas ao DSR ligadas a NLS ou NES localizam-se no
núcleo ou citosol, respectivamente (vermelho). Localização nuclear foi confirmada com
o marcador nuclear específico TO-PRO-3 (Azul). Imagem representativa de quatro
experimentos. Barra = 10 µm
26
Resultados Dawidson A. Gomes
2. Atenuação dos transientes de Ca
2+
pela expressão das construções de
calretinina e parvalbumina.
Foi determinado se o rápido aumento de Ca
2+
induzido por adenosina trifosfato
(ATP) pode ser atenuado pela expressão de CR. Expressão transiente da CR-NLS-DSR
em células SkHep1 não afetou o aumento de Ca
2+
induzido no citosol (Figura 8A e B).
Por outro lado, a construção CR-NLS-DSR atenuou o aumento de Ca
2+
no núcleo após
estimulação por ATP, quando comparado com células não transfectadas (Figura 8A e
B). O aumento de Ca
2+
induzido por ATP foi reduzido pela expressão de CR-NLS-DSR
de 426% para 253% no núcleo, quando comparado com o controle (Figura 8E). A
expressão de CR-NLS-DSR não mostrou diferença significativa na fluorescência do
fluo-4/AM no citosol (Figura 8E), demonstrando que o Ca
2+
citosólico não é afetado
pela expressão de CR no núcleo. Em contraste, a construção CR-NES-DSR não alterou
o aumento de Ca
2+
no núcleo após estimulação por ATP (Figura 8C e D), quando
comparado com células SkHep1 não transfectadas (Figuras 8C e D). Por outro lado,
CR-NES-DSR suprimiu o aumento de Ca
2+
induzido por ATP somente no citosol de
273% para 182% comparado com os níveis do controle (Figura 8C, D e F). Estes
resultados mostram que o aumento de Ca
2+
induzido por ATP é proveniente
principalmente do citosol.
Como a CR, a expressão da PV tampona Ca
2+
dependendo da localização
subcelular. Quando comparado com aumentos de Ca
2+
induzidos por ATP no citosol de
células SkHep1 não transfectadas (Figura 9A), a expressão de PV-NLS-DSR não afetou
o aumento de Ca
2+
no citosol (Figura 9B). Entretanto, PV-NLS-DSR (Figura 9B)
suprimiu o aumento de fluorescência no núcleo de células SkHep1 estimuladas com
ATP, quando comparadas com o controle (Figura 9A). A construção PV-NLS-DSR
27
Resultados Dawidson A. Gomes
inibiu significantemente o aumento do Ca
2+
núcleoplasmático induzido por ATP de
625% para 422% (Figura 9E). Como observado previamente, PV-NES-DSR não afetou
o aumento de Ca
2+
nuclear induzido por ATP quando comparado com células não
transfectadas (Figura 9C e D). Por outro lado, o aumento de Ca
2+
induzido por ATP foi
diminuído significantemente pela expressão da construção PV-NES-DSR de 366% para
193% (Figura 9F).
Estudos anteriores usando a sonda radiométrica fura-2 indicaram que a
expressão da PV não altera a concentração basal de Ca
2+
no citosol e no núcleo (Pusl et
al. 2002). Neste estudo foi também demonstrado que a fluorescência do fluo-4/AM não
é alterada pela expressão da PV ou CR (Tabela 1). Para examinar os efeitos da CR e PV
na cinética dos sinais de Ca
2+
, examinamos a taxa de aumento dos sinais de Ca
2+
em
células estimuladas com ATP. Em células controle, não transfectadas, o Ca
2+
aumentou
de 20% para 80% e atingiu o pico máximo de resposta em 5.1 ± 0.4 segundos no citosol
(n=30), semelhante ao que foi observado previamente em células epiteliais e neurônios
(Leite et al. 2002; Jacob et al. 2005). Desse modo o pico máximo de resposta foi
semelhante ao do núcleo, 5.2 ±0.3 segundos. No citosol a taxa de aumento da
fluorescência foi de 26.7 ± 3.1 unidades de fluorescência/segundos e de 60.6 ± 7.7
unidades/segundo no núcleo, provavelmente refletindo as maiores mundanças de
fluorescência observadas no núcleo (Thomas et al. 2000). Para explorar esta diferença,
normalizamos a taxa de aumento do Ca
2+
no núcleo ou citosol das células transfectadas
e das células não tranfectadas (Tabela 2). A taxa de aumento do Ca
2+
foi
significantemente diminuída no núcleo, mas não no citosol de células transfectadas com
as construções PV-NLS e CR-NLS. Estes achados demonstram que a PV e CR
tamponam a resposta de Ca
2+
no citosol e no núcleo. Esta observação reflete o fato de
que os sinais de Ca
2+
núcleoplasmáticos induzidos pela estimulação por ATP são
28
Resultados Dawidson A. Gomes
resultantes em parte, da difusão do Ca
2+
citosólico através dos poros nucleares para o
núcleoplasma (Fox et al. 1997). É importante ressaltar que as construções com NES
foram mais eficazes em atenuar o Ca
2+
citoplasmático do que o núcleoplasmático. Estes
dados demosntram que a PV e a CR direcionadas tanto para o núcleo quanto para o
citosol são efetivas no tamponamento do aumento de Ca
2+
desses compartimentos
subcelulares.
29
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 8. Supressão dos sinais de Ca
2+
em células SkHep1 por expressão de CR.
Células SkHep1 expressando CR foram marcadas com a sonda fluorescente para Ca
2+
,
fluo-4/AM, e subsequentemente estimuladas com 10 µM de ATP. As células foram
monitoradas em experimentos de decurso temporal através de microscopia confocal. (A)
Células não transfectadas e (B) transfectadas com CR-NLS-DSR. (C) Células não
transfectadas e (D) transfectadas com CR-NES-DSR. (E) Resumo dos dados obtidos em
células isoladas mostrados em (A) e (B). Os resultados mostram a percentagem de
aumento da fluorescência do fluo-4/AM induzido por ATP, em relação à linha de base,
e são representativos de no mínimo seis células não tranfectadas e tranfectadas com a
construção CR-NLS-DSR. (F) Resumo dos dados obtidos em células isoladas mostrados
em (C) e (D). Os resultados mostram a percentagem de aumento da fluorescência do
fluo-4/AM induzido por ATP, em relação à linha de base, e são representativos da
percentagem de no mínimo nove células não transfectadas e transfectadas com as
construção CR-NES-DSR. O asterisco representa p<0.05.
30
Resultados Dawidson A. Gomes
Tabela 1. Fluorescência da linha de base não é alterada em células expressando as
proteínas quelantes de Ca
2+
.
Os valores são representativos da média ± EPM de no mínimo seis células de cada
grupo. Nenhum dos valores do núcleo ou citoplasma de células transfectadas difere
significantemente daqueles obtidos em células não transfectadas.
31
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 9. Supressão dos sinais de Ca
2+
em células SkHep1 por expressão de
parvalbumina. Células SkHep1 expressando PV foram marcadas com a sonda
fluorescente para Ca
2+
, fluo-4/AM, e subsequentemente estimuladas com 10 µM de
ATP. As células foram monitoradas em experimentos de decurso temporal através de
microscopia confocal. (A) Células não transfectadas e (B) transfectadas com PV-NLS-
DSR. (C) Células não transfectadas e (D) transfectadas com PV-NES-DSR. (E) Resumo
dos dados obtidos em células isoladas mostrados em (A) e (B). Os resultados mostram a
percentagem de aumento da fluorescência do fluo-4/AM induzido por ATP, em relação
à linha de base, e são representativos de no mínimo quatro células não transfectadas e
transfectadas com a construção PV-NLS-DSR. (F) Resumo dos dados obtidos em
células isoladas mostrados em (C) e (D). Os resultados mostram a percentagem de
aumento da fluorescência do fluo-4/AM induzido por ATP, em relação à linha de base,
e são representativos de no mínimo sete células não transfectadas e transfectadas com a
construção PV-NES-DSR. O asterisco representa p<0.05.
32
Resultados Dawidson A. Gomes
Tabela 2. Efeito da parvalbumina e calretinina na sinalização do Ca
2+
A taxa de aumento (unidades de fluorescência/segundo) dos sinais de Ca
2+
foi
normalizada pelas taxas observadas em células controles, não transfectadas, presentes
no mesmo campo de visão das células transfectadas. Os valores são representativos da
média ± EPM de no mínimo seis células de cada grupo. O asterisco representa p<0.05.
33
Resultados Dawidson A. Gomes
3. Localização subcelular das construções de adenovírus de
parvalbumina-DSR.
Para maximizar a taxa de expressão transferimos as construções de PV para um sistema
de expressão adenoviral. Inicialmente testamos diferentes títulos virais para determinar
a concentração que induz a maior taxa de infecção com a menor toxicidade. Desse
modo na concentração de 200 MOI, 90% das células foram infectadas e nenhum efeito
tóxico foi observado. Assim, este título viral foi utilizado em todos os experimentos
subsequentes. Como podemos observar na figura 10, as construções apresentam a
distribuição celular esperada. A construção ad-PV-NLS-DSR é expressa unicamente no
núcleo e a construção ad-PV-NES-DSR é expressa somente no citosol das células
SkHep1. Usamos a construção ad-DSR como controle e como esperado o ad-DSR foi
expresso tanto no núcleo quanto no citosol.
Figura 10 Localização subcelular das construções de adenovírus de parvalbumina-
DSR. Células SkHep1 foram infectadas com 200 MOI por 48 horas com vetores
adenovirais para ad-PV-NLS-DSR, ad-PV NES-DSR ou com o vetor controle ad-DSR.
As construções apresentam a distribuição celular esperada. Ad-PV-NLS-DSR é
expresso unicamente no núcleo, ad-PV-NES-DSR somente no citosol e o ad-DSR é
expresso tanto no núcleo como no citosol. Imagem representativa de seis experimentos.
34
Resultados Dawidson A. Gomes
4. HGF fosforila endógeno c-met em células SkHep1.
Como discutido anteriormente, escolhemos o HGF para estimulação de SkHep1, pois
ele ativa a maquinaria responsável em gerar Ca
2+
nuclear. Inicialmente, testamos a
capacidade de HGF fosforilar o c-met endógeno em células SkHep1. A figura 11 mostra
que a fosforilação do c-met pelo HGF é dependente da concentração. A concentração de
100 ng/mL de HGF induziu a fosforilação máxima do c-met e esta concentração foi
escolhida para realizar todos os demais experimentos.
Figura 11. HGF fosforila c-met em células SkHep1. Células SkHep1 foram
estimuladas com 1, 10, 50, 100 e 200 ng/mL de HGF por 2 minutos. O painel superior
representa western blot usando anticorpo anti c-met fosforilado e o painel inferior
representa a quantificação de dois experimentos independentes. Os dados foram
normalizados em relação ao controle, células não estimuladas com HGF. Os valores são
representativos da média ± EPM de quatro experimentos.
35
Resultados Dawidson A. Gomes
5. Ad-PV-NES bloqueia a fosforilação de Erk 1.
Foi observado que fatores de crescimento induzem aumentos de Ca
2+
que contribuem
para a ativação de MAPKs (Pusl et al. 2002). Para estudarmos a função do Ca
2+
citosólico e nuclear na ativação de MAPKs utilizamos as construções de PV entregues
por adenovirus. Testamos inicialmente a fosforilação da MAPK Erk 1 e 2 induzida por
HGF. Lisados de células SkHep1 estimuladas com 100 ng/mL de HGF por 2, 4, 8, 16,
32 e 64 minutos foram submetidos a westerns utilizando anticorpos anti Erk 1 e 2
fosforilado e anti Erk 1, como controle. Como observado na Figura 12A, HGF induz
uma rápida fosforilação da Erk 1 e não foi observado fosforilação significativa de Erk 2.
Após 16 min ocorreu a fosforilação máxima induzida pelo HGF (Figura 12B). Para
investigar o efeito do Ca
2+
nuclear e citosólico na fosforilação de Erk 1, estimulou-se as
células SkHep1 durante 8 minutos com 100 ng/ml de HGF (após as células serem
infectadas com as construções ad-DSR, ad-PV-NES, ad-PV-NLS, ad-PV-NLS-CD por
48 horas). As amostras não infectadas e não estimuladas com HGF foram chamadas de
C- (controle negativo) e as amostras não infectadas e estimuladas com 100 ng/mL de
HGF foram nomeadas de C+ (controle positivo). A construção ad-PV-NES reduziu a
fosforilação de Erk 1 em 90.1 ±11% (P<0.05) (Figura 13A e B). As construções ad-PV-
NLS e ad-PV-NLS-CD reduziram a fosforilação de Erk 1 de 33.7 ±8.3% para 18.5
±8.4% (p>0.05), respectivamente (Figura 13A e B). Os resultados obtidos mostram que
a diminuição dos níveis de Ca
2+
citosólico pela construção ad-PV-NES causou bloqueio
quase que total da fosforilação de Erk 1. Por outro lado, a redução dos níveis de Ca
2+
do
núcleo levou à redução parcial da fosforilação de Erk 1.
36
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 12. HGF fosforila Erk 1. (A) Western blots foram realizados utilizando
anticorpos anti Erk 1/2 fosforilado (painel superior) e anti Erk 1 (painel inferior) em
células SkHep1 estimuladas com 100 ng/ml de HGF por 2, 4, 8, 16, 32 e 64 minutos. A
membrana do painel superior foi reincubada com o anticorpo anti Erk 1, após ser tratada
para a remoção do anticorpo anti Erk 1/2 fosforilado (B) Os resultados mostrados no
painel A foram quantificados por densitometria e os valores obtidos normalizados em
relação ao controle, células não estimuladas com HGF, e dividido por Erk 1 total. Dados
representativos de quatro experimentos.
37
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 13. Ad-PV-NES bloqueia a fosforilação de Erk 1 induzida por HGF. (A)
Western blots foram realizados utilizando anticorpos anti Erk 1/2 fosforilado (painel
superior) e anti Erk 1 (painel inferior). Células SkHep1, infectadas com as construções
ad-DSR, ad-PV-NES, ad-PV-NLS e PV-NLS-CD foram estimuladas com 100 ng/ml de
HGF por 8 minutos. As amostras não infectadas e não estimuladas com HGF foram
chamadas de C- e as amostras não infectadas e estimuladas com 100 ng/mL de HGF
foram nomeadas de C+. (B) Os resultados mostrados no painel A foram quantificados
por densitometria e os valores obtidos foram normalizados em relação ao controle,
células não estimuladas com HGF, e divididos por Erk 1 total. Os valores são
representativos da média ± EPM de três experimentos indepedentes.
38
Resultados Dawidson A. Gomes
6. PV-NES bloqueia a expressão de p38
Após investigar a função do Ca
2+
citosólico e nuclear na fosforilação de Erk 1
investigamos a MAPK p38. Para este experimento, as células SkHep1 foram infectadas
com as construções ad-DSR, ad-PV-NES, ad-PV-NLS, ad-PV-NLS-CD por 48 horas e
estimuladas com HGF por 8 minutos. Os lisados foram submetidos à westerns
utilizando anticorpos anti p38 e anti actina, como controle. As amostras não infectadas e
não estimuladas com HGF foram chamadas de C- (controle negativo) e as amostras não
infectadas e estimuladas com 100 ng/mL de HGF foram nomeadas de C+ (controle
positivo). Com o procedimento acima a construção ad-PV-NES bloqueou por completo
a expressão de p38 (Figura 14A e B). Observamos tambem que as construções ad-PV-
NLS e ad-PV-NLS-CD reduziram a expressão de p38 em 30.1 ±6.4% e 19.3 ±3.1%,
respectivamente (Figura 14A e B). Estes resultados mostram que diminuição dos níveis
de Ca
2+
citosólico pela construção ad-PV-NES bloqueia a expressão de p38.
39
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 14. Ad-PV-NES bloqueia a expressão de p38. (A) Western blots foram
realizados utilizando anticorpos anti p38 (painel superior) e anti actina (painel inferior).
Células SkHep1, infectadas com as construções ad-DSR, ad-PV-NES, ad-PV-NLS e
PV-NLS-CD foram estimuladas com 100 ng/ml de HGF por 8 minutos. As amostras
não infectadas e não estimuladas com HGF foram chamadas de C-. A amostra não
infectadas e estimuladas com 100 ng/mL de HGF foram nomeadas de C+. (B) Os
resultados mostrados no painel A foram quantificados por densitometria e os valores
obtidos foram normalizados em relação ao controle, células não estimuladas com HGF,
e divididas pela actina. Os valores são representativos da média ± EPM de quatro
experimentos.
40
Resultados Dawidson A. Gomes
7. PV-NLS diminui a fosforilação de CDK1
A ativação da CDK1 é importante para a transição da fase G2 do ciclo celular para a
mitose (Kramer et al. 2004; Nagy et al. 2000). Assim, estudamos o efeito do Ca
2+
citosólico e nuclear na fosforilação da CDK1. Para isto, células SkHep1 foram
infectadas com as construções ad-DSR, ad-PV-NES, ad-PV-NLS, ad-PV-NLS-CD
durante 48 horas. Os lisados foram submetidos à westerns utilizando anticorpos anti
CDK1 fosforilado e anti CDK1 total, como controle. O grupo controle representa as
amostras não infectadas. Verificamos que a construção ad-PV-NES bloqueou a
fosforilação de CDK1 em 15 ±5% (Figura 15A e B). As construções ad-PV-NLS e ad-
PV-NLS-CD reduziram a fosforilação de CDK1 em 92 ±4% e 68 ±6% (p<0.05),
respectivamente (Figura 15A e B). Estes resultados mostram que a diminuição dos
níveis de Ca
2+
nuclear pela construção ad-PV-NLS reduz a fosforilação da CDK1,
sugerindo que o Ca
2+
nuclear pode ter uma função importante na regulação do ciclo
celular. Experimentos em colaboração com a estudante Michele Angela Rodrigues
(Yale University) mostram como o Ca
2+
nuclear está envolvido na regulação do ciclo
celular (dados ainda não publicados).
41
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 15. Ad-PV-NLS bloqueia a fosforilação de CDK1. (A) Western blots foram
realizados utilizando anticorpos anti CDK1 fosforilado (painel superior) e anti CDK1
total (painel inferior). Células SkHep1 foram infectadas com as construções ad-DSR,
ad-PV-NES, ad-PV-NLS e PV-NLS-CD. As amostras não infectadas foram chamadas
de Controle. (B) Os resultados mostrados no painel A foram quantificados por
densitometria e os valores obtidos foram normalizados em relação ao controle, células
não infectadas, e divididos pelos níveis de CDK1 total. Os valores são representativos
da média ± EPM de três experimentos indepedentes. O asterisco representa p<0.05.
42
Resultados Dawidson A. Gomes
8. O receptor de HGF (c-met) transloca-se para o núcleo de células
SkHep1.
Após investigarmos algumas proteínas que podem ser reguladas pelo Ca
2+
nuclear e
citosólico, estudamos as vias intracelulares que levam à geração de Ca
2+
nuclear.
Inicialmente, investigamos se c-met é capaz de translocar para o núcleo. Nossa hipótese
é que c-met possa ativar PLCγ nuclear. Para testar esta hipótese primeiramente
realizamos westerns das frações citosólicas e nucleares de células SkHep1 estimuladas
por tempos crescentes com 100 ng/mL de HGF. Na figura 16A, c-met somente foi
observado no citosol de células SkHep1 não estimuladas. Em contraste, após
estimulação com 100 ng/mL de HGF c-met pode ser encontrado em frações nucleares
mesmo após 1 minuto de estimulação (Figura 16A, B e C). O pico máximo de
translocação e fosforilação acontece após 4 minutos de estimulação com HGF (Figura
16B e C). Anticorpos anti Na
+
/K
+
ATPase e Lamina B foram usados como controles das
frações citosólicas e nucleares, respectivamente (Figura 16A). Para comprovar a
translocação de c-met para o núcleo também realizamos imunofluorescência de células
SkHep1 antes e após 4 minutos de estimulação com 100 ng/mL de HGF (Figura 17A e
B). Após 4 minutos de estimulação observamos c-met no núcleo de celulas SkHep1
(Figura 17B). Em conjunto estes resultados mostram que c-met transloca-se para o
núcleo de células SkHep1.
43
Resultados Dawidson A. Gomes
44
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 16. Tratamento com HGF induz translocação de c-met para o núcleo de
células SkHep1. (A) Análises de western blot para c-met, c-met fosforilado, Na
+
/K
+
ATPase (controle citosólico) e anti-lamina B (controle nuclear) de frações citosólicas
(Cit.) e de núcleos isolados (Núc.) de células SkHep1 estimuladas por períodos
crescentes de tempo com 100 ng/mL de HGF. (B) Os dados obtidos para c-met foram
analisados por densitometria e normalizados em relação às frações citosólicas de células
não estimuladas. (C) Os dados obtidos utilizando anticorpo anti c-met fosforilado foram
analisados por densitometria e normalizados em relação às frações citosólicas de células
não estimuladas. Os blots são representativos de quatro experimentos independentes.
45
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 17. Receptor c-met transloca para o núcleo de células SkHep1.
Reconstruções tridimensionais de imunofluorescências realizadas em células SkHep1
utilizando anticorpo anti c-met conjugado com alexa 488 (em verde) e Hoechst (em
azul), indicando o núcleo. As reconstruções tridimensionais foram realizadas no
software LSM 510 (Zeiss) e microscopia de dois fótons foi utilizada para excitar
Hoechst a 380 nm. O painel A representa células SkHep1 não estimuladas e o painel B
células estimuladas com 100 ng/mL de HGF por 4 minutos. As interseções entre as
linhas verdes e vermelhas representam o interior dos núcleos de células SkHep1.
Imagens representativas de três experimentos independentes.
46
Resultados Dawidson A. Gomes
9. PLCγ localiza-se no núcleo de células SkHep1.
Em seguida exploramos a possibilidade de que PLCγ estar no núcleo de células
SkHep1. O domínio C terminal da subunidade β do c-met contém dois sítios de ligação
à tirosina que sob autofosforilação liga-se a múltiplas proteínas que contêm domínios
SH2 (Gual et al. 2000). A PLCγ é uma das proteínas que contém o domínio SH2 e tanto
a interação entre PLCγ quanto sua fosforilação por c-met já foram relatados (Gual et al.
2000; Ponzetto et al. 1994; Okano et al. 1993). Como demostrado, c-met transloca-se
para o núcleo de células SkHep1 e a ativação de PLCγ presente no núcleo por c-met
pode ser uma nova via de geração de InsP
3
nuclear. Para testarmos está hipótese
realizamos análises de western blots para PLCγ, Na
+
/K
+
ATPase (controle citosólico),
anti-lamina B (controle nuclear) de frações citosólicas (Cit.) e de núcleos isolados
(Núc.) de células SkHep1. A figura 18A mostra que PLCγ está presente no citosol e no
núcleo de células SkHep1. Para comprovar a presença de PLCγ no núcleo destas células
realizamos imunofluorescências utilizando anticorpo anti PLCγ conjugado com alexa
488 (em verde) e Topro-3 (em azul) indicando o núcleo (Figura 18B). A
imunofluorescência comprova que PLCγ está no núcleo de células SkHep1, como
indicado pelas setas. Desse modo c-met transloca-se para o núcleo sugerindo, portanto
uma nova via de ativação de Ca
2+
nuclear. Em seguida exploramos a possibilidade de
HGF gerar InsP
3
nuclear. Para estudarmos esta via intracelular, construções que podem
quelar InsP
3
tanto no citosol quanto no núcleo foram utilizadas.
47
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 18. PLCγ localiza-se no núcleo de células SkHep1. (A) Análises de western
blot para PLCγ, Na
+
/K
+
ATPase (controle citosólico), anti-lamina B (controle nuclear)
de frações citosólicas (Cit.) e de núcleos isolados (Núc.) de células SkHep1 não
estimuladas. (B) Imunofluorescência realizada em células SkHep1 utilizando anticorpo
anti PLCγ conjugado com alexa 488 (em verde) e Topro-3 (em azul) indicando o
núcleo. Setas indicam a presença de PLCγ no núcleo. Fatias ópticas de 0.5 micrômetros
foram realizadas tanto para PLCγ quanto para o Topro-3. Imagem representativa de
quatro experimentos.
48
Resultados Dawidson A. Gomes
10. Localização das construções de InsP
3
Sponge.
Foi demostrado que HGF aumenta Ca
2+
primeiro no núcleo de células SkHep1 e que
caged InsP
3
quando liberado dentro do núcleo de células induz a liberação de Ca
2+
pelo
retículo nucleoplasmático (Echevarria et al. 2003). Porém, as vias que levam à geração
de InsP
3
dentro do núcleo ainda são matéria de expeculação. Para estudarmos esta
questão foram geradas construções que podem quelar InsP
3
tanto no núcleo quanto no
citosol. Foi demostrado que o sítio de ligação ao InsP
3
do receptor de InsP
3
R (resíduos
224-605) foi efetivo em atenuar os sinais de Ca
2+
citosólicos induzidos por ATP em
células HEK 293 e COS-7 (Varnai et al. 2002; Uchiyama et al. 2002). A construção
InsP
3
R
224-605
fundida a proteína fluorescentes vermelha monomerica (mRFP) foi
gentilmente fornecida pelo Dr. Tamas Balla (Varnai et al. 2002; Lin et al. 2005).
Similarmente ao que foi feito com as construções de PV e CR, mRFP-InsP
3
R
224-605
foi
fundida a sequências de exclusão nuclear (NES) ou sequências de localização nuclear
(NLS) no contexto de direcioná-las tanto para o citosol quanto para o núcleo,
respectivamente. A construção mRFP-InsP
3
R
224-605
fusionadas a NES ou NLS foram
denominadas InsP
3
Sponge NES e InsP
3
Sponge NLS, consecutivamente (Figura 19).
Figura 19: Representação esquemática das construções de InsP
3
Sponge fusionadas
a mRFP. NLS representa a sequência de localização nuclear e NES representa a
sequência de exclusão nuclear.
49
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 20. Localização subcelular das construções de InsP
3
Sponge. Células
SkHep1 foram transientemente transfectadas tanto com os vetores de expressão (A)
controle mRFP, (B) InsP
3
Sponge-NES ou (C) InsP
3
Sponge-NLS conforme indicado e
então examinadas por microscopia confocal. Os InsP
3
Sponges fundidos a mRFP e
ligados a NLS ou NES localizam-se no núcleo ou citosol, respectivamente (vermelho).
A localização nuclear foi confirmada com o marcador nuclear específico Hoescht
(Azul). Imagem representativa de 4 experimentos.
50
Resultados Dawidson A. Gomes
11. InsP
3
Sponge NLS suprime aumentos de Ca
2+
induzidos por HGF
Estudamos se aumento de Ca
2+
induzido por arginina vasopressina (AVP) ou HGF pode
ser suprimido pela expressão de InsP
3
Sponge. Estes experimentos foram realizados
para demostrar se o aumento de Ca
2+
induzido por HGF se deve à formação de InsP
3
nuclear. Observamos que a expressão transiente da InsP
3
Sponge NLS em células
SkHep1 não afetou significativamente o aumento de Ca
2+
induzido no citosol ou núcleo
após estimulação com 5 nM de AVP (Figura 21A, B). Comparando com o controle,
InsP
3
Sponge NLS reduziu o aumento de Ca
2+
induzido por AVP de 402 ±33% para 373
±31% (p>0.05) no citosol (Figura 21E) e de 525 ±26% para 426 ±44% (p>0.05) no
núcleo (Figura 21F). Em contraste, InsP
3
Sponge NES suprimiu o aumento de Ca
2+
induzido por AVP no citosol e núcleo (Figura 21C e D). As quantifições destes dados
demonstraram que InsP
3
Sponge NES reduz significantivamente o aumento da
fluorescência do fluo-4/AM no citosol de 386 ±52% para 134 ±16% (p<0.05) e no
núcleo de 453 ±77% para 125 ±20% (p<0.05) comparado aos níveis do controle (Figura
21F). Estes resultados demonstram que o aumento de Ca
2+
induzido por AVP é
primariamente gerado no citosol, pois a expressão de InsP
3
Sponge NES bloqueia a
resposta induzida por AVP tanto no citosol quanto no núcleo. A resposta de Ca
2+
induzida por AVP observada por expressão de InsP
3
Sponge NLS é um indicativo de
que o Ca
2+
observado no núcleo é devido à difusão do Ca
2+
citosólico.
Por outro lado, estimulando as células SkHep1 com 100 ng/mL de HGF, a
expressão de InsP
3
Sponge NES não afetou o aumento de Ca
2+
no citosol e no núcleo
(Figura 22C e D). Quantificações destes resultados demonstraram que InsP
3
Sponge
NES reduziu o aumento da fluorescência do fluo-4/AM induzido por HGF de 252 ±22%
para 248 ±3% (p>0.05) no núcleo (Figura 22E), porém aumentou de 227 ±11% para 253
51
Resultados Dawidson A. Gomes
±33% (p>0.05) no núcleo (Figura 22F), quando comparado ao controle. Em constraste,
a expressão de InsP
3
Sponge NLS suprimiu o aumento de Ca
2+
induzido por HGF no
núcleo e citosol (Figura 22B), quando comparado com células SkHep1 não
transfectadas (Figura 22A). O aumento em Ca
2+
núcleoplasmático induzido por HGF foi
significativamente reduzido de 230 ± 18% para 115 ±15% (p<0.05) em células SkHep1
expressando InsP
3
Sponge NLS (Figura 22E). A construção InsP
3
Sponge NLS reduziu
o aumento de Ca
2+
induzido por HGF no citosol de 248 ± 26% para 108 ± 8%,
comparado com células não transfectadas. Estes resultados demonstram que o aumento
de Ca
2+
induzido por HGF em contraste com os resultados obtidos pelo AVP são
principalmente gerados no núcleo, pois a expressão de InsP
3
Sponge NLS bloqueou a
resposta induzida por HGF tanto no núcleo quanto no citosol. A resposta de Ca
2+
induzida por HGF observada por expressão de InsP
3
Sponge NES é um indicativo de
que o Ca
2+
observado no citosol é devido à difusão do Ca
2+
nuclear. Em conjunto, estes
resultados sugerem que alguns agonistas como AVP podem gerar Ca
2+
no citosol,
enquanto outros como HGF podem gerar Ca
2+
principalmente no núcleo.
52
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 21. InsP
3
Sponge NES suprime aumento de Ca
2+
induzido por AVP. Células
SkHep1 expressando InsP
3
Sponge foram marcadas com a sonda fluorescente para Ca
2+
,
fluo-4/AM, e subsequentemente estimuladas com 5 nM de AVP. As células foram
monitoradas através de experimentos de decurso temporal por microscópia confocal.
(A) Células não transfectadas e (B) transfectadas com InsP
3
Sponge NLS. (C) Células
não transfectadas e (D) transfectadas com InsP
3
Sponge NES. (E) Resumo dos dados de
células isoladas representadas em (A) e (B). Os resultados mostram a percentagem de
aumento da fluorescência do fluo-4/AM induzido por AVP, em relação à linha de base,
e são representativos de no mínimo 6 células não transfectadas e transfectadas com
InsP
3
Sponge NLS. (F) Resumo dos dados obtidos em células isoladas representadas em
(C) e (D). Os resultados mostram a percentagem de aumento da fluorescência do fluo-
4/AM induzido por AVP, em relação à linha de base, e são representativos de no
mínimo 6 células não transfectadas e transfectadas com com InsP
3
Sponge NES. O
asterisco representa p<0.05.
53
Resultados Dawidson A. Gomes
Figura 22. InsP
3
Sponge NLS suprime aumento de Ca
2+
induzido por HGF. Células
SkHep1 expressando InsP
3
Sponge foram marcadas com a sonda fluorescente para Ca
2+
,
fluo-4/AM, e subsequentemente estimuladas com 100 ng/mL de HGF. As células foram
monitoradas através de experimentos de decurso temporal por microscópia confocal.
(A) Células não transfectadas e (B) transfectadas com InsP
3
Sponge NLS. (C) Células
não transfectadas e (D) transfectadas com InsP
3
Sponge NES. (E) Resumo dos dados de
células isoladas mostradas em (A) e (B). Os resultados mostram a percentagem de
aumento da fluorescência do fluo-4/AM induzido por HFG, em relação à linha de base,
e são representativos de no mínimo 7 células não transfectadas e transfectadas com com
InsP
3
Sponge NLS. (F) Resumo dos dados de células isoladas mostradas em (C) e (D).
Os resultados mostram a percentagem de aumento da fluorescência do fluo-4/AM
induzido por HGF, em relação à linha de base, é são representativos de no mínimo 8
células não transfectadas e transfectadas com InsP
3
Sponge NES. O asterisco representa
p<0.05.
54
Discussão e Conclusões Dawidson A. Gomes
5. Discussão e Conclusões
55
Discussão e Conclusões Dawidson A. Gomes
O Ca
2+
citosólico é um sinal altamente versátil e que pode regular muitos
processos celulares (Berridge et al. 2003). Os sinais de Ca
2+
também podem ser gerados
em diversos compartimentos celulares incluíndo o núcleoplasma (Gerasimenko et al.
1995; Echevarria et al. 2003; Leite et al. 2003). Resultados experimentais fornecem
evidências funcionais de que InsP
3
pode liberar Ca
2+
através de InsP
3
Rs presente no
retículo endoplasmático. Apesar das inúmeras publicações nesta área os mecanismos
que levam a sinalização de Ca
2+
nuclear ainda continuam controversos.
A maioria dos experimentos descritos para explorar a sinalização de Ca
2+
nuclear foram realizados com indicadores fluorescentes adicionados em células
permermeabilizadas ou injetados diretamente em núcleos isolados (Carafoli et al. 1997).
Como alternativa para estas metodologias, demonstramos inicialmente que a expressão
de PV no núcleo ou citosol reduzia nestes compartimentos subcelulares, o aumento de
Ca
2+
induzido por agonistas (Pusl et al. 2002; Thompson et al. 2003). Os resultados
apresentados aqui, extendem estas nossas observações anteriores mostrando que a CR,
proteína que se liga ao Ca
2+
, pode também ser direcionada seletivamente para o núcleo
ou citosol e subsequentemente atenuar a sinalização de Ca
2+
especificamente nestes
compartimentos subcelulares. Estes achados demonstram a generalidade da expressão
das proteínas que se ligam ao Ca
2+
como ferramentas para seletivamente tamponar a
sinalização de Ca
2+
em compartimentos subcelulares.
A CR apresenta propriedades de ligação ao Ca
2+
que são distintas daquelas da
PV. Desse modo, a CR apresenta cinco domínios de ligação ao Ca
2+
funcionais
enquanto a PV contém dois (Schwaller et al. 2002). Além disso, CR não se liga a Mg
2+
(Schwaller et al. 2002). Estas propriedades únicas de ligação ao Ca
2+
provavelmente
tornam a CR um supressor mais potente da sinalização de Ca
2+
quando comparada a
PV. Porém, quando PV e CR foram expressas em níveis comparavéis em células
56
Discussão e Conclusões Dawidson A. Gomes
SkHep1 observamos que, quando expressas no núcleo, a PV e a CR foram similarmente
efetivas na supressão dos aumentos de Ca
2+
induzidos por ATP. Resultados
semelhantess foram obtidos quando a PV e CR foram direcionadas para o citoplasma.
Nossos resultados foram similares aos obtidos em oócitos de Xenopus, onde foi
demonstrado que a PV comporta-se de maneira semelhante a CR (Dargan et al. 2004).
O aprimoramento das construções testadas neste trabalho, em relação aquelas
previamente publicadas pelo nosso grupo, reflete-se no fato de que as proteínas foram
fusionadas ao DSR ao invés de GFP. A utilização dessa estratégia tem a vantagem de
evitar possíveis incompatibilidades com o espectro de emissão e excitação da GFP com
indicadores de Ca
2+
, tais como fura-2 e fluo-4/AM (Bolsover et al. 2001). Desse modo
as construções utilizadas são mais compatíveis com uma ampla gama de indicadores de
Ca
2+
. Além disso, aprimoraramos as construções de PV através da utilização de infecção
viral (adenovírus) ao invés de transfecções transientes. Adenovírus são largamente
usados e sendo vírus de dupla fita de DNA podem aceitar fragmentos de até 7Kb. Desse
modo permite a produção de altos títulos virais atingindo altas taxas de infecção mesmo
em células que não estão em divisão. A expressão é transiente como uma consequência
de raras integrações no genoma do hospedeiro e integrações extracromossomais. Uma
das grandes vantagens dos sistemas adenovirais é a possibilidade de infecção de tecidos
em cultura ou de animais vivos. As desvantagens incluem respostas inflamatórias e
imunes do hospedeiro (revisado em Partridge and Oreffo 2004).
Após a caracterização das construções de PV e CR na cinética da sinalização de
Ca
2+
em células SkHep1 estudamos vias intracelulares que poderiam ser afetadas pelas
construções de PV direcionadas para o núcleo ou citosol. Como demonstramos a
construção PV-NES bloqueou a fosforilação de Erk 1 e a tradução de p38. Alguns
artigos descrevem que a via Ras-Erk pode ser modulada por proteínas que se ligam à
57
Discussão e Conclusões Dawidson A. Gomes
calmodulina. Em células PC12 ou neurônios ativação prolongada da via Ras-Erk induz
parada do crescimento celular ligada à sobrevivência e diferenciação. Em contraste, em
outros tipos celulares tais como fibroblastos ou queratinócitos, uma ativação prolongada
da via Ras-Erk leva a uma parada do ciclo celular ligado a senescência ou apoptose.
Nestas células, Ca
2+
e calmodulina tem nítido efeito inibitório na ativação da via de Erk
(revisado em Agell et al. 2002). Por outro lado, como o Ca
2+
pode modular a transcrição
ou tradução da p38 ainda é materia de especulação.
Resultados do laboratório de Lucio Cocco sugerem que Erk fosforila PLCβ
nuclear (Cocco et al. 2002; Martelli et al. 2000; Martelli et al. 1999). Os nossos
resultados mostram que o Ca
2+
citosólico é importante modulador da fosforilação destas
MAPKs. Em conjunto estes resultados sugerem que as ErKs podem contribuir para a
modulação ou geração do Ca
2+
nuclear, mas como estas MAPKs parecem ser
dependentes do Ca
2+
citosólico, elas não podem ser responsáveis pela geração de Ca
2+
nuclear independente do Ca
2+
citosólico.
É sabido que células eurarióticas requerem Ca
2+
extracelular para crescer e
proliferar em cultura. Balk, em 1971, reportou que a proliferação de fibroblatos é
estritamente dependente da concentração extracelular de Ca
2+
. Estas células tornaram-se
quiescentes se mantidas em meio deficiente de Ca
2+
por três dias, mesmo na presença de
fatores de crescimento. Quando adiciou-se quantidades fisiológicas de Ca
2+
nas culturas
celulares, a síntese de DNA retornou dentro de algumas horas, seguida por divisão
celular (Balk et al. 1973). Observações semelhantes foram descritas também em
fibroblastos humanos (Boynton et al. 1977; Hazelton et al. 1979; Tupper et al. 1980;
Takuwa et al. 1993), de camundongo (MacManus et al. 1975; Nicholson et al. 1984;
Takuwa et al. 1991) e em outros tipos de células (Whitfield et al. 1980; Veigl et al.
1984; Boynton 1988; Gardner 1989), excetuando células da paratireóde (Sakaguchi
58
Discussão e Conclusões Dawidson A. Gomes
1992) e querationócitos (Hennings and Holbrook 1982). Dulbecco e Elkington (1975)
demonstraram que entre os componentes dos meios de cultura celular, somente o CaCl
2
induz replicação de DNA em células 3T3 de camundongos Balb/c inibidas por contato.
Esses autores também encontraram que em cultivos prolongados destas células na
presença de suprafisiológica de CaCl
2
(5.4 mM) por 6 dias resultou em alterações na
morfologia e densidade celulares saturantes (Dulbecco and Elkington 1975).
Mais de 50 anos se passaram desde que Howard e Pele descreveram o ciclo
celular e suas fases. Todavia, somente estudos recentes revelaram que o ciclo celular é
um evento altamente conservado e ordenado (Golias et al. 2004). O ciclo celular em
células eucarióticas consiste em quatro fases: G1, S, G2 and M. O DNA é replicado
durante a fase S, onde as histonas necessárias para a nova cromatina são síntetizadas
durante a fase G1. Outras proteínas são também sintetizadas na fase G1, e sua síntese
continua aumentando durante a fase G2, aumentando significantemente a massa celular.
No final da fase G2 as células progridem para a fase M. Os atores principais na
inicialização e progressão do ciclo celular são as quinases do ciclo celular (CDK’s) as
quais se tornam ativadas por associação com as ciclinas. Várias ciclinas são sintetizadas
e degradadas em fases específicas do ciclo celular. Ciclinas C, D, e E, são essenciais
para a progressão do ciclo celular na fase S, e são sintetizadas durante a fase G1. As
ciclinas A e B essenciais para a entrada na mitose são sintetizadas durante a fase G2. Os
mecanismos que levam a ativação das CDK’s não são completamente entendidos.
Sugeriu-se que segundos mensageiros regulam as cascatas de proteínas quinases que
podem eventualmente resultar em sua ativação. Entre os segundos mensageiros o Ca
2+
parece ter importância especial (revisado por Santella 1998).
Estudos realizados em nosso laboratório pela estudante Michele Rodrigues
demonstram que células SkHep1 infectadas com PV-NLS perdem a capacidade de
59
Discussão e Conclusões Dawidson A. Gomes
multiplicar. Não se observou este efeito em células infectadas com PV-NES. Células
SkHep1 param de multiplicar-se exatamente no início da prófase, pois as células
perdem a capacidade de dividir os centrossomos (dados ainda não publicados). Em
conjunto estes resultados mostram que realmente o Ca
2+
nuclear é um importante
regulador do ciclo celular.
Após explorar algumas vias intracelulares que podem ser moduladas pelo o Ca
2+
nuclear e citosólico também estudamos vias que podem ser responsáveis pela a geração
do Ca
2+
nuclear. O domínio C terminal da subunidade β do c-met contém dois sítios de
ligação à tirosina o qual sob autofosforilação liga-se a múltiplas proteínas que contém
domínios SH2 (Gual et al. 2000). A PLCγ é uma das proteínas que contém o domínio
SH2 e tanto a interação entre PLCγ quanto sua fosforilação por c-met foi relatado (Gual
et al. 2000; Ponzetto et al. 1994; Okano et al. 1993). A nossa hipótese é que c-met ativa
diretamente PLCγ presente no núcleo levando à hidrólise de PIP
2
, formação InsP
3
e
consequentemente liberação de Ca
2+
do retículo núcleoplasmático para o interior do
núcleoplama através dos InsP
3
Rs. Corroborando nossa hipótese, observamos que c-met
pode translocar-se para o núcleo de maneira rápida e capaz de gerar Ca
2+
no núcleo. O
pico de translocação de c-met para o núcleo ocorre em torno de 4 minutos e o pico da
resposta de Ca
2+
induzida por HGF é observado após 5 minutos. Análises de western
blots e imunofluorescência também identificaram a presença de PLCγ no núcleo de
células SkHep1. Em conjunto, estes resultados suportam a idéia que c-met possa vir a
ativar PLCγ presente no envelope nuclear, e assim gerar InsP
3
no nucleoplasma, com
conseqüente aumento de Ca
2+
nuclear.
Exploramos também a hipótese de HGF gerar InsP
3
no nucleoplasma de células
SkHep1. Para isso, produzimos construções que quelam InsP
3
no citosol ou núcleo.
Assim, células SkHep1 foram transfectadas transientemente por 48h com as construções
60
Discussão e Conclusões Dawidson A. Gomes
de InsP
3
Sponge e a resposta de Ca
2+
induzida por AVP ou HGF foram comparadas e
analisadas. A construção InsP
3
Sponge NES praticamente aboliu a resposta de Ca
2+
induzida por AVP tanto no núcleo quanto no citosol de células SkHep1. Por outro lado,
nenhuma redução do Ca
2+
citosólico ou nuclear foi observado em células estimuladas
com HGF. Estes resultados mostram que AVP gera InsP
3
principalmente no citosol. Em
contranste, a construção InsP
3
Sponge NLS reduz drásticamente a resposta de Ca
2+
induzida por HGF, tanto no núcleo quanto no citosol. No entanto, a resposta de Ca
2+
induzida por AVP, tanto no citosol quanto no núcleo, não foi alterada pela construção
InsP
3
Sponge NLS. Nossos resultados são pioneiros, ao demonstrarmos que HGF gera
InsP
3
principalmente no núcleo de celular, com conseqüente aumento de Ca
2+
nuclear.
Este aumento de Ca
2+
no nucleoplasma difere do aumento de Ca
2+
nuclear observado
após estimulação com AVP, cujo Ca
2+
é proveniente da difusão do Ca
2+
citoplasmático.
Em conjunto, nossos dados mostram que o HGF pode produzir InsP
3
e
consequentemente Ca
2+
no núcleo de células SkHep1.
Com estas evidências experimentais iremos agora explorar com mais detalhes
como c-met está envolvido na geração de InsP
3
e Ca
2+
no núcleo de células SkHep1.
Posteriormente, estudaremos se estes mecanismos existem em outros modelos celulares.
Atualmente estamos desenvolvendo c-met em fusão com GFP. Esperamos com esta
construção observar a translocação de c-met em tempo real após estimulação com HGF.
Apesar da interação entre PLCγ e c-met ter sido observado anteriormente,
planejamos realizar algumas coimunoprecipitações para demonstrarmos esta interação
nas frações nucleares (Gual et al. 2000; Ponzetto et al. 1994; Okano et al. 1993).
Planejando também produzir siRNAs para a proteína Gab1 que pode ser a responsável
por levar c-met para o núcleo. Se a translocação de c-met for bloqueada pelo
knockdown de Gab1 demonstraremos experimentalmente que a geração de Ca
2+
no
61
Discussão e Conclusões Dawidson A. Gomes
núcleo realmente dependente da translocação de c-met. Iremos também realizar
coimunoprecipitações de c-met e PLCγ, após tratamento com siRNA para Gab1, caso
não seje observado interação entre estas proteínas nas frações nucleares. Esperamos
assim ter evidências experimentais demonstrando que a a interação c-met/PLCγ é
necessária para a geração de Ca
2+
nuclear.
Conclusões
Várias evidências demostraram que a introdução de segundos mensageiros dentro do
núcleo induz sinais de Ca
2+
independentes das mudanças do Ca
2+
citosólico
(Gerasimenko et al. 1995; Hennager et al. 1995; Santella and Kyozuka 1997). O
aumento de Ca
2+
nuclear e citoplasmático tem efeitos diferentes nas atividades
nucleares, e assim, é importante saber a origem precisa destes sinais de Ca
2+
(Lipp et al.
1997). Neste trabalho, obtivemos evidências experimentais que c-met gera sinais de
Ca
2+
especificamente dentro do núcleo. Entretanto, continuam em aberto às questões
sobre os mecanismos pelos quais a sinalização de Ca
2+
nuclear torna-se ativada.
Avanços neste campo irão resultar no entendimento das fontes e da natureza dos sinais
que modulam o Ca
2+
nuclear. Outra questão importante refere-se à relevância das
funções distintas do retículo núcleoplasmático. Muitos tipos celulares regulam
processos dependentes de Ca
2+
citosólico por regulação de regiões nas quais o Ca
2+
citosólico possa ser liberado. Neste trabalho, demonstramos que as MAPKs são
dependentes do Ca
2+
citosólico e por outro lado que a fosforilação de CDK1 é
dependente dos níveis de Ca
2+
nuclear. Continua para ser estudado se o retículo
núcleoplasmático exerce níveis de controle espaciais sobre os processos dependentes de
Ca
2+
em regiões distintas do núcleo. As respostas destas questões irão ajudar nosso
62
Discussão e Conclusões Dawidson A. Gomes
entendimento dos modos pelos quais os sinais de Ca
2+
estão integrados para regular
funções celulares em condições de saúde e doença.
63
Referências bibliográficas Dawidson A. Gomes
6. Referências bibliográficas
64
Referências bibliográficas Dawidson A. Gomes
Agell,N., Bachs,O., Rocamora,N., and Villalonga,P. 2002. Modulation of the
Ras/Raf/MEK/ERK pathway by Ca(2+), and calmodulin. Cell Signal. 14: 649-654.
Allbritton,N.L., Oancea,E., Kuhn,M.A., and Meyer,T. 1994. Source of nuclear calcium
signals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 91: 12458-12462.
Bachs,O., Agell,N., and Carafoli,E. 1992. Calcium and calmodulin function in the cell
nucleus. Biochim. Biophys. Acta 1113: 259-270.
Balk,S.D., Whitfield,J.F., Youdale,T., and Braun,A.C. 1973. Roles of calcium, serum,
plasma, and folic acid in the control of proliferation of normal and Rous sarcoma virus-
infected chicken fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 70: 675-679.
Berridge,M.J. 1993. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature 361: 315-325.
Berridge,M.J. 2002. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle.
Cell Calcium 32: 235-249.
Berridge,M.J., Bootman,M.D., and Roderick,H.L. 2003. Calcium signalling: dynamics,
homeostasis and remodelling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 517-529.
Bolsover,S., Ibrahim,O., O'luanaigh,N., Williams,H., and Cockcroft,S. 2001. Use of
fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and
solutions. Biochem. J. 356: 345-352.
Boronenkov,I.V., Loijens,J.C., Umeda,M., and Anderson,R.A. 1998. Phosphoinositide
signaling pathways in nuclei are associated with nuclear speckles containing pre-mRNA
processing factors. Mol. Biol. Cell 9: 3547-3560.
Boynton,A.L. 1988. Calcium and epithelial cell proliferation. Miner. Electrolyte Metab
14: 86-94.
Boynton,A.L., Whitfield,J.F., Isaacs,R.J., and Tremblay,R.G. 1977. Different
extracellular calcium requirements for proliferation of nonneoplastic, preneoplastic, and
neoplastic mouse cells. Cancer Res. 37: 2657-2661.
Brini,M., Murgia,M., Pasti,L., Picard,D., Pozzan,T., and Rizzuto,R. 1993. Nuclear Ca2+
concentration measured with specifically targeted recombinant aequorin. EMBO J. 12:
4813-4819.
Bustamante,J.O. 1994. Nuclear electrophysiology. J. Membr. Biol. 138: 105-112.
Carafoli,E., Nicotera,P., and Santella,L. 1997. Calcium signalling in the cell nucleus.
Cell Calcium 22: 313-319.
Carrion,A.M., Link,W.A., Ledo,F., Mellstrom,B., and Naranjo,J.R. 1999. DREAM is a
Ca2+-regulated transcriptional repressor. Nature 398: 80-84.
Chawla,S., Hardingham,G.E., Quinn,D.R., and Bading,H. 1998. CBP: a signal-
regulated transcriptional coactivator controlled by nuclear calcium and CaM kinase IV.
Science 281: 1505-1509.
65
Referências bibliográficas Dawidson A. Gomes
Clapham,D.E. 1995. Calcium signaling. Cell 80: 259-268.
Clark,E.A. and Brugge,J.S. 1995. Integrins and signal transduction pathways: the road
taken. Science 268: 233-239.
Cocco,L., Martelli,A.M., Vitale,M., Falconi,M., Barnabei,O., Stewart,G.R., and
Manzoli,F.A. 2002. Inositides in the nucleus: regulation of nuclear PI-PLCbeta1. Adv.
Enzyme Regul. 42: 181-193.
Collings,D.A., Carter,C.N., Rink,J.C., Scott,A.C., Wyatt,S.E., and Allen,N.S. 2000.
Plant nuclei can contain extensive grooves and invaginations. Plant Cell 12: 2425-2440.
Dargan,S.L., Schwaller,B., and Parker,I. 2004. Spatiotemporal patterning of IP3-
mediated Ca2+ signals in Xenopus oocytes by Ca2+-binding proteins. J. Physiol 556:
447-461.
Divecha,N., Banfic,H., and Irvine,R.F. 1991. The polyphosphoinositide cycle exists in
the nuclei of Swiss 3T3 cells under the control of a receptor (for IGF-I) in the plasma
membrane, and stimulation of the cycle increases nuclear diacylglycerol and apparently
induces translocation of protein kinase C to the nucleus. EMBO J. 10: 3207-3214.
Dulbecco,R. and Elkington,J. 1975. Induction of growth in resting fibroblastic cell
cultures by Ca++. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 72: 1584-1588.
Echevarria,W., Leite,M.F., Guerra,M.T., Zipfel,W.R., and Nathanson,M.H. 2003.
Regulation of calcium signals in the nucleus by a nucleoplasmic reticulum. Nat. Cell
Biol. 5: 440-446.
Fox,J.L., Burgstahler,A.D., and Nathanson,M.H. 1997. Mechanism of long-range Ca2+
signalling in the nucleus of isolated rat hepatocytes. Biochem. J. 326 ( Pt 2): 491-495.
Fricker,M., Hollinshead,M., White,N., and Vaux,D. 1997. Interphase nuclei of many
mammalian cell types contain deep, dynamic, tubular membrane-bound invaginations of
the nuclear envelope. J. Cell Biol. 136: 531-544.
Gardner,P. 1989. Calcium and T lymphocyte activation. Cell 59: 15-20.
Gensburger,C., Freyermuth,S., Klein,C., and Malviya,A.N. 2003. In vivo nuclear Ca2+-
ATPase phosphorylation triggers intermediate size molecular transport to the nucleus.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 303: 1225-1228.
Gerasimenko,O.V., Gerasimenko,J.V., Tepikin,A.V., and Petersen,O.H. 1995. ATP-
dependent accumulation and inositol trisphosphate- or cyclic ADP-ribose-mediated
release of Ca2+ from the nuclear envelope. Cell 80: 439-444.
Golias,C.H., Charalabopoulos,A., and Charalabopoulos,K. 2004. Cell proliferation and
cell cycle control: a mini review. Int. J. Clin. Pract. 58: 1134-1141.
Gual,P., Giordano,S., Williams,T.A., Rocchi,S., Van Obberghen,E., and Comoglio,P.M.
2000. Sustained recruitment of phospholipase C-gamma to Gab1 is required for HGF-
induced branching tubulogenesis. Oncogene 19: 1509-1518.
66
Referências bibliográficas Dawidson A. Gomes
Hardingham,G.E., Chawla,S., Johnson,C.M., and Bading,H. 1997. Distinct functions of
nuclear and cytoplasmic calcium in the control of gene expression. Nature 385: 260-
265.
Hardingham,G.E., Cruzalegui,F.H., Chawla,S., and Bading,H. 1998. Mechanisms
controlling gene expression by nuclear calcium signals. Cell Calcium 23: 131-134.
Hazelton,B., Mitchell,B., and Tupper,J. 1979. Calcium, magnesium, and growth control
in the WI-38 human fibroblast cell. J. Cell Biol. 83: 487-498.
Hennager,D.J., Welsh,M.J., and DeLisle,S. 1995. Changes in either cytosolic or
nucleoplasmic inositol 1,4,5-trisphosphate levels can control nuclear Ca2+
concentration. J. Biol. Chem. 270: 4959-4962.
Jacob,S.N., Choe,C.U., Uhlen,P., DeGray,B., Yeckel,M.F., and Ehrlich,B.E. 2005.
Signaling microdomains regulate inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated intracellular
calcium transients in cultured neurons. J. Neurosci. 25: 2853-2864.
Koppler,P., Matter,N., and Malviya,A.N. 1993. Evidence for stereospecific inositol
1,3,4,5-[3H]tetrakisphosphate binding sites on rat liver nuclei. Delineating inositol
1,3,4,5-tetrakisphosphate interaction in nuclear calcium signaling process. J. Biol.
Chem. 268: 26248-26252.
Kramer,A., Lukas,J., and Bartek,J. 2004. Checking out the centrosome. Cell Cycle 3:
1390-1393.
Lee,M.A., Dunn,R.C., Clapham,D.E., and Stehno-Bittel,L. 1998. Calcium regulation of
nuclear pore permeability. Cell Calcium 23: 91-101.
Leite,M.F., Hirata,K., Pusl,T., Burgstahler,A.D., Okazaki,K., Ortega,J.M., Goes,A.M.,
Prado,M.A., Spray,D.C., and Nathanson,M.H. 2002. Molecular basis for pacemaker
cells in epithelia. J. Biol. Chem. 277: 16313-16323.
Leite,M.F. and Nathanson,M.H. 2001. Ca
2+
Signaling in the liver. In The liver: Biology
and Pathobiology. Edited by I.M.Arias, J.L.Boyer, F.V.Chisari, N.Fausto, D.Schachter,
and D.A.Shafritz. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. pp. 537-554.
Leite,M.F., Thrower,E.C., Echevarria,W., Koulen,P., Hirata,K., Bennett,A.M.,
Ehrlich,B.E., and Nathanson,M.H. 2003. Nuclear and cytosolic calcium are regulated
independently. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100: 2975-2980.
Lin,S.Y., Makino,K., Xia,W., Matin,A., Wen,Y., Kwong,K.Y., Bourguignon,L., and
Hung,M.C. 2001. Nuclear localization of EGF receptor and its potential new role as a
transcription factor. Nat. Cell Biol. 3: 802-808.
Lin,X., Varnai,P., Csordas,G., Balla,A., Nagai,T., Miyawaki,A., Balla,T., and
Hajnoczky,G. 2005. Control of calcium signal propagation to the mitochondria by
inositol 1,4,5-trisphosphate-binding proteins. J. Biol. Chem. 280: 12820-12832.
Lipp,P., Thomas,D., Berridge,M.J., and Bootman,M.D. 1997. Nuclear calcium
signalling by individual cytoplasmic calcium puffs. EMBO J. 16: 7166-7173.
67
Referências bibliográficas Dawidson A. Gomes
Lui,P.P., Kong,S.K., Kwok,T.T., and Lee,C.Y. 1998. The nucleus of HeLa cell contains
tubular structures for Ca2+ signalling. Biochem. Biophys. Res. Commun. 247: 88-93.
MacManus,J.P., Whitfield,J.F., Boynton,A.L., and Rixon,R.H. 1975. Role of cyclic
nucleotides and calcium in the positive control of cell proliferation. Adv. Cyclic.
Nucleotide. Res. 5: 719-734.
Mak,D.O. and Foskett,J.K. 1994. Single-channel inositol 1,4,5-trisphosphate receptor
currents revealed by patch clamp of isolated Xenopus oocyte nuclei. J. Biol. Chem. 269:
29375-29378.
Malviya,A.N. 1994. The nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate and inositol 1,3,4,5-
tetrakisphosphate receptors. Cell Calcium 16: 301-313.
Malviya,A.N., Rogue,P., and Vincendon,G. 1990. Stereospecific inositol 1,4,5-
[32P]trisphosphate binding to isolated rat liver nuclei: evidence for inositol
trisphosphate receptor-mediated calcium release from the nucleus. Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A 87: 9270-9274.
Martelli,A.M., Billi,A.M., Manzoli,L., Faenza,I., Aluigi,M., Falconi,M., De,P.A.,
Gilmour,R.S., and Cocco,L. 2000. Insulin selectively stimulates nuclear
phosphoinositide-specific phospholipase C (PI-PLC) beta1 activity through a mitogen-
activated protein (MAP) kinase-dependent serine phosphorylation. FEBS Lett. 486:
230-236.
Martelli,A.M., Cocco,L., Bareggi,R., Tabellini,G., Rizzoli,R., Ghibellini,M.D., and
Narducci,P. 1999. Insulin-like growth factor-I-dependent stimulation of nuclear
phospholipase C-beta1 activity in Swiss 3T3 cells requires an intact cytoskeleton and is
paralleled by increased phosphorylation of the phospholipase. J. Cell Biochem. 72: 339-
348.
Mignery,G.A., Sudhof,T.C., Takei,K., and De Camilli,P. 1989. Putative receptor for
inositol 1,4,5-trisphosphate similar to ryanodine receptor. Nature 342: 192-195.
Nagy,P., Bisgaard,H.C., Schnur,J., and Thorgeirsson,S.S. 2000. Studies on hepatic gene
expression in different liver regenerative models. Biochem. Biophys. Res. Commun.
272: 591-595.
Nicholson,N.B., Chen,S., Blanck,G., and Pollack,R. 1984. SV40 transformation of
Swiss 3T3 cells can cause a stable reduction in the calcium requirement for growth. J.
Cell Biol. 99: 2314-2321.
Nowycky,M.C. and Thomas,A.P. 2002. Intracellular calcium signaling. J. Cell Sci. 115:
3715-3716.
Okano,Y., Mizuno,K., Osada,S., Nakamura,T., and Nozawa,Y. 1993. Tyrosine
phosphorylation of phospholipase C gamma in c-met/HGF receptor-stimulated
hepatocytes: comparison with HepG2 hepatocarcinoma cells. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 190: 842-848.
68
Referências bibliográficas Dawidson A. Gomes
Osborne,S.L., Thomas,C.L., Gschmeissner,S., and Schiavo,G. 2001. Nuclear
PtdIns(4,5)P2 assembles in a mitotically regulated particle involved in pre-mRNA
splicing. J. Cell Sci. 114: 2501-2511.
Partridge,K.A. and Oreffo,R.O. 2004. Gene delivery in bone tissue engineering:
progress and prospects using viral and nonviral strategies. Tissue Eng 10: 295-307.
Perez-Terzic,C., Pyle,J., Jaconi,M., Stehno-Bittel,L., and Clapham,D.E. 1996.
Conformational states of the nuclear pore complex induced by depletion of nuclear
Ca2+ stores. Science 273: 1875-1877.
Plevin,R., Palmer,S., Gardner,S.D., and Wakelam,M.J. 1990. Regulation of bombesin-
stimulated inositol 1,4,5-trisphosphate generation in Swiss 3T3 fibroblasts by a
guanine-nucleotide-binding protein. Biochem. J. 268: 605-610.
Ponzetto,C., Bardelli,A., Zhen,Z., Maina,F., dalla,Z.P., Giordano,S., Graziani,A.,
Panayotou,G., and Comoglio,P.M. 1994. A multifunctional docking site mediates
signaling and transformation by the hepatocyte growth factor/scatter factor receptor
family. Cell 77: 261-271.
Pusl,T., Wu,J.J., Zimmerman,T.L., Zhang,L., Ehrlich,B.E., Berchtold,M.W., Hoek,J.B.,
Karpen,S.J., Nathanson,M.H., and Bennett,A.M. 2002. Epidermal growth factor-
mediated activation of the ETS domain transcription factor Elk-1 requires nuclear
calcium. J. Biol. Chem. 277: 27517-27527.
Reilly,J.F. and Maher,P.A. 2001. Importin beta-mediated nuclear import of fibroblast
growth factor receptor: role in cell proliferation. J. Cell Biol. 152: 1307-1312.
Rizzuto,R. and Pozzan,T. 2006. Microdomains of intracellular Ca2+: molecular
determinants and functional consequences. Physiol Rev. 86: 369-408.
Rogue,P.J., Humbert,J.P., Meyer,A., Freyermuth,S., Krady,M.M., and Malviya,A.N.
1998. cAMP-dependent protein kinase phosphorylates and activates nuclear Ca2+-
ATPase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95: 9178-9183.
Sakaguchi,K. 1992. Acidic fibroblast growth factor autocrine system as a mediator of
calcium-regulated parathyroid cell growth. J. Biol. Chem. 267: 24554-24562.
Santella,L. 1998. The role of calcium in the cell cycle: facts and hypotheses. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 244: 317-324.
Santella,L. and Kyozuka,K. 1997. Effects of 1-methyladenine on nuclear Ca2+
transients and meiosis resumption in starfish oocytes are mimicked by the nuclear
injection of inositol 1,4,5-trisphosphate and cADP-ribose. Cell Calcium 22: 11-20.
Schwaller,B., Meyer,M., and Schiffmann,S. 2002. 'New' functions for 'old' proteins: the
role of the calcium-binding proteins calbindin D-28k, calretinin and parvalbumin, in
cerebellar physiology. Studies with knockout mice. Cerebellum. 1: 241-258.
Shah,P.K. and Sowdhamini,R. 2001. Structural understanding of the transmembrane
domains of inositol triphosphate receptors and ryanodine receptors towards calcium
channeling. Protein Eng 14: 867-874.
69
Referências bibliográficas Dawidson A. Gomes
Stehno-Bittel,L., Luckhoff,A., and Clapham,D.E. 1995a. Calcium release from the
nucleus by InsP3 receptor channels. Neuron 14: 163-167.
Stehno-Bittel,L., Perez-Terzic,C., and Clapham,D.E. 1995b. Diffusion across the
nuclear envelope inhibited by depletion of the nuclear Ca2+ store. Science 270: 1835-
1838.
Tabellini,G., Billi,A.M., Fala,F., Cappellini,A., Evagelisti,C., Manzoli,L., Cocco,L., and
Martelli,A.M. 2004. Nuclear diacylglycerol kinase-theta is activated in response to
nerve growth factor stimulation of PC12 cells. Cell Signal. 16: 1263-1271.
Takeshima,H. 1993. Primary structure and expression from cDNAs of the ryanodine
receptor. Ann. N. Y. Acad. Sci. 707: 165-177.
Takuwa,N., Iwamoto,A., Kumada,M., Yamashita,K., and Takuwa,Y. 1991. Role of
Ca2+ influx in bombesin-induced mitogenesis in Swiss 3T3 fibroblasts. J. Biol. Chem.
266: 1403-1409.
Takuwa,N., Zhou,W., Kumada,M., and Takuwa,Y. 1993. Ca(2+)-dependent stimulation
of retinoblastoma gene product phosphorylation and p34cdc2 kinase activation in
serum-stimulated human fibroblasts. J. Biol. Chem. 268: 138-145.
Thomas,D., Tovey,S.C., Collins,T.J., Bootman,M.D., Berridge,M.J., and Lipp,P. 2000.
A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring
elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium 28: 213-223.
Thompson,M., Andrade,V.A., Andrade,S.J., Pusl,T., Ortega,J.M., Goes,A.M., and
Leite,M.F. 2003. Inhibition of the TEF/TEAD transcription factor activity by nuclear
calcium and distinct kinase pathways. Biochem. Biophys. Res. Commun. 301: 267-274.
Tupper,J.T., Kaufman,L., and Bodine,P.V. 1980. Related effects of calcium and serum
on the G1 phase of the human W138 fibroblast. J. Cell Physiol 104: 97-103.
Uchiyama,T., Yoshikawa,F., Hishida,A., Furuichi,T., and Mikoshiba,K. 2002. A novel
recombinant hyperaffinity inositol 1,4,5-trisphosphate (IP(3)) absorbent traps IP(3),
resulting in specific inhibition of IP(3)-mediated calcium signaling. J. Biol. Chem. 277:
8106-8113.
Varnai,P., Lin,X., Lee,S.B., Tuymetova,G., Bondeva,T., Spat,A., Rhee,S.G.,
Hajnoczky,G., and Balla,T. 2002. Inositol lipid binding and membrane localization of
isolated pleckstrin homology (PH) domains. Studies on the PH domains of
phospholipase C delta 1 and p130. J. Biol. Chem. 277: 27412-27422.
Veigl,M.L., Vanaman,T.C., and Sedwick,W.D. 1984. Calcium and calmodulin in cell
growth and transformation. Biochim. Biophys. Acta 738: 21-48.
Whitfield,J.F., Boynton,A.L., MacManus,J.P., Rixon,R.H., Sikorska,M., Tsang,B.,
Walker,P.R., and Swierenga,S.H. 1980. The roles of calcium and cyclic AMP in cell
proliferation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 339: 216-240.
70
Participação em eventos e Produção Bibliográficas Dawidson A. Gomes
7.1 Participação em eventos.
1. The Liver Meeting. Realizado em San Francisco, USA, 2005
2. Digestive Disease Week (DDW). Realizado em Chicago, USA, 2005.
3. Yale Digestive Diseases Reunion Weekend & Scientific Symposium.
Realizado em New Haven, USA, 2005.
4. The Liver Meeting. Realizado em Boston, USA, 2004.
5. Electrophysiological concepts and techniques for studying cells. Realizado em
Ribeirão Preto, Brasil, 2004.
7.2 Trabalhos apresentados em eventos.
1. MINAGAWA, N. ; SHIBAO, K. ; GOMES, D. A. ; MASYUK, A. ;
LARUSSO, N. F. ; NATHANSON, M. H. . Cyclic AMP regulates bicarbonate
secretion in cholangiocytes through release of ATP into bile. In: The Liver
Meeting, 2005, San Francisco. Hepatology, 2005. v. 42.
2. O'BRIEN, E. M. ; GOMES, D. A. ; SEGHAL, S. ; NATHANSON, M. H.
Vasopressin increases the permeability of the nuclear membrane. In: The Liver
Meeting, 2005, San Francisco. Hepatology, 2005. v. 42. p. 752A.
3. RODRIGUES, M. A. ; GOMES, D. A. ; GRANT, W. ; BENNETT, A. M. ;
NATHANSON, M. H. . Calcium signals in the nucleus regulate activation of
cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1). In: The Liver Meeting, 2005, San Francisco.
Hepatology, 2005. v. 42. p. 753A.
4. LEITE, M. F. ; RODRIGUES, M. A. ; GOMES, D. A. ; NATHANSON, M. H.
. Regulation of calcium signals in the nucleus. In: 3rd Meeting of the European
Club for Liver Cell Biology, 2005, Thurgovie. 3rd Meeting of the European Club
for Liver Cell Biology, 2005.
5. GOMES, D. A. ; PINHEIRO, C. C. ; SOUTO, N. C. ; GOES, Tércio ; GOES,
Alfredo M ; NATHANSON, M. H. ; LEITE, M. F. . The type 3 isoform of the
inositol-1,4,5-triphosphate receptor (InsP
3
R) selectively mediates apoptosis. In:
Digestive Disease WeeK (DDW), 2005, Chicago. Gastroenterology, 2005. v. 128.
p. A707-A707.
6. GOMES, D. A. ; VORONOV, S. ; De CAMILLI, P. ; NATHANSON, M. H. .
The gamma isoform of phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP
2
) Kinase
regulates Ca
2+
signaling. In: Digestive Disease Week, 2005, Chicago.
Gastroenterology, 2005. v. 128. p. A693-A693.
7. PIMENTA, F. J. G. S. ; GOMES, D. A. ; PERDIGAO, P. F. . Análise da
Expressão do gene WWOX no Carcinoma de Células Escamosas da Cavidade
Bucal. In: VII Encontro de Pesquisa da Faculdade de Odontologia UFMG/ VI
Encontro Científico das Faculdades de Odontologia de MG, 2004, Belo
Horizonte. Arquivos em Odontologia, 2004. v. 40.
8. GOMES, D. A. ; RODRIGUES, M. A. ; SOUTO, N. C. ; THOMPSON, M. ;
GOES, Tércio de Souza ; LEITE, M. F. . Modulation of Calcium Siganling by
Inositol trisphosphate receptors in Hek-293 cells. In: FESBE XIX, 2004, Águas
de Lindoia. FESBE XIX, 2004.
71
Participação em eventos e Produção Bibliográficas Dawidson A. Gomes
7.3 Prêmios e títulos.
2005 Apresentação oral na Digestive Disease Week (DDW), Chicago, USA,
sobre o trabalho: The gamma isoform of phosphatidylinositol 4,5-biphosphate
(PIP2) Kinase regulates Ca
2+
signaling
2004 Prêmio Hyclone, FeSBE.
2004 Prêmio Roberto Alcântara Gomes-SBBf, FeSBE.
2004 Menção Honrosa, Centro de Extensão da Faculdade de Odontologia da
UFMG.
2003 Prémio Iniciação Científica, 49º Congresso Nacional de Genética.
7.4 Artigos pubicados em periódicos.
1. GOMES, D. A. ; LEITE, M. F. ; BENNETT, A. M. ; NATHANSON, M. H. .
Calcium Signaling in the Nucleus. Canadian Journal of Physiology and
Pharmacology, In Press, 2006.
2. GRANT, W. ; ROTH, R. ; GOMES, D. A. ; EHRLICH, B. E. ; NATHANSON,
M. H. ; BENNETT, A. M. . Suppression of Nuclear and Cytosolic Calcium
Signaling By Targeted Expression of Calretinin. Calcium Binding Proteins, v. 1,
n. 1, p. 1, 2006.
3. PIMENTA, F. J. G. S. ; GOMES, D. A. ; PERDIGAO, P. F. ; ROMANO-
SILVA, M. A. ; GOMEZ, M. V. ; de MARCO, L. A. ; GOMEZ, R. S. .
Characterization of the tumor suppressor gene WWOX in primary human oral
squamous cell carcinomas. International journal of cancer. Journal international
du cancer, v. 118, n. 5, p. 1154-1158, 2006.
4. MENDES, C. C. P. ; GOMES, D. A. ; THOMPSON, M. ; SOUTO, N. C. ;
GOES, T. S. ; RODRIGUES, M. A. ; GOES, A. M ; GOMEZ, M. V. ;
NATHANSON, M. H. ; LEITE, M. F. . THE TYPE III INOSITOL 1,4,5-
TRISPHOSPHATE RECEPTOR PREFERENTIALLY TRANSMITS
APOPTOTIC Ca
2+
SIGNALS INTO MITOCHONDRIA. Journal of Biological
Chemistry, v. 280, n. 49, p. 40892-40900, 2005.
5. GOMES, D. A. ; GUATIMOSIM, C. ; GOMEZ, R. S. ; LEITE, M. F. ;
VIEIRA, L. B. ; ROMANO-SILVA, M. A. ; PRADO, M. A. M. ; GOMEZ,
Marcus Vinícius . Effect of halothane on the release of [Ca
2+
]i in dorsal root
ganglions neurons.. Neuroreport, v. 15, n. 7, p. 1187-90, 2004.
6. FERNANDES, V. M. V. ; ROMANO-SILVA, M. A. ; GOMES, D. A. ;
PRADO, M. A. M. ; SANTOS, T. M. ; GOMEZ, M. V. . Dopamine Release
Evoked by Beta Scorpion Toxin, Tityus Gamma, in Prefrontal Cortical Slices is
Mediated by Intracellular Calcium Stores. Cellular and Molecular Neurobiology,
v. 24, n. 6, p. 757-767, 2004.
72
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