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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE ESTUDOS GERAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
PATRÍCIA DE ABREU MARQUES COENTRÃO
AVALIAÇÃO DE TRÊS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO DE
POLIFENÓIS: aplicação em amostras de chocolate meio amargo
Dissertação apresentada ao
Curso de Pós-Graduação em
Química da Universidade Federal
Fluminense, como requisito
parcial para obtenção do Grau de
Mestre. Área de Concentração:
Química Analítica.
Orientadora: Prof
a
Dr
a
ANA MARIA R. TEIXEIRA
Niterói
2005
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1
PATRÍCIA DE ABREU MARQUES COENTRÃO
AVALIAÇÃO DE TRÊS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO DE
POLIFENÓIS: aplicação em amostras de chocolate meio amargo
Dissertação apresentada ao Curso
de Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal Fluminense,
como requisito parcial para
obtenção do Grau de Mestre. Área
de Concentração:Química Analítica.
Aprovada em Janeiro de 2005
BANCA EXAMINADORA
Prof
a
. Dr
a
Marta Regina Verruma Bernardi
Faculdade de Nutrição/UFF lotada na
Universidade Federal de São Carlos
Prof
a
. Heloísa Helena Rosmaninho Mantovani
Faculdade de Nutrição
Universidade Federal Fluminense
Prof
a
. Dr
a
Ana Maria R. de F. Teixeira
Instituto de Química
Universidade Federal Fluminense
Prof
o
. Dr
o
. Ricardo Erthal Santelli
Instituto de Química
Universidade Federal Fluminense
Niterói
2005
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2
Coentrão, Patrícia de Abreu Marques
Avaliação de três técnicas de isolamento de polifenóis: aplicação em
amostras de chocolate meio amargo/Patrícia de Abreu Marques Coentrão. –
Niterói:[s.n.], 2005.
110 f.,30 cm.
Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal Fluminense,
2005.
Bibliografia: f. 106 -109.
1. Isolamento de Polifenóis. I. Título.
3
Meus Sinceros Agradecimentos
- Agradeço primeiramente a Deus, por me conceder vida e saúde para a
realização deste trabalho;
- Aos meus queridos pais, José Marques e Neiva, por todo amor, dedicação e
paciência. As minhas irmãs, pela amizade;
- Ao meu querido marido, Léo, por todo apoio, carinho, compreensão e ajuda nos
momentos mais difíceis. Aos meus sogrinhos, Cláudio e Jane por estarem
sempre presentes em todos os momentos;
- Aos grandes amigos: Renata, Rosanna, Liliane, Alessandra, Fernando, Jaílton e
Ana, e a todos os companheiros do Mestrado em Química;
- Ao pessoal dos laboratórios 410, ex-física e 201/202, pelos preciosos momentos
de descontração;
- À Capes, pelo apoio financeiro;
- À Frederico Guilherme, pela amizade e ajuda essencial na percolação das
colunas cromatográficas de isolamento;
- À amiga Rosanna, pela ajuda na leitura das soluções do padrão através da
espectrofotometria no ultravioleta;
- Ao bolsista de graduação em Farmácia, Leandro, pelo essencial treinamento do
uso do equipamento HPLC;
- À minha orientadora, Prof
a
Dr
a
Ana Maria, pelo auxílio e colaboração;
- À Prof
a
Dr
a
Ana Albino da Faculdade de Farmácia, pela informação sobre o
mestrado;
- Aos meus professores Antônio Silva (UFRJ), Santelli, Sílvia e Denise; pelo
fundamental auxílio técnico e fornecimento de insumos necessários à realização
deste trabalho;
- Ao pessoal da Sinc (Marcus, Rogério, Sidney e Gustavo) e ao Ciro da Tédia; pelo
rápido e importante apoio técnico;
- À Marcos Pereira Rosa, pelo belíssimo trabalho desempenhado no laboratório de
Hialotecnia da UFF;
- Enfim, à todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a execução
deste trabalho de pesquisa.
4
“Let food be the medicine and medicine be the food”
“Faça do alimento o seu medicamento”
Hipócrates (2500 anos atrás)
5
RESUMO
Os polifenóis são componentes intrínsecos do cacau, e assim, produtos
derivados do cacau, como o chocolate, podem ser considerados como alimento
funcional por conferirem efeitos benéficos à saúde do consumidor, como é sugerido
para o vinho tinto e o chá verde ou preto. Devido à evidência de que os polifenóis
podem agir como potenciais antioxidantes, desempenhar uma importante função na
redução do risco ou retardo do desenvolvimento de doenças, como as
cardiovasculares, câncer e outras relacionadas à idade; e ainda, modular processos
biológicos essenciais em mamíferos in vivo; as áreas de nutrição e medicina têm tido
um especial interesse nestes compostos. O principal objetivo deste trabalho foi
avaliar novas fases estacionárias para isolamento de polifenóis, através do uso da
espuma de poliuretano e de resina polimérica (XAD-16) e determinar a fase de maior
eficiência, comparando-se os dados obtidos com aqueles descritos na literatura
(C18). O monitoramento da eficiência do processo foi feito por cromatografia líquida
de alta eficiência (HPLC), cujos dados permitiram estabelecer um índice que mede a
relação P/C, como sendo a relação entre o maior pico do polifenol e o maior pico do
carboidrato, expressos através de suas alturas ou absorbâncias (mAU). A resina
XAD-16 se mostrou como a fase de maior eficiência e foi usada para isolar os
polifenóis presentes em amostras de chocolate. Foi alcançada uma significativa
separação dos polifenóis com reprodutibilidade comprovada através dos
experimentos em triplicata. Nesta fase estacionária, a água se apresentou como um
eluente adequado para carboidratos, enquanto o metanol foi eficaz na eluição dos
polifenóis, pois foram obtidas frações cujos cromatogramas permitiram calcular
razões P/C muito maiores que 100%, mesmo diante de teores muito pequenos de
polifenóis.
Palavras-chaves: polifenóis, chocolate, cromatografia, coluna C18, resina XAD-16 e
espuma de poliuretano.
6
ABSTRACT
Polyphenols were intrinsic components of the cocoa; therefore, derivative
products of cocoa, like chocolate, can be considered functional food, bringing
beneficial effects to costumer's health, as it is suggested for red wine and green or
black tea. Nutrition and medicine areas have dedicated special attention to these
components. That is due to evidences that polyphenols can act as potential
antioxidants, and that they can carry out an important function in the reduction of the
risk or delay of the development of diseases, like the cardiovascular ones, cancer
and other ones related to aging; and yet, that they can modulate essential biological
processes mammals in vivo. The first objective of this work was to evaluate novel
stationary phases for the isolation of polyphenols, by the use of polyurethane foam
and of a polymeric resin (XAD-16). Therefrom, to determine the best phase by
comparison of performance with the one of a phase previously described in literature
(C18), by high-performance liquid chromatography (HPLC). Once the phase is
chosen, the second objective is to isolate polyphenols from chocolate samples. An
index was established to monitor the performance by the ratio P/C, the ratio of
heights or absorbances (mAU) of the largest peak among the ones attributed to
polyphenols and the largest peak among the ones attributed to carbohydrates. The
chosen column was XAD-16, given the observed separation of the polyphenols and
reprodutibility of elutions, which was confirmed by triplicate procedures. The
polymeric resin XAD-16 was shown as a quite effective way to isolate polyphenols
from carbohydrates because the latter are eluted with water while the polyphenols
are retained. Subsequent methanol elution was considered quite appropriate for the
recovery of polyphenols, because the chromatograms of the fractions obtained
yielded P/C ratios much higher than 100%, even considering very small contents of
polyphenols.
Key-Words: polyphenols, chocolate, chromatography, column C18, resin XAD-16 and
polyurethane foam.
7
S U M Á R I O
1 - Introdução ...............................................................................................................12
1.1 - Importância dos polifenóis ...........................................................................................14
1.2 - Justificativa...................................................................................................................15
2 - Objetivos.................................................................................................................. 17
2.1 - Objetivo Geral ..............................................................................................................17
2.2 - Objetivos Específicos ...................................................................................................17
3 - Revisão de Literatura ..............................................................................................19
3.1 - Química dos polifenóis.................................................................................................19
3.2 - Ocorrência dos polifenóis .............................................................................................26
3.3 - Biodisponibilidade dos polifenóis ................................................................................28
3.4 - Atividade antioxidante dos polifenóis em alimentos....................................................31
4 - Metodologia disponível para análise, isolamento, purificação e identificação ....37
4.1 - Isolamento de polifenóis em coluna de sílica modificada com C18.............................38
4.2 - Isolamento de polifenóis em espumas de poliuretano ..................................................43
4.2.1 - Definição, estrutura e síntese da espuma de poliuretano .................................................... 45
4.3 - Isolamento de polifenóis por meio de resina polimérica ..............................................50
5 - Análise quantitativa dos flavonóides.......................................................................53
5.1 - Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) .........................................................54
6 - Materiais e Métodos................................................................................................59
6.1 – Preparo de solução padrão estoque de polifenóis ........................................................59
6.1.1- Medidas da estabilidade da solução padrão de polifenóis usando espectrofotometria ........ 60
6.1.2 – Medida de estabilidade das soluções padrão de polifenóis usando HPLC......................... 61
6.1.3 - Procedimento de Extração em Fase Sólida usando coluna empacotada com C18.............. 61
6.1.4 - Otimização da Extração em Fase Sólida com a coluna XAD-16........................................ 63
6.1.5 - Otimização da Extração em Fase Sólida com a coluna de espuma de poliuretano............. 64
6.2 - Estudo com amostras de chocolate ...............................................................................66
6.2.1 - Procedimento experimental aplicado as amostras .............................................................. 66
6.2.2 - Pré-tratamento das amostras............................................................................................... 67
8
6.2.3 - Percolação da amostra por uma coluna de resina XAD- 16 ............................................... 68
6.3 - Caracterização dos Polifenóis por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(HPLC) 69
7 - Resultados e Discussão ...........................................................................................70
7.1 - Estudo com padrão .......................................................................................................70
7.1.1 - Avaliação das medidas da estabilidade da solução padrão de polifenóis usando
espectrofotometria
............................................................................................................................ 70
7.1.2 - Avaliação da estabilidade do padrão através do sistema de HPLC .................................... 78
7.1.3 - Condições de Contorno do Padrão para as colunas C18, XAD-16 e Espuma .................... 82
7.1.4 - Avaliação da coluna C18.................................................................................................... 83
7.1.5 - Avaliação da coluna XAD-16............................................................................................. 84
7.1.6 - Avaliação da coluna de espuma de poliuretano.................................................................. 87
7.1.7 - Seleção da melhor coluna de extração em fase sólida ........................................................ 87
7.2 - Estudo com amostras de chocolate ...............................................................................88
7.2.1 - Condições de Contorno das Amostras na Coluna XAD-16................................................ 89
7.2.2 - Avaliação da marca A......................................................................................................... 98
7.2.3 - Avaliação da marca B....................................................................................................... 100
7.2.4 - Comparação entre as marcas A e B .................................................................................. 101
9 - Referências Bibliográficas ....................................................................................105
9
Lista de Figuras
Figura 1 - Estruturas de polifenóis comuns encontrados no chocolate.
8
............................... 20
Figura 2 - Ciclo biossintético dos metabólitos secundários
29
.............................................. 21
Figura 3 - Estrutura básica e sistema de numeração dos Flavonóides................................. 24
Figura 4 - Possíveis rotas dos polifenóis ingeridos por humanos. ........................................ 30
Figura 5 - Estrutura da quercetina, mostrando as características estruturais relacionadas à
capacidade antioxidante........................................................................................................ 34
Figura 6 - Perfil do procedimento geral de trabalho para análise, quantificação, isolamento e
elucidação da estrutura dos polifenóis em alimentos.
12, 66, 67, 68, 69
......................................... 37
Figura 7 - Superfície em escova da fase ligada alquil na sílica gel....................................... 41
Figura 8 - Reações comumente empregadas na preparação da EPU.................................. 47
Figura 9 - Reações paralelas que ocorrem durante a preparação das EPU: formação das
ligações cruzadas e das ramificações................................................................................... 48
Figura 10 - Estrutura química da resina XAD-16 (estireno-divinilbenzeno)........................... 51
Figura 11 – Coluna C18......................................................................................................... 62
Figura 12 - Coluna XAD-16 ................................................................................................... 63
Figura 13 – Coluna de Espuma de Poliuretano..................................................................... 65
Figura 14 - Espectro de absorção para o padrão Polyphenon 60......................................... 70
Figura 15 – Variação da absorbância em função da concentração obtida na faixa do visível
(
λ
=440nm). ............................................................................................................................ 71
Figura 16 - Comparação entre as absorbâncias de soluções recolhidas da coluna C18
(cartucho) provenientes da percolação do Padrão 1 (
λ
=440nm). ......................................... 72
Figura 17 - Curva de calibração para as soluções preparadas a partir do Padrão 1
(
λ
=280 nm) . .......................................................................................................................... 73
Figura 18 - Curva de calibração para as soluções preparadas a partir do Padrão 2
(
λ
=280 nm) . .......................................................................................................................... 73
Figura 19 - Curva de calibração para soluções preparadas a partir do Padrão 2 (
λ
=280 nm).
............................................................................................................................................... 74
Figura 20 - Acompanhamento da estabilidade ao longo do tempo, apenas para a solução de
6,40 ppm em água, originada do padrão 2, no comprimento de onda igual a 280 nm. ........ 75
Figura 21 - Acompanhamento da estabilidade ao longo do tempo, apenas para a solução de
25,50 ppm em água, originada do padrão 2, no comprimento de onda igual a 280 nm. ...... 75
Figura 22 - Comparação da estabilidade para uma solução de 510 ppm, originada do padrão
3; usando-se a mistura de acetona, acido acético e água como solvente, no comprimento de
onda igual a 280 nm. ............................................................................................................. 77
10
Figura 23 - Cromatograma do padrão de chá verde Polyphenon 60 .................................... 78
Figura 24 - Acompanhamento da estabilidade do padrão de chá verde em água ao longo do
tempo, através de seus analitos: carboidrato 1 (CH1), carboidrato 2 (CH2), polifenol 1 (Pf1) e
polifenol 2 (Pf2).
..................................................................................................................... 79
Figura 25 - Comparação da estabilidade entre os carboidratos e polifenóis contidos no P1 e
no P2, do primeiro dia de análise e dezesseis dias depois.
.................................................. 80
Figura 26 - Acompanhamento da estabilidade do padrão de chá verde em meio não aquoso,
ao longo do tempo: carboidrato 1 (CH1), carboidrato 2 (CH2), polifenol 1 (Pf1) e polifenol 2
(Pf2).
...................................................................................................................................... 81
Figura 27 - Cromatograma do Padrão Polyphenon 60 após ter sido adicionado a coluna
XAD-16.
................................................................................................................................. 85
Figura 28 - Cromatograma do Padrão Polyphenon 60 após ter sido adicionado a coluna
XAD-16 (duplicata).
............................................................................................................... 85
Figura 29 - Cromatograma do Padrão Polyphenon 60 após ter sido adicionado a coluna
XAD-16 (triplicata).
................................................................................................................ 86
Figura 30 - Cromatograma do Padrão Polyphenon 60 após ter sido adicionado a coluna
XAD-16 (Zoom do Carboidrato 1 e do Polifenol 1).
............................................................... 86
Figura 31 - Cromatograma da amostra de chocolate meio amargo da marca A1................. 91
Figura 32 - Cromatograma da amostra de chocolate meio amargo da marca A2................. 91
Figura 33 - Cromatograma da amostra de chocolate meio amargo da marca A3................. 92
Figura 34 - Cromatograma da amostra de chocolate meio amargo da marca B1................. 92
Figura 35 - Cromatograma da amostra de chocolate meio amargo da marca B2................ 93
Figura 36 - Cromatograma da amostra de chocolate meio amargo da marca B3................. 93
Figura 37 - Polifenóis da amostra de chocolate meio amargo da marca A1, sem os
carboidratos.
.......................................................................................................................... 94
Figura 38 - Polifenóis da amostra de chocolate meio amargo da marca A2, sem os
carboidratos.
.......................................................................................................................... 94
Figura 39 - Polifenóis da amostra de chocolate meio amargo da marca A3, sem os
carboidratos.
.......................................................................................................................... 95
Figura 40 - Polifenóis da amostra de chocolate meio amargo da marca B1, sem os
carboidratos.
.......................................................................................................................... 95
Figura 41 - Polifenóis da amostra de chocolate meio amargo da marca B2, sem os
carboidratos.
.......................................................................................................................... 96
Figura 42 - Polifenóis da amostra de chocolate meio amargo da marca B3, sem os
carboidratos.
.......................................................................................................................... 96
11
Lista de Tabelas
Tabela 1- Estruturas das Catequinas e Procianidinas........................................................... 20
Tabela 2 - Principais classes de compostos polifenólicos
28
................................................ 22
Tabela 3 - Classificação dos principais flavonóides em alimentos
30
.................................... 23
Tabela 4 - Coeficientes de distribuição e capacidade de absorção do fenol em espuma de
poliuretano.
84
........................................................................................................................ 50
Tabela 5 - Composição das soluções-estoque P1, P2 e P3 ................................................. 61
Tabela 6 - Experimentos realizados na Coluna C18 ............................................................. 62
Tabela 7 - Experimentos realizados na Coluna XAD-16 ....................................................... 63
Tabela 8 - Experimentos realizados na Coluna de Espuma de Poliuretano ......................... 65
Tabela 9 - Volume do extrato das amostras A e B de chocolate, percolado pela resina XAD-
16 e volume de eluente usado.................................................. Erro! Indicador não definido.
Tabela 10 - Valores de Absorbâncias medidos para soluções recolhidas a partir do Padrão
1, após percolarem a coluna C18 cartucho. (
λ
=280 nm). ..................................................... 74
Tabela 11 - Valores de Absorbância medidos para as soluções preparadas a partir do
Padrão 3 (padrão em meio de acetona, água e ácido acético)-
λ
=280 nm........................... 76
Tabela 12 - Resultados relevantes encontrados para a coluna C18..................................... 83
Tabela 13 - Resultados relevantes encontrados para a coluna XAD-16............................... 84
Tabela 14 - Resultados relevantes encontrados para a coluna de espuma.......................... 87
Tabela 15 - Relação P/C das amostras de referência das marcas A e B equivalentes a
100%...................................................................................................................................... 90
Tabela 16 - Resultados relevantes encontrados para a amostra A....................................... 98
Tabela 17 - Resultados relevantes encontrados para a amostra B..................................... 100
12
1 - Introdução
O cacau é fruto do cacaueiro (Theobroma cacao) e significa, em grego,
“alimento dos deuses”. O cacau cresce nas regiões quentes do mundo e suas
sementes não podem ser ingeridas diretamente da árvore, sem serem submetidas a
um tratamento prévio. Elas têm primeiramente que ser fermentadas e secas.
Desde os primórdios do século VI, os Maias tinham suas plantações de cacau
na América Central. Neste tempo, o cacau tinha duas funções: era usado para
preparar uma deliciosa bebida e também era utilizado como uma forma de
pagamento.
1
No século XVI, o chocolate foi levado para a Europa e então, em 1875, Daniel
Peters fez o primeiro chocolate feito com leite e em 1880, Rodolphe Leindt fez um
suave chocolate derretido pela adição de manteiga de cacau à massa de chocolate
(líquor).
1
A idéia que o chocolate ou o cacau podem conferir alguns benefícios à saúde
não é necessariamente um conceito novo. Quando Cortez visitou a América Central,
uma de suas primeiras observações foi à rotina do uso do chocolate,
particularmente, pelo alto sacerdócio. O mais curioso foi referente ao chocolate
primariamente como um medicamento e documentos históricos na Europa referem-
se ao valor medicinal do chocolate.
2
Entre 1600 e 1700, o chocolate e o cacau eram vistos não apenas como uma
bebida de sabor agradável; mas, primariamente, como um alimento para tratar
13
alguns distúrbios, incluindo a angina e dores no coração. O conceito de que as
bebidas do cacau poderiam prover benefícios à saúde foi amplamente aceito até por
volta de 1850 e início de 1900. Somente nos últimos 30 a 40 anos, as percepções do
chocolate mudaram de um alimento medicinal para apenas um doce, sem efeitos
benéficos ou possíveis efeitos negativos para a saúde.
2
A avaliação sensorial dos alimentos é uma característica primária do homem
que desde a infância, aceita ou rejeita os alimentos, de acordo com a sensação que
experimenta ao ingerí-los. Assim, o chocolate, por suas propriedades de sabor, goza
de uma aceitação quase universal.
1
O chocolate é um alimento de grande valor nutritivo e energético (cerca de
523,8 Kcal por 100g) que permite uma rápida metabolização por parte do organismo
humano. Seus três ingredientes: cacau, leite e açúcar levam-no a ser considerado
como um dos alimentos melhor balanceados que existem, devido ao teor de
proteínas, carboidratos, lipídios, sais minerais e vitaminas.
1
Os produtos do cacau e do chocolate têm sido iguarias por centenas de anos.
Só ultimamente, eles têm sido reconhecidos como fontes significativas de
fitoquímicos com efeitos desejáveis a saúde. Esses alimentos estão entre as fontes
mais concentradas de flavonóides como as procianidinas, catequinas e
epicatequinas.
2
Os flavonóides são os polifenóis mais abundantes de nossa dieta e o
consumo de polifenol como flavonóides tem sido alvo de interesse de consumidores
e indústrias alimentícias por várias razões. Estudos epidemiológicos têm sugerido
associações entre o consumo de bebidas ou alimentos ricos em polifenóis e a
prevenção de doenças.
3
Uma segunda razão está ligada à natureza química fundamental dos
polifenóis. Os polifenóis são agentes redutores e junto com outros agentes redutores
da dieta, como a vitamina C, vitamina E e carotenóides, eles protegem os tecidos
corporais contra o estresse oxidativo.
3
14
Estudos atuais têm mostrado que esses polifenóis (procianidinas, catequinas
e epicatequinas) são absorvidos no intestino de animais e humanos, sendo a
epicatequina absorvida muito mais que a catequina. Esses flavonóides têm potencial
antioxidante e atividades anti-plaquetárias, através do consumo de cacau ou de
chocolate.
2
1.1 - Importância dos polifenóis
Por décadas, os polifenóis de plantas despertaram o interesse de cientistas,
porque eles são essenciais a fisiologia da planta, pela contribuição em sua
morfologia (pigmentação), envolvimento no crescimento e reprodução, e ainda,
oferecendo resistência a patógenos e predadores.
4 - 6
Os perfis de polifenóis de plantas diferem entre variedades da mesma espécie
e, portanto, eram pesquisados com propósitos taxionômicos ou para determinar
adulteração em produtos alimentícios.
4 - 6
Os polifenóis possuem várias aplicações industriais, como na produção de
tintas, papéis e cosméticos, como agentes taninos e como aditivos (corantes
naturais e conservantes) na indústria de alimentos. Além disso, alguns compostos
fenólicos, os flavonóides, têm aplicações como antibióticos e agentes antidiarréicos,
antiúlcerativo e anti-inflamatório; bem como o tratamento de doenças como a
hipertensão, fragilidade vascular, alergias, hipercolesterolemia e outras.
4 - 6
Os compostos polifenólicos são onipresentes em órgãos de todas as plantas
e são, portanto, parte integrante da dieta humana. Até bem pouco tempo atrás, a
maior parte do interesse nutricional nos compostos polifenólicos era sobre os efeitos
deletérios causados pela habilidade de certos polifenóis em se ligar e precipitar
macromoléculas, como as proteínas dietéticas, carboidratos e enzimas digestivas;
reduzindo, assim, sua digestibilidade.
7
Os polifenóis têm recebido muita atenção, recentemente, devido a sua
capacidade antioxidante (reagindo com radicais livres e quelando metais) e suas
15
possíveis implicações benéficas na saúde humana, como na prevenção e tratamento
do câncer, doenças cardiovasculares e outras patologias.
8
A Associação Dietética Americana (ADA) especifica que as substâncias nos
alimentos, por exemplo, os fitoquímicos que são componentes naturais e
constituintes dos chamados alimentos funcionais, podem desempenhar uma
importante função benéfica para a saúde como parte de uma dieta variada
9
.
Dentre
os fitoquímicos, os polifenóis constituem um dos grupos de substâncias mais
numerosos e largamente distribuídos no Reino Vegetal, com mais de 8000
estruturas fenólicas conhecidas.
7
1.2 - Justificativa
Os polifenóis existem como componentes intrínsecos do cacau, e assim,
produtos derivados do cacau como o chocolate, podem ser considerados um
alimento funcional para conferir efeitos benéficos à saúde do consumidor, como é
sugerido para o vinho tinto e o chá verde ou preto.
10
A manufatura do chocolate, em particular, em relação a mudanças na
composição e no conteúdo de polifenóis não têm sido muito objeto de investigação,
com exceção dos casos de aplicação de patente
11
. Além disso, é ainda muito
limitado o conhecimento sobre o teor e a composição de polifenóis no chocolate,
especialmente no chocolate ao leite; apesar de produtos do cacau serem largamente
consumidos.
12
Devido à evidência de que os polifenóis podem agir como potenciais
antioxidantes, desempenhar uma importante função na redução do risco ou retardo
do desenvolvimento de doenças, como as cardiovasculares, câncer e outras
relacionadas à idade; e ainda, modular processos biológicos essenciais em
mamíferos in vivo; as áreas de nutrição e medicina têm tido um especial interesse
nestes compostos
13-24
. Cada vez mais, têm-se desenvolvido métodos de seleção
e/ou processamento dos grãos de cacau, para produzir componentes do cacau ou
do chocolate com níveis aumentados de polifenóis.
12
16
O Padrão de Identidade e Qualidade (PIQ) de um alimento pode ser
considerado como o conjunto de características ou atributos que o identificam ou
qualificam, ou seja, o objetivo é fixar a identidade e as características mínimas de
qualidade às quais o produto deverá obedecer
25
. De acordo com a expressão
“Padrão de Identidade”, o chocolate amargo deve apresentar pelo menos 3600 µg (à
até mais de 8000 µg) de polifenóis do cacau, por grama de chocolate, enquanto que
para o chocolate ao leite encontra-se pelo menos 1000 µg (até mais de 5000 µg),
por grama de chocolate ao leite
12
. O padrão de identidade do chocolate está
intimamente relacionado com o teor de polifenóis.
Polifenóis isolados de carboidratos e de outras espécies, ou seja, o material
puro pode ser necessário para atividades de mensuramento, por exemplo, atividade
antioxidante ou anticarcinogênica, ou para estudos de biodisponibilidade em
animais, humanos ou em cultura de células
12
. Técnicas usuais e atuais para
separação de polifenóis fundamentam-se em colunas de sílica modificada com C18,
para o caso de escala preparativa, e em coluna de sílica, num sistema de HPLC. A
coluna C18 tem custo elevado e não tem uso viabilizado sob fluxo gravitacional.
O presente estudo visa contribuir com a proposta do uso de duas técnicas de
isolamento de polifenóis, utilizando-se espumas de poliuretano-EPU e resina
polimérica, tipo Amberlite XAD-16 que, ao contrário da coluna C18, são viáveis de
uso sob fluxo gravitacional. A espuma de poliuretano é de baixo custo enquanto que
a resina é de custo elevado, mas facilmente regenerável sendo, portanto, ambas
convidativas para trabalho de rotina. Uma das técnicas avaliadas foi escolhida para
isolamento de polifenóis presentes em amostras de chocolate; adquiridas em
estabelecimento comercial de Niterói, no Estado do Rio de Janeiro.
Sendo assim, além da avaliação de novas possibilidades de isolamento de
polifenóis, este trabalho também vem contribuir gerando dados sobre polifenóis que
não estão disponíveis, na literatura, para o chocolate meio amargo produzido no
Brasil.
17
2 - Objetivos
2.1 - Objetivo Geral
Avaliar novas técnicas de isolamento de polifenóis, através do uso de espuma
de poliuretano e de resina polimérica (XAD-16) e determinar a melhor técnica
através da comparação da eficiência de separação, com os dados descritos na
literatura (C18). As técnicas foram monitoradas por meio da cromatografia líquida de
alta eficiência (HPLC) e, a mais eficiente, foi aplicada para isolamento de polifenóis
presentes em amostras de chocolate meio amargo.
2.2 - Objetivos Específicos
- Avaliar condições experimentais para isolamento dos polifenóis,
segundo o procedimento descrito na literatura;
- Avaliar condições experimentais para isolamento dos polifenóis,
através da percolação em espuma de poliuretano;
- Avaliar condições experimentais para o isolamento de polifenóis,
utilizando-se coluna de resina (XAD-16);
- Comparar a eficiência do isolamento de polifenóis nas três técnicas
citadas, em escala preparativa: aquela usualmente divulgada na
literatura (C18), o uso de espuma de poliuretano e de coluna de resina;
18
- Isolamento dos polifenóis, em amostras de chocolate meio amargo, de
acordo com a técnica avaliada como a mais eficiente e monitoramento
por HPLC.
19
3 - Revisão de Literatura
3.1 - Química dos polifenóis
As plantas fornecem fontes alimentares aos animais que contém diversos
tipos de compostos químicos comumente chamados de fitoquímicos. Os polifenóis
são uma classe de fitoquímicos, com pelo menos 8.000 membros conhecidos.
7
O cacau é rico em polifenóis particularmente em catequinas (flavan-3-ols ou
sub-classe flavanol) e procianidinas (catequinas oligoméricas e poliméricas). O
conteúdo de polifenol total do grão é cerca de 6-8% do peso do grão seco.
10
As catequinas monoméricas predominantes no chocolate são (+)- catequina
(C) e (-)- epicatequina (EC). As procianidinas são uma classe de compostos
polifenólicos encontradas em várias espécies de plantas e podem estar presentes
como monômeros individuais ou, em alguns casos, como unidades oligoméricas
26
.
(Fig. 1)
As procianidinas são formadas pela associação de várias unidades
monoméricas (catequinas e epicatequinas): 2-5 unidades, para catequinas
oligoméricas; e acima de 5 unidades, para catequinas poliméricas. As procianidinas
diferem na posição e na configuração de suas ligações monoméricas. As estruturas
mais bem conhecidas são os dímeros de procianidinas B1, B2, B3 e B4 ; e os
trímeros, C1 e C2 (Tab.1).
27
20
R
1
=H, R
2
=OH = (+) - catequina
R
1
=OH, R
2
=H = (-) - epicatequina
Procianidina
(4ß>6) - Dímeros
Procianidina
(4ß>8) - Dímeros
Figura 1 - Estruturas de polifenóis comuns encontrados no chocolate.
8
Tabela 1 - Estruturas das Catequinas e Procianidinas.
Nome Estrutura
Procianidina B1 (-)-epicatequina-(4-8)-(+)-catequina
Procianidina B2
(-)-epicatequina-(4-8)-(-)-epicatequina
Procianidina B3 (+)-catequina-(4-8)-(+)-catequina
Procianidina B4 (+)-catequina-(4-8)-(-)-epicatequina
Procianidina C1 (-)-epicatequina-(4-8)-(-)-epicatequina-(4-8)-(-)-epicatequina
Procianidina C2 (-)-epicatequina-(4-8)-(-)-epicatequina-(4-8)-(+)-catequina
Polifenóis são um grupo de substâncias de plantas extremamente amplo e
complexo
7
. Os polifenóis são produtos do metabolismo secundário de plantas. Eles
surgem biogeneticamente por duas principais vias metabólicas sintéticas: “via do
ácido chiquímico” e “via do acetato” (Fig. 2).
28
21
Figura 2 - Ciclo biossintético dos metabólitos secundários
29
Os polifenóis naturais (Tab.2) podem abranger desde moléculas simples,
como os ácidos fenólicos, até compostos altamente polimerizados, como os taninos.
Eles ocorrem primariamente sob forma conjugada, com um ou mais resíduos de
carboidratos ligados a grupos hidroxil, embora ligações diretas da unidade do
carboidrato com um átomo de carbono aromático também existam.
7
Os carboidratos associados podem estar presentes como monossacarídios,
dissacarídios, ou mesmo como oligossacarídios. A glicose é o resíduo de carboidrato
mais comum, apesar da galactose, raminose, xilose e arabinose também serem
encontradas, bem como os ácidos glicurônico e galacturônico e muitos outros.
Associações com outros compostos, como os ácidos orgânicos, aminas e lipídios, e
ligações com outros fenóis são também comuns.
7
22
Tabela 2 - Principais classes de compostos polifenólicos
28
23
Os flavonóides, os quais constituem o grupo mais importante dos polifenóis,
com mais de 5000 compostos descritos
30
, são ilustrados em suas principais classes
fenólicas encontradas nos alimentos (Tab.3).
Tabela 3 - Classificação dos principais flavonóides em alimentos
30
24
A estrutura mais comum dos flavonóides é aquela do difenilpropano (C6-C3-
C6) e consiste em dois anéis aromáticos ligados através de três carbonos que
usualmente formam um anel heterocíclico oxigenado. A Figura 3 representa a
estrutura básica e o sistema utilizado de numeração dos carbonos nos núcleos dos
flavonóides. Biogeneticamente, o anel A, usualmente, é sintetizado pela “via do
acetato”, já o anel B é derivado da “via do ácido chiquímico”.
31
Figura 3 - Estrutura básica e sistema de numeração dos Flavonóides.
Os Flavonóides (ex: catequina, epicatequina, gallocatequina) são os
constituintes monoméricos dos taninos condensados, embora eles sejam também
muito comuns como monômeros livres.
32
Os Fenóis simples e flavonóides representam a vasta maioria dos fenóis em
plantas. A maioria desses compostos possui pesos moleculares relativamente baixos
e são solúveis de acordo com sua polaridade e estrutura química (grau de
hidroxilação, glicosilação, acilação - conversão de fenol em ésteres e etc.) Alguns
deles, entretranto, podem se ligar aos componentes da parede celular
25
(polissacarídios, lignina). Devido à natureza das ligações éster, esses compostos
podem ser solubilizados em condições alcalinas ou são em contrapartida retidos na
matriz da fibra.
7
Os taninos são compostos de peso molecular médio a alto, significativamente
hidroxilados e podem formar complexos insolúveis com carboidratos e proteínas. Os
taninos nas plantas são responsáveis pela adstringência dos alimentos, por causa
da precipitação das proteínas salivares. O termo “tanino” vem da capacidade destes
compostos em tratar peles de animais; para obtenção do couro, pela formação de
complexos estáveis tanino-proteína com o colágeno da pele.
7
Taninos condensados ou proantocianidinas são polímeros de alto peso
molecular. A unidade monomérica é um flavan-3-ol (catequina, epicatequina, etc.),
com um flavan-3,4-diol ou uma molécula de leucoantocianidina como seu precursor.
Condensações oxidativas ocorrem entre o carbono C-4 do anel heterocíclico e
carbonos C-6 ou C-8 das unidades adjacentes.
33
A literatura sobre o conteúdo dos taninos condensados de diferentes plantas
refere-se apenas as proantocianidinas oligoméricas (dímeros, trímeros, tetrâmeros),
por causa da dificuldade em analisar moléculas de alta polimerização.
Proantocianidinas, entretanto, podem ocorrer como polímeros com níveis de
polimerização de 50 ou mais.
34
Polimerização autooxidativa ou enzimática das unidades de flavan-3-ol e
flavan-3,4-diol têm sido sugeridas como um processo que leva a formação dos
taninos condensados. As ligações interflavonóides são ácido lábeis e produzem
antocianidinas durante a hidrólise ácida em soluções alcoólicas. Esta reação é
usada para determinação de moléculas de proantocianidinas.
5
Proantocianidinas oligoméricas e taninos hidrolisáveis de baixo peso
molecular são solúveis em diferentes solventes aquosos e orgânicos, como a
acetona, metanol e água. Entretanto, taninos condensados de alto peso molecular
são insolúveis. Além disso, quando os taninos formam complexos com proteína ou
polissacarídios da parede celular, eles permanecem insolúveis.
7
26
Esta insolubilidade dos taninos é responsável por erros significativos na
quantificação do conteúdo dos polifenóis de plantas, porque os polifenóis geralmente
são analisados em extratos, frequentemente omitindo a quantificação dos taninos
insolúveis e que não são extraídos desta maneira.
7
3.2 - Ocorrência dos polifenóis
Os membros da classe dos compostos polifenólicos podem ser encontrados
em vários alimentos comumente consumidos na dieta, incluindo chocolates, maçãs,
amêndoa, cevada, uvas, chá, milho, canela, cacau, amendoim, vinho, morangos,
dentre outros.
35
Os polifenóis são quase onipresentes em alimentos vegetais (hortaliças,
cereais, leguminosas, frutas, nozes, etc.) e bebidas (vinho, sidra, cerveja, chá,
cacau,etc.). Seus níveis variam grandemente mesmo entre cultivos da mesma
espécie. Por exemplo, a formação dos glicosídios flavona e flavonol depende muito
da incidência da luz. Portanto, as maiores concentrações desses compostos são
encontradas geralmente em folhas e em partes externas da planta, com apenas
quantidades traços em partes subterrâneas da planta.
35
A presença de polifenóis em alimentos vegetais é largamente influenciada
por fatores genéticos e condições ambientais. Outros fatores, como germinação,
nível de maturidade, variedade, processamento e armazenamento, também
influenciam o conteúdo de compostos fenólicos em plantas.
5,32,33,35,36
O melhor modo de como produzir chocolate ou componentes do cacau com
altos conteúdos de polifenóis é pela conservação através: da escolha dos grãos de
cacau ricos em polifenóis, utilizando grãos sub-fermentados e reduzindo o tempo
e/ou temperatura de tratamento térmico. Por exemplo, a torrefação ou tratamento
térmico do liquor de cacau. Entretanto, o conteúdo mais alto de polifenol é
tipicamente associado com um sabor amargo e adstringente.
11
27
Vários métodos são realizados para reduzir o amargor e a sensação de
adstringência, como os aditivos de flavour, leite em pó em uma quantidade maior
que 12% do peso para chocolates ao leite e algumas variações no processamento
do chocolate.
11
Dois liquores de chocolate com vários níveis de polifenóis de cacau foram
obtidos e patenteados. Àqueles com conteúdos mais baixos em polifenol foram
submetidos a altas temperaturas, ao passo que os de conteúdos mais altos em
polifenol encontravam-se em temperaturas mais baixas, necessárias para conservar
o maior conteúdo de polifenóis. Posteriormente, os dois liquores foram combinados
por processamento em um produto final de chocolate.
11
Polifenóis são parcialmente responsáveis pelas qualidades sensoriais e
nutricionais dos alimentos vegetais. A adstringência e o amargor dos alimentos e
bebidas dependem do conteúdo dos compostos polifenólicos. A oxidação dos
polifenóis durante o processamento ou armazenamento resultará em características
benéficas ou indesejáveis nos produtos alimentícios.
37,38
Por exemplo, mudanças oxidativas, como o escurecimento do cacau durante
o processamento ou a polimerização oxidativa dos polifenóis do chá durante a
manufatura do chá preto, resultam no desenvolvimento de propriedades sensoriais
distintivas e desejáveis. Reciprocamente, a reação de escurecimento enzimático dos
compostos fenólicos (catalisadas pela polifenol oxidase) e reações de escurecimento
não enzimáticas são responsáveis pela formação de coloração e flavour indesejáveis
em frutas e hortaliças.
37,38
Há uma vasta literatura sobre a composição e o conteúdo dos polifenóis nos
alimentos vegetais e bebidas. Devido à complexidade desse imenso grupo de
metabólitos de plantas, entretanto, muitos polifenóis permanecem sem
identificação.
7
Além disso, é difícil comparar dados experimentais dentro da literatura, devido
à falta de um consenso a respeito de um método apropriado para extrair e
determinar os diferentes tipos ou famílias de compostos polifenólicos. Como
28
resultado, a informação na literatura sobre o conteúdo e a composição de polifenóis
em alimentos vegetais não é apenas incompleta; mas, algumas vezes também
contraditória e de difícil comparação.
7
3.3 - Biodisponibilidade dos polifenóis
É importante para um nutricionista conhecer não apenas a ingestão diária dos
polifenóis da dieta de um indivíduo; mas também, a biodisponibilidade daqueles
polifenóis ingeridos, já que seu significado nutricional e seus efeitos sistêmicos
potenciais irão depender de seu comportamento no trato digestivo.
7
A absorção e o metabolismo dos constituintes dos alimentos que contêm
grupos fenólicos são determinados primariamente pela sua estrutura química, a qual
depende de fatores como grau de glicosilação/acilação, sua estrutura básica
(ex. benzênicos ou derivados da flavona), conjugação com outros grupamentos
fenólicos, tamanho molecular, grau de polimerização e solubilidade. A enorme
variabilidade desse grupo de substâncias, bem como sua ocorrência em materiais
vegetais como uma mistura complexa de compostos fenólicos, criam grandes
dificuldades no estudo de sua biodisponibilidade, sua fisiologia e efeitos
nutricionais.
7
As catequinas e procianidinas podem ser apenas encontradas como
agliconas em plantas e em produtos alimentícios derivados de plantas e, desta
maneira, o tamanho molecular e a solubilidade podem ser propriedades
determinantes para a absorção.
8
Propriedades biológicas dos polifenóis dependem de sua biodisponibilidade.
Evidências indiretas de sua absorção através da barreira intestinal estão no aumento
da capacidade antioxidante do plasma após o consumo de alimentos ricos em
polifenol.
3
Alguns autores como Bravo et al., 1994
39
, têm sugerido uma classificação
dos polifenóis para propósitos nutricionais em polifenóis capazes de serem extraídos
29
- “Extractable polyphenols” (EPP) e em polifenóis que não formam extratos – “non-
extractable polyphenols” (NEPP).
Os EPP são compostos fenólicos de baixa ou intermediária massa molecular,
incluindo alguns taninos hidrolisáveis e proantocianidinas que podem ser extraídas;
utilizando diferentes solventes como água, etanol, metanol e, em alguns casos,
acetona aquosa.
39
Os NEPP são compostos ou ligações fenólicas de alto peso molecular de
fibras da dieta ou proteínas que permanecem insolúveis em solventes usuais.
Resultados de testes in vitro com enzimas digestivas e de estudos em animais
sugerem a indisponibilidade de alguns compostos polifenólicos, principalmente
NEPP.
39
A estrutura química dos polifenóis determina a velocidade e a extensão da
absorção intestinal e, ainda, a natureza dos metabólitos circulantes no plasma.
Alguns estudos de biodisponibilidade em humanos mostram que as quantidades de
polifenóis encontrados intactos na urina variam de um composto fenólico para o
outro.
3
A maior parte dos polifenóis ingeridos (75-99%) não é encontrada na urina.
Isso implica que, ou eles não foram absorvidos através da barreira intestinal, foram
absorvidos e excretados na bile ou, então, metabolizados pela microflora colônica ou
pelos próprios tecidos.
3
Os polifenóis que não são absorvidos no estômago ou no intestino delgado,
serão carregados para o cólon (Fig. 4). Outra possibilidade ocorre quando, os
polifenóis são absorvidos, metabolizados no fígado, excretados na bile e,
diretamente, pelos enterócitos voltam ao intestino delgado, alcançando também o
cólon; mas em uma forma química diferente, como um glicuronídeo.
3
30
Figura 4 - Possíveis rotas dos polifenóis ingeridos por humanos.
No fígado, grupos hidroxil de moléculas intactas de compostos fenólicos são
conjugados com o ácido glicurônico ou sulfato e uma metilação pode ocorrer. Os
conjugados têm sido encontrados na urina, mas a excreção na bile de glicuronides e
sulfatos parecem também ser de grande importância.
8
O cólon contém cerca de 10
12
microrganismos/cm
3
e tem enorme potencial
catalítico e hidrolítico
3
. Os microrganismos do cólon hidrolisam os conjugados e
permitem a absorção das agliconas liberadas. Assim, os conjugados podem ser
reabsorvidos e entram na circulação entero-hepática.
8
Entretanto, esses microrganismos degradam também substancialmente o
flavonóide invertido por clivagem do anel heterocíclico, produzindo diferentes ácidos
fenólicos. No caso da catequina, diferentes δ-fenilvalerolactonas têm sido
encontradas, uma classe de metabólitos intermediários que não poderiam ser
detectados como metabólitos de outros flavonóides.
8
31
Os ácidos fenólicos são absorvidos e excretados na urina. Uma ampla faixa
de espécies mamíferas tem mostrado variações consideráveis de substâncias neste
metabolismo secundário. Embora haja evidências de que a absorção e metabolismo
de polifenóis existem no intestino, pouco se sabe sobre a eficiência de cada
captação e permanência dos compostos fenólicos ou seus conjugados e derivados
no organismo.
8
Recentemente, Richelle et al.,1999
40
, estudou a cinética da epicatequina no
plasma de homens após consumo de 40g e 80g de chocolate amargo. A
epicatequina aumentou consideravelmente após o consumo de chocolate,
alcançando o máximo entre 2 e 3 horas. A concentração máxima e a área abaixo da
curva da cinética de permanência deste composto no plasma correlacionam-se
muito bem com a dose do chocolate. Conclui-se que a epicatequina é absorvida do
chocolate e é rapidamente eliminada do plasma. Os níveis plasmáticos obtidos
foram de 0,7 µmol/L (epicatequina livre e seus conjugados) de 80g de chocolate
amargo, contendo 164 mg de epicatequina.
3.4 - Atividade antioxidante dos polifenóis em alimentos
Tornou-se claro que existe uma relação entre os antioxidantes da dieta e as
funções imunes. Foi sugerido que o chocolate contém grandes quantidades de
polifenóis que possuem atividade antioxidante.
41
As espécies de oxigênio reativas (ROS) desempenham uma importante
função em muitos processos biológicos. Os ROS são produzidos durante reações de
transferência de elétrons em células aeróbicas, especialmente pela cadeia
transportadora de elétrons mitocondrial.
42
Os ROS incluem o radical hidroxil (•OH), o ânion superóxido (O
2
-
), o peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
), ácido hipocloroso (HOCl) e o oxigênio singlete (
1
O
2
). Os ROS
estão envolvidos como mensageiros secundários em respostas fisiológicas, bem
como em condições patológicas.
43
32
A produção de ROS é bem controlada sob condições fisiológicas e os ROS
exercem atividades microbicidas, sem acompanhar efeitos colaterais tóxicos. Os
ROS danificam membranas celulares e moléculas biológicas, quando o ROS
subjulga os sistemas endógenos antioxidantes. A maioria dos ROS são combatidos
por sistemas defensivos como a superóxido desmutase (SOD), o sistema glutationa
peroxidase/ glutationa, catalase e peroxidase.
44
Entretanto, os ROS que são produzidos excessivamente ou os ROS que
tenham escapado dos sistemas defensivos antioxidantes facilmente reagem com
DNA, proteína e lipídio, levando ao desenvolvimento de muitas doenças, incluindo
câncer, arteriosclerose e injúria da mucosa gástrica, bem como de processos de
envelhecimento.
42
Devido aos sistemas defensivos antioxidantes em humanos não serem
completamente eficientes, é desejável a ingestão de antioxidantes exógenos para
combater o excesso de ROS. Os antioxidantes da dieta como a vitamina C, vitamina
E e os carotenóides reduzem o risco de desenvolvimento de certas doenças, porque
eles combatem o excesso de ROS.
44
A maioria dos antioxidantes da dieta são derivados da ingestão de vegetais,
frutas, chá e vinho. Muitos flavonóides são conhecidos por serem antioxidantes e
alguns deles, como a quercetina, catequina e morina têm mostrado inibir a oxidação
da lipoproteína de baixa densidade (LDL) in vitro
45
. O cacau (Theobroma cacao),
material do chocolate, contêm vários polifenóis e a fração polifenol do chocolate
inibe a oxidação do LDL.
41
Muitos dos efeitos biológicos e dos benefícios dos polifenóis ocorrem
hipoteticamente via proteção contra o dano oxidativo. Radicais livres são definidos
como moléculas que possuem número de elétrons desemparelhados no último
orbital.
A adição de um elétron livre ao O
2
produz o radical superóxido O
2
-
. A adição
de um outro elétron e dois íons hidrogênios produz o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
),
o qual combina-se com O
2
-
, produzindo radicais hidroxila OH
•
. O radical hidroxila
33
rapidamente interage com macromoléculas do ambiente próximo e pode produzir
enormes danos a proteínas, lipídios e DNA.
46
Ácidos graxos poliinsaturados são particularmente alvos oportunos dos
radicais livres e reações em cadeia geram uma cascata de intermediários reativos. O
oxigênio livre (
1
O
2
) é também um reativo de alta energia e uma espécie de oxigênio
de vida curta, formado em sistemas biológicos que podem reagir com biomoléculas.
Várias fontes de oxidantes endógenos têm sido caracterizadas. A produção de
moléculas de oxigênio parcialmente reduzidas durante a respiração aeróbica normal
é inevitável.
46
As células imunocompetentes liberam óxido nítrico (NO) e vários radicais de
oxigênio durante a resposta imune crônica e perspicaz. Os peroxissomos envolvidos
no metabolismo de ácidos graxos e o citocromo P-450 microssomal da cadeia
transportadora de elétrons são fontes adicionais de oxigênio reativo. Fontes
exógenas incluem algumas drogas e toxinas ambientais, fumaça de cigarro, radiação
ionizante, sol, choque térmico, e poluentes do ar como dióxido de nitrogênio e
ozônio.
46
Recentemente houve um Interesse crescente nos alimentos fenólicos devido
às suas funções como antioxidantes, antimutagênico e destruidores dos radicais
livres; além de sua implicação na prevenção de patologias como câncer e doença
cardiovascular.
7
Estudos epidemiológicos têm demonstrado uma correlação entre um aumento
no consumo de antioxidantes fenólicos e um risco reduzido de doença
cardiovascular e certos tipos de câncer.
7
Os antioxidantes fenólicos têm como função destruir radicais livres e
quelantes de íons metálicos que são capazes de catalisar a peroxidação lipídica. Os
antioxidantes fenólicos interferem com a oxidação de lipídios e outras moléculas por
doação rápida de um átomo de hidrogênio para os radicais, como ilustrado nas
seguintes reações:
7
34
ROO• + PPH → ROOH + PP•
RO• + PPH → ROH + PP•
Desta maneira, os intermediários do radical fenóxi são relativamente estáveis;
portanto, uma nova reação em cadeia não é facilmente iniciada. Os intermediários
do radical fenóxi também agem como destruidores da rota de propagação pela
reação com outros radicais livres.
47
ROO• + PP• → ROOPP
RO• + PP• → ROPP
Entretanto, sob certas condições (altas concentrações de antioxidantes
fenólicos, alto pH e presença de ferro), os antioxidantes fenólicos podem iniciar um
processo de autooxidação e comportam-se como prooxidantes.
47
A eficiência dos polifenóis como componentes antioxidantes depende
imensamente da estrutura química. Os fenóis são inativos como antioxidante, mas
difenóis orto- e para- possuem capacidade antioxidante, o qual aumenta com a
substituição de átomos de hidrogênio por grupos etil ou n-butil.
47
Os flavonóides estão entre os antioxidantes de planta mais potentes, porque
eles tomam posse de um ou mais elementos estruturais seguintes envolvidos na
atividade anti-radical (Fig. 5): (1) um grupo o-difenólico (de anel B), (2) uma dupla
ligação conjugada 2-3 com a função 4-oxo e (3) grupos hidroxil em posições 3
e 5.
48-50
O
O
OH
OH
OH
OH
O
H
Figura 5 - Estrutura da quercetina, mostrando as características estruturais relacionadas à
capacidade antioxidante.
35
A quercetina é um flavonol que combina todas essas características, é um
dos mais potentes antioxidantes naturais. Assim, a eficiência antioxidante dos
flavonóides é diretamente correlacionada com seu grau de hidroxilação e diminui
com a presença de açúcar invertido (glicosídios não são antioxidantes, ao passo que
suas agliconas correspondentes são antioxidantes).
48
Os flavonóides são destruidores muito efetivos de radicais hidroxil e peroxil,
embora sua eficiência como destruidor de ânion superóxido ainda não seja clara
50
.
Os polifenóis são quelantes de metais e inibem as reações de Fenton e
Haber-Weiss, os quais são importantes fontes de radicais oxigênio ativo
51
. Além
disso, os flavonóides conservam sua capacidade de destruir radicais livres após
formarem complexos com íons metálicos.
52
Embora, tradicionalmente, a atividade antioxidante tenha sido atribuída
apenas a compostos fenólicos solúveis (extrato de polifenóis), um estudo recente
sugere que polifenóis não extraídos (procianidinas poliméricas e taninos hidrolisáveis
de alto peso molecular) são de 15 a 30 vezes mais efetivos para quelar radicais
peroxil que os fenóis simples.
53
Como esses compostos não são absorvidos, eles poderiam exercer sua
atividade antioxidante dentro do trato digestivo e proteger lipídios, proteínas e
carboidratos contra o dano oxidativo durante a digestão e tornar disponível os
antioxidantes solúveis.
7
A maioria dos estudos tem mostrado que a atividade antioxidante dos
polifenóis emprega diferentes modelos in vitro
48,52,53,54,55
e, subseqüentemente, os
compostos fenólicos são classificados de acordo com sua capacidade antioxidante
ou eficiência anti-radical
49,56,57
. A função dos polifenóis in vivo ainda não está
esclarecida.
7
A eficiência antioxidante dos polifenóis depende da extensão da absorção e
metabolismo desses compostos, bem como a atividade das formas metoxiladas e
conjugadas, circulantes no plasma.
7
36
Apenas quantidades parciais de polifenóis em alimentos são absorvidas in
vivo, e apenas níveis muito baixos de catequinas foram detectadas no plasma após
ingestão de chá
58,59
. Todavia, essas baixas concentrações parecem suficientes para
exercer uma potente ação antioxidante in vivo, como observada em estudos
humanos e como sugerido por registros epidemiológicos.
60
Os polifenóis antioxidantes, principalmente os flavonóides, são potentes
inibidores da oxidação do LDL
51,54,55,61
.Vários mecanismos pelo qual os flavonóides
exercem esse efeito protetor têm sido propostos: (1) redução da formação de radical
livre, (2) proteção ao α-tocoferol do LDL contra oxidação, (3) regeneração do α-
tocoferol oxidado e (4) quelação de íons metálicos.
7
Através dessas ações antioxidantes, os polifenóis exercem seu efeito protetor
contra doenças cardiovasculares. Além disso, os flavonóides possuem efeitos anti-
trombóticos e vasoprotetores; bem como efeitos hipolipidêmicos.
7
Diferentes tipos de polifenóis (ácidos fenólicos, taninos hidrolizáveis e
flavonóides) também têm mostrado efeitos anticarcinogênicos
62-64
. Os polifenóis
devem interferir em várias etapas que levam ao desenvolvimento de tumores
malignos, portanto protegendo o DNA contra dano oxidativo, inativando
carcinógenos, inibindo a expressão de genes mutantes, a atividade de enzimas
envolvidas na ativação de pró-carcinógenos e ativação de sistemas enzimáticos
envolvidos na detoxificação de xenobióticos.
65
37
4 - Metodologia disponível para análise, isolamento, purificação e
identificação
A metodologia aplicada ao estudo dos flavonóides depende, em uma certa
extensão, ao propósito da investigação; podendo ser: (1) para examinar a presença
de flavonóides em um certo vegetal; (2) isolar flavonóides de uma planta que contêm
esse tipo de substância; (3) determinar a concentração de um certo flavonóide em
um vegetal em particular; ou (4) identificar um flavonóide isolado e purificado.
66
Geralmente, trabalha-se seguindo os seguintes passos:
Preparação do material vegetal
↓
Procedimentos de extração
↓
Cromatografia ou eletroforese capilar e/ou quantificação dos flavonóides
↓
Procedimentos de isolamento dos flavonóides
↓
Análise de estrutura por degradação e/ou técnicas instrumentais
Figura 6 - Perfil do procedimento geral de trabalho para análise, quantificação, isolamento e
elucidação da estrutura dos polifenóis em alimentos.
12, 66, 67, 68, 69
Como alguns flavonóides são instáveis, como no caso dos polifenóis
antocianinas e procianidina, é necessário cuidado durante o armazenamento e o
preparo da amostra.
Se o objetivo é a análise e a subseqüente quantificação, o
congelamento e, mais freqüentemente, o congelamento em nitrogênio líquido, é
aconselhado.
66
38
Como muitos polifenóis ocorrem na forma de ligações com glicosídeos ou
ésteres, a preparação da amostra deve incluir hidrólise alcalina ou ácida para liberar
ligações fenólicas, antes ou após a etapa de extração com solventes.
66, 67, 69
Os carboidratos e os polissacarídeos são constituintes comuns em alimentos
e bebidas. Estas substâncias são sempre removidas por extração em água ou com
soluções de tampões ácidos ou básicos. O chocolate, o qual possui um alto
conteúdo de lipídio, necessita de extração prévia com hexano ou cloreto de metileno
para remover gordura; então, um solvente aquoso ou um solvente polar, como o
metanol, deve ser usado para extrair o carboidrato ou o polissacarídeo.
70
O isolamento e a purificação dos flavonóides individuais é sempre requerido,
porque as estruturas são desconhecidas ou, como no caso do padrão de
procianidinas do cacau, não estão comercialmente disponíveis. O material puro pode
ser também necessário para atividades de mensuramento, por exemplo, atividade
antioxidante ou anticarcinogênica, ou para estudos de biodisponibilidade em
animais, humanos ou em cultura de células.
12
4.1 - Isolamento de polifenóis em coluna de sílica modificada com
C18.
A extração em fase sólida é uma técnica utilizada nos processos de pré-
concentração e separação de espécies químicas inorgânicas e orgânicas presentes
em solução aquosa, utilizando um material sólido extrator. Também pode ser
utilizada para a extração de vapores orgânicos ou outras substâncias de amostras
gasosas.
71
Os primeiros materiais a serem utilizados como extratores sólidos, como o
carvão ativado e resinas trocadoras iônicas, eram pouco seletivos. Entre os
materiais mais utilizados como fase sólida destacam-se: resinas poliméricas
trocadoras de íons ou não, celulose, sílica-gel, espumas de poliuretano, alumina,
naftaleno, etc.
71
39
Sílicas modificadas têm sido sintetizadas e estudadas e suas propriedades
são resultado da presença de grupo funcional covalente ligado ao substrato da
sílica, e são produzidas pela reação de organosilanos com sílica ativada. O produto
é um sorvente com o grupo funcional do organosilano. Sílicas modificadas são
estáveis em um intervalo de pH de aproximadamente 2,0 a 7,5 e acima de 7,5 o
substrato de sílica é suscetível à dissolução em soluções aquosas. Abaixo de pH 2,0
a ligação éter é lábil, e o grupo funcional começará a se romper, perdendo as suas
propriedades sortivas. Apesar disso, na prática, sílica modificada pode ser usada
para extração no intervalo de pH de 1,0 a 14,0, já que a degradação do sorvente é
um processo lento e este é tipicamente exposto à solventes somente por períodos
de tempo curtos. A sílica modificada é quimicamente estável em todos os solventes
orgânicos, são materiais rígidos, de partículas de 15 a 100 microns, não encolhem
ou incham sob a ação de diferentes solventes, permitem rápido fluxo de solvente sob
condições mínimas de pressão (10 a 15 psi). A solvatação do sorvente é sempre
necessária sendo o metanol um bom agente solvatador, porque ele pode interagir
tanto com os grupos silanóis sobre a sílica, quanto com os átomos de carbono do
grupo funcional ligado. Em adição ao metanol, outros solventes como acetonitrila e
isopropanol podem ser usados para solvatação. A capacidade de retenção do
sorvente é definida como a massa total de analito retido por massa de sorvente e,
geralmente está em torno de 1 à 5%.
72
Pelo pré-condicionamento do cartucho C18, seqüencialmente com solventes
ácidos ou neutros, fracionam-se os grupamentos fenólicos em grupos ácidos e
neutros; bem como pode ser encontrada a separação dos grupos fenólicos, pela
modificação por eluição seqüenciada, utilizando-se diferentes eluentes.
66, 67
A Waters introduziu o cartucho Sep-pak para enriquecimento de traços de
solutos por fase reversa C18 em 1978. Tipicamente, o sorvente consiste de silica
gel 40-60 µm de tamanho de partícula de sílica na qual a fase líquida é
quimicamente ligada. A sílica gel não pode ser usada diretamente com misturas de
solventes aquosos, porque a água desativa a sílica em um grau de extensão em que
ela passa a apresentar apenas interações fracas com a maioria das substâncias,
durante o processo de isolamento. Tão fraco que não há essencialmente retenção,
40
dessa maneira, é necessário que a superfície da sílica apresente natureza
hidrofóbica; para tornar-se funcional com solventes aquosos.
70
A superfície de sílica completamente hidrolisada (por aquecimento com HCl
0,1 M por um dia ou dois) é constituída de grupos silanóis quimicamente reativos
73
,
isto é, superfícies típicas de sílica contendo 8 µmol/m
2
de grupos OH.
Os recobrimentos mais usados de fase ligada são siloxanos formados por
reação da superfície hidrolisada com um organoclorossilano. Por exemplo, onde R é
um grupamento alquil ou um alquil-substituído. Em muitos casos, o alquil é tanto
uma cadeia C
8
(n-octil) ou uma cadeia C
18
(n-decaoctil).
104
A fase estacionária organosilano tem sido denominada como fase em escova.
Ela consiste na reação de uma superfície de sílica com o dimetiloctilsilano-
clorosilano a elevadas temperaturas, o qual causa a ligação do grupo
dimetiloctilsilano na superfície (Fig. 7). Como resultado, o produto é uma superfície
coberta com cadeias de dimetiloctilsilano, como cerdas de uma escova. Assim, o
termo fase em escova, às vezes, é usado. A derivatização é monofuncional em que
apenas uma ligação Si-O-Si existe entre a partícula de sílica e a fase ligada alquil.
70
41
Figura 7 - Superfície em escova da fase ligada alquil na sílica gel.
Uma área de superfície específica de sílica deve variar de ~100 à 850 m
2
/g,
com uma margem típica para SPE de 200 à 600 m
2
/g. Geralmente, as partículas são
irregulares em tamanho com um diâmetro de partícula aproximado de 40 µm, um
tamanho de poro aproximado de 60 Å e uma área de superfície média de
aproximadamente 500 m
2
/g
74
. O diâmetro do poro afeta a fase ligada pelo controle
da densidade da cobertura da fase ligada alquil e a migração dos analitos dentro e
fora dos poros durante a sorção
70
. Geralmente, os poros com largura menores que
2 Å são considerados microporos. Poros de 2 a 50 Å são chamados de mesoporos e
estes são os poros onde a maior parte das retenções ocorre
75
. Poros com diâmetros
maiores que 50 Å são classificados como macroporos e são importantes na
cromatografia de exclusão por tamanho. Tipicamente, um tamanho de poro de 50 Å
mostrará alguma exclusão de moléculas com pesos moleculares maiores que 2000
76
. Assim, se o isolamento de moléculas maiores é necessário, sorventes especiais
devem ser obtidos com tamanhos de poros maiores que 300 Å.
70
Um grande número de partículas sólidas tem sido utilizado para SPE de
compostos orgânicos de amostras predominantemente aquosas. As partículas de
sílica de fase ligada, especialmente sílica ODS (sílica octildecil silano), são
frequentemente o tipo mais comum. Entretanto, umas amplas variedades de poros
para resinas poliméricas têm sido usadas.
77
42
SPE em fase reversa: O mecanismo envolve a partição de solutos orgânicos
de uma fase móvel polar, como a água, em uma fase apolar, como o sorvente C-18.
O mecanismo de isolamento é uma interação apolar, chamada Van der Waals,
forças dispersivas ou partição (partitioning). A eluição de analitos por sorventes de
fase reversa é um processo bem simples e consiste na escolha de um solvente polar
para romper as forças de Van der Waals que retêm o analito. A partição envolve a
interação do soluto dentro das cadeias da fase estacionária, o qual pode ser um
hidrocarboneto C-18 ou C-8, ou ainda, um sorvente polimérico (como o estireno-
divinilbenzeno). O mecanismo de partição é um processo de baixa energia (5 vs. 80
Kcal/mol para troca iônica) e é análogo a uma molécula sendo removida pela água
em uma extração líquido-líquido. A diferença está na fase orgânica ligada
quimicamente à sílica. O mecanismo é chamado de fase reversa porque ela é
oposta ao estudo original (cromatografia em fase normal), onde a fase estacionária
era polar e a fase móvel era apolar
70
. Na fase reversa, a função é isolar analitos
relativamente apolares de amostras polares como a água. Esse tipo de aplicação
requer o uso de adsorventes com partículas relativamente hidrofóbicas, como a
sílica com grupos octildecilsilanos ligados ou um polímero orgânico com anéis
benzenos. As substâncias extraídas são eluídas por um volume pequeno de
solvente orgânico.
77
Para esse propósito, o extrato é dissolvido em água (ou no solvente orgânico
removido por evaporação rotatória) e passado através da coluna. Os carboidratos
não são adsorvidos e são totalmente lavados (eluídos) da coluna com água
adicional.
66
Os componentes menos polares retidos, incluindo os flavonóides, são então
eluídos da coluna com álcool aquoso ou puro. Se desejado, algumas separações
podem ser obtidas, neste estágio, pelo aumento das etapas do conteúdo de
metanol.
66
Para polifenóis do cacau, 70-80% de metanol aquoso ou 70% de acetona
aquosa ou combinações entre eles são os solventes ou sistemas de solvente mais
comumente utilizados para extração. Água e etanol têm sido usados também,
43
entretanto, procianidinas oligoméricas são extraídas apenas parcialmente e
polímeros de alto peso molecular não são extraídos totalmente.
67
No processo de isolamento de polifenóis para uma futura caracterização
torna-se necessário remover potenciais interferentes como a teobromina e cafeína,
no caso do cacau. A remoção de interferentes poderá ser obtida por meio de um
fracionamento líquido-líquido com um solvente não-miscível e uma coluna
cromatográfica Sephadex LH-20, poliamida, Amberlite XAD-2 e utilizando-se
cartuchos comercialmente disponíveis
66
. A remoção de teobromina e cafeína podem
usualmente ser acompanhada pela extração com clorofórmio ou diclorometano, já
que a maioria dos flavonóides tem uma solubilidade muito limitada nesses
solventes.
67
A coluna conhecida como Sephadex LH-20 foi utilizada com sucesso para
purificação de flavonóides e para procedimentos preparativos de HPLC. Neste caso,
uma coluna C18 em escala preparativa também pode ser aplicada.
66, 67
A faixa larga de sílica baseada em fases estacionárias polar e apolar, em
pequenos cartuchos, é comercialmente disponível e a extração em fase sólida feita
com coluna C18 é a mais usada para isolamento de substâncias fenólicas,
reproduzindo o uso da Sephadex para etapas de purificação.
66, 67
4.2 - Isolamento de polifenóis em espumas de poliuretano
Tem se observado nas duas últimas décadas um uso cada vez mais
freqüente das espumas de poliuretano (EPU), como meio de separação entre
espécies, devido principalmente ao seu baixo custo e facilidade de obtenção
78
.
Além disto, a estrutura celular das EPU, constituída por membranas abertas de
geometria quase esférica que permitem grande velocidade de difusão das espécies
químicas, promove rapidez na retenção e na transferência de massa
79
. Suas
propriedades físico-químicas (alta porosidade, flexibilidade e facilidade para
acondicionar espécies orgânicas e inorgânicas) permitem uma maior variação nas
modificações químicas e versatilidade nas aplicações analíticas. As diversas formas
44
de utilização das EPU (trituradas, em cubos, discos, etc.) se constituem em
vantagem ao se comparar com outros sólidos porosos granulares
78
.
Há cerca de
400 anos, uma esponja natural impregnada com óleo de oliva foi utilizada como
suporte sólido para purificação de vapores de etanol
80
. Em 1962, Bayer
81
usou esta
técnica para purificar alcoóis.
Uma das primeiras aplicações de EPU como suporte sólido foi publicada em
1965, por Bauman e colaboradores
82
. Os autores imobilizaram fisicamente uma
enzima contida em gel de amido em poliuretano reticulado para monitorar poluentes
inibidores enzimáticos, em água e ar. Em 1967, os estudos realizados por Van
Venrooy
83
sobre a utilização de EPU como material suporte para cromatografia
gasosa, deram origem a uma patente americana.
Em 1970, Bowen
84
utilizou pela primeira vez espumas de poliuretano para a
sorção e recuperação de compostos orgânicos e inorgânicos de solução aquosa por
processo em batelada. Seu trabalho apontou para a potencialidade e versatilidade
das aplicações das espumas de poliuretano na química de separação,
impulsionando a partir de então, a investigação e publicação de inúmeros trabalhos.
A utilização vantajosa de espumas de poliuretano como material suporte na
cromatografia de extração foi vislumbrada por Braun e Farag. Suas primeiras
investigações publicadas em 1972
85, 86
, utilizavam o polímero carregado com fosfato
de tributila (TBP); para sorver vários complexos metálicos de soluções aquosas. A
imobilização de reagentes orgânicos na espuma é baseada, principalmente, em seu
caráter hidrofóbico.
80
Braun, Navratil e Farag, 1984
87
reuniram a literatura do período entre 1970 e
1985, em um livro sob forma de revisão, direcionado às diversas aplicações das
espumas de poliuretano carregadas e não carregadas (do tipo poliéter ou poliéster).
As EPUs mostraram ser versáteis e adequadas para a separação, pré-concentração
e recuperação de um amplo espectro de compostos inorgânicos e orgânicos de meio
aquoso e gasoso. Suas propriedades físico-químicas e a natureza de sua membrana
permitem rápidas cinéticas de sorção com taxas de fluxos elevadas em operações
em colunas. Esta característica pode ser utilizada para pré-concentrar componentes
45
traços e/ou separar interferentes em sistemas em linha, melhorando a sensibilidade
e diminuindo o limite de detecção de métodos analíticos instrumentais. É vantajoso e
adequado também para a extração e determinação simultânea de elementos-traço
em águas naturais
88
.
Assim, as espumas de poliuretano utilizadas em diferentes sistemas de
separação de espécies químicas são constituídas de células com membranas
abertas, apresentando alta porosidade e flexibilidade. Estas podem ser usadas sob a
forma de discos, cubos, colunas com peças inteiras e trituradas, em processos em
batelada ou coluna. Sua estrutura celular constituída por membranas abertas de
geometria quase esférica possibilita grande velocidade de difusão de espécies
químicas promovendo rapidez de sorção e transferência de massa, o que constitui
uma vantagem única comparativamente à utilização de sólidos porosos granulares.
Essa característica permite ainda, a sua utilização em procedimentos de separação
em coluna com elevadas taxas de fluxo, sem prejuízo significativo da eficiência de
separação.
80
4.2.1 - Definição, estrutura e síntese da espuma de poliuretano
As espumas de poliuretano (EPUs) podem ser definidas como uma classe de
polímeros, onde a dispersão de um gás durante o processo de polimerização dá
origem à formação de pequenos bulbos ou células interligadas em uma estrutura
tridimensional.
80
O desenvolvimento comercial dos poliuretanos começou na Alemanha no final
da década de 1930, inicialmente com a fabricação de espumas rígidas, adesivos e
tintas e têm sido utilizados há cerca de 60 anos em aplicações das mais
diversificadas. Os poliuretanos são produzidos basicamente pela reação de
poliadição de um isocianato (di ou polifuncional) com um poliol e outros reagentes
como: catalisadores, surfactantes, extensores de cadeia, etc. Sua estrutura pode ser
celular (espumas flexíveis, semi-rígidas e rígidas, e elastômeros microcelulares) ou
sólida (elastômeros, revestimentos, selantes, adesivos, etc.).
80
46
A potencialidade de aplicação de EPUs como material para absorção e
separação de espécies orgânicas e inorgânicas presentes em soluções aquosas foi
pioneiramente observada por Bowen
84
, em 1970, ao investigar as propriedades
químicas de algumas EPU comerciais, à base de tolueno diisocianato (DTI – o
isocianato mais usado comercialmente) e óxido de propileno, com diferentes
densidades.
Na área de espumas flexíveis os PU’s se popularizaram nos segmentos de
colchões, estofados e assentos automotivos; os semi-rígidos na indústria automotiva
na forma de descança-braços, painéis, pára-choques, etc; os microcelulares em
calçados e os rígidos no isolamento térmico de geladeiras, “freezers” e caminhões
frigoríficos, etc.
80
A utilização de espumas de poliuretano como material adequado para a
sorção de espécies químicas foi pioneiramente introduzida no Brasil à época do
acidente radioativo com césio-137 em Goiânia (1987), visando a descontaminação
de superfícies por pesquisadores do Instituto de Engenharia Nuclear (CNEN).
Pesquisadores deste instituto, prosseguindo com os estudos com EPU, motivaram e
divulgaram a utilização das EPUs por outros grupos de pesquisa na área de química
analítica, tendo sido desenvolvido vários interessantes trabalhos e teses com
aplicações das EPUs na química de separação
89
. Carvalho,1992
90
optou
inicialmente em sua tese de doutorado, por utilizar espumas de poliuretano flexíveis
do tipo poliéter, de fabricação nacional, usada em colchões; adotando como critério
para seleção, entre espumas de diferentes especificações, a que apresentasse
maior capacidade de sorção para o sistema ferro (similar ao gálio) em meio cloreto.
Posteriormente, em um outro trabalho realizado por Jesus,1999
91
observou-se que
algumas espumas de poliuretano utilizadas na lavagem doméstica de louças
apresentavam o mesmo desempenho de sorção que a espuma para colchão
anteriormente utilizada.
As EPU podem ser definidas também como materiais plásticos em que uma
parte do sólido é substituído por gás, que dá origem ao que se chama de células. A
fase gasosa pode ser contínua, gerando um material com células abertas, ou pode
ser uma fase descontínua, gerando células fechadas, ditas não-comunicantes. Sob o
47
ponto de vista geométrico, se o gás ocupa uma fração menor do que 76% do volume
total, células esféricas tendem a serem geradas. Por outro lado, se o gás ocupar
uma proporção maior do que 76%, haverá uma tendência das células à distorção,
originando poliedros, principalmente com a forma de dodecaedros pentagonais.
92
Espumas de baixa densidade são dispersões de grandes volumes de gás em
pequenos volumes de sólido, tendo por exemplo, uma densidade menor do que 0,1
g/cm
3
. Espumas médias são classificadas por terem densidade variando de 0,1 a 0,4
g/cm
3
. Espumas com densidade maior são ditas de alta densidade.
79
A presença ou ausência de janelas na célula ou o número de janelas por
célula é uma função da maneira como o material plástico é produzido
79
. As
espumas de poliuretano podem ser preparadas nas formas rígidas ou flexível, sendo
sintetizadas através da reação entre grupos hidroxílicos terminais de uma resina do
tipo poliéster ou poliéter com um grupamento isocianato, ou ainda pela reação entre
grupos isocianato e água.
92
São duas as reações principais determinantes na formação das EPU (Fig. 8):
(1) reação entre um isocianato (geralmente tolueno di-isocianato – TDI) com um
composto hidroxilado (poliol, geralmente, poliéter ou poliéster). Essa reação é
responsável pela formação do grupamento poliuretano; (2) reação entre o isocianato
e a água, gerando ácido carbâmico, que se decompõe em amina e dióxido de
carbono (agente formador das células da espuma).
78
O
‖
R-N=C=O + R`- OH → R-NH-C-OR`
ISOCIANATO URETANO
O
‖
R-N=C=O + H
2
O → R-NH-C-OH → CO
2
+ R-NH
2
ISOCIANATO ÁCIDO CARBÂMICO
Figura 8 - Reações comumente empregadas na preparação da EPU.
48
Como sub-produtos das reações secundárias entre aminas e isocianato, dos
produtos desta reação com o próprio isocianato (presente em excesso no processo
de fabricação da EPU), e ainda da reação do isocianato e uretano surgem, em maior
ou menor concentração, uréia dissubstituída, biureto e alofanato. Desses sub-
produtos, o alofanato e o biureto (Fig. 9) constituem-se nos principais responsáveis
pelas ramificações e ligações cruzadas das EPU.
78
O O O
‖
‖
‖
R
-
N=C=O + R-
NH
-
C
-
NH
2
→
R-
NH
-
C
-
NH
-
C
-
NHR`
ISOCIANATO URÉIA BIURENO
DI
-
SUBSTITUÍDA
O O O
‖
‖
‖
R
-
N=C=O + R-
NH
-
C
-
NH
2
→
R-
NH
-
C
-
NH
-
C
-
OR`
ISOCIANATO URÉIA ALOFANATO
DI-
SUBSTITUÍDA
Figura 9 - Reações paralelas que ocorrem durante a preparação das EPU: formação das
ligações cruzadas e das ramificações.
As características físicas das espumas de poliuretano dependem
fundamentalmente da maneira como são preparadas. O rompimento ou não da
célula ao final do processo de expansão da espuma é um fator determinante para a
obtenção de espumas rígidas ou flexíveis. Espumas flexíveis são obtidas quando o
material apresenta células abertas, e espumas rígidas são resultado de um material
contendo células fechadas. Outros fatores que influenciam a rigidez da espuma são
o grau de cruzamentos e o tipo de poliol utilizado durante o seu preparo. Espumas
contendo baixa densidade de cruzamentos e preparadas com polióis de alto peso
molecular dão origem a materiais flexíveis, enquanto que espumas com alta
densidade de cruzamentos e sintetizadas a partir de polióis de baixo peso molecular
geram materiais com alta rigidez.
93
Os compostos hidroxilados utilizados na fabricação das EPUs são os polióis.
Geralmente, são poliéteres ou poliésteres e têm peso molecular médio entre 400 a
49
6000. Na indústria, as espumas flexíveis convencionais em geral são produzidas em
bloco por processos a quente utilizando poliol poliéter. Os polióis poliéteres mais
usados comercialmente são trifuncionais, obtidos da reação do glicerol e óxido de
propileno, possuindo mais de 90% de grupamentos hidroxilas secundários e peso
molecular médio entre 3000 e 4000. São também muito utilizados polióis poliéteres a
base de óxido de propileno (PO) e óxido de etileno (EO). O teor de EO presente nos
polióis poliéteres varia entre 5% e 15% e o aumento do teor de EO resulta em maior
hidrofilicidade do poliol, devido a sua maior solubilidade em água. É usado para
diminuir a concentração de micelas de água na massa reagente e minimizar a
formação de esferas de poliuréia que enrijecem a espuma.
80
As espumas de poliuretano possuem boa resistência térmica, sendo
degradadas a temperaturas que variam de 180 a 220
o
C, dependendo de sua
estrutura. Em termos de solubilidade, a literatura relata que elas podem ser
completamente solubilizadas com H
2
SO
4
concentrado, HNO
3
concentrado e
soluções de KMnO
4
em meio alcalino. Sua estrutura permanece inalterada em H
2
O,
em HCl com concentrações menores do que 6 mol/L, em H
2
SO
4
com concentrações
menores do que 2 mol/L, em NH
4
OH com concentrações menores do que 2 mol/L e
em NaOH com concentrações menores do que 2 mol/L. Da mesma forma, as
espumas não se mostram solúveis nos solventes orgânicos mais comumente
utilizados em laboratório tais como benzeno, tetracloreto de carbono, clorofórmio,
acetona, metil-isobutil cetona, acetato de etila e quaisquer álcoois.
79
Examinando a resistência química das EPUs conclui-se que elas são muito
estáveis. Exceto por variações no grau de inchação, permanecem inalteradas
quando em contato com água, ácido clorídrico até 6 mol/L, ácido sulfúrico até 2
mol/L, ácido acético glacial, soluções de amônia e de hidróxido de sódio 2 mol/L.
Não sofrem alteração em presença de vários solventes orgânicos como éteres,
benzeno, tetracloreto de carbono, clorofórmio, acetona, metil-isobutil cetona, acetato
de etila, acetato de isopentila e álcoois. Mostraram-se solúveis, entretanto, em
cloreto de arsênio à quente, m-cresol, dimetilsulfóxido e dimetilacetamida. São
oxidadas pelo permanganato de potássio em meio alcalino, degradadas por ácido
sulfúrico e nítrico concentrado e também quando aquecidas entre 180 e 220
o
C.
Observou-se que existiam duas classes de substâncias que eram fortemente
50
adsorvidas pelas EPU tipo poliéter: substâncias presentes como moléculas livres
altamente polarizadas em soluções aquosas tais como iodo, compostos aromáticos
e ditizonatos metálicos ou ânions univalentes como FeCl
4
-
, TlCl
4
-
, AuCl
4
-
, etc...
80
Tabela 4 - Coeficientes de distribuição e capacidade de absorção do fenol em espuma de
poliuretano.
84
Substância Meio D (L/Kg)
Capacidade de
Absorção (mol/Kg)
Espécie
Fenol água 45-410
≥ 0,032
C
6
H
5
OH
4.3 - Isolamento de polifenóis por meio de resina polimérica
A resina Amberlite XAD-16 é um estireno/divinilbenzeno, baseado em um
material que é não-iônico, hidrofóbico, sendo um polímero interconectado com a
superfície de natureza aromática. As propriedades adsortivas são originadas de sua
estrutura macroreticular (macroporos), o qual contém tanto uma fase polimérica
contínua como uma fase porosa contínua. O tamanho do poro compreende de 2 a
300 Å e a área de superfície é de 800 m
2
/g. A distribuição do tamanho do poro
mostra sua aplicação para adsorção de compostos orgânicos de baixo a médio peso
molecular. Os polifenóis são adsorvidos pela resina XAD-16 pelas forças de Van der
Waals entre dois anéis aromáticos.
94
A história da extração em fase sólida data em torno do ano de 1970, quando
colunas empacotadas com partículas de resina XAD da Rohm and Haas foram
utilizadas para concentrar quantidades muito pequenas de poluentes orgânicos de
amostras de água.
95
Os adsorventes constituídos por sílica não são muito estáveis acima de pH 8
ou em soluções altamente ácidas; o que torna vantajoso o uso de resinas
poliméricas, pois são bem mais estáveis, em meios tanto básicos como ácidos.
As resinas poliméricas devem ter ligações cruzadas suficientemente para
assegurar que elas não serão dissolvidas, nem alteradas em solventes orgânicos. As
resinas não devem ser submetidas a mudanças grandes de volume devido à
51
inchação e ao encolhimento, quando em contato com líquidos de diferentes
naturezas.
77
O uso do poliestireno de ligação cruzada está aumentando quando se
compara com o uso de sílica quimicamente ligada, usualmente, com grupos
orgânicos C18 e C8. As resinas poliméricas são mais definidas e com pH estável,
possuem área de superfície maior do que a maioria dos materiais baseados em
sílica. As pesquisas têm consistentemente mostrado que o percentual recuperado
para muitos tipos de analitos é significantemente maior com as resinas poliméricas
do que com partículas de sílica.
96
Na maioria dos casos, os analitos adsorvidos são facilmente e completamente
eluídos de adsorventes poliméricos por um pequeno volume de solvente orgânico.
77
Tipicamente, os sorventes de polímero orgânico como o estireno-
divinilbenzeno (SDB) possui ampla área de superfície (600-1200 m
2
/g), maior
capacidade do que as de fase ligada devido ao alto percentual de carbono e uma
superfície mais hidrofóbica (Fig. 10). Sua maior aplicação é na área de SPE com
fase reversa.
70
Figura 10 - Estrutura química da resina XAD-16 (estireno-divinilbenzeno)
Os sorventes poliméricos estão disponíveis por vários fabricantes e variam
em área de superfície. Geralmente, quanto maior a área de superfície, maior a
capacidade do sorvente para amostras de traços orgânicos. Além disso, os anéis
52
aromáticos em contato com a matriz permitem interações de doação de elétron entre
o sorvente e as ligações π do soluto, os quais devem promover um aumento das
interações analito-sorvente, aumentando a energia de sorção. Assim, os sorventes
poliméricos retêm mais que os sorventes de fase reversa C-18.
70
Os sorventes poliméricos possuem consideravelmente uma maior capacidade
para substâncias polares. Por exemplo, Hennion e Pichon, 1994
97
reportaram
capacidades de 20 a 40 vezes maiores para fases poliméricas do que para a maioria
das fases C-18 hidrofóbicas, no isolamento de substâncias aromáticas polares da
água. Esta capacidade aumentada é muito importante quando baixos limites de
detecção são requeridos. Outra vantagem dos sorventes poliméricos sobre os
sorventes baseados em sílica é sua tolerância à valores de pH altos e baixos. Esses
sorventes poliméricos são estáveis em pH de 2.0 a 12.0.
53
5 - Análise quantitativa dos flavonóides
Numerosos métodos têm sido desenvolvidos para análise de rotina qualitativa
de polifenóis. A quantificação bruta dos componentes puros ou misturas é possível
utilizando-se técnicas colorimétricas e/ou espectrometria do UV/visível. Nos casos
onde os componentes de uma mistura são do mesmo tipo, exemplo: todos os
componentes são antocianidinas ou são flavanóis, esses métodos podem fornecer
resultados razoáveis empregando-se curvas padronizadas com flavonóides
comercialmente disponíveis
12,66
.
No caso dos componentes do cacau, isto requer
pelo menos o fracionamento das antocianinas e flavanóis.
A maior parte das propostas para fracionamento se baseiam em técnicas de
cromatografia que tem demonstrado a capacidade em separar adequadamente os
abundantes monômeros, dímeros e trímeros; mas, segundo a literatura, ainda são
incapazes de resolver estruturas oligoméricas mais complexas, como os oligômeros
de procianidina (tetrâmeros ou mais)
98
.
Tradicionalmente, os oligômeros de
procianidina são isolados minuciosamente com base no grau de polimerização,
utilizando-se múltiplos passos através de várias colunas em gel permeável.
Apesar de pouco divulgada na literatura, a determinação quantitativa de
polifenóis pode ser baseada no estudo de degradação de sua estrutura e a técnica
mais importante se baseia numa reação química de hidrólise
12,99
.
Gravimetricamente, os polifenóis podem ser determinados pelo “Método de Folin”
que se baseia no cálculo de equivalentes em relação ao ácido gálico. É adequado
quando para avaliar apenas os monômeros e poucos oligômeros
11,100
.
54
Alguns autores tem citado a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
como capaz de separar procianidinas monoméricas até procianidinas heptaméricas
como classes oligoméricas distintas
101,102
.
A literatura sobre aplicações de HPLC é
muito vasta devido a sua alta resolução, alta eficiência, alta reprodutibilidade e
tempo de análise relativamente curto e sem derivação. Além disto, o sistema é
facilmente acoplado a uma variedade de detectores
66,67
.
A cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por
espectrotofotometria de UV/visível é de ampla aplicação e pode ser usada para
quantificação. O cromatograma obtido mostra todos os componentes que absorvem
no comprimento de onda de interesse e a área do pico de cada componente.
A área
do pico é dependente do coeficiente de absorção daquele componente em um
determinado comprimento de onda. Para quantificação, as áreas desses picos são
então comparadas com aquelas das substâncias do padrão, as quais são ambos
incluídos na amostra antes da injeção (padrão interno) ou cromatografados
separadamente (padrão externo).
12,66
5.1 - Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
Na análise de polifenóis várias técnicas de cromatografia encontram
aplicações que vão desde a simplicidade da cromatografia em camada fina (CCF)
até a cromatografia de alta eficiência acoplada a poderosos detectores de massa.
Para análises qualitativas e para examinar o conteúdo de flavonóides em extratos ou
frações obtidas de outras separações cromatográficas, a CCF é particularmente
usada.
12,66
A cromatografia líquida de alta eficiência, conhecida como HPLC (em inglês
High Performance Liquid Chromatography) é indiscutivelmente a técnica
cromatográfica mais usada nos estudos de polifenóis. A primeira abordagem,
relacionada com a separação de polifenóis por HPLC, foi publicada em 1976, por
Wulf e Nagel. Esses autores utilizaram misturas ternárias de metanol, água e ácido
acético em uma coluna de fase reversa C18 para separar os flavonóides, agliconas e
glicosídios.
103
55
O HPLC têm sido utilizado para separação de antocianidinas, xantonas,
isoflavonas, procianidinas e taninos. Além disso, o HPLC é também usado para
padronização de flavonóides em uso farmacêutico.
103
Quando analisamos amostras complexas em que os componentes de
interesse atingem uma ampla faixa de retenção, é necessário modificar as condições
de eluição durante a análise; para assegurar uma resolução suficiente dos primeiros
componentes que são eluídos e a manutenção do tempo de análise dentro de limites
razoáveis. Isto geralmente é feito através da mudança na composição do eluente,
aumentando a força eluotrópica com o tempo. Com a recente tendência do uso de
três e, até mesmo, quatro componentes do eluente, isso não é uma questão
experimental trivial. O ácido usado para acidificação da fase móvel deve ser o
acético, fórmico, fosfórico ou perclórico. Fotômetros com comprimentos de onda
fixados (280 nm) ou espectrofotômetros são utilizados para detecção.
103
O HPLC pode ser usado para separação, determinação quantitativa e
identificação de flavonóides. Na maioria dos casos, os sistemas para separações de
grupos fenólicos e seus glicosídios em alimentos são realizados pela cromatografia
de fase reversa (RP), baseadas em colunas de sílica com fase ligada C18
12,66,67,69
.
Uma escolha conveniente de fase estacionária C18 e uma apropriada concentração
de ácido acético para a polaridade da fase móvel são particularmente importantes na
análise do polifenol, para obtenção de picos definidos e seletividades desejadas de
separação
103
.
A maioria dos sistemas de solventes usados para análise por HPLC inclui
eluição de gradiente binária e, ocasionalmente, eluição isocrática. Eluição com
gradiente ou isocrática; empregando solventes de ácido acético, ácido fórmico ou
ácido fosfórico aquosos com metanol (MeOH) ou acetonitrila (ACN) como
modificadores orgânicos é comum.
12,66,67
O pH e a força iônica da fase móvel são conhecidos por influenciar a retenção
de fenóis na coluna, dependendo da ocorrência de protonação, dissociação ou uma
dissociação parcial. Uma mudança no pH que aumenta a ionização da amostra
poderia reduzir a retenção na separação da fase reversa.
Assim, pequenas
56
quantidades de ácido acético (2-5%), fosfórico ou ác. trifluoracético (TFA-0,1%) são
incluídos no sistema de solvente para supressão da ionização dos fenóis e dos
grupos carboxílicos e, com isso, aprimorar a resolução e a reprodutibilidade das
corridas.
66,67
Rigaud
et al.,1993
102
desenvolveram um método por HPLC com coluna de
sílica de fase normal e um gradiente de diclorometano em metanol, com uma mistura
constante de 4% de ácido fórmico-água (1:1) como eluente, para separar
procianidinas com base em sua massa molecular, sem derivação. Isso é
repetidamente aplicado para análise de extrato de procianidina do cacau, bem como
para HPLC semi-preparativo e preparativo no isolamento, purificação e,
subseqüente, análise estrutural
11,12,104
.
Os grupos fenólicos absorvem bem na região do ultravioleta e não há um
único comprimento de onda ideal para monitoramento de todas as classes de fenóis,
já que eles apresentam absorbância máxima em diferentes comprimentos de onda.
Para sensibilidade máxima, usualmente, um comprimento de onda próximo ao
máximo é desejado. Entretanto, na prática, comprimentos de onda são escolhidos
para obter-se a melhor detecção global de todos os componentes; a qual, no caso
dos flavonóides, é na maioria das vezes, por volta de 280 nm.
67,69
Os instrumentos modernos, multicanais, detecção rápida ou detectores com
arranjo de fotodiodo, conhecido como PDA
(photo diode array) têm se tornado
norma. O PDA pode produzir dados em ambos os domínios de tempo e de espectro.
Isso demonstra a utilidade da informação qualitativa na análise de fenóis baseados
no espectro de absorção. O PDA tem três grandes vantagens para análise de HPLC:
detecção de múltiplos comprimentos de onda, identificação dos picos e
determinação da pureza do pico.
12,66,67
Como o PDA pode registrar as características do espectro no ultravioleta para
diferentes grupos fenólicos à medida que eles são eluídos da coluna, a
caracterização e o provimento de informação sobre a pureza do pico podem ser
facilitados através da comparação do espectro de frente, ápice e tamanho de cada
pico. Além disso, o cálculo rápido dos coeficientes de absorbância é possível entre
57
diferentes comprimentos de onda. Comumente, a identificação das substâncias
fenólicas na análise de HPLC foi sempre realizada por comparação entre os tempos
de retenção e características espectrais de seus picos com aqueles
dos padrões.
12,66,67
Amostras padronizadas de agliconas e de alguns glicosídios mais comuns
são comercialmente disponíveis, entretanto, as procianidinas, especialmente os
oligômeros com três ou mais unidades monoméricas, não são encontradas.
12,66,67
Para comprovar a pureza do espectro; o “upslope”, o “dowslope” e o ápice do
pico são comparados. Entretanto, para isômeros, a informação espectral no UV-Vis
isolada não pode ser aproveitada para uma identificação positiva; porque isômeros
de co-eluição podem criar um espectro, representando uma mistura de isômeros.
Neste caso e para essas substâncias, das quais os padrões não são disponíveis,
meios adicionais de identificação devem ser aplicados na interpretação da
separação por HPLC; como a espectrometria de massa (MS), ressonância
magnética nuclear (NMR) e o infra-vermelho com transformada de Fourier
(FT-IR).
66,67
Detectores de fluorescência são também usados para fenóis, mas não têm
sido aplicados largamente para detecção de flavonóides. A detecção por
fluorescência pode oferecer vantagens sobre a detecção pelo UV em termos de
aumento na seletividade e maior sensibilidade. Além disso, acoplado com o
ultravioleta, a detecção por fluorescência pode proporcionar melhor identificação e
determinação da pureza do espectro.
67
O acoplamento do sistema de HPLC com um espectrômetro de massa
on-line
(MS) utiliza uma câmara eletrospray de ionização a pressão atmosférica e tem
mostrado ser uma ferramenta poderosa de análise qualitativa permitindo a
identificação de procianidinas nos componentes do cacau e no chocolate.
12,104
Combinando os dados de massa e tempo de retenção são suficientes para
pré-definir ou confirmar a identidade das substâncias, sem isolamento prévio. A
confirmação desse método como uma ferramenta quantitativa fidedigna para
58
determinação dos níveis de procianidina no cacau, chocolate e outros produtos
alimentícios, está sendo correntemente investigada. Como este método não requer o
isolamento de substâncias com o propósito de caracterizar seu tamanho, ele é mais
rápido e pode, além disso, prover uma confirmação da fidedignidade da técnica
baseada na hidrólise, para estimativa em média do grau de polimerização (DG) da
procianidina.
12,104
59
6 - Materiais e Métodos
Todas as soluções aquosas foram preparadas utilizando-se água Milli-Q. Em
alguns experimentos, foi utilizado um solvente de composição 70% de acetona;
29,5% de água e 0,5% de ácido acético, que será denominado de mistura
eluente
104
.
As colunas de leito de espuma, de resina e de C18 foram todas tratadas
previamente com 100 mL de metanol, 100 mL de água e 100 mL de mistura eluente.
Após a percolação do padrão e da amostra, os carboidratos foram eluídos
com água e os polifenóis com a mistura eluente. Mais tarde, essa mistura eluente foi
substituída por metanol puro.
Para alcançar os objetivos propostos, as atividades foram desenvolvidas
segundo as seguintes etapas:
6.1 – Preparo de solução padrão estoque de polifenóis
Por não se dispor comercialmente de um padrão de polifenóis de chocolate foi
utilizado, neste trabalho, um padrão de chá verde. Foi adquirido um padrão
Polyphenon 60 (mínimo de 60% de catequinas totais), desidratado, fabricado pela
Sigma
e que foi estocado no escuro entre 2°C e 8°C.
A solução estoque aquosa de polifenóis foi preparada usando 4,25 g do
padrão de
Polyphenon 60 em 25 mL. Esta concentração estava de acordo com a
60
proporção do extrato obtido da amostra antes de ser percolado em coluna, segundo
Hammerstone
et al., 1999
104
. A solução estoque foi preparada sob agitação, filtrada
em papel de filtro, recolhida num frasco de vidro escuro e congelada em refrigerador.
6.1.1- Medidas da estabilidade da solução padrão de polifenóis
usando espectrofotometria
Com o intuito de averiguar a degradação, oxidação ou qualquer outra
alteração nas propriedades físico-químicas da solução padrão, realizou-se um
estudo espectrofotométrico onde a variação de absorbância foi medida em nm e ao
longo do tempo.
A espectrofotometria de UV/visível foi escolhida por ser uma técnica simples,
de baixo custo e por ser utilizada na detecção de polifenóis por HPLC. A
disponibilidade de uma técnica espectrofotométrica otimizada para avaliar a
estabilidade e a concentração de polifenóis seria muito útil no monitoramento das
frações obtidas nos processos de isolamento de polifenóis e, nas diferentes colunas
de interesse deste trabalho e, portanto, investiu-se no estudo desta técnica.
A percolação de soluções-padrão em um cartucho C18, da marca
P R COLA
(600 mg), foi necessária para auxiliar na avaliação da estabilidade das
mesmas. Utilizou-se um espectrofotômetro na faixa do visível e outro no ultravioleta.
As soluções preparadas a partir das soluções-estoque P1, P2 e P3 do padrão e
àquelas que foram resultantes da percolação pela coluna foram mantidas sob
refrigeração.
Uma bomba peristáltica foi utilizada para percolar as soluções por uma coluna
contendo C18, por não se dispor de uma bomba de pressão, sendo que a maior
dificuldade com esta coluna tipo cartucho residiu no fato de permitir uma vazão
baixa, cerca de 0,3 mL/ min.
Neste estudo, foram utilizadas duas soluções padrão estoques idênticas P1 e
P2; para avaliação da estabilidade, ao longo do tempo e durante as mesmas
variações de concentração. Também verificou-se a influência do solvente na
61
estabilidade da solução padrão estoque; comparando-se as soluções-estoque P1 e
P2 preparadas em água, com uma solução estoque preparada na mistura eluente
(70% de acetona, 29,5% de água e 0,5% de ácido acético) denominada
de P3.
Tabela 5 –Composição das soluções-estoque P1, P2 e P3
Soluções-
estoque
Quantidade de
padrão (g)
Volume final de
eluente (mL)
Eluente
P1 e P2 H
2
O
P3
4,25 25
Mistura eluente (70% acetona, 29,5%
água e 0,5% ácido acético)
6.1.2 – Medida de estabilidade das soluções padrão de polifenóis
usando HPLC
A estabilidade das soluções padrão foi verificada em um sistema de HPLC
para que se conhecesse a estabilidade dos analitos, polifenóis e carboidratos, ao
longo do tempo. Foram medidos os valores de absorbância em 280 nm e a altura do
pico em função do tempo de análise. Nesta etapa, não houve fracionamento do
padrão em coluna.
6.1.3 - Procedimento de Extração em Fase Sólida usando coluna
empacotada com C18
Algumas minicolunas (Fig.11) foram preparadas, utilizando-se sílica-gel
modificada com grupos octadecil (C-18) fornecida pela Waters, sob a forma de
cartuchos Sep-pak. Os cartuchos foram abertos e o seu conteúdo foi utilizado para
empacotar as minicolunas confeccionadas com tubo de vidro de 5,6 cm de
comprimento e 0,6 cm de diâmetro interno, cujo leito comportava cerca de 100 mg
de sílica. As colunas foram previamente umedecidas com metanol e acondicionadas
com água Milli-Q, de acordo com Hammerstone
et al., 1999
104
.
62
Figura 11 – Coluna C18
Tabela 6 - Experimentos realizados na Coluna C18
No
Sol. Estoq (
µ
L)
Vazão
(mL/min)
Vol. (mL) Eluente No Frações
1
20 H
2
O 1
2
5 Mist 1
3
35 H
2
O 7 x 5 mL
4
5 Mist 1
5
100
20 H
2
O 4 x 5 mL
6
25 20 H
2
O 4 x 5 mL
7
60 H
2
O 12 x 5 mL
8
25 Mist 5 x 5 mL
9
50
25 MeOH 5 x 5 mL
10
20 H
2
O 1
11
55 H
2
O 11 x 5 mL
12
25 Mist 5 x 5 mL
13
400
1
25 MeOH 5 x 5 mL
14
80 H
2
O 8 x 10 mL
15
100 0,5
80 MeOH 8 x 10 mL
• Uma alíquota de 100 uL da solução estoque do padrão
Polyphenon 60 foi
percolada por uma das colunas preparadas como acima, sob vazão de
1 mL/min;
63
• Numa segunda coluna, adicionou-se 25 uL da solução estoque do padrão
Polyphenon 60, sob vazão de 1 mL/min;
• Em uma terceira coluna, adicionou-se 50 uL da solução estoque, sob vazão
de 1 mL/min;
• Na quarta coluna, uma alíquota de 400 uL da solução estoque foi percolada,
sob vazão de 1 mL/min;
• Após os procedimentos anteriores, resolveu-se diminuir a vazão para
0,5 mL/min, na tentativa de que ocorresse uma melhor interação entre os
analitos, polifenóis e carboidratos, com a sílica da coluna. Sendo assim, foi
adicionado à coluna, uma alíquota de 100 uL da solução estoque.
6.1.4 - Otimização da Extração em Fase Sólida com a coluna
XAD-16
Foram confeccionadas algumas colunas com tubo de vidro de 45 cm de
comprimento e 0,65 cm de diâmetro interno, que foram empacotadas com resina do
tipo XAD-16, sendo o volume de leito de 30 mL.
Figura 12 - Coluna XAD-16
Tabela 7 – Experimentos realizados na Coluna XAD-16
64
No
Sol. Estoq (
µ
L)
Vazão
(mL/min)
Vol. (mL) Eluente No Frações
1
20 H
2
O 1
2
5 Mist 1
3
1000 1
20 H
2
O 4 x 5 mL
4*
80 H
2
O 8 x 10 mL
5*
25
80 MeOH 8 x 10 mL
6
80 H
2
O 8 x 10 mL
7
50
80 MeOH 8 x 10 mL
8**
80 H
2
O 8 x 10 mL
9**
100
0,5
80 MeOH 8 x 10 mL
* - Feitas em duplicata
** - Feitas em triplicata
• Uma alíquota de 1 mL da solução estoque do padrão
Polyphenon 60 foi
percolada por uma das colunas preparadas, sob vazão de 1 mL/min;
• Numa segunda coluna, adicionou-se 25 uL da solução estoque do padrão
Polyphenon 60, sob vazão de 0,5 mL/min, em duplicata;
• Em uma terceira coluna, adicionou-se 50 uL da solução estoque, sob vazão
de 0,5 mL/min;
• Finalmente, uma alíquota de 100 uL da solução estoque foi percolada em
todas as colunas de XAD, sob vazão de 0,5 mL/min, em triplicata;
• Resolveu-se diminuir a vazão para 0,5 mL/min, na tentativa de que ocorresse
uma melhor interação entre os analitos, polifenóis e carboidratos, com a
resina da coluna.
6.1.5 - Otimização da Extração em Fase Sólida com a coluna de
espuma de poliuretano
Foram utilizadas para o procedimento três esponjas para lavagem doméstica,
ou seja, pedaços de espumas de poliuretano (EPU) comercial de células abertas do
tipo poliéter, marca Scotch-Brite
TM
da 3 M. A referida esponja é constituída de
duas faces: uma de cor amarela lisa e outra de cor verde e áspera. Primeiramente,
65
retirou-se completamente a face verde da esponja. A face amarela foi picotada em
pequenos tabletes, com auxílio de uma tesoura.
Os tabletes de espuma, então, foram tratados com ácido clorídrico 1 M, por
24 horas; para remover possíveis contaminantes inorgânicos e lavado com água de
pureza Milli-Q até a retirada completa do ácido. Estes foram, em seguida, extraídos
com acetona no sistema soxhlet, por 6 horas; para remover contaminantes
orgânicos; finalmente, secos em estufa a 60
°C e armazenados em frascos de
vidro.
15
Em seguida, empacotou-se uma bureta de 50 mL, com diâmetro interno de
1,1 cm; sendo o volume de leito igual a 32 mL, preenchidos com os tabletes de
espuma purificados.
Figura 13 – Coluna de Espuma de Poliuretano
Tabela 8 - Experimentos realizados na Coluna de Espuma de Poliuretano
No
Sol. Estoq (
µ
L)
Vazão
(mL/min)
Vol. (mL) Eluente No Frações
1
20 H
2
O 1
2
5 Mist 1
3
250 1
20 H
2
O 4 x 5 mL
4*
100 0,5 80 H
2
O 8 x 10 mL
66
5*
80 MeOH 8 x 10 mL
* - Feitas em triplicata
• Uma alíquota de 250 uL da solução estoque do padrão
Polyphenon 60 foi
percolada por uma das colunas preparadas, sob vazão de 1 mL/min;
• Após recuperação, nesta mesma coluna, adicionou-se 100 uL da solução
estoque do padrão
Polyphenon 60, sob vazão de 0,5 mL/min, em triplicata;
• Resolveu-se diminuir a vazão para 0,5 mL/min, na tentativa de que ocorresse
uma melhor interação entre os analitos, polifenóis e carboidratos, com a
espuma da coluna.
6.2 - Estudo com amostras de chocolate
Foram adquiridas no mercado, na cidade de Niterói, RJ, duas amostras de
chocolate, em barra, do tipo meio amargo, de duas marcas de grande aceitação. As
amostras sofreram um pré-tratamento de acordo com o procedimento descrito por
Hammerstone
et al., 1999
104
, com modificações.
6.2.1 - Procedimento experimental aplicado as amostras
Hammerstone
et al., 1999
104
previa um tratamento inicial com a finalidade de
pré-concentrar a amostra, isto é, pré-concentrar os constituintes da amostra, isto é,
pré-concentrar o extrato obtido, numa determinada etapa do processo, por meio de
uma evaporação em rotavapor. A evaporação deveria ser feita à temperatura
máxima de 40
0
C para evitar a degradação dos polifenóis.
A formação de azeótropo pelos componentes da mistura utilizada como
extrator inviabilizou qualquer tentativa de evaporação dos solventes; sem contar com
a degradação e oxidação totais dos polifenóis, devido ao longo tempo de exposição
ao calor, mesmo em temperatura adequada. Além disto, as condições experimentais
disponíveis para a realização deste trabalho estavam muito aquém daquelas
67
reportadas na literatura. Era necessária uma bomba de vácuo mais apropriada e
algumas adaptações no condensador do rotavapor, de modo a ser resfriado a 5
o
C,
sendo o sistema submerso em nitrogênio líquido. Desta forma, não foi possível
introduzir a evaporação rotativa para evitar a excessiva diluição dos polifenóis, frente
aos carboidratos.
Além disso, houve modificação no tipo de solvente utilizado para eluição dos
polifenóis da coluna cromatográfica escolhida, na etapa de extração em fase sólida.
A mistura constituída de acetona, água e ácido acético foi substituída pelo metanol,
a partir dos estudos realizados anteriormente com o padrão
Polyphenon 60.
6.2.2 - Pré-tratamento das amostras
Experimento realizado de acordo com Hammerstone et al., 1999
104
:
−
−
−
−
−
−
−
Pesar cerca de 5,0 g de chocolate em barra, previamente picado;
Em funil de separação, extrair os lipídios com 50 mL de n-hexano;
Após decantar, desprezar o líquido sobrenadante, rico em lipídios;
Repetir o procedimento de extração por 3 vezes;
Filtrar em funil de Buckner acoplado a um Kitassato; deixando aspirar o
excesso de solvente;
Após secagem do solvente, uma alíquota em torno de 2,0 g do resíduo
retido no papel de filtro foi transferida para funil de separação, sofrendo
extração com 10 mL de mistura: 70% de acetona; 29,5% de água e
0,5% de ácido acético. Este procedimento de extração foi realizado
duas vezes, para retirada mais eficiente dos polifenóis;
Após decantação, o sobrenadante foi filtrado e recolhido em frasco de
vidro escuro e armazenado em congelador.
A decantação é um procedimento extremamente demorado, sendo necessário
cobrir o funil de separação com papel alumínio; para proteger os polifenóis da ação
da luz. A centrifuga comum não é aconselhada, pois não se consegue uma
68
separação satisfatória, visto que não se visualiza a interface entre as duas frações
(água/lipídio, da primeira extração e água/mistura, do segundo tipo de extração) no
tubo de centrifuga e, além disso, a separação entre fases é muito instável e o menor
movimento feito no mesmo tubo, já é suficiente para misturar as frações novamente.
6.2.3 - Percolação da amostra por uma coluna de resina XAD- 16
De forma simplificada, a Tabela 9 mostra os volumes dos extratos, gerados a
partir das amostras de chocolate meio amargo, que foram percoladas na coluna
XAD-16 (200 µL, 500 µL, 1 mL e 5 mL); para as duas marcas comerciais A e B, cada
qual feita em triplicata (A1, A2 e A3; B1, B2 e B3). A tabela mostra também os
volumes de eluente, isto é, de H
2
O e MeOH utilizados em cada alíquota de extrato;
sendo as oito frações de cada eluente ordenadas de A à H.
As amostras de chocolate foram percoladas em duas etapas. Na primeira,
diferentes alíquotas do extrato obtido foram percoladas e eluídas com água em um
total de 80 mL e com MeOH, num total de 80 mL. Na segunda etapa, uma única
alíquota de 5 mL foi percolada e utilizou-se, para eluição, 8 frações de 20 mL de
H
2
O, totalizando-se 160 mL e 80 mL de MeOH, em frações de 10 mL. A vazão
operacional foi igual a 0,5 mL/min.
O uso de uma alíquota maior (5 mL), tanto no final da primeira etapa como na
segunda etapa, teve como objetivo averiguar o comportamento, na coluna de resina
e no sistema de HPLC, de frações mais ricas em polifenóis.
Tabela 9 - Volume do extrato das amostras A e B de chocolate, percolado pela resina XAD-
16 e volume de eluente usado.
Volume de eluente adicionado à coluna XAD-16
8 frações de 10 mL = 80 mL H
2
O
8 frações de 10 mL = 80 mL MeOH
8 frações de 20 mL = 160 mL H
2
O
8 frações de 10 mL = 80 mL MeOH
Volume de amostra adicionada à coluna XAD-16
Amostras
de
chocolate
200 µL 500 µL
1 mL 5 mL 5 mL
A1
X X X X
A2
X X X
69
A3
X X X X
B1
X X X X
B2
X X X
B3
X X X
6.3 - Caracterização dos Polifenóis por Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (HPLC)
Condições:
−
−
−
−
−
−
−
−
−
Detector com arranjo de fotodiodo;
Coluna de fase normal;
Tamanho do diâmetro da partícula da coluna: 5 µm;
Tamanho da coluna: 25 x 4,6 mm;
Comprimento de onda: 280 nm (ultravioleta);
Temperatura do forno: 37
0
C;
Volume de amostra: 25 µL;
Fase móvel terciária: (A) diclorometano, (B) metanol e (C) ácido acético
e água (1:1 v/v);
Gradientes lineares de B para A com uma constante de 4% de C a uma
vazão de 1 mL/min.: a eluição começou com 14% B em A (até a
estabilização completa da linha base); 14 - 28,4% B em A, 0-30 min.;
28,4 – 50% B em A, 30-60 min.; 50-86% B em A, 60-65 min.; 65-70
min., no isocrático, ou seja, 86% B em A.
70
7 - Resultados e Discussão
7.1 - Estudo com padrão
7.1.1 - Avaliação das medidas da estabilidade da solução padrão de
polifenóis usando espectrofotometria
De uma forma exploratória, o espectro de absorção (Fig.14) para o padrão
Polyphenon 60 foi construído na faixa do visível, isto é, na faixa de 400-700 nm
porque o padrão era colorido, isto é, de cor marrom.
Padrão de polifenóis (chá verde)
-
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Figura 14 - Espectro de absorção para o padrão Polyphenon 60.
A partir da
Figura 14, percebe-se que não há apenas um comprimento de
onda, mas sim, uma faixa de comprimento de onda. Neste caso, adotou-se o
λ
max
=440 nm, por ser o ponto médio mais alto das absorbâncias.
A
Figura 15 mostra a relação entre duas soluções-estoque idênticas (P1 e P2)
e suas absorbâncias; sendo que as curvas de calibração são diferentes para
padrões de mesma concentração. Além disto, fica claro que os valores de
absorbâncias não seguem a lei de Beer.
71
Absorbância X Concentração
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
255 510 765 1020
Concentração (ppm)
Absorbância (mAU)
P1
P2
Figura 15 – Variação da absorbância em função da concentração obtida na faixa do visível
(
λ
=440nm).
A
Figura 16 mostra a avaliação da estabilidade do padrão P1, após
percolação numa coluna C18, de cartucho, em meio aquoso. A partir da eluição do
padrão P1 foram obtidas soluções de concentração de polifenóis igual a 425,0 ppm;
212,5 ppm e, novamente, 212,5 ppm. As duas últimas soluções foram repetidas para
que fosse avaliada a reprodutibilidade do procedimento. Novamente, pode-se
observar que não há seguimento da lei de Beer.
Quanto à estabilidade, pode-se dizer que não houve diferença entre as
absorbâncias das soluções preparadas a partir do padrão P1 percolado, quando
analisadas no primeiro dia, armazenadas sob refrigeração e depois analisadas,
novamente, após nove dias. As diferenças observadas entre as soluções de mesma
concentração, provavelmente, se devem ao fato de que o processo de percolação
não foi otimizado e, portanto, alguma diferença nos parâmetros de percolação
causou a diferença de absorbância notada.
72
Padrão P1 pós-coluna C18 cartucho
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
T= 1 dia T= 9 dias
Tempo
Absorbância (mAU)
212,5 ppm
212,5 ppm
425,0 ppm
Figura 16 - Comparação entre as absorbâncias de soluções recolhidas da coluna C18
(cartucho) provenientes da percolação do Padrão 1 (
λ
=440nm).
Como não houve obediência a lei de Beer, na faixa do visível, decidiu-se
investir na faixa do ultravioleta, apesar do padrão de
Polyphenon 60 ser colorido.
Segundo a literatura, o comprimento de onda mais apropriado e utilizado pela
maioria dos autores como referência para polifenóis é λ=280 nm. Sendo assim, a
estabilidade começou a ser monitorada ao longo do tempo, através da
espectrofotometria, na faixa do ultravioleta (UV). Foi necessário que todos os
padrões fossem diluídos a uma faixa de concentração de modo a gerar um valor de
absorbância adequado. Os valores de absorbância medidos são apresentados nas
Figuras 17 e 18 e na Tabela 10.
73
P 1
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
2,60 5,10 7,70 10,20
Concentração (ppm)
Absorbância
Figura 17 - Curva de calibração para as soluções preparadas a partir do Padrão 1
(
λ
=280 nm) .
P 2
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
1,30 2,60 6,40 12,80 19,10 25,50
Concentração (ppm)
Absorbância
Figura 18 - Curva de calibração para as soluções preparadas a partir do Padrão 2
(
λ
=280 nm) .
74
Tabela 10 - Valores de Absorbâncias medidos para soluções recolhidas a partir do Padrão
1, após percolarem a coluna C18 cartucho. (
λ
=280 nm).
Soluções recolhidas a partir do P1 pós-C18 cartucho
C (ppm) A
212,5 0,0676
212,5 0,0692
425,0 0,1128
Os resultados mostram uma reprodutibilidade das medidas de absorbância e,
deve ser lembrado que as soluções tiveram suas absorbâncias medidas após
percolação por uma coluna C18. Portanto, na reprodutibilidade do valor de
absorbância se inclui também a reprodutibilidade do comportamento dos polifenóis
na coluna C18. Entretanto, não foi observado o cumprimento da lei de Beer.
A partir do padrão 2, uma nova seqüência de soluções, ainda utilizando-se
água como solvente, foi realizada; como pode ser visto na
Figura 19. Em seguida,
fez-se um acompanhamento das soluções de concentração 6,40 ppm e 25,50 ppm
ao longo do tempo, de acordo com seus respectivos comprimentos de onda, como
se pode verificar através das
Figuras 20 e 21.
P 2
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
6,40 9,20 12,50 16,30 20,70 25,50
Concentração (ppm)
Absorbância
Figura 19 - Curva de calibração para soluções preparadas a partir do Padrão 2 (
λ
=280 nm).
75
P 2 (Solução de C= 6,40 ppm)
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
1257912
Tempo (dias)
Absorbância
Figura 20 - Acompanhamento da estabilidade ao longo do tempo, apenas para a solução de
6,40 ppm em água, originada do padrão 2, no comprimento de onda igual a 280 nm.
P 2 (Solução de C=25,50 ppm)
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
1257912
Tempo (dias)
Absorbância
Figura 21 - Acompanhamento da estabilidade ao longo do tempo, apenas para a solução de
25,50 ppm em água, originada do padrão 2, no comprimento de onda igual a 280 nm.
Todos os dados gerados até então, mostraram que o padrão se mantém
estável ao longo do tempo, pelo menos por até 12 dias, que foi o período aqui
avaliado. Entretanto, nem a fração colorida que absorve no visível, nem a fração
incolor que absorve no ultravioleta, acompanharam a lei de Beer.
76
A influência do solvente nos valores de absorbância foi avaliada através do
preparo de uma batelada de soluções em meio de uma mistura, constituída de 70%
de acetona; 29,5% de água e 0,5% de ácido acético. Neste solvente, o padrão,
agora chamado de P3, se mostrou estável; mas não acompanhou a lei de Beer,
como pode ser visto na
Tabela 11 e Figura 22.
Tabela 11 - Valores de Absorbância medidos para as soluções preparadas a partir do
Padrão 3 (padrão em meio de acetona, água e ácido acético)-
λ
=280 nm.
Valores de absorbância lido para soluções
preparadas a partir do P3
C (ppm) A
255 0,0791
510 0,1078
2550 0,0377
5100 0,0378
Nem em função de diferentes faixas de concentração, nem em função do
meio de preparo das soluções; não foi observada a lei de Beer para as soluções
preparadas a partir do padrão de
Polyphenon 60. Entretanto, independente do meio
e da faixa de concentração, a estabilidade das soluções foi mantida.
77
P 3 (Solução de C= 510 ppm)
0,00
0,05
0,10
0,15
13
Tempo (dias)
Absorbância
Figura 22 - Comparação da estabilidade para uma solução de 510 ppm, originada do padrão
3; usando-se a mistura de acetona, acido acético e água como solvente, no comprimento de
onda igual a 280 nm.
Os dados gerados nesta etapa mostraram que a espectrofotometria serviu ao
propósito de monitoramento da estabilidade do padrão
Polyphenon 60, sob variadas
condições. Entretanto, como não houve qualquer compromisso com a lei de Beer,
em qualquer dos casos avaliados, a espectrofotometria não se mostrou adequada
ao monitoramento da eficiência de percolação e eluição das frações que serão
obtidas nos procedimentos de isolamento de polifenóis, realizados nas etapas
posteriores deste trabalho. Sendo assim, decidiu-se que o monitoramento da
eficiência do processo de isolamento seria realizado por meio do sistema de HPLC.
Por outro lado, os resultados aqui gerados mostraram que os padrões podem
ser mantidos e guardados sob refrigeração por um período de, pelo menos, 12 dias,
sem que haja degradação. A estabilidade do padrão vem favorecer, sobremaneira, o
procedimento experimental; pois não acarreta a necessidade de injetar as frações,
no sistema HPLC, imediatamente após o seu recolhimento das colunas
cromatográficas onde será feito o isolamento dos polifenóis.
78
7.1.2 - Avaliação da estabilidade do padrão através do sistema de
HPLC
O padrão
Polyphenon 60 gerou o cromatograma mostrado na Figura 23.
Minutes
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Figura 23 - Cromatograma do padrão de chá verde Polyphenon 60
O cromatograma do padrão de chá verde íntegro (Fig.23), sem fracionamento
em coluna, revelou que se tratava de uma mistura de substâncias, não apenas de
catequinas (polifenóis). O perfil do cromatograma mostra uma série de sinais
referentes a polifenóis, localizados após o tempo de retenção de aproximadamente
10 minutos, e dois picos referentes aos carboidratos, localizados antes do tempo de
retenção de 5 minutos
104
.
Os carboidratos referidos aqui, na verdade são pseudo-alcalóides, conhecidos
como cafeína e teobromina (1
o
pico e 2
o
pico, respectivamente, antes do tempo de
retenção de aproximadamente 5 minutos). Entretanto, são chamados na literatura de
carboidratos
104
.
Para efeito deste estudo, inicialmente consideraremos como importante
apenas os dois maiores picos dos carboidratos, antes do tempo de retenção de 5
minutos, na ordem da esquerda para direita (CH1 e CH2) e; da série de polifenóis,
79
apenas os dois maiores picos, após o tempo de retenção de aproximadamente 10
minutos e antes de 40 minutos. Os dois maiores sinais dos polifenóis (Pf1 e Pf2),
neste cromatograma, estariam no tempo de retenção de 18.699 e 20.288,
respectivamente. O Pf1 e o Pf2 não são sempre os mesmos picos, ao contrário dos
carboidratos, eles são sempre os dois maiores picos de polifenóis, na ordem da
esquerda para direita, que aparecem no cromatograma. Estes picos foram
considerados como de referência e escolhidos, pois foram os que realmente se
destacaram nas soluções-estoque do padrão
Polyphenon 60, sem fracionamento
através de coluna.
Os dados para acompanhamento da estabilidade das soluções-estoque foram
gerados a partir do perfil de cada cromatograma obtido ao longo do tempo para o
padrão de
Polyphenon 60. Em cada cromatograma foi determinado o valor da
absorbância dos picos de referência para polifenóis (Pf1 e Pf2) e para carboidratos
(CH1 e CH2). Com estes dados foram construídas as curvas da
Figura 24.
Estabilidade dos analitos do padrão Polyphenon 60 em H
2
O
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1 6 7 151686
Tempo (dias)
Absorbância (mAU)
CH1
CH2
Pf1
Pf2
Figura 24 - Acompanhamento da estabilidade do padrão de chá verde em água ao longo do
tempo, através de seus analitos: carboidrato 1 (CH1), carboidrato 2 (CH2), polifenol 1 (Pf1) e
polifenol 2 (Pf2).
Como pode ser observado na Figura 24, as espécies responsáveis pelo
aparecimento dos picos denominados de Pf1 e CH1 mantiveram-se bastante
80
estáveis com o tempo. A estabilidade do Pf2 oscilou quase uniformemente e não
houve estabilidade no CH2, ou seja, foi completamente aleatória.
A estabilidade dos polifenóis e dos carboidratos de referência, presentes nas
soluções-estoque P1 e P2, ao longo de 16 dias, está compilada no gráfico de barras
mostrado na
Figura 25.
Estabilidade das Duplicatas de P1 x P2
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
1 (P1) 1 (P2) 16 (P1) 16 (P2)
Tempo (dias)
Absorbância (mAU)
CH1
CH2
Pf1
Pf2
Figura 25 - Comparação da estabilidade entre os carboidratos e polifenóis contidos no P1 e
no P2, do primeiro dia de análise e dezesseis dias depois.
Pode-se observar que o perfil do P1 é muito semelhante ao perfil obtido para
o padrão P2, para o primeiro dia de análise. Fica claro que o polifenol 1 e o
carboidrato 1 mostraram-se os mais estáveis ao longo do tempo. A estabilidade do
polifenol 2 foi pouco significativa, mas não pode ser desprezada, enquanto que o
carboidrato 2 não se manteve estável.
A estabilidade do padrão
Polyphenon 60 em meio não aquoso, isto é, em
meio da mistura de ácido acético, água e acetona foi avaliada e os dados gerados
são apresentados na
Figura 26.
81
Estabilidade dos analitos do padrão Polyphenon 60 em mistura
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
123
Tempo (dias)
Absorbância (mAU)
CH1
CH2
Pf1
Pf2
Figura 26 - Acompanhamento da estabilidade do padrão de chá verde em meio não aquoso,
ao longo do tempo: carboidrato 1 (CH1), carboidrato 2 (CH2), polifenol 1 (Pf1) e polifenol 2
(Pf2).
Neste caso, o Pf1, CH1 e o Pf2 tiveram estabilidades praticamente idênticas,
ao contrário do CH2 que se manteve instável, como anteriormente. Comparando-se
com a
figura 24 que mostra a estabilidade em água, as espécies que geraram os
picos Pf1 e o CH1 se mantiveram estáveis ao longo do tempo, independente do
meio reacional. Entretanto, as espécies responsáveis pelo pico Pf2 se mantiveram
satisfatoriamente estáveis somente em meio da mistura.
Como o Pf2 após eluição nas colunas praticamente não é observado, em
comparação ao Pf1 e ao CH1, o seu desempenho na mistura em termos de
estabilidade não foi levado em consideração, para o julgamento do melhor solvente
a ser utilizado nos experimentos seguintes; visto que, se compararmos o solvente
água e os solventes que compõem a mistura, a água foi escolhida por ser atóxica,
não poluente, pela facilidade de manipulação e baixo custo.
No geral, o polifenol 1 e o carboidrato 1 foram os que apresentaram melhor
estabilidade com o tempo; já, em contrapartida, o polifenol 2 e o carboidrato 2
demonstraram várias oscilações e, além disso, quando foram eluídos através da
82
coluna (tanto quando são constituintes do padrão; como quando são constituintes da
amostra, como será visto posteriormente no capítulo de estudo das amostras), não
são encontrados de maneira expressiva nos resultados. Por estes motivos, só
consideraremos neste estudo o polifenol 1 e o carboidrato 1.
7.1.3 - Condições de Contorno do Padrão para as colunas C18,
XAD-16 e Espuma
Todas as frações recolhidas das colunas foram injetadas no sistema de
HPLC, sendo analisado o perfil de cada cromatograma obtido. A partir destes, foram
gerados dados que permitiram a escolha da coluna mais adequada ao isolamento de
polifenóis dos carboidratos.
O perfil dos cromatogramas foi analisado à luz dos seguintes fundamentos:
−
−
−
−
−
−
−
−
Os carboidratos (ou pseudo-alcalóides, cafeína e teobromina) são os
dois maiores analitos, respectivamente, que se localizam antes do
tempo de retenção de 5 minutos.
104
Os polifenóis compreendem a série de picos localizados entre os
tempos de retenção de 10 e 40 minutos.
104
O grande interesse é obter o máximo de polifenóis e o mínimo de
carboidratos possível.
Os polifenóis são eluídos em sua maioria pelo metanol, não tendo
ocorrido nenhuma eluição de polifenóis pela mistura.
Os carboidratos são eluídos em sua maioria pela água.
104
Quanto menor a concentração dos carboidratos após a extração em
fase sólida, maior será a pureza dos polifenóis envolvidos e menor será
a dificuldade na avaliação, devido a problemas na escala.
Estabelece-se a relação P/C como sendo a relação entre o maior pico
do polifenol e o maior pico do carboidrato, expressos através de suas
alturas, ou seja, de suas absorbâncias medidas nos cromatogramas.
Em todos os cromatogramas, os polifenóis para serem considerados
como relevantes devem apresentar percentuais derivados do índice
83
P/C maiores que 100% em relação ao padrão de referência, ou seja,
aquele que ainda não foi adicionado à coluna; sendo rejeitados por
completo todos àqueles cromatogramas apresentando separação
abaixo de 60%, já que valores abaixo deste percentual são
insignificantes e demonstram que não vale a pena investir no mesmo
método.
Sendo assim, a partir das absorbâncias dos picos Pf1 e CH1 foi calculada a
razão P/C para o padrão de chá verde, isto é, para o padrão íntegro, sem
fracionamento em coluna, cujo perfil do cromatograma (
Fig.23) mostrou que os picos
de polifenol e de carboidrato são praticamente da mesma altura. O valor obtido para
P/C foi igual a 1,02 e será equivalente a 100%. Este valor servirá como referência
para o julgamento da ocorrência ou não do isolamento dos polifenóis, após
percolação através das colunas.
Assim, para os casos onde houver a separação dos polifenóis dos
carboidratos, o pico referente a polifenol será sempre maior que aquele de
carboidrato e, portanto, a relação P/C será maior que 100%.
7.1.4 - Avaliação da coluna C18
Tabela 12 - Resultados relevantes encontrados para a coluna C18
Volume de
Padrão (uL)
Ordem da
Fração
Eluente P/C %
50 A H
2
O (5 mL) 2,29 224,82
100 A H
2
O (20 mL) 1,47 144,9
400 A H
2
O (20 mL) 1,01 98,9
Teoricamente, ocorreria separação nas alíquotas de 50 e 100 uL, de acordo
com o percentual obtido a partir do índice P/C que estabelece a separação acima de
100%. Mas, isso jamais ocorreria na 1
a
fração de água; visto que os polifenóis são
eluídos em sua maioria pelo metanol e não pela água. Assim, podemos observar
que houve, provavelmente, uma ultrapassagem de limite da capacidade da coluna e
não uma separação efetiva. Os demais resultados foram desprezados porque
apresentaram um percentual de separação abaixo de 60%.
84
7.1.5 - Avaliação da coluna XAD-16
Tabela 13 - Resultados relevantes encontrados para a coluna XAD-16
Volume de
Padrão (uL)
Ordem da
Fração
Eluente P/C %
50 A MeOH (10 mL) 2,29 224,94
50 B MeOH (10 mL) 0,87 85,29
100 A MeOH (10 mL) 27,37 2692,16
100 A MeOH (10 mL) 43,60 4288,39
100 A MeOH (10 mL) 21,28 2092,81
Diante dos resultados apresentados, podemos dizer que houve significativa
separação na fração A, de MeOH, para todas as replicatas. Observou-se também
pico de polifenol no cromatograma da fração B, de metanol, entretanto, a relação
P/C era menor que 1,02.
As
Figuras 27, 28 e 29 ilustram os cromatogramas das frações em triplicatas
da separação dos polifenóis em relação aos carboidratos. Estas são frações A de
metanol, isto é, de 10 mL, quando foram percolados 100 uL da solução estoque do
padrão
Polyphenon 60 pela coluna XAD-16. A Figura 30 mostra, nitidamente, o
isolamento ocorrido no padrão
Polyphenon 60, através da aproximação visual,
Zoom, dos seus analitos: carboidrato 1, à esquerda; e do polifenol 1, à direita.
85
Minutes
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
mAU
0
50
100
150
200
250
300
mAU
0
50
100
150
200
250
300
Figura 27 - Cromatograma do Padrão Polyphenon 60 após ter sido adicionado a coluna
XAD-16.
Minut es
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
mAU
0
100
200
300
400
500
mAU
0
100
200
300
400
500
Figura 28 - Cromatograma do Padrão Polyphenon 60 após ter sido adicionado a coluna
XAD-16 (duplicata).
86
Minut es
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
mAU
0
100
200
300
400
500
mAU
0
100
200
300
400
500
Figura 29 - Cromatograma do Padrão Polyphenon 60 após ter sido adicionado a coluna
XAD-16 (triplicata).
Minut es
4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
0
50
100
150
200
250
300
mAU
0
50
100
150
200
250
300
Figura 30 - Cromatograma do Padrão Polyphenon 60 após ter sido adicionado a coluna
XAD-16 (Zoom do Carboidrato 1 e do Polifenol 1).
87
7.1.6 - Avaliação da coluna de espuma de poliuretano
Tabela 14 - Resultados relevantes encontrados para a coluna de espuma
Volume de
Padrão (uL)
Ordem da
Fração
Eluente P/C %
100 E MeOH (10 mL) 0,69 67,34
100 G MeOH (10 mL) 2,09 205,48
A separação ocorreu na fração G de MeOH, diferentemente da XAD-16 em
que, nas triplicatas, ocorria sempre na fração A de MeOH. Além disto, para a coluna
de espuma, não foi observada qualquer separação na duplicata e triplicata. O valor
percentual de P/C calculado para a fração E não se mostrou interessante porque
está abaixo de 100% e o restante dos resultados obtidos foram desprezados por
apresentarem percentuais abaixo de 60% de separação.
7.1.7 - Seleção da melhor coluna de extração em fase sólida
De acordo com a literatura levantada durante a realização deste trabalho, o
isolamento de polifenóis esteve sempre relacionado com a separação em sílica, seja
em coluna C18, seja em coluna de sílica, propriamente dita. O uso de outras fases
sólidas, em particular, o uso de resina e de espuma de poliuretano, não tem sido
explorado para polifenóis. Neste particular, o que existe disponível na literatura são
poucos trabalhos referentes ao estudo da retenção de fenóis.
O estudo de avaliação de técnicas para isolamento de polifenóis apresentado
veio explorar a aplicação de duas fases sólidas, isto é, de uma resina polimérica e
de espuma de poliuretano, ainda não utilizadas para o isolamento de polifenóis. A
espuma e a sílica modificada com C18 não mostraram um perfil de eluição
reprodutível e nem eficiência de separação que justificasse um investimento no
método, enquanto que a resina se mostrou capaz de isolar, com eficiência, polifenóis
de carboidratos, gerando frações muito ricas em polifenóis. Esta metodologia, uma
vez otimizada, poderá ser implementada para atender técnicas que requeiram
frações, nas quais, necessariamente, os polifenóis deverão estar livres de
carboidratos, como no caso da espectrometria de massa.
88
Os dados gerados mostraram que dentre os meios avaliados, a coluna de
resina XAD-16 se apresentou como o mais adequado ao isolamento dos polifenóis,
tendo em vista os altos valores determinados para a razão P/C. O isolamento
eficiente foi confirmado pelos resultados obtidos em triplicata. Considerando o valor
de P/C igual a 27,37 (Tab. 13), é possível eluir uma fração da coluna de resina com
um fator de concentração de 27 vezes, do teor de polifenol em relação ao teor de
carboidrato. Este fator foi calculado em relação ao valor de P/C inicial que é de 1,02.
Há de se considerar ainda que este resultado foi conseguido com um volume muito
pequeno de metanol.
Por outro lado, os experimentos realizados com a espuma não apresentaram
uma boa reprodutibilidade. A interação da amostra com a espuma sofreu variações
que não puderam ser controladas, por falta de tempo hábil, e gerou dados de pouca
consistência. São ainda necessários estudos exploratórios que permitam otimizar as
condições operacionais.
Assim, houve uma coerência entre os resultados da coluna XAD-16, pois os
maiores valores de P/C ocorreram sempre para a mesma fração eluida. Esta
coerência deu subsídios para que a coluna de resina fosse escolhida dentre os
outros meios avaliados.
7.2 - Estudo com amostras de chocolate
Sob as mesmas condições experimentais definidas para os padrões, os
extratos obtidos no pré-tratamento das amostras de chocolate, das marcas A e B,
foram percolados pela coluna de resina XAD-16. Cada fração obtida na eluição das
colunas foi injetada no sistema de HPLC gerando um cromatograma, cujo perfil foi
analisado da mesma forma que para os padrões.
Os cromatogramas mostraram picos de altura muito pequena para polifenóis,
o que significa que o extrato deveria ter sido pré-concentrado. Entretanto, se fosse
usado o rotavapor para pré-concentrar, nas condições que possuíamos no
laboratório, as amostras se degradariam e oxidariam pela dificuldade de evaporação
89
do azeótropo formado entre a acetona (70%), água (29,5%) e ácido acético (0,5%)
e, principalmente, pelo longo tempo de exposição (mesmo em temperatura
adequada de 40
o
C para os polifenóis), como chegou a acontecer
experimentalmente. Então, preferiu-se estudar amostras com baixas concentrações
de polifenóis do que correr o risco de perdê-las completamente. A água possui uma
grande capacidade de eluir os carboidratos retidos na XAD-16; isso explica o fato
dos percentuais relativos ao índice P/C, no caso das amostras, serem tão altos,
mesmo com uma baixa concentração de polifenóis.
7.2.1 - Condições de Contorno das Amostras na Coluna XAD-16
O perfil dos cromatogramas foi analisado à luz dos seguintes fundamentos:
−
−
−
−
−
−
Os carboidratos (ou pseudo-alcalóides, cafeína e teobromina) são os
dois maiores analitos, respectivamente, que se localizam antes do
tempo de retenção de 5 minutos
104
. Sendo que no caso das amostras,
como elas estão imersas na mistura, o primeiro pico mais alto e de
base mais larga corresponde à mistura e os dois picos seguintes
seriam os carboidratos.
Os polifenóis compreendem a série de picos localizados entre os
tempos de retenção de 10 e 40 minutos.
104
O grande interesse é obter o máximo de polifenóis e o mínimo de
carboidratos possível.
Os polifenóis são eluídos em sua maioria pelo metanol, não tendo
ocorrido nenhuma eluição de polifenóis pela mistura.
Os carboidratos são eluídos em sua maioria pela água.
104
Em uma separação efetiva pelo HPLC, quanto menor a concentração
dos carboidratos após a extração em fase sólida através da coluna
XAD-16, menor a probabilidade de interferência com os polifenóis,
melhorando a pureza dos polifenóis envolvidos e minimizando
problemas de escala.
90
Estabelece-se a relação P/C como sendo a relação entre o maior pico
do polifenol e o maior pico do carboidrato, expressos através de suas
alturas, ou seja, de suas absorbâncias lidas nos cromatogramas.
−
−
−
Em todos os cromatogramas, os polifenóis para serem considerados
como relevantes devem apresentar percentuais derivados do índice
P/C maiores que 100% em relação ao padrão de referência, ou seja,
aquele que ainda não foi adicionado à coluna; sendo rejeitados por
completo todos àqueles cromatogramas apresentando separação
abaixo de 60%, já que valores abaixo deste percentual são
insignificantes e demonstram que não vale a pena investir no mesmo
método.
Estabelece-se, então, o índice de separação P/C das amostras de
referência das duas marcas A e B feitas em triplicatas e equivalentes a
100 %: a partir das absorbâncias dos picos Pf1 e CH1 foi calculada a
razão P/C para as amostras de chocolate meio amargo, que foram
assumidas como
amostras de referência, ou seja, a partir do extrato
íntegro obtido no pré-tratamento da amostra, sem fracionamento em
coluna. Os valores obtidos para P/C nas amostras de referência serão
equivalentes a 100% (Tab. 15).
Tabela 15 - Relação P/C das amostras de referência das marcas A e B equivalentes a
100%.
Amostras de Chocolate meio amargo
A1 A2 A3 B1 B2 B3
P/C
0,04 0,04 0,03 0,03 0,26 0,03
%
100 100 100 100 100 100
Assim, para os casos onde houver a separação dos polifenóis dos
carboidratos, a relação P/C será maior que 100%.
As
Figuras 31 a 36 mostram os cromatogramas obtidos para as amostras de
chocolate meio amargo, das marcas A e B, em triplicata (A1, A2, A3 e B1, B2 e B3),
sem fracionamento através da coluna. Destes cromatogramas foram calculados os
valores de P/C.
91
Minutes
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Figura 31 - Cromatograma da amostra de chocolate meio amargo da marca A1.
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Figura 32 - Cromatograma da amostra de chocolate meio amargo da marca A2.
92
Minut es
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
mAU
0
250
500
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1250
1500
1750
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Figura 33 - Cromatograma da amostra de chocolate meio amargo da marca A3.
Minut es
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Figura 34 - Cromatograma da amostra de chocolate meio amargo da marca B1.
93
Minut es
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Figura 35 - Cromatograma da amostra de chocolate meio amargo da marca B2.
Minutes
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Figura 36 - Cromatograma da amostra de chocolate meio amargo da marca B3.
As
Figuras 37 a 42 mostram os mesmos cromatogramas obtidos
anteriormente; só que desta vez isentos dos picos de carboidratos, apenas
destacando os polifenóis do chocolate meio amargo, das marcas A e B, em triplicata
(A1, A2, A3 e B1, B2 e B3), sem fracionamento através da coluna.
94
Minut es
10.0
12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0
mAU
10
20
30
40
50
60
70
mAU
10
20
30
40
50
60
70
Figura 37 - Polifenóis da amostra de chocolate meio amargo da marca A1, sem os
carboidratos.
Minut es
10.0
12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0
mAU
10
20
30
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50
60
mAU
10
20
30
40
50
60
Figura 38 - Polifenóis da amostra de chocolate meio amargo da marca A2, sem os
carboidratos.
95
Minutes
10.0
12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0
mAU
-10
0
10
20
30
mAU
-10
0
10
20
30
Figura 39 - Polifenóis da amostra de chocolate meio amargo da marca A3, sem os
carboidratos.
Minutes
10.0
12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0
mAU
-10
0
10
20
30
mAU
-10
0
10
20
30
Figura 40 - Polifenóis da amostra de chocolate meio amargo da marca B1, sem os
carboidratos.
96
Minutes
10.0
12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0
mAU
0
100
200
300
400
mAU
0
100
200
300
400
Figura 41 - Polifenóis da amostra de chocolate meio amargo da marca B2, sem os
carboidratos.
Minutes
10.0
12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0
mAU
-10
0
10
20
30
40
mAU
-10
0
10
20
30
40
Figura 42 - Polifenóis da amostra de chocolate meio amargo da marca B3, sem os
carboidratos.
O perfil dos cromatogramas mostrou que os extratos íntegros das amostras
de chocolate possuem matriz bastante complexa pois apresentou variados picos
numa ampla faixa de tempo de retenção. Qualitativamente, os cromatogramas se
equivalem salvo aquele referente a amostra B2, onde surgiu um pico de polifenol de
intensidade, em relação ao mesmo pico nos demais cromatogramas.
97
Os cromatogramas dos extratos obtidos no pré-tratamento da amostra
mostraram que tal procedimento é adequado para uma avaliação qualitativa de
polifenóis. Hammerstone
et al., 1999
104
também usou o mesmo procedimento para
avaliar qualitativamente as procianidinas em cacau.
O fato de ter sido obtido extrato de composição quantitativa diferente para
amostra em replicata não representa uma desvantagem para o propósito deste
trabalho, pois os cromatogramas destes extratos mostram com clareza a relação
entre polifenol e carboidrato. Este parâmetro é que será usado para monitorar a
eficiência de enriquecimento das frações em relação ao teor de polifenol.
98
7.2.2 - Avaliação da marca A
Tabela 16 - Resultados relevantes encontrados para a amostra A
Amostra Volume (uL)
Fração
H
2
O
(mL)
Ordem da
Fração
Eluente P/C %
A1 200 10 F MeOH (10 mL) 1,04 2536,34
A1 5000 10 A H
2
O (10 mL) 0,35 859,75
A1 5000 10 C H
2
O (10 mL) 0,19 460,8
A1 5000 10 D H
2
O (10 mL) 0,05 110,72
A1 5000 10 G H
2
O (10 mL) 0,04 94,99
A1 5000 10 H H
2
O (10 mL) 1,85 4516,43
A1 5000 10 A MeOH (10 mL) 0,57 1400,13
A1 5000 10 E MeOH (10 mL) 0,25 604,93
A1 5000 10 F MeOH (10 mL) 0,7 1721,38
A1 5000 20 B H
2
O (20 mL) 0,47 1157,25
A1 5000 20 C H
2
O (20 mL) 0,22 539,38
A1 5000 20 D H
2
O (20 mL) 0,09 212,6
A1 5000 20 E H
2
O (20 mL) 0,36 885,54
A1 5000 20 F H
2
O (20 mL) 0,25 622,26
A1 5000 20 G H
2
O (20 mL) 0,32 787,8
A1 5000 20 H H
2
O (20 mL) 0,09 230,88
A1 5000 20 A MeOH (10 mL) 0,11 271,37
A1 5000 20 B MeOH (10 mL) 0,03 66,48
A1 5000 20 C MeOH (10 mL) 0,04 102,08
A1 5000 20 D MeOH (10 mL) 0,58 1429,5
A1 5000 20 E MeOH (10 mL) 4,32 10579,24
A1 5000 20 F MeOH (10 mL) 0,52 1272,39
A1 5000 20 G MeOH (10 mL) 0,62 1526,21
A1 5000 20 H MeOH (10 mL) 0,19 464,79
A2 5000 20 A MeOH (10 mL) 0,17 448,22
A2 5000 20 E MeOH (10 mL) 0,42 1121,23
A2 5000 20 F MeOH (10 mL) 0,27 729,51
A3 5000 10 H H
2
O (10 mL) 0,22 785,05
A3 5000 10 A MeOH (10 mL) 0,92 3341,21
A3 5000 10 E MeOH (10 mL) 0,46 1669,54
A3 5000 10 F MeOH (10 mL) 0,56 2045,21
A3 5000 20 A MeOH (10 mL) 0,19 691,07
A3 5000 20 E MeOH (10 mL) 0,53 1930,71
A3 5000 20 F MeOH (10 mL) 0,57 2067,95
- Houve uma ótima separação na fração F de metanol, mas que não foi reproduzido
nem na fração de 200 uL da duplicata (A2) , nem na fração de 200 uL da triplicata
(A3).
- Foram separadas as frações F, A e E de metanol, em ordem decrescente;
correspondentes a amostra A1 de 5 mL e frações de água contendo 10 mL.
99
- Na tentativa de aumentar a eficiência de separação, aumentou-se o volume das
frações de água com a intenção de eluir maior quantidade de carboidrato, nas
frações iniciais e, assim, proporcionar um maior destaque aos polifenóis. Realmente,
com a mudança deste parâmetro experimental, chegamos a um valor de 10579,24 %
de separação na fração E de metanol; correspondentes a amostra A1 de 5 mL e
frações de água contendo 20 mL.
- Observando-se os valores de P/C para as frações aquosas iniciais de 10 e 20 mL,
fica claro que não houve interação entre os polifenóis e a resina. Entretanto, os
dados já mostram que um volume em torno de 60 mL de metanol é adequado para
alcançar a maior eficiência de separação.
- Alíquotas menores foram percoladas, mas para a amostra A2 só houve separação
para um volume de 5 mL de amostra. Separação mais significativa ocorreu para a
fração E, o que significa o gasto de 50 mL de metanol.
- Destacam-se as frações A, F e, em seguida, E de metanol; no que diz respeito a
separações significativas. Ocorreu reprodutibilidade em duplicata nas amostras A1 e
A3 de 5 mL, com frações de água contendo 10 mL; para as frações A, E e F de
MeOH.
- O aumento do volume de água como eluente apresentou vantagens para a relação
P/C e se manteve a tendência para se obter frações com maiores níveis de
polifenóis em relação ao carboidrato, usando-se em torno de 60 mL de metanol.
Além disso, houve reprodutibilidade nas triplicatas A1, A2 e A3, das frações A, E e F
de MeOH para volume de amostra de 5 mL, com frações de 20 mL de água.
100
7.2.3 - Avaliação da marca B
Tabela 17 - Resultados relevantes encontrados para a amostra B
Amostra Volume (uL)
Fração H
2
O
(mL)
Ordem da
Fração
Eluente P/C %
B1 200 10
A
MeOH (10 mL) 0,15 547,04
B1 200 10 F MeOH (10 mL) 2,17 8092,78
B1 500 10 F MeOH (10 mL) 3,7 13816,03
B1 1000 10 A MeOH (10 mL) 0,18 683,81
B1 1000 10 C MeOH (10 mL) 0,09 351,2
B1 5000 20 B H
2
O (20 mL) 0,21 795,92
B1 5000 20 C H
2
O (20 mL) 0,35 1295,86
B1 5000 20 D H
2
O (20 mL) 0,23 841,7
B1 5000 20 E H
2
O (20 mL) 0,57 2112,69
B1 5000 20 F H
2
O (20 mL) 0,39 1451,2
B1 5000 20 G H
2
O (20 mL) 0,39 1447,6
B1 5000 20 H H
2
O (20 mL) 0,89 3338,44
B1 5000 20 A MeOH (10 mL) 0,36 1357,1
B1 5000 20 B MeOH (10 mL) 0,13 477,27
B1 5000 20 C MeOH (10 mL) 0,15 560,35
B1 5000 20 D MeOH (10 mL) 0,47 1761,37
B1 5000 20 E MeOH (10 mL) 0,49 1836,02
B1 5000 20 F MeOH (10 mL) 2,61 9771,91
B1 5000 20 G MeOH (10 mL) 0,46 1725,67
B1 5000 20 H MeOH (10 mL) 0,54 2003,67
B2 200 10 F MeOH (10 mL) 0,28 107,33
B2 500 10 A MeOH (10 mL) 0,32 123,62
B2 5000 20 A MeOH (10 mL) 0,36 138,26
B2 5000 20 E MeOH (10 mL) 0,52 202,66
B3 5000 20 A MeOH (10 mL) 0,32 979,41
B3 5000 20 E MeOH (10 mL) 0,71 2195,65
B3 5000 20 F MeOH (10 mL) 0,22 678,17
- Ótima separação ocorrida na duplicata das frações F de metanol das amostras de
B1 e de B2, 200 uL e frações de água de 10 mL.
- Alto percentual de separação para a amostra B1 de 500 uL, com frações de água
de 10 mL; apesar do resultado não ter se reproduzido para as demais amostras B2 e
B3 correspondentes.
- Ocorreu separação nas frações A e C de metanol da amostra B1 de 1 mL, com
frações de água de 10 mL.
101
- Encontramos em 5 mL, com frações de água de 20 mL: triplicata nas frações A e E
de metanol para B1, B2 e B3; além de duplicata na fração F de metanol em B1 e B3.
- Ao invés de ter ocorrido separação na fração F de metanol como foi em B1, dessa
vez foi na fração A de metanol para o B2; em 500 uL, com frações de água de
10 mL.
7.2.4 - Comparação entre as marcas A e B
É importante notar que os valores de P/C confirmam que não houve interação
dos polifenóis com a resina durante a eluição com água. Porém, a separação dos
polifenóis ocorreu em diversas frações de metanol.
Os cromatogramas obtidos para os extratos das amostras A e B, em
triplicatas, deixaram claro que há uma tendência para eluição de polifenóis com
metanol utilizando-se um volume em torno de 60 mL. Uma vez otimizada, esta
eluição deverá permitir o fracionamento da amostra, isolando com eficiência, os
polifenóis de carboidratos.
O perfil dos cromatogramas das Figuras 37 a 42 permitiu traçar uma relação
qualitativa entre as amostras A e B. Os principais picos de polifenóis aparecem com
repetibilidade nos cromatogramas, contudo, não reproduzem em sensibilidade para
uma mesma amostra. Entretanto, cabe salientar que Hammerstone
et al., 1999
104
detectou, por HPLC/PDA e por HPLC/MS, picos de polifenóis, isto é, de monômeros
de procianidinas, em extrato obtido de sementes de cacau produzido no Brasil e
comparando-se o cromatograma obtido para tal extrato com aqueles obtidos para as
triplicatas das amostras de chocolate A e B, picos com tempo de retenção muito
similar foram obtidos. Não houve diferenciação entre ambas as marcas avaliadas.
Relacionando as marcas A e B, podemos dizer que o volume mais adequado
para as análises das amostras de chocolate, ou seja, o volume onde se consegue o
maior percentual de isolamento seria o de 5 mL, nas frações de água contendo 10
ou 20 mL e com a reprodutibilidade do método marcada pelas frações A, E e F
102
contendo 10 mL de MeOH cada uma; onde realmente ocorreram as separações em
sua grande maioria.
Em relação ao isolamento de polifenóis, pode-se afirmar que o perfil de
eluição encontrado para o chocolate da marca A foi o mesmo para a marca B, o que
variou foi a eficiência da separação.
103
8 - Conclusão
- Os resultados alcançados para a resina mostraram um perfil de eluição
reprodutivo, tanto para o padrão, quanto para as amostras de
chocolate. A resina XAD-16 gera fração muito mais rica em polifenol
que a espuma de poliuretano ou a silica modificada com C18.
- Além de se mostrar bastante promissora quanto ao isolamento de
polifenóis, a resina é vantajosa por permitir procedimentos
experimentais rápidos e que podem ser feitos sob ação da gravidade,
evitando-se o uso de bomba peristáltica; é um material regenerável,
diminuindo-se, assim, o custo operacional.
−
−
A espectrofotometria mostrou-se como um método interessante na
avaliação da estabilidade do padrão de chá
Polyphenon 60, ao longo
do tempo; mas, não é apropriada para determinação quantitativa, pois
não houve cumprimento da “Lei de Beer”.
As espécies denominadas de polifenol 1 e carboidrato 1 foram as que
apresentaram melhor estabilidade com o tempo; já, em contrapartida,
aquelas denominadas de polifenol 2 e carboidrato 2 demonstraram
várias oscilações e, além disso, quando eluídas das colunas, tanto no
caso do padrão como no caso da amostra, não foram encontrados de
maneira expressiva.
104
−
−
−
−
O estudo com padrão de chá verde mostrou que, para matriz menos
complexa, a coluna de resina XAD-16 gerou resultados eficientes, com
rapidez e com reprodutibilidade, enquanto que o mesmo não foi
observado para a coluna de espuma. Tais qualidades deixa a coluna
de resina em vantagem também sobre a coluna C18 que é pouco
convidativa para trabalhos de rotina.
O metanol se mostrou bastante adequado para a eluição de polifenóis
da coluna de resina XAD-16, independente da complexidade da matriz.
Com apenas 20 mL de metanol foi possível eluir os polifenóis
presentes nas alíquotas do padrão que foram percoladas pela resina.
O perfil de eluição com metanol mostrou uma significativa
reprodutibilidade confirmada através dos procedimentos em triplicata.
As amostras de chocolate, que foram objetos deste trabalho,
apresentaram um teor de carboidratos equivalente aquele encontrado
na solução estoque do padrão
Polyphenon 60, enquanto que o teor de
polifenóis na mesma amostra foi muito menor, gerando picos de baixa
absorbância.
Não foi possível pré-concentrar a amostra por rotavapor, devido à
formação de azeótropo pelos componentes da mistura, os quais
inviabilizava qualquer tentativa de evaporação dos solventes; sem
contar com a degradação e oxidação totais dos polifenóis, devido ao
longo tempo de exposição ao calor, mesmo em temperatura adequada
(40
o
C). Além disso, as condições experimentais citadas
104
para a
evaporação eram muito diferentes das nossas; pois possuíam bomba
de vácuo mais apropriada e adaptações no condensador do rotavapor
de modo a ser resfriado a 5
o
C e, ao mesmo tempo, o sistema era
submerso em nitrogênio líquido. Entretanto, neste trabalho, um
procedimento experimental foi desenvolvido, com sucesso, mesmo
excluindo-se a etapa de pré-concentração por evaporação.
105
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