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Vanessa Ramos Kirsten
CARACTERIZAÇÃO DO MODELO EXPERIMENTAL
NOD (NONOBESE DIABETIC) EM AMBIENTE CONVENCIONAL
Porto Alegre
2006
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Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
1
VANESSA RAMOS KIRSTEN
Caracterização do modelo experimental
NOD (nonobese diabetic) em ambiente convencional
Dissertação de Mestrado apresentada à
Faculdade de Medicina da PUCRS para a
obtenção do título de Mestre em Medicina e
Ciências da Saúde, área de concentração
Nefrologia.
Orientador: Prof. Dr. David Saitovitch
Porto Alegre
2006
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Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
2
Ficha Catalográfica
K61c Kirsten, Vanessa Ramos
Caracterização do modelo experimental NOD (nonobese diabetic) em ambiente
convencional / Vanessa Ramos Kisrten; orient. David Saitovich. Porto Alegre:
PUCRS, 2005.
97 f.: il. graf. tab.
Dissertação (Mestrado) – Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.
Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da
Saúde. Área de concentração: Nefrologia.
1.
D
IABETES MELLITUS EXPERIMENTAL
. 2.
INCIDÊNCIA
DE
D
IABETES
.
3.
C
AMONDONGOS
NOD. 4. Modelos animais. I. Saitovich, David. II. Título.
C.D.D. 616.462
C.D.U. 616.379-008.64:599.323.4(043.3)
N.L.M. WK 810
Rosária Maria Lúcia Prenna Geremia/Bibliotecária
CRB10/l96
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
3
VANESSA RAMOS KIRSTEN
Caracterização do modelo experimental NOD (nonobese diabetic)
em ambiente convencional
Dissertação de Mestrado apresentada à
Faculdade de Medicina da PUCRS para
a obtenção do título de Mestre em
Medicina e Ciências da Saúde, área de
concentração Nefrologia
Aprovada em 20 de Janeiro de 2006
Dra. Denise Cantareli Machado - PUCRS
__________________________________________________
Dr. Ivan Carlos Ferreira Antonello - PUCRS
__________________________________________________
Dra. Nance Nardi – UFRGS
___________________________________________________
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
4
Dedico este trabalho à minha família
Que trabalhou em dobro,
Sacrificou seus sonhos em favor dos meus,
Que não foram somente pais e irmão,
Mas meus melhores amigos...
A vocês toda a minha gratidão.
Ao meu amor Ricardo ...
Por ser incentivador de todas as minhas causas,
E me fazer sentir tão bem amada...
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
5
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao meu querido amigo, orientador e mestre David Saitovitch, por ter sido a
primeira pessoa a acreditar no meu potencial, ter me acolhido com toda a sua
generosidade, humildade e sabedoria. Serei eternamente grata pela ajuda, orientação,
amizade e pelos diversos ensinamentos. OBRIGADA POR TUDO.
A minha grande amiga, colega, mestra, Patrícia Sesterheim. Amiga e profissional
que me ensinou tudo sobre bioterismo e ciência dos animais de laboratório. Com
certeza, és a maior colaboradora deste trabalho. Obrigada por sempre estar ao meu
lado, dando forças, ensinando, lutando por mim. ESTE TRABALHO NÃO TERIA SIDO
REALIZADO SEM A TUA AJUDA!!!
A Família de Gravataí: João Ricardo Bittencourt, Aline Duran Bittencourt, Beatriz
Bittencourt, Maria Bittencourt, Elida Duran da Silveira, Acrimar Lopes da Silveira e Élen
Duran da Silveira. Vocês me acolheram como se fossem meus pais e irmãos de
verdade e me proporcionaram um lar repleto de carinho e ternura. Fizeram com que eu
pudesse me sentir em casa, e este sentimento não tem preço. Vocês fazem parte deste
momento tão importante da minha vida e serei eternamente grata por tudo. OBRIGADA
DE CORAÇÃO.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todas as pessoas e serviços que possibilitaram a realização deste
trabalho:
Agradeço ao Serviço de Nefrologia do Hospital São Lucas (HSL) da Pontifícia
Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS), por ser um local com
profissionais acolhedores e prestativos. Agradeço em especial aos médicos
nefrologistas e professores da Pós-Graduação: Carlos Eduardo Poli de Figueiredo,
Domingos D’Avila e Ivan Carlos Antonello pelo aprendizado, companheirismo, amizade
e apoio nestes dois anos de convivência.
Aos colegas do curso de Nefrologia: Dirceu, Florence, Iara, Karine, Sheila e
Salvador, pelos momentos de coleguismo, trocas, momentos de diversão e alegria. Em
especial ao colega Giovane Gadonski pela amizade e ajuda em todos os momentos.
Aos professores da pós-graduação, em especial ao Professor Mário Bernardes
Wagner pelo apoio bioestatístico e pelos conselhos profissionais.
A secretaria da Pós Graduação, em especial a Sônia e ao Maurício, pelos
serviços prestados sempre com muita agilidade, organização, coleguismo e bom humor.
Ao serviço da Biblioteca da Faculdade de Medicina do HSL da PUC, pelo serviço
prestativo.
A PUC e ao Hospital São Lucas, pela educação de qualidade e serviços de
excelência que ofertam aos seus alunos.
Ao CEDEME (Centro de desenvolvimento de modelos experimentais) da
UNIFESP pelo fornecimento dos camundongos NOD.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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7
A Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde (FEPPS), em especial
a Coordenação de Produção e Experimentação Animal (CPEA) pelo abrigo aos atores
principais deste trabalho.
“Aos bioteristas, que com seu senso ético, profissionalismo e habilidade
proporcionam conforto e bem-estar aos animais de laboratório, contribuindo
significativamente para o desenvolvimento da pesquisa, do ensino, da produção e do
controle de imunobiológicos e fármacos na área da ciência e tecnologia em saúde”.
(Antenor Andrade)
A Luísa Macedo Braga pelo carinho e ajuda, e a Marta Speck, por ter sido o anjo
da guarda dos camundongos NOD, uma das principais colaboradoras deste estudo.
Aos colegas da Especialização Gabriela, Graciela, Ceres e Rafael Soares, por
terem plantado a sementinha da pesquisa na minha vida.
A UNIFRA, por ter acreditado em mim, e ter disponibilizado minha iniciação na
carreira docente.
Aos colegas de trabalho, em especial Professora Marizete Mesquita de Oliveira e
Professor Thiago Durand Mussoi, por entenderem momentos de ausência e
colaborarem para o andamento final deste trabalho.
A CAPES, pelo apoio financeiro.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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8
“Descobri como é bom chegar
quando se tem paciência,
e para se chegar onde quer que seja,
aprendi que não é preciso dominar a força,
mas a razão.
É preciso, antes de mais nada, querer.
Um dia é preciso parar de sonhar,
Tirar os planos das gavetas e,
De algum modo, partir...”
(Almir Klink)
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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9
RESUMO
O diabetes mellitus tipo 1 é uma doença auto-imune mediada por células T. Os
camundongos NOD (nonobese diabetic) são o modelo experimental de doença auto-
imune órgão-específica mais utilizado em todo o mundo. Apresentam destruição das
células beta associada com insulite e produção de auto-anticorpos.
A incidência de
diabetes nestes camundongos é variável, dependendo do ambiente em que estão
alocados, assim como do sexo dos mesmos. Dados na literatura demonstram que em
biotério SPF (Specific Patogen Free), a incidência de diabetes em fêmeas varia de 60 a
100% e em machos de 20 a 60%. No entanto, não são descritos valores de incidência
de diabetes nestes camundongos em biotério convencional. Este trabalho tem o
objetivo de avaliar a incidência de diabetes mellitus insulino-dependente de
camundongos NOD em biotério convencional, além de verificar a sobrevida dos
animais. Três casais de camundongos NOD foram endocruzados para a obtenção dos
animais desta pesquisa. Setenta e nove machos e 58 fêmeas foram acompanhados
durante 32 semanas de vida em biotério convencional. Peso e glicemia foram
mensurados após o desmame, a cada 15 dias, e as mortes contabilizadas. Foram
considerados diabéticos, os animais que apresentavam glicemia acima de 250mg/dl.
Em 32 semanas de seguimento, 38% da amostra tornou-se diabética; as fêmeas (51%)
tornaram-se significativamente (P<0,001) mais diabéticas do que os machos (27%).
Além disso, verificou-se que o início do diabetes, em ambos os sexos, ocorreu por volta
da oitava semana de vida. A sobrevida dos camundongos NOD em biotério
convencional, em 32 semanas de vida, foi de 60%, as fêmeas tiveram sobrevida de
aproximadamente 40% e os machos de 85%, sendo esta diferença significativa
(P<0,02). Conclui-se que, em ambiente convencional, os camundongos NOD do sexo
feminino desenvolvem mais diabetes que os machos, similarmente aos camundongos
NOD criados em biotério SPF. As fêmeas possuem sobrevida menor que os machos,
provavelmente devido a presença do diabetes. Desta forma, verifica-se que, mesmo em
ambiente convencional, é possível que camundongos NOD, apresentem diabetes em
proporções que possibilitem sua utilização experimental.
Palavras-chave: camundongos NOD, diabetes espontâneo, incidência de diabetes,
ambiente convencional.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
10
ABSTRACT
Type 1 diabetes is an autoimmune disease mediated by T cells. Nonobese diabetic mice
(NOD) are the most important experimental model of organ specific autoimmune
disease. These animals develop beta cells damage associated to insulitis and
autoantibodies, and diabetes similar to the human type 1 diabetes. The incidence of
diabetes in NOD mice is not constant, depending on gender and environment. Recent
publications demonstrated that in germ free environment (SPF), the incidence of
diabetes in females ranges from 60 to 100%, and from 20 to 60% in males. However,
there are no data describing the incidence of diabetes employing this model in
conventional environment. The aim of this study was to verify the incidence of diabetes
in NOD mice placed in conventional environment, as well as to verify the survival of
these animals. Initially, three NOD couples were bred to produce offsprings for the
research. During 32 weeks, 79 males and 58 females were followed. Every 15 days,
weaning, non-fasting glucose blood levels and body weight were measured and the
number of deaths were registered. Diabetes was considered in those animals presenting
glucose blood levels above 250 mg/dl. After 32 weeks, 38% of these animals became
diabetic. The incidence was significantly higher in females (51%) when compared to
males (27%, P<0,05). Moreover, diabetes diagnosis was made around the 8
th
week in
both genders. The total NOD mice survival in eight months was 60%. Survival was
significantly higher in males (85%) than in females (60%, P<0,05). In conclusion, the
incidence of diabetes in females NOD mice in conventional environment is significantly
higher than in males, similarly to what is observed in germ free environment. Females
Survival is lower in females than males, probably related to higher incidence of diabetes.
Therefore, these data demonstrate that, even in conventional environment NOD mice
breed grow and develop diabetes in an acceptable rate, which allows its experimental
use.
Key words: NOD mice, spontaneous diabetes, diabetes incidence, survival,
conventional environment .
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
11
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................16
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS DO DIABETES MELLITUS TIPO 1............................16
1.1.1 Epidemiologia........................................................................................................17
1.1.2 Patogênese do diabetes mellitus tipo 1.................................................................19
1.1.3 Complicações........................................................................................................22
1.1.4 Tratamento e futuras perspectivas ........................................................................23
1.2 MODELOS EXPERIMENTAIS .................................................................................25
1.2.1 Modelos experimentais de diabetes ......................................................................28
1.2.2 Diabetes experimental induzido quimicamente .....................................................29
1.2.3 Diabetes experimental espontâneo .......................................................................30
1.3 CAMUNDONGOS NOD ...........................................................................................31
1.3.1 Background da linhagem NOD..............................................................................31
1.3.2 Processo inflamatório............................................................................................33
1.3.3 Características do diabetes no modelo experimental NOD...................................35
1.3.4 Suscetibilidade para o desenvolvimento do dm1 nos camundongos NOD ...........35
1.3.5 Divergência entre o sexo.......................................................................................41
1.4 HIPÓTESES DO TRABALHO ..................................................................................44
2 OBJETIVOS ................................................................................................................45
2.1 OBJETIVO GERAL ..................................................................................................45
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. ...................................................................................45
3 METODOLOGIA..........................................................................................................46
3.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO...............................................................................46
3.2 MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................46
3.2.1 Animais..................................................................................................................46
3.2.2 Produção e manutenção da linhagem NOD..........................................................46
3.2.3 Características ambientais do biotério convencional.............................................49
3.2.4 Aferição de peso e glicemia ..................................................................................51
3.2.5 Transplante cutâneo..............................................................................................53
3.3 CONSIDERAÇÕES METODOLÓGICAS .................................................................55
3.4 TREINAMENTO DAS TÉCNICAS............................................................................56
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..........................................................................................56
4 RESULTADOS............................................................................................................58
4.1 ACASALAMENTOS E NÚMERO DE FILHOTES.....................................................58
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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12
4.2 PESO DOS CAMUNDONGOS NOD........................................................................58
4.3 GLICEMIA DOS CAMUNDONGOS NOD.................................................................60
4.4 OCORRÊNCIA DE DIABETES NOS CAMUNDONGOS NOD.................................62
4.5 SOBREVIDA ............................................................................................................64
4.6 TRANSPLANTE CUTÂNEO.....................................................................................68
5 DISCUSSÃO ...............................................................................................................70
CONCLUSÃO.................................................................................................................82
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................................83
ANEXOS ........................................................................................................................92
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
13
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Aumento da incidência de diabetes tipo 1 em crianças com idade menor a 14
anos ..............................................................................................................................18
Figura 2. Modelo de patogênese e história natural dos diabetes tipo 1 .........................22
Figura 3. Camundongos NOD........................................................................................32
Figura 4. Incidência de DM1 em camundongos NOD em alguns laboratórios ...............42
Figura 4a: Laboratório Taconic.......................................................................................42
Figura 4b: Laboratório Jackson......................................................................................43
Figura 4c: Colônia Ba - St.Bartholomew's Hospital Medical College .............................43
Figura 5: Fichas de identificação....................................................................................48
Figura 6: Pesagem dos Camundongos NOD .................................................................52
Figura 7: Mensuração da glicemia .................................................................................53
Figura 8. Transplante Cutâneo.......................................................................................55
Figura 9: Camundongo que recebeu enxerto cutâneo sem rejeição..............................69
Figura 10: Gráfico que demonstra o ganho de peso de camundongos NOD do
Laboratório Taconic........................................................................................................76
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
14
Gráfico 01: Peso médio (g) dos camundongos NOD .....................................................58
Gráfico 02: Peso médio (g) dos camundongos NOD, de acordo com a presença ou não
de diabetes......................................................................................................................59
Gráfico 03: Peso médio (g) dos camundongos não diabéticos e diabéticos de acordo
com sexo........................................................................................................................60
Gráfico 04: Glicemia média (mg/dl) dos camundongos NOD..........................................61
Gráfico 05: Glicemia média (mg/dl) dos camundongos NOD de acordo com a presença
ou não de diabetes. ........................................................................................................61
Gráfico 06: Glicemia média (mg/dl) dos camundongos NOD não diabéticos e
diabéticos, de acordo com sexo. ..................................................................................62
Gráfico 07: Proporção de diabetes nos camundongos NOD em 32 semanas de
seguimento......................................................................................................................63
Gráfico 08: Proporção de diabetes, em 32 semanas de seguimento, em % de
Camundongos NOD em biotério convencional, de acordo com sexo e idade................64
Gráfico 09: Sobrevida de Camundongos NOD em biotério Convencional......................65
Gráfico 10: Sobrevida, em 32 semanas, dos camundongos NOD, de acordo com o
sexo.................................................................................................................................66
Gráfico 10a: Curvas de sobrevida de camundongos NOD não diabéticos, machos e
fêmeas.............................................................................................................................67
Gráfico 10b: Curvas de sobrevida de camundongos NOD diabéticos, machos e
fêmeas.............................................................................................................................68
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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15
LISTA DE ABREVIATURAS
ACF: Adjuvante Completo de Freund
ADA: American Diabetes Association
APC: Célula Apresentadora de Antígeno
BB: BioBreading
BCG: Bacillus Calmette Guérin
BSA: Albumina Sérica Bovina
CEDEME: Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais
COBEA: Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
CPEA : Coordenação de Produção e Experimentação Animal
DM: Diabetes Mellitus
DM1: Diabetes Mellitus tipo 1
DM2: Diabetes Mellitus tipo 2
DNA: Ácido desoxiribonucleico
FEPPS: Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde
GAD 65: Ácido Glutâmico Descarboxilase
HLA: Antígeno Leucocitário Humano
IAAs: Auto Anticorpo Contra Insulina
ICAS: Anticorpo Anti-ilhota
IFN- γ: Interferon Gama
IL: Interleucina
MHC: Complexo Principal de Histocompatibilidade
NAD+: Nicotina Adenina Dinucleotídeo
NK: Natural Killer
NOD: Non Obese Diabetic
SPF: Specific Patogen Free
STZ: Estreptozotocina
TNF-α: Fator de Necrose Tumoral alfa
1,25(OH)2D3: 1,25- dihidroxi vitamina D3
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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16
1 INTRODUÇÃO
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS DO DIABETES MELLITUS TIPO 1
O Diabetes Mellitus (DM) é um grupo de doenças metabólicas, resultante de
defeitos na secreção e/ou ação da insulina que levam à hiperglicemia (1).
Os sintomas decorrentes da hiperglicemia acentuada incluem inexplicada perda
de peso, poliúria, polidipsia, infecções, visão turva e complicações agudas que podem
levar ao risco de vida, como cetoacidose diabética e síndrome hiperosmolar
hiperglicêmica não cetótica (2,3).
As formas de diabetes mellitus são classificadas de acordo com a sua etiologia e
não mais como “insulino dependente” ou “não-insulino dependente” (2).
O diabetes tipo 1 (DM1) e o tipo 2 (DM2) são as formas mais prevalentes e
incidentes e se destacam pela diferença na forma de apresentação clínica. O tipo 1
caracteriza-se por resposta imunológica auto-imune, fatores genéticos predisponentes e
influência do meio ambiente na destruição das células-beta produtoras de insulina.
Ocorre mais freqüentemente em pessoas jovens e a instalação clínica é abrupta. O
diabetes tipo 2 age na resistência à ação da insulina e está associado à obesidade,
levando à perda progressiva das células beta pancreáticas. Manifesta-se
predominantemente após os 40 anos e na grande maioria dos casos não é necessária
à utilização de insulina exógena (4).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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17
1.1.1 Epidemiologia
A prevalência do diabetes vem crescendo de forma notável, e o advento da
industrialização e urbanização populacional ocorrido nos últimos anos acelera este
processo. As mudanças no estilo de vida reduziram a atividade física que, juntamente
com uma alimentação mais calórica, favoreceram a ocorrência de obesidade, stress e
hipertensão arterial (4).
O “Diabetes Health Economics Study Group” da Federação Internacional de
Diabetes, estima que em 2025, cerca de 300 milhões de pessoas apresentarão esta
doença (5). Embora o diabetes mellitus tipo 2 tenha a maior parte da atenção devido a
sua prevalência crescente nos últimos anos, o diabetes tipo 1 cresce paralelamente.
Este, sempre foi conhecido como uma doença de crianças e adolescentes, mas
estudos epidemiológicos recentes indicam que a sua incidência é comparável em
adultos (4).
Globalmente, entre 10 a 20 milhões de pessoas são afetadas na atualidade (6).
Nos Estados Unidos, há uma estimativa que 123.000 crianças e 1,4 milhões de adultos
tenham o diabetes tipo 1. Anualmente, no mínimo 60.000 crianças são diagnosticadas
em todo o mundo, incluindo 12.000 nos Estados Unidos (7) e de 18 a 20/100.000
crianças no Reino Unido (8).
O estudo EURODIAB, que envolveu 44 países da Europa, indicou um aumento
na incidência anual do diabetes tipo 1 em 3-4% conforme demonstrado na figura 1 (8),
e poderá ser 40% maior em 2010 em relação a 1997 (9).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
18
Figura 1. Aumento da incidência de diabetes tipo 1 em crianças com idade menor a 14
anos (8).
Esta incidência é rapidamente progressiva em regiões específicas e mostra
tendência em direção ao início precoce, podendo ter alta variabilidade sobre os
diferentes grupos étnicos populacionais. Dados sugerem um gradiente polar-equatorial
descrito pela incidência da doença. Por exemplo, Europa, Kuwait e Porto Rico são
regiões que possuem altas taxas de incidência. Na Finlândia, onde a incidência triplicou
desde 1953, ocorreram 45 casos por 100.000 habitantes no ano de 1996 (10); na
Escandinavia, 20% do total de pacientes diabéticos são do tipo 1 (11). Por outro lado,
em populações como no Peru (0.7/100.000 habitantes/ano), Japão e China (menos que
1% dos pacientes com diabetes possuem DM1) baixas taxas de diabetes tipo 1 são
observadas (10).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
19
Suscetibilidade genética e fatores ambientais, individualmente ou em conjunto,
podem colaborar para tais disparidades (8).
No Brasil, existem poucos estudos epidemiológicos sobre o diabetes tipo 1.
Ferreira e colaboradores, estudando três cidades do interior paulista, constataram
incidência de 7,6/100.000 habitantes naquela população (12), em Londrina no estado
do Paraná a taxa encontrada foi de 12,7/100.000 (13).
1.1.2 Patogênese do Diabetes Mellitus Tipo 1
A American Diabetes Association (ADA), recomenda o termo diabetes tipo 1
para o diabetes imuno-mediado, com destruição das ilhotas pancreáticas (8).
A história natural do diabetes tipo 1 inclui quatro estágios distintos: (I) pré-clínico:
auto-imunidade dirigida às células beta, com uma diminuição aguda e progressiva da
resposta insulínica à glicose intravenosa ou oral; (II) início do diabetes clínico; (III)
remissão transitória; (IV) diabetes associado com complicações agudas, crônicas e
morte (7).
O estágio pré-clínico é caracterizado pela presença de auto-anticorpos contra
constituintes da célula beta pancreática, que participam da sua autodestruição (14).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
20
A descoberta dos auto-anticorpos anti-ilhotas pancreáticas, reforçou o papel da
auto-imunidade na fisiopatologia do diabetes tipo 1 (14). Marcadores como o anticorpo
anti-ilhota (ICAs), anti-insulina (IAAs), ácido glutâmico descarboxilase (GAD-65) e
contra as tirosinas fosfatases IA-2 e 1A-2B, estão relacionados com o desenvolvimento
do DM1 (15). Geralmente, pelo menos um destes marcadores está presente em 85-
90% dos indivíduos com hiperglicemia de jejum, diagnosticado no início da doença (1).
Embora o processo patogênico destes auto-anticorpos não esteja bem caracterizado, a
sua dosagem possibilita rastrear indivíduos com risco elevado para o desenvolvimento
da doença. Por exemplo, pessoas com ICA possuem risco de até 42% para
desenvolver DM1, quando associados à presença de IAA, o risco eleva-se para 77%,
em prazo menor que dez anos (14).
O processo auto-imune é mediado por macrófagos, linfócitos B e T (7),
verificando-se diminuição progressiva da função secretória das células beta, que se
traduz, inicialmente, por perda da primeira fase de secreção de insulina e elevação
gradual dos níveis glicêmicos (14).
Além disso, a doença tem forte associação com o sistema HLA (Antígenos
Leucocitários Humanos), sendo um determinante genético para o diabetes tipo 1 (1).
Mais de 90% dos pacientes que desenvolvem DM tipo 1 possuem haplótipos
DR3, DQ2 ou DR4, DQ8. Desta forma, alelos ou variantes genéticas associadas com
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
21
diabetes tipo 1 podem suscetibilizar ou proteger a doença. Uma interação entre
suscetibilidade genética e ambiental é fundamental para o desenvolvimento da doença
(8). Estudos em irmãos gêmeos determinam riscos estimados envolvendo gêmeos
monozigotos entre 20 e 50% (16). No entanto, 90% dos indivíduos com DM1
diagnosticados não possuem parentes em primeiro grau que apresentem a doença e a
chance de gêmeos idênticos terem a doença, segundo Balda (17) é de apenas 33%.
Além disso, estudos em gêmeos têm revelado que 70 a 75% do risco para o
DM1 é relacionado aos efeitos genéticos e 25 a 30% aos fatores ambientais (10).
Dentro destes achados, as informações disponíveis sugerem que o DM1 é uma
doença multifatorial dependente da complexa interação entre fatores genéticos, imunes
e ambientais (figura 2).
Os determinantes ambientais, mais estudados, podem ser classificados em 3
grupos: infecções virais (citomegalovírus, rubéola, caxumba, sarampo), dieta precoce
na infância (amamentação versus introdução precoce de ingredientes do leite de vaca,
cereais e glúten) e toxinas (por exemplo, derivados de N-nitroso). Outros fatores não-
genéticos modificadores da doença incluem administração de vacinas, estresse
emocional, influências climáticas, sazonalidade, agentes sanitários e acesso ao cuidado
de saúde (7,8,9).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
22
Figura 2. Modelo de patogênese e história natural dos diabetes tipo 1 (8).
De acordo com Atkinson e Eisenbarth (9) os agentes ambientais agem como
modificadores da patogênese da doença, podendo servir como “gatilhos”.
1.1.3 Complicações
O controle da glicemia nas pessoas com diabetes é crítico por três razões: (I) A
insulina é necessária para a prevenção de cetoacidose fatal; (II) A falta do controle da
glicemia e a conseqüente hiperglicemia, associam-se a sintomas como polidipsia,
poliúria, fadiga, entre outros; (III) indivíduos com diabetes de longa data, possuem risco
aumentado para o desenvolvimento de complicações secundárias (18), como
retinopatia, nefropatia e vasculopatia, além de maior suscetibilidade a certas infecções
por fungos, bactérias e vírus (19).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
23
Uma adequada quantidade de insulina previne cetoacidose e minimiza os
sintomas (18) e é indiscutível, atualmente, que o bom controle glicêmico do DM
(hemoglobina glicada normal) diminui enormemente as chances de complicações
microvasculares, notadamente: nefropatia, retinopatia e neuropatia (20).
1.1.4 Tratamento e Futuras Perspectivas
O tratamento intensivo com insulina, efetivamente, adia o início da progressão de
doenças crônicas secundárias em pacientes com DM tipo 1. Os efeitos benéficos deste
tratamento, podem não ser garantidos à comunidade em geral, pelo alto custo
envolvido (21). Além disto, um controle glicêmico estrito associa-se na ocorrência mais
freqüente de hipoglicemias (22).
Novas alternativas de aplicação de insulina, como o uso de bombas de insulina
de ação rápida, por infusão contínua subcutânea, que permitem menor oscilação da
glicemia nas 24 horas do dia, ou insulinas de ação ultra prolongada, cujo efeito persiste
por 24 horas, permitindo assim uma única aplicação durante o dia, vêm sendo
desenvolvidas, e buscam oferecer maior liberdade e qualidade de vida ao paciente
diabético (23).
Alternativas terapêuticas que oferecem controle rigoroso do metabolismo da
glicose são o transplante de pâncreas e o transplante de ilhotas pancreáticas (21).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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24
O transplante de pâncreas apresentou importantes avanços nos últimos anos.
Entre 1994 e 1997 a sobrevida dos pacientes no primeiro ano pós-transplante era de
mais de 90%, e a sobrevida dos enxertos (definido como insulino-dependência) no
primeiro ano era de 82%, nos casos de transplante simultâneo de pâncreas/rim (24).
De acordo com dados americanos, 5% de todos os transplantes de pâncreas de
1990 até 2000 foram retransplantados (24). Este procedimento exige alta complexidade
técnica, o que pode levar a este número de retransplantes. Além dos efeitos colaterais
associados ao uso de drogas imunossupressoras, existe o risco inerente ao
procedimento cirúrgico e a rejeição. A mortalidade destes pacientes é de cerca de 2%
após 2 anos da alta hospitalar (25).
O transplante de ilhotas em seres humanos, ainda em fase experimental, tem o
objetivo de ser menos invasivo que o transplante de pâncreas, além de diminuir tempo
de internação e complicações. O sucesso deste procedimento conduz um otimismo
para a substituição do transplante de pâncreas. O transplante de ilhotas é um método
que não envolve cirurgia, permite pouco grau de medicamentos imunossupressores, e
poderá ser menos caro para o receptor (26).
Além destes tratamentos, as pesquisas atuais estão sendo orientadas para a
gênese do próprio processo auto-imune. Espera-se que, através destas pesquisas,
possam ser desenvolvidos tratamentos capazes de prevenir o processo
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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25
autoimunológico antes da destruição das células produtoras de insulina, permitindo
assim, a manutenção de uma função endócrina normal (27).
A importância do diabetes mellitus tipo 1 do ponto de vista social e econômico é
inegável, devido às altas taxas de morbidade, mortalidade e de incapacitação para o
trabalho. Assim, fica evidente que tal doença mereça uma atenção e cuidados especiais
no sentido de uma detecção precoce dos indivíduos susceptíveis para que haja
possibilidade de intervenção profilática nos mesmos (17).
Desta forma, a utilização de modelos animais experimentais torna-se de grande
valia para que o estudo no campo de doenças auto-imunes se difunda e possa
colaborar principalmente na prevenção do processo autoimunológico (27). A utilização
de modelos animais que expressam a doença de forma similar que nos humanos
proporciona um melhor entendimento da fisiopatologia, oferecendo oportunidades de
pesquisa na formulação de novas modalidades terapêuticas.
1.2 MODELOS EXPERIMENTAIS
Grande parte dos conhecimentos científicos que o homem adquiriu na área da
biomedicina visando, primordialmente, à saúde humana e à dos animais domésticos foi
possível, em grande parte, graças ao uso dos animais de laboratório em suas
pesquisas (28).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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26
Esta íntima relação entre pesquisa biomédica e uso de animais de laboratório se
deve, principalmente, ao conhecimento científico adquirido a respeito destes animais.
(28).
Animais de laboratório são definidos como aqueles criados e produzidos sob
condições ideais e mantidos em ambiente controlado, com conhecimento e
acompanhamento microbiológico e genético seguros, obtidos por monitoração regular
(29). Após vários anos de pesquisa, foram criadas numerosas linhagens de animais
consangüíneos e híbridos capazes de reproduzir as variáveis causadas por diferenças
genéticas e, mais recentemente, os animais foram classificados quanto ao status
sanitário ou ecológico, visando a prevenção de erros induzidos por diferenças
ambientais (30).
O ambiente inclui organismos associados aos animais e organismos presentes
dentro dos limites do ambiente físico e barreiras sanitárias. Quanto mais eficazes forem
as barreiras sanitárias deste ambiente, menor a contaminação dos animais por vírus,
bactérias, fungos ou parasitas (30).
A padronização dos animais utilizados em pesquisas é indispensável, pois
diminui o número de animais necessários para atingir a exatidão ou reprodutibilidade do
experimento. Assim, o ambiente onde os animais são mantidos e/ou criados deve
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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27
prevenir erros induzidos por diferenças ambientais, denominados padrão sanitário, e se
definir conforme a relação dos animais com o seu ambiente (31).
Em função das barreiras sanitárias existentes, podemos classificar os animais
conforme seu padrão sanitário, ou seja, quanto à microbiota a eles associada:
• Animais SPF (Specific Pathogen Free): O termo SPF significa que o
animal é livre de uma variedade de microorganismos (patógenos e
parasitas) específicos, porém não necessariamente livre de outros não-
específicos. Animais SPF originam-se de animais germ-free e não
apresentam microbiota capaz de lhes determinar doenças, ou seja,
possuem somente microorganismos não-patogênicos (28). Esta
nomenclatura é recomendada pelo Comitê Internacional de Animais de
Laboratórios, desde 1964 (31).
• Animais Gnotobióticos: possuem microbiota associada definida e devem
se mantidos em ambientes dotados de barreiras sanitárias absolutas
(isoladores) (31).
• Os animais convencionais: são aqueles que possuem microbiota
indefinida por serem mantidos em ambiente desprovido de barreiras
sanitárias rigorosas (30,31). A maioria dos animais usados em
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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28
experimentação, ainda é criada em colônias de acasalamento
convencional (28).
É válido ressaltar que o padrão de qualidade no cuidado aos animais pode
interferir significativamente no resultado dos experimentos, direta ou indiretamente.
Desta maneira, pode-se avaliar o que significariam possíveis “falsos positivos” nos
resultados obtidos em virtude da utilização de modelos animais de padrões
inadequados (31).
A maior parte dos animais usados em pesquisa, nos últimos 30 anos, tem sido
proveniente de ambiente convencional. Eles são relativamente mais baratos para se
produzir e manter, e têm sido usados praticamente em todo tipo de pesquisa, desde a
genética até a cirúrgica (30)
1.2.1 Modelos Experimentais de Diabetes
Os modelos animais de diabetes têm sido usados extensivamente na obtenção
do esclarecimento sobre esta doença (32). Eles têm fornecido inúmeros benefícios para
os humanos, incluindo o tratamento de complicações oculares ou vasculares, e o
desenvolvimento das técnicas de transplante de pâncreas, evidenciando o aumento ao
entendimento do início de uma base imune no diabetes tipo 1, entre outros (33).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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29
No caso do Diabetes Mellitus tipo 1, existem modelos experimentais que são
utilizados largamente em pesquisas e que podem ser classificados em 2 tipos: (I)
diabetes mellitus induzido quimicamente e (II) diabetes mellitus espontâneo.
1.2.2 Diabetes Experimental Induzido Quimicamente
A indução química do diabetes em animais experimentais ocorre após a
destruição química seletiva das células beta pancreáticas. As substâncias mais usadas
para esta indução em ratos, camundongos e coelhos são a Alloxana e a
Estreptozotocina (STZ). A dose destas drogas para indução do diabetes, depende da
espécie do animal e do seu peso (34).
A STZ, na dosagem de 160 a 250 mg/kg, têm um efeito citotóxico direto nas
células beta de camundongos. A STZ causa dano no ácido desoxirribonucléico (DNA),
depletando Nicotina Adenina Dinucleotídeo (NAD+), que inibe a biossíntese e a
secreção de insulina e, deste modo inicia a morte das células beta, através da depleção
de energia. Em doses sub-diabetogênicas (40mg/kg) a STZ pode produzir insulite
pancreática, com morte progressiva das células beta levando também ao diabetes
mellitus. O aparecimento de lesão inflamatória nas ilhotas sugere que, múltiplas baixas
doses de STZ agem pela iniciação de reação imune mediada por células (35).
A Alloxana é mais freqüentemente administrada por aplicações intravenosas,
intraperitoneais ou subcutâneas. As ilhotas humanas são mais resistentes a alloxana do
que as de ratos e camundongos. A dose intravenosa mais freqüentemente usada para
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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30
induzir diabetes em ratos é 65mg/kg. A dose intraperitoneal. ou subcutânea efetiva
deve ser 2 a 3 vezes maior do que este valor, pois abaixo de 150mg/kg pode ser
insuficiente para causar diabetes em ratos que, em jejum, se tornam mais suscetíveis à
ação da droga (34).
1.2.3 Diabetes Experimental Espontâneo
Os animais que desenvolvem espontaneamente o diabetes insulino-dependente
têm sido estudados por 2 fatores patogenéticos que se complementam: os defeitos
imunológicos e a predisposição genética. Existem várias espécies, como o Hamster
Chino, o coelho Branco da Nova Zelândia e o cachorro Keshond, porém estes animais
não são suficientemente caracterizados e convenientes para serem comparáveis com o
DM1 dos seres humanos (36).
Entretanto, o DM1 possui dois excelentes modelos animais espontâneos para a
doença: os ratos BB (Biobreading) e os camundongos NOD (Non Obese Diabetic)
(32,37,38,39).
Nos ratos BB, que foram descobertos no Laboratório BioBreeding de Ottawa
(Canadá), os sintomas aparecem ao redor dos 3 meses de idade. Tem-se reportado
tratamentos aplicados a estes ratos que interferem na resposta imunológica e previnem
o diabetes, como timectomia neonatal, irradiação linfóide total, tratamento com soro
antilinfocítico ou ciclosporina (36).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
31
A predisposição genética destes animais é demonstrada através de estudos que
empregam o entrecruzamento entre distintas linhagens entre si, de ratos BB com outras
linhagens co-sangüíneas, e identificaram 3 genes: [I] iddm1 – Lyp (linfopenia)
autossômica recessiva, localizado no cromossomo 4 e induz a ausência de células T
periféricas das subpopulações CD8+ e RT6+ desde o nascimento, [II] iddm2 – MHC
(Complexo Principal de Histocompatibilidade) presente no cromossomo 20, que induz
suscetibilidade a insulite e ao diabetes, [III] iddm3 confere resistência ao diabetes.
Fenotipicamente, apresentam linfopenia e um fenômeno poliendócrino como a tireoidite
auto-imune (36).
1.3 CAMUNDONGOS NOD
Os camundongos NOD são o modelo mais estudado de doença espontânea
auto-imune órgão-específico em todo o mundo (40,41,42). As razões para a preferência
deste modelo incluem um genoma bem definido, maior quantidade de reagentes
monoclonais para a análise de componentes do sistema imune e um custo
razoavelmente baixo, comparado com a utilização de ratos (39).
1.3.1 Background (linha evolutiva genética) da linhagem NOD
Os camundongos NOD foram descobertos em 1974, no Laboratório de
Investigações Shinogui, em Osaka - Japão (36). Possuem fenótipo albino (figura 3) e
são procedentes de uma derivação da subllinhagem Jc 1 – ICR outbread que
desenvolvia catarata (39).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
32
Figura 3. Camundongos NOD (39).
Segundo o Laboratório Jackson, na 6º geração, os progenitores dos futuros
NOD/Shi foram acasalados inbread com camundongos livres de catarata, mas com
níveis elevados de glicemia de jejum. Na 13º geração, os progenitores foram separados
da nova linhagem NOD/Shi. Os níveis plasmáticos elevados de glicose continuaram a
ser a base para a seleção da última linhagem, enquanto que seus progenitores – da
geração 13 – foram selecionados na base de níveis normais de glicose sangüínea
plasmática. Em 1974, na 20º geração, uma fêmea de linhagem normoglicêmica
desenvolveu espontaneamente diabetes mellitus, depeleção de insulina sérica e
insulite. A reprodução seletiva da linhagem desta fêmea diabética produziu a linhagem
“Nonobese Diabetic” - NOD (43).
Originalmente restrita ao Japão, a linhagem NOD foi distribuída durante o ano de
1980 para a Austrália e Estados Unidos. Hoje, no Laboratório Jackson (que se localiza
na cidade de Bar Harbor - Maine nos Estados Unidos), sua produção já ultrapassou a
83º geração isogênica (43).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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33
1.3.2 Processo inflamatório
Estes camundongos exibem autoimunidade espontânea que causa diabetes
através da destruição das células produtoras de insulina, de forma semelhante à
observada em humanos (44). A destruição auto-imune é caracterizada por insulite,
infiltrado leucocitário nas ilhotas pancreáticas. Esta infiltração é composta
predominantemente por células dendríticas, macrófagos, por células T (CD4
+
e CD8
+
) e
células B – e ocorre do ducto perivascular para regiões periféricas das ilhotas
pancreáticas de Langerhans (peri-insulitis) (40). Algumas células NK (Natural Killer)
também são achadas no infiltrado (45).
Este estágio é acompanhado por uma lenta, progressiva e seletiva destruição
das células beta, mediada principalmente, por células T, inicia-se em 3-4 semanas e
estendendo-se por 4-6 meses de idade (40). Segundo Gross e colaboradores (46), o
infiltrado nas ilhotas é similar ao que é observado nos pacientes com início recente do
diabetes tipo 1. No entanto, para Atkinson (39), a insulite em pacientes diabéticos de
início agudo é muito diferente da encontrada nas ilhotas dos NOD.
Este infiltrado progride e invade as ilhotas (insulite) em poucas semanas,
levando a um quadro severo de insulite em 10 semanas de idade (74).
Paralelamente, há uma liberação de citocinas pró-inflamatórias como Fator de
Necrose Tumoral α (TNF-α), Interferon-Gama (IFN- γ) e Interleucina 1 beta (IL-1).
Estas citocinas, secretadas pelas células apresentadoras de antígeno (APC) e células
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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34
T, podem favorecer a iniciação e progressão da resposta auto-imune. Além disso, estas
citocinas podem ser finalmente reguladas por outras citocinas e quimiocinas numa
complexa rede de interações recíprocas (47).
Uma das peculiaridades da linhagem é a acumulação de algumas células T auto-
reativas nos órgãos linfóides periféricos, pâncreas e glândulas salivares
submandibulares. Este acúmulo de linfócitos T possibilita o reflexo de baixos níveis de
IL-2 e a resistência de timócitos e células T periféricas para a indução de apoptose (39).
Os camundongos NOD também desenvolvem doença auto-imune generalizada,
afetando múltiplos órgãos e tecidos, incluindo salivar, lacrimal, tireóide, paratireóide,
adrenal, testículos e hemáceas (48,49).
Somente após a destruição de pelo menos 95% das células beta produtoras de
insulina é que, se manifesta, o diabetes nos camundongos NOD (36).
Similar aos humanos, os camundongos NOD geralmente expressam
autoanticorpos anti-insulina no soro antes de apresentarem hiperglicemia (42). De
acordo com Gross e colaboradores (46), a variedade de autoanticorpos contra
proteínas das ilhotas pancreáticas, incluindo insulina, ácido glutâmico descarboxilase
(GAD) e ICA512, foi identificada tanto no modelo animal quanto no homem.
A insulite por sua vez, pode ser prevenida mediante vários procedimentos
imunomoduladores, que compreendem a timectomia neonatal, transplante de medula
óssea, irradiação, transfusão de sangue, ciclosporina A, corticosteróides, nicotinamida,
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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35
eliminação de radicais livres (36) e tratamento com anticorpo monoclonal anti-CD4 e
anti-CD8 (40).
1.3.3 Características do Diabetes no Modelo Experimental NOD
Embora todos os camundongos NOD desenvolvam insulite, isto não é sempre
acompanhado de diabetes (42).
Neste modelo experimental, o início do diabetes é marcado por glicosúria
moderada e glicemia maior que 250mg/dl. Eles são hipoinsulinêmicos e
hiperglucagonêmicos, confirmando a destruição seletiva das células beta pancreáticas
(43). A glicosúria e a hiperglicemia tornam-se progressivamente mais severas por volta
da 34
a
semana, quando a perda de peso, a polidipsia e a poliúria ocorrem. Sem o
tratamento com insulina exógena, os camundongos diabéticos tornam-se severamente
hiperglicêmicos e cetonêmicos, mas eles não se tornam cetoacidóticos (50).
Na maior parte de colônias criadas em ambiente SPF, os camundongos NOD
sem tratamento sobrevivem de 3 a 4 semanas após a primeira detecção de glicosúria
(50).
1.3.4 Suscetibilidade para o desenvolvimento de Diabetes nos camundongos NOD
Os fatores ambientais em conjunto com a genética, claramente modificam a
incidência do diabetes tipo 1 nos modelos experimentais espontâneos. A suscetibilidade
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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36
destes camundongos é poligênica e ambiental, enfatizando condições de habitação
(ambiente gnobiótico), sanitárias, dietéticas e de gênero (41,43).
Isto se deve ao fato que a diabetogênese nos camundongos NOD é uma
conseqüência hereditária de imudeficiência dentro do complexo poligênico. A
penetrância desta suscetibilidade é fortemente influenciada pelo ambiente físico,
particularmente a dieta e a exposição a patógenos microbianos. Uma das
características mais fascinantes dos camundongos NOD é a estimulação do sistema
imune pelos patógenos ambientais que levam ao desenvolvimento de um sistema
imune mais normal e menos suscetível ao diabetes. Assim, estes animais precisam ser
alocados em condições livre de patógenos (SPF) para expressar o fenótipo do diabetes
(51).
1.3.4.1 Genética
A herança genética da suscetibilidade para a doença em humanos (DM1) e nos
camundongos NOD é poligênica (52). Os alelos de classe II do MHC constituem um dos
mais importantes fatores de risco genéticos para a suscetibilidade ao DM1. Os
camundongos NOD são homozigotos para o haplótipo H-2
g7
(K
d
, I-A
g7
, I-E
null
, D
b
) que
mapeia o locus idd-1 no cromossomo 17, e contribui para disfunções severas de células
apresentadoras de antígenos (APC), que podem promover o desenvolvimento de
células T- autoreativas às ilhotas (40,49). Esta região é necessária, mas não suficiente,
para o desenvolvimento visível do diabetes (52).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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37
Recentemente, foram correlacionadas as seqüências codificadoras da
Interleucina 2 (IL-2) e o polimorfismo da molécula CTLA-4 no desenvolvimento de
diabetes em camundongos NOD (49).
1.3.4.2 Dietética
Fatores dietéticos modificam o desenvolvimento do diabetes autoimune em
modelos animais de diabetes (camundongos NOD e os ratos BB) (53).
Em alguns estudos, proteínas ou peptídeos, constituem fatores desencadeantes
para o diabetes, além de alguns componentes das rações padronizadas para roedores,
que contém trigo, soja e alfafa, também podem desencadear diabetes tanto nos
camundongos NOD como nos ratos BB (36,54). A ingesta de leite ou albumina sérica
bovina (BSA) durante a infância tem sido sugerida como importante fator
desencadeante de diabetes tipo 1 em humanos. No entanto, estudos em animais são
divergentes quanto a este respeito (36,54).
Além desses componentes, foi verificado que, nestes camundongos, a
introdução precoce de dieta isenta de glúten, influencia o início e a incidência de
diabetes, assim como a insulite e o número de linfócitos na mucosa intestinal,
retardando significativamente o diabetes (55). Dietas restritas em ácidos graxos
essenciais, como o ácido araquidônico, também previnem o desenvolvimento do
diabetes nestes animais (36).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
38
De acordo com Mathieu e colaboradores (56), camundongos NOD tratados
precocemente (começando aos 3 dias de idade até os 70 dias de vida), com vitamina D
ou com 1,25-dihidroxivitamina D
3
(1,25(OH)
2
D
3
)
desenvolvem diabetes em menor
quantidade. O efeito da deficiência de vitamina D é maior que o da suplementação,
sugerindo um papel importante para esta molécula na patogênese desta patologia.
1.3.4.3 Exposição a microorganismos
Teoricamente, infecções por vírus podem contribuir para o aumento ou
diminuição da incidência do diabetes tipo 1 (54)(57). Em modelos experimentais, o
diabetes pode ser prevenido nos camundongos NOD pela infecção em idade jovem
com micobactéria, vírus da coriomeningite linfocítica, vírus da hepatite murina, vírus da
encefalomiocardites (58). De acordo com Christen e colaboradores (59), injeções com
Coxsackie vírus não somente melhoram, mas também previnem a doença nos NOD.
Segundo Leiter (50), a imunoestimulação geral deve ser subjacente à proteção
ao desenvolvimento de diabetes, porque o tratamento de NODs pré-diabéticos com
vários tipos de imunomoduladores exógenos, incluindo citocinas (IL-1, TNF, IL-2, IL-4),
previnem em geral o aparecimento desta doença.
Camundongos NOD vacinados com o Bacillus Calmette Guérin (BCG) durante as
primeiras semanas de vida previnem o aparecimento do diabetes. Da mesma forma, as
enterotoxinas estafilocócicas também previnem o aparecimento do diabetes nestes
animais (36).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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39
1.3.4.4 Estresse Crônico
O estresse crônico nos camundongos NOD (como rotação, vibração, limitação de
espaço) entre a sexta e a oitava semana de vida, assim como repetidas injeções
contendo salina diminuem a incidência de diabetes em ambos sexos. O estresse pré-
natal acelera o início do diabetes.
Suspeita-se que o estresse modula o desenvolvimento do diabetes por
interações neuroendócrinas-imunes envolvendo glucocorticóides e citocinas (54).
1.3.4.5 Ambiental
Para um melhor manejo em biotérios, os camundongos NOD, deverão estar em
ambiente SPF, alocados em gaiolas com filtro e autoclavadas, em locais com irradiação
e fluxo laminar (51). Somente animais com boa qualidade microbiológica podem
oferecer garantia de um resultado experimental sem interferências de outras variáveis,
por isso as utilizações desses animais (em SPF) vêm crescendo à medida que os
pesquisadores necessitam de resultados mais fidedignos de seus experimentos (28).
Em camundongos NOD alocados em instalações padrão, o diabetes afeta
primeiramente as fêmeas, com incidência entre 60-90% ao redor da 30
a
semana de
idade, em oposição aos machos os quais se tornam diabéticos em apenas 30% dos
casos. A incidência cumulativa, entretanto, é reportada próximo de 100%, independente
do gênero (54).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
40
A transferência de machos NOD de biotério convencional, no Japão, para
biotério SPF aumentou a incidência de diabetes nos machos de 6 para 70% (50).
A incidência de diabetes nos camundongos NOD é muito divergente entre os
laboratórios, conforme pode ser observado na tabela 1.
Tabela 1: Colônias de NOD e suas taxas de diabetes em ambiente SPF (54)
COLÔNIAS INCIDÊNCIA DE DIABETE
Referências
NOD/Lt (Leiter) 90% fêmeas, 83% machos (60)
NOD/Shi (Shionogi) 70-80 fêmeas,
<20% machos
(61)
NOD/Wehi (Walter and Eliza Hall Institute)
< 10% Fêmeas,
< 1% nos machos
(62)
No Biotério do Laboratório Jackson a incidência relatada de diabetes é de 85%
na colônia de fêmeas e 37% nos machos, em 30 semanas de idade (43). Delovitch e
Singh (40) reportam que a incidência nas fêmeas varia de 80-90% enquanto nos
machos de 10-40%. De acordo com Hanafusa e colaboradores(45) em 30 semanas de
idade, a incidência de diabetes alcança 80% nas fêmeas e 20% nos machos.
Segundo Leiter (50) a incidência de diabetes em NOD machos serve como um
indicador útil da presença de fatores ambientais afetando a penetrância da linhagem na
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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41
suscetibilidade para o diabetes. Expor camundongos NOD a uma variedade de vírus de
murinos (por exemplo, vírus da encefalomiocarditis, hepatite, coriomeningite) previne o
desenvolvimento de diabetes.
Estes agentes infecciosos aparentemente, protegem pelo fornecimento de
imunoestimulação geral, devido ao tratamento de NOD pré-diabéticos com vários tipos
de imunomoduladores exógenos, incluindo ACF e citocinas (IL-1, TNF-, IL-2, IL-4),
todos evitam o desenvolvimento do diabetes (50).
1.3.5 Divergência entre os sexos
A incidência de diabetes em camundongos NOD é aproximadamente quatro
vezes maior em fêmeas do que em machos (54).
Em análises de colônias NOD, em todo o mundo, verificou-se que a incidência
cumulativa de diabetes na 30º semana é mais variável: menor nos machos do que nas
fêmeas (figura 4). Embora algumas diferenças das colônias possam ser explicadas por
divergências genéticas entre linhagens NOD separadas das colônias originais, estas
parecem depender muito mais de fatores ambientais (52).
Conforme Delovitch e Singh (40), as fêmeas NOD desenvolvem uma forma mais
agressiva de insulite e a conseqüente incidência mais alta de diabetes comparadas aos
machos.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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42
De acordo com Hernandorena (36) e Bieg (54), o início da doença pode ser
acelerado em machos castrados. O inverso é observado em fêmeas tratadas com
andrógenos. Estes achados sugerem um papel imunomodulador para os hormônios
sexuais. Estas observações do modelo animal contrastam com as do diabetes tipo 1 em
seres humanos, no qual não há diferença de incidência entre homens e mulheres (63).
O fato dos camundongos NOD serem isogênicos, a necessidade de condições
de habitação controlada, a facilidade para mudar a fisiologia natural através de
manipulação genética e a relativa facilidade para a prevenção da doença tem causado
alguns questionamentos sobre a qualidade do modelo. Fica claro que o curso do
diabetes tipo 1 em humanos não será facilmente alterado, ao contrário do observado
nos modelos murinos isogênicos, onde o risco genético é o mesmo para todos e,
intervenções podem ser iniciadas em muitos estágios da doença (39).
Figura 4. Incidência de diabetes de camundongos NOD em alguns laboratórios. 4a:
Laboratório taconic (64)
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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43
Figura 4b: Laboratório Jackson (65)
Figura 4c: Colônia Ba - St.Bartholomew's Hospital Medical College (66)
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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44
Assim, não se pode assumir que os modelos disponíveis de diabetes espontâneo
em ratos e camundongos representem um equivalente à doença em humanos (39).
Entretanto, estes parecem ser instrumentos importantes de pesquisa, principalmente,
da patogênese e terapia do diabetes humano.
O custo envolvido com instalação e manutenção de ambiente livre de patógenos
é extremamente alto, o que leva vários biotérios no mundo, e principalmente no Brasil,
a utilizarem ambientes convencionais. Desta forma, são poucas as universidades que
possuem biotérios do tipo SPF no país. No Rio Grande do Sul, não há este tipo de
biotério.
1.4 HIPÓTESE DO TRABALHO
Visto que não há relatos na literatura sobre tentativas de desenvolvimento de
colônias NOD em biotério convencional em nosso meio, no presente trabalho
objetivamos verificar a incidência de diabetes deste modelo em ambiente convencional.
• H0 (Hipótese Nula): Em ambiente Convencional, os Camundongos NOD não
desenvolvem taxas significativas de diabetes.
• H1 (Hipótese alternativa): Em ambiente convencional, os Camundongos NOD
desenvolvem taxas significativas de diabetes.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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45
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar o modelo experimental NOD em ambiente convencional.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Avaliar a incidência de diabetes mellitus de camundongos NOD criados em
ambiente convencional;
- Avaliar a sobrevida dos camundongos NOD com a presença do diabetes sem
tratamento;
- Avaliar a isogenicidade da linhagem NOD.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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46
3 METODOLOGIA
3.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO
Este estudo caracteriza-se como experimental, informando a freqüência e a
distribuição do diabetes mellitus na colônia NOD (67).
3.2 MATERIAIS E MÉTODOS
O estudo teve seu início após sua aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa
da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, sob o ofício nº 669/05 –CEP
(Anexo 1).
3.2.1 Animais
Para o início do desenvolvimento deste trabalho, foram utilizados 3 machos e 3
fêmeas, irmãos da mesma ninhada, de camundongos isogênicos da linhagem NOD,
criados sob condições de biotério estéril (animais Specific Patogen Free - SPF), doados
pelo Biotério Central da Escola Paulista de Medicina (EPM).
3.2.2 Produção e manutenção da linhagem NOD
Após o período de ambientação (10 dias) na Coordenação de Produção e
Experimentação Animal (CPEA), da Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
47
Saúde do estado do Rio Grande do Sul (FEPPS), os animais foram acasalados através
do método de criação isogênica (inbred) Brother & Sister.
As proles oriundas deste acasalamento consangüíneo alcançaram a idade
adulta, em torno de 55 dias de idade, formaram novos reprodutores que foram
acasalados sucessivamente, entre irmãos, formando a colônia de produção da
linhagem NOD.
Todos os animais, após o desmame, o qual ocorreu em torno do 21º dia de vida,
foram submetidos à sexagem e mensuração de peso e glicemia. Para a identificação
individual dos animais foram realizadas, aleatoriamente, marcações circulares com
caneta na cauda dos animais.
A sexagem foi realizada no momento do desmame, baseada na distância
anogenital, que é duas vezes maior nos machos que nas fêmeas, além de se poderem
visualizar os testículos através da parede abdominal (28).
Cada unidade reprodutiva, ou unidade de recria formada a partir do desmame,
continha suas fichas de identificação individual, a qual fornecia informações suficientes
a respeito dos acontecimentos na colônia, como: data do acasalamento, nascimentos,
número de filhotes nascidos, data do desmame, proporção de fêmeas e machos
desmamados e mortos (Figura 5).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
48
A
Figura 5: Fichas de identificação. A: Ficha para controle de acasalamentos; B: Ficha
para animais em criação
Dos dez (10) casais formados no período de novembro de 2004 a julho de 2005,
o total de camundongos NOD analisados foi 79 machos e 58 fêmeas. Estes eram
avaliados, à medida que nasciam, e portanto, este total de animais não foi
acompanhamento por um período igual. Os resultados foram analisados por
B
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
49
prevalência. O tempo de acompanhamento total foi de 32 semanas, para as primeiras
crias.
Cabe ressaltar que no presente estudo, não foram incluídos os dados das
fêmeas que procriaram e amamentaram para não induzir o aumento na incidência de
diabetes.
Conforme a rotina de manutenção do biotério, todos os animais foram
ambientados com ração balanceada padrão para roedores da empresa NUVITAL,
maravalha de pinus selecionada autoclavada, água ad libitum e mantidos em gaiolas
devidamente identificadas, em fotoperíodo de doze horas claro e doze horas escuro
(06:00 / 18:00h) e em temperatura média de 21ºC.
3.2.3 Características ambientais do biotério convencional
O biotério da CPEA em sua concepção separa-se em duas áreas básicas:
I – área “limpa”: destinada ao preparo do material a ser enviado para as salas de
animais, incluindo o corredor de distribuição – “corredor limpo”;
II – área “suja”: o material a ser limpo é recolhido através do “corredor sujo” e destinado
à área de lavagem.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
50
O fluxo de material e pessoal era feito em sentido unidirecional (da área “limpa”
para área “suja”). Em seus 560 m², além das áreas acima mencionadas, eram
distribuídas cinco salas de produção, três salas de experimentação, dois vestiários, uma
sala de administração, um hall de entrega de animais e um almoxarifado.
A temperatura ambiental do biotério da CPEA variou entre 13 e 27ºC conforme a
variação do ambiente externo, enquanto que os padrões internacionais recomendam
temperatura ambiental de 20 a 24ºC para roedores (28). Por não haver controle
atmosférico, a otimização na qualidade sanitária dos animais foi impedida, já que não
há movimentação do ar nas salas de criação que remova poluentes e que mantenham
o conforto térmico (28).
A iluminação das salas foi feita através de 4 lâmpadas fluorescentes 40W de
potência, à 3,5m do piso. O fotoperíodo foi controlado por um timer que mantém um
regime de 12 horas claro X 12 horas escuro.
3.2.3.1 Barreiras sanitárias
a) Físicas
A autoclave é o principal equipamento, utilizado pela CPEA, na esterilização de
materiais e insumos. Utiliza o processo de calor úmido para esterilização em
conseqüência da pressão e do isolamento térmico, obtendo-se temperaturas elevadas,
podendo atingir até 135°C.
De modo geral, o ciclo de esterilização de maravalha, gaiolas plásticas, tampas
de gaiolas, bicos e “camas”, utilizado pela CPEA, é de 120°C durante 30 minutos.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
51
b) Químicas
A CPEA possui três tanques de imersão, sendo que dois deles têm capacidade
para 700 litros (L) e outro com 350 L. As gaiolas eram submersas em solução de
hipoclorito de sódio diluída em água a 5%, por 24 horas, e após enxaguadas.
Todas as áreas envolvidas direta ou indiretamente com a criação eram,
rotineiramente, limpas e desinfetadas.
A solução de hipoclorito de sódio também era utilizada nestes casos, porém na
concentração que varia de 1,5% a 2%, em estantes, paredes, pisos, portas, teto e pias.
c) Higiene Pessoal
Fundamental para evitar-se a contaminação dos animais, através do manuseio,
por microorganismos associados à flora microbiológica normal do ser humano. Era
realizado da seguinte maneira:
Para evitar essa contaminação, alguns procedimentos são adotados:
- Retirada de toda a roupa de rua, dos acessórios pessoais e banho;
- Paramentação apropriada ( calçados, calça , jaleco e luvas);
- Não se deve comer, beber ou fumar dentro do biotério.
3.2.4 Aferição de peso e glicemia
As ninhadas provenientes dos acasalamentos foram acompanhadas durante 40
semanas de vida.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
52
Após o desmame, aos 21 dias de idade, sempre sob a supervisão do técnico de
biotério e do pesquisador, os animais eram sexados e, a partir deste momento eram
realizadas as mensurações do peso e da glicemia, procedimentos repetidos
quinzenalmente.
Antes do momento da verificação da glicemia, os animais eram pesados em
balança analítica (Marte
®
, AM220 – Carga máxima de 500g) (Figura 6).
Figura 6: Pesagem dos Camundongos NOD
Para verificação do nível sérico de glicose, uma gota de sangue era obtida,
através de uma pequena incisão na ponta da cauda com um bisturi- lanceta (Figura 7).
Procedia-se, então, com a aferição, realizada através de fitas reagentes para medição
de glicemia, acopladas a medidor Accu-Check Advantage
®
(68).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
53
Segundo as informações do fabricante, o aparelho não quantifica glicemias
maiores que 600 mg/dL, sendo esses valores registrados como “HI”(68). Para
realização de cálculos estatísticos, representamos esses valores de glicemia em 601
mg/dL.
Foram considerados diabéticos os animais que apresentaram glicemia (no-
fasting) maior ou igual a 250mg/dL, de acordo com o Laboratório Jackson (43).
A
Figura 7: Mensuração da glicemia. A:Contensor e monitor de glicemia. B: Obtenção do
sangue caudal
3.2.5 Transplante Cutâneo
Para este procedimento foram utilizados 5 camundongos machos da linhagem
NOD, sendo um doador e 4 receptores, representando cada geração.
B
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
54
Os camundongos receptores foram, depois de pesados em balança analítica,
anestesiados com uma solução final de cloridrato de xilazina 2% (Rompun®, Bayer
Animal Health) e cloridrato de ketamina 10%(Dopalen®, Agribrands Brasil Ltda.)
diluídos a 2mg/mL e 10mg/mL de solução salina (0,9%) respectivamente. Foi
administrada uma dose única de 0,05mL para cada 10g de peso corporal por via
intraperitoneal (ip).
Após anestesia, foi realizada a tricotomia dorso-lateral (4 cm
2
) com máquina para
tosa (Oster®, USA), seguida de anti-sepsia com álcool etílico 70%.
No doador, foi realizada a eutanásia através de deslocamento cervical
preconizada pela Lei 714, de 20 de junho de 2002 que dispõe sobre procedimentos e
métodos de eutanásia em animais e outras providências, do Conselho Federal de
Medicina Veterinária, e pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA)
(69)(70).
A pele da base da cauda do animal foi seccionada, transversalmente, com
lâmina de bisturi nº24 (Solidor®) e após, longitudinalmente. Com o auxílio de uma pinça
de dissecção, esta foi tracionada distalmente (base-ponta), retirada do animal e
submersa em solução salina 0,9% a 4ºC.
Na região tricotomizada do receptor, com uma pinça nº3 e uma tesoura fina reta
para íris, foi retirado 1 cm
2
de tecido cutâneo. Com a lâmina de bisturi, foi seccionado
um 1 cm
2
da pele total da cauda do doador. Com uma pinça, o fragmento de pele
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
55
caudal foi distribuído no seu leito receptor e mantido com sutura simples transfixante
nas quatro extremidades do quadrado cutâneo enxertado (Figura 8).
Figura 8. Transplante Cutâneo. A: Implantação do enxerto cutâneo. B: Isotransplante
concluído.
Recuperado da anestesia, o animal foi colocado em gaiola individual mantendo o
manejo rotineiro adotado pelo biotério da CPEA (71).
Todos os procedimentos adotados, envolvendo os animais do presente estudo,
estão de acordo com o que preconiza o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal,
cumprimentando a Constituição do Estado Lei nº 11.915, artigo 82, inciso IV de 21 de
maio de 2003 (72).
3.3 CONSIDERAÇÕES METODOLÓGICAS
Este trabalho teve como características metodológicas, o uso das normas da
ABNT 2006 no corpo do trabalho, formatado de acordo com a publicação da Biblioteca
Central da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
A
B
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
56
(www.pucrs.br/biblioteca) e as referências bibliográficas estão de acordo com as
normas de VANCOUVER (73).
3.4 TREINAMENTO DAS TÉCNICAS
Para a realização das técnicas utilizadas nesta dissertação, os treinamentos dos
procedimentos com animais de laboratório iniciaram-se em março de 2004. Para isto,
houve aprimoramento no contato com camundongos, estudo de diversas linhagens,
indução de diabetes em camundongos Balb/c, C57 e C3H, mensuração da glicemia
através de punção da veia caudal, acompanhamento das variáveis peso e idade,
isolamento e transplante de ilhotas.
Todas estas etapas foram realizadas antes de serem utilizados os procedimentos
nos animais do estudo e foram acompanhadas pela Bióloga Patrícia Sesterheim,
bioterista especialista em cirurgias de roedores, Coordenadora de Projetos e Membro
do Comitê de Ética da FEPPS (Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde)
de Porto Alegre - RS.
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
O peso e a glicemia dos animais foram expressos através de média e desvio
padrão.
As curvas de sobrevida foram elaboradas utilizando o método de Kaplan-Meier,
método não paramétrico que permite a comparação entre diferentes categorias de uma
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
57
variável durante o período de sobrevida para o diabetes. O log rank test, permitiu
avaliar estatisticamente as curvas. As medidas de precisão das taxas de sobrevida e de
diabetes foram o erro padrão e o intervalo de confiança de 95%.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
58
4 RESULTADOS
4.1 ACASALAMENTOS E NÚMERO DE FILHOTES
A partir dos três casais iniciais, acasalando-se consagüinamente os animais
durante 4 gerações, formaram-se 10 casais. A média de filhotes por fêmea foi de
8,25+3,2 camundongos. Para a análise dos dados, foram utilizados 79 machos e 58
fêmeas, totalizando 137 camundongos.
4.2 PESO DOS CAMUNDONGOS NOD
Verifica-se que, na análise do peso de todos os camundongos a cada mês, o
ganho de peso parece não ter sido influenciado pelo diabetes até a 26ª semana. Após
este período, verifica-se uma tendência à estabilização nos pesos, tanto de machos
como de fêmeas. Nota-se que camundongos machos ganham mais peso naturalmente
que as fêmeas (Gráfico 1).
Gráfico 1: Peso (em gramas) dos camundongos NOD.
Peso médio (g) dos camundongos NOD
0
5
10
15
20
25
30
35
40
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24 26
28
30
32
Tempo (semanas)
Peso médio (g)
Machos
Fêmeas
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
59
No entanto, quando se estratificam os camundongos diabéticos dos não
diabéticos, verifica-se que os camundongos que se tornam diabéticos possuem uma
tendência a serem mais leves do que os não diabéticos a partir da 12ª semana (Gráfico
02).
Gráfico 02: Peso médio (g) dos camundongos NOD, de acordo com a presença ou não
de diabetes.
Da mesma forma quando se estratifica por sexo e pela presença ou não de
diabetes, verifica-se que os camundongos que desenvolvem diabetes possuem pesos
semelhantes que os não diabéticos, e só começam a ter uma leve diferença a partir da
30ª semana nos machos, e nas fêmeas a partir da 26ª semana. Neste caso, verifica-se
que nas primeiras semanas, o peso dos camundongos não diabéticos se equivale ao
dos diabéticos. No entanto, à medida que alguns camundongos vão se tornando
hiperglicêmicos, há uma tendência do peso diminuir em ambos os sexos (Gráfico 03).
Peso médio (g) dos camundon
gos NOD, de
acordo com a presença ou não de diabetes
0
10
20
30
40
2
4
6 8
10
12
14
16
18
20
22
24 26
28
30
32
Tempo (semanas)
Peso médio (g)
Não diabéticos
Diabéticos
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
60
Peso médio (g) dos camundongos NOD não
diabéticos e diabéticos de acordo com sexo
0
10
20
30
40
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Tempo (semanas)
Peso médio (g)
Machos não diabéticos Fêmeas não diabéticas
Machos diabéticos Fêmeas diabéticas
Gráfico 03: Peso médio (g) dos camundongos
não diabéticos
e
diabéticos
de acordo
com sexo.
4.3 GLICEMIA DOS CAMUNDONGOS NOD
As médias das glicemias dos camundongos analisados mostram que há um
aumento da glicemia não uniforme, a partir do 10ª semana de vida, dado este,
observado pelos valores do desvio-padrão (Anexo 3), que demonstram que alguns
camundongos já apresentam hiperglicemia. Quando estes valores foram estratificados
pelos sexos dos camundongos, verificou-se que a glicemia das fêmeas aumentou na
12ª semana, enquanto os machos só apresentaram um aumento significativo a partir da
16ª semana. Além disso, os valores das fêmeas são mais altos que os valores dos
machos a partir da 12ª semana de vida (Gráfico 04).
No Gráfico 05, verifica-se a diferença das glicemias entre camundongos
diabéticos e não diabéticos.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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61
Gráfico 04: Glicemia média (mg/dl) dos camundongos NOD.
Gráfico 05: Glicemia média (mg/dl) dos camundongos NOD de acordo com a presença
ou não de diabetes.
Nos camundongos NOD que não apresentaram diabetes, tanto machos quanto
fêmeas, a glicemia variou de 90mg/dl a, no máximo, 150mg/dl. Nos diabéticos,
Glicemia média (mg/dl) dos camundongos NOD
de acordo com a presença ou não de diabetes
0
100
200
300
400
500
600
2
6
10
14 18
22
26
30
Tempo (semanas)
Glicemia média
Não diabéticos
Diabéticos
Glicemia média (mg/dl) dos camundongos NOD
0
50
100
150
200
250
300
350
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
Tempo (semanas)
Glicemia média (mg/dl)
Machos
Fêmeas
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
62
verificou-se que as fêmeas iniciaram o processo hiperglicêmico na 16ª semana de vida,
enquanto os machos na 18ª semana.
Nota-se também, que os valores glicêmicos médios das fêmeas foram maiores
que os dos machos em todas as semanas de seguimento, após a instalação do
diabetes (Gráfico 06).
Glicemia média (mg/dl) dos camundongos NOD
não diabéticos e diabéticos, de acordo com sexo
0
200
400
600
800
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Tempo (semanas)
Glicemia média
(mg/dl)
Machos não diabéticos Fêmeas não diabéticas
Machos diabéticos Fêmeas diabéticas
Gráfico 06: Glicemia média (mg/dl) dos camundongos NOD
não diabéticos
e
diabéticos,
de acordo com sexo.
4.4 OCORRÊNCIA DE DIABETES NOS CAMUNDONGOS NOD
Do total de 137 animais analisados, em 40 semanas, a proporção de diabetes
em porcentagem dos camundongos que sobreviveram, analisando o sexo masculino e
feminino juntos, foi de 38% (Gráfico 07). Verifica-se no gráfico que, os eventos iniciam
em torno da oitava semana e acentuam-se por volta da vigésima semana de vida.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
63
Gráfico 07: Proporção de diabetes nos camundongos NOD em 32 semanas de
seguimento
Verificou-se que em oito meses de acompanhamento, analisando-se 79 machos
e 58 fêmeas, os camundongos NOD em Biotério Convencional apresentaram as
seguintes taxas de diabetes: 51% para as fêmeas e 27% para os machos, com 40
semanas de idade (Gráfico 08). Esta diferença foi significativa (P<0,001).
Além disso, é possível verificar que o início do desenvolvimento do diabetes nas
fêmeas é aproximadamente na mesma semana que os machos. No entanto, o processo
nas fêmeas ocorre de forma mais acelerada do que nos machos.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
64
Gráfico 08: Proporção de diabetes, em 32 semanas de seguimento, em % de
Camundongos NOD em biotério convencional, de acordo com sexo e idade.
4.5 SOBREVIDA
A sobrevida dos camundongos, analisando-se os dois sexos, em 32 semanas de
idade foi de 60%. Verifica-se que os animais começam a morrer por volta da vigésima
terceira (23º) semana de vida (Gráfico 09).
Quando a sobrevida é avaliada de acordo com o sexo, verificou-se para as
fêmeas sobrevida de aproximadamente 40% e para os machos de aproximadamente
85%, sendo esta diferença significativa (P < 0,02).
P<0,001
Fêmeas
Machos
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
65
Gráfico 09: Sobrevida de Camundongos NOD em biotério Convencional
Verificou-se ainda, que as fêmeas começam a morrer mais cedo que os machos,
por volta da vigésima quarta semana (Gráfico 10).
Sobrevi
da (%)
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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66
Gráfico 10: Sobrevida, em 32 semanas, dos camundongos NOD, de acordo com o
sexo.
No entanto, quando comparadas às sobrevidas de camundongos machos e
fêmeas que não apresentaram diabetes, verificou-se não haver diferença significativa
entre elas (P<0,76) (Gráfico 10a).
Fêmeas
Machos
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
67
Gráfico 10a: Curvas de sobrevida de camundongos NOD não diabéticos, machos e
fêmeas.
Da mesma forma, quando foram comparadas as sobrevidas dos camundongos
machos e fêmeas diabéticos, verificou-se não haver diferença entre estas (<0,25)
(Gráfico 10b), devido ao pequeno número de camundongos machos diabéticos (n=4).
P < 0,76
Fêmeas
Machos
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
68
Gráfico 10b: Curvas de sobrevida de camundongos NOD diabéticos, machos e fêmeas.
4.6 TRANSPLANTE CUTÂNEO
Nos 4 isotransplantes cutâneos realizados, não houve rejeição, confirmando a
isogenicidade da colônia. A Figura 9 mostra que, após 100 dias do procedimento, o
enxerto está viável.
P < 0,25
Machos
Fêmeas
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
69
Figura 9: Camundongo que recebeu enxerto cutâneo sem rejeição.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
70
5 DISCUSSÃO
5.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS
As dificuldades no tratamento do diabetes (como por exemplo, a necessidade de
várias injeções diárias de insulina para o controle glicêmico), a ocorrência de
complicações crônicas da doença e o risco de hipoglicemias severas em pacientes com
diabetes tipo 1, já justificam, por si só, a pesquisa por estratégias terapêuticas
alternativas à aplicação de insulina exógena. Além dos vários tipos de pesquisas que
buscam soluções alternativas para o tratamento desta doença, atualmente é verificada
uma ênfase em estudos que aprofundem o entendimento da patogenia desta
enfermidade (27). Os modelos animais têm-se mostrado bastantes úteis para este fim
(36).
A utilização de modelos experimentais com processo patogênico semelhante ao
humano, pode auxiliar no aprofundamento da compreensão do desenvolvimento do
diabetes tipo 1, assim como permitir o teste de novas modalidades terapêuticas.
Para que isto seja possível, estes animais devem ser bem caracterizados nos
ambientes em que são alojados. Isto propiciará melhor qualidade e fidedignidade dos
resultados.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
71
5.2 MODELO EXPERIMENTAL DE DIABETES
Os camundongos NOD, modelo experimental utilizado nesta pesquisa, foi
escolhido devido a sua grande importância no estudo do diabetes tipo 1 e de doenças
auto-imunes.
Os camundongos NOD, desde a sua descoberta há 20 anos atrás, oferecem
uma imensa percepção dentro dos complexos processos que envolvem as doenças
auto-imunes (74), e representam o melhor modelo animal para o estudo do diabetes
tipo 1 (40,41,42).
Experimentos recentes, utilizando estes camundongos, têm começado a fornecer
indícios sobre como devem ser moduladas e reguladas as respostas imunes para a
proteção do diabetes tipo 1 em humanos (40).
Outras linhagens também podem ser utilizadas para a pesquisa do diabetes,
como os ratos BB. No entanto, outras espécies e linhagens de animais apresentam
diferenças genéticas e imunológicas em relação ao desenvolvimento de diabetes
espontâneo, e não são tão bem caracterizadas como os camundongos NOD (36).
5.3 AMBIENTE E INCIDÊNCIA DE DIABETES
Uma das características que mais se destaca nos camundongos NOD é a
divergência dos valores de incidência de diabetes nas várias colônias existentes no
mundo (43,52,54). Além disso, a grande disparidade de valores quando comparados os
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
72
sexos; fêmeas possuem mais diabetes que machos (54). Em 30 semanas de idade, a
incidência de diabetes nas fêmeas é geralmente 80% ou mais, enquanto nos machos, a
incidência difere altamente de acordo com as colônias, variando de 0 a 100% em
diferentes instituições (43,50). Paralelamente, todos os valores de incidência de
diabetes destes camundongos são relativos a Biotérios mantidos em condições SPF,
onde os NOD alcançam maiores taxas de diabetes (41).
Os camundongos NOD utilizados neste estudo foram alocados na Coordenação
de Produção e Experimentação Animal, mantida pela FEPPS, caracterizada como um
Biotério Convencional. Os camundongos desta pesquisa foram mantidos e procriados
neste ambiente para que a taxa de diabetes fosse verificada em tais condições. Estes
dados não estão bem determinados na literatura científica.
5.3.1 Ambiente
a) Ração
Vários estudos demonstram que os fatores dietéticos modificam o
desenvolvimento do diabetes auto-imune em modelos animais de diabetes tipo 1,
incluindo os camundongos NOD (53,75). A ração oferecida aos camundongos NOD
neste estudo, foi ofertada de maneira ad libitum, peletizada. Esta ração é utilizada há
mais de 10 anos pelo biotério da CPEA por atender às exigências nutricionais e
microbiológicas dos animais, e possui os seguintes nutrientes: carbonato de cálcio,
farelo de milho, farelo de soja, farelo de trigo, fosfato bicálcico, cloreto de sódio,
complexo mineral vitamínico e aminoácidos.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
73
Não houve preocupação neste estudo em se modificar a dieta, pois o foco central
era avaliar a importância do ambiente (convencional) no desenvolvimento de
camundongos NOD, principalmente no que se refere à incidência de diabetes mellitus.
Além disso, em ambiente SPF, onde a ocorrência de diabetes é elevada, a dieta
normalmente não é diferente da empregada na presente investigação.
Esta ração possui alguns ingredientes em que os estudos indicam acelerar o
processo diabetogênico, como a soja e o trigo (54). No entanto, não há indicação da
quantidade destes, necessária para acelerar este processo. Ressalta-se que a ração
oferecida aos camundongos é um alimento padrão, utilizado em larga escala para ratos
e camundongos em diversos biotérios do país, não oferecendo desta forma riscos aos
camundongos.
b) Patógenos
Expor camundongos NOD a patógenos virais como o vírus da encefalomiocardite
ou o vírus da hepatite murino, assim como a bactérias (por exemplo, Streptococus ou
Mycobacterium) pode prevenir ou retardar o início do DM1 (52).
Os camundongos NOD, deste estudo, foram expostos a um ambiente que não
possui barreiras sanitárias ideais contra a entrada de patógenos. A literatura indica que
para que esses animais apresentem taxas elevadas de diabetes, devem ser
monitorados com dieta autoclavada, água clorada, uso de filtros (microisoladores) sobre
as gaiolas e monitorização da saúde dos animais (28,50,51).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
74
O ambiente convencional em que os camundongos NOD foram alocados possui
as seguintes normas de controle higiênico-sanitário: (I) ciclo de esterilização de
maravalha, gaiolas plásticas, tampas de gaiolas, bicos e “camas”, de 120°C durante 30
minutos; (II) ração autoclavada; (III) gaiolas submersas em solução de hipoclorito de
sódio diluída a 5%, por 24 horas, e após enxaguadas; (IV) solução de hipoclorito de
sódio também utilizada em estantes, paredes, pisos, portas, teto e pias; (V) funcionários
de uniforme.
Este biotério não possui filtros isoladores, mais uma ferramenta no controle de
patógenos. Também não é realizada análise microbiológica do micro-ambiente para
verificar a presença de algum patógeno que poderia estar influenciando os níveis de
incidência de diabetes neste estudo.
5.4 REPRODUÇÃO
De acordo com Leiter (51), os camundongos NOD são excelentes reprodutores,
produzindo grandes ninhadas com uma média de 11 camundongos por prole. Neste
estudo, verificou-se que os camundongos NOD tiveram em média ninhada de 8 a 9
filhotes, confirmando a alta reprodução, mesmo em biotério convencional. É importante
ressaltar que o stress de amamentar e de procriar aumenta a incidência de diabetes
nas fêmeas (51). Por esta razão, não incluímos nas análises as fêmeas em que foram
acasaladas.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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75
5.5 PESO E GLICEMIA
De acordo com a literatura, os camundongos machos pesam em torno de 40 a
60 gramas e as fêmeas entre 30 e 60g na vida adulta (3 a 12 meses de idade). No
entanto, o tamanho e o peso podem variar consideravelmente entre as linhagens (28).
Os camundongos NOD na vida adulta variaram de 28 a 33 gramas (Gráfico 01). Leiter
(51), afirma que quando os camundongos apresentam glicosúria e hiperglicemia
progressiva, ocorre polidipsia e poliúria, além da perda de peso.
A perda de peso é um fator que pode ser indicativo de saúde precária dos
animais, ou decorrente do procedimento experimental (28). Em nosso estudo, os
animais que não desenvolveram diabetes, apresentaram curva de peso normal para
idade e sexo. Houve perda de peso nos camundongos que se tornaram diabéticos, a
partir da 26ª semana acompanhamento. Quando os valores foram estratificados por
sexo, verificou-se que os machos perdem peso em torno da 28ª semana de vida,
enquanto as fêmeas na 26ª semana (Gráficos 01).
De acordo com o Laboratório Taconic – Figura 10 (64), no primeiro mês,
camundongos machos chegam a 22,5 + 2,5 gramas e as fêmeas com 18 + 2 gramas.
Os machos apresentaram, em média, 22,1 + 2,74 gramas e as fêmeas 18 + 2,0 gramas,
no primeiro mês (Anexo 3).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
76
Figura 10: Gráfico que demonstra o ganho de peso de camundongos NOD do
Laboratório Taconic (64).
A literatura indica que a glicemia dos camundongos NOD deve ser monitorada
apenas após a décima semana de vida (51). No entanto, como este trabalho se propõe
a caracterizar o modelo em biotério convencional, foram realizadas medidas de glicemia
após o desmame, por volta da terceira semana de vida. Foi considerado diabético o
camundongo que apresentasse glicemia maior que 250mg/dl, conforme Leiter (50) do
Laboratório Jackson (43).
O que vimos foi que, o diabetes iniciou nos camundongos NOD por volta da 16ª
semana de vida. Toyoda (76) relata que o início da doença em fêmeas ocorre antes que
os machos, iniciando entre a oitava e décima semana de idade. Um pouco depois é
mostrado no Laboratório Jackson (43) e em outras instituições, onde o início é por volta
da décima a décima segunda semana (64,65,66).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
77
5.6 PROPORÇÃO DE DIABETES EM BIOTÉRIO CONVENCIONAL
A literatura mundial indica que, quando os camundongos NOD são mantidos em
Biotério SPF, sua incidência de diabetes atinge níveis máximos possíveis (51), e que
quando são mantidos em ambiente convencional há uma diminuição drástica destes
valores (36,50,52,54,74). Leiter (51) relata que se em 30 semanas de idade, a
incidência de diabetes em camundongos machos for menor que 20% e nas fêmeas
menor que 60%, a presença de um patógeno ou outro agente imunomodulatório na
colônia é indicado.
A base para este efeito é incerta, mas tem-se sugerido que a ausência de
barreiras sanitárias reflete em um fino ajustamento do sistema imune que ocorre
durante a exposição a proteínas estranhas
e protege indivíduos de alergia,
autoimunidade, e outras doenças da desregulação imune (74).
O dimorfismo sexual na incidência do diabetes humano não é tão óbvia quanto
nos camundongos NOD. Todavia, no diabetes tipo 1, mulheres possuem risco
aumentado de outras doenças autoimunes, particularmente tireoidite. Assim, doenças
com suscetibilidade sexual, têm recebido atualmente atenção especial (76), da mesma
forma, os camundongos NOD também desenvolvem outras doenças auto-imunes (74).
Este estudo, que acompanhou em 32 semanas camundongos NOD em biotério
convencional, verificou que em 30 semanas 13% dos machos atingem o estado
diabético, enquanto 51% das fêmeas. Neste sentido, confirma-se o que o autor acima
descreve, que em condições não SPF, a incidência fica abaixo dos valores citados
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
78
anteriormente. Se observarmos o que Suzuki (77) comenta, transferir NOD machos de
biotério convencional para um biotério germ free, aumenta a incidência de 7 a 70% - O
biotério da CPEA chegou a 27% de diabetes nos machos em 40 semanas.
No entanto, se analisarmos os camundongos em 40 semanas de idades,
verificamos proporções maiores de camundongos diabéticos: 27% dos machos e 51%
das fêmeas. Desta forma, o número de camundongos machos aumenta, ao contrário
das fêmeas que continuam nas mesmas proporções. Indicando desta forma, que
mesmo em ambiente convencional, o biotério em que os camundongos NOD foram
alocados provavelmente possui pouca presença de patógenos.
Cabe ressaltar que no presente estudo, não forma incluídos os dados das
fêmeas que procriaram e amamentaram para não induzir o aumento na incidência de
diabetes. Isto foi feito com base na literatura, onde é citado que, a gestação e a
amamentação aceleram o desenvolvimento do diabetes nos camundongos NOD, sendo
uma forma de estresse para a fêmea. Entretanto, nenhum dos autores descreve a
retirada destes animais, nem mesmo Leiter (43). A inclusão destas fêmeas
provavelmente aumentaria a incidência de diabetes nesta casuística.
Há ainda, relato de baixa incidência de diabetes em camundongos NOD
mantidos em biotério SPF (< 10% nas fêmeas e 1% nos machos)(54).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
79
5.7 SOBREVIDA
Na maior parte das colônias mantidas em SPF, camundongos NOD diabéticos
sem tratamento irão sobreviver por 3 a 4 semanas, após a primeira detecção de
glicosúria. É muito difícil manter níveis séricos normais de glicose, com o tratamento de
insulina, embora o peso dos animais seja mantido e a expectativa de vida prolongada
(50,51). Os animais devem ser eutanaziados após o diagnóstico comprovado (51)
No nosso estudo, acompanhamos os camundongos durante 32 semanas, para
ver a sobrevida dos mesmos sem tratamento. Verificou-se que em 32 semanas, a
sobrevida dos camundongos NOD em ambiente convencional é de 60% (Gráfico 3).
Quando a sobrevida é comparada entre os dois sexos, é notado que há diferença
significativa: as fêmeas possuem taxas mais baixas de sobrevida (40%) quando
comparados com os machos (85%) (Gráfico 09). Este dado se deve, provavelmente, ao
fato das fêmeas tornarem-se diabéticas em maior número e intensidade (dados não
demonstrados) que os machos (óbito mais precoce e em maior número que os
camundongos machos).
Na análise com base no estado glicêmico (camundongos diabéticos e não
diabéticos), nota-se que não existe diferença significativa na mortalidade dos
camundongos; machos e fêmeas sobrevivem da mesma forma (este dado
provavelmente não demonstrou significância devido ao baixo número de camundongos
machos diabéticos).
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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80
A interpretação destes dados fica dificultada, visto que a literatura científica não
publica dados de sobrevida destes camundongos sem algum tipo de terapia, diabéticos
ou não.
5.8 TRANSPLANTE CUTÂNEO
A definição genética dos camundongos NOD é endocuuzada, ou inbread
(64)(65);
Inbred é a classificação dos camundongos que
exibem uma variação genética como resultado de
acasalamentos entre irmãos por pelo menos 20
gerações sucessivas ou o equivalente. O
cruzamento consangüíneo deve ser acompanhado
de rigorosa seleção para eliminar mutações
deletérias e anular a transmissão genética
pretendida. Vários métodos incluindo eletroforese,
marcadores sorológicos e enxertos de pele são
usados no monitoramento genético de linhagens
consangüíneas (28).
Neste estudo, optou-se pelo enxerto de pele a cada geração, para verificar o
status genético da linhagem. Todos os camundongos transplantados não rejeitaram o
enxerto, confirmando a isogenicidade da linhagem.
Faz-se necessário um acompanhamento contínuo desta linhagem neste
ambiente, analisando uma amostra de tamanho mais significativo. Assim, será possível
verificar se há uma modificação na incidência de diabetes conforme o número de
gerações.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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81
No entanto, os resultados deste estudo, já são suficientes para caracterizar
valores de referência, para futuros estudos envolvendo camundongos NOD em
ambiente convencional.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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82
CONCLUSÃO
Com base nos resultados encontrados no presente estudo é possível concluir
que:
Camundongos NOD atingem 40% de incidência de diabetes em 32 semanas de
acompanhamento, em ambiente convencional.
Camundongos NOD fêmeas possuem maior incidência de diabetes (51%) em
oito meses, comparado aos camundongos machos (27%) em ambiente convencional.
A sobrevida das fêmeas (40%) é menor do que os machos (85%), em 32
semanas de acompanhamento.
Quando ajustado para presença ou não de diabetes, verifica-se que machos e
fêmeas possuem taxas de sobrevida semelhantes.
Os camundongos NOD neste estudo confirmam isogenicidade da linhagem,
através da ausência de rejeição de enxertos cutâneos realizadados entre si.
Caracterização do Modelo Experimental NOD
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9. ANEXOS
Tabela 2: Peso (em gramas) dos camundongos NOD.
Mês Machos (n) Fêmeas (n) Total (n)
01 17,7 + 2,3 (79) 15,7+ 1,7 (58) 16,9 + 2,3 (137)
01 22,1 + 2,7 (79) 18,0+ 2,0 (58) 20,4 + 3,2 (137)
02 24,8 + 2,6 (79) 19,9 + 2,3 (58) 22,79 + 3,5 (137)
02 27,0 + 2,7 (72) 21,7+ 2,2 (51) 24,8 + 3,6 (123)
03 29,1+ 2,9 (72) 23,4 + 2,3 (51) 26,7+ 3,9 (123)
03 30,6 + 2,8 (72) 25,0 + 2,4 (51) 28,3 + 3,8 (123)
04 31,7 + 2,8 (62) 25,8 + 1,8 (51) 29,1 + 3,8 (113)
04 32,6 + 3,0 (52) 25,7 + 2,7 (44) 29,4 + 4,4 (96)
05 33,5 + 2,8 (52) 26,2 + 2,9 (43) 30,2 + 4,6 (95)
05 34,3 + 2,5 (47) 26,7 + 3,2 (37) 30,9 + 4,7 (84)
06 34,8 + 2,6 (41) 27,0 + 3,0 (33) 31,3 + 4,8 (74)
06 34,8 + 2,8 (25) 26,6 + 3,3 (23) 30,9 + 5,1 (48)
07 35,4 + 2,9 (22) 27,3 + 2,7 (21) 31,5 + 4,9 (43)
07 35,1 + 2,3 (19) 26,0 + 3,4 (15) 31,1 + 5,3 (34)
08 34,2 + 3,0 (19) 25,8 + 3,9 (15) 30,5 + 5,4 (34)
08 35,4 + 3,7 (19) 28,7 + 4,4 (11) 33,0 + 2,35 (30)
Tabela 3: Peso (em gramas) dos camundongos, de acordo com a presença ou não de
diabetes.
Mês Não Diabéticos (n) Diabéticos (n)
01 17,0 + 2,3 (114) 16,2 + 2,4 (23)
01 20,5 + 3,3 (114) 19,9 + 2,6 (23)
02 22,9 + 3,6 (114) 22,0 + 2,8 (23)
02 25,0 + 3,8 (100) 24,2 + 2,6 (23)
03 27,0 + 3,9 (100) 25,5 + 3,2 (23)
03 28,6 + 3,8 (100) 26,9 + 3,5 (23)
04 29,5 + 3,8 (90) 27,4 + 3,1 (23)
04 30,3 + 4,0 (74) 26,3 + 4,5 (22)
05 31,2 + 4,0 (74) 26,8 + 5,1 (21)
05 31,6 + 4,4 (68) 28,0 + 4,8 (16)
06 32,1 + 4,5 (60) 28,1 + 4,9 (14)
06 32,2 + 4,4 (34) 27,5 + 5,3 (14)
07 32,3 + 4,5 (32) 28,9 + 5,2 (11)
07 32,2 +4,3 (25) 28,0 + 7,0 (9)
08 31,9 + 4,2 (25) 26,5 + 6,6 (9)
08 34,1 + 3,9 (25) 27,2 + 7,1 (5)
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
92
Tabela 4: Peso (em gramas) dos camundongos
não diabéticos
e
diabéticos
de acordo
com sexo:
Não
diabéticos Diabéticos
Mês Machos (n) Fêmeas (n) Machos (n) Fêmeas (n)
01 17,7 + 2,3 (75) 15,6 + 1,5 (39) 17,5 + 3,3 (4) 16,0 + 2,2 (19)
01 22,1 + 2,7 (75) 17,5 + 1,8 (39) 23,9 + 2,0 (4) 19,1 + 1,9 (19)
02 24,8 + 2,7 (75) 19,3 + 2,0 (39) 25,6 + 1,1 (4) 21,2 + 2,4 (19)
02 27,0 + 2,7 (68) 20,8 + 1,7 (32) 28,2 + 1,1 (4) 23,3 + 2,0 (19)
03 28,9 + 2,9 (68) 22,7 + 2,2 (32) 30,4 + 2,7 (4) 24,5 + 2,3 (19)
03 30,6 + 2,8 (66) 24,5 + 2,1 (32) 31,9 + 2,3 (4) 25,8 + 2,7 (19)
04 31,6 + 2,9 (58) 25,6 + 1,8 (32) 32,9 + 2,1 (4) 26,2 + 1,8 (19)
04 32,5 + 3,1 (48) 26,3 + 2,0 (26) 33,0 + 1,5 (4) 24,9 + 3,4 (18)
05 33,5 + 2,8 (48) 26,9 + 1,9 (26) 34,0 + 3,2 (4) 25,1 + 3,8 (17)
05 34,3 + 2,6 (43) 27,0 + 3,0 (25) 34,2 + 0,9 (4) 25,9 + 3,7 (12)
06 34,9 + 2,7 (37) 27,5 + 2,5 (23) 34,0 + 1,0 (4) 25,7 + 3,7 (10)
06 35,0 + 2,9 (21) 27,8 + 2,4 (13) 33,9 + 2,4 (4) 24,9 + 3,6 (10)
07 35,4 + 3,1 (19) 27,9 + 2,1 (13) 35,7 + 1,3 (3) 26,3 + 3,4 (8)
07 34,9 + 2,4 (16) 27,4 + 1,8 (9) 36,0 + 1,9 (3) 23,9 + 4,3 (6)
08 34,5 + 2,5 (16) 27,1 + 1,2 (9) 32,1 + 5,1 (3) 23,8 + 5,6 (6)
08 36,5 + 2,4 (16) 29,8 + 1,5 (9) 29,6 + 4,9 (3) 23,5 + 10,6 (2)
Tabela 5: Glicemia (em mg/dl) dos Camundongos NOD.
Mês Machos (n) Fêmeas (n) Total (n)
01 88,0 + 10,8 (79) 83,8 + 7,9 (58) 86,2 + 9,9 (137)
01 92,4 + 10,1 (79) 86,9 + 8,1 (58) 90,0 + 9,7 (137)
02 94,0 + 14,8 (79) 88,7 + 9,7 (58) 91,7 + 13,1 (137)
02 92,3 + 8,2 (71) 93,9 + 31,1 (51) 93,0 + 21,0 (122)
03 93,9 + 8,3 (71) 101,4 + 48,9 (51) 97,0 + 32,3 (122)
03 93,2 + 11,2 (71) 114,1 + 74,9 (51) 101,9 + 50,0 (122)
04 92,7 + 11,5 (62) 143,16+ 127,8(50) 115,2 + 88,9 (112)
04 100,9 + 36,7 (52) 156,1 + 128,6 (44) 126,2 + 94,7 (96)
05 110,7 + 73,2 (52) 224,1 + 206,9 (43) 162,0 + 158,9 (95)
05 115,6 + 79,4 (47) 194,2 + 182,0 (37) 150,2 + 139,2 (84)
06 113,7 + 85,2 (41) 194,7 + 185,6 (33) 149,8 + 143,9 (74)
06 140,5 + 107,4 (25) 240,5 + 208,0(22) 187,3 + 168,3 (47)
07 126,3 + 85,4 (22) 241,1 + 219,3 (21) 182,4 + 173,0 (43)
07 143,4 + 110,1 (19) 274,1 + 226,7 (15) 201,0 + 181,0 (34)
08 169,0 + 155,2 (19) 289,7 + 239,1 (15) 222,2 + 181,0 (34)
08 169,7 + 153,1 (19) 193,45 +202,4(11) 178,4 + 169,8 (30)
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
93
Tabela 6: Glicemia (em mg/dl) de acordo com a presença ou não de diabetes.
Mês Não Diabéticos (n) Diabéticos (n) Total (n)
01 86,5 + 10,1 (115) 84,8 + 8,3 (22) 86,2 + 9,9 (137)
01 89,8 + 9,6 (115) 90,9 + 10,2 (22) 90,0 + 9,7 (137)
02 91,0 + 11,8 (115) 95,5 + 18,2 (22) 91,7 + 13,1 (137)
02 91,3 + 8,2 (100) 100,8 + 46,3 (22) 93,0 + 21,0 (122)
03 92,6 + 8,9 (100) 117,2 + 71,6 (22) 97,0 + 32,3 (122)
03 92,5 + 10,7 (100) 144,8 + 107,3 (22) 101,9 + 50,0 (122)
04 98,5 + 52,3 (89) 179,8 + 153,3 (23) 115,2 + 88,9 (112)
04 97,0 + 21,4 (74) 224,4 + 160,9 (22) 126,2 + 94,7 (96)
05 106,0 + 63,0 (74) 359,5 + 217,9 (16) 162,0 + 158,9 (95)
05 101,6 + 28,5 (68) 356,8 + 217,9 (16) 150,2 + 139,2 (84)
06 99,6 + 28,4 (60) 365,1 + 226,2 (14) 149,8 + 143,9 (74)
06 112,8 + 41,1 (34) 382,1 + 217,0 (13) 187,3 + 168,3 (47)
07 100,4 + 19,0 (32) 421,0 + 201,1 (11) 182,4 + 173,0 (43)
07 112,8 + 33,2 (25) 446,3 + 199,5 (9) 201,0 + 181,0 (34)
08 134,2 + 101,3 (25) 466,8 + 217,2 (9) 222,2 + 181,0 (34)
08 106,2+ 32,5 (25) 539,6 + 84,0 (5) 178,4 + 169,8 (30)
Tabela 07: Glicemia (em mg/dl) dos camundongos
não diabéticos
e
diabéticos,
de
acordo com sexo:
Mês Não diabéticos Diabéticos
Machos (n) Fêmeas (n) Machos (n) Fêmeas (n)
01 88,0+ 11,0(75) 83,4 + 7,5(39) 86,3 + 6,8 (4) 84,6 + 8,7 (19)
01 92,0+ 10,1(75) 85,7+ 6,9(39) 101,6+ 6,6(4) 89,21+ 9,8(19)
02 92,9+12,4 (75) 87,4+ 9,8(39) 120,6 + 40,2(4)
91,5 + 9,2(19)
02 92,3 + 8,2 (68) 89,1 + 8,0 (32) 93,3+ 11,0(4) 102,0+ 9,8(19)
03 93,7+ 8,4(68) 90,1+ 9,6(32) 96,67+ 6,6(4) 120,4+76,7(19)
03 92,7+ 10,0(32) 92,1+ 10,0(32) 105,3+4,5(4) 151,1+114,6(19)
04 91,6+9,4(58) 111,5+87,1(31) 108,7+25,3(4) 194,7+165,1(19)
04 96,7+15,8(48) 97,6+ 29,5(26) 151,7+123,5(4)
240,6+166,7(18)
05 100,4+23,6(48) 116,2+101,8(26)
234,2+245,5(4)
389,0+219,9(17)
05 103,9+33,4(43) 97,6+17,1(25) 241,2+240,9(4)
395,4+205,9(12)
06 98,5+33,1(37) 101,2+19,0(23) 253,7+234,0(4)
409,7+219,0(10)
06 119,1+50,2(21) 102,6+16,1(13) 252,7+235,6(4)
439,6+194,3(9)
07 108,0+14,7(19) 89,3+19,8(13) 242,6+226,3(4)
488,0+156,1(8)
07 120,5+38,0(16) 99,1+16,3(9) 265,6+267,8(3)
536,6+86,9(6)
08 150,1+124,5(16)
105,8+18,0(9) 269,6+287,1(3)
565,5+86,9(6)
08 108,0+37,6(16) 102,8+22,4(9) 498,6+88,6(3) 601,0 + 0,0(2)
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
94
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
95
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
96
Caracterização do Modelo Experimental NOD
Vanessa Ramos Kirsten
97
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