( PDF ) Expressão imunohistoquímica de moléculas HLA não clássicas (HLA-G E HLA-E) e receptores CD4, CD25 e CD28 em lesões de mucosa oral,associadas à infecção pelo Papilomavírus humano (HPV)

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESSQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

CAMPUS DE ARARAQUARA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS

PAULA ANDRÉA GABRIELLI FREGONEZI

EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE MOLÉCULAS HLA NÃO CLÁSSICAS (HLA-

G E HLA-E) E RECEPTORES CD4,CD25 E CD28 EM LESÕES DE MUCOSA ORAL,

ASSOCIADA A INFECÇÃO PELO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV)

ARARAQUARA

2007

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESSQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

CAMPUS DE ARARAQUARA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS

PAULA ANDRÉA GABRIELLI FREGONEZI

EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE MOLÉCULAS HLA NÃO CLÁSSICAS (HLA-

G E HLA-E) E RECEPTORES CD4,CD25 E CD28 EM LESÕES DE MUCOSA ORAL,

ASSOCIADA A INFECÇÃO PELO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV)

ARARAQUARA

2007

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PAULA ANDRÉA GABRIELLI FREGONEZI

EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE MOLÉCULAS HLA NÃO CLÁSSICAS (HLA-

G E HLA-E) E RECEPTORES CD4,CD25 E CD28 EM LESÕES DE MUCOSA ORAL,

ASSOCIADA A INFECÇÃO PELO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV)

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Análises Clínicas da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas da

Universidade Estadual Paulista “Júlio de

Mesquita Filho”, para obtenção do título

de Doutor em Análises Clínicas, área de

Citologia Clínica.

ORIENTADORA: Prof(a).Dra. Christiane Pienna Soares

ARARAQUARA

2007

Ficha Catalográfica

Elaborada pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

UNESP – Campus de Araraquara

Fregonezi, Paula Andréa Gabrielli

F859e Expressão imunohistoquímica de moléculas HLA não clássicas (HLA-G E

HLA-E) e receptores CD4, CD25 e CD28 em lesões de mucosa oral,associadas

à infecção pelo Papilomavírus humano (HPV) / Paula Andréa Gabrielli

Fregonezi. – Araraquara, 2006.

145 f.

Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de

Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em

Análises Clínicas.

Orientadora: Christiane Pienna Soares.

1. Papilomavírus humano (HPV) – Lesões orais. 2. HLA não clássicas

HLA-G e HLA-E . I. Soares, Christiane Pienna, orient. II. Título.

CDD: 616.075

COMISSÃO EXAMINADORA

Profa.Dra. Christiane Pienna Soares – Orientadora e

Presidente

Profa.Dra. Beatriz Maria Machado de Medeiros – Membro

Titular

Prof.Dr. Eduardo Antonio Donadi – Membro Titular

Prof.Dr. Sérgio Nicolau Mansini – Membro Titular

Prof.Dr. Paulo Tambasco – Membro Titular

MENSAGEM

BOM MESMO É IR À LUTA COM DETERMINAÇÃO,

ABRAÇAR A VIDA E VIVER COM PAIXÃO,

PERDER COM CLASSE E VENCER COM OUSADIA,

POIS O TRIUNFO PERTENCE A QUEM SE ATREVE...

E A VIDA É MUITO PARA SER INSIGNIFICANTE.

( Charles Chaplin )

DEDICATÓRIA

Dedico esta tese as minhas filhas Maria Paula e Paola,

ao meu marido Carlinhos e aos meus amados pais,

por todo tempo que fui ausente e não pude compartilhar

os momentos de alegria que vocês sempre me proporcionam.

AGRADECIMENTOS

A Deus por me dar saúde, consciência, habilidade e coragem para atingir o meu

objetivo realizando este trabalho.

Ao meu esposo Carlinhos, o meu reconhecimento pelo sacrifício e a minha promessa de

fazer o máximo para que esses anos sejam lembrados, de momentos poucos, mas muito

intensos, nos méritos de minhas conquistas há muito de sua presença.

A minha orientadora profa. Dra. Christiane exemplo, aprendizado, pois todo o tempo foi

presente e realizou sua função com excelência.

A professora Dra. Beatriz Maria Machado de Medeiros pela colaboração com seus

valiosos conhecimentos que foram relevantes na conclusão deste trabalho.

Ao professor Dr. Eduardo Antonio Donadi que nos auxiliou com seu conhecimento e

nos ofereceu seu laboratório para realizar parte dos experimentos.

Ao professor Dr. Vanderlei Menani que novamente foi pronto para nos emprestar seus

equipamentos de captura de imagem e analisador.

Ao Dr. Edson Garcia Soares que nos auxiliou na interpretação dos resultados das

biópsias e dos marcadores.

A Débora, grande amiga, que sempre me incentivou na execução deste trabalho.

A Renata Mazon que participou ativamente deste trabalho e se tornou grande amiga.

Mariana, Maísa e Roberta que sempre me ajudaram quando solicitava e estavam a todo

o momento presente.

A Renata Simões que foi essencial na realização deste trabalho me ensinou muito do

seu profissionalismo e competência.

Ao pessoal do laboratório da Usp de Ribeirão, Neife, Marcos e Mariana, que estiveram

sempre prontos para me auxiliar.

A Ana Soares que cortou as biópsias com rapidez e prontidão.

As funcionárias da Seção de Pós-graduação Claudia, Laura e Sônia por estarem sempre

prontos para atender e dispensar toda atenção e informações necessárias para a

realização deste trabalho.

A Irani que sempre me auxiliou em todas as dúvidas com relação a realização deste

trabalho.

As minhas funcionárias do laboratório e de minha casa, que sem elas não conseguiria

completar este trabalho.

A minha amiga Laurita que me ajudou muito com a impressão destes exemplares.

A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, não

podendo citar todos neste espaço, mas os meus sinceros agradecimentos.

SUMÁRIO

1) RESUMO 15

2) ABSTRAT 17

3) REVISÃO DA LITERATURA E INTRODUÇÃO 19

-3.1 Cancer oral 20

-3.2 Cofatores da carcinogênese oral 25

-3.3 HPV e Câncer oral 30

-3.4 CHP e Câncer 30

-3.5 Resposta de células T e moléculas co-estimulatórias 34

-3.6 Resposta imunológica, HPV e Câncer 38

4) JUSTIFICATIVA 39

5) OBJETIVOS 43

6) MATERIAIS E MÉTODOS 45

-6.1 Casuistica 46

-6.2 Metodologias 47

-6.2.1 Imunohistoquímica 47

-6.2.2 Controles 48

-6.2.3 Análise Quantitativa da expressão imunohistoquímica 48

-6.2.4 Interpretação da imunoreatividade 49

-6.2.5 Detecção e tipagem do HPV 50

-6.2.6 Amplificação do HPV e de Beta-globina 51

-6.2.7 Análise Estatística 53

7) RESULTADOS: 54

7.1-EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE MOLÉCULAS NÃO CLÁSSICAS

HLA-G E HLA-E EM LESÕES DE MUCOSA ORAL SSOCIADAS A INFECÇÃO

PELO HPV 55-61

7.2- EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DOS RECEPTORES CD4, CD25 E

CD28 EM LESÕES DE MUCOSA ORAL INFECTADDAS PELO HPV 62-68

8) DISCUSSÃO 69

9) CONCLUSÕES 79

10) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 81

11) ANEXO 1 105

12) ANEXO 2 124

LISTA DE TABELAS

01) EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE MOLÉCULAS NÃO CLÁSSICAS

HLA-G E HLA-E EM LESÕES DE MUCOSA ORAL SSOCIADAS A INFECÇÃO

PELO HPV

TABELA 1- Expressão de moléculas não clássicas e detecção do DNA de HPV 57

TABELA 2- Expressão imunohistoquímica quantitativa de HLA-G and HLA-E 58

2) EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DOS RECEPTORES CD4, CD25 E CD28

EM LESÕES DE MUCOSA ORAL INFECTADDAS PELO HPV

TABELA 1- Detecção do DNA de HPV 64

TABELA 2- Ausência ou baixa expressão imunohistoquímica (positivity index = zero to <

15%) das moléculas CD4, CD25 and CD28 molecules de acordo com as lesões 64

TABELA 3- Ausência ou baixa expressão imunohistoquímica das moléculas CD4, CD25 and

CD28 de acordo com a presença de HPV 65

LISTA DE FIGURAS

01) REVISÃO DA LITERATURA E INTRODUÇÃO

FIGURA 1- Incidência de Câncer Oral 21

FIGURA 2- Ciclo de Vida do HPV 29

FIGURA 3- Representação Esquemática do complexo HLA 32

2) RESULTADOS

2.1 EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE MOLÉCULAS NÃO CLÁSSICAS

HLA-G E HLA-E EM LESÕES DE MUCOSA ORAL SSOCIADAS A INFECÇÃO

PELO HPV

FIGURA 1- Expressão quantitativa das moléculas não clássicas ( HLA-G e HLA-E) 59

FIGURA 2- Correlação de Pearson de HLA-G and HLA-E e o HPV 60

FIGURA 3- HLA-G ( Painel A a C) e HLA-E (Painel D a F) marcação da membrana

citoplasmática em lesões infectadas pelo HPV 61

2.2 EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DOS RECEPTORES CD4, CD25 E CD28

EM LESÕES DE MUCOSA ORAL INFECTADDAS PELO HPV

FIGURA 1- Expressão quantitative dos receptores CD4, CD25 e CD28 66

FIGURA 2- CD25 (Painel A a C) and CD28 (Painel D a F) marcação de infiltrado

linfocitário em lesões infectadas pelo HPV 67

FIGURA 3- CD4 ( Painel A a C) marcação do infiltrado linfocitário em lesões orais 68

ABREVIATURAS

HPV- Papilomavírus Humano

CEC- Carcinoma espinocelular

KDa-Kilo Daltons

CTLs- Linfócitos T citotóxicos

CHP- Complexo de Histocompatibilidade Principal

HLA- Human Leukocyte Antigen

TNF- Fator de Necrose Tumoral

KIR- Human Killer inhibitory receptor group

LIR- Leucocyte Ig-like receptors

CD- Cluster of differentiation

APC- Célula Apresentadora de Antígeno

IL- Interleucina

NK- Natural Killer

PCR- Reação de Polimerização em Cadeia

TAP- Transportador Associado ao Processamento de Antígeno

INF- Interferon

RESUMO

As células tumorais infectadas pelo HPV podem apresentar estratégias para escapar da

resposta imunológica resultando na persistência da infecção viral e na transformação celular

maligna. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel das células T e, indiretamente,

das células Natural Killer (NK), em lesões orais causadas pelo HPV. A avaliação

imunohistoquímica dos receptores de células T em infiltrado linfocitário foi realizada nas 79

biópsias de mucosa oral divididas de acordo com sua diferenciação histológica. Por outro

lado, em algumas destas lesões (=51) foi avaliada a expressão tecidual de moléculas HLA não

clássicas. A expressão das moléculas CD4, CD25, CD28 , HLA-G e HLA-E foi avaliada

pelo método de imunoperoxidase e quantitativamente avaliado por análise de imagem. A

detecção do DNA do HPV e a identificação dos tipos virais foi realizada pela técnica de

polimerização em cadeia (PCR). Das 79 lesões orais, 30(38%) tinham HPV e 49(62%) não

tinham HPV, enquanto em 51 pacientes, 24(47%) foram HPV positivo e 27(53%) foram HPV

negativos. Tipos de HPV de alto risco foram mais freqüentes em todas as lesões orais e

infecções por diferentes tipos de HPV foram observados na mesma lesão. Diminuição da

expressão de CD4/CD25 e CD25/CD28 ( P=0,037) foi observada nas lesões malignas e em

todas as lesões com HPV. Menor expressão de CD4 e maior expressão de CD28 foram

observadas em lesões orais malignas quando comparadas com as lesões benignas (P=0,005).

Em 51 pacientes, elevada expressão de HLA-G foi observada em lesões orais benignas

(p<0,01) e progressivamente diminuiu nas lesões pré-malignas e malignas.Correlação inversa

(r = - 0,3944, p<0,05) foi observada em lesões orais com HPV, com alta expressão de HLA-G

e baixa expressão de HLA-E. Em conclusão, a diminuição da expressão de receptores de

células T e de moléculas HLA-E, bem como a maior expressão de moléculas HLA-G pode

ser uma estratégia do HPV para escapar da imunovigilância do hospedeiro, resultando na

infecção viral persistente e na carcinogênese oral.

ABSTRACT

HPV-infected tumor cells could present strategies to evade from the immune responses,

resulting in the persistence of viral infection and to malignant cell transformation. The aim of

the present study was to investigate the role of T cells, and, indirectly, natural killer cells, in

HPV-infected oral lesions. To investigate T cell receptors in lymphocyte infiltrate,

immunohistochemistry evaluation was performed in 79 oral biopsies, stratified according

histological differentiation. On the other hand, some of those oral lesions (n=51) were

evaluated to non-classic HLA molecules tissue expression. The analysis of CD4, CD25,

CD28, HLA-G and HLA-E expression were performed by immunoperoxidase method and

quantitatively evaluated by computer-assisted image analyse method. DNA HPV detection

and HPV typing was performed by PCR technique. Out of 79 oral lesions, 30 (38%) were

infected with HPV and 49 (62%) were not infected, while in 51 patients, 24(47%) were HPV

positive and 27(53%) were negative. High-risk HPV types were more frequent among all oral

lesions and multiple HPV type infection was observed in the same oral lesions.

Downregulation of CD4/CD25 and CD25/28 (P=0.037) was observed in malignant oral

lesions and in all oral lesions groups HPV-infected. Lower expression of CD4 and higher

expression of CD28 were observed in malignant oral lesions, when compared with benign

lesions (P=0.005). In 51 patients, HLA-G overexpression was observed in benign oral lesions

(p < 0.01) and progressively decreased in premalignant to malignant oral lesions. An inverse

correlation (r = - 0.3944, p< 0.05) was observed in HPV-infected oral lesions, with high

HLA-G expression and low HLA-E expression. We can conclude that downregulation of T

cell receptors and HLA-E tissue expression as well as upregulation of HLA-G molecule might

be an HPV strategy to escape from host immune surveillance, which could result in HPV

persistent infection and oral carcinogenesis

REVISÃO DE LITERATURA E INTRODUÇÃO

CÂNCER ORAL

O câncer é uma das maiores ameaças à saúde pública tanto nos países desenvolvidos

quanto nos países em desenvolvimento e, segundo relatório de 2004, ele foi o responsável

pela morte, em todo o mundo, de 7,1 milhões de pessoas no ano de 2003 (WHO, 2004).

Mundialmente considerado como um problema de saúde pública, o câncer representa a

terceira causa de morte no Brasil, e, segundo dados do Ministério da Saúde, 402.190 novos

casos e 126.960 óbitos por câncer foram observados no ano de 2003 (BRASIL, 2004).

Os carcinomas de cabeça e pescoço representam 5,5% do total de neoplasias malignas

no mundo, sendo o sexto tipo de carcinoma mais comumente encontrado (SARANATH et

al., 1999) . No Brasil, excluindo o câncer de pele, os cânceres de oro-faringe representam a

quinta maior incidência de neoplasias entre os homens e a sétima entre as mulheres. Esses

tumores contribuíram com, em média, 2,7% e 0,7% do total de mortes causadas por câncer

entres homens e mulheres, respectivamente, no período compreendido entre 1980-1995

(WUNSCH-FILHO, 2002) . A incidência de câncer oral é de 9,5 em homens e 3,0 em

mulheres por 100 mil habitantes. Anualmente, cerca de 500.000 novos casos de carcinomas

da região da orofaringe são diagnosticados no mundo, sendo que desses, 65.000 casos

ocorrem na Índia. Em alguns países, a incidência e a mortalidade por esse tipo de carcinoma

têm permanecido estáveis ou aumentado nas últimas décadas, especialmente na população

masculina jovem dos países ocidentais e na Europa Oriental (SARANATH et al., 1999) . Por

outro lado, o aumento da incidência do câncer oral/faríngeo tem sido relatado em várias

regiões tais como Dinamarca, França, Alemanha, Escócia, Europa Central e Oriental (LANE,

2003); nos Estados Unidos cerca de 29.000 casos por ano são diagnosticados (WALKER et

al., 2003) .

Figura 1- Incidência do Câncer Oral no mundo, independente da idade. As diferenças

observadas se devem aos fatores de risco de cada região e ao acesso ao sistema de saúde.

IARC - International Agency for Research on Cancer, 2003.

Dentre as lesões de orofaringe o câncer oral é um grave e crescente problema de saúde

pública no Brasil, correspondendo a 4% de todos os tipos de câncer, ocupando o oitavo lugar

entre os tumores que acometem o homem e o décimo primeiro entre as mulheres. O

carcinoma espinocelular é a neoplasia mais comum na mucosa oral, representando 95% dos

tumores malignos dessa região. (SCULLY et al., 2000; BIRNER et al., 2001).O diagnóstico

do câncer oral é simples e deve ser precoce, pois sua evolução natural é rápida e, num estágio

avançado não é possível o tratamento, culminando com a morte do indivíduo (KOWALSKI e

CARVALHO, 2001) . Adicionalmente, a média de vida de um paciente com câncer oral é de

aproximadamente 5 anos em 40 a 50% dos casos e algumas vezes essa mortalidade tem sido

atribuída ao acesso de determinados pacientes a serviços especializados (BROUHA et al.,

2005). Por outro lado, o diagnóstico tardio resulta no aumento dos custos com o tratamento e

HOMENS MULHERES

prolongado tempo de internação hospitalar do paciente, ocasionando severo impacto no

sistema de saúde. (KOWALSKI et al., 1994) .

Nas regiões geográficas de maior prevalência de câncer oral, o hábito de fumar e a

ingestão regular de álcool parecem estar diretamente relacionados ao desenvolvimento desse

tipo de carcinoma, totalizando 90% dos cânceres orais; o risco de câncer aumenta com o

consumo de álcool (REIBEL, 2003; COGLIANO, 2004). Um estudo no Rio de Janeiro

revelou que 76,5% dos pacientes com câncer oral eram fumantes, enquanto um outro estudo

realizado nas cidades de São Paulo, Curitiba e Goiânia também apontou uma forte associação

entre o fumo e o aumento da incidência de câncer oral. Esse e outros estudos também indicam

o consumo de álcool, especialmente da cachaça, como contundente fator de risco para o

desenvolvimento de neoplasias orais (FRANCO et al., 1989; LEITE e KOIFMAN, 1998;

WUNSCH-FILHO, 2002).

Dentre as diferentes lesões que são observadas na cavidade oral, carcinoma

espinocelular (CEC) é o tumor maligno mais freqüentemente encontrado na mucosa oral, nas

regiões da língua, lábio e assoalho bucal (KUFFER e LOMBARDI, 2002). Sendo precedido

por lesões pré-malignas que podem apresentar-se clinicamente como leucoplasias,

eritroplasias, leucoeritroplasia e líquen plano (NEVILLE et al., 1998, RUIZ MENDEZ et al.,

1989; GERVASIO et al., 2001; COLETTA et al., 2002) . Durante a última década, um maior

interesse tem ocorrido em relação às alterações celulares que precedem o carcinoma

espinocelular, como por exemplo, as leucoplasias sendo uma parte delas representativas de

diferentes estágios de malignização ou decorrentes de lesões que parecem clinicamente

normais. A maioria dessas lesões tem sido chamadas de pré-cancerosas, um termo que é

empregado de forma diversa entre os diferentes especialistas. Para os ginecologistas, lesões

pré-cancerosas são entendidas segundo o conceito histológico de displasia ou neoplasia

intraepitelial. Entretanto, para os dentistas e estomatologistas, o entendimento de alterações

pré-malignas está associado ao conceito clínico de leucoplasia (KUFFER e LOMBARDI,

2002). O carcinoma espinocelular (CEC) é a neoplasia mais comum na cavidade bucal e

representa 90% de todos os tumores malignos da região bucal e 4% de todos os tipos de

câncer (SCULLY et al., 2000; BIRNER et al., 2001; KUFFER e LOMBARDI, 2002;

WALKER et al., 2003).

As lesões pré-malignas na mucosa oral são classificadas clinicamente como

leucoplasia oral que é conceituada como uma lesão predominantemente branca que

clinicamente não pode ser caracterizada como qualquer outro tipo de lesão (AXELL et al.,

1996) , sendo considerada uma lesão pré-maligna ou potencialmente malignizante (AXELL et

al., 1996; VAN DER WAAL, et al., 1997). As leucoplasias apresentam padrões e aspectos

semelhantes, porém, microscopicamente, são muito heterogêneas, variando da hiperqueratose

benigna ao carcinoma invasor de células escamosas. As características histológicas das

leucoplasias podem, eventualmente, estar associadas a um maior risco de transformação

maligna, podendo ser classificadas segundo o grau de displasia (REGEZI e SCIUBA, 2000;

VAN DER WAAL et al., 2000; SCHEPMAN et al., 1998).

Assim, displasia é uma organização anormal ou um crescimento desordenado de

células ou tecidos presentes em um órgão. Histologicamente, comparando-se o tecido normal

ao displásico, podem-se observar alterações epiteliais nítidas e bem características,

constituindo-se um quadro histológico distinto (REGEZIE e SCIUBA, 2000).Quanto maior a

atipia celular presente na displasia epitelial, maior será o risco de transformação maligna.

Dessa forma, a caracterização histopatológica tecidual é importante para o estabelecimento da

extensão e gravidade dessas lesões.

O sistema de classificação das leucoplasias orais inclui o tamanho, o local da lesão em

sítios de alto risco ou de baixo risco, a subclassificação clínica homogênea ou não homogênea

e grau de displasia epitelial (VAN DER WAAL et al., 2000) . Em geral, o aspecto histológico

da leucoplasia pode variar de atrofia a hiperplasia epitelial com ou sem hiperqueratose.

Entretanto, as leucoplasias também podem apresentar diferentes graus de displasia epitelial,

de discreto a severo, e em alguns casos, ter alterações compatíveis com carcinoma in situ

(VAN DER WAAL et al., 1997). O diagnóstico histopatológico das leucoplasias serve para

dois propósitos: excluir qualquer outra lesão branca definida, como por exemplo, o líquen

plano, e estabelecer o grau de displasia epitelial, se presente. Ainda, o diagnóstico clínico de

leucoplasia pode ser substituído, se o diagnóstico histopatológico for definido como

carcinoma in situ ou invasivo (VAN DER WAAL et al., 1997).

O risco de transformação maligna pode variar de acordo com o sexo, mais prevalente

entre as mulheres, tipo de leucoplasia, presença de Candida albicans, e/ou a presença de

displasia epitelial. Em relação ao tipo, as lesões leucoplásicas idiopáticas, não homogêneas e

de longa duração, ou mesmo aquelas situadas na língua e/ou assoalho da boca, apresentam

maior probabilidade de tornarem-se lesões malignas (RODRIGUES, et al., 1998). Dessa

forma, as lesões displásicas (leucodisplasia) possuem maior risco de transformação maligna

que as lesões não displásicas, também denominadas leucoqueratoses (AXELL, et al., 1996;

VAN DER WAAL, et al., 2000). Embora a malignização seja mais freqüente nas lesões com

displasias, a transformação carcinomatosa pode também acontecer em leucoplasias não

displásicas (BURKHARDT,1985; CRISSMAN, 1989; SILVERMAN, 1996). As lesões sem

displasia são consideradas benignas com possibilidade de reversão e apresentam, em geral,

bom prognóstico. Das lesões benignas que acometem os tecidos orais, a hiperplasia fibrosa

inflamatória é encontrada com freqüência, localizada na face vestibular do rebordo alveolar.

Estas lesões apresentam padrão de proliferação celular em tecido conjuntivo fibroso, em

função de trauma ocasionado por prótese total ou parcial mal-adaptada. Outras hiperplasias

fibrosas similares não tão comuns, classificadas como pólipo fibroepitelial, estão localizadas

no palato duro como resposta celular proliferativa induzida por dentadura (NEVILLE et al.,

1998). Porém, é possível encontrar esse tipo de hiperplasia em gengiva, resultantes de

irritação local, com quadro histológico característico de processo inflamatório (SHAFER,

1987).

COFATORES DA CARCINOGÊNESE ORAL

Fumo e Álcool

O cigarro contém uma mistura de pelo menos 50 componentes, incluindo carcinógenos

como nitrosaminas, aldeídos, aminas aromáticas e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos

(SCULLY, 2000.). Muitos desses componentes formam aductos com o DNA, sendo que

fumantes apresentam uma maior quantidade de aductos e de quebras no DNA em tecidos da

cavidade oral do que não fumantes (PHILLIPS, 2002). As bebidas alcoólicas também contêm

muitos carcinógenos e pró-carcinógenos, incluindo o etanol e as nitrosaminas. O acetaldeído,

um dos produtos do metabolismo do etanol, é citotóxico e resulta na produção de radicais

livres e bases hidroxiladas no DNA (SCULLY, 2000) . Existe uma clara evidência de que

pacientes com câncer oral apresentam maior dano no DNA do que pessoas com hábitos

similares de consumo de álcool e fumo, mas sem neoplasia (SCULLY, 2000).

Adicionalmente, a presença de lesões de cavidade oral pode ocorrer em diferentes sítios

anatômicos e está associada a cofatores distintos. No carcinoma de lábio inferior, a

participação da radiação solar como fator de risco está bem estabelecida. Em contrapartida, a

etiologia dos carcinomas intrabucais, principalmente o de língua, é atribuída ao fumo e ao

álcool (BUNDGAARD, 1994; COLETTA et al., 2002). Embora tabaco e álcool sejam fatores

de risco bem estabelecidos para o câncer oral, entretanto uma pequena proporção (15 a 20%)

dos pacientes não tem historia de tabagismo e etilismo, sugerindo a presença de outros fatores

de risco como o papilomavírus humano (HPV), porém seu papel ainda não foi bem definido

(XAVIER et al., 2005). Assim, o carcinoma da cavidade oral é considerado uma doença que

envolve a participação de fatores genéticos e ambientais e alguns estudos apontam a infecção

pelo HPV no desenvolvimento desse tipo de câncer ( FREGONESI, 2003; NAGPAL, 2003).

Papilomavírus Humano (HPV)

O HPV é um vírus de DNA, da família Papovaviridae, identificado primeiramente por

STRAUSS, em 1949, e, desde então, vem sendo isolado em inúmeras espécies animais. As

partículas virais completas não são envelopadas e o capsídeo proteico tem padrão icosaédrico,

possuindo 55 nm de diâmetro. No interior do capsídeo, o DNA é circular e dupla fita,

medindo de 7500 a 8000 pares de bases (pb) (HOWLEY, 1994; MAJEWSKI, 1997; ZUR

HAUSEN, 2002). O ciclo de vida dos tipos de HPV está ligado ao processo de diferenciação

celular do epitélio (STUBENRAUCH, 1999; ZUR HAUSEN, 2000). O genoma viral contém

duas regiões principais compostas por ORFs (open reading frames) que codificam as

proteínas virais. A região E (precoce) é constituída por 8 genes (E1-E8, sendo que E3 e E8

não têm função conhecida) e codifica as proteínas envolvidas na replicação viral, e, para os

HPVs de alto risco, no processo de imortalização. A região L (tardia) codifica as proteínas

estruturais necessárias para a produção do capsídio. Além dessas, ainda existe uma região

regulatória que contém a origem para a replicação viral e controla a transcrição de alguns

genes da região E (HEISE, 2003). As proteínas codificadas pela região E são capazes de

interagir com várias proteínas da célula hospedeira, interferindo com processos como controle

do ciclo celular, resposta apoptótica, sinalização celular e expressão gênica e podendo

colaborar com a transformação maligna celular (ZUR HAUSEN, 2000).

O tamanho relativamente pequeno do genoma do HPV permite a análise de cada gene

e a interação das proteínas virais com a célula hospedeira. Os genes precoces compõem 60%

do genoma viral e estão envolvidos com a replicação do DNA (região E1), controle da

transcrição (região E2), maturação do vírus e alteração da matriz e citoesqueleto celulares

(região E4) e no estímulo da proliferação e transformação celular (regiões E5, E6 e E7). Os

genes L1 e L2, da região tardia, compõem 40% do genoma e constituem seqüências altamente

conservadas entre todos os papilomavírus e respondem por sua antigenicidade. Estes genes

codificam proteínas estruturais do capsídeo viral, a proteína principal L1, de 54 Kilo Daltons

(KDa) e a proteína secundária L2, de 52 KDa (ZUR HAUSEN, 2002).

A origem de replicação está localizada na região designada LCR ou URR, entre L1 e

E6, com aproximadamente 500 a 1000 pb, onde foram mapeados vários sítios de ligação de

elementos regulatórios virais (produtos de E2), ou celulares (fatores de transcrição da célula

hospedeira) que, em conjunto, determinam a regulação positiva ou negativa da transcrição dos

genes virais (HOWLEY, 1994; IARC, 1995; ZUR HAUSEN, 2002).

O HPV tem tropismo por células epitelias de pele e mucosa, causando proliferação

benigna ou maligna, na dependência do tipo viral, decorrente do modo de interação,

epissomal ou integrada, entre o vírus e a célula. Portanto, esta interação determina o potencial

oncogênico de determinados tipos virais em sítios anatômicos prevalentes. Alguns tipos são

encontrados com maior frequência em lesões malignas de pele (HPV 5 e 8) e os tipos 16, 18,

31, 33 e 45 nas mucosas. Outros tipos são encontrados mais comumente em lesões benignas,

como o HPV1 e 2 (pele) e 6, 11 e 42 (mucosas). A infecção de pele e mucosas pelo HPV

ocorre através de microlesões existentes na camada basal do tecido (ZUR HAUSEN, 1996;

2002) . Ainda, os tipos de HPV são classificados, segundo seu potencial oncogênico, em

baixo risco e alto risco de malignidade, segundo estudos clínicos, epidemiológicos e

imunológicos (LAZO, 1988; MAJEWSKI, 1997). Têm-se conhecimento até o momento de

100 tipos diferentes de HPVs sequenciados e cerca de 35% não são totalmente caracterizados,

cada qual relacionado com o desenvolvimento de um tipo de lesão em pele ou mucosas (ZUR

HAUSEN, 2002).

A transcrição inicia-se a partir de um mesmo promotor em todos os RNAm dos

diferentes tipos virais, na região próxima ao gene E6 (ZUR HAUSEN, 2002). Contudo, a

transcrição ocorre de maneira diferenciada em determinados tipos celulares, na dependência

da interação viral com o genoma da célula hospedeira e o grau de diferenciação do epitélio.

Dessa forma, os genes precoces são expressos na camada basal do tecido infectado, e

continuam nas linhagens celulares subseqüentes, observados em células benignas e malignas.

Por sua vez, os genes tardios, L1 e L2, são expressos somente em células queratinizadas,

resultando na produção de partículas virais completas e infectantes observados nas verrugas e

condilomas (ZUR HAUSEN, 2002). Há dois modos de replicação do HPV, o primeiro ocorre

nas células da camada basal do epitélio, onde o genoma viral é distribuído às células filhas,

principalmente quando o DNA próviral encontra-se integrado ao genoma da célula

hospedeira. A integração do genoma viral garante uma infecção persistente nas células

proliferativas das camadas basais, associadas ao maior risco de malignização celular. No

segundo, chamado epissomal ou vegetativo, a replicação do HPV ocorre nas camadas mais

diferenciadas do epitélio e não há a integração do DNA viral ao genoma da célula hospedeira.

Neste caso, são produzidas múltiplas cópias do genoma do vírus, que serão envolvidas pelo

capsídeo protéico, formando assim as partículas virais maduras, também denominadas vírions

(ZUR HAUSEN, 2002).

Figura 2 – Ciclo de vida do HPV em relação à diferenciação celular. Em vermelho estão

demonstrados os genes de E6 e E7 expressos na camada basal e parabasal e relacionados com

a manutenção e proliferação do vírus. Em verde está demonstrada a relação de expressão dos

genes E4, E1 e E2 em relação à amplificação do genoma viral nas camadas intermediárias do

epitélio infectado. Em azul está demonstrado o DNA viral no interior do núcleo das células

intermediárias e superficiais. Em laranja, a expressão dos genes relacionados com o

empacotamento do DNA viral na camada superficial. Nas células da camada superficial

queratinizadas os vírus são liberados (ZHENG E BAKER, 2006).

Manutenção

do Genoma

Proliferação

Amplificação

do Genoma

Empacotamento

Liberação do

Vírus

HPV E O CÂNCER ORAL

Dessa forma, o HPV vem sendo considerado como um dos agentes etiológicos

relevantes e a infecção viral parecem promover o descontrole do ciclo celular no

desenvolvimento das lesões bucais. A possível relação do HPV na etiologia do câncer oral foi

primeiramente relatada por SYRJANEN (1993) . Muitos trabalhos, desde então, se seguiram e

essa associação vem se tornando cada vez mais consistente (MCGLENNEN, 2000; SAND et

al., 2000; SCULLY et al., 2000). Estudos realizados no Brasil demonstram a presença de

HPV em lesões benignas e malignas de mucosa oral com positividade variando de 15-60%,

sendo que a infecção com os tipos de HPV oncogênicos, tais como 16 e 18, tem sido descrita

em cerca de 20 a 30 % das lesões orais pré-malignas e neoplásicas (MIGUEL et al., 1998;

GIOVANNELLI et al., 2002; SOARES et al., 2002; FREGONESI, et al., 2003; OSTWALD

et al., 2003; SOARES et al., 2003; SUGIYAMA et al., 2003). Lesões malignas ou pré-

malignas apresentam maior risco de associação com o vírus, o que sugere que o HPV pode

estar envolvido na carcinogênese de mucosa oral (GIOVANNELLI et al., 2002; RITCHIE et

al., 2003; SUGIYAMA et al., 2003).

O envolvimento do HPV com a carcinogênese celular tem sido alvo de diversos

estudos, com o objetivo de melhor compreender os fatores virais e celulares responsáveis

pelos eventos de transformação maligna (SYRJANEN e SYRJANEN, 1999; MCGLENNEN,

2000; ZUR HAUSEN, 2000). Estudos com HPVs de alto risco permitiram definir a

importância do modo de replicação (integrado ou episomal) e a função dos genes precoces E6

e E7 nos eventos de proliferação celular (MUNGER e PHELPS, 1993). Os produtos dos

genes E6 e E7 dos HPVs de alto risco codificam proteínas multifuncionais que interferem no

crescimento celular, estando diretamente envolvidos nos eventos de transformação celular

(TOMMASINO e CRAWFORD, 1995). A ligação da proteína E6 de HPVs de alto risco

resulta na degradação da p53, uma proteína supressora de tumor que determina a parada do

ciclo celular para o reparo de danos no DNA genômico. Dessa forma, o complexo gerado por

E6/p53 remove o controle p53-dependente do ciclo celular, provocando o aumento de divisão

celular, com instabilidade cromossômica e acúmulo de várias mutações na célula infectada

(ZUR HAUSEN, 1996). Por outro lado, a ligação da proteína E6 de HPVs de baixo risco à

p53 não resulta em sua degradação e portanto não colabora para os eventos de carcinogênese

(LI, 1996). Há uma estreita correlação entre a presença do genoma viral de alto risco e

mutações na seqüência gênica, também colaborando com a proliferação celular desordenada

(SCULLY et al., 2000). Portanto, a inativação de p53 parece representar o fator mais

importante na progressão de malignidade, possivelmente por não conseguir impedir

diretamente a imortalização e transformação celular.

O aparecimento de tumor ou a persistência de uma infecção viral depende da resposta

imunológica do hospedeiro. Uma vez que a partícula viral infecte as células hospedeiras, os

linfócitos T citotóxicos (CTLs) reconhecem os peptídeos antigênicos apresentados na

superfície das células infectadas associadas às moléculas do complexo de

histocompatibilidade principal (CHP).

MOLÉCULAS DO COMPLEXO DE HISTOCOMPATIBILIDADE PRINCIPAL

(CHP) E O CÂNCER

Os genes CHP estão relacionados à rápida rejeição de tecidos transplantados

entre animais de experimentação, particularmente entre camundongos. Assim, o CHP

representa o conjunto de genes responsáveis por codificar as moléculas de

histocompatibilidade em uma determinada espécie, sendo chamado no ser humano de sistema

HLA (Human Leukocyte Antigen). Esses genes estão localizados no braço curto do

cromossomo 6 e reunidos em 3 grupos, denominados genes de classe I, classe II e classe III.

Os genes de classe I codificam as moléculas clássicas de histocompatibilidade HLA-A, B e C,

os genes de classe II codificam as moléculas clássicas de histocompatibilidade HLA-DR, DQ

e DP e os genes de classe III, embora estejam incluídos dentro do CHP, não codificam

moléculas de histocompatibilidade. Assim, as proteínas C4 e C2 da via clássica e o fator B da

via alternativa do complemento, os fatores de necrose tumoral (TNF-α e TNF-β), proteína

heat shock (HSP 70) e as enzimas 21-hidroxilase são moléculas incluídas na região de classe

III (DONADI, 2001) . A Figura 1 representa de modo esquemático os genes do CHP

humano.

Figura 3 - Representação esquemática do complexo HLA, ilustrando os principais locos de

classe I e II. A região de classe III não está representada. (Não estão representados todos os

locos existentes no complexo HLA).

O CHP é o conjunto de genes mais polimórfico entre os mamíferos. O entendimento

do termo polimorfismo é essencial para a compreensão dos mecanismos de associação com as

doenças, da evolução das espécies, e também, para a seleção de doadores em transplantes de

órgãos ou células. Alguns genes apresentam uma mesma seqüência de ácidos nucléicos em

todos os membros de uma população, sendo chamados não polimórficos (exemplo: β

microglobulina). Assim, se o gene não polimórfico (não relacionado ao sexo) vier do

cromossomo materno ou paterno, a proteína sintetizada será basicamente a mesma em todos

os membros da população (REYBURN et al., 1997).

Entre os loci HLA-C e HLA-A há muitos genes que são chamados classe I-like porque se

assemelham aos genes de classe I, mas exibem pouco ou nenhum polimorfismo. Alguns

desses genes codificam proteínas que são expressas em associação com a β2-microglobulina e

são chamadas de moléculas de classe IB, para diferenciá-las das moléculas clássicas

polimórficas de classe I. Nesta classe de moléculas IB estão as moléculas HLA-G , HLA-E e

HLA-F (ABBAS et al., 2005).

Os peptídeos associados ás moléculas codificadas pelo CHP de classe I são produzidos

pela degradação proteolítica de proteínas citosólicas, pelo transporte dos peptídeos através de

proteínas TAP gerados no retículo endoplasmático, e pela ligação de moléculas de classe I

recém sintetizadas (ABBAS, 2005).

O HLA-G é expresso nos tecidos placentários (trofoblastos, macrófagos placentários e

células endoteliais) nos quais não há expressão de moléculas clássicas do HLA de classe I e

II. Contudo, transcritos de HLA-G foram encontrados em baixos níveis nos olhos, timo,

pulmão, coração e rins de fetos e nas células mononucleares do cordão umbilical.

Interessantemente, os transcritos não foram encontrados nas células pluripotentes

hematopoéticas (KIRSZENBAUM et al., 1995). Moléculas de RNA mensageiro de HLA-G

foram também observadas em altos níveis na câmara anterior dos olhos, pele, pulmão e

células mononucleares do sangue periférico de adultos (JURISICOVA et al., 1996). Três

receptores das células NK, no mínimo, reconhecem a molécula de HLA-G, são eles: receptor

p49, que é membro do grupo KIR (human killer inhibitory receptor group) (LOPEZ-BOTET et

al., 2000); receptor LIR-1/ILT-2 e receptor ILT-4, membros do grupo LIR (leukocyte Ig-like

receptors) ou da família ILT (Ig-like transcript families) (LE BOUTELLIER , 1999). Ocorre

uma interação entre células T CD8

e moléculas de HLA-G, sugerindo que esses linfócitos

devem ser ativados para desempenhar funções citotóxicas supressoras (SANDERS et al., 1991).

O HLA-E é expresso em maior número de tecidos do que o HLA-G, sendo também

expresso em tecidos placentários, contudo, a expressão em tecidos fetais ocorre

principalmente em estágios tardios da gestação, estando diretamente relacionada à proteção

fetal. Assim como o HLA-G, o HLA-E está envolvido na regulação de células NK,

interagindo com o receptor inibitório CD94/NKG2A. O HLA-E apresenta seqüências líder

peptídicas de moléculas clássicas do HLA (-A, -B e –C), por isso sua expressão está

relacionada à expressão de moléculas clássicas do HLA (HODGKINSON et al., 2000).

RESPOSTA DE CÉLULAS T E MOLÉCULAS CO-ESTIMULATÓRIAS

Diversos modelos animais para infecção pelo HPV têm associado a resposta imune

celular à regressão da lesão. Em lesões de alto grau pode haver uma regressão espontânea, que

é presumivelmente mediada pela resposta imunológica. No câncer cervical é possível verificar

que os linfócitos infiltrantes no tumor são predominantemente linfócitos T citotóxicos, CTLs

(WANG, et al., 2003). CLTs específicos contra oncoproteínas do HPV foram identificados no

sangue periférico de pacientes com câncer cervical e neoplasias intraepiteliais cervicais, bem

como em indivíduos saudáveis infectados pelo HPV 16 (MCDEVITT, 2000). A persistência

viral está relacionada à resposta imune do hospedeiro, especialmente na ausência de resposta

linfoproliferativa em resposta à infecção (UNG et al., 1999). A resposta imune do tipo Th1

pode gerar resposta específica dos linfócitos T citotóxicos, contribuindo para a eliminação da

infecção e regressão das lesões causadas pelos tipos de HPV de baixo risco (GONCALVES e

DONADI, 2004). Embora a resposta linfocitária específica possa ser encontrada no sangue

periférico, a presença e a retenção de grande quantidade de linfócitos T citotóxicos são

observadas, preferencialmente, no tumor cervical (UNG et al., 1999). Entretanto, a relação

entre a resposta imunológica e o clearence da infecção viral ainda é pouco entendida. A

persistência da infecção pelo HPV ou sua eliminação, associados à regressão das neoplasias

intraepiteliais cervicais é ainda pouco compreendida.

As células T expressam diferentes proteínas de membrana, as quais servem como

marcadores fenotípicos de diferentes populações linfocitárias e atuam em funções importantes

e na ativação da resposta imune celular. As moléculas denominadas CD (Cluster of

Differentiation) são reconhecidas por um agrupamento de anticorpos monoclonais que podem

ser usados para identificar a linhagem ou o estágio de diferenciação dos linfócitos

(KERREBIJN et al., 1999). As duas funções mais freqüentemente atribuídas aos diferentes

antígenos CD são de promover as interações entre as células e sua aderência, e enviar sinais

que levem à ativação da resposta imune celular (SUGAMURA et al., 1995).

Os linfócitos T desempenham papéis centrais em todas as respostas imunes

adaptativas contra antígenos protéicos. Sendo que na imunidade celular, as células T CD4

ativam macrófagos para destruir microrganismos fagocitados, e os linfócitos T CD8 destróem

as células infectadas por microrganismos intracelulares.Os linfócitos T reconhecem os

fragmentos de peptídeos derivados de antígenos protéicos associados a moléculas da

superfície celular codificadas por genes do CHP (ABBAS, 2005).

As moléculas CD4 e CD8 são proteínas das células T que se ligam às regiões não

polimórficas das moléculas de CHP e traduzem sinais que, juntamente com sinais liberados

pelo complexo TCR, iniciam a ativação das células T. Uma vez que as moléculas CD4 e CD8

atuam simultaneamente com o TCR no reconhecimento do Ag, essas moléculas passam a ser

conhecidas como co-receptores pois passam a ser efetoras.A segregação de resposta da célula

T CD4 e do CD8 a esses diferentes grupos de antígenos é derivada das especificidades do

CD4 e CD8 para diferentes classes de moléculas do CHP. O CD4 se liga a moléculas de CHP

de classe II e é expresso nas células T cujos TCRs reconhecem os complexos de peptídeos e

moléculas de CHP de classe II. A maioria das células T CD4 são restritas à classe II , e

produz citocinas e, assim, funciona para a defesa contra microrganismos extracelulares. Já a

célula T CD8 é restrita à classe I, células citotóxicas (CTLs), que servem para erradicar

infecções por microrganismos intracelulares (ABBAS, 2005). Para ocorrer a expansão clonal

específica de células T é necessário um co-estímulo, que vai promover interação e

reconhecimento do antígeno específico entre as células apresentadoras de antígeno (APC) e as

células T CD4 ou CD8 (JANEWAY, 2002). Quando um microrganismo infecta um

indivíduo, as células APCs especializadas se ligam aos antígenos e os transportam para os

linfonodos, neste trajeto as APCs amadurecem e se tornam eficientes.Nos linfonodos as APCs

apresentam peptídeos derivados de antígenos protéicos, associados à classe II para

reconhecimento por linfócitos T CD4. Essa reação estimula as APCs a expressarem altos

níveis de co-estimuladores, como proteínas B7-1 e B7-2, as quais fornecem o segundo sinal

para a ativação das células T, que secretam citocinas tais como a IL-12 a qual estimula a

diferenciação das células T (NORTON et al., 1992; ALLISON e BEST, 1998). Já a ativação

das células T CD8 é também iniciada pelo reconhecimento de antígenos em APCs

especializadas nos órgãos linfóides periféricos.Assim, as células T CD8 respondem a

microrganismos que podem infectar qualquer célula nucleada. É provável que as células

dendríticas ingiram células infectadas ou células tumorais e processem e apresentem os

antígenos dos microrganismos ou tumores para reconhecimento por linfócitos T CD8, sendo

este processo denominado de apresentação cruzada (ABBAS, 2005). Por isso, a ativação de

células T CD8 parece exigir um co-estímulo mais forte que as células T CD4 e sua expansão

clonal pode ser auxiliada pelas céluals T CD4 interagindo com a mesma molécula APC

(JANEWAY , 2002).

Uma propriedade geral dos linfócitos T e B naive é que eles precisam de dois sinais

extracelulares distintos para iniciar sua proliferação e diferenciação em células efetoras.

Sendo que o primeiro sinal é fornecido pela ligação do antígeno ao receptor antigênico, e é

essencial para garantir a especificidade da resposta imune subseqüente.No caso das células T,

o reconhecimento do complexo peptídeo-CHP pelo receptor de antígeno das células T ( TCR)

gera o primeiro sinal para ativação e proporciona a especificidade para a subseqüente resposta

da célula T ( aos co-receptores CD4 e CD8).Já o segundo sinal é gerado por moléculas

denominadas co-estimulatórias que para os linfóctios T são proteínas denominadas por B7-1

(CD80) e B7-2 (CD86) que são expressas nas APCs.Os co-estimuladores B7 nas APCs são

reconhecidos por meio de receptores específicos nas células T, sendo CD28 e CTLA-4 os

mais estudados (ABBAS, 2005).A ligação de B7 ao CD28 promove sinais para a célula T que

induzem a expressão de proteínas antiapoptóticas e estimulam a produção de fatores de

crescimento e de outras citocinas, promovendo diferenciação e proliferação das células T

(DONADI, 2001; GONCALVES e DONADI, 2004). Além do CD28 ser o principal receptor

para liberar o segundos sinais para a ativação de células T, o CTLA-4 (CD152) é homólogo

ao CD28, mas é expresso nas células T CD4 e T CD8 recentemente ativadas, sendo sua

função inibir a ativação das células T através da inibição dos sinais liberados pelo CD28

(ABBAS, 2005).

O CD25 é constituído pela cadeia alfa do receptor para interleucina 2 humana (IL-2),

sendo uma cadeia simples de glicoproteína com um peso molecular de 55kDa, também

conhecido como subunidade do receptor de IL-2, IL-2R (SUGAMURA, et al., 1995). Depois

da ativação das células T pelo antígeno e na presença de interleucina 1 (IL-1), a IL-2 é

rapidamente sintetizada e secretada. Em resposta a esse estímulo, a sub-população de células

T expressam receptor de IL-2 de alta afinidade, iniciando uma complexa cascata de

sinalização celular (TANAKA et al., 1985). O tratamento com medicamentos moduladores da

resposta imunológica, demonstra que a resposta imune ao câncer oral garante a diminuição do

tamanho tumoral, resultando na regressão da lesão (FEINMESSER et al., 2004). Entretanto,

estudos de resposta imune em câncer oral associado à infecção pelo HPV ainda são escassos.

RESPOSTA IMUNOLÓGICA, HPV E O CÃNCER

Muito do que se sabe sobre a resposta imune associada à infecção pelo HPV tem sido

observado em diversos estudos com lesões cervicais e, pouco se sabe sobre a resposta

imunológica associada ao HPV em lesões de mucosa bucal. Células infectadas pelos tipos de

HPV de alto risco parecem estar modificadas no câncer cervical em relação à resposta

humoral e celular efetuadas pelas citocinas IL-10, IL-2, IL-6 e IL-8, TNF-alfa, TGF-beta,

configurando um dos mecanismos de evasão da resposta imune mediada por células T (KIM,

et al., 1995). Parece que, nos estágios precoces do desenvolvimento do carcinoma

espinocelular oral ocorre uma polarização da expressão de citocinas do padrão Th-1(

Interferon gama), enquanto que nos estágios avançados do tumor, com acentuada capacidade

metastática, a polarização se desvia para o padrão Th-2 ( IL-4 e IL-5) (AGARWAL et al.,

2003). Entretanto, todos esses eventos celulares e humorais da resposta imune ao vírus são

muito pouco estudados na mucosa oral, em especial no câncer da cavidade oral, necessitando

ainda, de uma investigação mais detalhada. Até o momento não foi realizada a avaliação da

expressão de moléculas HLA-G e HLA-E em câncer oral e sua relação com a infecção por

HPV no tecido bucal.

JUSTIFICATIVA

No Brasil, o câncer oral é um grave e crescente problema de saúde pública e, segundo

dados do Ministério da Saúde, ocupa o oitavo lugar entre as neoplasias que acometem o sexo

masculino e o décimo lugar para o sexo feminino. Nesse contexto, o câncer de boca assume

importância, pois, apesar de ser um carcinoma de fácil diagnóstico e tratamento, com lesões

precursoras bem definidas, ainda apresenta grande incidência entre os homens brasileiros.

Enquanto as lesões superficiais ou aquelas com baixo potencial invasivo demonstram um

excelente prognóstico, as lesões carcinomatosas têm prognóstico pior, exigindo tratamento

radical, mutilante, com grave impacto físico e psicológico ao paciente, podendo acarretar o

óbito. O desenvolvimento do carcinoma oral em diferentes sítios anatômicos está associado a

cofatores distintos. No carcinoma de lábio inferior, a participação da radiação solar como

fator de risco está bem estabelecida. Em contrapartida, a etiologia dos carcinomas intrabucais,

principalmente o de língua, é atribuída ao fumo e ao álcool. Entre os fatores de risco

associados ao câncer oral, o papilomavírus humano (HPV) vem sendo considerado como um

dos agentes etiológicos relevantes no desenvolvimento das lesões bucais. Recentemente,

alguns trabalhos demonstraram a ocorrência de HPV de alto risco em 11-80% das lesões pré-

malignas e malignas de mucosa oral, associada ao descontrole funcional das proteínas

supressoras de tumor e de proliferação. Em contrapartida, a maioria dos tipos de HPV de

baixo risco está associada a lesões papilomatosas benignas da mucosa bucal (papilomas,

condiloma acuminado, verruga vulgar), as quais apresentam menor potencial de progressão

maligna. Entretanto, os mecanismos de carcinogênese induzidos pelo HPV na mucosa oral

ainda exigem maiores estudos, em especial no tocante às alterações genéticas e à resposta

imune do hospedeiro. As moléculas de histocompatibilidade clássicas e não clássicas

participam ativamente da resposta imune contra os tumores. A expressão adequada de

moléculas HLA de classe I clássicas (HLA-A,B,C), apresentando peptídeos virais, contribui

para a eliminação das células tumorais por intermédio da ação dos linfócitos T citotóxicos.

Em diversas linhagens tumorais, incluindo os carcinomas de mama, próstata, colo de útero,

pâncreas, esôfago, cólon, pulmão e melanomas, ocorre uma diminuição da expressão de

moléculas HLA de classe I clássicas, permitindo a evasão das células tumorais ao controle dos

linfócitos T citotóxicos. Por outro lado, o organismo ainda pode recrutar as células natural

killer (NK) para eliminar as células tumorais deficientes em moléculas clássicas, deflagrando

a ação das células NK por estimulação dos receptores estimulatórios que, então, eliminam as

células neoplásicas. No entanto, em alguns tumores, particularmente no câncer de colo uterino

(lesão também causada pelo HPV), foi demonstrado um aumento de expressão de moléculas

HLA não clássicas (HLA-E), à medida que o tumor progride das lesões de baixo grau para as

de alto grau, indicando que essas células tumorais também desenvolveram um mecanismo

adicional de escape à ação das células NK. Diversas associações têm sido relatadas entre a

presença de alelos/haplótipos HLA e o risco alterado para desenvolvimento de neoplasias. A

maior ou menor afinidade de alguns antígenos tumorais com moléculas específicas do

complexo HLA, em parte explica a maior ou menor susceptibilidade de pacientes que

compartilham as mesmas alterações genéticas ou os mesmos alelos HLA para o

desenvolvimento de determinada neoplasia. Assim, acredita-se que a afinidade diferencial de

determinada molécula HLA por antígenos específicos das células neoplásicas possa

influenciar a posterior resposta imunitária do organismo no sentido de contenção, eliminação

ou susceptibilidade ao tumor. Existem pouquíssimos estudos acerca da expressão de

moléculas HLA não clássicas nas lesões orais e a expressão de moléculas HLA-G e HLA-E

poderia contribuir para a maior susceptibilidade ou persistência da infecção pelo HPV na

cavidade oral, assim colaborando para a carcinogênese de mucosa bucal.

Por outro lado, pouco se conhece sobre a relação entre a resposta de células T e a

carcinogênese de mucosa oral associada à infecção pelo HPV. Sabe-se que o maior problema

da infecção pelo HPV é a possibilidade de persistência da infecção viral, promovendo a

progressão das lesões cervicais para câncer. A impossibilidade de regressão da lesão, bem

como a remoção do vírus é atribuída à menor eficiência do sistema imunológico do

hospedeiro, impedindo a destruição das células tumorais e/ou infectadas pelo vírus.

Aparentemente, a resposta imune ao HPV é principalmente celular, do tipo Th1, em em

menor proporção o vírus ativa resposta humoral ou do tipo Th2. Assim, a deficiência de

resposta celular parece ser a chave para o entendimento da capacidade de escape do HPV

frente à resposta imunológica complexa do hospedeiro. Dessa forma, ao entender como as

células agem, através da observação da expressão de suas moléculas de superfície, será

possível o entendimento do mecanismo viral associado à carcinogênese humana. Conhecendo

a resposta de células T, poder-se-á contribuir para os futuros estudos de imunoterapia através

da vacina profilática do HPV que possivelmente estará disponível para a população até 2007.

Adicionalmente, a presença do HPV nas lesões de cabeça e pescoço e a verificação de

particularidades da resposta imunológica nos diferentes sítios anatômicos, poderão contribuir

para o planejamento de vacinação para o HPV nesses pacientes.

OBJETIVO

OBJETIVO GERAL

O presente estudo teve por objetivo avaliar a expressão de moléculas associadas à

resposta imunológica do organismo diante das lesões benignas, pré-malignas e malignas de

mucosa bucal associada ou não à infecção pelo HPV.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Verificar a expressão de moléculas HLA-G e HLA-E e receptores CD4, CD25 e CD28 nas

lesões orais em estudo, comparando essa expressão ao diagnóstico histopatológico.

2. Verificar a presença de infecção pelo HPV nas lesões orais em estudo, identificando,

através de reação de polimerização em cadeia, os tipos virais mais freqüentes na mucosa

oral 6/11, 16, 18, 31 e 33.

3. Avaliar a expressão das moléculas de resposta imune nas lesões infectadas pelo HPV e

verificar a eventual desregulação dessa resposta imune promovida pelo vírus.

MATERIAIS E MÉTODOS

1. CASUÍSTICA

No presente estudo foram avaliados 79 pacientes, que concordaram em participar

(Comitê de Ética HCFMRP processo nº10108/2004), e cujas biópsias de mucosa bucal foram

fixadas em formol tamponado e incluídas em parafina, retiradas dos arquivos do

Departamento de Patologia, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (USP). As biópsias

foram selecionadas pelo diagnóstico histopatológico dos cortes corados pela

hematoxilina/eosina e classificadas de acordo com critérios histopatológicos propostos por

VAN DER WAAL et al. (2000), como hiperplasia fibrosa inflamatória, papiloma de células

escamosas, líquen plano, leucoplasias sem e com displasia e carcinoma espinocelular. As

lesões foram separadas em três grupos: lesões benignas (hiperplasia fibrosa inflamatória,

papiloma de células escamosas), lesões pré-malignas (líquen plano e leucoplasias com e sem

displasia) e lesões malignas (carcinoma espinocelular) Para as reações de imunohistoquímica,

cortes histológicos de 4µm foram colocados em lâminas previamente silanizadas com

organosilano 4 % em acetona (3-aminopropril trietoxisilano – SIGMA, St. Louis, USA).

Cortes de 15µm foram colocados em eppendorf estéril e submetidos aos procedimentos de

extração e amplificação por PCR para a detecção e tipagem do HPV.

2. METODOLOGIAS

2.1. Imunohistoquímica (CD4,CD25, CD28, HLA-G e HLA-E)

As lâminas foram submetidas a banhos consecutivos em baterias de xilol e álcool

(Synth–Diadema, SP) para a completa desparafinização. A atividade da peroxidase endógena

foi bloqueada tratando as lâminas com 2 banhos consecutivos de peróxido de hidrogênio 3%

em metanol (v/v), por 15 minutos, à temperatura ambiente. A seguir, para a recuperação

antigênica, os cortes foram submetidos à fervura em panela à vapor steam-cuisine (T-FAL,

Industria de Aparelhos Médicos LTDA) imersos em solução de citrato 10mM/pH6,0 (Synth -

Diadema, SP), durante 40 minutos, a 95°C. Após o resfriamento, as lâminas foram lavadas 3

vezes em PBS, por 5 minutos cada lavagem. A seguir, para o bloqueio de reações

inespecíficas, as lâminas foram lavadas em PBS por três vezes, 5 minutos cada, e incubadas

com leite desnatado 1% por 40 minutos. A diluição dos anticorpos foi estabelecida através de

avaliação da positividade em lâmina sabidamente positiva com diferentes concentrações para

determinação de melhor título dos anticorpos anti-CD25, anti-CD28, anti- HLA-G e anti-

HLA-E. Deste modo, as lâminas foram, novamente, lavadas em PBS e foram adicionados

sobre os cortes os anticorpos primários monoclonais anti-CD25 (Santa Cruz, Newcastle, UK),

anti-CD28 (Santa Cruz), anti-HLA-G e HLA-E (gentilmente cedido pelo Dr Edgardo D.

Carosella, Instituto Universitário de Hematologia e Imunologia, Hospital Saint-Louis, Paris,

França) As lâminas foram incubadas a temperatura ambiente, overnight em câmara úmida.

Decorrido o período de incubação, as lâminas foram submetidas à lavagem com PBS e

incubadas com o anticorpo secundário, biotonilado anti-cabra, coelho e camundongo,

produzido em porco (LSAB, DAKO) em câmara úmida por 30 minutos à temperatura

ambiente. A seguir, as lâminas foram novamente lavadas 3 vezes em PBS, por 5 minutos cada

lavagem, e incubadas com complexo Streptavidina- Biotina -Peroxidase (LSAB, DAKO,

Glostrup, Dinamarca), em câmara úmida por 30 minutos, à temperatura ambiente. Em

seguida, os cortes foram lavados em PBS, e a reação revelada com incubação dos cortes em

solução de diaminobenzidina e peróxido de hidrogênio à temperatura ambiente, por cinco

minutos. Após a incubação, as lâminas foram lavadas em água corrente, contra coradas com

hematoxilina de Carrazi por 60 segundos, lavadas novamente em água corrente, desidratadas

em baterias de álcool e xilol e montadas em Permount (Fisher Scientific, CA, USA).

2.1.1. Controles

Para controle positivo do marcador CD4, CD25 e CD28 foram utilizados cortes

histológicos de Tonsila Humana e para HLA-G e HLA-E, cortes histológicos de trofoblasto

Humano. O controle negativo para todos os marcadores foi constituído dos mesmos cortes

histológicos utilizados no controle positivo, subtraindo-se a etapa de incubação com o

anticorpo primário.

2.1.2. Análise quantitativa da expressão imunohistoquímica (HLA-G, HLA-E, CD4,

CD25, CD28)

As lâminas apresentando marcação positiva de HLA-G, HLA-E (membrana

citoplasmática das células epiteliais) e a marcação positiva de CD4, CD25 e CD28 no

infiltrato linfocítico das lesões orais foram submetidas à captura de imagens e a posterior

avaliação quantitativa da expressão de todos os marcadores foi realizada através de um

sistema de análise de imagem. O equipamento para análise de imagem é constituído de um

microscópio (OLYMPUS BX50) acoplado a uma câmera colorida (OLYMPUS DP10) e a um

computador, contendo o software (Image Pro Plus, versão 4.1 - Media Cybernetics), do

Departamento de Fisiologia e Patologia, da Faculdade de Odontologia de Araraquara

(UNESP). A média de 8 a 10 campos com células marcadas foi selecionada de cada lâmina

para a análise quantitativa dos diferentes marcadores. As células positivas foram quantificadas

em 1000 células/biópsia, estabelecendo a porcentagem de expressão imunohistoquímica para

todos os marcadores selecionados para o presente estudo.

2.1.3. Interpretação da Imunorreatividade (HLA-G, HLA-E, CD4, CD25, CD28)

Para a expressão quantitativa de HLA-G e HLA-E as lesões foram consideradas

negativas quando ≤ 25% células neoplásicas possuíam marcação castanha em membrana

citoplasmática. Em contrapartida, foram consideradas positivas as lesões orais que

apresentaram índice de positividade entre 25 a 75% e alta expressão com valores acima de

75%, segundo proposto por PALMISANO et al., 2002. Foram considerados aumento de

expressão de HLA-G e HLA-E a presença de > 25% a 100% de células neoplásicas com

marcação castanha na membrana citoplasmática. A partir da quantificação, as lesões orais

foram analisadas segundo a marcação de HLA-G e HLA-E em quatro grupos: expressão

aumentada de ambas as moléculas (G+/E+), marcação aumentada em uma molécula e

diminuída na outra (G+/E- ou G-/E+) e marcação diminuída em ambas as moléculas (G-/E).

Assim, os resultados de expressão dessas moléculas foram comparadas com o grupo de lesões

orais segundo o diagnóstico histológico, bem como em relação à presença do HPV.

Para a expressão quantitativa de CD4, CD25 e CD28, as células presentes no infiltrato

linfocítico presente no estroma das lesões orais foram consideradas negativas na ausência de

imunocoloração até ≤ 15% de células marcadas. A expressão desses receptores foi

considerada positiva na presença de > 15 a 100% de células do infiltrado marcadas

(LADANYI et al., 2004). Após a quantificação, a expressão dos receptores foi subdividida em

quatro grupos, de acordo com a diminuição da expressão dessas moléculas: quando os três

receptores tinham ausência ou expressão ≤ 15% (CD4/25/28), quando 2 receptores

apresentavam ausência ou expressão ≤ 15% (CD4/25, CD4/28, CD25/C28).

2.2. Detecção e tipagem do HPV

2.2.1. Extração de DNA genômico de tecido parafinizado

Para a extração do DNA de tecido parafinizado foram utilizados dois cortes

histológicos com espessura de 10 µm e, a extração foi realizada segundo proposto por

BETTINI et al., (2003) e modificado neste estudo. Os cortes histológicos foram transferidos

para eppendorf estéril, e foi adicionado 1000µL de xilol absoluto em cada tubo. O tecido

parafinizado contendo xilol foi homogeneizado por inversão e incubado em Banho Maria a

65ºC, por 10 min, seguido de centrifugação 4000 g, 4°C por 2 min. O sobrenadante é

descartado e esse procedimento foi repetido por 4 a 5 vezes para retirada completa da

parafina. Na última centrifugação, o sobrenadante foi removido, adicionando 700µl de xilol

absoluto e 300µl de etanol absoluto, e em seguida a amostra foi homogeneizada, centrifugado

a 4000 g, 4°C por 2 min e novamente o sobrenadante foi descartado. Em seguida, foi

adicionado ao sedimento, 500µl de xilol e 500µl de etanol absoluto, seguido de centrifugação

e descarte do sobrenadante. Novamente, foi adicionado 300µl de xilol e 700µl de etanol

absoluto. Na seqüência, 1000µl de etanol absoluto foi acrescido ao sedimento, centrifugando

e novamente descartando o sobrenadante. No sedimento obtido foi adicionado 1000µl de

tampão de lise Tris-HCL 10Mm, pH 8,5 (2,5mM MgCl2, 50mM KCl, Nonidet P-40 1% e

Tween1%). Em seguida os tubos foram homogeneizados, centrifugados a 4000 g, por 2 min e

o sobrenadante descartado. Novamente, o sedimento obtido foi ressuspendido com 1000µl de

tampão de lise Tris-HCl 10mM (pH 8,5) e 10µl de proteinase K (10mg/ml) e incubado em

Banho Maria a 65ºC por 2h. Após o período de incubação, os tubos foram submetidos à

temperatura de 94ºC por 10 min, objetivando a inativação da proteinase K. O DNA extraído

foi acondicionado a –20°C até o momento dos experimentos de amplificação para a detecção

do HPV.

2.2.2. Amplificação do HPV (região consenso) e de Beta-globina

Após a extração, o DNA obtido dos tecidos parafinados foi submetido à amplificação

pela reação da polimerase em cadeia (PCR) para verificar a presença de DNA (gene da Beta-

globina) nas amostras e para detectar e tipificar o HPV (GP5+/6+ e HPV tipo específico).

Considerando que os DNA extraídos de tecidos fixados e incluídos em parafina apresentam-se

fragmentados, a estratégia de amplificação deve considerar a utilização de iniciadores para

fragmentos de DNA com no máximo 200 pares de bases (pb). Todas as reações foram

realizadas no termociclador Biocycler.

A amplificação do gene da Beta-globina (β-globina) foi utilizada para avaliar a

integridade do DNA genômico pós-extração, e como um controle interno da amplificação. Os

iniciadores aqui utilizados PCO3 e PCO4 (PCO3+ CTT CTG ACA CAA CTG TGT TCA

CTA GC e PCO4+ TCA CCA CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC) amplificam um

fragmento de 100 pares de bases (pb). A reação de PCR foi realizada sob as seguintes

condições: 0,20mM de dNTP, 0,1uM de cada iniciador, 1.25U/uL Taq DNA polimerase

(Invitrogen), tampão de PCR 1X (Invitrogen), 2µg de DNA genômico, e água destilada

deionizada para um volume final de 25 µL. Os ciclos da reação foram estabelecidos segundo

MORALES et al,(1993) e modificados posteriormente nas etapas de padronização A mistura

de reaçao foi amplificada pelo programa de 1 ciclo de 94ºC por 7 min, 35 ciclos de 94°C por

1min, 55°C por 1min e 72°C por 1 min e 1 ciclo de 72ºC por 10 min.

Para detectar a presença do DNA do HPV nas amostras analisadas, foram utilizados os

iniciadores GP5+ e GP6+(MANOS et al., 1989) que amplificam um fragmento de 142 pb da

região L1 comum a todos os tipos de HPV. A reação de PCR foi realizada segundo o

protocolo modificado de BETTINI et al., (2003), utilizando-se 0,20mM de dNTP, 0,60uM de

cada iniciador, 1,25U/uL Taq DNA polimerase (Invitrogen), tampão de PCR 1,4 x

(Invitrogen), 2µg de DNA genômico e água deionizada para um volume final de 25 µL. O

DNA das amostras foi amplificado em termociclador de acordo com as seguintes condições: 1

ciclo de 95ºC por 5 min, 37 ciclos de 94°C por 30s, 45°C por 45 s e 72°C por 1 min e

finalmente 1 ciclo de 72°C por 10 min. Como a quantidade de DNA viral presente na amostra

é pouca em relação ao DNA humano e a qualidade do DNA extraído de fragmentos

parafinizados com xilol e álcool é baixa, foram necessáris 2 reações de PCR (nested PCR) sob

as mesmas condições da primeira para permitir a visualização dos produtos amplificados nos

géis de poliacrilamida 10%. A segunda PCR foi realizada sob as mesmas condições de

primeira, substituindo-se o DNA genômico por 1µL de DNA amplificado na primeira reação.

A tipagem dos HPVs 6, 11, 16, 18, 31 e 33 foi realizada em todas as amostras

positivas para GP5+/GP5+, segundo protocolo descrito e modificado por Walboomers et al.,

(1999). Para os procedimentos de amplificação e identificação dos tipos de HPV um volume

final de reação de 25 µl foi utilizado, numa mistura da reação que incluía 20 ng de DNA

genômico, 0,020 mM de deoxinucleosideo trifosfato (Pharmacia, Uppsala, Sweden), 0.6 µM

de primer (IDT, IA, USA), 1,25 U Taq polimerase, 3 mM MgCl2, and 1x buffer (Invitrogen,

Brasil). As condições dos ciclos de amplificação foram: desnaturação de 94°C por 5 min,

seguida por 35 ciclos de 94°C por1 min, 55°C por 1min, and 72°C por1 min e a extensão por

1 ciclo de 72 °C por 10 min.Para a amplificação do HPV11 a temperatura de anelamento

utilizada foi de 60°C.A observação de todos os produtos amplificados foi feita em gel de

poliacrilamida 10%, submetido à eletroforese a 250 volts por 1 hora e 30 minutos e corado

com nitrato de prata (SANGUINETI, 1994).

3. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Considerando que os dados apresentaram distribuição Gaussiana no teste de

normalidade, a análise estatística da expressão imunohistoquímica quantitativa de HLA-G e

HLA-E em relação ao diagnóstico histopatológico e à infecção viral foi realizada através do

teste paramétrico de análise de variância (One Way ANOVA) com pós-teste de comparação

múltipla de Bonferroni para avaliação de significância entre o grupo. Análise de correlação

entre a expressão quantitativa de HLA-G e HLA-E em lesões infectadas por HPV foi

realizada pelo teste de correlação linear de Pearson. Para a avaliação da associação entre

HLA-G e HLA-E, segundo a maior ou menor expressão imunohistoquímica, em relação ao

diagnóstico histológico das lesões e à infecção pelo HPV foram utilizados, respectivamente, o

qui quadrado para testes independentes e o teste exato de Fisher. Os dados de expressão de

CD4, CD25 e CD28 não passaram no teste de normalidade e, portanto, foi utilizado o teste

não paramétrico de Kruskall Wallis com pós-teste de Dunnet para múltiplas comparações

entre a expressão quantitativa desses receptores em relação ao diagnóstico das lesões orais

bem como a análise de correlação da expressão qualitativa das moléculas CD25 e CD28 em

relação ao diagnóstico histológico das lesões orais e à infecção pelo HPV. Teste exato de

Fisher foi aplicado na comparação entre a expressão de CD25 e CD28 e o diagnóstico

histológico e a presença de HPV. Os valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente

significantes. Os dados estatísticos foram avaliados pelo software Instat Mac 2.01 (GraphPad

software, San Diego, CA, USA).

RESULTADOS

1- EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE MOLÉCULAS NÃO CLÁSSICAS

HLA-G E HLA-E EM LESÕES DE MUCOSA ORAL SSOCIADAS A INFECÇÃO

PELO HPV

Os resultados da avaliação da expressão imunohistoquímica quantitativa de HLA-G e

HLA-E em relação ao diagnóstico histológico e a infecção pelo HPV estão demonstrados nas

Tabelas 1 e 2 e Figuras 1 a 3. Na Tabela 1 está demonstrada a detecção do HPV e o

diagnóstico histológico das lesões de cavidade oral dos 51 pacientes. Das 51 lesões orais 24

(47%) foram infectadas pelo HPV, dessas 11 (47%) faziam parte do grupo das 18 lesões

benignas, 8 (47%) foram das 16 lesões pré malignas e 5 (28%) foram das 17 lesões de

carcinoma de células escamosas (OSCC). No grupo das lesões benignas infectadas pelo HPV,

8 (44%) foram diagnosticadas como Hiperplasia oral, sendo que 5 (42%) estavam infectadas

com HPV18, 1 (8%) estava infectada com HPV11 e 1 (8%) estava infectada com um tipo não

identificado (NI) pelos primers propostos neste estudo. Assim, das 18 lesões benignas

infectadas pelo HPV, 3 (17%) foram Papiloma escamoso oral, sendo que 2 (11%) estavam

infectadas pelos tipos HPV18/31/6 e 1 (6%) por um tipo NI pelos primers propostos neste

estudo. No grupo das lesões pré malignas infectadas pelo HPV, 4 (25%) das 16 pré malignas

eram Líquen plano, sendo que 1 (6%) estava infectada pelo HPV18, 1 (6%) estava infectada

pelos tipos de HPV 18/6/11 e 1 (6%) por um tipo NI pelos primers propostos neste estudo.

Ainda no grupo das lesões pré malignas 4 (25%) foi diagnosticada como Leucoplasia com

displasia severa, sendo 2 (13%) infectadas pelo HPV18 e 2 (13%) infectadas por um tipo NI

pelos primers propostos neste estudo. Finalmente, dos Carcinomas de células escamosas

(OSCC) infectados pelo HPV, 2 (12%) dos 17 diagnosticados como OSCC foram HPV18, 1

(6%) foi HPV18/31/6 e 1 (6%) foi do tipo NI pelos primers propostos neste estudo. Não foi

encontrado nenhum HPV16 em todas as lesões avaliadas neste estudo.

Na Tabela 2 e Figura 1 a 3 está demonstrada a expressão imunohistoquímica

quantitativa comparadas com os grupos das lesões orais. A expressão de HLA-G e HLA-E foi

classificada como alta expressão de ambas as moléculas (G+/E+), alta e baixa expressão

(G+/E-) ou (G-/E+) e baixa expressão de HLA-G e HLA-E (G-/E-). A Tabela 2 demonstra a

desregulação de HLA-G e HLA-E (G+/E+, G+/E-, G-/E+), sendo verificado em lesões

benignas e pré malignas, enquanto nas lesões malignas (OSCC) não foi encontrada expressão.

( Tabela 2, P = 0,007).A associação foi encontrada entre as lesões infectadas pelo HPV e a

desregulação de HLA-G e HLA-E ( P = 0,0025). A desregulação das moléculas não clássicas

foi verificada com maior freqüência nas lesões orais infectadas pelo HPV18 e nas lesões

infectadas com dois ou três tipos de HPV. A análise quantitativa da expressão de HLA-G e

HLA-E (Figura 1), demonstra que a alta expressão de HLA-G foi predominante nas lesões

benignas e decrescentes nas lesões orais pré malignas e malignas (P=0,0196). Em contraste,

não foi observado diferença significante entre as lesões orais benignas, pré malignas e

malignas e a expressão do HLA-E. Interessantemente, houve uma correlação inversa (Figura

2; r = - 0,3944; P = 0,0462) observada entre a alta expressão de HLA-G e a baixa expressão

de HLA-E nas lesões infectadas pelo HPV, o que poderia indicar que a desregulação de HLA-

G e HLA-E pode estar mais relacionada com a infecção pelo HPV do que com a atipia celular

e o câncer.

Tabela 1 – Expressão das moléculas não clássicas e detecção do DNA HPV em 51 pacientes

com lesões orais de acordo com diagnóstico histopatológico de lesões benignas (Hiperplasia e

papiloma) pré malignas (líquen plano, leucoplasia com e sem displasia) e malignas (OSCC).

HPV Positivo HPV Negativo HPV11 HPV18 HPV18/31/6 HPV18/6 NI

n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) N (%) n (%)

Benigna (n=18) 11(58) 7 (37) 1 (5) 5 (26) 2 (11) 0 3 (16)

Pre maligna (n=16) 8 (47) 8 (47) 0 4 (24) 0 1 (6) 3 (18)

Maligna (n=17) 5 (28) 12 (67) 0 2 (11) 2 (11) 0 1 (6)

Total 24(47) 27 (53) 1 (4) 11 (46) 4 (17) 1 (4) 7 (29)

NI = HVP não identificado; OSCC = carcinoma célula escamosa.

Tabela 2 - Expressão imunohistoquímica quantitativa das moléculas HLA-G and HLA-E de 51

pacientes com lesões orais de acordo com diagnóstico histopatológico de lesoes

benignas(Hiperplasia e papiloma), pre malignas (liquen plano, leucoplasia com e sem displasia) e

malignas (OSCC).

G(+)/E(+) G(-)/E(-) G(+)/ E(-) G(-)/E(+) Total

n (%) n (%) n (%) n (%) n

Benigna

(

4 (21) 2 (11) 10 (53) 2 (11) 18

Pre maligna 1 (12) 1 (6) 8 (47) 6 (35) 16

Maligna 3 (17) 8 (44) 4 (22) 2 (11) 17

Total n(%) 8 (16) 11 (22) 22 (43%) 10 (20) 51

HPV Positivo

(

5(21) 0 14(58) 5(21) 24

HPV Negativo 3(11) 11(41) 8(30) 5(19) 27

HPV 11 0 0 1(100) 0 1

HPV18 4(36) 0 4(36) 3 (36) 11

HPV18/31/6 0 0 4(100) 0 4

HPV18/6 0 0 1 (100) 0 1

NI 1(14) 0 5 (71) 1(14) 7

HLA-G(+) and HLA-E(+) = ≥ 25% células marcadas, HLA-G (-) e HLA-E(-) = <25% de

células marcadas.

OSCC = carcinoma espino celular.

(a)

HLA- G e HLA-E expressão versus lesões orais. Qui quadrado, P = 0.007.

(b)

HLA- G and HLA-E expressão versus infecção. Fisher’s Exact Test, P = 0.0025.

Figura 1: Expressão quantitativa de moléculas não clássicas (HLA-G e HLA-E) nas 51 lesões

orais classificadas como benignas (hiperplasia e papiloma), pré malignas (líquen plano e

leucoplasia) e malignas (carcinoma espinocelular). A) Expressão quantitativa de HLA-G,

ANOVA (P=0.0196) com pós teste de comparação múltipla de Bonferroni(*) nas lesões

benignas verso malignas; p<0.05. B) Expressão quantitativa de HLA-E, ANOVA (P =

0.9024).

Figura 2 – Correlação de Pearson entre a expressão quantitativa de HLA-G e HLA-E

em lesões orais infectas pelo Papilomavírus Humano. r = - 0.3944; P = 0.0462.

0 20 40 60 80 100

100

HLA-G (%)

HLA-E (%)

r = - 0.3944; p=0.046

Figura 3- Reação de imunoperoxidase para HLA-G e HLA-E com marcação castanha

no citoplasma (setas) em lesões de cavidade oral infectadas por HPV. A) Expressão de HLA-

G em Hiperplasia Fibrosa apresentando intensa marcação citoplasmática; B) Expressão de

HLA-G em leucoplasia sem displasia com marcação citoplasmática de moderada intensidade;

C) Expressão de HLA-G em Carcinoma espinocelular com intensa marcação citoplasmática;

D) Expressão de HLA-E em Hiperplasia Fibrosa apresentando marcação citoplasmática

discreta; E) Expressão de HLA-E em leucoplasia sem displasia com marcação citoplasmática

de intensidade discreta; F) Expressão de HLA-E em Carcinoma espinocelular com marcação

discreta. Barra de escala = 25µm.

2- EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DOS RECEPTORES CD4, CD25 E CD28

EM LESÕES DE MUCOSA ORAL INFECTADDAS PELO HPV

Considerando todas as lesões orais analisadas, foi detectado DNA de HPV em 30 das 79

(38%) pesquisadas, sendo 12 das 31 (40%) foram lesões benignas, 13 das 25 (43%) eram pré

malignas e 5 das 23 (17%) eram carcinomas de células escamosas (OSCC). De todas as lesões

benignas infectadas com HPV, 8 (67%) foram diagnosticadas como Hiperplasia oral, sendo

que 5 (42%) foram HPV18, 1 (8%) foi HPV11 e 2 (17%) do tipo de HPV não identificado

pelos primers utilizados neste estudo.Ainda nas lesões benignas, 4 de 12 (33%) foram

Papiloma escamoso oral, das quais 2 (17%) tiveram infecção tripla por HPV ( HPV18/31/6) e

2 (17%) apresentaram o tipo de HPV não identificado pelos primers utilizados neste estudo.

Nas lesões pré malignas infectadas pelo HPV, 3 das 13 (23%) foram Líquen Plano, sendo

HPV18, HPV18/31/6 e 1 tipo não foi identificado pelos primers deste estudo respectivamente.

Nas lesões pré malignas, 2 (15%) foram Leucoplasia sem displasia e 7 (54%) foram

Leucoplasia com displasia discreta a severa. Nas Leucoplasias sem displasias foram

encontrados os tipos de HPV18, HPV18/31/6 e HPV31/6 sendo um caso de cada tipo. Em

contraste, nas Leucoplasias com displasia 1 (8%) foi HPV18 e 2 (15%) foi HPV18/31/6 e 4

casos (31%) de HPV não identificado. Finalmente, os OSCC infectados com HPV, 2 de 5

(40%) foi HPV18, 1 (20%) foi HPV31/6, 1(20%) foi HPV18/31/6 e 1(20%) foi de HPV não

identificado. O HPV 16 não foi encontrado nas lesões avaliadas neste estudo (Tabela 1).

Embora, um pequeno número de macrófagos e células dendríticas foi marcado pelos

receptores CD4 e CD25, sendo que a maioria das células marcadas por estes receptores foram

os linfócitos (Figura 2). A comparação da expressão quantitativa de CD4, CD25 e CD28 nas

lesões orais foi representada de acordo com a expressão nas três moléculas, na combinação de

2 moléculas e pela análise de apenas uma molécula, demonstrada na Tabela 2 e Figura 1.

Outra vez, nas lesões orais que exibiu baixa ou ausência de expressão imunohistoquímica

destas moléculas (<15% de células marcadas). Considerando a expressão das três moléculas

nos mesmos pacientes, obteve-se ausência ou baixa expressão nas lesões benignas, pré

malignas e malignas tanto quanto o aumento da progressão da lesão e da coexpressão destas

moléculas. Quando foi considerado a combinação de CD4/CD25 e CD4/CD28 a ausencia ou

baixa a expressão destas moléculas nas lesões benignas e pré malignas estava

aumentada(Tabela 2). Quando a expressão destas moléculas foi considerada individualmente,

a expressão de CD4 diminuida foi significante em pacientes que apresentavam lesões

malignas quando comparados com pacientes com lesões benignas e pré malignas (p<0.005).

A expressão de CD25 foi similar em todas as lesões. A expressão de CD28 foi significante em

lesões malignas quando comparadas com lesões benignas e pré malignas (p<0.001). (Figura

1). Quando a expressão das moléculas CD4, CD25 e CD28 em várias combinações foram

associadas com a presença ou não da infecção pelo HPV não foi observada diferença

estatística significante (Tabela 3).Contudo, pacientes infectados pelo HPV18 não exibiram

diferença estatística significante na diminuição da expressão destas moléculas relacionadas

com pacientes com outros tipos de HPV.

Tabela 1 – Detecção de DNA de HPV observado em 79 lesões de acordo com diagnóstico

histológico em benignas (hiperplasia e papiloma), pré-malignas (liquen plano, leucoplasia

com ou sem displasia) e malignas (carcinoma espino celular).

HPV

Positivo

HPV

Negativo

HPV18

HPV18/31/6

HPV31/6

HPV6/11

NI Total

N (%) n (%) n (%)

n (%) n (%) n (%) n(%)

N(%)

Benigna (n=31) 12 (40) 19 (39) 5 (17) 2 (7) 0 2 (3) 3(10)

12 (40)

Premaligna(n=25)

13 (43) 12 (24) 3 (10) 4 (13) 1 (3) 0 5(17)

13 (43)

Maligna (n=23) 5 (17) 18 (37) 2 (6) 1 (3) 1 (3) 0 1(3) 5 (17)

Total (n=79) 30 (38) 49 (62) 10 (33)

7 (23) 2 (6) 2 (6) 9(30)

79(100)

NI = tipo de HPV não identificado

Tabela 2 – Ausência ou baixa espresssão imunohistoquímica ( índice de positividade=<15%)

de moléculas CD4, CD25 and CD28 observadas em 79 lesões orais, classificadas de acordo

com o diagnóstico histopatológico em benignas(hiperplasia e papiloma), pré-malignas (líquen

plano, leucoplasia com e sem displasia) e malignas (carcinoma espinocelular).

CD4/25/28 CD4/CD25 CD4/CD28 CD25/CD28

n (%) n (%) n (%) n (%)

Benigna (n=31)

18 (58) 4 (13) 3 (10) 3 (10)

Pre maligna (n=25)

12 (48) 3 (12) 1 (4) 4 (16)

Maligna (n=23)

7 (30) 12 (52) 1 (4) 2 (9)

Total (n=79)

37 (47) 19 (24) 4 (5) 9 (11)

Qui-Quadrado por inpedância, P=0.0347

NI = tipo de HPV não identificado

Tabela 3 – Ausência e baixa expressão imunohistoquímica ( índice de positividade=

<15%) das moléculas CD4, CD25 and CD28 molecules observadas em 79 lesões orais

classificadas de acordo com as lesões orais com a presença ou não de algum tipo de HPV.

CD4/25/28 CD4/CD25 CD4/CD28 CD25/CD28

Total

n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)

HPV positivo (n=30)

13 (43) 4 (13) 2 (7) 4 (13) 23 (77)

HPV negativo (n=49)

12 (24) 4 (8) 1 (2) 3 (6) 20 (41)

HPV 18 (n=8)

3 1 1 2 7 (88)

HPV 18/31/33 (n=5)

3 0 0 0 3 (60)

HPV 31/6 (n=2)

1 1 0 0 2 (100)

HPV 6 (n=1)

1 0 0 0 1 (100)

NI (n=10)

6 2 0 2 9 (90)

Qui-Quadrado por inpedância, P<0.0001

NI = tipo de HPV não identificado

Figura 1- Expressão imunohistoquímica quantitativa de CD4,CD25 e CD28 através do

sistema de análise de imagem observada nas 79 lesões orais classificadas de acordo com o

diagnóstico histológico em lesões benignas (n=31) (hiperplasia e papiloma), pré-malignas

(n=25) (líquen plano, leucoplasia com e sem displasia) e malignas (n=23) (carcinoma

espinocelular). * P<0.005; Pós teste de Dunn’s comparação entre lesões benignas e malignas,

p<0.001.

Benign

Premalignant

Malignant

CD28 (%)

Benign

Premalignant

Malignant

CD25 (%)

Benign

Premalignant

Malignant

CD4 (%)

Figura 2 – Reação de imunoperoxidase para CD25 e CD28 no infiltrado inflamatório

de lesões de cavidade oral infectadas por HPV com marcação castanha nas células

inflamatórias (setas). A) Expressão de CD25 em Hiperplasia Fibrosa com intensidade

moderada; B) Expressão de CD25 em Leucoplasia sem displasia com intensidade discreta, C)

Expressão de CD25 em Carcinoma espinocelular com intensa marcação; D) Expressão de

CD28 em Hiperplasia Fibrosa com intensidade discreta; E) Expressão de CD28 em

Leucoplasia sem displasia com intensidade moderada; F) Expressão de CD28 em Carcinoma

espinocelular com intensa marcação. Barra de escala = 25µm.

Figure3 - Expressão imunohistoquímica de moléculas CD4 no infiltrado linfocitário de

lesões infectadas por DNA HPV, de acordo com o diagnóstico histológico. A)Hiperplasia oral

(Moderada) B) Leucoplasia com displasia (Intensa) e C) Carcinoma espinocelular

(Moderado). Barra de escala = 25 µm.

DISCUSSÃO

Os tipos de HPV de alto risco são agora reconhecidos como um potencial fator de

risco para a carcinogênese oral (HA e CALIFANO, 2004). No presente estudo, a infecção

pelo HPV foi encontrada em 38% das lesões de mucosa oral. A presença do DNA do HPV é

encontrada em proporções muito variadas em diversos estudos, com freqüência média de 20 a

30% (D’COSTA et al., 1998; MIGUEL et al., 1998, SOARES et al., 2003). Estudos

anteriormente realizados em nosso laboratório demonstraram a presença de HPV em lesões

benignas e malignas de mucosa oral com positividade variando de 33 até 60% (SOARES et

al., 2000; SOARES et al., 2002; FREGONESI et al., 2003; SOARES et al., 2003). A presença

do vírus na mucosa oral pode contribuir para a carcinogênese por fatores combinados. A

somatória de eventos como infecção pelo HPV, deficiências imunológicas e co-carcinógenos

químicos ou físicos favorecem o desenvolvimento do câncer oral (LLEWELLYN et al., 2001;

MILLER e JOHNSTONE, 2001). A associação entre câncer e infecção pelo HPV no epitélio

do trato genital masculino e feminino já é bem conhecida. Entretanto, o estudo do papel do

HPV em mucosa oral, relacionado com proliferações benignas ou malignas é um tema que

merece ser mais investigado. A possível relação do HPV na etiologia do câncer oral foi

primeiramente relatada por SYRJANEN (1993). Muitos trabalhos desde então se seguiram e

essa hipótese vem se tornando cada vez mais consistente (MUNGER e PHELPS, 1993;

MCGLENNEN, 2000; SAND et al., 2000; SCULLY et al., 2000). Nesse estudo foi

observada alta freqüência dos tipos de HPV de alto risco em lesões benignas e pré-malignas e,

embora prévios estudos tenham associado esses tipos de HPV ao câncer oral (SAND et al.,

2000; FREGONESI et al., 2003), foi pequena a frequência do DNA do HPV nos casos de

câncer oral (17%). Os mesmos tipos virais, e mais proeminentemente o HPV 18, têm sido

encontrados em câncer de laringe, orofaringe e língua (DE VILLIERS, 1997). No total, 16

tipos de HPV (1, 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 31, 32, 33, 35, 57) já foram isolados de

lesões orais (CHANG, et al., 1993; MILLER, 1994). A maioria dos tipos HPVs de baixo risco

(6, 11, 13 e 32) estão associados a lesões papilomatosas benignas da mucosa oral (papilomas,

condiloma acuminado, verruga vulgar) e apresentam pequeno potencial de progressão

maligna. Em contraste, os genótipos de alto risco (16, 18, 31, 33, 35) têm potencial de

malignidade aumentado e estão freqüentemente associados às displasias epiteliais e carcinoma

de células escamosas orais (LAKSHMI et al., 1993; SAND et al., 2000). Dessa forma, os

tipos de HPVs que eram considerados exclusivos do trato anogenital estão sendo encontrados

nos tecidos de revestimento bucal, o que torna este vírus um importante agente etiológico no

desenvolvimento do câncer (CHANG, SYRJANEN et al., 1993; MIGUEL et al., 1998). Nas

lesões orais benignas avaliadas no presente estudo, foi observada uma alta prevalência de

tipos de HPV oncogênicos, sugerindo que a infecção pelo HPV ocorra em estágios precoces

de desenvolvimento das lesões proliferativas de cavidade oral (PAPAROTTO LOPES e

MEEKS 2001, HABERLAND-CARRODEGUAS et al., 2003). Assim, a detecção precoce do

HPV nessas lesões é altamente recomendada e pode oferecer novas direções para a terapia e

prevenção do câncer oral (MOLIJN et al., 2004).

Entre as lesões infectadas, foi observada uma maior prevalência de HPV18 e,

surpreendente ausência de HPV16. Recente estudo, avaliando 60 artigos elegidos da

literatura, encontrou maior prevalência de HPV16 e em segundo lugar de HPV18 (KREIMER

et al., 2005). A alta prevalência de HPV18 encontrada em nosso estudo poderia significar uma

particularidade geográfica de distribuição observada no interior de São Paulo, demonstrada

em estudo anterior, cujas lesões cervicais também apresentaram maior prevalência de HPV18

(GUIMARÃES et al., 2005).

De maneira intrigante, algumas lesões orais apresentaram infecção por múltiplos tipos

de vírus e isso ocorreu especialmente nas lesões pré-malignas e no câncer oral. Não há

dúvida de que certas leucoplasias evoluem para o carcinoma espinocelular (REGEZI e

SCIUBA, 2000). A freqüência de transformação maligna da leucoplasia oral varia entre 0 e

20% e aproximadamente 5% de todas as leucoplasias se transformarão em câncer em um

período médio de 5 anos (SCHEPMAN, 1998) . Com base em estudos de taxa de

transformação maligna, os pacientes com leucoplasia possuem um risco cinco vezes maior de

desenvolver câncer oral do que pacientes sem este tipo de lesão (VAN DER WAAL, 1997).

Considerando estudos prévios, o presente estudo resolveu avaliar os tipos de HPV mais

prevalentes na mucosa oral e portanto foram utilizados primers para a identificação dos tipos

de HPV6, 11, 16, 18, 31 e 33. Não foi possível identificar 9(30%) lesões orais que

apresentaram-se positivas utilizando primer GP5+/6+. Entretanto, outros tipos de HPV menos

comuns (JIMENEZ et al., 2001) deverão ser avaliados para melhor entendimento da

associação entre o HPV, carcinogênese oral e resposta imunológica celular.

O papilomavírus humano (HPV) é encontrado nas lesões de cavidade oral e vem

sendo considerado um dos fatores de risco para a carcinogênese oral por promover o

descontrole do ciclo celular e algumas vezes o HPV é eliminado pela ativação do sistema

imunológico. Entretanto, ocasionalmente as lesões não regridem e a progressão maligna da

doença acontece sob condições apropriadas do micro-ambiente. A persistência da infecção

viral parece ser necessária para a progressão neoplásica e a incapacidade de remover a

infecção viral é atribuída á pobre resposta imunológica (O’BRIEN e CAMPO, 2002).

O sistema imune do hospedeiro desempenha um papel fundamental no resultado

clínico de lesões relacionadas ao HPV. Cerca de 70% a 90% dos indivíduos infectados

eliminam o vírus entre 12 a 24 meses após a detecção da infecção inicial. A persistência viral

nos 10% a 30% restantes está geralmente relacionada ao tipo viral infectante (oncogênicos) e

com o quadro imunológico do paciente. Estudos demonstraram que, em pacientes

imunossuprimidos, há um aumento da persistência viral e maior progressão de lesões

neoplásicas (OZSARAN, 1999; HARWOOD, 2000; HEARD 2000). Já em indivíduos

imunocompetentes, pode ocorrer a deficiência ou ausência da resposta imunológica,

permitindo assim que o vírus utilize estratégias para evadir-se da imunovigilância do

hospedeiro. O HPV pode subverter a resposta imune do hospedeiro, atuando diretamente na

resposta antiviral através da inibição da síntese de interferon tipo I e moléculas HLA de classe

I envolvidas na apresentação de antígenos aos CTLs (FRAZER, 1996; RONCO, 1998 ;

ALCAMI, 2000 ; O'BRIEN 2002; TINDLE, 2002). A infecção pelo HPV e a neoplasia

cervical estão associados ao impedimento da imunidade celular e não especificamente à

imunidade humoral, indicando que os efetores da imunidade celular são mais importantes que

os anticorpos nesta doença. Existem evidências de que a imunidade celular, e não a humoral,

tem um papel importante na destruição de células infectadas com vírus (ABBAS,2005).

O HPV pode escapar da defesa imunológica, modificando a polarização de células T,

induzindo uma menor expressão de moléculas CHP de classe I e reduzindo a função das

células apresentadoras de antígeno. Nas lesões pré-malignas e malignas ocorre um defeito na

apresentação do antígeno, pois o vírus promove um decréscimo de moléculas MHC de classe

I e de proteínas TAP, dificultando sua eliminação (KEATING et al., 1995).

Embora trofoblastos e tumores sejam ambos imunogênicos, eles são capazes de

escapar da imunovigilância do hospedeiro. Os mecanismos exatos envolvidos neste processo

são surpreendentemente similares em ambas as situações (WILCZYNSKI, 2006). No presente

estudo o aumento da expressão de HLA-G e baixa expressão de HLA-E foram observados,

sendo a expressão de HLA-G elevada nas lesões benignas e diminuindo nas lesões pré-

malignas e no câncer oral. Ainda, alta expressão de HLA-G foi observada em associação

estreita com a presença do DNA do HPV. Não parece surpresa que as lesões benignas e pré-

malignas, as quais apresentam maiores níveis de expressão de HLA-G, sejam também as

mesmas lesões com maior freqüência da infecção pelo HPV. Existem cada vez mais relatos

sobre o papel dos vírus na modulação da expressão do HLA-G. Seu efeito é dependente do

tipo celular. A expressão de HLA-G por células neuronais foi observada após a infecção pelo

vírus da raiva em níveis de mRNA e na superfície celular (LEMAOULT, et al., 2003). HLA-

G também foi altamente regulado em infecções de monócitos pelo citomegalovírus (CMV)

humano após estimulação alogênica (ONNO et al., 2000). Em pacientes infectados pelo vírus

da imunodeficiência humana (HIV – human immunodeffiency vírus), foi observada uma alta

expressão de HLA-G1 na superfície de todos os monócitos e em 10% das células T desses

pacientes (LOZANO et al., 2002; CABELLO et al., 2003).

HLA-G é observado como uma molécula com caráter imunossupressivo e

imunomodulatório no desenvolvimento do câncer (TRIPATHI eAGRAWAL, 2006). A

molécula HLA-G pode inibir as funções de células T e células natural killer (NK) e a alta

concentração dessa molécula poderia sistematicamente reduzir a imunovigilância contra o

desenvolvimento do tumor e assim favorecer a progressão do câncer. A inibição de células

NK promovidas pela elevada expressão de HLA-G ocorre pela interação direta da molécula –

G com receptores inibitórios na superfície das células NK, denominado killing

immunoglobulin-like receptors (KIRs) ou agindo indiretamente, estabilizando a expressão de

HLA-E na superfície celular. In vitro, a expressão da molécula HLA-G apresenta-se

intensamente aumentada por citocinas Th1, como IFN gama, enquanto as citocinas Th2 (IL-

4, IL-10) promovem menores efeitos sobre a molécula HLA-G (REBMANN et al., 2003;

ROUAS-FREISS et al., 2005). Células T CD4+ secretam IL-10 em resposta a proteínas de

capsídeo de diversos vírus, estas proteínas são apresentadas pelas células dendríticas e

desviam a resposta de células T CD8+ associadas a epítopos restritos pela molécula CHP de

classe I. Essa associação, reduz a produção de IFN-gama, resultando na baixa resposta de

células T CD8 contra células tumorais e/ou infectadas por vírus (LIU et al, 2006).

O presente estudo observou uma correlação inversa entre a alta expressão de molécula

HLA-G e a baixa expressão de molécula HLA-E na maioria das lesões infectadas pelo HPV.

A regulação positiva da molécula HLA-G permite a estabilidade da molécula HLA-E na

superfície e poderia potencializar a resposta imunossupressora da molécula –G (ROUAS-

FREISS et al., 2005). Entretanto, alterações genéticas e moleculares acumulativas nas células

tumorais levariam ao aparecimento das moléculas HLA-E em um número limitado de

linhagens celulares tumorais e estaria relacionada com a regulação negativa da molécula HLA

de classe I ou mutação em subunidades da molécula de classe I (MARIN et al., 2003).

Recente estudo demonstrou que a expressão de HLA-E na superfície das células de melanoma

diminui a sua susceptibilidade à lise pelos linfócitos T citotóxicos (CTL) (DERRE et al.,

2006). No presente estudo, o HPV esteve presente com maior frequência em lesões orais com

alta expressão de ambas as moléculas não clássicas (G+/E+) e em diferentes níveis de

expressão com HLA-G elevado e HLA-E baixo (G+/E-) ou HLA-G baixo e HLA-E alto (G-

/E+). A elevada expressão de HLA-E foi observada em um pequeno número de lesões orais,

algumas delas infectadas pelo HPV. A expressão aberrante de HLA-E pode ser de particular

relevância biológica quando comparada à inibição da citotoxidade das células NK devido a

interação com o receptor CD94/NKG2A.( MARIN, 2003. Assim, a expressão aberrante de

HLA-G e a baixa expressão de HLA-E em associação com as lesões proliferativas e

malignas de mucosa oral infectadas pelo HPV sugerem que diferentes níveis de ambas as

moléculas não clássicas poderia ser uma estratégia do HPV para escapar da imunovigilância

do hospedeiro realizadas pela ação lítica das células NK e linfócitos T citotóxicos.

A análise quantitativa de CD4, CD25 e CD28 e o diagnóstico histológico das lesões

orais demonstrou uma menor expressão de CD4 e CD25, bem como maior expressão de

CD28 nos carcinomas de mucosa oral. Células T CD4+ produzem IL-2, que é considerado

um fator de crescimento crítico de células T devido à habilidade de crescimento e expansão

dessas células em cultura sob estímulo de IL-2 (ANTONY et al., 2006). Da mesma forma, a

ação autócrina e parácrina da produção de IL-2 resulta na expressão de CD25 (receptor de

IL-2) que está relacionada à sobrevida e mecanismo supressivo de células T regulatórias,

(Treg) (WANG e CHEN, 2004). Adicionalmente, dentre as várias citocinas, os níveis de IL-2

também ativam células natural killer (NK), resultando na lise de células tumorais e/ou

infectadas por vírus (RALAINIRINA et al., 2006). Por outro lado, a maior expressão de

CD28 observada nesse estudo poderia indicar a ativação do segundo sinal para a proliferação

de células T. Quanto ao CD28 estar expresso em altos níveis, foi também encontrada baixa

expressão de CD4 e CD25, podendo indicar que os sinais co-estimulatórios promovidos pela

expressão de CD28 poderiam não ser eficientes, impedindo o aumento de produção de IL-2 e

CD25. Entretanto, a alta expressão de CD28 no infiltrado linfocítico pode corresponder a uma

diminuição ou ausência de expressão de CD28 nas células epiteliais (BECKER et al., 2000).

Na mucosa cervical, o decréscimo de células de Langerhans na zona de transformação

apresentando lesões intraepiteliais tem sido associado à redução in vivo da proliferação de

células T e produção de IL-2

(GONCALVES e DONADI, 2004). Com a progressão para

lesões intra-epiteliais de alto grau (HG-SIL), ocorre o aumento de células de Langerhans

imaturas com função deficiente observada nesse epitélio quando comparado com a zona de

transformação (GONCALVES e DONADI, 2004).

A expressão de IL-2 e INF-gama (INF-γ) é freqüentemente observada nos estágios

recentes dos tumores de mucosa oral. Estudos prévios demonstram que as oncoproteínas do

HPV inibem a indução da resposta imune ativada por INF-γ, interferindo na efetiva

eliminação do vírus (BARNARD e MCMILLAN, 1999). A resposta ao tratamento com INF-γ

é fraca em lesões com HPV16 e HPV18 quando comparadas às lesões infectadas por

HPV6/11 (SCHNEIDER, 1987). Lesões pouco diferenciadas e aquelas com potencial

metastático expressam mais IL-4 e IL-10 e suprimem a expressão de IL-2 e INF-γ

(BARNARD e MCMILLAN, 1999).

Embora a resposta imunológica ao HPV seja ainda pouco compreendida, tem sido

postulado que a resposta imune principalmente celular (Th1), em oposição à resposta humoral

(Th2), seja fundamental para a eliminação do vírus (GONCALVES e DONADI, 2004). Ao

avaliar a expressão de receptores de células T regulatórias ou efetoras (CD4, CD25 e CD28),

foi observado no presente estudo a menor expressão desses receptores no infiltrado

linfocitátio das lesões orais e associação positiva com a presença de malignidade e infecção

pelos tipos de HPV de alto risco. Nossos resultados se opõem aos observados em alguns

estudos, nos quais o aumento da expressão de IL-2R tem sido documentado em neoplasias

malignas humanas e nas linhagens celulares derivadas de câncer (ROCHA-ZAVALETA, et

al., 2004). No câncer cervical, o aumento da expressão de IL-2R é observado em lesões intra-

epiteliais de alto grau (HGSIL) que evoluem para o câncer (UNG, et al., 1999). No presente

estudo, observou-se uma menor população de linfócitos CD4+ CD25+ progressivamente

entre as lesões benignas, pré-malignas e malignas de mucosa oral, possivelmente indicando

menor resposta de células T associada com o câncer oral e a infecção pelo HPV. Baixa ou

perda de expressão de células T CD4 e CD25 poderia resultar na resposta imune celular

deficiente ao tumor e/ou às células infectadas por vírus (ALCOCER-GONZALEZ et al.,

2006, DELONG et al., 2005). A progressão do câncer parece relacionada à diminuição de

produção de IL-2 e outras citocinas nos linfócitos infiltrantes no tumor, bem como em

defeitos na via de CLTs, contribuindo para a inabilidade do sistema imune em eliminar as

células neoplásicas e, em especial , as células malignas de tumores de cabeça e pescoço

(KERREBIJN et al., 1999). A presença de células T CD4+ CD25+ poderia ser responsável

pela resposta ao antígeno tumor-específico, resultando na tolerância imunológica e evasão das

células tumorais da imunovigilância do tumor hospedeiro. Resposta imune celular ineficiente

poderia contribuir para a permanência das células com defeitos acumulativos em genes

específicos que regulam a morte celular, sendo considerado um mecanismo de sobrevivência

(OZSARAN et al., 1999). A persistência da infecção pelo HPV parece ocorrer em 10 a 30%

das pessoas infectadas, principalmente associada à infecção pelos tipos de HPV de alto risco,

associada à menor resposta imune e à progressão tumoral em pacientes imunossuprimidos.

(HARWOOD et al., 2000; HEARD et al., 2000). Por outro lado, em indivíduos normais, a

ausência ou deficiência de resposta imunológica poderia ser uma estratégia do HPV para se

evadir da imunovigilância do hospedeiro (O'BRIEN e SAVERIA, 2002).

Finalmente, o presente estudo traz resultados inéditos sobre a inter-relação de

moléculas não clássicas e carcinogênese de mucosa oral, bem como a resposta imune celular.

Ainda, a presença do HPV tem sido observada nesse e em outros trabalhos conduzidos em

nosso laboratório, especialmente encontrados em lesões benignas e pré-malignas. Esse fato

leva à reflexão de que não existe protocolo no Brasil para diagnóstico precoce da infecção por

HPV em cavidade oral. Sendo assim, com infecção por um vírus carcinogênico e associado à

deficiência de resposta imunológica, certamente as lesões benignas de hoje serão o câncer de

amanhã.

CONCLUSÕES

1. Verificou-se a presença do HPV em lesões orais benignas, premalignas e malignas,

predominantemente com tipo de HPV de alto risco, o que poderia indicar que o HPV

possivelmente seja um fator de risco para o desenvolvimento do câncer oral.

2. Observou-se o aumento na expressão quantitativa de HLA-G nas lesões benignas e

essa expressão diminuiu progressivamente entre as lesões pré-malignas e malignas,

isto poderia indicar que a desregulação de HLA-G ocorre precocemente, em lesões

proliferativas e precursoras do câncer oral .

3. Observou-se a menor expressão quantitativa de HLA-E igualmente entre as lesões

benignas, pré-malignas e malignas, não evidenciando a associação da expressão dessa

molécula e a carcinogênese de mucosa oral.

4. Observou-se uma correlação inversa entre a maior expressão de HLA-G e a menor

expressão de HLA-E nas lesões infectadas pelo HPV, aparentemente isto indicaria

que a desregulação dessas moléculas não clássicas possivelmente contribue para a

persistência da infecção viral e progressão maligna das lesões orais.

5. Verificou-se a menor expressão das moléculas de células T , CD4, CD25 e CD28,

apresentando concomitante baixa de expressão de CD4/CD25 e CD25/CD28,

indicando que aparentemente a deficiência de resposta imune celular mediada por

células T possibilitaria a persistência da infecção pelo HPV e transformação maligna

celular da cavidade oral.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABBAS, A.K.Imunologia celular e molecular.5. Rio de Janeiro: Elsevier,2005.

AGARWAL, A.; RANI, M.; SAHA, G. K.; VALARMATHI, T. M.; BAHADUR, S.;

MOHANTI, B. K.; DAS, S. N.Disregulated expression of the Th2 cytokine gene in patients

with intraoral squamous cell carcinoma. Immunol Invest, v.32, n.1-2, Feb, p.17-30. 2003.

ALCAMI, A.; KOSZINOWSKI, U.H. Viral mechanisms of immune evasion. Immunol

Today, v.21, n.9, Sep; p.447-55. 2000

ALCOCER-GONZALEZ, J.M.; BERUMEN, J.; TAMEZ-GUERRA, R.; BERMUDEZ-

MORALES, V.; PERALTA-ZARAGOZA, O.;HERNANDEZ-PANDO, R.; MORENO, J.;

GARIGLIO, P.; MADRID-MARINA, V. In vivo expression of immunosuppressive cytokines

in human papillomavirus-transformed cervical cancer cells. Viral Immunol. v.19,n.3,p.481-

91, 2006.

ALGARRA, I.; GARCIA-LORA, A.; CABRERA, T.; RUIZ-CABELLO, F.; GARRIDO, F.

The selection of tumor variants with altered expression of classical and nonclassical MHC

class I molecules: implications for tumor immune escape. Cancer Immunol Immunother.

v.53, n.10, p.904-1010, 2004.

ALLISON, R. T.; BEST, E. T. p53, PCNA and Ki-67 expression in oral squamous cell

carcinomas: the vagaries of fixation and microwave enhancement of immunocytochemistry. J

Oral Pathol Med, v.27, n.9, Oct, p.434-440. 1998.

ANTONY, P.A.; PAULOS, C.M.; AHMADZADEH, M.; AKPINARLI, A.; PALMER, D.C.;

SATO, N.; KAISER, A.; HINRICHS, C.S.; KLEBANOFF, C.A.; TAGAYA, Y.; RESTIFO,

N.P. Interleukin-2-dependent mechanisms of tolerance and immunity in vivo. J Immunol.

v.176,n.9,p.5255-5266, 2006.

AXELL, T.;PINDBORG, J. J.;SMITH, C. J.;VAN DER WAAL, I. Oral white lesions with

special reference to precancerous and tobacco- related lesions: conclusions of an international

symposium held in Uppsala, Sweden, May 18-21 1994. International Collaborative Group on

Oral White Lesions. J Oral Pathol Med, v.25, n.2, Feb, p.49-54. 1996.

BARNARD, P.; MCMILLAN, E. N. A. The human papillomavirus E7 oncoprotein abrogates

signaling mediated by interferon-alpha. Virology, v.259, n.2, Jul 5, p.305-313. 1999.

BECKER, J.C.; BRABLETZ, T.; CZERNY, C.; TERMEER, C.; BROCKER, E.B. Tumor

escape mechanisms from immunosurveillance: induction of unresponsiveness in a specific

MHC-restricted CD4+ human T cell clone by the autologous MHC class II+ melanoma. Int

Immunol.;v. 5,n.12,p.1501-1508, 1993.

BECKER J.C.; VETTER, C.S.; SCHRAMA, D.; BROCKER, E.B.; THOR STRATEN, P.

Differential expression of CD28 and CD94/NKG2 on T cells with identical TCR beta variable

regions in primary melanoma and sentinel lymph node. Eur J Immunol. v.30,n12,p.3699-

706, 2000.

BETTINI, J.S.; SOARES,E.G.; DUARTE, G.; SIMOES, R.T.; SIMOES,A.L.PCR diagnosis

of HPV in cervical biopsies of CIN and invasive neoplasia formerly diagnosed as HPV

negative. Acta Cytol. v.47,p.545-549, 2003.

BIRNER, P.; BACHTIARY, B.;DREIER, B.;SCHINDL, M.;JOURA, E.

A.;BREITENECKER, G.;OBERHUBER, G.;Signal-amplified colorimetric in situ

hybridization for assessment of human papillomavirus infection in cervical lesions. Mod

Pathol, v.14, n.7, Jul, p.702-709. 2001.

BRASIL. Ministério da Saúde. Estatísticas de câncer oral. Brasília, DF, 2004. Disponível

em:<http://www.saude.gov.br/ Acesso em: 25/06/2006.

BROUHA, X. D.;TROMP, D. M.;HORDIJK, G. J.;WINNUBST, J. A.;DE LEEUW, J. R.Oral

and pharyngeal cancer : analysis of patient delay at different tumour stages. Head Neck, v.27,

p.939-945, 2005.

BUNDGAARD, T.;BENTZEN, S. M.;WILDT, J.The prognostic effect of tobacco and alcohol

consumption in intra-oral squamous cell carcinoma. Eur J Cancer B Oral Oncol, v.30B, n.5,

Sep, p.323-328, 1994.

BURKHARDT, A.; Advanced methods in the evaluation of premalignant lesions and

carcinomas of the oral mucosa. J. Oral Pathol., v.14, p.751-778. 1985.

CABELLO, A.;RIVERO, A.;GARCIA, M. J.;LOZANO, J. M.;TORRE-CISNEROS,

J.;GONZALEZ, R.;DUENAS, G.;GALIANI, M. D.;CAMACHO, A.;SANTAMARIA,

M.;SOLANA, R.;MONTERO, C.;KINDELAN, J. M.;PENA, J.HAART induces the

expression of HLA-G on peripheral monocytes in HIV-1 infected individuals. Hum

Immunol, v.64, n.11, Nov, p.1045-9. 2003.

CHANG, F.;SYRJANEN, S.;TERVAHAUTA, A.;SYRJANEN, K. Tumourigenesis

associated with the p53 tumour suppressor gene. Br J Cancer, v.68, n.4, Oct, p.653-61. 1993.

COGLIANO, V. J. Current criteria to establish human carcinogens. Semin Cancer Biol, v.14,

n.6, Dec, p.407-12. 2004.

COLETTA, R.D.;GRANER, E.;LOPES, M.A.;VARGAS, P.A.;JORGE, J.JR.;ALMEIDA,

O.P. Os avanços da biologia molecular e o câncer bucal. . Rev. APCD, v.56, p.62-66. 2002.

CRISSMAN, J.D. & ZARBO, R.J. Dysplasia, in situ carcinoma, and progression to invasive

squamous cell carcinoma of the upper aerodigestive tract. Am. J. Surg. Pathol, v.13(suppl),

p..5-16. 1989.

CROMME, F. V.;SNIJDERS, P. J.;VAN DEN BRULE, A. J.;KENEMANS, P.;MEIJER, C.

J.;WALBOOMERS, J. M. MHC class I expression in HPV 16 positive cervical carcinomas is

post-transcriptionally controlled and independent from c-myc overexpression. Oncogene, v.8,

n.11, Nov, p.2969-75. 1993.

D’COSTA, J.; SARANATH, D.; DEDHIA, P.; SANGHVI, V.; MEHTA, A.R. Detection of

HPV-16 genome in human oral cancers and potentially malignant lesions from India. Oral

Oncol,v.34,p.413-420, 1998.

DELONG, P.; CARROLL, R.G.; HENRY, A.C.; TANAKA, T.; AHMAD, S.; LEIBOWITZ,

M.S.; STERMAN, D.H.; JUNE, C.H.; ALBELDA, S.M.; VONDERHEIDE, R.H. Regulatory

T cells and cytokines in malignant pleural effusions secondary to mesothelioma and

carcinoma. Cancer Biol Ther,v. 4,n.3,p.342-346, 2005.

DERRE, L.;CORVAISIER, M.;CHARREAU, B.;MOREAU, A.;GODEFROY, E.;

MOREAU-AUBRY, A.;JOTEREAU, F.;GERVOIS N.; Expression and release of HLA-E by

melanoma cells and melanocytes: potential impact on the response of cytotoxic effector cells.

J Immunol.,v.177,n.5,p.3100-3107, 2006.

DE VILLIERS, E. M. Papillomavirus and HPV typing. Clin Dermatol, v.15, n.2, Mar-Apr,

p.199-206, 1997.

DONADI, E. A. Aspectos moleculares do complexo principal de Histocompatibilidade: com

entender a associação entre o sistema HLA e as doenças reumáticas. Rev Bras Reumat, v.41,

n. 2, p.225-236, 2001.

FEINMESSER, M.;OKON, E.;SCHWARTZ, A.;KAGANOVSKY, E.;HARDY,

B.;AMINOV, E.;NAGERIS, B.;SULKES, J.;FEINMESSER, R. Histologic and

immunohistochemical characterization of tumor and inflammatory infiltrates in oral squamous

cell carcinomas treated with local multikine immunotherapy: the macrophage at the front line.

Eur Arch Otorhinolaryngol, v.261, n.7, Aug, p.359-368, 2004.

FORTE, P.;BAUMANN, B.C;WEISS, E.H.; SEEBACH, J.D.HLA-E expression on porcine

cells: protection from human NK cytotoxicity depends on peptide loading. Am J Transplant.

5(9):2085-93, 2005.

FRANCO, E. L.;KOWALSKI, L. P.;OLIVEIRA, B. V.;CURADO, M. P.;PEREIRA, R.

N.;SILVA, M. E.;FAVA, A. S.;TORLONI, H. Risk factors for oral cancer in Brazil: a case-

control study. Int J Cancer, v.43, n.6, Jun 15, p.992-1000, 1989.

FRAZER, I. H. Immunology of papillomavirus infection. Curr Opin Immunol, v.8, n.4,

Aug, p.484-491, 1996.

FREGONESI, P. A.;TERESA, D. B.;DUARTE, R. A.;NETO, C. B.;DE OLIVEIRA, M.

R.;SOARES, C. P.p16(INK4A) immunohistochemical overexpression in premalignant and

malignant oral lesions infected with human papillomavirus. J Histochem Cytochem, v.51,

n.10, Oct, p.1291-1297. 2003.

GERVASIO, O. L.;DUTRA, R. A.;TARTAGLIA, S. M.;VASCONCELLOS, W.

A.;BARBOSA, A. A.;AGUIAR, M. C. Oral squamous cell carcinoma: a retrospective study

of 740 cases in a Brazilian population. Braz Dent J, v.12, n.1, p.57-61. 2001.

GIOVANNELLI, L.;CAMPISI, G.;LAMA, A.;GIAMBALVO, O.;OSBORN,

J.;MARGIOTTA, V.;AMMATUNA, P. Human papillomavirus DNA in oral mucosal lesions.

J Infect Dis, v.185, n.6, Mar 15, p.833-836, 2002.

GONCALVES, M. A.;DONADI, E. A. Immune cellular response to HPV: current concepts.

Braz J Infect Dis, v.8, n.1, Feb, p.1-9, 2004.

GUIMARAES, M.C.; GONCALVES, M.A.;SOARES, C.P.;BETTINI, J.S.;DUARTE,

R.A.;SOARES, E.G.;Immunohistochemical expression of p16INK4a and bcl-2 according to

HPV type and to the progression of cervical squamous intraepithelial lesions. J Histochem

Cytochem, v.53,n.4,p.509-516, 2005.

HA , P.K.; CALIFANO, J.A. The role of human papillomavirus in oral carcinogenesis. Crit

Rev Oral Biol Med, v. 15, n. 4, p. 188-196, 2004.

HABERLAND-CARRODEGUAS, C.;FORNATORA, M.L.;REICH, R.F.;FREEDMAN,

P.D.; Detection of human papillomavirus DNA in oral inverted ductal papillomas. J Clin

Pathol.,v.56,n.12,p.910-913, 2003.

HANSEN, L.S.; OLSON, J.A.; SILVERMAN JUNIOR, S. Proliferative verrucous

leukoplakia. A long-term study of thirty patients. Oral Surg Oral Med Oral Pathol, v. 60, n.

3, p. 285-298, 1985.

HANSEL, D.E.;RAHMAN, A.;WILENTZ, R.E.;SHIH, I.E.M.;MCMASTER, M.T.;YEO,

C.J.;MAITRA, A. HLA-G upregulation in pre-malignant and malignant lesions of the

gastrointestinal tract. Int J Gastrointest Cancer.v.35,n.1,p.15-23,2005.

HARWOOD, C.A.; SURENTHERAN, T.; MCGREGOR, J.M.; SPINK, P.J.; LEIGH, I.M.;

BREUER, J.; PROBY, C.M. Human papillomavirus infection and non-melanoma skin cancer

in immunosuppressed and immunocompetent individuals. J Med Virol, v. 61, n, 3, p. 289-

297, 2000.

HEARD, I.T.J.;SCHMITZ, V.;MANDELBROT, L.;KAZATCHKINE, M.D.;ORTH, G.

Increased risk of cervical disease among human immunodeficiency virus-infected women

with severe immunosuppression and high human papillomavirus load. n.1, p.289-297, 2000.

HEARD, I.;TASSIE, J.M.;SCHMITZ, V.;MANDELBROT, L.;KAZATCHKINE,

M.D.;ORTH, G. Increased risk of cervical disease among human immunodeficiency virus-

infected women with severe immunosuppression and high human papillomavirus

load(1).Obstet Gynecol.Sep,v.96, n.3, p.403-409, 2000.

HEISE, A. The clinical significance of HPV. Nurse Pract, v.28, n.10, Oct, p.8-19; quiz 20-

21. 2003.

HODGKINSON, A. D.;MILLWARD, B. A.;DEMAINE, A. G. The HLA-E locus is

associated with age at onset and susceptibility to type 1 diabetes mellitus. Hum Immunol,

v.61, n.3, Mar, p.290-295, 2000.

HOWLEY, P. Papillomavirinae: The viruses and their replication. In: B. N. Fields, D. M.

Knipe, et al (Ed.). Fields Virology.LIPPINCOTT-RAVEN, 1994. Papillomavirinae: The

viruses and their replication, p.2045-2076

INTERNACIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON CANCER.Human Papillomaviruses.

Lyon: IARC,1995.415p. (IARC Monographs on the carcinogenic Risk of Chemicals to

Humans, Vol.(64) disponível em: http://www.who.int/entity/cancer/media/en/415.pdf Acesso

em : 25/07/2006.

IBRAHIM, S. O.;LILLEHAUG, J. R.;JOHANNESSEN, A. C.;LIAVAAG, P. G.;NILSEN,

R.;VASSTRAND, E. N.Expression of biomarkers (p53, transforming growth factor alpha,

epidermal growth factor receptor, c-erbB-2/neu and the proliferative cell nuclear antigen) in

oropharyngeal squamous cell carcinomas. Oral Oncol, v.35, n.3, May, p.302-313. 1999.

JANEWAY, C. A. O. T., PAUL Imunobiologia o Sistema Imune na Saúde e na Doença:

ARTMED. 2002

JIMENEZ, C.;CORRENTI, M.;SALMA, N.;CAVAZZA, M.E.;PERRONE, M. Detection of

human papillomavirus DNA in benign oral squamous epithelial lesions in Venezuela. J Oral

Pathol Med. v.30,n.7,p.385-388, 2001.

JURISICOVA, A.;CASPER, R. F.;MACLUSKY, N. J.;MILLS, G. B.;LIBRACH, C. L.

HLA-G expression during preimplantation human embryo development. Proc Natl Acad Sci

U S A, v.93, n.1, Jan 9, p.161-5. 1996.

KIESSLING, R.;WASSERMAN, K.;HORIGUCHI, S.;KONO, K.;SJOBERG, J.;PISA, P.;

PETERSSON, M.;Tumor-induced immune dysfunction. Cancer Immunol Immunother.

1999;v.48,n.7,p.353-362

KREIMER, A.R.;CLIFFORD, G.M.; BOYLE, P.;FRANCESCHI, S.Human papillomavirus

types in head and neck squamous cell carcinomas worldwide: a systematic review. Cancer

Epidemiol Biomarkers Prev. v.14,n.2,p.467-475, 2005.

KEATING, P. J.;CROMME, F. V.;DUGGAN-KEEN, M.;SNIJDERS, P.

J.;WALBOOMERS, J. M.;HUNTER, R. D.;DYER, P. A.;STERN, P. L. Frequency of down-

regulation of individual HLA-A and -B alleles in cervical carcinomas in relation to TAP-1

expression. Br J Cancer, v.72, n.2, Aug, p.405-411,1995.

KERREBIJN, J. D.;BALM, A. J.;FREEMAN, J. L.;DOSCH, H. M.;DREXHAGE, H. A Who

is in control of the immune system in head and neck cancer? Crit Rev Oncol Hematol, v.31,

n.1, Jun, p.31-53. 1999.

KIM, J.;MODLIN, R. L.;MOY, R. L.;DUBINETT, S. M.;MCHUGH, T.;NICKOLOFF, B.

J.;UYEMURA, K.IL-10 production in cutaneous basal and squamous cell carcinomas. A

mechanism for evading the local T cell immune response. J Immunol, v.155, n.4, Aug 15,

p.2240-2247. 1995.

KIRSZENBAUM, M.;MOREAU, P.;TEYSSIER, M.;LAFON, C.;GLUCKMAN,

E.DAUSSET, J.;CAROSELLA, E.Evidence for the presence of the alternatively spliced

HLA-G mRNA forms in human mononuclear cells from peripheral blood and umbilical cord

blood. Hum Immunol, v.43, n.3, Jul, p.237-241, 1995.

KOWALSKI, L. P.;CARVALHO, A. L. Influence of time delay and clinical upstaging in the

prognosis of head and neck cancer. Oral Oncol, v.37, n.1, Jan, p.94-98, 2001.

KOWALSKI, L. P.;FRANCO, E. L.;TORLONI, H.;FAVA, A. S.;DE

ANDRADE;SOBRINHO, J.;RAMOS, G.;OLIVEIRA, B. V.;CURADO, M. P.Lateness of

diagnosis of oral and oropharyngeal carcinoma: factors related to the tumour, the patient and

health professionals. Eur J Cancer B Oral Oncol, v.30B, n.3, May, p.167-173,1994.

KUFFER, R.;LOMBARDI, T. Premalignant lesions of the oral mucosa. A discussion about

the place of oral intraepithelial neoplasia (OIN). Oral Oncol, v.38, n.2, Feb, p.125-130, 2002.

LAFON, M.;PREHAUD, C.;MEGRET, F.;LAFAGE, M.;MOUILLOT, G.;ROA

M,MOREAU, P.;ROUAS-FREISS, N.;CAROSELLA, E.D.Modulation of HLA-G expression

in human neural cells after neurotropic viral infections. J Virol. v.79,n.4,p.226-237,2005.

LADANYI,A.;SOMLAI,B.;GILDE,K.;FEJOS,Z.;GAUDI,I.;TIMAR,J.T-cell activation

marker expression on tumor-infiltrating lymphocytes as prognostic factor in cutaneous

malignant melanoma. Clin Cancer Res . v.10,n.2,p.521-530,2004.

LAKSHMI, S.;AIR, S. A.;ILLAI, M. R.. Oral cancer and human papillomaviruses: is there a

link? J Surg Oncol, v.52, n.3, Mar, p.193-196,1993.

LANE J.E.;PETERSON, C.M.;RATZ, J.L. Letter to the editor: modified mohs technique for

Basal cell carcinomas of the head and neck. Arch Facial Plast Surg, v.5, n.1, p.116. 2003.

LAZO, P. A. Human papillomaviruses in oncogenesis. Bioessays, v.9, n.5, Nov, p.158-

162,1988.

LE BOUTELLIER P. ,BLASCHITZ, A. The functionality of HLA-G is emerging. Immunol

Rev, v.167, p.233-244,1999.

LEITE, I. C.;KOIFMAN, S.Survival analysis in a sample of oral cancer patients at a reference

hospital in Rio de Janeiro, Brazil. Oral Oncol, v.34, n.5, Sep, p.347-352,1998.

LEMAOULT, J.;LE DISCORDE, M.;ROUAS-FREISS, N.;MOREAU, P.;MENIER,

C.;MCCLUSKEY, J.;CAROSELLA, E. D.; Biology and functions of human leukocyte

antigen-G in health and sickness. Tissue Antigens, v.62, n.4, Oct, p.273-284,2003.

LI, X., COFFINO, P. High-risk human papillomavirus E6 protein has two distinct binding

sites within p53, of which only one determines degradation. J Virol, v.70, n.7, Jul, p.4509-

4516,1996.

LIU, X.S.;DYER , J.;LEGGATT,G.R.;FERNANDO,G.J.;ZHONG, J.;THOMAS ,

R.;FRAZER,I.H.Overcoming original antigenic sin to generate new CD8 T cell IFN-gamma

responses in an antigen-experienced host. J Immunol. v.77,n.5,p.2873-2879,2006.

LLEWELLYN, C. D.;JOHNSON, N. W.;WARNAKULASURIYA, K. A.Risk factors for

squamous cell carcinoma of the oral cavity in young people--a comprehensive literature

review. Oral Oncol, v.37, n.5, Jul, p.401-418,2001.

LOKE,P.;ALLISON,J. Emerging mechanisms of immune regulation: the extended B7 family

and regulatory T cells. Arthritis Res Ther v.6,n.5,p.214-216,2004.

LOPEZ-BOTET, M.;LLANO, M.;NAVARRO, F.BELLON, T. NK cell recognition of non-

classical HLA class I molecules. Semin Immunol, v.12, n.2, Apr, p.109-119,2000.

LOZANO, J. M.;GONZALEZ, R.;KINDELAN, J. M.;ROUAS-FREISS, N.;CABALLOS,

R.;DAUSSET, J.;CAROSELLA, E. D.;PENA, J. Monocytes and T lymphocytes in HIV-1-

positive patients express HLA-G molecule. Aids, v.16, n.3, Feb 15, p.347-351,2002.

MANOS, M.M.;TING,Y.; WRIGHT,D.K.;LEWIS,A.J.; BROKER,T.R.; and WOLINSKY

S.M.; The use of polymerase chain reaction amplification for the detection of genital humam

papillomaviruses. In In Molecular Diagnostics of Human Cancer: Cancer Cells. Vol. 7. M.

Furth and M. Greaves, editors. Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 209-214,989.

MAJEWSKI, S.;JABLONSKA, S. Human papillomavirus-associated tumors of the skin and

mucosa. Journ. Am. Acad. Derm., v.36, p.659-685. 1997.

MARIN,R.;RUIZCABELLO,F.;PEDRINACI,S.;MENDEZ,R.;JIMENEZ,P.;GERAGHTY,D.

E.;GARRIDO,F.Analysis of HLA-E expression in human tumors. Immunogenetics.

v.54,n11,p.767-775,2003.

MCDEVITT, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the

immune response. Annu Rev Immunol, v.18, p.1-17, 2000.

MCGLENNEN, R. C. Human papillomavirus oncogenesis. Clin Lab Med, v.20, n.2, Jun,

p.383-406, 2000.

MIGUEL, R. E.;VILLA, L. L.;CORDEIRO, A. C.;PRADO, J. C.;SOBRINHO, J.

S.;KOWALSKI, L. P.Low prevalence of human papillomavirus in a geographic region with a

high incidence of head and neck cancer. Am J Surg, v.176, n.5, Nov, p.428-429, 1998.

MILLER, C. S. Herpes simplex virus and human papillomavirus infections of the oral cavity.

Semin Dermatol, v.13, n.2, Jun, p.108-117, 1994.

MILLER, C. S. E JOHNSTONE, B. M. Human papillomavirus as a risk factor for oral

squamous cell carcinoma: a meta-analysis, 1982-1997. Oral Surg Oral Med Oral Pathol

Oral Radiol Endod, v.91, n.6, Jun, p.622-35, 2001.

MOLIJN, A.; KLETER, B.; QUINT, W.; VAN DOORN, L. J. Molecular diagnosis of human

papillomavirus (HPV) infections. J Clin Virol, v.32, n.1, Marc, p.43-51,2005

MORALES, P.; CORELL, A.; MARTINEZ-LASO, J.; MARTIN-VILLA, J.M.; VARELA,

P.; PAZ-ARTAL, E.; ALLENDE, L.M. & ARNAIZ-VILLENA, A. Three new HLA-G alleles

and their linkage disequilibria with HLA-A. Immunogenetics, v.38, p. 323-331, 1993.

MUNGER, K.; PHELPS, E W. C. The human papillomavirus E7 protein as a transforming

and transactivating factor. Biochim Biophys Acta, v.1155, n.1, May 25, p.111-123, 1993.

NAGPAL, J. K. E DAS, B. R. Oral cancer: reviewing the present understanding of its

molecular mechanism and exploring the future directions for its effective management. Oral

Oncol, v.39, n.3, Apr, p.213-221, 2003.

NEVILLE, B.W.;DAMM, D.D.;ALLEN, C.M.;BOUQUOT, J.E.; Patologia oral e

maxilofacial. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1998.

NORTON, S. D.;ZUCKERMAN, L.;URDAHL, K. B.;SHEFNER, R.;MILLER, J.,JENKINS,

M. K. The CD28 ligand, B7, enhances IL-2 production by providing a costimulatory signal to

T cells. J Immunol, v.149, n.5, Sep 1, p.1556-1561, 1992.

O'BRIEN, P. M.; SAVERIA CAMPO, M..Evasion of host immunity directed by

papillomavirus-encoded proteins.Virus Res., v.88, n.1-2, Sep; p.103-117, 2002.

ONNO, M.;PANGAULT, C.;LE FRIEC, G.;GUILLOUX, V.;ANDRE, P.;FAUCHET,R.

Modulation of HLA-G antigens expression by human cytomegalovirus: specific induction in

activated macrophages harboring human cytomegalovirus infection. J Immunol, v.164, n.12,

Jun 15, p.6426-6434, 2000.

OSTWALD, C.;RUTSATZ, K.;SCHWEDER, J.;SCHMIDT, W.;GUNDLACH,

K.;BARTEN, M.Human papillomavirus 6/11, 16 and 18 in oral carcinomas and benign oral

lesions.Med Microbiol Immunol. Berl, v.192, p.145-148, 2003.

OZSARAN, A.A.;ATES, T.;DIKMEN, Y.;ZEYTINOGLU, A.;TEREK, C.;ERHAN, Y.;

OZACAR, T.;BILGIC, A.;(2): Evaluation of the risk of cervical intraepithelial neoplasia and

human papilloma virus infection in renal transplant patients receiving immunosuppressive

therapy. Eur J Gynaecol Oncol, v.20, n.2, p.127-130, 1999;.

PALMISANO, G.L.; PISTILLO, M.P.; FARDIN, P.; CAPANNI, P.; NICOLO, G.; SALVI,

S.;SPINA, B.;PASCIUCCO, G. & FERRARA; G.B. Analysis of HLA-G expression in breast

cancer tissues. Hum Immunol, v.63, 969-976,2002

PAPAROTTO LOPES, S.M.;MEEKS, V.I. Analysis of HPV 16 and 18 by in situ

hybridization in oral papilloma of HIV+ patients. Gen Dent ,v.49,p. 386-389, 2001.

PHILLIPS, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues.

Carcinogenesis, v.23, n.12, Dec, p.1979-2004, 2002.

RALAINIRINA N, POLI A, MICHEL T, POOS L, ANDRES E, HENTGES F, ZIMMER J.

Control of natural killer (NK) cell functions by CD4+CD25+ regulatory T cells. J Leukoc

Biol. 2006 (in press)

REBMANN, V.; REGEL, J.; STOLKE, D.; GROSSE-WILDE, H. Secretion of sHLA-G

molecules in malignancies. Semin Cancer Biol. Oct;v.3,n.5,p.371-377,2003

REGEZI, J. A.;SCIUBA, J. J.Patologia Bucal: correlações clinicopatológicas. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan. 2000, 64-84 p.

REIBEL, J. Tobacco and oral diseases. Update on the evidence, with recommendations. Med

Princ Pract, v.12 Suppl 1, p.22-32, 2003.

REYBURN, H. T.,MANDELBOIM, O.,VALES-GOMEZ, M.,DAVIS, D. M.,PAZMANY,

L.,STROMINGER, J. L..The class I MHC homologue of human cytomegalovirus inhibits

attack by natural killer cells. Nature, v.386, n.6624, Apr 3, p.514-517, 1997.

RITCHIE, J. M.,SMITH, E. M.,SUMMERSGILL, K. F.,HOFFMAN, H. T.,WANG,

D.,KLUSSMANN, J. P.,TUREK, L. P.,HAUGEN, T. H..Human papillomavirus infection as a

prognostic factor in carcinomas of the oral cavity and oropharynx. Int J Cancer, v.104, n.3,

Apr 10, p.336-44, 2003.

ROCHA-ZAVALETA, L.;HUITRON, C.,CACERES-CORTES, J. R.;ALVARADO

MORENO, J. A.;VALLE-MENDIOLA, A.;SOTO-CRUZ, I.;WEISS STEIDER,

B.;RANGEL-CORONA, R.Interleukin-2 (IL-2) receptor-betagamma signalling is activated

by c-Kit in the absence of IL-2, or by exogenous IL-2 via JAK3/STAT5 in human

papillomavirus-associated cervical cancer. Cell Signal, v.16, n.11, Nov, p.1239-1247, 2004.

RODRIGUES, V. C.;MOSS, S. M.;TUOMAINEN, H. Oral cancer in the UK: to screen or not

to screen. Oral Oncol, v.34, n.6, Nov, p.454-465, 1998.

RODGERS, J.R.;COOK, R.G.;MHC class Ib molecules bridge innate and acquired immunity.

Nat Rev Immunol,v. 5,n.6,p.459-471, 2005.

RONCO, L. V.; KARPOVA ,A.Y.; VIDAL, M.; HOWLEY, P.M. Human papillomavirus 16

E6 oncoprotein binds to interferon regulatory factor-3 and inhibits its transcriptional activity. .

Genes Dev., v.1, n.12-13, 2061-2072Jul, 1998

ROUAS-FREISS, N.;GONCALVES, R.M.;MENIER, C.;DAUSSET, J.;CAROSELLA, E.D.

Direct evidence to support the role of HLA-G in protecting the fetus from maternal uterine

natural killer cytolysis. Proc Natl Acad Sci U S A,v. 94,n.21,p.11520-11525, 1997.

ROUAS-FREISS, N.;MOREAU, P.;FERRONE, S.;CAROSELLA, E.D. HLA-G Proteins in

Cancer: Do They Provide Tumor Cells withan Escape Mechanism? Cancer Res,v.65,p.22,

2005.

RUIZ MENDEZ, A.;.PASEIRO GARRIGA, M. A.;ESCALONA VELOZ, R.;MARCOS

CORZO, L. [Prevalence of malignant oral neoplasms in the Celia Sanchez Clinicosurgical

Hospital from 1982 to 1985]. Rev Cubana Estomatol, v.26, n.3, Jul-Sep, p.235-241, 1989.

SAND, L.;JALOULI, J.;LARSSON, P. A.;HIRSCH, J. M.Human papilloma viruses in oral

lesions. Anticancer Res, v.20, n.2B, Mar-Apr, p.1183-1188, 2000.

SANDERS, S. K.;GIBLIN, P. A.;KAVATHAS, P. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and

human histocompatibility leukocyte antigen G, a nonclassical major histocompatibility

complex class 1 molecule on cytotrophoblasts. J Exp Med, v.174, n.3, Sep 1, p.737-740,

1991.

SANGUINETTI, C.J.; DIAS NETO, E.; AND SIMPSON, A.J. Rapid silver staining and

recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques,v. 17,p.914-921,

1994.

SARANATH, D.;TANDLE, A. T.;TENI, T. R.;DEDHIA, P. M.;BORGES, A. M.;PARIKH,

D.;SANGHAVI, V.;MEHTA, A. R.p53 inactivation in chewing tobacco-induced oral cancers

and leukoplakias from India. Oral Oncol, v.35, n.3, May, p.242-250, 1999.

SATO, N.;NABETA, Y.;KONDO, H.;SAHARA, H.;HIROHASHI, Y.;KASHIWAGI,

K.;KANASEKI, T.;SATO, Y.;RONG, S.;HIRAI, I.;KAMIGUCHI, K.;TAMURA,

Y.;MATSUURA, A.;TAKAHASHI, S.;TORIGOE, T.;IKEDA, H. Human CD8 and CD4 T

cell epitopes of epithelial cancer antigens. Cancer Chemother Pharmacol,v.46,p.86-90,2000.

SCHEPMAN, K. P. V. M.;SMEELE, E.H.; VAN DER WAAL, L.E..Malignant

transformation of oral leukoplakia: a follow-up study of a hospital-based population of 166

patients with oral leukoplakia from The Netherlands. Oral Oncol.,v.34,p.270-275, 1998.

SCULLY, C.;FIELD, J. K.;TANZAWA, H.Genetic aberrations in oral or head and neck

squamous cell carcinoma (SCCHN): 1. Carcinogen metabolism, DNA repair and cell cycle

control. Oral Oncol, v.36, n.3, May, p.256-263, 2000.

SCULLY, C.; PORTER, S. ABC of oral health. Oral cancer. BMJ, v.321, n.7253, p.97-100,

2000.

SHAFER, W.G.; HINE, M.K.; LEVY, B.M. Tratado de Patologia Bucal. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, v.508, p.723-727,1987.

100

SCHNEIDER, A.; PAPENDICK, U.; GISSMANN, L.; DE VILLIERS E.M. I. . Interferon

treatment of human genital papillomavirusinfection: importance of viral type. Int. J.

Cancer,Vol.40, p.610-614, 1987.

SILVERMAN, S. J. G., M.; LOZADA, F. Leucoplasia, dysplasia, and malignant

transformation. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v.82, p.117,

1996.

SOARES, C. P.;BENATTI NETO, C.;FREGONEZI, P. A.;TERESA, D. B.;SANTOS, R.

T.;LONGATTO FILHO, A.;MAEDA, M. Y.Computer-assisted analysis of p53 and PCNA

expression in oral lesions infected with human papillomavirus. Anal Quant Cytol Histol,

v.25, n.1, p.19-24, 2003.

SOARES, C.P.;DOS REIS, R.I.;KIMURA, S.S.;TERESA, D.B.;NETO, C.B.;LONGATTO-

FILHO, A.;MAEDA, M.Y.S.;SANTOS, R.T.M.

Papilomavírus humano (HPV) em lesões benignas e malignas de mucosa oral pelos métodos

de hibridização in situ e imunohistoquímica. Rev. Cienc. Farm., v.23. 2002.

SOARES, C. P.;MALAVAZI, I.;DOS REIS, R. I.;NEVES, K. A.;ZUANON, J. A.;BENATTI

NETO, C.;SPOLIDORIO, L. C.;DE OLIVEIRA, M. R. [Presence of human papillomavirus in

malignant oral lesions]. Rev Soc Bras Med Trop, v.35, n.5, Sep-Oct, p.439-444. 2002.

STUBENRAUCH, F.; LAIMINS L.A. Human papillomavirus life cycle: active and latent

phases. Semin Cancer Biol, v.9, n.6, Jul-Aug; p.379-386, 1999.

101

SUGAMURA, K.;ASAO, H.;KONDO, M.;TANAKA, N.;ISHII, N.;NAKAMURA,

M.;TAKESHITA, T.The common gamma-chain for multiple cytokine receptors. Adv

Immunol, v.59, p.225-277, 1995.

SUGIYAMA, M.;BHAWAL, U. K.;DOHMEN, T.;ONO, S.;MIYAUCHI, M.;ISHIKAWA,

T. Detection of human papillomavirus-16 and HPV-18 DNA in normal, dysplastic, and

malignant oral epithelium. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, v.95, n.5,

May, p.594-600, 2003.

SYRJANEN, F. C. T., A.; SYRJANEN, K. Tumorigenesis associated with p53 tumor

suppressor gene. Br. J. Cancer, v..68, p.653-661, 1993.

SYRJANEN, S. M. E SYRJANEN, K. J.. New concepts on the role of human papillomavirus

in cell cycle regulation. Ann Med, v.31, n.3, Jun, p.175-87, 1999.

TANAKA, M.;NISHIZAWA, M.;INUZUKA, T.;BABA, H.;SATO, S.;MIYATAKE, T.

Human natural killer cell activity is reduced by treatment of anti-myelin-associated

glycoprotein (MAG) monoclonal mouse IgM antibody and complement. J Neuroimmunol,

v.10, n.2, Dec, p.115-127, 1985.

TINDLE, R. W. Immune evasion in human papillomavirus-associated cervical cancer. Nat

Rev Cancer, v.2, n.1, Jan, p.59-65,2002.

102

TOMMASINO, M. E CRAWFORD, L.. Human papillomavirus E6 and E7: proteins which

deregulate the cell cycle. Bioessays, v.17, n.6, Jun, p.509-518,1995.

TRIPATHI, P.;AGRAWAL, S.Non-classical HLA-G antigen and its role in the cancer

progression. Cancer Invest,v.24,n.2,p.178-186, 2006.

UNG, A.;KRAMER, T. R.;SCHIFFMAN, M.;HERRERO, R.;BRATTI, M.

C.;BURK,R.D.SWANSON, C. A.;SHERMAN, M. E.;HUTCHINSON, M. L.;ALFARO,

M.;MORALES, J.;BALMACEDA, I.;HILDESHEIM. ASoluble interleukin 2 receptor levels

and cervical neoplasia: results from a population-based case-control study in Costa Rica.

Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, v.8, n.3, Mar, p.249-253. 1999.

UROSEVIC, M.;DUMMER, R. HLA-G and IL-10 expression in human cancer-different

stories with the same message. Semin Cancer Biol.13(5):337-42, 2003.

VAN DER WAAL, I.; AXELL, T. Oral leukoplakia: a proposal for uniform reporting. Oral

Oncol. Sep; v.38,n.6,p.521-526, 2002.

VAN DER WAAL, I.;SCHEPMAN, K. P.;VAN DER MEIJ, E. H.A modified classification

and staging system for oral leukoplakia. Oral Oncol, v.36, n.3, May, p.264-266, 2000.

VAN DER WAAL, I. S.; VAN DER MEIJ K. P, E. H.,SMEELE, L. E. Oral leukoplakia: a

clinicopathological review. Oral Oncol, v.33, n.5, Sep, p.291-301, 1997.

WALKER, D. M.;BOEY, G.;MCDONALD, L. A. The pathology of oral cancer. Pathology,

v.35, n.5, Oct, p.376-83, 2003.

103

WALBOOMERS, J.M.; JACOBS, M.V.; MANOS M.M.; BOSCH F.X., J.A.; KUMMER,

SHAH, K.V.; SNIJDERS, P.J.; PETO, J.; MEIJER, C.J.; AND MUNOZ, N.Human

papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide [see comments]. J

Pathol, v.189,p.12-19, 1999

WANG, S. S.;SCHIFFMAN, M.;SHIELDS, T. S.;HERRERO, R.;HILDESHEIM,

A.;BRATTI, M. C.;SHERMAN, M. E.;RODRIGUEZ, A. C.;CASTLE, P. E.;MORALES,

J.;ALFARO, M.;WRIGHT, T.;CHEN, S.;CLAYMAN, B.;BURK, R. D.;VISCIDI, R. P.

Seroprevalence of human papillomavirus-16, -18, -31, and -45 in a population-based cohort of

10000 women in Costa Rica. Br J Cancer, v.89, n.7, Oct 6, p.1248-1254, 2003.

WANG, S.;CHEN, L. T lymphocyte co-signaling pathways of the B7-CD28 family. Cell Mol

Immunol,v. 1,n.1,p.37-42, 2004.

WARRENS-LECHLER. Mechanisms of HLA and disease associations. In: R. L. A. Warrens

(Ed.). HLA in Health and Disease. San Diego: Academic Press, 2000. Mechanisms of HLA

and disease associations, p.139-146

WILCZYNSKI, J.R. Cancer and pregnancy share similar mechanisms of immunological

escape. Chemotherapy, v.52,n.3,p107-110, 2006.

WHO. World Health Organization. WHO cancer control programme. 2004. Disponível em:

<http://www.who.int/cancer/en. Acesso em: 26/06/2006

WUNSCH-FILHO, V. The epidemiology of oral and pharynx cancer in Brazil. Oral Oncol,

v.38, n.8, Dec, p.737-746, 2002.

104

XAVIER, S. D.;BUSSOLOTI FILHO, I.;LANCELLOTTI, C. L. Prevalence of histological

findings of human papillomavirus (HPV) in oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma

biopsies: preliminary study. Rev Bras Otorrinolaringol (Engl Ed), v.71, n.4, Jul-Aug, p.510-

514. 2005.

ZHENG, Z. M.;BAKER, C. C. Papillomavirus genome structure, expression, and post-

transcriptional regulation. Front Biosci, v.11, p.2286-2302, 2006.

ZUR HAUSEN, H. Roots and perspectives of contemporary papillomavirus research. J

Cancer Res Clin Oncol, v.122, n.1, p.3-13, 1996.

ZUR HAUSEN, H. Papillomaviruses causing cancer: evasion from host-cell control in early

events in carcinogenesis. J Natl Cancer Inst, v.92, n.9, May 3, p.690-698, 2000.

ZUR HAUSEN, H. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application.

Nat Rev Cancer, v.2, n.5, May, p.342-350, 2002.

105

ANEXO 1

106

QUANTITATIVE EXPRESSION OF NONCLASSIC HLA CLASS I MOLECULES,

HLA-G AND HLA-E, RELATED TO HPV-INFECTED ORAL LESIONS.

Paula Andrea Gabrielli Fregonezi

, Renata Toscano Simões

, Philipe Moreau

, Edgardo D

Carosella

, Carla Patrícia Martinelli Kläy

, Maria Alice Guimarães Gonçalves

, Edson Garcia

Soares

, Francisco Souto

, Eduardo Antonio Donadi

, Christiane Pienna Soares

Department of Clinical Analyses, School of Pharmaceutical Sciences of Araraquara,

UNESP, University of São Paulo State, Araraquara, São Paulo, Brazil.

Division of Clinical Immunology, Department of Medicine, School of Medicine of Ribeirão

Preto, São Paulo University (USP), Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil.

CEA, Service de Recherche en Hémato-Immunologie, DSV/DRM, Hospital Saint Louis,

Institut Universitaire d´Hématologie, 1 avenue Claude Vellefaux, 75010 Paris (France).

Department of Pathology, School of Medicine of Ribeirão Preto, São Paulo University

(USP), Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil.

Department of Internal Medicine, Federal University of Mato Grosso, Cuiabá, Mato Grosso,

Brazil. Av. Fernando Corrêa, s/n zip code 78 060900, Cuiabá, Mato Grosso, Brazil.

Correspondence and reprint requests to: Christiane Pienna Soares, School of

Pharmaceutical Sciences of Araraquara, UNESP, University of São Paulo State. Rua

Expedicionários do Brasil, 1621, Centro, 14 801 902, Araraquara, São Paulo, Brazil. Tel: +55

16 33016554; Fax: +55 16 3301 6559.

107

ABSTRACT

The understanding of the interactions between HPV-infected and tumor cells of the host

immune system could led to the conclusion which strategies that cells might develop to evade

immune responses. The aim of the study was to verify if HLA-G and HLA-E overexpression

were related to oral carcinogenesis and HPV infection. Fifty-one oral biopsies were stratified

according to histological differentiation in benign lesion (hyperplasia and papilloma),

premalignant lesions (lichen planus and leukoplakia with displasia) and malignant (squamous

cell carcinoma). HLA-G and HLA-E expression were analysed by immunoperoxidase method

(LSAB, DAKO, Glostrup Denmark) and the expression was quantified by computer-assisted

image analysis equipament (Image Pro Plus, MD, USA). DNA HPV detection and typing was

performed by PCR technique, using specific primer sequence to HPV 6, 11, 16, 18, 31 and 33.

HLA-G over expression was observed in benign oral lesions (p < 0.01) and progressively

decreased in premalignant to malignant oral lesions. No significant difference (P = 0.9024)

was observed in HLA-E expression in benign, premalignant and malignant lesions. Twenty-

five (49%) out of 51 oral lesions were HPV positive, of which 13 (52%) presented high HLA-

G expression and 7 (28%) with HLA-E overexpression. Pearson correlation between HLA-G

and HLA-E in oral biopsies HPV-infected demonstrated an inverse correlation (r = - 0.3944,

p< 0.05), indicating the HLA-G overexpression and HLA-E low expression in oral lesions

infected with HPV. Conclusion: HPV infection seems to be related to up-regulation of HLA-

G genes, resulting in overexpression of HLA-G protein and apparently resulting in immune

response evasion of HPV-infected oral lesion and might contribute to HPV persistent

infection and carcinogenesis.

Key Words: HLA-G, HLA-E, HPV, oral cancer, immune response.

INTRODUCTION

Immune response against virus-infected and/or tumor cells is dependent of classical

Major Histocompatibility Complex (MHC) molecules, HLA class I and II, T cell and Natural

108

Killer Cell (NK) responses. In early stages of oral cancer development, cellular or Th1 branch

of immune response is triggered while in poorly differentiated tumors and with metastasis, the

immune response is polarized to Th2 response (AGARWAL et al, 2003). Non-classical HLA

molecules, HLA-G and HLA-E are usually expressed in extravillous cytotrophoblast cells

and, together with the absence or low expression of classical HLA class I molecules, prevents

the attack of natural killer (NK) and cytotoxic T cells, respectively, protecting the semi-

allogenic fetus from maternal rejection (ROUAS-FREISS, 1997). Aberrant expression of non-

classical molecules could represent a strategy to viral infection persistence and tumor

progression in cancer patients; previous studies verified aberrant HLA-G expression in virus-

infected and/or tumor cells (HANSEL et al., 2005; LAFON et al., 2005). A similar

mechanism has been proposed to HLA-E molecule, although little information is available

about the cell surface expression of HLA-E in human tumors. To reach the cell surface, HLA-

E needs to bind to a leader peptide derived from HLA class I molecules, and the groove of

HLA-E presents the highest affinity for the HLA-G leader peptide (RODGERS and COOK,

2005). Down-regulation of HLA class I seems to impair HLA-E to be delivered to

cytoplasmatic membrane, allowing the virus and/or tumor cells to also escape NK immune

surveillance (FORTE et al., 2005). In addition to down-regulation of HLA class I expression,

IL-10 seems to be one of the responsible factors for the up-regulation of HLA-G and HLA-E

itself it is possible promotes of Th2-skewing state and the production of IL-10, establishing a

vicious circle of immune abrogation in cancer (UROSEVIC and DUMMER, 2003).

To evaluate the possible associations between HLA non-classical (G and E) molecules

and cancer, as well as virus-infected cells, we assessed the expression of these molecules in

oral biopsies stratified according to the severity of the lesion and the HPV infection.

109

MATERIAL AND METHODS

Specimens

Fifty-one formalin-fixed and paraffin-embedded oral biopsies were selected from the

Department of Pathology, School of Medicine of Ribeirão Preto, São Paulo University (USP)

archives, between 1992 and 2005, and their use was approved by the Brazilian Institutional

Ethical Committee on Human Experimentation. Tumor grades were evaluated histologically

by experienced pathologists in tissues stained with hematoxylin and eosin and all the samples

were graded according to the criteria recently proposed by VAN DER WAAL e AXÉLL,

(2002). The oral biopsies were stratified according to histological differentiation in benign

lesion (hyperplasia and papilloma), premalignant lesions (lichen planus and leukoplakia with

and without dysplasia) and malignant (squamous cell carcinoma). Of the 51 oral lesions, 14

(27%) out of were diagnosed as oral hyperplasia (OH), 4 (8%) were oral squamous papilloma

(OSP). Out of 16 premalignant oral lesions, 5 (10%) were oral lichen planus, 11 (22%) were

oral leukoplakia without and with dysplasia (mild to severe). In malignant group, 17 (33%)

were oral squamous cell carcinoma. (OSCC).

Immunohistochemistry for HLA-G and HLA-E

The sections were dewaxed in hot xylene (100 ºC) for 10 a 20 seconds, followed by

three consecutive xilol baths (room temperature), rehydrated in graded alcohol ethanol (90%,

70% and 50%) and rinsed several times in distilled water. For antigen retrieval, the sections

were immersed in 10 mM sodium citrate (C

) buffer,

pH 6.0, and submitted to steam

heating for 40 minutes, at 95 ºC. The sections were cooled at room temperature and were

immersed in 2 changes of aqueous hydrogen peroxide 3% and methanol (v/v), for 15 min each

change. The sections were rinsed with three consecutive PBS baths, for 5 minutes each one.

110

To unspecific blockage, the sections were incubated with skim milk 1%, for 30 minutes, and

rinsed in distilled water. HLA-G and HLA-E expression were immunohistochemically

assayed by immunoperoxidase method (LSAB, DAKO, Glostrup Denmark). The sections

were incubated with primary monoclonal antibody raised against HLA-G, (diluted 1:500;

clone 87G which recognizes both membrane-bound and soluble forms of HLA-G - HLA-G1

and HLA-G5) and HLA-E (diluted 1: 1000, clone MEM-E/02 specifically reacts with

denaturated heavy chain of human HLA-E). Both primary antibodies were kindly provided by

Dr Edgardo D Carosella, from Service de Recherche en Hémato-Immunologie, Hôpital Saint

Louis, Institut Universitaire d´Hématologie, Paris, France. The slides were placed in a

humidified chamber, at room temperature, overnight. After incubation with primary

antibodies, immunoperoxidase staining was performed using biotinylated secondary antibody

and streptavidin-peroxidase complex (LSAB, DAKO), at 37°C for 30 minutes, in accordance

with the manufacturer’s instructions. Between each stage of the above procedure, the sections

were carefully rinsed with 3 times changes of 1M phosphate-saline buffered (KH

PBS).

Subsequently, the sections were incubated in solution containing 60mg of diaminobenzidine

(GIBBICO, Gaithersburg, Maryland, USA), dissolved in 100ml of PBS and 2ml of peroxidase

6%, followed by distilled water rinses. After that, the sections were counterstained with

Carrazzi’s hematoxylin for 1 minute, following several rinses with distilled water. The

sections were dehydrated in three absolute alcohol changes, followed by two immersion

changes in xilol, allowed to dry air and assembled on Permount mounting medium (MERCK,

Darmstadt, Germany). Two controls were included for each section: positive and negative.

The positive control was a section of human extravillous cytotrophoblast. The negative

control was also human extravillous cytotrophoblast, in which the primary antibody was

omitted from the assay and replaced by PBS.

111

HLA-G and HLA-E image analysis quantification

Cytoplasm and plasmatic membrane (HLA-G) and cytoplasmic membrane (HLA-E)

were automatically quantified by a computer-assisted system (Image-Pro Plus - Cybernetics,

MD, USA), which includes a microscope, a digital camera and a software package. A mean of

eight to ten random microscope fields was selected in order to analyze 1000 labeled nuclei per

biopsy in all patients. The image acquisition of 51-oral-lesion sections was performed on an

electronic photomicrograph and the image was processed and analyzed by the software. For

each slide, the digitalized image segmentation was controlled interactively through the RGB

color filter existent in the software program. The automatic count of positive nuclei was

established and expressed as percentage and the classification of HLA-G and HLA-E

immunohistochemistry expression was modified from PALMISANO et al. (2002): HLA-G

and HLA-E expression was classified as negative when cytoplasm membrane labelling was

absent to ≤ 25%, while the expression was considered positive when > 25 to 100% of the

cells were labelled.

HPV detection and typing.

Genomic DNA was obtained from 2 sections paraffin blocks (10µm each), according

to modified protocol proposed by BETTINI et al.( 2003) amplified by PCR using the primers

GP5+ and GP6+ (MANOS et al.,1989), which amplify a 150 bp DNA fragment, was used for

generic HPV amplification. The amplification was made together with a set of primers for a

beta globin (PCO3 and PCO4) gene (PCO3+ CTT CTG ACA CAA CTG TGT TCA CTA GC

e PCO4+ TCA CCA CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC), as an internal control of

amplification. The generic HPV positive samples were amplified with specific primers for

112

HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV6 and HPV11 how described by WALBOOMERS et

al.,( 1999).

The amplification procedure for HPV detection and typing was carried out using a

final volume of 25 µl. The reaction mixture included 20 ng of genomic DNA, 0.20 mM

deoxynucleoside triphosphate (Pharmacia, Uppsala, Sweden), 0.6 µM of each primer (IDT,

IA, USA), 1.25 U Taq polymerase (Invitrogen, Brazil), 3 mM MgCl2, and 1x buffer

(Invitrogen, Brazil). The cycling conditions to almost all generic and HPV types consisted of

an initial denaturation step of 94°C for 5 min, followed by 35 cycles of 94°C for 1 min, 55°C

for 1 min, and 72°C for 1 min and a final extension cycle of 72°C for 10 min. For

amplification HPV11 was used an annealing temperature of 60°C. PCR products were

separated by 10% nondenaturing polyacrylamide gels followed by a silver staining procedure

how described by SANGUINETTI et al. (1994).

Statistical Analysis

To the association between HLA-G and HLA-E in oral lesions, Chi-squared test for

Independence was used, considering a contingency table higher than 2 X 2. HLA- G and

HLA-E expression versus oral lesions. The statistical test to compare –G and –E molecules

and the presence of HPV infection was Fisher’s exact test. Since the data met the assumptions

for parametric tests, variance One Way ANOVA with Bonferroni’s postest to multiple

comparison was applied to compare quantitative analysis of HLA-G and –E in association

with oral lesions stratified according to histological diagnosis. Pearson correlation test was

performed to compare quantitative expression of HLA-G and HLA-E in oral lesions infected

with HPV. P values were two-sided and the level of significance was set at ≤ 0.05. All data

was analysed using the GraphPad Instant software, San Diego, CA, USA).

113

RESULTS

The results of HLA-G and HLA-E quantitative immunohistochemistry expression in

oral biopsies infected with HPV are demonstrated in Table 1 and 2, as well as Figures 1 to 3.

Table 1 shows the detection of HPV DNA in oral lesions, stratified according to

histological diagnosis. Out of 51 oral lesions 24 (47%) were infected with HPV, 11 (58%) out

of 18 benign lesions, 8 (47%) out of 16 premalignant lesions and 5 (28%) out of 17 oral

squamous cell carcinoma (OSCC). Among benign lesions infected with HPV, 8 (44%) were

diagnosed as oral hyperplasia, being 5 (42%) infected with HPV18, 1 (8%) with HPV11 and 1

(8%) HPV type not identified (NI) with the set of primers proposed in the present study. In

addition, out of 18 benign lesions HPV-infected, 3 (17%) were oral squamous papilloma,

being 2 (11%) HPV18/31/6 and 1 (6%) was NI. In premalignant group HPV-infected, 4

(25%) out of 16 were lichen planus, which 1 (6%) was HPV18, 1 (6%) HPV18/6 and 1 (6%)

HPV was not identified. Moreover, among premalignant oral lesions, 4 (25%) were

leukoplakia with severe dysplasia. In leukoplakia with dysplasia, 2 (13%) was HPV18, 1 (8%)

and 2 (13%) HPV type not identified. Finally, among OSCC infected with HPV, 2 (12%) out

of 17 were HPV18, 1 (6%) HPV31/6, 1 (6%) HPV18/31/6 and 1 (6%) HPV type not

identified. HPV16 was not found in any oral lesions evaluated in the present study.

In Table 2 and Figure 1 to 3 are demonstrated HLA-G and HLA-E quantitative

immunohistochemistry expression in comparison to oral lesions groups. HLA-G and HLA-E

expression were stratified in high expression of both molecules (G+/E+), high and low

expression (G+/E- or G-/E+) and low expression of HLA-G and HLA-E (G-/E-). Table 2

demonstrates deregulation of HLA-G and HLA-E (G+/E+, G+/E- and G-/E+), mainly verified

in benign and premalignant lesions of oral lesions and was not frequently found in OSCC

(Table 2, P = 0.007). The close association was observed between oral lesions HPV-infected

114

and HLA-G and HLA-E deregulation (P = 0.0025). The deregulation of non classical

molecules was verified with more frequency in oral lesions infected with HPV18 than oral

lesions presenting infection with two or three HPV types. The quantitative evaluation of

HLA-G and HLA-E expression (Figure 1), demonstrates that the high expression of HLA-G

was predominantly in benign lesions and steadly decreasing in premalignant and malignant

oral lesions (P=0.0196). In contrast, no difference was observed in HLA-E and oral lesions

from benign, premalignant and malignant groups. Interestingly, an inverse correlation (Figure

2; r = - 0.3944; P = 0.0462.) was observed between high HLA-G expression and low HLA-E

expression in oral lesions HPV-infected, might indicate that HLA-G and HLA-E deregulation

could be related to HPV infection more than cellular atypia or cancer.

Table 1 –HPV DNA detection in 51 patients with oral lesions stratified according to

histological diagnosis in benign (Hyperplasia and papilloma), premalignant (lichen planus,

leukoplakia with and without dysplasia) and malignant (OSCC).

HPV Positive

HPV Negative HPV11

HPV18

HPV18/31/6

HPV18/6

n (%) n (%) n (%) n (%)

n (%) N (%) n (%)

Benign (n=18) 11(58) 7 (37) 1 (5) 5 (26) 2 (11) 0 3 (16)

Premalignant (n=16)

8 (47) 8 (47) 0 4 (24) 0 1 (6) 3 (18)

Malignant (n=17) 5 (28) 12 (67) 0 2 (11) 2 (11) 0 1 (6)

Total 24(47) 27 (53) 1 (4) 11 (46)

4 (17) 1 (4) 7 (29)

NI = HVP type not identified; OSCC = oral squamous cell carcinoma.

115

Table 2 – HLA-G and HLA-E quantitative immunohistochemistry expression in 51 patients

with oral lesions stratified according to histological diagnosis in benign (Hyperplasia and

papilloma), premalignant (lichen planus, leukoplakia with and without dysplasia) and

malignant (OSCC).

G(+)/E(+) G(-)/E(-) G(+)/ E(-) G(-)/E(+) Total

n (%) n (%) n (%) n (%) n

Benign

(

4 (21) 2 (11) 10 (53) 2 (11) 18

Premalignant 1 (12) 1 (6) 8 (47) 6 (35) 16

Malignant 3 (17) 8 (44) 4 (22) 2 (11) 17

Total n(%) 8 (16) 11 (22) 22 (43%) 10 (20) 51

HPV Positive

(

5(21) 0 14(58) 5(21) 24

HPV Negative 3(11) 11(41) 8(30) 5(19) 27

HPV 11 0 0 1(100) 0 1

HPV18 4(36) 0 4(36) 3 (36) 11

HPV18/31/6 0 0 4(100) 0 4

HPV18/6 0 0 1 (100) 0 1

NI 1(14) 0 5 (71) 1(14) 7

HLA-G(+) and HLA-E(+) = ≥ 25% of cells labelled, HLA-G (-) and HLA-E(-) = <25% of

cells labelled. OSCC = oral squamous cell carcinoma.

(a)

HLA- G and HLA-E expression versus oral lesions. Chi-squared test for Independence, P =

0.007;

(b)

HLA- G and HLA-E expression versus HPV infection. Fisher’s Exact Test, P = 0.0025.

116

Figure 1 – Quantitative expression of non-classical molecules (HLA-G e HLA-E) in 51 oral

lesions classified in benign (hyperplasia and papilloma), prémalignant (lichen planus and

leucoplakia) and malignant (oral squamous cell carcinoma). A) Quantitative expression of

HLA-G, one way ANOVA (P=0.0196) with Bonferroni’s multiple comparison postest (*)

benigna versus maligna; p<0.05. B) Quantitative expression of HLA-E, one way ANOVA (P

= 0.9024).

Benign

Premalignant

Malignant

HLA-E (%)

Benign

Premalignant

Malignant

HLA-G (%)

117

Figure 2 – Pearson correlation between HLA-G and HLA-E immunohistochemistry

expression in oral lesions HPV- infected. r = - 0.3944; P = 0.0462.

0 20 40 60 80 100

100

HLA-G (%)

HLA-E (%)

r = - 0.3944; p=0.046

118

Figure 3 – Oral lesions HPV-infected presenting HLA-G and HLA-E immunolabelling in

cytoplasmatic membrane and cytosol (arrows). A) HLA-G expression in oral hyperplasia

showing intense cytoplasmatic immunolabellinga; B) HLA-G expression in oral leukoplakia

without dysplasia, showing moderate intensity of immunolabelling; C) HLA-G expression in

oral squamous cell carcinoma showing intense cytoplasmatic immunolabelling; D), E) and F)

HLA-E expression showing discret to moderate immunolabelling in, respectively, oral

hyperlasia leukoplakia without dysplasia and oral squamous cell carcinoma. Scale bars equals

to 25mm.

119

DISCUSSION

HPV has been found in oral lesions, being considered a risk factor to oral

carcinogenesis by disrupting cellular control and, in almost all cases, virus infection is cleared

followed by activation of the host immune response. However, occasionally the lesions do not

regress and malignant progression of the disease can follow under appropriated environmental

conditions. Persistent viral infection seems to be required for neoplastic progression and

failure of virus clearence is attributed to a poor immunological response. (O’BRIEN and

CAMPO, 2002).

Despite the fact that trophoblasts and cancer are both immunogenic, they are able to

escape from host immunosurveillance, and the precise mechanisms involved in this process

are surprisingly similar in both situations (WILCZYNSKI, 2006). In the present study we

found high HLA-G and low HLA-E expression in benign, decreasing in premalignant and

OSCC oral lesions. Moreover, HLA-G high expression was closed associated with the

presence of HPV DNA. It does not seem to surprise that benign and premalignant oral lesions

which presented high HLA-G levels, also presented more frequency of the HPV infection.

HLA-G, which has been found to have immunosuppressive and immunomodulatory

roles in the cancer development (TRIPATHI e AGRAWAL, 2006). As HLA-G can inhibit the

functions of T and NK cells high concentration of these molecules, should systemically or at

the tumor site reduce the immune surveillance and thus favour the progression of cancer.

HLA-G is responsible for the escape of tumor cells from NK lysis, interacting directly with

inhibitor receptors like killing immunoglobulin-like receptors (KIRs) or indirectly by

stabilising the surface expression of HLA-E molecules. In vitro, the HLA-G tumor cells

strongly enhance by TH1 cytokines like IFN- gamma whereas TH2 cytokines (e.g. IL-4, IL-

10) had minor effects (REBMANN et al., 2003; ROUAS-FREISS et al., 2005). CD4+ T cells

secrete IL-10 in response to virus capsid protein presented by dendritic cells, and deviate

120

CD8+ T cells responding to a linked MHC class I-restricted epitope to reduce IFN-gamma

production, resulting in low response of CD8 T cells against virus-infected tumor cells (LIU

et al, 2006). We found an inverse correlation between high HLA-G expression and low HLA-

E in the majority of the oral lesions infected with HPV. Up-regulation of HLA-G allows the

stabilization of HLA-E in cell surface and may be potentializing immunosuppressive response

(ROUAS-FREISS et al., 2005). However, cumulative genetic and molecular changes in tumor

cells lead to the appearance of HLA-E in a limited number of tumor cell lines, related to HLA

class I down-regulation or mutation in subunits of class I subunits (MARIN et al., 2003).

Recent study demonstrated that HLA-E expression at the cell surface of melanoma cells

decreased their susceptibility to CTL lysis (DERRE et al., 2006). In our study, HPV virus

was present more frequently in oral lesions with high expression of both non-classical

molecules (G+/E+) and in different level expression with HLA-G high and HLA-E low

(G+/E-) or HLA-G low and HLA-E high (G-/E+). HLA-E high expression was observed in

few oral biopsies, some infected with HPV. The aberrant HLA-E expression might be of

particular biological relevance in those HLA tumor phenotypes that express a single HLA-A

allele when NK inhibition is markedly reduced due to the down-regulation of HLA-B and -C

alleles (ALGARRA et al., 2004). We can conclude that aberrant HLA-G and low or absence

of HLA-E expression is closed associated to oral proliferative and malignant oral HPV-

related, suggesting that different levels of both non-classical molecules could be a strategy of

HPV to escape from immunosurveillance mediated by NK and CTLs lysis.

ACKNOWLEDGEMENTS

The present study was financially supported by CAPES, a Brazilian research funding

organization. We wish to thank Ana Maria Rocha for excellent technical assistance.

121

REFERENCES

AGARWAL, A.; RANI, M.; SAHA, G. K.; VALARMATHI, T. M.; BAHADUR, S.;

MOHANTI, B. K.; DAS, S. N.Disregulated expression of the Th2 cytokine gene in patients

with intraoral squamous cell carcinoma. Immunol Invest, v.32, n.1-2, Feb, p.17-30. 2003.

ALGARRA, I.; GARCIA-LORA, A.; CABRERA, T.; RUIZ-CABELLO, F.; GARRIDO, F.

The selection of tumor variants with altered expression of classical and nonclassical MHC

class I molecules: implications for tumor immune escape. Cancer Immunol Immunother.

v.53, n.10, p.904-1010, 2004.

DERRE, L.;CORVAISIER, M.;CHARREAU, B.;MOREAU, A.;GODEFROY, E.;

MOREAU-AUBRY, A.;JOTEREAU, F.;GERVOIS N.; Expression and release of HLA-E by

melanoma cells and melanocytes: potential impact on the response of cytotoxic effector cells.

J Immunol.,v.177,n.5,p.3100-3107, 2006.

FORTE, P.;BAUMANN, B.C;WEISS, E.H.; SEEBACH, J.D.HLA-E expression on porcine

cells: protection from human NK cytotoxicity depends on peptide loading. Am J Transplant.

5(9):2085-93, 2005.

HANSEL, D.E.;RAHMAN, A.;WILENTZ, R.E.;SHIH, I.E.M.;MCMASTER, M.T.;YEO,

C.J.;MAITRA, A. HLA-G upregulation in pre-malignant and malignant lesions of the

gastrointestinal tract. Int J Gastrointest Cancer.v.35,n.1,p.15-23,2005.

LAFON, M.;PREHAUD, C.;MEGRET, F.;LAFAGE, M.;MOUILLOT, G.;ROA

M,MOREAU, P.;ROUAS-FREISS, N.;CAROSELLA, E.D.Modulation of HLA-G expression

in human neural cells after neurotropic viral infections. J Virol. v.79,n.4,p.226-237,2005.

122

LIU, X.S.;DYER , J.;LEGGATT,G.R.;FERNANDO,G.J.;ZHONG, J.;THOMAS ,

R.;FRAZER,I.H.Overcoming original antigenic sin to generate new CD8 T cell IFN-gamma

responses in an antigen-experienced host. J Immunol. v.77,n.5,p.2873-2879,2006.

MARIN,R.;RUIZCABELLO,F.;PEDRINACI,S.;MENDEZ,R.;JIMENEZ,P.;GERAGHTY,D.

E.;GARRIDO,F.Analysis of HLA-E expression in human tumors. Immunogenetics.

v.54,n11,p.767-775,2003.

REBMANN, V.; REGEL, J.; STOLKE, D.; GROSSE-WILDE, H. Secretion of sHLA-G

molecules in malignancies. Semin Cancer Biol. Oct;v.3,n.5,p.371-377,2003

RODGERS JR, COOK RG. MHC class Ib molecules bridge innate and acquired immunity.

Nat Rev Immunol. 5(6):459-71, 2005.

ROUAS-FREISS, N.;GONCALVES, R.M.;MENIER, C.;DAUSSET, J.;CAROSELLA, E.D.

Direct evidence to support the role of HLA-G in protecting the fetus from maternal uterine

natural killer cytolysis. Proc Natl Acad Sci U S A,v. 94,n.21,p.11520-11525, 1997.

ROUAS-FREISS, N.;MOREAU, P.;FERRONE, S.;CAROSELLA, E.D. HLA-G Proteins in

Cancer: Do They Provide Tumor Cells withan Escape Mechanism? Cancer Res,v.65,p.22,

2005.

TRIPATHI, P.;AGRAWAL, S.Non-classical HLA-G antigen and its role in the cancer

progression. Cancer Invest,v.24,n.2,p.178-186, 2006.

UROSEVIC M, DUMMER R. HLA-G and IL-10 expression in human cancer-different

stories with the same message. Semin Cancer Biol.13(5):337-42, 2003.

123

WILCZYNSKI JR. Cancer and pregnancy share similar mechanisms of immunological

escape. Chemotherapy; 52(3):107-10. 2006.

124

ANEXO 2

125

CD4, CD25 AND CD28 QUANTITATIVE EXPRESSION IN ORAL LESIONS

INFECTED WITH THE HUMAN PAPILLOMAVIRUS

Paula Andrea Gabrielli Fregonezi

, Renata Toscano Simões

, Renata Casellato Mazon

Edson Garcia Soares

, Carla Patrícia Martinelli Kläy

, Eduardo Antonio Donadi

, Christiane

Pienna Soares

Department of Clinical Analyses, School of Pharmaceutical Sciences of Araraquara,

UNESP, University of São Paulo State, Araraquara, São Paulo, Brazil.

Division of Clinical Immunology, Department of Medicine, School of Medicine of Ribeirão

Preto, University of São Paulo (USP), Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil

Department of Pathology, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo

(USP), Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil.

Correspondence and reprint requests to: Christiane Pienna Soares, School of

Pharmaceutical Sciences of Araraquara, UNESP, University of São Paulo State. Rua

Expedicionarios do Brasil, 1621, Centro, 14 801 902, Araraquara, São Paulo, Brazil.Tel: +55

16 33016554; Fax: +55 16 3301 6559.

126

ABSTRACT

The central role of T cells in antitumor immunity is well established. However, tumor

progression, often frequent by seen in the presence of substantial lymphocytic infiltration,

suggests that these cells are not capable of mounting an effective immune response to

modulate proliferative activity of benign cells and neither to modulate tumor growth.

Considering that HPV infection could deregulate the host immune response, permitting the

persistence of viral infection as well as contributing to malignant cell transformation, the

present study aimed to investigate tissue expression of T cell receptors CD4, CD25 and CD28

in lymphocyte infiltrate of oral lesions HPV-infected. Seventy-nine formalin-fixed and

paraffin-embedded oral biopsies were retrospectively selected and CD4, CD25 and CD28

immunoperoxidase expression were quantitatively evaluated by computer-assisted image

analyze method. Out of 79 oral lesions 30 (38%) were infected with HPV and 49 (62%) were

not infected, being mainly found HPV18, followed by HPV18/31/6, HPV31/6 and HPV6/11.

Thus, 2 HPV types (HPV31/6, n=2) or 3 types (HPV18/31/6, n=5). Downregulation of

CD4/CD25 and CD25/CD28 (P=0.037) was observed in malignant oral lesions and in all oral

lesions groups HPV-infected. The analysis of the T cell receptors individually, evaluated in

comparison with histological grades, demonstrated lower expression of CD4 and higher

expression of CD28 was observed in malignant oral lesions, when compared with benign

lesions (P=0.005). In conclusion, the downregulation of T cell receptors seems to be a way to

HPV infections persistence, which could represent a risk factor to oral malignant cell

transformation.

Key Words: T cell, CD4, CD25, CD28, HPV and oral cancer.

127

INTRODUCTION

Despite the presence of lymphocyte infiltration at the tumor site, immune response is

apparently incapable of controlling tumor growth (LADANYI et al., 2004). Several potential

mechanisms may explain the lack of effectiveness of antitumor response, including

insufficient peptide presentation, production of immunesuppressive factors by cells in the

tumor microenvironment or lack of costimulatory response (KIESSLING et al., 1999).

Accumulated evidence has indicated that T lymphocytes infiltrating human neoplasm may be

functionally defective, incompletely activated or anergic (BECKER et al., 1993). High risk

human papillomavirus (HPV) types are strongly associated with HPV persistence and cancer

development, especially in the absence of a lymphoproliferative response against the virus

(TINDLE, 2002). Previous studies have demonstrated that HPV may subvert host immune

response, deregulating antigen presentation to cytotoxic T cells (ALCAMI, 2000). Besides,

tumor cell evasion from the immunological surveillance has been considered essential to

cancer development and progression. Human solid tumors are often infiltrated by

lymphocytes, mostly cytotoxic T cells, which are capable of specific lysis of autologous

tumor cells. In addition, tumor-specific CD4+ T cells could be isolated from lymphocytes

infiltrating human neoplasms, which may induce cytokine production that permits tumor cell

lysis (LOKE and ALLISON, 2004). The production of interleukin-2 (IL-2) and the expression

of the IL-2R (CD25) and costimulatory molecules like CD28 on CD4 T cells are important to

trigger cellular signals to T cell stimulation (WANG and CHEN, 2004). Considering that the

absence of CD28 and CD25 molecules on CD4 cells may prevent an efficient T cell immune

response against viral infection and tumor cells, the present work aimed to investigate the

quantitative expression of CD4, CD25 and CD28 molecules in oral lesions associated with

HPV-infection, stratified according to the severity of the lesion.

128

MATERIALS AND METHODS

Specimens

Seventy-nine formalin-fixed paraffin-embedded oral biopsies were selected from the

Department of Pathology archives, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São

Paulo (USP), between 1992 and 2005. The study was approved by the local Institutional

Ethics Committee on human experimentation. Tumor grade was histologically evaluated by

experienced pathologists in tissues stained with hematoxylin and eosin. Lesion severity was

classified according to the criteria recently proposed by Van der Waal and Axell, 2002. Oral

biopsy lesions were stratified according to the histological differentiation into benign

(hyperplasia and papilloma), premalignant (lichen planus and leukoplakia presenting or not

dysplasia) and malignant (squamous cell carcinoma). Of the 79 oral lesions, 19 (61%) out of

31 benign lesions were diagnosed as oral hyperplasia (OH), 12 (39%) were oral squamous

papilloma (OSP). Out of 25 premalignant oral lesions, 21 (84%) were oral leukoplakia

without and with dysplasia and 4(16%) were oral lichen planus. Out of 21 oral leukoplakia, 3

(14%) did not present dysplasia (LK) and 18 (86%) were diagnosed as leukoplakia with

displasia (DLK), 9 (43%) mild and 9 (43%) moderate to severe cellular atypia. In malignant

group, 24 (100%) were oral squamous cell carcinoma (OSCC).

Immunohistochemistry for CD4, CD25 and CD28

The sections were dewaxed in hot xylene (100 ºC) for 10 a 20 seconds, followed by

three consecutives xilol baths (room temperature), rehydrated in graded alcohol ( 90%, 70%

and 50%) and rinsed several times in distilled water. For antigen retrieval, the sections were

immersed in 1 mM EDTA buffer,

pH 8.0, and submitted to steam heating for 40 minutos, at

95 ºC. The sections were cooled at room temperature and were immersed in 2 changes of

aqueous hydrogen peroxide 3% and methanol (v/v), for 15 min each change. The sections

129

were rinsed with three consecutive PBS bath, for 5 minutos each one. To inespecific

blockage, the sections were incubated with skim milk 1%, for 30 minutes seguir, and rinsed

several times in distilled water. T cell receptors CD4, CD25 and CD28 expression, localized

at cytoplasmatic membrane, were immunohistochemically assayed by immunoperoxidase

method (LSAB, DAKO, and Glostrup Denmark). The sections were incubated with primary

monoclonal antibody raised against monoclonal antibodies anti-CD4 (diluted 1:60, Santa Cruz

Biotechnology, Newcastle, UK), anti-CD25 (diluted 1:300, Santa Cruz Biotechnology) and

anti-CD28 (diluted 1:300, Santa Cruz Biotechnology). The slides were incubated in a

humidified chamber, at room temperature, overnight. After incubation with primary

antibodies, immunoperoxidase staining was performed using biotinylated secondary antibody

and streptavidin-peroxidase complex (LSAB, DAKO), at 37°C for 30 minutes, in accordance

with the manufacturer’s instructions. After, the sections were carefully rinsed with 3 times

changes of 1M phospate-saline buffered (KH

PBS). Subsequently, the sections were

incubated in solution containing 60mg of diaminobenzidine (GIBICO, Gaithersburg,

Maryland, USA), dissolved in 100ml of PBS and 2ml of peroxidase 6%, and followed by

distilled water rinses. After that, the sections were counterstained with Carrazzi’s hematoxylin

for 1 minute, following several rinses with distilled water. The sections were dehydrated in

three absolute alcohol changes, followed by two immersion changes in xilol, allowed to air

dry and mounted on Permount mounting medium (MERCK, Darmstadt, Germany). Two

controls were included for each section: positive and negative. The positive control to CD25

and CD28 was sections of human tonsil while to CD4 were sections of human lymphonodes.

The negative control was the same sections used in positive control, in which the primary

antibody was omitted from the assay and replaced by PBS.

130

CD4, CD25 and CD28 image acquisition and computer assisted quantification

Cytoplasm membrane (CD4, CD25 and CD28) were automatically quantified by a

computer-assisted system (Image-Pro Plus - Cybernetics, MD, USA) which includes a

microscope, a digital camera and a software package. A mean of eight to ten random

microscope fields were selected in order to analyze 1000 cells with cytoplasmatic membrane

labelling per biopsy in 79 patients. The image acquisition of all oral lesions sections was

performed on an eletronic photomicrograph and the image was processed and analyzed by the

software. For each slide, the digitalized image segmentation was controlled interactively

through the RGB color filter existent in the software program. The automatic count of positive

cytoplasmatic membrane was established and expressed as percentage and the classification

of CD4, CD25 and CD28 immunohistochemistry expression was modified from

FEINMESSER et al., (2004) CD4, CD25 and CD28 expression was classified as negative

when cytoplasm membrane labelling was absent to ≤ 15% while the expression were

considered positive when > 15 to 100% of the cells were labelled.

HPV detection and typing.

Genomic DNA was obtained from 2 sections paraffin blocks (10µm each), acoording

to modified protocol proposed by (BETTINI et al., 2003) amplified by PCR using the primers

GP5+ and GP6+ (MANOS et al., 1989), which amplify a 150 bp DNA fragment, were used

for generic HPV amplification. The amplification was made together with a set of primers for

a beta globin (PCO3 and PCO4) gene (PCO3+ CTT CTG ACA CAA CTG TGT TCA CTA

GC e PCO4+ TCA CCA CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC). as an internal control of

amplification. The generic HPV positive samples was amplified with specific primers for

HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV6 and HPV11 how described to WALBOOMERS et

al., (1999).

131

The amplification procedure for HPV detection and typing was carried out using a

final volume of 25 µl. The reaction mixture included 20 ng of genomic DNA, 0.20 mM

deoxynucleoside triphosphate (Pharmacia, Uppsala, Sweden), 0.6 µM of each primer (IDT,

IA, USA), 1.25 U Taq polymerase (Invitrogen, Brazil), 3 mM MgCl2, and 1x buffer

(Invitrogen, Brazil). The cycling conditions to almost all generic and HPV types consisted of

an initial denaturation step of 94°C for 5 min, followed by 35 cycles of 94°C for 1 min, 55°C

for 1 min, and 72°C for 1 min and a final extension cycle of 72°C for 10 min. For

amplification HPV11 was use an annealing tempetrature of 60°C. PCR products were

separated by 10% nondenaturing polyacrylamide gels follow of a silver staining procedure

how described by SANGUINETTI et al, (2004).

Statistical Analysis

To the association between CD4, CD25 and CD28 expression and oral lesions groups,

stratified according histological diagnosis, as well as, the presence of HPV infection, Chi-

squared for independence test was used, considering a contingency table higher than 2 X 2.

HLA- G and HLA-E expression versus oral lesions. Since the data met the assumptions for

nonparametric tests, Kruskall Wallis test with Dunn’s postest to multiple comparison was

applied to compare quantitative analyse of CD4, CD25 and CD28 quantitative expression and

oral lesions grouped in benign, premalignant and malignant lesions. P values were two-sided

and the level of significance was set at ≤ 0.05. All data were analysed using the GraphPad

Instat software, San Diego, CA, USA).

132

RESULTS

Considering all oral lesions, HPV DNA was detected in 30 out of 79 (38%) specimens,

and in 12 out of 31 (40%) of benign lesions, 13 out of 25 (43%) premalignant lesions and in 5

out of 23 (17%) oral squamous cell carcinoma (OSCC). Among benign lesions infected with

HPV, 8 (67%) were diagnosed as oral hyperplasia, being 5 (42%) infected with HPV18 and 1

(8%) with HPV11. Among HPV-infected benign lesions, 4 out of 12 (33%) were oral

squamous papilloma, of whom 2 (17%) harbored a triplet HPV infection (HPV18/31/6) and in

2 (17%) the HPV type was not identified with the set of primers used in this study. In

premalignant HPV-infected lesions, 3 out of 13 (23%) were lichen planus, harboring HPV18,

HPV18/31/6 and an unidentified HPV type, respectively. Among premalignant lesions, 3

(23%) exhibited leukoplakia without dysplasia and 7 (54%) leukoplakia with mild to severe

dysplasia. Leukoplakia without dysplasia harbored HPV18, HPV18/31/6 and HPV31/6 (1

case each of). In contrast, in leukoplakia with dysplasia 1(8%) harbored HPV18, 2 (15%) the

triplet HPV18/31/6 and in 4 cases (31%) the HPV type was not identified. Finally, among

OSCC infected with HPV, 2 out of 5 (40%) were HPV18, 1HPV31/6 (20%), 1(20%)

HPV18/31/6 and 1(20%) the HPV type not identified. HPV16 was not found in oral lesions

evaluated in the present study (Table 1).

Although few macrophages and dendritic cells were labeled with CD4 and CD25, the

majority of cells labeled with these markers were lymphocytes (Figure 2). The comparisons of

the quantitative expression of CD4, CD25 and CD28 in oral lesions were performed

considering the expression of the three molecules, combinations of two molecules and single

ones, as shown in Table 2 and Figure 1. Overall, oral lesions exhibited low or absent

immunohistochemistry expression of these molecules (<15% of labeled cells). Considering

the expression of three molecules in the same patient, absence or low expression decreased

from benign to malignant lesions, i. e., as far as the lesion progressed the co-expression of

133

these molecules increased. When the combinations CD4/CD25 and CD4/CD28 were

considered, absence or low expression increased from benign to malignant lesions, meaning

that as far as the lesion progressed the co-expression of these molecules decreased (Table 2).

When the expression of these molecules was considered individually, CD4 expression was

significantly decreased in patients presenting malignant lesions when compared to patients

with benign or premalignant lesions (p< 0.005). The expression of CD25 was closely similar

for all oral lesions. CD28 was increased in malignant lesions when compared to benign and

premalignant lesions (p< 0.001). (Figure 1). When the expression of CD4, CD25 and CD28

molecules in several combinations was associated the presence or not of the HPV infection no

significant differences were observed; however, patients harboring HPV18 infection exhibited

non-significant decreased expression of these molecules in relation to patients harboring other

HPV types.

Table 1 – HPV DNA detection observed in 79 oral lesions stratified according to the

histological diagnosis into benign (hyperplasia and papilloma), premalignant (lichen planus,

leukoplakia presenting or not dysplasia) and malignant (oral squamous cell carcinoma).

HPV

Positive

HPV

Negative

HPV18

HPV18/31/6

HPV31/6

HPV6/11

NI Total

N (%) n (%) n (%)

n (%) n (%) n (%) n(%)

N(%)

Benign (n=31) 12 (40) 19 (39) 5 (17) 2 (7) 0 2 (3) 3(10)

12 (40)

Premalignant

(n=25)

13 (43) 12 (24) 3 (10) 4 (13) 1 (3) 0 5(17)

13 (43)

Malignant

(n=23)

5 (17) 18 (37) 2 (6) 1 (3) 1 (3) 0 1(3) 5 (17)

Total (n=79) 30 (38) 49 (62) 10 (33)

7 (23) 2 (6) 2 (6) 9(30)

79(100)

NI = non-identified HPV type

134

Table 2 – Absent and low immunohistochemistry expression (positivity index = zero to <

15%) of CD4, CD25 and CD28 molecules observed in 79 oral lesions, stratified according to

the histological diagnosis into benign (hyperplasia and papilloma), premalignant (lichen

planus, leukoplakia presenting or not dysplasia) and malign (oral squamous cell carcinoma).

CD4/25/28 CD4/CD25 CD4/CD28 CD25/CD28

n (%) n (%) n (%) n (%)

Benign (n=31)

18 (58) 4 (13) 3 (10) 3 (10)

Premalignant (n=25)

12 (48) 3 (12) 1 (4) 4 (16)

Malignant (n=23)

7 (30) 12 (52) 1 (4) 2 (9)

Total (n=79)

37 (47) 19 (24) 4 (5) 9 (11)

Chi-squared test for Independence, P=0.0347.

Table 3 - Absent and low immunohistochemistry expression of CD4, CD25 and CD28

molecules observed in 79 patients presenting with oral lesions, stratified according the

presence or not of the HPV DNA type.

CD4/25/28 CD4/CD25 CD4/CD28 CD25/CD28

Total

n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)

HPV positive (n=30)

13 (43) 4 (13) 2 (7) 4 (13) 23 (77)

HPV negative (n=49)

12 (24) 4 (8) 1 (2) 3 (6) 20 (41)

HPV 18 (n=8)

3 1 1 2 7 (88)

HPV 18/31/33 (n=5)

3 0 0 0 3 (60)

HPV 31/6 (n=2)

1 1 0 0 2 (100)

HPV 6 (n=1)

1 0 0 0 1 (100)

NI (n=10)

6 2 0 2 9 (90)

Chi-squared test for independence, p<0.0001.

NI= non-identified HPV type

135

Figure 1 – Quantitative immunoperoxidase expression of CD4, CD25 and CD28 as assessed

by a computer image analysis system observed in 79 oral lesions, stratified according to the

histological diagnosis in benign (oral hyperplasia and squamous papilloma), premalignant

(lichen planus, leukoplakia presenting or not dysplasia) and malignant (OSCC). * P = 0.005;

Dunn’s post test to multiple comparison benign versus malignant, p<0.001

Benign

Premalignant

Malignant

CD28 (%)

Benign

Premalignant

Malignant

CD25 (%)

Benign

Premalignant

Malignant

CD4 (%)

136

Figure 2 – CD25 (panels A to C) and CD28 (panels D to F) immunolabeling in lymphocytic

infiltrates (arrows) of HPV-infected oral lesions, stratified according to the histological

diagnosis. A and D oral hyperplasia (moderate labeling), Leukoplakia without dysplasia

(discrete intensity) and oral squamous cell carcinoma (high intensity); D) to F) CD28

expression in respectively, oral hyperplasia (moderate intensity), Leukoplakia without

dysplasia (discrete intensity) and oral squamous cell carcinoma (high intensity). Scale bars

equals to 25 µm.

137

Figure 3– CD4 immunolabelling in lymphocyte infiltrates (arrows) of HPV-infected oral

lesions, stratified according to the histological diagnosis. A) oral hyperplasia (moderate

labeling), B) leukoplakia without dysplasia (intense labeling) and C) oral squamous cell

carcinoma (moderate labeling).

Scale bars = 25 µm.

138

DISCUSSION

High-risk HPV types have been recognized as a potential risk factor to oral

tumorigenesis (HA and CALIFANO, 2004). In the present study, HPV DNA was observed in

38% of all oral lesions, a frequency which is similar to those described by us in other studies

as well as by other authors (D’COSTA et al., 1998; MIGUEL et al., 1998, SOARES et al.,

2003). Among patients harboring the HPV infection, a high frequency of high-risk HPV types

was observed in benign and premalignant oral lesions. Although previous studies have

associated high-risk HPV with oral cancer (SAND et al., 2000) we found few OSCC lesions

infected with HPV (17%). Moreover, a higher prevalence of HPV18 was observed and,

surprisingly HPV16 was absent in this series, contrasting with a recent study that

demonstrated HPV16 as the most prevalent type in oral lesions, followed by HPV18

(KREIMER et al., 2005). The high prevalence of HPV18 type in the present study may

indicate a particular geographic distribution in the São Paulo State region, since this HPV type

has been previously reported in cervical lesions (GUIMARAES et al., 2005). In addition, high

risk HPV types have also been observed in benign oral lesions, indicating viral infection in

early stages of proliferative oral lesions (PAPAROTTO LOPES and MEEKS, 2001,

HABERLAND-CARRODEGUAS et al., 2003). Thus, early detection of HPV in these lesions

should be recommended for oral cancer prevention and therapy. It is also worthy to observe

that some oral lesions were infected with multiple HPV types, especially in premalignant

group and OSCC.

Samples of patients with benign or premalignant oral lesions exhibited closely similar

expression of CD4 and CD25; however, samples from patients with OSCC presented low

expression of CD4 and high expression of CD28. On the other hand, the expression of CD25

was closely similar irrespective of lesion severity. CD4/CD25 cells may be correspond either

139

to stimulated T cells or regulatory T cells. CD4+ T cells produce IL-2, which is a critical T

cell growth factor because its ability to grow and expand T cells in culture (ANTONY et al.,

2006). Likewise, the paracrine action of IL-2 production results in CD25 (IL-2 receptor)

expression and it is related to T regulatory survival and the suppressive mechanism (WANG

and CHEN, 2004). In addition, among several cytokines IL-2 levels also activates natural

killer (NK) cells, resulting in lysis of tumor and infected (RALAINIRINA et al., 2006). In

contrast, at first side CD28 higher expression in oral cancer in our study seems to indicate

activation of second signal to T cells proliferation. While CD28 T cell expression were in

high levels, we found T CD4, TCD25 were in low levels, might indicating that co-

stimulatory signals provided by CD28 T cells could not be efficient. However, CD28 present

high levels in tumor lymphocytic infiltrate could be found low or absent expression in tumor

cells (BECKER et al., 2000).

Although the host immune response to HPV is poorly understood, it has been

postulated that the cellular, or Th1 branch of immune response, as opposed to the Th2 or

humoral response, plays a crucial role in eliminating the virus (GONCALVES e DONADI,

2004). Evaluating the expression of T cell receptors, we verified a downregulation of those

receptors in tumor lymphocyte infiltrate in close association with oral cancer and high-risk

HPV infection. We verified a lower CD4+ CD25+ lymphocytes population expression

progressively among benign, premalignant and malignant lesions, may indicate less T cell

response associated with oral cancer HPV-infected. Low expression or lack of CD4 and CD25

T cell receptors results in defficient T cells responses and tumor and/or virus-infected cells are

protected from immune response (ALCOCER-GONZALEZ et al., 2006, DELONG et al.,

2005). Presence of CD4+ CD25+ T cells could be response to tumor-specific antigen,

resulting to immunological tolerance and evasion of tumor cells from host immune

surveillance. Deffective cellular response could contribute to stepwise accumulation of

140

defects in specific genes regulating cell death and survival mechanisms (OZSARAN et al.,

1999). The HPV infection persistence seems to occur in 10% to 30%, mainly associated with

high-risk HPV types, tumor progression and a poor immune response, such as observed in the

immunessupressed patients. (HARWOOD et al., 2000; HEARD et al., 2000). Otherwise, in

normal individuals, the absent or deficient immune response sugests a HPV strategy to evade

from host immunesorveillance (O'BRIEN and SAVERIA, 2002). In conclusion, the

downregulation of T cell regulatory receptors, with low expression of CD4/CD25 and

CD25/CD28 seems to be a way to HPV infections persistence, which could represent a risk

factor to oral malignant cell transformation.

ACKNOWLEDGEMENTS

The present study was financially supported by CAPES, a Brazilian research funding

organization. We wish to thank Ana Maria Rocha, from Pathology Department of Faculty of

Medicine of Ribeirão Preto (USP) for excellent technical assistance.

141

REFERENCES

ALCAMI, A., KOSZINOWSKI, U.H. Viral mechanisms of immune evasion. Immunol

Today, v.21, n.9, Sep;, p.447-55. 2000

ALCOCER-GONZALEZ, J.M.; BERUMEN, J.; TAMEZ-GUERRA, R.; BERMUDEZ-

MORALES, V.; PERALTA-ZARAGOZA, O.;HERNANDEZ-PANDO, R.; MORENO, J.;

GARIGLIO, P.; MADRID-MARINA, V. In vivo expression of immunosuppressive cytokines

in human papillomavirus-transformed cervical cancer cells. Viral Immunol. v.19,n.3,p.481-

91, 2006.

ANTONY, P.A.; PAULOS, C.M.; AHMADZADEH, M.; AKPINARLI, A.; PALMER, D.C.;

SATO, N.; KAISER, A.; HINRICHS, C.S.; KLEBANOFF, C.A.; TAGAYA, Y.; RESTIFO,

N.P. Interleukin-2-dependent mechanisms of tolerance and immunity in vivo. J Immunol.

v.176,n.9,p.5255-5266, 2006.

BECKER, J.C.; BRABLETZ, T.; CZERNY, C.; TERMEER, C.; BROCKER, E.B. Tumor

escape mechanisms from immunosurveillance: induction of unresponsiveness in a specific

MHC-restricted CD4+ human T cell clone by the autologous MHC class II+ melanoma. Int

Immunol.;v. 5,n.12,p.1501-1508. 1993

BECKER J.C.; VETTER, C.S.; SCHRAMA, D.; BROCKER, E.B.; THOR STRATEN, P.

Differential expression of CD28 and CD94/NKG2 on T cells with identical TCR beta variable

regions in primary melanoma and sentinel lymph node. Eur J Immunol. v.30,n12,p.3699-

706, 2000.

142

D’COSTA, J.; SARANATH, D.; DEDHIA, P.; SANGHVI, V.; MEHTA, A.R. Detection of

HPV-16 genome in human oral cancers and potentially malignant lesions from India. Oral

Oncol,v.34,p.413-420, 1998.

DELONG, P.; CARROLL, R.G.; HENRY, A.C.; TANAKA, T.; AHMAD, S.; LEIBOWITZ,

M.S.; STERMAN, D.H.; JUNE, C.H.; ALBELDA, S.M.; VONDERHEIDE, R.H. Regulatory

T cells and cytokines in malignant pleural effusions secondary to mesothelioma and

carcinoma. Cancer Biol Ther,v. 4,n.3,p.342-346, 2005.

GONCALVES, M. A. e DONADI, E. A. Immune cellular response to HPV: current concepts.

Braz J Infect Dis, v.8, n.1, p.1-9. 2004.

GUIMARAES, M.C.; GONCALVES, M.A.;SOARES, C.P.;BETTINI, J.S.;DUARTE,

R.A.;SOARES, E.G.;Immunohistochemical expression of p16INK4a and bcl-2 according to

HPV type and to the progression of cervical squamous intraepithelial lesions. J Histochem

Cytochem, v.53,n.4,p.509-516, 2005.

HA , P.K.; CALIFANO, J.A. The role of human papillomavirus in oral carcinogenesis. Crit

Rev Oral Biol Med, v. 15, n. 4, p. 188-196, 2004.

HABERLAND-CARRODEGUAS, C.;FORNATORA, M.L.;REICH, R.F.;FREEDMAN,

P.D.; Detection of human papillomavirus DNA in oral inverted ductal papillomas. J Clin

Pathol.,v.56,n.12,p.910-913, 2003.

HARWOOD, C.A.; SURENTHERAN, T.; MCGREGOR, J.M.; SPINK, P.J.; LEIGH, I.M.;

BREUER, J.; PROBY, C.M. Human papillomavirus infection and non-melanoma skin cancer

143

in immunosuppressed and immunocompetent individuals. J Med Virol, v. 61, n, 3, p. 289-

297, 2000.

HEARD, I.T.J.;SCHMITZ, V.;MANDELBROT, L.;KAZATCHKINE, M.D.;ORTH, G.

Increased risk of cervical disease among human immunodeficiency virus-infected women

with severe immunosuppression and high human papillomavirus load. n.1, p.289-297, 2000.

JIMENEZ, C.;CORRENTI, M.;SALMA, N.;CAVAZZA, M.E.;PERRONE, M. Detection of

human papillomavirus DNA in benign oral squamous epithelial lesions in Venezuela. J Oral

Pathol Med. v.30,n.7,p.385-388, 2001.

KIESSLING, R.;WASSERMAN, K.;HORIGUCHI, S.;KONO, K.;SJOBERG, J.;PISA, P.;

PETERSSON, M.;Tumor-induced immune dysfunction. Cancer Immunol

Immunother.;v.48,n.7,p.353-362,1999.

KREIMER, A.R.;CLIFFORD, G.M.; BOYLE, P.;FRANCESCHI, S.Human papillomavirus

types in head and neck squamous cell carcinomas worldwide: a systematic review. Cancer

Epidemiol Biomarkers Prev. v.14,n.2,p.467-475, 2005.

LADANYI,A.;SOMLAI,B.;GILDE,K.;FEJOS,Z.;GAUDI,I.;TIMAR,J.T-cell activation

marker expression on tumor-infiltrating lymphocytes as prognostic factor in cutaneous

malignant melanoma. Clin Cancer Res . v.10,n.2,p.521-530,2004.

LOKE,P.;ALLISON,J. Emerging mechanisms of immune regulation: the extended B7 family

and regulatory T cells. Arthritis Res Ther v.6,n.5,p.214-216,2004.

144