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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
RAQUEL DA SILVA LEVISKI
ESTUDO COMPUTACIONAL DA INTERAÇÃO ENTRE BICAMADA LIPÍDICA
ANIÔNICA E MORICINA
Dissertação apresentada como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Química
Prof. Dr. Hubert K. Stassen
Orientador
Prof. Dr. Paulo F. B. Gonçalves
Co-orientador
Porto Alegre, junho de 2006.
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
A presente dissertação foi realizada inteiramente pelo autor, exceto as
colaborações as quais serão devidamente citadas nos agradecimentos, no período entre
setembro de 2003 e junho de 2006, no Instituto de Química da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul sob Orientação do Professor Doutor Hubert Karl Stassen e Co-orientação do
Professor Doutor Paulo Fernando Bruno Gonçalves. A dissertação foi julgada adequada para
a obtenção do título de Mestre em Química pela seguinte banca examinadora:
Comissão Examinadora:
Prof. Dr. Laurent Emmanuel Dardenne Prof. Dr. Paolo Roberto Livotto
Profa. Dra. Nádya Pesce da Silveira Prof. Dr. Paulo Fernando Bruno Gonçalves
Co-orientador
Prof. Dr. Hubert Karl Stassen
Orientador
Raquel da Silva Leviski
II
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Agradecimentos:
São muitas as pessoas que participaram deste trabalho, de várias formas diferentes que
contribuíram para sua conclusão. Por isso, começo agradecendo aos meus orientadores, Paulo
e Hubert, pela paciência acima de tudo. Aos colegas de laboratório do GQT, em especial
Lucas Bourscheidt; Jones de Andrade; Leandro Greff da Silveira e Emanuele Campelo; por
terem me ajudado a vencer muitas etapas.
Agradeço ao meu noivo
Alexandre Bender que sempre compreendeu minha ausência e
aos meus (velhos) amigos, da mesma forma. Aos meus pais; irmãos e cunhados, pela força e
incentivo para prosseguir.
III
Artigo
1. Leviski, R.S.; Stassen, H.K.; Gonçalves, P.F.B., Molecular Dynamics Simulation of
Calcium Binding Effects to an Anionic Lipid Bilayer; em preparação.
IV
SUMÁRIO
1. Introdução
1
2. Revisão Bibliográfica
5
3. Metodologia
18
3.1. Campo de Força – CHARMM27 19
3.2. Mecânica Clássica 21
3.3. Algoritmo Integrador – Velocity Verlet 22
3.4. Mecânica Estatística 24
3.5. Ensemble Estatístico 28
3.6. Termostato e Barostato 30
3.7. Condições Periódicas de Contorno 33
3.8. Constraints e Restraints 34
3.9. Tratamento das Interações Eletrostáticas - PME 39
3.10. Múltiplos Passos de Integração 42
V
3.11. Raio de Corte 43
3.12. Função Switch 44
3.13. Lista de Vizinhos 45
4. Parte Experimental 47
4.1. Moricina (MRI)
50
4.2. Moricina + Água (WMRI)
51
4.3. Membrana (MEM)
53
4.4. Membrana + 1 Moricina (MMRI)
55
4.5. Membrana + 6 Moricinas (CANAL)
57
5. Resultados e Discussão
59
a. Área 59
b. Função de Distribuição Radial 60
c. Perfil de Densidade de Massa 61
VI
d. Parâmetro de Ordem 62
e. Estrutura Secundária 63
f. Raio Interno do Poro 63
g. Ramachandran 64
5.1 Moricina (MRI)
65
5.2 Moricina + Água (WMRI)
69
5.3 Membrana (MEM)
73
5.4 Membrana + 1 Moricina (MMRI)
80
5.5 Membrana + 6 Moricinas (CANAL)
90
6. CONCLUSÃO
98
7. REFERÊNCIAS
100
VII
Lista de Figuras
Figura 2.1. Composição dos Fosfolipídios: (a) fosfato; (b) Etanolamina; (c) glicerol; (d)
Fosfatidil-Glicerol; (e) Fosfatidil-Etanolamina; (f) Ácido Palmítico; (g) Ácido Oléico. (6)
Figura 2.2. Estrutura dos Fosfolipídios: (a) POPE; (b) POPG. (6)
Figura 2.3. Estrutura de um Aminoácido. (11)
Figura 2.4. Estrutura genérica de um polipeptídio. (11)
Figura 2.5. Aminoácidos classificados quanto à carga em pH 7. (12)
Figura 2.6. Aminoácidos classificados quanto à carga em pH 7. (13)
Figura 2.7. Estrutura α-Helice. (14)
Figura 2.8. Estrutura Folha-β. (14)
Figura 2.9. Modelos de Estruturas Secundárias. (16)
Figura 2.10. Definição de ψ e φ. (17)
Figura 3.1. Eliminação do efeito do sistema finito. (33)
Figura 4.1. Estrutura da Moricina: (a) alguns resíduos identificados; (b) resíduos coloridos
conforme tipo. (48)
Figura 4.2. Helical Wheel dos resíduos da Moricina. (49)
Figura 5.1. Definição do raio e do elemento de volume para FDR. (60)
Figura 5.2. Definição do eixo molecular i e da Normal da Membrana. (62)
Figura 5.3. Diagrama de Ramachandran. (64)
Figura 5.1.1. Estrutura da Moricina após 2 ns de simulação no vácuo. (65)
Figura 5.1.2. Evolução temporal (1 ns) da DESP da Moricina no vácuo (MRI). (67)
Figura 5.1.3. Diagrama de Ramachandran das configurações acumuladas da Moricina em
vácuo (1 ns). (68)
Figura 5.2.1. Estrutura da Moricina após 1,4 ns de simulação em água com contra-íons. (69)
Figura 5.2.2. Evolução temporal (1 ns) DESP da Moricina em água (WMRI). (71)
Figura 5.2.3.
Diagrama de Ramachandran da Moricina em água (WMRI), com as
configurações de 1 ns acumuladas. (72)
Figura 5.3.1. Evolução temporal da área por fosfolipídio para o sistema MEM. (74)
Figura 5.3.2. FDR P-P para o sistema MEM (a partir de 20 ns). (75)
Figura 5.3.3. FDR P-OH para o sistema MEM (a partir de 20 ns). (75)
Figura 5.3.4. PDM do sistema MEM (intervalo 1). (76)
Figura 5.3.5. Parâmetro de Ordem do Palmitoil, sistema MEM. (78)
VIII
Figura 5.3.6. Parâmetro de Ordem do Palmitoil, sistema MEM. (78)
Figura 5.3.7. Sistema MEM após 55 ns de simulação. (79)
Figura 5.4.1. Evolução temporal da área por fosfolipídio para o sistema MMRI. (80)
Figura 5.4.2. FDR P-P para o sistema MMRI (a partir de 40 ns). (82)
Figura 5.4.3. FDR P-OH para o sistema MMRI (a partir de 40 ns). (83)
Figura 5.4.4. PDM do intervalo MMRI 6 (60 – 62 ns). (83)
Figura 5.4.5. PDM da água, sistema MMRI (todos os intervalos). (84)
Figura 5.4.6. Parâmetro de Ordem do Palmitoil, sistema MMRI (todos os intervalos). (85)
Figura 5.4.7. Parâmetro de Ordem do Oleil, sistema MMRI (todos os intervalos). (85)
Figura 5.4.8. DESP do sistema MMRI, entre 70 e 72 ns. (87)
Figura 5.4.9. Diagrama de Ramachandran do sistema MMRI (configurações acumuladas
entre 70 e 72 ns). (88)
Figura 5.4.10. Sistema MMRI após 75 ns de simulação. (89)
Figura 5.5.1. Evolução temporal da área por fosfolipídio para o CANAL. (90)
Figura 5.5.2. FDR P – P e P – OH do CANAL, calculada entre 120 e 130 ns. (91)
Figura 5.5.3. Presença de água e íons no interior do poro formado por 6 moricinas. (92)
Figura 5.5.4. PDM do CANAL (entre 120 e 130 ns). (92)
Figura 5.5.5. Parâmetros de Ordem para Palmitoil e Oleil, no sistema CANAL. (93)
Figura 5.5.6. Perfil do Raio do Poro do CANAL em Å
2
, avaliado entre 120 ns e 130 ns. (94)
Figura 5.5.7. Preenchimento volumétrico do poro formado por 6 moricinas (CANAL). (94)
Figura 5.5.8. DESP do sistema CANAL, entre 120 e 130 ns. (95)
Figura 5.5.9. Diagrama de Ramachandran do CANAL, configurações acumuladas entre 120 e
130 ns. (96)
Figura 5.5.10. Vista superior do sistema CANAL. (97)
IX
Lista de Tabelas:
Tabela 1. Parâmetros de DM aplicados a todas as simulações. (46)
Tabela 4.1. Parâmetros da Simulação e Composição do Sistema MRI (Moricina no vácuo).
(50)
Tabela 4.2. Parâmetros da Simulação e Composição do Sistema WMRI (Moricina em água).
(52)
Tabela 4.3. Parâmetros da Simulação e Composição do Sistema MEM (Membrana em água).
(54)
Tabela 4.4. Parâmetros da Simulação e Composição do Sistema MMRI (1 Moricina,
Membrana). (56)
Tabela 4.5. Parâmetros da Simulação e Composição do Sistema CANAL (6 Moricinas,
Membrana). (58)
Tabela 5.3. Propriedades do sistema MEM analisadas em 4 intervalos de tempo. (73)
Tabela 5.4. Propriedades do sistema MMRI analisadas em 4 intervalos de tempo. (81)
X
Glossário
POPE Palmitoil – oleil – fosfatidil – etanolamina
POPG Palmitoil – oleil – fosfatidil – glicerol
ts “time step”; passo de integração
ns nano segundo (10
-9
segundos)
ps pico segundo (10
-12
segundos)
fs femto segundo (10
-15
segundos)
MRI Sistema composto por 1 moricina no vácuo
WMRI Sistema composto por 1 moricina em água
MEM Sistema composto por membrana, água e íons
MMRI Sistema composto por membrana, 1 moricina, água e íons
CANAL Sistema composto por membrana, 6 moricinas, água e íons
FDR, g(r) Função de Distribuição Radial
PDM Perfil de Densidade de Massa
DESP Definição de Estrutura Secundária da Proteína
P Átomo de fósforo da cabeça polar dos lipídios POPE e POPG
Na, SOD íon sódio
Cl, CLA íon cloreto
OH Átomo de oxigênio da água
(FDR) P – P entre 2 átomos de fósforo de fosfolipídio
(FDR) P – OH entre um átomo de fósforo do lipídio e o oxigênio da água
D
P
Distância P – P (primeiro máximo da FDR, distância mais provável)
D
SP
Fim da primeira camada de solvatação P – P (primeiro mínimo da FDR)
n
P
Numero de lipídios vizinhos na primeira camada de solvatação
D
OH
Distância P – OH (primeiro máximo da FDR, distância mais provável)
D
SW
Primeira camada de solvatação P – OH, primeiro mínimo da FDR
n
W
Número de águas coordenadas
d Distância de Repetição da Bicamada (altura da membrana)
IW Dimensão da interface água – membrana
P.O. Parâmetro de Ordem
XI
RESUMO
Neste trabalho foram desenvolvidas cinco simulações: Moricina no vácuo; moricina
em meio fisiológico (água e íons); membrana em meio fisiológico; 1 moricina e 6 moricinas
no interior da membrana. O objetivo é avaliar as interações antibiótico – membrana. Para esse
estudo foi escolhido um peptídeo catiônico com atividade bactericida já constatada. A
membrana adotada é baseada na composição da membrana celular da bactéria E. Coli.
A metodologia utilizada foi a Dinâmica Molecular. Os sistemas foram construídos
com o software VMD e os cálculos foram desenvolvidos com o software NAMD2. O Campo
de Força para os lipídios, os íons e a moricina foi o CHARMM27 e o modelo para água foi
TIP3P. O ensemble adotado foi o NpT, com uma pressão de 1 atm e temperatura de 310 K,
por ser o mais coerente com o sistema fisiológico.
A moricina é um peptídeo α-hélice e por isso o modelo de atuação aplicado foi barrel
stave. Em presença do peptídeo se observou a perturbação da estrutura da membrana, o que
valida a metodologia. No sistema contendo 6 moricinas o poro formado possibilitou o
escoamento de água e íons através da bicamada lipídica, desfazendo o gradiente de
concentrações essencial à manutenção da célula bacteriana.
XII
ABSTRACT
In the present dissertation, five systems have been treated by molecular dynamics
computer simulations: isolated moricine, moricine in physiological solution, membrane in
physiological solution, a single moricine molecule inserted into the membrane, and an ion
channel consisted of six moricine molecules inserted into the membrane. The moricine
molecule represents a cationic peptide with known antibiotic activity. The membrane model
was chosen to mimic the composition of the celular membrane of E.Coli.
Our studies were directed towards the interaction between the antibiotic moricine and
the membrane. All the systems were constructed using the VMD software. The simulations
have been performed with the NAMD2 package adopting the CHARMM27 force field to the
lipides, ions, and the moricine molecule. Water was described by the TIP3P model. The
simulations were carried out within the NpT ensemble corresponding to physiological
conditions (pressure of 1 atm and a temperature of 310 K).
Moricine is a peptide with alpha-helix treated as a barrel stave. The adopted
methodology demonstrated a perturbation of the membrane's structure in the presence of the
peptide. The system containing six moricine molecules forming a pore within the membrane
exhibited a flux of water molecules and ions passing the membrane indicating the antibiotic
activity of moricine.
XIII
1
1.
INTRODUÇÃO
O estudo de membranas biológicas é muito importante para o planejamento e
desenvolvimento de fármacos. Os principais componentes de uma membrana são lipídios,
colesterol e proteínas de membrana.
[1]-[3]
A biodisponibilidade dos princípios ativos de muitos
medicamentos depende da sua solubilidade
em
membranas. O mecanismo de ação de várias
anestesias, apesar de não estar bem caracterizado, envolve sua distribuição na membrana.
[4]
Estima
-se que mais de 70% dos fármacos disponíveis atuem através de proteínas de
membrana.
[5]
A toxicidade de um antibiótico para um organismo animal diminui à medida que o
fármaco se torna capaz de um ataque seletivo, direcionado às células procariontes. Ou seja,
ele deve ter a menor afinidade possível por células eu
cari
ontes e a máxima afinidade com
células procariontes.
As células
procari
ontes
(bactérias) e eucari
ontes
(animais e vegetais) apresentam uma
membrana plasmática de composição fosfolipídica. Células bacterianas são mais simples e
menores que as eucarióticas, pois não apresentam núcleo e o conteúdo genético é bem menos
complexo.
Essas células também se diferenciam quanto à composição da membrana.
[1]
O
estudo das interações entre fármaco e membrana é de grande relevância no desenvolvimento
dos medicamentos e na
elucidação do mecanismo de ação destes.
Bactérias são seres unicelulares com uma membrana composta por fosfolipídios e
proteínas associadas, envoltas por uma parede celular composta por polissacarídeos e
peptídeos. Como a parede celular é facilmente transposta, o isolamento efetivo da célula com
relação ao meio se deve à membrana.
As
paredes celulares rígidas conferem as formas características das bactérias, e lhes
permitem viver em ambientes hipotônicos. Nesses meios a concentração de sais é menor que
a in
tracelular,
isso
causaria um inchasso osmótico até que suas membranas plasmáticas se
rompessem.
As paredes celulares bacterianas são de considerável relevância médica, pois são
responsáveis pela virulência das bactérias. Os sintomas de muitas doenças bacterianas podem
ser obtidos pela injeção da parede celular em animais, pois os antígenos característicos de
bactérias são componentes de suas paredes celulares. A injeção de preparações da parede
celular bacteriana em animais pode desenvolver imunidade contra
infecções desse agente.
[2]
2
As bactérias são classificadas como Gram-positivas (por exemplo, a
Staphylococcus.
Aureus
) ou Gram-negativas (por exemplo, a Escherichia Coli) dependendo de serem coradas
ou não pelo corante de Gram. Esse procedimento foi desenvolvido em 1884 por Crystian
Gram, e consiste em tratar sucessivamente com corante cristal de violeta e iodo células
fixadas pelo calor e, em seguida, descorá
-
las com etanol e acetona.
[2]
As bactérias Gram
-
positivas possuem uma parede celular com aproximad
amente 250Å
de espessura envolvendo sua membrana plasmática. As bactérias Gram-negativas possuem
uma parede celular fina, de aproximadamente 30Å de espessura, coberta por uma membrana
externa complexa. Essa membrana externa entre outras funções, atua como uma barreira
efetiva à permeabilidade e na exclusão de substâncias tóxicas à bactéria, como o corante de
Gram. Devido a essa estrutura, as bactérias Gram-negativas são mais resistentes a antibióticos
que as Gram
-
positivas.
[2]
Para
um antibiótico
atingir ín
dices de seletividade satisfatórios,
suas
interações
com
as
membrana
s celular
es
devem ser observadas. Um dos fatores que impulsiona a pesquisa e o
desenvolvimento
de
stes fármacos é a capacidade de adaptação do
s
microorganismos
. Após
algum tempo de exposição
da bactéria
,
a eficácia do antibiótico é gradativamente reduzida.
A primeira família de antibióticos surgiu com a penicilina, descoberta acidentalmente
em 1928, por Alexander Fleming. Foi utilizada na 2ª Guerra Mundial, embora na época não
fosse conhecido em detalhes o seu mecanismo de ação. Hoje, em decorrência das
modificações sofridas pelos microorganismos, seu potencial bactericida é muito inferior.
Uma classe de antibióticos que vem sendo estudada é dos
PCAs
(peptídeos catiônicos
antibióticos)
[6]
, e embora haja informações experimentais abundantes acerca destes, os
mecanismos de ação ainda não estão completamente elucidados.
[7]
Independente do
mecanismo específico de atuação, a interação desses peptídeos com membranas é crucial para
a atividade antimi
crobial.
[8]
O presente trabalho é voltado a estes peptídeos, que interagem
com a membrana celular perturbando o equilíbrio vital para a bactéria.
O uso de PCAs pode ser vantajoso por vários aspectos, alguns dos quais seguem
relacionados abaixo: São eficazes contra bactérias gram-positivas e gram-negativas e, em
alguns casos, penetram a membrana externa bacteriana para sensibilizar a célula ao ataque de
outros antibióticos. Muitos apresentam toxicidade seletiva contra células eucarióticas e
procarióticas devido à afinidade eletrostática com membranas bacterianas. Por interagirem e
desestabilizarem a membrana, sua ação é mais rápida que a dos antibióticos que apenas
inibem a divisão celular e o crescimento da colônia. Não induzem a formação de organismos
resis
tentes, pois as bactérias teriam que modificar a estrutura de suas membranas para se
3
tornarem resistentes a eles, o que teria conseqüências na permeabilidade e as tornaria
vulneráveis ao ataque de outros tipos de antibiótico.
[9]
Neste estudo temos por objetivo entender as interações de um peptídeo antibiótico
com uma membrana bacteriana. Adotamos a composição da membrana da Escherichia Coli
(E. Coli) como modelo, esta bactéria é bastante utilizada por pesquisadores e sua estrutura é
bem conhecida.
[1]-
[3]
A membrana pode ser satisfatoriamente representada por uma bicamada
lipídica, neste caso formada 75% POPE (palmitoil-
oleil
-
fosfatidil
-etanolamina) e 25% POPG
(palmitoil
-
oleil
-
fosfatidil
-
glicerol).
[10]
-
[1
2]
Os insetos não possuem um sistema imune baseado em relações antígeno-
anticorpo
como os vertebrados, mas têm defesas eficazes contra infecções bacterianas. A moricina é um
peptídeo de 42 resíduos, com atividade bactericida constatada.
[13]-[15]
É um antibiótico da
classe PCA sintetizada pelo bicho-
da
-seda em resposta ao contato com bactérias como a
E.
Coli
ou componentes da parede celular destas.
[1
3]
Outros peptídeos com estrutura primária
semelhante foram descobertos e integram a família da moricina.
[6]
Esse tipo de antibiótico
atua na membrana bacteriana e em decorrência da estrutura secundária -hélice deve se
posicionar no interior da membrana.
O estudo computacional das interações da moricina com a membrana bacteriana pode
ajudar a entender as causas da atividade bactericida. Dados experimentais continuam sendo
usados para validar resultados computacionais, mas muitas informações obtidas nas
simulações
, como as que dizem respeito ao comportamento do sistema a nível microscópico,
são inatingíveis pelos métodos empíricos convencionais e vice
-
versa.
Os testes empíricos são essenciais na pesquisa de novos fármacos principalmente n
as
etapas finais do planejamento
,
a tendência atual é combinar métodos computacionais e
experimentais
para investigar as propriedades do composto em questão. Com os modelos
adequados é possível antecipar o comportamento de uma molécula como resultado de suas
interações com diferentes meios.
Das metodologias computacionais que podem ser utilizadas no estudo e
desenvolvimento de novos fármacos, optamos por simulações de Dinâmica Molecular (DM).
Sistemas biológicos envolvem um grande número de átomos (da ordem de 10
4
), e um
tratamento quântico até o momento é inviável. Uma alternativa é a utilização de métodos
híbridos.
Uma das limitações das simulações de DM é o intervalo de tempo que pode ser
observado,
atualmente
na ordem de 10
-7
segundos. Muitos processos, como a penetração de
uma proteína na membrana
, ainda não podem ser estudados por DM pura . Nesse caso pode-
4
se optar por dinâmica forçada (
SMD
Steered Molecular Dynamics
),
empurrando a
proteína para o interior da membrana e monitorando as energias a cada passo
.
[16
],[
17]
O objetivo desse estudo é observar os efeitos do peptídeo
quando
inserido na
membrana bacteriana. Para isso são comparado
s
o
s
sistemas com a moricina dentro e fora d
a
bicamada,
bem como a membrana com e sem peptídeo. Com essas análises serão avaliadas as
alterações provocadas na bicamada e as interações
fármaco
membrana, esses dados podem
ser úteis na elucidação de mecanismos da ação bactericida de antibióticos da família da
moricina
. Nos sistemas em que há peptídeo e membrana, a configuração inicial das
simulações aqui desenvolvidas contém a moricina inserida na membrana.
5
2.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A partir da década de 90, com a significativa evolução na capacidade de
processamento dos computadores abriu-se um novo campo nas simulações de Dinâmica
Molecular. Tornou-se viável a realização de estudos de membranas biológicas e suas
interações com diferentes moléculas, tais como proteínas.
Na maioria dos casos, uma membrana sintetizada para fins experimentais é formada
apenas por lipídios, na forma de uma bicamada lipídica. Um lipídio é composto de duas
cadeias alifáticas, que podem ser saturadas ou insaturadas, e uma cabeça polar ligadas a um
gli
cerol.
[1]
-
[3]
Cada cadeia se liga a um carbono do glicerol, a cabeça polar consiste num grupo
polar conectado ao terceiro carbono do glicerol através de um fosfato, constituindo assim um
glicero
-
fosfolipídio.
As cadeias alifáticas se ligam ao glicerol por uma reação de esterificação
entre ácido
graxo e álcool. Fosfolipídios são anfifílicos, com um segmento solúvel em água ou
hidrofílico, e outro hidrofóbico. Essa característica é fundamental para a formação de
membranas. A parte hidrofóbica fica orientada para o interior da bicamada e consiste de
cadeias alifáticas.
A parte hidrofílica consiste de uma cabeça polar. Na Figura 2.1. são exibidos os
componentes das cabeças polares de POPE e POPG, com a distribuição de cargas que torna o
primeiro zwiteriônico, e o segundo aniônico. Também nesta figura aparecem os ácidos
carboxílicos Palmítico (C16) e Oléico (C18), que se ligam ao glicerol (reação de
esterificação) na composição das cadeias hidrofóbicas. A Figura 2.2. mostra as estruturas
completas de POPE e POPG. O único fosfolipídio que não tem as cadeias alifáticas
conectadas por um glicerol é a esfingomielina, todos os demais são glicero
-
fosfolipídios.
Os fosfolipídios são classificados conforme a carga da cabeça polar: são aniônicos se
os grupos polares ap
resentam carga resultante negativa, ou zwitteriônicos se a carga resultante
é nula. As membranas procarióticas são compostas por fosfolipídios aniônicos e
zwitteriônicos, o que confere a ela carga final negativa e caráter aniônico. As membranas
eucariótica
s são compostas por fosfolipídios zwitteriônicos, com carga resultante nula que lhe
confere caráter neutro. Estas informações podem e devem ser aplicadas no desenvolvimento
de agentes bactericidas mais seletivos.
6
Figura 2.1
. Composição
dos Fosfolipídios: (a) fosfato; (b) Etanolamina; (c) glicerol; (d)
Fosfatidil
-
Glicerol; (e) Fosfatidil
-
Etanolamina; (f) Ácido Palmítico; (g) Ác
ido Oléico.
Figura
2
.2
.
Estrutura
dos Fosfolipídios: (a) POPE; (b) POPG.
7
A formação de membranas é regida pelas interações favoráveis entre lipídios e
desfavoráveis dos lipídios com o meio aquoso. Interações hidrofóbicas permitem aglomeração
de lipídios, que orientam as cabeças polares na direção das moléculas de água e as caudas
hidrofóbicas para o interior da memb
rana.
Segundo o modelo do Mosaico Fluido,
[2]
os fosfolipídios na membrana apresentam
difusão lateral e
flip
-
flop
. No primeiro caso, os lipídios se movem ao longo de uma lâmina da
bicamada, sem que a cabeça polar penetre na parte hidrofóbica. No segundo, a cabeça polar
atravessa a porção hidrofóbica, e o fosfolipídio passa de uma lâmina para a outra, um
processo muito mais raro e mais lento que a difusão lateral. Este último processo é mediado
pela
Flipase
(enzima).
Os movimentos lentos dos átomos das cabeças polares dos lipídios fazem com que sua
contribuição para o potencial de dipolo varie lentamente. No entanto, a reorganização rápida
das moléculas de água em torno dos grupos polares compensa tais oscilações do potencial,
mantendo
-
o praticamente constan
te.
[16],[18],[19]
Com relação à fluidez da membrana, abaixo da temperatura de transição de fase (T
m
) a
membrana está numa fase gel (L ), mais compactada e com mobilidade restrita. As interações
hidrofóbicas são enfraquecidas com o aquecimento do sistema, e a mobilidade aumenta. A
partir da temperatura de transição de fase a membrana passa à fase líquido-cristalina (L
).
[20]
Para
membranas compostas somente por
POPE
ou
POPG, as temperaturas de transição de
fase são 299.1 K e 269 K, respectivamente.
[10],[21]
-
[23]
As cadeias hidrofóbicas
também
têm influência na fluidez: cadeias curtas têm maior
mobilidade e a presença de insaturações
quase todas as duplas têm configuração
cis
provoca dobras na cadeia que impedem um empacotamento dos fosfolipídios e aumentam a
fluidez.
[3]
As terminações das caudas hidrofóbicas se encontram na região central da
bicamada, por estarem livres têm maior mobilidade e conferem maior fluidez a esse ponto da
membrana.
A extremidade da cadeia hidrofóbica que se liga à cabeça polar te
m menor mobilidade.
A rigidez da membrana na região das cabeças polares pode ser atribuída às interações cabeça-
cabeça e cabeça
-
íon, uma vez que podem se coordenar aos cátions presentes na interface.
[24]
A interação de cátions, principalmente os divalentes, com membranas biológicas é
relevante para a estrutura, dinâmica, estabilidade e fusão da membrana, do transporte de
pequenas moléculas através dela e da
inser
ção de proteínas. Além disso, os íons cálcio estão
relacionados à transmissão de impulsos neurais. A interação dos íons sódio com a membrana
é mais lenta, mas também é efetiva.
[25]
As interações dos cátions com os lipídios também são
8
presumidas como o principal elemento diretor da agregação e fusão de lipídios em vesículas.
Embora se verifique a desidratação parcial dos cátions que blindam a bicamada lipídica, as
interações dos grupos polares com as moléculas de água não são afetadas.
[26]
A interação dos íons sódio com as cabeças polares da membrana neutra DPPC é mais
forte que dos íons cloreto. Em função dessa interação o número de moléculas de água que
solvatam o cátion é reduzido, ocorre uma desidratação parcial dos íons sódio coordenados às
cabeças polares dos lipídios.
[26]
A penetração dos íons sódio na membrana pode ser
acompanhada a medida que diminui o número de moléculas de água coordenadas ao cátion e
aumenta o número de átomos oxigênio do éster dos lipídios coordenados ao sódio. A
membrana hidratada, em presença de NaCl 0,15M não apresentou alteração na área por
lipídio, mas houve um discreto acréscimo no parâmetro de ordem dos primeiros carbonos da
cadeia alifática, como resultado da coordenação dos íons sódio, próximos a essa região.
[27]
A idéia de como as membranas se organizam está mudando atualmente, as bicamadas
lipídicas não estão mai
s sendo entendidas como um fluido homogêneo
. Em membranas mistas
pode haver a formação de aglomerados lipídicos duradouros ou não, que segregam
componentes das membranas e as compartimentalizam.
[28]
Esses aglomerados são chamados
domínios, e sua existência
daria origem a regiões com características distintas.
[29]
A grande diversidade de lipídios existentes é justificada pela quantidade de funções
que estes desempenham: como base molecular de vários processos catalíticos; pela barreira
seletiva que impõem à permeabilidade de moléculas em células e organelas; como doadores
na síntese de macromoléculas; por influenciarem várias funções e processos relacionados às
membranas,...
[30]
A hipótese da formação de domínios é baseada no comportamento de misturas
lipí
dicas em lipossomas ou membranas-modelo. A relevância dos domínios está nas
interações intermoleculares diferenciadas, como resultado das diferentes concentrações locais
dos componentes da membrana.
[31]
As alterações nas concentrações locais podem controlar a
permeabilidade e a estabilidade da membrana.
[32]
As interações Coulombicas entre as cabeças polares de lipídios carregados podem
acarretar redução da área por lipídio se comparada a membranas não carregadas. Em função
disso podem ocorrer alterações no parâmetro de ordem, na distribuição dos átomos ao redor
do fosfolipídio e no coeficiente de difusão. A penetração de moléculas de água
verificada
na
interface com a membrana carregada foi menor. As interações cabeça-cabeça são mais fortes
e as interações d
as cabeças polares com as moléculas de água podem ser mais fracas.
[33]
9
A partir de simulações de uma bicamada lipídica POPE 3:1 POPG constatou-se que a
interação mais forte se dá entre as cabeças polares PE-PG, com formação de ligações de
hidrogênio onde o principal doador é PE. Ocorrem ainda ligações entre PE-PE, e mais
raramente entre PG-
PG.
[10],[34]
As propriedades das bicamadas formadas apenas por POPE ou
POPG são diferentes. A área superficial de POPG é maior e a altura da bicamada menor, além
disso, as cadeias alifáticas têm maior ordenamento. Provavelmente em função da interação
mais fraca entre as cabeças polares e da área superficial maior, o empacotamento para POPG
é menor.
[10]
Com relação aos parâmetros aplicados nas simulações de membranas, há a
lgumas
divergências quanto ao uso de área constante e tensão superficial. Em 1996, Tieleman e
Berendsen entenderam que não havia diferença significativa quanto ao uso ou não de tensão
superficial constante em simulações de membranas.
[35]
Em sua tese de doutorado, defendida
em 1998, Tieleman reconsiderou argumentando que aquela conclusão estava em desacordo
com resultados experimentais.
[36]
Feller e Pastor, em 1999, apresentaram simulações de DM
de uma bicamada de DPPC e mostraram que as áreas por lipídio e a compressibilidade da
membrana são sensíveis ao uso de tensão superficial ( ) constante. Os resultados mostraram
maior dependência com os valores aplicados para área por lipídio ou
do que com o tipo de
ensemble (NpAT ou Np
T).
[37]
O uso de dados experimentais para área por lipídio ou tensão superficial depende da
aplicação de condições semelhantes às da determinação. No caso de membranas mistas,
compostas por mais de um tipo de lipídio ou com inserção de peptídeos ou proteínas, dados
experimentais obtidos para membranas puras não são confiáveis. A adição de peptídeo na
bicamada lipídica inviabiliza o uso de área constante na simulação por falta de dados
experimentais apropriados e se faz necessário rodar a simulação sob pressão constante.
[38]
Segundo Forrest e Sansom, uma bicamada lipídica de DPPC em fase gel L
I
simulada
no ensemble Np T não é sensível aos valores de . Já para a fase líquido-cristalina L , a área
por lipídio e o parâmetro de ordem apresentaram forte dependência com os valores de
aplic
ados.
[18]
Quanto maior o número de lipídios numa membrana simulada com área
constante, menor o valor correspondente calculado para
.
[39]
Em 2005, Edholm e Nagle apresentaram um método para cálculo da área por lipídio
em membranas mistas compostas por um tipo de lipídio e colesterol.
[40]
A determinação das
áreas por lipídio pelo método Voronoi Tessellation em membranas mistas formadas por mais
de um tipo de lipídio tem precisão reduzida.
[10],[11]
10
Os tempos de cálculo requeridos aumentaram ao longo dessa década, e é provável que
a complexidade dos sistemas e o tamanho das simulações continuem aumentando.
[18]
Há 20
anos os tempos das simulações ficavam entre centenas de ps e algumas dezenas de ns e
atualmente, os cálculos estão próximos de s e os modelos usados são mais
detalhados.
[7],[19],[41]
-
[43]
Em 1996 um sistema contendo uma membrana na fase L , formada por 32 DPPC por
lâmina e hidratada por 434 moléculas de água foi simulado em NpT durante 2ns para
avaliação estrutural.
[43]
A Tese de Doutorado de D.P. Tieleman, defendida em 1998, pode ser
considerada um dos marcos iniciais dessa área. Ele desenvolveu simulações de DM de
bicamadas lipídicas hidratadas, estudou as interações da membrana com peptídeos -hélice e
com proteínas-canal. Um dos sistemas, contendo 65898 átomos, foi simulado por pouco mais
de 1 ns.
[36]
Em 1999 foi apresentado um estudo de estabilidade da membrana a tempos longos,
com uma simulação de 10ns.
[16]
Um canal formado por 6 alameticinas no interior de uma
bicamada lipídica hidratada foi simulado por 12 ns.
[7]
Em 2002, para estudo da blindagem da
bicamada lipídica DPPS por íons sódio a simulação teve duração de 4ns.
[44]
Ainda para
estudos da blindagem da membrana, em 2004 uma bicamada lipídica POPS neutralizada com
íons sódio e cloreto foi simulada por 40ns.
[27]
Em outro artigo, uma bicamada DPPC com
íons cálcio foi simulada durante 200ns.
[25]
Em 2005 foram comparadas simulações de DM para uma bicamada lipídica hidratada,
e as propriedades se mostraram mais rapidamente convergentes para ens
emble NVT que NpT.
A bicamada formada por 36 fosfolipídios em cada lâmina apresentou convergência das
propriedades como perfil de densidade eletrônica, parâmetro de ordem e tensão superficial
entre 3ns e 4ns de cálculo.
[39]
Uma bicamada lipídica mista POPE/POPG, simulada durante
25ns para estudos estruturais, indicou que a interação PE-PG é preferencial se comparada a
PE
-
PE ou PG
-
PG.
[10]
As interações entre membranas aniônicas e peptídeos catiônicos são governadas por
interações eletrostáticas, fator que aumenta a seletividade dos antibióticos da cl
asse
PCA.
[27],[44]
O potencial transmembrana pode ser determinante na reorientação e passagem
dos peptídeos -hélices da superfície para o interior da membrana, devido às interações com
os momentos de dipolo dos peptídeos. Outro fator que influencia essa transição é a
concentração de peptídeos sobre a membrana, cujo acréscimo permite a inserção na bicamada
11
lipídica. Para razões maiores peptídeo/lipídio, pode haver a formação de canal através do qual
se estabelece o
fluxo de água, que pode romper a membrana e causar a morte da célula.
[7],[45]
Polipeptídio é um polímero de aminoácidos
[1],[2]
(Figuras 2.3. e 2.4.). Embora não haja uma regulamentação,
costuma
-
se usar o termo
proteína
para um polipeptídio de mais
de 50 aminoácidos. Abaixo disso, o mesmo é considerado um
peptídeo
. As proteínas são variações na combinação de 20
aminoácidos específicos, que se diferenciam por suas cadeias
laterais (grupo
R
) ligadas ao carbono
(C
). Os 4 substituintes
desse carbono são dis
postos num arranjo tetraédrico.
Com exceção do aminoácido glicina (cujo R é um hidrogênio) todos os demais têm C
assimétrico e apresentam atividade óptica. Em proteínas de mamíferos todos os aminoácidos
encontrados são
Levogiros
, conhecidos como L-
amino
ácidos, pois desviam o plano da luz
polarizada para a esquerda. Usando a projeção de Fisher, o grupo -
COO
-
é direcionado para
dentro do plano da folha e para cima, o -R para dentro e para baixo, restando o -H e o -
NH
3
+
. Por convenção, se o último estiver posicionado à esquerda, o aminoácido é L, caso
contrário será D (
Destrogiro
). Os aminoácidos são classificados ainda em função da carga que
apresentam em pH fisiológico (pH 7) como ácidos, básicos, polares e não-polares (Figuras
2.5. e 2.6.).
Os aminoácidos básicos apresentam carga resultante positiva em pH neutro, são eles
Lisina (Lys); Arginina (Arg) e Histidina (His). Os aminoácidos ácidos apresentam carga
resultante negativa em pH neutro, são o Ácido Aspártico (Asp) e o Ácido Glutâmico (Glu).
Há ainda dois tipos de aminoácidos, cujas cadeias laterais têm carga resultante neutra: os
polares e os não-polares. Serina (Ser); Treonina (Thr); Asparagina (Asn); Glutamina (Gln);
Tirosina (Tyr) e Cisteína (Cys) fazem parte dos aminoácidos polares. Alanina (Ala); Valina
C
H
H
3
N+
R
COO-
Figura 2.
3.
Estrutura de
um aminoácido.
N
N
N
N
N
N
O
O
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
R
H
H
R
R
H
HR
R
H
N
O
R
H
H
R
H
Cadeia Peptídica
1
2
3
4
5
6
7
Figura 2.
4.
Estrutura genérica de um polipeptídio.
12
(Val); Leucina (Leu); Isoleucina (Ile); Metionina (Met); Prolina (Pro); Fenilalanina (Phe);
Triptofano (Trp) e Glicina (Gly) são aminoácidos não-polares. Este último, Gly, tem apenas
um átomo de hidrogênio na cadeia lateral e também pode ser cons
iderado polar.
NH
3
+
O
N
O
NH
3
+
O
O
NH
3
+
O
S
CH
3
O
NH
3
+
O
S
O
NH
2
+
O
O
NH
3
+
O
CH
3
CH
3
O
NH
3
+
O
CH
3
CH
3
O
NH
3
+
O
CH
3
O
NH
3
+
O
O
H
NH
3
+
CH
3
OCH
3
O
[Ala]
[Gly]
[Val]
[Leu]
[Ile]
[Pro]
[Cys]
[Met]
[Phe]
[Trp]
Não-Polares
Figura
2.5
.
Estrutur
a dos aminoácidos não
-
polares, classificados quanto à carga em pH 7.
13
NH
3
+
O
O
O
O
O
O
O
O
NH
3
+
Ácidos
[Glu]
[Asp]
NH
3
+
O
N
NH
2
+
NH
2
O
NH
3
+
O
H
3
N+
O
NH
3
+
O
N
+
N
O
H
H
Básicos
[Lys]
[Arg]
[His]
NH
3
+
OH
O
O
NH
3
+
O
OH
O
NH
3
+
CH
3
OH
O
O
NH
3
+
O
O
NH
2
O
NH
3
+
O
O
NH
2
O
Polares
[Ser]
[Tyr]
[Thr]
[Asn]
[Gln]
Figura
2.6
.
Estrut
ura dos aminoácidos básicos, polares e ácidos, classificados quanto à carga em pH 7.
14
As proteínas têm estruturas definidas,
[2]
qualificadas como Primária; Secundária;
Terciária e Quaternária. A estrutura Primária consiste na seqüência de aminoácidos que a
compõe, e é fundamental que seja conhecida, pois dela depende o arranjo tridimensional da
proteína.
Polipeptídios de até 25 resíduos podem ser seqüenciados por Espectroscopia de
Massas. Os seqüenciadores automáticos fragmentam a proteína em subunidades para fazer a
determinação. Pelo procedimento de Sanger,
[46]
a proteína é quebrada em fragmentos
pequenos o suficiente para serem seqüenciados de modo individual e a estrutura da proteína
intacta é reconstituída a partir da sobreposição das seqüências dos fragmentos.
A Estrutura Secundária é referente à disposição espacial de domínios do polipeptídio.
Linus Pauling e Robert Corey fizeram vários estudos por Raio-X das estruturas de
aminoácidos e dipeptídios nas décadas de 30 e 40, constatando que a ligação peptídica possui
40% de caráter de ligação dupla, o que confere ao esqueleto do peptídeo uma conformação
planar rígida. A ligação C N do peptídeo é 0,13 Å mais curta que a C N normal; bem como
a ligação C=O é 0,02Å maior que a C=O de aldeídos e cetonas.
Com poucas exceções, os peptídeos adotam conformações trans, na qual C
sucessivos
ficam em lados opostos da cadeia; a conformação cis para C
sucessivos é aproximadamente
8kJ.mol
-1
ais instável devido a efeitos estéricos de cadeias laterais vizinhas.
As torções na cadeia principal da proteína determinam suas conformações esp
aciais,
tal como -hélice e folha-
(ou fita- ) (Figuras 2.7. e 2.8.). A definição da estrutura
secundária de uma seqüência de peptídeos segue uma hierarquia.
[47]
Primeiramente são
definidas as ligações de hidrogênio entre O do C=O, e H do N
H.
Figura 2.7
.
Estrutura
-
Helice
.
Figura
2.8
.
Estrutura Folha
-
.
15
Com base
na separação dos resíduos e no dobramento da seqüência envolvidos (Figura
2.9.) determinam-
se
turns
(voltas) ou
bridges
(pontes). Nos n-
turns
, o n indica o número de
resíduos entre as ligações de hidrogênio. Por exemplo, 3-
turn
, indica que a ponte é forma
da
entre o O
C=O
de um aminoácido (i) com o H
N-H
do aminoácido (i+2). As -hélices são
formadas por repetições de 3-
turns
(4 3-
turns
consecutivos), enquanto folhas-
são formadas
por repetições de
bridges
; fragmentos de curva que unem diferentes domínios sã
o
coils
(alças).
As hélices se enrolam em sentido anti-horário e as pontes, conforme o sentido que
se dispõem, podem ser paralelas ou antiparalelas. Hélices longas podem apresentar desvios na
estrutura que impedem a formação de ligações de hidrogênio, gerando imperfeições. O
tamanho máximo sugerido para uma estrutura secundária é de 30 Å (hélice mais provável: 13
a 18 resíduos).
[47]
A Figura 2.10. tem as definições dos ângulos
e . São traçados dois planos que
contém os grupos amida dos resíduos ligados ao C . Para o plano que contém os átomos N-
C -C
lat
(cadeia lateral) tomado como referência,
é o ângulo entre este e o plano que contém
a ligação N(grupo amida)-C . Para o plano que tem a ligação entre C
e C=O, o ângulo que
este plano faz com o plano re
ferência C
lat
-C -C
C=O
é
.
A estrutura Terciária diz respeito à conformação da proteína como um todo, onde o
dobramento dos domínios determina a posição de todos os átomos no espaço, é obtida por
Cristalografia de Raio-X ou por Ressonância Magnética Nuclear (RMN). A estrutura
Quaternária é atribuída apenas a agregados de proteínas.
Geralmente os peptídeos são compostos por no máximo 50 resíduos de aminoácidos,
[2]
por isso só apresentam estrutura primária e secundária. As proteínas, que são cadeias maiores
de aminoácidos, apresentam também estruturas terciária e quaternária que são relativas ao
dobramento da estrutura secundária e à disposição espacial das subunidades. De acordo com a
estrutura terciária em -hélice ou folha- , acredita-se que a proteína atue sobre a membrana
ou no interior desta respectivamente.
[48]
Quando a estrutura predominante é folha-
o modelo de atuação é referido como
carpet
, segundo o qual várias unidades da proteína revestem a parte externa da membrana
formando um tapete.
[45],[48
]
Nesta distribuição, os resíduos polares são direcionados para as
cabeças polares da membrana, enquanto os apolares são direcionados para o meio externo à
célula. As interações desfavoráveis entre os resíduos apolares e o meio provocam um
dobramento na
membrana, resultando na ruptura da célula.
16
N
N
N
N
N
N
O
O
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
R
H
H
R
R
H
HR
R
H
N
O
R
H
H
R
H
N
N
N
N
N
N
O
O
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
R
H
H
R
R
H
HR
R
H
N
O
R
H
H
R
H
N
N
N
N
N
N
O
O
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
R
H
H
R
R
H
HR
R
H
N
O
R
H
H
R
H
N
N
N
N
N
N
O
O
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
R
H
H
R
R
H
HR
R
H
N
O
R
H
H
R
H
N
N
N
N
N
N
O
O
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
R
H
H
R
R
H
H
R
R
H
N
O
R
H
H
R
H
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
alfa-hélice (
3-turn
)
pi-hélice (
5-turn
)
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
Folha-Beta Paralela
7
6
5
4
3
2
1
Folha-Beta Anti-Paralela
Figura
2.9
.
Modelos de Estruturas Secundárias.
17
Se a estrutura predominante é -hélice as unidades desta proteína penetram na
membrana formando um feixe como as tábuas de um barril, e o modelo é referido como
Barrel Stave. Essa configuração da origem a um poro na membrana, alterando sua
permeabilidade e desfazendo o gradiente de concentração mantido por ela, também causando
a lise da célula.
[45],[48]
-
[50]
Figura
2.10
. Definição de
e
.
18
3.
METODOLOGIA
Os sistemas foram estudados por simulações computacionais de Dinâmica Mol
ecular
[51]
(DM), aplicando o software NAMD2
[52]
. A escolha do NAMD se deu, principalmente, em
função da performance do software quando rodado em paralelo. Como sistemas biológicos
são extensos a obtenção de resultados é demorada, foi a possibilidade de rodar os cálculos
num cluster com 14 nodos que viabilizou um estudo desse porte como trabalho de mestrado.
No final de 2003, quando esse projeto começou, testamos os principais softwares
o NAMD
e o GROMACS
[53]
no cluster do nosso laboratório, e a melhor r
esposta foi do NAMD.
A DM parte da Mecânica Clássica, resolvendo as equações do movimento de Newton por
meio de algoritmos integradores que geram as trajetórias de cada átomo do sistema. As
condições iniciais requeridas são as coordenadas de cada partícula dentro do volume (V)
acessível e suas respectivas velocidades, que seguem uma distribuição Maxwelliana de acordo
com a temperatura (T). A DM representa uma ferramenta da Mecânica Estatística (ME)
conectando propriedades microscópicas e macroscópicas do si
stema.
A evolução temporal do sistema simulado por DM é controlada através das médias
termodinâmicas. Tendo obtido médias estáveis que não apresentem dependência com
qualquer configuração inicial considera-se o sistema equilibrado. A partir desse ponto se
rão
feitas as análises que, sempre que possível, devem ser comparadas a resultados obtidos
experimentalmente a fim de validar os dados da simulação.
A seguir são apresentados alguns parâmetros de uma Simulação por Dinâmica Molecular,
incluindo o tratamento
por Mecânica Clássica e Mecânica Estatística.
19
3.1.
CAMPO DE FORÇA
CHARMM27
Os Campos de Força empíricos fornecem informações detalhadas sobre os átomos e
suas interações em uma molécula, levando em consideração átomos que se ligam diretamente
e os não ligados (separados por duas ou mais ligações). A qualidade dos parâmetros de um
Campo de Força é determinante para obtenção de bons resultados. O Campo de Força
escolhido para desenvolver esse estudo foi o CHARMM27
[54]
-
[59]
, cujos parâmetros foram
oti
mizados para a descrição de biomoléculas tal como proteínas e lipídios.
[60],[61]
Além disso,
o CHARMM é compatível com o software NAMD, aplicado aqui.
Os parâmetros de Campo de Força usados pelo NAMD podem ser usados nos
programas CHARMM
[60]
e X-
PLOR
[62]
.
A forma funcional da energia potencial é definida
pela Equação 1:
2 2 2
2
2
12 6
1 cos
b o UB o o
bonds UB ang
impr o
dihed impr
ij ij i j
ij
nbond
ij ij ij
V r k b b k S S k
k n k
q q
r r er
(1)
Na equação acima, as duas primeiras linhas são referentes às interações ligantes; a
última linha, às não
-
ligantes:
b
o comprimento de ligação
k
b
a const
ante de força da ligação
b
0
a distância de equilíbrio
S
a distância 1
-3 (entre dois átomos separados por duas ligações covalentes)
k
UB
força Urey
-
Bradley
S
0
a distância de equilíbrio
o ângulo
k
a constante de força do ângulo
0
o ângulo de equilíb
rio
diedro ou ângulo de torção
k
constante de força do diedro
n
a multiplicidade
20
o ângulo fase
diedro impróprio
k
constante de força do diedro impróprio
0
diedro de equilíbrio
r
ij
distância entre os átomos i e j
ij
distância de equilíbrio
entre os átomos i e j
ij
energia de LJ no ponto de equilíbrio entre os átomos i e j
q
i
carga individual para o átomo i
e constante dielétrica; em todos os cálculos é igual a 1, que corresponde à
permissividade no vácuo.
Na equação 1, a primeira expressão da última linha é referente ao Potencial de
Lennard-Jones (LJ), que não envolve interações eletrostáticas. Entre colchetes o primeiro
termo, elevado à potência 12, refere-se às interações repulsivas entre os átomos i e j; o
segundo, elevado à potência 6, é relativo às interações atrativas de Van der Waals. Pela regra
de Lorentz-
Berthelot
[63]
, os parâmetros
ij
e
ij
são obtidos para cada átomo e depois
combinados, como mostra a Equação 2.
2
ij i j
i j
ij
(2)
(3)
A segunda expressão na última linha da equação 1 é referente ao Potencial de
Coulomb, que trabalha as interações eletrostáticas, que decorrem das cargas individuais dos
átomos que compõe a molécula.
O modelo TIP3P
[64],[65]
define a molécula de água por 3 cargas puntuais, 2
comprimentos de ligação O H, e 1 ângulo H O H. Pode-se usar TIP4P
[46]
ou TIP5P
[66]
; mas
por enquanto existem rec
omendações para que se utilize TIP3P com o CHARMM.
[67]
Não existe o melhor Campo de Força. A melhor opção de Modelo e Campo de Força
depende do tipo de sistema molecular e o tipo de propriedade na qual se tem interesse
.
van Gunsteren.
[51]
21
3.2.
MECÂNICA CLÁS
SICA
Em simulações de DM, os átomos são tratados como pontos de massa que se movem
no espaço, descritos através de equações clássicas do movimento. No formalismo
Newtoniano, o movimento do i-ésimo átomo com massa m
i
é descrito pela seguinte
equação:
[68]
2
2
i i i i i i
d d d
F p m v m r
dt dt dt
(4)
A força
i
F
exercida sobre o átomo i é a conseqüência de todas as interações com os
demais átomos do sistema. Para um sistema contendo
N
átomos:
N
i ij
i j
F F
(5)
Sendo a força
ij
F
exercida pelo átomo j no átomo i, definida pela derivada do Campo de
Força (Equação 1) em relação a separação
ij
r
(Equação 6).
ij ij
ij
F V r
r
(6)
As Equações do Movimento de Newton representam um sistema de N equações
diferenciais acopladas:
i i i i
d d
F p m v
dt dt
(7)
Sendo
i
p
o momentum do átomo i, de massa m
i
com velocidade
i
v
. As soluções podem ser
obtidas através da escolha adequada de coordenadas e velocidades iniciais para os N átomos.
Em simulações por DM, essas soluções são obtidas numericamente pelo algoritmo Integrador.
22
3.3.
ALGORITMO INTEGRADOR
VELOCITY VERLET
Este tipo de algoritmo é responsável pela integração computacional das equações do
movimento de Newton, a cada passo de integração t.
[51],[63]
A Equação 4 é uma equação
diferencial de 2ª ordem, que pode ser reescrita como duas equações diferenciais de 1ª ordem,
para coordenada e velocidade:
1
i i i i
i i
d
v t m F r t
dt
d
r t v t
dt
(8)
(9)
As forças
i
F
são derivadas da Energia Potencial (Equação 6), e dependem da
configuração do sistema. Pela soma das expansões em série de Taylor para
i
v t
, num
instante
t=t
n
, pode-se construir um algoritmo para integração das funções acima em pequenos
intervalos de tempo (passos de integração):
2
2
3
2
2
2
3
2
1 3
2
( ) ( ) ( )
2 2
2!
2
( ) ( ) ( )
2 2
2!
( )
2 2
n
n
n
n
i i n i i
t
t
i i n i i
t
t
i n i i i i n
t
d d
t t
v t v t v t v t O t
dt dt
t
d d
t t
v t v t v t v t O t
dt dt
t t
v t v t m F r t t O t
(10)
Aplicando a expansão em série de Taylor para
i
F t
no instante
t=(t
n
-
t/2)
, teremos:
3
( )
2
i n i n i n
t
r t t r t v t t O t
(11)
O algoritmo mais utilizado é o Verlet, e pode ser obtido suprimindo as velocidades
2
i n
t
v t
e
2
i n
t
v t
das equações anteriores, e substituindo
t
n
por
(t
n
-
t)
:
1 2 4
2 ( )
i n i n i n i i i n
r t t r t r t t m F r t t O t
(12)
23
As
velocidades atômicas não são necessárias para calcular as trajetórias, mas são
necessárias nos cálculos de Energia Cinética (e assim também para o cálculo da Energia
Total). Como a velocidade atômica não aparece explicitamente no algoritmo
Verlet
, o
acopl
amento do sistema ao banho térmico (controle de temperatura) através do escalonamento
das velocidades se torna impossível. Uma das soluções propostas para essa deficiência é o
algoritmo
Velocity Verlet, utilizado pelo NAMD; é equivalente ao
Verlet
(Equação 12) mas
retorna
; ;
i n i n i n
r t v t a t
:
2
1
2
i n i n i n i n
r t t r t v t t a t t
1
2
i n i n i n i n
v t t v t a t a t t t
(13)
(14)
24
3.4.
MECÂNICA ESTATÍSTICA
Simulações computacionais são usadas para estudar propriedades de sistemas de
muitas partículas, mas nem todas essas propriedades podem ser medidas diretamente na
simulação. As médias da simulação são equivalentes a medidas experimentais, quando
obtidas por métodos mecânico
-
estatísticos ou medidas ao longo da trajetória.
Para calcular essas médias a partir de dados microscópicos utilizamos conceitos da
Mecânica Estatística
[63],[69]
. Para medir um observável ou propriedade macroscópica estimada
na DM precisamos expressar este como função das coordenadas e dos momenta das partículas
do sistema
.
Pelo Princípio da Eqüipartição da Energia
[70]
, a energia cinética média associada a
cada grau de liberdade N é de k
B
T/2. Tendo
2
2 2
, ,
2 2 2
i y
i x i z
m v
m v m v
, a contribuição para
a energia cinética passa a ser 3N(k
B
T)/2. Considerando um sistema composto de
N
partículas
de massa
i
m
, cada uma com coordenada
, ,
i x y z
r r r r
. Para qualquer temperatura T
>0
K
,
essas partículas terão velocidade não nula
, ,
i x y z
v v v v
, e um momentum linear a
ssociado
i i i
p m v
.
2
1
2 3
N
i
B
i
i
p
K Nk T
m
(15)
Essa é a definição da temperatura no sistema. Na prática, é medida a energia cinética
total do sistema K, que posteriormente é dividida pelo número de graus de liberdade.
Consideran
do as flutuações da energia cinética, é adotada a temperatura instantânea:
2
2
1 1
2 1 1
3 3 3
N N
i
i i
i i
B B i B
p
K
T t m v
Nk Nk m Nk
(16)
25
a.
Teorema Virial
O Teorema Virial
[68]
tem origem estatística e se aplica a sistemas moleculares de N
partículas. Cada partícula possui um vetor posição
i
r
e momentum
i
p
relacionado. Sendo
uma quantidade
X
definida como função de
i
r
e
i
p
:
i i
i
X p r
(17)
A derivada temporal de
X
é:
i i i i
i
dX
X p r p r
dt
(18)
Calculando
-
se a média de
X
sobre um intervalo de tempo
, teremos:
0
0
1
X X
dX dX
dt
dt dt
(19)
Se o movimento do sistema for periódico, e se
for um múltiplo integrador do sistema
no período, então X( )
=X
(0), e
X
será igual a zero. No entanto, se o sistema não apresenta
nenhuma periodicidade, sendo X uma função finita para qualquer valor de t, podemos tornar
X
um valor tão pequeno q
uanto desejado, através de
suficientemente longo:
i i i i
i i
p r p r
(20)
No lado esquerdo da equação (20),
i i
p r
corresponde ao dobro da Energia Cinética,
no direito,
i
p
é a força
i
F
sobre a
i-
ésima partícula.
26
Logo:
2
i i i
i i
K F r
(21)
A soma sobre
K
i
é a energia cinética total do sistema
K
, portanto:
1
2
i i
i
K F r
(22)
O lado direito da equação (22) foi o que Clausius chamou de
virial
do sistema, e o
Teorema Virial consiste no fato de que a energia cinética média de um sistema de partículas
é igual ao
virial
.
Como
1 2
, ,...,
N
r r r r
e
1 2
, ,...,
N
p p p p
as energias interna total, potencial e
cinética serão expressas por:
2
1
,
2
N
i i
i
E p r K p V r
K p p m
(23)
(24)
Podemos escrever
E K V
(25)
Temperatura e pressão podem ser calculadas pelo teorema virial que, para uma
coordenada e um momentum qualquer, escrevendo na forma de uma eqüipartição
generali
zada:
B
B
E
p k T
p
E
q k T
q
(26)
(27)
27
b.
Hipótese Ergódiga
Segundo esta hipótese, as médias temporal e de ensemble devem ser iguais.
[69]
A
média do observável A (função do momentum
p
e das coordenadas
r
) pode ser computada
como média temporal,
A
, ou estimada sobre todas as configurações de um ensemble,
A
.
Na DM são especificadas as condições iniciais (
p
,
q
) que seguem uma evolução
temporal conforme a mecânica Newtoniana, com as médias calculadas referentes ao tempo.
Assim:
0
1
lim
t
t
A A t dt
t
(28)
Para um tempo de simulação suficientemente longo, a média temporal não deve
depender da condição inicial, isto é, partindo de diferentes configurações deve-se chegar à
mesma média. Dessa forma as médias serão equivalentes:
A A
.
28
3.5.
ENSEMBLE ESTATÍSTICO
Um Ensemble pode ser definido como o conjunto de configurações e as proprieda
des
mantidas constantes durante a integração das equações de Newton, que representam o estado
do sistema.
[63]
Uma das primeiras opções de ensemble é o microcanônico ou
NVE
(número de
partículas; volume e energia total constantes durante a simulação). Foram desenvolvidas
alternativas para esse ensemble, em que se controla separadamente T e P ao invés da energia
total, derivada destas.
[63]
Outros ensembles definidos são o grand-canônico ou
VT
(potencial químico; volume
e temperatura constantes); o canônico o
u
NVT
(com número de partículas; volume e
temperatura constantes); o isobárico-isoentalpico ou
NpH
(com número de partículas; pressão
e entalpia constantes) e o isotérmico-isobárico ou
NpT
(com número de partículas; pressão e
temperatura constantes).
[63]
Quando se trabalha com DM de não-equilíbrio, como no estudo de processos
irreversíveis; eventos catalíticos ou propriedades de transporte, é necessário impor ao sistema
constraints ou restraints externos. Nesses casos, pode-se controlar T com o objetivo de
absorver o calor dissipado nesses processos. Para simulações de DM no equilíbrio também é
conveniente que se controle T e P. Isso evita erros no cálculo das forças, e torna mais fácil a
transição para determinadas condições de
T
e
P.
No caso de sistemas biológicos contendo membranas homogêneas, é recomendável
aplicar tensão superficial ( ) constante no plano
xy
da bicamada. No ensemble
NpT
, a pressão
que atua no sistema é a mesma em todas as direções (x, y, z), o sistema pode ser considerado
isotrópico
a variação do volume em qualquer direção enfrenta a mesma resistência . Para
um sistema no qual se aplica tensão superficial (
xy
), a pressão definida atua somente no eixo
z
(p
z
), e a resistência não é mais a mesma em todas as direções. Assim pode ser caracterizado
o ensemble
N p
z
xy
T
ou
Np T.
O valor de
xy
pode ser determinado de duas maneiras: Tomando o valor experimental
de tensão superficial que tenha sido determinado para uma membrana de mesma composição
da simulada, ou aplicando ao sistema uma área constante no plano
xy
. Neste caso é utilizado
um valor experimental pré-definido para uma membrana de mesma composição, com base na
área superficial do fosfolipídio (depende, principalmente, das cabeças polares). Esse seria um
ensemble
N p
z
A
xy
T ou
NPAT,
é utilizado em alguns casos para agilizar a equilibração do
sistema
como a área por fosfolipídio é um critério de equilibração, deve convergir para
determinado valor durante a simulação.
29
A partir da simulação
NpAT
, depois do sistema equilibrado, é possível calcular a
tensão superficial a ser aplicada. Valores experimentais de A e
são determinados para
bicamadas lipídicas homogêneas (composta apenas por um tipo de lipídio). Para membranas
heterogêneas, a mistura de dois lipídios diferentes modifica as interações cabeça-
cabeça,
podendo aproximar ou afastar os lipídios uns dos outros.
Qualquer alteração nas condições usadas para obtenção dos valores experimentais
pode afetar as interações entre as cabeças polares. Se o solvente for modificado ou houver a
inserção de uma proteína, por exemplo, as interações cabeça-cabeça serão alteradas. Neste
caso, o uso de valores experiment
ais
de área por lipídio ou tensão superficial
pode incutir
erro nos resultados, ainda que a membrana seja homogênea.
Em decorrência das alterações de intensidade nas forças intermoleculares, a utilização
de uma média ainda que ponderada conforme a composição da membrana não fornece um
valor confiável. Assim, os valores de referência iniciais para área e tensão superficial não são
aplicáveis quando se trabalha em condições diversas das usadas para determinação dos
parâmetros experimentais.
Fizemos o teste com os ensembles NpAT e Np T, essa experiência está brevemente
relatada no capítulo
4
Parte Experimental, e em decorrência dos maus resultados obtidos, os
cálculos foram refeitos no ensemble NpT.
30
3.6.
TERMOSTATO E BAROSTATO
O controle de temperatura do NAMD usa Dinâmica de Langevin simples e o controle
de Pressão é feito pelo
Nosé
-Hoover Langevin Piston Method
[59]
(dinâmica de Langevin
implementada no barostato Nosé-
Hoover
[72],[73]
). Os termostatos e barostatos são bastante
semelhantes. No controle da pressão as variáveis
T
são substituídas por p, e as velocidades
atômicas pelas coordenadas.
a.
Constraint
Através do uso de
constraint
, a temperatura instantânea T(t) é a mesma da pré-
determinada
T
0
. Isso pode ser feito re-escalonando as velocidades a cada passo de integração
por um fator [T
0
/T(t
)]
2
, sendo que a temperatura é definida em termos da Energia Cinética
(K(t
)), segundo a eqüipartição:
2
1
1 3
2 2
N
i i B
i
K t m v t Nk T t
(29)
Este método apresenta desvantagens como a imprecisão numérica do algoritmo que
pode levar à perda do controle da temperatura instantânea, uma vez que T
0
não aparece nas
equações integráveis. Além disso, esse método é modelado pelo Hamiltoniano, que não
representa um sistema físico no qual flutuações de K(t) são características. Embora seja
possível obter expressões matematicamente consistentes, o Hamiltoniano não tem significado
físico.
b.
Extended System
Quando é aplicado o Extended System, são adicionados graus de liberdade extras aos
graus de liberdade atômicos do sistema, reproduzindo o efeito do banho térmico. Os termos
de energia cinética e potencial referentes aos graus de liberdade extras são inseridos no
Hamiltoniano e a simulação é controlada com esses
N+1
graus de liberdade do sistema
expandido. A energia flui entre o sistema e o banho térmico de acordo com o termo cinético
1/2
m
s
(
dS
/
dt
)
2
do Hamiltoniano, sendo a velocidade controlada pelo parâmetro de inércia m
S
.
31
Uma desvantagem desse tipo de acoplamento de 2ª ordem com o banho é a ocorrência de
oscilações na en
ergia.
c.
Acoplamento Fraco
Utilizando
-
se
acoplamento fraco as equações do movimento são modificadas de tal
forma que a relaxação da temperatura instantânea do sistema para a temperatura de referência
seja de 1ª ordem:
1
0T
d
T t T T t
dt
(30)
A
energia cinética pode variar ( K) no intervalo t, com o escalonamento de todas as
velocidades
i
v
por um fator
:
2
3
1
2
B
K Nk T t
(31)
Se a capacidade calorífica do sistema por grau de liberdade for C
v
f
, a variação da
energia leva a:
1
2
1
0
2
1 1
f f
V
f
V T
B
T N C K
T
C t
k T t
(32)
(33)
A capacidade calorífica C
v
f
não pode ser determinada com precisão, mas
T
(período
de relaxação da temperatura) é um parâmetro ajustável, não havendo prejuízos para a DM.
Esse acoplamento ajustável de 1ª ordem pode ser fraco (
T
suficientemente grande)
para evitar distúrbios no sistema; ou forte (
T
suficientemente pequeno) para se obter o
resultado desejado.
32
d.
Métodos Estocásticos
As velocidades atômicas são alteradas segundo a Dinâmica de Lange
vin
(ou
estocástica), e as novas velocidades seguem uma distribuição Maxwelliana. O tempo médio
entre as colisões é um parâmetro ajustável e determina a força do acoplamento com o banho
térmico. Outra opção é usar o coeficiente atômico de fricção
i
como parâmetro ajustável no
acoplamento com o banho térmico. A Equação de Langevin para uma partícula simples é:
[74]
2
2
i i i i i i i i
d d
m r F r t m r R t
dt dt
(34)
O segundo termo, do lado direito da Equação 34, representa o
damping
ou
amortecimento da fricção aplicada à partícula. O último termo é referente às forças aleatórias
que podem ser aplicadas à partícula, como o efeito do solvente, por exemplo. Essa expressão
mantém a energia cinética constante e, como conseqüência, a temperatura. Também pode ser
aplicada, com alg
umas modificações, para controle da pressão.
Para um sistema isotrópico, no qual a pressão aplicada ao sistema é a mesma em todas
as direções, a pressão é um escalar determinado por:
2
3
P K
V
(35)
Onde
K é a energia cinética; o V volume da caixa, e
é o virial (equação 22). Para
sistemas moleculares, as forças dos átomos de uma mesma molécula podem ser
desconsideradas. Isso porque as contribuições para K são computadas a partir dos graus de
liberdade moleculares. Variações de pressão podem ser obtidas alterando o volume da caixa e
o virial através do escalonamento das distâncias interatômicas.
33
3.7.
CONDIÇÕES PERIÓDICAS DE CONTORNO
Simulações com Condições Periódicas de Contorno
[51]
costumam ser aplicadas com a
finalidade de minimizar os efeitos da parede (efeito do sistema finito). Caso o sistema não
seja compatível com a periodicidade, é possível restringir artificialmente os movimentos dos
átomos na região da parede.
A condição periódica mais simples é o vácuo, onde o sistema não delimitado por
paredes. O vácuo corresponde a uma fase gasosa, com pressão nula. As propriedades dos
átomos mais externos da molécula são distorcidas, normalmente, para minimizar a área
superficial.
Nas demais condições periódicas, o sistema é posto numa célula que funciona como
unidade de repetição, a ser replicada indefinidamente em todas as direções. Para manter
N
constante assume-se que quando a partícula chega ao limite da caixa ela passa para a caixa ao
lado, na mesma direção e velocidade com que se movia. Ao mesmo tempo, outra partícula
idêntica entra na caixa em qu
estão pela face oposta (Figura 3
.1).
Figura
3
.1.
Eliminação do efeito do sistema finito, replicaç
ão da imagem para cima e para
baixo do plano da folha (conforme as setas à direita, fora da caixa) elimina completamente o contato
de uma partícula com a parede da caixa central (sombreada). As setas dentro da caixa indicam o
deslocamento de uma partícula da caixa central para a da direita, e ao mesmo tempo de uma partícula
da esquerda para a central.
34
3.8.
CONSTRAINTS E RESTRAINTS
Para simulações de DM, a evolução temporal do sistema deve considerar movimentos
de estiramento das ligações interatômicas, além dos movimentos angulares e de torções
(diedros). Os valores das freqüências de estiramento são consideravelmente maiores que das
demais, e se puderem ser subtraídos do cálculo das interações, o passo de integração pode
ser aumentado; isso representa uma redução considerável no custo computacional. Neste
trabalho está sendo aplicado
Constraint
apenas em ligações intramoleculares.
Ao congelar os comprimentos de ligação, torna-se possível desconsiderar as
freqüências de estiramento. Isso é feito incorporando forças de constraint ao integrador por
meio de um algoritmo de constraint.
[64],[69],[75]
A cada passo de integração as coordenadas são
resetadas para satisfazerem as distâncias de ligação desejadas.
A equação do movi
mento para o átomo
i
de uma molécula é:
2
2
i i i i
d
m r F g
dt
(36)
Onde
i
F
são as forças resultantes das interações inter e intramoleculares e
i
g
representa as forças de constraint aplicadas para manter o comprimento de ligação constante.
Conforme a função:
2 2
0
ij ij ref
r d
(37)
Onde
d
ref
é o comprimento de ligação entre os átomos i e j; e
ij i j
r r r
a distância
entre esses átomos a ser satisfeita a cada passo de integração. As forças de constraint podem
ser escritas como:
1 1
...
2 2
a a
a ij ij jk jk
r r
g
(38)
Aqui,
a
g
representa a força de constraint que atua sobre o átomo a, de uma molécula
específica;
ij
;
jk
; ... são pares de átomos desta molécula ligados diretamente, cujas distâncias
35
devem ser fixadas.
ij
e
jk
são multiplicadores de Lagrange não-determinados e os fatores ½
foram introduzidos para que essas equações sejam consistentes com as próximas.
Para assegurar que os constraints sejam satisfeitos a cada passo de integração, será
usada uma aproximação para corrigir as forças de constraint com o mesmo grau de precisão
do algoritmo integrador:
[76]
2
2
r
a a a a a a
d
m r F g F g
dt
(39)
Onde
r
a
g
é uma aproximação da força real de constraint. Inserindo-se a força de
constraint ao algoritmo Verlet, teremos:
2
` r
a n a n a n
a
t
r t t r t t g t
m
(40)
Onde
`
a n
r t t
é a posição calculada sem constraint que deve ser corrigida. Considerando
uma molécula triatômica, com o átomo j ligado a i e k, as forças aplicadas a cada um deles
serão:
r
i ij ij
r
j jk jk ij ij
r
k jk jk
g r
g r r
g r
(41)
Reescrevendo pa
ra o algoritmo de Verlet:
2
`
2
2
`
2
1 1
1 1
ij n ij n ij ij n jk jk n
i j j
jk n jk n jk jk n ij ij n
j k j
t
r t t r t t t r t r t
m m m
t
r t t r t t t r t r t
m m m
(42)
36
Fazendo o módulo quadrático da equação acima:
2 2
2
ij n ij n ref
r t t r t d
(43)
Para um sistema poliatômico com n
c
constraints, a solução dessas equações requer a
inversão de uma matriz n
c
x n
c
, a cada passo de integração. Outra possibilidade é percorrer a
lista de constraints, satisfazendo-os um a um com certa tolerância. Este é o processo
empregado pelo SHAKE
[76]
, o algoritmo mais usado em simulações de moléculas grandes.
O SHAKE pode ser implementado facilmente ao algoritmo de Verlet e outros de
ordem maior. Para o Velocity Verlet, foi desenvolvido o RATTLE
[77]
, que corrige as
coordenadas
`
a n
r t t
e velocidades
`
2
a n
t
v t
calculadas pelo algoritmo origina
l
(equações 13 e 14), calculadas sem constraint, para valores (
a n
r t t
e
2
a n
t
v t ) que
satisfaçam os comprimentos de ligação desejados:
2
`
1
2
r
a n a n a n
a
t
r t t r t t g t
m
(44)
2
`
1
2 2 2
r
a n a n a n
a
t t t
v t v t g t
m
(45)
Para fazer a restrição do ângulo entre as ligações i-j e j-k, é definida uma terceira
ligação
i-k, que será fixada como as demais. Para o caso específico de moléculas de água, que
representam cerca de 80% do sistema simulado, foi desenvolvido o SETTLE (uma soluçã
o
analítica do SHAKE). Neste, o comprimento das ligações O H é fixado e o ângulo H O H é
definido como uma ligação H H, também fixada. Assim são tratadas as águas rígidas nos
modelos TIP3P e TIP4P, ao invés de 2 ligações O H e 1 ângulo. No primeiro modelo
a
molécula de água é definida por 3 cargas puntuais e no segundo, por 4 cargas puntuais sendo
a última de um átomo fictício, que não precisa ser fixado.
Ângulos e diedros também podem ser restringidos, mas acarretam mudanças
significativas na estrutura e na dinâmica do sistema. Além disso, esses movimentos têm
freqüência mais baixa que os estiramentos, e não é produtivo trabalhar com eles fixos.
37
Assim como os constraints, os restraints fixam as ligações e ângulos da molécula em
torno de um comprimento de equilíbrio, e podem ser aplicados também a posições e diedros
(torções).
[64],[75]
No caso dos constraints, ligações e ângulos congelados são mantidos re-
escalonando as coordenadas dos átomos a cada passo de integração, para satisfazer valores
determinados. O
s restraints são restrições energéticas.
Quando as posições assumidas pelos átomos não satisfazem as condições estipuladas,
ocorre um aumento significativo de energia; fazendo com que o sistema mantenha essas
configurações. O potencial de restraint pode ser comparado ao do Oscilador Harmônico, e o
poço do potencial corresponde aos valores determinados de posições, distâncias, ângulos e
diedros.
A energia do restraint de posição (1 átomo) pode ser calculada por:
2
2
f
i ref
K
E r r
(46)
Para distâ
ncia (2 átomos), por:
2
2
f
ij ref
K
E r d
(47)
Para ângulo (3 átomos), por:
2
2
f
i ref
K
E
(48)
E, para diedro (4 átomos), por:
0
1 cos
2
i ref
E
E
(49)
Sendo
k
f
uma constante de força;
ref
r
a posição de referência; d
ref
a distância de
referência;
ref
o ângulo de referência;
E
0
uma barreira energética; e
ref
o diedro de referência.
Os restraints podem ser fixos ou forçados, sendo o cálculo das energias praticamente o
mesmo. No restraint forçado o valor de referência tem adição de um parâmetro
ajustável,
38
para regular o acoplamento entre dois valores específicos. Esses novos valores podem ser
expressos por:
1 0
1
ref
r r r
(50)
1 0
1
ref
d d d
(51)
1 0
1
ref
(52)
1 0
1
ref
(53)
39
3.9.
TRATAMENTO DAS INTERAÇÕES ELETROSTÁTICAS
PME
O custo computacional para calcular todas as interações eletrostáticas de um sistema
de
N partículas, pelo potencial de Coulomb, é proporcional a N
2
. Foram desenvolvidos
métodos alternativos, a fim de reduzir o custo computacional dessas interações.
[51],[69]
Utilizando
-se o potencial de Coulomb simples, é possível aplicar um Raio de Corte R
c
que trunca as interações na distância r=R
c
e as considera nulas para r>R
c
. Isso aumenta a
energia cinética dos átomos artificialmente e, como conseqüência, a temperatura do sistema,
acarretando erros na simulação de DM. Uma forma de reduzir esse erro é multiplicar as
interações não ligadas do potencia
l por uma função
switch.
Outro método que também trabalha com o potencial de Coulomb é o Twin Range, que
usa 2 raios de corte (R
1
e R
2
). Até o primeiro corte (r R
1
) as interações eletrostáticas são
computadas passo a passo. Entre o primeiro e o segundo (R
1
<r R
2
) estas forças são estimadas
em intervalos que podem ir de 10 a 100 passos de integração. Para distâncias r>R
2
as
interações são consideradas nulas.
Para sistemas periódicos existem métodos baseados em Somas de Ewald, que calcula
as interações de uma carga com todas as suas imagens periódicas. A distribuição de cargas no
sistema
i
(r) é um conjunto infinito de cargas puntuais, matematicamente representadas por
funções
:
i i i
r q r r
(54)
Cada carga puntual q
i
é envolvida por uma distribuição de cargas Gaussiana, com
mesma magnitude e sinal contrário:
3
2
exp
G
i i i
r q r r
(55)
Esta distribuição cobre a interação entre as cargas puntuais. As forças calculadas
usando a distribuição de cargas blindada
S G
i i i
r r r
tem menor alcance, devido à
função erro complementar
erfc
( |r
ij
+n|
), que pode ser definida como:
40
1
2
2
2 exp
x
erfc x y dy
(56)
Assim, a energia para a distribuição de cargas blindada E
S
é:
1
0
0 1 1
1
4
2
N N
i j
S
ij
n i j i
ij
q q
E erfc r n
r n
(57)
Uma distribuição de carga puramente Gaussiana de sinal contrário -
i
G
(r) deve ser
acrescentada à
i
S
(r), para contrabalançar a carga inserida pela primeira distribuição. Assim, a
carga final do sistema continua sendo igual à soma das cargas puntuais.
A energia dessas distribuições Gaussianas é expressa por uma soma no espaço
recíproco, subtraindo
-
se o próprio termo:
2
2
1
3 2
2
0
0 1
1
1
2
2
0
1
4 2 exp exp
4
4
N
G
j j
k j
N
j
j
k
E L k q ik r
q
(58)
onde
k=
2 L
-1
e L é a dimensão da caixa nas direções x
,
y e z ,
L(l
x
,l
y
,l
z
). Devido à presença do
fator exponencial, esta soma infinita converge para 1 (resultado finito). O parâmetro
pode
ser ajustado para otimizar as propriedades de convergência das 2 somas, que contribuem para
a energia eletrostática final:
S G
E E E
(59)
Embora a Soma de Ewald seja bastante usada para simulação de sistemas periódicos
pequenos, o custo computacional a torna proibitiva para sistemas grandes de macromoléculas
(N
>10
4
). Técnicas alternativas para calcular as forças eletrostáticas de longo alcance incluem
a expansão do potencial de Ewald em polinômios cúbicos, além do uso de potenciais de
Wigner, múltiplos passos de integração, particle-mesh, e expansões em séries de Taylor e/ou
multipolos.
41
O método PME
[78]
(Particle Mesh Ewald), incorporado pelo NAMD, requer a escolha
do valor de
suficientemente grande para que os pares de átomos nas distâncias r
ij
>r
c
sejam
desconsiderados na soma do espaço direto (
E
S
), o que reduz este termo à ordem
N.
A soma no espaço recíproco (E
G
) é aproximada por uma interpolação
multidimensional baseada no m
étodo Particle Mesh
[63]
. As aproximações das forças e energias
do espaço recíproco são expressas como convoluções, e podem ser calculadas rapidamente
usando FFT (Fast Fourier Transforms). O algoritmo resultante, de ordem
NlogN
, é preciso e
eficiente para s
istemas macromoleculares.
A aplicação de PME modifica a função do raio de corte sobre o potencial eletrostático
sem interferir no cálculo das interações de VdW. As forças eletrostáticas são computadas a
cada passo de integração para distâncias r R
c
. Para r>R
c
, as mesmas são computadas a cada 4
passos.
42
3.10.
MÚLTIPLOS PASSOS DE INTEGRAÇÃO
Com o objetivo de reduzir o custo computacional foram desenvolvidos algoritmos que
trabalham com múltiplos passos de integração (
MTS
Multiple Time Step)
[
51]
. O passo de
integração depende do tempo de oscilação ou relaxação das forças, sendo que em sistemas
moleculares podem-se identificar 3 freqüências diferentes: forças de estiramento de alta
freqüência,
F
hf
, que têm tempos de relaxação da ordem de 10 fs; forças de Coulomb de longo
alcance,
F
lf
, com freqüência bem inferior, da ordem de 1000 fs; forças remanescentes de
freqüência intermediária, F
if
, como as vibrações angulares e de diedros e forças de VdW e
Coulomb de curto alcance, com freqüências da ordem
de 40 fs.
Essas contribuições podem ser estimadas em intervalos de tempo (passos de
integração) diferentes. Dessa forma, as forças F
hf
serão calculadas a cada (
tn
+
n`
t`
), com
n`
=0,1,2,... e ( t=m
t`
). Quando
n`
for múltiplo de m
,
F
lf
e F
if
serão computadas e
multiplicadas por m, para compensar os intervalos nos quais são omitidas. Esse tipo de
algoritmo representa uma economia tão eficiente quanto o SHAKE, mas sem acarretar erros.
43
3.11.
RAIO DE CORTE
Uma partícula i interage com todas as demais na caixa central, bem como com as
introduzidas através de condições periódicas. Para um par de partículas essas interações, tanto
eletrostáticas como de VdW, diminuem à medida que a separação aumenta. Com base nisso, é
aplicado às interações não-
ligadas
do sistema um
raio de corte
[51],[64]
(
R
c
).
Define
-se uma distância R
c
a partir da qual as interações são consideradas nulas. Ou
seja, só serão consideradas no cálculo das forças as partículas que estiverem afastadas até um
comprimento
R
c
. Na distância equivalente ao R
c
, as interações eletrostáticas e de VdW são
abruptamente truncadas, prejudicando a conservação de energia.
A aplicação de PME modifica a função do raio de corte sobre o potencial eletrostático
sem interferir no cálculo das interações de VdW. Isso faz com que as forças eletrostáticas
sejam computadas a cada passo para partículas distantes até o raio de corte. Para distâncias
maiores, somente para alguns passos.
Pode
-se determinar um raio de corte interno, pois as forças dos átomos de uma mesma
molécula podem ser desconsideradas. As contribuições para a energia cinética são
computadas partir dos graus de liberdade moleculares.
44
3.12.
FUNÇÃO SWITCH
Uma alternativa para reduzir o erro decorrente do raio de corte é multiplicar as
interaçõ
es não-ligadas do potencial por uma função
Switch
[51]
, S(r), que suaviza as interações
no intervalo (R
sw
,R
c
). No caso do potencial de LJ, esta amortece as energias a partir de um
ponto
R
sw
pré
-
determinado, até o zero na distância
r=R
c
.
As interações eletrostáticas não-ligadas são calculadas normalmente e em seguida a
magnitude da energia no ponto r=R
c
é subtraída de todo o potencial, zerando as interações em
R
c
. Cabe lembrar, no entanto, que o uso do PME modifica a função do raio de corte.
Esta função po
de ser escrita como:
2
3
1;
2 3
;
0;
sw
c sw
c sw c
c sw
sw
r R
R r R
S r R r R r R
R R
r R
(60)
Com:
0
0
0
sw
c
c
d
S R
dr
d
S R
dr
S R
(61)
45
3.13.
LISTA DE VIZINHOS
A maior parte do tempo computacional numa simulação de DM é gasto para calcular
interações não
-ligadas. Ou seja, identificar o átomo vizinho mais próximo, e assim por diante,
para calcular as interações de VdW e eletrostáticas de cada par. Para agilizar esse processo de
busca foram desenvolvidos alguns métodos, como busca por grid e lista de vizinhos.
[51]
Na busca por grid a caixa é dividida em subcélulas e são determinados quais os
átomos presentes em cada uma. Este processo tem custo proporcional a N. Os vizinhos mais
próximos são facilmente encontrados nas subcaixas que envolvem a central.
No outro método os vizinhos mais próximos são identificados, seja pelo escaneamento
de todos os pares possíveis (ordem
N
2
) ou pelo uso de técnicas de busca como grid (ordem
N
).
Feito isso, os pares serão disponibilizados numa lista de vizinhos que será atualizada apenas
em alguns passos de integração; o novo intervalo fica entre 5 e 100 passos. A cada passo, a
lista é utilizada para o cálculo das interações.
Com o uso do raio de corte, só serão computados os átomos que estiverem numa
distância
r R
c
. Em função da evolução temporal do sistema, alguns átomos saem desse raio
de corte e são desconsiderados, enquanto outros entram. Se a lista relacionar apenas os
vizinhos mais próximos no momento de sua atualização, essas trocas causarão erros no
cálculo das energias.
No momento da criação da lista, pode-se determinar uma margem além do raio de
corte.
[64]
Assim, os átomos que estejam numa faixa de transição e que possam entrar no R
c
antes da próxima atualização constarão na lista.
46
Tabela 1
. Parâmetros de DM a
plicados a todas as simulações.
Campo de Força
CHARMM27
Modelo para Água TIP3P
Integrador
Velocity Verlet
Ensemble
NPT
Temperatura
310 K
Termostato
Dinâmica de Langevin
Pressão
1 atm
Barostato
Nosé
-
Hoover Langevin Piston
Interações Eletrostáticas
P
ME
Constraint
SETTLE
47
4.
PARTE EXPERIMENTAL
Por se tratar da simulação de sistemas biológicos, este capítulo foi dividido em duas
partes: a primeira contém informações sobre proteínas e lipídios; a segunda descreve os
sistemas e a forma como foram construídos. Os programas utilizados foram VMD1.8.2
[79]
para construção e NAMD2
[52]
para simulação, ambos em sistema operacional LINUX. Os
cálculos foram desenvolvidos em um cluster com 15 nodos, cada um com processador
ATHLON 1.4 GHz e 512 MB RAM.
Para a moricina (Figura 4.1.), os fosfolipídios e os íons, os parâmetros usados foram
do campo de força CHARMM27
[54]
-
[59]
; o campo de força utilizado para água foi o TIP3P
[65]
.
A topologia para Palmitoil-
Oleil
-
Fosfatidil
-Glicerol (POPG) foi adaptada a partir das
topologias do Palmitoil-
Oleil
-
Fosfatidil
-Etanolamina (POPE) e do glicerol, disponíveis no
Campo de Força CHARMM27
[54]
-
[59]
.
Para o peptídeo, o arquivo de coordenadas (PDB) foi
obtido do
Protein Data Bank
sob
o código 1kv4
.
[80]
São disponibilizadas 20
estruturas equivalentes com pequenas variações
nas
coordenadas dos átomos, determinadas por RMN.
[14]
Qualquer uma dessas estruturas pode ser
tomada como ponto de partida para a DM, sem acarretar prejuízos ou divergência nos
resultados. Neste estudo optamos pela estrutura 1. O arquivo de estrutura (Protein Structure
File
, PSF) foi gerado com o pacote
psfgen
, executado dentro do VMD1.8.2.
A
moricina possui 682
átomos, distribuídos em 42 resíduos. Sua estrutura primária é:
ALA
1
-LYS
2
-
ILE
3
-
PRO
4
-
ILE
5
-
LYS
6
-
ALA
7
-I
LE
8
-LYS
9
-
THR
10
-
VAL
11
-
GLY
12
*
-
LYS
13
-
ALA
14
-
VAL
15
-
GLY
16
*
-LYS
17
-
GLY
18
*
-
LEU
19
-
ARG
20
-
ALA
21
-
ILE
22
-
ASN
23
-
ILE
24
-
ALA
25
-
SER
26
-
THR
27
-
ALA
28
-
ASN
29
-
ASP
30
-
VAL
31
-
PHE
32
-
ASN
33
-
PHE
34
-
LEU
35
-
LYS
36
-
PRO
37
-LYS
38
-LYS
39
-
ARG
40
-LYS
41
-
ALA
42
Destes resíduos, 24 são não
-
polares; 6 são po
lares; 11 são básicos e 1 é ácido (ASP). A
moricina é um peptídeo catiônico com carga resultante (+10). Por ser pequeno, vamos nos
ater à sua estrutura secundária, majoritariamente -hélice. A orientação dos resíduos na -
hélice pode ser visualizada na Figura 4.2., que mostra a análise de Helical Wheel
[81]
da
Moricina.
*
O
R
da GLY é um átomo de H, o aminoácido pode ser classificado como polar.
48
Figura
4.1
.
Estrutura da Moricina: (a) alguns resíduos identificados; (b) resíduos coloridos conforme tipo.
49
No começo deste trabalho fizemos tentativas para aplicar área e tensão superfici
al
constantes. Como as bicamadas simuladas reproduzem a membrana celular da bactéria
E.
Coli
, foram construídas com POPE e POPG, numa proporção 3:1. Foram 3 etapas de cálculos,
variando os ensembles de NpT para NpAT e para Np T, respectivamente. No primeiro
momento os sistemas foram simulados sob 1 atm de pressão isotrópica, com p
x
= p
y
= p
z
, e o
tempo médio de cálculo foi de 45 ns. Após essa etapa, o sistema foi simulado com área
constante no plano xy, com tempos de cálculo em torno de 15 ns. Ponderamos a área por
lipídio conforme a composição da membrana, usando valores experimentais para POPE
(A
POPE
) e POPG (A
POPG
).
[10],[11],[37],[82]
A
média
= 0,25 x A
POPG
+ 0,75 x A
POPE
Esta área média foi multiplicada pelo número de lipídios contidos em uma lâmina da
bicamada, extraindo a raiz quadrada deste resultado obtivemos as dimensões x e y da caixa ,
que foram fixadas. Depois disso o sistema passou a ser simulado com tensão superficial
constante, em Np T. Nesse caso optamos pelo valor experimental de
referente ao POPE, de
44 dyn/cm
[82]
, por ser este o componente majoritário das bicamadas. Os cálculos no ensemble
NP
T tiveram duração média de 40 ns.
Os tempos de cálculo ficaram em torno de 100 ns no total e os sistemas não
permaneceram estáveis. Como não obtivemos bons resultados com esse procedimento, os
cálculos foram refeitos no ensemble NpT.
Figura
4.2
.
Helical Wheel
dos resíduos da Mori
cina.
50
4.1.
MORICINA (MRI)
Este primeiro sistema é o mais simples, onde a estrutura 1 do 1kv4
[80]
é simulada em
condições de vácuo, com temperatura de 310 K. O sistema é composto apenas por uma
molécula de moricina com 682 átomos e massa total 4487.55 u.m.a., correspondendo a 2046
graus de liberdade. Na ausência de contra-íons o sistema não é neutralizado e tem carga
resultante de +10
e.
O passo de integração aplicado foi de 1 fs e o tempo total da simulação foi de 1,2 ns,
sem aplicação de
constraint
ou
restraint
,
sendo 200 ps de equilibração e 1 ns de aquisição dos
dados para análise com o sistema equilibrado. Na Tabela 4.1. são apresentados os parâmetros
usados nesta simulação.
Tabela 4.1. Parâmetros da Simulação e Composição do Sistema MRI (Moricina no vácuo).
Passo de Integração (ts)
1 fs
Custo Computacional
0,265 dias / ns
Equilibração
0,2 ns
Aquisição
1 ns
Simulação
1,2 ns
Passo Interações Eletrostáticas
r > R
c
4 ts
4 fs
Distância Switch
1 nm
Raio de Corte
1,2 nm
Distância da Lista de Vizinhos
1,4 nm
Ciclo da Lista de Vizinhos
10 ts
10 fs
Átomos
682
Graus de Liberdade
2046
Moricinas
1
Carga Resultante
+10
e
51
4.2.
MORICINA + ÁGUA (WMRI)
Este sistema também partiu da estrutura 1 de 1kv4. No VMD, a moricina foi solvatada
por uma caixa de água pré-equilibrada contendo 3654 moléculas de água. A concentração
fisiológica do cloreto no líquido intersticial é 0,114 mol/l,
[83]
o que neste sistema
corresponderia a 7,5 cloretos. Este número é insuficiente para neutralizar a carga do peptídeo,
por isso a adição de 10 ânions cloreto, resultando numa concentração superior. Assim, o
sistema somou um total de 11654 átomos, com 34962 graus de liberdade, carga final nula e
massa total 70670 u.m.a.
As dimensões iniciais da caixa foram 90Å x 40Å x 40Å. A pressão aplicada foi de 1
atm, controlada com o barostato
Nosé
-Hoover Langevin Piston. As moléculas de água não
foram fixadas com
constraints
(sistema simulado sem utilização de SETTLE).
Quando se aplica minimização, as coordenadas dos átomos são ajustadas em busca da
configuração de menor energia (mínimo do potencial), sem resolver as equações de
movimento. O sistema foi minimizado durante 500 passos de integração e depois foi aquecido
de 0 K a 310 K, em um
intervalo de 11000 passos de integração
equivalente a 11 ps
e esta
temperatura foi mantida constante com
Nosé
-Hoover Langevin Piston. O tempo total de
simulação foi de 1,4 ns, sendo 200 ps para equilibração e 1,2 ns para aquisição. As análises
foram feitas utilizado apenas o último nanosegundo. O passo de integração aplicado foi de 1
fs e foram utilizadas condições periódicas de contorno. Detalhes desta simulação são
apresentados na Tabela 4.2.
52
Tabela 4.2.
Parâmetros da Simulação e Composição do Sistema WMRI (Moricina em água).
Passo de Integração (ts)
1 fs
Custo Computacional
1,389 dias/ns
Minimização
500 ts
Aquecimento
11 ps
Equilibração
0,2 ns
Aquisição
1,2 ns
Simulação
1,4 ns
Passo Interações Eletrostáticas
r > R
c
4 ts
4 f
s
Distância Switch
1 nm
Raio de Corte
1,2 nm
Distância da Lista de Vizinhos
1,4 nm
Ciclo da Lista de Vizinhos
10 ts
10 fs
Átomos
11654
Graus de Liberdade
34962
Moricinas
1
Águas
3654
Íons Cloreto
10
Carga Resultante
0
e
53
4.3.
MEMBRANA (MEM)
Este é o primeiro sistema que contém fosfolipídios, mas não possui proteína. Com o
objetivo de simular uma membrana bacteriana, foi construída uma bicamada lipídica tendo
por modelo a bactéria Escherichia Coli. Assim, 75% da membrana a ser simulada é com
posta
por POPE (zwitteriônico) e 25% por POPG (aniônico). Durante a construção do sistema no
VMD é gerada uma lâmina contendo 16 POPG e 48 POPE, a qual é duplicada, sendo que uma
lâmina é girada em 180° no eixo y. As lâminas são sobrepostas de forma que as cabeças
polares fiquem orientadas para fora e as caudas apolares sejam direcionadas para o interior da
bicamada.
A membrana gerada é aniônica e contém 128 lipídios, são 96 POPE e 32 POPG. A
carga resultante é -
32
e, relativa aos POPG. Essa bicamada é solvatada com água acima e
abaixo da membrana, no eixo z, e caso existam moléculas de água dentro da membrana essas
são removidas. As concentrações fisiológicas dos íons sódio e cloreto são 0,147 mol/l e
0,114
mol/l
, respectivamente.
[
83
]
Foram utilizados 8 cl
oretos
e 40 sódios, sendo a concentração do
ânion
0,092 mol/l e do cátion 0,46 mol/l. A concentração do cloreto ficou próxima da
fisiológica e sendo a concentração fisiológica do sódio insuficiente para neutralizar o sistema
,
foi utilizada uma concentração superior para que a carga final do sistema
fosse
de
0
e. As
4843 moléculas de água foram fixadas com SETTLE. O sistema contém 30609 átomos com
massa total 181318 u.m.a. e 67666 graus de liberdade. As dimensões da caixa inicial foram
60Å x 60Å x 80Å.
Para
simulação de membranas, a área por lipídio deve ser observada como critério de
equilibração, e o tempo necessário para estabilizá-la é muito superior ao das médias
termodinâmicas. Como se trata de uma membrana heterogênea, o valor para o qual a área
deve
convergir não está determinado. Quando as interações da membrana estiverem estáveis,
pode
-se esperar que a área por lipídio apresente convergência (independente do valor). Nesse
caso, apenas o tempo de convergência é tomado como parâmetro de equilibração.
Inicialmente foi aplicada ao sistema uma minimização de 1000 passos e em seguida a
membrana foi comprimida sob 50 atm de pressão, com passo de integração de 2 fs, durante
100 ps. O aquecimento do sistema de 0 K a 310 K se deu num intervalo de 3 ns, e a si
mulação
do sistema utilizou
Nosé
-Hoover Langevin Piston para manter constantes a temperatura de
310 K e a pressão de 1 atm. Foram simulados 55 ns, sendo os primeiros 20 ns de equilibração
e os últimos 35 ns de aquisição. Detalhes desta simulação são aprese
ntados na Tabela 4.3.
54
Tabela 4.3.
Parâmetros da Simulação e Composição do Sistema MEM (Membrana em água).
Passo de Integração (ts)
2 fs
Custo Computacional
0,668 dias /ns
Minimização
1000 ts
Pressão
50 atm
Aquecimento
3 ps
Compressão
100 ps
Press
ão
1 atm
Equilibração
20 ns
Aquisição
35 ns
Simulação
55 ns
Passo Interações Elétrostáticas
r > R
c
4 ts
8 fs
Distância Switch
1 nm
Raio de Corte
1,2 nm
Distância da Lista de Vizinhos
1,4 nm
Ciclo da Lista de Vizinhos
10 ts
20 fs
Átomos
30609
Graus de Liberdade
67666
Águas
4843
POPE
96
POPG
32
Água:POPE
50,448
Água:POPG
151,344
Água:Lipídio (total)
37,836
Íons Sódio
40
Íons Cloreto
8
Carga Resultante
0
e
55
4.4.
MEMBRANA + 1 MORICINA (MMRI)
Os sistemas contendo peptídeo no interior da membrana tornam-se mais complexos
desde a preparação. Com a bicamada construída como no sistema MEM, são removidos
alguns lipídios para gerar uma cavidade onde será inserido o peptídeo. Depois da inserção o
sistema é solvatado e ionizado como no sistema MEM
.
Na retirada de lipídios para gerar a lacuna perde-se a proporção 3:1 de POPE para
POPG e a membrana resultante passa a ter 43 POPE e 17 POPG, ou seja, as lâminas não são
mais idênticas. O sistema final possui 4815 moléculas de água fixadas com SETTLE e 7 íons
sódio, a carga resultante é nula. No total são 22651 átomos, o sistema possui 67497 graus de
liberdade com massa igual a 134983 u.m.a..
Inicialmente todos os átomos da moricina foram fixados com
restraints
enquanto os
demais átomos do sistema se ajustaram ao peptídeo num intervalo de 1000 passos de
minimização. Na segunda minimização de 1000 passos, foram mantidos os
restraints
apenas
dos
C
para preservar o esqueleto ou
backbone
da moricina.
O sistema foi aquecido de 0 K a 310 K num intervalo de 6 ps usando um passo de
integração de 2 fs. Esta temperatura de 310 K e a pressão de 1 atm foram controladas com
Nosé
-Hoover Langevin Piston. Foram realizadas ainda duas pré-equilibrações para ajuste do
volume da caixa. Na primeira pré-equilibração que teve duração de 10 ps os C
foram
mantidos fixos e na segunda, que não teve aplicação de restraint
, a duração foi de 20 ps.
Com a temperatura constante a 310 K a membrana foi comprimida durante 500 ps, sob
50 atm de pressão. A simulação foi iniciada a 1 atm, 310 K e passo de integração de 2 fs,
sendo o tempo total de 75 ns. O tempo de equilibração foi de 40 ns e foram simulados mais 35
ns com o sistema equilibrado para aquisição. Detalhes desta simulação são apresentados na
Tabela 4.4.
56
Tabela 4.4.
Parâm
etros da Simulação e Composição do Sistema MMRI (1 Moricina, Membrana).
Passo de Integração (ts)
2 fs
Custo Computacional
0,868 dias/ns
Minimização (restraint proteína)
1000 ts
Minimização (restraint
C )
1000 ts
Aquecimento
6 ps
Pré
-
Equilibração (
C
f
ixo)
10 ps
Pré
-
Equilibração (sem restraint)
20 ps
Compressão (50 atm)
500 ps
Pressão
1 atm
Equilibração
40 ns
Aquisição
35 ns
Simulação
75 ns
Passo Interações Elétrostáticas
r > R
c
4 ts
8 fs
Distância Switch
1 nm
Raio de Corte
1,2 nm
Distância
da Lista de Vizinhos
1,4 nm
Ciclo da Lista de Vizinhos
10 ts
20 fs
Átomos
22651
Graus de Liberdade
67497
Águas
4815
Moricinas
1
POPE
43
POPG
17
Água:POPE
111,977
Água:POPG
283,235
Água:Lipídio (total)
80,25
Íons Sódio
7
Carga Resultante
0
e
57
4.5.
MEMBRANA + 6 MORICINAS (CANAL)
A moricina é um peptídeo carregado que contém resíduos hidrofílicos e hidrofóbicos
orientados em sentidos opostos, originando um anfífilo facial. A análise por Helical Wheel
[81]
da moricina dá uma visão axial do peptídeo e é apresentada na
Figura
4.2.. Nela observa-
se
que a maioria dos aminoácidos polares ocupa 120º, sendo que os não-polares ocupam os 240º
restantes. Para minimizar o contato desfavorável entre a porção polar da moricina e o interior
hidrofóbico da bicamada lipídica o melhor ajuste foi obtido com um feixe de 6 peptídeos, o
que foi determinante na escolha do hexâmero. Os resíduos hidrofílicos ficam voltados para o
interior do canal e os hidrofóbicos para a parte externa deste.
A construção e simulação deste sistema se assemelham ao item anterior (MMRI) e
assim como no sistema anterior a proporção 3:1 entre POPE e POPG foi alterada com a
retirada de lipídios para inserção de 6 moricinas. A membrana é composta por 122 POPE e 40
POPG, foram adicionadas 17165 moléculas de água para solvatar a membrana, além de 49
íons sódio e 69 cloretos. A concentração do ânion é equivalente a 0,159 mol/l,
aproximadamente a concentração fisiológica de 0,147 mol/l
[83]
. A concentração do cátion é
0,223 mol/l, superior a concentração fisiológica de 0,114 mol/l
[83]
, pois esta não seria
suficiente neutralizar o sistema. A massa total é de 457142 u.m.a., são 75995 átomos e
162060 graus de liberdade. As dimensões da caixa inicial foram 90Å x 90Å x 90Å.
Antes da simulação o sistema passou por uma minimização de 1000 passos com todos
os átomos das proteínas fixados por
restraints
, e uma segunda minimização onde apenas os
C
foram mantidos fixos, também com duração de 1000 passos.
O aquecimento do
sistema de
0 K a 310 K se deu num intervalo de 6 ps, com um passo de integração de 2 fs. Esta
temperatura de 310 K e a pressão de 1 atm foram controladas com
Nosé
-Hoover Langevin
Piston
.
Nessas condições o sistema foi pré-equilibrado durante 10 ps mantendo os C
fixos.
Em seguida foram liberados os
restraints
dos C
e todos os átomos do sistema passaram por
uma segunda pré-equilibração de 20 ps. O sistema foi então comprimido sob uma pressão de
50 atm durante 1 ns. O tempo total da simulação foi de 110 ns, sendo 80 ns para equilibração
e 30
ns
pa
ra aquisição.
Na Tabela 4.5. são apresentados detalhes desta simulação.
58
Tabela 4.5.
Parâmetros da Simulação e Composição do Sistema CANAL (6 Moricinas, Membrana).
Passo de Integração (ts)
2 fs
Custo Computacional
1,972 dias/ns
Minimização (restraint
proteínas)
1000 ts
Minimização (restraint
C )
1000 ts
Aquecimento
6 ps
Pré
-
Equilibração (
C
fixo)
10 ps
Pré
-
Equilibração (sem restraint)
20 ps
Compressão (50 atm)
1 ns
Pressão
1 atm
Equilibração
80 ns
Aquisição
30 ns
Simulação
110 ns
Passo Intera
ções Elétrostáticas
r > R
c
4 ts
8 fs
Distância Switch
1 nm
Raio de Corte
1,2 nm
Distância da Lista de Vizinhos
1,4 nm
Ciclo da Lista de Vizinhos
10 ts
20 fs
Átomos
75995
Graus de Liberdade
162060
Águas
17165
Moricinas
6
POPE
122
POPG
40
Água
:POPE
140,697
Água:POPG
429,125
Água:Lipídio (total)
105,957
Íons Sódio
49
Íons Cloreto
69
Carga Resultante
0
e
59
5.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados serão apresentados e discutidos individualmente para cada sistema.
Inicialmente, são descritas as análises aplicadas aos sistemas, bem como o tipo de resultado
esperado de cada uma.
a.
ÁREA
Como já foi mencionado os lipídios têm uma área superficial fixa, determinada
principalmente pela cabeça polar. Em simulações de membranas quando o sistema est
á
equilibrado a área da bicamada tende a ficar constante, e por isso é considerada parâmetro de
equilibração. Também foi citado o fato de a membrana estudada não ser homogênea e, nesse
caso, ainda não há um valor experimentalmente determinado para cada lipídio. Assim, a
evolução desta área ao longo da simulação é usada para conhecer o tempo necessário para a
convergência, independente do valor da área.
Com base no processo de construção, uma bicamada com 2n lipídios é composta de
duas lâminas, cada uma com n moléculas. Se o número de lipídios retirados para inserção de
peptídeos no interior da membrana for 2k, cada camada permanece com (n-k) moléculas, e a
membrana com 2(n-k). Por isso, a área estimada por fosfolipídio é a área total da membrana
no plano xy
da caixa dividida pelo número de lipídios de uma lâmina.
60
b.
FUNÇÃO DE DISTRIBUIÇÃO RADIAL
Uma Função de Distribuição Radial
[63]
(
g(r)
ou
FDR
) expressa a probabilidade de
encontrar uma partícula j, a uma distância r da partícula i. Para um sistema no qual as
partículas (átomos) apresentem uma distribuição completamente aleatória no ensemble NVT,
mantendo a densidade
constante, a g(r) pode ser escrita como:
2
2
i j ij
i j i i j i
V
g r r r r r r
N
(62)
A FDR verifica, para cada distância r, as
moléculas
presen
tes numa casca esférica de
espessura
dr
(Figura 5
.1.).
Quando as interações
são truncadas no Raio de Corte (
R
c
), a g(r) só deve
ser considerada para distâncias r
R
c
. Quando há
uma regularidade na distribuição dos átomos,
como na formação de camadas de solvatação, a
FDR apresenta máximos e mínimos definidos,
indicando as distâncias de maior e menor
probabilidade de encontrar os átomos. Dessa
forma pode ser usada para uma melhor
compreensão da estruturação do sistema.
A integral de uma g(r), por sua vez, dá
o número de átomos encontrados até a distância
r a partir do átomo de referência. Esta função pode ser escrita como:
2
0
4
c
ij
R
r
G g r r dr
(63)
Assim, é possível obter o número de átomos na primeira camada de solvatação, e,
dependendo do grau de estruturação do sistema, da segunda. De qualquer modo, os dados da
primeira camada são os mais relevantes. A partir desses é que se pode determinar o número de
átomos coordenados ao átomo de referencia, a distância e o número de átomos mais
próximos. As FDRs foram calculadas com o software VMD.
Figura 5.1
. Definição do raio e do
elemento de volume para RDF.
61
c.
PERFIL DE DENSIDADE
DE MASSA
Através de uma varredura ao longo do eixo z (Normal da membrana), é detectado o
número de elétrons pertencentes a uma dada molécula. O mapeamento desses elétrons gera
um Perfil de Densidade Eletrônica
[84]
(PDE). Outra alternativa é identificar a quantidade de
massa dessas moléculas em cada ponto, cujo mapeamento gera um Perfil de Densidade de
Massa (PDM). Ambas as análises fornecem as mesmas informações e por este trabalho tratar
de simu
lações de Dinâmica Molecular, é mais coerente falar em PDM.
Qualquer um desses métodos pode ser usado na determinação da posição, com relação
à Normal da membrana, das diversas moléculas que fazem parte do sistema. Dessa forma
podemos determinar a região ocupada pelo solvente, a região ocupada pela membrana, a
posição dos íons e a posição de cada resíduo da moricina no interior da membrana.
Com a sobreposição desses perfis pode-se observar, por exemplo, a interface entre a
membrana e o solvente, bem como a altura da membrana e a posição de cada molécula do
sistema em relação à bicamada. Também é possível localizar qualquer molécula no interior da
bicamada, como os resíduos do peptídeo na região de maior fluidez ou na região das cabeças
polares onde ocorre a
ancoragem deste.
Para delimitar a interface água
membrana (
IW
) é tomado o intervalo no qual a
densidade da água varia entre 90% e 10% em relação à região ocupada pelo solvente. A
distância de repetição ou altura da bicamada (d) é a distância entre os pontos de intersecção
dos PDMs da água e da membrana. Aproximadamente na metade deste comprimento fica a
região de maior fluidez da bicamada, que apresenta a menor densidade do sistema. Os PDMs
foram gerados usando programas próprios a partir da análise das t
rajetórias.
62
d.
PARÂMETRO DE ORDEM
O Parâmetro de Ordem
[49],[85]
(O.P.) é um parâmetro normalizado que indica o grau de
ordenamento do sistema. Quanto mais próximo de 0 (zero), menor o alinhamento das cadeias
alifáticas
. O valor para o estado ordenado absoluto é 1.
[85]
Neste trabalho o parâmetro é
calculado para as cadeias hidrofóbicas dos fosfolipídios POPE e POPG, sem distinção. E
ssas
cadeias são derivadas dos ácidos palmítico e oléico (Figuras 2
.1
. e 2
.2
.). A expressão usada
para calculo do Parâ
metro de Ordem é
dada pela equação (64)
:
[11]
2
1
3cos 1
2
i i
S
(64)
Sendo
i
o ângulo entre o eixo molecular i e a Normal à bicamada. Os brakets denotam uma
média de ensemble. O eixo molecular para a i-ésima unidade de CH
2
é definido pelo veto
r
que une os carbonos (
i-1
) e (
i
+1),
conforme Figura
5.2.
Para calcular o valor médio do parâmetro de ordem de uma cadeia são considerados os
carbonos, do 4º ao penúltimo.
[10]
O arquivo utilizado para calcular os parâmetros de ordem foi
executado no softwa
re VMD.
R`
R``
i
(i-1 )
(i+ 1 )
eixo i
Figura 5.2
. Definição do eixo molecular
i
e da Normal da Membrana.
63
e.
ESTRUTURA SECUNDÁRIA
A Definição da Estrutura Secundária de uma Proteína (
DESP
ou
DSSP
Definition of
secondary structure of proteins) é baseada no dobramento da cadeia, conforme explicado no
capítulo 2.
[47]
Com o
stride
(ferramenta do software VMD), pode-se ter acesso à estrutura
assumida pela proteína de ponta a ponta da cadeia de aminoácidos, para cada passo do
arquivo de trajetórias.
Para um sistema equilibrado não deve haver mudanças significativas na
estrutura.
A moricina é majoritari
amente
-
hélice.
Quando uma seqüência de aminoácidos não
apresentar integridade de hélice, a ocorrência de n-
turns
será identificada pela cor verde.
Quando formar uma -hélice (3-
turn
), será indicada pela cor púrpura. Se houver formação de
-hélice (5-
turn
), esta será indicada em vermelho. As alças (
coil
) que conectam duas
estruturas são indicadas pela branca.
f.
RAIO INTERNO DO PORO
Apenas para o sistema que contém o hexâmero será apresentada uma última analise,
que corresponde a uma medida do raio interno do canal feita com o software HOLE
[86],[87]
. O
algoritmo utiliza Monte Carlo Simulated Annealing para determinar o volume e a forma do
poro através do preenchimento do interior deste com esferas de raios variados.
64
g.
RAMACHANDRAN
O Diagrama
de Ramachandran
[2]
(
Figura
5
.3
.) mostra as configurações permitidas para
a espinha dorsal (
backbone
) da proteína. No Capítulo 2, a Figura 2.10. mostra as definições
dos ângulos
e . As regiões em azul do Diagrama de Ramachandran são os valores
permiti
dos de
e
para qualquer resíduo. Os aminoácidos Gly e Pro são exceções, pois
devido às particularidades de suas cadeias laterais (Figura 2.5.) podem ocupar outras regiões
do diagrama.
No primeiro quadrante a região indicada por
L
, em torno de (70°, 70
°), corresponde a
uma
-hélice para a esquerda, em sentido horário, de rara ocorrência. A região indicada por
,
em torno de (-
70°,
-50°), corresponde a valores de
e
característicos de -hélice para a
direita, em sentido anti
-
horário, mais comum.
No segundo quadrante em azul está a região correspondente às folhas- . A região em
torno de (-150°, 150°), indicada por
ap
, é relativa a folhas antiparalelas. Em torno de (-
120°,
90°), na região marcada com
p
, às folhas
-
paralelas.
Existe ainda uma região indicada por C, aproximadamente a (-70°, 150°), referente a
uma hélice de colágeno. Esta se deve a ligações de hidrogênio entre duas cadeias de
aminoácidos (como por exemplo, o DNA). Sendo a moricina um peptídeo pequeno, a
formação dessa estrutura é inviáve
l.
Figura 5
.3.
Diagrama de Ramachandran.
65
5.1
MORICINA
(MRI)
Neste sistema, a moricina é simulada em vácuo por 2 nanosegundos (ns) e para as
análises da estrutura secundária foi utilizado o último ns. A Figura 5.1.1. apresenta o peptídeo
ao final da simulação. Pode-se observar que a integridade da -hélice não é conservada. Por
se tratar de um peptídeo catiônico, os resíduos polares e carregados tendem a se aproximar
para estabilizar suas cargas. Para obter uma configuração mais adequada, a cadeia peptídica se
dobra e a -hélice é parcialmente desfeita. Nestes pontos o raio da hélice é alterado e
aparecem
turns
(voltas) e
coils
(alças).
A Figura 5
.1.
2. mostra a evolução temporal da estrutura secundária (DESP) deste
sistema. Em geral, nas análises estruturais os 5 resíduos terminais de cada lado da cadeia
peptídica são desconsiderados. Entretanto, como a moricina é um peptídeo pequeno todos os
resíduos serão discutidos. Nesta figura pode-se ver que na maior parte do tempo os 2 resíduos
terminais de cada extremidade não mantêm a estrutura -
hélic
e e formam
coils
. Ao contrário
dos
turns
,
os
coils
são
fragmentos de curvas que
não
têm
uma estrutura regular, sendo
detectados quando o espiral se desenrola e a seqüência de aminoácidos assume curvaturas
irregulares. Os
turns
são as voltas com raios variados, que podem permanecer isolados.
Quando alinhados, suas repetições podem constituir hélices (
;
; 3
-
10).
Figura 5
.1.
1.
Estrutura da Moricina após 2 ns de simulação no vácuo.
66
Na
s Figuras 5
.1
.1. e 5.1.2. as -hélices (em púrpura) aparecem intercaladas com
turns
(em ciano), e os pontos nos quais a moricina se dobra são caracterizados como
coils
(em
branco). Estes resíduos que perdem a configuração conectam os do
mínios
que preservam
estrutura (
turns
ou hélices). Esses aspectos são confirmados com a observação da Figura
5
.1.3.
, que mostra o Diagrama de Ramachandran com as configurações da moricina
acumuladas ao longo de 1 ns. Nesta figura, os valores de
e
que apresentam maior
população são característicos de -hélice. Os aminoácidos que se dispõem como
coil
s podem
assumir valores de
e
não convencionais, proibidos par
a
domínios que assumam
estruturas
secundárias definidas como hélices ou folhas- . Os
turns
têm maior restrição para esses
ângulos
e
em função da curvatura da cadeia peptídica aparecem na região de -
hélice
n
o
Diagrama de Ramachandran.
Assim,
pode
-se atribu
ir
aos
coils
a
reduzida
oc
orrência em regiões incomuns e a
os
turns
e -hélices a ocorrência majoritária no terceiro quadrante do Diagrama de
Ramachandran
da Figura 5
.1.3..
Cabe ainda salientar que a população sobre os eixos,
cujos
valores
corresponde
m a zero graus para
ou , deve-
se
às particularidades da cadeia lateral
da
Glicina
que é composta
apenas
de
um hidrogênio.
67
Figura
5
.1.
2.
Evolução temporal (1 ns) da DESP da Moricina no vácuo (MRI):
-
hélice
;
turn
,
coil
.
68
Figura
5.1.3
.
Diagrama de Ramachandran das configurações acumuladas da Moricina em vácuo (1 ns).
69
5.2
MORI
CINA + ÁGUA (WMRI)
Este sistema contém a moricina solvatada em água e neutralizada com 10 cloretos. O
mesmo foi simulado durante 1,4 ns. O intervalo usado nas análises de estrutura secundária foi
de 1 ns. As duas análises, DESP e Ramachandran, são complementares e por isso as
discussões são apresentadas simultaneamente. A Figura 5.2.1. mostra a moricina ao final da
simulação, c
om a
-
hélice praticamente intacta.
Na Figura 5.2.2. é apresentada a evolução temporal da estrutura secundária na análise
de DESP, que mostra a preservação da -hélice (em púrpura, entre os resíduos 3 e 35) com
variações insignificantes. As forças que atraíam os resíduos causando o dobramento do
peptídeo no primeiro sistema são amenizadas com a
solvatação
e
a hélice é estabilizada.
As
Figura
s 5
.2.
1 e 5.2.2
.
mostram a formação de
coils
apenas
nos resíduos
terminais
1;
2; 41 e 42. Além destes, o resíduo 36 faz a conexão da -hélice com um
turn
.
Os
resíduos
terminais têm maior liberdade de movimento que os do interior da cadeia e dificilmente retêm
um
a configuração.
A Figura 5.2.3. mostra o Diagrama de Ramachandran da moricina neste sistema com
as configuraç
ões acumuladas ao longo de 1 ns. A região mais populosa do Diagrama continua
Figura
5.2
.1.
Estrutura da Moricina após 1,4 ns de simulação em água com contra
-
íons.
70
sendo o terceiro quadrante, com ângulos característicos de
-
hélice e quase sem ocorrência de
ângulos proibidos. Essas observações permitem dizer que não há quebras na estrutura da
cadeia como verificado com o peptídeo no vácuo.
A
-hélice foi definida anteriormente no Capítulo 2. Sua formação instantânea pode
ser observada na Figura 5
.2.
2., no intervalo em vermelho entre os resíduos 10 e 16. Há uma
ligeira oscilação de -
hélice
para -hélice e
turn
devido a variações no raio das voltas
(espiral), o que não é necessariamente perda de configuração. Esse argumento pode ser
sustentado com a Figura 2.10.. Os ângulos
e
detectados estão próximos dos valores
característicos de -
hél
ice sem grandes variações. Neste sistema também são registradas
Glicinas (GLY) sobre os eixos do Diagrama.
A moricina é instável no vácuo por ser um peptídeo do tipo -hélice e catiônico. A
integridade da estrutura secundária é preservada quando solvatada, uma vez que as cargas são
estabilizadas. Por DESP (Figura 5.2.2.) pode-se ver que 33 dos 42 resíduos da moricina
formam a estrutura majoritária, ficando plenamente de acordo com o Diagrama de
Ramachandran (Figura 5.2.3.), segundo o qual a população se concentra em região -
hélice.
Apenas nas extremidades da cadeia peptídica, que podem ser desconsideradas, a moricina
apresentou domínios desestruturados.
71
Figura
5.2.2
.
Evolução temporal (1 ns) DESP da Moricina em água (WMRI):
-
hélice
;
-
hélice
;
turn
,
coil
.
72
F
igura 5.2.3
.
Diagrama de Ramachandran da Moricina em água (WMRI), com as configurações de 1 ns acumu
ladas.
73
5.3
MEMBRANA (MEM)
Este sistema é composto por uma bicamada lipídica
hidratada, formada por
96 POPE e
32 POPG (são 64 lipídios em cada lâmina), com
48
íons
(40 cátions sódio e 8 ânions cloreto)
que neutralizam as cargas do POPG (a membrana
possui uma
carga
de
-
32
e
).
Foram simulados 55 ns. Como a área por lipídio usada como critério de equilibração
não converge rapidamente, foram feitas análises a cada 10 ns de cálculo com o sistema
equilibrado,
em intervalos de 2 ns defin
idos
na Tabela 5
.
3.
Tabela
5.3. Propriedades do sistema MEM analisadas em 4 intervalos de tempo (I): A
P
(área/Lipídio); D
P
(distância P
P);
D
SP
(distância no fim da primeira camada de solvatação P
P); n
P
(número de lipídios vizinhos); D
OH
(distância P
OH); D
SW
(distância no fim da
primeira camada de solvatação P
OH); n
W
(número de águas coordenadas); d (distância de
repetição da bicamada); IW (dimensão da interface água
membrana); P.O. (parâmetro de
ordem)
.
Propriedade
MEM 2
MEM 3
MEM 4
MEM 5
I (ns)
20 22
30 32
40 42
50 52
A
P
(Å
2
)
49,9 ± 0,4
48,7 ± 0,3
49,5 ± 0,6
49,2 ± 0,2
D
P
(Å)
5,6
5,5
5,5
5,7
D
SP
7,2
7,2
7,2
7,2
n
P
1,3
1,3
1,3
1,3
D
OH
(Å)
3,8
3,8
3,8
3,8
D
SW
4,6
4,6
4,6
4,6
n
W
6,3
6,3
6,3
6,3
d (Å)
50
51
50
50
IW (Å)
8,6
7,5
8,3
8,5
P.
O.
Palmitoil
0,33 ± 0,04
0,34 ± 0,04
0,33 ± 0,04
0,32 ± 0,04
P.
O.
Oleil
0,23 ± 0,1
0,26 ± 0,07
0,23 ± 0,09
0,23 ± 0,09
Tam
bém
são
apresentadas nesta tabela
as médias da área
por lipídio em cada intervalo
.
A área calculada ao longo de toda a simulação é apresentada na Figura 5.3.1.. Depois de 20 ns
a mesma converge para 49,1
±
0,7
Å
2
. E
sta área apresenta uma queda moderada
no
período de
equilibração e a partir do vigésimo nanosegundo começa a convergir. Antes de 20 ns o
comportamento do sistema é diferente do observado para o sistema equilibrado. São
74
apresentados os resultados apenas do sistema equilibrado, segundo os intervalos da Tabela
5.3..
A partir da FDR P
P pode-se obter a distância mais provável entre dois fosfolipídios
vizinhos,
D
P
, que corresponde ao primeiro máximo desta função. O número de lipídios da
primeira camada de solvatação, n
P
, é determinado pela integral da g(r) para a distância do
primeiro mínimo, D
SP
,
que
corresponde ao final da primeira camada de solvatação na Figura
5.3.3.. A distância entre o fósforo e as moléculas de água coordenadas à cabeça polar é
determinada pelo primeiro máximo da FDR P
OH, D
OH
, e o número de moléculas de água
coordenadas, n
W
, é calculado pela integral da g(r) até o final da primeira camada de
solvatação, distância do primeiro mínimo, D
SW
. Esses dados são indicados na Tabela 5.3. Os
átomos de fósforo utilizados para as análises são do total que compõe a membrana. Foram
utilizados os fósforos do POPE e do POPG, sem distinção.
A área superficial da membrana é determinada pela separação dos lipídios. Com o
sistema equilibrado, as distâncias P
P apresentam pequenas variações que podem ser vistas
com a sobreposição das FDRs para os 4 intervalos analisados, na Figura 5.3.2.. O valor obtido
para o final da primeira camada de solvatação foi 7,2 Å, coerente com a literatura
[10]
que
ÁREA POR LIPÍDIO - MEM
40
45
50
55
60
0
10 20
30 40 50
60
t ( ns )
A ( Å^2 )
Figura
5
.3.1
. Evolução temporal da área por fosfolipídio para o sistema MEM.
75
apresenta valores calculados de 7 Å. O número de fosfolipídios correspondentes à primeira
camada foi de 1,3.
RDF P-OH
0
1
2
3
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12
r / angstron
g (r)
MEM2 P-OH
MEM3 P-OH
MEM4 P-OH
MEM5 P-OH
Figura
5
.3.3.
FDR P
OH para o sistema MEM (a partir de 20 ns).
RDF P-P
0
1
2
3
4
5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
11
12
r / angstron
g (r)
MEM2 P-P
MEM3 P-P
MEM4 P-P
MEM5 P-P
Figura
5
.3.2.
FDR P
P para o sistema MEM (a partir de 20 n
s).
76
Na Figura 5.3.3. são apresentadas as g(r) fósforo
água. Comparando-se as FDRs P
OH dos 4 intervalos, pode-se ver que a sobreposição é maior que para as g(r) P
P. As
interações da cabeça polar com as moléculas de água não são afetadas, a primeira camada de
solvatação tem o mesmo perfil em cada intervalo. Logo, as distâncias e o número de águas
coordenadas à cabeça polar
não se modificam.
A altura da membrana ou distância de repetição da bicamada
, d, bem como a dimensão
da interface água
membrana, IW, são obtidas a partir dos PDMs. Esses valores são
apresentados na Tabela 5.3. Como a variação nos perfis de densidade de massa para o sistema
equilibrado não é significativa, apenas o PDM do último intervalo é apresentado na Figura
5.3.4.
Os perfis de densidade de massa apontam a posição de uma molécula em relação ao
eixo z (Normal da membrana). Como se pode observar na Figura 5.3.4, a densidade da
membrana
está
entre
-
25Å e + 25Å. Nesses 50Å que c
orrespondem à distância de repetição da
bicamada lipídica, os perfis do sódio, do cloreto e da água são nulos, o que permite afirmar
que não há moléculas de água ou íons no interior da membrana.
Figura
5
.3.
4.
PDM do sistema MEM (intervalo 1).
MEM 5
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
-50 -40 -30 -20 -10
0
10
20
30
40 50
z / angstron
EDP
POPE
POPG
água
Na
Cl
MEMBRANA
TOTAL
77
Na região das cabeças polares, onde o perfil de densidade da membrana apresenta seu
máximo, começam a aparecer moléculas de água na interface água
membrana, assim como
os íons sódio que se concentram nessa altura devido às interações eletrostáticas entre as
cabeças polares aniônicas e esses cátions. O PDM dos ânions indica que estes estão dispersos
em água, não concentrados próximos às cabeças polares, e apresentam densidade eletrônica
menor que a do sódio (são apenas 8 cloretos contra 40 sódios). Os valores referentes aos íons
foram multiplicados por 10 para melh
orar a visualização.
As densidades do POPE e do POPG são somadas, e se obtém o perfil de densidade de
massa da membrana; os valores de PDM para o POPG são menores em relação aos do POPE,
pois aqueles estão em número menor na membrana. No PDM TOTAL foram somados os
perfis de densidade da membrana e da água. A região de menor densidade do sistema fica no
centro da membrana. Esta região também apresenta a maior fluidez, devido à grande
mobilidade das terminações das cadeias alifáticas.
Os Parâmetros de Ordem (P.O.) das cadeias de Palmitoil (16 carbonos, saturada) e
Oleil (18 carbonos, insaturação no carbono 9) dos quatro intervalos são
mostrados nas
Figuras
5
.3.
5 e 5
.3.
6 respectivamente. As médias apresentadas na Tabela 5.3 são calculadas a partir
dos parâmetro
s dos carbonos 4 a 15 para o palmitoil, e 4 a 17 para o
oleil
.
[10]
De acordo com a
definição, quanto maior o alinhamento dos carbonos na cadeia, maior o parâmetro de ordem.
Partindo deste princípio, a diminuição da área da membrana sugere uma proximidade
maior entre os lipídios restringindo a movimentação das cadeias alifáticas, podendo ser
relacionado com o aumento da ordem do sistema. Da mesma forma o aumento da área confere
maior mobilidade às cadeias, e o parâmetro de ordem
deve diminuir.
As análises realizadas com o sistema equilibrado em 4 intervalos mostram que os
parâmetros de ordem seguem a tendência descrita acima. Assim como as variações da área, os
valores dos P.O. apresentam uma pequena oscilação. As cadeias saturadas permitem um
empacotamento maior, enquanto as insaturadas, cuja dupla ligação tem configuração
cis
,
dificultam esse ajuste. O efeito da redução da área é maior para as cadeias oleil. Os valores
encontrados na literatura para POPE são 0,30 ± 0,1 para palmitoil e 0,39 ± 0,1 para oleil.
[10]
Para POPG os valores são de 0,35 ± 0,1 para palmitoil e 0,45 ± 0,1 para oleil.
A Figura 5.3.7. mostra o sistema MEM ao final dos 55 ns de simulação.
78
Parâmetro de Ordem MEM (Oleil)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 2 4 6 8
10
12 14
16 18
20
Carbono
Parâmetro de Ordem
MEM 2
MEM 3
MEM 4
MEM 5
Figura
5
.3.
6.
Parâmetro de Ordem do Palmitoil, sistema MEM.
Parâmetro de Ordem MEM (palmitoil)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 2 4 6 8
10 12
14
16
18
Carbono
Parâmetro de Ordem
MEM 2
MEM 3
MEM 4
MEM 5
Figura
5
.3.
5.
Parâmetro de Ordem do Palmitoil, sistema MEM.
79
Figura
5
.3.7.
Sistema MEM a
pós 55 ns de simulação.
80
5.4
MEMBRANA + 1 MORICINA (MMRI)
A partir deste sistema começam a ser avaliados os efeitos da moricina na bicamada,
analisando as alterações na estrutura da moricina com base nos sistemas MRI e WMRI, além
das modificações na membrana em comparação com o sistema MEM. O tempo total de
simulação foi de 75 ns. A convergência da área e, consequëntemente, a equilibração desta
bicamada é mais lenta se comparada ao sistema anterior. A evolução temporal da área por
lipídio ao longo de toda a simulação é apresentada na Figura 5.4.1.. Em função dos declínios
da área foram considerados para análise ap
enas os dados a partir de 40 ns.
Com relação aos efeitos da proteína no interior da membrana, no sistema MEM foi
simulada uma membrana de mesma composição (POPE 3:1 POPG), sem peptídeo inserido. A
área converge logo após 20 ns de cálculo (Figura 5.3.1.). Neste sistema (MMRI), após 60 ns
de cálculo a área volta a apresentar variações. Para o sistema anterior (MEM), a maior
diferença verificada entre as áreas calculadas nos intervalos foi de 1,2 Å
2
; para o sistema atual
chega a 4,4 Å
2
(ver Tabela 5.4).
O que se pode perceber é que a membrana continua sendo comprimida, e o ajuste dos
lipídios nesse processo é lento. As variações na área como resultado da mudança de
ÁREA POR LIPÍDIO - MMRI
50
55
60
65
70
0
10 20 30 40 50 60 70 80
t ( ns )
A ( Å^2 )
Figura 5.4
.1
.
Evolução temporal da área por fosfolipídio para o sistema MMRI.
81
configuração dos lipídios aparecem após intervalos nos quais esta se mantém praticamente
estáve
l. A área oscila em torno de 63Å
2
até 35 ns, quando apresenta uma queda e permanece
dos 40 ns aos 62 ns em torno de 59Å
2
. A partir de então há uma nova queda no valor da área
por lipídio que estabiliza aos 65 ns em aproximadamente 56Å
2
. A dificuldade na es
tabilização
da área pode ser percebida com a sobreposição das FDRs P
P de cada intervalo, apresentada
na Figura 5.4.2. Como a área varia com a movimentação dos lipídios, a g(r) reflete o
comportamento das cabeças polares no intervalo, e há uma sensível alteração no perfil dessas
funções. As distâncias P
P registradas (nos intervalos de 2 ns) estão relacionadas na Tabela
5.4..
Tabela
5.
4.
Propriedades do sistema MM
RI
analisadas em 4 intervalos de tempo (I): A
P
(área/Lipídio); D
P
(distância P
P);
D
SP
(distância no fim da primeira camada de solvatação P
P); n
P
(número de lipídios vizinhos); D
OH
(distância P
OH); D
SW
(distância no fim da
primeira camada de solvatação P
OH); (n
W
(número de águas coordenadas); d (distância de
repetição da bicamada); IW (dimensão da interface água
membrana); P.O. (parâmetro de
ordem)
.
Propriedade
MMRI 4
MMRI 5
MMRI 6
MMRI 7
I (ns)
40 42
50 52
60 62
70 72
A
P
(Å
2
)
59,0 ± 0,6
60,9 ± 0,7
58,1 ± 0,5
56,5 ± 0,9
D
P
(Å)
5,6
5,7
5,7
5,7
D
SP
6,9
7,4
7,0
7,0
n
P
0,8
1,1
0,7
0,9
D
OH
(Å)
3,8
3,8
3,8
3,8
D
SW
4,5
4,5
4,5
4,5
n
W
4,7
4,7
4,7
4,7
d (Å)
45
45
47
48.5
IW (Å)
10,5
9,5
10
10
P.
O.
Palmitoil
0,25 ± 0,05
0,23 ± 0,03
0,24 ± 0,03
0,25 ± 0,04
P.
O.
Oleil
0,17 ± 0,08
0,18 ± 0,04
0,19 ± 0,04
0,21 ± 0,04
No sistema anterior a área converge para 49,1 Å
2
; utilizando-se a área do intervalo
MMRI 7 para comparação, houve um aumento de 7,4 Å
2
por lipídio. Numa bicamada com 30
lipídios em cada lâmina corresponde a um aumento de 222 Å
2
na área desta membrana. Cabe
lem
brar que a área por lipídio foi calculada dividindo-se a área total da caixa (em xy) pelo
82
número de lipídios de cada lâmina, o que inclui a área ocupada pela moricina. Parte do
acréscimo na área calculada aqui se deve, portanto, à área ocupada pelo peptídeo dentro da
membrana. Se o raio da cavidade onde a moricina se encontra for menor que 8,4 Å (que
corresponde à área de 222 Å
2
), a diferença citada acima representa um aumento na área por
lipídio.
A evolução das distâncias P
P mostra que para o intervalo MMRI 5 (Figura 5.4.2.),
no qual a área por lipídio é maior, há um aumento na separação entre as cabeças polares. Para
o intervalo MMRI 7 (menor área por lipídio) há um aumento no número de lipídios na
primeira camada de solvatação em relação ao intervalo MMRI 6. Em relação ao sistema
anterior (MEM) foi observada uma redução nesse número, uma vez que para as mesmas
distâncias P
P as integrais do sistema MEM apresentam maior número de moléculas. Pode-
se considerar então que há um aumento na área por lipídio
.
Para as g(r) P
OH, a Figura 5.4.3. mostra a sobreposição das funções de todos os
intervalos. As variações da área, que afetam as distâncias P
P, não modificam as interações
das cabeças polares com as moléculas de água. A distância de 4,5 Å para a primeira camada
de solvatação é a mesma para o sistema MEM, com uma pequena redução no número de
moléculas coordenadas.
RDF P-P
0
1
2
3
4
5
6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12
r / angstron
g (r)
MMRI 4
MMRI 5
MMRI 6
MMRI 7
Figura
5
.4.2.
FDR P
-
P para o sistema MMRI (a partir de 40 ns).
83
A Figura 5.4.4. mostra os PDMs deste sistema para o intervalo MMRI 6. A Figura
5.4.5. mostra os PDMs da água no interior da membrana para os 4 intervalos, com alguns
RDF P-OH
0
1
2
3
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12
r / angstron
g (r)
MMRI 4
MMRI 5
MMRI 6
MMRI 7
Figura
5
.
4.3
.
FDR P
-
OH para o sistema MMRI (a partir de 40 ns).
Figura
5
.4.4.
PDM do intervalo MMRI 6 (60
62 ns).
MMRI 6
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
-50 -40 -30 -20 -10
0
10 20
30
40 50
z / angstron
EDP
POPE
POPG
água
Na
MEMBRANA
TOTAL
84
resíduos da moricina identificados. Os dados da altura da bicamada e dimensão da interface
água
-membrana são apresentados na Tabela 5.4. Estes apontam um pequeno aumento na
distância de repetição da membrana. Como a área (xy) está diminuindo, essa modificação é
previsível. Quanto à interface água-membrana, as variações não são significativas, o que está
de acordo com as FDRs P
OH que já indicaram que as interações das cabeças polares com a
água não foram afetadas pelas tr
ansformações na área da membrana.
Como esta membrana não possui as duas lâminas idênticas, pois embora ambas
possuam 30 lipídios cada, uma apresenta 21 POPE e 9 POPG e a outra 22 POPE e 8 POPG,
os perfis dos lipídios não são simétricos com relação ao centro da membrana (z=0). O PDM
total da membrana, por se tratar da soma desses perfis (POPE + POPG), não apresenta grande
diferença entre as lâminas. O PDM total do sistema, que é a soma das densidades de massa da
membrana e da água, aponta a região de maior d
ensidade como sendo a das cabeças polares, e
de menor densidade o centro da membrana. Conforme comentado para MEM, essa região é a
de maior fluidez, o empacotamento é menor em função da maior mobilidade das terminações
das cadeias alifáticas.
Pela comparação com os PDMs do sistema MEM, verificou-se a diminuição da altura
de repetição da bicamada, o que é coerente com o aumento da área da membrana, bem como
um aumento da interface água-lipídio. Com os lipídios mais afastados, as moléculas de água
penetram
mais na membrana. O mais importante é a detecção de água no interior da
bicamada, o que não foi verificado no sistema anterior, na ausência de peptídeo.
EDP água
0
5
10
15
20
25
30
-40 -30 -20 -10
0
10 20 30 40
z / angstron
EDP
MMRI 4
MMRI 5
MMRI 6
MMRI 7
LYS -7
PHE - 7
THR - 7
Figura
5
.4.5. PDM da água, sistema MMRI (todos os intervalos).
85
Nas Figuras 5.4.6. e 5.4.7. são apresentados os P.O. do sistema MMRI para Palmitoil e
Oleil, respectivamente. As médias de cada intervalo estão na Tabela 5.4. Comparados aos
dados do sistema anterior (MEM), os parâmetros das duas cadeias apresentaram valores
inferiores. Com a inserção da proteína a área por lipídio teve um acréscimo considerável,
conferind
o às cadeias maior mobilidade. Assim, o alinhamento imposto é menor, o que
diminui o parâmetro de ordem e consequentemente o empacotamento dos lipídios.
Parâmetro de Ordem MMRI (palmitoil)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 2 4 6 8
10 12 14 16 18
Carbono
Parâmetro de Ordem
MMRI 4
MMRI 5
MMRI 6
MMRI 7
Figura
5
.4.
6.
Parâmetro de Ordem do Palmitoil, sistema MMRI (todos os intervalos).
Figura
5
.4.
7.
Parâmetr
o de Ordem do Oleil, sistema MMRI (todos os intervalos).
Parâmetro de Ordem MMRI (oleil)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 2 4 6 8
10 12 14 16
18 20
Carbono
Parâmetro de Ordem
MMRI 4
MMRI 5
MMRI 6
MMRI 7
86
Com a presença da moricina houve um aumento na área da membrana, quando
comparado ao sistema anterior, MEM, que não contém peptídeo. Todas as propriedades da
membrana analisadas no sistema MMRI são consistentes com o aumento verificado na área
por lipídio.
Nas análises de estrutura secundária da moricina, para todos os intervalos, as DSSP se
mostram muito semelhantes. Na Figura 5.4.8. é apresentada a DESP do intervalo MMRI 7. A
integridade da -hélice é quebrada nos resíduos terminais (1-2, e 36-42), o que é previsível.
Além desses, também há uma perturbação da estrutura da proteína entre os resíduos 15 a 1
8
(VAL
-
GLY
-
LYS
-GLY). Pelo PDM da Figura 5.4.5., aproximadamente em z = 0Å, a região
da caixa com menor densidade de massa, pode ser identificada em rosa a lisina do resíduo 17.
No vácuo, Figura 5.1.1., a hélice quebra exatamente nos resíduos 17 e 18 form
ando
coil
, e entre 12 e 16 a -hélice se deforma e origina um
turn
. Quando solvatada, a proteína
conserva a -hélice do resíduo 3 ao 35 (Figura 5.2.1.). No sistema MMRI, as hélices
preservadas dos resíduos 3 a 14 e 19 a 35 estão alojadas no interior da membrana em
regiões de maior densidade de massa.
Com relação aos Diagramas de Ramachandran, o máximo de ocorrência para ângulos
característicos de -hélice chega a 5 pontos em todos os intervalos. Em função da grande
semelhança dos Diagramas de cada intervalo, na Figura 5.4.9. são apresentadas as
configurações acumuladas durante o intervalo MMRI 7.
A Figura 5.4.10. apresenta o sistema MMRI ao final dos 75 ns de simulação. Pode-
se
observar a quebra da moricina no interior da membrana, entre resíduos 15 e 18. Nesta Figura
pode
-se distinguir os átomos de fósforo das cabeças polares (na cor ocre), bem como o
peptídeo (colorido conforme a estrutura secundária, coma -hélice em púrpura;
coil
em
branco e
turn
em ciano) no interior da bicamada.
87
Figura
5
.4.8.
DESP do sistema MMRI, entre 70 e 72 ns:
-
hélice
;
-
hélice
;
turn
,
coil
.
88
Figura
5
.4.
9.
Diagrama de Ramachandran do sistema MMRI (configurações acumuladas entre 70 e 72 ns).
89
Figura
5.4.
10
.
Sistema MMRI após
75 ns de simulação.
90
5.5
MEMBRA
NA + 6 MORICINAS (CANAL)
Esse sistema é formado por uma membrana de 122 POPE e 40 POPG, além de 17165
moléculas de água, 49 cloretos e 69 sódios. No interior da membrana foram inseridas 6
moricinas (conforme justificativa do capítulo 4, item 4.5) dispostas como as tabuas de um
barril, formando um poro. Os resíduos polares são orientados para o interior do canal, e os
apolares para os lipídios da membrana, fazendo a ancoragem do canal.
A simulação deste sistema teve duração total de 130 ns, sendo 80 ns
de
equilibração e
50 ns de
aquisiçã
o.
O intervalo usado para as análises corresponde aos últimos 10 ns. A área
por fosfolipídio entre 80 ns e 130 ns é apresentada na Figura 5
.5.1
.. O valor médio obtido foi
de 74,57 ± 0,28 Å
2
,
aproximadamente 25 Å
2
a mais que
no
sistema MEM, que corresponde a
membrana
sem moricina. O sistema MMRI continha 1 peptídeo no interior da membrana e
registrou um aumento de 7,4 Å
2
na área de cada lipídio em relação ao MEM. No CANAL, se
dividirmos o aumento na área pelo número de proteín
as, veremos que cada uma corresponde a
um aumento de menos de 4,2 Å
2
por lipídio, se comparado ao MEM. Isso sugere uma maior
compactação da membrana
com relação ao MMRI
.
ÁREA POR LIPÍDIO - MEM
73
74
75
80 85 90 95
100 105 110
115
120 125 130
t ( ns )
A ( Å^2 )
Figura 5.5
.1
.
Evolução temporal da área por fosfolipídio para o CANAL.
91
As g(r) apresentadas na Figura 5
.5.
2.
mostram que as distâncias P
P e P
OH neste
sistema são aproximadamente as mesmas verificadas nos sistemas anteriores, MEM e MMRI:
5,8 Å para os lipídios vizinhos
;
7,2 Å no final da primeira camada de solvatação; 3,7 Å
para
as
águas coordenadas;
4,5 Å
no final da
primeira camada de solvatação
. Deve
-
se observar que
as interações das cabeças polares com as águas coordenadas não foram modificadas.
A Figura 5
.5.3.
mostra moléculas de água e íons no interior do canal. A Figura 5.5.4.
mostra o PDM do sistema. Os lipídios e as moricinas não são exibido
s
para melhor
visualização do interior do poro. A altura da bicamada para este sistema foi 47,7 Å, bastante
próxima da encontrada para o sistema MMRI, que também apresenta p
eptídeo
no interior da
membrana. No sistema
MEM,
em que foi simulada apenas a membr
ana
, essa altura foi maior
,
de
aproximadamente 50 Å.
Figura 5.5
.2.
FDR P
P e P
OH do CANAL, calculada entre 120 e 130 ns.
RDF P-P
0
1
2
3
4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11
12
r / angstron
g (r)
P-P CANAL
P-OH CANAL
92
Figura 5.5
.3.
Presença de água e íons (cloreto em ve
rde e sódio em amarelo) no interior do poro
formado por 6 moricinas (CANAL).
CANAL
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
-50 -40 -30 -20
-10
0
10
20 30 40
50
z / angstron
EDP
água
Na
Cl
POPE
POPG
MEMBRANA
TOTAL
MORICINA
Figura 5.5
.4.
PDM do CANAL (entre 120 e 130 ns).
93
Com relação aos Parâmetros de Ordem das cadeias alifáticas (Figura 5.5.5.), os valores
obtidos para este sistema foram 0,32 ± 0,03 para Palmitoil e 0,26 ± 0,1 para Oleil; bastante
semelhantes aos parâmetros do sistema MEM, cuja área se manteve estável. As médias
calculadas para o sistema MMRI foram menores, o que pode ser atribuído à área deste, que
apresentou variações mais pronunciadas. As principais diferenças apresentadas com relação
ao sistema MMRI são referentes às propriedades dos lipídios. Assim como as variações da
área, as demais análises são influenciadas pelas movimentações destes.
As
Figuras 5
.5.6.
e
5
.5.
7. apresentam o perfil do raio interno do canal, ao longo da do
eixo z. O cálculo foi feito com o software HOLE
[86],[87]
, conforme o item f deste capítulo. O
raio mínimo
foi de
3,14 Å.
As análises de DESP e Ramachandran da estrutura secundária das moricinas no canal
são apresentadas nas Figuras 5.5.8. e 5.5.9., respectivamente. Na DESP pode ser verificada a
formação de -hélice, quando o número de resíduos num
turn
passa de 3 para 5 com a
formação de ligação de hidrogênio entre
os
resíduos 2 e 7, aumentando o diâmetro da
hélice. Nesse caso, os ângulos
e
são praticamente os mesmos da -hélice e a região
ocupada no Diagrama de Ramachandran continua sendo a mesma.
Parâmetro de Ordem CANAL
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 2 4 6 8
10
12
14 16
18
Carbono
Parâmetro de Ordem
Palmitoil
Oleil
Figura 5.5
.5.
Parâmetros de Ordem para Palmitoil e Oleil, no sistema CANAL.
94
Outra observação é referente aos resíduos 15 a 18, que no sistema MMRI
apresentaram desestruturação da -hélice, quebrando a moricina. Comparando-se as
análises de DESP deste e daquele sistemas percebe-se que a faixa branca, que corresponde a
formação de coil
, não aparece aqui para estes resíduos, e a hélice é conservada. A perda da
estrutura
-hélice ocorre principalmente nos resíduos terminais 40 a 42. Do 1 ao 11 o que se
verifica é a oscilação entre
turn
,
e
-
hélice, com pequenas variações nos ângulos
e
.
Figura 5.5.7.
Preenchimento v
olumétrico do poro, em vermelho, formado por 6 moricinas no
sistema CANAL.
Figura 5.5.6.
Perfil do Raio do Poro do CANAL em Å
2
,
avaliado entre 120 ns e 130 ns.
CANAL
0
5
10
15
20
-50
-40
-30 -20 -10
0
10 20
30 40 50
z / Å
RAIO DO PORO / Å^2
95
Figura
5
.
5.8
.
DESP do sistema CANAL, entre 120 e 130 ns:
-
hélice
;
-
hélice
;
turn
,
coil
.
96
Figura
5
.5.9.
Diagrama de Ramachandran do CANAL, configurações acu
muladas entre 120 e 130 ns.
97
Com a formação do canal, a integridade da -hélice é mantida mesmo na região de
maior fluidez da membrana. A orientação dos resíduos hidrofílicos de todas as moricinas para
o centro do poro estabilizou a estrutura destas. Apenas os resíduos hidrofóbicos estão em
contato com os lipídios. Sem dobramentos das moricinas, a área por lipídio também
apresenta
menor variação.
A permeabilidade da membrana é regulada pela bactéria, permitindo manter o
gradiente eletrolítico estabelecido no interior da célula em relação ao meio. A passagem de
moléculas de água e de íons pela membrana, através do canal, desfaz essa condição e
desestabiliza a célula.
A Figura 5.5.10. mostra uma vista superior (na direção da Normal da membrana) do
sistema CANAL. Nesta imagem foram omitidas as moléculas de água e íons, e pode-
se
observar a disposição das moricinas originando o poro no interior da bicamada.
Figura
5.5.
10
.
Vista superior do sistema CANAL, com os lipídios POPE em verde e POPG em azul.
98
6.
CONCLUSÃO
A partir dos 5 sistemas simulados foi possível verificar a perturbação da membrana
pela moricina, o que valida a metodologia aplicada. Este peptídeo catiônico tem atividade
bactericida constatada
[
71
]
, e segundo os modelos de atuação sugeridos a moricina deve agir
inseri
ndo
-se na membrana bacteriana
[22],[23]
. A permeabilidade da membrana é
regula
da pela
bactéria
a fim de manter o equilíbrio interno da célula. Dessa forma, é possível manter através
da bicamada um gradiente eletrolítico que preserva o microorganismo. Quando a moricina é
inserida na bicamada, provoca um aumento da área por lipídio, o que resulta num aumento da
permeabilidade da membrana.
No sistema contendo uma moricina no vácuo foi observado o dobramento da cadeia
peptídica, com perda da estrutura -
hélice
. Os resíduos carregados não estabilizados se
aproximam, causando a quebra da hélice em vários pontos, originando
turns
e
coils
. Com a
solvatação em água a integridade da hélice é preservada, com perda da estrutura apenas nos
resíduos terminais, o que é
previsível, considerando sua maior mobilidade.
Para a bicamada hidratada sem proteína e com íons, a estabilização é facilmente
atingida após 20 ns de simulação. Este sistema apresenta o maior empacotamento,
correspondendo a menor área por lipídio, ao maior parâmetro de ordem e à maior altura de
repetição.
Com a inserção de uma molécula de moricina foi verificada a desestabilização da
membrana, refletida na variação das propriedades analisadas. Essas interações também
causam a quebra da -hélice dos resíduos localizados na região de maior fluidez, ou menor
densidade. Houve penetração de um pequeno número de moléculas de água no interior da
membrana na cavidade que contém proteína.
Não é possível prever o comportamento de íons cloreto caso estes fossem adicio
nados
ao sistema, mas considerando a penetração de algumas moléculas de água na membrana deve
-
se considerar a possibilidade de estas carregarem ânions consigo. Embora as cargas do
sistema tenham sido neutralizadas, a não inserção de cloretos no sistema MMRI pode ter sido
um equívoco. Em função do alto custo computacional das simulações de membranas os
cálculos não foram repetidos neste trabalho.
Com a inserção do hexâmero na membrana, a redução dos contatos desfavoráveis
entre os resíduos carregados da moricina e as cadeias alifáticas dos lipídios estabilizou a -
99
hélice. Com o interior do poro totalmente hidrofílico, verifica-se o preenchimento total do
canal por moléculas de água e íons; o gradiente de concentrações através da membrana
(necessárias para m
anutenção das funções celulares) é destruído, e a bactéria é consumida.
O processo bactericida é desencadeado pela fixação do CPA (
peptídeo
catiônico) no
interior da membrana. A ancoragem do peptídeo na bicamada não foi investigada aqui, mas
para os sistemas estudados acreditamos que sejam os resíduos apolares os responsáveis
devido às interações com as cadeias hidrofóbicas dos lipídios. Em função das interações
desfavorecidas entre os resíduos hidrofílicos com o interior hidrofóbico da membrana, estes
deve
m estar voltados para o interior do canal. Desta forma, são os resíduos polares e
carregados que promovem o escoamento da água e íons através da membrana.
A finalização deste trabalho deixa questões em aberto que podem ser apontadas como
perspectivas. As mais relevantes dizem respeito a estudos estruturais do peptídeo, para
identificação das funções desempenhadas pelos resíduos que o compõe. Dessa forma pode ser
possível apontar os resíduos fundamentais na atividade bactericida, desde a penetração e
ancorag
em na membrana bacteriana até o estabelecimento do fluxo através desta. O estudo
das interações de moricinas mutantes, além de outros peptídeos da mesma família, com
membranas pode ser utilizado para identificação funcional dos resíduos.
Outro aspecto que
deve ser considerado na continuidade deste estudo é a simulação do
sistema MMRI com a inserção de íons cloreto e sódio. Esses cálculos poderiam esclarecer o
comportamento da área da membrana que não estabilizou, ou a quebra verificada na
estrutura
-
héli
ce da moricina.
100
7.
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