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UNIVERSIDADE REGIONAL DE BLUMENAU – FURB
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS – CCEN
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA – PPGQ
ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E AVALIAÇÃO DA PROPRIEDADE
INSETICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Piper amplum Kunth
SANDRA INÊS ADAMS ANGNES
BLUMENAU – SC
2005
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SANDRA INÊS ADAMS ANGNES
ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E AVALIAÇÃO DA PROPRIEDADE
INSETICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Piper amplum Kunth
Dissertação submetida à Universidade Regional
de Blumenau como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Química.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Andrade Rebelo
BLUMENAU – SC
2005
SANDRA INÊS ADAMS ANGNES
ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E AVALIAÇÃO DA PROPRIEDADE
INSETICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Piper amplum Kunth
Esta dissertação foi julgada e aprovada em sua forma final pelo orientador e demais
membros da banca examinadora.
Prof. Dr. Ricardo Andrade Rebelo
Orientador e Coordenador do PPGQ-FURB
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Ricardo Andrade Rebelo
Departamento de Química da FURB
Prof. Dr. Moacir Geraldo Pizzolatti
Departamento de Química da UFSC
Prof
a
. Dra. Flávia Aparecida Fernandes da Rosa
Departamento de Química da FURB
Profª. Dra. Iêda Maria Begnini
Departamento de Química da FURB
Suplente
Blumenau, 09 de dezembro de 2005.
ads:
“Aos meus pais, que realmente
acreditaram na minha conquista, e a todos
que me proporcionaram a emoção em
sentir a descoberta do meu crescimento
pessoal, profissional e intelectual”
A Deus, que tudo dirige e determina.
Aos meus pais pelo incentivo nos momentos difíceis.
Aos meus amigos, colegas de mestrado, principalmente Melissa, Irineu,
Suzete, Iguatemy e Ranieri pela amizade, motivação, acredito que essa etapa foi
uma das melhores fases em nossas vidas.
Ao Prof. Dr. Ricardo Rebelo pela orientação, confiança, “paciência” e apoio
oferecidos durante todas as etapas desse trabalho.
A Profª. Dra. Iêda Maria Begnini e Profª. Dra. Flávia Aparecida Fernandes da
Rosa e aos demais professores pelo incentivo, e amizade em todas as etapas do
curso de mestrado.
Ao Prof. Dr. Carlos Staller da Universidade Federal de Santa Catarina, pelo
empenho na realização dos testes de atividade Repelente e Inseticida.
Ao Prof. Dr. Moacir Geraldo Pizzolatti, da Universidade Federal de Santa
Catarina, pelo auxílio na determinação dos índices de retenção.
Ao químico Alberto Wisniewski Junior do Instituto de Pesquisas
Tecnológicas de Blumenau – IPTBLaboratório de Ensaios de Cromatografia, pela
realização das análises cromatográficas e espectrométrica de massas.
RESUMO
A familia Piperaceae pertence à subordem Nymphaeiflorae, ordem Piperales,
sendo formada por 5 gêneros principais e 1400 espécies. Os gêneros Piper e
Peperômia são os de maior representatividade, com aproximadamente 700 e 600
espécies, respectivamente. O gênero Piper destaca-se pela produção de óleos
essenciais, constituindo importante fonte de matéria-prima para diferentes
segmentos da indústria química. O óleo essencial in natura pode ainda apresentar
propriedades citotóxica, inseticida ou organoléptica, ampliando seu potencial
científicotecnológico. O presente trabalho emvolveu procedimentos de extração,
isolamento, identificação e propriedades de constituintes químicos das partes aéreas
da espécie Piper amplum Kunth, de ocorrência no Parque Natural Municipal São
Francisco de Assis, Blumenau em Santa Catarina. O óleo essencial das folhas e
infrutescência foi obtido por hidrodestilação com extrator Clevenger modificado,
obtendo-se rendimentos máximos de 0,12 e 0,045%, respectivamente. A composição
química do óleo essencial das folhas foi determinado por cromatografia gasosa (CG),
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM) e índice de
retenção (IR), neste caso empregando como padrões uma série homóloga de
hidrocarbonetos lineares. Foram identificados 19 compostos, respondendo por 90%
dos constituintes, sendo que os majoritários foram α-pineno 12,9 %; limoneno 3,8%;
α- copaeno 4,2%; E-cariofileno 24,4%; Valenceno 16,3% e α-cadinol 8,5%. Foi
também observada forte influência sazonal sobre a concentração dos
hidrocarbonetos monoterpênicos, que alcançaram teores máximos no verão
(janeiro). Ensaios inseticida e de repelência com o óleo essencial das folhas
empregando Cx. quinquefasciatus forneceram inesperadamente resultados
7
negativos. Os extratos das infrutescências verde e madura foram obtidos utilizando
se a mistura binária acetato de etila e hexano / 1:1 como solvente extrator em
aparelho soxhlet. Embora tenham apresentado a mesma composição química, os
rendimentos do extrato bruto proveniente de frutos verdes foi superior, 2,18% contra
apenas 0,78% obtido dos frutos maduros. Do extrato da infrutescência isolou-se por
cromatografia em coluna um constituinte principal que foi parcialmente analisado. A
técnica de Ressonância Nuclear Magnética de
13
C e
1
H convencionais e DEPT
indicou tratar-se de composto com cadeia alifática de origem parafínica, associada a
um sistema fenólico. Análises complementares devem ser realizadas para sua
elucidação completa. Para melhor avaliar o potencial terapêutico da planta em
questão, sugere-se a continuidade do estudo.
ABSTRACT
The Piperaceae family belongs to the superorder Nymphaeiflorae and order
Piperales, comprising 5 main genera with 1400 species. Piper and Peperomia are the
most important genera with about 700 and 600 species, respectively. The genus
Piper provides several representatives, which are essential oil producers. The
essential oils find application as raw materials for different chemical industrial
sectors. In natura they may also show cytotoxic, insecticidal and organoleptic
properties, which increases their scientific and technological potential. The present
work describes the extraction, isolation, identification and properties of the chemical
constituents from the aereal parts of Piper amplum Kunth, ocurring in the Parque
Natural Municipal São Francisco de Assis, Blumenau em Santa Catarina. The
essential oil obtained from the leaves and fruits were extracted by hidrodestillation
using a modified Clevenger apparatus, providing maximum yields of 0,12 e 0,045%,
respectively. The chemical composition of the leaves essential oil was determined by
a combination of analytical techniques, namely gas chromatography (GC), gas
chromatography coupled to mass spectrometry (GC-ME) and retention index (RI).
The latest technique used as standards a homologous series of linear hydrocarbons.
It was identified 19 compounds, comprising 90% of the essential oil constituents,
among them α-pinene (12,9%); limonene (3,8%); α-copaene (4,2%); E-cariophylene
(24,4%); valencene (16,3%) e α-cadinol (8,5%). It was also observed a strong
seasonal influence on the monoterpene hydrocarbons concentration, which reached
a maximum value during the summer season (January). The insecticide property of
the leaves essential oil against Cx. Quinquefasciatus gave an unexpected negative
result. The extracts from green and mature fruits were obtained by continuous
9
extraction in Soxhlet apparatus employing the binary system n-hexane and ethyl
acetate (1:1). Although their chemical composition was shown to be the same, the
extract yield from mature fruits was much superior, 2,18%, when compared to 0,78%
for the green fruits. It was isolated from the fruit extract by column chromatography a
major constituent, which was partially characterised. Conventional and DEPT
13
C and
1
H Nuclear Magnetic Resonance technique indicated the compound to have a
parafinic chain associated to a phenolic system. Complementary analysis is required
for the full structural characterization. For a better evaluation of the plant therapeutic
properties, further studies are suggested.
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Rota biossintética dos fenilpropanóides ................................
................................
23
Figura 2 – Estruturas precursoras dos terpenóides................................
................................
24
Figura 3 – Compostos terpênicos mais freqüentes em óleos essenciais
................................
25
Figura 4 – Inseticidas orgânicos de origem natural ................................
................................
32
Figura 5 – Inseticidas orgânicos sintéticos ................................
................................
33
Figura 6 – Monoterpenos, fenilpropanóides e sesquiterpenos ensaiados
sobre larvas de terceiro estágio de Aedes Aegypti
................................
36
Figura 7 – Extrator Clevenger ................................................................
................................
42
Figura 8 –
Foto de Piper amplum Kunth de ocorrência ao longo da “trilha das
águas” no Parque Natural Municipal São Francisco de Assis,
Blumenau – Santa Catarina.............................................................
52
Figura 9 – Extrator Clevenger modificado ................................
................................
58
Figura 10 –
Criação do culex quinquefasciatus Say 1823 no insetário do
Laboratório de Transmissores de Hematozoários do
Departamento de Microbiologia e Parasitologia do Centro de
Ciências Biológicas da UFSC................................
................................
62
Figura 11 – Estágios de desenvolvimento do Culex quinquefasciatus Say,
1823................................................................................................
.........................
63
Figura 12 –
Perfil cromatográfico do óleo volátil das folhas da Piper amplum
Kunth - coleta realizada em 15.05.2003 ................................
................................
66
Figura 13 –
Cromatograma do óleo volátil das folhas da Piper amplum Kunth -
coleta realizada em 09.11.2004................................
................................
66
Figura 14 –
Cromatograma do óleo volátil das folhas da Piper amplum Kunth -
11
coleta realizada em 26.01.2004................................
................................
66
Figura 15 –
Terpenos presentes no óleo essencial da Piper amplum Kunth,
coleta realizada em novembro de 2004, no Parque Municipal São
Francisco de Assis em Blumenau................................
................................
69
Figura 16 –
Espectro de massas (1) do E-cariofileno identificado como
constituinte majoritário no óleo essencial de Piper amplum Kunth,
(2) Espectro de massas proposto pela biblioteca de massas Nist
...........................
70
Figura 17 –
Rota de fragmentação do E- cariofileno associada ao espectro de
massas ................................................................
................................
71
Figura 18 –
Infravermelho do óleo essencial da Piper amplum Kunth
................................
72
Figura 19 –
Perfil cromatográfico do óleo essencial da infrutescência da Piper
amplum Kunth - coleta realizada em 26.01.2004
................................
73
Figura 20 – Correlação do perfil cromatográfico do óleo essencial das folhas e
infrutescência da Piper amplum Kunth - coleta realizada em
26.01.2004................................................................
................................
74
Figura 21 – Perfil cromatográfico do extrato bruto da infrutescência..................
76
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Diferentes formas de agentes terapêuticos ................................
.............................
28
Gráfico 2 – Valor de R
2
( coeficiente de linearidade ) para cálculo de índice de
retenção do hidrocarboneto padrão C9 ................................
................................
60
Gráfico 3 – Análise comparativa de hidrocarbonetos terpênicos da espécie
Piper amplum Kunth com estudos realizados por Santos 2001
..............................
71
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 –
Susceptibilidade de larvas de terceiro estágio de Aedes aegypti
...........................
37
Tabela 2 – Percentual de mortalidade de insetos em 24 h de exposição a
monoterpenos................................................................
................................
38
Tabela 3 –
Constituição química do óleo essencial das folhas frescas da Piper
amplum Kunth – coleta realizada em novembro de 2003, no Parque
Natural Municipal São Francisco de Assis, em Blumenau
................................
68
14
LISTA DE ABREVIAÇÕES
CG-EM - cromatografia gasosa associada à espectrometria de massas
CDCl
3
- Clorofórmio deuterado
CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
DMAPP - Dimetilalilpirofosfato
EFS - Extração por fluído supercrítico
FPP - Farnesilpirofosfato
HMTP - Hidrocarbonetos monoterpênicos
HMTPO - Hidrocarbonetos monoterpênicos oxigenados
HSTP - Hidrocarbonetos sesquiterpênicos
HSTPO - Hidrocarbonetos sesquiterpênicos oxigenados
IR - Índice de retenção
IV - Infravermelho
IPP - Isopentenilpirofosfato
m/z - Razão massa/carga
RMN
1
H - Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
RMN
13
C - Ressonância magnética nuclear de carbono
TR - Tempo de retenção
TMS - Tetrametilsilano
15
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................
18
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA...........................................................................
20
2.1 ÓLEOS VOLÁTEIS ...........................................................................................
20
2.1.1 Localização ....................................................................................................
20
2.1.2 Composição química......................................................................................
21
2.1.3 Fenilpropanóides............................................................................................
22
2.1.4 Terpenóides ...................................................................................................
23
2.1.5 Propriedades terapêuticas..............................................................................
26
2.1.6 Propriedades inseticidas ................................................................................
29
2.2 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO..............................................................................
39
2.2.1 Enfloração ......................................................................................................
39
2.2.2 Prensagem.....................................................................................................
39
2.2.3 Extração com solventes orgânicos.................................................................
40
2.2.4 Extração por fluído supercrítico......................................................................
40
2.2.5 Arraste por vapor d’água ou hidrodestilação..................................................
42
2.3 TÉCNICAS ANALÍTICAS ..................................................................................
44
2.3.1 Cromatografia em camada delgada (CCD) ....................................................
45
2.3.2 Cromatografia em coluna (CC).......................................................................
45
2.3.3 Cromatografia gasosa (CG) ...........................................................................
45
2.3.4 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM)........
47
2.3.5 Métodos espectroscópicos.............................................................................
47
2.3.5.1 Espectroscopia na região do ultravioleta (UV) ............................................
47
2.3.5.2 Espectroscopia na região do infravermelho (IV)..........................................
48
2.3.5.3 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de
13
C e
1
H .................
48
2.4 DESCRIÇÃO BOTÂNICA E CARACTERÍSTICAS DA FAMÍLIA
PIPERACEAE .........................................................................................................
49
2.4.1 Piper amplum Kunth.......................................................................................
52
2.5 OBJETÍVOS .....................................................................................................
54
2.5.1 Objetívo geral.................................................................................................
54
2.5.2 Objetívos específicos .....................................................................................
54
3 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................
55
3.1 MATERIAIS ......................................................................................................
55
3.1.1 Reagentes.....................................................................................................
55
3. 1.2 Equipamentos ...............................................................................................
55
3.2 MÉTODOS ........................................................................................................
56
3.2.1 Origem e coleta do material vegetal...............................................................
56
3.2.2 Preparo das exsicatas e classificação............................................................
57
3.2.3 Hidrodestilação do óleo essencial..................................................................
57
3.2.4 Extração contínua em aparelho Soxhlet.........................................................
58
3.2.5 Isolamento dos constituintes da infrutescência .............................................
58
3.2.6 Análise por CG-EM ........................................................................................
59
3.2.7 Índice de retenção..........................................................................................
59
3.2.8 Atividade larvicida e repelente........................................................................
61
3.2.8.1 Mosquito ( Culex quinquefaciatus, Say, 1823) ............................................
61
3.2.8.2 Criação em laboratório ................................................................................
62
3.2.8.4 Metodologia experimental do teste larvicida ...............................................
63
17
3.6.4 Metodologia experimental do teste de repelência. .........................................
64
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................................
65
4.1 ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS FRESCAS..................................................
65
4.1.1 Rendimento....................................................................................................
65
4.1.2 Análise por cromatografia gasosa..................................................................
65
4.1.3 Caracterização química por cromatografia gasosa acoplada à
espectrometria de massa e índice de retenção.......................................................
67
4.1.4 Caracterização química por espectroscopia no infravermelho.......................
72
4.2 ÓLEO ESSENCIAL DA INFRUTESCÊNCIA.....................................................
73
4.2.1 Rendimento....................................................................................................
73
4.2.2 Perfil cromatográfico do óleo volátil da infrutescência ...................................
73
4.3 ANÁLISE DE DADOS DOS TESTES DE REPELÊNCIA E INSETICIDA..........
74
4.4 EXTRATO DA INFRUTESCÊNCIA...................................................................
75
4.4.1 Rendimento....................................................................................................
75
4.4.2 Isolamento dos constituintes ..........................................................................
76
4.4.3 Análise preliminar dos principais constituintes do extrato da infrutescência .
77
5 CONCLUSÃO ......................................................................................................
79
REFERÊNCIAS.......................................................................................................
81
ANEXO 1- RMN
1
H EM CDCl
3
................................................................................
86
ANEXO 2 - RMN
1
H EM CDCl
3
+ D2O....................................................................
86
ANEXO 3 - RMN
13
C
EM CDCl
3
.............................................................................
87
ANEXO 4- RMN
13
C
EM CDCl
3
..............................................................................
87
ANEXO 5 - RMN
13
C
EM CDCL
3
- DEPT ...............................................................
88
ANEXO 6 - RMN
13
C
EM CDCL
3
- DEPT ...............................................................
88
18
1 INTRODUÇÃO
O interesse crescente das indústrias de alimentos, de cosméticos e
farmacêutica por matéria-prima de origem natural tem impulsionado a pesquisa de
produtos naturais, objetivando o seu isolamento, caracterização e o estudo das suas
propriedades.
A produção de óleos essenciais no Brasil teve início ao fim da segunda
década do século XX, com base no extrativismo de essências nativas para o
atendimento do mercado externo. O interesse pelos óleos essenciais está baseado
não somente na possibilidade de obtenção de compostos aromáticos (odor
agradável), mas também daqueles possuidores de propriedades terapêuticas, ou
ainda, de compostos precursores de substâncias de elevado valor agregado. Os
óleos essenciais são comumente misturas complexas de compostos orgânicos,
conjuntamente responsáveis pela qualidade da essência. Entretanto, alguns contêm
um componente majoritário em elevada concentração.
A química dos produtos naturais está intimamente relacionada à
biodiversidade, principalmente vegetal. Neste contexto, o Brasil, que apresenta duas
das maiores diversidades vegetais do planeta, Floresta Amazônica e Floresta
Atlântica, apresenta um valioso arsenal químico a ser estudado. Dentre as famílias
vegetais conhecidas e utilizadas popularmente e, portanto, com elevado potencial
químico, encontra-se a família Piperaceae, constituída por 3 (três) gêneros
predominantes, Piper, Ottonia e Peperomia. Importantes propriedades estão
associadas aos seus representantes, tais como, condimentares, farmacológicas e
inseticidas.
19
Apesar da importância do gênero Piper, como fonte de produtos naturais de
alto valor comercial, muitas espécies encontradas no Brasil ainda não foram
investigadas fitoquimicamente.
Com o intuito de contribuir para o isolamento e caracterização de compostos
bioativos de espécies brasileiras do gênero Piper, optou-se por investigar Piper
amplum Kunth, de ocorrência na Mata Atlântica catarinense e para a qual poucos
dados estão disponíveis na literatura especializada.
Na execução deste trabalho, adotou-se procedimentos experimentais
baseados em técnicas descritas na literatura para o isolamento e identificação de
produtos naturais, e avaliação da atividade biológica, compreendendo portanto, a
extração do óleo essencial das folhas frescas por hidrodestilação e da infrutescência
com solvente orgânico binário; a identificação dos constituintes químicos associados
ao óleo essencial e infrutescência da espécie Piper amplum kunth por técnicas
cromatográficas, espectrométricas e espectroscópicas, e a determinação das
propriedades inseticidas do óleo essencial.
20
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 ÓLEOS VOLÁTEIS
Os óleos voláteis são produtos obtidos tradicionalmente de parte de plantas
através de destilação por arraste com vapor d’água, também conhecida por
hidrodestilação. São misturas complexas de substâncias voláteis lipofílicas,
geralmente odoríferas e líquidas. Também são chamados de óleos essenciais,
etéreos ou essências. Essas denominações derivam de algumas de suas
características físico-químicas, como, por exemplo, a de serem geralmente líquidos
de aparência oleosa à temperatura ambiente, advindo daí a designação de óleo
(SIMÕES et al., 2003).
Em água apresentam solubilidade limitada, mas suficiente para aromatizar
as soluções aquosas que são denominadas hidrolatos. Apresentam sabor
geralmente acre (ácido) e picante, são geralmente incolores ou ligeiramente
amarelados, são poucos os óleos voláteis que apresentam cor, como o óleo volátil
de camomila de coloração azulada, devido o alto teor de azulenos. Em geral, os
óleos voláteis não são muito estáveis, principalmente na presença de luz, ar, calor,
umidade e metais. Possuem algumas propriedades físicas como índice de refração,
densidade, índice de retenção e outras que são úteis na sua caracterização.
2.1.1 Localização
Localizam-se nos espaços intercelulares ou bolsas oleíferas, presentes
praticamente em todas as partes da planta embora cada tipo os possua em órgãos
21
anatômicos específicos: embriões, flores, folhas, cascas, talos, frutas, sementes,
madeira, raízes, rizomas e, algumas árvores, nos exsudados óleos-resinosos
(ZAMBONI, 1983).
Sob a ótica da exploração da biodiversidade vegetal, quando esse órgão
representa um substrato renovável, é possível extrair-se a essência sem eliminar a
planta. No entanto, a grande parte dos óleos essenciais mundialmente
comercializados são atualmente oriundos de cultivos racionalizados e sempre que
possível estabilizado genética e climaticamente, o que garante a reprodutibilidade do
perfil químico do produto.
2.1.2 Composição química
Os constituintes químicos dos vegetais se dividem em dois grandes grupos,
os metabólitos primários que estão associados à produção de celulose, lignina,
proteínas, lipídios, açúcares e outras substâncias que realizam suas principais
funções vitais e o chamado metabolismo secundário do qual resultam substâncias
de baixo peso molecular as vezes produzidas em pequenas quantidades. No
metabolismo secundário das plantas temos a biossíntese de estruturas complexas
como alcalóides, terpenóides e fenilpropanóides. Os metabólitos secundários são
formados por vários caminhos biossintéticos que produzem moléculas dotadas de
grande diversidade de esqueletos carbônicos e grupamentos funcionais.
O metabolismo secundário responde a estímulos ambientais bastante
variáveis, de natureza física, química ou biológica. Fatores tais como fertilidade e
tipo de solo, umidade, radiação solar, vento, temperatura e poluição atmosférica,
dentre outros podem influenciar e alterar a composição química dos vegetais. Além
22
desses há interações e adaptações co-evolutivas complexas que se produzem entre
planta-planta, planta-animal e planta-microorganismo de um dado ecossistema
(ALVES, 2001).
Os óleos voláteis em sua maioria são constituídos de substâncias
terpênicas (monoterpenos e sesquiterpenos), e freqüentemente de fenilpropanóides,
acrescidos de moléculas menores, como álcoois, ésteres, aldeídos e cetonas de
cadeia curta. O perfil terpênico apresenta normalmente substâncias constituídas de
moléculas de dez a quinze carbonos mas, dependendo do método de extração e da
composição da planta, terpenos menos voláteis podem aparecer na composição do
óleo essencial (SIMÕES, 2003; SIANI, 2000; FARIAS, 1998; ARAÚJO, 1999;
CHENG et al., 2003).
2.1.3 Fenilpropanóides
Os fenilpropanóides se formam pela via do ácido chiquímico que origina os
aminoácidos aromáticos precursores de uma importante parcela de metabólitos
secundários. É formado pela condensação aldólica de dois metabólitos da glicose: o
fosfoenolpiruvato e a eritrose-4-fosfato.
A reação do ácido chiquímico com o ácido fosfoenolpirúvico, seguida de um
rearranjo intramolecular produz o ácido prefênico, precursor dos aminoácidos
aromáticos. A descarboxilação deste, seguida de aromatização e aminação redutiva
produz a fenilalanina, que pela ação da enzima fenilalanina amoliase (PAL) perde
uma molécula de amônia originando unidades básicas dos ácidos cinâmico e p-
cumárico. Estes últimos por redução enzimática produzem propenilbenzenos ou
alilbenzenos e por meio de oxidação com degradação de cadeias laterais, aldeídos
23
aromáticos. Ciclizações enzimáticas intramoleculares produzem cumarinas
conforme, Figura 1.
GLICOSE
ciclo das
pentoses
glicólise
OH O
OH
H
O
P
O
P
O
-
O
eritrose-4-fosfato
fosfoenolpiruvato
(H
2
PO
4
)
2
OH
2
NADP
+
NADPH
+
H
+
OHO
OH
OH
OH
ácido chiquímico
OO
-
OH OH
OH
OO
-
OH OH
OH
chiquimato
ácido gálico
taninos
hidrolisáveis
OO
-
OH
O
O
O
-
corismato
prefenato
OH
NH
2
O
-
O
NH
2
O
-
O
tirosina
fenilalanina
O
-
O
R
PAL
cinamato
ácido cinâmico R=H
acido p-cumarico R=OH
R
O
R
R
O OR
redução
redução
oxidação
ciclização
OH
OO
-
O
O
-
O
propenilbenzenos
alilbenzenos
aldeídos aromáticos
cumarinas
Figura 1 – Rota biossintética dos fenilpropanóides
Fonte: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia: da Planta ao Medicamento. Porto Alegre/
Florianópolis: Ed. Universidade/ UFRGS / Ed. Da UFSC, 2003.
2.1.4 Terpenóides
Os terpenóides constituem uma grande variedade de substâncias vegetais
derivadas do isopreno. A unidade isoprênica origina-se a partir do ácido mevalônico
24
que é formado pela condensação de uma unidade de acetoacetil-CoA com uma
molécula da acetil-CoA. Após a condensação aldólica, ocorre hidrólise originando a
3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA que é reduzida a mevalonato numa reação irreversível.
O mevalonato é então convertido em isopentenil-pirofosfato, ou isopreno ativo, a
unidade básica na formação dos terpenos e esteróides. A polimerização do
mevalonato vai originar moléculas de cadeias carbonadas multiplas de cinco em
cinco átomos de carbono, conforme ilustrado na Figura 2. A molécula do isopentenil-
Figura 2 – Estruturas precursoras dos terpenóides
Fonte: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia: da Planta ao Medicamento. Porto Alegre/
Florianópolis: Ed. Universidade/ UFRGS / Ed. Da UFSC, 2003.
pirofosfato e seu isômero dimetilalil-pirofosfato formam trans-geranil-pirofosfato, a
partir do qual se formam os demais terpenos. Novas ligações cabeça-cauda entre
transgeranil-pirofosfato e isopentenil-pirofosfato resultarão em sesquiterpenos (C15),
e diterpenos (C20). Já a ligação cabeça-cauda entre duas moléculas de farnesil-
pirofosfato (C15) dará origem ao esqualeno. As diferentes formas de ciclização do
25
esqualeno e rearranjos de metilas originam os diferentes esqueletos triterpênicos e
esteróides.
Aproximadamente 90% dos óleos voláteis são constituídos por
monoterpenos e sesquiterpenos. Alguns exemplos de hidrocarbonetos terpênicos
são: α–pineno (1), tujona (2), cânfora (3), fenchona (4), mirceno (5), linalol (6),
geraniol (7), limoneno (8), mentol (9), mentona (10), carvona (11), farnesol (12),
nerolidol (13), gama-bisaboleno (14), ácido abscícico (15), β-cariofileno (16), β-
bisaboleno (17) entre outros, (Figura 3).
O
H
O
H
5
6
7
O
O
1
2
O
3
4
O
H
O
O
8
9
10
11
H
2
COH
O
H
1 2
1 3
CO
2
H
O
O
H
14 15
17 16
Figura 3 – Compostos terpênicos mais freqüentes em óleos essenciais
Fonte:SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia: da Planta ao Medicamento. Porto Alegre/
Florianópolis: Ed. Universidade/ UFRGS / Ed. Da UFSC, 2003.
Os álcoois e aldeídos derivados dos terpenos apresentam odor mais
acentuado e são mais voláteis que hidrocarbonetos aromáticos, sendo que os
26
mesmos se apresentam em diferentes concentrações, como componente majoritário
ou mesmo em baixíssima quantidade (ZAMBONI, 1983, p.106-109).
2.1.5 Propriedades terapêuticas
Na prática médica popular, os óleos essenciais possuem uma larga tradição
de uso como agentes medicinais. Há registros pictóricos de seis mil anos atrás, entre
os egípcios, de práticas religiosas associadas à cura de males, às unções da
realeza, e à busca de bem estar físico, através dos aromas obtidos das partes
específicas de certos vegetais, como resinas, folhas, flores e sementes. As
substâncias aromáticas também já eram populares nas antigas China e Índia,
centenas de anos antes da era cristã, quando eram incorporados em incenso,
poções e vários tipos de acessórios, usados diretamente sobre o corpo. “No entanto,
foi apenas a partir da Idade Média, através do processo de destilação, introduzido
pelos cientistas muçulmanos, que se iniciou a real comercialização de materiais
aromáticos” (TYRREL, 1990).
A primeira obra contendo referências para o uso médico de ervas e óleos de
sementes aromáticas, o Khauterburch, foi publicada em 1551, pelo alemão Alan
Lonicir. O termo aromaterapia foi cunhado pelo químico francês M. Gatfossé, a partir
da experiência em acelerar sua própria convalescença das queimaduras sofridas
após um grave acidente em seu laboratório, através do uso da essência de lavanda.
Há cerca de duas décadas, vem se consolidando nos meios científicos o
termo Aromacologia, que trata do estímulo, por intermédio do olfato, ao
sistema límbico cerebral e ao hipotálamo, respectivamente o responsável
pelo controle do comportamento emocional e impulsos motivacionais do ser
humano, e o controlador da maioria das funções vegetativas e endócrinas
do corpo (CORAZZA, 2000, p.39-44 ).
27
A aromacologia lida com os efeitos resultantes de estímulos alcançados
através das vias olfativas até o cérebro. Não trata dos efeitos alcançados por
intermédio da introdução de agentes ativos na corrente sanguínea, ou através da
ingestão ou da absorção transdérmica, resultante da aplicação por massagem. Os
experimentos com o sistema olfativo e inalações são principalmente efetuadas no
Japão, Estados Unidos e Europa (JELINEK, 1994).
Com exceção à indústria de cosméticos, poucos trabalhos foram
desenvolvidos sobre a aplicação tópica dos óleos essenciais, e são concentrados
em seus efeitos terapêuticos, associadas às práticas de massagens em pacientes
hospitalizados. “A maior parte da pesquisa realizada com óleos essenciais ingeridos
é executada pelas indústrias de alimentos e bebidas, e não visam exatamente seus
aspectos farmacológicos” (BUCKLE, 1993, p.32-35).
Conforme Siani (2000), os óleos essenciais estão associados a várias
funções necessárias a sobrevivência do vegetal em seu ecossistema, exercendo
papel fundamental na defesa contra microorganismos e predadores, e também na
atração de insetos e outros agentes fecundadores, como pássaros e morcegos.
Para Siani (2000), os óleos essenciais encontram sua maior aplicação
biológica como agentes antimicrobianos. Esta capacidade, presente na grande
maioria destes compostos, de certa maneira, irá representar uma extensão do
próprio papel que exercem nas plantas, defendendo-as das bactérias e fungos
fitopatogênicos.
Os óleos essenciais apresentam propriedades medicinais tais como:
adstringente, antimicrobiana, analgésica, antidepressiva, antipirética, antiviral,
desodorante, estimulante, imunoestimulante e outras (DAVIS, 1996; WORWOOD,
1995; CHENG et al., 2003),.
28
Silva et al (1992), cita diversas atividades biológicas dos compostos
terpênicos, dentre elas a atividade herbicida, antimicrobiana, citostática e
antitumoral.
Os óleos essenciais ocupam um lugar preponderante nos mercados de
farmácias, perfumarias, cosméticos e nas indústrias agroalimentícias. São
largamente usados para conferir aromas especiais em inúmeros produtos, tais como
perfumes, cosméticos, sabonetes e condimentos (SILVA et al., 2003; LAVABRE,
1990).
Segundo Hostettmann et al., (2003, p.9 ):
As plantas representaram, durante séculos, a única fonte de agentes
terapêuticos para o homem. No início do século XIX com o desenvolvimento
da química farmacêutica, as plantas passaram a representar a primeira
fonte de substâncias para o desenvolvimento de medicamentos.
Atualmente, apesar do grande desenvolvimento da síntese orgânica e de
novos processos biotecnológicos, 25% dos medicamentos prescritos nos
países industrializados são originários de plantas e 120 compostos de
origem natural, obtidos a partir de cerca de 90 espécies de plantas, são
utilizados na terapia moderna. Os produtos naturais estão envolvidos no
desenvolvimento de 44% de todas as novas drogas (Gráfico 1).
Gráfico 1 – Diferentes fontes de agentes terapêuticos
Fonte: HOSTETTMANN, KURT et al.,. Princípios ativos de plantas superiores. São Carlos:
EdUFScar, 2003. p 9. (Série de textos da Escola de Verão em Química, vol. IV).
29
Segundo Yunes (2001), a fitoterapia constitui uma forma de terapia
medicinal que vem crescendo nestes últimos anos, ao ponto que atualmente o
mercado mundial de fitoterápicos movimenta valores na ordem de 22 bilhões de
dólares.
A utilização de plantas medicinais tornou-se um recurso terapêutico
alternativo de grande aceitação pela população e vem crescendo junto a
comunidade médica, desde que sejam utilizadas plantas cujas atividades biológicas
tenham sido investigadas cientificamente, comprovando a sua eficácia e segurança
(NOLDIN et al., 2003).
A importância das plantas medicinais deve-se também por sua contribuição
como fonte natural de fármacos e por proporcionar grandes chances de obter-se
uma molécula protótipo devido à diversidade de constituintes presentes nestas. No
entanto, inúmeras plantas que são usadas em preparação de fitoterápicos carecem
de um maior controle de qualidade, uma vez que a literatura científica indica que
muitas destas podem apresentar substâncias tóxicas ou composição química
variável (NOLDIN et al., 2003; CECHINEL FILHO, 1999).
2.1.6 Propriedades inseticidas
Segundo Samways (1989), a origem do controle biológico pode ser atribuída
aos antigos chineses, que utilizavam a formiga Oecophylla smaragolina
(Hymenoptera: Formocidae) para controlar certas pragas das culturas de frutas
cítricas. Desde então, cerca de 150 insetos-praga diferentes e 30 espécies de ervas
daninhas foram controlados parcial ou totalmente pelos métodos clássicos de
controle biológico, baseado na introdução de um inimigo natural. Não estão incluídas
30
nesses números a enorme quantidade de pragas que passam despercebidas e
ervas que são continuadamente eliminadas pela diversidade de inimigos naturais
resistentes, tanto em comunidades naturais como em algumas áreas reflorestadas
ou de agricultura. O controle biológico surge da preocupação em manter a natureza
e os processos ecológicos em equilíbrio.
Antes do descobrimento do Brasil os insetos endêmicos desse território
limitavam-se a alimentar-se de plantas silvestres, situação que se modificou com o
processo de colonização, quando parte dos insetos nativos passou a tirar alimento
de novas plantas e como estas normalmente apresentava-se concentradas, houve
multiplicação rápida e desequilibrada de insetos. Situação semelhante ocorreu com
algumas espécies estrangeiras, onde o clima mais favorável, predadores naturais
em pequeno número e hospedeiros em grande concentração determinam uma
superpopulação. O desmatamento e a caça indiscriminada de pássaros insetívoros
colaboraram para um desequilibro ainda maior que aliado, ao crescimento
populacional rápido e contínuo, tem aumentado em muito a competição homem-
inseto pelo mesmo tipo de alimentação e território, dificultando o controle de
infecções hospitalares e doenças que têm nos insetos os vetores de transmissão.
Todos estes fatores têm levado à busca contínua por novos agentes inseticidas
eficientes que representem maior segurança ao homem e ao meio ambiente
(VIEGAS JUNIOR 2003; SALERNO et al., 2002).
Conforme Viegas (2003), a toxicidade de uma substância química em
insetos não a qualifica necessariamente como um inseticida. Diversas propriedades
devem estar associadas à atividade, tais como eficácia mesmo em baixas
concentrações, ausência de toxicidade frente a mamíferos e animais superiores,
ausência de fitotoxicidade, fácil obtenção, manipulação e aplicação, viabilidade
31
econômica e não ser cumulativa no tecido adiposo humano e de animais
domésticos. Fica evidente que as características citadas referem-se àquele
inseticida tido como ideal, o que raramente será o caso. Dentro da classificação de
inseticidas são incluídos também substâncias que repelem e que atraem insetos. Os
inseticidas podem ser classificados segundo três pontos de vista: finalidade, modo
de ação e origem.
Segundo Samways (1989), o uso de inimigos naturais traz muitas vantagens
do ponto de vista ambiental, pois atua somente por intermédio de seres vivos. O
controle biológico é as vezes, considerado uma oposição ao controle químico, mas
se os dois métodos forem utilizados em harmonia, se tornam complementares no
processo de supressão de pragas.
O uso de inseticidas consome mundialmente bilhões de dólares na tentativa
de controlar inseto. Os produtos naturais inseticidas foram muito utilizados até a
década de 40, quando os produtos sintéticos passaram a ganhar espaço a partir da
II Guerra Mundial, devido a pesquisa em produtos biocidas. Estes mostraram-se
muito mais potentes e menos específicos que os naturais, até então utilizados no
controle de pragas agrícolas, e foram quase totalmente substituídos.
A utilização de inseticidas pode ser vista de forma bastante genérica no
século XX predominando nos primeiros 50 anos os inseticidas naturais de origem
orgânica e inorgânica.
Dentre os orgânicos de origem natural foram muito utilizados os alcalóides
como a nicotina (18), nor-nicotina (19), e anabasina (20); os piretróides como a
piretrina (21) e aletrina (22); os rotenóides tendo a rotenona (23) como principal
exemplo, (Figura 4).
32
N
C
H
3
N
N
H
N
N
N
H
18
19
20
H
H
O
O
H
O
2 1
H
H
O
O
H
O
2 2
O
O
O
O
O C H
3
C H
3
2 3
Figura 4 – Inseticidas orgânicos de origem natural
Fonte: VIEGAS JUNIOR, C. Terpenos com atividade inseticida: uma alternativa para o controle
químico de insetos. Química Nova, São Paulo, v. 26, n. 3: p. 390-400, maio/jun. 2003.
Essas substâncias agem no sistema nervoso das pragas, que param de se
alimentar, ficam gradualmente paralisadas e morrem. Quando utilizadas em
conjunto, piretrina e rotenona se completam na eficácia de mortalidade das pragas:
enquanto a piretrina possui rapidez de ação e efeito de choque (Knock down), a
rotenona tem ação antimitótica e inibidora da respiração celular. É importante
salientar que humanos e animais domésticos (mamíferos e aves) não são
incomodados por sua utilização, quando esta segue doses normais de emprego
(SAMWAYS, 1989).
Na década de 50 a 70, logo após a II guerra mundial, ocorreu uma explosão
no desenvolvimento da síntese orgânica, inclusive de produtos com atividade
inseticida. Passaram a ser utilizados o aldrin (24), hexacloroexano - HCH (25),
dieldrin (26), DDT (27), e clordano (28), (Figura 5).
33
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
25
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
24
CH
Cl
3
C
Cl
Cl
27
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
O
26
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
28
Figura 5 – Inseticidas orgânicos sintéticos
Fonte: VIEGAS JUNIOR, C. Terpenos com atividade inseticida: uma alternativa para o controle
químico de insetos. Química Nova, São Paulo, v. 26, n. 3: p. 390-400, maio/jun. 2003.
Naquela época começou a reforçar-se um propósito de proteção ao meio
ambiente e um sério questionamento quanto ao uso de inseticidas clorados e
fosforados que, além de causarem enorme impacto ambiental depois de certo
tempo, perdiam o largo espectro de atividade que anteriormente mostraram.
Uma abordagem para a seleção de novos inseticidas que preencham os
requisitos de eficácia, segurança e seletividade, pode ser através do estudo de
mecanismos de defesa de plantas.
Plantas, como organismos que co-evoluem com insetos e outros
microorganismos, são fontes naturais de substâncias inseticidas e antimicrobianas,
já que as mesmas são produzidas pelo vegetal em resposta a um ataque
patogênico. Inúmeras substâncias acumulam-se no vegetal para sua defesa contra
microorganismos, algumas delas sendo denominadas de fitoalexinas. As plantas
sintetizam e emitem inúmeros compostos voláteis (ácidos, aldeídos e terpenos) para
34
atrair polinizadores e se defender de herbívoros. Ao que tudo indica, os insetos
reagem a substâncias voláteis através do mecanismo olfativo semelhante ao nosso,
sentindo-se, portanto, atraídos ou repelidos pelos odores produzidos pelas plantas
(ALVES, 2001).
No que concerne à defesa contra herbívoros, as plantas desenvolveram dois
tipos de defesa a direta e a indireta. Na defesa direta estão envolvidas substâncias
como sílica, metabólitos secundários, enzimas e proteínas, além de órgãos como
tricomas e espinhos que afetam diretamente o desempenho do inseto. Na defesa
indireta estão envolvidas substâncias emitidas pela planta, que atraem parasitas e
predadores do inseto fitófago. Terpenos e fenilpropanóides voláteis sintetizados por
espécies vegetais podem ter, dependendo do inseto em análise, propriedades
atrativas (alimentação, polinização) e/ou deterrentes e inseticidas (ALVES, 2001;
SIMAS, 2003).
Extratos de plantas vêm sendo utilizados pelo homem desde a Idade Antiga,
numa prática que persiste até hoje, com mais de 200 espécies de plantas
conhecidas por suas propriedades inseticidas ( VIEGAS JUNIOR, 2003; ROEL,
2001; SIMAS, 2004).
Segundo Simas (2004), com o surgimento de formas resistentes, de insetos
aos inseticidas convencionais utilizados, tem crescido a procura por extratos
vegetais e substâncias naturais que sejam efetivas no combate a insetos adultos e
larvas e que sejam isentas de toxicidade para o meio ambiente. Resistência a
inseticidas convencionais é um dos principais obstáculos ao controle de insetos,
pestes de importância na agricultura e na medicina. A resistência resulta no aumento
da freqüência de aplicação de inseticida, dosagens crescentes, rendimentos
diminuídos, danos ambientais e surgimento de doenças, quando os vetores não
35
podem ser controlados. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), o custo
da resistência de insetos a inseticidas pode alcançar anualmente US$ 1,4 bilhão nos
Estados Unidos.
Conforme Alves (2001), nos últimos anos, óleos essenciais obtidos de
plantas têm sido considerados fontes em potencial de substâncias biologicamente
ativas. Ênfase tem sido dada a propriedade inseticida de compostos voláteis de ação
sobre o sistema nervoso central, como exemplo tem-se os monoterpenos pulegona,
mentona e carvona, que mostraram-se eficientes larvicidas contra Drosophila
malanogaster.
Os terpenos abrangem uma grande variedade de substâncias de origem
vegetal e sua importância ecológica como defensivos de plantas está bem
estabelecida. Simas (2004), testou a susceptibilidade de larvas de terceiro estágio
de Aedes aegypti a frações ativas de Myroxylon balsamum , no qual observou que
das frações obtidas, o E-nerolidol puro isolado mostrou uma CL
50
de 17 ppm,
enquanto que as frações originadoras (misturas de terpenos) do E-nerolidol
mostraram-se mais ativas, com CL
50
de 4-10ppm. Isso pode ocorrer, pois terpenos
são substâncias que aumentam a absorção transmembrana tanto de drogas
lipofílicas quanto de drogas hidrofílicas. Sendo assim, é possível que outros
constituintes das frações estejam atuando como sinergistas, potencializando a
atividade do E-nerolidol.
Com o objetivo de comparar a atividade larvicida do sesquiterpeno E-
nerolidol com outros constituintes originados de óleos essenciais, Simas (2004),
realizou ensaios com alguns terpenos e fenilpropanóides obtidos comercialmente:
linalol (6); citronelal (29); mentol (9); carvona (11); geraniol (7); α-pineno (1); β-
36
pineno (30); safrol (31); aldeído cinâmico (32); eugenol (33); E-nerolidol (13); E,E-
farnesol (12), (Figura 6), sobre larvas de terceiro estágio de A. aegypti.
Figura 6 – Monoterpenos, fenilpropanóides e sesquiterpenos ensaiados sobre
larvas de terceiro estágio de Aedes Aegypti
Fonte: SIMAS, N. K. Produtos Naturais para o Controle da Transmissão da Dengue – Atividade
Larvicida de Myroxylon balsamum (óleo vermelho) e de Fenilpropanóides. Química Nova, v. 27, n. 1,
p.46-49, 2004.
A Tabela 1 mostra os resultados obtidos. O sesquiterpeno farnesol, uma
forma isomérica do E-nerolidol, mostrou atividade larvicida com uma CL
50
de 13
ppm. Entretanto, o monoterpeno geraniol precursor biossintético do farnesol,
mostrou-se menos ativo (CL
50
= 81,6 ppm). Estes resultados sugerem que a maior
lipofilicidade dos sesquiterpenos testados, quando comparados aos monoterpenos,
é uma propriedade importante para a atividade larvicida. Os fenilpropanóides safrol,
37
eugenol e aldeído cinâmico foram ativos com CL
50
de 49,0; 44,5 e 24,4 ppm,
respectivamente.
Tabela 1 – Susceptibilidade de larvas de terceiro estágio de Aedes aegypti
Substâncias Classe Química CL
50
(ppm) CL
99
(ppm)
Farnesol Sesquiterpeno 13.0 32.5
Nerolidol Sesquiterpeno 17.0 50.0
Aldeído cinâmico Fenilpropanóide 24.4 54.7
β-Pineno
Monoterpeno 42.5 145.4
Carvona Monoterpeno 43.8 131.5
Eugenol Fenilpropanóide 44.5 100.0
Safrol Fenilpropanóide 49.0 63.8
α-Pineno
Monoterpeno 74.3 168.1
Geraniol Monoterpeno 81.6 122.0
Mentol Monoterpeno >100.0 Não determinado
Citronelal Monoterpeno >100.0 Não determinado
Linalol Monoterpeno >100.0 Não determinado
Fonte: SIMAS, N. K. Produtos Naturais para o Controle da Transmissão da Dengue – Atividade
Larvicida de Myroxylon balsamum (óleo vermelho) e de Fenilpropanóides. Química Nova, v. 27, n. 1,
p.46-49, 2004.
Os resultados indicam claramente que algumas características estruturais
foram importantes para a atividade biológica. A ligação dupla exocíclica no β-pineno
(CL
50
= 42,5 ppm) parece ser mais importante que a ligação dupla endocíclica do α-
pineno (CL
50
= 74,3 ppm); a presença de uma carbonila com insaturação nos
carbonos α e β em um esqueleto cicloexânico parece ser importante para a atividade
biológica, visto que a carvona contendo tal estrutura foi ativa (CL
50
= 43,8 ppm),
enquanto o mentol (CL
50
> 100 ppm) foi inativo; a presença de um anel benzênico
conjugado a uma carbonila com insaturação nos carbonos α e β no aldeído cinâmico
(CL
50
24,4 ppm), torna-o mais ativo que aquele não conjugado do safrol (CL
50
= 49,
ppm) e do eugenol (CL
50
= 44,5 ppm). O grupo aldeído isolado não é importante
para a atividade, visto que o citronelal mostrou-se inativo. É provável que o sistema
aromático menos nucleofílico do aldeído cinâmico contribua mais para a atividade
38
larvicida que aquele mais nucleofílico, devido aos grupos doadores de elétrons
benzodioxila, hidroxila e metoxila do safrol e eugenol, respectivamente.
Em estudo realizado por Viegas Junior (2003), vários monoterpenos foram
isolados e avaliados quanto à toxicidade a diferentes insetos. Estes estudos
envolveram testes com o α-pineno, β-pineno, β-careno, limoneno, mirceno, α-
terpineno e canfeno, aos quais os insetos ficaram expostos por um período de 24 h
cujos resultados se encontram na Tabela 2.
Tabela 2 – Percentual de mortalidade de insetos em 24 h de exposição aos
monoterpenos
Insetos Mortalidade (%)
*
Idendroctonus micans: colonizador solitário
Larvas: 0 Adultos: 5-10
Ips typographus
Adultos 7-20
Rhizophagus grandis: predador específico de D. micans
0
Rhizophagus dispars: predador ocasional de Ips
100
Formica rupa
100
Tenebrio molito
40-100
* resultados de testes separados com α-pineno, β-pineno, β-careno, limoneno, mirceno, α-terpineno e
canfeno
Fonte: VIEGAS JUNIOR, C. Terpenos com atividade inseticida: uma alternativa para o controle
químico de insetos. Química Nova, São Paulo, v. 26, n. 3: p. 390-400, maio/jun. 2003.
Os limonóides ou tetra-nortriterpenos representam o nível máximo na
seqüência de produção de terpenóides em plantas que normalmente não são
atacadas por insetos. No nível inferior, os monoterpenos de estrutura relativamente
simples como o limoneno, o mirceno, exercem funções de proteção às plantas que
os produzem. Aparentemente sua ação inseticida seria decorrente da inibição da
acetilcolinesterase nos insetos. A grande maioria de trabalhos na literatura que se
referem a terpenóides superiores, fazem referência a observações de atividades
como inibidores ou retardadores de crescimento, danos na maturação, redução da
capacidade reprodutiva, supressores de apetite, podendo levar os insetos
predadores à morte por inanição ou toxicidade direta ( VIEGAS JUNIOR, 2003).
39
2.2 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO
Os métodos de extração variam conforme a localização do óleo essencial na
planta e com a finalidade de utilização do mesmo.
2.2.1 Enfloração
Esse método já foi muito utilizado, mas atualmente é empregado apenas por
algumas indústrias de perfumaria. É principalmente aplicado em algumas plantas
com baixo teor de óleo, mas de alto valor comercial. Por exemplo, pétalas de flores
são depositadas a temperatura ambiente sobre uma camada de gordura, durante um
certo tempo. Em seguida, as pétalas esgotadas são substituídas por novas até a
saturação total, quando a gordura é tratada com álcool. “Para se obter o óleo
essencial, o álcool é destilado a baixa temperatura e o produto é assim obtido”
(SIMÕES, 2003, p. 396).
2.2.2 Prensagem
Normalmente esse método é empregado para a extração dos óleos
essenciais de frutos cítricos. “Os pericarpos desses frutos são prensados e a
camada que contém óleo essencial, é então separado da emulsão formada com a
água por decantação, centrifugação ou destilação fracionada” (SIMÕES, 2003,
p.396).
40
2.2.3 Extração com solventes orgânicos
Segundo Chaar (2000), os óleos essenciais podem ser extraídos com
solventes (éter, éter de petróleo ou diclorometano). Porém, outros compostos
lipofílicos são também extraídos, além do óleo essencial. “Por isso, os produtos
obtidos assim raramente possuem valor comercial” (SIMÕES, 2003, p.396).
A maneira inicial mais óbvia de preparar corretamente uma amostra é a
escolha adequada do solvente de extração, com uma extração inicial que utiliza
solventes de baixa polaridade. “Obtém-se compostos mais lipofílicos, de outras
forma com solventes alcoólicos obtém-se um amplo espectro de material polar e
apolar” (HOSTETTMANN et al., 2003, p.152).
2.2.4 Extração por fluído supercrítico
Nunes et al., (2002, p.214-220 ):
A extração em fluído supercrítico (SFE) foi introduzida no final da década de
80 como uma das alternativas para o desenvolvimento de procedimentos de
extração. Desta forma, nos casos em que as recuperações pelos métodos
(SFE) são satisfatórios para determinados princípios ativos, os métodos que
empregam procedimentos de partição líquido-líquido ou sólido-líquido
podem ser paulatinamente substituídos. Técnicas de extração empregando
vácuo ou elevada temperatura e pressão (instrumentos Soxhlet, por
exemplo) têm sido utilizadas nas etapas de extração. Entretanto, tais
técnicas apresentam a desvantagem de acarretar degradação térmica em
alguns compostos. Uma vez que o fluído supercrítico pode ser visto como
sendo tanto um gás quanto um líquido, ele oferece grande vantagem de
participar como ambas as fases nas técnicas de extração, além de exibir
elevado coeficiente de difusão, que favorece o processo de extração,
sobretudo em matrizes sólidas.
Segundo Chaar (2000), Atualmente é um dos métodos de opção para
extração industrial de óleos essenciais, pois permite recuperar os aromas de vários
tipos, não somente óleo essencial, de modo bastante eficiente. Nenhum traço de
41
solvente permanece no produto obtido, tornando-o mais puro do que aqueles obtidos
por outros métodos. Para tal extração, o CO
2
é primeiramente liquefeito por
compressão e, em seguida, aquecido a uma temperatura de 30 à 31°C. Nessa
temperatura, o CO
2
atinge um quarto estado, no qual sua viscosidade é análoga a
de um gás, mas sua capacidade de dissolução é elevada como a de um líquido.
Uma vez efetuada a extração, faz-se o CO
2
retornar ao estado gasoso, resultando
na sua total eliminação.
Esta técnica pode ser aplicada a compostos quimicamente estáveis e é
empregada fundamentalmente para compostos de baixa polaridade. A EFS é uma
valiosa alternativa à destilação por arraste de vapor ou à extração Soxlhet. Pode-se
conseguir uma maior seletividade na extração e obter-se produtos mais puros,
escolhendo-se condições adequadas de pressão e temperatura.
Os índices de recuperação são maiores que os das extrações
convencionais, líquido-líquido e sólido-líquido. O aspecto da segurança do método é
muito importante porque se elimina a necessidade de grandes quantidades de
solventes orgânicos.
Também podem ser enumeradas as vantagens referentes a não poluição do
meio ambiente, já que se reduz a utilização de solventes clorados. Muitos fluídos
supercrítico, por exemplo, dióxido de carbono, oxido nitroso e amoníaco têm
características de transferência de massa adequada (baixa viscosidade e alta
velocidade de difusão comparadas com os líquidos, fazendo com que sejam ideais
para extração de tecidos em plantas). “São gases à temperatura ambiente,
relativamente inertes não tóxicos e econômicos. As suas propriedades extrativas
podem se modificar com a adição de co-solvente como metanol, etanol, propanol
acetonitrila, diclorometano e água” (HOSTETTMANN et al., 2003, p. 61).
42
2.2.5 Arraste por vapor d’água ou hidrodestilação
Segundo Chaar (2000), na indústria de óleos essenciais existem três tipos
de extrações distintas de arraste por vapor d’água, essa distinção é feita pela forma
na qual se estabelece o contato entre a amostra e a água, na fase líquida ou de
vapor. A primeira é chamada de hidrodestilação, onde a amostra fica imersa na água
contida numa caldeira.
Em laboratórios de pesquisa utiliza-se o aparelho Clevenger, conforme
Calderari (2002); Clevenger (1928) e Gotlieb e Magalhães (1960), (Figura 7).
Figura 7 – Extrator Clevenger
Fonte: CLEVENGER, J. F. Apparatus for the determination of volatile oil. J. Am. Pharm. Ass.
Washington. v. 17, p. 315, 1928.
Este aparelho é conectado na sua parte inferior por um balão de fundo
redondo, que fica parcialmente preenchido pelo material a ser extraído (folhas, talos,
infrutescência), coberto por água destilada. O balão é colocado numa manta de
aquecimento, para promoção da evaporação das substâncias voláteis contidas no
material vegetal. Na porção superior do Clevenger, o mesmo é conectado por um
43
condensador submetido à refrigeração através de passagem de água corrente,
fazendo com que as substâncias extraídas do balão na forma de vapor, caso
cheguem ao condensador, estas sejam condensadas, retornando ao aparelho
Clevenger. Ao retornar ao aparelho, a substância extraída, no caso o óleo essencial,
fica retida no reservatório graduado e preenchido com água.
Depois de realizada a extração, o óleo essencial, juntamente com sua água
aromática, é removido do aparelho através de saída contendo uma torneira e este
material é recebido numa proveta graduada.
Quando o volume de óleo obtido é inferior a 1 mL, este pode ser isolado com
o uso de solvente orgânico, comumente n-hexano ou éter etílico bidestilado, sendo
empregado sulfato de sódio anidro para a remoção de água residual. Posteriormente
faz-se filtração gravimétrica e concentração da amostra em evaporador rotatório com
temperatura em aproximadamente 40°C, até a obtenção do óleo puro.
Para volumes superiores emprega-se técnica clássica de separação de
líquidos imiscíveis.
Conforme Chaar (2000), na chamada destilação pela água e vapor, a
amostra permanece contida em um recipiente logo acima da água da caldeira,
ficando assim separada da água. Na terceira, chamada propriamente de destilação
pelo vapor de água que flui de um gerador próprio e independente.
A indústria utiliza, preferencialmente, a extração por vapor d’ água por ser
reduzido o contato da amostra com a água em relação aos métodos anteriores de
arraste por vapor d’ água. Neste caso, são menos acentuada a hidrólise de ésteres,
a oxidação de componentes voláteis e a polimerização de outros constituintes, em
particular dos aldeídos (COSTA, 1994). A água residual desse método de extração é
chamada de hidrolato, que normalmente é rica em compostos do óleo essencial
44
solubilizados (BRUNETON, 1991).
2.3 TÉCNICAS ANALÍTICAS
Conforme Chaar (2002), a análise de misturas complexas de
multicomponentes, como o são os óleos essenciais, requer a aplicação de métodos
analíticos modernos e instrumentação adequada. As técnicas analíticas permitem a
avaliação da qualidade do óleo essencial, garantindo, assim, a constância de seus
constituintes químicos e a segurança de sua utilização. A avaliação quantitativa e
qualitativa envolve a utilização de diversas técnicas básicas, que passaram por
algumas alterações nos últimos anos, devido essencialmente à revolução da
informática (programa de computadores, níveis de automação, forma de integração
dos dados obtidos) e da sofisticação dos experimentos que podem ser realizados,
resultando na dedução de uma estrutura coerente.
A análise química de separação e identificação dos constituintes dos óleos,
é feita por meio das técnicas de Cromatografia em Camada Delgada (CCD),
Cromatografia em Coluna (CC), cromatografia gasosa (CG), cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE), e técnicas espectroscópicas, dentre as quais as mais
freqüentes são a espectroscopia na região do ultravioleta (UV), do infravermelho
(IV), de Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN
1
H) e de carbono
(RMN
13
C) e a espectrometria de massas (EM), além do uso de bibliotecas contendo
informações espectroscópicas e espectrométricas de um grande número de
substâncias já conhecidas.
45
2.3.1 Cromatografia em camada delgada (CCD)
A Cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica bastante
utilizada na análise de óleos essenciais devido à sua simplicidade, baixo custo,
rapidez de análise e requerer reduzida quantidade de amostra. Pode-se usar vários
tipos de fases estacionárias e móveis, além do auxílio do uso de reveladores
próprios para determinar grupamentos químicos específicos. Alternativamente, para
a caracterização qualitativa da amostra, poderão ser empregadas substâncias
padrões. Quanto à fase móvel, pode-se fazer uso de solventes ou misturas de
solventes com diferentes afinidades pelas substâncias a serem separadas,
(CALDERARI, 2002 e COLLINS, 1997).
2.3.2 Cromatografia em coluna (CC)
A cromatografia em coluna apresenta-se como uma eficiente técnica de
separação e de isolamento dos constituintes de misturas complexas, fazendo uso de
uma coluna de vidro presa no sentido vertical, onde a fase estacionária é
sedimentada e compactada. Na cromatografia em coluna pode-se utilizar o recurso
de variar continuamente a fase móvel, interferindo na sua polaridade que poderá ser
gradativamente aumentada ou diminuída (CALDERARI, 2002, p. 33).
2.3.3 Cromatografia gasosa (CG)
Segundo Chaar (2000) diferentes técnicas cromatográficas são utilizadas na
análise de compostos voláteis, em particular, a cromatografia gasosa (CG) é usada
46
na separação da mistura em componentes individuais. Esta técnica de separação
baseia-se na distribuição dos componentes da amostra entre a fase estacionária
(sólido ou líquido) e uma fase móvel (gás), sendo aplicada a compostos
volatilizáveis. O gás da fase móvel tem a finalidade de transportar as moléculas a
serem separadas através da coluna, sendo por isso conhecido como gás de arraste
ou gás carreador.
O processo cromatográfico acontece ao ser introduzida a amostra na coluna
através de um injetor, onde o gás de arraste flui e carrega a amostra. O componente
da amostra cuja afinidade pela fase estacionária é maior, requer maior tempo para
ser eluído que aquele cuja interação é menor. Nesse processo de separação
também é considerado o ponto de ebulição do componente, pois este é um fator
determinante do tempo de eluição. Considerando que dois componentes de uma
mistura tenham a mesma afinidade pela fase estacionária, aquele que possuir maior
ponto de ebulição apresentará um tempo de eluição maior.
Um detector é conectado na saída da coluna, onde é constatada a eficiência
da separação pelo cromatograma registrado. O detector é o principal responsável
pela quantidade mínima da substância a ser detectada, a coluna pela quantidade
máxima (COLLINS, 1997 e VOGEL, 2002).
A identificação dos compostos individuais pode ser realizada através da
comparação dos tempos de retenção da amostra com padrões. Para ser mais
independente das variações do tempo de retenção sob diferentes condições de
análise, foi introduzido o índice de Kovats (IK) e o Índice de Retenção (IR) que
relacionam o tempo de retenção dos compostos sob análise ao tempo de retenção
de uma série homóloga de hidrocarbonetos. Tais índices permitem uma maior
confiabilidade na interpretação dos resultados.
47
2.3.4 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM )
A CG-EM por impacto de elétrons (IE), é uma das técnicas mais aplicadas
na caracterização de misturas complexas. Esta técnica permite a separação dos
constituintes pela cromatografia gasosa, que são introduzidos individualmente em
ordem de eluição na câmera de ionização do espectrômetro de massas. O espectro
de massas obtido para cada um dos constituintes geralmente indica a massa
molecular e o seu padrão de fragmentação. O padrão de fragmentação pode ser
comparado eletronicamente com aqueles constantes da biblioteca de espectros de
massas, permitindo a elucidação estrutural da amostra por análise comparativa.
Mesmo que esse sistema constitua um grande avanço, o analisador tem de decidir,
finalmente, se a resposta do computador é correta. Por isso, para a identificação
com segurança também é importante considerar os índices de retenção (SIMÕES,
2003).
2.3.5 Métodos espectroscópicos
2.3.5.1 Espectroscopia na região do ultravioleta (UV)
Útil na avaliação de cromóforos, principalmente sistemas aromáticos e
conjugados.
Em compostos aromáticos informações estruturais valiosas poderão ser
obtidas pelo emprego de reagentes de deslocamento como acetato de sódio, cloreto
de alumínio e outros.
48
2.3.5.2 Espectroscopia na região do infravermelho (IV)
A espectroscopia na região do infravermelho fornece informações acerca
dos grupos funcionais presentes nas moléculas que compõe os óleos essenciais.
Uma vês que as vibrações moleculares desses grupos são bastante característicos
tanto quanto a freqüência quanto a absorção. Apesar de ser uma técnica altamente
sensível, é pouco seletiva no caso das misturas de multicomponentes. (CHAAR,
2002).
2.3.5.3 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de
13
C e
1
H
A ressonância magnética nuclear é muito usada na elucidação estrutural de
compostos orgânicos. Geralmente á aplicada para substâncias puras, mas os óleos
voláteis podem também ser analisados diretamente, após diluição em clorofórmio
deuterado. (SIMÕES, 2003).
A técnica de RMC
13
C é eficiente quando da análise de substâncias puras ou
quando o extrato bruto apresenta um constituinte majoritário em alta concentração, e
preferencialmente quando já se dispõe de dados espectrais para fins de comparação
( FERREIRA et al., 2001 e BROCHINI et al., 1999).
Segundo Ferreira et al., (2001); Siddiqui (1996); Martins (2003); Martins
(1998) e Brochini et al., (1999) a RMN é a técnica espectroscópica mais indicada
para a identificação de terpenos, principalmente sesquiterpenos que constituem uma
classe de substâncias naturais com uma gama muito grande de possibilidades
estruturais.
49
2.4 DESCRIÇÃO BOTÂNICA E CARACTERÍSTICAS DA FAMÍLIA PIPERACEAE
Piperaceae, nome latino proveniente do grego peperi, que por sua vez se
origina do árabe babary – pimenta-do-reino. Uma das mais numerosas famílias das
dicotiledôneas, representada nas regiões tropicais e subtropicais de ambos os
hemisférios, ( REITZ, 1978 e PARMAR, 1998 ).
Segundo Rorig et al., (1991); Danelutte et al., (2003); Santos, (2001); Rates
et al., (1997); Moreira et al., (1998) “a família Piperaceae apresenta mundialmente
12-14 gêneros e cerca de 1400 a 1950 espécies, sendo 700 pertencentes ao gênero
Piper e 600 espécies ao gênero Peperomia, distribuídas em todas as regiões
tropicais”. No Brasil a família Piperaceae compreende 5 gêneros, sendo que Piper e
Peperomia predominam com 170 e 150 espécies, respectivamente. Santa Catarina
possui os 5 gêneros, Ottonia, Sarcorhachis, Pothomorphe, Piper e Peperomia, sendo
que são citadas na literatura 32 espécies do gênero Piper e 50 espécies, distribuídas
em 5 sub-gêneros, de Peperomia ( REITZ, 1978 ; GUIMARÃES, 1978; YUNCKER,
1972, 1973, 1974 ; ANTUNES, 2001).
Em geral, são plantas herbáceas ou arbustivas, com folhas inteiras, alternas,
inflorescência espiciforme, com flores hermafroditas e muito reduzidas.
Algumas espécies de Piper são usadas na medicina popular no tratamento
de várias doenças, enquanto que espécies do gênero Peperomia s
ão usadas
principalmente como plantas ornamentais.
As espécies do gênero Piper apresentam como característica, em quaisquer
órgãos destes vegetais, aroma forte, agradável e sabor picante. Oferecem grande
variedade de uso como condimentos, aromatizantes e medicinais (HEGNAUER,
50
1996). O gênero oferece à nossa culinária uma lista de especiarias, os mais
importantes são as pimentas branca e preta preparadas a partir de frutos de P.
nigrum (pulverizados) verdes e maduros, respectivamente.
O gênero Piper, numeroso em espécies se destaca tanto comercial quanto
economicamente uma vez que constitui-se em rica fonte de compostos
químicos com relevantes atividades biológicas. Um grande número de
espécies deste gênero já foi investigado do ponto de vista fitoquímico,
levando ao isolamento de compostos fisiologicamente ativos, pertencentes
às mais variadas classes (PARMAR, et al., 1997 p.577-673)..
Segundo Leal (2000), “a grande importância do gênero Piper está baseada
não somente na utilização de suas inúmeras espécies como plantas medicinais, mas
também como fonte de matéria-prima para a indústria farmacêutica, cosmético e de
perfumarias”.
Ensaios biológicos realizados com o extrato total, com o óleo essencial ou
com compostos isolados de espécies de Piper estão descritos na literatura
especializada como responsáveis por importantes atividades dentre as quais,
algumas serão citadas a seguir.
O uso medicinal de espécies de Piper inclui, tratamento de doenças
venéreas, desordens intestinais, males genito-urinárias, epilepsia e para prevenir
concepção. Da Amazônia, várias espécies já foram estudadas como P. belte, P.
nigrum, P. amapaense, P. duckei, P. bartilingianum etc. O chá feito por infusão das
folhas da P. arboreum é eficiente como carminativo (gases estomacais) e tem sido
usado contra reumatismo pelos índios amazonenses. A Piper callosum Ruiz et Pav é
conhecido popularmente como João Brandin, sendo usado como afrodisíaco e em
picadas de mosquito. “O óleo essencial da P. nigrum, em combinação com óleos
essenciais de outras espécies exibiu importante atividade antibacteriana contra
51
Corynabacterium diphterial, streptococcus pyogenes e Pseudomonas
solanaceareum” (LEAL, p.50, 2000). Extrato aquoso e etanólico da P. Guinense
apresentou efeito anticonvulsionante em ratos em doses que não causaram
significante depressão do SNC. Dihidrochalconas A, B, C, D e E isolados das partes
aéreas de Piper aduncum, conhecida como pimenta longa apresentaram atividade
antibacteriana e citotóxica contra células KB carcinomatosas”(LEAL, p.50, 2000).
Piper longum “inibiu fertilidade em ratas fêmeas quando administrada por via oral na
forma de extrato total. Já o extrato etanólico dos frutos demonstrou atividade
amebicida contra Entamoeba histolytica” (LEAL, p.50, 2000).
Em P. divaricatum constatou-se efeito inseticida. Efeitos biológicos
semelhantes foram encontrados em P. acutislegium e P. falconeri cujos extratos
mostraram atividade inseticida contra Musca domestica e Aedes aegypti.
Diversos trabalhos sobre a composição química de óleos essenciais do
gênero Piper vêm sendo publicados, aos quais estão associadas importantes
atividades biológicas (PRASAD et al., 1992; TIRILLINI et al.,1996 apud LEAL, 2000).
Conforme, Martins et. al., (2003), piperácias são espécies abundantes nos
trópicos e são componentes importantes da vegetação secundária. Devido a sua
importância econômica, medicinal e ecológica, um número expressivo de espécies
foi investigado fotoquimicamente, apresentando diversas classes de compostos
secundários como amidas, fenilpropanóides, cromonas, lignanas e neolignanas.
Muitos terpenos têm sido isolados em espécies de piperácia, como
componentes do óleo essencial das folhas, caules e flores, sendo que a análise dos
constituintes voláteis revela a presença de monoterpenos, sesquiterpenos e
arilpropanóides, tais como, apiol, dilapiol, miristicina , safrol, limoneno, citral,
geraniol, mirceno, canfeno, eugenol, cariofileno, E-nerolidol e outros com
52
interessantes propriedades biológicas (MARTINS et al.,2003; SANTOS et al., 1998 e
POSER et al.,1994 apud LEAL, 2000).
2.4.1 Piper amplum Kunth
Segundo Guimarães et al., (2001), amplum, um-amplo, vasto, grande, em
referência ao tamanho das folhas desta espécie, são plantas arbustivas de 2-3
metros de altura, (Figura 8).
Figura 8 – Foto de Piper amplum Kunth de ocorrência ao longo da “trilha das águas” no Parque
Municipal Natural São Francisco de Assis, Blumenau – Santa Catarina.
Têm ramos cilíndricos, estriados, nodosos, glabros, entrenós variando entre
4-9cm comprimento. As folhas apresentam-se com pecíolo de 3,0-3,5cm
comprimento com bainha caniculada. Lâmina paprácia, membrácia, ovado-elíptica,
elíptica aguda ou levemente acuminada no ápice, obtusa, arredondada, aguda ou as
vezes cordada, levemente assimétricas, glabras mais raramente providas de
tricomas esparsos na face dorsal, 16-25cm de comprimento, 7-15cm largura.
Nervura secundária obliqua impressa ou não na face ventral, dispostas em toda
extensão da lâmina. As nervuras das folhas são secundárias com 11-13cm de cada
lado, alternas, dispostas até a ápice e ascendentes em relação a principal. Presença
53
de nervuras pseudo-secundárias. Nervuras terciárias axiais e laterais. Anastomose
de nervuras de ordem inferior na proximidades do bordo. Rede de nervura densa,
bordo anastomosado. Epiderme com células poligonais, com 5-7 lados, paredes
retas; estômatos em roseta. Estípulas lanceoladas, agudas rígidas, 2-3mm de
comprimento. As espigas são eretas, levemente curvas, apiculadas, 6-9cm
comprimento, 2-3mm de espessura quando jovens, quando em fruto alcança até 1
cm de diâmetro, sustentadas por pendúculo que alcança 1,2cm comprimento, glabro.
Bractéolas oculado-pedicelado-cocrescidas, ciliadas nos ângulos. As drupas são
ablongas as vezes comprimidas lateralmente, glabras, com ápices arredondados ou
sub-arredondados, côncavo na região central, sésseis, com semente reticulada
levemente faveolada. Essa espécie encontra-se distribuída geograficamente desde o
nordeste até o sul do Brasil. Alguns nomes vulgares são atribuídos para espécie
como murta e jaborandi. Encontrada florescendo nos meses de janeiro, fevereiro,
abril, setembro, outubro, novembro e dezembro.
54
2.5 OBJETIVOS
2.5.1 Objetivo geral
• Investigar a presença de material volátil nas folhas e infrutescências de Piper
amplum Kunth, e de compostos lipofílicos nas infrutescências.
• Avaliar a propriedade inseticida do óleo essencial extraído.
2.5.2 Objetivos específicos
• Submeter folhas e infrutescências da Piper amplum Kunth à hidrodestilação em
aparelho Clevenger modificado;
• Caracterizar os constituintes químicos do óleo essencial obtido empregando
cromatografia gasosa, cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de
massa, índice de retenção e espectroscopia de infravermelho;
• Submeter as infrutescências de Piper amplum Kunth à extração contínua em
aparelho soxhlet;
• Caracterizar os constituintes lipofílicos majoritários das infrutescências
empregando técnicas cromatográficas, espectrométricas e espectroscópicas de
ressonância nuclear magnética de
1
H e
13
C;
• Avaliar a propriedade inseticida do óleo essencial da Piper amplum Kunth
55
3.0 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS
3.1.1 Reagentes
Produtos comerciais de pureza analítica foram empregados sem prévia
purificação, exceto éter dietílico e acetato de etila que foram submetidos à destilação
simples sob pressão normal.
Para as análises cromatográficas em camada delgada (CCD) foram
empregadas placas de vidro de 2,5cm por 7,5cm, e como fase estacionária, sílica gel
com fluorescência (GF-254-Merck). Os solventes empregados como fase móvel
foram acetato de etila e hexano. A revelação das cromatoplacas foi realizada em
câmera com radiação ultravioleta e posteriormente com iodo e solução alcoólica de
ácido sulfúrico a 20%, seguido de aquecimento a 110
o
C por 10 minutos.
Para o isolamento dos constituintes da infrutescência utilizou-se coluna
cromatográfica com 1,5cm de diâmetro e 20 cm de comprimento, empregando sílica
gel 60 (Merck ) com granulometria de 70 - 230 mesh (0,063 – 0,200mm) como
adsorvente.
3.1.2 Equipamentos
Balança analítica Metler modelo AB 204-S foi empregada na determinação
das massas de material vegetal e óleo essencial.
56
O óleo essencial foi obtido utilizando-se a hidrodestilação com extrator
clevenger. O extrato da infrutescência foi obtido utilizando-se extrator soxhlet e
misturas binárias de hexano e acetato de etila 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; e somente acetato
de etila, como solvente.
As análises por espectrometria no infravermelho foram conduzidas em
espectrômetro Shimadzu modelo Prestige – 21/FT8400S, empregando alíquotas de
óleo puro na forma de filme entre discos de brometo de potássio.
As análises de RNM C
13
e H
1
foram realizadas em aparelho Bruker AC – 200
MHz para H
1
e 50 MHz para C
13
, em clorofórmio deuterado (CDCl
3
) contendo
tetrametilsilano (TMS) como padrão interno, sendo os deslocamentos químicos
expressos em valores de ppm e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz).
As análises por cromatografia gasosa e espectrometria de massas foram
realizadas em cromatógrafo gasoso Varian CP – 3800 acoplado a espectrômetro de
massa Saturn 2000, coluna capilar CP-Sil 8CB (30m x 0,25mm – filme de 0,25 wm),
sendo as condições de análise descritas no item métodos.
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Origem e coleta do material vegetal
As coletas das folhas e infrutescências foram realizadas no ano de 2003 e
2004, no período da manhã e ao longo da “trilha das águas” no Parque Natural
Municipal São Francisco de Assis, Blumenau – Santa Catarina. Três exemplares
devidamente classificados forneceram o material vegetal estudado, tendo-se
realizado 6 (seis) coletas: maio, agosto e novembro de 2003, e janeiro, maio e
57
novembro de 2004. Com exceção da coleta no mês de agosto de 2003, os
exemplares estudados apresentaram infrutescência.
3.2.2 Preparo das exsicatas e classificação
Exsicatas foram preparadas com material vegetal proveniente dos 3 (três)
exemplares estudados.
O reconhecimento da espécie foi conduzido pelo botânico Olavo Araújo
Guimarães da Universidade Federal do Paraná (UFPR), tendo-se depositado um
exemplar no Herbário Barbosa Rodrigues da Universidade Regional de Blumenau -
FURB sob número 3907.
3.2.3 Hidrodestilação do óleo essencial
As folhas frescas e infrutescências seccionadas foram submetidas a
hidrodestilação por 4 horas em aparelho Clevenger conforme metodologias descritas
em várias literaturas dentre elas, Aburjai (2005); Mundina et al., (1997); Gotlieb e
Magalhães (1960) apud in Calderari (2002), entre outras, (Figura 9).
O óleo e o hidrolato foram recolhidos em balão de decantação ao qual foi
adicionado éter etílico bidestilado. À fase etérea contendo o óleo essencial foi
adicionado sulfato de sódio anidro, posteriormente fez-se uma filtração e remoção do
solvente em evaporador rotatório, determinando-se o rendimento do óleo extraído.
58
Figura 9 – Extrator Clevenger Modificado
Fonte: CALDERARI, M. T. Estudo dos óleos essenciais de Piperaceae do Vale do Itajaí em Santa
Catarina. Florianópolis – Santa Catarina, 2002. Dissertação (Mestrado em Química). Universidade
Federal de Santa Catarina.
3.2.4 Extração contínua em aparelho Soxhlet
Infrutescências frescas e secas (60
o
C em estufa microbiológica) foram
submetidas à extração contínua em aparelho soxhlet empregando misturas binárias
de acetato de etila:n-hexano nas seguintes proporções: 1:1, 2:1 e 3:1 e acetato de
etila puro.
3.2.5 Isolamento dos constituintes da infrutescência.
Os extratos da infrutescência foram caracterizados por cromatografia em
camada delgada e espectrometria de massas.
Os constituintes majoritários foram isolados por cromatografia em coluna
empregando o seguinte gradiente de eluição - mistura hexano:acetato de etila (1:1,
1:2, 1:3, 1:4) e finalmente acetato de etila puro. Foram recolhidas 19 frações, sendo
o acompanhamento do fracionamento realizado por cromatografia em camada
59
delgada (CCD). As frações que apresentaram igual Rf foram combinadas e
concentradas em evaporador rotatório.
O óleo essencial (das folhas e infrutescência ) e o extrato (infrutescência ) da
Piper amplum Kunth antes de serem analisados foram transferidos para ampolas
escuras para evitar decomposição sob ação da luz, fechadas sob atmosfera inerte
com gás argônio e mantidas em ambiente refrigerado.
3.2.6 Análise por CG-EM
A análise por cromatografia gasosa foi conduzida sob as seguintes
condições de análise: hélio foi usado como gás de arraste com vazão de 1mL/min,
estando o injetor à 250
o
C e o detector à 280
o
C. A injeção da amostra de 0,2 µL foi
conduzida no modo split / 1:50, empregando-se a seguinte rampa de aquecimento:
temperatura inicial 50
o
C/2min, seguido de aquecimento à uma taxa de 5
o
C/min até
200
o
C, permanecendo nesta temperatura por 8min.
O sistema CG-EM apresenta um programa interpretativo automático (
biblioteca Nist ) onde identificações foram conduzidas por comparação dos
espectros de massa obtidos com aquelas existentes na biblioteca de massas.
Análise visual comparativa foi realizada complementarmente, neste caso, o texto de
ADAMS 1995, foi exaustivamente consultado.
3.2.7 índice de retenção
Para o cálculo dos índices de retenção foi empregado como padrão uma
série homóloga de hidrocarbonetos lineares alifáticos – C
10 à
C
19
. O tempo de
60
retenção para o hidrocarboneto C
9
, ausente na mistura de padrões, foi calculado por
extrapolação com o auxílio do programa Microsoft Excel empregando a equação da
reta gerada pelo plote do número de carbonos dos hidrocarbonetos C10-C15 versus
seus respectivos tempos de retenção (Gráfico 2).
Gráfico 2 – Valor de R
2
( coeficiente de linearidade) para cálculo de índice de retenção para o
hidrocarboneto padrão teórico C
9
Fonte: dados da pesquisa
O índice de retenção (IR) foi calculado de acordo com a fórmula
abaixo:
lx (t’) =100z + 100 {t’
Rx
– t’
Rz
/ t’
R(z + 1)
– t’
Rz
}
Onde:
Z = número n de carbonos;
t’
Rx
= tempo de retenção ajustado;
t’
Rz
= tempo de retenção ajustado do hidrocarboneto padrão com n carbonos;
t’
R(z + 1)
= tempo de retenção ajustado do hidrocarboneto padrão com n + 1 carbonos.
Ainda:
61
t
R
= t
M
+ t’
R
Onde:
t
R
= tempo de retenção total (tempo experimental obtido durante a análise);
t
M
= tempo morto da coluna (medido nas condições de análise empregando
propano).
O tempo morto obtido nas condições de análise foi de 1,493 min.
3.2.8 Atividade larvicida e repelente
3.2.8.1 Mosquitos ( Cx. quinquefasciatus Say, 1823 )
A espécie sinantrópica de mosquitos Culex quinquefasciatus Say, 1823 é de
grande importância em Saúde Pública por estar relacionada à transmissão da
filariose baccroftiana nas Américas. A endemicidade da filariose constitui desafios
administrativo e público no controle de mosquitos, devido a resistência em
populações desta espécie a inseticidas organofosforados e piretróides (CAMPOS,
2003; CALHEIRO, et al., 1998; RIBEIRO et al., 2004; BRACO, 1997; GONZÀLES,
1999; REYES-LUGO, 2000; CHENG et al., 2003).
Para a realização dos testes inseticidas e de repelência utilizou-se o Culex
quinquefasciatus Say, 1823. Este inseto foi criado no insetário do Laboratório de
Transmissores de Hematozoários do Departamento de Microbiologia e Parasitologia
do Centro de Ciências Biológicas da UFSC.
62
3.2.8.2 Criação em laboratório
As formas imaturas foram mantidas em recipientes plásticos (bandejas),
contendo 1 litro de água declorada (foto 1, figura 10 ). Manteve-se cerca de 50 a 100
larvas por recipiente. Três vezes por semana toda a água era substituída e
diariamente era acrescentado ração para peixes, marca Tetramin®, como alimento
para as larvas. As pupas eram coletadas com o auxílio de uma pipeta e transferidas
para a gaiola dos adultos para emergência. Estas gaiolas apresentam um formato de
cubo com 60x60x60cm em madeira revestida com tela nas três faces laterais e vidro
na parte frontal ( foto 2, figura 10). Dentro desta gaiola era mantido um frasco
plástico com água para a desova ( foto 3, figura 10 ) e um recipiente contendo
algodão e gaze enrolados na forma de tubo umedecido com uma solução de glicose
a 10% para a alimentação dos adultos.
Foto 1 Foto 2 Foto 3
Figura 10 – Criação do culex quinquefasciatus Say, 1823 no insetário do Laboratório de
Transmissores de Hematozoários do Departamento de Microbiologia e Parasitologia do Centro de
Ciências Biológicas da UFSC.
Uma vez por semana, durante a noite, a alimentação açucarada era
substituída por um camundongo albino anestesiado e imobilizado para o repasto
sanguíneo das fêmeas. Após 4 dias, as desovas eram transferidas para os
recipientes plásticos destinados para a criação das larvas onde ocorria a eclosão. A
63
temperatura do insetário era mantida à 27±2°C com umidade relativa do ar de
75±5%. A Figura 11 mostra os quatro estágios de desenvolvimento do inseto.
Figura 11 – Estágios de desenvolvimento do Culex quinquefasciatus Say, 1823.
3.2.8.3 Metodologia experimental do teste larvicida
Foram testadas as concentrações de 100mg/L, 10mg/L, e 1mg/L do óleo
essencial em meio aquoso. 150mL de solução a ser testada foi colocada em copo
plástico com capacidade para 250mL, ao qual adicionou-se 30 larvas de 4° estágio
jovens de Cx. quinquefasciatus. Após 48 horas foram quantificados os números de
larvas mortas, tomando como critério de morte, aquelas que se localizavam no fundo
do recipiente, inertes e inábeis para subir à superfície. Todos os testes foram
realizados em triplicata com controle negativo.
No teste inseticida realiza-se a correção do número de larvas segundo
Abbott (1925), o qual se faz necessário quando o número de larvas mortas nos
copos controle ultrapassar 5% do total.
Correção de Abbott – (% de larvas mortas – % de larvas mortas no controle) x 100
100 – % de larvas mortas no controle
Quando a concentração nos copos controle ultrapassava 10% de
mortalidade o experimento era desprezado.
64
A mortalidade média de cada concentração dos diferentes extratos é
comparada utilizando-se o teste de Duncan considerando significativas as diferenças
significativas quando p<0,05.
Como controle positivo utilizou-se o inseticida comercial K-otrini®. Isto serve
para verificar se a colônia de mosquitos apresentava resistência.
3.2.8.4 Metodologia experimental do teste de repelência.
O teste de repelência foi realizado colocando-se copos plásticos contendo a
150mL de solução com as mesmas concentrações utilizadas nos testes inseticidas
(100mg/L, 10mg/L, e 1mg/L) dentro das gaiolas dos mosquitos adultos. Os copos
eram colocados em cada canto da gaiola juntamente com um copo controle, em 3
réplicas. Esses copos eram colocados no 4° dia após o repasto sangüíneo das
fêmeas, quando se dá a oviposição.
Após 24 e 48 horas foram observadas as oviposições existentes em cada
copo, sendo contabilizados em lupa binocular.
Nos testes de repelência os ovos são contabilizados, calcula-se a média das
oviposições nos copos a cada dia de observação. As médias são comparadas pela
Análise de Variância (ANOVA), sendo as diferenças consideradas significativas
quando p<0,05.
65
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS FRESCAS
4.1.1 Rendimento
O material vegetal proveniente das diversas coletas forneceu óleo essencial
em rendimento de 0,06 a 0,12%, sendo que a coleta conduzida no mês de novembro
forneceu o maior rendimento.
Embora as folhas tenham sido coletadas de 3 espécimes, os rendimentos
foram calculados com base no material vegetal total de cada coleta. Desta forma, as
variações de rendimento estão associadas principalmente a aspectos sazonais e
domínio das técnicas de extração e isolamento do óleo essencial.
4.1.2 Análise por cromatografia gasosa
Das amostras analisadas, três perfis cromatográficos foram identificados,
estando representados pelas coletas realizadas em maio de 2003, figura 12,
novembro de 2004, figura 13 e janeiro de 2004, figura 14.
Os cromatogramas revelam diferenças consideráveis na região dos
constituintes mais voláteis e identificados, por análises complementares descritas
mais adiante, como sendo monoterpenos. Por sua vez, a fração menos volátil
apresentou grande similaridade, com pequenas variações quantitativas.
66
Figura 12 – Perfil Cromatográfico do óleo volátil das folhas frescas da Piper amplum Kunth coleta
realizada em 15.05.2003.
Figura 13 – Perfil cromatográfico do óleo volátil das folhas frescas da Piper amplum Kunth - coleta
realizada em 09.11. 2004.
Figura 14 – Perfil cromatográfico do óleo volátil das folhas frescas da Piper amplum Kunth - coleta
realizada em 26.01.2004.
67
A maior concentração de constituintes voláteis nas folhas de Piper amplum
Kunth nos meses de novembro e janeiro de 2004, figuras 13 e 14, pode estar
relacionada à atração de polinizadores, proteção contra o ataque de predadores, ou
ainda como mecanismo de proteção contra a perda de água associada à
temperatura ambiente mais elevada no verão (SIMÕES, 2003). Embora,
temperaturas elevadas possam conduzir à perda física de óleo, os exemplares
estudados encontram-se no interior da mata, protegidos da incidência direta de
raios solares. Fatores como a pluviosidade total, umidade do ar e os seus efeitos
associados à capacidade de retenção de água pelo solo podem estar relacionados à
baixa concentração de constituintes mais voláteis no mês de maio, figura 11, pois a
queda continuada de chuva pode conduzir, por “lavagem”, a perda de substâncias
solúveis em água das partes aéreas, e das raízes. Fato já verificado em algumas
plantas produtoras de alcalóides, de glicosídeos e mesmo de óleos voláteis, que
apresentam baixo percentual de produção de metabólitos secundários nas estações
úmidas (ARAÚJO, 2005).
4.1.3 Caracterização química por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria
de massas e índice de retenção
Os espectros de massas associados aos índices de retenção (IR), nos
permitiram a caracterização de aproximadamente 90% dos constituintes do óleo
essencial obtido das folhas frescas. Na tabela 3 estão relacionados os constituintes
identificados, com suas respectivas concentrações, índices de retenção da literatura
e calculados, e a indicação da classe a que pertencem: HMTP (Hidrocarboneto
MonoTerPênico); HMTPO (Hidrocarboneto MonoTerPênico Oxigenado); HSTP
(Hidrocarboneto SesquiTerPênico) e HSTPO (Hidrocarboneto SesquiTerPênico
68
Oxigenado).
Embora a espectrometria de massas seja uma ferramenta poderosa para a
elucidação estrutural de compostos orgânicos, a existência de isômeros
constitucionais e geométricos, com padrão de fragmentação semelhante, requer a
utilização de métodos analíticos complementares. Em se tratando de óleos
essenciais, comumente faz-se uso do índice de retenção (IR), que possui valores
bastante distintos para estruturas isoméricas com grande similaridade estrutural.
A análise qualitativa e quantitativa do óleo volátil de Piper amplum Kunth
permitiu a identificação de 19 constituintes (Tabela 3) , todos pertencentes à classe
Tabela 3 – Constituição química do óleo essencial das folhas frescas da Piper
amplum Kunth – coleta realizada em novembro de 2004, no Parque Natural
Municipal São Francisco de Assis em Blumenau.
Constituinte – Classe % IR calculado IR Lit
α-Pineno – HMTP
12,9 937 939
α-Felandreno – HMTP
1,9 1004 1005
Silvestreno – HMTP 0,7 1029 1027
Limoneno – HMTP 3,8 1030 1031
Eucaliptol – HMTPO 2,0 1037 1033
δ-Elemeno – HSTP
0,7 1341 1339
α-Copaeno – HSTP
4,2 1381 1376
β-Elemeno – HSTP
0,6 1396 1391
E-Cariofileno – HSTP
24,4 1429 1418
α-Guaieno – HSTP
2,9 1444 1439
α-Cariofileno – HSTP
2,6 1462 1467
Valenceno – HSTP 16,4 1492 1491
E-β-Guaieno – HSTP
1,0 1505 1505
( E, E )-α-Farneseno – HSTP
1,2 1508 1508
γ-Cadineno – HSTP
3,2 1514 1513
δ-Cadineno – HSTP
0,4 1523 1524
α-Cadineno – HSTP
1,9 1530 1530
E-Nerolidol – HSTPO
0,7 1567 1567
α-Cadinol – HSTPO
8,5 1669 1658
Total identificado 90
Fonte: Dados da Pesquisa
dos terpenos, ficando assim distribuídos com base na coletada de novembro:
69
HMTP – 19,4%; HMTPO – 2,0%; HSTP – 59,5% e HSTPO – 9,3%. Os constituintes
majoritários foram α-pineno (12,9%); limoneno (3,8%); α-copaeno (4,2%); E-
cariofileno (24,4%); valenceno (16,3%) e α-cadinol (8,5%).
Na figura 15 estão representadas as estruturas moleculares dos compostos
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
O
OH
OH
A
A A
A
A
A
A
A
A
OH
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
OH
O
1
34
35
8
36
A
A
A
A
O
OH
OH
OH
O
OH
O
O
O
A
A A
A
A
A
OH
A
A
OH
H
H
H
O
OH
OH
A
A
A
A
O
OH
OH
OH
O
OH
O
O
O
37
38
39
A
A A
A
A
A
O
H
H
OH
OH
O
OH
O
O
O
+
O
+
O
O
O
+
OH
O
+
O
O
O O
O
OH
O
OH
O
OO
OOH
OH
H
H
O O
O O
O
O
O
O
OH
OH
OH
16
40
41
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
OH
OH
O
A
A
O
2+
O
2+
O
O
OH
O
+
OH
O
O
O
2+
O
O
OH
OH
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
O
O
42 43
44
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
OH
H
OH
H
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
OH
(
56
)
OH
OH OH
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
OH
H
OH
H
O
OH
OH
H
55
56
57
A
A
A
A
A
A
A
A
O
A
O
O
O
OH
O
H
A
A
C
-
A
A
A
A
A
A
A
OH
H
H
O
H
O
OH
OH
58
59
Figura 15 – Terpenos presentes no óleo essencial de Piper amplum Kunth, coleta realizada em
novembro de 2004, no Parque Natural Municipal São Francisco de Assis em Blumenau.
70
caracterizados: α-pineno (41); α-felandreno (42); silvestreno (43); limoneno (44);
eucaliptol (45); δ-elemeno (46); α-copaeno (47); β-elemeno (48); E-cariofileno (49);
α-guaieno (50); α-cariofileno (51); valenceno (52); E-β-guaieno (53); (E-E)-α-
farneseno (54); γ-cadineno (55); δ-cadineno (56); α-cadineno (57); E-nerolidol (58);
α-cadinol (59)
Para fins de ilustração e por ser o sesquiterpeno E-cariofileno constituinte
majoritário, com um índice de retenção calculado atipicamente distinto do valor
teórico, apresenta-se na figura 16 os espectros de massa do composto majoritário
proveniente do óleo essencial e do E-cariofileno da biblioteca NIST de espectros,
que permitiu a sua identificação.
(1)
(2)
Figura 16 –Espectro de massa (1) para E-cariofileno identificado como constituinte majoritário
presente no óleo essencial de Piper amplum Kunth; (2) Espectro de massas do E-cariofileno da
biblioteca de massas Nist.
O espectro de massa do E-cariofileno apresenta as fragmentações da
cadeia lateral a partir do íon molecular 204, fornecendo os íons de m/z 133, 105, 91
e 39, cuja rota de fragmentação proposta está representada na figura 17.
71
C
15
H
24
- C
5
H
11
C
10
H
13
- C
2
H
4
C
8
H
9
m/z = 204
m/z = 133
m/z = 105
- CH
2
C
7
H
7
m/z = 91
- C
4
H
4
C
3
H
3
m/z = 39
+
+
+
+
+
.
.
.
.
.
Figura 17 –Rota de fragmentação do E-cariofileno associada ao espectro de massas.
O pico base e íon molecular de baixa intensidade são coerentes com a
estrutura proposta e de acordo com a literatura (ADAMS, 1995 ). Os demais picos
observados correspondem principalmente aos fragmentos formados pela perda de
CH
3
(metila) e CH
2
(metileno).
Em recente artigo, publicado por Santos e colaboradores (2001), que ao
estudarem o óleo essencial de 10 piperáceae, dentre elas, a espécie P. amplum
Kunth procedente do Rio de Janeiro - RJ, identificaram para esta espécie, 17
constituintes terpênicos, monoterpenos e sesquiterpenos, sendo majoritário o alfa-
pineno 16,8%, E-cariofileno 9,8%, Germacreno D 5,3%, E-nerolidol 8,3%.
Analisando a composição química do óleo essencial das espécies de ocorrência
em Santa Catarina e Rio de Janeiro (Gráfico 3), observa-se notada diferença
1,38
10,85
2,69
24,04
21,10
2,02
9,25
19,35
59,45
0
10
20
30
40
50
60
70
1
2
3
4
5
%
Hidrocarbonetos terpênicos
(SANTOS, 2001)
Dados da fonte de pesquisa
HMTP HMTPO HSTP HSTPO OUTROS
Gráfico 3 – Análise comparativa de hidrocarbonetos terpênicos da espécie Piper amplum Kunth com
estudos realizados por Santos 2001.
72
quantitativa na região dos hidrocarbonetos sesquiterpênicos de 59,5% para 24,0% e
relevante diferença na caracterização total do óleo essencial 90% para 60%,
respectivamente, o que dificulta a análise comparativa dos óleos obtidos.
4.1.4 Caracterização química por espectroscopia no infravermelho
A partir da análise complementar do óleo essencial de Piper amplum Kunth
pela espectroscopia de infravermelho, figura 18, confirma-se as principais
freqüências de absorção dos constituintes monoterpênicos e sesquiterpênicos do
óleo essencial. Na região de 3338cm
-1
observa-se uma banda intensa de absorção
do grupamento hidroxila, característico dos hidrocarbonetos sesquiterpênicos
hidroxilados E-nerolidol e α-cadinol. Em 3100 cm
-1
tem-se estiramento da ligação
=C-H olefínico, em 2900 cm
-1
absorção devido as vibrações –C-H alifático cuja
intensidade alta é característica de esqueletos terpênicos, na região de 1700 cm
-1
observa-se ausência de C=O e em 1600 cm
-1
deformação axial C=C e de 1600 a
600 cm
-1
, tem-se bandas de deformação angular C-C e C-H alifático.
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0
50
100
%T
Figura 18 – Infravermelho do óleo essencial da Piper amplum Kunth
73
4.2 ÓLEO ESSENCIAL DA INFRUTESCÊNCIA
4.2.1 Rendimento
As infrutescências desidratadas forneceram óleo essencial em rendimento
de 0,045%, valor este consideravelmente inferior ao obtido para as folhas frescas.
4.2.2 Perfil cromatográfico do óleo volátil da infrutescência
O perfil cromatográfico do óleo essencial da infrutescência ( Figura 19 )
apresenta destacada diferença quantitativa, quando correlacionado ao óleo
essencial das folhas ( Figura 20 ), entretanto, essa mesma correlação permite
afirmar que o óleo essencial da infrutescência está contido no óleo essencial das
folhas.
Essa diferença no quantitativa não deve surpreender, pois a composição
química dos óleos essenciais num mesmo espécime pode variar segundo a sua
localização na planta.
Figura 19 – Perfil cromatográfico do óleo essencial da infrutescência da P. amplum Kunth
(coleta 26.01.04)
74
Figura 20 – Correlação do Perfil cromatográfico do óleo essencial das folhas e infrutescência
da P. amplum Kunth (coleta 26.01.04)
-------infrutescência
-------folhas
4.3 ANÁLISE DE DADOS DOS TESTES DE REPELÊNCIA E INSETICIDA
No experimento para os teste larvicida no período de 24 horas não houve
diferença estatística significativa entre o tratamento com o óleo de Piper amplum
Kunth e o controle na mortalidade Cx. quinquefasciatus Say, 1823. Da mesma forma
o número de mortos após 48 horas também não diferiu entre o tratamento e controle.
No teste positivo com extratos aquosos do inseticida comercial K-otrini® a colônia de
insetos não apresentou resistência.
No teste repelência, após um período de 24 e 48 horas não se observou
diferença significativa na ovoposição dos insetos nos frascos com as soluções de
óleo essencial na concentração de 1; 10 e 100mg/L, em relação aos testes controle.
A partir dos testes de ANOVA e dentro da forma proposta de
experimentação pode-se concluir que a aplicação do extrato do óleo volátil de Piper
amplum Kunth não apresentou qualquer atividade, seja repelente ou inseticida.
Na literatura, hidrocarbonetos monoterpênicos como o
α
-pineno e limoneno,
e sesquiterpenos como o E-nerolidol, apresentam atividade inseticida, seja na forma
75
pura, ou constituindo misturas. O E-nerolidol isolado de Miroxylom balsamum
apresentou-se como potente inativador de larvas da espécie Aedes aegypti,
especialmente quando misturado a outros terpenos, que poderiam estar atuando
como sinergistas na absorção transmembrânica do E-nerolidol ( SIMAS, 2004 ).
A inatividade do óleo essencial de Piper amplum foi de certa forma
inesperado, por apresentar os monoterpenos
α
-pineno e limoneno. Entendemos que
seja recomendável a investigação das propriedades inseticida e repelente deste óleo
essencial com outras espécies, tais como, Aedes aegypti.
4.4 EXTRATO DA INFRUTESCÊNCIA
4.4.1 Rendimento
Na obtenção do extrato da infrutescência empregando Soxhlet, a mistura de
acetato de etila:hexano - 1:1 mostrou ser a mais seletiva.
O rendimento do extrato bruto utilizando frutos secos foi de 1,15%, inferior ao
obtido na extração empregando infrutescência fresca (2,0-2,2%). Entretanto, a
análise cromatográfica em camada delgada dos extratos indicou semelhança
química qualitativa.
Ao analisar os resultados obtidos em novembro de 2003 e 2004 verificou-se
grande diferença no rendimento dos extratos comparado aos outros períodos de
coleta pelo fato dos frutos encontrarem-se maduros nessa época do ano, porém a
análise cromatográfica em camada delgada (CCD), utilizando como agentes
reveladores ácido sulfúrico, iodo e radiação ultravioleta, indicou tratar-se de
amostras com o mesmo perfil cromatográfico daquelas obtidas nos demais períodos.
76
A análise dos extratos brutos através de CCD mostrou que os principais
constituintes absorvem intensamente radiação ultravioleta, indicando tratar-se de um
sistema insaturado altamente conjugado e/ou aromático. A análise por
cromatografia gasosa espectrometria de massas indicou tratar-se de uma mistura de
monoterpenos, sesquiterpenos e de compostos aromáticos ( figura 21 ).
Figura 21: Perfil cromatográfico do extrato bruto da infrutescência.
4.4.2 Isolamento dos constituintes
A cromatografia em coluna em fase normal empregando o eluente binário n-
hexano: acetato de etila em diferentes proporções e finalmente acetato de etila puro,
conduziu ao isolamento de dois compostos não cristalinos, ambos absorvendo na
região do ultra-violeta.
Posteriormente, sucessivas cromatografias em coluna para a obtenção de
amostra adequadamente pura para estudos espectroscópicos conduziu a um único
composto cristalizável sob refrigeração.
77
4.4.3 Análise preliminar do principal constituinte do extrato da infrutescência
O constituinte majoritário isolado da infrutescência foi submetido à análise
unidimensional de RMN
1
H e
13
C convencional e DEPT.
O espectro de ressonância de hidrogênio (ANEXO 1) indica a presença de
hidrogênios alifáticos (0,91 – 2,32 ppm), dois singletos olefínicos (5,77ppm e 5,69
ppm) e mais um multipleto (5,4 ppm), dois singletos de hidrogênios aldeídicos (10,14
ppm), hidrogênio ionizável em 6,35 ppm e dois grupamentos hidroxi-quelado (13,18
ppm e 13,37 ppm). A presença de apenas duas hidroxilas (aromáticas ou olefínicas)
está em concordância com o espectro de hidrogênios que apresenta poucos sinais
para esse núcleo. Estes foram confirmados pela adição de água deuterada
(ANEXO 2). O deslocamento químico dos hidrogênios em campo baixo parece
indicar a presença de hidroxilas fenólicas. Os espectros de
13
C (ANEXOS 3 E 4)
confirma a presença do elevado número de carbonos alifáticos (5 – 4 ppm),
aproximadamente 23 carbonos, o espectro DEPT (ANEXOS 5 e 6) mostra ausência
de carbono quaternário nesta região e presença de quatro grupamento metilênicos.
Os espectros de
13
C (NEXOS 3 E 4), mostram presença de seis carbonos
aromáticos (101,0 – 111,0 ppm), carbonos olefínicos em 144,9 – 167,9 ppm e dois
grupos aldeídicos em 191,7 e 192,6 ppm, que sugere ser uma mistura de dois
isômeros de origem sesquiterpênica com grupo aromático altamente substituído, e a
função aldeído, que pelo deslocamento químico em campo alto deve ser aromático,
nesse caso a cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas seria
fundamental para caracterização destes compostos. Os espectros DEPT (ANEXOS
5 e 6) confirmam a presença de carbonilas de aldeído (191, 7 ppm e 192, 6 ppm) e
de vários carbonos quaternários, neste caso, indicando sistema aromático altamente
78
substituído, sem exclusão de grupamentos olefínicos tetrasubstituídos, em
concordância ao espectro de prótons. Análises complementares como UV em
metanol ou clorofórmio com adição de reagentes de deslocamento; IV para
caracterização dos grupos funcionais; ponto de fusão e rotação ótica e CG-EM
deverão se realizas para a elucidação estrutural deste composto.
79
5 CONCLUSÃO
Os estudos realizados com a espécie Piper amplum Kunth permitiram as
seguintes conclusões:
1. O maior rendimento de óleo volátil encontra-se nas folhas da Piper amplumKunth,
em especial quando coletadas em épocas mais quentes do ano, provavelmente por
uma questão de defesa contra predadores, atração de polinizadores ou implesmente
como proteção da espécie para evitar a perda excessiva de água;
2. A análise química qualitativa e quantitativa do óleo essencial das folhas permitiu
a elucidação estrutural de 19 (dezenove) substâncias, aproximadamente 90% dos
seus constituintes, sendo majoritariamente hidrocarbonetos mono e esquiterpênicos;
3. Não foi observado influência significativa da época de coleta sobre a composição
química do óleo essencial produzido pela espécie Piper amplum Kunth na região dos
sesquiterpenos, entretanto, foi observada variação significativa na concentração dos
constituintes monoterpênicos, que apresentaram baixíssima concentração no
inverno;
4. O óleo essencial obtido das infrutescências por hidrodestilação apresentou
rendimento reduzido (<0,10%) e um perfil químico quali e quantitativo diferente do
óleo essencial das folhas;
5. A forma de secagem da infrutescência para a extração do óleo essencial não
produziu alteração qualitativa do extrato verificado por CCD. Não houve aumento
significativo no rendimento do extrato da infrutescência seca em relação a fresca não
sendo necessário o processo de secagem para a extração dos componentes dos
frutos da Piper amplum Kunth;
80
6. O óleo essencial da espécie em estudo não apresentou atividade repelente e
inseticida conforme os testes realizados;
7. O constituinte principal da infrutescência obtido por extração contínua – Soxhlet e
purificado por cromatografia em coluna, foi parcialmente caracterizado pela técnica
de RMN
13
C e
1
H, apresentando longa cadeia alifática, confirmando o seu caráter
lipofílico. A propriedade de absorver na região do ultra-violeta parece estar
relacionada a presença na sua estrutura de um sistema fenólico.
8. Este estudo abre perspectivas para que novas investigações envolvendo Piper
amplum Kunth sejam realizados, notadamente em relação a definitiva elucidação
estrutural dos constituintes principais do extrato proveniente da infrutescência e no
estabelecimento das suas propriedades citotóxicas, ensaio este extensivo ao óleo
essencial proveniente das folhas. Deve-se considerar ainda a ampliação dos
estudos fitoquímicos para os constituintes não voláteis das folhas.
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86
ANEXO 1
RMN
1
H EM CDCl
3
ANEXO 2
RMN
1
H EM CDCl
3
+ D2O
87
ANEXO 3
RMN
13
C
EM CDCl
3
ANEXO 4
RMN
13
C
EM CDCl
3
88
ANEXO 5
RMN
13
C
EM CDCl
3
- DEPT
ANEXO 6
RMN
13
C
EM CDCl
3
- DEPT
