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UFPE
GLÁUCIO NÓBREGA DE SOUZA
BIOMARCADORES MOLECULARES NO ESÔFAGO DE
BARRETT
Análise comparativa da imunoexpressão tecidual do p53, c-erbB-2,
E-caderina, COX-2 e Ki-67, na esofagite por refluxo, no esôfago de
Barrett e no adenocarcinoma associado ao esôfago de Barrett
Recife
2006
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Livros Grátis
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GLÁUCIO NÓBREGA DE SOUZA
BIOMARCADORES MOLECULARES NO ESÔFAGO
DE BARRETT
Análise comparativa da imunoexpressão tecidual do p53, c-erbB-2,
E-caderina, COX-2 e Ki-67, na esofagite por refluxo, no esôfago de
Barrett e no adenocarcinoma associado ao esôfago de Barrett.
Dissertação apresentada ao colegiado do Programa
de Pós-Graduação em Saúde do Adulto e do Idoso
do Centro de Ciências da Saúde da Universidade
Federal de Pernambuco, como parte do requisito
para obtenção do Título de Mestre.
ORIENTADORES
Prof. Dr. Fernando Tarcísio de Miranda Cordeiro
Profª. Drª. Maria Salete Trigueiro de Araújo.
Recife
2006
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Souza, Gláucio Nóbrega de
Biomarcadores moleculares no esôfago de
Barrett: Análise comparativa da imunoexpressão
tecidual do p53, c-erbB-2, E-caderina, COX-2 e Ki-67,
na esofagite por refluxo, no esôfago de Barrett e no
adenocarcinoma associado ao esôfago de Barrett/
Gláucio Nóbrega de Souza. – Recife : O Autor, 2006.
148 folhas : il., fig., tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal
de Pernambuco. CCS. Mestrado em Medicina Interna,
2006.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Biomarcadores moleculares no esôfago de
Barrett. 2. Adenocarcinoma. 3. Esofagite por refluxo.
I. Título.
616.002.771 CDU (2.ed.) UFPE
616.127 CDD (22.ed.) BC2006-062
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
REITOR
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PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
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HOSPITAL DAS CLÍNICAS
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Prof. José Ricardo Barros Pernambuco
Prof. Lurildo Cleano Ribeiro Saraiva
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. Maria de Fátima Pessoa Militão de Albuquerque
“ De tudo, ficaram três coisas :
a certeza de que ele estava sempre começando,
a certeza de que era preciso continuar e
a certeza de que seria interrompido antes de
terminar.
Fazer da interrupção um caminho novo.
Fazer da queda um passo de dança, do medo
uma escada, do sono uma ponte, da procura um
encontro.”
FERNANDO SABINO
O Encontro Marcado – 1956
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Olavo e Glaura, princípio e fundamento de tudo na minha vida.
À minha esposa, Fabiana, e aos nossos filhos, Joanna e Lucas, pelo amor, pelo
companheirismo, pelo apoio, pelo estímulo e pela compreensão nas minhas ausências dos
momentos de família.
Ao amigo Pierre Landolt, grande incentivador e apoiador da minha vida profissional.
AGRADECIMENTOS
A DEUS, sempre presente em mim e ao meu lado, o qual me permitiu, mais uma
vez, concretizar um projeto científico-profissional.
Ao Prof. Dr. Fernando Tarcísio de Miranda Cordeiro, que como orientador, desde
o início abraçou o projeto e me permitiu a execução, com observações e orientações
pertinentes e precisas.
À Profª Drª. Maria Salete Trigueiro de Araújo, orientadora, que, de uma forma
incansável e profissional, perseguiu, juntamente conosco, os objetivos deste trabalho.
Ao Governo do Estado da Paraíba, na pessoa do Exmº Sr. Governador, Dr. Cássio
Cunha Lima, por acreditar, incentivar e apoiar este projeto científico.
Ao laboratório farmacêutico NOVARTIS, na pessoa do seu presidente, o Dr. Patrice
Zagamé, pelo apoio financeiro e pelos kits de imunoistoquímica, fundamentais na
viabilização e execução do nosso trabalho.
À Dra. Norma Jucá e ao Dr. Guilherme Costa Guedes Pereira, patologistas, pela
disponibilidade em fornecer material e informações anatomoclínicas dos pacientes.
Aos Drs. Carlos Alberto Fernandes Ramos e Álvaro Ferreira Lima Júnior,
patologistas, pela disponibilidade em nos ajudar profissionalmente no nosso projeto.
Aos Professores das Disciplinas do Mestrado em Medicina Interna, da
Universidade Federal de Pernambuco, os quais contribuíram com o ensino e com as
orientações valiosas para a conclusão deste trabalho.
Aos colegas Clínicos e Cirurgiões de João Pessoa e Recife, pela atenção,
prestimosidade e disponibilidade em fornecer as informações clínico-cirúrgicas de alguns
pacientes.
Aos Professores Dr. José Luiz Simões Maroja e Eurípedes Sebastião Mendonça
de Souza, os quais viabilizaram e nos auxiliaram no estágio de docência na Universidade
Federal da Paraíba (UFPB).
Ao presidente da Fundação e Hospital do Câncer Napoleão Laureano, Dr. Antônio
Carneiro Arnaud, que, de uma forma profissional, científica e socialmente responsável,
permitiu o acesso às informações anatomoclínicas dos pacientes do hospital.
Aos Colegas de Mestrado, com os quais tive a honra e a oportunidade de
compartilhar as atividades diárias do aprendizado da pós-graduação.
Ao Professor José Natal Figueiroa pelo trabalho de toda a estatística desta
dissertação de mestrado.
Ao Professor Laerte Pereira da Silva pela revisão de português do presente
trabalho.
Ao Professor John Philip Medcraft pelos preciosos ensinamentos na língua inglesa
e pela revisão do abstract.
Às secretárias do mestrado em Medicina Interna da UFPE, Esmeralda, Andréa e
Karita, as quais me auxiliaram com as atividades administrativas para a execução e conclusão
do nosso projeto.
Aos Pacientes e Familiares, que, com uma atitude altruísta, contribuíram para a
busca de novos conhecimentos na Medicina.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS................................................................ xiii
LISTA DE TABELAS................................................................................................ xv
LISTA DE GRÁFICOS............................................................................................. xvii
LISTA DE FIGURAS................................................................................................ xix
RESUMO.................................................................................................................... xxi
ABSTRACT................................................................................................................ xxiii
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................... 01
1.1 Objetivos............................................................................................................ 12
2. CASUÍSTICA E MÉTODOS................................................................................ 13
2.1 Local do estudo.................................................................................................. 14
2.2 Desenho do estudo............................................................................................. 14
2.3 Definição de critérios......................................................................................... 15
2.3.1 Critérios endoscópicos.............................................................................. 15
2.3.2 Critérios anatomopatológicos.................................................................... 19
2.3.3 Critérios de inclusão.................................................................................. 21
2.3.4 Critérios de exclusão................................................................................. 21
2.4 Caracterização da amostra.................................................................................. 21
2.5 Procedimentos e técnicas.................................................................................... 22
2.5.1 Dados clínicos........................................................................................... 22
2.5.2 Procedimento endoscópico........................................................................ 22
2.5.3 Procedimento anatomopatológico.............................................................. 24
2.5.4 Técnica imunoistoquímica......................................................................... 24
2.5..5 Metodologia da descrição dos resultados.................................................. 28
2.6 Limitações metodológicas do estudo.................................................................. 32
2.7 Aspectos Éticos do estudo................................................................................. 33
2.8 Análise estatística............................................................................................... 33
3. RESULTADOS......................................................................................................
34
3.1 Dados clínicos................................................................................................... 35
3.2 Dados endoscópicos.......................................................................................... 40
3.3 Dados imunoistoquímicos.................................................................................... 44
4. DISCUSSÃO............................................................................................................. 66
5. CONCLUSÕES........................................................................................................ 82
REFERÊNCIAS.......................................................................................................... 84
ANEXOS...................................................................................................................... 110
ABREVIATURAS E SIGLAS
AGA – American Gastroenterology Association.
cm – centímetros.
COXs – Ciclooxigenases.
DAB – Diaminobenzidina.
DNA – Ácido desoxirribonucleico.
DRGE – Doença do refluxo gastroesofágico.
EB – esôfago de Barrett.
EGF – Fator de crescimento epidérmico.
EGFR – Receptor do fator de crescimento epidérmico.
EUA – Estados Unidos da América do Norte.
°C – grau Celsius
HE – Hematoxilina-Eosina.
H. pylori – Helicobacter pylori.
IMC – Índice de massa corpórea.
M – Mol.
mM – Milimol.
mRNA – Ácido ribonucléico mensageiro.
N – Número.
OMS – Organização Mundial da Saúde.
OR – Odds ratio.
PCNA – Antígeno nuclear de proliferação celular.
SOBED – Sociedade Brasileira de Endoscopia Digestiva.
SBP – Sociedade Brasileira de Patologia.
TEG – Transição esôfago-gástrica.
TGF-alfa – Fator de transformação do crescimento-alfa.
vs – Versus.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados clínicos dos pacientes do grupo I (esofagite por refluxo)...........
37
Tabela 2 Dados clínicos dos pacientes do grupo II (esôfago de Barrett)..............
38
Tabela 3 Dados clínicos dos pacientes do grupo III (adenocarcinoma
relacionado com o esôfago de Barrett)....................................................
39
Tabela 4 Dados endoscópicos dos pacientes com esofagite por refluxo (grupo
I)..............................................................................................................
41
Tabela 5 Dados endoscópicos dos pacientes com esôfago de Barrett (grupo II)...
42
Tabela 6
Dados endoscópicos dos pacientes com adenocarcinoma esofágico
relacionado com o esôfago de Barrett (grupo III)..................................
43
Tabela 7
Imunoexpressão tecidual do p53 em todos os grupos analisados............ 45
Tabela 8
Imunoexpressão tecidual da COX-2 em todos os grupos analisados...... 47
Tabela 9
Imunoexpressão tecidual do c-erbB-2 em todos os grupos analisados.... 49
Tabela 10
Escore final da imunoexpressão tecidual do p53 em todos os grupos
analisados................................................................................................ 53
Tabela 11
Escore final da imunoexpressão tecidual da COX-2 em todos os grupos
do estudo................................................................................................. 55
Tabela 12
Escore da imunoexpressão tecidual do c-erbB-2 nos três grupos
analisados................................................................................................ 57
Tabela 13
Escore final da imunoexpressão tecidual do Ki-67 nos três grupos do
estudo...................................................................................................... 61
Tabela 14
Escore final da imunoexpressão tecidual da E-caderina nos grupos do
estudo...................................................................................................... 63
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1
Imunoexpressão tecidual do p53 em todos os grupos do
estudo....................................................................................................... 45
Gráfico 2
Imunoexpressão tecidual da COX-2 em todos os grupos analisados....... 47
Gráfico 3
Imunoexpressão tecidual do c-erbB-2 em todos os grupos estudados..... 49
Gráfico 4
Análise agrupada da positividade tecidual dos biomarcadores p53, c-
erbB-2 e COX-2, nos três grupos do estudo............................................. 51
Gráfico 5
Escore semiquantitativo do Ki-67 em todos os grupos de estudo............ 60
Gráfico 6
Análise do escore semiquantitativo da E-caderina em todos os grupos
de estudo.................................................................................................. 64
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Imunoexpressão fraca e focal da proteína p53 na esofagite por refluxo
(400X)..................................................................................................... 46
Figura 2
Imunomarcação do p53 no esôfago de Barrett (400X)........................... 46
Figura 3
Forte imunoexpressão do oncógeno p53 no adenocarcinoma esofágico
(400X)..................................................................................................... 46
Figura 4
Imunoexpressão da COX-2 na esofagite por refluxo (400X).................. 48
Figura 5
COX-2 - imunoexpressão citoplasmática no epitélio glandular do
esôfago de Barrett: 100X(A) e 400X(B)................................................. 48
Figura 6
Imunoexpressão acentuada da COX-2 no adenocarcinoma esofágico
(400X), e fraca marcação no controle interno (epitélio
escamoso)................................................................................................ 48
Figura 7
c-erbB-2 - imunoexpressão citoplasmática, sem forte marcação de
membrana epitelial, no esôfago de Barrett - A(100X) e B(400X).......... 50
Figura 8
Forte imunoexpressão (citoplasmática e de membrana) da oncoproteína
c-erbB-2 no adenocarcinoma esofágico (400X)....................................... 50
Figura 9
Ki-67 – atividade proliferativa da camada basal do epitélio
malphigiano, na esofagite por refluxo (A–B:400X)................................ 59
Figura 10
Expressão nuclear do Ki-67 no esôfago de Barrett e na atividade
proliferativa basal do epitélio escamoso esofágico (A-100X; B-400X).. 59
Figura 11
Ki-67 - alto índice proliferativo no adenocarcinoma esofágico (A–
B:400X)................................................................................................... 59
Figura 12
Forte expressão de membrana da E-caderina na esofagite por refluxo
(400X)..................................................................................................... 65
Figura 13
Imunoexpressão da E-caderina no esôfago de Barrett (400X)................ 65
Figura 14
Imunomarcação inconstante da E-caderina no adenocarcinoma
associado com o esôfago de Barrett (A-Bulbo duodenal amplo e sem
anormalidades.: 400X)............................................................................. 65
RESUMO
O esôfago de Barrett, definido pela metaplasia colunar do esôfago distal, com a presença de
células caliciformes, representa importante complicação da doença do refluxo gastroesofágico
(DRGE), e caracteriza-se como a principal lesão precursora do adenocarcinoma esofágico.
Fatores clínicos e endoscópicos não apresentam a sensibilidade e especificidade necessárias à
estratificação de risco para o câncer. Biomarcadores moleculares têm sido utilizados com esse
objetivo. Este trabalho incluiu três grupos de pacientes, portadores de esofagite por refluxo
(grupo I; N=23), esôfago de Barrett (grupo II; N=30) e adenocarcinoma esofágico associado
ao esôfago de Barrett (grupo III; N=11), nos quais foram realizadas, respectivamente, análises
comparativas da imunoexpressão tecidual dos seguintes biomarcadores: p53, c-erbB-2, E-
caderina, COX–2 e Ki-67. As imunorreações qualitativas com p53, COX-2 e c-erbB-2
revelaram maior expressão no grupo III, contrastando com a positividade menor e decrescente
dos grupos II e I (p<0,001; p=0,002; p<0,001, respectivamente). O escore semiquantitativo
final para p53, c-erbB-2, COX-2 e Ki-67 seguiu a mesma tendência da expressão qualitativa,
com os maiores índices no grupo III, e os menores no grupo I (p<0,001). A E-caderina
apresentou um perfil inverso de imunomarcação, com a maior positividade no grupo I
(p<0,001). Em conclusão, constatamos uma tendência monotônica de crescimento na
imunoexpressão para os biomarcadores oncogênicos e de atividade mitótica (p53, c-erbB-2,
COX–2 e Ki-67) em todos os grupos analisados, com expressão máxima na doença
neoplásica. Por outro lado, a preservação organizacional do tecido, revelada pela E-caderina,
foi marcante na esofagite por refluxo e no esôfago de Barrett, em contraste com escassa
imunorreação no adenocarcinoma esofágico.
ABSTRACT
Barrett’s esophagus, defined by the presence of columnar metaplasia of distal esophagus, and
characterized by the presence of goblet cells, is an important complication of gastroesophageal
reflux disease (GERD), and represents the main premalignant lesion of esophageal
adenocarcinoma. Clinical and endoscopic factors do not have the sensibility and/or the
specificity needed to stratify the risk of the development of cancer. Molecular biomarkers
have been used with this purpose. This paper included three groups of patients, with reflux
esophagitis (group I; N=23), Barrett’s esophagus (group II; N=30) and Barrett associated
esophageal adenocarcinoma (group III; N=11), in which were proceeded comparative
analyses, respectively, of the tissues’ immunoexpressions of p53, c-erbB-2, E-cadherin, COX–
2 and Ki-67. Qualitative immunoreactions with p53, c-erbB-2 and COX-2, revealed high
indexes of positivity in group III, contrasting with lower and decreasing levels in groups II and
I (p<0.001; p=0.002; p<0.001, respectively). The semiquantitative final score for p53, c-erbB-
2, COX-2 and Ki-67 followed the same tendency of the qualitative expression, with the
highest indexes in group III and lowest in group I (p<0.001). E-cadherin presented an inverse
profile of reactivity, with the highest immunoreaction in group I (p<0.001). In conclusion, we
have noted a monotonic growth tendency in both the immunoexpressions of oncogenic and
mitotic activity biomarkers ( p53, c-erbB-2, COX-2, and Ki-67) in all analyzed groups, with
maximum marking on neoplastic disease. On the other hand, the structural preservation of the
tissue, revealed by E-cadherin, was marked in reflux esophagitis and Barrett’s esophagus, in
contrast with the sparse immunoreaction in esophageal adenocarcinoma patients (p<0.001).
INTRODUÇÃO
O esôfago de Barrett (EB) é definido como uma condição pré-maligna, em que se
assinala a substituição do epitélio escamoso do esôfago distal por epitélio colunar, em
qualquer extensão, e caracteriza-se, histologicamente, pela presença de células mucíparas
caliciformes
1,2
.
O EB representa uma importante complicação da doença mais prevalente do
aparelho digestório, a doença do refluxo gastroesofágico (DRGE)
3
, sendo considerado, pela
comunidade científica internacional, como a principal lesão precursora do adenocarcinoma
esofágico.
Historicamente, atribui-se a Normann Barrett, no ano de 1950, a descrição da
síndrome do esôfago recoberto por mucosa colunar
4
. Allinson & Johnstone, por sua vez, em
1953, relacionaram a DRGE com o EB
5
, e Naef et al.
6
,
na sua série clássica em 1975, de uma
forma definitiva, correlacionaram a DRGE com o EB e com o adenocarcinoma esofágico.
De elevada e crescente prevalência na população ocidental
7,8
, estima-se que,
atualmente, a DRGE afete 40% dos adultos nos Estados Unidos da América do Norte (EUA)
9
.
No Brasil, em amplo estudo envolvendo vinte e duas cidades, com 14.000 mil indivíduos,
observou-se que 7,3% da população sofrem da DRGE
10
.
Por sua vez, supõe-se que a
prevalência do EB oscile entre 0,5% a 2% dos adultos no Ocidente
11
,
podendo, no entanto, ser
este percentual bem maior, uma vez que, conforme dados de autópsia, foi encontrada uma
prevalência vinte e uma vezes acima daqueles casos clinicamente diagnosticados
12
.
Há, também, relatos na literatura que referem ser assintomática a grande parte dos
pacientes portadores de EB, de forma que a maioria dos casos permanece, assim,
subdiagnosticada
12-14
.
Esse fato poderia explicar o aumento nas taxas de incidência do
adenocarcinoma do esôfago e da cárdia, nas últimas três décadas, nos países ocidentais
15,16
.
Dos portadores de esofagite por refluxo, estima-se que 10% evoluem para o esôfago
de Barrett
12,17
. Uma vez diagnosticado o EB, observa-se a progressão para a displasia de alto
grau em 5% dos casos, em cinco anos, quando se considera, inicialmente, a presença do
epitélio de Barrett sem displasia e, em 25% dos pacientes, naqueles casos com a displasia, à
princípio, de baixo grau
18
. Nas situações de displasia de alto grau, relata-se a presença do
câncer invasivo em percentual de 38% a 50% dos espécimes de biópsias
19
.
A DRGE, o esôfago de Barrett e o adenocarcinoma esofágico são doenças dos
tempos modernos.
Ao longo destas últimas três décadas, desde os relatos iniciais de Naef et al.
6
, quando
o adenocarcinoma esofágico raramente era diagnosticado, tem-se observado que esta
neoplasia tem apresentado um aumento uniforme na incidência, nos EUA e na Europa, em
proporções epidêmicas, com taxas que excedem as de quaisquer outras neoplasias
20-24
.
Atualmente, três dentre cinco neoplasias malignas do esôfago diagnosticadas são
adenocarcinomas
25
.
Com a definição da DRGE crônica e a sua principal seqüela, o EB, como fatores de
risco primários para o adenocarcinoma do esôfago
26
, e considerando o EB como a única lesão
precursora desta neoplasia maligna, a American Gastroenterology Association (AGA) tem
recomendado o rastreamento endoscópico naqueles pacientes portadores de sintomas crônicos
de DRGE
27
. Indica também, em consonância com outros autores, o seguimento periódico dos
pacientes reconhecidamente portadores do EB, com biópsias seriadas do epitélio metaplásico,
seguido do estudo histopatológico
27-29
.
Objetiva-se, desse modo, detectar o câncer e as suas lesões precursoras em estágios
precoces
26
,
de forma que se ofereça um melhor prognóstico aos pacientes,
com a perspectiva
de cura para uma patologia sabidamente letal
30-32
.
Entretanto, embora o adenocarcinoma esofágico encontre-se intimamente
relacionado com o EB, somente 5% dos pacientes portadores desta neoplasia têm um
diagnóstico prévio do EB
31,33,34
.
Ademais, apesar do câncer do esôfago ser uma das doenças mais letais do aparelho
digestório, de pobre prognóstico, com uma sobrevida média de cinco anos em torno de 10%
dos casos
35
, e mesmo já se conhecendo a sua lesão precursora, a maioria desses cânceres ainda
continua sendo diagnosticada tardiamente, quando não podem mais ser curados
36
.
A definição dos fatores de risco que apontam essa possível progressão neoplásica,
nos pacientes portadores do EB, reveste-se, portanto, de uma importância fundamental. Isto
porque não só permite que se selecionem, realmente, aqueles pacientes que ingressarão em
programas eficazes de seguimento e vigilância endoscópica, mas, também, possibilita que a
relação custo–benefício, do seguimento desses pacientes, seja, efetivamente, positiva, já que,
sabidamente, a maioria dos portadores dessa doença não evolui para o adenocarcinoma
esofágico
30,37,38
.
Não obstante, fatores de risco convencionais, clínicos e endoscópicos (sexo, idade,
extensão do epitélio de Barrett, presença do refluxo duodeno-gastro-esofágico, cronicidade do
refluxo, raça, índice de massa corpórea (IMC), história familiar de câncer, uso de
medicamentos com efeito sobre o esfíncter inferior do esôfago, infecção pelo Helicobacter
pylori, tabagismo e lesões no epitélio de Barrett, relacionados ao desenvolvimento do câncer
no EB, não apresentam a sensibilidade e/ou a especificidade necessárias a estratificação de
risco dos pacientes para o surgimento do câncer
13,27,39-48
.
Atualmente, a presença da displasia epitelial, definida histopatologicamente, tem
sido o marcador tecidual mais utilizado na estratificação de risco do EB, para o
desenvolvimento do adenocarcinoma, determinando, inclusive, o período e o intervalo da
vigilância endoscópica
29
. Contempla-se, nesta abordagem, a seqüência neoplásica descrita no
EB, de metaplasia, displasia de baixo grau, displasia de alto grau, carcinoma in situ e,
finalmente, câncer invasivo
49-51
.
Contudo, há várias restrições quando se considera a displasia como o único fator
preditivo do adenocarcinoma relacionado com o EB.
Variações intra e interobservadores no diagnóstico e na graduação
anatomopatológica da displasia
52
, incertezas a respeito da sua história natural
53,54
, e
dificuldades na distinção entre a displasia de baixo grau e atipia regenerativa, são alguns dos
fatores que têm limitado a sua aplicabilidade clínica.
Além disso, a displasia epitelial tem sido considerada um marcador imperfeito para o
câncer no EB, uma vez que a neoplasia precoce já é possível de ser encontrada,
aproximadamente, em um terço dos pacientes portadores de displasia de alto grau, quando são
submetidos a cirurgia
55
.
Contrariamente, pode, também, haver a regressão do epitélio
displásico, no seguimento dos pacientes portadores do EB
56,57
.
Observa-se, ademais, que nos portadores de displasia de alto grau não ocorrerá
evolução, invariavelmente, para o adenocarcinoma esofágico
54,58,59
, e que, pode ocorrer o
desenvolvimento do carcinoma do esôfago sem o diagnóstico prévio da displasia de alto
grau
60,61
. O significado clínico das displasias de baixo e alto grau permanece, portanto, ainda
controverso
2,52,53,62-64
.
Desta forma, métodos de rastreamento alternativos e de detecção precoce são
necessários para a identificação efetiva destes pacientes portadores do EB, com risco de
evoluírem para o câncer esofágico.
Novas estratégias têm investigado reais fatores de risco adicionais, de forma que,
correlacionados com as alterações histológicas e com os dados clínico-endoscópicos, sejam
capazes de predizer e identificar esse subgrupo de pacientes com possibilidades concretas para
o desenvolvimento do câncer esofágico.
Uma melhor compreensão dos eventos celulares e de biologia molecular, que
ocorrem na evolução neoplásica do EB, dentro da seqüência metaplasia–displasia–
adenocarcinoma descrita
49-51
,
tem auxiliado e permitido a busca desta abordagem.
No adenocarcinoma esofágico relacionado com o EB, tem-se observado que as
células metaplásicas são predispostas a desenvolver todas as características do processo da
carcinogênese em geral
49
, descritas por Hanahan e Weinberg
65
.
Esses autores identificaram
vários eventos biológicos, de forma que as células necessitam, para uma evolução neoplásica:
1) promover sinais de crescimento; 2) ignorar sinais inibitórios do crescimento; 3) evitar a
apoptose; 4) replicar sem limites; 5) sustentar a angiogênese; 6) invadir e proliferar.
Nowell
66
, em 1976, por sua vez, propôs que o câncer desenvolve-se como resultado
de uma instabilidade genética adquirida, predispondo, assim, a evolução de um clone de
células com erros genéticos acumulados. Estes clones adquirem, então, vantagens
proliferativas seletivas, de forma que, eventualmente, um subclone poderá progredir para o
câncer precoce.
Há evidências de que essa evolução clonal, postulada por Nowell, ocorre na maioria
dos cânceres humanos, inclusive no adenocarcinoma esofágico relacionado com o EB
67-70
.
Vários estudos têm demonstrado que nesta neoplasia ocorre este acúmulo de alterações
genéticas descritas, desde as células normais às células neoplásicas invasoras
51,71,72
, além das
anormalidades cromossômicas e mutações específicas nos genes de supressão tumoral p53 e
p16. Distúrbios no ciclo celular, como um aumento no número de células na fase S
(correspondente à síntese do DNA) e na fase G2 (pré-mitose), têm, igualmente, sido
observados e relatados
73
.
A aneuploidia (conteúdo anormal de DNA) e uma fração maior da fase G2/M do
ciclo celular das células metaplásicas,
têm sido, também, demonstradas na evolução
neoplásica do epitélio esofágico normal para o epitélio de Barrett
18,74,75
.
Segundo dados da
literatura, a aneuploidia é encontrada em 79 a 100% dos adenocarcinomas esofágicos
57,75-80
.
Todo esse acúmulo de alterações genéticas relatado, pode resultar na perda da função
de genes que, normalmente, bloqueiam o crescimento da célula, nos pontos de checagem do
ciclo celular (genes de supressão tumoral), ou pode ativar genes dominantes que estimulam o
crescimento, a diferenciação e a proliferação celular (proto-oncogenes). A ativação desses
oncogenes pode ser observada pelo aumento de suas expressões protéicas no tecido, as quais
são detectáveis na análise imunoistoquímica dos espécimes de biópsias.
Nesse contexto, o termo biomarcador tem sido introduzido e utilizado, aplicando-se
esta denominação a qualquer medida biológica que possa evidenciar, no tecido, essa série de
fatores imunoprotéicos, correspondentes às várias alterações genéticas descritas, e, por
consegüinte, permita predizer, com segurança, aqueles indivíduos, portadores do EB, que
poderão, ou não, evoluir para o adenocarcinoma esofágico.
A literatura sobre biomarcadores moleculares no esôfago de Barrett é bastante
ampla, envolvendo vários estudos, desde a pesquisa básica até estudos de base populacional.
Atualmente, já existe mais do que 60 biomarcadores descritos para o EB
81,82
.
O p53 é um gene de supressão tumoral localizado no braço curto do cromossomo 17,
tendo um importante papel no crescimento e na proliferação celular. Influencia, de forma
supressora, a instabilidade genômica, promovendo a apoptose e modulando a diferenciação
celular. O produto de um gene p53 intacto impede a célula, com danos ao DNA, de entrar no
ciclo celular na fase S, no ponto de checagem G1, conduzindo a célula ao bloqueio na
progressão do ciclo, promovendo, posteriormente, reparo no DNA ou a apoptose da célula
83
.
Desse modo, a proteína p53 é considerada o “guardião do genoma”.
As mutações e as deleções do gene de supressão tumoral p53 são as lesões genéticas
mais comuns dos cânceres humanos. A meia-vida prolongada da proteína p53 mutante (a
mutação estabiliza a proteína), e o aumento na sua concentração intracelular, permitem a
análise imunoistoquímica.
No processo inflamatório crônico observado na DRGE, há uma sobrecarga
intracelular de radicais de oxigênio, que pode levar a mutações de vários genes relacionados
com o câncer, inclusive com o gene de supressão tumoral p53
84
.
Há evidências de que estas
alterações ocorram de uma forma freqüente no adenocarcinoma esofágico, indicando, assim,
que este gene está associado à degeneração maligna do epitélio de Barrett
85-87
.
Dados na literatura também têm demonstrado a importância do p53 na manutenção
da estabilidade do genoma
88
. Anormalidades deste gene precedem o desenvolvimento da
aneuploidia no EB, podendo ser, desse modo, um importante marcador molecular na
determinação do risco para o adenocarcinoma no EB, sobretudo se for associado com a
detecção da aneuploidia
89
.
No desenvolvimento e surgimento do adenocarcinoma no epitélio de Barrett, a
proliferação celular é, também, considerada como uma de suas etapas mais precoces.
Populações normais de células em divisão mantêm o equilíbrio entre a proliferação celular e a
apoptose, conservando constante o número de células. Distúrbios neste equilíbrio podem
favorecer a formação e a progressão tumoral
90
. Do ponto de vista imunoistoquímico, a
proliferação celular pode, também, ser avaliada com o uso de anticorpos monoclonais, que
reconhecem os antígenos expressos no núcleo durante esse período.
Vários estudos têm utilizado estes anticorpos relacionados com os antígenos Ki-67 e
PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular), para se avaliar as propriedades proliferativas
do EB e do adenocarcinoma esofágico
91-93
.
O estudo imunoistoquímico, combinado, da expressão do p53 e do Ki-67 pode,
também, proporcionar um visão mais aprofundada da proliferação celular na metaplasia de
Barrett e na displasia associada, respectivamente, permitindo, assim, obter-se informações
sobre o potencial neoplásico desse epitélio. Ademais, estas análises objetivas e quantitativas
têm permitido a reprodutibilidade das avaliações anatomopatológicas e estabelecido
diferenças diagnósticas significativas, não obtidas, somente, com a avaliação microscópica,
qualitativa, habitual
94
.
A apoptose, considerada como um dos fatores protetores da célula, é, de forma
semelhante, um dos mecanismos envolvidos na carcinogênese esofágica. Na apoptose normal,
ocorre a remoção do DNA danificado e das células geneticamente alteradas, que podem
interferir na função celular normal. Um aumento dos níveis de apoptose encontra-se associado
com um decréscimo no crescimento celular. Contrariamente, a inibição da apoptose (um dos
eventos precoces na seqüência evolutiva tumoral do epitélio de Barrett), promove um
incremento na sobrevida da célula, e está diretamente relacionada com a progressão
neoplásica. A análise do mecanismo da apoptose também pode ser realizada pelo estudo
imunoistoquímico.
As ciclooxigenases (COXs) são enzimas–chaves relacionadas com a produção das
prostaglandinas, a partir do ácido araquidônico. Altos níveis de prostaglandinas têm potente
efeito imunomodulatório, como a inibição de citocinas e a proliferação de linfócitos, que têm,
também, um importante papel na carcinogênese.
Estudos têm demonstrado que, a injúria contínua do refluxato gastroduodenal para o
esôfago induz a síntese e a liberação de mediadores inflamatórios, inclusive as
prostaglandinas e as citocinas pró-inflamatórias, que podem causar danos à mucosa esofágica,
com um papel definitivo, por consegüinte, na progressão neoplásica do EB
95-97
.
Duas isoformas de COXs foram descritas: COX-1 e COX-2, sendo ambas reguladas
por diferentes mecanismos e tendo diferentes padrões de expressão
98
. A COX-1 é
predominantemente constitutiva e a COX-2 está normalmente ausente na maioria dos tecidos,
no entanto, esta pode ser induzida por estímulos inflamatórios, citocinas, estímulos
mitogênicos, fatores de crescimento e fatores promotores de tumores. Por outro lado, pode ser
suprimida pelos genes de supressão tumoral
99-103
.
A COX-2 encontra-se envolvida nos vários processos necessários ao
desenvolvimento das neoplasias, como a própria apoptose, a adesão celular, a invasão, a
metástase e a angiogênese
104
, relatando-se níveis aumentados em diversas neoplasias
malignas
105,106
.
Pesquisas in vitro têm relatado que esta expressão aumentada, na seqüência
carcinogenética do EB, reduz a apoptose, estimula o poder de invasão das células malignas e
promove a angiogênese, mediante efeitos parácrinos e autócrinos
104,107-114
.
Níveis elevados da COX-2 têm sido, efetivamente, relatados no esôfago de Barrett e
no carcinoma epidermóide do esôfago, observando-se percentuais de expressão, no
adenocarcinoma esofágico, em torno de 70% a 80%
96,115,116
. A COX-2, com esses níveis de
expressão, tem sido definida como um fator prognóstico independente na neoplasia esofágica
relacionada ao EB
117
.
A E-caderina, presente à superfície de todas as células epiteliais, está ligada ao
citoesqueleto por meio das cateninas, no citoplasma da célula, tendo uma importante função
na adesividade e na interação das células. Quebras nessas pontes intercelulares têm, também,
um papel fundamental na patogênese das neoplasia malignas
118-125
.
Níveis normais da E-caderina são observados no epitélio esofágico normal,
contudo,
no epitélio de Barrett, à medida que se evolui na seqüência neoplásica para o adenocarcinoma
esofágico, assinala-se uma redução progressiva dos índices de expressão destas moléculas.
Níveis reduzidos nas imunoexpressões têm, também, sido evidenciados nos graus
progressivos das displasias, encontrando-se, da mesma forma, relacionados com os
mecanismos de invasão e metastatização neoplásicos
118,119,126-128
.
Fatores de crescimento são igualmente importantes na regulação e na diferenciação
celular. Expressões anormais dos fatores de crescimento, como o EGF (fator de crescimento
epidérmico), o TGF-alfa (fator de transformação do crescimento-alfa) e o EGFR (receptor do
fator de crescimento epidérmico), estão associadas com a mitogênese e com a carcinogênese.
O c-erbB-2 é um proto-oncogene que codifica uma glicoproteína altamente
homóloga, porém distinta, ao EGFR e está relacionada com a diferenciação e com a
proliferação celular
129
. Apresenta-se superexpresso em vários adenocarcinomas,
correlacionando-se com a sobrevida dos pacientes
130
.
Expressão aumentada do c-erbB-2 foi
relatada em 11 a 73% dos carcinomas esofágicos invasivos, no entanto, foi ausente nas áreas
displásicas, sugerindo ser, efetivamente, um evento tardio na seqüência neoplásica do esôfago
de Barrett
131
.
Todos estes processos moleculares descritos previamente, com os seus respectivos
biomarcadores, antecedem as alterações morfológicas para o diagnóstico da displasia, e seus
diferentes graus, no esôfago de Barrett.
O emprego desses marcadores moleculares, em forma de painel, ou de um perfil
imunoistoquímico, no seguimento dos pacientes portadores do EB, tem-se apresentado como
ferramenta clínica importante e promissora, na identificação dos pacientes realmente de risco
para o desenvolvimento do adenocarcinoma esofágico. Além disso, apresentam o potencial
para permitir, juntamente com os dados clínicos, endoscópicos e anatomopatológicos, a
otimização e a padronização dos programas atuais de vigilância.
A combinação desses biomarcadores, validados através de um painel
imunoistoquímico, tem demonstrado ser, também, um instrumento clínico-laboratorial com
potencial para ser empregado na monitorização da eficácia dos tratamentos conservadores das
lesões displásicas, associadas à DRGE. Ademais, oferece a perspectiva de novas estratégias
terapêuticas, a exemplo da quimioprofilaxia, em pacientes selecionados
132
.
1.1 Objetivos
Estabelecer e comparar, por meio de técnica imunoistoquímica, o perfil da
imunoexpressão tecidual dos biomarcadores moleculares p53, c-erbB-2, E-caderina, COX-2 e
Ki-67, em três fases distintas do espectro da doença do refluxo gastroesofágico,
respectivamente, na esofagite por refluxo, no esôfago de Barrett e no adenocarcinoma
associado ao esôfago de Barrett.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
2.1 Local do estudo
O estudo foi desenvolvido na cidade de João Pessoa, na Paraíba, no Endocentro
(clínica privada de gastroenterologia e endoscopia digestiva) e no Virchow (laboratório
médico de patologia celular). Os dados clínico-endoscópicos de oito pacientes foram obtidos
de outras instituições privadas de gastroenterologia, cirurgia do aparelho digestivo e
endoscopia digestiva: em João Pessoa (Clínica Cirúrgica Dr. Gilson do Vale - 01 paciente;
Centro Médico Dr. Luiz Antônio Cavalcante da Fonsêca - 02 pacientes; Centro de Cirurgia do
Aparelho Digestivo-CECAD - 01 paciente; CEDIPA - Centro de Endoscopia Digestiva da
Paraíba - 01 paciente; Clínica Cirúrgica Dr. Cássio Virgílio de Oliveira - 01paciente), e em
Recife (EndoSabin - 02 pacientes). Os dados anatomopatológicos de 05 pacientes foram
obtidos em João Pessoa, no Histo (02 pacientes), e, em Recife, no SPAC (03 pacientes),
ambos laboratórios médicos de patologia celular. Todos os demais pacientes pesquisados
foram provenientes do Endocentro e do Virchow. As análises imunoistoquímicas foram
integralmente realizadas no laboratório Virchow em João Pessoa.
2.2 Desenho do estudo
Estudo descritivo, ambidirecional, tipo série de casos, no qual foram avaliados,
simultaneamente, em três fases distintas, evolutivas, do espectro da doença do refluxo
gastroesofágico, os dados clínicos, endoscópicos, anatomopatológicos e os respectivos painéis
de imunoexpressão tecidual, de cinco biomarcadores moleculares selecionados.
2.3 Definição de critérios
2.3.1 Critérios endoscópicos
a) Esofagite por refluxo (grupo I)
Na definição endoscópica da esofagite por refluxo, foi utilizada a classificação de
Savary-Miller modificada (Quadro 1).
b) Esôfago de Barrett (grupo II)
O critério endoscópico utilizado para a definição do esôfago de Barrett foi o
estabelecido e respaldado pelo I Consenso Brasileiro da Doença do Refluxo
Gastroesofágico
133
, pelo American College of Gastroenterology
2
e pela Organização Mundial
de Saúde
134
,
nos quais se denomina o esôfago de Barrett como a substituição do epitélio
escamoso estratificado do esôfago por epitélio colunar, contendo células intestinalizadas
(metaplasia intestinal), no estudo anatomopatológico, em qualquer extensão do órgão.
Com o propósito de excluir metaplasia intestinal gástrica (da cárdia), ou da transição
esôfago-gástrica – TEG (metaplasia intestinal da TEG), este estudo somente utilizou epitélios
de Barrett com, no mínimo, 1,0cm de extensão acima da TEG, definida, na endoscopia, como
o limite máximo, cranial, da prega gástrica.
A extensão do epitélio de Barrett, estabelecida endoscopicamente, correspondeu ao
segmento do esôfago recoberto pelo epitélio colunar, existente entre o limite cranial da prega
gástrica e o início da junção escamo-colunar, deslocada proximalmente.
c) Adenocarcinoma esofágico associado ao esôfago de Barrett (grupo III).
A classificação macroscópica utilizada na definição endoscópica do adenocarcinoma
esofágico foi definida pela Associação Japonesa do Câncer Gástrico, também aplicada para o
carcinoma esofágico (Quadro 2).
Com o propósito de excluir tumores da junção esôfago-gástrica, ou tumores gástricos
com invasão esofágica, este estudo somente incluiu os casos em que foi evidenciado epitélio
metaplásico tipo intestinal especializado, corados com a Hematoxilina-Eosina (HE), ao lado
do adenocarcinoma esofágico, independentemente da sua extensão.
Quadro 1. Classificação da esofagite por refluxo de Savary-Miller modificada.
Grau Aspecto endoscópico
I
Uma ou mais erosões, lineares ou ovaladas, em uma
única prega longitudinal.
II
Várias erosões em mais de uma prega longitudinal,
confluentes ou não, mas que não ocupam toda a
circunferência do órgão.
III
Erosões confluentes que ocupam toda a
circunferência do órgão.
IV
Lesões crônicas : úlcera(s) e estenose(s), isoladas ou
associadas às lesões dos graus I, II e III.
V
Epitélio colunar em continuidade com a linha Z:
circunferencial ou não, de extensão variável,
associado ou não às lesões dos graus I, II, III e IV.
Fonte: Breyer & Maguilnik
135
Quadro 2. Classificação endoscópica do adenocarcinoma esofágico, definida pela Associação
Japonesa do Câncer Gástrico, também aplicada para o carcinoma esofágico.
Tipo Aspecto endoscópico
0
Superficial : polipóide, elevado, plano, deprimido,
ulcerado.
1
Avançado : polipóide de base larga.
2
Avançado : ulcerado de bordas elevadas e bem
delimitadas.
3
Avançado : ulcerado, de bordas infiltrativas.
4
Avançado : infiltração difusa, sem ulceração.
5
Avançado : não-classificável.
Fonte: Maluf, Moura & Sakai
136
2.3.2 Critérios anatomopatológicos
Os critérios anatomopatológicos utilizados na definição dos distintos grupos do
presente estudo foram os descritos a seguir, após coloração das lâminas com HE e exame com
microscopia óptica.
a) Esofagite por refluxo (grupo I).
As características histológicas da esofagite por refluxo encontradas nas biópsias
endoscópicas, estão demonstradas no quadro 3.
b) Esôfago de Barrett (grupo II)
Para a definição histológica do esôfago de Barrett, considerou-se fundamental e
necessária a presença do epitélio colunar metaplásico, definido pela presença das células
caliciformes no epitélio colunar, substituindo o epitélio escamoso estratificado do esôfago, em
qualquer extensão do órgão, e sendo, indubitavelmente, positivas a coloração padrão com HE.
Epitélios colunares com células pseudocaliciformes não foram incluídos no estudo.
c) Adenocarcinoma esofágico associado ao esôfago de Barrett (grupo III)
As alterações citológicas e arquiteturais definidas na microscopia óptica, após
coloração com HE, foram, para o adenocarcinoma esofágico, estabelecidas pela classificação
de tumores da Organização Mundial da Saúde (OMS)
134
.
Quadro 3. Características histológicas das biópsias endoscópicas nos portadores de DRGE.
Úlceras, erosão, tecido de granulação.
Dilatação e congestão de vasos papilares.
Exocitose de células inflamatórias no epitélio escamoso:
• Neutrófilos.
• Eosinófilos.
• Linfócitos.
Alterações epiteliais escamosas:
• Hiperplasia de células basais.
• Alongamento de cones interpapilares.
Fonte : DeNardi & Riddel
137
2.3.3 Critérios de inclusão
Foram selecionadas e incluídas no estudo as amostras das lâminas dos pacientes com
os seguintes diagnósticos endoscópicos e anatomopatológicos: esofagite por refluxo (grupo I),
esôfago de Barrett (grupoII) e adenocarcinoma associado ao esôfago de Barrett (grupo III), de
ambos os sexos, conforme os critérios estabelecidos nos itens 2.3.1 e 2.3.2.
2.3.4 Critérios de exclusão
Foram excluídos do estudo aqueles pacientes que se recusaram a participar, aqueles
em uso de antiinflamatórios ou de inibidores da bomba de prótons, em tratamento
quimioterápico ou radioterápico, e os que não se enquadraram nos critérios endoscópicos e
anatomopatológicos definidos nos itens 2.3.1 e 2.3.2.
2.4 Caracterização da amostra
Os casos do presente estudo foram do Estado da Paraíba e de Pernambuco (três casos
do grupo III), sendo a maioria residente na cidade de João Pessoa. Foram selecionados, entre
julho de 1994 e setembro de 2005. Ao final das avaliações dos prontuários, verificou-se que
64 pacientes satisfaziam os critérios de inclusão e exclusão definidos previamente, sendo
então distribuídos, segundo os objetivos do estudo, em três grupos:
Grupo I: esofagite por refluxo: 23 pacientes;
Grupo II: esôfago de Barrett sem displasia: 30 pacientes;
Grupo III: adenocarcinoma esofágico associado com o esôfago de Barrett:
11 pacientes.
As análises anatomopatológicas foram inicialmente realizadas nos Laboratórios
Médicos de Patologia Celular, Virchow e Histo (02 casos) em João Pessoa, e SPAC (03casos)
em Recife, no mesmo período previamente descrito. Os estudos imunoistoquímicos foram
todos procedidos posteriormente no Laboratório Virchow, no período de outubro de 2005 a
janeiro de 2006.
2.5 Procedimentos e técnicas
2.5.1 Dados clínicos
Dados referentes à idade, sexo, queixa principal e tempo da sintomatologia foram
coletados a partir das informações dos prontuários em arquivo e registrados em protocolo
próprio (Anexo 1), sendo então cruzados entre si.
2.5.2 Procedimento endoscópico
As endoscopias digestivas foram, na maioria, realizadas pelo autor deste trabalho -
GNS, segundo as normas e padrões técnicos da Sociedade Brasileira de Endoscopia Digestiva
(SOBED), com videoendoscópio padrão Pentax®-EG2901 e processadora Pentax®-EPM
3000, exceto em sete casos do grupo III, que foram realizados por endoscopistas do aparelho
digestório, de outras clínicas privadas de João Pessoa e Recife, respectivamente.
O exame foi procedido após jejum prévio de oito horas, com o paciente em decúbito
lateral esquerdo, sob sedação venosa leve (quando assim indicada). A realização das biópsias
foi efetuada com a pinça padrão da Pentax® (7mm de tamanho e fenestrada).
No grupo I (esofagite por refluxo) e no grupo III (adenocarcinoma relacionado com o
esôfago de Barrett), as biópsias foram procedidas diretamente sobre a lesão. No grupo II
(esôfago de Barrett), as biópsias foram realizadas cranialmente, em pontos eqüidistantes,
iniciando às doze, três, seis e nove horas, progressivamente a cada 1,0cm, no epitélio de
Barrett circunferencial, ou, diretamente, sobre a projeção parcial da mucosa tipo gástrica
acima do limite cranial da prega gástrica, no epitélio de Barrett parcial, também no sentido
cranial, até a neojunção escamo-colunar, em ambas as situações.
As medidas da extensão do epitélio de Barrett, e dos locais para a realização das
biópsias, foram realizadas considerando-se, indiretamente, a distância do endoscópio
observada na topografia dos dentes incisivos centrais.
Os espécimens de biópsias, colhidos durante o procedimento endoscópico, foram
imediatamente imersos em solução tamponada de formaldeído a 10%, sendo então
devidamente identificados e encaminhados para estudo histopatológico.
2.5.3 Procedimento anatomopatológico
O estudo anatomopatológico de todos os pacientes, previamente ao estudo
imunoistoquímico, foi realizado pela orientadora desse trabalho, MSTA, em microscopia
óptica, abrangendo técnicas histológicas convencionais. Outro patologista, AFLJ, foi
convocado para uma segunda análise, de forma que os resultados finais do estudo histológico
fornecessem um diagnóstico consensual.
Os espécimens de biópsias endoscópicas foram recebidos para exame, devidamente
identificados e imersos em solução tamponada de formaldeído a 10%. O processamento
histotécnico incluiu etapas sucessivas de desidratação e diafanização das amostras teciduais,
antecedendo o emblocamento em parafina. Cortes histológicos foram efetuados no micrótomo
rotativo manual, com a espessura de 3 a 4 micrômetros, perpendiculares à superfície da
mucosa, e, posteriormente, submetidos a coloração por solução de HE e montagem de
lamínulas em Entellan (Merck 1,07961).
2.5.4 Técnica imunoistoquímica
O estudo imunoistoquímico foi realizado pela mesma equipe de profissionais,
precedentemente enunciada, que emitiu, individualmente, sua interpretação para cada
imunorreação efetuada. Os casos de discordância foram reavaliados conjuntamente pelos dois
patologistas, de modo a se obter pareceres consensuais, nos escores aplicados aos resultados
finais.
A técnica imunoistoquímica empregada seguiu protocolo da SBP, adaptada às
condições laboratorias locais. Efetuaram-se cortes histológicos com espessura variável de 3 a
4 micrômetros, dispostos em lâminas previamente revestidas com solução a 4% de
dimetiletoxisilano (Sigma A3648) e acetona. A desparafinização ocorreu em estufa a 60ºC,
por 24 horas, com posterior submissão do material a banhos sucessivos de imersão em xilol,
álcool e água corrente. Procedida a inibição das peroxidases endógenas, em solução de
peróxido de hidrogênio a 3% em metanol durante 10 minutos, todos os cortes histológicos
foram submetidos ao processo de recuperação antigênica, em solução de citrato 10mM / pH
6,0, através da exposição das amostras ao calor úmido, utilizando-se banho-maria específico
para esse tipo de procedimento, a uma temperatura de 96°C. Após esfriamento e lavagens em
PBS (solução salina tamponada com fostato 0,01M / pH 7,4), realizou-se incubação em
câmara úmida, com o anticorpo secundário, durante 20 minutos, a uma temperatura ambiente.
Subseqüentemente, procedeu-se incubação das amostras com os anticorpos monoclonais
selecionados para o presente estudo, diluídos em solução PBS, conforme discriminados no
quadro 4. A incubação foi realizada também em câmara úmida, overnight, a 4°C. No processo
de revelação utilizou-se o Complexo Estreptavidina-biotina-peroxidase (Kit StrepABC-
Vectastain®) e solução reveladora substrato-cromógeno DAB plus (diaminobenzidina).
Controles positivos e negativos, internos e externos, atestaram a fidelidade da reação. Ao
final, as lâminas foram contracoradas por hematoxilina de Harris e montadas com lamínulas
em Entellan (Merck 1,07961), para leitura em microscopia óptica comum.
Os resultados foram considerados positivos quando apareceram colorações ou
granulações castanho-douradas, nos citoplasmas ou núcleos celulares.
Os anticorpos utilizados, as diluições e o fabricante encontram-se sumarizados no
quadro 4.
Em todas as amostras definidas para os três grupos, foi realizado, individualmente, o
painel dos seguintes biomarcadores moleculares: p53, c-erbB-2, a E-caderina, o COX-2 e o
Ki-67.
Quadro 4. Anticorpos monoclonais utilizados na técnica imunoistoquímica.
Anticorpo Clone Diluição Origem
p53 PAb240 1:200 Dako
Ki-67 MIB 1 1:200 Dako
c-erbB-2 Produto de oncogene 1:400 Dako
E-caderina NCH-38 1:200 Dako
COX-2 CX-294 1:100 Dako
2.5.5 Metodologia da descrição dos resultados
a) Dados clínicos e endoscópicos
Foram obtidos e tabulados para cada grupo conforme o preenchimento do modelo de
ficha tipo A (Anexo 1).
b) Análise anatomopatológica
A análise histológica dos fragmentos das biópsias endoscópicas, juntamente com as
informações dos laudos da endoscopia digestiva, definiram e classificaram os pacientes dentro
dos três grupos de estudo, para posterior análise imunoistoquímica, conforme o modelo de
ficha tipo B (Anexo 1).
c) Análise imunoistoquímica
Na análise imunoistoquímica de todos os imunomarcadores teciduais (antígeno de
proliferação celular Ki-67, gene de supressão tumoral p53, E-caderina, COX–2 e o proto-
-oncogene c-erbB-2), foram obedecidos a metodologia de interpretação descrita a seguir, e
preenchidos conforme o modelo de ficha tipo B (Anexo 1), com base nos critérios descritos
em 2001, por Morris et al.
138
.
1) Biomarcadores teciduais nucleares: p-53 e Ki-67
Os resultados da imunorreação em cada grupo foram definidos separadamente,
mediante uma escala com nível de mensuração ordinal, baseada na intensidade da
imunomarcação nuclear, com escore variável de 0+ a 4+, avaliada de forma semiquantitativa,
pela qualidade da expressão antigênica em células glandulares, conforme o que está descrito a
seguir:
0+ = Marcação negativa ou ausência de expressão;
1+ = Marcação positiva focal;
2+= Marcação positiva multifocal;
3+= Marcação positiva: moderada e difusa;
4+= Marcação positiva intensa.
O padrão de expressão também foi definido, de forma semiquantitativa, por meio da
média de uma análise percentual dos núcleos imunomarcados, sobre uma total de cem células,
em quatro campos de grande aumento por lâmina, categorizados em escore variável de 1 a 4,
conforme o que está descrito a seguir:
1= <25% de núcleos imunomarcados;
2= 25-50% de núcleos imunomarcados;
3= >50-75% de núcleos imunomarcados;
4= > 75% de núcleos imunomarcados.
2) Biomarcadores teciduais citoplasmáticos : COX-2 e E-caderina.
Os resultados da imunorreação em cada grupo foram definidos separadamente,
mediante uma escala com nível de mensuração ordinal, baseada na intensidade da
imunomarcação citoplasmática, com escore variável de 0+ a 4+, avaliada de forma
semiquantitativa, pela qualidade da expressão antigênica em células glandulares.
0+ = Marcação negativa ou ausência de expressão;
1+ = Marcação positiva focal;
2+= Marcação positiva multifocal;
3+= Marcação positiva: moderada e difusa;
4+= Marcação positiva intensa.
O padrão de expressão também foi definido, de forma semiquantitativa, por meio da
média de uma análise percentual de células com expressão antigênica citoplasmática, sobre
uma total de cem células, em quatro campos de grande aumento, por lâmina, categorizadas em
escore variável de 1 a 4, conforme o que está descrito a seguir:
1= <25% células com marcação citoplasmática;
2= 25-50% células com marcação citoplasmática;
3= >50-75% células com marcação citoplasmática;
4= > 75% células com marcação citoplasmática.
A qualidade da imunomarcação (escore 0, 1, 2, 3, 4) e o escore percentual
supradescrito, correspondente a 1, 2, 3 e 4, foram multiplicados entre si, de forma que se
obteve um escore semiquantitativo final para os imunomarcadores descritos acima, cujos
resultados deverão variar, no mínimo de zero a, no máximo, dezesseis, obtendo-se então um
escore final para cada biomarcador, com a seguinte pontuação:
Marcação Ausente - 0 ponto;
Marcação Fraca - 1, 2 e 3 pontos;
Marcação Moderada - 4, 6 e 8 pontos;
Marcação Forte - 9 , 12 e 16 pontos.
Para a validação do escore de cada lâmina, os procedimentos descritos foram
efetuados por dois patologistas, objetivando identificar possíveis variações entre os
observadores. Para tanto, os dados resultantes da análise histológica foram omitidos para o
segundo observador, de forma que não influíssem nos resultados. Nos casos de discrepância,
os resultados foram também reavaliados conjuntamente pelos dois patologistas, para que
houvesse um escore consensual final.
3) Biomarcador tecidual: c-erbB-2
Os resultados da imunorreação, em cada grupo, foram definidos separadamente, por
meio de uma escala com nível de mensuração ordinal, baseada na intensidade da
imunomarcação de membrana citoplasmática de células glandulares, com escores variáveis de
0+ a 4+, conforme o que está descrito a seguir:
0+= Ausência de marcação de membrana celular ou marcação apenas
citoplasmática;
1+= Marcação focal ou fracamente perceptível, em membranas celulares. Este
padrão é, imunoistoquimicamente, reportado como negativo;
2+= Marcação moderada de membrana, na maioria das células;
3+= Forte marcação de membrana celular (superexpressão).
2.6 Limitações metodológicas do estudo
a) Como os dados foram obtidos a partir dos prontuários médicos, algumas
informações não estavam disponíveis por completo;
b) Possíveis fontes de vieses:
Viés de seleção: heterogeneidade da amostra em relação ao sexo, idade,
tempo de duração dos sintomas, queixas clínicas e extensão do epitélio de
Barrett;
Viés de classificação: pacientes no grupo de esofagite por refluxo com
diferentes graus de severidade de esofagite (graus: I, II, III e IV);
Viés de aferição e interpretação:
♦ Pelo endoscopista na extensão do epitélio de Barrett;
♦ Pelo anatomopatologista na análise semiquantitativa da imunorreação;
c) Não foram identificados fatores de confusão no presente estudo.
2.7 Aspectos Éticos do estudo
O presente estudo foi realizado após a aprovação e autorização do Comitê de Ética
em Pesquisa, do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba, com a
certidão sob o número de protocolo 111/05, aprovado no dia 25 de maio de 2005 (Anexo 2).
As análises dos dados clínicos nos prontuários médicos e os exames laboratoriais,
anatomopatológicos e imunoistoquímicos, só foram procedidos após os pacientes e/ou
responsáveis assinarem o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 3).
2.8 Análise estatística
Todos os dados dos pacientes foram preenchidos e tabulados conforme os modelos
de ficha anexos (fichas–padrão, tipo A e B ) - (Anexo 1).
Os resultados da imunorreação dos biomarcadores teciduais, em cada grupo, foram
definidos, separadamente, mediante uma escala com nível de mensuração ordinal. A análise
comparativa entre os grupos foi realizada através do teste exato de Fisher (distribuição do
sexo), do Score test de tendência (positividade dos biomarcadores teciduais), da análise de
variância (comparação da idade) e do teste de Kruskal−Wallis (comparação do tempo de
queixas e dos escores finais de imunoexpressão tecidual dos biomarcadores). As comparações
pareadas foram realizadas com o teste de Marascuillo, teste de Dunn e o teste de Tukey. O
teste binomial foi utilizado para verificar se entre os pacientes com adenocarcinoma
esofágico, acima de 50% deles apresentavam neoplasia avançada. Igualmente, este mesmo
teste foi utilizado para verificar se, no grupo III, mais de 50% dos pacientes eram do sexo
masculino. Em todos os testes foi adotado o nível de significância de 5%.
RESULTADOS
3.1 Dados clínicos
Neste estudo foram incluídos 64 pacientes: 39 (60,9%) do sexo masculino e 25
(39,1%) do feminino, com a média de idade de 52,3 anos, variando de 13 a 87 anos. Foram
distribuídos em 03 grupos, sendo 23 no grupo I, 30 no grupo II, e 11 no grupo III. Os dados
referentes à distribuição por sexo, idade, queixas clínicas e duração da queixa principal, em
cada grupo, encontram-se discriminados, respectivamente, nas tabelas 1, 2 e 3. Não foi
possível recuperar as informações clínicas de um paciente do grupo III.
O resultado da análise da variância mostra que as médias das idades dos pacientes
apresentaram diferenças estatisticamente significantes (p=0,011). O resultado do teste de
comparações múltiplas de Tukey indica que só a média de idade do grupo III apresentou
diferença significante em relação às médias do grupo I (p=0,021) e do grupo II (p=0,012),
respectivamente. Entre os grupos I e II não houve diferença estatística significante (p>0,05).
Em relação à análise comparativa entre os grupos, para distribuição do sexo, através
do teste exato de Fisher, observa-se que não houve homogeneidade nas amostras (p=0,048). O
teste de Marascuillo mostra que a proporção de homens foi significativamente maior no grupo
III, em comparação com o grupo I (p=0,030). Em relação aos outros pares de grupos, as
diferenças não foram significantes (grupo I vs grupo II: p=0,997; grupo II vs
grupo III: p=0,090). O resultado do teste binomial indica que, no grupo III, a proporção de
pacientes do sexo masculino foi significativamente maior do que 50,0% (p = 0,012).
Na análise estatística da duração das queixas, o resultado do teste de Kruskal−Wallis
indica que houve diferenças significantes entre os três grupos de pacientes (p=0,004). As
comparações pareadas, realizadas pelo teste de comparações múltiplas de Dunn, mostraram
que o grupo III apresentou uma distribuição de tempo de queixas significativamente diferente
daquelas observadas nos grupos I e II (grupo III vs grupo I: p=0,026; grupo III vs grupo II:
p<0,001); entre os grupos I e II a diferença não foi estatisticamente significante (p=0,172).
Tabela 1. Dados clínicos dos pacientes do grupo I (esofagite por refluxo).
Dados clínicos
n
%
Pacientes
23
Sexo
Masculino 13
Feminino 10
Idade em anos (média)
13-86 (49,9)
Queixa principal
Pirose 17 73,9
Epigastralgia 11 47,8
Regurgitação 8 34,8
Vômitos 4 17,4
Sensação de entalo 4 17,4
Odinofagia 2 8,7
Dor torácica de origem
não-cardíaca (DTNC)
2 8,7
Dor abdominal 2 8,7
Outros* 4 17,4
Tempo de história clínica
Dias (< 30) 5 21,7
Meses (01-12) 7 30,4
Anos (> 01) 11 47,8
*Outros: náuseas, empachamento, faringite e emagrecimento.
Fonte: fichas clínicas dos pacientes (arquivo privado).
Tabela 2. Dados clínicos dos pacientes do grupo II (esôfago de Barrett).
Dados clínicos
n
%
Pacientes
30
Sexo
Masculino 16
Feminino 14
Idade em anos (média)
23-77 (49,5)
Queixa principal
Pirose 21 70,0
Epigastralgia 13 43,3
Regurgitação 6 20,0
Plenitude gástrica 3 10,0
Tosse seca 3 10,0
Pigarro 2 6,7
Disfagia 1 3,3
Odinofagia 1 3,3
Dor torácica de origem
não-cardíaca (DTNC)
1 3,3
Globo faríngeo 1 3,3
Tempo de história clínica
Dias (< 30) 2 6,7
Meses (01-12) 9 30,0
Anos (> 01) 19 63,3
Fonte: fichas clínicas dos pacientes (arquivo privado).
Tabela 3. Dados clínicos dos pacientes do grupo III (adenocarcinoma relacionado com o
esôfago de Barrett).
Dados clínicos
n
%
Pacientes
11
Sexo
Masculino 10
Feminino 1
Idade em anos (média)
45-87 (64,73)
Queixa principal
Disfagia 8 72,7
Emagrecimento 5 45,5
Epigastralgia 2 18,2
Vômitos 1 9,09
Hemorragia digestiva alta 1 9,09
Pirose/Regurgitação 1 9,09
Não disponível 1 9,09
Tempo de história clínica
Dias (< 30) 5 45,45
Meses (01-12) 4 36,36
Anos (> 01) 1 9,09
Fonte: fichas clínicas dos pacientes (arquivo privado).
3.2 Dados endoscópicos
Os dados referentes aos resultados das endoscopias digestivas altas, realizadas nos
três grupos do presente estudo, encontram-se discriminados nas tabelas 4, 5 e 6,
respectivamente. Entre os 11 pacientes do grupo III, portadores de adenocarcinoma esofágico,
8 (72,7%) apresentaram aspecto endoscópico de lesão avançada e 3 (27,3%) de lesão
superficial. O resultado do teste binomial indica que a proporção de adenocarcinoma
esofágico avançado não foi significativamente maior do que 50,0% (p=0,227). A média da
extensão do epitélio de Barrett, no grupo II, entre os 30 pacientes estudados, foi igual a
2,53cm, variando de 1 a 11cm.
Tabela 4. Dados endoscópicos dos pacientes com esofagite por refluxo (grupo I).
Esofagite por refluxo
n
%
Pacientes
23
Grau I
12 52,2
Grau II
4 17,4
Grau III
3 13,0
Grau IV
4 17,4
Grau V
0 0
Fonte: fichas clínicas dos pacientes (arquivo privado); classificação de esofagite por refluxo de Savary-Miller modificada: Breyer &
Maguilnik
135
Tabela 5. Dados endoscópicos dos pacientes com esôfago de Barrett (grupo II).
Esôfago de Barrett
n
%
Pacientes
30
Extensão do epitélio de Barrett (cm)
01 a 03cm 25 83,3
> 03cm 5 16,7
Fonte: fichas clínicas dos pacientes (arquivo privado).
Tabela 6. Dados endoscópicos dos pacientes com adenocarcinoma esofágico relacionado com
o esôfago de Barrett (grupo III).
Adenocarcinoma esofágico relacionado com o esôfago
de Barrett
n %
Pacientes
11
Classificação endoscópica*
Tipo 0 Superficial
(polipóide, elevado, plano, deprimido, ulcerado )
3 27,3
Tipo 1 Avançado
(polipóide de base larga )
1 9,1
Tipo 3 Avançado
(ulcerado, de bordas infiltrativas)
7 63,6
Fonte: fichas clínicas dos pacientes (arquivo privado); classificação endoscópica da Associação Japonesa do Câncer Gástrico também
aplicada para o Carcinoma Esofágico
146
.
3.3 Dados imunoistoquímicos
O resultado da positividade e da negatividade da imunoexpressão tecidual dos
seguintes biomarcadores: p53, COX-2 e c-erbB-2, em todos os grupos de estudo do presente
trabalho, encontra-se discriminado, em uma análise isolada, nas tabelas 7, 8 e 9 e nos gráficos
1, 2 e 3 e, de uma forma agrupada, no gráfico 4, respectivamente. Exemplos das
imunorreações destes três biomarcadores analisados, nos três grupos do presente estudo,
encontram-se ilustrados, respectivamente nas figuras 1, 2 e 3 (p53); 4, 5 e 6 (COX-2) e 7 e 8
(c-erbB-2).
Observa-se que houve uma significativa tendência monotônica de crescimento na
positividade, de todos os biomarcadores, do grupo I para o grupo II e, finalmente para o grupo
III [Score test: p<0,001(p53); p=0,002 (COX-2) e p<0,001 para o c-erbB-2].
Em relação ao oncogene p53, os resultados do teste de Marascuillo revelam que as
diferenças de positividade entre os três grupos foram significantes (grupo I vs grupo II:
p=0,010; grupo I vs grupo III: p<0,001; grupo II vs grupo III: p=0,001). No biomarcador
COX-2, só a diferença entre o grupo I e o grupo II não foi estatisticamente significativa (grupo
I vs grupo II: p=0,431; grupo I vs grupo III: p<0,001; grupo II vs grupo III: p=0,005). No que
diz respeito ao c-erbB-2, as diferenças na positividade entre os três grupos foram significantes
(grupo I vs grupo II: p<0,001; grupo I vs grupo III: p<0,001 e grupo II vs grupo III: p=0,001).
Tabela 7. Imunoexpressão tecidual do p53 em todos os grupos analisados.
Grupo
n
p53 positivo p53 negativo
n % n %
Esofagite por refluxo – I
23 5 21,74 18 78,26
Esôfago de Barrett – II
30 19 63,33 11 36,66
Adenocarcinoma associado ao
esôfago de Barrett - III
11 11 100,0 0 0
0
20
40
60
80
100
Esofagite por
refluxo
Esôfago de
Barrett
Adenocarcinoma
esofágico
p53
Gráfico 1. Imunoexpressão tecidual do p53 em todos os grupos do estudo.
%
Figura 1. Imunoexpressão fraca e focal da proteína p53 na esofagite por refluxo (400X).
Figura 2. Imunomarcação do p53 no esôfago de Barrett (400X).
Figura 3. Forte imunoexpressão do oncógeno p53 no adenocarcinoma esofágico (400X).
Tabela 8. Imunoexpressão tecidual da COX-2 em todos os grupos analisados.
Grupo
n
COX-2 positivo COX-2 negativo
n % n %
Esofagite por refluxo – I
23 11 47,83 12 52,17
Esôfago de Barrett – II
30 21 70,0 9 30,0
Adenocarcinoma associado ao
esôfago de Barrett - III
11 11 100,0 0 0
0
20
40
60
80
100
Esofagite por
refluxo
Esôfago de
Barrett
Adenocarcinoma
esofágico
COX-2
Gráfico 2. Imunoexpressão tecidual da COX-2 em todos os grupos analisados.
%
Figura 4. Imunoexpressão da COX-2, na esofagite por refluxo (400X).
Figura 5. COX-2 - imunoexpressão citoplasmática, no epitélio glandular do esôfago
de Barrett: 100X(A) e 400X(B).
Figura 6. Imunoexpressão acentuada da COX-2, no adenocarcinoma esofágico(400X),
e fraca marcação no controle interno (epitélio escamoso).
A
B
A
B
Tabela 9. Imunoexpressão tecidual do c-erbB-2, em todos os grupos analisados.
Grupo
n
c-erbB-2 positivo c-erbB-2 negativo
n % n %
Esofagite por refluxo – I
23 1 4,35 22 95,65
Esôfago de Barrett – II
30 19 63,34 11 36,66
Adenocarcinoma associado ao
esôfago de Barrett - III
11 11 100,0 0 0
0
20
40
60
80
100
Esofagite por
refluxo
Esôfago de
Barrett
Adenocarcinoma
esofágico
c-erb-B2
Gráfico 3. Imunoexpressão tecidual do c-erbB-2, em todos os grupos estudados.
%
Figura 7. c-erbB-2 - imunoexpressão citoplasmática, sem forte marcação de membrana
epitelial, no esôfago de Barrett - A(100X) e B(400X).
Figura 8. Forte imunoexpressão (citoplasmática e de membrana) da oncoproteína c-erbB-2,
no adenocarcinoma esofágico (400X).
A
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Esofagite por
refluxo
Esôfago de
Barrett
Adenocarcinoma
esofágico
p53
c-erbB-2
COX-2
Gráfico 4. Análise agrupada da positividade tecidual dos biomarcadores p53, c-erbB-2 e
COX-2, nos três grupos do estudo.
%
O padrão de expressão do p53 também foi analisado de uma forma estratificada e
semiquantitativa (escore final), nos três grupos estudados, quanto à intensidade da
imunomarcação nuclear, com os resultados demonstrados na tabela 10.
O resultado do teste de Kruskal−Wallis indica que houve diferenças significantes
entre os três grupos de pacientes em relação ao escore final (p<0,001). As comparações
pareadas, realizadas pelo teste de comparações múltiplas de Dunn, indicam que os escores
mais altos ocorreram com freqüências que aumentaram em consonância com o espectro da
gravidade dos grupos envolvidos (esofagite por refluxo < esôfago de Barrett <
adenocarcinoma esofágico): grupo I vs grupo II: p = 0,018; grupo I vs grupo III: p < 0,001;
grupo II vs grupo III: p < 0,001.
Tabela 10. Escore final da imunoexpressão tecidual do p53 em todos os grupos analisados.
Grupo
n
Escore final
ausente
(0)
fraco
(1-2-3)
moderado
(4-6-8)
forte
(9-12-16)
n % n % n % n %
Esofagite por refluxo - I
23
18 78,3 5 21,7 0 0 0 0
Esôfago de Barrett - II
30
11 36,7 19 63,3 0 0 0 0
Adenocarcinoma associado ao
esôfago de Barrett - III
11
0 0 1 9,1 3 27,3 7 63,3
Na tabela 11, observa-se o escore final da COX-2 nos três grupos estudados, quanto
à intensidade da imunomarcação citoplasmática.
O resultado do teste de Kruskal−Wallis indica que houve diferenças significativas
entre os três grupos de pacientes (p<0,001). As comparações pareadas, realizadas pelo teste de
comparações múltiplas de Dunn, revelam que os grupos I e II apresentaram comportamento
homogêneo, quanto aos escores obtidos, porém, no grupo III, os escores maiores ocorreram
com freqüências mais altas em comparação com os grupos I e II. Nestes dois grupos, os
escores mais baixos foram mais frequentes (grupo I vs grupo III: p< 0,001; grupo II vs grupo
III: p< 0,001).
Tabela 11. Escore final da imunoexpressão tecidual da COX-2 em todos os grupos do
estudo.
Grupo
n
Escore final
ausente
(0)
fraco
(1-2-3)
moderado
(4-6-8)
forte
(9-12-16)
n % n % n % n %
Esofagite por refluxo – I
23 12 52,2 7 30,4 4 17,4 0 0
Esôfago de Barrett – II
30 9 30,0 15 50,0 5 16,7 1 3,3
Adenocarcinoma associado
ao esôfago de Barrett - III
11
0 0 0 0 5 45,5 6 54,5
O imunomarcador c-erbB-2 apresentou um perfil de marcação mais tardio, de forma
que somente 1 paciente no grupo I, de um total de 23 (4,35%), foi fracamente positivo. No
grupo II a positividade foi a de 63,33% e, no grupo III, todos os pacientes (100%)
apresentaram imunoexpressão (tabela 12 e gráfico 3).
O resultado do teste de Kruskal−Wallis indica que houve diferenças significantes
entre os três grupos de pacientes em relação ao escore final (p<0,001). As comparações
pareadas, realizadas pelo teste de comparações múltiplas de Dunn, mostram que os escores
mais altos ocorreram com freqüências que aumentaram progressivamente, a partir do grupo I
(grupo I vs grupo II: p=0,018; grupo I vs grupo III: p< 0,001; grupo II vs grupo III: p<0,001).
Tabela 12. Escore da imunoexpressão tecidual do c-erbB-2 nos três grupos analisados.
Grupo
n
Escore
ausente
+
fraco
++
moderado
+++
forte
++++
n % n % n % n %
Esofagite por refluxo - I
23 22 95,7 1 4,3 0 0 0 0
Esôfago de Barrett - II
30 11 36,7 13 43,3 4 13,3 2 6,7
Adenocarcinoma associado
ao esôfago de Barrett - III
11
0 0 1 9,1 2 18,2 8 72,7
Na análise da imunoexpressão tecidual do Ki-67, qualitativa e semiquantitativa,
observou-se que o biomarcador foi positivo nos três grupos analisados, não havendo
imunoexpressão negativa. Nas figuras 9, 10 e 11, observam-se exemplos da imunomarcação
do Ki-67, e, no gráfico 5, assinala-se o escore semiquantitativo deste biomarcador, em todos
os grupos de estudo, respectivamente.
O resultado do teste de Kruskal−Wallis indica que houve diferenças significantes
entre os três grupos de pacientes, em relação ao escore final (p<0,001). As comparações
pareadas, realizadas pelo teste de comparações múltiplas de Dunn, revelam que os grupos I e
II apresentaram comportamento homogêneo quanto aos escores obtidos, porém, no grupo III,
os escores maiores (positivos fortes: 9, 12 e 16) ocorreram com freqüências mais altas em
comparação com os grupos I e II. Nestes dois grupos, os escores mais baixos foram os mais
freqüentes (grupo I vs grupo III: p<0,001; grupo II vs grupo III: p< 0,001) - tabela 13.
Figura 9. Ki-67 – atividade proliferativa da camada basal do epitélio malphigiano, na
esofagite por refluxo (A–B:400X).
Figura 10. Expressão nuclear do Ki-67, no esôfago de Barrett e na atividade proliferativa
basal do epitélio escamoso esofágico (A - 100X; B - 400X).
Figura 11. Ki-67 - alto índice proliferativo no adenocarcinoma esofágico (400X).
A
B
A B
A
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Ausente Fraco Moderad o Forte
Ki-67 Escore final
Percentagem
G1 G2 G3
Gráfico 5. Escore semiquantitativo do Ki-67, em todos os grupos de estudo.
Tabela 13. Escore final da imunoexpressão tecidual do Ki-67 nos três grupos do estudo.
Grupo
n
Escore final
ausente
(0)
fraco
(1-2-3)
moderado
(4-6-8)
forte
(9-12-16)
n % N % n % n %
Esofagite por refluxo - I
23 0 0 21 91,3 2 8,7 0 0
Esôfago de Barrett - II
30 0 0 24 80,0 6 20,0 0 0
Adenocarcinoma associado
ao esôfago de Barrett - III
11
0 0 1 9,1 4 36,4 6 54,6
Na análise qualitativa e semiquantitativa da imunoexpressão tecidual da E-caderina,
observou-se que o biomarcador foi positivo em todos os grupos estudo, entretanto o resultado
do teste de Kruskal−Wallis indica que houve diferenças significantes entre os três grupos de
pacientes, em relação ao escore final (p<0,001). As comparações pareadas, realizadas pelo
teste de comparações múltiplas de Dunn, mostram que os grupos I e II apresentaram
comportamento homogêneo quanto aos escores obtidos, porém, no grupo III, os escores mais
baixos ocorreram com freqüências mais altas em comparação com os grupos I e II. Nestes dois
grupos, os escores mais altos foram mais freqüentes (grupo I vs grupo III: p<0,001; grupo II vs
grupo III: p=0,005) - (tabela 14 e gráfico 6). Nas figuras 12, 13 e 14 observam-se exemplos da
imunomarcação da E-caderina, em todos os grupos do estudo.
Tabela 14. Escore final da imunoexpressão tecidual da E-caderina nos grupos do estudo.
Grupo
n
Escore final
ausente
(0)
fraco
(1-2-3)
moderado
(4-6-8)
forte
(9-12-16)
n % N % n % n %
Esofagite por refluxo - I
23 0 0 0 0 7 30,4 16 69,6
Esôfago de Barrett - II
30 0 0 0 0 19 63,3 11 36,6
Adenocarcinoma associado
ao esôfago de Barrett - III
11
0 0 5 45,5 5 45,5 1 9,1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Ausente Fraco Moderado Forte
Escore final da E-caderina
Percentagem
G1 G2 G3
Gráfico 6. Análise do escore semiquantitativo da E-caderina, em todos os grupos de estudo.
Figura 12. Forte expressão de membrana da E-caderina, na esofagite por refluxo (400X).
Figura 13. Imunoexpressão da E-caderina, no esôfago de Barrett (400X).
Figura 14. Imunomarcação inconstante da E-caderina no adenocarcinoma associado com
o esôfago de Barrett (A-B: 400X).
A B
DISCUSSÃO
O EB representa a conseqüência mais séria da DRGE crônica, ocorrendo entre 5 a
10% dos pacientes
12,17
.
No espectro da DRGE, considera-se o EB como uma etapa intermediária no
desenvolvimento do adenocarcinoma esofágico
49-51
, a neoplasia que, nos últimos 25 anos,
apresentou a maior incidência dentre todos os cânceres, nos países ocidentais e na Europa
20,24
.
Vários autores ressaltam a importância do seguimento endoscópico periódico dos
pacientes portadores do EB. Consideram a melhor sobrevida em cinco anos daqueles que
foram submetidos à ressecção do câncer esofágico e que participavam de programas de
seguimento e vigilância endoscópica, com protocolos de biópsias, comparativamente àqueles
pacientes com cânceres diagnosticados na endoscopia, ou fora dos programas de vigilância
54,139,140
. No entanto, alguns pesquisadores afirmam não haver argumentos para se submeter a
totalidade desses indivíduos a endoscopias e biópsias esofágicas seriadas, mas somente
aqueles com alto risco de degeneração maligna, considerando-se que a grande maioria dos
pacientes portadores do EB não evoluirá para o adenocarcinoma esofágico
37,141,142
.
Realmente, não há, na literatura, dados concretos a respeito da história natural do
EB, das suas taxas reais de progressão para o câncer, ou dos fatores de risco envolvidos,
efetivamente, na patogênese e na degeneração maligna desta importante lesão pré-neoplásica.
Os fatores considerados de risco, clínicos e endoscópicos, não apresentam, segundo alguns
autores, a sensibilidade e/ou a especificidade necessárias à estratificação de risco dos
pacientes para o câncer
13,29,39-48
.
Adicionalmente, o rastreamento de pacientes portadores do EB não tem demonstrado
ser uma medida científica e epidemiologicamente capaz de reduzir o índice de mortalidade do
adenocarcinoma esofágico. Não demonstrou, também, diferenças significativas na sobrevida
dos pacientes, quando foram comparados com a população.
Considerações e questionamentos têm sido, efetivamente, levantados, a respeito da
relação custo–benefício deste rastreamento,
uma vez que a incidência estimada da displasia de
alto grau e do câncer esofágico, são baixas em geral (em torno de 0,5% ao ano), e as lesões
neoplásicas precoces são difíceis de identificar endoscopicamente
143,144
.
Nesse contexto, considerando não só estas limitações dos programas de
rastreamento e vigilância clínico-endoscópicos, associados ao estudo histopatológico, mas
também que há características celulares e biomoleculares outras, na carcinogênese esofágica
relacionada com o EB, as quais não são detectáveis apenas com essas metodologias, é que o
estudo e a definição de um painel imunoistoquímico de biomarcadores moleculares preditivos,
com o potencial de estratificar os pacientes realmente de risco para o câncer no EB, têm
assumido um papel fundamental na abordagem dessa importante entidade nosológica.
O biomarcador preditivo deve ser capaz de identificar, precocemente, o clone de
células com a combinação necessária dos erros genéticos descritos, com potencial evolutivo
para o câncer, dentro da seqüência neoplásica do EB.
Na detecção desses biomarcadores, a maior prevalência deve ocorrer no
adenocarcinoma esofágico, e o seu desenvolvimento deve ser observado no epitélio pré-
maligno, antes do surgimento do tumor. Aqueles que surgirem tardiamente, ou seja, após o
desenvolvimento do adenocarcinoma, não serão, portanto, úteis nessa fase de detecção
precoce; no entanto, podem ter a sua aplicabilidade clínica como valor preditivo nas
metástases
145,146
.
O biomarcador preditivo deve ter, também, alta reprodutibilidade, sensibilidade e
especificidade, quando são comparados com a histopatologia
25,147
, atualmente o método
padrão-ouro para definição de risco do adenocarcinoma esofágico.
No presente estudo, considerando a seqüência neoplásica do epitélio de Barrett
49-51
,
foram estudados e correlacionados, além dos aspectos clínicos e endoscópicos, o padrão de
expressão de cinco biomarcadores moleculares: o antígeno de proliferação celular Ki-67, o
gene de supressão tumoral p53, a E-caderina, a COX–2 e o proto-oncogene c-erbB-2, dentro
de três fases do espectro evolutivo da DRGE: a esofagite por refluxo, o esôfago de Barrett e o
adenocarcinoma esofágico relacionado com o esôfago de Barrett.
Foi definido também, individualmente, o escore final para cada biomarcador, em
cada grupo de estudo, permitindo-se avaliar em conjunto, de uma forma semiquantitativa, a
qualidade da imunomarcação e a média do percentual de células que expressam o
biomarcador.
Foram consideradas, na seleção desses biomarcadores, todas as etapas descritas por
Hanahan e Weinberg,
dentro do processo geral da carcinogênese
65
, também aplicadas ao EB.
Na análise dos resultados, observa-se que não houve homogeneidade dos grupos em
relação ao sexo. No grupo III, a proporção de homens foi significativamente maior, dados
estes em conformidade com os encontrados na literatura, onde a predominância do
adenocarcinoma esofágico é maior nos pacientes do sexo masculino
14,42,148
.
No que concerne aos dados relacionados, especificamente, com o sexo e com o EB,
assinala-se, na literatura, uma maior prevalência do epitélio de Barrett nos pacientes do sexo
masculino, embora a razão seja desconhecida. Em estudo multicêntrico italiano, o EB foi
encontrado em 1% dos homens e em 0,39% das mulheres,
com uma proporção de 2,6 para
1
149
. Na clínica Mayo, observou-se uma predominância de 0,97% em homens e de 0,49% nas
mulheres
13
. No nosso estudo não foram observadas estas proporções, dentro do grupo de
pacientes portadores do esôfago de Barrett.
Analisando-se os dados referentes à sintomatologia, observou-se que a queixa clínica
predominante no grupo III foi a disfagia, em 8 de 11 pacientes (72%), comparativamente às
queixas de pirose e epigastralgia, que dominaram entre os pacientes dos grupos I e II (acima
de 80%). Contudo, há que se considerar o viés de seleção dos pacientes.
No que diz respeito à duração das queixas, Winters et al.
150
, afirmam em seu trabalho
que, em relação ao EB e a esofagite por refluxo, não houve diferença estatisticamente
significativa na média de duração dos sintomas; entretanto, em ambos os casos, constatou-se
diferença maior do que a observada na DRGE não-erosiva.
Lieberman et al.
151
,
por sua vez, comparando pacientes que foram submetidos à
endoscopia por refluxo, afirmaram que a odds ratio (OR) para o EB, em pacientes com
duração da sintomatologia maior que 10 anos, era a de 6.4, comparativamente àqueles com
sintomas com duração de 1 a 5 anos, com OR de 3.0 ( p<0,001).
Na análise dos resultados do presente trabalho, em relação à duração das queixas
previamente a realização do exame endoscópico, observou-se que não houve diferenças
significantes entre o grupo de pacientes portadores de esofagite por refluxo e o grupo de
pacientes portadores de EB.
Em relação à média de idade, assinalou-se que não houve, estatisticamente,
diferenças entre os grupos I e II; entretanto, o grupo III, do adenocarcinoma esofágico
relacionado com o EB, apresentou diferença significante em relação às médias dos grupos I e
II, respectivamente. O adenocarcinoma é, sabidamente, uma patologia de ocorrência mais
tardia, dentro da seqüência carcinogenética do EB
49-51
.
Embora o câncer do esôfago seja uma das patologias mais agressivas e letais do
aparelho digestório, de pobre prognóstico, e se conheça a sua lesão presursora, o EB, a
maioria desses cânceres, como já ressaltado, ainda continua sendo diagnosticada
principalmente nas fases mais tardias, quando não podem mais ser curados
36
.
Com efeito, dos 11 pacientes portadores de adenocarcinoma esofágico no presente
estudo, observou-se que 8 (72,72%) foram, igualmente, diagnosticados nas fases tardias, com
aspectos, durante a endoscopia, de lesões já em fases avançadas.
No que concerne, especificamente, aos biomarcadores moleculares, em relação ao
gene de supressão tumoral p53, observam-se, na literatura, resultados conflitantes da
imunoexpressão no epitélio de Barrett, embora grande parte dos estudos apontem um perfil de
reatividade progressivamente maior na seqüência neoplásica evolutiva do EB
19,83,152-159
.
Alguns autores relatam que as alterações do gene p53 são eventos precoces na
progressão neoplásica do EB, podendo, em alguns casos, ser detectadas antes da presença das
alterações histológicas ou das anormalidades no ciclo celular
69,160,161
.
Dolan et al.
162
, em estudo preliminar, na análise de 30 pacientes submetidos à
esofagectomia por adenocarcinoma associado, e de 48 portadores do EB, em programa de
vigilância endoscópica, concluíram que as mutações no gene p53 podem ser detectadas antes
do desenvolvimento da displasia de alto grau ou do carcinoma, podendo ser, portanto, úteis,
na estratificação de risco dos pacientes portadores do EB. No entanto, ressaltam que o
adenocarcinoma do esôfago pode se desenvolver sem a expressão do gene p53 mutante, e que
a mutação pode ocorrer, tardiamente, no processo da carcinogênese relativa ao EB. Afirmam,
também, que não está estabelecido, ainda, se todos os pacientes portadores de mutação no
gene p53 desenvolverão, ou não, o câncer esofágico.
Younes et al
89
, demonstraram, igualmente, expressão aumentada da proteína p53 em
amostras de mucosa do EB, que ocorreram antes do desenvolvimento da displasia de alto grau
ou do carcinoma, em dois de três pacientes.
Garewal
163
identificou, na literatura, 16 trabalhos analisando a imunoexpressão do
p53 no EB.
Os resultados demonstram, de forma semelhante, um acréscimo gradual na
freqüência das alterações do p53, à medida que o grau de displasia aumenta, com variação de
percentuais de 0% a 10% no epitélio sem displasia (média de 1,4%), 0% a 60% na displasia de
baixo grau (média de 30%), 50% a 100% na displasia de alto grau (média de 68%) e 53% a
100% no adenocarcinoma esofágico (média de 72%).
No entanto, outros pesquisadores também observaram resultados da imunoexpressão
do p53 mais tardios, dentro da seqüência neoplásica do EB, com baixos percentuais no
epitélio de Barrett
19,154,156,164-166
, ou positividade somente no adenocarcinoma esofágico, com
ausência de expressão no epitélio metaplásico. Symmans et al.
167
não encontraram
positividade do p53 em nenhum dos portadores do EB (n=7),
e Roth
168
encontrou mutação do
p53 em 5 de 12 pacientes com epitélio de Barrett adjacente ao adenocarcinoma esofágico, mas
não a encontrou em nenhum dos 10 pacientes com EB sem câncer.
Flejou et al.
169
igualmente relataram imunoexpressão do p53 em 56 de 82 pacientes
com adenocarcinoma relacionado com o EB, com ausência do p53 no epitélio metaplásico ou
com displasia de baixo grau, nas peças ressecadas. Reportaram, ainda, não haver correlação
entre o grau de disseminação do tumor e o status do p53, sugerindo ser a imunoexpressão
tecidual do p53 um evento, efetivamente, tardio
170
.
Feith et al.
171
, em análise de 24 portadores de adenocarcinoma do esôfago distal
ressecado, demonstraram, da mesma forma, não haver imunoexpressão do p53 no epitélio
esofágico normal ou na metaplasia colunar; entretanto, observaram positividade na
imunexpressão em 50% dos casos portadores de câncer. Concluíram, também, na sua
pesquisa, ser o p53 uma marcador tardio na seqüência evolutiva neoplásica do EB.
Há outros estudos na literatura, que também demonstram esta imunorreatividade
tardia do p53 na seqüência metaplasia–displasia–adenocarcinoma do EB,
com expressão
apenas demonstrável, mais intensamente, na displasia de alto grau, quando esta é comparada
com a displasia de baixo grau ou com o epitélio de Barrett não-displásico
adjacente
85,86,156,172,173
.
No presente estudo foi encontrada uma expressão do gene p53 já no grupo I, com um
perfil de imunoexpressão tecidual subseqüente, nos demais grupos de análise, II e III,
progressivamente maior (p<0,001). No grupo I, observou-se uma positividade em 5 dos 23
pacientes (21,74%). No grupo II, o percentual de pacientes positivos foi significativamente
maior, com imunomarcação em 19 dos 30 pacientes (63,33%), e, no grupo III, observou-se a
máxima positividade do p53, com 11 dos 11 pacientes (100%) imunomarcados. Houve,
também, diferenças significativas entre os três grupos de pacientes, em relação aos escores
finais da expressão. As comparações pareadas revelaram que os escores mais altos ocorreram
com freqüências que aumentaram em consonância com o espectro de gravidade dos grupos
envolvidos.
Discrepâncias nos resultados encontrados na literatura, da imunoexpressão do
oncogene p53 na seqüência neoplásica do EB, realmente ocorrem.
Alguns autores afirmam, efetivamente, que há limitações no estudo
imunoistoquímico do p53, considerando-o um teste relativamente inespecífico, com mais de
25% de resultados falso-positivos e falso-negativos, quando são comparados com o teste-
padrão ouro de seqüenciamento do DNA
172,174,175
,
o que poderia trazer restrições no seu uso, na
rotina clínica diária, na abordagem dos pacientes portadores do EB.
No entanto, as divergências de resultados observadas na literatura, podem ser
devidas, em parte, a variações nas técnicas de detecção de mutações do gene p53 e,
igualmente, a diferenças nos anticorpos e na coloração utilizados nas técnicas
imunistoquímicas. A ausência de anormalidades do p53, em alguns casos de epitélio de
Barrett displásico ou neoplásico, pode, também, indicar que a progressão maligna é possível
sem o envolvimento do gene p53
166,176
.
Ademais, observa-se que não há, sempre, a
imunoexpressão protéica tecidual de todas as mutações genéticas que ocorrem no gene p53, e
que, contrariamente, é possível identificar-se a imunoexpressão deste oncogene, na ausência
da mutação genética correspondente
177,178
.
Um aumento do número de células proliferativas e uma expansão do seu
compartimento também foram evidenciados no esôfago de Barrett e no adenocarcinoma
esofágico. A coloração do Ki-67, um dos biomarcadores de proliferação celular, também, a
exemplo do PCNA, correlaciona-se com os achados histológicos encontrados no EB
179-181
.
Relata-se na literatura que o número e a localização dos núcleos positivos para o Ki-
-67 são significativamente diferentes no EB sem displasia, no EB com displasia de baixo e de
alto grau, e no adenocarcinoma associado com o EB
19,57,179,182,183
, com positividade acentuada
somente nestes dois últimos grupos
184
, e menor expressão no epitélio de Barrett, com ou sem
displasia de baixo grau.
Polokowski et al.
19
encontraram, em peças ressecadas por adenocarcinoma esofágico
e displasia de alto grau, uma correlação estatisticamente significativa entre anormalidades do
p53 e o índice de proliferação celular (Ki-67). Admitiram que a proliferação poderia ser
conseqüente à ativação do oncogene e à perda da supressão tumoral.
Szachnowicz et al.
185
, em análise de treze pacientes portadores de adenocarcinoma
esofágico (11 deles associados à metaplasia intestinal), evidenciaram extensiva positividade
na imunomarcação para o Ki-67 em todos os pacientes, constatando forte atividade da
proliferação celular.
Outros autores têm relatado, também, baixa expressão do Ki-67 em pacientes com
EB (14%), sem a presença do adenocarcinoma, e expressões acentuadas no EB, associado ao
adenocarcinoma (87%)
183
.
Neste trabalho, foi encontrada uma imunoexpressão tecidual, qualitativa, do
biomarcador Ki-67, em 100% dos pacientes nos grupos estudados, refletindo, possivelmente,
já no grupo I, o estado de proliferação celular observado no processo inflamatório que ocorre
na esofagite por refluxo. Todavia, quando se analisa o escore final semiquantitativo da
imunoexpressão tecidual do Ki-67, de uma forma estratificada, nos respectivos grupos do
estudo, assinala-se que houve diferenças significativas. As comparações pareadas, revelam
que os grupos I e II apresentaram comportamento homogêneo quanto aos escores obtidos,
porém no grupo III os escores mais altos ocorreram com freqüências mais altas em
comparação com os grupos I e II. Nestes dois grupos, os escores mais baixos foram os mais
freqüentes.
No que diz respeito ao imunomarcador COX-2, diversos grupos têm relatado que os
seus níveis estão aumentados no EB e no adenocarcinoma associado e que, adicionalmente, a
sua expressão se correlaciona com o grau da displasia. Altos níveis são detectados no tecido
com displasia de alto grau e no adenocarcinoma esofágico, quando, respectivamente, são
comparados com a displasia de baixo grau ou com o tecido não-displásico
115,138,186
.
Zimmerman et al.
116
informaram que 78% de 27 pacientes com adenocarcinoma
esofágico expressavam a COX-2.
Shrivani et al.
96
também demonstraram, em estudos
imunoistoquímicos e de imunoblotting, que a expressão da COX-2 encontra-se aumentada no
adenocarcinoma esofágico e no EB, quando estes são comparados com o esôfago normal e
com o duodeno. Ademais, com a exposição de culturas de células do epitélio de Barrett ao
ácido e/ou bile observou-se um aumento na expressão de COX-2.
Morris et al.
138
reportaram, também, um acréscimo hierárquico na expressão da
COX-2, no processo de carcinogênese relacionado com o EB, e Souza et al.
98
confirmaram que
a inibição seletiva da COX-2 reduz a proliferação e aumenta a apoptose em duas linhagens de
células do adenocarcinoma relacionadas com o EB, expressando COX-2. Esse efeito da
inibição seletiva da COX-2 reduzindo a proliferação celular também foi observado por Buttar
et al.
187
.
Contrariamente, Van der Woude et al.
188
demonstraram que a COX-2 estava ausente
no epitélio de Barrett não-neoplásico e/ou displásico, mesmo presente na lâmina própria e nos
miofibroblastos. Entretanto, no grupo de pacientes portadores do adenocarcinoma esofágico,
houve imunoexpressão da COX-2 em 9 das 10 amostras, porém apenas na minoria das células
tumorais. Ademais, observam esses autores, os seus resultados não suportam a hipótese da
inibição seletiva da COX-2 na prevenção ou tratamento da displasia ou câncer relacionados
com o EB, já que não houve imunoexpressão da COX-2 nos estadios pré-neoplásicos desta
entidade nosológica.
Na análise da expressão tecidual da COX-2 em todos os distintos grupos do presente
estudo, observa-se, também, que houve uma imunomarcação positiva, progressivamente
crescente, a partir do grupo I. Neste grupo, assinala-se a positividade na imunomarcação em
47,82% dos pacientes avaliados (11/23), e no grupo do EB em 70% dos pacientes (21/30). No
grupo III (adenocarcinoma esofágico), a imunoexpressão positiva foi verificada em 100% dos
pacientes analisados. Todas essas diferenças foram estatisticamente significativas.
Na avaliação estratificada, semiquantitativa, da imunomarcação da COX-2,
observou-se que houve diferenças também significativas entre os três grupos de pacientes em
relação aos escores finais. O resultado das comparações pareadas revelam que os grupos I e II
apresentaram comportamento homogêneo quanto aos escores obtidos, mas no grupo III os
escores mais altos ocorreram com freqüências mais altas em comparação com os grupos I e II.
Nestes dois grupos os escores mais baixos foram mais freqüentes.
Do mesmo modo, as diferenças nas técnicas empregadas na análise da
imunoexpressão da COX-2, o uso de inibidores da bomba de prótons e de antiinflamatórios
pelos pacientes, arrolados em alguns estudos, e também o fato de que os níveis do mRNA
necessariamente não refletem os níveis da expressão protéica, podem, todos estes fatores,
explicar a discrepância dos resultados encontrados na literatura, relativos à imunoexpressão,
na carcinogênese esofágica do EB.
A molécula de adesão E-caderina desempenha um papel fundamental na manutenção
da estrutura e na função epitelial dos tecidos.
Há estudos que demonstram que, entre 60% e 80% dos pacientes portadores do
adenocarcinoma esofágico, existe expressão reduzida da E-caderina e das cateninas
126,127,189
.
Ademais, esta expressão reduzida da E-caderina e da alfa e da beta catenina
correlaciona-se, significativamente, com estágios desfavoráveis do tumor, grau do tumor,
metástase linfonodal e sobrevida, respectivamente
127
.
Swami et al.
118
encontraram um decréscimo significativo na expressão da E-caderina
na metaplasia colunar, inclusive nos casos com displasia de baixo grau, quando estes eram
comparados ao epitélio escamoso normal do esôfago.
Feith et al.
171
, contrariamente, observaram que a expressão da E-caderina no EB não-
displásico foi similar à encontrada no epitélio esofágico normal. No entanto, encontraram uma
perda quase completa da expressão da E-caderina no carcinoma esofágico invasivo, e uma
redução significativa da expressão tumoral da E-caderina na seqüência, EB, displasia e
adenocarcinoma esofágico, sustentando a hipótese da degeneração neoplásica evolutiva no
EB
118
.
No presente estudo, apesar de todos os grupos demonstrarem positividade na
imunomarcação para a E-caderina, observa-se que houve, ao contrário dos demais
biomarcadores descritos anteriormente, uma queda progressiva na intensidade da
imunomarcação, dos grupos I ao III – demonstrando uma perda na qualidade estrutural dos
tecidos.
O resultado estatístico, da análise estratificada da imunoexpressão da E-caderina,
indica que houve diferenças significativas entre os três grupos de pacientes em relação aos
escores finais. As comparações pareadas, por sua vez, demonstram que os grupos I e II
apresentaram comportamento homogêneo quanto aos escores obtidos, porém no grupo III os
escores mais baixos ocorreram com freqüências mais altas em comparação com os grupos I e
II. Nestes dois grupos os escores mais altos foram mais freqüentes.
No EB, expressões anormais de EGF têm sido encontradas
190
. O EGFR e o TGF-alfa
encontram-se aumentados na metaplasia tipo intestinal e elevados nas lesões displásicas e no
adenocarcinoma esofágico
191-193
.
A superexpressão do EGFR e do TGF-alfa no
adenocarcinoma esofágico está associada com um pior prognóstico e com a presença de
metástases
194,195
.
O c-erbB-2 é um proto-oncogene que codifica uma glicoproteína altamente
homóloga, porém distinta, ao EGFR. O c-erbB-2 está relacionada com a diferenciação e
proliferação celular
129
, e, a sua expressão, também se correlaciona com a sobrevida de
pacientes com adenocarcinoma
130
.
Jankowski et al.
190
descreveram uma imunomarcação positiva do c-erbB-2 em 9 de
15 pacientes com EB e em 11 de 15 pacientes adicionais, com adenocarcinoma esofágico
relacionado com o EB.
Em outro estudo, um aumento na imunoexpressão da oncoproteína c-erbB-2 foi
observado em 7 de 66 casos de adenocarcinoma relacionado com o EB (11%), mas não no
tecido displásico adjacente. Também não houve imunoexpressão no epitélio não-displásico.
Neste último trabalho, a presença do c-erbB-2 correlacionou-se com prognóstico desfavorável
e com piora na sobrevida dos pacientes
130
.
A superexpressão de c-erbB-2 também foi demonstrada em 10% a 73% dos
adenocarcinomas
77,130,190,196-199
;
entretanto, a expressão aumentada não foi evidenciada na
displasia do epitélio de Barrett, sugerindo ser um evento tardio na seqüência neoplásica do
EB
131
. A presença desses índices elevados correlacionou-se com a invasão tumoral, com o
envolvimento linfático, com metástases à distância e com o status do tumor residual, após a
sua ressecção
77,130,190,196-199
.
Kim et al.
200
constataram que a expressão do c-erbB-2 ocorreu em 31% dos casos de
displasia de alto grau e somente em 10% dos casos de adenocarcinoma esofágico. Sugeriram,
igualmente, que o c-erbB-2 seria um marcador de estágios avançados da neoplasia esofágica,
relacionado com o EB, não sendo, portanto, útil como biomarcador do adenocarcinoma
esofágico, considerando-se a sua baixa prevalência.
Na análise da imunoexpressão tecidual do c-erbB-2, no presente estudo, observa-se,
também, que houve uma imunomarcação positiva, progressivamente crescente, do grupo I ao
grupo III, com diferenças significativas na positividade entre todos os grupos. No grupo I, de
um total de 23 pacientes, o c-erbB-2 foi ausente quase que na totalidade dos pacientes (22/23).
Se considerarmos que a marcação focal ou fracamente perceptível em membranas celulares é
também considerada, imunoistoquimicamente, como negativa, teremos então 100% dos
pacientes no grupo I com ausência de imunomarcação. Já no grupo III, 100% dos pacientes
foram imunomarcados demonstrando ser, realmente, o c-erbB-2, um marcador tardio na
evolução carcinogenética do esôfago, dentro dos nossos grupos de estudo.
Na análise semiquantitativa da imunoexpressão tecidual do c-erbB-2 observa-se que
houve diferenças significativas entre os três grupos de pacientes, em relação aos escores
finais. As comparações pareadas demonstram, também, que os escores mais altos ocorreram
com freqüências que aumentaram em consonância com o espectro evolutivo da gravidade dos
grupos envolvidos.
No câncer relacionado com o EB, assinala-se que as células metaplásicas são
efetivamente predispostas a desenvolverem todas as características inerentes ao processo geral
do câncer, com a conseqüente evidência tecidual e imunoprotéica dos diversos fatores
descritos acima: de proliferação celular (biomarcador: Ki-67), secretórios, de crescimento
(EGF, c-erbB-2 e TGF-alfa), de expressão da ciclooxigenase-2 (COX-2), fatores apoptóticos,
dos oncogenes (genes de supressão tumoral p53 e p16), de proteínas do ciclo celular, e de
alterações nas moléculas de adesão da célula, com expressão reduzida da E-caderina.
Diversos estudos têm avaliado uma gama de biomarcadores moleculares teciduais
utilizáveis na estratificação de risco da progressão neoplásica do EB, com resultados algumas
vezes discordantes e controversos, como foram vistos anteriomente. Entretanto, apontam, na
sua maioria, para resultados crescentes na imunoexpressão, com exceção da E-caderina, que
apresenta um padrão de expressão inverso, decrescente.
Não obstante, não há ainda descrito na literatura nenhum marcador genético que,
isoladamente, seja capaz de ser utilizado para predizer o potencial maligno do EB. Nenhum
biomarcador tecidual tem se mostrado, ainda, superior à identificação histológica da displasia
no epitélio de Barrett, como fator de risco para o adenocarcinoma esofágico, mesmo com as
limitações previamente descritas. Dessa forma, um marcador menos subjetivo para essa
possível progressão neoplásica no EB, que suplemente ou até mesmo substitua o sistema atual
de classificação do grau de displasia, é realmente necessário, no sentido de se melhorar a
sensibilidade, a especificidade e a relação custo–benefício dos programas de seguimento
relativos ao EB.
A rede de pesquisa e detecção precoce, do Instituto Nacional do Câncer, nos EUA,
recentemente propôs cinco fases para a validação dos biomarcadores
201
,
de forma que
pudessem ser úteis na análise do surgimento destes novos biomarcadores moleculares, e na
sua possível aplicabilidade clínica, relacionada com o manuseio do risco de câncer.
Estudos nas fases 1 e 2 constituem a grande maioria das publicações; no entanto,
encontram-se em estágios muito precoces de análise para que possam ser utilizados
clinicamente. As fases 3, 4 e 5, por sua vez, englobam uma minoria das pesquisas, mas são
importantes estudos e requerem uma revisão e uma especial atenção clínica.
Atualmente, as alterações na ploidia do DNA (tetraploidia e aneuploidia), analisadas
através da citometria de fluxo, bem como as anormalidades no gene de supressão tumoral p53,
têm sido os biomarcadores que mais têm avançado em termos de validação, com estudos na
fase 4, que são aquelas investigações prospectivas que podem envolver grande número de
pacientes para se determinar a capacidade de um determinado biomarcador em predizer
evoluções clínicas importantes de uma determinada patologia.
A identificação dos genes envolvidos na carcinogênese também tem sido objeto de
pesquisa do câncer, ao longo das últimas duas décadas.
Na era pós-genômica, estudos determinando o perfil proteômico do tumor têm
recebido uma atenção toda especial, ao lado dos avanços da bioinformática. A identificação
dos genes diferentemente expressos no epitélio de Barrett e no adenocarcinoma esofágico,
pode ser empregada para distinguir entre as duas condições, e os seus padrões de expressão
podem ser utilizados como marcadores teciduais para progressão neoplásica
202-204
.
Essas novas abordagens revestem-se de grande importância no manuseio diagnóstico
e terapêutico dos pacientes portadores do EB, com repercussões significativas no seu
prognóstico. São medidas que tem por objetivo, sobretudo, a otimização e a padronização dos
programas de rastreamento e seguimento dos pacientes de risco para a carcinogênese
esofágica, como também a monitorização da eficácia da terapêutica conservadora das lesões
displásicas associadas ao EB, abrindo, conseqüentemente, a perspectiva para o
estabelecimento de novas estratégias terapêuticas, a exemplo da quimioprofilaxia
132
em
pacientes selecionados.
Estudos prospectivos, bem planejados, randomizados, são ainda necessários para
validar a sua relevância clínica, de forma que se ofereça, seguramente, uma melhor
perspectiva na abordagem dos pacientes portadores do EB.
CONCLUSÕES
Obedecidos os objetivos formulados, e através das análises dos resultados, pode-se
concluir que:
Os biomarcadores moleculares oncogênicos e de atividade mitótica, p53,
c-erbB-2, COX-2 e Ki-67, apresentam um aumento progressivo na intensidade
da imunoexpressão tecidual, na esofagite por refluxo (grupo I), no esôfago de
Barrett (grupo II) e no adenocarcinoma relacionado ao esôfago de Barrett (grupo
III), respectivamente;
O grupo III (adenocarcinoma relacionado ao esôfago de Barrett) apresenta os
níveis mais acentuados da imunomarcação dos biomarcadores p53, COX-2,
Ki-67 e c-erbB-2;
O c-erbB-2 apresenta um perfil tardio de positividade e intensidade da
imunoexpressão tissular, com ausência de marcação na esofagite por refluxo
(grupo I) e marcação forte no adenocarcinoma relacionado ao esôfago de Barrett
(grupo III);
A E-caderina demonstra um perfil de imunoexpressão decrescente, inverso a
todos os demais biomarcadores moleculares pesquisados, com os maiores níveis
de marcação tecidual na esofagite por refluxo (grupo I), e os menores no
adenocarcinoma relacionado ao esôfago de Barrett (grupo III).
REFERÊNCIAS
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ANEXOS
ANEXO 1
PROTOCOLO DE COLETA DE INFORMAÇÕES.
MODELO DE FICHA TIPO A
ENDOSCOPIA DIGESTIVA ALTA
ENDOCENTRO
Nome :...................................................................................................................................
Idade:.....................................................................................................................................
Sexo: ( __) Masculino (__) Feminino
Queixa principal e duração...................................................................................................
( ) Até 30 dias
( ) Meses ( de 01 a 12 meses)
( ) Anos ( acima de doze meses )
DADOS DA ENDOSCOPIA DIGESTIVA ALTA
1. Esofagite por refluxo (Classificação de Savary-Miller modificada) :
(__) Grau I
(__) Grau II
(__) Grau III
(__) Grau IV
(__) Grau V
2. Esôfago de Barrett :
Extensão.............(__) 01-03cm
(__) > 03cm
3. Neoplasia de esôfago :
TIPO ASPECTO ENDOSCÓPICO
( ) 0................Superficial : polipóide, elevado, plano, deprimido, ulcerado.
( ) 1................Avançado : polipóide de base larga.
( ) 2................Avançado : ulcerado de bordas elevadas e bem delimitadas.
( ) 3................Avançado : ulcerado, de bordas infiltrativas.
( ) 4................Avançado : infiltração difusa, sem ulceração.
( ) 5................Avançado : não-classificável.
MODELO DE FICHA TIPO B
LAUDO ANÁTOMO-PATOLÓGICO
LABORATÓRIO VIRCHOW
Nome :...................................................................................................................................
Idade:.....................................................................................................................................
Sexo: ( __) Masculino (__) Feminino
DIAGNÓSTICO ENDOSCÓPICO :
1. Esofagite por refluxo (Classificação de Savary-Miller modificada):
(__) Grau I
(__) Grau II
(__) Grau III
(__) Grau IV
(__) Grau V
2. Esôfago de Barrett :
Extensão.............(__) 01-03cm
(__) > 03cm
3. Neoplasia de esôfago
TIPO ASPECTO ENDOSCÓPICO
( ) 0................Superficial : polipóide, elevado, plano, deprimido, ulcerado.
( ) 1................Avançado : polipóide de base larga.
( ) 2................Avançado : ulcerado de bordas elevadas e bem delimitadas.
( ) 3................Avançado : ulcerado, de bordas infiltrativas.
( ) 4................Avançado : infiltração difusa, sem ulceração.
( ) 5................Avançado : não-classificável.
DIAGNÓSTICO ANATOMOPATOLÓGICO
Descrição da macroscopia:
.......................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................
.........................................................................................................................
Descrição da microscopia :
.......................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................
Conclusão Diagnóstica:
.......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
DIAGNÓSTICO IMUNOISTOQUÍMICO
1) Biomarcador tecidual nuclear p-53
Intensidade da imunomarcação nuclear :
( ) 0+ = Marcação negativa ou ausência de expressão.
( ) 1+ = Marcação positiva focal.
( ) 2+= Marcação positiva multifocal.
( ) 3+= Marcação positiva - moderada e difusa.
( ) 4+= Marcação positiva intensa.
Padrão de expressão dos núcleos imunomarcados
( )1= <25% de núcleos imunomarcados.
( )2= 25-50% de núcleos imunomarcados.
( )3= >50-75% de núcleos imunomarcados.
( )4= >75% de núcleos imunomarcados
Número de células ( 0-100 )
Lâmina 01.................................... ...............%.
Lâmina 02.................................... ...............%.
Lâmina 03.................................... ...............%.
Lâmina 04................................... ...............%.
MÉDIA NOS 04 CAMPOS....... ..............%
ESCORE FINAL : TOTAL ( )
* Mínimo de 0 e máximo de 16
2) Biomarcador tecidual nuclear ki-67
Intensidade da imunomarcação nuclear :
( ) 0+ = Marcação negativa ou ausência de expressão.
( ) 1+ = Marcação positiva focal.
( ) 2+= Marcação positiva multifocal.
( ) 3+= Marcação positiva - moderada e difusa.
( ) 4+= Marcação positiva intensa
Padrão de expressão dos núcleos imunomarcados
( )1= <25% de núcleos imunomarcados.
( )2= 25-50% de núcleos imunomarcados.
( )3= >50-75% de núcleos imunomarcados.
( )4= >75% de núcleos imunomarcados
Número de células ( 0-100 )
Lâmina 01.................................... ...............%.
Lâmina 02.................................... ...............%.
Lâmina 03.................................... ...............%.
Lâmina 04................................... ...............%.
MÉDIA NOS 04 CAMPOS....... ..............%
ESCORE FINAL : TOTAL ( )
* Mínimo de 0 e máximo de 16
3) Biomarcador tecidual citoplasmático E-Caderina
Intensidade da imunomarcação citoplasmática :
( ) 0+ = Marcação negativa ou ausência de expressão;
( ) 1+ = Marcação positiva focal;
( ) 2+ = Marcação positiva multifocal;
( ) 3+ = Marcação positiva - moderada e difusa;
( ) 4+ = Marcação positiva intensa.
Intensidade da expressão antigênica citoplasmática :
( ) 1= <25% células com marcação citoplasmática;
( ) 2= 25-50% células com marcação citoplasmática;
( ) 3= >50-75% células com marcação citoplasmática;
( ) 4= > 75% células com marcação citoplasmática.
Número de células ( 0-100 )
Lâmina 01.................................... ...............%.
Lâmina 02.................................... ...............%.
Lâmina 03.................................... ...............%.
Lâmina 04................................... ...............%.
MÉDIA NOS 04 CAMPOS....... ..............%
ESCORE FINAL : TOTAL ( )
* Mínimo de 0 e máximo de 16
4) Biomarcador tecidual citoplasmático COX-2
Intensidade da imunomarcação citoplasmática :
( ) 0+ = Marcação negativa ou ausência de expressão;
( ) 1+ = Marcação positiva focal;
( ) 2+ = Marcação positiva multifocal;
( ) 3+ = Marcação positiva - moderada e difusa;
( ) 4+ = Marcação positiva intensa.
Intensidade da expressão antigênica citoplasmática :
( ) 1= <25% células com marcação citoplasmática;
( ) 2= 25-50% células com marcação citoplasmática;
( ) 3= >50-75% células com marcação citoplasmática;
( ) 4= > 75% células com marcação citoplasmática.
Número de células ( 0-100 )
Lâmina 01.................................... ...............%.
Lâmina 02.................................... ...............%.
Lâmina 03.................................... ...............%.
Lâmina 04................................... ...............%.
MÉDIA NOS 04 CAMPOS....... ..............%
ESCORE FINAL : TOTAL ( )
* Mínimo de 0 e máximo de 16
5) Biomarcador tecidual c-erbB-2
Intensidade da imunomarcação de membrana citoplasmática
( ) 0+ = Ausência de marcação de membrana celular ou marcação apenas citoplasmática.
( ) 1+ = Marcação positiva focal ou fracamente perceptível em membranas celulares. Este
padrão é imunistoquimicamente reportado como negativo.
( ) 2+ = Marcação moderada de membrana, na maioria das células.
( ) 3+ = Forte marcação de membrana celular (superexpressão).
Escore final ( ) Mínimo de 1 e máximo de 4
ANEXO 2
AUTORIZAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM
PESQUISA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA (UFPB).
ANEXO 3
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título: DOENÇA DO REFLUXO GASTROESOFÁGICO : Análise comparativa entre os
aspectos histopatológicos e de biologia molecular na esofagite por refluxo, no esôfago de
Barrett e na displasia e adenocarcinoma associados ao esôfago de Barrett.
Você tem um tipo de doença denominada ( )esofagite por refluxo, ( )esôfago de
Barrett, ( )esôfago de Barrett com displasia, ( )esôfago de Barrett complicado com
adenocarcinoma, que teve como causa principal e inicial o retorno anormal do líquido do seu
estômago para o seu esôfago, chamado, cientificamente, de refluxo gastroesofágico
patológico, e que progrediu, no seu caso, para uma das fases da doença, descritas acima. O seu
diagnóstico médico foi dado, inicialmente, quando você realizou a sua endoscopia digestiva
alta no Endocentro - clínica de gastroenterologia e endoscopia digestiva, ou na clínica
(....................). Neste exame, também foram realizadas as biópsias, que é quando se coletam
alguns pequenos fragmentos do tecido do seu esôfago, para uma análise em laboratório,
chamada análise anatomopatológica, em que, com técnicas especiais, estuda-se esse material
colhido com um microscópio especial. Esse segundo exame foi feito no Virchow – laboratório
médico de patologia celular, ou no laboratório (......................) e permitiu a conclusão do seu
diagnóstico endoscópico. Como é do seu conhecimento, os pacientes portadores dessa doença
devem ser submetidos a tratamento clínico continuado, ou cirúrgico, dependendo do caso, e
acompanhados, em algumas situações, de repetidos exames endoscópicos e de biópsias do
esôfago, realizados periodicamente.
Estamos, neste momento, convidando você a participar do estudo denominado
DOENÇA DO REFLUXO GASTROESOFÁGICO : Análise comparativa entre os aspectos
histopatológicos e de biologia molecular na esofagite por refluxo, no esôfago de Barrett e na
displasia e adenocarcinoma associados ao esôfago de Barrett. Os avanços na área da saúde
ocorrem através de estudos como esse, por isso a sua participação (voluntária) é importante.
O objetivo desse estudo é, em uma primeira fase, aprofundar a análise do seu material
de biópsia, que se encontra arquivado no laboratório Virchow ou no laboratório
(.....................), com técnicas especiais e mais modernas, que foram obtidas com o avanço da
Medicina. Essa nova técnica chama-se imunoistoquímica.
Serão selecionadas, no seu arquivo de biópsias do laboratório Virchow, ou no
laboratório (......................) as lâminas ideais para que possam ser pesquisadas a presença, ou
não, de algumas substâncias, chamadas, tecnicamente, de biomarcadores moleculares
teciduais, e que são as seguintes: Ki-67, COX-2, p53, E-caderina e c-erbB-2. A presença
dessas substâncias, nas biópsias do esôfago, daqueles pacientes que têm a doença do refluxo
gastroesofágico, têm sido descritas, nos artigos médicos nacionais e internacionais, como
possivelmente relacionadas ao surgimento do câncer do esôfago.
Em uma segunda etapa, com as informações obtidas a partir dessas duas técnicas
descritas anteriormente, a anatomopatológica e a imunoistoquímica, faremos uma comparação
desses resultados entre si, e, também, com os seus dados clínicos e da sua endoscopia
digestiva, que constam no seu prontuário no Endocentro ou na clínica (...........................).
Dessa forma obteremos, então, as conclusões do nosso projeto.
A sua participação durante todo o estudo será restrita a unicamente autorizar, livre e
espontaneamente, o acesso a todos esses dados clínicos e laboratoriais descritos acima.
Não será feito nenhum procedimento outro que lhe traga qualquer desconforto ou risco
à sua vida, bem como não será realizado nenhum exame médico ou laboratorial em você.
Além disso, todas as informações sobre o estudo, solicitadas, poderão ser obtidas a qualquer
tempo. Você também poderá não participar da pesquisa, ou retirar seu consentimento a
qualquer momento, sem prejuízo no seu atendimento. Pela sua participação no estudo, você
não receberá qualquer valor em dinheiro. Também não há despesas pessoais para o
participante em qualquer fase do estudo. Seu nome não aparecerá em qualquer momento do
estudo, pois você será identificado com um número. As informações obtidas serão analisadas
em conjunto com as de outras pacientes, que também não serão identificados.
Deixamos claro que somente ao final do trabalho é que poderemos tirar conclusões a
respeito, quando então serão apresentados os resultados integralmente aos pacientes, com os
quais se discutirá individualmente, caso a caso, oferecendo, aos mesmos, possíveis e novas
contribuições no diagnóstico ou nas estratégias de tratamento.
O pesquisador utilizará todos os dados obtidos somente para esta pesquisa.
O principal investigador é o Dr. Gláucio Nóbrega de Souza, CRM 4299-PB, que pode
ser encontrado no Endocentro, na Av. Camilo de Holanda 280 em João Pessoa-PB, fone 0 xx
83 - 32227300, em período integral.
Declaro que compreendi as informações do que li ou que me foram explicadas sobre o
trabalho em questão.
Discuti com o Dr. Gláucio Nóbrega de Souza sobre minha decisão em participar nesse
estudo, ficando claros para mim, quais são os propósitos da pesquisa, os procedimentos a
serem realizados, as garantias de confidencialidade e dos esclarecimentos permanentes.
Ficou claro também que minha participação não tem despesas, de que tenho livre
acesso as informações parciais, a qualquer momento, ou integrais, ao término do estudo.
Concordo, voluntariamente, em participar desse estudo, podendo retirar meu
consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades, prejuízo ou
perda de qualquer benefício que possa ter adquirido, ou no meu atendimento no Endocentro
ou na clínica (........................) ou no laboratório Virchow, ou no laboratório (......................).
João Pessoa, ____, de ___________________de 2005.
_________________________________________
Assinatura do(a) paciente ou do seu representante legal
Declaro que assisti a explicação do Dr. Gláucio Nóbrega de Souza a(o) paciente, que
compreendeu e retirou suas dúvidas, assim como eu, a tudo o que será realizado na pesquisa.
__________________________________________
Assinatura da testemunha
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o consentimento livre e
esclarecido desta paciente ou representante legal para participação no presente estudo.
__________________________________________
Dr. Gláucio Nóbrega de Souza
Pesquisador responsável
Em caso de dúvida em relação a esse documento, você poderá entrar em contato com o
Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da
Paraíba, pelo telefone 0XX83-32167791.
Normas adotadas
Esta dissertação seguiu as normas estabelecidas pelo Comitê Internacional de Editores de
Revistas Médicas, denominadas Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomed
Journals, e conhecidas como o estilo de Vancouver. Atualmente, mais de 500 periódicos em todo
o mundo seguem essas normas, podendo ser localizado na Internet no endereço:
http://www.cma.ca/publications/mwc/uniform.htm
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
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