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Resumo
O presente trabalho teve como objetivos avaliar em pacientes com
aterosclerose obliterante periférica os níveis plasmáticos das citocinas pró e anti-
inflamatórias fator de necrose tumoral- alfa (TNF-α) interleucina 6 (IL-6),
interferon- gama (IFN-γ), interleucina 10 (IL-10) e fator transformador de
crescimento beta (TGF-β), assim como o grau de ativação de monócitos do
sangue periférico, através da capacidade dessas células liberarem peróxido de
hidrogênio (H2O2) e desenvolverem atividade fungicida contra Cândida
&
). Foram avaliados 8 indivíduos do sexo masculino, acima de 60 anos
portadores de claudicação intermitente moderada e 8 indivíduos do sexo
masculino acima de 60 anos que não apresentaram doença arterial periférica.
Observamos que os níveis plasmáticos de todas as citocinas testadas foram
significativamente mais elevados nos pacientes, quando comparados aos
detectados nos indivíduos controle. A capacidade das células de indivíduos
controle e pacientes de liberarem H
2
O
2
foi avaliada antes e após a incubação com
citocinas envolvidas no processo de ativação dessas células, como o IFN-γ e TNF-
α. Observamos que monócitos de indivíduos controle não ativados liberaram
níveis substanciais do metabólito que, no entanto, aumentaram significativamente
após a ativação com IFN-γ ou TNF-α. As células dos pacientes apresentaram um
perfil de resposta semelhante aos apresentados pelos indivíduos controles. No
entanto, quando comparamos a resposta dos dois grupos detectamos que os
monócitos dos pacientes antes e após o processo de ativação, apresentaram
respostas menores que os indivíduos controle. Resultados semelhantes foram
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detectados nos ensaios de avaliação da atividade fungicida isto é, células de
controles e pacientes apresentaram um aumento da atividade fungicida após a
ativação tanto com IFN-γ como com TNF-α. No entanto, os resultados dos
pacientes foram sempre significativamente menores que os detectados para os
controles. A análise conjunta dos resultados revelou uma associação entre altos
níveis de citocinas plasmáticas tanto pró-inflamatórias como anti-inflamatórias a
um processo de desativação dos monócitos do sangue periférico, nos pacientes
avaliados.
1. Introdução
A lesão aterosclerótica é a anormalidade mais comum encontrada nos
vasos sanguíneos, que se desenvolve na íntima sobre um substrato de células
musculares lisas, leucócitos derivados do sangue e de uma quantidade variável de
tecido conjuntivo formando as placas fibrosas que se projetam para dentro do
lúmen
enfraquecendo a subcamada média, impedindo assim o fluxo sanguíneo e
conseqüentemente, levando a necrose tecidual
(1,2,3)
. Evidências têm sido
acumuladas no sentido de sugerir que a lipoproteína de baixa densidade (LDL)
modificada pela oxidação (LDLox) é o principal fator envolvido no
desencadeamento da lesão
(4,5)
.
Essas partículas, após o processo de oxidação tornam-se citotóxicas para
as células endoteliais que, uma vez lesadas passam a expressar e produzir uma
série de moléculas de adesão e quimiocinas proporcionando o recrutamento e a
aderência de monócitos
(6,7,8)
. Adicionalmente, a LDLox pode amplificar esse
processo, regulando positivamente a expressão de genes, nas células endoteliais,
tanto para quimiocinas como para citocinas envolvidas no processo de
diferenciação de monócitos
(9)
. Outros trabalhos têm mostrado que a própria
LDLox é quimiotática para monócitos
(10,11)
.
Os monócitos, uma vez recrutados, penetram no subendotélio, diferenciam-se
em macrófagos que têm como primeira função fagocitar as LDLox
transformando-se nas chamadas células espumosas
(6)
. Assim, a função inicial
dessas células, na resposta inflamatória, seria protetora no sentido de, através
da fagocitose, remover a LDL modificada minimizando os efeitos dessa
partícula sobre as células endoteliais.
No entanto, estudos têm mostrado o papel dúbio dessas células limitando
por um lado, a oxidação pela fagocitose, mas ao mesmo tempo, favorecendo esse
processo, sendo, juntamente com células musculares lisas e endoteliais,
importantes fontes de radicais livres
(12,13)
.
A liberação desses radicais está associada a maior migração de células
musculares lisas da camada média do vaso para camada íntima
(13)
e a uma
amplificação da resposta inflamatória através do aumento da expressão de
moléculas de adesão, produção de fatores quimioatraentes para linfócitos e
principalmente monócitos, aumento da vasoconstrição, angiogênese e apoptose
das células endoteliais
(14-17)
.
Além dos radicais livres, outros fatores extremamente importantes no
processo inflamatório associado à aterosclerose, são as citocinas, com destaque
para as pro-inflamatórias como a interleucina-1 (IL-1), fator de necrose tumoral-
alfa (TNF-α) , interleucina-6 (IL-6), interferon-gama (IFN-γ)
(3,18-21)
que participam
do recrutamento de células inflamatórias, aumento da expressão de moléculas de
adesão, diferenciação celular, produção de proteínas de fase aguda, quimiotaxia,
proliferação de células musculares lisas e ativação de monócitos e macrófagos
(3,22-25)
. Todos esses processos amplificam a resposta inflamatória local e
sistêmica, culminando com alterações importantes nos sistemas de coagulação,
fibrinolítico e de plaquetas. No entanto, trabalhos também demonstram claramente
a participação de citocinas anti-inflamatórias como a interleucina 10 (IL-10) e o
fator transformador de crescimento beta (TGF-β) que são mediadores
multifatoriais capazes de regular o crescimento, diferenciação e a função de
células imunes, controlando assim, a resposta inflamatória. Podem ser produzidos
por várias células incluindo células musculares lisas, monócitos, células T e
plaquetas
(26)
.
Estudos têm demonstrado que os macrófagos presentes na placa
aterosclerótica estão altamente ativados, com conseqüente aumento da expressão
de moléculas de classe II do complexo de histocompatibilidade principal. Esse
processo faz com que essas células tornem-se importantes células
apresentadoras de antígeno, com o desenvolvimento de uma resposta imune
específica, tendo como possível antígeno indutor a LDLox
(27)
que determina um
padrão de resposta de células CD
+
4 do tipo TH1, com produção de IFN-γ e TNF-α
e β
(3,28)
e interleucina-12 (IL-12)
(23,29)
. Nesse sentido, o IFN-γ tem sido
considerado como uma das principais citocinas liberadas durante a aterosclerose
que, através de um processo de ativação de macrófagos, amplifica as ações
dessas células, mas sob certas circunstâncias induzem a apoptose
(30,31)
.
A doença arterial periférica é uma condição causada pelo bloqueio do fluxo
sanguíneo conseqüente ao depósito de colesterol nas artérias dos braços, pernas
e aorta
(32)
.
O diagnóstico clínico das doenças arteriais periféricas baseia-se na busca e
na interpretação de sinais e sintomas que podem aparecer no local de uma
alteração arterial ou que surgem em decorrência de isquemia no território irrigado
pela artéria lesada
(33)
.
A claudicação intermitente é um sintoma patognomônico da obstrução
arterial crônica é um dos sintomas mais específicos e bem definidos da medicina.
Claudicar vem do verbo claudicare que significa não ter firmeza nos pés. A origem
da expressão é possivelmente ligada ao fato de que o indivíduo, após andar
determinada distância, comece a mancar pelo surgimento de dor em determinados
grupos musculares, essa dor ocorre pela diminuição do fluxo sanguíneo para os
músculos em exercício, desaparecendo com o repouso e recomeçando a após a
mesma quantidade de exercícios, sendo por isso intermitente
(32,33)
.
Na aterosclerose obliterante periférica, os estudos enfocando o papel das
células da resposta imune e de seus mediadores, particularmente os referentes a
atividade de monócitos/ macrófagos e produção de citocinas, são bastante
escassos.
Considerando esse último aspecto e que as alterações funcionais das
células participantes do processo de aterogênese podem se manifestar no sangue
periférico, o objetivo do presente trabalho foi avaliar, em pacientes com
aterosclerose obliterante periférica, os níveis plasmáticos das citocinas pró-
inflamatórias e anti-inflamatórias IL-6, TNF-α , IFN-γ , IL-10 e TGF-β, assim como
o grau de ativação de monócitos do sangue periférico através da capacidade
dessas células liberarem peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e desenvolverem atividade
fungicida contra Cândida albicans (C. albicans).
2. Material e Métodos
2.1. Pacientes e indivíduos controle
O presente estudo foi desenvolvido com 8 indivíduos do sexo masculino,
acima de 60 anos portadores de claudicação intermitente moderada, atendidos
pelo ambulatório de claudicação do serviço de Cirurgia Vascular Periférica do
Hospital das Clínicas da faculdade de Medicina – UNESP Botucatu. O diagnóstico
clínico foi realizado pelo índice de pressão tornozelo braço, prova de esforço.
Foram também avaliados com os mesmos critérios, 8 indivíduos do sexo
masculino acima de 60 anos que não apresentaram doença arterial periférica.
O consentimento dos indivíduos para a participação no presente trabalho foi
obtido após informação e esclarecimento sobre os objetivos da pesquisa e
assinatura do formulário de consentimento tendo aprovação do Comitê de Ética
em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu em 06 de novembro de 2000.
2.2. Obtenção do plasma para realização dos exames bioquímicos e
dosagem de IL-6,TNF-α, IFN-γ, IL-10 e TGF-β
Sangue periférico de pacientes e indivíduos controles (volume de 10mL)
submetidos a jejum de 12 horas foram coletados da região cubital, colocados em
tubo contendo heparina e centrifugados a 400g a 4°C por 10 minutos. Os plasmas
obtidos foram estocados a - 70°C , para posteriores dosagens.
2.3. Isolamento e cultura de monócitos do sangue periférico
Sangue periférico dos indivíduos foram obtidos por punção venosa, sendo 20
mL colocados em tubos estéreis contendo 200L de heparina (Liquemine-Roche).
As células mononucleares foram obtidas por meio da separação em gradiente de
Ficoll-Hypaque. O anel rico em linfócitos e monócitos foi lavado inicialmente com
solução gelada de EDTA-PBS, por 10 minutos a 200g e, logo após, com meio de
cultura RPMI por mais 10 minutos a 200g. Após este período, a suspensão celular foi
ressuspensa em meio de cultura RPMI 1640 (Gibco Laboratories, Grand Island, N.
Y.) suplementado com 2 mM de L-glutamina (Sigma Chemical Co, ST Louis, MO,
USA), 40 g/mL de gentamicina e 10% de soro autólogo inativado (Meio de Cultura
de Células Completo: MCCC), sendo a identificação e viabilidade dos monócitos
realizada através da incorporação pelo vermelho neutro (alíquotas de 50 L da
suspensão celular foram incubadas a 37°C durante 10 minutos com 0,45 mL da
solução do corante a 0,02%). A seguir, a concentração foi ajustada para 2x10
6
monócitos/mL, com posterior plaqueamento da suspensão celular (100L/orifício) em
placas de microcultura de fundo chato com 96 orifícios. Após uma hora de
incubação a 37°C em tensão de 5% de CO
2
, as células não aderentes foram
eliminadas através de lavagem das placas com meio de cultura RPMI.
As células foram então incubadas durante 18 horas, em tensão de 5% de CO
2
à 37ºC, na presença de 100L de MCCC, MCCC + IFN- recombinante humano
(R&D Systems), MCCC + TNF-α recombinante humano (R&D Systems) em
diferentes concentrações.
2.4. Atividade fungicida de monócitos contra C. albicans.
Foi utilizada a cepa mantida em nosso laboratório através de cultivo em
meio BHI ágar em tubos de 20 x 20 mm, com subcultivos semanais. As culturas
foram usadas após 5 ou 6 dias de cultivo.
Após o período de incubação de 18 h, os sobrenadantes das culturas de
monócitos ativados ou não com as citocinas foram dezprezados e as monocamadas
de monócitos estimuladas com 1ml de solução de meio RPMI + 10% soro AB fresco
contendo C.albicans na proporção de um fungo para 25 monócitos (1:25) por um
período de 2,5 horas de incubação a 37C em tensão de 5% de CO
2
( culturas
experimentais). Alguns orifícios da placa de cultura receberão apenas as
suspensões controles do fungo em concentrações equivalentes às utilizadas na
incubação com as monocamadas de monócitos ( culturas controles ). Após um
período de incubação, os sobrenadantes das culturas foram coletados, e as
monocamadas de monócitos submetidas a diversas lavagens com água destilada.
Este processo permitiu que os monócitos sejam removidos da lamínula, lisados, com
conseqüente liberação dos fungos que serão eventualmente fagocitados. Após o
tratamento com água destilada, as suspensões, contendo fungos viáveis ou não,
foram semeadas em placas contendo BHI ágar, sendo as colônias contadas após 24
h de incubação a 37C.
A atividade fungicida foi detectada através da contagem das unidades
formadoras de colônias (UFC) e calculada através da seguinte fórmula:
% Atividade Fungicida = 1 - [ média das UFC das culturas
experimentais ] x 100
média das UFC das culturas controles
2.5. determinação da liberação de água oxigenada (H
2
O
2
)
A produção de H
2
O
2
foi determinada segundo o método descrito por Pick &
Keisari (1980)
(34)
e adaptado por Pick & Misel (1981)
(35)
.
Após o período de incubação de 18 h, os sobrenadantes das culturas de
monócitos ativados ou não com as citocinas foram dezprezados e as células
ressuspensas ao volume original em solução de vermelho fenol contendo: 140 mM
de NaCl; 10 mM de tampão fosfato, pH 7; 5,5 mM de dextrose; 0,56 mM de vermelho
fenol; 0,01 mg/ml de peroxidase de raiz forte tipo II (Sigma, Chemical Co USA) e 1
ug de “Phorbol Mirestate Acetate” (PMA). Após 1 hora, a reação foi interrompida pela
adição de 0,01 ml de NaOH 1N. As amostras foram ensaiadas em quadriplicata. A
absorbância foi determinada em leitor automático de ELISA, com filtro de 620 nm,
contra um branco constituído de solução de vermelho fenol e NaOH 1N.
Os resultados foram expressos em nanomoles de H
2
O
2
/2x10
5
células, a partir
de curva padrão estabelecida em cada ensaio, constituída com concentrações
molares conhecidas de H
2
O
2
em tampão vermelho fenol. Em nossas condições
experimentais, a curva foi realizada com concentrações 0,5; 1,0 1,5 e 2,0 nM de
H
2
O
2
.
2.6. Dosagem Plasmática de IL-6
As placas de 96 orifícios e fundo plano (Maxsorb-Nunc Life Tech. Inc., MD,
USA) foram sensibilizadas por 18h a 5ºC com anticorpo monoclonal de
camundongo anti-IL6- humano (R&D Systems), diluído em PBS, pH 7.2, na
concentração de 2g/mL. Após esse período, os orifícios foram lavados 3 vezes
com 300L de PBS, pH 7.2, contendo Tween 20 a 0,05% (PBST). O bloqueio da
placa foi realizado adicionando-se a cada orifício 300L de PBS contendo 5%
sacarose, 0.5% de Tween 20, 1% de soro albumina bovina (BSA) e 0,005% de
NaN
3
(azida sódica) e posterior incubação a temperatura ambiente, por 2 horas. A
seguir, a placa foi lavada conforme descrito acima e a alguns orifícios da placa
foram adicionados 100L de IL6- recombinante humano (R&D Systems) cuja
concentração inicial foi diluída de forma seriada estabelecendo as concentrações
de 5000, 2500, 1250, 625, 312, 156, 78 e 39 pg/mL para obtenção de curva
padrão. Nos orifícios restantes foram colocados 100L de plasma dos indivíduos
controles e dos pacientes. Após 2 horas de incubação à temperatura ambiente,
foram retiradas as amostras, realizada nova lavagem das placas e adicionados
100 L do anticorpo revelador policlonal de cabra anti-IL6 humano conjugado com
biotina ( R&D Systems), na concentração de 100ng/mL, seguindo-se incubação
por 2 horas á temperatura ambiente. A placa foi lavada novamente com PBST e
adicionados, 100L de avidina conjugada com peroxidase (Sigma Chemical Co,
ST Louis, MO, USA) diluída em PBS contendo 0,1% de BSA na concentração de
1:10.000, por 30 minutos à 37°C. Em seguida, adicionaram-se 100L do substrato
enzimático, constituído por 12,5mL de tampão citrato-fosfato 0,1M, pH5.0
contendo 1mg/mL do revelador ortofenilenodiamina (Sigma Chemical Co, ST
Louis, MO, USA) e 10L de H
2
O
2
a 30% (Sigma , ST Louis, MO, USA). As placas
foram incubadas a temperatura ambiente por 15 minutos e a reação foi bloqueada
pela adição de 50L de ácido sulfúrico 2M. A leitura dos ensaios foi realizada em
leitor de ELISA (Multiskan EFLAB, Helsinki, Finland) com comprimento de onda de
492 nm e os níveis de plasmáticos de IL-6 calculados utilizando-se a curva
padrão.
2.7. Dosagem Plasmática de TNF-α, IFN-γ, IL-10 E TGF-β
A dosagem plasmática de todas essas citocinas, foram determinadas pelo
KIT comercial de ELISA para determinações em seres humanos (quantikine ELISA
kit R&D Systems) com sensibilidade de 5.0 pg/mL.
2.8. Exames Bioquímicos
Os exames bioquímicos de Colesterol, triglicérides, HLD colesterol, LDL
colesterol, glicose, uréia, creatinina, Alanina transaminase (TGP), aspartato
transaminas (TGO) foram realizados por kits enzimáticos colorimétricos da marca
CELM.
A proteína C reativa foi dosada pela química seca no aparelho Vitros-950
com o Kit específico da marca JOHNSON e α1-glicoproteína ácida por
Nefelometria. O aparelho utilizado foi o Nefelômetro Bohering com o Kit específico
da marca Bohering.
2.9. Análise Estatística
Os resultados referentes a avaliação do grau de ativação de monócitos
foram analisados pelo teste de Análise de Variância ( ANOVA ) para amostras
dependentes, e as médias comparadas pelo teste de correlações múltiplas de
Tukey-Kramer.
Para análise dos resultados referentes à dosagem de citocinas, exames
bioquímicos e perfil lipídico foi utilizado o teste T de Student.
Os procedimentos estatísticos para todas as análises foram
aplicados
empregando-se o programa Graph Pad Instat 3.05, San Diego, CA, USA ( ) e o
nível de significância adotado foi de 5%.
3. Resultados
3.1. Exames Bioquímicos
Os resultados referentes a determinação plasmática de glicose ( valores de
referência (vr)= 70,0-110,0 mg/dL), alanina aminotransferase (ALT) (vr= 3,0-65,0
U/L), aspartato amino transferase (AST) ( vr= 1,0 a 37,0 U/L ) uréia ( vr= 15,0 a
40,0 mg/dL) e creatinina ( vr=0,6 a 1,4mg/dL) de pacientes e indivíduos controle
podem ser visualizados na Tabela 1. Em relação aos níveis de glicose, os
indivíduos controle mostraram resultados que variaram de 78,0 a 96,0 mg/dL
(média ± desvio padrão = 88,0 ± 2,5 mg/dL), e os pacientes de 80,0 a 104 mg/dL
(média ± desvio padrão= 92,04 ±2,9 mg/dL). Os de alanina transaminase foram de
8,0 a 32,0 U/L (média ± desvio padrão= 18,85 ± 2,7) para os indivíduos controle,
enquanto os pacientes apresentaram níveis de 12,0 a 26,0 U/L (média ± desvio
padrão= 20,42 ± 2,76). Os níveis de uréia foram de 25,0-45,0 mg/dL (média ±
desvio padrão= 30,57 ± 2,53) para os indivíduos controle e 24,0-46,0 mg/dL
(média ± desvio padrão= 36,14 ± 2,82) para os pacientes. Os valores de creatinina
variaram de 1,0 a 1,2 mg/dL (média ± desvio padrão= 1,1 ± 0,1 ) e 0,9 a 1,3
(média ± desvio padrão =1,08 ± 0,13 ) para controles e pacientes respectivamente.
Observamos que com exceção de um indivíduo controle e um paciente que
apresentaram níveis de uréia ligeiramente altos em relação a faixa de
normalidade, tanto os pacientes como os indivíduos controle, apresentaram níveis
de todos os fatores avaliados dentro dessa faixa. Assim, a análise comparativa
dos
resultados de todos os parâmetros apresentados por controles e pacientes
não revelou diferenças importantes entre os dois grupos, indicando que a grande
maioria dos indivíduos testados não apresentou resultados indicativos de
presença de diabetes, e outros problemas hepáticos e renais.
3.2. Perfil Lipídico
Os resultados referentes à determinação plasmática de colesterol total ( vr :
200,0-239,0 mg/dL) , triglicérides ( vr : < 200,0mg/dL), HDL ( vr > 55,0 mg/dL) e
LDL (vr <100,0 mg/dL) são mostrados na Figura 1. Os valores referentes a
dosagem plasmática de colesterol total para os indivíduos controle variaram de
100,0-297,0 mg/dL e de 150,0-259,0 mg/dL para os pacientes. Em relação aos
triglicérides a faixa de resultados variou de 72,0-206,0 mg/dL para o indivíduos
controle e de 100,0-190,0 mg/dL para os pacientes. A determinação plasmática de
HDL resultou em valores que variaram de 39,0 a 76,0 mg/dL para indivíduos
controle e 29-53 mg/dL para os pacientes. Os valores de LDL foram de 104,0-
155,0 mg/dL para os controles e 143,0-201,0 mg/dL para os pacientes.
Detectamos, portanto, que os níveis de colesterol total tanto para controles como
para pacientes apresentaram-se na maioria dos indivíduos acima da faixa de
normalidade, chamando a atenção que os apresentados pelos pacientes (média+
desvio padrão = 203,4 ± 20,32 mg/dL ) que foram ligeiramente maiores que os dos
controles (201,7 ± 16,0 mg/dL). Os níveis de triglicérides para indivíduos controle e
pacientes apresentaram-se dentro da faixa de normalidade. No entanto, apesar de
não haver diferença estatística, os valores dos pacientes (média ± desvio
padrão=132,0 ± 22,4 mg/dL) foram maiores que os apresentados pelos controles
(média ± desvio padrão=107,0 ± 18,0 mg/dL ). Os níveis de HDL apresentados
pelos controles estiveram dentro da faixa de normalidade, na maioria dos
indivíduos controle (média + desvio padrão= 54,0 ± 4,5 mg/dL) enquanto que
todos os pacientes apresentaram níveis significativamente fora dessa faixa (
média + desvio padrão = 38,14 ± 3,2 mg/dL). Resultados semelhantes foram
detectados quando da análise dos níveis de LDL. Apesar de todos indivíduos dos
dois grupos apresentaram níveis dessa lipoproteina acima da faixa de
normalidade, valores significativamente mais altos dessa fração foram detectados
nos pacientes (média + desvio padrão= 163,14 ± 9,0 mg/dL) quando comparados
aos dos controles ( média + desvio padrão = 123,71 ± 6,9 mg/dL ). A análise
comparativa do perfil lipídico global apresentado pelos dois grupos mostra que
diferenças importantes foram detectadas em relação aos níveis de HDL e LDL,
com os pacientes apresentando níveis significativamente anormais quando
comparados aos controles.
3.3. Proteínas Positivas de Fase Aguda
Os resultados referentes à dosagem plasmática de alfa 1 glicoproteína
ácida (α1 GA), ( vr = 30,0-120,0 mg/dL) e proteína C reativa (PCR) (vr= <0,9
mg/dL) podem ser analisados na Tabela 2. A faixa de resultados apresentada
pelos indivíduos controle foi de 66,0-95,0 mg/dL (média + desvio padrão = 76,7 ±
3,5 mg/dL) para alfa 1 glicoproteína ácida e 0,1-0,1mg /dL para proteína C reativa
(média + desvio padrão = 0,1 ± 0 mg/dL ), apresentando-se portanto dentro do
limite de normalidade. Os valores para os pacientes foram de 79,0-153,0 mg/dL
para alfa 1 glicoproteína ácida (média + desvio padrão = 112,4 ± 8,7mg/dL ) e 0,1-
0,61mg /dL para proteína C reativa (média + desvio padrão =0,9 ± 0,6mg/dL). A
análise desses resultados mostra que, apesar de alguns pacientes apresentarem
valores dentro do limite de normalidade, níveis bastante altos destas duas
proteínas foram detectados na maioria dos pacientes. Assim, a análise
comparativa global mostra claramente que os pacientes apresentaram níveis mais
elevados de alfa 1 glicoproteina ácida e de proteína C reativa, quando
comparados aos controles.
3.4. Determinação dos níveis plasmáticos de IL-6, TNF-α, IFN-γ
Observamos que os níveis plasmáticos de IL-6 foram significativamente
mais elevados nos pacientes (média + desvio padrão= 17,7± 1,7 pg/mL), quando
comparados aos detectados nos indivíduos controle ( média + desvio padrão=
9,23 ± 0,44 pg/mL) (Figura 2). Resultados semelhantes foram observados em
relação à dosagem de TNF-α (controles: média e desvio padrão = 2,7 ± 0,3 e
pacientes= 5,0 ± 0,5 pg/mL) ( Figura 3) e IFN-γ (controles = 181,0 ± 43,0 e
pacientes = 327,0 ± 70,0 pg/mL) com os pacientes apresentando níveis
significativamente mais elevados quando comparados aos indivíduos controle.
(Figura 4). Em conjunto, os resultados mostram que os níveis das três citocinas
pró-inflamatórias foram significativamente mais elevados nos pacientes quando
comparados aos detectados nos indivíduos controle.
3.5. Determinação dos níveis plasmáticos de IL-10 e TGF-β
Os resultados referentes a esses ensaios são mostrados na Figura 5.
Observamos que os níveis plasmáticos de IL-10 foram significativamente
mais elevados nos pacientes (média + desvio padrão = 66,6 ± 14,3pg/mL) ,
quando comparados aos detectados nos indivíduos controle ( média + desvio
padrão= 10,0 ± 3,4pg/mL). Resultados semelhantes foram observados em relação
à dosagem de TGF-β (controles: média e desvio padrão = 105,6 ± 9,9pg/mL e
pacientes= 483,6 ± 161pg/mL). Em conjunto, os resultados mostram que os
níveis plasmáticos das três citocinas anti-inflamatórias foram significativamente
mais elevados nos pacientes quando comparados aos detectados nos indivíduos
controle.
3.6. Atividade fungicida de monócitos contra C.albicans
A capacidade das células de indivíduos controle e pacientes
desenvolverem essa atividade foi avaliada antes e após a incubação com citocinas
envolvidas no processo de ativação dessas células, como o IFN-γ e TNF-α. Os
resultados referentes a esses ensaios podem ser analisados nas Figuras 6 e 7,
nas quais são mostrados os valores obtidos com IFN-γ e TNF-α, respectivamente.
Nos experimentos referentes ao IFN-γ (Figura 6) observamos que monócitos de
indivíduos controle não ativados apresentaram uma significativa atividade
fungicida, que, no entanto, mostrou-se mais elevada após a estimulação com a
citocina nas diferentes concentrações (50,100,250,500,1000 unidades/mL).
Entretanto, resultados estatisticamente significativos, quando comparados aos
monócitos não estimulados, foram detectados somente com a dose de 100U/mL .
Os monócitos dos pacientes apresentaram um perfil de resposta semelhante aos
apresentados pelos indivíduos controle. No entanto, quando compara-se a
resposta dos dois grupos, detecta-se que as células dos pacientes antes e após o
processo de ativação apresentaram respostas significativamente menores que os
controles. Resultados semelhantes foram detectados nos ensaios com TNF-α
(Figura 7), isto é, células de controles e pacientes apresentaram um aumento da
atividade fungicida após a ativação, principalmente com a dose de 100U/mL. Não
obstante, os resultados dos pacientes foram sempre menores que os detectados
para os controles.
3.7 Produção de H
2
O
2
De forma semelhante aos ensaios de avaliação da atividade fungicida, os
níveis de H
2
O
2
liberados pelas células de indivíduos controles e pacientes foram
avaliados antes e após a ativação com IFN-γ e TNF-α. Os resultados referentes a
esses ensaios podem ser analisados nas Figuras 8 e 9, nas quais são mostrados
os valores obtidos com IFN-γ e TNF-α, respectivamente. Nos experimentos
referentes ao IFN-γ (Figura 8) observamos que monócitos de indivíduos controles
não ativados liberaram níveis substanciais do metabólito que aumentaram
significativamente após a ativação (dados estatisticamente significativos com a
concentração de 100U/mL). O perfil de resposta dos monócitos dos pacientes foi
semelhante ao apresentado pelos controles, mas com níveis significativamente
mais baixos antes e após o processo de ativação. Resultados semelhantes foram
detectados nos ensaios com TNF-α (Figura 9), isto é, células de controles e
pacientes apresentaram um aumento dos níveis de H
2
O
2
após a ativação,
principalmente com a dose de 100U/mL. No entanto, os resultados dos pacientes
foram sempre menores que os detectados para os controles. Em conjunto, os
ensaios avaliando a capacidade de ativação de monócitos de indivíduos controle e
pacientes mostraram claramente que os pacientes apresentaram respostas
significativamente menores que os controles em todos os parâmetros avaliados.
4. Discussão
O presente trabalho teve como objetivos avaliar em pacientes com
aterosclerose obliterante periférica, os níveis plasmáticos das citocinas pró e anti-
inflamatórias TNF-α, IL-6, IFN-γ, IL-10 e TGF-β, assim como o grau de ativação de
monócitos do sangue periférico, através da capacidade dessas células liberarem
peróxido de hidrogênio e desenvolverem atividade fungicida contra C. albicans.
Inicialmente foram avaliados os parâmetros bioquímicos dos pacientes e
indivíduos controle que mostraram claramente que os dois grupos não apresentam
doenças associadas. Em relação ao perfil lipídico, os níveis séricos de colesterol
total, apresentaram-se acima dos níveis de normalidade na maioria dos pacientes
e indivíduos controle. Esse comportamento é esperado em indivíduos com faixa
etária acima de 60 anos
(39)
.
Segundo a III diretriz brasileira sobre dislipidemias e de prevenção de
aterosclerose, o aumento de colesterol total nessa faixa etária acima de 60 anos
pode ocorrer em alguns indivíduos estando associado ao estilo de vida,
principalmente ao sedentarismo e às mudanças de hábito alimentar
(40)
.
No que se refere a LDL colesterol, estudos clínicos e experimentais têm
estabelecido que concentrações elevadas dessa lipoproteína, estão associadas
com à progressão da aterogênese
(41-43)
. Diversos trabalhos fazem associações
com níveis elevados de LDL e eventos cardiocirculatórios
(42,44)
sendo, portanto,
essa lipoproteína considerada um forte marcador do processo aterosclerótico e
suas complicações. Nesse sentido, os resultados laboratoriais obtidos nesse
trabalho, concordam com a literatura uma vez que os pacientes apresentaram
níveis significativamente mais elevados de LDL quando comparados com o grupo
controle.
De forma contrária, os níveis plasmáticos da lipoproteína de alta densidade
(HDL), têm mostrado uma relação inversa com a doença cardiovascular. Embora
seu metabolismo seja complexo, a principal função atribuída a essa lipoproteína é
o transporte de colesterol para o fígado e outros tecidos periféricos, retirando-o
assim da corrente circulatória. Adicionalmente a essa função, outros trabalhos
consideram a HDL uma partícula anti-inflamatória pela inibição das espécies
reativas do oxigênio e detoxificadora
( 42,44-47)
.
No presente trabalho, pode-se observar que os níveis séricos de HDL
colesterol apresentaram-se diminuídos nos pacientes, confirmando assim a
associação feita pela literatura.
Entre os reagentes de fase aguda, a proteína C reativa e a α1 glicoproteína
ácida são duas proteínas que refletem situações diferentes no processo
inflamatório devido às suas funções. A PCR está envolvida no processo
inflamatório agudo, onde seria importante para a opsonização, apresentação de
antígeno e ativação do sistema complemento
(48)
. A α1 glicoproteína ácida, está
associada ao processo inflamatório crônico com efeitos imunomoduladores como
a inibição da proliferação de linfócitos, agregação plaquetária e da ativação de
neutrófilos, sendo, assim, classificada como uma proteína de caráter anti-
inflamatório e portanto protetor
(49)
.
Os resultados mostraram que os níveis dessas duas proteínas de fase
aguda estiveram significantemente aumentados nos pacientes quando
comparados com os dos indivíduos controle. A literatura referente a doenças
cardiovasculares, de uma forma geral
"
apresenta trabalhos mostrando que a PCR
é um importante indicador de eventos cardiocirculatórios
(50-55)
. Especificamente na
aterosclerose obliterante periférica FIOTTI e colaboradores em 1999
(56)
,
mostraram que os níveis das duas proteínas, não diferiram do grupo controle. No
entanto, resultados semelhantes aos obtidos no presente trabalho, detectando um
aumento significativo dos níveis de PCR, foram observados por Cushman e
colaboradores em 1997
(57)
. Esses resultados sugerem que especificamente em
relação a PCR e a aterosclerose obliterante periférica, estudos complementares
devem ser realizados no sentido de considerar essa proteína como um importante
indicador de diagnóstico e prognóstico dessa doença.
Além desses marcadores, muitos outros fatores imunológicos têm sido
estudados no sentido de apontar o melhor indicador para risco de doença
cardiovascular. Entre eles, estão as moléculas de adesão
(58)
, proteínas
quimioatraentes de monócitos
(52)
e principalmente as citocinas pró e anti-
inflamatórias
(59)
.
Nesse contexto, um dos objetivos do presente trabalho foi avaliar os níveis
plasmáticos das citocinas pró-inflamatórias IL-6, TNF-α e IFN-γ e anti-inflamatórias
IL-10 e TGF-β.
Os resultados mostraram que os níveis plasmáticos das três citocinas pró-
inflamatórias encontram-se elevados nos pacientes quando comparados aos
detectados nos indivíduos controle. Esses resultados são esperados, uma vez que
os trabalhos na literatura mostram que, de uma forma geral, os níveis dessas
citocinas encontram-se elevados nos vários processos ateroscleróticos. Nesse
sentido, alguns autores em estudo clínicos, têm mostrado que os níveis séricos de
IL-6 estão elevados em pacientes com infarto do miocárdio
(50,60,61)
.
Adicionalmente, em pacientes portadores de claudicação intermitente, observou-
se um aumento nos níveis séricos dessa citocina, sugerindo que a sua dosagem
pode ser importante no sentido de auxiliar no prognóstico de complicações, como
claudicação seguida de infarto do miocárdio
(62)
. Em outro trabalho mais recente,
Tzoulaki e colaboradores em 2004
(63)
reforçam esses achados. Os autores
sugerem que esse aumento pode representar um forte marcador entre outros
marcadores séricos já estudados, como a PCR, e as moléculas de adesão ICAM-1
e VCAM-1. Esses trabalhos confirmam que a IL-6 está diretamente relacionada
com o processo inflamatório da aterosclerose, devido principalmente à sua função
quimiotática e mitogênica para as células musculares lisas, além de estimular a
produção de proteínas de fase aguda pelos hepatócitos
(64)
.
Em relação ao TNF-α, os trabalhos na literatura também mostram
claramente um aumento dos níveis séricos nos eventos ateroscleróticos. Assim,
níveis aumentados dessa citocina, e também de interleucina 8 (IL-8) e IL-1 foram
detectados em algumas doenças cardíacas, como infarto e angina.
(65-67)
. Não
obstante, na doença arterial periférica, Fiotti e colaboradores em 1999
(56)
,
discutem que os receptores dessas citocinas pró-inflamatórias são marcadores
mais sensíveis, uma vez, que comparando pacientes com claudicação intermitente
com ou sem isquemia com um grupo controle, verificou que os receptores de TNF-
α, IL-1 foram indicadores mais significativos do que as próprias citocinas.
Entretanto, trabalhos mais recentes mostram uma associação entre níveis
aumentados de TNF-α e doença arterial periférica.
(62)
. Esses níveis encontram-se
ainda mais elevados quando esses pacientes apresentam comprometimentos
adicionais, sugerindo uma associação entre os níveis dessa citocina e gravidade
do processo
(68)
.
Nesse contexto, os resultados de uma forma geral confirmam o
envolvimento dessa citocina nos processos ateroscleróticos. As principais funções
que lhe são atribuídas são a de estimular o recrutamento de neutrófilos e
monócitos para os locais da inflamação e o aumento da expressão das moléculas
de adesão. Quando liberada em altas concentrações, provoca a perda das
propriedades anticoagulantes normais do endotélio
(69)
.
Em relação ao IFN-γ, os trabalhos têm demonstrado claramente o seu papel
no sentido de favorecer a resposta inflamatória na aterosclerose, como um
importante mediador de uma resposta CD4 do tipo TH1. Os níveis plasmáticos
dessa citocina encontram-se elevados em pacientes com doenças coronárias
como angina estável e instável e miocardites
(70)
. Essa citocina tem como função
inicial a ativação de monócitos / macrófagos, com conseqüente aumento da
apoptose, da expressão das moléculas de adesão do endotélio, e da síntese de
outras citocinas proinflamatórias com IL-1 e IL-6. Está ainda envolvida na
diminuição da síntese de colágeno pelas células endoteliais.
De forma semelhante ao observado para as citocinas pró-inflamatórias,
detectamos nos pacientes avaliados, altos níveis das citocinas anti-inflamatórias
IL-10 e TGF-β. Esses dados concordam com a literatura uma vez que trabalhos
têm mostrado que a IL-10 apresenta uma importante função antiinflamatória
durante a aterosclerose, no sentido de controlar a ativação de células imunes
como os monócitos, através da diminuição do fator nuclear kappa B. Outra função
atribuída a essa citocina, no processo aterosclerótico, seria a de controlar a morte
celular excessiva limitando a resposta inflamatória local. Resultados obtidos em
estudos da placa aterosclerótica da carótida de ratos confirmam essa função. Os
animais que receberam IL-10 apresentaram uma diminuição dos níveis das
citocinas pró-inflamatórias e do processo de apoptose com conseqüente
estabilidade da placa aterosclerótica
(71)
.
Outros estudos acentuam a importância da avaliação de citocinas pró e
anti-inflamatórias, no auxilio do diagnóstico de doenças coronárias, salientando a
clara existência de um balanço entre esses mediadores. Um trabalho avaliando
pacientes com síndromes coronárias foi concluído que a elevação da IL-10 parece
exercer um efeito protetor em pacientes com níveis elevados de PCR, sugerindo a
importância da dosagem dessa citocina para o prognóstico da doença, e possível
estratégia para o seu tratamento
(72)
. Esses relatos têm sido confirmados em
outros estudos com portadores de doenças coronarianas, nos quais detectou-se
um aumento dos níveis dessa citocina quando comparados aos apresentados por
indivíduos controle
(73)
.
De forma semelhante a IL-10, o TGF-β é considerado uma citocina com alto
poder antiinflamatório nas doenças coronárias em geral apresentando-se em altas
concentrações nos processos ateroscleróticos avançados
(74-76)
. Essa citocina foi
detectada em altos níveis em pacientes hipertensos, nos quais a força de
cisalhamento provocaria um processo inflamatório, levando a uma possível
formação aterosclerótica
(77)
, e em pacientes com outras doenças cardiovasculares
(78)
.
No presente trabalho, também realizou-se experimentos avaliando o nível
de ativação de monócitos do sangue periférico. Esses ensaios justificam-se pelo
fato de que não existem trabalhos na literatura avaliando esse processo em
pacientes com aterosclerose obliterante periférica. Adicionalmente, os monócitos
do sangue periférico foram avaliados, considerando-se que as alterações
funcionais das células participantes do processo de aterogênese podem
manifestar-se nesse compartimento.
Em conjunto, os ensaios avaliando a capacidade de ativação de monócitos
de indivíduos controle e pacientes mostraram claramente que os pacientes
apresentaram respostas significativamente menores que os controles em todos os
parâmetros avaliados. Esses resultados, de início, poderiam ser interpretados
como a existência de um processo de ativação menor nos pacientes. Esses
achados são inesperados uma vez que vários trabalhos na literatura mostram que
células de pacientes encontram-se ativadas apresentando uma liberação maior de
radicais livres e um aumento da capacidade de apresentação de antígenos, via
aumento da expressão de moléculas CHP de classe II, processo que levaria ao
desenvolvimento de uma resposta específica TH1
(79-83)
.
Considerando esse mecanismo, esperávamos que as células dos pacientes
avaliadas in vitro, mesmo na ausência de estímulo (TNF-α ou IFN-γ),
apresentassem maior atividade fungicida e liberação de H
2
O
2
quando comparadas
as células controles, o que refletiria uma condição de intensa ativação in vivo.
Devido a esse processo, não responderiam aos estímulos in vitro. No entanto,
detectamos resultados contrários, com as células dos pacientes apresentando
respostas menores que os pacientes mesmo antes do processo de ativação.
Apesar de não encontrarmos respaldo na literatura para os nossos resultados
acreditamos que podemos interpretá-los por um processo que estamos chamando
de “exaustão” das atividades celulares. Segundo esse raciocínio, os resultados
detectados para os monócitos dos pacientes nessa fase da doença, podem estar
refletindo um intenso processo de ativação ocorrido em um período anterior do
desenvolvimento da doença que tornou essas células não responsivas. Um
trabalho na literatura
(84)
mostra que células espumosas isoladas de aorta de ratos
hipercolesterolinêmicos foram capazes de oxidar lipoproteínas, mas não tiveram
capacidade de produzir espécies reativas do oxigênio in vitro. Os autores discutem
que esse processo estaria relacionado à intensa fagocitose e ingestão de lipídeos
com conseqüente prejuízo das funções celulares Ainda nesse sentido, outros
estudos realizados no sentido de observar a capacidade de produção de
substâncias por monócitos de pacientes com aterosclerose, detectaram uma
diminuição na capacidade de produção de prostaglandina in vitro em resposta a
estímulos
(85-87)
, devido ao fato de estarem ativadas, repleta de lipídeos, o que as
impediria de responder a estímulos exógenos.
Adicionalmente, como já citado, mecanismos naturais de controle do
processo inflamatório na aterosclerose, com conseqüente inibição da ativação
das células fagocitárias têm sido descritos. Esse controle estaria relacionado à
inibição do principal mecanismo de ativação dessas células que decorre do
desenvolvimento de uma resposta TH1, e envolveria como principais mediadores
as citocinas IL-10 e TGF-β. Um trabalho importante nesse sentido relata que
camundongos geneticamente deficientes na expressão de receptor para LDL e
submetidos à dieta hipercolesterolenêmica, transplantados com células T de
camundongos com capacidade de produzir altos níveis de IL-10, apresentaram
uma significativa diminuição do processo aterosclerótico. Os autores ainda
demonstram que os mecanismos através dos quais a IL-10 atuou envolve o
direcionamento para o ramo de resposta CD4 TH2 com inibição da ativação
macrofágica e do processo de apoptose
(88)
.
No entanto, a análise conjunta dos nossos resultados relativos a avaliação
da ativação de monócitos e a dosagem de citocinas plasmáticas revela de início,
uma associação inversa entre citocinas pró-inflamatórias e ativação de monócitos,
uma vez que altos níveis desses mediadores, particularmente o IFN-γ deveriam
estar associados a um processo de ativação da célula fagocitária. No entanto,
podemos sugerir que o balanço final entre as atividades das citocinas pró e anti-
inflamatórias sobre os monócitos, possa resultar em um favorecimento da
atividade anti-inflamatória através da liberação de IL-10 e TGF-β, cujos níveis
séricos também encontram-se elevados, levando ao processo de desativação
celular detectado nessa fase da doença,nos pacientes avaliados.
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Tabela 1. Níveis plasmáticos de glicose, alanina aminotransferase (ALT),
aspartato aminotransferase (AST), uréia, creatinina apresentados em indivíduos
controle e pacientes.
Indivíduos controle (8) Pacientes (8)
Glicose (mg/dL)
88,57 + 2,46 (78-96) 92,42 + 2,97 (80-104)
Alanina aminitransferase
(U/L) (ALT)
18,85 + 2,76 (8-32) 20,42 + 2,77 (12-26)
Aspartato
aminitransferase (U/L)
(AST)
16,57 + 3,45 (3-33) 15,42 + 3,77 (2-28)
Uréia (mg/dL)
30,57 + 2,53 (25-45) 36,14 + 2,82 (24-46)
Creatinina (mg/dL)
1,1+ 0,03 (1,0-1,2) 1,08 + 0,05 (0,9-1,3)
Valores de referência – glicose: 70-110 mg/dL, alanina transaminase: 30-65 U/L, aspartato
transaminase: 15-37 U/L, uréia: 15-40 mg/dL, creatinina: 0,6-1,4 mg/dL
Os resultados são expressos em média
+
erro padrão. Os números entre parênteses indicam o
menor e o maior valor obtido.
Tabela 2. Níveis plasmáticos de α1 glicoproteína acida (α1 GA) e Proteína C
Reativa (PCR) detectados me indivíduos controles e pacientes.
Indivíduos controle (8) Pacientes (8)
α1-GA (mg/dL)
76,71 + 3,59 (66-95) 112,42 + 8,71 (79-153)
PCR (mg/dL) 0,10 + 0 (0,10-0,10) 0,27+ 0,60 (0,1-0,6)
Valores de referência: α1GA: 30-120 mg/dL , PCR: <0,9mg/dL
Os resultados são expressos em média
+
erro padrão. Os números entre parênteses indicam o
menor e o maior valor obtido.
0
50
100
150
200
250
COL TG HDL LDL
mg/dl
Controles
Pacientes
*
*
Figura 1.
Níveis plasmáticos de colesterol (Col), triglicérides (TG), lipoproteína de
alta densidade (HDL), e lipoproteína de baixa densidade (LDL) apresentados por
indivíduos controle e pacientes. Os resultados estão expressos em média + erro
padrão.
* p<0,05
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Controles Pacientes
IL-6 (pg/ml)
*
Figura 2.
Níveis plasmáticos de (IL-6) apresentados por indivíduos controle e
pacientes. Os resultados são expressos em média + erro padrão.
*p<0,05
0
1
2
3
4
5
6
Controles Pacientes
TNF-
α
(pg/ml)
*
Figura 3.
Níveis plasmáticos de (TNF-
α
) apresentados por indivíduos controle e
pacientes. Os resultados estão expressos em média + erro padrão.
*p<0,05.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Controles Pacientes
IFN-
γ
(pg/ml)
*
Figura 4.
Nívies plasmáticos de IFN-
γ
apresentados por indivíduos controle e
pacientes. Os resultados estão expressos em média + erro padrão.
*p<0,05
0
100
200
300
400
500
600
IL-10 TGF-beta
pg/ml
Controles
Pacientes
*
*
Figura 5.
Níveis plasmáticos de (IL-10) e (TGF-
β
) apresentados por indivíduos
controle e pacientes. Os resultados estão expressos em média + erro padrão.
*p<0,05 X respectivos grupos controle
0
10
20
30
40
50
60
70
80
MCCC IFN 50 IFN 100 IFN 250 IFN 500 IFN 1000
% Atividade Fungicida
Controles
Pacientes
*
+
+
+ +
+
+
*
Figura 6.
Atividade fungicida contra
Cândida albicans
de monócitos obtidos do
sangue periférico de indivíduos controle e pacientes, antes e após a ativação com
diferentes concentrações de IFN-
γ
. Os resultados expressos em média + erro
padrão.
*p<0,05 x MCCC do respectivo grupo controle.
+p<0,05 x indivíduos controle e pacientes de cada grupo.
0
10
20
30
40
50
60
MCCC TNF 50 TNF 100 TNF 250 TNF 500 TNF
1000
% Atividade Fungicida
Controles
Pacientes
*
+
+
+
+
+ +
*
Figura 7.
Atividade fungicida contra
Cândida albicans
de monócitos obtidos do
sangue periférico de indivíduos controle e pacientes, antes e após a ativação com
diferentes concentrações de TNF-
α
. Os resultado são expressos em média + erro
padrão.
*p<0,05 x MCCC do respectivo grupo controle.
+p<0,05 x indivíduos controle e pacientes de cada grupo.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
MCCC IFN 50 IFN 100 IFN 250 IFN 500 IFN 1000
H
2
O
2
nmoles/ 2X10
5
monócitos
Controles
Pacientes
*
+ +
+
+
+
+
*
Figura 8.
Produção de H
2
O
2
por monócitos obtidos do sangue periférico de
indivíduos controle e pacientes, antes e após a ativação com diferentes
concentrações de IFN-
γ
. Os resultados foram expressos como média + erro
padrão.
*p<0,05 x MCCC do respectivo grupo controle.
+p<0,05 x indivíduos controle e pacientes de cada grupo.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
MCCC TNF 50 TNF 100 TNF 250 TNF 500 TNF
1000
H
2
O
2
nmoles/2X10
5
monócitos
Controles
Pacientes
*
+
+
+
+ +
+
*
Figura 9.
Produção de H
2
O
2
por monócitos obtidos do sangue periférico de
indivíduos controle e pacientes, antes e após a ativação com diferentes
concentrações de TNF-
α
. Os resultados foram expressos em média + erro
padrão.
*p<0,05 x MCCC do respectivo grupo controle.
+p<0,05 x indivíduos controle e pacientes de cada grupo.
Revisão da Literatura
Aterosclerose e resposta inflamatória
Atherosclerosis and inflammatory response
Camila Renata Corrêa-Camacho
1
, Luciane Alarcão Dias-Melicio
2
,
Ângela Maria Victoriano de Campos Soares
2
1
Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina – UNESP,
Botucatu – São Paulo, SP – Brasil
2
Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências
– UNESP, Botucatu – São Paulo, SP – Brasil
Correspondência: Camila Renata Corrêa-Camacho, Departamento
de Clínica Médica, Faculdade de Medicina, UNESP, Distrito de
Rubião Júnior, CEP: 18618-000, Botucatu, São Paulo-SP, Brasil.
Fone: 14-38116339. E-mail: ccorrea@fmb.unesp.br.
Introdução
A aterosclerose é a doença responsável pelo maior índice de mortalidade
no Brasil. Em 1995, 23% das mortes, em todas as idades em nosso país,
ocorreram em conseqüência da aterosclerose. Essa porcentagem cresce para
26,3 quando a análise é feita exclusivamente no estado de São Paulo e 32,7 no
Rio Grande do Sul
1
.
Desde o início do século, vários pesquisadores, tiveram interesse em
estabelecer a história natural da aterosclerose, pois dados de necrópsias
indicaram vínculo entre doenças arteriais ateroscleróticas e distúrbios
cardiovasculares
2
.
O sistema vascular é complexo, porém os vasos sanguíneos individuais
estão entre as estruturas teciduais mais simples do organismo. Um vaso
sanguíneo é formado por apenas dois tipos celulares: células endoteliais que
formam a camada íntima e células musculares lisas que compõem a camada
média
3
.
A lesão aterosclerótica é a anormalidade mais comum encontrada nas
artérias decorrente inicialmente de dois processos básicos: proliferação de células
musculares lisas na íntima e o acúmulo de lipídeos
4
, desenvolvendo-se, portanto,
sobre um substrato formado dessas células, leucócitos derivados do sangue e de
uma quantidade variável de tecido conjuntivo formando uma placa fibrosa que se
projeta para dentro do lúmem enfraquecendo a sub-camada média, levando a uma
série de complicações circulatórias
5
.
A aterosclerose primariamente afeta as artérias elásticas como a aorta,
carótida e as ilíacas, mas também pode comprometer as grandes e médias como
a coronária e as poplíteas. A doença começa na infância, mas os sintomas não
são detectados até a idade média ou até mais tarde quando ocorrem lesões e os
órgãos são afetados
6
.
Os sintomas da doença aterosclerótica são mais freqüentes nas artérias
que irrigam o coração, cérebro, rins, extremidades e o intestino delgado. Infarto do
miocárdio, infarto cerebral, aneurisma aórtico, são as maiores conseqüências
dessa doença. Além disso, a diminuição na irrigação pode levar à gangrena dos
membros inferiores ou oclusão mesentérica
7
.
Observações fisiopatológicas em homens e animais levam a hipótese de
que a aterosclerose é resultante de uma resposta do organismo à injúria tecidual,
com enfoque para a disfunção endotelial. Evidências têm sido acumuladas no
sentido de sugerir que a lipoproteína de baixa densidade (LDL) modificada pela
oxidação (LDLox) é o principal fator envolvido no desencadeamento da lesão
8
.
O acúmulo da LDL no compartimento plasmático, que pode ocorrer devido
a uma diminuição no seu catabolismo, especialmente pelo fígado, devido a um
defeito gênico que promove deficiência na expressão ou função dos seus
receptores, resulta na hipercolesterolemia
9
.
A maioria dos pacientes com hipercolesterolemia pertence a esse grupo.
No entanto, esses fatores genéticos estabelecem uma complexa interação com os
de natureza ambiental, ligados principalmente com a dieta que determinam a
concentração da LDL no plasma
10
.
Papel da resposta imunológica na aterosclerose
Estudos têm mostrado que a resposta imunológica está presente no
processo aterosclerótico, que tem como início o desencadeamento de uma
resposta inflamatória na parede do vaso
3,11
.
Quando ocorre um aumento dos níveis de LDL, essas partículas são
depositadas nas artérias, com conseqüente oxidação e formação da LDLox. As
partículas oxidadas são citotóxicas para as células endoteliais resultando em
lesões
12
.
As células endoteliais agredidas pela lesão aterosclerótica expressam e
produzem uma série de moléculas que facilitam a entrada e o recrutamento de
monócitos, como a molécula de adesão intercelular (ICAM-1), E-selectina,
molécula de adesão vascular (VCAM-1) e a interleucina- 8 (IL-8), uma quimiocina
importante no recrutamento de monócitos
13
. Adicionalmente a própria LDLox é
quimiotática para outros monócitos através da regulação positiva de expressão
dos genes para citocinas como o fator estimulador de colônia de macrófago (M-
CSF) e proteína quimiotática de monócito (MCP-1) derivada de células
endoteliais
14
. Esse processo pode expandir a resposta inflamatória estimulando a
replicação de macrófagos derivados de monócitos e a entrada dessas células na
lesão
12
.
Os monócitos, uma vez recrutados para esse local, penetram no sub-
endotélio e diferenciam-se em macrófagos, que têm como primeira função
fagocitar as LDLox transformando-se em células espumosas
12
.
Estudos realizados em animais têm mostrado que, além das células
musculares lisas, as células espumosas são componentes essenciais da placa
aterosclerótica
15
, que como já citado, pode evoluir para um estado mais avançado
formando as placas fibrosas que causam o impedimento do fluxo sanguíneo com
conseqüente necrose
16
.
Os trabalhos citados demonstram que os monócitos são células
extremamente envolvidas no processo aterosclerótico. A função inicial dessas
células na resposta inflamatória seria protetora, no sentido de, através da
fagocitose, remover a LDL modificada, minimizando os efeitos dessa partícula
sobre as células endoteliais. No entanto, estudos mostram o papel dúbio dessas
células limitando a oxidação pela fagocitose, e paradoxalmente, favorecendo esse
processo, sendo juntamente com células musculares lisas e endoteliais
importantes fontes de radicais livres
17,18
. Dentro deste contexto, o processo de
fagocitose da LDLox com liberação de radicais livres, induz a produção pelos
macrófagos de grandes quantidades de proteases digestivas como
mieloperoxidase, as quais saem da matriz extracelular aumentando ainda mais a
síntese de espécies reativas do oxigênio, que amplificam o processo de
recrutamento de células musculares lisas da camada média do vaso, para a
camada íntima
18
.
Durante esse processo oxidativo, ocorre também uma amplificação da
resposta inflamatória através do aumento de moléculas de adesão como a P-
selectina e produção de fatores quimioatraentes, levando a um aumento na
migração de células do sistema imune, como linfócitos e principalmente monócitos
para dentro do espaço subendotelial
20
.
Outros estudos têm mostrado o envolvimento das espécies reativas do
oxigênio em vários outros processos relacionados à aterosclerose como aumento
da vasoconstrição, angiogênese e apoptose das células endoteliais
20-22
.
O radical superóxido (O
2
-
) e o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) são os
principais metabólitos produzidos e participam de alguns processos aterogênicos.
Embora o H
2
O
2
não seja um radical livre verdadeiro, pode reagir com metais
redox-ativos como ferro e cobre, produzindo novos radicais. Além disso, tem meia
vida longa e grande capacidade de se difundir através de membranas celulares
hidrofóbicas, ampliando o efeito tóxico da reoxigenação
23
.
A angiogênese, um dos processos envolvidos na aterosclerose, está
altamente associada a H
2
O
2
, uma vez que esse metabólito induz a proliferação e
migração de células endoteliais e células musculares lisas e também a expressão
de mediadores inflamatórios por essas células, contribuindo assim, para a
instabilidade da placa aterosclerótica
24
.
O envolvimento dessas espécies pode iniciar-se por interferência também
da vasodilatação, um processo complicador na patogênese da aterosclerose, pois
o aumento do ânion superóxido inativa o óxido nítrico (NO), um potente
vasodilatador
25
. A exposição a esses mesmos radicais, principalmente o peróxido
de hidrogênio leva a apoptose das células endoteliais, resultando em um processo
aterogênico e um estado pró-coagulante
26
.
Os estudos citados acima têm levado os autores a apontar a aterosclerose
como uma doença inflamatória, uma vez que, em condições normais o endotélio
vascular apresenta uma superfície inerte. Entretanto, como já mencionado, a lesão
da célula endotelial promove um recrutamento de monócitos e conseqüente
liberação de seus produtos, processo chave para o desenvolvimento de uma
intensa resposta inflamatória vascular. Como já referido, dentre os produtos
liberados pelos macrófagos e outras células estão os radicais livres.
Participação das citocinas no processo aterosclerótico
No entanto, outros fatores extremamente importantes no processo
inflamatório são as citocinas pro-inflamatórias produzidas mediante o estímulo do
fator nuclear Kappa B (NFKB), processo totalmente dependente das espécies
reativas de oxigênio
16,27,28
. Como um fator de transcrição da resposta inflamatória,
o NFKB está envolvido na regulação dos genes da resposta inflamatória,
apoptose, proliferação celular e aumento na produção de espécies reativas do
oxigênio
28-30
. Muitos estudos apontam a presença desse fator ativado na placa
aterosclerótica, nas células musculares lisas, células endoteliais e macrófagos
29
.
As citocinas envolvidas principalmente nas primeiras fases da resposta
inflamatória que culmina com aterosclerose são a interleucina-1 (IL-1), a
interleucina-6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-
α
)
16,27,28,31
.
Alguns papéis desempenhados por essas citocinas já estão bem
estabelecidos como a expressão de moléculas de adesão, quimiotaxia de células
inflamatórias, diferenciação celular, produção de proteínas positivas de fase
aguda, e proliferação de células musculares lisas. Todos esses processos
amplificam a resposta inflamatória local e sistêmica envolvendo os sistemas de
coagulação, fibrinolítico e plaquetas
16,31,32
.
A principal função atribuída a IL-1 na aterogênese, é a sua capacidade de
aumentar a expressão de moléculas de adesão quando secretada em baixas
doses. Porém em altas doses, passa a ser liberada na circulação sanguínea e
exerce efeitos endócrinos, estimulando a produção de proteínas inflamatórias de
fase aguda pelo fígado
33
. No que se refere a IL-6, essa citocina tem como
principais funções a quimiotaxia e mitogênese para as células musculares lisas
34
.
O TNF-
α
tem como ação principal estimular o recrutamento de neutrófilos e
monócitos para os locais de inflamação. Essa citocina induz a expressão de
moléculas de adesão, além de estimular a secreção de quimiocinas pelas células
endoteliais e monócitos. Quando produzido em grandes quantidades, provoca a
perda das propriedades anticoagulantes normais do endotélio
35
.
Nos últimos anos, uma outra função foi atribuída especificamente para o
TNF-
α
e IL-1, no processo aterosclerótico, que seria a de favorecer a expressão
de um receptor chamado receptor para LDLox “lectin like oxidized LDL receptor-1”
(LOX-1), na superfície de células musculares lisas, células endoteliais e
macrófagos onde o mesmo é encontrado na forma inativa, favorecendo assim, a
formação de células espumosas e ampliando o processo inflamatório
36
.
Os processos citados mostrando a capacidade de macrófagos liberarem
vários fatores como radicais livres e citocinas durante a resposta inflamatória
vascular, sugerem fortemente que essas células encontram-se bastante ativadas.
Dentro desse contexto, macrófagos ativados expressam moléculas de
classe II codificadas pelo complexo de histocompatibilidade principal (moléculas
MHC de classe II), que permitem a apresentação de antígenos a linfócitos T
CD4
+37
. Assim, não é surpreendente que uma resposta imune específica do tipo
celular esteja envolvida na aterogênese, tendo como possível antígeno indutor a
LDLox
38
, uma vez que tanto as células TCD8
+
como TCD4
+
estão presentes nas
lesões durante todos os estágios do processo
39
.
Em relação a essa resposta, os estudos têm sugerido claramente que
ocorra na doença aterosclerótica a participação de células CD4
+
do tipo
TH
1
, entretanto, trabalhos experimentais afirmam que há um equilíbrio entre
as respostas de perfil TH
1
e TH
2
40
.
A predominância de um padrão TH
1
de resposta envolve a participação de
interferon-gamma (IFN-
γ
), TNF-
α
e TNF-
β
que amplificam a resposta
inflamatória
16,39
. Nesse sentido, o IFN-
γ
têm sido considerado como uma
das principais citocinas pró-aterogênicas, que por ativarem macrófagos,
favorecem a participação dessas células na resposta inflamatória
40
. Porém,
outros estudos relatam que essa citocina, além de ativar macrófagos, sob
certas circunstâncias, induzem os mesmos a apoptose. Se esse processo
ocorrer
in vivo
, os macrófagos podem estar envolvidos na característica
necrótica e pró-aterogênica das lesões complexas que ocorrem em fases
avançadas do processo aterosclerótico
41
.
As células musculares lisas das lesões, também possuem moléculas MHC
de classe II em sua superfície, podendo assim, apresentar antígenos a
células T CD4
+39
. Outro mecanismo envolvendo essas células seria que a
LDLox contribuiria para apoptose das células musculares lisas na placa
aterosclerótica, secretando assim, metaloproteinases e proteínas do
tecido conjuntivo
38
. Todos esses fatores, principalmente os macrófagos,
estariam envolvidos na quebra do colágeno, proteína responsável pela
sustentação
e estabilização da placa aterosclerótica, podendo assim,
causar a ruptura da mesma
39-41
.
Outros importantes estudos sobre o envolvimento de citocinas de padrão
TH
1
na aterosclerose têm sido realizados
in situ.
Em placas
ateroscleróticas, foram encontradas uma grande expressão de mRNA
para IFN-
γ
e interleucina-12 (IL-12), no entanto baixos níveis de mRNA
para interleucina-4 (IL-4). Adicionalmente, os estudos mostram que a IL-
12 foi produzida por monócitos em resposta a LDLox. Esses resultados
sugerem que a IL-12, por sua expressão nas lesões ateroscleróticas,
pode levar à amplificação de respostas de células TCD4
+
TH
1
,
contribuindo consideravelmente para a imunopatologia da
aterosclerose
32,42
. Todavia, esse processo pode apresentar-se altamente
regulado pela ação das citocinas anti-inflamatórias como a interleucina-10
(IL-10)
43,44
. O papel regulador da IL-10 foi demonstrado através da sua
expressão em algumas lesões ateroscleróticas, bem como na
demonstração de que a IL-10 exógena inibe a liberação de IL-12 induzida
por LDL. Essa citocina pode atuar inibindo a ação do fator nuclear kappa
B, com conseqüente diminuição da produção de citocinas pró-
inflamatórias, na inibição da apoptose de macrófagos, expressão do fator
tecidual, fibrinogênio e proliferação de células musculares lisas,
mecanismos esses diretamente relacionados com a progressão da
aterosclerose
45
.
Outra citocina com características anti-inflamatórias e que também
participa do controle do processo aterosclerótico é o fator de
crescimento e transformação beta-1 (TGF-
β
), que pode ser produzido
por várias células, incluindo monócitos, células musculares lisas,
plaquetas e células T. Essa citocina além de regular o crescimento,
diferenciação e função das células imunes, tem um efeito primordial no
início do processo aterosclerótico, inibindo a colagenase-1, estimulando
o aumento do fator inibidor do plasminogênio, e modulando a
proliferação de células musculares lisas e células endoteliais
46
.
Tomados em conjunto, os trabalhos relacionados deixaram claro que na
aterosclerose tanto as células das paredes vasculares, bem como os
leucócitos infiltrantes podem sintetizar uma variedade de mediadores
multipotentes da resposta inflamatória, principalmente as citocinas
envolvidas na modulação da expressão de moléculas de adesão entre
célula endotelial-leucócito e no recrutamento dessas células
27,35,36,39
.
Portanto, fica claro que uma amplificação do processo aterosclerótico
ocorre a partir do desencadeamento de uma resposta imune específica
que gera citocinas participantes da resposta TH
1
como a IL-12 e o IFN-
γ
47
.
Participação das proteínas de fase aguda
Além das citocinas, as proteínas positivas de fase aguda, principalmente a
proteína C reativa (PCR) tem sido alvo de vários estudos na patogênese da
aterosclerose. Além de exercer o papel clássico de opsonização de antígenos,
outros aspectos interessantes têm sido investigados
como o aumento dessa
proteína nas condições de obesidade, inflamação, síndrome metabólica, diabetes
e hipertensão arterial
48,49
.
Durante a resposta inflamatória da aterosclerose tem-se detectado
inúmeros papéis da PCR no processo de disfunção endotelial tais como o
aumento da expressão de moléculas de adesão como a endotelina-1 e
quimiocinas
50,51
, favorecendo o processo de ligação de monócitos ao endotélio,
com conseqüente aumento da formação de células espumosas
52
, e diminuição
da ativação da enzima oxido nítrico sintetase
50
.
O papel da PCR na aterosclerose têm sido reforçado por estudo que atribui
a essa proteína uma produção extra hepática
53
. Nesses estudos foi observado que
nas placas ateroscleróticas ocorre uma expressão significativa de mRNA para
PCR e que a presença dessa proteína pode ser detectada tanto nas células
musculares lisas quanto nos macrófagos, mostrando que a sua produção local
está aumentada. Outros dados também demonstram que essa proteína pode ser
expressa em células mononucleares periféricas, células das artérias coronárias e
células epiteliais de rins. Assim, considera-se que a PCR pode agir localmente
sobre as células endoteliais, monócitos e macrófagos ou células musculares lisas
de maneira autócrina e parácrina
54
.
Outro papel interessante e recente atribuído a essa proteína é o aumento
da expressão de LOX-1, induzindo a disfunção endotelial e a geração de ânions
superóxidos
54,55
.
Através desses relatos podemos concluir que o papel da PCR na
aterosclerose é muito mais complexo e que essa proteína está realmente
envolvida na progressão da doença, não sendo simplesmente um marcador
inflamatório, mas um fator de risco
56
.
A alfa-1 glicoproteína ácida (
α
1-GA) é outra proteína positiva de fase aguda
que está presente no processo inflamatório aterosclerótico, porém, sua função
ainda não está bem estabelecida. Em geral, a
α
1-GA é considerada uma
importante proteína que tem capacidade de se ligar a drogas e substâncias
endógenas
57
. Entretanto, estudos
in vitro
mostram diferentes funções como a
inibição da agregação plaquetária e modulação da resposta imunológica, inibindo
a proliferação de linfócitos. Não obstante, uma das principais funções dessa
proteína parece ser a de inibir a ligação de neutrófilos ao endotélio pelas
selectinas, que ocorre via glicanas fucosiladas presentes na sua molécula
58
.
Outros estudos apontam que a
α
1-GA inibe a produção das espécies
reativas de oxigênio, como ânion superóxido e peróxido de hidrogênio,
confirmando o efeito modulador exercido por essa proteína durante o processo
inflamatório
59
.
Marcadores laboratoriais na aterosclerose
Uma outra substância envolvida na aterosclerose é a lipoproteína de alta
densidade (HDL), a qual têm sido relacionada inversamente com as doenças
cardiovasculares
60
. O efeito protetor dessa lipoproteína não está totalmente
entendido, mas sabe-se que envolve o transporte de colesterol das células
periféricas para o fígado e também a modulação da função inflamatória e do
processo oxidativo, através da inibição das moléculas de adesão nas células
endoteliais, quimiocinas, o fator nuclear Kappa B, e a oxidação da LDL
60-64
.
Além dessas funções, a HDL possui outras propriedades importantes como
a de inibir a síntese do fator estimulador de plaquetas (PAF), estimular a síntese
de prostaciclina pelas células endoteliais, além de modular a função endotelial
estimulando a produção de óxido nítrico (NO)
61,65
. Essa lipoproteína, via ligação de
seus fosfolípides oxidados, também participa da neutralização da PCR,
confirmando assim seu importantíssimo papel na prevenção da aterosclerose.
O envolvimento tanto de citocinas, como de proteínas de fase aguda na
aterosclerose tem levado os pesquisadores a considerá-las como potenciais
marcadores inflamatórios que poderiam auxiliar na detecção de indivíduos que
apresentem riscos de sofrer complicações vasculares
66
. Nesse sentido, a PCR,
cujos níveis encontram-se elevados na aterosclerose, tem sido amplamente
avaliada como um potente indicador real de complicações na aterosclerose
66,67
.
Outras proteínas de fase aguda como o fibrinogênio e
α
-1 anti-tripsina,
também são apontadas como marcadores por apresentarem alterações
principalmente no infarto do miocárdio
68,69
.
A dosagem sérica de citocinas pró-inflamatórias como TNF-
α
, IL-1 e IL-6 e
de citocinas anti-inflamatórias como IL-10 e TGF-
β
, também tem sido estudada
como um marcador em potencial. Os resultados têm mostrado um significativo
aumento dos níveis dessas citocinas, principalmente nas síndromes coronarianas
agudas, angina instável e infarto do miocárdio
45-47.
Entretanto, devido à meia vida dessas proteínas, os seus níveis podem
tornar-se indetectáveis quando atingem a circulação sanguínea. De início, esse
fato desencorajou os pesquisadores a considerá-las como marcadores
importantes no processo
70,71
. No entanto, estudos mais recentes, apontam a
dosagem plasmática de IL-6, da PCR e das moléculas de adesão (ICAM-1) como
indicadores valiosos para doença arterial periférica. Adicionalmente esses
resultados mostram ainda a forte correlação da PCR com a IL-6, reforçando o
papel dessa citocina na produção dessa proteína pelo fígado
67,72
.
Receptores de citocinas podem também ser considerados como
indicadores de processos inflamatórios, uma vez que citocinas em altas
concentrações, têm sua atividade controlada através da ligação a esses
receptores, que são liberados na corrente sanguínea durante algum tempo. Os
estudos até o momento têm indicado que o receptor para IL-1 é o que está mais
relacionado com o estado inicial da doença
71,73
.
Outro indicador de fácil execução, que tem se mostrado importante no
processo diagnóstico é a contagem diferencial de leucócitos, uma vez que os
monócitos são células extremamente envolvidas no processo aterosclerótico
74-76
.
Estudos demonstraram um aumento significativo dessas células em pacientes,
deixando claro porém, que uma vez instalada a doença, os resultados obtidos com
esse marcador não permitem predizer os riscos posteriores desses pacientes.
Assim, além dessa contagem, é sugerido a utilização de outros marcadores que
associados a ela possam fornecer informações sobre o estágio em que a doença
se encontra. Nesse sentido, outro indicador em potencial a ser utilizado em
associação com a contagem diferencial, seria a avaliação do grau de ativação
dessas células, que, como já citado, está diretamente relacionado com a
aterogênese e isquemia
77
.
Esses relatos demonstram que a literatura tem se preocupado em descobrir
indicadores inflamatórios em potencial para a avaliação do risco de um
evento aterosclerótico. Muitos indicadores têm sido avaliados, porém,
devido às baixas especificidades e ou sensibilidade de detecção, poucos
apresentam habilidade para predizer o risco real dos pacientes
avaliados
66
.
Dentro desse contexto, os trabalhos devem ser direcionados no sentido de
considerar a complexidade do processo inflamatório que culmina com a
aterosclerose, estabelecendo marcadores sensíveis e específicos que, juntamente
com a avaliação clínica, possam efetivamente auxiliar no prognóstico de
aterosclerose
66
.
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