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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
SETOR DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BÁSICA
CURSO DE MESTRADO EM
MICROBIOLOGIA, PARASITOLOGIA E PATOLOGIA
A SUSCETIBILIDADE A DROGAS ANTIFÚNGICAS DE ISOLADOS
AMBIENTAIS DE Cryptococcus neoformans, PROCEDENTES DA
CIDADE DE CURITIBA E REGIÃO METROPOLITANA,
PARANÁ-BRASIL
CURITIBA
2006
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MAURICIO CICHON
A SUSCETIBILIDADE A DROGAS ANTIFÚNGICAS DE ISOLADOS
AMBIENTAIS DE Cryptococcus neoformans, PROCEDENTES DA
CIDADE DE CURITIBA E REGIÃO METROPOLITANA,
PARANÁ-BRASIL
Dissertação apresentada como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre pelo Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia, Parasitologia e
Patologia – Área de Concentração Microbiologia, do
Setor de Ciências Biológicas e da Saúde da
Universidade Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Flávio de Queiroz Telles Filho.
CURITIBA
2006
ii
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AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais por todo o incentivo e apoio dados durante os
momentos difíceis do Curso de Mestrado.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia,
Parasitologia e Patologia da Universidade Federal do Paraná-UFPR e a
Coordenação por parte da professora Vanete Soccol.
A Lili, Emilia, Cida técnicas do Laboratório de Micologia da UFPR.
A Professora Rosângela Pinheiro pelas técnicas passadas e apoio sempre
oferecido.
A Professora Marisol e Professora Gisele pela atenção e sugestões
disponibilizadas.
A Professora Vânia Vicente pelas correções, sugestões e conhecimentos
passados.
Ao professor Flávio Queiroz-Telles, pela orientação durante a realização
desta dissertação.
iii
SUMÁRIO
LISTA DE ANEXOS......................................................................................... v
LISTA DE APÊNDICES ................................................................................... vi
LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................ vii
RESUMO.......................................................................................................... viii
ABSTRACT...................................................................................................... ix
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................... 1
2 OBJETIVOS .......................................................................................... 3
2.1 OBJETIVO GERAL................................................................................ 3
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................. 3
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................ 4
3.1 CRIPTOCOCOSE: PATOGÊNESE, ETIOLOGIA E EPIDEMIOLOGIA 4
3.2 C. neoformans: IDENTIFICAÇÃO E TAXONOMIA................................ 4
3.2.1 Isolamento Ambiental de C. neoformans Variedade neoformans... 5
3.2.2 Isolamento Ambiental do Cryptococcus gattii.................................. 7
3.2.3 Isolamento Ambiental do C. neoformans Variedade grubii ............. 7
3.3 ISOLAMENTO DO C. neoformans DE AVES........................................ 8
3.4 TERAPIA ANTIFÚNGICA E TESTES DE SUSCETIBILIDADE ............. 9
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................... 12
4.1 ÁREA DE ESTUDO .............................................................................. 12
4.2 LOCAIS ESCOLHIDOS PARA COLETAS DE AMOSTRA.................... 12
4.3 TIPOS DE AMOSTRAS COLETADAS .................................................. 12
4.4 COLETA DE AMOSTRAS .................................................................... 13
4.5 PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS .................................................. 13
4.6 IDENTIFICAÇÃO DE ISOLADOS ......................................................... 13
4.7 TESTES DE SUSCETIBILIDADE.......................................................... 14
4.7.1 Meio Sintético ..................................................................................... 14
4.7.2 Preparo do Inóculo.............................................................................. 15
4.7.3 Preparo das Drogas Antifúngicas...................................................... 15
4.7.4 Tempo de Leitura do Teste ................................................................ 16
5 RESULTADOS e DISCUSSÃO............................................................. 17
6 CONCLUSÃO ....................................................................................... 19
REFERÊNCIAS ............................................................................................... 20
ANEXOS .......................................................................................................... 23
APÊNDICES .................................................................................................... 32
iv
LISTA DE ANEXOS
ANEXO I
QUADRO 1 - RESULTADO PARA O TESTE DE SENSIBILIDADE AO FLUCONAZOL.......... 24
QUADRO 2 - RESULTADOS PARA O TESTE DE SENSIBILIDADE A
ANFOTERICINA B................................................................................................ 24
QUADRO 3 - RESULTADOS PARA O TESTE DE SENSIBILIDADE AO
ITRACONAZOL .................................................................................................... 25
ANEXO II
FIGURA 1 - MOSTRA ACÚMULO DE FEZES NAS CANALETAS DO SETOR DE
MANUTENÇÃO DO H.C, ESTE LOCAL FOI POSITIVO PARA A
AMOSTRA 39 ......................................................................................................... 26
FIGURA 2 - MOSTRA ESCADA DO PRÉDIO DESATIVADO DO CEASA, ESTE
LOCAL FOI POSITIVO PARA ISOLAMENTO DA AMOSTRA 57 ......................... 26
FIGURA 3 - MOSTRA O PISO DO PRÉDIO INTERDITADO DO CEASA, ESTE
LOCAL FOI POSITIVO PARA O ISOLAMENTO DA AMOSTRA 81...................... 27
FIGURA 4 - MOSTRA VIGAS DE MADEIRA DO TELHADO DO PRÉDIO DO CEASA,
A AMOSTRA DESTE LOCAL FOI POSITIVA PARA O ISOLAMENTO DA
AMOSTRA 74 ......................................................................................................... 27
FIGURA 5 - MOSTRA ACÚMULO DE FEZES DENTRO DO PRÉDIO INTERDITADO
DO CEASA, ESTA AMOSTRA FOI POSITIVA PARA O ISOLAMENTO DA
AMOSTRA 73 ......................................................................................................... 28
FIGURA 6 - MOSTRA O TELHADO DO ESTACIONAMENTO DO CEASA ONDE SE
ENCONTRAM 2 POMBAS MORTAS JUNTO AS FEZES DE POMBO, A
AMOSTRA DESTE LOCAL FOI POSITIVA PARA O ISOLAMENTO DA
AMOSTRA 80 ......................................................................................................... 28
FIGURA 7 - MOSTRA O PRÉDIO INTERDITADO, DESTE LOCAL FORAM
COLETADAS DIVERSAS AMOSTRAS DE FEZES DE POMBO QUE
FORNECERAM SEIS ISOLADOS DE C. neoformans PARA ESTE
TRABALHO............................................................................................................. 29
ANEXO III
TABELA 1 - MOSTRA AS AMOSTRAS POSITIVAS PARA DESENVOLVIMENTO DO
C. neoformans ENCONTRADAS NO HOSPITAL DE CLÍNICAS,
INCLUINDO LOCAL E DATA DE COLETA............................................................ 30
TABELA 2 - MOSTRA AS AMOSTRAS POSITIVAS PARA DESENVOLVIMENTO DO
C. neoformans ENCONTRADAS NO CEASA, INCLUINDO LOCAL E
DATA DE COLETA................................................................................................. 30
ANEXO IV
QUADRO 1 - COMPARATIVO ENTRE OS RESULTADOS DE CURITIBA E OS
UTILIZADOS COMO BASE.................................................................................. 31
v
LISTA DE APÊNDICES
APÊNDICE 1 - LISTA DAS DROGAS UTILIZADAS E DILUIÇÕES TESTADAS ...................... 33
APÊNDICE 2 - AÇÃO DA ANFOTERICINA B SOBRE O C. neoformans.................................. 34
APÊNDICE 3 - FORMAÇÃO CORRETA DO ERGOSTEROL.................................................... 34
APÊNDICE 4 - AÇÃO DOS AZÓIS NA INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO ERGOSTEROL ......... 35
APÊNDICE 5 - BAIRROS DE CURITIBA E TIPO DE AMOSTRAS COLETADAS .................... 36
APÊNDICE 6 - CIDADE DE PINHAIS (REGIÃO METROPOLITANA DE CURITIBA) ............... 37
APÊNDICE 7 - MOSTRA OS ESCORES PADRONIZADOS PELA CLSI PARA
DETERMINAÇÃO DE POSITIVIDADE OU NEGATIVIDADE NO
CRESCIMENTO DO FUNGO NO POÇO .......................................................... 38
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
CEASA - Central Estadual de Abastecimento
CMI - Concentração Mínima Inibitória
CGB - Canavanina, glicina e azul de bromotimol
CLSI - Clinical Laboratory Standart Institute
HC - Hospital de Clínicas
HIV - Human Imunodeficient Vírus (vírus da imunodeficiência humana)
K - Potássio
mL - mililitro
mm - milímetro
pH - Percentual de hidrogênio
R - Resistente
S - Sensível
UFPR - Universidade Federal do Paraná
µL - microlitro
µm - micrômetro
µg/mL - microgramas por mililitro
≥ - maior ou igual a
vii
RESUMO
Cryptococcus neoformans trata-se de levedura encapsulada patogênica
causadora da criptococose, que em sua forma disseminada alcança as meninges
de pacientes imunodeprimidos causando a meningite criptococcica. A
identificação de fontes ambientais se faz necessária para minimizar a
possibilidade de imunodeprimidos entrarem em contato com o fungo
potencialmente patogênico. O isolamento deste fungo é realizado através do
processamento de fezes de pombos (Columba lívia) e semeadura das mesmas
em placa contendo ágar níger (Guizotia abyssinica). Testes de sensibilidade
frente a diferentes diluições de antifúngicos são necessários para determinar as
concentrações mínimas inibitórias (CMI) destas drogas e identificar isolados
resistentes aos medicamentos usados no tratamento. Este estudo analisou 88
amostras de diferentes materiais orgânicos (fezes de pombos, materiais vegetais
de eucalipto, solo de locais freqüentados por pombos, amostra de fezes de
morcegos) destas, 11 amostras foram positivas para o desenvolvimento do
Cryptococcus neoformans (12,5%). Para as amostras positivas foram realizados
testes de sensibilidade aos seguintes antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e
itraconazol. Nenhum dos isolados foi resistente às drogas utilizadas: as
Concentrações Mínimas Inibitórias encontradas foram: CIM de 0.03 a 1 µg/mL
para anfotericina B, CIM de 0.125µg/mL para fluconazol e CIM de 0.03µg/mL para
itraconazol.
Palavras-chave: C. neoformans, pombos, isolamento, antifúngicos.
viii
ABSTRACT
Cryptococcus neoformans is a pathogenic encapsulated yeast that causes
criptococose, that in it´s disseminated form causes the meninges of
imunocompromissed patients inducing then criptococcic meningitis. The
identification of enviromental sources to infeccion is necessary to reduce the
possibility of this patients come in contact with the bold. The isolation of this bold,
carried through the processing og pigeon feces (Columbia livia) and inoculation of
this feces in plates with níger ágar (Guizotia abyssinica) that is a seed rich in
fenols, that will be ixidate by fenoloxidase, that is a enzyme present in the C.
neoformans. This study analised 88 different samples of organic materials (pigeon
feces, materials of eucaliptos and soil), and of those 88, 11 samples werw positive
to isolation of C. neoformans, 12,5%. These had their sensibility tests at different
dilutions of antifungics drugs, this is necessary to determine possible resistant
isolated to antifungics used in the treatment like anfotericin B, fluconazole e
itraconazole. None of the isolated bolds were resistant to the antifungic drugs
used. The Minimum Ininhibitor Concentration (MIC) found were: to anfotericin B
(MIC of 0,03 to 1 µg/mL), to fluconazole (MIC of 0,125µg/mL) e to itraconazole
(MIC of 0,03µg/mL). With the results found in the study, we concluded that the city
of Curitiba has enviromental sources to contamination of C. neoformans. The
metodology used to isolataing is efficient. The ratio of isolation was of 12,5%, and
is in conformity with other studies in Brazil as well as in the world. None of the
samples were resistant to antifungics tested. These results are in conformity with
other studies used with base for this study. The metodology of microtitulation in
RPMI 1640 broth tamponed with MOPS of M27-A2 document of CLSI is efficient
for MIC determination isolated C. neoformans.
Key words: C. neoformans, pigeon, isolation, antifúngics.
ix
1
1 INTRODUÇÃO
O fungo recebe o nome de Cryptococcus neoformans em sua fase
assexuada e Filobasidiella neoformans em sua fase sexuada. O C. neoformans é
um fungo leveduriforme, esférico envolta em espessa cápsula de polissacarídeos
que inibem a fagocitose do fungo pelos macrófagos, impedindo a formação de
anticorpo, reproduz-se por brotamento, mede entre 5 e 20 µm de diâmetro. Cora-
se bem por tinta da China ou tinta nanquim, que devido a sua cápsula não permite
a penetração do corante, dando-nos a impressão de um “céu estrelado”, com o
fundo negro e as leveduras transluminescentes.
Cultivado em ágar sangue ou ágar Sabouraud, tanto a temperatura
ambiente quanto a 37°C, cresce em uma ou duas semanas sob a forma de
colônias de cor creme, planas ou ligeiramente elevadas, brilhantes, úmidas que
logo se tornam mucóides e tendem a assumir uma coloração acastanhada, de
maneira geral não apresentam micélio. E comumente cultivado em ágar níger
(Guizotia abyssinica) esta e uma semente usada como alimento por diversas
espécies de pássaros, é rica em fenóis, que são oxidados pela fenoloxidase
sintetizada pelo fungo, caracterizando as colônias com uma coloração marrom
escura, isto dentro de uma semana de cultivo (MAFFEI e SANTOS, 1997;
PEREIRA, 2001).
Os antígenos da cápsula determinam cinco tipos de C. neoformans: A, B,
C, D e AD, sendo este último um híbrido das variedades neoformans e grubii.
Estes sorotipos estão correlacionados com diferentes nichos ecológicos,
variedades e com maior ou menor virulência da amostra. O sorotipo A é
cosmopolita e o maior causador de criptococose. Os sorotipos A e D são isolados
com muita freqüência de solo e fezes de aves, principalmente pombos (Columba
lívia). Os sorotipos B e C raramente são isolados do solo, são causadores da
enfermidade em pacientes imunocompetente, principalmente nas regiões tropicais
e subtropicais, são normalmente isolados de fragmentos vegetais, em especial
eucaliptos (Eucalyptus camaldulensis). O C. neoformans possui 2 variedades, o
C. neoformans variedade neoformans (sorotipo A), C. neoformans variedade
grubii (sorotipo A e D) além de C. gatti (sorotipos B e C), antes considerado uma
2
variedade (RUIZ, VELEZ e FROMTLING, 1989; ELLOT et al., 1995; PEREIRA,
2001; FILIÚ et al., 2002; TAY et al. 2005).
Dentro deste contexto sobre as características ambientais do C.
neoformans, o presente trabalho tem como objetivos identificar possíveis fontes
ambientais para o isolamento do C. neoformans na Cidade de Curitiba, e
posteriormente testar a suscetibilidade destes isolados frente a diversas diluições
de anfotericina B, fluconazol e itraconazol, que são os antifúngicos utilizados no
tratamento da criptococose.
3
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Isolar o C. neoformans de amostras ambientais provenientes da Cidade de
Curitiba, e testá-los frente aos antifúngicos anfotericina B, fluconazol e
itraconazol.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Identificação de possíveis fontes ambientais através do isolamento de C.
neoformans.
Testar a suscetibilidade de isolados ambientais de C. neoformans, frente
aos principais antifúngicos disponíveis para o tratamento da criptococose
em seres humanos.
.
4
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 CRIPTOCOCOSE: PATOGÊNESE, ETIOLOGIA E EPIDEMIOLOGIA
A criptococose é uma micose sistêmica causada por uma levedura
encapsulada, o C. neoformans, infecta o hospedeiro humano por via inalatória,
apresentando tropismo pelo sistema nervoso central (SNC), este tropismo pode
ser explicado de duas formas, a primeira é de que o cérebro é rico em tiamina o
que favoreceria o desenvolvimento do fungo esta hipótese foi descartada já que
ratos com baixa ingestão de tiamina também desenvolveram a doença, a segunda
associa-se ao fato do cérebro ser rico em glutamato de sódio, este constituinte
estimularia a síntese da cápsula. Além do acometimento meningoencefálico,
responsável por significativos índices de morbidade e mortalidade, C. neoformans
pode também causar manifestações clínicas: pulmonares, cutâneas, ósteo-
articulares, renais, prostáticas e no sistema hematopoiético (LAZERA, WANKE e
SHIKAWA, 1993).
Com a utilização de procedimentos imunossupressores como a
quimioterapia antineoplásica, corticoterapia e o aparecimento da AIDS, houve um
incremento muito grande nos casos descritos de criptococose na literatura. Até
1955 existiam 300 casos descritos de criptococose, sendo que em 1976 nos
Estados Unidos foram registrados 338 casos da doença. A criptococose é a
quarta infecção que mais causa óbitos em pacientes com AIDS, apenas superada
pela tuberculose, pneumocistose e infecções por bactérias comuns.
3.2 C. neoformans: IDENTIFICAÇÃO E TAXONOMIA
Em 1990, Ellis e Pfeiffer descobriram na Austrália que havia duas
variedades de C. neoformans variedade neoformans - fungo oportunista, e a
variedade gattii, patógeno primário; este tem sido mais associado às infecções em
pacientes imunologicamente competentes. O C. neoformans var. neoformans
possui os sorotipos A e D. O sorotipo A é mais comumente isolado que o D,
5
exceto em países como a Dinamarca e Itália, onde o D é mais comum , esta
variedade foi isolada de fezes de pombos e de solo contaminado por fezes de
outras aves (LAZERA, WANKE e NISHIKAWA, 1993). O C. neoformans tem sido
tradicionalmente classificado dentro de três variedades, C. neoformans variedade
neoformans, C. neoformans variedade gattii e C. neoformans variedade grubii,
entretanto, recentes estudos moleculares têm indicado que a variedade gattii deve
ser reconhecida como uma espécie em separado, tal reconhecimento separa
molecularmente baseado no trabalho de BARRETO DE OLIVEIRA et al. (2004),
que ao analisar por AFLP (Analyse Fragment Lengh Polimorphism), revelou a
existência de dois principais genótipos, a espécie C. neoformans (AFLP genótipos
1 a 3) e C. gattii (AFLP genótipos 4 a 6), assim, ficaríamos com C. neoformans e
C. gattii. Ambas as espécies afetam tanto os pulmões quanto o sistema nervoso
central, porém, apresentam diferenças quanto à distribuição geográfica,
características genotípicas, epidemiologia, características clínicas e resposta
terapêutica (BARRETO DE OLIVEIRA et al., 2004).
No Brasil, esta variedade já foi isolada a partir de outros substratos, como
ocos de árvores, ninho de marimbondos, fezes de morcego entre outros.
Propágulos com menos de 2μm de diâmetro, são encontradas em fezes
desidratadas de pombos e no solo. Estas dimensões possibilitam ao agente,
atravessar toda a árvore respiratória, chegando até os alvéolos, iniciando a
infecção.
3.2.1 Isolamento Ambiental de C. neoformans Variedade neoformans
FILIÚ et al. (2002) comprovaram, pela primeira vez, a contaminação de
excretas de aves de cativeiro por C. neoformans variedade neoformans na Cidade
de Campo Grande. Foram observadas concentrações do fungo de até 46.000
propágulos viáveis por grama de material seco, o que é considerado elevado,
refletindo a existência de fontes ambientais na forma de microfocos do fungo,
possibilitando que estes propágulos sejam inalados, pois também se apresentam
dispersos no ar. A contaminação pode estar relacionada ao grande ciclo de aves
nas gaiolas, a forma de limpeza das mesmas ou viveiros, utilizando-se da mesma
6
ferramenta e a grande quantidade de sementes nestes locais que podem servir
como substrato para o fungo. Mais recentemente a variedade neoformans foi
associada à madeira em decomposição, proveniente Isolamento ambiental de C.
neoformans variedade neoformans.
Trabalhos pioneiros de EMMONS, no início dos anos 50, fazem referência
ao acúmulo de excretas secas e envelhecidas de pombos (Columba livia) em
solos contaminados como fontes saprobióticas de C. neoformans em ambientes
urbanos. Staib em 1984, concluiu que a exposição dos homens e animais a
excretas destas aves explica pelo menos em parte a epidemiologia da
criptococose (RUBIO et al., 1984; BAWENS et al., 1986; LACAZ et al., 1987;
RUIZ, VELEZ e FROMTLING, 1989 ; ELLIS e PFEIFFER, 1990; FILIÚ et al.,
2002).
PASSONI et al. (1999), encontraram 15% de positividade na poeira de
residências na Cidade do Rio de Janeiro, tal comprovação é valorizada pelo
achado do C. neoformans variedade neoformans nos excretas de aves, como
canários, periquitos e outros psitacídeos em cativeiro nestas residências. Foi
demonstrando uma correlação entre a existência de aves cativas no ambiente
domiciliar e a probabilidade de contaminação destas residências por C.
neoformans (FILIÚ et al., 2002).
MONTENEGRO e PAULA (2000) comprovaram a ocorrência do C.
neoformans variedade neoformans em fontes ambientais urbanas na Cidade de
São Paulo, dos 38 sítios analisados, foram coletadas amostras de fezes de
pombos, dez (26,3%) apresentaram positividade para o isolamento do fungo, e
ainda duas amostras do fungo foram obtidas de materiais vegetais de eucaliptos
provenientes do parque Ibirapuera e da Aclimação (MONTENEGRO e PAULA,
2000).
Os isolamentos obtidos comprovam a necessidade de minimizar a
exposição ao C. neoformans variedade neoformans em locais de circulação
pública através da limpeza constante, evitando-se assim o acúmulo de fezes de
aves nestes locais e nas residências de pessoas imunocomprometidas (FILIÚ et
al., 2002).
7
3.2.2 Isolamento Ambiental do Cryptococcus gattii
C. gattii (sorotipos B e C) é conhecido por sua por afinidade com matéria
orgânica viva, servindo como fonte de infecção para os humanos. Esta espécie
ocorre em regiões tropicais e subtropicais, acometendo hospedeiros
imunocompetentes. No Brasil C.gattii foi isolado de oco de árvores tropicais, como
o oiti (Moquilea tomentosa), cássia rosa (Cassia grandis), figueira (Fícus
microcarpa) e outros, evidenciando diferentes habitats naturais para essa
variedade, alcançando taxas de 62% no Brasil, tornando-o endêmico nas regiões
Norte e Nordeste. Foi inicialmente associado à E. camaldulensis na Austrália,
seguindo-se seu isolamento de restos vegetais de eucaliptos em diferentes países
(ELLIS e PFEIFFER, 1990; FISHER et al., 1993; PADHYE et al., 1993; FILIÚ et
al., 2002; PEREIRA, 2001).
Estudos recentes demonstram que tanto E. camaldulensis quanto E.
tereticornis que são exportados da Austrália por via marítima podem albergar o C.
gattii, isto demonstra bem a distribuição epidemiológica da criptococose causada
pelo C. gattii (ELLIS e PFEIFFER, 1990; PADHYE et al., 1993; FILIÚ et al., 2002).
Na Cidade de São Paulo um estudo realizado por MONTENEGRO e
PAULA (2000) comprovou a associação do C. neoformans variedade gattii com o
eucalipto, já que em um período de dois anos através de coletas mensais, 12
eucaliptos dos parques da cidade foram analisados. Os resultados revelaram que
apenas um E. camaldulensis apresentou positividade para o fungo, em duas
coletas realizadas nas mesmas estações (novembro de 1996 e novembro de
1997) apresentando um evento sazonal (MONTENEGRO e PAULA; 2000).
3.2.3 Isolamento Ambiental do C. neoformans Variedade grubii
O sorotipo A, atualmente denominado variedade grubii é o sorotipo
prevalente em amostras ambientais, como, excrementos de pombos, restos de
vegetais e ar atmosférico. Tal associação com excretas de pombos é bem
conhecida, porém, esta variedade também tem sido isolada de fezes de outras
8
espécies de aves, principalmente Psitacídeos. A variedade grubii está relacionada
com a meningite fúngica em pacientes imunocomprometidos em todo o mundo.
As amostras positivas de C. neoformans variedade grubbi, foram isoladas
de amostras de fezes de pombos observadas no estudo de KOBAYASHI et al.
(2005), estas foram identificadas em locais fechados sugerindo alta exposição ao
fungo. KOBAYASHI et al. em 2005 mostraram que a contaminação por C.
neoformans variedade grubii foi maior em locais protegidos das intempéries
ambientais, do que em locais não protegidos. O insucesso no isolamento deste
fungo de amostras de fezes de aves provenientes de criadouros é atribuída pelos
autores à temperatura baixa no momento da coleta, da umidade e da
decomposição por bactérias, causando assim, a alcalinização do substrato,
inibindo desta forma o crescimento do C. neoformans. O rápido crescimento de
fungos filamentosos pode mascarar o desenvolvimento do C. neoformans
independente da variedade em amostras de fezes de pombos, proporcionando
um resultado falso negativo (KOBAYASHI et al., 2005).
3.3 ISOLAMENTO DO C. neoformans DE AVES
Alguns trabalhos experimentais documentam que o trato digestório de
pombos deve ser colonizado por C. neoformans e quando estes são excretados
junto com as fezes, continuam viáveis, outros estudos sugerem que a excreta dos
pombos poderia enriquecer o solo, fornecendo nutrientes para o desenvolvimento
do C. neoformans presente neste local, o guano (excretas de morcegos), por
exemplo, contém uma mistura de constituintes químicos, incluindo a creatinina,
que fornece condições de multiplicação ao microrganismo (MAFFEI e SANTOS,
1997; PEREIRA, 2001; FILIÚ et al., 2002; MALIK et al., 2003).
A alta temperatura corporal dos pombos (40-44°C) é um conhecido inibidor
da proliferação do C. neoformans tanto “in vitro” quanto “in vivo”. Sendo, portanto
a criptococose clínica raramente observada nestas aves (KWONG-CHUNG,
VARMA e HOWARD, 1988; MALIK et al., 2003).
MALIK et al. (2003), realizaram um estudo na Austrália utilizando-se de 26
casos de criptococose em aves. Características da ave como: observações
9
citológicas e histológicas, encontrados micológicos, respostas à terapia
antifúngica e dados da necropsia foram coletados. Os casos estudados são
insuficientes para se generalizar os episódios envolvidos na criptococose em
aves, porém são bem definidas as duas principais portas de entrada pelas quais
os propágulos do C.neoformans alcançam os tecidos das aves, o trato respiratório
e a pele. Em aves imunocompetentes, o envolvimento geralmente é restrito ao
trato respiratório superior ou estruturas muito próximas à cavidade nasal,
refletindo a melhor capacidade do C. neoformans se reproduzir e produzir os
fatores de virulência em temperaturas abaixo de 40°C (MALIK et al., 2003).
O C. neoformans é considerado um patógeno oportunista quando o
microrganismo não está restrito a sítios superficiais frios, mas quando penetra
profundamente no trato respiratório inferior ou disseminando, isto é causado pela
queda na imunidade do pássaro, as causas da imunodeficiência nestes pássaros
configuram-se como diminuição na proteção da microbiota do intestino e do trato
respiratório superior, como conseqüência da ação de longos tratamentos com
antibióticos de amplo espectro, causando desequilíbrio na microbiota (FILIÚ et al.,
2002; MALIK et al., 2003).
3.4 TERAPIA ANTIFÚNGICA E TESTES DE SUSCETIBILIDADE
A criptococose é tratada com anfotericina B, o fluconazol e o itraconazol
aos quais o C. neoformans não apresenta resistência. A anfotericina B
(fungistático extraído do Streptomyces nodosus) tem como alvo a membrana
celular dos fungos. Os poliênicos ligam-se ao ergosterol presente na membrana
de fungos, formando poros e ou canais, que resultam no aumento da
permeabilidade causando um desequilíbrio osmótico, que leva a célula à morte. O
(Apêndice 2) Mostra a ação da anfotericina B no desequilíbrio osmótico do C.
neoformans.
Por outro lado os azóis como, fluconazol e itraconazol são compostos
totalmente sintéticos e seu mecanismo de ação consiste na inibição do α-14-
dimetilase, um sistema enzimático microssomal dependente da enzima citocromo
p450 codificada pelo gene ERG 11, que prejudica a síntese do ergosterol na
membrana citoplasmática, levando ao acúmulo de 14-metilesteróis, estes por não
10
possuírem as mesmas propriedades físicas que o ergosterol proporcionam
formação da membrana com propriedades alteradas, que não desempenham as
funções básicas necessárias ao desenvolvimento do fungo (Apêndice 4) Mostra a
ação do itraconazol e fluconazol na inibição e na lise do C. neoformans. O
Apêndice 3 mostra a formação correta do ergosterol.
Os azóis são considerados tanto fungistáticos como fungicidas e causam
menos reações adversas que a anfotericina B, porém, são menos potentes
(BERGOLD e GEORGIADIS, 2004).
Usando o método de microdiluição em caldo padronizado pela CLSI
(Clinical Laboratory Standart Institute) e o E-test, BRANDT et al. (2001),
demonstraram que a resistência “in vitro” para isolados clínicos de C. neoformans
é incomum. No estudo realizado por TAY, 2005 uma concentração mínima
inibitória (CMI) precisa não foram alcançados para isolados ambientais, assim
todos foram sensíveis a anfotericina B, ao fluconazol, e ao itraconazol com CMIs
de ≥1, ≥8 e ≥0,125 μg/mL respectivamente (BRANDT et al., 2001).
O Subcomitê de Testes de Suscetibilidade Antifúngica do Comitê Europeu
de Testes de Suscetibilidade a Antifúngicos (AFST- EUCAST) desenvolveu uma
proposta padronizando microtitulação em caldo como procedimento para
determinação de CMIs de antifúngicos para algumas espécies de leveduras. Este
padrão é determinado pelo documento M27-A2, procedimento referente à
microdiluição em caldo do CLSI (Clinical Laboratory Standart Institute) (BRANDT
et al., 2001).
Em estudo realizado por CALVO et al., 2001, ao analisar a cem isolados
clínicos de C. neoformans isolados de pacientes HIV positivos e HIV negativos do
Brasil, Chile e Venezuela verificaram suscetibilidade frente a quatro drogas
antifúngicas: anfotericina B, fluconazol, itraconazol e 5-Flucitocina. O método
utilizado por CALVO et al. (2001), foi o de microdiluição em caldo RPMI 1640,
tamponado com MOPS, este padronizado pela CLSI. O ponto de leitura adotado
para determinar a CMI para anfotericina B foi o de inibição de qualquer
crescimento (escore zero), para os azóis a menor concentração com decréscimo
proeminente do crescimento (escore 2) foi o utilizado. Nenhum dos isolados
demonstrou resistência a qualquer um dos antifúngicos. As concentrações
mínimas inibitórias (CMI) encontradas foram; para anfotericina B (entre 0,125 e
11
0,5 μg/mL), Fluconazol (entre 4 e 8 μg/mL) e Itraconazol (entre 0,06 e 0,125
μg/mL). Tais CMIs se apresentam em conformidade com outros trabalhos que
utilizaram as mesmas drogas e o mesmo método (CALVO et al., 2001).
12
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ÁREA DE ESTUDO
A Cidade de Curitiba, capital do Estado do Paraná, possui muitos locais
com alta concentração de pombos, tanto no centro da cidade como em sua região
metropolitana e periferia, tais locais são de acesso público, o que aumenta as
chances de pessoas imunocomprometidas entrarem em contato com o C.
neoformans e desenvolverem a criptococose.
4.2 LOCAIS ESCOLHIDOS PARA COLETAS DE AMOSTRA
Foram escolhidos locais com acúmulo de fezes e com grande população
de pombos. O Apêndice 5 mostra a Cidade de Curitiba, evidenciando os locais
onde foram coletas as amostras e o Apêndice 6 mostra a Cidade de Pinhais no
Mapa da Região Metropolitana de Curitiba, mostrando, também, a Cidade de
Pinhais, de onde foram coletadas amostras de fezes de Pombo (ver apêndice).
a. Hospital de Clínicas da UFPR.
b. Passeio Público de Curitiba.
c. Praças de Curitiba (Santos Andrade e Rui Barbosa).
d. Ceasa de Curitiba, situado no bairro Capão da Imbúia.
e. Moinho de farinha de trigo Molino Rosso, situado na Cidade de Pinhais.
4.3 TIPOS DE AMOSTRAS COLETADAS
a. Fezes de aves e morcegos.
b. Terra e areia com excrementos.
c. Materiais orgânicos (penas e folhas).
d. Fragmentos de flores, caules e folhas de eucaliptos.
13
4.4 COLETA DE AMOSTRAS
Coleta-se aproximadamente 30 gramas de cada amostra, para isso são
utilizadas espátulas de madeira descartáveis e coletores plásticos estéreis com
capacidade para 100 mL. Após coletar os materiais, estes são processados no
laboratório de Micologia do Hospital de Clínicas da UFPR. As 88 amostras foram
coletas no período de 13 meses (setembro de 2004 a setembro de 2005).
4.5 PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS
Para isolamento, foi empregado o método de STAIB modificado.
Aproximadamente dez gramas das amostras foram depositadas em provetas de 250 ML
contendo 40 mL de solução fisiológica esterilizada, procede-se a agitação manual por
dois minutos, posteriormente o material foi deixado em repouso por dez minutos. Foram
pipetados 8 mL do sobrenadante, utilizando-se uma pipeta volumétrica de 10 mL,
colocando-os em tubos cônicos de 15 mL com tampa de rosca, juntando-os a 2 mL de
solução de antibióticos (água destilada estéril, contendo 4,5 mg/mL de penicilina
cristalina e 10 mg/mL de estreptomicina) que foi aliquotada com uma pipeta volumétrica
de 5 mL. Após homogeneização, 100 µL da suspensão foram semeados através de
esgotamento por quadrantes em três placas de petri contendo ágar níger (Guizotia
abyssinica), incubando-se a 30°C por até sete dias. As culturas foram examinadas
diariamente, identificando-se todas as colônias sugestivas, ou seja: marrons, pequenas
e brilhantes que se desenvolveram no ágar níger (SILVA e PAULA, 1963; SWINNE-
DESGAIN, 1976; BAWENS et al., 1986; RUIZ, VELEZ e FROMTLING, 1989; ELLIS e
PFEIFFER, 1990; MACHADO, AMARAL e SEVERO, 1993; OLIVEIRA et al., 2004;
PAL, 1995; QUEIROZ-TELLES et al., 1997; RUBIO et al., 1984).
4.6 IDENTIFICAÇÃO DE ISOLADOS
A identificação dos isolados foi feita por métodos morfológicos e
fisiológicos. Dentre os testes morfológicos observou-se macromorfologia e
micromorfologia fúngica, sendo esta realizada em objetivas de 10 e 40 x. Com
14
relação aos testes fisiológicos pesquisou-se a ação da uréase, capacidade de
assimilação de carbohidratos, além da pesquisa da fenol oxidase feita
inicialmente no meio de ágar níger e a termotolerância a 35°C.
Os isolados foram identificados através da realização do teste de
Auxanograma (teste de assimilação de carbohidratos), onde são colocados em
placas de 150 mm X 90 mm, uma solução das colônias suspeitas de C.
neoformans, suspensas em salina 0,85% esterilizada. Após se adicionar a
suspensão são adicionados 15 ml do meio fundido como fonte de Nitrogênio e
fonte de Carbohidrato conhecidas, em seguida através de movimentos lentos se
distribui o meio por toda a placa, após a solidificação do meio foram adicionados
os açúcares para o teste em discos ou em pó. A turbidez foi ajustada utilizando-se
a escala 0,5 McFarland (PROBAC Brasil), assegurando uma suspensão contendo
aproximadamente 1 X 10
6
a 5 X 10
6
células por mL, assim a leitura foi realizada
com 24 e 48 horas de incubação à 35ºC.
Os 11 isolados identificados como C. neoformans mostraram o mesmo
perfil fisiológico condizente com a literatura, onde estes são positivos para a
assimilação de peptona, rafnose, dextrose, sacarose, maltose, dulcitol, trealose,
galactose e inositol e não apresentam assimilação de KNO3, lactose e melobiose.
Na tentativa de se identificar o C. gatti, todos os isolados foram semeados
em ágar canavanina, glicina e azul de bromotimol (CGB), que é usado com
sucesso para isolamento diferencial das espécies. De um a cinco dias, o C. gattii
torna o meio de CGB, cuja cor original é verde claro, em azul, devido a alterações
no pH. As variedades neoformans e grubbi não produzem tais mudanças
(SWINNE-DESGAIN, 1975; LACAZ et al., 1987; ELLIS e PFEIFFER, 1990;
MACHADO, AMARAL e SEVERO, 1993; OLIVEIRA et al., 2004).
4.7 TESTES DE SUSCETIBILIDADE
4.7.1 Meio Sintético
O meio de cultura utilizado para os testes de suscetibilidade foi o RPMI
1640 (Sigma). Este meio foi tamponado com MOPS (ácido 3-(N-morfolino)
15
propanosulfônico) com concentração final de 0,156 mol/Litro em pH 7,0,
esterilizado por filtração (usando-se filtro 0,22 µm), sendo utilizado o MOPS por
não interferir na atividade dos antifúngicos, e armazenado em geladeira (4ºC) até
o momento do uso (BRANDT et al., 2001; CALVO et al., 2001; NCCLS, 2002).
4.7.2 Preparo do Inóculo
Os isolados foram mantidos através de subcultivos em ágar batata–
dextrose à 35ºC até o momento do plaqueamento também em ágar batata
dextrose, após 48 horas de incubação aproximadamente cinco colônias foram
suspensas em 5 ml de salina estéril (0,85%), e a turbidez foi ajustada utilizando-
se a escala 0,5 McFarland (PROBAC Brasil), assegurando uma suspensão
contendo aproximadamente 1 X 10
6
a 5 X 10
6
células por mL, em seguida cada
uma das suspensões foi diluída 1:50 em salina esterilizada e 1:20 em meio RPMI,
deixando a suspensão 2X concentrada (1X 10
3
a 5X 10
3
UFC/mL), esta
suspensão será diluída 1:2 com a suspensão de antifúngicos a ser testado, no
momento da inoculação da placa de microtitulação (NCCLS, 2002).
4.7.3 Preparo das Drogas Antifúngicas
Para este teste de suscetibilidade foram utilizadas três drogas antifúngicas:
anfotericina B (CRISTÁLIA-Brasil), fluconazol (MERK-4148) e Itraconazol (MERK-
5266), sendo que anfotericina B e itraconazol foram dissolvidos em DMSO
(Dimetilsufóxido) e fluconazol em água ultrapura (Apêndice 1) Mostra a lista das
drogas utilizadas e diluições testadas no teste de sensibilidade (ver apêndices)
(NCCLS, 2002).
As diferentes diluições foram adquiridas em concentrações 100 vezes a
concentração utilizada. No momento do uso cada concentração de cada
antifúngico foi diluído 1:100 em meio RPMI 1640, deixando as suspensões 2x
concentradas, e estas foram diluídas 1:2 (proporção 1:1) no momento da
inoculação da placa de microtitulação, juntamente com a suspensão de C.
neoformans, também 2x concentrada (NCCLS, 2002).
16
Para o teste de microdiluição foram utilizadas placas de microtitulação de fundo
chato contendo 96 poços (KARTEL-Itália). Cada poço recebeu 100 µL da
suspensão de C. neoformans em meio RPMI 2x concentrada, e 100 µL da
suspensão do antifúngico também 2x concentrada (NCCLS, 2002; KOBAYASHI et
al., 2005).
Para cada diluição de cada uma das drogas, foi deixado um poço contendo
apenas o agente antifúngico, este poço foi utilizado para controle negativo do
crescimento do fungo no teste, o tubo esterilizado onde se realizou a diluição das
amostras de C. neoformans em meio RPMI 1640 foi colocado a 35ºC como
controle positivo do crescimento do fungo, que ocorreu em 48 horas (NCCLS,
2002).
A determinação de concentração mínima inibitória para cada uma das
drogas seguiu o critério determinado pela CLSI. Lista de escores padronizados
para o método de suscetibilidade (Apêndice 7).
Para anfotericina B, a concentração mínima inibitória (CMI) foi determinada
como a menor concentração onde se observou o escore 0 (oticamente claro).
Para fluconazol e itraconazol, a concentração mínima inibitória (CMI) ficou
determinada como a menor concentração que apresentou o escore 2 (redução
proeminente do crescimento).
4.7.4 Tempo de Leitura do Teste
Os resultados para testes de microdiluição para concentração mínima
inibitória (CMI) são alcançados com leitura de 24 a 48 horas. A leitura realizada
com 48 horas é a que apresenta resultados melhores e com breakpoints (ponto
de mudança na turvação do meio) visualizados com maior facilidade. (NCCLS,
2002; SOARES et al., 2005).
Segundo SOARES et al., 2005, um isolado de C. neoformans somente
pode ser considerado resistente a estas drogas testadas se sua concentração
mínima inibitória (CMI) for ≥ 2 µg/mL para anfotericina B, se ≥16 µg/mL para
fluconazol e se ≥1 µg/mL para Itraconazol.
17
5 RESULTADOS e DISCUSSÃO
Das 88
amostras coletadas, 11 apresentaram positividade para o
desenvolvimento do C. neoformans, com uma taxa de 12,5% que apresenta-se
em conformidade com os estudos tomados como base, como os de KOBAYASHI
et al. (2005) que obtiveram 20,9% na Cidade de Goiânia, SOARES et al. (2005)
que obtiveram 13,5 % na Cidade de Santos e TAY et al. (2005) na Malásia que
obtiveram 3,5%.
No trabalho de TAY et al., os pesquisadores, explicam que devido à
dificuldade em encontrarem amostras secas de fezes de pombos a taxa de
isolamento ambiental se apresentou baixa em comparação com os outros estudos
(TAY et al., 2005) .
Todas as amostras positivas neste estudo foram obtidas de locais com
grande concentração de pombos, protegidos das intempéries e sob o abrigo da
luz solar, fornecendo amostras de fezes secas e em grande quantidade, que
segundo KOBAYASHI et al. (2005) devido à capacidade do Crypoccoccus
neoformans em resistir a ambientes ressecados sobrevive em quanto que outros
microrganismos morrem em situações adversas como as encontradas nestas
amostras. O anexo II mostra figuras dos locais de onde foram coletadas amostras
de fezes de pombos, as quais foram positivas para o desenvolvimento do C.
Neoformans.
O Hospital de Clínicas de Curitiba apresentou cinco amostras positivas
para o desenvolvimento do fungo (Anexo III, Tabela 1) assim como o CEASA que
apresentou seis amostras positivas para o desenvolvimento do C. Neoformans
(Anexo III, Tabela 02).
Nas 77 amostras restantes coletas de locais como as praças Santos
Andrade, Rui Barbosa e Portugal (Igreja do Perpétuo Socorro), dos eucaliptos do
Centro Politécnico da UFPR, Moinho Molino Rosso na Cidade de Pinhais, uma
amostra de fezes de morcego, amostras de areia e terra de galinheiros e solo de
locais freqüentados por pombos na Cidade de Curitiba, apos análise (descrita em
materiais e métodos) não apresentaram resultado positivo para o
desenvolvimento do C. neoformans, segundo KOBAYASHI et al. (2005) isto
18
ocorre por que amostras que se apresentam úmidas, criam ambiente favorável ao
desenvolvimento de bactérias, que alcalinizam a amostra e inibem o
desenvolvimento do C. Neoformans. Amostras coletadas no Jockey Club,
encontravam-se em lugar coberto e em grande quantidade, porém, estavam
úmidas e portanto não apresentaram desenvolvimento do fungo, o que e
explicado por KOBAYASHI et al. (2005) relacionando-as com a alcalinização
promovida pelas bactérias .
Os 11 isolados foram caracterizados como C. neoformans, pois quando
semeados em ágar CGB que apenas é positivo para amostras de C. gattii, não
apresentaram mudança de cor, caracterizando o teste como negativo.
Quanto ao teste de suscetibilidade do C. neoformans frente aos
antifúngicos anfotericina B, fluconazol e itraconazol os resultados estão
apresentados no Anexo I (Quadros 1, 2 e 3) que mostram CMI encontrada para a
anfotericina B entre 0,03 e 0,5 µg / mL, para fluconazol de 0,03 µg / mL e para
itraconazol de 0,03 µg / mL, estes resultados segundo SOARES et al. (2005)
estão abaixo dos valores considerados como resistentes, assim os isolados
ambientais de C. neoformans testados neste estudo são sensíveis às drogas
usadas. Estes resultados estão em conformidade com os resultados
apresentados por TAY et al. (2005), SOARES et al. (2005), KOBAYASHI et al.
(2005) e CALVO et al. (2001), que também não encontraram amostras de C.
neoformans resistentes aos antifúngicos, o que pode ser visto no comparativo
entre os estudos apresentado no Anexo IV (Quadro 1).
Se desconsiderarmos a origem ambiental das amostras de C. neoformans
testadas, e considerarmos estes isolados como potenciais patógenos, os
resultados apresentados pelos testes de sensibilidade frente à anfotericina B,
fluconazol e itraconazol, concluiríamos que os C. neoformans isolados da Cidade
de Curitiba seriam de fácil tratamento, já que as CMI alcançadas pelos isolados
estão abaixo do que se considera como resistente, sendo desta forma inibido o
seu desenvolvimento e reprodução.
19
6 CONCLUSÃO
A Cidade de Curitiba apresenta possíveis fontes ambientais para o
desenvolvimento do C. neoformans.
Fezes secas, em grande quantidade e protegidas das intempéries,
apresentam melhores condições para o isolamento ambiental do C.
neoformans, isto é explicado por KOBAYASHI et al. (2005) como sendo uma
habilidade do fungo em resistir a ambientes ressecado enquanto que outros
microrganismos morrem em tais condições. Por outro lado fezes úmidas e
desprotegidas, que devido à alcalinização das fezes em decorrência da ação
de bactérias propiciam ambiente desfavorável ao desenvolvimento do fungo.
O método de Staib modificado para isolamento do C. neoformans é
apresentou-se neste estudo de maneira eficiente no isolamento do C.
neoformans provenientes de amostras ambientais
Os isolados de C. neoformans obtidos de amostras ambientais na Cidade de
Curitiba apresentaram, assim como em outros estudos realizados no Brasil e
no mundo, suscetibilidade aos antifúngicos anfotericina B, fluconazol e
itraconazol, que são os medicamentos utilizados para o tratamento da
criptococose.
A metodologia recomendada pela CLSI (Clinical laboratory Standart Institute),
de microdiluição em meio líquido RPMI 1640, tamponado com MOPS (ácido 3
(N-morfolino) propanosulfônico) apresenta-se como uma metodologia de
confiável para determinação da Concentração Mínima Inibitória (CIM) em
isolados de C. neoformans em laboratórios de micologia .
20
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23
ANEXOS
24
ANEXO I
Para os Quadros 1, 2 e 3, consideramos – (como negativos para
crescimento) e + (como positivo para crescimento), assim podemos encontrar a
CMI para cada um dos antifúngicos testados.
QUADRO 1 - RESULTADO PARA O TESTE DE SENSIBILIDADE AO FLUCONAZOL
Hospital de Clínicas CEASA
amostra 02 39 44 45 47 56 57 73 74 80 81
µg/mL
64 - - - - - - - - - - -
32 - - - - - - - - - - -
16 - - - - - - - - - - -
8 - - - - - - - - - - -
4 - - - - - - - - - - -
2 - - - - - - - - - - -
1 - - - - - - - - - - -
0.5 - - - - - - - - - - -
0,250 - - - - - - - - - - -
0,125 - - - - - - - - - - -
Fonte: O autor
QUADRO 2 - RESULTADOS PARA O TESTE DE SENSIBILIDADE A ANFOTERICINA B
Hospital de Clínicas CEASA
amostra 02 39 44 45 47 56 57 73 74 80 81
µg/mL)
16 - - - - - - - - - - -
8 - - - - - - - - - - -
4 - - - - - - - - - - -
2 - - - - - - - - - - -
1 - - - - - - - - - - -
0,5 - + + + - + - - - + -
0,250 - + + + - + - - - + -
0,125 - + + + - + - - - + -
0,06 - + + + - + - - - + -
0,03 - + + + - + - - - + -
Fonte: O autor
25
QUADRO 3 - RESULTADOS PARA O TESTE DE SENSIBILIDADE AO ITRACONAZOL
Hospital de Clinicas CEASA
amostra 02 39 44 45 47 56 57 73 74 80 81
µg/mL
16 - - - - - - - - - - -
8 - - - - - - - - - - -
4 - - - - - - - - - - -
2 - - - - - - - - - - -
1 - - - - - - - - - - -
0,5 - - - - - - - - - - -
0,25 - - - - - - - - - - -
0,125 - - - - - - - - - - -
0,06 - - - - - - - - - - -
0,03 - - - - - - - - - - -
Fonte: O autor
26
ANEXO II
FIGURA 1 - MOSTRA ACÚMULO DE FEZES NAS CANALETAS DO SETOR DE MANUTENÇÃO
DO H.C, ESTE LOCAL FOI POSITIVO PARA A AMOSTRA 39
Legenda: Indica o acúmulo de fezes nas canaletas da manutenção do H.C.
Fonte: O autor
FIGURA 2 - MOSTRA ESCADA DO PRÉDIO DESATIVADO DO CEASA, ESTE LOCAL FOI
POSITIVO PARA ISOLAMENTO DA AMOSTRA 57
Legenda: Indica o acúmulo de fezes na escada do prédio do CEASA
Fonte: O autor
27
FIGURA 3 - MOSTRA O PISO DO PRÉDIO INTERDITADO DO CEASA, ESTE LOCAL FOI
POSITIVO PARA O ISOLAMENTO DA AMOSTRA 81
Legenda: Indica o acúmulo de fezes por todo o piso do prédio
interditado do CEASA
Fonte: O autor
FIGURA 4 - MOSTRA VIGAS DE MADEIRA DO TELHADO DO PRÉDIO DO CEASA, A
AMOSTRA DESTE LOCAL FOI POSITIVA PARA O ISOLAMENTO DA AMOSTRA 74
Legenda: Indica o acúmulo de fezes sobre as vigas caídas
Fonte: O autor
28
FIGURA 5 - MOSTRA ACÚMULO DE FEZES DENTRO DO PRÉDIO INTERDITADO DO CEASA,
ESTA AMOSTRA FOI POSITIVA PARA O ISOLAMENTO DA AMOSTRA 73
Legenda: Indica o acúmulo de fezes próximas a porta
Fonte: O autor
FIGURA 6 - MOSTRA O TELHADO DO ESTACIONAMENTO DO CEASA ONDE SE
ENCONTRAM 2 POMBAS MORTAS JUNTO AS FEZES DE POMBO, A AMOSTRA
DESTE LOCAL FOI POSITIVA PARA O ISOLAMENTO DA AMOSTRA 80
Fonte: O autor
29
FIGURA 7 - MOSTRA O PRÉDIO INTERDITADO, DESTE LOCAL FORAM COLETADAS
DIVERSAS AMOSTRAS DE FEZES DE POMBO QUE FORNECERAM SEIS
ISOLADOS DE C. neoformans PARA ESTE TRABALHO
Fonte: O autor
Este prédio fica na esquina das ruas professor Nivaldo Braga e Prefeito
Mauricio Fruet, no bairro Capão da Imbuia.
30
ANEXO III
TABELA 1 - MOSTRA AS AMOSTRAS POSITIVAS PARA DESENVOLVIMENTO DO C.
neoformans ENCONTRADAS NO HOSPITAL DE CLÍNICAS, INCLUINDO LOCAL E
DATA DE COLETA
Número da amostra Local da coleta Data da coleta
02 fisioterapia do HC (janela) 21/09/04
39 canaleta da manutenção 19/02/05
44 Rampa de acesso (HC) 09/04/05
45 2ª canaleta da manutenção 09/04/05
47 Parede do prédio 09/04/05
Fonte: O autor
TABELA 2 - MOSTRA AS AMOSTRAS POSITIVAS PARA DESENVOLVIMENTO DO C.
neoformans ENCONTRADAS NO CEASA, INCLUINDO LOCAL E DATA DE COLETA
Número da amostra Local da coleta Data da coleta
56 1ª escada CEASA 11/06/05
57 2ª escada CEASA 11/06/05
73 Prédio interditado (Parede) 30/07/05
74 Prédio interd. embaixo das vigas 30/07/05
80 Telhado do estacionamento (CEASA) 07/08/05
81 Prédio desativado (antigo CEASA) 07/08/05
Fonte: O autor
31
ANEXO IV
QUADRO 1 - COMPARATIVO ENTRE OS RESULTADOS DE CURITIBA E OS UTILIZADOS
COMO BASE
Droga
Estudo
anfotericina B fluconazol itraconazol
CURITIBA 0.03 a 1 µg/mL 0.125µg/mL 0.03µg/mL
CALVO et al. 0.125 a 0.5µg/mL 4 a 8µg/mL 0.06 a 0.125µg/mL
KOBAYASHI et al. 0.015 a 0.125µg/mL 0.250 a 2 µg/mL 0.06 a 0.12µg/mL
SOARES et al. 0.25 a 1 µg/mL 0.012 a 1 µg/mL 0.015 a 0.06 µg/mL
TAY et al. 1µg/mL 8µg/mL 0.125 µg/mL
32
APÊNDICES
33
APÊNDICE 1 - LISTA DAS DROGAS UTILIZADAS E DILUIÇÕES TESTADAS
anfotericina B fluconazol itraconazol
16µg/mL 64µg/mL 16µg/mL
8µg/mL l 32µg/mL 8µg/mL
4µg/mL 16µg/mL 4µg/mL
2µg/mL 8µg/mL 2µg/mL
1µg/mL 4µg/mL 1µg/mL
0,5µg/mL 2µg/mL 0,5µg/mL
0,25µg/mL 1µg/mL 0,25µg/mL
0,125µg/mL 0,5µg/mL 0,125µg/mL
0,06µg/mL 0,25µg/mL 0,06µg/mL
0,03µg/mL 0,125µg/mL 0,03µg/mL
Fonte: NCCLS
34
APÊNDICE 2 - AÇÃO DA ANFOTERICINA B SOBRE O C. neoformans
1
1
2
3
3
2
Legenda: (1) Ergosterol; (2) União dos Poliênicos da anfotericina B com o
ergosterol na membrana do fungo;
(3) Poro formado na
membrana do fungo, ocasionando desequilíbrio osmótico e morte
da célula.
APÊNDICE 3 - FORMAÇÃO CORRETA DO ERGOSTEROL
14-metilesterol
Converte o 14-metilesterol
em Ergosterol
Ergosterol e formado e
depositado na membrana
celular
35
APÊNDICE 4 - AÇÃO DOS AZÓIS NA INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO ERGOSTEROL
14-metilesterol
Enzima α-14-dimetilase
Não ativação da
enzima α-14-dimetilase
A enzima não converte o
14-metilesterol em
Ergosterol
.
Acúmulo de 14-metilesterois
na membrana do fungo,
estes não possuem as
mesmas características, e
assim a célula morre.
Fonte: BERGOLD e GEORGIADIS (2004)
36
APÊNDICE 5 - BAIRROS DE CURITIBA E TIPO DE AMOSTRAS COLETADAS
01-Centro da
cidade, Praças
Santos Andrade e
Rui Barbosa,
coleta de amostras
de fezes de
pombos.
03- Centro Cívico,
coleta de fezes de
pombos do
Passeio Público.
04- Bairro Alto da
Glória, Praça
Portugal e Hospital
de Clínicas, coleta
de amostras de
fezes de pombos.
05-Bairro Alto da
XY, coleta de
amostra de fezes
de morcego.
19- Bairro Tarumã,
Jockey Club de
Curitiba, coleta de
amostras de fezes
de pombos.
20- Bairro Capão
da Imbuia,
CEASA, coleta de
amostras de fezes
de pombos.
22- Bairro Jardim
das Américas,
Centro Politécnico,
coleta de restos
vegetais de
eucaliptos.
63- Bairro Santa
Felicidade, coleta
de amostras de
fezes de pombos.
Fonte: www.curitiba-parana.net/mapas
37
APÊNDICE 6 - CIDADE DE PINHAIS (REGIÃO METROPOLITANA DE CURITIBA)
Legenda: Indica a Cidade de Pinhais, onde fica o Moinho Molino Rosso, de onde
foram coletadas amostras de fezes de pombos
Fonte: www.curitiba-parana.net/mapas/regiao-metropolitana
38
APÊNDICE 7 - MOSTRA OS ESCORES PADRONIZADOS PELA CLSI PARA DETERMINAÇÃO
DE POSITIVIDADE OU NEGATIVIDADE NO CRESCIMENTO DO FUNGO NO
POÇO
Escore 0 Escore 1 Escore 2 Escore 3 Escore 4
Oticamente claro Crescimento
indefinido
Redução
proeminente do
crescimento
Ligeira redução
do crescimento
Nenhuma
redução do
crescimento
Fonte: Documento M27-A2 da NCCLS, atualmente denominada CLSI
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