( PDF ) Caracterização das amostras clínicas de Cryptococcus neoformans isolados em Sergipe no período de 2001 a 2004

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ANTONIO MARCIO BARBOSA JUNIOR

CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS CLÍNICAS DE

Cryptococcus neoformans ISOLADOS EM SERGIPE

NO PERÍODO DE 2001 A 2004

São Cristóvão

Núcleo de Pós Graduação em Medicina – UFS

2005

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ANTONIO MARCIO BARBOSA JUNIOR

CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS CLÍNICAS DE

Cryptococcus neoformans ISOLADOS EM SERGIPE

NO PERÍODO DE 2001 A 2004

Dissertação apresentada à Coordenação do Curso

de Mestrado em Ciências da Saúde da

Universidade Federal de Sergipe, como requisito

para obtenção do titulo de Mestre em Ciências da

Saúde.

Área de Concentração: Microbiologia.

Orientadora: Prof. Dra. Rita de Cássia Trindade

ABRIL

2005

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iii

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

Barbosa Junior, Antonio Marcio.

B238c Caracterização das amostras clínicas de Cryptococcus neoformans isolados no

estado de Sergipe no período de 2001 a 2004 / Antonio Marcio Barbosa Junior –

São Cristóvão, 2005.

77 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Núcleo de Pós

Graduação em Medicina, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa,

Universidade Federal de Sergipe.

Orientadora: Prof. Drª Rita de Cássia Trindade.

1. Microbiologia médica. 2. Cryptococcus neoformans – Teste

de sensibilidade. 3. Epidemiologia - Meningite. 4. Saúde pública –

Sergipe. 5. Cryptococcus gattii. I. Título.

CDU 579.61:616-092(813.7)”2001/2004”

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE – UFS

NÚCLEO EM PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA - NPGMED

MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS CLÍNICAS DE

Cryptococcus neoformans ISOLADOS EM SERGIPE NO

PERÍODO DE 2001 A 2004

ANTONIO MARCIO BARBOSA JUNIOR

DISSERTAÇÃO DEFENDIDA EM ___ DE ___ DE 2005.

APROVADA PELA BANCA EXAMINADORA EM __/__/__/ NOTA _____

CONSTITUÍDA PELOS PROFESSORES:

______________________________________

Profa. Dra. Rita de Cássia Trindade

Departamento de Morfologia – Universidade Federal de Sergipe

_______________________________________________

Profa. Dra. Cláudia Maffei

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo

______________________________________

Prof Dr. Cristiano Barros de Melo

Departamento de Engenharia Agronômica – Universidade Federal de

Sergipe

Dedico este trabalho a Deus, a

minha família e todos aqueles que

me ajudaram e me deram força para

executa-lo.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Aos meus pais, Márcio e Cecília, por tudo aquilo que fizeram ao longo de todos

esses anos através da compreensão, carinho e na ajuda me mostrando um

futuro digno e sincero.

A Dângelly pela luta, carinho e no complemento para a construção da minha

vida.

À Professora Rita pela orientação, confiança e amizade colocada não somente

durante esse período, mas em toda a minha formação acadêmica e cientifica.

À Patrícia pelas sugestões, companheirismo e na aplicação nas minhas

conquistas cientificas.

À Fátima Travália sem a sua ajuda e apoio nada disso teria se construído,

muito obrigado.

À Márcia Lázera pelo auxilio e nas sugestões para a realização dessa obra

alem de ter aberto as portas do seu laboratório para um curto, porem grandioso

estágio.

A Eryca pelo apoio e auxilio ao longo desses anos.

Ao professor Cristiano pela participação nessa reta final e acima de tudo na

visão científica apresentada e nas grandes sugestões fundamentais

levantadas.

À atual equipe LMA, Diogo, Erick, Emerson, Euvaldo, Flávia, Reinalda, Camila

pelas conversas e sugestões recebidas.

vii

Aos velhos integrantes da equipe LMA, Michel, Celso, Éden, Mila, Meyline,

Talita pelas dicas e ajuda recebida.

Ao grande ”brother” Rodrigo Neomed pelo auxilio e apoio além das grandes

conversas realizadas nesse período.

Ao colega Francisco pelo apoio necessário na realização desse curso.

Aos meus colegas da pós-graduação Paula, Vaneska, Sergio, Alexsandro,

Mônica Paixão pela convivência e apoio recebido.

Ao professor Ângelo Antoniolli e Jéferson Costa por terem participado da minha

banca de exame de qualificação em que me indicaram varias sugestões que

em muito me fez pensar e escrever cientificamente.

Ao Instituto Parreiras Horta por ter cedido, gentilmente, as amostras para

elaboração dessa obra.

Ao Laboratório de Microbiologia Aplicada pela aplicação, execução e apoio

irrestrito recebido ao longo desses anos.

Ao Laboratório de Micologia Ambiental do IPEC, em especial para Gláucia e

Berna pela orientação e execução no estagio no Rio de Janeiro.

À professora Cida da UFMG pelas dicas recebidas na execução dessa

dissertação.

Ao Núcleo de Medicina pela oportunidade recebida.

Á CAPES pela concessão da bolsa de pesquisa em mestrado.

Aos funcionários, professores e colegas da Universidade Federal de Sergipe

pelo convívio durante esses anos.

viii

SUMÁRIO

PREFÁCIO _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ xi

RESUMO GERAL _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ xiii

ABSTRACT_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ xiv

1. CAPÍTULO 1 -Introdução, revisão de literatura, objetivos e referencias

bibliográficas_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 1

2. CAPÍTULO 2 – Determinação das variedades de Cryptococcus neoformans

no Estado de Sergipe_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 27

3. CAPÍTULO 3 - Teste de sensibilidade de amostras clínicas de Cryptococcus

neoformans isolados do líquido cefalorraquidiano a antifúngicos _ _ _ _ 43

4. CAPÍTULO 4 - Identificação do mating type de isolados clínicos de

Cryptococcus neoformans, pela reação em cadeia da polimerase – PCR _ _ _ _

_ __ _ 62

5. CAPÍTULO 5 - Discussão inter-relacionada e perspectivas futuras _ _ 75

6. CAPÍTULO 6 - Conclusões gerais_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 77

7. CAPÍTULO 7 – Referências bibliográfica geral _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 79

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Identificação das variedades, soropositividade para HIV das

amostras de Cryptococcus neoformans, isolados clínicos do Estado de Sergipe

no período de 2001 a 2004. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 34

TABELA 2 – Valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos antifúngicos

testados frente aos isolados clínicos de Cryptococcus neoformans no Estado

de Sergipe _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 49

LISTA DE FIGURA

FIGURA 1 – Resultado da PCR para detecção do estágio sexual de

Cryptococcus neoformans isolados clínicos em Sergipe no período de 2001 a

2004, amostras de 1 a 9. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 68

FIGURA 2 – Resultado da PCR para detecção do estágio sexual de

Cryptococcus neoformans isolados clínicos em Sergipe no período de 2001 a

2004, amostras 10 a 13 alem dos padrões. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 69

LISTA DE SIGLAS

5-FC – 5-Fluorocitosina

AM – Anfotericina B

ATCC – American Type Collection

Culture

C – Carbono

CDTB – Creatinina Dextrose Timina de

Azul de Bromotimol

CET – Cetoconazol

CGB – Canavanina Glicina de Azul de

Bromotimol

CIM – Concentração Inibitória Mínima

DMSO – Dimetilsulfóxido

DNA – Acido Desoxiribonucléico

EDTA – Ethylenediaminetetraacetic

acid.

FLU – Fluconazol

HART – High HIV/Aids Response

Team

HIV – Vírus da Imunodeficiência

Humana

IGS – Seqüências dos Espaçadores

Intergênicos

ITR – Itraconazol

LCR – Liquido Cefaloraquidiano

MAT – Mating type

MIC – Minimum Inhibitory

Concentration

MIZ – Miconazol

MOPS – Acido

Morfolinepropanesulfônico

N – Nitrogênio

NCCLS – National Committee For

Clinical Laboratory Standard

PCR – Reação em Cadeia da

Polimerase

R – Resistência

RAPD – Random Amplification of

Polymorphic DNA

RFLP – Restriction Fragment Length

Polymorphism

RPMI – Roswell Park Memorial

Institute.

S – Sensibilidade

SDD – Sensibilidade Dose

Dependente

SDS – Dodecilsulfato de sódio.

SIDA – Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida

SNC – Sistema Nervoso Central

TER – Terbinafrina

UFC – Unidades Formadoras de

Colônias

YM Agar – Yeast Modified Agar

PREFÁCIO

CAPÍTULO 1 -Introdução, revisão de literatura, objetivos e referências

bibliográficas.

Neste capitulo foi realizada uma introdução geral sobre o tema proposto

finalizando com a justifica para a realização dessa dissertação. Logo em

seguida, foi realizada uma revisão da literatura com alguns tópicos: taxonomia,

aspecto clinico, variedades do microrganismo, características bioquímicas,

fisiológicas e fatores de virulência, características epidemiológicas, ecológicas,

mating type e sensibilidade aos antifúngicos. E por fim, foram apresentados os

objetivos dessa dissertação de mestrado.

CAPÍTULO 2 - Determinação das variedades de Cryptococcus neoformans no

Estado de Sergipe.

Foi estudada a ocorrência das variedades de Cryptococcus neoformans

isolados clínicos mais freqüentes em Sergipe no período estudado

correlacionando com outros estados e paises.

Este capítulo, assim como os dois seguintes, foram elaborados em

forma de artigo. Esse modelo foi composto por uma breve introdução, materiais

e o método trabalhado, os resultados e discussão (quadros, tabelas e figuras

foram inseridos no texto) e por fim as conclusões. Vale ressaltar que cada

referencia bibliográfica correspondente foi colocada no final de cada capitulo.

CAPÍTULO 3 - Teste de sensibilidade de amostras clínicas de Cryptococcus

neoformans isolados do líquido cefalorraquidiano a antifúngicos.

Neste capitulo foram determinadas às concentrações inibitórias mínimas

frente aos antifúngicos estudados baseados no documento M-27 da NCCLS.

Onde foi discutido o comportamento dos microrganismos no perfil de

xii

sensibilidade, como mérito de informação, esse experimento seguindo as

recomendações padronizadas foi o primeiro realizado em Sergipe.

CAPÍTULO 4 - Identificação do mating type de isolados clínicos de

Cryptococcus neoformans, pela reação em cadeia da polimerase – PCR

Foi identificado e analisado o tipo sexual ou mating type sexual dos

isolados clínicos de Cryptococcus neoformans em Sergipe. Usou-se a reação

em cadeia da polimerase com primers específicos após utilização de técnicas

para extração de DNA de leveduras modificada para a levedura em questão.

Poucos trabalhos são citados para a analise do mating type sexual de

Cryptococcus neoformans o que torna esses resultados de fundamental

importância na literatura.

CAPÍTULO 5 - Discussão inter-relacionada e perspectivas futuras

Neste capitulo foi colocado uma síntese correlacionando os resultados

obtidos nos capítulos 2, 3 e 4. Apresentando de forma integrada as

informações obtidas.

CAPÍTULO 6 - Conclusões gerais

E por fim foram colocadas as conclusões gerais obtidas após as

analises experimentais respondendo assim o que foi proposto nos objetivos.

CAPÍTULO 7 – Referências bibliográficas geral

Nesse capítulo são apresentadas as referências bibliográficas da

dissertação de mestrado.

xiii

RESUMO GERAL

Cryptococcus neoformans é um fungo oportunista que desencadeia meningite

tanto em pacientes imunocompetentes como em pacientes hígidos Este

trabalho teve como objetivo estudar as variedades (neoformans e gattii) de

Cryptococcus neoformans isolados no Estado de Sergipe a partir do LCR de

pacientes com meningite infecciosa. Também teve como objetivo determinar a

sensibilidade de C. neoformans variedade neoformans e variedade gattii,

isolados do líquor de pacientes com meningite infecciosa no Estado de

Sergipe, através do método de microdiluição (NCCLS) e determinar o mating

type de isolados clínicos de Cryptococcus neoformans através da Reação em

Cadeia da DNA Polimerase em Sergipe. Foram utilizadas amostras do LCR

que deram entrada no IPH/LACEN/SE no período de 2001 a 2004. Foi

realizada microscopia direta através da coloração com Tinta Nanquim. Uma

alíquota do líquor foi transferida para tubos contendo Agar Sabouraud com

clorafenicol e incubado em temperatura ambiente 25ºC e a 37ºC.Foram

realizadas provas para identificação presuntiva, fenotípica em meio Níger e das

variedades em meio CGB. No período analisado, apenas uma amostra

apresentou características fenotípicas em meio Níger diferenciada das outras.

Do total de 15 amostras analisadas em meio CGB, 02 amostras (13,33%) se

apresentaram positiva, ou seja, foram identificadas como variedade gattii,

sendo uma delas isolada de paciente soronegativo para HIV (paciente não

aidético). As outras 13 amostras (86,67%) apresentaram CGB negativo, ou

seja, foram identificadas como variedade neoformans. A maioria das amostras

de Cryptococcus neoformans isolados do líquor de pacientes com meningite

infecciosa são da variedade neoformans em Sergipe. Para a realização do

teste de sensibilidade foram utilizadas duas amostras de C. neoformans

variedade gattii e 11 de C. neoformans variedade neoformans listadas acima.

Para controle dos testes foi utilizada a cepa padrão ATCC 32608. Em seguida

foi realizada a preparação do inóculo. Foram utilizados os seguintes

antifúngicos: Anfotericina B, Fluconazol, Cetoconazol, Miconazol, Itraconazol,

5- Fluorocitosina e Terbinafrina. A suspensão fúngica foi ajustada numa

concentração final de 0,5x10³ para 2,5x10³ UFC no meio RPMI. O experimento

foi realizado em placas de microtitulação. Após a inoculação, as placas de

microdiluição foram incubadas a 37ºC e lida em 24, 48 e 72 horas. O ponto

final da CIM foi determinado nas leituras de 48 e 72 horas. Os isolados clínicos

de C. neoformans apresentaram valores altos de CIM para os agentes

antifúngicos testados, o que simboliza uma alta taxa de resistência

principalmente a Anfotericina B e ao Fluconazol, dado que pode ser

correlacionado com os dados clínicos. Para análise do mating type sexual

foram utilizadas 13 amostras de C. neoformans a partir do líquor de pacientes

com meningite infecciosa em Sergipe durante o período de 2001 e 2004. Os

procedimentos laboratoriais relacionados à biologia molecular seguiram como

referência Chatuverdi et al. (2000). Todas as amostras de C. neoformans tanto

aquelas pertencentes à variedade neoformans como gattii são matting type a,

considerado de maior virulência.

Palavras – chaves: Cryptococcus neoformans; Cryptococcus gattii; teste de

sensibilidade; variedades; tipo sexual; epidemiologia; saúde publica.

xiv

ABSTRACT

Cryptococcus neoformans is one yeast opportunist that it unchains meningitis in

imunocompetentes patients in such a way as in patients This work had as

objective to study the varieties (neoformans and gattii) of isolated C.neoformans

in the State of Sergipe from the liquor liquid of patients with infectious miningitis.

Also had as objective to determine the sensitivity of C. neoformans variety

neoformans and variety gattii, isolated of the líquor of patients with infectious

meningite in the State of Sergipe, through the microdilution method (NCCLS)

and to determine the sexual type - mating type of isolated physicians of

Cryptococcus neoformans through the Reaction in Chain of DNA Polimerase

(PCR) in Sergipe. Samples of the LCR had been used that had given entered in

the IPH/LACEN/SE in the period of 2001 the 2004. Direct microscopy through

the coloration with Nanquim Ink was carried through. An aliquot one of the

líquor (0,1mL) was transferred to pipes contends Agar Sabouraud with

clorafenicol and incubado in ambient temperature 25ºC and 37ºC. Tests for

presumptive, fenotípica identification had been carried through in half Níger and

of the varieties in half CGB. In the analyzed period, only one sample presented

fenotípicas characteristics in half Níger differentiated of the others. Of the total

of 15 samples analyzed in half CGB, 02 samples (13,33%) if had presented

positive, or either, had been identified as variety gattii, being one of them

isolated one of soronegativo patient for HIV (patient not aidético). The others 13

samples (86,67%) had presented negative CGB, or either, they had been

identified as variety neoformans. The majority of the isolated samples of

Cryptococcus neoformans of the líquor of patients with infectious meningite is of

the variety neoformans in Sergipe. For the accomplishment of the sensitivity

test variety had been used two samples of C. neoformans var. gattii and 11 of

C. neoformans listed variety neoformans above. For control of the tests

standard ATCC 32608 was used. After that suspension of fúngicas cells. The

following antifungal had been used: Anphotericin B, Fluconazol, Cetoconazol,

Miconazol, Itraconazol, 5- Fluorocitosina and Terbinafrina. The fungal

suspension was adjusted in a final concentration of 0,5x10³ for 2,5x10³ UFC in

the half RPMI. The experiment was carried through in microtitulação plates.

After the inoculation, the microdilution plates had been incubadas 37ºC and

deal in 24, 48 and 72 hours. The end point of the CIM was determined in the

readings of 48 and 72 hours. The isolated physicians of C. neoformans had

presented high values of CIM for the antifungal agents tested, what he mainly

symbolizes one high tax of resistance Anfotericina B and to the Fluconazol,

given that he can be correlated with the clinical data. For analysis of mating

type sexual of C. neoformans from the líquor of patients with infectious

meningite in Sergipe during the period of 2001 and 2004 had been used 13

samples. The related laboratoriais procedures to molecular biology (extration of

DNA and accomplishment of the PCR) had followed as Chatuverdi reference et

al. (2000). All the samples of C.neoformans tested, as much that pertaining to

the variety neoformans as gattii are matting type, considered of bigger

virulence.

Keys-words: Cryptococcus neoformans; Cryptococcus gattii; sensitivity test;

varieties; sexual type; epidemiology; health publishes

CAPÍTULO 01

1 INTRODUÇÃO

O Reino Fungi é extremamente diversificado e estima-se que existem

mais de 100.000 espécies de fungos descritas. Destas, cerca de 150 espécies

são reconhecidas como patógenos humanos e veterinários (KWON-CHUNG;

BENNETT, 1992). Dados mais recentes mostraram que estes números são

ainda mais expressivos, 200.000 espécies de fungos identificados e

caracterizados estando aproximadamente 200 espécies associadas às

infecções (SIDRIN; MOREIRA, 1999).

Os fungos são decompositores de organismos mortos e/ou seus

produtos (sapróbios ou saprótropos), além disto parasitam seres vivos e

apresentam como característica a ausência de clorofila (ARENAS, 1994).

Podem ser encontrados em vários habitats, tendo uma distribuição ubiquitária

na natureza, onde elaboram processos de síntese e decomposição (MIDGLEY

et al., 1996). As espécies sapróbias são bem adaptadas às diversas condições

ambientais, e, em alguns casos, podem ser encontrados em ambientes com

pouca exigência nutricional.

Dentre as espécies de fungos que se relacionam com os seres vivos

podem ser identificados alguns patógenos que apresentam invasidade e

multiplicação em tecidos nos hospedeiros e podem ser integrantes da

microbiota normal deste hospedeiro (SEVERO; LONDERO, 1996).

Os fungos patogênicos causam inúmeras doenças de localização:

superficial, cutânea, subcutânea ou sistêmica, com caráter oportunista ou

causando patogenia em hospedeiro hígido (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).

A freqüência de patogenia por esses microrganismos pode ser favorecida na

presença de fatores predisponentes (como por exemplo: Síndrome da

imunodeficiência adquirida (SIDA), diabetes, uso de corticóides, leucemias,

tumores, antibioticoterapia etc) que colaboram com alteração do mecanismo de

defesa do hospedeiro. Porém, somente a existência destes fatores não

determina necessariamente um aumento na freqüência de infecção, pois esta

depende da exposição ao agente infectante (MIDGLEY et al., 1996).

Durante o processo de invasão no hospedeiro humano, os fungos

patógenos elaboram diversos produtos de expressão para escape dos

mecanismos de defesa do hospedeiro como: produção de cápsulas

polissacarídeas ou mucopolissacarídeas, elaboração de produtos na parede

celular, síntese de melanina etc, contribuindo assim para sua multiplicação nos

tecidos (MIDGLEY et al., 1996). Esses processos invasivos tornam-se mais

eficazes quando relacionados a indivíduos imunocomprometidos,

caracterizando uma infecção oportunista. Os fungos “oportunistas” têm tido

destaque em estudos biomédicos devido a crescente freqüência nos últimos

anos, tanto no Brasil como no mundo.

Nesse universo insere-se a criptococose, micose oportunista causada

pelo Cryptococcus neoformans (Sanfelice) Vuillemin, 1901 e suas variedades

gattii e neoformans. As variedades da espécie C. neoformans apresentam

características muito distintas entre si (fisiológicas, bioquímicas,

epidemiológicas, genéticas, ecológicas, espectro clinico e patogenicidade) e

isso suscitou o interesse na realização do presente trabalho, que busca

aprofundar o conhecimento acerca de C. neoformans em Sergipe pela

caracterização de algumas amostras clínicas e assim disponibilizar dados para

a Rede Nacional de Criptococcias, além de fornecer informações sobre a

meningite criptocócicas, patogenia que ocorre de forma oportunista e/ou

endêmica na Região Nordeste do Brasil.

Esta dissertação está estruturada seguindo o modelo de artigos

(capítulos) sendo iniciada por uma introdução e revisão de literatura sobre o

tema seguindo pelos objetivos (geral e específicos). Cada objetivo específico

originou um artigo, o qual foi elaborado no seguinte modelo: título do artigo,

resumo, introdução, objetivo, materiais e métodos, resultados e discussão,

conclusões e referências bibliográficas. Tal estruturação foi padrão para os três

artigos. Na seqüência foi elaborado o tópico: resultados e discussão geral, no

qual foi possível relacionar os dados obtidos nos três artigos. E por fim uma

conclusão geral e as referências bibliográficas referentes aos tópicos:

introdução e revisão de literatura.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Taxonomia

São descritas 19 espécies de Cryptococcus. É sabido que o

Cryptococcus neoformans é essencialmente um agente infectante, porém

infecções causadas por outras espécies, como Cryptococcus albidus e

Cryptococcus laurentii, ocorrem em casos raríssimos (HOROWITZ et al., 1993).

A espécie está inserida no Reino Funghi;

Filo Basidiomycota;

Ordem Filobasidiales;

Familia Filobasidiacea;

Gênero Filobasidiella.

Dividindo-se em duas fases distintas, baseadas em diferenças nas

estruturas reprodutivas, em fase teleomorfica correpondente à Filobasidiella

neoformans relacionada a variedade neoformans e Filobasidiella neoformans

correspondente a variedade bacillispora. E na fase anamorfica, definido em

Cryptococcus neoformans variedade neoformans e Cryptococcus neoformans

variedade gattii, respectivamente (CASADEVALL; PERFECT, 1998).

Sua inserção na família Filobasidiacea se deve a semelhanças na

composição de ácidos graxos e características fenotípicas entre os gêneros

Cryptococcus e Tremella (SMITH et al., 1988, WICLES et al., 1996). A

aproximação taxonômica entre os gêneros Filobasidiella e Tremellaceae foi

confirmada através do seqüênciamento dos genes do RNA ribossômico 16 S –

like, 26 S e 5 S por CASADEVALL; Perfect (1998 b). Na fase leveduriforme

(fase anamórfica), apresentam morfologia esférica de 3 a 8µm de diâmetro com

presença de cápsula mucopolissacarídea espessa (1a 30µm), essa estrutura

está relacionada com a invasidade e patogenicidade do fungo (BATISTA;

SILVA, 1996).

2.2 Aspecto clínico

O Cryptococcus neoformans é o agente etiológico da criptococose,

doença crônica ou subaguda, ocasionando manifestações cutâneas e/ou

principalmente meningoencefalites (ZAITS et al., 1998).

A infecção tem seu inicio com a inalação de propágulos que se

depositam nos pulmões. Para se ter uma efetiva penetração, as partículas

devem ter menos de 2µm de diâmetro, tamanho inferior ao das células

leveduriformes do Cryptococcus neoformans. Uma vez que os basidiósporos

de Filobasidella neoformans apresentam de 1,8 a 2µm de tamanho, estão

presentes em hifas aéreas e aerolizadas, e são mais resistentes à dissecação

do que as células leveduriformes, acredita-se que os basidiósporos (fase

teleomorfa) são mais infectantes do que as células leveduriformes (fase

anamorfa) (WICLES et al., 1996).

Provavelmente um grande número de pessoas inala os basidiósporos,

mas apenas uma pequena parte da população que os inalam desenvolve a

doença, isso se explica pela ocorrência de uma imunidade celular íntegra que

promovem uma eficiente barreira imunológica contra a colonização de

Cryptococcus neoformans (CASADEVALLL, 1994; MITCHEL et al., 1995).

Quase todas as áreas do organismo do hospedeiro podem ser atingidas,

porém, os principais sítios são: pulmão, sistema nervoso central (SNC), pele,

próstata e olhos (MITCHELL; PERFECT, 1995). No pulmão se apresenta nas

seguintes formas: primaria e/ou regressiva – assintomáticos ou subagudos;

progressiva – assintomáticos ou invasivo (como uma infecção leve ou aguda) e

disseminada – acometimento de qualquer órgão, lesão cutânea e lesão no

SNC (LONDERO, GONÇALVEZ, 1988).

A pneumonia criptocócica reflete uma infecção primaria, podendo

regredir ou apresentar forma sub-clínica com cura sem tratamento. Já a

meningoencefalite é resultante de uma disseminação secundária, sendo

considerada a manifestação clinica mais comum da criptococose. Na maioria

dos casos apresenta sinais e sintomas como vomito, febre, distúrbio visuais,

coma, perda de memória e alteração de comportamento (RIPPON, 1988;

MITCHEL; PERFECT, 1995).

Sinais específicos de infecção meníngea como rigidez da nuca, sinais

meníngeos, raramente estão presentes na criptococose, por isso, a punção

liquórica torna-se obrigatória em doentes com criptococose (COLLIER et al.,

1998).

A doença é sempre grave principalmente com tendência à disseminação

para o sistema nervoso central (SNC), sítio pelo qual o agente etiológico

apresenta tropismo. Assim, o acometimento do SNC é o quadro clinico mais

comum da doença, representando de 70 a 90% dos casos de criptococose

(KWON-CHUNG; BENNETT, 1992; MITCHELL et al., 1995). O neurotropismo é

aspecto essencial na patogênese uma vez que a mortalidade decorrente da

criptococose está relacionada com a presença de meningoencefalite

(CASADEVALL, 1994).

Esse neurotropismo pode estar associado na presença de substancias

que servem de substratos para a fenoloxidase como a epinefrina,

noraepinefrina e dopamina essenciais para a atividade cerebral existente em

todo o sistema nervoso central (JACOBSON; EMERY, 1991).

Lesões hematogênicas na pele ocorrem em aproximadamente 10% dos

pacientes com criptococose, principalmente em imunodeprimidos (MITCHEL;

PERFECT, 1995). Uma vez que estes apresentam uma infecção diferente e

mais rápido que os pacientes imunocompetentes (COLLIER et al., 1998).

2.3 Variedades

Similaridades bioquímicas, morfológicas, epidemiológicas e genéticas

levam Cryptococcus neoformans ao agrupamento em quatro sorotipos e dois

sorogrupos – A e D (variedade neoformans) e B e C (variedade gattii) (KWON-

CHUNG; BENNETT, 1992 e MITCHELL et al., 1995). A taxa de reassociação

DNA – DNA observada entre as duas variedades sugere a sua divergência

gênica, indicando a ocorrência de espécies distintas e diferenciadas (AULAKH

et al., 1981).

Segundo Kwon-Chung; Bennett (1992) Cryptococcus neoformans

apresenta diferenças sorológicas, sendo identificados os sorotipos A, B, C, D e

AD. Estes sorotipos identificados se diferenciam através da composição

antigênica da cápsula do Cryptococcus neoformans visualizado através da

técnica de aglutinação em lamina utilizando kits especiais – Cryptocchek

(MITCHELL; PERFECT, 1995).

Kwon-Chung (1984) citou que as duas variedades da espécie

apresentaram características metabólicas, fisiológicas e epidemiológicas

diferenciadas. A variedade gattii foi proposta em 1970 com base na morfologia

atípica de um isolado de Cryptococcus neoformans isolado a partir de liquido

cefalorraquidiano de um menino africano com meningite (CASADEVALL;

PERFECT, 1998).

Uma das formas de diferenciação das variedades é através de cultivo

em meios sólidos específicos como o meio Agar canavanina – glicina – azul de

bromotimol (CGB) e o meio creatinina – dextrose – azul de bromotimol – timina

(CDTB) (IROKANULO et al., 1995; KWON-CHUNG et al., 1982).

A capacidade de degradação da glicina em meio CGB pode ser utilizada

para diferenciar a variedade gatti, sendo verificada através da mudança da cor

do meio CGB de verde para azul, resultado da reação de alcalinização pela

produção de amônio (KWON-CHUNG; BENNETT, 1984, 1992). Por outro lado,

na variedade neoformans não ocorre esta alcalinização do meio CGB, pois esta

variedade não assimila glicina e é sensível a canavanina indicando resultado

negativo. Raros isolados desta variedade, classificados como sorotipo A,

podem assimilar a glicina, porém, são sensíveis à canavanina o que impede o

seu crescimento (KWON-CHUNG; BENNETT, 1984, 1992).

A D-prolina é utilizada pela variedade gattii como fonte de nitrogênio (N),

mas não o é pela variedade neoformans, este teste é sugerido quando há

existência de resultados duvidosos, mas mesmo assim o meio CGB continua

sendo a primeira e principal opção para o estudo das variedades (DUFAIT,

1987; NISHIKAWA, 1996).

2.4 Características bioquímicas, fisiológicas e fatores de virulência.

As leveduras do gênero Cryptococcus neoformans são aeróbios,

apresentam assimilação de galactose, glicose, maltose e sacarose, mas, não

assimilam nitrato (fonte de N) nem lactose (fonte de carbono - C); outra

característica é a habilidade de crescimento à 37ºC (termotolerância) e

patogenicidade para camundongo. Sintetizam fenoloxidase (presença de uma

lacase) além da enzima urease em meios especiais, são sensíveis a

ciclohexamida, hidrolisam peptona, uréia e creatinina e não reduzem o nitrato

(KWON-CHUNG; BENNETT, 1992; MITCHELL; PERFECT, 1995).

Cryptococcus neoformans é a única espécie do gênero Cryptococcus

que produz melanina quando cultivada em meios contendo compostos

fenólicos. A fenoloxidase presente realiza a hidroxilação do fenol gerando

polimerização e produção de pigmento marrom – característica da melanina. A

melanina tem a capacidade neutralizante contra ação dos agentes oxidantes

naturais produzidos pelos seres vivos como óxido nítrico, superóxido etc

(JACOBSON; EMERY, 1991).

Essa atividade bioquímica é importante na identificação de Cryptococcus

neoformans principalmente quando se utiliza meio de cultura suplementado

com sementes de níger (Guizotia abyssinica) e com concentração de glicose

inferior a 0,1% (KWON-CHUNG; BENNETT; 1992; KWON-CHUNG; RHODES,

1986).

Cryptococcus neoformans apresenta vários fatores de virulência, como

cápsulas mucopolissacarídea, sintentização de melanina, termotolerância a

37ºC, além de produzir efeitos tóxicos aos hospedeiros, como a produção de

proteases e manitol (KOZEL, 1995).

Os genes responsáveis pela produção da cápsula forma identificados

como CAP 59, CAP 64 e CAP 60. A deleção desses genes produz cepas

acapsuladas e sem virulência expressa (CHANG; KWON-CHUNG, 1988).

A presença do mucopolissacarídeo capsular associada à produção da

enzima fenoloxidase – responsável pela conversão de hidrobenzóicos em

melanina, e a capacidade de crescimento em 37ºC são importantes fatores

envolvidos na virulência de Cryptococcus neoformans (CASADEVALLL, 1994;

MITCHEL et al., 1995).

2.5 Características epidemiológicas

A variedade gattii comporta-se como patógeno primário enquanto que a

variedade neoformans, como patógeno oportunista (KWON-CHUNG;

BENNETT, 1992).

Entre os isolados da variedade neoformans o sorotipo A tem prevalência

mundial, já o sorotipo D tem maior ocorrência na Europa ocidental (KWON-

CHUNG; BENNETT, 1992; DROMER et al., 1999).

Sorrel et al (1996) classificaram o sorotipo híbrido AD como variedade

neoformans, isso se deve ao resultado cruzado que acontece na técnica de

aglutinação em lâmina (CryptoCheck). Já Franzot et al. (1999) sugeriram que o

sorotipo A seja classificado como uma nova variedade grubbii devido as suas

diferenças clínicas, epidemiológicas, moleculares e biológicas.

Com relação à variedade gattii, o sorotipo B é mais prevalente que o

sorotipo C, este é mais freqüente no sul da Califórnia, nos Estados Unidos

(KWON-CHUNG; BENETT, 1992).

Boekhout et al (1999) sugeriram que os quatros sorotipos de

Cryptococcus neoformans representam linhagens genéticas distintas,

identificadas pelas seqüências dos espaçadores intergênicos (IGS) do DNA

ribossômico.

A criptococose não é doença de notificação compulsória, portanto não é

possível estabelecer a sua prevalência real tanto no mundo como no Brasil

(CASADEVALL, 1994; MINISTERIO DA SAÚDE, 2000). O Cryptococcus

neoformans é capaz de causar doença em hospedeiro imunocompetente,

porém esta não é uma ocorrência comum sendo bem mais freqüente em

pacientes imunosuprimidos e/ou imunodeprimidos (CASADEVALL, 1994;

LEVITZ, 1991; MITCHEL et al., 1995).

Nos casos de pacientes soropositivo para HIV – pacientes com SIDA, a

meningite criptocócica é, entre as infecções micóticas, aquela responsável

pelas maiores taxas de mortalidade (MITCHELL et al., 1995).

Estima-se que de cinco a 13% dos pacientes com SIDA desenvolvem a

criptococose (CASADEVALL, 1994). Já no Brasil, entre 1980 e 1999, 4,5% das

infecções oportunistas associadas à SIDA foram causadas pelo Cryptococcus

neoformans (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1999).

Dados do MINISTÉRIO DA SAÚDE (1999) mostraram que em pacientes

maiores de 12 anos acometidos por doenças associadas à SIDA foi verificado

um aumento expressivo nos casos notificados de criptococose. No período de

1980/84, 15 casos, de 1985/87, 297 e 1988/99, 6601, totalizando 6913 casos

no período de 1980 a 1999.

Já em pacientes menores de 13 anos com SIDA foram notificados, pelo

Ministério da Saúde, um (01) caso entre os anos de 1983 a 1984 e oito (08) no

período de 1985/87. De 1983 a 1999 foram constatados 53 casos, totalizando

no período de 1983 a 1999, 62 registros (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1999).

A ocorrência da criptococose em pacientes com SIDA no oeste europeu

representa 3 a 6% dos casos relatados (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992). Já

na África Sub-saariana esse número sobe para 15 a 20% dos casos notificados

(COLLIER et al., 1998).

A freqüência de casos de meningite criptocócica causada pela variedade

neoformans associada a pacientes imunocompetentes é mais expressiva

mesmo em áreas geográficas endêmicas para a variedade gattii. Embora

ocorram casos raros de pacientes com SIDA infectados pela variedade gattii

(LEVITZ, 1991; KWON-CHUNG; BENNETT, 1992; ROSEMBAUM et al., 1992;

1994;OLIVARES, 1997; FILIU, 2000).

Não há diferenças significativas na ocorrência com relação a raça e

ocupação. Têm sido relatados casos clínicos em todas as faixas de idade,

sendo mais raro em crianças. O sexo masculino e a faixa adulta (20 a 59 anos)

fornecem os números mais elevados da criptococose. Isto se deve

principalmente à exposição mais freqüente aos propágulos e ás diferenças

hormonais (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992; RIPPON, 1988).

Recentemente, o método de tipagem molecular tem sido aplicado para o

estudo da epidemiologia das infecções fúngicas, principalmente aquelas

causadas por espécies do gênero Candida e, em menor extensão, por

Cryptococcus neoformans e outros fungos patogênicos (PFALLER et al., 1995).

A importância no uso destas técnicas é que permitem estabelecer se os

isolados compartilham ou não o mesmo perfil e/ou padrão de DNA (PFALLER

et al., 1995). Desse modo pode-se detectar a ocorrência de microepidemias,

casos de recidivas ou reinfecção, surgimentos de novas linhagens ou

persistência de resistência (PFALLER et al., 1992).

Com relação ao Cryptococcus neoformans têm sido empregadas as

seguintes técnicas: análise de fragmentos por enzimas de restrição (Restriction

Fragment Length Polymorphism – RFLP), análise eletroforética do cariótipo,

seqüenciamento de DNA e a PCR utilizando-se primers específicos ou

aleatórios (Random amplification of polymorphic DNA – RAPD). Tais

procedimentos têm evidenciado a grande heterogeneidade genética entre

isolados clínicos e isolados ambientais (DROMER et al., 1999; VARMA et al.,

1995; PERFECT et al., 1993; CASADEVALL, 1992; YAMAMOTO et al., 1995).

A variabilidade genética pode ser evidenciada por mudanças fenotípicas,

tais como perda ou aquisição de virulência, ou na susceptibilidade aos agentes

antifúngicos (TIMBAYREME, 1996). Estudos de variabilidade genética,

somados a testes padronizados de sensibilidade aos antifúngicos representam

uma nova abordagem da epidemiologia, da patogenia e no tratamento das

infecções fúngicas (PFALLER, 1995).

2.6 Características ecológicas

A variedade neoformans apresenta distribuição mundial sendo

constantemente associada ao habitat de aves, particularmente de pombo

(Collumbia ssp.) (LAZÉRA, 1994; CASADEVALL, 1994; LEVITZ, 1991;

MITCHEL et al., 1995). Já a variedade gattii tem distribuição geográfica mais

restrita sendo limitada às áreas tropicais e subtropicais (SORREL et al., 1996).

As fezes de pombo contêm altas concentrações de resíduos

nitrogenados que favorecem o crescimento do fungo. A alta temperatura

corpórea – 42ºC, da ave impede que se tornem infectados pela levedura

(MITCHELL et al., 1995).

Cryptococcus neoformans foi isolado em fezes secas de aves como

canários, papagaios, pardais e periquitos além de outros ambientes

contaminados com as excretas como madeira, folha e solo (SORREL; ELLIS,

1997).

ELLIS; PFEIFFER (1990 a, b) isolaram cepas sorotipo B (Cryptococcus

neoformans var. gattii de restos vegetais sob a copa de Eucalyptus

camaldulensis na Austrália e nos Estados Unidos. Porém, esta variedade

nunca foi encontrada em fontes ambientais relacionada aos pássaros (KWON-

CHUNG; BENNETT, 1992).

A variedade gattii foi identificada em outras espécies de Eucaliptus como

Eucaliptus tereticornis (LICEA et al., 1999) assim como de outras fontes

ambientais como um ninho de vespas no Uruguai (GEZUELE et al., 1993) e

amendoeiras na Colômbia (CALLEJAS et al., 1998).

A ocorrência de um paralelismo entre a distribuição geográfica de

árvores como Eucaliptus spp. e a incidência de infecção causada pela

variedade gattii (SORREL et al., 1996) tem sido contestada pelo isolamento de

novos habitats – ocos de arvores – nativas no Brasil (FORTES et al., 2001).

EMMON (1955) relata a presença pioneira de Cryptococcus neoformans

no solo demonstrando que isolados virulentos são abundantes em ninhos de

pombo e nas suas fezes.

LAZÉRA (1989) conseguiu identificar Cryptococcus neoformans var

neoformans em oco de arvores (Syzygium jambolana), este trabalho é o

primeiro relato da presença sapróbia da levedura no ambiente.

Já Lazéra; Wanke (1993) no Rio de Janeiro encontraram Cryptococcus

neoformans var. neoformans em ocos de árvores de cássia rosa (Cassias

grandis), cássia amarela (Senna multijuga) e fícus (Ficcus microcarpa).

Em Teresina/PI, foi identificada cepa de Cryptococcus neoformans var.

gattii sorotipo B em oco de arvore de fícus, cássia rosa e oiti (Moquilea

tomentosa) (LAZÉRA, 1998).

Trabalhos recentes demonstram uma positividade significativa de

Cryptococcus neoformans variedade neoformans em poeira domiciliar tanto em

Bujumbura na África como no Rio de Janeiro indicando que a exposição

cotidiana do homem ao fungo nesses ambientes torna-se preocupante

(SWINNE et al., 1991; PASSONI et al., 1994).

A variedade neoformans foi isolada inicialmente em 1894 de suco de

pêssego (CASADEVALL; PERFECT, 1998) sendo encontrados de forma mais

comum nos outros diversos microambientes do que a variedade gattii (CHEN et

al., 2000).

Lazéra (1999) citou o achado das duas variedades no mesmo habitat

(ocos de arvores) apresentando uma possível ligação entre ambas variedades

no ciclo vital na natureza.

Estes resultados sugeriram que nos ambientes onde são isolados

Cryptococcus neoformans ocorre uma interação entre as duas variedades.

Dessa forma, em estudos nos quais foi encontrada apenas uma destas,

devem-se aprofundar novos experimentos porque se supõem que a outra

variedade ainda não tenha sido isolada devido a baixa concentração dos

propágulos existentes. Essa afirmação é corroborada em trabalhos realizados

por MACEDO et al (2001).

2.7 Mating type

O cruzamento dos sorotipos B e C levou à formação de basidiósporos

bacilares com ou sem curvatura e com parede celular lisos, denominando

Filobasidiella bacillispora como sendo a forma teleomórfica de Cryptococcus

neoformans var gattii (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).

Esses mesmos autores ao cruzarem cepas dos sorotipos A e D, de

Cryptococcus neoformans var. neoformans descrevem a formação de

basidiósporos globosos de forma circular, alongados, elípticos com parede

celular fina rugosa. Devido a isso se considerou Filobasidiella neoformans

como a forma teleomórfica de Cryptococcus neoformans var. neoformans.

A fase teleomórfica é representada por células haplóides heterotálicas,

porém, algumas são homotálicas autofertéis produzindo basidiósporos sem

troca de material genético, o que se observa na maioria dos Basidiomicetos

(KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).

Para que aconteça o ciclo sexuado torna-se necessária à presença de

tipos sexuados opostos num estado de carência nutricional (MOORE; EDMAN;

1993).

O cruzamento sexual é controlado pelo sistema bipolar de

incompatibilidade, onde as células de ambos os tipos conjugadas produzem

hifas dicarióticas com ligações em ansa a partir dos conjugantes representados

por duas células haplóides do tipo α e tipo a (KWON-CHUNG; BENNETT,

1992).

As hifas produzidas são hialinas com 3µm em media de largura com

ramificações regulares, doliporos sem parentossoma e ligações em ansa em

cada septo (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).

Os basídios se desenvolvem na porção terminal ou em ramificações

laterais de hifas. Os basídios apresentam forma delgada, não apresentam

septos e se expandem formando no ápice formato de clava onde ocorre

formação de basidiósporos. Devido à umidade, se rompem, liberando os

esporos e em poucas horas produzem brotamentos e formação de cápsulas

(KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).

O genoma DNA que produz ferormônio – lócus mating type α é

identificado somente nas células MAT α. Não ocorre lócus silencioso de alelos

MAT α. Isto acontece porque não há troca de tipos sexuais (MOORE; EDMAN,

1993).

Os mating type MAT α ocorrem com 30 a 40 vezes mais freqüência do

que os mating type MAT a, tanto em isolados clínicos como ambientais; não é

comum ocorrer células diplóides auto-fertéis (WHITE, 1985).

A partir de um par de cepas congênitas de Cryptococcus neoformans

nota-se que o mating type α é muito mais virulento que o mating type a. Isso se

deve ao fato de que este mating type apresenta um gene STE 12 alpha que de

acordo com Chang et al. (2000) ao ser rompido, deixa as cepas

correspondentes menos virulentas (CHANG, 2000; KWON-CHUNG, 1991).

Os tipos sexuais α – apresentam maior produção da enzima

fenoloxidase e, conseqüentemente, também de melanina que os tipos sexuais

a (WICLES et al., 1996) o que é considerado um fator de virulência.

2.8 Sensibilidade aos antifúngicos

O inicio do tratamento especifico deve-se ser rápido assim logo se

estabeleça o diagnostico definido do agente infeccioso (KWON-CHUNG;

BENNETT, 1992).

A primeira terapia efetiva para o tratamento de criptococose foi o uso de

anfotericina B (CASADEVALLL; PERFECT, 1998).

O uso do antibiótico poliênico – anfotericinia B, associada ou não a 5-

flucitosina é o tratamento usual e principal para o combate a criptococose,

porém, os efeitos tóxicos conseqüentes desse uso são extremamente graves e

sérios (DISMUKES, 1993).

Essa associação mudou drasticamente a terapia, e diminuiu a

mortalidade de 95% para 25% dos casos clínicos (CASADEVALLL; PERFECT,

1998).

Os derivados azólicos são utilizados como meio alternativo a essa

terapia e teve sua utilização aumentada após a ocorrência de pacientes

portadores de SIDA (DISMUKES, 1993). Após a implantação do uso de

fluconazol (uso oral) na década de 80, completou-se o tratamento da

criptococose (CASADEVALLL; PERFECT, 1998).

3. OBJETIVOS

3.1. GERAL

- Caracterizar as amostras clínicas de Cryptococcus neoformans isolados

no Estado de Sergipe no período de 2001 a 2004.

3.2. ESPECÍFICOS

- Determinar as variedades de Cryptococcus neoformans isolados em

Sergipe;

- Verificar a sensibilidade dos isolados de C. neoformans a antifúngicos

através da técnica de determinação da concentração inibitória mínima

segundo o teste padrão do National Committee For Clinical Laboratory

Standard (NCCLS);

- Identificar o mating type dos isolados clínicos de C. neoformans através

da reação em cadeia da polimerase (PCR).

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CAPÍTULO 02

Medical Mycology

ISSN: 1369-3786

ARTIGO 1

DETERMINAÇÃO DAS VARIEDADES DE Cryptococcus neoformans

NO ESTADO DE SERGIPE

RESUMO

Este trabalho teve como objetivo estudar as variedades (neoformans e gattii)

de Cryptococcus neoformans isolados no Estado de Sergipe a partir do líquido

cefalorraquidiano de pacientes com meningite infecciosa. Foram utilizadas

amostras do Líquido cefalorraquidiano que deram entrada no IPH/LACEN/SE

no período de 2001 a 2004. Foi realizada microscopia direta através da

coloração com Tinta Nanquim. Uma alíquota do líquor (0,1mL) foi transferida

para tubos contendo Agar Sabouraud com clorafenicol e incubado em

temperatura ambiente 25ºC e a 37ºC. Foram realizadas provas para

identificação presuntiva, fenotípica em meio Níger e das variedades em meio

CGB. No período analisado, apenas uma amostra apresentou características

fenotípicas em meio Níger diferenciada das outras. Do total de 15 amostras

analisadas em meio CGB, 02 amostras (13,33%) se apresentaram positiva, ou

seja, foram identificadas como variedade gattii, sendo uma delas isolada de

paciente soronegativo para HIV (paciente não aidético). As outras 13 amostras

(86,67%) apresentaram CGB negativo, ou seja, foram identificadas como

variedade neoformans. A maioria das amostras de Cryptococcus neoformans

isolados do líquor de pacientes com meningite infecciosa são da variedade

neoformans em Sergipe.

Palavras-chaves: Cryptococcus neoformans; variedades; meningite

criptocócica; levedura patogênica; Agar Níger

4.1 INTRODUÇÃO

Cryptococcus neoformans é um basidiomiceto encapsulado que infectas

tanto pacientes imunodeprimidos como pacientes imunocompetentes (KWON-

CHUNG; BENNETT, 1992). A meningite criptocócica ocorre em

aproximadamente 8 a 30% dos pacientes com a síndrome de imunodeficiência

adquirida (SIDA); apesar da terapia antifúngica a mortalidade permanece

elevada de 6 a 29% dos casos (MITCHELL; PERFECT, 1995; POWDERLY,

1996).

Esta levedura apresenta duas variedades descritas, a variedade

neoformans (sorotipos A, D e AD) e a variedade gattii (sorotipos B e C) (ELLIS;

SORREL, 1997). A variedade neoformans tem sido isolada de fezes de aves,

restos vegetais e solos contaminados por esses materiais (KWON-CHUNG;

BENNETT, 1992; CASADEVALLL; PERFECT; 1998). Também foi encontrado

em vegetais como Eucaliptos (ELLIS; PFEIFFER, 1990) e de plantas nativas do

Brasil (LAZÉRA et al., 1996; FORTES et al., 2001).

A variedade gattii acomete pacientes principalmente de regiões tropicais

(KWON-CHUNG; BENNETT, 1992). Foi isolado continuamente de ambientes e

materiais de Eucaliptus spp. (ELLIS; PFEIFFER, 1990). Também foi isolado de

plantas nativas da Amazônia como a Guetarda spp. (FORTES et al., 2001),

esta variedade foi descrita no primeiro exemplo de criptococose causada por

um golfinho macho Tursiops truncatus presente no Oceano Atlântico (MILLER

et al., 2002). SORREL et al. (2002) apresentam um surto epidêmico de

Cryptococcus neoformans var. gattii na região de Vancouver – Canadá, região

temperada da América do Norte, causando criptococose em pacientes hígidos,

imunodepridimidos, animais (cães e golfinhos) e isolados em espécies de

plantas nas cercanias da região epidêmica.

O sorotipo A predomina tanto em amostras clínicas quanto ambientais,

com exceção do Norte europeu e isso pode ser reflexo da diferenças climáticas

e da virulência do sorotipo (DHROMER et al., 1996).

Já o sorotipo C foi recentemente encontrado em detritos vegetais na

Colômbia, em áreas identificadas como endêmicas para a variedade gattii

(CALLEJAS et al., 1998). Esta variedade também já foi encontrada em vespa,

morcego, coalas e camelos (LAZÉRA et al., 1993; MONTAGNA et al., 1996;

ELLIS; PFEIFFER; 1990). Neves et al (2004) isolaram ambas variedades em

areia contaminada com fezes de galinha assim como madeira em

decomposição de tábuas de casas e tronco de palmeira, e isolou pela primeira

vez em ninho de cupim no Estado de Roraima. Macedo et al (2001)

apresentam um relato de ocorrência de Cryptococcus neoformans em “habitat”

de tatu no Nordeste do Brasil.

Uma das características fisiológicas de C. neoformans é a produção de

fenoloxidase, enzima recentemente identificada como uma lacase

(WILLIAMSON, 1994) que apresenta atividade relacionada à virulência do

fungo. Esta enzima tem capacidade de mineralização da lignina e isto sugere

uma adaptação natural de Cryptococcus neoformans as diversas espécies de

plantas e não somente a Eucaliptus, o que favorece sua associação a estes

nichos (LAZÉRA et al., 1993). As presenças de substâncias fenólicas em

extratos de Níger favorecem a tal atividade bioquímica de Cryptococcus

neoformans, que se caracteriza pela produção regular de fenoloxidase e

confere a esse meio, Agar Staib, grande aplicabilidade na micologia médica.

Nele, C. neoformans desenvolve colônias marrons (POLACHEK, 1991) e pode

se diferenciar de outras espécies de Cryptococcus, bem como de Candida

albicans, outra levedura de grande interesse médico.

O objetivo deste trabalho foi determinar as variedades (neoformans e

gattii) de Cryptococcus neoformans isolados em Sergipe a partir do líquido

cefalorraquidiano de pacientes com meningite infecciosa.

4.2 MATERIAL E MÉTODO

4.2.1 Processamento dos materiais biológicos

As amostras do Líquido cefalorraquidiano deram entrada no Instituto

Parreiras Horta – Laboratório Central de Saúde Pública através do Laboratório

de Micologia no período de 2001 a 2004. Foi realizada microscopia direta

através da coloração com Tinta Nanquim. Uma alíquota do líquor (0,1mL) foi

colocado em tubos de Agar Sabouraud com clorafenicol e incubado em

temperatura ambiente 25ºC e a 37ºC.

4.2.2 Identificação presuntiva

Colônias brancas ou creme e mucóides foram confirmadas como

Cryptococcus neoformans a partir de nova preparação usando Tinta Nanquim.

Essas cepas foram enviadas para o Laboratório de Microbiologia Aplicada

(LMA) da Universidade Federal de Sergipe para os testes presuntivos.

4.2.3. Identificação fenotípica

Foi utilizada a metodologia recomendada por STAIB et al. (1987) onde

cada cepa foi re-isolada, utilizando meio Níger (sementes de Guizotia

abyssinica) e três colônias de cada amostra e/ou morfotipos com fenótipos

diferentes foram isoladas de cada amostra. Esse tipo de atividade é

recomendado caso haja variabilidade (de variedade, sorotipo, sorogrupo ou tipo

molecular) intracolonial de Cryptococcus neoformans.

No meio Níger, Cryptococcus neoformans apresenta uma coloração

marrom e úmida, devido à produção de uma enzima classificada como lacase –

fenoloxidase que produz melanina, importante fator de virulência.

4.2.4 Identificação das variedades

Cada colônia foi replicada em Agar Sabouraud à temperatura de 25ºC e

incubada por 48 horas para a realização do teste de variedade, através da

técnica de inoculação no meio canavanina – glicina – azul de bromotimol

(CGB). Nesta técnica um pequeno inóculo foi semeado no meio CGB e

incubado a 25ºC durante 48 horas.

A variedade gattii utiliza a glicina e são resistentes a canavanina.

Quando esta variedade cresce no meio CGB, a cor do meio muda de verde

para o azul, resultado da alcalinização do meio e pela produção de amônio, isto

se deve a degradação da glicina indicando resultado positivo (KWON-CHUNG;

BENNETT, 1984, 1992).

A variedade neoformans não promove a alcalinização do meio CGB,

pois esta variedade não assimila glicina e suas amostras são sensíveis a

canavanina indicando resultado negativo. Raros isolados desta variedade,

pertencentes ao sorotipo A, podem assimilar a glicina, porem, são sensíveis a

canavanina, o que impossibilita o seu crescimento (KWON-CHUNG;

BENNETT, 1984, 1992).

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.3.1 Processamento dos materiais biológicos

Os líquor amostrados foram corados com tinta Nanquim para pesquisa

direta de células de leveduras em uni ou multibrotamento de tamanho regular,

globosas, arredondadas, apresentando cápsula mucopolissacarídica bem

evidenciada.

4.3.2 Identificação presuntiva

No período de 2001 a 2004 obteve-se 13 amostras de C. neoformans

crescidos em Ágar Sabouraud.

4.3.3 Identificação fenotípica em meio Níger

O “screening” realizado em meio Níger, quase todas as amostras

testadas apresentam atividade fenoloxidase positiva, o que pode ser

evidenciado pela presença de colônias de coloração marrom (melanização),

puntiformes ou até 2mm de diâmetro com aspecto úmido; a única exceção foi à

colônia D da amostra 13. Esta cepa apresentou características morfotípicas

diferentes como colônia creme, brilhante e com 2mm de diâmetro.

O achado nesta pesquisa sugere a ocorrência de uma linhagem

mutante, porém tal afirmação necessita de estudos mais aprofundados com

esta cepa de característica fenotípica diferente, entretanto, estudos como o de

Williamson, (2003), pode corroborar ou não esta afirmação, haja vista que o

mesmo afirma que a síntese da enzima responsável pela melanização é

regulada pelo gene CNLAC1, o qual, após depleção de bases de DNA

desencadeia a formação de linhagens mutantes não produtoras de

pigmentação. Este mesmo autor cita que expressão deste gene CNLAC1 foi

evidenciada através de uma indução de uma grande expressão do gene STE12

que regula a produção dessa enzima.

Para contrapor a afirmação de Staib et al. (1987) que o tempo de

pigmentação e diferentes concentrações dos solutos do meio podem alterar a

caracterização morfotípica das colônias de Cryptococcus neoformans foram

realizados sucessivos repiques em diferentes lotes de Agar Níger e os mesmos

resultados foram verificados. Mesmo com a possibilidade de alteração de

melanização o método proposto por Staib et al (1987) continua sendo a melhor

ferramenta para a caracterização fenotípica da levedura.

4.3.4 Identificação das variedades

Na Tabela 1 são apresentados os resultados do teste para

caracterização das variedades de Cryptococcus neoformans através do meio

CGB.

Número da amostra

HIV Variedade

1 Positiva neoformans

2 Positiva neoformans

3 Negativo neoformans

4 Negativo neoformans

5 Negativo neoformans

6 Negativo gattii

7 Positiva neoformans

8 Positiva neoformans

9 Positiva neoformans

10 Positiva gattii

11 Negativo neoformans

12 Positiva neoformans

13 Negativo neoformans

13 - colônia D Negativo neoformans

14 Negativo neoformans

De acordo com a tabela 01, do total de 15 amostras analisadas através

do meio CGB, apenas duas amostras apresentaram CGB positivo, ou seja,

foram identificadas como variedade gattii, o que representa 13,33% dos isolado

clínicos de Cryptococcus neoformans em Sergipe no período de 2001 a 2004.

As demais amostras (13) apresentaram CGB negativo, sendo identificadas

Tabela 1

: Identificação das variedades, soropositividade para HIV das amostras de

Cryptococcus neoformans

, isolados clínicos do Estado de Sergipe no período de

2001 a 2004. São Cristóvão/SE, 2004.

como variedade neoformans, representando 86,67% do total dos isolados

clínicos.

Pode-se observar também, que das sete amostras isoladas de pacientes

HIV positivos apenas uma amostra pertencia à variedade gattii enquanto os

seis restantes revelaram-se como variedade neoformans. Com relação às

amostras isoladas de pacientes HIV negativos, também apenas uma amostra

pertence à variedade gattii enquanto as outras sete amostras foram variedade

neoformans.

O morfotipo D da amostra 13 que apresentou característica fenotípica

diferente no meio Níger apresentou-se como variedade neoformans (CGB

negativo), resultado idêntico aos outros morfotipos da mesma amostra. Esse

morfotipo pode está apresentando uma variabilidade fenotípica que merece

destaque já que ele foi confirmado como Cryptococcus neoformans variedade

neoformans, tanto através do meio CGB como pela tinta Nanquim. Uma vez

que já foi eliminada qualquer possibilidade de contaminação, propõe-se um

estudo mais aprofundado com esta cepa.

Merecem destaque as amostras 06 e 10. A amostra 06, que foi

identificada como Cryptococcus neoformans variedade gattii e isolada de

paciente HIV negativo se apresenta epidemiologicamente de acordo com a

literatura comentada, porém, nesse trabalho, o número de casos de pacientes

HIV negativo com meningite criptocócica causada pela variedade gattii ficou

abaixo do esperado mostrando, em Sergipe, uma frequencia mais significativa

da variedade neoformans. Outros trabalhos realizados na região Nordeste do

Brasil, precisamente no Piauí, demonstraram que 91,2% dos casos de

pacientes HIV negativo com criptococose foram acometidos pela variedade

gattii prevalecendo o sorotipo B em 100% das amostras (CAVALCANTI, 1997;

NISHIKAWA et al., 2003).

A amostra 10, isolada de paciente HIV positivo foi identificada como

Cryptococcus neoformans variedade gattii. Este dado é pouco freqüente na

literatura e é aqui apresentado como único caso identificado e analisado em

Sergipe. Entretanto, embora se tenha pouca citação neste sentido, estudo

realizado por GARZA et al (1995) revelou que das cepas isoladas de pacientes

com HIV positivo na América Latina, 15% pertenciam a variedade gattii e 85%

a variedade neoformans. Esses dados indicaram que a variedade gattii está

amplamente distribuída no meio ambiente e é capaz de infectar indivíduos

imunodeprimidos.

O aumento na incidência da criptococose causada principalmente pela

variedade gattii pode ser atribuído a migração da população urbana para locais

rurais assim como para áreas de desmatamento de mata nativa além dos

fatores sociais (desnutrição e estresse físico-emocional) e da deficiência

imunológica do paciente (Py et al., 1997).

Garza et al (1995) afirmaram que em cepas isoladas de pacientes com

SIDA foi encontrada uma ocorrência de 15% para a variedade gattii e 85% para

a variedade neoformans e indicaram que a variedade gattii está amplamente

distribuída no meio ambiente e é capaz de infectar indivíduos imunodeprimidos.

Na região Nordeste do Brasil, precisamente no Piauí foi isolado 91,2%

dos casos de pacientes com criptococose não – SIDA foram acometidos pela

variedade gattii prevalecendo o sorotipo B em 100% das amostras

(CAVALCANTI, 1997; NISHIKAWA et al., 2003).

Entre as técnicas de tipificação empregadas em estudos

epidemiológicos, os esquemas de sorotipagem tornaram-se valiosos devido à

associação da infecção com isolados sorotipo A e pacientes com SIDA e, a

maior dificuldade, no tratamento com antifúngicos nas infecções pela variedade

gattii (AOKI et al., 1999).

Estudos recentes sugerem uma nova classificação: C. neoformans var.

grubii (sorotipo A) e C. neoformans var. neoformans (sorotipo D), ambos de

distribuição mundial; C. neoformans var. gattii (sorotipos B e C) restritos a

regiões de clima tropical e subtropical (FRANZOT et al., 1999; STEENBERG et

al., 2000). Tais variedades apresentam diferenças significativas tanto em

questões morfofisiológicas quanto em distribuição e “habitat”.

A freqüência mundial das variedades neoformans e gattii indicou uma

proporção bem mais significativa da primeira variedade citada nos casos

clínicos; dados epidemiológicos do México indicaram que aproximadamente

86% dos casos de meningite criptocócica são da variedade neoformans, na

Argentina de 97% de neoformans, no Brasil de 83% de neoformans; em Cuba

de 97% dos casos são pertencentes à variedade neoformans; e na Venezuela

de aproximadamente de 67% dos casos são da variedade neoformans. Já em

Porto Rico (100% da variedade neoformans) e no Paraguai (100% da

variedade gattii) apresentaram freqüências contestadas devido aos poucos

casos ocorridos (CASTANON-OLIVARES et al., 2000).

Banerjee et al (2004) mostraram o primeiro caso reportado em que um

individuo imunocompetente foi infectado pelas duas variedades (sorotipos A e

B) simultaneamente. Isto sugere uma variabilidade intracolonial entre os

isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus neoformans.

Após a implantação do HART (terapia anti-retroviral de grande

capacidade) a meningite criptocócica está se alterando epidemiologicamente,

principalmente no Nordeste brasileiro, diminuindo o numero de casos

relacionados aos pacientes soropositivo para o HIV e atingindo de modos mais

freqüentes pacientes hígidos. Esse novo comportamento evidencia a

ocorrência em que a levedura acontece de modo ocorrente, porém não

detectado e favorece a pesquisa de novos nichos ecológicos e modos de

contaminação em Sergipe.

4.4 CONCLUSÃO

Nas amostras de Cryptococcus neoformans isolado de líquor de pacientes

com meningite infecciosa em Sergipe, no período de 2001 a 2004,

prevaleceram às variedades neoformans frente as gatti.

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CAPÍTULO 03

Journal of Antimicrobial

Chemotherapy

ISSN 0305-7453

ARTIGO 2

TESTE DE SENSIBILIDADE DAS AMOSTRAS CLÍNICAS DE Cryptococcus

neoformans ISOLADOS DO LÍQUIDO CEFALORRAQUIDIANO A

ANTIFÚNGICOS

RESUMO

Este trabalho teve como objetivo determinar a sensibilidade de C. neoformans

variedade neoformans e variedade gattii, isolados do líquor de pacientes com

meningite infecciosa em Sergipe, pelo método de microdiluição (NCCLS). Para

a realização do teste foram utilizadas duas amostras de C. neoformans

variedade gattii e 11 de C. neoformans variedade neoformans. Para controle

dos testes foi utilizada a cepa padrão ATCC 32608. Em seguida foi realizada a

preparação do inóculo – suspensão de células fúngicas até atingir o nível 3+ da

escala de Mcfarland com salina estéril. Foram utilizados os seguintes

antifúngicos: Anfotericina B (AMB), Fluconazol (FLU), Cetoconazol (CET),

Miconazol (MIZ), Itraconazol (ITR), 5- Fluorocitosina (5-FC) e Terbinafrina

(TER). A suspensão fúngica foi ajustada numa concentração final de 0,5x10³

para 2,5x10³ UFC no meio RPMI. O experimento foi realizado em placas de

microtitulação. Após a inoculação, as placas de microdiluição foram incubadas

a 37ºC e lida em 24, 48 e 72 horas. O ponto final da CIM foi determinado nas

leituras de 48 e 72 horas. Os isolados clínicos de C. neoformans apresentaram

valores altos de CIM para os agentes antifúngicos testados, o que simboliza

uma alta taxa de resistência principalmente a Anfotericina B e ao Fluconazol,

dado que pode ser correlacionado com os dados clínicos. Palavras-chaves:

Cryptococcus neoformans; MIC; Nordeste brasileiro, resistência antifúngica.

5.1 INTRODUÇÃO

O Cryptococcus neoformans é um fungo patogênico que afeta pacientes

imunocomprometidos ou, em casos esporádicos, imunocompetentes. As

drogas disponíveis – anfotericina B, fluconazol, 5 fluorocitosina e miconazol são

tóxicas ou causam interações droga-droga que afetam o seu uso (Drouhet,

1997). Além disso, o surgimento de cepas resistentes às drogas é alarmante na

era pós-SIDA (DUPONT, 1990).

A variedade neoformans age como agente causador de infecção

oportunista atingindo pacientes imunodeprimidos como portadores de HIV,

leucêmicos, transplantados, e pacientes submetidos à quimioterapia

antitumores, uso de corticóides e antibioticoterapia prolongada (MITCHEL;

PERFECT, 1995; RIPPON, 1988). Já a variedade gattii é um patógeno primário

afetando pacientes imunocompetentes (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992.

ROSENBAUM; GONÇALVES, 1994).

Desde 1980 a ocorrência de infecções por Cryptococcus neoformans

tem crescido dramaticamente nos mais diversos paises como resultado da

susceptibilidade às infecções oportunistas dos pacientes com SIDA

(CASADEVALL; PERFECT, 1998).

Aproximadamente 5% dos pacientes com SIDA da Europa Central

apresentam criptococose (LISTEMANN; MEIGEL, 1995); dados do Ministério

da Saúde através da Coordenação Nacional DST/AIDS, revelaram que no

período de 1980 a 1997, 4,3% das infecções oportunistas associadas aos

pacientes com HIV foram causadas por Cryptococcus neoformans (LEVI,

1998).

O tratamento efetivo com anfotericina B sozinha ou combinada com 5-

fluorocitosina, tem sido recomendado para o tratamento da meningite

criptocócica. A partir da década de 70 os azólicos começaram a ser utilizado

como método alternativo ou complementar (SLAVOSKI et al., 1995).

Recentemente tem-se uma atenção em especial para os relatos de

resistências às diversas drogas antifúngicas principalmente ao uso e abuso

destes agentes antifúngicos (ALEXANDER et al., 1997), o que revela o mau

uso e a não implantação na rotina, dos testes antifúngicos.

Na realidade, os testes de sensibilidade não são de fácil execução e a

padronização de alguns testes tem sido proposta somente recentemente

(ESPINE-INGROFF et al., 1998). O “National Committee For Clinical

Laboratory Standard “ (NCCLS) tem investido nessa padronização para

detecção exata da concentração inibitória mínima das drogas antifúngicas. A

técnica de diluição em caldo tem sido destacada como o melhor método para

as leveduras patogênicas (NCCLS, 2002).

A resposta terapêutica antimicrobiana é resultado da resistência

microbiana (intrínseca ou desenvolvida durante a terapia) e a resistência clinica

e está associada com diversos fatores como: farmacocinética da droga,

resposta imune do hospedeiro, estado da doença, manipulação do paciente,

grau de infecção e virulência (REX et al., 1997).

A determinação da concentração inibitória mínima é de extrema

importância no auxilio da resposta clinica ao uso correto de antimicrobianos,

principalmente, na interpretação dos pontos finais. Este método é o que mais

corrobora o aspecto in vivo devido à diminuição de fatores físicos ou químicos

envolvidos (ESPINEL-INGROFF, 1997).

Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo determinar a

sensibilidade de C. neoformans variedade neoformans e variedade gattii,

isolados do líquor de pacientes com meningite infecciosa em Sergipe, pelo

método de microdiluição estabelecido pelo National Committee For Clinical

Laboratory Standard (NCCLS).

5.2 MATERIAL E MÉTODOS

5.2.1 Amostras de Cryptococcus neoformans.

Para a realização do teste foram utilizadas duas amostras (AM) de

Cryptococcus neoformans variedade gattii (AM 06 e AM 10) e 11 amostras de

Cryptococcus neoformans variedade neoformans (AM 01, AM 02, AM 03, AM

04, AM 05, AM 07, AM 08, AM 09, AM 11, AM 12 e AM 13) pertencentes ao

banco de linhagens do Laboratório de Microbiologia Aplicada da Universidade

Federal de Sergipe. Para controle dos testes foi utilizada a cepa padrão da

American Type Culture Colection (ATCC) Cryptococcus neoformans 32608.

Antes da realização dos testes, as amostras foram cultivadas em Agar

Sabouraud, 37ºC por 48 horas.

Em seguida foi realizada a preparação do inóculo – suspensão de

células fúngicas até atingir o nível 3+ da escala de Mcfarland com salina estéril,

com aproximadamente 0,5x10³ UFC. A suspensão fúngica foi ajustada para

uma concentração final de 2,5x10³ UFC em meio RPMI 1640 (Sigma) -

tamponado para pH 7,0 com acido morfolinepropanesulfônico (MOPS),

conforme descrito no documento NCCLS M – 27 (1997).

5.2.2 Agentes antifúngicos.

Foram utilizados os seguintes antifúngicos: Anfotericina B (AMB),

Fluconazol (FLU), Cetoconazol (CET), Miconazol (MIZ), Itraconazol (ITR), 5-

Fluorocitosina (5-FC) e Terbinafrina (TER). Anfotericina B, cetoconazol e

itraconazol foram dissolvidos em DMSO (dimetilsulfóxido) e colocados em

banho-maria por 1 hora a 75ºC. Fluconazol, miconazol, 5-fluorocitosina e

terbinafrina foram dissolvidos em água destilada estéril. Os agentes

antifúngicos foram preparados numa concentração estoque de 10000µg/mL.

Estas soluções foram diluídas em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)

e a concentração final das drogas variou de 0,243 a 250µg/mL.

O experimento foi realizado em placas de microtitulação de 96 poços, ou

seja, cada amostra de Cryptococcus neoformans com a sua respectiva placa.

Em cada poço foi inoculado 100µL da suspensão fúngica padronizada. Em

cada linha foi testado um antifúngico respectivamente. No primeiro poço de

cada linha foi inoculado 100µL da maior concentração (250µg/mL). Formando

neste primeiro poço uma solução de 200µL da concentração do antifúngico e

da suspensão fúngica.

Após homogeneização da solução no primeiro poço foi transferido 100µL

da solução para o poço subseqüente. Assim subseqüente até o ultimo poço;

sempre deixando no poço anterior a concentração dobrada do poço atual, ou

seja, de modo que após a transferência deste volume a concentração do poço

foi reduzida a metade.

Esse protocolo foi iniciado numa concentração antifúngica de 250µg/µL

e finalizando a 0,243µg/µL das drogas. Perfazendo uma taxa entre 250µg/µL a

0,243µg/µL em todas as drogas submetidas ao teste.

Para padronizar o CIM (Concentração Inibitória Mínima), foi realizado

um controle positivo – suspensão celular, mais meio RPMI sem a droga e um

controle negativo – suspensão da droga no meio RPMI, sem células.

5.2.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima

Após a inoculação, as placas de microdiluição foram incubadas a 37ºC e

a leitura foi realizada em 24, 48 e 72 horas respectivamente. O ponto final da

concentração inibitória mínima foi determinado nas leituras de 48 e 72 horas.

O crescimento em cada poço foi determinado numa escala de turvação:

Escala 0 – ausência de crescimento nos poços.

Escala 1 – Leve turbidez quando comparado com o controle positivo.

Escala 2 – Proeminente decréscimo na turbidez quando comparado com o

controle positivo (aproximadamente 50% de inibição).

Escala 3 – Leve redução na turbidez quando comparado com o controle

positivo (aproximadamente 90% de inibição).

Escala 4 – Não há redução na turbidez quando comparado com o controle livre

da droga.

Para os agentes azólicos e 5-Fluorocitosina a concentração inibitória

mínima (CIM) é definida como a concentração mais baixa da droga com ligeira

turbidez (escala 1). Já para Anfotericina B a CIM é considerada a mais baixa

concentração que se apresente totalmente clara (escala 0).

5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Este trabalho foi realizado em duas etapas. A primeira realizada com os

seguintes antifúngicos: AMB – anfotericina B; TER – Terbinafrina, Flu –

Fluconazol, ITRA – Itraconazol e 5-FC – 5-fluorocitosina. E a segunda com

terbinafrina, 5-fluorocitosina e alguns antifúngicos da classe dos azólicos, como

MICO – Miconazol e CETO – Cetoconazol.

Espécie testada MIC 50% (mg/mL ou µg/µL)

MIC 90% (mg/mL ou µg/µL)

Drogas antifúngicas testadas

48h 72h 48h 72h

Cryptococcus neoformans

Anfotericina B 0,243 0,4875 0,4875

0.97

Terbinafrina <=0,24 0,243 <=0,24

0.24

5-Fluorocitosina <=0,24 0,243 1,95 3.91

Fluconazol 1,95 3,91 15,63 31.25

Itraconazol <= 0.24 <=0,24 <= 0.24

<= 0.24

Anfotericina B <= 0.24 <= 0.24 0,24 0.48

Terbinafrina 0,4875 0,975 1,95 3.91

5-Fluorocitosina 0,4875 0,975 1,95 3.91

Fluconazol 3,91 7,81 7,81 15.63

Itraconazol <=0,24 <=0,24 62,5 125

Anfotericina B 0,24 0,4875 0,4875

0.97

Terbinafrina 0,24 0,4875 0,4875

0.97

5-Fluorocitosina 0,24 0,4875 0,4875

0.97

Fluconazol 15,63 15,63 15,63 31.25

Itraconazol 0,4875 0,975 7,81 15.63

Anfotericina B 0,4875 0,975 1,95 3.91

Terbinafrina 0,24 0,4875 0,4875

0,975

5-Fluorocitosina 0,4875 0,975 31,25 62.5

Fluconazol 3,91 7,81 7,81 15.63

Itraconazol 0,24 0,4875 125 250

TABELA 2 – Concentração Inibitória Mínima

(CIM) dos antifúngicos testados frente aos

isolados clínicos de Cryptococcus neoformans em Sergipe.

Anfotericina B 0,4875 0,975 3,91 7.81

Terbinafrina <= 0.24 0,243 0,4875

0.97

5-Fluorocitosina <= 0.24 0,4875 1,95 3.91

Fluconazol 7,81 7,81 7,81 15.63

Itraconazol 1,95 3,91 62,5 125

Anfotericina B <= 0.24 0,4875 1,95 3.91

Terbinafrina 0,4875 0,975 1,95 3.91

5-Fluorocitosina 1,95 3,91 7,81 15.63

Fluconazol 1,95 3,91 3,91 7,81

Itraconazol 0,4875 0,975 62,5 125

Anfotericina B 0,4875 0,975 1,95 3.91

Terbinafrina 0,4875 0,975 1,95 3.91

5-Fluorocitosina 0,4875 0,975 1,95 3.91

Fluconazol 3,91 7,81 15,63 31.25

Itraconazol <=0,243 <=0,243 62,5 125

Anfotericina B 0,24 0,4875 3,91 7.81

Terbinafrina <=0,243 0,4875 1,95 3.91

5-Fluorocitosina 0,24 0,4875 1,95 3.91

Fluconazol 1,95 3,91 7,81 15.63

Itraconazol <=0,243 0,975 62,5 125

Anfotericina B 31,25

5,26

62,5

521

Terbinafrina 31,25

5,26

62,5

521

5-Fluorocitosina 0,4875 0,975 125

052

Fluconazol 62,5 62,5 125 125

Itraconazol 62,5 62,5 125 125

Anfotericina B 3,91 7,81 7,81 15,63

Fluconazol 0,243 0,4875 7,81 15,63

Itraconazol <=0,243 0,4875 1,95 3,91

Miconazol <=0,243 0,4875 15,63 31,25

Cetoconazol 0,243 0,4875 7,81 15,63

Anfotericina B 15,63 31,25 31,25 62,5

Fluconazol 62,5 125 125 250

Itraconazol 0,24 0,4875 0,4875

0,975

Miconazol 1,95 3,91 3,91 7,81

Cetoconazol 3,91 7,81 7,81 15,63

Anfotericina B 7,81 15,63 15,63 31,25

Fluconazol 0,975 1,95 1,95 3,91

Itraconazol 3,61 7,81 7,81 15,63

Miconazol 0,975 1,95 1,95 3,91

Cetoconazol 0,975 1,95 1,95 3,91

Anfotericina B 3,91 7,81 7,81 15,63

Fluconazol 0,975 1,95 1,95 3,91

Itraconazol 0,24 0,4875 0,4875

0,975

Miconazol 0,975 1,95 1,95 3,91

Cetoconazol 0,24 0,4875 0,4875

0,975

ATCC 32608

Anfotericina B 0,243

342,0

0,243 0,48

Terbinafrina 0,243 0,4875 1,95 3,91

5-Fluorocitosina 0,243

342,0

15,63 31,25

Fluconazol 15,63 31,25 31,25 62,5

Itraconazol 3,91 7,81 7,81 15,63

Na Tabela 02 é demonstrado que as amostras de Cryptococcus

neoformans apresentam alto valor de concentração inibitória mínima,

principalmente na CIM 90%, para anfotericina B. Esses resultados evidenciam

a alta resistência destas cepas clinicas para justamente à droga de escolha no

combate a criptococose.

Vale destacar que a amostra nove apresenta resistência a todos os

antifúngicos não azólicos (MIC >250µg/µL).

Esses dados corroboram aqueles obtidos por Soares et al (2003) que

registraram alta atividade da terbinafrina contra o fungo, embora em

concentrações maiores em comparação àquelas requeridas pelos azólicos em

geral.

Observa-se na Tabela 02 uma resistência dose dependente para os

agentes azólicos, principalmente para o fluconazol. Este antifúngico é usado

em conjunto com a anfotericina B para pacientes imunodeprimidos ou que

sofrem com os efeitos da anfotericina B.

De acordo com o NCCLS (2002) os agentes antifúngicos podem ser

considerados como agente fungicida ou fungistático. Para a anfotericina B,

quando os valores de MIC detectados no teste enquadram o agente somente

como sensível ou resistente, infere-se que a ação da anfotericina B é fungicida.

Quando agindo como fungistático, podem ser encontrados valores que

caracterizam a sensibilidade dose dependente. Para este antifúngico uma cepa

é considerada sensível quando apresenta valores de CIM ≥ 1µg/mL. Enquanto

que para ser considerada uma cepa resistente deve apresentar valores de CIM

≥ 1µg/mL.

Para o fluconazol, uma cepa considerada sensível (S) deve apresentar

um CIM ≤ 8µg/mL; sensível dose dependente (SDD) entre 16 e 32µg/mL e

resistentes (R) valores ≥ 64µg/mL. Para itraconazol, CIM ≤ 0,125µg/mL

caracteriza as cepas sensíveis (S), entre 0,25 e 0,5µg/mL caracteriza a

sensibilidade dose dependente (SDD) e valores ≥ 1µg/mL caracterizam as

cepas resistentes (R). Para o cetoconazol o NCCLS não especifica valores de

sensibilidade e resistência e apenas indica que as concentrações inibitórias

mínimas variam entre 0,03 e 16µg/mL.

Para a 5-fluorocitosina as cepas são consideradas sensíveis (S) quando

apresentam valores ≤ 4µg/mL; para esse grupo de fármacos não existem

valores de sensibilidade dose dependente, mas sim valores intermediários (I)

que está entre 8 e 16µg/mL. A cepa é considerada resistente (R) quando

apresenta valores ≥ 32µg/mL.

De acordo com os resultados obtidos neste trabalho e comparando-se

com o padrão de valores sugerido pelo documento NCCLS M27-A2 (2002), as

amostras um, dois e três apresentaram sensibilidade para a anfotericina B. Já o

restante das amostras (77%) apresentou valores que as caracterizam como

cepas resistentes. Para a 5-fluorocitosina nenhuma amostra apresentou

valores resistentes, apenas as amostras cinco e seis apresentaram valores

intermediários.

Para os azólicos, as amostras nove e 11 apresentaram resistência ao

fluconazol porem, 77% das amostras restantes, com exceção apenas da

amostra seis (variedade gatti), apresentaram valores relacionados à

sensibilidade dose dependente, o que configura um aspecto preocupante na

utilização desta droga. Este resultado reforça o comportamento diferenciado e

mais virulento relacionado à variedade gatii como afirmaram Speed et al (1995)

e Peach et al (1998). Peetermans et al (1993) relataram a ocorrência de

resistência em um paciente AIDS infectado com a variedade gatti.

Os valores obtidos para itraconazol causam preocupação, já que

nenhuma das amostras analisadas apresentou valores relacionados aos

padrões de sensibilidade. Apenas as amostras um, 11 e 13 apresentaram

sensibilidade dose dependente. O restante das amostras (77%) apresentou

valores que as classificam como resistentes. Com relação ao cetoconazol

todas as amostras analisadas foram consideradas sensíveis, dose dependente.

Anfotericina B e outros poliênicos agem ligando-se ao ergosterol da

membrana celular do fungo inibindo conseqüentemente a formação das

enzimas da biossíntese do ergosterol, a citocromo P-450 dependente e a 14α

esterol dimetilase (P450-DM). Quando cepas apresentam resistência a

anfotericina B isso se deve a alterações na biossíntese dos lipídeos de

membrana como também a interrupção dos fosfolipídios da membrana

plasmática (DICK et al., 1980).

Já os azólicos atuam exclusivamente na inibição da P450-DM que

resulta na inibição do ergosterol e aumento na concentração da 24 α metil

esterol causando grande inibição na formação das células fúngicas. Como

também nos poliênicos, um mecanismo comum de resistência é a mudança na

composição do esterol nas membranas da célula fúngica (HITCHCOCK, 1993).

Kerridge et al (1990) afirmaram que a existência de cepas resistentes a

anfotericina B está relacionada com o tratamento prévio com derivados

azólicos que afeta a membrana celular (redução da síntese do ergosterol)

podendo provocar a seleção de mutantes.

Joseph-Horne et al (1996) reportaram poucos casos de resistência a

anfotericina B na era SIDA. Enquanto que Orni-Wasserlauf et al (1999)

relataram que cepas fluconazol resistentes isoladas de pacientes

imunodeprimidos ocorrem de forma mais comum, o que serve de alerta já que

em pacientes com SIDA esta droga tem sido combinada com a anfotericina B.

Isolados do Rio Grande do Sul demonstraram pouca susceptibilidade

aos antifúngicos com valores baixos de CIM (VAINSTEIM et al., 2001),

enquanto resultados obtidos por Fraznot et al., (2001) com isolados de Minas

Gerais sugeriram uma certa resistência aos azólicos em especial ao fluconazol.

Em outros isolados de Minas Gerais (MORAES et al., 2003), foi

detectada grande ocorrência de amostras com resistência dose dependente

além de variabilidade nas leituras de 24 e 48 horas. Esses dados foram

também registrados neste trabalho e reforça a idéia de que os testes ainda

estão em fase de padronização. O documento NCCLS M 27-A (2002) indicou

uma leitura máxima em 72 horas.

Em um trabalho realizado por Diaz et al. (2003) com amostras de São

Paulo, registrou perfil de sensibilidade diferenciado: ocorrência de resistência

apresentada por um isolado ambiental frente a 5- Fluorocitosina, um isolado

clínico frente ao Fluconazol, um isolado ambiental frente ao Voriconazol, dois

isolados ambientais e um isolado clínico frente a Anfotericina B.

Armengou et al (1996) citaram altas taxas de CIM para os azólicos, em

especial para o fluconazol, fato que tem sido associado à falta de resposta do

fluconazol em pacientes imunodeprimidos. Devido a isso novos agentes

triazólicos tem sido pesquisado como voriconazol e posaconazol além da

utilização de anfotericina B combinada com outros produtos como substancias

lipossolúvel (Viviane et al., 1998). Nesse sentido, Pfaller et al (1999)

apresentaram as maiores taxas de resistência de Cryptococcus neoformans, 12

a 40%.

Yamazumi et al (2003) sugeriram a existência de clones

heteroresistentes, fruto de uma seleção rápida de fenótipos resistentes sob

exposição ao fluconazol. Isso reforça a necessidade do desenvolvimento de

métodos apropriados para não só a detecção de resistência, mas a

determinação de clones heteroresistentes de Cryptococcus neoformans frente

aos agentes antifúngicos.

Silveira et al (2004) ressaltaram a relação existente entre melanização e

baixa susceptibilidade de Cryptococcus neoformans, principalmente frente a

anfotericina B. Segundo esses autores ocorre uma taxa maior de sobrevivência

de cepas produtora de colônias melanizadas. In vitro a melanização foi

associado com a resistência microbiana, esse efeito acontece devido à

oxidação do sistema imunológico do hospedeiro alterando a composição dos

peptídeos microbicidas e principalmente ao agente antifúngico anfotericina B

(CASADEVALL, 2000).

Dados apresentados por Revankara et al (2004) evidenciaram a relação

entre o gene ERG11 e a resistência aos agentes azólicos mostrando que a

regulação desse gene caracteriza um perfil resistente de Cryptococcus

neoformans frente aos agentes azólicos. Esses autores ainda não obtiveram

resultados que confirmem a mesma relação com os novos azólicos.

Estes resultados sugerem que se faz necessário ampliar as opções de

técnicas disponíveis para a determinação da resistência antimicrobiana de

Cryptococcus neoformans pela associação da determinação da CIM, com

outros métodos como o E – TEST e através da identificação e seqüenciamento

de genes de resistência. Com dados seguros acerca do perfil de sensibilidade

e resistência, associados ao conhecimento dos genes envolvidos, será possível

realizar um estudo epidemiológico de qualidade e assim, elucidar a dinâmica

local da relação ambiente-fungo-paciente.

5.4 CONCLUSÃO

Os isolados clínicos de Cryptococcus neoformans isolados no Estado de

Sergipe apresentaram valores altos de concentração inibitória mínima – CIM

para os agentes antifúngicos testados, o que simboliza alta taxa de resistência

principalmente a Anfotericina B e ao Fluconazol, dado que pode ser

correlacionado com os dados clínicos.

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CAPÍTULO 04

Memória do Instituto

Oswaldo Cruz

ISSN 0074-0276

ARTIGO 3

IDENTIFICAÇÃO DO MATING TYPE DE ISOLADOS CLÍNICOS DE

Cryptococcus neoformans, PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE –

PCR

RESUMO

O Cryptococcus neoformans é um fungo oportunista que desencadeia

meningite tanto em pacientes imunocompetentes como em pacientes hígidos.

O ciclo de vida de Cryptococcus neoformans envolve uma fase anamorfa

(leveduriforme, presente tanto na natureza quanto em espécimes clínicos) e

uma teleomorfa (filamentosa, ausente em espécimes clínicos), com formação

de basidiósporos, indicando que o estado sexual do fungo existe na natureza.

Os basidiósporos são dispersos no ar e podem atingir os pulmões. A

reprodução sexual de ambas variedades de Cryptococcus neoformans tem sido

observada sob condições laboratoriais. Conjugações entre os tipos sexuais

(mating types) – MAT α e MAT a, resultam na formação de micélio dicariótico,

com a presença de basídios, seguida por meiose com formação de

basidiósporos que germinam na forma de levedura. Esses tipos sexuais

também estão relacionados aos aspectos da virulência sendo o MATα se

apresenta como o mais virulento e também mais freqüente. Este trabalho tem

como objetivo determinar o tipo sexual – mating type de isolados clínicos de

Cryptococcus neoformans através da Reação em Cadeia da DNA Polimerase

(PCR) em Sergipe. As cepas são pertencentes do banco de linhagens do

Laboratório de Microbiologia Aplicada da Universidade Federal de Sergipe. 13

amostras de Cryptococcus neoformans a partir do líquor de pacientes com

meningite infecciosa em Sergipe durante o período de 2001 e 2004. Os

procedimentos laboratoriais relacionados a biologia molecular (extração de

DNA e realização da PCR) seguiu como referência Chatuverdi et al. (2000).

Todas as amostras de Cryptococcus neoformans testadas, tanto aquelas

pertencentes à variedade neoformans como gattii são matting type a,

considerado de maior virulência.

Palavras-chaves: Cryptococcus neoformans; tipo sexual; MAT; alpha mating

type

6.1 INTRODUÇÃO

O Cryptococcus neoformans é um fungo oportunista que desencadeia

meningite e acomete mais freqüentemente pacientes imunodeprimidos (CD4 <

100 cels/mm³) embora recentemente venha ocorrendo em pacientes

imunocompetentes (PINNER et al., 1995; POWDERLY et al., 1996).

O ciclo de vida de Cryptococcus neoformans envolve uma fase

anamorfa (leveduriforme, presente tanto na natureza quanto em espécimes

clínicos) e uma teleomorfa (filamentosa, ausente em espécimes clínicos), com

formação de basidiósporos, indicando que o estado sexual do fungo existe na

natureza. Os basidiósporos são dispersos no ar e podem atingir os pulmões

(ELLIS; PFEIFFER, 1990). A reprodução sexual de ambas variedades de

Cryptococcus neoformans tem sido observada sob condições laboratoriais.

Conjugações entre os tipos sexuais (mating types) – MAT α e MAT a, resultam

na formação de micélio dicariótico, com a presença de basídios, seguida por

meiose com formação de basidiósporos que germinam na forma de levedura

(KWON-CHUNG et al., 1992).

O “mating type” tem sido postulado como um fator de virulência e

sugere-se que o mating type α é mais virulento e comum em amostras clínicas

(KWON-CHUNG et al., 1992).

Detectou-se a ocorrência natural do estagio sexual de Cryptococcus

neoformans no seu habitat natural como fezes de pombo e oco de arvore viva

mostrando que a levedura apresenta a fase sexual no seu desenvolvimento

natural no ecossistema (SWUINNE et al.; 1992).

Este trabalho tem como objetivo determinar o tipo sexual – mating type de

isolados clínicos de Cryptococcus neoformans através da Reação em Cadeia

da DNA Polimerase (PCR) em Sergipe.

6.2 MATERIAL E MÉTODO

6.2.1 Amostras de Cryptococcus neoformans

As cepas são pertencentes do banco de linhagens do Laboratório de

Microbiologia Aplicada da Universidade Federal de Sergipe. 13 amostras de

Cryptococcus neoformans a partir do líquor de pacientes com meningite

infecciosa em Sergipe durante o período de 2001 e 2004.

Cabe ressaltar que cada isolado clinico gerou uma cepa discriminada e

identificada, porém, após a semeadura, cada colônia foi subcultivda e

identificada como cepas individuais da mesma amostra. Tal metodologia

permitiu obter uma análise através da variabilidade intracolonial de cada cepa

isolada podendo verificar algum caso de conjugação entre colônias com

estagio sexual diferente.

Como cepas controle, foram utilizadas as amostras padrão ATCC 28957

(matting type α) e ATCC 28958 (matting type a) respectivamente, fornecidas

pelo Laboratório de Micologia Ambiental do Instituto Evandro Chagas da

Fundação e Instituto Osvaldo Cruz – Rio de Janeiro. Todas as amostras foram

cultivadas em YM Agar (Yeast modified Agar) e incubadas à 25ºC durante 48

horas. Os procedimentos laboratoriais relacionados a biologia molecular

(extração de DNA e realização da PCR) seguiu como referência Chatuverdi et

al. (2000).

6.2.2 Presença e integridade do DNA fúngico extraído

O material extraído (DNA fúngico) de cada amostra foi colocado em gel de

agarose a 1,6%, numa corrida de eletroforese utilizando tampão de corrida TBE

1x (0,89M Tris, 0,89M Borato e 0,02M EDTA pH 8,4) em 70V por uma hora. O

resultado da corrida foi visualizado num transluminador 110V com brometo de

etídio 4µL. Utilizou-se marcador molecular de 100pb e 3µL de corante orange

para realizar o contraste do DNA extraído.

A concentração do DNA extraído foi verificada em espectrofotômetro

(Amersham pharmacia biotech – Gene Quant Pro) a 260nm. Para tanto o DNA

extraído foi diluído com água ultrapura para uma concentração final de

20ng/µL. O DNA foi estocado a –20ºC.

6.2.3. A reação da PCR

Para a reação da PCR foram utilizados os seguintes “primers” de acordo

com Chatuverdi et al. (2000).

- MAT α 1 (senso): 5’  3’ : CTT CAC TGC CAT CTT CAC CA

- MAT α 2 (antisenso): 5’  3’: GAC ACA AAG GGT CAT GCC A

- MAT a 1 (senso): 5’  3’: CGC CTT CAC TGC TAC CTT CT

- MAT a 2 (antisenso): 5’  3’: AAC GCA AGA GTA AGT CGG GC

Foi utilizado um ciclo térmico para amplificação do DNA alvo da seguinte

forma: 1 ciclo de 95ºC por 3 minutos; 30 ciclos: de 94ºC, 57,5ºC e 72ºC por 1

minuto cada. Finalizando com 1ciclo de 72ºC por 7 minutos.

A reação de PCR foi padronizada para um volume final de 25µL. Em

todos os tubos foi colocado 5µL do DNA template (DNA extraído) numa

concentração de 20ng/µL; 6,25µL de tampão com DNTP (280µL de água

ultrapura, 200µL de tampão 10x e 20µL de DNTP a 2mM); 1,5µL de MgCl

;

1,25µL do primer senso; 1,25µL do primer antisenso; 0,25µL de Taq DNA

polimerase e 9,5µL de água ultrapura estéril. Toda a reação foi realizada em

capela especifica para PCR sanitizada.

6.2.4 Corrida eletroforética do produto de PCR

O material amplificado realizou uma corrida em cuba de eletroforese

100V por uma hora em gel de agarose 2%. Colocaram-se 3µL de orange com

17µL do produto de PCR para auxiliar no contraste. Foi utilizado marcador

molecular de 100 e 50pb. Os produtos da PCR foram visualizados com

brometo de etídio em transluminador de 110V.

6.2.5 Análise dos produtos de PCR

As bandas, que apresentaram um tamanho de 117pb foram identificadas

como “mating type” a. Já bandas que apresentaram tamanho de 101pb foram

identificadas como “mating type” α. As comparações de tamanho foram

baseadas nas cepas padrão corrido em paralelo às amostras clinica – ATCC

28958 – “matting type” a e ATCC 28957 matting type α. Na ultima canaleta foi

colocado o branco (reação da PCR sem os “primers”).

6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A extração de DNA fúngico produziu um material limpo com pouco rastro

(contaminação com DNA estranho e/ou proteínas) com exceção das amostras

sete, 12 e 13, mas nada que interferiu na realização da PCR.

Nas Figuras 01 e 02 observa-se o produto de PCR. Nas canaletas

números 1 e 20 está o marcador molecular de 100pb; após o marcador

molecular sempre na primeira canaleta, pode-se observar o material

amplificado pelo “primer” MAT α e logo em seguida pelo “primer” MAT a. Em

ambas as canaletas a mesma amostra.

50 pb

Primer

Branco

1a b 2a b 3a b 4a b 5a b 6a b 7a b 8a b 9 1a b 2a b 3a b 4a b 5a b 6a b 7a b 8a b 9

Figura 1

–

Resultado da PCR para detecção do est

ágio sexual de

Cryptococcus

neoformans

isolados clínicos em Sergipe no período de 2001 a 2004, amostras de

1 a 9.

As Figuras 1 e 2 observam-se que todas as amostras de Cryptococcus

neoformans testadas, tanto aquelas pertencentes à variedade neoformans

como gattii são matting type α, considerado de maior virulência. Isto corrobora

com o comportamento dessas cepas frente aos agentes antifúngicos (dados

não publicados) e com os dados clínicos.

Estudo realizado por Fortes et al (2001) realizado com amostras clínicas

e ambientais de Roraima, no Norte do Brasil, também apresentaram baixa

diversidade do tipo sexual. Nessas amostras, os isolados ambientais todas

Figura 2

–

Resultado da PCR para detecção do estágio sexual de

Cryptococcus

neoformans

isolados clínicos em Sergipe no período de 2001 a 2004, amostras 10

a 13 alem dos padrões.

MAT a - 117pb

ATCC 28958

Branco

MAT α - 101pb

ATCC 28957

50pb

10 11 12 13 13D

foram MAT α e isolados clínicos: 10 amostras foram MAT α e apenas 1

amostra foi MAT a. Esta cepa, através do teste de cruzamento in vitro, revelou

autofertilidade.

Outro trabalho realizado com amostras do Estado de São Paulo

(MATSUMOTO et al., 2003) demonstrou que a ocorrência do tipo MAT α, em

todas as amostras analisadas, o que corrobora com os dados aqui

apresentados. Pereira et al (2004) com amostras do Estado de Minas Gerais

também obtiveram um grande percentual de matting type α (88 %) contra

apenas 12% heterozigotos. Fraser et al (2003); Halliday et al (1999) e Kwon-

Chung et al (1978) relataram que em 95% dos casos de criptococose os

isolados apresentaram frutificação haplóide do tipo matting type α.

Martins et al (2004) mostraram resultados do Meio-Norte do Brasil nos

quais o matting type α foi detectado em 85 amostras, nenhum matting type a foi

detectado e em 5 isolados, e a seqüência do gene do feromônio não foi

detectada pelos primers utilizados. Estes resultados sugeriram um melhor

estudo relacionado ao desenho dos primers. Essas amostras circulam em uma

região endêmica para a criptococose no Brasil e apresentaram as mesmas

características apresentadas pelas amostras isoladas neste trabalho.

Wicles et al (1996) citaram que os “matting type” α produzem propágulos

infecciosos com diâmetro de 3µm ou até menos e formação de cápsulas com

pequena espessura. Segundo estes autores, tais características são

fundamentais na capacidade de resistência desse propágulo ao dessecamento

e favorece o escape dos mecanismos de defesa do hospedeiro, o que facilitou

a invasão e conseqüentemente a infecção pelo Cryptococcus neoformans.

Através da PCR, Chatuverdi et al. (2000) encontraram amostras tanto

MAT a como MAT α. Neste mesmo trabalho foram encontradas apenas duas

amostras positivas para MAT a enquanto que 53 amostras apresentaram

positividade para MAT α, relação que está em acordo com os dados deste

trabalho.

Tscharkea et al (2003) estabeleceram que a frutificação haplóide em

Cryptococcus neoformans não é exclusivo do sistema MAT e até o momento

não se tem nenhuma evidência da associação genética entre o tipo de

acoplamento no cruzamento e a frutificação haplóide. A frutificação haplóide

serve como um mecanismo da sobrevivência para a levedura na natureza e em

espécimes clínicos.

Macedo et al (2001) relataram a ocorrência de Cryptococcus

neoformans no “habitat” de tatu no Nordeste do Brasil de ambos tipos sexuais.

Os resultados deste trabalho induz a novos desdobramentos com

relação à frutificação e recombinação das amostras clinicas aqui trabalhadas

com vistas na verificação da diversidade molecular dessas cepas e sua relação

com as características fenotípicas.

6.4 CONCLUSÃO

Todas as cepas circulantes de Cryptococcus neoformans, isolados do

líquor de pacientes com meningite infecciosa em Sergipe no período de 2001 a

2004 pertencem ao matting type α .

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CAPÍTULO 05

7. DISCUSSÃO GERAL

As amostras 6 e 10 diferem das outras por serem variedade gattii enquanto

que as outras são pertencentes a varidade neoformans. Porem os resultados

obtidos no perfil de sensibilidade não mostraram evidencia que apresente que

uma variedade seja mais resistente que outra no trabalho. Nota-se certa

diferença dentro da variedade neoformans em que as amostras 09 e 11

apresentaram resistência ao fluconazol já as amostras 01, 02 e 03

apresentaram sensibilidade para a anfotericina B.

Um fato de destaque é que o restante das amostras apresentou valores que

as caracterizam como cepas resistentes independentes de ser neoformans ou

gatti.

Em relação ao mating type sexual não foi apresentando diferença entre as

variedades encontradas já que todas as amostras foram MAT α.

Trabalhos futuros serão necessários para determinar ou não genes de

resistência que evidenciem esses perfis de sensibilidade; como também

experimentos que complementem as analises de epidemiologia molecular que

aumentem as informações a respeito sobre esse microrganismo importante

atualmente no cenário nacional além de verificar como se caracterizam os

isolados de diversos nichos ambientados onde são encontradas essas

leveduras patogênicas.

CAPÍTULO 6

8. CONCLUSÕES GERAIS

A maioria das amostras de Cryptococcus neoformans isolado de líquor de

pacientes com meningite infecciosa no Estado de Sergipe no período de 2001

a 2004 são da variedade neoformans.

Apenas duas amostras de Cryptococcus neoformans isolados clínicos

pertence à variedade gattii sendo uma delas isolada de paciente soro negativo

para HIV.

Os agentes antifúngicos são eficientes em inibir o crescimento de

Cryptococcus neoformans em Sergipe.

Todas as cepas circulantes de Cryptococcus neoformans, isolados do líquor

de pacientes com meningite infecciosa em Sergipe no período de 2001 a 2004

são pertencentes ao tipo sexual alpha ou matting type α.

CAPÍTULO 7

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS