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MARIA CRISTINA DONADIO ABDUCH
Avaliação dos mecanismos adaptativos do miocárdio
durante sobrecarga de pressão induzida
com o uso de bandagem do tronco pulmonar:
participação da proliferação celular
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Doutor em Ciências
Área de concentração: Cardiologia
Orientadora: Dr
a
Vera Demarchi Aiello
São Paulo
2006
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Livros Grátis
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“Não basta saber, é preciso também aplicar;
não basta querer, é preciso também agir”.
Goethe
Agradecimentos Especiais
Àquelas pessoas que foram imprescindíveis para a realização desta
tese e que ocupam um lugar muito especial em meu coração.
À caríssima Dra. Vera Demarchi Aiello, por seu apoio e dedicação
incondicionais desde muito antes do início desta tese. Agradeço por ter
participado ativamente de todas as etapas deste estudo, começando pela
idéia brilhante do tema, e seguindo com toda a orientação séria e cuidadosa,
sempre preocupada com minha formação como cientista. Seu exemplo não
foi apenas profissional, e sinto-me realmente privilegiada em todos os
aspectos de minha vida por tê-la como mentora e modelo a ser seguido.
Espero que meu maior reconhecimento seja o de honrar, para sempre, a
riqueza recebida com seu convívio, procurando guiar-me pelos seus
ensinamentos. E, ouso ainda desejar ser merecedora de perpetuar nossos
laços para além deste trabalho.
Ao caríssimo Prof. Dr. Renato Samy Assad, incansável incentivador e
entusiasta da Ciência, por ter-me motivado nesta linha de pesquisa, a qual
iniciou há mais de uma década. Agradeço pela valiosíssima colaboração
neste estudo, pelo reconhecimento de meu trabalho e pela felicidade sincera
dos frutos colhidos. Seu exemplo, dedicação e persistência, quaisquer que
sejam as adversidades, serão lembrados em todos os momentos,
principalmente naqueles mais difíceis, como um incentivo para seguir
sempre em frente.
À amantíssima Miriam Abduch, que, para mim, sempre significou
muito mais do que uma irmã: minha melhor amiga, conselheira, porto seguro
nos momentos mais difíceis de minha vida, a pessoa que sempre se
preocupou para que eu tivesse sólida formação moral e intelectual. Minha
grande incentivadora, que tantas vezes abriu mão de seus próprios
interesses para que eu tivesse as melhores oportunidades. Agradeço pelo
amor verdadeiro, dedicação e por compartilhar comigo todos os momentos
importantes de minha vida.
Agradecimentos
Aos meus pais, Iussef Hana Abduch e Biasina Donadio Abduch, por
todos os esforços despendidos em minha formação.
À minha querida irmã Maria Angela Abduch, pelo otimismo e apoio
constantes, por me deixar alegre nos momentos tristes e por se orgulhar
imensamente de todas as minhas conquistas.
À minha querida irmã Maria da Penha Donadio Abduch Lifschitz e ao
meu querido sobrinho Lucas Abduch Lifschitz, pelo apoio e incentivos
recebidos.
Ao meu querido primo, Dr. Álvaro Abduchi (in memoriam), por ter
despertado em mim a vontade de ser médica veterinária, por seu exemplo
de amor e respeito aos animais e pela sua contribuição à Cardiologia
Veterinária.
Ao Dr. Álvaro Villela de Moraes e ao Dr. Caio Medeiros, por terem
aberto as portas do Laboratório de Ecocardiografia do InCor, onde realizei
grande parte de meu aprendizado e iniciei minha incursão pela Ciência.
Ao Dr. Miguel Quintana Rodriguez e ao Dr. Acrísio Valente pela coleta
dos dados hemodinâmicos, pela amizade e incentivo no transcorrer deste
estudo.
Ao Prof. Dr. José Lázaro de Andrade pelo apoio e interesse,
viabilizando a realização do estudo ecocardiográfico.
À equipe da Divisão de Experimentação do Instituto do Coração,
representada pelo Sr. Nelson Correa Jr., por todo auxílio recebido para a
realização dos exames ecocardiográficos.
À equipe do Laboratório de Patologia do Instituto do Coração,
especialmente à Dra. Nadia Vieira Sambiase, Ms. Suely Aparecida Pinheiro
Palomino, Dra. Márcia Martins Reis, Sra. Julia Lucia La Chioma Silvestre e
Sr. Antonio José Vicente Guedes, pelo precioso auxílio no preparo do
material para análise imuno-histoquímica.
À Srta. Solange Consorte, do Laboratório de Patologia do Instituto do
Coração, pelo processamento do material para análise morfológica.
Ao Sr. Gerson Lilá Ramos, do Laboratório de Patologia do Instituto do
Coração, pelo pronto auxílio prestado em tantos momentos deste trabalho.
À Sra. Creuza Maria Dal Bó, pela colaboração estatística.
À equipe da pós-graduação, Sra. Neusa Rodrigues Dini, Srta. Juliana
Lattari Sobrinho e Srta. Eva Malheiros Guiss de Oliveira, por serem sempre
tão prestativas, esclarecendo dúvidas e tornando nossas tarefas
burocráticas mais simples de serem realizadas.
À FAPESP pelo apoio financeiro a este projeto, através dos
processos número 2002/11721-6 e 2004/08825-0.
Ao Instituto do Coração – HC-FMUSP, por me proporcionar as
condições necessárias para a realização deste estudo.
À querida amiga, Dra. Lea Maria Macruz Demarchi, pelo apoio e
sugestões durante a realização desta tese.
À querida Dra. Maria Angélica Binotto, por ter compartilhado com
tanto entusiasmo um momento muito importante deste trabalho.
Aos queridos amigos que fiz durante estes anos, Raquel Fagundes,
Alessandra Roggerio e Luciano Borges, por todos os momentos que
passamos juntos e por tudo que me ensinaram, com o sincero desejo de que
nossa amizade continue além desse convívio.
Aos amigos do Instituto Veterinário de Imagem, representados pelo
Prof. Dr. Benedicto Wladimir De Martin, agradeço pelo incentivo recebido,
permitindo-me concluir este trabalho.
Aos animais que fizeram parte deste estudo, meu profundo respeito e
agradecimento, na certeza de que, sem eles, este trabalho não teria se
concretizado e na esperança de que esta pesquisa possa servir de algum
modo à Medicina Veterinária.
Aos meus amantíssimos irmãos em Deus, meus cães e meu gato,
com quem venho tendo o privilégio da convivência desde o meu nascimento,
sou grata por tudo o que me têm ensinado. Agradeço por me amarem
incondicionalmente, serem meus grandes amigos das horas de estudo e de
lazer, secarem minhas lágrimas com uma graça singela, trazerem calor ao
meu coração com um simples olhar e serem o grande motivo de minha
escolha profissional. A todos, os que estão presentes e àqueles que fazem
parte de minha lembrança, meu agradecimento, respeito e amor eternos.
A Deus, pela grande oportunidade recebida e por poder conviver com
pessoas que me ensinam tantas coisas, com tanto empenho.
Sumário
página
Lista de abreviaturas e siglas
Lista de símbolos
Lista de figuras
Lista de tabelas
Resumo
Summary
1. Introdução ......................................................................
1
1.1 Fisiologia da circulação fetal .................................................... 2
1.2 Circulação pós-natal na TGA .................................................... 7
1.3 Correção cirúrgica na TGA ....................................................... 8
1.4 Considerações sobre o preparo ventricular .............................. 13
2. Objetivos ........................................................................
23
3. Métodos .........................................................................
25
3.1 Anestesia .................................................................................. 26
3.2 Dispositivo de bandagem ajustável do tronco pulmonar .......... 27
3.3 Procedimento cirúrgico ............................................................. 28
3.4 Protocolo de insuflação do dispositivo de bandagem ajustável 29
3.5 Estudo ecocardiográfico ........................................................... 31
3.6 Exame morfológico dos corações ............................................. 33
3.6.1 Estudo histológico e morfométrico ................................... 34
3.6.1.1 Diâmetro das fibras miocárdicas e dos núcleos .. 34
3.6.1.2 Estudo da fração de área de colágeno ................ 36
3.6.1.3 Estudo imuno-histoquímico ................................. 36
3.7 Análise estatística ..................................................................... 40
4. Resultados .....................................................................
42
4.1 Análise hemodinâmica .............................................................. 44
4.1.1 Grupo de estimulação intermitente .................................. 44
4.1.2 Grupo de estimulação contínua ....................................... 45
4.2 Massa estimada do ventrículo direito ....................................... 46
4.3 Aspecto histológico geral .......................................................... 48
4.4 Fração de área de colágeno dos ventrículos direito e
esquerdo ..................................................................................
48
4.5 Diâmetro médio dos miocardiócitos e de seus respectivos
núcleos ..................................................................................... 50
4.5.1 Miocardiócitos .................................................................. 50
4.5.1.1 Comparação entre os grupos .............................. 51
4.5.1.2 Comparação dentro de cada grupo ..................... 52
4.5.2 Núcleos ............................................................................ 53
4.5.2.1 Comparação entre os grupos .............................. 54
4.5.2.2 Comparação dentro de cada grupo ..................... 55
4.6 Número de miocardiócitos e células do interstício e vasos
positivos para Ki-67 .................................................................. 56
4.6.1 Análise do índice de miocardiócitos Ki-67+ ..................... 56
4.6.1.1 Comparação entre os grupos .............................. 58
4.6.1.2 Comparação dentro de cada grupo ..................... 59
4.6.2 Análise do índice de células do interstício e vasos
Ki-67+ .............................................................................. 60
4.6.2.1 Comparação entre os grupos .............................. 61
4.6.2.2 Comparação dentro de cada grupo ..................... 62
4.7 Proporção entre índices de miocardiócitos e células do
interstício/vasos marcadas com Ki-67 .....................................
64
5. Discussão ......................................................................
65
5.1 Aspectos gerais sobre o preparo ventricular ........................... 66
5.2 A hipertrofia miocárdica ........................................................... 73
5.3 Marcadores da proliferação celular .......................................... 75
5.4 Estudo da proliferação celular ................................................. 81
5.4.1 Miocardiócitos ................................................................. 81
5.4.2 Células do interstício e vasos ......................................... 83
5.4.3 Considerações gerais sobre proliferação celular ............ 84
5.5 Limitações do estudo ............................................................... 89
5.6 Perspectivas futuras ................................................................ 90
6. Conclusões ....................................................................
92
7. Anexos ...........................................................................
94
8. Referências ....................................................................
97
Listas
Lista de Abreviaturas e Siglas
AD Átrio direito
AE Átrio esquerdo
Ag Antígeno
ATP Adenosina tri-fosfato
Bcl-2 Oncogene envolvido na apoptose celular
BrdU Bromodeoxiuridina
BSA Soro albumina bovina
C Controle
DNA Ácido desoxirribonucléico
Dp Derrame pericárdico
e Espessura
EC Estimulação contínua
EI Estimulação intermitente
EP Erro padrão
G
Gap
H Hipótese
HE Hematoxilina-Eosina
HRP
Horseradish peroxidase
ICC Insuficiência Cardíaca Congestiva
IgG Imunoglobulina
InCor-HC FMUSP Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo
Ki-67 Antígeno de proliferação celular
M Massa
MIB
Molecular Immunology Borstel
PBS
Phosphate buffer saline
PCNA
Proliferation cell nuclear antigen
RNAr Ácido ribonucléico ribossômico
S Septo interventricular
SHR
Spontaneous hypertensive rat
SD Metade direita do septo interventricular
SE Metade esquerda do septo interventricular
TGA Transposição das grandes Artérias
TP Tronco pulmonar
TUNEL
TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling
VAo Valva aórtica
VD Ventrículo direito
VE Ventrículo esquerdo
Lista de Símbolos
A Área
0
C Graus Celsius
cm Centímetro
cm
2
Centímetro quadrado
g Gramas
h Altura
kg Kilograma
M Mol
mg Miligramas
mm Hg Milímetros de mercúrio
ml Mililitros
MHz Megahertz
mm Milímetros
µm
Micrômetros
mM miliMol
pH Potencial de hidrogênio iônico
U Unidade
Lista de Figuras
Figura 1 - Dispositivo de bandagem do tronco pulmonar ................ 28
Figura 2 - Projeções ecocardiográficas para o cálculo da massa do
ventrículo direito ..............................................................
32
Figura 3 - Gradientes de pressão entre o VD e tronco pulmonar
nos grupos estimulados .................................................... 45
Figura 4 - Ecocardiograma basal e após treinamento através de
bandagem do tronco pulmonar .........................................
46
Figura 5 - Massa estimada do VD ao longo dos dias de
treinamento ....................................................................... 47
Figura 6 - Porcentagem de área de colágeno, segundo grupo de
estudo e segmento cardíaco ............................................
49
Figura 7 - Diâmetro transverso dos miocardiócitos, segundo grupo
de estudo e segmento cardíaco ....................................... 52
Figura 8 - Diâmetro transverso dos núcleos de miocardiócitos,
segundo grupo de estudo e segmento cardíaco ..............
56
Figura 9 - Núcleos de miocardiócitos marcados com Ag Ki-67 ........ 57
Figura 10 - Índice de miocardiócitos marcados com Ag Ki-67,
segundo grupo de estudo e segmento cardíaco ..............
59
Figura 11 - Núcleos de células do interstício e vasos do VD
marcados com Ag Ki-67 ................................................... 60
Figura 12 - Índice de células do interstício e vasos marcados com
Ag Ki-67, segundo grupo de estudo e segmento cardíaco
63
Figura 13 - Ciclo proliferativo celular ................................................... 76
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Gradientes de pressão desenvolvidos pelo VD nos
grupos estimulados .......................................................... 44
Tabela 2 - Massa estimada do VD, segundo grupo de estudo e dias
de observação ..................................................................
47
Tabela 3 - Porcentagem de área de colágeno, segundo grupo de
estudo e segmento cardíaco .............................................
49
Tabela 4 - Diâmetro dos miocardiócitos, segundo grupo de estudo e
segmento do septo interventricular ...................................
50
Tabela 5 - Diâmetro dos miocardiócitos, segundo grupo de estudo e
segmento cardíaco ............................................................
51
Tabela 6 - Diâmetro dos núcleos de miocardiócitos, segundo grupo
de estudo e segmento do septo interventricular ................
53
Tabela 7 - Diâmetro dos núcleos de miocardiócitos, segundo grupo
de estudo e segmento cardíaco ........................................
54
Tabela 8 - Índice de miocardiócitos marcados com o Ag Ki-67,
segundo grupo de estudo e segmento do septo
interventricular ...................................................................
57
Tabela 9 - Índice de miocardiócitos marcados com o Ag Ki-67,
segundo grupo de estudo e segmento cardíaco ...............
58
Tabela 10 - Índice de células do interstício e vasos marcados com Ag
Ki-67, segundo grupo de estudo e segmento do septo
interventricular ...................................................................
61
Tabela 11 - Índice de células do interstício e vasos marcados com Ag
Ki-67, segundo grupo de estudo e segmento cardíaco ..... 62
Tabela 12 - Proporção entre índices de miocardiócitos e células do
interstício e vasos marcadas com o Ag Ki-67 ...................
64
Resumo
Abduch MCD. Avaliação dos mecanismos adaptativos do miocárdio durante
sobrecarga de pressão induzida com o uso de bandagem do tronco
pulmonar: participação da proliferação celular [tese]. São Paulo: Faculdade
de Medicina, Universidade de São Paulo; 2006. 119p.
INTRODUÇÃO: Para os pacientes portadores de transposição das grandes artérias
que perderam a chance da cirurgia de Jatene nas primeiras semanas de vida,
indica-se realizar o preparo ventricular através da bandagem do tronco pulmonar
(BTP), objetivando causar aumento na massa miocárdica. Entretanto, com o tempo,
a câmara hipertrofiada pode apresentar disfunção contrátil; portanto, é importante
conhecer a qualidade do tecido preparado, uma vez que já se sabe que tanto os
miocardiócitos (MCD) quanto as células do interstício e vasos (I/V) são capazes de
proliferar após o período neonatal. Baseando-se no condicionamento físico de
atletas e considerando-se que os músculos cardíaco e esquelético são ambos
estriados, postula-se a hipótese de que o tipo de preparo ventricular possa
influenciar nas características do miocárdio treinado. OBJETIVOS: Identificar o tipo
de mecanismo adaptativo (hipertrofia/hiperplasia) envolvido no preparo rápido do
ventrículo pulmonar submetido à sobrecarga de pressão por meio de BTP, através
da análise dos MCD e células do I/V, verificando se existem diferenças em relação
ao tipo de treinamento (contínuo x intermitente) em comparação com os controles.
MÉTODOS: Foram estudados experimentalmente 21 cabritos após o período
neonatal, divididos em três grupos (C= grupo controle, n= 7, sem procedimento
cirúrgico; EC= grupo de estimulação contínua, n= 7, com bandagem progressiva e
permanente do tronco pulmonar durante 96 horas; EI= grupo de estimulação
intermitente, n= 7, com bandagem progressiva, 12 horas ao dia, totalizando 48
horas). Todos foram submetidos a estudo ecocardiográfico basal e aqueles dos
grupos EC e EI a ecocardiogramas diários para verificar a aquisição de massa
muscular do ventrículo direito (VD). Após o estudo, os animais foram sacrificados,
os corações retirados e cortes histológicos do VD, ventrículo esquerdo (VE) e septo
interventricular (S) fixados em formalina e processados para análise. Foram
estudados a porcentagem de área de colágeno através do Picro-sirius, o diâmetro
dos MCD e seus respectivos núcleos e o número de MCD e células do I/V
marcadas com Ki-67. As células marcadas foram avaliadas por campo
microscópico e por índice (número de células Ki-67+/2000 células). O nível de
significância considerado foi de 0,05. RESULTADOS: Ambos os grupos
estimulados apresentaram ganho significativo de massa muscular do VD (p< 0,05).
Não houve aumento na porcentagem de colágeno do VD nos grupos treinados (p=
0,403). Considerando-se o VD, os grupos EC e EI apresentaram diâmetro dos MCD
maior que o grupo controle (p< 0,001), ocorrendo o mesmo com os respectivos
núcleos (EI x C: p< 0,001 e EC x C: p= 0,005). O número de MCD marcados com
Ki-67 foi maior no VD dos grupos estimulados comparado com o VE (p= 0,009,
índice de proliferação; p= 0,001, contagem por campo), bem como para as células
do I/V (p< 0,001, contagem por campo e índice). CONCLUSÕES: Tanto hipertrofia
quanto hiperplasia celular estão envolvidas na adaptação do ventrículo pulmonar
submetido à sobrecarga sistólica através da BTP. Ambos os tipos de
condicionamento (contínuo e intermitente) provocaram hipertrofia e hiperplasia dos
MCD, induziram também à mitose das células do I/V, sem deposição de colágeno
intersticial ao final do experimento.
Descritores: 1.Transposição dos grandes vasos, 2.Cardiopatias congênitas,
3.Cirurgia torácica, 4.Proliferação de células, 5.Antígeno Ki-67, 6.Hipertrofia
ventricular direita.
Summary
Abduch MCD. Assessment of myocardial adaptive mechanisms during
pressure overload induced by pulmonary artery banding: contribution of cell
proliferation [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de
São Paulo”; 2006. 119p.
INTRODUCTION: Rapid ventricular conditioning induced by pulmonary artery
banding (PAB) has been indicated to those patients with transposition of the great
arteries (TGA) who have lost the chance for arterial switch operation – Jatene’s
procedure – aiming at induce myocardial mass increase. However, with time,
hypertrophied chamber may exhibit contractile dysfunction, so that, it is important to
assess quality of the prepared tissue, once it is of knowledge that both
cardiomyocytes (CMC) and interstitial/vessel (I/V) cells are capable of proliferating
after neonatal period. Based on fitness of athletes and considering that cardiac and
skeletal muscles are both striated, there is the hypothesis that the type of ventricular
prepare may influence the characteristics of the training myocardium. OBJECTIVES:
Through CMC and I/V cells analysis, identifies the type of adaptive mechanism
(hypertrophy/ hyperplasia) involved in rapid prepare of subpulmonary ventricle
submitted to pressure overload by PAB, and verifies if there are differences in
relation to the kind of training (continuous x intermittent), comparing them to the
controls. METHODS: Twenty-one goats, beyond neonatal period, were
experimentally studied. They were divided in three groups: C (control group, n= 7,
with no surgical procedure); CS (continuous stimulation group, n= 7, with
progressive and permanent PAB, during 96 hours); IS (intermittent stimulation
group, n= 7, with progressive PAB, 12 hours/day, totalizing 48 hours). All the
animals were submitted to basal echocardiograms and those from CS and IS groups
to diary echocardiograms to verify right ventricular (RV) muscular mass acquisition.
After the study, goats were killed, hearts excised and histological sections from RV,
left ventricle (LV) and ventricular septum (VS) were formalin fixed and histologically
processed. Collagen area fraction (through Picro-sirius red staining), CMC and
respective nuclei diameter, and number of CMC and I/V cells Ki-67 positive were
studied. Marked cells were analysed per high-power fields and by index (Ki-67
positive cells/2000 cells). The statistical significant level was set at 5%. RESULTS:
Both stimulated groups presented significant RV muscular mass increase (p< 0.05).
There were no augmentation in RV collagen area fraction in training groups (p=
0.403). Considering the RV, CS and IS groups showed an increase in CMC
diameter compared to the control group (p< 0.01), occurring the same to respective
nuclei (EI x C: p< 0.001 e EC x C: p= 0.005). Number of CMC marked with Ki-67
was greater in RV from stimulated groups in relation to LV (p= 0.009, proliferation
index; p= 0.001, number/high-power fields); the same occurred to I/V cells
(proliferation index and number/high-power fields: p< 0.001). CONCLUSIONS: Both
cell hypertrophy and hyperplasia are involved in adaptation of the pulmonary
ventricle submitted to pressure overload through PAB. Both types of conditioning
(continuous and intermittent) caused CMC hypertrophy and hyperplasia, besides
induced I/V cells mitosis, without interstitial collagen deposition at the end of
experiment.
Descriptors: 1.Transposition of great vessels, 2.Congenital heart defects, 3.Thoracic
surgery, 4.Cell proliferation, 5.Ki-67 antigen, 6.Right ventricular hypertrophy.
1. Introdução
Introdução 2
A transposição das grandes artérias (TGA) é uma malformação
cardíaca congênita em que há conexão atrioventricular concordante e
conexão ventrículo-arterial discordante, de modo que a aorta emerge do
ventrículo morfologicamente direito (VD) e o tronco pulmonar conecta-se ao
ventrículo morfologicamente esquerdo (VE)
1-3
.
Durante a vida intra-uterina, essa situação não oferece risco ao
paciente, devido às características da circulação fetal. Entretanto, após o
nascimento, as alterações circulatórias que ocorrem no neonato fazem com
que a criança portadora dessa doença sofra uma série de complicações
4-8
.
1.1 Fisiologia da circulação fetal
A maior parte do conhecimento sobre fisiologia da circulação fetal
normal foi obtida por meio de estudos realizados em ovelhas
9-11
, mamíferos
classificados como pequenos ruminantes. As observações feitas em fetos
humanos indicam que o padrão de fluxo sangüíneo é semelhante em ambas
as espécies
9
.
Após o nascimento, as trocas gasosas são realizadas pelos pulmões.
O sangue venoso que chega ao átrio direito passa através da valva
tricúspide para o ventrículo direito e daí para o tronco pulmonar, atingindo os
pulmões onde, então, é saturado com oxigênio. As veias pulmonares levam
o sangue saturado ao átrio esquerdo, que passa pelo ventrículo esquerdo e
Introdução 3
daí para a aorta, de onde atinge todos os órgãos do corpo. Dessa forma, a
circulação se dá em série, sendo que o débito cardíaco direito é
representado pelo fluxo pulmonar e o débito cardíaco esquerdo, pelo fluxo
aórtico. Ambos os débitos são semelhantes
11-12
.
Durante a vida intra-uterina, o feto recebe os nutrientes e sangue
oxigenado da placenta materna. Saindo da placenta, as veias umbilicais
direita e esquerda confluem para a veia umbilical comum que chega ao
fígado do feto pela veia porta hepática. Cerca de 55% desse sangue é
direcionado ao duto venoso e os 45% restantes vão para os lobos direito e
esquerdo do fígado. O duto venoso funciona como uma ponte entre a veia
umbilical e o feto, levando sangue oxigenado para a veia cava inferior e daí
para o átrio direito
12
. Na seqüência, a maior parte desse sangue é
direcionada para o átrio esquerdo através do forame oval, passando, em
seguida, para o ventrículo esquerdo e para a aorta ascendente, indo irrigar a
cabeça e os membros superiores. Apenas uma pequena parte do sangue
que chega à veia cava inferior passa para o ventrículo direito através da
valva tricúspide
1,10,12
.
A veia cava superior é responsável por aproximadamente 20% do
retorno venoso do coração fetal e praticamente todo o sangue contido em
seu interior passa do átrio direito para o ventrículo direito pela valva
tricúspide
12
. Quando chega ao tronco pulmonar, esse sangue é distribuído
para os pulmões e para a aorta descendente através do canal arterial. Da
aorta descendente, segue para o abdome e membros inferiores do feto,
voltando então à placenta para ser oxigenado
1,12
.
Introdução 4
O fígado do feto representa um importante regulador do retorno
venoso para o coração, uma vez que tem grande parte de seu volume
constituído por sangue e é um órgão altamente complacente. Cerca de 25%
do retorno venoso do coração fetal são provenientes do fígado. A veia cava
inferior recebe, em sua porção mais distal, sangue proveniente da veia
hepática direita; esse fluxo dirige-se quase que totalmente para o ventrículo
direito através da valva tricúspide. O sangue contido na veia hepática
esquerda se junta ao da veia cava inferior que passa pelo forame oval e
dirige-se para o átrio esquerdo
10,12
.
Portanto, a veia cava inferior contém uma mistura de sangue
(oxigenado da placenta e venoso do sistema cava), enquanto que a veia
cava superior contém apenas sangue venoso. Desse modo, a saturação de
oxigênio no átrio e ventrículo esquerdos é maior que aquela no átrio e
ventrículo direitos. Isso é comprovado por estudos experimentais em fetos
de ovelha, os quais apresentam maior concentração de oxigênio na carótida
do que na artéria femoral, uma vez que o sangue do ventrículo esquerdo
dirige-se para a aorta ascendente e o sangue do ventrículo direito vai para a
aorta descendente
12
.
No feto, a existência dos shunts (representados pelo duto venoso,
forame oval e canal arterial) faz com que haja mistura de sangue oxigenado
e venoso e com que certas partes do corpo sejam supridas por ambos os
ventrículos, caracterizando o débito cardíaco combinado e a chamada
circulação em paralelo. O ventrículo direito ejeta cerca de 60 a 65% de seu
volume; desses, cerca de 7% vão para os pulmões (apenas para
Introdução 5
suprimento, pois os mesmos não exercem ainda as trocas gasosas) e os
55% restantes passam pelo canal arterial e, daí, para a aorta descendente.
O ventrículo esquerdo ejeta cerca de 34 a 40% de sangue do débito total:
3% para o miocárdio, 20% para a cabeça, pescoço, parte superior do corpo
e membros anteriores e de 10 a 15% para a aorta descendente
12
.
Devido à presença do forame oval, as pressões nos átrios direito e
esquerdo são semelhantes, como também o são as pressões de enchimento
dos ventrículos. O fato de as pressões serem equalizadas na vida intra-
uterina faz com que ambos os ventrículos tenham espessuras de paredes
iguais e as pressões na aorta e no tronco pulmonar sejam equivalentes
12-14
.
Os pulmões do feto funcionam como um circuito de alta resistência,
pois recebem sangue apenas para seu desenvolvimento, dado que as trocas
gasosas são realizadas pela placenta
1,13,15
. Essa última representa, então,
um circuito de baixa resistência, pois recebe cerca de 50% do débito
cardíaco dos dois ventrículos
10
. Após o nascimento, o cordão umbilical é
cortado, o fluxo para a placenta é interrompido e os pulmões passam a atuar
como o órgão responsável pela oxigenação dos tecidos. A queda da
resistência vascular pulmonar após o nascimento, determinada pela entrada
de oxigênio nos pulmões, ocasiona aumento considerável do volume de
sangue que passa pela circulação pulmonar, queda na pressão do tronco
pulmonar e aumento do retorno venoso para o átrio esquerdo.
Conseqüentemente, as pressões no ventrículo esquerdo e na aorta se
elevam
10
. Tais diferenças de pressão levam ao fechamento do forame oval.
Paralelamente, dá-se o fechamento do canal arterial em decorrência do
Introdução 6
aumento da saturação de oxigênio sangüíneo após o nascimento e da
ausência de prostaglandinas vasoativas produzidas pela placenta. Dessa
forma, estabelecem-se duas circulações que passam a funcionar em série: a
circulação pulmonar e a circulação sistêmica, com débitos cardíacos
semelhantes
1,9,11,13,16-20
.
A espessura das paredes ventriculares também é afetada pela
diferença de sobrecarga de pressão entre os dois ventrículos. Ao trabalhar
com as pressões sistêmicas da aorta (portanto mais altas), a massa
ventricular esquerda aumenta em relação à do ventrículo direito, submetido
às pressões pulmonares (mais baixas). Após o nascimento, o ventrículo
direito sofre hipotrofia e perde cerca de 20% de sua massa muscular
4,21
.
O processo de transição varia entre as diferentes espécies de
mamíferos, mas, de modo geral, completa-se por volta de quatro a cinco
semanas
9
.
Enquanto no feto a presença dos shunts intra e extracardíacos –
representados pelo forame oval, pelo canal arterial e pelo ducto venoso – é
essencial para que as trocas gasosas sejam viabilizadas, após o nascimento
os mesmos não são mais necessários porque os pulmões realizam essas
trocas. Entretanto, algumas doenças cardíacas congênitas fazem com que a
patência desses shunts seja determinante para a manutenção da vida após
o nascimento
13,22,23
.
Introdução 7
1.2 Circulação pós-natal na TGA
Na TGA, os ventrículos não estão conectados em série e, portanto, é
imperioso que haja mistura de sangue, o que se faz por meio dos shunts
existentes desde a vida intra- uterina (canal arterial e/ ou forame oval) ou de
defeitos nos septos atrial e/ ou ventricular
13,22,23
. Assim, o débito cardíaco de
cada ventrículo pode ser determinado individualmente por suas pressões de
enchimento, complacência e resistência dos respectivos leitos vasculares.
Como o ventrículo esquerdo encontra-se conectado ao tronco pulmonar, há
queda progressiva na massa muscular e aumento da complacência em
relação ao ventrículo sistêmico (VD)
24
. Baño-Rodrigo et al.
25
, estudando
104 espécimes com TGA e comparando-os com 63 corações infantis
normais, concluíram que, ao nascimento, a espessura das paredes do VE é
semelhante em ambos os casos. Os corações com TGA e septo
interventricular íntegro apresentaram diminuição da espessura a partir dos
oito meses de vida; naqueles com defeito de septo interventricular
significativo (ou seja, com sobrecarga de pressão e de volume), a espessura
foi menor a partir dos 13 meses de idade. Os corações com TGA e septo
interventricular íntegro estudados por Huhta et al.
26
possuíam espessura
das paredes do VE bastante reduzida já com dois a quatro meses de vida.
Na verdade, não se sabe ao certo em que momento o VE deixa de ser apto
para suportar as pressões sistêmicas
26
, visto que a espessura de suas
paredes, entre outros fatores, é um dos determinantes dessa capacidade
27
.
Um ventrículo com espessura maior terá também maior massa muscular, o
Introdução 8
que o torna habilitado a trabalhar sob regime de pressões maiores,
executando mais trabalho com menor consumo de energia.
1.3 Correção cirúrgica da TGA
A primeira preocupação frente a uma criança com transposição das
grandes artérias é possibilitar que o sangue venoso pulmonar (oxigenado)
alcance a circulação sistêmica e que o sangue venoso sistêmico (com baixa
saturação de oxigênio) atinja a circulação pulmonar
28
. Assim, as primeiras
abordagens cirúrgicas corretivas realizadas nesses pacientes foram as
cirurgias de Senning e de Mustard, conhecidas como forma de correção no
plano atrial, em que o sangue proveniente das veias pulmonares é
redirecionado para o átrio e ventrículo direitos, atingindo a aorta, e o sangue
proveniente das veias cavas é desviado para o átrio e ventrículo esquerdos,
alcançando o tronco pulmonar; desse modo, o VD passa a atuar como
ventrículo sistêmico
28,29
. Entretanto, o ventrículo direito não é adaptado para
trabalhar com pressões elevadas e, com o tempo, passa a sofrer disfunção
contrátil, conforme mostram vários relatos de casos de pacientes submetidos
a essas cirurgias e de pacientes com transposição corrigida das grandes
artérias (em que o ventrículo direito apresenta contração normal na infância,
mas, com a idade, os índices de função sistólica vão diminuindo
progressivamente)
30-34
. Em termos gerais, cerca de 10% ou mais dos
pacientes submetidos à correção no plano atrial apresentam disfunção do
VD dentro de dez anos
30
. Graham
31
observou incidência de 50 a 75% de
disfunção ventricular direita em seguimento de um mês a dez anos após
Introdução 9
reparo através das cirurgias de Mustard e Senning para correção da TGA;
Graham et al.
32
encontraram fração de ejeção do VD abaixo da normalidade
em 67% dos pacientes com TGA no período de seis a 29 meses após a
cirurgia de Mustard; no estudo de Okuda et al
33
,
todas as 15 crianças com
TGA e cirurgia de Senning apresentavam fração de ejeção do VD reduzida
em relação ao normal. No Instituto do Coração do Hospital das Clínicas -
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, em seguimento
tardio (média= 15,3 anos) de 44 pacientes submetidos à cirurgia de Senning,
observou-se que 93% apresentavam insuficiência cardíaca congestiva (ICC)
classe funcional I e 7% ICC classe funcional II (New York Heart
Association)
35
.
Sabe-se que existem diferenças entre os ventrículos direito e
esquerdo quanto à capacidade de suportar determinadas pressões
6,7
. O VE
apresenta o formato cilíndrico, a via de entrada e saída lado a lado e um
padrão de contração concêntrico, o que favorece o trabalho de bomba de
pressão, enquanto o VD, com uma grande superfície e uma via de entrada
mais afastada da via de saída, parece ser mais apropriado para regime de
menor pressão. Além disso, o VE apresenta duas artérias coronárias
(interventricular anterior e circunflexa), ao passo que o VD apresenta apenas
uma artéria (coronária direita). Portanto, existem motivos anatômicos e
fisiológicos que favorecem a disfunção tardia do VD, quando submetido
cronicamente a pressões maiores. Além disso, outras complicações podem
advir em decorrência desse tipo de procedimento, como arritmias atriais e
Introdução 10
anormalidades na condução, obstrução no sistema venoso sistêmico e
pulmonar e alterações nos retalhos intra-atriais
29,36,37
.
A queda na contratilidade do VD nos portadores de TGA é outro
motivo de preocupação no suporte a esses pacientes. Em 1975, Jatene et al.
realizaram com sucesso, no Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia, em
São Paulo, a correção no plano arterial em uma criança com quarenta dias
de vida e diagnóstico de TGA com defeito de septo interventricular amplo
38
.
Por promover a correção anatômica, essa cirurgia devolve ao VE sua
condição fisiológica de ventrículo sistêmico, sendo o procedimento de
escolha no tratamento da referida cardiopatia em crianças com até dez
semanas de vida
39-46
.
Colan et al.
47
estudaram 53 crianças com TGA e septo
interventricular intacto ou com defeito de septo interventricular insignificante.
Os pacientes foram divididos em dois grupos: TGA 1 (21 crianças estudadas
entre cinco a dez dias após a cirurgia) e TGA 2 (32 pacientes mais velhos,
estudados no pós- operatório tardio, entre cinco e cinqüenta meses); no
momento da cirurgia os pacientes possuíam idade média de quatro dias.
Quatro anos após a cirurgia de Jatene, não foram encontradas evidências de
disfunção sistólica ou diastólica com relação aos controles; provavelmente,
isso se deva ao fato de a correção ter sido feita precocemente.
A correção anatômica deve ser realizada quando a criança é
encaminhada logo após o nascimento ou, após o período neonatal, naqueles
casos de TGA associada a defeitos que mantenham alta a pressão no
ventrículo pulmonar (defeito de septo interventricular amplo, canal arterial
Introdução 11
patente ou estenose subpulmonar)
40,48
. Entretanto, quando o paciente é
encaminhado após o período neonatal ou quando existem complicações que
impeçam a realização da cirurgia de Jatene precocemente (enterocolite
necrotizante, insuficiência renal, insuficiência hepática, baixo peso, anatomia
desfavorável das artérias coronárias, outros problemas cardíacos maiores
associados, bebês prematuros ou distantes dos centros de referência), a
queda na resistência vascular pulmonar faz com que diminua a massa
muscular do VE, colocando em risco o sucesso da cirurgia
44,49-52
.
Em 1977, Yacoub et al.
53
introduziram o conceito de preparo do
ventrículo pulmonar, tornando-o capaz de trabalhar com pressões maiores
para, posteriormente, realizar a correção anatômica. A primeira criança em
que foi aplicado esse conceito possuía TGA e septo interventricular íntegro,
sendo operada pela primeira vez com quatro semanas de idade; o grupo
realizou a bandagem do tronco pulmonar com a finalidade de aumentar o
pico sistólico sobre o ventrículo e, conseqüentemente, sua massa muscular.
A bandagem permaneceu até os seis meses de idade, quando foi feita a
correção total.
A bandagem do tronco pulmonar como procedimento isolado foi
realizada pela primeira vez por Muller e Dammann, em 1952
54
, para
prevenir a sobrecarga do circuito pulmonar e evitar doença vascular
obstrutiva pulmonar. Nos portadores de transposição das grandes artérias, a
utilização inicial da bandagem tinha a finalidade de preservar o ventrículo de
hipertensão pulmonar, nos casos com alta pressão no VE (defeitos de septo
interventricular grandes associados ou após atrioseptostomia). O uso dessa
Introdução 12
técnica para capacitar o VE a sustentar a circulação sistêmica abriu novas
perspectivas para a correção total da TGA
55
.
Os primeiros estudos com a cirurgia de Jatene em duas etapas
preconizavam o uso de bandagem fixa do tronco pulmonar, por períodos de
tempo que variavam de um a 36 meses até ser realizada a segunda fase, ou
seja, a correção total. Porém, isso se mostrou problemático em alguns
aspectos: a bandagem fixa não permitia eventuais ajustes necessários sem
que fosse realizada nova toracotomia no paciente, o aumento súbito na pós-
carga do VE causava comprometimento de sua função contrátil, o período
prolongado de bandagem podia acarretar estenose no local, dilatação e
insuficiência da neo-aorta
27,50,56,57
.
Estudos experimentais em ratos com bandagem do arco aórtico
58
e
estudos clínicos em pacientes com estenose aórtica
59
mostram que a
sobrecarga de pressão imposta ao ventrículo esquerdo leva à diminuição de
sua contratilidade. Ilbawi et al.
27
encontraram disfunção miocárdica aguda
em pacientes com TGA e septo interventricular íntegro submetidos à
bandagem do tronco pulmonar, devido à sobrecarga aguda de pressão a
que foi submetido o VE. Hon et al.
60
, estudando experimentalmente ovelhas
antes e trinta minutos após constrição do tronco pulmonar, observaram que
a sobrecarga aguda na pós-carga do ventrículo direito produziu aumento no
volume diastólico final e no volume sistólico dessa câmara, com aumento da
contratilidade; entretanto, tais resultados não podem ser extrapolados para
sobrecarga crônica.
Introdução 13
1.4 Considerações sobre o preparo ventricular
Considerando-se que o preparo do VE é desejável, mas oferece
desvantagens no modelo utilizado inicialmente, propôs-se o uso de
bandagem ajustável do tronco pulmonar, com elevação lenta e progressiva
da pós-carga a fim de que o ventrículo pudesse se adaptar melhor, com
menores alterações na função sistólica. Com esse objetivo, dispositivos de
bandagem com ajuste externo passaram a ser desenvolvidos e utilizados
com sucesso
61-66
.
Solis et al.
63
analisaram, por meio do ecocardiograma, seis porcos
jovens com bandagem ajustável do tronco pulmonar durante trinta dias;
todos os animais sobreviveram ao experimento e todos desenvolveram
hipertrofia do ventrículo direito.
Lange et al.
64
, trabalhando com leitões que tiveram bandagem
progressiva do tronco pulmonar, observaram que, após um período de
quatro a seis semanas, os animais desenvolveram hipertrofia do ventrículo
direito, com aumento significativo de sua massa muscular.
Muraoka et al
. 65
analisaram oito crianças com cardiopatias congênitas
complexas e que foram submetidas à bandagem do tronco pulmonar com
torniquete ajustável externamente. Todas sobreviveram ao procedimento,
não houve deterioração hemodinâmica, a pressão no tronco pulmonar
diminuiu e a pressão arterial sistêmica elevou-se, mostrando que a
possibilidade de regular a pós-carga torna o procedimento mais vantajoso e
Introdução 14
seguro, pois diminui a morbidade e a mortalidade relacionadas com a
bandagem fixa e, às vezes, inadequada.
Outra questão de grande interesse relacionada com a primeira etapa
da cirurgia de Jatene incide sobre o tempo necessário para que o ventrículo
esteja preparado. Conforme mencionado anteriormente, preparos mais
longos implicam em maiores complicações. Estudos experimentais mostram
que o miocárdio submetido à sobrecarga de pressão é capaz de sofrer
hipertrofia num curto período de tempo, iniciando-se horas após a aplicação
do estímulo e completando-se em alguns dias
67-70
.
Bing et al.
58
encontraram hipertrofia do ventrículo esquerdo de ratos
com bandagem do arco aórtico três dias após o procedimento; com sete
dias, a massa muscular atingiu os valores máximos e permaneceu constante
nos 21 dias subseqüentes de estudo. Jonas et al.
51
mostraram que o
preparo rápido, em sete dias, do VE em pacientes com TGA e septo
interventricular intacto provoca aumento de 85% da massa muscular do
ventrículo; a fração de ejeção diminui nos primeiros três dias, havendo
recuperação ao longo do estudo. O preparo rápido do ventrículo pulmonar
em crianças com TGA e septo interventricular íntegro também foi
pesquisado por Boutin et al.
71
que concluíram que existe aumento
significativo da massa muscular, atingindo o pico em sete dias. Portanto, é
possível a indução de hipertrofia ventricular num período mais curto,
reduzindo os riscos de complicações decorrentes da primeira etapa de
correção anatômica
72,73
.
Introdução 15
Em nosso meio, Assad et al.
74
principiaram uma série de estudos
experimentais em cabritos utilizando os conceitos de preparo rápido do
ventrículo pulmonar e estenose ajustável do tronco pulmonar com a
finalidade de causar hipertrofia ventricular
75
. Os trabalhos iniciais basearam-
se na idéia de que a primeira fase da cirurgia de Jatene poderia ser
realizada de maneira não-cirúrgica, por meio da colocação de um cateter-
balão que chegasse ao tronco pulmonar através do ventrículo direito (VD) e
provocasse aumento da pós-carga por meio de ajuste controlado
61-66,76
.
Desse modo, foi idealizado um modelo de cateter com um balão em uma de
suas extremidades, o qual poderia ser insuflado externamente, permitindo
um ajuste fino da diminuição do lúmen do tronco pulmonar. Estudando seis
cabritos após o período neonatal, com insuflação ininterrupta e progressiva
do balão (de nove a vinte dias), observou-se que a espessura da parede
livre do ventrículo treinado igualou-se (e, num dos animais, superou) à
espessura da parede do ventrículo esquerdo (VE) e do septo interventricular.
O estudo de microscopia óptica mostrou aumento relevante do diâmetro dos
miocardiócitos do VD em relação aos controles, ao septo interventricular e
ao VE; os núcleos dos miocardiócitos aumentaram significativamente em
relação aos controles. Esses resultados mostraram não só a possibilidade
de um treinamento mais rápido e eficiente, bem como sugeriram possível
aumento do material nuclear dos miocardiócitos para realizar uma maior
síntese de proteínas no ventrículo pulmonar
74
.
Seguindo a mesma linha de pesquisa para um preparo rápido e
controlado do ventrículo pulmonar, Dias et al.
77
utilizaram um manguito
Introdução 16
hidráulico à base de silicone para bandagem do tronco pulmonar com ajuste
percutâneo; o tempo de treinamento foi reduzido para 96 horas. O estudo
ecocardiográfico mostrou aumento de 66% na espessura da parede livre do
VD em relação aos valores basais, superando, inclusive, a espessura do
septo interventricular e da parede livre do VE. À microscopia óptica,
observou-se aumento do perímetro e da área dos miocardiócitos do VD,
indicando hipertrofia celular. Portanto, o dispositivo mostrou-se capaz de
aumentar a massa do ventrículo pulmonar em menor intervalo de tempo.
Com a finalidade de comparar a eficácia dos dois métodos utilizados
para causar aumento da sobrecarga ventricular, Canêo et al.
78
estudaram
dois grupos de animais. Num dos grupos (grupo I) implantou-se o cateter-
balão; no outro (grupo II), o manguito hidráulico de bandagem externa. Os
animais do grupo II atingiram pressões maiores, porém ambos os engenhos
foram competentes para causar hipertrofia do VD num curto intervalo de
tempo (96 horas), concluindo-se que, apesar do dispositivo externo ter maior
capacidade de provocar estenose, o primordial é o treinamento ventricular,
que se revela mais importante que o tipo de mecanismo utilizado. A partir
disso, começou-se a pensar em outros tipos de treinamento.
Além do preparo do ventrículo relacionar-se com a aquisição de
massa muscular e com a idade do paciente, uma questão muito importante é
a qualidade do tecido treinado. O miocárdio que sofre hipertrofia reacional
pode apresentar disfunção contrátil com o passar do tempo, o que não é
desejável no ventrículo preparado
73,79-81
. Baseando-se no princípio do
treinamento de atletas, em que os músculos esqueléticos e também o
Introdução 17
músculo cardíaco desenvolvem a capacidade de suportar maior carga de
trabalho através da hipertrofia de suas fibras, coloca-se a hipótese de que
talvez o ventrículo a ser preparado sofra melhor adaptação, se submetido a
uma sobrecarga de pressão intermitente
82-84
.
A qualidade do preparo também está relacionada com o tipo de
aquisição de massa muscular
72,73,79,85
. Inicialmente, pensava-se que, após o
nascimento, o coração dos mamíferos não estava capacitado para sofrer
hiperplasia (aumento da população de células através de mitose) e que o
único mecanismo adaptativo disponível em resposta à sobrecarga de
pressão seria a hipertrofia celular (aumento do diâmetro das células, sem
alteração do número das mesmas)
86,87
. Porém, estudos experimentais e
clínicos mostram que a fibra miocárdica e os componentes intersticiais
podem apresentar hiperplasia tanto algumas semanas após o nascimento
quanto em corações adultos comprometidos por doenças valvares,
coronarianas ou por cardiomiopatia dilatada. Essa capacidade de
proliferação celular também foi observada em corações transplantados que
apresentaram rejeição
88-99
. Isso indica que, mesmo sendo células
diferenciadas, os miocardiócitos são capazes de reentrar no ciclo
proliferativo em diferentes idades do indivíduo. Dowel et al.
85
demonstraram,
em ratos adultos com constrição da aorta abdominal, que a incorporação de
timidina nos núcleos de miocardiócitos foi 8,11 vezes maior nesse grupo do
que nos controles. Anversa et al.
92
, estudando ratos adultos, idosos e senis,
encontraram uma porcentagem maior de miocardiócitos em mitose nos
animais senis, seguidos pelos idosos e depois pelos adultos. Esse aumento
Introdução 18
foi 6,3 vezes maior no VE e 2,3 vezes maior no VD, sugerindo que a
sobrecarga mecânica à qual o ventrículo sistêmico está submetido estimula
o crescimento miocárdico; além disso, a deterioração da função cardíaca
com o passar do tempo também induziria à hiperplasia miocárdica. Quaini
et al.
95
observaram porcentagens semelhantes (33,51±1,60%) de
miocardiócitos marcados com antígeno nuclear de proliferação celular
(PCNA) em corações normais de fetos e de pacientes adultos (idades
variando de 26 a 80 anos) com ICC. Kajstura et al.
99
compararam os índices
de mitose entre miocardiócitos de 27 pacientes com isquemia e
cardiomiopatia dilatada (médias de idade respectivamente 52 e 55 anos) e
nove controles, encontrando um índice dez vezes maior de mitose nos
corações doentes.
Após o nascimento, o VE exposto à circulação sistêmica sofre
aumento significativo de sua massa e também de seu volume. Desse modo,
a relação entre a espessura e o raio ventricular permanece constante,
havendo, portanto, uma hipertrofia excêntrica. A proliferação celular
(hiperplasia) continua mais intensamente até algumas semanas após o
nascimento. Associado a isso, ocorre igualmente aumento do diâmetro dos
miócitos (hipertrofia). Esses dois fatores contribuem para o aumento da
espessura das paredes do VE. Progressivamente, o crescimento em
paralelo supera a proliferação dos miócitos e há aumento do número de
mitocôndrias e miofibrilas
4,100,101
.
Nas fases iniciais de sobrecarga de pressão, a espessura das
paredes cardíacas aumenta sem que haja dilatação das câmaras (hipertrofia
Introdução 19
concêntrica), com o objetivo de normalizar o estresse sistólico sobre os
ventrículos
4,45,100
. É de extrema importância saber se isso é devido apenas
ao aumento do diâmetro das células cardíacas contráteis ou se também
existe replicação das mesmas, pois a hipertrofia como mecanismo
adaptativo é eficiente na fase compensada, podendo evoluir para disfunção
do músculo e ICC com o tempo
49,52,64,85,98,101,102
.
Sabe-se que ratos jovens (dois meses de idade), com oclusão
experimental do tronco pulmonar e conseqüente sobrecarga crônica de
pressão sobre o VD apresentam hipertrofia (24%) e aumento do número de
miócitos (44%) do referido ventrículo, tornando-o mais apto a diminuir o pico
de estresse sistólico resultante da pressão elevada. O número de
mitocôndrias apresenta-se elevado numa primeira fase, havendo
restauração para os níveis normais após um período crônico, o que indica
que a quantidade de mitocôndrias existentes é capaz de produzir energia
(ATP) suficiente para evitar disfunção ventricular
100
.
Foram efetuados estudos de proliferação celular em miocárdio através
de marcadores da síntese de DNA
103
. Os métodos mais comumente
utilizados são:
Observação de figuras de mitose. É altamente específico, visto que
sua presença identifica com certeza o núcleo em divisão. Entretanto, a fase
M (de mitose) é proporcionalmente menor que as outras fases e, como os
miocardiócitos têm baixo índice de proliferação, pode ser difícil identificá-la;
além disso, as figuras de mitose podem estar relacionadas com a poliploidia.
Introdução 20
Incorporação de timidina. Também é bastante específico, mas o
método é trabalhoso e requer o uso de radioisótopos.
Incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU). Células que sintetizam
DNA incorporam BrdU e a utilização de anticorpos monoclonais anti- BrdU
identifica tais células. Esse método apresenta maior sensibilidade, rapidez e
facilidade do que a incorporação de timidina, mas a perda da integridade
tecidual durante as etapas de permeabilização pode dificultar a identificação
das células. Outra desvantagem consiste na reduzida especificidade do
método, o que aumenta as chances de falsos positivos.
Quantificação direta do DNA nuclear. Distingue ploidia de replicação
do genoma e síntese de DNA para reparo; porém, é um estudo estático,
dificultando a diferenciação entre síntese ativa de DNA e alterações
cumulativas do conteúdo nuclear.
Utilização do PCNA. Esse antígeno participa da proliferação celular e
foi utilizado em muitos estudos clínicos e experimentais para identificar
hiperplasia dos miocardiócitos. Entretanto, tal antígeno não permite
diferenciar o DNA sintetizado para reparo daquele empenhado na replicação
celular. Além disso, sua expressão não se limita à fase de síntese de DNA,
tendo sido observado em células não proliferativas presentes ao redor de
tumores (os quais liberariam fatores parácrinos capazes de induzir a
expressão do PCNA na ausência de síntese de DNA).
O anticorpo murino monoclonal da classe das IgG
1
denominado de Ki-
67 reconhece um antígeno (Ag Ki-67) presente no núcleo celular e que se
Introdução 21
expressa em todas as fases do ciclo da célula, com exceção de G
0
e início
de G
1
. Portanto, esse antígeno atua como marcador de proliferação celular
104- 108
, tendo, inclusive, similaridade com DNA topoisomerase II, enzima
considerada como marcadora específica de replicação da célula
109
.
Evidências qualitativas de que o Ki-67 atua como marcador de
proliferação celular podem ser demonstradas pela sua distribuição em
tecidos normais. Células do centro germinativo das amídalas, células basais
do epitélio e espermatogônias indiferenciadas dos testículos são fortemente
marcadas com esse antígeno. Por outro lado, células do fígado, rim e
cérebro não aparecem marcadas com o Ki-67, enquanto que sua expressão
é bastante acentuada em linfócitos do sangue periférico estimulados a
proliferarem. Quantitativamente, também existe uma correlação muito alta
entre o número de células que participam do ciclo proliferativo e a
quantidade das mesmas que são marcadas com Ki-67
104,109
.
Estudos realizados em indivíduos normais e pacientes com
cardiomiopatia dilatada ou submetidos a transplante cardíaco mostram que o
Ki-67 se expressa nos corações com doença inflamatória ou imunológica,
indicando que os miocardiócitos são capazes de renovar seu DNA em
resposta a tais estímulos
110-114
.
Além das alterações nas fibras contráteis (hipertrofia e hiperplasia),
outros mecanismos são descritos na resposta à sobrecarga de pressão,
como, por exemplo, o incremento numérico de vasos e da área ocupada
pela matriz intersticial. Em particular, admite-se que a fibrose que se
deposita no miocárdio nessas condições acaba por levar à disfunção
115
. O
Introdução 22
aumento da concentração de colágeno intersticial primeiramente eleva a
rigidez diastólica e sistólica do miocárdio, causando disfunção apenas na
diástole; a seguir, com a progressão do quadro, a fibrose passa a ser
perimuscular, mantendo a rigidez diastólica alta, porém diminuindo a
sistólica, o que inicia a falência na contratilidade miocárdica; nas fases finais,
a deposição de tecido intersticial passa a ser de caráter reparador, com a
finalidade de substituir o tecido muscular perdido, o que agrava ainda mais a
disfunção ventricular
115-118
.
A observação do incremento na espessura da parede livre do
ventrículo pulmonar frente ao aumento da pós-carga (o que reflete
acréscimo na massa muscular), associada à possibilidade de determinar a
existência e extensão de proliferação celular no músculo cardíaco após o
nascimento, faz surgir a oportunidade de investigar quais mecanismos
adaptativos estariam presentes quando se imprime uma sobrecarga de
pressão a esse ventrículo.
2. Objetivos
Objetivos
24
O presente trabalho tem por objetivos:
1. Identificar, histologicamente, o tipo de mecanismo adaptativo (hipertrofia
e/ou hiperplasia celular) envolvido no preparo rápido do ventrículo
pulmonar submetido à sobrecarga de pressão por meio de bandagem
ajustável do tronco pulmonar, através da análise das células
miocárdicas contráteis e do interstício/vasos;
2. Verificar as diferenças, em relação aos controles e aos diferentes
segmentos do coração (VD, VE e septo interventricular), na resposta do
ventrículo preparado mediante os dois tipos de treinamento –
sobrecarga sistólica contínua e intermitente - quanto à:
a) massa ventricular direita avaliada pelo ecocardiograma,
b) fração de área de colágeno intersticial,
c) hipertrofia de miocardiócitos,
d) proliferação de miocardiócitos e de células do interstício/vasos.
3. Métodos
Métodos 26
Foram estudados 21 cabritos hígidos de trinta a sessenta dias de
idade (correspondente ao período pós-natal), com média de pesos igual a
8,35 kg (mínimo de 4,80 kg, máximo de 12,00 kg), tratados conforme as
normas para cuidado e uso de animais de laboratório
119
.
Para atestar que os ventrículos cardíacos já haviam assumido o
padrão de pressão esperado para o período pós-natal, realizaram-se
exames ecocardiográficos basais antes de qualquer procedimento cirúrgico.
Os animais foram divididos, aleatoriamente, em três grupos: controle -
C (n= 7, sem nenhum procedimento cirúrgico), estimulação contínua - EC
(n= 7, metodologia explicada abaixo) e estimulação intermitente - EI (n= 7,
metodologia explicada abaixo). O número de cabritos por grupo foi
determinado segundo estudos anteriores desta linha de pesquisa
74,77,78
.
3.1 Anestesia
Após jejum de 24 horas, os animais dos grupos de estimulação
contínua e intermitente receberam medicação pré-anestésica (quetamina, 30
mg/kg, intramuscular). Realizou-se tricotomia cervical e no hemitórax
esquerdo, seguida da punção na veia jugular externa com Jelco nº 18 para
administração de drogas. A anestesia foi mantida com pentobarbital sódico
(nembutal, 5-10 mg/kg, via intravenosa) e quetamina (1mg/kg endovenoso);
a ventilação mecânica (Harvard 708 South Natick, MA, EUA) foi mantida por
Métodos 27
meio de tubo endotraqueal com 100% de saturação de oxigênio e volume
corrente de 10 a 15 ml/ kg. Por fim, os cabritos foram posicionados em
decúbito lateral direito e preparados para o procedimento cirúrgico estéril.
3.2 Dispositivo de bandagem ajustável do tronco pulmonar
O dispositivo utilizado neste estudo é formado por três componentes:
anel oclusor de silicone auto-selante, tubo extensor e botão de insuflação. O
anel oclusor (Braile Biomédica, São José do Rio Preto, SP) consiste em um
manguito hidráulico em forma de “U”, com diâmetro interno de 10 mm e
largura de 5 mm. Externamente, é revestido por silicone rígido com 1 mm de
espessura para evitar deformações centrífugas. A superfície interna é
formada por uma camada flexível de silicone, com capacidade de expandir-
se e comprimir, assim, o lume do vaso de acordo com o volume injetado
através do botão de insuflação. Nas duas extremidades distais do manguito,
existem pequenos orifícios que têm por finalidade manter o anel bem preso
ao tronco pulmonar. O tubo extensor, também feito de silicone, conecta o
anel oclusor ao botão de insuflação; possui 2 mm de diâmetro interno e 25
cm de comprimento. O botão de insuflação (Braile Biomédica) é um
reservatório circular feito de silicone auto-aderente, com base de metal;
possui um conduto conectado ao tubo extensor. Esse botão é implantado no
subcutâneo e permite a insuflação ou o esvaziamento do anel oclusor por via
percutânea (Figura 1).
Métodos 28
Botão de insuflação auto-selante
Anel Oclusor
Figura 1 - Dispositivo de bandagem constituído por um anel oclusor ajustável,
tubo extensor e botão de insuflação.
3.3 Procedimento cirúrgico
Realizou-se toracotomia no quarto espaço intercostal esquerdo para a
exposição da aorta descendente e da via de saída do VD. Na aorta, fez-se
sutura em bolsa com polipropileno 5-0 para inserção do cateter de 16 gauge
(Bard Co) a fim de monitorar a pressão sistêmica. Dois outros cateteres de
16 gauge foram implantados, um no VD e outro distalmente ao tronco
pulmonar, fixados com polipropileno 5-0 por meio de sutura em bolsa. Os
cateteres foram testados (permeabilidade e curvas de pressão), mantidos
heparinizados e exteriorizados através da caixa torácica; as pressões foram
medidas pelo sistema de software ACQ Knowledge 3.01 (Biopac Systems,
Inc., Goleta, CA, EUA). Em seguida, o tronco pulmonar foi dissecado para a
colocação do dispositivo de bandagem ajustável. O anel oclusor foi colocado
ao redor do tronco pulmonar e suas extremidades foram suturadas com fio
de polipropileno 5-0 na camada adventícia do vaso, logo acima da valva
Métodos 29
pulmonar. O tubo extensor foi exteriorizado através do terceiro espaço
intercostal e conectado ao botão de insuflação alocado na camada
subcutânea da parede torácica. O botão de insuflação foi testado e todo o ar
do sistema foi retirado. As costelas foram aproximadas logo após a
colocação de um tubo de drenagem no espaço pleural esquerdo e as
camadas de tecidos moles foram fechadas, colocando-se, por fim, um colete
protetor. Os animais recuperaram-se da anestesia em maca especial
(Instituto do Coração – InCor – HC-FMUSP) para quadrúpedes, sofreram
extubação e tiveram o tubo de drenagem removido após um período de
quatro a seis horas do procedimento cirúrgico. Em seguida, foram
encaminhados para o biotério.
Como antibioticoterapia profilática, receberam 500 mg de cefalozina e
10 mg de gentamicina por via intramuscular a cada 12 horas, tendo início
imediatamente antes da cirurgia e terminando ao final do protocolo. Também
foram administradas digoxina (0,005 mg/Kg por via intravenosa a cada 12
horas) e heparina (2500 U a cada 12 horas, por via subcutânea).
3.4 Protocolo de insuflação do dispositivo de bandagem
ajustável
Os animais foram mantidos em descanso por um período de 48 horas
para recuperação. Em seguida, foi introduzido o protocolo de insuflação do
dispositivo de bandagem ajustável do tronco pulmonar.
Métodos 30
Com o animal consciente e imobilizado na maca especial, foram feitas
as leituras das pressões basais do VD, tronco pulmonar e aorta, com o
dispositivo totalmente vazio.
Após a leitura, deu-se início à insuflação progressiva do dispositivo
com água destilada a fim de que a pressão sistólica no VD alcançasse um
valor aproximadamente igual a 70% da pressão sistólica sistêmica
27,71-74,77,78
, desde que não houvesse queda superior a 10% nessa última.
Caso o cabrito apresentasse sinais clínicos de hipóxia importante (agitação,
dispnéia ou arritmias), o volume do dispositivo era reduzido a um valor
tolerável pelo animal. Os animais do grupo de estimulação contínua
permaneceram em treinamento por um período de 96 horas, com
insuflações progressivas a cada 24 horas, no limite máximo tolerado. No
grupo de estimulação intermitente, procedeu-se da mesma forma, porém
deixando o dispositivo inflado apenas por 12 horas ao dia: ao final desse
tempo, o mesmo era esvaziado completamente e assim mantido por mais 12
horas, até a próxima insuflação, perfazendo um total de 48 horas de
condicionamento.
O gradiente de pressão entre o VD e o tronco pulmonar foi calculado
através da subtração de suas pressões sistólicas.
A insuflação do dispositivo e a mensuração das pressões na aorta,
VD e tronco pulmonar foram realizadas diariamente, nos dois grupos. No
grupo de estimulação intermitente, as pressões também foram medidas com
o dispositivo desinflado. O volume de água aspirado do dispositivo era
medido e comparado com o do dia anterior para avaliar possível perda. De
Métodos 31
modo geral, foi possível acrescentar um maior volume ao dispositivo a cada
dia de insuflação.
3.5 Estudo ecocardiográfico
Para a realização dos ecocardiogramas, os cabritos foram
tricotomizados no hemitórax direito, permanecendo acordados e em decúbito
esternal durante os exames. Utilizaram-se transdutores de 7,5 MHz para a
obtenção das imagens e de 2.5 MHz para a análise dos fluxos (Apogee CX,
ATL - Advanced Technologies Laboratories, Bothell, WA). Todos os animais
foram avaliados antes do procedimento cirúrgico com a finalidade de atestar
a espessura mais fina da parede livre do VD em relação ao VE (perda do
padrão circulatório fetal). No seguimento, os exames foram realizados
diariamente, após a insuflação do dispositivo de bandagem externa, em
ambos os grupos estimulados, durante os cinco dias de condicionamento.
No grupo de preparo intermitente, o último ecocardiograma foi feito com o
dispositivo vazio. Os cabritos do grupo controle foram estudados uma única
vez, por meio de um exame ecocardiográfico basal, antes de serem
sacrificados.
As espessuras do septo interventricular e da parede posterior do VE
foram mensuradas no modo M, no final da diástole, por meio do corte
paraesternal transverso na altura dos músculos papilares
120
; no mesmo
corte foram obtidos os índices de função sistólica do VE (porcentagem de
Métodos 32
encurtamento da fibra miocárdica e fração de ejeção) pelo método do cubo,
conforme descrito
121
.
A massa do VD foi calculada com base nas observações de Pontes et
al.
122
a partir da dissecção da parede livre dessa câmara, conforme proposto
por Fulton et al.
123
. O ventrículo assim isolado assume formato trapezoidal,
cuja área é mensurada na fórmula:
A= b1 + b2 x h (cm
2
) onde A= área do VD
2
Transpondo a fórmula para o VD, b1, b2 e h corresponderiam aos
perímetros internos da parede livre dessa câmara, obtidos no corte
paraesternal transverso (na altura dos vasos da base e no nível dos
músculos papilares) e no corte apical quatro câmaras, respectivamente
(Figura 2).
Figura 2 - Esquema das projeções ecocardiográficas para o cálculo da massa do
ventrículo direito (conforme Pontes et al.). VD- ventrículo direito; VE-
ventrículo esquerdo; AD- átrio direito; AE- átrio esquerdo; VAo- valva
aórtica.
Adaptado de: Pontes SC Jr, Assef JE, Barretto RB, Chaccur P, Moreira DA, Nina VJS, Nunes F,
Melani RH, Correia EB, Dinkuisen J, Sousa AM. Estimation of right ventricular mass by two-
dimensional echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 2005;18(5):427-34.
Métodos 33
Devido à dificuldade para a obtenção desse último corte em cabritos
(pelo fato de terem o tórax com formato muito convexo), o mesmo foi
substituído pelo corte longitudinal quatro câmaras. Em cada uma das três
abordagens ecocardiográficas descritas, também foi mensurada a espessura
da parede livre dessa câmara, na região onde seus limites fossem mais
facilmente visibilizados; a seguir, obteve-se a média aritmética desses
valores. Uma vez calculada a área, a mesma foi multiplicada por 1, 055 (que
corresponde à densidade do miocárdio) e pela espessura média da parede,
calculando-se, assim, a massa ventricular direita segundo a fórmula:
M= A x 1,055 x e (g) onde M= massa do VD
e= espessura média da parede livre do VD
3.6 Exame morfológico dos corações
Após 96 horas de treinamento do ventrículo subpulmonar, os animais
dos grupos contínuo e intermitente foram sacrificados de acordo com as
normas para cuidado e uso de animais de laboratório
119
. O mesmo
procedimento foi realizado com os sete cabritos do grupo controle.
Como medicação pré-anestésica, foi administrada quetamina
(20 mg/kg, via intramuscular). Por meio de um cateter venoso percutâneo
colocado na veia jugular, administrou-se nembutal (15 mg/kg); a seguir, os
cabritos foram entubados e mantidos em ventilação mecânica. Através da
mesma incisão utilizada para o procedimento cirúrgico inicial, fez-se a
exposição do coração. Ao atingir-se o plano anestésico profundo, foram
Métodos 34
administrados, pelo cateter, heparina (500 U/kg) e cloreto de potássio até
que houvesse parada cardíaca.
3.6.1 ESTUDO HISTOLÓGICO E MORFOMÉTRICO
Todos os animais sacrificados tiveram seus corações fixados em
solução de formalina salina (formol a 10% em solução salina a 0,9%,
tamponado com fosfato de sódio monobásico e bibásico, para pH 7,0). Os
espécimes foram assim mantidos por um período de 24 horas. No
seguimento, após corte transversal ao nível da massa ventricular, obtiveram-
se secções de ambos os ventrículos e do septo interventricular (S). O lado
direito do septo foi tingido com tinta Nanquim para identificação imediata à
microscopia óptica.
As amostras foram processadas para análise histológica e, a partir
dos blocos, obtiveram-se cortes de cinco micrômetros (µm) de espessura,
utilizando-se micrótomo (Leica RM 2145). Os cortes foram pescados em
lâminas de vidro previamente tratadas com organosilano e levados à
temperatura de 37ºC para secagem e colagem. Seguiram-se as colorações
pelos métodos da hematoxilina-eosina (HE) e Picro-sirius vermelho, além
das reações de imuno-histoquímica descritas abaixo.
3.6.1.1 Diâmetro das fibras miocárdicas e dos núcleos
As medidas morfométricas foram realizadas por meio de um sistema
computadorizado interativo de análise de imagens (Leica QWin versão 2.2 –
Métodos 35
Leica Imaging Systems Ltd, 1997, Cambridge)
124
. Uma câmara de vídeo
(JVC modelo TK – 1280U) conectada a microscópio óptico (Leica DMLS)
transmite ao sistema cada campo microscópico que é, então, transformado
em uma imagem digital binária. Uma seqüência de operações matemáticas e
morfológicas permite identificar e quantificar todas as estruturas de
interesse.
Os cortes corados pela hematoxilina-eosina foram utilizados para
mensurar o diâmetro transversal das fibras miocárdicas e dos núcleos
(cortados longitudinal ou transversalmente). Para cada segmento do coração
(VD, VE e septo interventricular), foram medidos os diâmetros de sessenta
células e de seus respectivos núcleos, com aumento de 40X. As
mensurações foram realizadas na altura dos núcleos, em seu maior eixo
transverso; os campos foram analisados seqüencialmente; porém, as células
deveriam ter os limites bem definidos para que fossem avaliadas. Para o
septo interventricular, foram abordadas, separadamente, as metades direita
e esquerda do mesmo. Estimou-se o número de miocardiócitos a serem
medidos através do estudo da evolução da média de 20, 30, 40, 50, 60,
70,80 e 90 observações. Como, a partir de 60 células medidas, a variação
da média mantinha-se menor ou igual a 10%, estipulou-se então esse
número de observações.
Métodos 36
3.6.1.2 Estudo da fração de área de colágeno
Estudaram-se cortes histológicos dos ventrículos direito e esquerdo
dos três grupos, corados pelo método de Picro-sirius vermelho. Esse método
cora o colágeno em vermelho e as fibras musculares em amarelo-pálido.
Utilizando o sistema computadorizado de análise de imagens
124
,
quantificou-se a fração de área de colágeno através da cor, por meio da
marcação prévia de uma região sabidamente preenchida por essa proteína,
de forma que o programa reconhecesse automaticamente todas as
estruturas coradas no mesmo tom (vermelho) como “colágeno”. Ajustes
manuais fortuitos foram necessários a fim de adicionar ou remover áreas
não marcadas ou reconhecidas incorretamente pelo sistema. Com lente
objetiva de 20X, analisaram-se vinte campos e o resultado foi expresso
como média da área ocupada por colágeno. Os campos foram escolhidos ao
acaso, evitando-se, entretanto, regiões ocupadas por vasos maiores que 50
micrômetros de diâmetro e áreas de grande retração do corte histológico.
3.6.1.3 Estudo imuno-histoquímico
Cortes histológicos de 5 µm de espessura foram submetidos a
reações de imuno-histoquímica de acordo com o protocolo de rotina usado
na Seção de Imunopatologia do Laboratório de Anatomia Patológica do
Instituto do Coração (InCor) HC-FMUSP (sistema Streptavidina conjugada
com peroxidase)
125
. Como controle positivo da reação, utilizou-se corte
histológico de esôfago de um dos animais, obtendo-se células marcadas nas
Métodos 37
porções basais do epitélio. Tal controle é feito com um segmento de órgão
em que as células apresentam alta capacidade de proliferação (como
epitélio, por exemplo), com a finalidade de comprovar se a prova imuno-
histoquímica aplicada é eficiente para o indivíduo estudado.
Lâminas contendo cortes de tecido foram desparafinadas em três
banhos de xilol, hidratadas e submetidas à técnica de recuperação de
antígenos com a finalidade de expor os epitopos teciduais para as reações
imuno-histoquímicas.
O marcador de proliferação celular utilizado foi o anticorpo primário Ki-
67, produzido em camundongo, clone MIB-1, código IM0505, fabricante
DAKO, Grostrup, Dinamarca. Conforme estabelecido em estudos anteriores,
esse marcador tem sido utilizado em tecidos de caprinos
126,127
.
Para a recuperação antigênica, as lâminas foram imersas em citrato
de sódio (10mM) pH 6.0 e aquecidas em panela de pressão durante 15
segundos.
Depois de feita a recuperação de antígenos, as lâminas foram lavadas
em dois banhos de PBS (tampão salina fosfato 1M pH 7,4) e realizou-se o
bloqueio da peroxidase endógena pelo tratamento com peróxido de
hidrogênio 130 volumes a 3% em PBS. As lâminas foram então colocadas
numa câmara úmida e submetidas a soro fetal bovino por uma hora, em
estufa a 37 ºC. A seguir, foram secas e expostas ao anticorpo primário.
O anticorpo primário foi diluído em BSA (soro albumina bovina) 1%
em PBS, na titulação de 1/400.
Métodos 38
Após a aplicação do anticorpo primário as lâminas foram deixadas
em câmara úmida a 4
o
C na geladeira, durante a noite. Após um período de
18 a 20 horas de incubação, foram então lavadas em três banhos de PBS
pH 7,4 e incubadas em câmara úmida com anticorpo secundário diluído em
PBS por uma hora, em estufa a 37ºC. Foi utilizado anticorpo secundário anti-
camundongo IgG biotinilado, produzido em coelho, código E0354 (DAKO),
na diluição de 1/200 em PBS, para marcação dos núcleos de miocardiócitos
e células do interstício e vasos em proliferação.
Houve, em seguida, passagem em três banhos de PBS e incubação
com estreptoavidina (Streptavidin/ HRP, código PO397, DAKO) conjugada
com peroxidase na diluição 1/100 em PBS por uma hora, em estufa a 37ºC.
As lâminas foram novamente lavadas em três banhos de PBS,
seguindo-se a revelação da reação, quando se usaram 3,0 tetracloridrato de
diaminobenzidina (DAB, código K3466, DAKO) – (0,04%), durante cinco
minutos em banho-maria, a 37ºC.
Após a passagem por água corrente, os cortes foram contracorados
com hematoxilina de Harris para evidenciar os núcleos. A seguir, foram
desidratados em banhos sucessivos de água corrente, álcool a 70%, álcool a
95%, álcool a 100%, xilol e cobertos com lamínula usando-se resina
sintética.
Os miocardiócitos e as células do interstício e dos vasos marcados
com o anticorpo (coloração castanho-dourada) foram quantificados
microscopicamente de duas maneiras. A primeira, através de contagem de
Métodos 39
seu número/campo microscópico, utilizando-se objetiva de 40X. A área
correspondente a um campo de grande aumento analisado é de
232.428,13 µm
2
. Para o septo interventricular, calculou-se separadamente o
número de células positivas nas metades direita e esquerda do mesmo. Para
cada corte histológico, calculou-se o número médio de células marcadas por
campo microscópico - miocardiócitos e células do interstício/vasos. Foram
analisados 60 campos para cada um dos segmentos cardíacos (VD, VE e as
duas metades do septo interventricular), visto que a variação da média
manteve-se menor ou igual a 10% a partir desse número de observações.
Considerando-se a possibilidade de hipertrofia celular e, portanto, de haver
menor número de células por campo microscópico, realizou-se também a
quantificação de células marcadas segundo a taxa de proliferação. Para
cada segmento do coração (VD, VE, SD- septo interventricular direito e SE-
septo interventricular esquerdo), foram contadas 4000 células (2000
miocardiócitos e 2000 células do interstício/vasos); das células contadas,
computou-se o número daquelas marcadas com o antígeno Ki-67, obtendo-
se a porcentagem de hiperplasia. Para o septo como um todo, foram
escolhidas aleatoriamente as primeiras 1000 células contadas em cada uma
das metades direita e esquerda. O número de células a ser contado foi
definido segundo dois critérios: quando a variação da média atingiu 10% e o
fato de trabalhos anteriores mostraram que 2000 células são uma
quantidade confiável para análise
92,103,128-131
.
Por fim, para os VDs dos três grupos, comparou-se a proporção entre
miocardiócitos e células do interstício/vasos marcadas com Ki-67.
Métodos 40
3.7 Análise estatística
Inicialmente, todas as variáveis foram analisadas de modo descritivo.
Para as variáveis quantitativas, essa análise foi feita através da observação
dos valores mínimo e máximo, e do cálculo da média, erro padrão e
mediana.
Para a análise da hipótese de igualdade entre três grupos, utilizou-se
a Análise de Variância a um fator
132
, com as comparações múltiplas através
de Bonferroni.
Para averiguar o comportamento dos grupos, e considerando as
condições estudadas, fez-se uso da técnica Análise de Variância com
medidas repetidas
133
, a qual consiste no ajuste de um modelo linear
multivariado a partir do qual foram testadas as seguintes hipóteses:
H
01
: os perfis médios de resposta correspondentes aos grupos são
paralelos, ou seja, não existe interação entre o fator grupo (controle, EC e
EI) e o fator condição de avaliação (VE, VD, S, SE e SD).
H
02
: os perfis médios de resposta são coincidentes, ou seja, não
existe efeito do fator grupo.
H
03
: os perfis médios de resposta são paralelos ao eixo das
abscissas, ou seja, não há efeito do fator condição de avaliação.
As hipóteses H
02
e H
03
só foram testadas quando não se rejeitou H
01
.
Caso contrário, foram testadas hipóteses de igualdade entre subconjuntos
dos grupos e entre as condições avaliadas.
Métodos 41
A estatística de Wilks, com a aproximação para a estatística F, foi
utilizada no teste das hipóteses acima.
O nível de significância utilizado para os testes foi de 5%.
4. Resultados
Resultados 43
Para cada grupo de animais, foram analisados os resultados referentes
a:
1. gradiente de pressão entre o ventrículo direito e o tronco
pulmonar (VD-TP) obtido pelo estudo hemodinâmico;
2. massa do VD estimada pelo exame ecocardiográfico;
3. aspecto histológico geral;
4. fração de área de colágeno do VD e do VE;
5. diâmetro médio dos miocardiócitos e dos núcleos do VD, VE e
septo interventricular;
6. índice e número por campo de miocardiócitos e células do
interstício e vasos positivos para marcador de proliferação celular
(Ki- 67) no VD, VE e septo interventricular;
7. proporção entre o número de miocardiócitos e células do
interstício/vasos marcadas com Ki-67 no VD .
Resultados 44
4.1 Análise hemodinâmica
A avaliação detalhada da evolução hemodinâmica durante o
experimento faz parte de outro trabalho de tese. Apresenta-se, a seguir, um
resumo desses dados.
Tabela 1 - Gradientes de pressão desenvolvidos pelo VD nos grupos de
sobrecarga sistólica contínua versus intermitente (média
+
EP)
Tempo Grupo contínuo Grupo intermitente
BASAL
15,67 ± 4,50 9,57 ± 3,58
0
42,50 ± 6,91
44,29 ± 4,21
24
47,50 ± 7,06
53,29 ± 4,34
48
61,17 ± 4,59
72,00 ± 5,75
72
57,14 ± 5,22 80,00 ± 4,92
96
44,17 ± 2,98 20,43 ± 5,28
Grupo Contínuo= sobrecarga sistólica contínua do VD.
Grupo Intermitente= sobrecarga sistólica intermitente do VD.
Valores= média em mm Hg ± erro padrão;
n = 7; Tempo = horas
4.1.1 GRUPO DE ESTIMULAÇÃO INTERMITENTE
O grupo iniciou o experimento com gradiente basal de 9,57 mm Hg
(EP= 3,58 mm Hg) e a última insuflação causou um gradiente de 80,00 mm
Hg (EP= 4,92 mm Hg), representando um aumento de 736% na variação de
pressão VD/ TP (Tabela 1, p= 0,018 – teste não-paramétrico de Wilcoxon). A
Figura 3 (painel superior) mostra a variação do gradiente ao longo do
estudo.
Resultados 45
4.1.2 GRUPO DE ESTIMULAÇÃO CONTÍNUA
A média dos gradientes de pico inicial (primeiro dia de experimento,
imediatamente antes da insuflação do dispositivo de bandagem externa)
encontrada na mensuração por cateter foi de 15,67 mm Hg (EP= 4,50 mm
Hg); ao final do estudo, esse valor passou a ser de 57,14 mm Hg (EP= 5,22
mm Hg), o que representa um acréscimo de 265% na variação de pressão
entre o VD e o tronco pulmonar (Tabela 1, p= 0,028 – teste não-paramétrico
de Wilcoxon). A Figura 3 (painel inferior) mostra a variação do gradiente ao
longo do tempo; os pontos de queda referem-se ao gradiente encontrado no
dia seguinte à estimulação, quando o volume do dispositivo diminuía devido
a perdas por absorção.
Figura 3 - Painel superior: Gradiente VD/TP (mm Hg) do grupo submetido a 12
horas de sobrecarga sistólica do VD, alternadas com 12 horas de
descanso.
Painel inferior: Gradiente VD/TP (mm Hg) do grupo submetido à
sobrecarga sistólica contínua do VD.
Resultados 46
4.2 Massa estimada do ventrículo direito
O aspecto ecocardiográfico da aquisição de massa muscular pelo VD
ao longo do período de estudo está representado na Figura 4.
Figura 4 - Ecocardiograma bidimensional nos tempos basal (a) e após cinco dias
de treinamento (b), em um animal do grupo de estimulação contínua.
VD - ventrículo direito; VE - ventrículo esquerdo; Dp - derrame pericárdico.
Através da análise de variância com medidas repetidas, observa-se
que, no momento basal, a massa estimada do VD não difere em nenhum
dos três grupos estudados (p= 0,110). Os grupos não apresentam
comportamento diferente em relação aos dias avaliados (p= 0,856), com
perfis de médias paralelos – Tabela 2.
Não há diferença significativa entre os grupos nas médias dos dias
(p= 0,571).
Há significância estatística entre os momentos de avaliação nos dois
grupos estimulados (p= 0,032) (Figura 5). No momento basal, a massa
estimada do VD é menor que nos outros momentos (p< 0,05). O dia 1 difere
significativamente do dia 2 (p= 0,018); o dia 2 não difere do dia 3 (p= 1,000);
o dia 3 difere do dia 4 (p= 0,013) e o dia 4 difere do dia 5 (p= 0,001).
Resultados 47
Tabela 2 - Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da variável
massa estimada do ventrículo direito, segundo o grupo de estudo e
os dias de observações
Grupo Dia N Média EP Mediana Mínimo Máximo
C
Basal 7 5,37 0,45 4,95 3,70 6,76
Basal 7 6,70 0,52 6,96 4,79 8,58
1 7 8,00 0,98 7,24 4,98 11,20
2 7 9,91 1,31 9,26 5,54 16,52
3 7 10,12 1,46 8,95 6,01 17,38
4 7 10,77 1,43 9,91 7,45 18,34
EC
5 7 11,97 1,76 9,64 8,36 21,37
Basal 7 6,33 0,30 6,34 5,38 7,72
1 7 7,69 0,91 6,92 6,08 13,00
2 7 8,76 0,78 7,78 6,67 12,38
3 7 8,55 0,65 7,70 6,99 11,95
4 7 10,13 1,14 9,31 6,62 16,22
EI
5 7 11,12 1,31 10,06 7,82 18,44
0
5
10
15
20
Basal Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5
Tempo
Massa estimada do VD (g)
EC EI
Figura 5 - Massa estimada do VD (g) em relação aos dias de treinamento.
EC= grupo de estimulação contínua; EI= grupo de estimulação intermitente.
Resultados 48
Os índices de função sistólica do ventrículo esquerdo (porcentagem
de encurtamento da fibra miocárdica e fração de ejeção) encontravam-se
normais no momento basal e mantiveram-se assim nos dois grupos
treinados, durante todo o tempo do estudo.
Em suma: para a variável “massa estimada do VD”, há aquisição
significativa por parte dos dois grupos treinados, ao longo dos dias de
estudo.
4.3 Aspecto histológico geral
Tanto para os animais do grupo controle quanto para aqueles dos
grupos estimulados, não foram observados, histologicamente, sinais de
edema, infiltrado inflamatório relevante ou presença de necrose.
4.4 Fração de área de colágeno dos ventrículos direito e
esquerdo
A análise de variância com medidas repetidas mostra que os grupos
não apresentam comportamento diferente em relação aos segmentos
avaliados (p= 0,403), ou seja, apresentam perfis de médias paralelos (Figura
6).
Há diferença estatística entre VD e VE nos três grupos avaliados (p=
0,015): os valores do VD são significativamente maiores que os do VE em
todos eles (Tabela 3).
Resultados 49
Tabela 3 - Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da
variável porcentagem de área de colágeno segundo o grupo de
estudo, no miocárdio do VD e VE
Grupo Segmento N Média EP Mediana Mínimo Máximo
VD 7 1,83 0,40 2,23 0,29 3,32
C
VE 7 1,58 0,37 1,59 0,24 2,61
VD 7 2,36 0,61 2,64 0,04 4,86
EC
VE 7 2,09 0,52 2,48 0,02 3,88
VD 7 2,34 0,53 2,86 0,56 3,76
EI
VE 7 1,63 0,39 1,34 0,56 3,09
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Controle EC EI
Grupo
Área de colágeno (%
)
VD VE
Figura 6 - Média e erro padrão da porcentagem de área de colágeno, segundo
grupo e segmento do coração
Em suma: para a variável “fração de área de colágeno”, o VD
difere significativamente do VE, apresentando valores maiores nos três
grupos estudados, mas não difere significativamente entre os grupos.
Resultados 50
4.5 Diâmetro médio dos miocardiócitos e de seus
respectivos núcleos
4.5.1 MIOCARDIÓCITOS
Através da análise de variância com medidas repetidas, observa-se
que os grupos não apresentam comportamento significativamente diferente
em relação aos segmentos avaliados (p= 0,679), isto é, apresentam perfis
de médias paralelos.
Considerando-se o septo como um todo (S) e as suas metades direita
(SD) e esquerda (SE), tanto entre os grupos quanto intragrupos não há
diferença estatística nas médias desses segmentos (Tabela 4, p= 0,056
entre grupos e p= 0,907 dentro dos grupos). Portanto, serão utilizados os
valores do septo como um todo para as comparações abaixo.
Tabela 4 - Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da
variável diâmetro dos miocardiócitos (em micrômetros), segundo o
grupo de estudo, nos segmentos S, SD e SE
Grupo Segmento N Média EP Mediana Mínimo Máximo
S 7 7,71 0,26 7,38 7,12 8,89
C
SD 7 7,60 0,30 7,20 6,97 9,11
SE 7 7,83 0,23 7,55 7,28 8,68
S 7 8,65 0,33 8,22 7,76 9,98
EC
SD 7 8,80 0,29 8,62 8,00 10,06
SE 7 8,50 0,38 8,08 7,39 9,90
S 7 8,77 0,34 8,84 7,32 10,12
EI
SD 7 8,64 0,50 8,60 7,11 11,02
SE 7 8,91 0,34 9,22 7,20 9,79
Resultados 51
4.5.1.1 Comparação entre os grupos
Por meio da análise de variância com medidas repetidas, nota-se que
os grupos apresentam comportamento significativamente diferente em
relação aos segmentos estudados (p< 0,001), existindo, assim, interação
entre segmento e grupo (Tabela 5).
Os grupos EC e EI não apresentam comportamento significativamente
distinto em relação aos segmentos avaliados, havendo perfis de médias
paralelos entre eles (p= 0,326); entretanto, diferem do grupo controle com
valores estatisticamente maiores para o VD (p< 0,001) – Figura 7.
Não há diferença significativa entre os grupos nas médias de S, VD e
VE (p= 0,978), quando considerados os grupos EC e EI.
Tabela 5 - Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da
variável diâmetro dos miocardiócitos (em micrômetros), segundo o
grupo de estudo, nos segmentos VD, VE e S
Grupo Segmento N Média EP Mediana Mínimo Máximo
VD 7 7,28 0,20 7,23 6,66 8,31
C
VE 7 9,50 0,24 9,41 8,53 10,44
S 7 7,71 0,26 7,38 7,12 8,89
VD 7 10,35 0,43 10,76 8,54 11,83
EC
VE 7 9,88 0,37 9,36 9,23 11,94
S 7 8,65 0,33 8,22 7,76 9,98
VD 7 10,57 0,27 10,85 9,49 11,33
EI
VE 7 9,50 0,39 9,66 7,66 10,50
S 7 8,77 0,34 8,84 7,32 10,12
Resultados 52
0
2
4
6
8
10
12
Controle EC EI
Gr upo
Diâmetro dos
miocardiócitos (
µ
m)
VD VE S
Figura 7 - Média e erro padrão do diâmetro transverso dos miocardiócitos (µm),
segundo grupo e segmento do coração
4.5.1.2 Comparação dentro de cada grupo
Há diferença entre S, VD e VE nos grupos EC e EI (p= 0,001). Em
ambos os grupos estimulados, o VD difere do VE (p= 0,011) e de S (p<
0,001), e o VE difere de S (p< 0,001), com valores significativamente
maiores (Tabela 5, Figura 7).
O grupo controle apresenta diferenças significativas nos segmentos
avaliados (p= 0,006). Observa-se que o diâmetro dos miocardiócitos do VD é
estatisticamente menor quando comparado ao VE (p< 0,001); porém, não
difere do diâmetro das células do septo (p= 0,134). Os valores encontrados
para o VE são significativamente maiores que os do septo (p= 0,006).
Em suma: para a variável “diâmetro dos miocardiócitos”,
quando considerados os VDs, os grupos EC e EI apresentam valores
Resultados 53
significativamente maiores que os do grupo controle. Além disso, o
diâmetro das células do VD nos grupos EC e EI é estatisticamente
maior quando comparado aos demais segmentos desses grupos. No
grupo controle, os valores do VD são significativamente menores que
os do VE.
4.5.2 NÚCLEOS
Através da análise de variância com medidas repetidas, observa-se
que não existem diferenças estatísticas entre os grupos em relação aos
segmentos avaliados (p= 0,379), ou seja, os mesmos apresentam perfis de
médias paralelos (Tabela 6).
Tabela 6 - Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da variável
diâmetro dos núcleos de miocardiócitos (em micrômetros), segundo
o grupo de estudo, nos segmentos S, SD e SE
Grupo Segmento N Média EP Mediana Mínimo Máximo
S 7 3,69 0,12 3,53 3,35 4,13
C
SD 7 3,59 0,13 3,39 3,24 4,08
SE 7 3,80 0,12 3,67 3,47 4,22
S 7 3,99 0,15 3,90 3,54 4,73
EC
SD 7 3,97 0,13 3,84 3,47 4,45
SE 7 4,00 0,20 3,79 3,50 5,06
S 7 3,96 0,11 3,97 3,61 4,40
EI
SD 7 3,95 0,14 3,89 3,38 4,52
SE 7 3,97 0,10 4,05 3,44 4,29
Resultados 54
Não há diferença significativa entre os grupos nas médias de S, SD e
SE (p= 0,252). O mesmo ocorre considerando-se os três segmentos dentro
de cada grupo (p= 0,379). Assim, será utilizado o valor de S para as
comparações abaixo (Tabela 7).
Tabela 7 - Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da variável
diâmetro dos núcleos de miocardiócitos (em micrômetros), segundo
o grupo de estudo, nos segmentos VD, VE e S
Grupo Segmento N Média EP Mediana Mínimo Máximo
VD 7 3,49 0,11 3,42 3,20 3,98
C
VE 7 4,26 0,06 4,28 4,01 4,47
S 7 3,69 0,12 3,53 3,35 4,13
VD 7 4,67 0,19 4,78 3,82 5,25
EC
VE 7 4,28 0,22 4,20 3,73 5,48
S 7 3,99 0,15 3,90 3,54 4,73
VD 7 4,54 0,08 4,50 4,28 4,84
EI
VE 7 4,08 0,07 4,05 3,80 4,35
S 7 3,96 0,11 3,97 3,61 4,40
4.5.2.1 Comparação entre os grupos
A análise de variância com medidas repetidas mostra que os grupos
apresentam diferenças significativas em relação aos segmentos avaliados
(p= 0,001), havendo interação entre segmento e grupo.
Resultados 55
Não se observam diferenças entre os grupos EC e EI em relação aos
segmentos (p= 0,744); entretanto, quando considerados os ventrículos
direitos, ambos os grupos treinados diferem dos controles (EC x C: p< 0,005
e EI x C: p< 0,001) – Tabela 7.
Comparando-se os grupos EC e EI, não há diferença significativa
entre eles nas médias de S, VD e VE (p= 0,439).
4.5.2.2 Comparação dentro de cada grupo
Considerando-se o VD dos animais treinados, o mesmo difere do VE
(p= 0,008) e de S (p= 0,001), com valores significativamente maiores em
ambos os grupos EC e EI (Tabela 7, Figura 8). Nesses mesmos grupos, não
há diferença estatística entre o VE e S (p= 0,063).
Para o grupo controle, há significância estatística entre os segmentos
(p= 0,008). O VD apresenta valores menores que o VE (p= 0,001), e maiores
que S (p= 0,025); da mesma forma, os núcleos dos miocardiócitos do VE
possuem diâmetro maior quando comparados a S (p= 0,005).
Em suma: para a variável “diâmetro dos núcleos de
miocardiócitos” os grupos EC e EI respondem da mesma forma e
apresentam valores maiores para o VD em relação ao grupo controle.
Dentro de cada grupo, os valores são maiores para os VDs dos grupos
condicionados (EC e EI).
Resultados 56
0
1
2
3
4
5
6
Controle EC EI
Gr upo
Diâmetro dos Núcleos (
µ
m)
VD VE S
Figura 8 - Média e erro padrão do diâmetro transverso dos núcleos de
miocardiócitos (µm), segundo grupo e segmento do coração.
4.6 Número de miocardiócitos e células do interstício e
vasos positivos para Ki- 67
4.6.1 ANÁLISE DO ÍNDICE DE MIOCARDIÓCITOS Ki-67+
O aspecto histológico dos miocardiócitos com núcleos marcados pelo
Ki- 67 está demonstrado na Figura 9.
Resultados 57
Figura 9. Fotomicrografia de
miocárdio do VD submetido à
reação de imuno-histoquímica
para marcação com Ki- 67. As
setas mostram núcleos
positivos de miocardiócitos.
Objetiva 40X, contra-coloração
pela hematoxilina de Harris.
Através da análise de variância com medidas repetidas, observa-se
que os grupos não apresentam comportamento diferente em relação aos
segmentos avaliados (p= 0,085), havendo, portanto, perfis de médias
paralelos entre eles (Tabela 8).
Tabela 8 - Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da variável
índice de miocardiócitos marcados com Ki-67 (expresso em
porcentagem), segundo o grupo de estudo, nos segmentos S, SD e SE
Grupo Segmento N Média EP Mediana Mínimo Máximo
S 7 0,18 0,12 0,05 0,00 0,90
C
SD 7 0,19 0,10 0,05 0,00 0,65
SE 7 0,30 0,21 0,10 0,00 1,55
S 7 0,21 0,05 0,25 0,00 0,40
EC
SD 7 0,40 0,06 0,40 0,20 0,60
SE 7 0,16 0,05 0,10 0,00 0,35
S 7 0,08 0,03 0,05 0,00 0,25
EI
SD 7 0,03 0,01 0,00 0,00 0,10
SE 7 0,09 0,04 0,05 0,00 0,30
Resultados 58
Não há diferença estatística entre os grupos nas médias de S, SD e
SE (p= 0,226). Também não existe diferença entre esses segmentos nos
três grupos estudados (p= 0,187). Conseqüentemente, será utilizado o valor
de S para as comparações abaixo.
4.6.1.1 Comparação entre os grupos
Não há diferença estatística entre os grupos nas médias de VD, VE e
S (Tabela 9, p= 0,351).
Tabela 9 - Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da variável
índice de miocardiócitos marcados com Ki-67 (expresso em
porcentagem), segundo o grupo de estudo, nos segmentos VD, VE e S
Grupo Segmento N Média EP Mediana Mínimo Máximo
VD 7 0,39 0,23 0,15 0,00 1,70
C
VE 7 0,40 0,19 0,20 0,05 1,45
S 7 0,18 0,12 0,05 0,00 0,90
VD 7 1,13 0,34 1,10 0,15 2,25
EC
VE 7 0,37 0,12 0,25 0,00 0,90
S 7 0,21 0,05 0,25 0,00 0,40
VD 7 0,68 0,21 0,75 0,05 1,40
EI
VE 7 0,21 0,08 0,20 0,00 0,60
S 7 0,08 0,03 0,05 0,00 0,25
Pela análise de variância com medidas repetidas, nota-se que os
grupos não apresentam comportamento diferente em relação aos segmentos
avaliados (p= 0,315), não havendo, portanto, interação entre segmento e
grupo.
Resultados 59
4.6.1.2 Comparação dentro de cada grupo
Há diferença entre S, VD e VE, nos três grupos (p= 0,001). O VD
difere do VE (p= 0,009) e de S (p< 0,001), apresentando valores
significativamente maiores nos grupos EC e EI; no grupo controle, o VE
apresenta valores maiores que o VD. Em relação ao septo, o VE possui
valores estatisticamente maiores (p= 0,012) nos três grupos estudados
(Tabela 9, Figura 10).
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Controle EC EI
Gr upo
Índice de miocardiócitos Ki-
67+
VD VE S
Figura 10 - Média e erro padrão do índice de miocardiócitos marcados com Ki-67
(número de células positivas/2000 miocardiócitos, expresso em
porcentagem)
Em suma: para a variável “índice de miocardiócitos positivos
para Ki-67”, o VD apresenta valores estatisticamente maiores nos
grupos EC e EI quando comparado com os outros segmentos dos
mesmos grupos.
Resultados 60
4.6.2 ANÁLISE DO ÍNDICE DE CÉLULAS DO INTERSTÍCIO E
VASOS Ki-67+
O aspecto histológico das células do interstício e vasos com núcleos
marcados pelo Ki-67 está demonstrado na Figura 11.
Figura 11 - Fotomicrografia de miocárdio do VD submetido à reação de imuno-
histoquímica para marcação com Ki- 67. Notam-se numerosos
núcleos positivos, pertencentes a células do interstício e vasos.
Objetiva 40X; contra-coloração pela hematoxilina de Harris.
Pela análise de variância com medidas repetidas, nota-se que os
grupos não apresentam comportamento diferente em relação aos segmentos
avaliados (p= 0,248), ou seja, os perfis das médias são paralelos (Tabela
10).
Não há diferença estatística entre os grupos nas médias de S, SD e
SE (p= 0,336). Porém, considerando-se os três grupos estudados, há
diferença entre S, SD e SE (p= 0,036). O valor de S difere significativamente
dos valores de SD (p= 0,009) e SE (p= 0,029). O SD e SE também diferem
entre si (p= 0,024).
Resultados 61
Portanto, serão utilizados os valores de SE e SD para as
comparações que se seguem.
Tabela 10 - Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da variável
índice de células do interstício e vasos (I/V) – expresso em
porcentagem – segundo o grupo de estudo, nos segmentos S, SD e
SE
Grupo Segmento N Média EP Mediana Mínimo Máximo
S 7 1,47 0,76 0,60 0,20 5,95
C
SD 7 1,59 0,80 0,85 0,10 6,05
SE 7 1,62 0,78 0,75 0,40 6,20
S 7 3,01 0,84 2,15 0,75 6,60
EC
SD 7 3,73 1,20 2,30 0,85 9,40
SE 7 2,06 0,54 1,40 0,75 4,55
S 7 3,17 1,04 2,85 0,90 9,00
EI
SD 7 4,94 1,56 4,60 0,70 13,00
SE 7 1,61 0,34 1,25 1,00 3,55
4.6.2.1 Comparação entre os grupos
Os grupos EC e EI não apresentam comportamento diferente em
relação aos segmentos avaliados (p= 0,462), mas diferem do grupo controle
(EC x C: p= 0,0095; EI x C: p= 0,0014). No grupo controle, o VD, VE, SD e
SE se comportam da mesma forma; entretanto, nos grupos estimulados, o
VD possui valores maiores, vindo logo a seguir o SD, com o VE e SE
apresentando os índices mais baixos (Tabela 11).
Resultados 62
Tabela 11 - Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da variável
índice de células do interstício e vasos (I/V) – expresso em
porcentagem – segundo o grupo de estudo, nos segmentos VD, VE,
SD e SE
Grupo Segmento N Média EP Mediana Mínimo Máximo
VD 7 1,16 0,75 0,40 0,00 5,50
VE 7 1,81 0,52 1,30 0,25 4,55
SD 7 1,59 0,80 0,85 0,10 6,05
C
SE 7 1,62 0,78 0,75 0,40 6,20
VD 7 16,32 3,03 16,20 5,40 30,80
VE 7 2,57 0,53 2,50 0,15 4,70
SD 7 3,73 1,20 2,30 0,85 9,40
EC
SE 7 2,06 0,54 1,40 0,75 4,55
VD 7 12,36 1,82 13,10 2,70 17,45
VE 7 1,45 0,29 1,30 0,85 3,10
SD 7 4,94 1,56 4,60 0,70 13,00
EI
SE 7 1,61 0,34 1,25 1,00 3,55
Através da análise de variância com medidas repetidas, observa-se
que os grupos exibem comportamento diferente em relação aos segmentos
avaliados (p= 0,003), havendo interação entre segmento e grupo.
Para os grupos EC e EI, não há diferença entre eles nas médias de S,
VD e VE (p= 0,399), comportando-se, portanto, de maneira semelhante.
4.6.2.2 Comparação dentro de cada grupo
Em ambos os grupos treinados – EC e EI – há diferença entre VD,
VE, SD e SE (p< 0,001): o VD apresenta valores significativamente maiores
que os outros segmentos (p< 0,001); o SD possui índices estatisticamente
Resultados 63
maiores que o VE (p= 0,024) e que o SE (p= 0,012); o VE não difere do SE
(p= 0,527) – Figura 12.
O grupo controle não apresenta diferença entre os segmentos
analisados (p= 0,198).
Em suma: para a variável “índice de células do interstício e vasos
marcadas com Ki-67”, os grupos EC e EI respondem da mesma forma,
com valores significativamente maiores para o VD em comparação com
o grupo controle. Em ambos os grupos estimulados, o VD apresenta
maior número de células marcadas em comparação com o VE, SD e SE.
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
Controle EC EI
Grupo
Índice de células do I / V Ki-
67+
VD VE SD SE
Figura 12- Média e erro padrão do índice de células do interstício e vasos
marcadas com Ki-67 (número de células positivas/2000 células do
interstício/vasos, expresso em porcentagem)
Resultados 64
4.7 Proporção entre índices de miocardiócitos e células do
interstício/vasos marcadas com Ki-67
Através do teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis, observa-se que
não existem diferenças significativas no VD entre os grupos estudados
(Tabela 12, p= 0,432).
Tabela 12 - Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da variável
proporção entre índices de miocardiócitos e células I/V Ki-67
positivas, segundo o grupo de estudo, no segmento VD
VD-Grupo N Média EP Mediana Mínimo Máximo
C
6* 0,23 0,07 0,30 0,00 0,45
EC
7 0,06 0,01 0,06 0,02 0,14
EI
7 0,05 0,01 0,05 0,01 0,10
* divisão por zero em um dos animais
Em suma: os grupos C, EC e EI respondem da mesma forma e
não apresentam diferença estatística para a variável “proporção entre
miocardiócitos e células do interstício/vasos Ki-67 +”.
Os resultados da quantificação de células marcadas com Ki-67
(miocardiócitos e células do interstício/vasos) através da análise por campo
microscópico estão demonstrados nos anexos de 1 a 4.
5. Discussão
Discussão
66
5.1 Aspectos gerais sobre o preparo ventricular
A indução artificial de hipertrofia miocárdica vem sendo utilizada em
crianças com transposição das grandes artérias candidatas à chamada
correção anatômica do defeito, com a finalidade de preparar o ventrículo que
se tornará sistêmico e que, portanto, será submetido a pressões mais
elevadas
52,65,71,134-136
.
Durante a vida intra-uterina, os pulmões não funcionam para trocas
gasosas, recebendo sangue apenas para seu desenvolvimento como tecido,
e a hematose é realizada através da placenta. Nessa situação, a resistência
vascular pulmonar é alta e as pressões no VE e no ventrículo direito
encontram-se igualadas, possuindo ambas as câmaras, portanto, paredes
de mesma espessura. Após o nascimento, com a queda na resistência
vascular pulmonar, os ventrículos adaptam-se às respectivas pressões, o
que se reflete na massa dos mesmos
10,13,21
.
Na TGA, o ventrículo pulmonar (anatomicamente o VE) sofrerá
diminuição da espessura de suas paredes após perder o “padrão fetal”
22,24,25
. Como o melhor procedimento a ser adotado nesses pacientes é a
correção cirúrgica “anatômica” (Cirurgia de Jatene, quando se faz a conexão
do VE à circulação sistêmica através da aorta e do VD ao tronco pulmonar),
o diagnóstico e a conduta operatória devem ser precoces a fim de evitar que
o ventrículo a ser submetido à maior resistência se encontre desadaptado
39-
44
. Quando isso não é possível, o que pode ser feito para contornar o
Discussão
67
problema é realizar a cirurgia em duas etapas, sendo que, numa primeira
fase, o VE seria preparado para se tornar sistêmico, passando-se, a seguir,
para a segunda fase, que compreenderia a conexão das artérias aos
ventrículos correspondentes
53,55
.
Uma maneira de realizar esse preparo é imprimir ao ventrículo uma
sobrecarga de pressão através da obstrução de sua via de saída. Isso causa
aumento reacional da massa muscular, o que, teoricamente, imprime força
contrátil efetiva contra pressões mais elevadas
50,51,56,60,71,74,77,78
. Quando a
correção anatômica da TGA é realizada numa única fase, as chances de os
pacientes desenvolverem disfunção ventricular tardiamente são menores do
que quando se procede ao preparo prévio do ventrículo pulmonar.
Provavelmente, tal fato esteja relacionado com a sobrecarga aguda que é
imposta a essa câmara e, conseqüentemente, com o tipo de resposta que
ela desenvolve frente a esse estímulo (hipertrofia e/ ou hiperplasia)
51,52
.
É de extrema importância que a adaptação do ventrículo pulmonar às
pressões sistêmicas seja realmente efetiva, isto é, que ele permaneça com
sua massa elevada e não sofra dilatação e disfunção com o passar do
tempo.
Com base no princípio de preparo muscular de atletas, em que os
músculos esqueléticos e cardíaco desenvolvem a capacidade de suportar
maior carga de trabalho através da hipertrofia de suas fibras, coloca-se a
hipótese de que talvez o ventrículo a ser preparado tenha melhor adaptação
se for submetido a um preparo intermitente
82-84
.
Discussão
68
Tanto o músculo cardíaco quanto o esquelético fazem parte da
musculatura estriada e ambos podem sofrer hipertrofia como mecanismo
adaptativo frente a sobrecargas de trabalho. O trabalho concêntrico é
observado na musculatura esquelética em presença da produção de tensão
ativa quando o músculo sofre encurtamento (como no caso dos levantadores
de peso); no músculo cardíaco, ocorre na elevação de pós-carga, ou seja,
na sobrecarga de pressão; nesse caso, o aumento da massa é
desproporcional ao volume da câmara
137,138
.
As unidades contráteis da musculatura estriada são representadas
pelos sarcômeros, os quais se constituem em filamentos finos e grossos,
organizados longitudinalmente, formando uma intrincada rede tridimensional
de proteínas, cuja função é produzir força e movimento. Por serem
estruturas tridimensionais, podem crescer em comprimento ou em largura;
na hipertrofia concêntrica, novos sarcômeros são adicionados em paralelo,
fazendo com que a célula aumente seu volume na tentativa de diminuir o
estresse sobre a parede muscular, no momento da contração
137,139
. Em
atletas de força, esse ganho de massa muscular é desejável e conseguido
com programas de treinamento físico; no coração, a hipertrofia concêntrica é
relacionada de imediato com condições patológicas de sobrecarga de
pressão, podendo levar, com o tempo, à disfunção contrátil do ventrículo.
Isso se relaciona a uma das principais diferenças entre os músculos
estriados: no músculo esquelético, a hipertrofia é alcançada mediante
trabalho intermitente e, no coração, a aquisição de massa muscular deve-se
ao trabalho contínuo
137
.
Discussão
69
Por serem ambos estriados, existe a possibilidade de que, se o
músculo cardíaco for submetido a um programa de exercício semelhante
àquele preconizado para o esquelético, talvez a qualidade da massa
muscular adquirida seja melhor, por proporcionar um maior aproveitamento
dos mecanismos de adaptação durante o descanso. Além disso, existem
evidências de que a hipertrofia proporcionada pelo exercício físico é
desencadeada por mecanismos genéticos e biomoleculares semelhantes
àqueles que provocam hipertrofia patológica
140,141
.
De Maria et al.
82
analisaram 26 adultos normais por meio do
ecocardiograma, verificando as alterações estruturais e funcionais que o
exercício físico provocou num treinamento de caminhada e corrida durante
uma hora por dia, quatro dias por semana. Após um condicionamento de 11
semanas, encontraram aumento no diâmetro diastólico final e diminuição no
diâmetro sistólico final do VE, o que resultou em aumento na fração de
encurtamento dessa câmara. Além disso, houve aumento na espessura das
paredes ventriculares esquerdas, com conseqüente aquisição de massa
muscular. Portanto, os resultados indicaram melhora no desempenho
ventricular esquerdo após o programa de treinamento. Scheuer et al.
142
demonstraram que o aumento da massa miocárdica induzida pelo exercício
associa-se a uma maior atividade da actomiosina ATPase, sugerindo melhor
desempenho ventricular nesse tipo de hipertrofia em contraste com aquela
reacional à sobrecarga hemodinâmica. O estudo de Ziada et al.
143
,
utilizando ratos geneticamente hipertensos (SHR) e com hipertrofia
miocárdica do VE, atesta que aqueles submetidos a exercícios de corrida ou
Discussão
70
esteira durante uma hora por dia, cinco dias por semana, apresentaram um
acréscimo significativo de 38% na capacidade de trocas gasosas, além de
um aumento de 48% na proliferação de vasos miocárdicos, mostrando que o
treinamento físico estimula a angiogênese, com conseqüente acréscimo no
suprimento de oxigênio para o miocárdio hipertrofiado.
No presente estudo, o período de 12 horas de estímulo ao dia foi
escolhido pela maior conveniência na manipulação dos animais dentro da
rotina do Laboratório Experimental. Na verdade, não se conhece ainda qual
o tempo ideal de sobrecarga sistólica para que o ventrículo pulmonar adquira
massa muscular satisfatória.
Até o início do século passado, acreditava-se que o aumento da
massa muscular cardíaca fosse conseqüência de hiperplasia (aumento da
população de células através de mitose) e de hipertrofia (aumento do
diâmetro das células, sem alteração no número das mesmas). Entretanto, a
partir da segunda década do referido século, postulou-se que o coração era
um órgão pós-mitótico e que, depois do nascimento, os miocardiócitos
estavam incapacitados para sofrer proliferação. Tal afirmação baseava-se na
dificuldade de identificar figuras de mitose, uma vez que a fase M tem curta
duração (aproximadamente 30 minutos), além do fato de os miocardiócitos
apresentarem baixa taxa de divisão celular
88
. Porém, estudos experimentais
e clínicos recentes mostram que tanto a fibra miocárdica quanto os
componentes intersticiais podem apresentar hiperplasia até algumas
semanas após o nascimento, como também o podem corações adultos
comprometidos por doenças valvares, coronarianas ou por cardiomiopatia
Discussão
71
dilatada. Essa capacidade de proliferação celular foi igualmente observada
em corações transplantados que apresentaram rejeição
89-99,128
. O conceito
de que os miocardiócitos não se replicam após o período neonatal implica
em considerar que todas as células presentes ao nascimento deveriam
perdurar pela vida inteira do indivíduo. Num modelo experimental em ratos
Fischer 344, Anversa et al.
129
demonstraram que, com o transcorrer da
idade, dá-se uma perda progressiva da função ventricular, o que, no entanto,
só se torna aparente no final da vida desses animais. Tal disfunção
relaciona-se com perda de miocardiócitos, diminuição da densidade dos
capilares e acúmulo de colágeno. Numa tentativa de reposição celular, os
miocardiócitos sofrem hiperplasia, a qual é mais intensa no VD do que no
VE. Esses estudos indicam que, mesmo sendo células diferenciadas, os
miocardiócitos são capazes de reentrar no ciclo proliferativo. Na vida intra-
uterina, o crescimento cardíaco deve-se principalmente à proliferação dos
miocardiócitos; no período neonatal, ocorre a transição do crescimento
hiperplásico para o crescimento hipertrófico e, no coração adulto, a maior
parte dos miocardiócitos não prolifera. Portanto, a idade em que o estímulo
aparece é um fator de suma importância para a ocorrência de replicação
satisfatória dessas células
4,52,85,91,92,103
.
Anversa et al.
4, 100
demonstraram em ratos que, após o nascimento, o
VE, exposto à circulação sistêmica, sofre aumento significativo de sua
massa e também de seu volume. Desse modo, a relação entre a espessura
e o raio ventricular permanece constante em um processo fisiológico. A
proliferação celular (hiperplasia) continua até algumas semanas após o
Discussão
72
nascimento. Associado a isso, há também aumento no diâmetro dos
miócitos (hipertrofia). Esses dois fatores contribuem para o aumento na
espessura das paredes do VE. Progressivamente, o crescimento em
paralelo supera a proliferação dos miócitos e há aumento do número de
mitocôndrias e miofibrilas.
Na presença de sobrecarga anormal de pressão, a espessura das
paredes cardíacas aumenta sem que haja dilatação das câmaras (hipertrofia
concêntrica), com o objetivo de normalizar o estresse sistólico sobre o
ventrículo
100,144
. É importante determinar se esse espessamento é devido
apenas ao aumento do diâmetro das células cardíacas contráteis ou se
existe também replicação das mesmas, pois a hipertrofia como mecanismo
adaptativo é eficiente na fase compensada, podendo evoluir para disfunção
do músculo e insuficiência cardíaca congestiva com o tempo
102
. Sabe-se
que ratos jovens (dois meses de idade), com oclusão experimental do tronco
pulmonar e conseqüente sobrecarga crônica de pressão sobre o VD,
apresentam hipertrofia (24%) e aumento do número de miócitos (44%) desse
ventrículo, tornando-o mais apto a diminuir o pico de estresse sistólico
resultante da pressão elevada. O número de mitocôndrias apresenta-se
elevado numa primeira fase e há restauração aos níveis normais após um
período crônico, indicando que a quantidade de mitocôndrias existentes é
capaz de produzir energia (ATP) suficiente para evitar disfunção ventricular
100
. No presente trabalho, observa-se tanto hipertrofia como hiperplasia de
miocardiócitos após sobrecarga de pressão, em animais que já haviam
ultrapassado o período neonatal, como será discutido adiante.
Discussão
73
5.2 A hipertrofia miocárdica
Este trabalho evidenciou, por meio do ecocardiograma, que houve
aquisição de massa muscular do VD em ambos os grupos estimulados e em
porcentagens semelhantes. Um dado importante a ser considerado no
cálculo da massa ventricular é a espessura da parede livre do VD, a qual
mostrou equalização com o septo interventricular e parede inferior do VE por
volta do terceiro dia de preparo em ambos os grupos treinados, apesar do
grupo EI ter sido estimulado durante a metade do tempo do grupo EC.
A análise histológica e morfométrica mostrou que, para ambos os
grupos estimulados, houve hipertrofia dos miocardiócitos do VD e dos seus
respectivos núcleos, quando comparados aos do grupo controle,
comprovando que esse mecanismo faz parte da aquisição de massa
muscular do ventrículo em treinamento, como já demonstrado em outros
modelos experimentais de sobrecarga de pressão
4,100,101
.
O miocárdio é formado por três componentes: muscular, intersticial e
vascular
115
. A hipertrofia miocárdica caracteriza-se não só pelo aumento do
componente muscular, mas também pela proliferação de células do
interstício
116
, o qual exerce funções importantes, como: 1. fornecer suporte
para os miocardiócitos, vasos sangüíneos e linfáticos; 2. atuar como
mecanismo de defesa contra microorganismos estranhos; 3. facilitar as
trocas de nutrientes entre os miocardiócitos; 4. auxiliar na contratilidade das
células
117
. Entretanto, quando está presente em excesso, pode causar
disfunção cardíaca, inicialmente diastólica e, nos estágios finais, também
sistólica
115-118
. Reiss et al.
93
, estudando corações fetais e neonatais de
Discussão
74
ratos, demonstraram que o padrão de proliferação das células miocárdicas é
o mesmo para os miocardiócitos e para os fibroblastos, decrescendo
progressivamente no período pós-natal, o que sugere ser o crescimento
miocárdico coordenado entre essas duas maiores populações celulares.
No presente estudo, não houve diferença significativa na porcentagem
de colágeno intersticial do VD nos três grupos; como a síntese de miosina é
mais rápida que a do colágeno
117
, talvez o tempo observado não tenha sido
suficiente para mostrar um incremento do componente intersticial. Le Bret et
al.
84
compararam, durante cinco semanas, três tipos de preparo do
ventrículo pulmonar em ovelhas jovens, após o período neonatal: contínuo,
progressivo e intermitente. Nenhum dos animais treinados de forma
intermitente apresentou fibrose do VD, ao contrário dos outros grupos,
sugerindo que a cascata de eventos que tem início na hipertrofia miocárdica
não é acompanhada por fibrose quando se desenvolve em boas condições
de oxigenação (correspondente ao período em que o ventrículo não está
submetido a aumento na pós-carga). Buccino et al.
145
, estudando 26 gatos
com hipertrofia ventricular direita produzida por constrição contínua do
tronco pulmonar, encontraram maior concentração de colágeno no VD em
relação aos controles e aos VEs. O tempo de constrição do tronco pulmonar
variou de três a noventa dias, sendo que a maioria dos VDs entraram em
falência com vinte a cinqüenta dias. Portanto, é necessário considerar o tipo
de treinamento e o fato de que talvez a indução de fibrose miocárdica seja
responsável pela disfunção a longo prazo nos corações preparados para a
correção da transposição no plano arterial.
Discussão
75
O achado de maior quantidade de colágeno intersticial no VD em
comparação com o VE encontra embasamento em trabalhos prévios
115-
118,146,147
, que mostram ser o interstício proporcionalmente maior no primeiro
em humanos
115-118
, ratos
146
e coelhos
147
.
5.3 Marcadores da proliferação celular
Para que haja proliferação celular, é pré-requisito a ocorrência de
duplicação do genoma por meio da síntese de DNA
90,103,148
. A partir disso,
tem lugar uma série de eventos que fazem parte do chamado ciclo celular.
As células que não se dividem continuamente encontram-se, a princípio,
num estado quiescente ou fase G
0
; para entrarem no ciclo celular, faz-se
necessário que as mesmas passem para a fase G
1
, a qual representa um
“gatilho” para iniciar o processo de duplicação. O passo seguinte é a
transição para a fase S (de síntese celular); entretanto, antes disso, dá-se a
verificação, por parte do organismo, de que o DNA encontra-se íntegro, para
só então ocorrer a replicação. Passada essa etapa, a célula atinge a fase G
2
e, antes de chegar à mitose propriamente dita, ocorre nova checagem
acerca da qualidade do DNA. Se o material genético duplicado apresentar
danos, o mesmo pode ser reparado ou, caso isso não seja viável, a célula
será desprezada através de um mecanismo conhecido como apoptose ou
morte celular programada
148
– Figura 13.
Discussão
76
G1
S
M
G2
Checagem
DNA
Checagem
DNA
Quiescência
G0
Fig. 13 - Ciclo proliferativo celular. G- gap; M- mitose; S- síntese
Adaptado de: Kumar V, Abbas AK, Fausto N. Tissue reneval and repair:
regeneration, healing, and fibrosis. In: Kumar V, Abbas AK, Fausto N. Robbins
and Cotran Pathologic Basis of Disease. 7
th
ed. Philadelphia: Elsevier
Saunders, 2005, Cap 3, p.87-118.
Estudos clínicos e experimentais foram desenvolvidos utilizando
marcadores da síntese de DNA para demonstrar a proliferação dos
miocardiócitos no período pós-natal e em corações adultos sob condições
patológicas. Com exceção da presença de figuras de mitose, que indicam
especificamente a célula em divisão, mas são difíceis de serem observadas,
os outros marcadores comumente utilizados (incorporação de timidina,
bromodeoxiuridina e PCNA) podem indicar síntese de DNA para citocinese,
mas também para cariocinese e reparo celular
103,130
.
Discussão
77
Em 1983, Gerdes et al.
104
descreveram pela primeira vez um
anticorpo murino monoclonal, da classe das IgG, gerado pela imunização de
camundongos com o núcleo de células pertencentes a linfoma de Hodgkin.
Essa proteína foi chamada de Ki-67 (K de Kiel, cidade de origem e 67
referindo-se ao número do clone original)
108
. Seu respectivo antígeno (Ag
Ki-67) está presente no núcleo celular e se expressa em todas as fases do
ciclo ativo da célula, com exceção de G
0
e início de G
1
105,106,108,109
.
O Ag Ki-67 tem similaridade com DNA topoisomerase II, enzima
considerada como marcadora específica de replicação da célula
109
. Esse
antígeno nuclear aparece principalmente no final da fase S e, como
marcador de proliferação, é preferível à timidina, bromodeoxiuridina e ao
PCNA, pois não está envolvido com reparo celular nem com ploidia
103,105,108,113
.
Evidências qualitativas de que o Ki-67 atua como marcador de
proliferação celular podem ser demonstradas pela sua distribuição em
tecidos normais. Células do centro germinativo das amídalas, células basais
do epitélio e espermatogônias indiferenciadas dos testículos são fortemente
marcadas com esse antígeno. Por outro lado, células do fígado, rim e
cérebro não aparecem marcadas com o Ki-67, ao passo que sua expressão
é bastante acentuada em linfócitos do sangue periférico estimulados a
proliferar
104,109
.
Outras fortes evidências atestam que a proteína Ki-67 está
relacionada com a proliferação celular. Leri et al.
113
, estudando cães com
ICC induzida por marca-passo, observaram expressão simultânea do Ki-67 e
Discussão
78
da telomerase, a qual é uma enzima que garante a replicação do DNA, uma
vez que mantém intactos os telômeros durante a multiplicação celular. Behr
et al.
111
demonstraram co-expressão de vimentina e Ki-67 em 15% das
biópsias analisadas de corações transplantados; o gene da vimentina
pertence ao grupo dos genes precoces, o qual só se expressa em
miocardiócitos embrionários e é crescimento-dependente. Sua expressão
indica a presença de células indiferenciadas e precede a manifestação do
Ki- 67, uma vez que aparece na transição da fase G
0
para G
1
.
Relatos experimentais já publicados evidenciam que o anticorpo
utilizado no presente trabalho é um marcador adequado de células
proliferativas em tecidos de caprinos, razão pela qual foi aplicado ao material
deste estudo
126,127
.
Quantitativamente, existe uma correlação muito alta entre o número
de células que participam do ciclo proliferativo e a quantidade das mesmas
que são marcadas com Ki-67
104,105
.
Dentro da área cardiológica, estudos realizados em indivíduos
normais e pacientes com cardiomiopatia dilatada ou submetidos a
transplante cardíaco mostram que o Ki-67 se expressa nos corações com
doença inflamatória ou imunológica, indicando que os miocardiócitos são
capazes de renovar seu DNA em resposta a esses estímulos
110-113
.
A imensa maioria dos trabalhos considera o Ki- 67 como um marcador
de proliferação celular bastante confiável
104,106,108,109,112,113,127
, embora raros
estudos questionem essa capacidade
149
. Segundo Scholzen e Gerdes
108
, a
Discussão
79
classificação de uma determinada população celular em proliferativa ou não
proliferativa é mais complexa do que pode parecer, visto que, in vivo, as
células tendem a apresentar uma grande variação de tempos intermitóticos.
Os procedimentos habituais para determinar a fração de crescimento celular
são baseados em protocolos experimentais que evidenciam o DNA
sintetizado durante a fase S; as amostras são analisadas em diferentes
tempos e a fração de núcleos marcados (núcleos em mitose) é estimada. Se
uma fração considerável das células analisadas tiver tempos intermitóticos
que excedam o intervalo de marcação, o resultado obtido pode subestimar a
fração de crescimento do tecido estudado. Em seu trabalho sobre a relação
da proteína Ki-67 com o ciclo celular, Gerdes et al.
105
subdividem a fase G
1
em G
1T
, G
1a
e G
1b
, sendo que a fase G
1T
é aquela de transição de G
0
para
G
1
, G
1a
é a fase inicial de G
1
e G
1b
a fase final; neste estudo, células em G
0
,
G
1T
e G
1a
foram negativas para Ki-67.
Outro ponto importante a ser considerado é que a positividade para o
Ag Ki-67 não significa necessariamente que a célula entrará em divisão: a
mesma pode deixar o ciclo ativo e entrar em estado quiescente; também
existe a possibilidade de a divisão celular ser interrompida sem interferir
imediatamente na marcação pelo Ki-67. Em tais situações, a expressão
desse antígeno pode significar que a célula tem capacidade de continuar a
proliferação após ser removido o estímulo negativo. Apesar disso, são
fortíssimas as evidências de que o Ki- 67 está intimamente relacionado com
a proliferação celular, tornando adequada sua utilização como marcador
específico dessa situação. Tem sido ainda utilizado para estudar o padrão
Discussão
80
de crescimento de tumores, seu comportamento frente a drogas e o
prognóstico dos pacientes
108
. No contexto do presente estudo, tais
características podem ser úteis na análise dos diferentes estímulos utilizados
para provocar aumento da massa muscular do VD, indicando qual o
treinamento mais eficiente na capacitação dos miocardiócitos para reentrar
no ciclo celular.
Pode-se questionar, ainda, se os núcleos marcados pelo Ki- 67, na
verdade, não estariam relacionados com células em processo de poliploidia,
uma vez que o miocárdio apresenta uma porcentagem considerável de
miocardiócitos mono e binucleados e uma menor fração de células tri e
tetranucleadas
91,92,150
. Além do fato de o Ki-67 ser considerado um
marcador específico para células em proliferação, Olivetti et al.
151
,
estudando 245 corações humanos (72 normais, 81 com hipertrofia
macroscópica e 92 com doença arterial coronariana), com idades entre 26 e
96 anos, demonstraram que a porcentagem de miocardiócitos mono, bi, tri e
tetranucleados não varia com a idade nem com a condição de normalidade
ou das doenças analisadas. Os miocardiócitos mononucleados
correspondem a aproximadamente 77%, os binucleados a 22% e os tri e
tetranucleados a menos de 1% do total. Verificaram ainda que, nos corações
com hipertrofia macroscópica, o aumento do volume dos miocardiócitos foi
menor que o aumento da massa muscular, indicando proliferação de células.
Mesmo sendo amplamente utilizada em pesquisas como indicadora
de células em proliferação, a função dessa imensa proteína ainda
permanece desconhecida
108
. Sabe-se que ela faz parte do componente
Discussão
81
fibrilar denso do nucléolo, o qual sofre profundas alterações morfológicas e
funcionais durante o ciclo celular. Como o Ag Ki-67 não se expressa em
células quiescentes, conclui-se que não seja essencial para a formação dos
ribossomos, mas supõe-se que atue como um fator de eficiência e de
melhora na síntese de RNAr, facilitando o crescimento celular rápido antes
da proliferação
152,153
.
5.4 Estudo da proliferação celular
O estudo da proliferação celular foi realizado de duas maneiras:
quantificação de células marcadas por campo e por índice. O primeiro
método pode induzir a um viés, pois, considerando-se que ocorre hipertrofia,
é possível que exista menor número de células numa determinada área de
campo microscópico. Entretanto, essa análise foi mantida pensando-se em
sua aplicação clínica, uma vez que as amostras para biópsia possuem
tamanho bastante reduzido e nem sempre é possível obter 2000 células
para contagem por índice.
5.4.1 MIOCARDIÓCITOS
Quanto à análise histológica quantitativa do índice de células
cardíacas marcadas, os animais do grupo controle apresentaram diferença
significativa no número de células positivas para Ki-67, quando comparados
o VD e o VE, com valores estatisticamente maiores para o segundo.
Entretanto, o número de miocardiócitos marcados no VD dos grupos
Discussão
82
estimulados foi significativamente maior do que no VE e S dos mesmos
grupos, indicando que a sobrecarga de pressão induz a um expressivo
aumento da proliferação celular, mesmo em animais que já ultrapassaram o
período neonatal, em ambos os tipos de treinamento.
A quantificação por campo também mostrou que os VDs dos grupos
EC e EI possuem maior número de miocardiócitos positivos, quando
comparados aos respectivos VEs. Nesses animais treinados, o VD e S
apresentaram valores similares, sendo que o último segmento evidenciou
mais hiperplasia que o VE; nos controles, o VD aparece com os menores
valores, seguido do VE e S. Comparando-se os três grupos, observou-se
que o VD dos grupos EC e EI possui valores maiores que o VD do grupo C;
entre os cabritos treinados, o grupo EC apresentou valores maiores que o
grupo EI em todos os segmentos estudados. Em relação a esse último dado,
alguns aspectos interessantes devem ser levados em conta: os grupos EC e
EI não apresentaram diferença no grau de hipertrofia dos miocardiócitos e
de seus respectivos núcleos, o que, somado ao fato de que a proliferação de
células contráteis foi maior nos animais treinados continuamente, pode levar,
à primeira vista, à interpretação de que o estímulo contínuo mostrou-se mais
eficiente do que intermitente. Entretanto, deve-se considerar que o miocárdio
não se constitui apenas por miocardiócitos: existem também os elementos
não contráteis, os quais podem ter sofrido expansão maior no grupo EI,
levando à contagem de um menor número de miócitos por campo; além
disso, nesse último grupo, o tempo total de bandagem foi metade daquele
imposto ao grupo EC. Talvez um maior tempo de treinamento intermitente
Discussão
83
possa induzir um aumento significativo de miocardiócitos em proliferação,
como aconteceu no treinamento contínuo. Vale a pena lembrar ainda que,
na prática, após o período de treinamento, faz-se a cirurgia de Jatene e o
ventrículo subpulmonar será permanentemente submetido à resistência da
circulação sistêmica e que, portanto, o estímulo proliferativo talvez continue
atuando até um provável equilíbrio. Dessa forma, não é possível deduzir, a
partir de um experimento como o presente, se o resultado final de cada tipo
de treinamento, após a cirurgia definitiva, será distinto.
5.4.2 CÉLULAS DO INTERSTÍCIO E VASOS
Quando analisadas as células do interstício e dos vasos marcadas
com Ki-67 por índice e por campo, constatou-se diferença significativa no VD
de ambos os grupos estimulados em relação aos respectivos VEs, bem
como em relação ao VD do grupo controle. Comparando o VD dos grupos
estimulados, não houve diferença estatística no número de células em
proliferação; porém, esse segmento superou o VE e o septo nessa variável.
No grupo controle, todos os segmentos miocárdicos (VD, VE e septo)
comportaram-se da mesma forma em ambas as análises. Tais dados
mostram que, também para as células do interstício e dos vasos, tanto o
preparo contínuo quanto o intermitente foram eficientes em aumentar a
hiperplasia celular durante o tempo de treinamento. Na análise por índice,
também houve significância estatística entre o septo direito dos grupos
treinados, quando comparado com o VE e SE dos mesmos grupos; não
houve diferença entre o VE e a metade esquerda do septo. Feigenbaum
154
,
Discussão
84
já havia descrito a presença de uma linha hiperecogênica dividindo os dois
lados do septo interventricular. Boettler et al.
155
, estudando o coração de 30
indivíduos normais, demonstraram, por meio do ecocardiograma, que essa
linha provavelmente representa a divisão do septo em duas metades (direita
e esquerda). O lado esquerdo é mais espesso e apresenta maior
deformação radial que o direito; a linha brilhante referir-se-ia à mudança
abrupta na orientação das fibras musculares e à presença das artérias
coronárias. O resultado do presente estudo sugere que existe diferença
entre os dois lados do septo interventricular, de maneira que o aumento da
pós- carga do VD reflete- se na metade direita do septo.
5.4.3 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE PROLIFERAÇÃO
CELULAR
Embora, à primeira vista, se possa admitir que seja desejável que a
hiperplasia do ventrículo em preparo ocorra principalmente às custas dos
miocardiócitos, para que essa câmara apresente acréscimo efetivo em sua
força contrátil e possa suportar pressões maiores, isso pode não ser correto.
Não se deve esquecer que o incremento do número de células contráteis
aumentará também a demanda por nutrientes e oxigênio do miocárdio e que,
dessa forma, será imperioso o acréscimo de vasos sangüíneos para
manutenção das células proliferadas
83,100
. É desejável que haja um
equilíbrio entre a proliferação de miocardiócitos e de capilares a fim de que o
preparo possa ser considerado capaz de sustentar as solicitações da
circulação sistêmica
156,157
. Anversa et al.
83
submeteram ratos Wistar-Kyoto
Discussão
85
com cinco semanas de idade a um treinamento intermitente: corridas de uma
hora por dia, cinco dias por semana, durante sete semanas. Ao final do
experimento, encontraram aumento de 16% no número de capilares por
mm
2
, indicando que houve proliferação dessas células nesse modelo mais
fisiológico de treinamento.
Nos preparados de imuno-histoquímica, não é tarefa fácil distinguir
entre células intersticiais (fibroblastos em sua maioria) e células endoteliais
de capilares, pois os últimos nem sempre se encontram abertos. Logo, não
se pode, no presente estudo, afirmar se as células do interstício/vasos são
predominantemente endoteliais ou fibroblastos. No primeiro caso, esse
incremento seria um fator positivo (aumento de vascularização). Já no
segundo, a conseqüência seria proliferação exagerada de fibroblastos e
deposição de fibrose. Como foi discutido anteriormente, a análise da
porcentagem de fibrose do VD pelo método de Picro-sirius vermelho não
mostrou diferença significativa entre os três grupos. Talvez estudos com
dupla marcação imuno-histoquímica (para endotélio e células em
proliferação) possam, no futuro, esclarecer essa questão.
Quanto à proporção entre miocardiócitos e células do interstício e
vasos do VD marcadas pelo Ki-67, não houve significância estatística entre
os três grupos. Aparentemente, portanto, os dois regimes de preparo
induzem a um crescimento numérico proporcionalmente igual de elementos
contráteis e não contráteis.
Tem-se demonstrado que o coração adulto encontra-se apto a sofrer
proliferação dos miocardiócitos em condições normais ou patológicas,
Discussão
86
existindo uma subpopulação celular indiferenciada. Não se sabe ainda se
essas células-tronco são provenientes do próprio coração ou se são
migrantes de outros órgãos
158
. As pesquisas realizadas, principalmente em
corações com cardiomiopatia dilatada
158,159
e infarto do miocárdio
160
,
também verificaram que essa capacidade de replicação vem acompanhada
de apoptose
161
. Nesse processo, o DNA nuclear é degradado de modo
específico, com consumo de energia
114,162,163
. A morte dos miocardiócitos
via apoptose está presente na cardiogênese
163,164
e também em doenças,
como displasia arritmogênica ventricular
163
e ICC progressiva
114,159,161
.
Também o miocárdio hibernante crônico apresenta uma série de
alterações observadas nos miocardiócitos indiferenciados de embriões e
fetos. Dispersyn et al.
162
, estudando esses corações doentes, colocam a
hipótese de que, no miocárdio hibernante, os miócitos podem ativar um
“programa fetal”, retornando ao estágio indiferenciado, o que possibilitaria a
essas células sobreviverem em condições reduzidas de oxigênio, retornando
ao estado diferenciado após a restauração do suprimento sangüíneo
(revascularização cardíaca). Dessa forma, os miocardiócitos não
diferenciados não terminariam em apoptose, o que pode estar relacionado
com a proteção miocárdica presente na hibernação. Considerando a
possibilidade desse processo de retorno a um padrão embriogênico, as
células cardíacas contráteis estariam aptas a sofrer hiperplasia, mesmo após
o período neonatal.
Zorc et al.
158
, estudando marcadores de proliferação celular (Ki- 67 e
PCNA), de apoptose (TUNEL e bcl- 2, sendo que o último é um anticorpo
Discussão
87
que inibe a apoptose) e índices morfométricos (volume das miofibrilas e
densidade do tecido intersticial) de pacientes com cardiomiopatia dilatada,
classificaram a doença em duas formas:
- progressiva: alta porcentagem de miocardiócitos marcados pelo
TUNEL, menor expressão do bcl- 2, baixa porcentagem de
miocardiócitos marcados pelo Ki-67 e PCNA, baixo volume das
miofibrilas e alta densidade de tecido intersticial;
- não-progressiva: marcação de miocardiócitos baixa pelo TUNEL
e alta pelo Ki-67 e PCNA, maior expressão de bcl- 2, alto volume
de miofibrilas e pouca densidade de tecido intersticial.
Sarkar et al.
114
, trabalhando com ratos de linhagem selvagem e
geneticamente hipertensos, observaram que os ratos hipertensos adultos
que evoluíram para ICC apresentaram simultaneamente apoptose e
proliferação dos miocardiócitos, sendo que a morte celular programada teve
expressão mais significativa do que a replicação celular.
Esses estudos sugerem que a homeostase tecidual depende do
equilíbrio entre proliferação, diferenciação e apoptose de modo que, sob
estresse significativo, a apoptose se sobressairia em relação à divisão
celular
114,159
. Parece que uma das funções da proteína Ki-67 é promover a
ligação da cromatina à matriz nuclear durante a proliferação; as pesquisas
também sugerem que essa proteína é fundamental para a replicação do
DNA e que tem a capacidade de se ligar ao ácido nucléico in vitro . Supõe-
se que uma maior demanda por DNA viria acompanhada de um aumento no
Discussão
88
Ki-67 ligado ao ácido nucléico; tal competição pelo sítio de ligação no DNA
faria com que a cromatina ligada à matriz nuclear fosse liberada no
nucleoplasma, causando ruptura nuclear e, eventualmente, apoptose
152
. A
associação entre apoptose e proliferação celular tem implicações
importantes quando se objetiva preparar um ventrículo para suportar
pressões sistêmicas, dado que o desejável é que ocorra proliferação das
células contráteis e que, ao mesmo tempo, as mesmas consigam manter-se
ativas e preservadas. Do ponto de vista terapêutico, miocardiócitos
proliferando a uma taxa de 0,05 a 0,1% já seriam suficientes para aumentar
significativamente o número de células contráteis ao longo de alguns meses,
desde que tal crescimento ocorra de forma sustentada, ou seja, sem ser
sobrepujado por morte celular
103,112
.
No presente estudo, os grupos
treinados apresentaram índices de 1,13% (grupo EC) e de 0,68% (grupo EI).
Outro fator importante a ser analisado futuramente é a quantificação
dos capilares nos três grupos estudados por meio de marcação imuno-
histoquímica. O tipo de treinamento que apresentar o melhor equilíbrio entre
proliferação de células contráteis e de vasos sangüíneos, além da menor
taxa de apoptose, poderá ser classificado, com mais propriedade, como
sendo aquele mais adequado na correção da TGA em duas etapas.
Discussão
89
5.5 Limitações do estudo
A principal limitação deste trabalho é o fato de que existem distinções
entre os ventrículos direito e esquerdo no que diz respeito à anatomia e
fisiologia.
Anatomicamente, o VD apresenta forma irregularmente cônica e o VE
é mais ovóide; a valva atrioventricular esquerda e a aorta apresentam
continuidade, enquanto as valvas tricúspide e pulmonar são separadas pela
crista supraventricular. As diferenças fisiológicas estão relacionadas com as
morfológicas e são determinadas principalmente pelas pressões às quais
cada ventrículo está conectado, o que, por sua vez, dita também a diferença
na espessura das paredes
6,7
.
Assumir que o ventrículo pulmonar é simplesmente aquele que
trabalha com regime de pressões mais baixas não é correto, pois as
particularidades de cada um deles determinam seu comportamento ao longo
da vida do indivíduo. Um exemplo bastante adequado dentro desse contexto
são os pacientes com transposição corrigida das grandes artérias: o defeito
anatômico correspondente às discordâncias atrioventricular e ventrículo-
arterial faz com que, fisiologicamente, a circulação comporte-se de maneira
normal. Apesar disto, uma parcela desses doentes morrem entre a terceira e
quinta décadas de vida devido à falência do VD, que, apesar de apresentar-
se hipertrofiado, não consegue se manter como ventrículo sistêmico
6
.
Entretanto, mesmo tendo ciência da relevância de tal fato, optou- se por
realizar o experimento em animais hígidos, uma vez que a alteração
Discussão
90
cirúrgica da concordância ventrículo- arterial acarretaria alta porcentagem de
mortalidade, inviabilizando a pesquisa
78
.
Outra restrição que deve ser considerada é aquela que se refere ao
tempo de treinamento dos dois grupos: os animais preparados
continuamente o foram por 96 horas, ao passo que aqueles do grupo EI
tiveram um tempo de preparo reduzido pela metade (48 horas). Essa
discrepância pode ser responsável pelos resultados encontrados; porém,
neste trabalho, a intenção foi a de analisar o comportamento dos ventrículos
submetidos ao preparo rápido, totalizando uma semana de estudo. O
objetivo final desta linha de pesquisa é obter os melhores resultados no
menor tempo possível, visando a aplicação clínica. Contudo, trata-se de uma
dúvida que pode ser dirimida numa próxima investigação, onde o tempo de
preparo intermitente seja expandido para 96 horas.
5.6 Perspectivas futuras
Estudos crônicos para conhecer o que ocorre com os miocardiócitos
do ventrículo treinado ao longo do tempo em relação à morte celular
programada serão de grande valia para determinar a aplicabilidade clínica
desse tipo de procedimento. Igualmente importante é a análise da
concentração dos capilares nos grupos estimulados, a fim de se conhecer o
comportamento vascular nos dois modelos de preparo. A análise do tecido
colhido neste experimento poderá ser efetuada posteriormente, com vistas à
Discussão
91
detecção de apoptose e de aumento na densidade capilar na fase inicial de
estimulação.
Em relação ao treinamento intermitente, duas questões chamam a
atenção: o que aconteceria se o tempo de preparo fosse igual aquele
aplicado ao grupo de estimulação contínua (96 horas) e, no caso das
crianças submetidas à correção em duas etapas, como seria a evolução,
uma vez que o aumento descontinuado na pós-carga se transformaria em
contínuo após a conexão da aorta ao ventrículo morfologicamente esquerdo.
Os achados do presente estudo abrem um leque de possibilidades
não só para os pacientes que perderam a chance da cirurgia de Jatene em
uma só etapa, mas também para aqueles submetidos à correção no plano
atrial e cujo ventrículo sistêmico entrou em falência com o passar do tempo.
6. Conclusões
Conclusões
93
À luz dos resultados obtidos para o ventrículo pulmonar submetido à
sobrecarga de pressão por meio de bandagem ajustável do tronco pulmonar,
nas condições de tempo e regime de treinamento do presente trabalho,
pode-se concluir que:
1. Tanto hipertrofia como hiperplasia celular são mecanismos presentes na
adaptação do miocárdio à sobrecarga de pressão
2. Comparando os tipos de estimulação (contínua e intermitente), pode-se
afirmar que:
a) ambos foram eficientes em proporcionar aquisição de massa
ventricular direita;
b) nenhum deles proporcionou aumento significativo da fração de
área ocupada por colágeno miocárdico intersticial;
c) ambos induziram significativa hipertrofia de miocardiócitos;
d) ambos induziram hiperplasia de miocardiócitos e de células do
interstício e vasos, quando comparados os ventrículos treinados
com os outros segmentos do coração.
7. Anexos
Anexos
95
Anexo 1: Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da
variável número de miocardiócitos Ki-67+/campo, segundo o grupo de
estudo, nos segmentos S, SD e SE.
Grupo Segmento N Média EP Mediana Mínimo Máximo
S 7 2,34 1,29 0,82 0,28 9,85
C SD 7 2,23 1,11 0,87 0,37 8,57
SE 7 2,46 1,48 0,77 0,20 11,13
S 7 2,70 0,57 2,32 1,58 5,95
EC SD 7 2,96 0,91 2,13 1,63 8,40
SE 7 2,43 0,34 2,20 1,20 3,63
S 7 1,26 0,20 1,48 0,50 1,77
EI SD 7 1,41 0,31 1,57 0,37 2,30
SE 7 1,12 0,14 1,10 0,63 1,83
Anexo 2: Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da
variável número de miocardiócitos Ki-67+/campo, segundo o grupo de
estudo, nos segmentos VD, VE e S.
Grupo Segmento N Média EP Mediana Mínimo Máximo
VD 7 0,70 0,37 0,28 0,17 2,90
C VE 7 1,27 0,64 0,78 0,23 4,97
S 7 2,34 1,29 0,82 0,28 9,85
VD 7 3,75 0,77 3,02 1,45 6,30
EC VE 7 1,17 0,24 1,28 0,15 1,80
S 7 2,70 0,57 2,32 1,58 5,95
VD 7 1,53 0,39 1,10 0,40 3,18
EI VE 7 0,59 0,07 0,57 0,38 0,90
S 7 1,26 0,20 1,48 0,50 1,77
Anexos
96
Anexo 3: Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da
variável número de células do interstício e vasos (I/ V) positivas para Ki-
67/campo, segundo o grupo de estudo, nos segmentos S, SD e SE.
Grupo Segmento N Média EP Mediana Mínimo Máximo
S 7 1,47 0,82 0,72 0,30 6,37
C SD 7 1,81 1,15 0,63 0,27 8,63
SE 7 1,14 0,51 0,77 0,33 4,10
S 7 6,74 1,57 6,15 2,67 14,08
EC SD 7 9,94 2,98 7,57 2,30 25,23
SE 7 3,53 0,69 3,23 1,17 6,43
S 7 3,76 1,18 2,92 0,95 9,70
EI SD 7 4,03 1,12 4,27 0,77 9,37
SE 7 3,50 1,86 1,87 0,63 14,57
Anexo 4: Valores de média, erro padrão, mediana, mínimo e máximo da
variável número de células do interstício e vasos (I/ V) positivas para Ki-
67/campo, segundo o grupo de estudo, nos segmentos VD, VE e S.
Grupo Segmento N Média EP Mediana Mínimo Máximo
VD 7 0,84 0,52 0,28 0,17 3,92
C VE 7 0,77 0,37 0,38 0,07 2,93
S 7 1,47 0,82 0,72 0,30 6,37
VD 7 13,39 2,48 10,23 6,10 24,03
EC VE 7 1,75 0,28 1,72 0,63 2,95
S 7 6,74 1,57 6,15 2,67 14,08
VD 7 12,76 3,03 10,23 0,80 23,00
EI VE 7 1,37 0,26 1,48 0,40 2,42
S 7 3,76 1,18 2,92 0,95 9,70
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