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DENISE CARLETO ANDIA
CARACTERÍSTICAS
MORFOLÓGICAS DO OSSO
ALVEOLAR DE RATOS TRATADOS
COM CICLOSPORINA-A
OU
TACROLIMUS
ARARAQUARA
2006
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARARAQUARA
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DENISE CARLETO ANDIA
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DO OSSO
ALVEOLAR DE RATOS TRATADOS COM
CICLOSPORINA-A OU TACROLIMUS
ARARAQUARA
2006
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARARAQUARA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Periodontia, da Faculdade de
Odontologia de Araraquara, da Universidade
Estadual Paulista - UNESP, para a obtenção
título de Mestre em Periodontia.
Orientador: Prof. Dr. Luis Carlos Spolidorio
Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Sérgio Cerri
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Andia, Denise Carleto
Características morfológicas do osso alveolar de ratos tratados
com ciclosporina-A ou tacrolimus / Denise Carleto Andia. –
Araraquara: [s.n.], 2006
116 f. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Odontologia.
Orientador: Prof. Dr. Luis Carlos Spolidorio
1. Ciclosporina 2. Tacrolimo 3. Osso e Ossos
4. Imunossupressores I. Título.
Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley Cristina Chiusoli Montagnoli CRB 8/5646
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP
Denise Carleto Andia
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DO OSSO
ALVEOLAR DE RATOS TRATADOS COM
CICLOSPORINA-A E TACROLIMUS
Comissão Julgadora
Tese para obtenção do grau de Mestre
Presidente e Orientador: Prof. Dr. Luis Carlos Spolidorio
2º examinador: Prof. Dr. Francisco Humberto Nociti Junior
3º examinador: Prof. Dr. Benedicto Egbert Corrêa de Toledo
Araraquara, 20/01/2006.
Denise Carleto Andia
Nascimento: 16 de Outubro de 1972 – Jales/SP
Filiação: Braz Baratela
Neuza Carleto
1990-1993: Curso de Graduação em Odontologia pela Universidade Estadual
Paulista “Julio de Mesquita Filho”, na Faculdade de Odontologia de
Araraquara – UNESP.
1995-1996: Curso de Aperfeiçoamento em Prótese, pela Escola Paulista de
Odontologia – Campinas.
1997-1998: Curso de Especialização em Dentística Estética e Restauradora, pela
Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, na
Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP.
1999-2000: Curso de Aperfeiçoamento em Periodontia, pela Faculdade de
Odontologia de Piracicaba – UNICAMP.
2004-2006: Curso de Pós-graduação em Odontologia, Área de Periodontia, nível
de Mestrado, pela Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita
Filho”, na Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP.
Agradecimentos
A Deus, inteligência suprema do Universo,
causa primária de todas as coisas, por permitir
o progresso contínuo de seus filhos.
À minha mãe, Neuza, por ter me recebido como sua única filha
nesta existência. Exemplo de mulher forte, batalhadora,
sincera, amorosa e acima de tudo justa, sempre. Mostrou-me
os caminhos do bem a serem percorridos, o respeito e amor
ao próximo, a importância da família e da fidelidade aos
meus ideais.
Ao Like, meu companheiro de sempre, impossível imaginar
minha vida até aqui sem sua presença. Você é um ser
iluminado, raro e especial, com uma capacidade incrível de
amar. Sempre digo que é um privilégio conviver com você.
Agradecimentos
Ao meu orientador, Prof. Dr. Luis Carlos Spolidorio, por ter me recebido
como sua orientada e pela convivência produtiva nestes dois anos.
Pesquisador competente e estudioso, sou grata pela oportunidade de
aprendizado.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Paulo Sérgio Cerri, pela contribuição
primorosa e imprescindível a esta Dissertação e à minha formação
profissional. Obrigada por ter compartilhado comigo seu respeito e
dedicação à pesquisa. Mesmo quando você não estava me ensinando, eu
estava aprendendo.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pelo auxílio financeiro em forma de bolsa e à FAPESP, pelo
auxílio financeiro à pesquisa.
Aos Profs. Drs. Joni Augusto Cirelli e Carlos Rossa Junior pela
seriedade e competência com que coordenaram o curso de Pós-
Graduação em Periodontia.
À Faculdade de Odontologia de Araraquara, nas pessoas de sua
Diretora, Profa. Dra. Rosemary Adriana Chiérici Marcantônio e Vice-
Diretor, Prof. Dr. José Cláudio Martins Segalla.
Aos docentes do curso de Periodontia, Prof. Benedicto Egbert Corrêa
de Toledo, Prof. Dr. Ricardo Samih Georges Abi Rached, Prof. Dr.
José Eduardo Cezar Sampaio, Prof. Dr. Elcio Marcantônio Junior,
Profa. Dra. Silvana Perez Orrico, Prof. Dr. Carlos Rossa Junior e Prof.
Dr. Joni Augusto Cirelli por compartilharem comigo seus
conhecimentos em Periodontia.
Aos Professores do Curso de Pós-Graduação em Periodontia da FOAr-
UNESP, obrigada por alimentarem meus sonhos.
Às Professoras Miriam e Elaine, obrigada pelo carinho e atenção nos
momentos em que precisei.
Aos amigos do curso de Mestrado em Periodontia, Dani Spi, Dani
Zandim, Dé, Fábio, Gabi, Miltinho, Rafa Faeda, Rafa Sartori e Rafaela.
Aos amigos que cursam o Doutorado em Periodontia, Ana Emília,
Andréa, Bia, Carla, Cacá, Dani, Fernanda, Fernando, Ishi, Ivy, Josi, Ju
Moraes, Ju Rico, Maurício, Pati, Vanessa.
Aos funcionários da Disciplina de Periodontia, Maria do Rosário,
Teresinha, Maria José, Cláudia, Regina Lúcia, Telma, Sueli e Toninho
pelo carinho, paciência e respeito em todos os momentos.
Aos amigos e companheiros de pesquisa Pati, Cacá e Morgana, que
fizeram das horas no Biotério, momentos agradáveis de trabalho:
vocês tornaram possível a realização desta pesquisa. Pati e Cacá, que
tanto me ensinaram, obrigada pela amizade e pela ajuda sempre que
pedi .
Aos Professores do Departamento de Fisiologia e Patologia da
Faculdade de Odontologia de Araraquara, Profa. Dra. Maria Rita
Brancini de Oliveira e Prof. Dr. Carlos Benatti Neto, pelo convívio
harmonioso.
Ao José Antônio Zuanon, o Zé, por proporcionar um ambiente de
trabalho agradável e com fundo musical de muito bom gosto, pelo
corte histológico das peças desta pesquisa, pela paciência infinita com
computadores, programas de imagem e sobretudo comigo.
Aos funcionários da Seção de Pós-graduação que, sempre com um
sorriso nos lábios, realizam um trabalho sério e competente.
Aos funcionários da Biblioteca da FOAr-UNESP, pela presteza e
competência, sem perder a simpatia e à Maria Helena, pela ajuda
primorosa na correção desta Dissertação.
Aos funcionários e professores do Departamento de Morfologia,
disciplina de Histologia da FOAr-UNESP que me acolheram sempre
com muito carinho.
Ao Departamento de Morfologia, área de Histologia da FOP-
UNICAMP, ao Prof. Dr. Pedro Duarte Novaes e a Sra. Eliene A. O. N.
Romani, pela disponibilização do Laboratório de Microscopia Eletrônica
de Transmissão, atenção e auxílio essenciais à realização de parte
desta Dissertação.
À Silvana, que além de professora, tornou-se amiga. A porta da sua
sala sempre esteve aberta aos meus questionamentos pessoais e
profissionais. Sei que seu carinho por mim é verdadeiro. Vou sentir sua
falta.
À Ju Rico, amiga de tantas horas, obrigada pela presença e otimismo,
tão necessários hoje em dia.
Débora, minha irmã, preencheu com muito carinho meus momentos em
Araraquara com muito amor e alegria. Dividir o lar e minha vida com
você, mesmo que por tão pouco tempo, foi um presente de Deus, uma
experiência ímpar que levarei sempre comigo. Você merece a
felicidade, nada menos do que isso. Vou sentir sua falta.
Gabi, obrigada pelo amor e carinho, sempre. Amizades construídas
assim, tão rapidamente mas ao mesmo tempo com tanta solidez, com
certeza são por um motivo maior, que ainda não entendemos. Vou
sentir sua falta.
Dani, obrigada pelas conversas, pela confiança, pelas risadas, por sua
presença leve e sempre amiga. Você é uma pessoa rara, de muito valor,
não se esqueça disso nunca. Vou sentir sua falta.
Aos meus grandes amigos Alessandra, Patrícia e Eduardo que
estiveram mais uma vez ao meu lado, me auxiliando na revisão da língua
inglesa.
Aos meus primeiros grandes incentivadores na Periodontia, Profa. Dra.
Luciana Machion, Profa. Dra. Ângela Guimarães Martins e Prof. Dr.
Francisco Humberto Nociti Junior:
Lu, trabalhar com você foi uma experiência valiosa e enriquecedora
que não pára de dar frutos. Seu amor à Periodontia, sua alegria e
energia permanecerão em meu coração por todos os dias de minha
vida. Obrigada pelas oportunidades, ensinamentos e amizade.
Jam, minha irmã, trabalhar com você me fez crer na pesquisa feita
com honestidade, seriedade e dedicação. Conhecer você me fez crer
que verdadeiras amizades podem existir aqui, agora. É perfeitamente
possível que elas aconteçam sem nenhum interesse, apenas pelo grande
prazer de estar junto, pela grande afinidade. Sabemos que isso é
eterno.
Chico, você me deu minha primeira oportunidade na área acadêmica.
Sem dúvida, estará para sempre em meu coração; essas coisas eu não
esqueço. Exemplo de pesquisador correto, dedicado e esforçado, foi
um privilégio e uma honra ter trabalhado com você. Melhor ainda é
saber que, depois da experiência profissional, a vida me deu de
presente um grande amigo.
À todos
“Tu te tornas eternamente responsável
por aquilo que cativas”
(Antoine de Saint-Exupéry)
“Nasceste no lar que precisavas,
Vestiste o corpo físico que merecias,
Moras onde melhor Deus te proporcionou, de acordo com teu adiantamento,
Possuis os recursos financeiros coerentes com as tuas necessidades, nem mais,
nem menos, mas o justo para as tuas lutas terrenas,
Teu ambiente de trabalho é o que elegeste espontaneamente para a tua realização,
Teus parentes e amigos são as almas que atraíste com tua própria afinidade
Portanto, teu destino está constantemente sob teu controle,
Tu escolhes, recolhes, eleges, atrais, buscas, expulsas,
modificas tudo aquilo que te rodeia a existência,
Teus pensamentos e vontade são a chave de teus atos e atitudes,
São as fontes de atração e repulsão na tua jornada vivência,
Não reclames nem te faças de vítima, antes de tudo, analisa e observa,
A mudança está em tuas mãos,
Reprograma tua meta, busca o bem e viverás melhor,
Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo,
Qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim”
Chico Xavier
Sumário
Introdução_____________________________________________ 13
Revisão da Literatura____________________________________ 15
Bloqueadores da Calcineurina__________________________ 15
Indicação terapêutica_________________________________ 16
Mecanismo de ação__________________________________ 17
Vias de administração e apresentação____________________ 18
Absorção e concentração sérica_________________________ 19
Metabolização e excreção______________________________ 20
Efeitos secundários___________________________________ 21
Nefrotoxicidade_______________________________ 22
Diabetes mellitus______________________________ 23
Influência sobre o osso__________________________ 24
Proposição_____________________________________________ 31
Artigo 1 – Tecido ósseo: aspectos morfológicos e histofisiológicos 32
Artigo 2 - The influence of CsA and FK506 based immunosuppression on
alveolar bone: a histometric, stereometric and ultrastructural study 58
Conclusão_____________________________________________ 92
Referências ____________________________________________ 93
Resumo_______________________________________________ 111
Abstract_______________________________________________ 113
Anexos _______________________________________________ 115
INTRODUÇÃO
Os avanços na compreensão dos eventos que controlam o sistema
imune, aliados à terapia imunossupressora e ao aprimoramento de técnicas
cirúrgicas, propiciam, de forma incontestável, avanços significativos no sucesso
da inibição de rejeição dos transplantes.
Atualmente, a Ciclosporina-A (CsA) e o Tacrolimus (FK506), são
drogas amplamente utilizadas nos protocolos terapêuticos imunossupressores
(GARCIA et al., 2004; TAYLOR et al., 2005; ZHAO et al., 2005). Paralelamente,
também são utilizadas no tratamento de doenças auto-imunes, como artrite
reumatóide, psoríase e líquen plano (KOVARIK et al., 2003; SANCHEZ et al .,
2004) assim como no tratamento dos retinoblastomas (ECKSTEIN et al, 2005).
Ambas as drogas atuam na via de sinalização de cálcio, inibindo a calcineurina e
o fator nuclear de células T ativadas (NFATc), primeiro sinal para ativação dos
linfócitos T helper e linfócito T citotóxico (FOXWELL et al., 1990; PLOSKER e
FOSTER, 2000), bem como a síntese de interleucina-2 (IL-2), receptor de IL-2,
interferon gama (INF-γ) e fator de necrose tumoral-∀ (TNF-∀) (BADER et
al.,1998; OETTINGER-BARAK et al., 2001).
A CsA induz efeitos secundários como nefrotoxicidade,
hipertensão arterial, síndrome urêmica hemolítica, hipercolesterolemia,
hipertricose, aumento gengival, hirsutismo e diabetes (GARCIA et al., 2004;
TAYLOR et al., 2005), muitas vezes inviabilizando seu uso.
A utilização do FK506 é uma alternativa escolhida para compor o
protocolo da imunossupressão em substituição a CsA. Possui atividade
imunossupressora entre 10 a 100 vezes maior que a CsA (SCOTT et al., 2003).
Entretanto, o FK506 também induz alguns efeitos secundários, incluindo
nefrotoxicidade, neurotoxicidade e diabetes (JAMES et al., 2000; PLOSKER e
FOSTER, 2000).
Há relatos na literatura em que a CsA induz perda óssea,
caracterizada por alterações morfológicas e bioquímicas (EPSTEIN, 1996;
14
HOFBAUER e HEUFELDER, 2000; FU et al., 2001; SHEN et al., 2001;
SPOLIDORIO, 2003). Por outro lado, a ação do FK506 no tecido ósseo é incerta
e conflitante. Alguns trabalhos “in vivo” e “in vitro” sugerem que o FK506 induz
perda óssea (CVETKOVIC et al., 1994; ROMERO et al., 1995; CAYCO et al.,
2000; STEMPFLE et al., 2002), enquanto outros sugerem aumento do
metabolismo ósseo, sem prejuízo da densidade óssea (FIORE et al., 2000; INOUE
et al., 2000; GOODMAN et al., 2001; GOFFIN et al., 2002; GOFFIN et al., 2003;
SCOLAPIO et al., 2003; SEGAL et al., 2003; GUICHELAAR et al., 2004). Neste
caso, parece haver uma tendência de que o tecido ósseo, sob a ação do FK506,
conserve sua integridade estrutural e bioquímica (GHICHELAAR et al., 2004),
mesmo aumentando seu metabolismo.
O sistema esquelético e o sistema imune estão intimamente
relacionados pois compartilham moléculas regulatórias como citocinas,
receptores, moléculas sinalizadoras e fatores de transcrição. Além disso, as
células imunes, formadas na medula óssea, interagem com as células ósseas
(TAKAYANAGI, 2005a). É de se esperar, então que, a alteração em um dos
sistemas, conseqüentemente leve à alteração do outro.
A homeostase óssea está na dependência da ação equilibrada das
células do tecido ósseo: osteoblastos e osteoclastos. Os osteoblastos são células
mononucleadas, de origem mesenquimal, envolvidas no processo de
mineralização óssea e os osteoclastos, células multinucleadas, possivelmente
formadas pela fusão de células mononucleadas da linhagem de origem
hematopoiética, são as células responsáveis pela reabsorção do tecido ósseo
(RHO et al., 2004).
Atualmente, há evidências que sugerem que as células T
desempenhem um papel crucial no desenvolvimento e função dos osteoclastos,
através da sinalização entre Interferon (INF) e RANKL (RHO et al., 2004).
Porém, ainda é absolutamente necessário mais estudos a fim de elucidar esta
estreita relação, assim como abordar aspectos morfológicos das eventuais
alterações ósseas induzidas por drogas imunossupressoras, como a CsA e o
FK506.
PROPOSIÇÃO
O objetivo deste trabalho foi analisar os padrões morfológicos do
tecido ósseo da região de furca dos primeiros molares superiores dos ratos
tratados com CsA ou FK506.
REVISÃO DA LITERATURA
BLOQUEADORES DA CALCINEURINA
A CsA e o FK506 são agentes imunossupressores que inibem a
calcineurina (fosfatase cálcio dependente) e são considerados a base para a
composição do protocolo imunossupressor pós-transplantes (ARMSTRONG et
al., 2001; GARCIA et al, 2004).
Estrutura química da CsA
CsA
A CsA foi inicialmente descrita na década de 70 e
a partir da década de 80 auxiliou na terapia de
imunossupressão, imprescindível no transplante de
órgãos (GARCIA et al., 2004). É um polipeptídeo
fúngico cíclico hidrofóbico e lipofílico, cuja
fórmula é C
62
H
111
O
12
e cujo peso molecular é 1202.6kDa. Inicialmente foi usada
como agente antifúngico, pois foi isolada de duas espécies de fungos :
Trichoderma polysporum rifai e Cylindrocarpo lucidum (CALNE et al., 1979;
DALEY e WYSOCKI, 1984). Foi produzida comercialmente a partir da cultura
do fungo Tolypocladium inflatum gams (GOODMAN et al., 2001).
16
Estrutura química do FK506
FK506
O FK506 foi descrito em 1987 como opção
terapêutica na profilaxia e tratamento de rejeição
de órgãos. É um antibiótico macrolídeo fúngico,
extraído da fermentação do microrganismo
Streptomyces tsukubaensis, possuindo ação
imunossupressora mais potente que a CsA (OETTINGER-BARAK et al., 2001;
GARCIA et al., 2004). É a droga base usada em mais de 80% dos transplantes
hepáticos e 30% dos transplantes renais e pode ser uma alternativa de protocolo
imunossupressor em substituição à CsA (SCOTT et al., 2003).
Indicação terapêutica
Ambas as drogas são largamente utilizadas na profilaxia e
tratamento de rejeição de órgãos transplantados, como coração, pulmão, rins,
medula óssea e fígado (CALNE et al., 1979; PLOSKER e FOSTER, 2000;
MOSER, 2002).
A CsA também têm sido utilizada para o tratamento de diabetes
tipo II, artrite reumatóide, psoríase, esclerose múltipla e malária (KOVARIK et
al., 2003) e apresenta eficácia clínica no tratamento de retinoblastomas
(ECKSTEIN et al., 2005).
Nos transplantes de medula, quando ocorre complicações como na
doença do hospedeiro versus enxerto (GVHD), pode haver o aparecimento de
lesões de líquen plano oral, como primeira manifestação de GVHD crônica. O
FK506 têm sido utilizado para o tratamento deste tipo de lesão, com bastante
sucesso e remissão dos sintomas em cerca de dois meses, em uma formulação
tópica (0,1%), três vezes ao dia (SANCHEZ et al., 2004).
17
Mecanismo de ação
O FK506 e CsA são potentes agentes inibidores da calcineurina
(fosfatase ativada por cálcio), sendo que esta inibição é alcançada através de
complexos que são formados com diferentes proteínas de ligação (SCOTT et al.,
2003).
A CsA, com base no sítio de ação imunorregulatório, é classificada
como um inibidor da transcrição do primeiro sinal para ativação do linfócito T
(FOXWELL et al., 1990). Não é uma droga citotóxica e exerce seu efeito em uma
população restrita de células linfóides, o que lhe confere seletividade (YAMADA
et al., 1992). A ação supressora depende da formação de um complexo com seu
receptor citoplasmático, a ciclofilina (uma proteína intracelular de ligação da
família da calmodulina), sendo que este complexo inibe a atividade da
calcineurina, o que resulta na inibição da expressão de genes de proteínas
nucleares (fator nuclear de células T ativadas – NFATc) envolvidas na ativação
celular e ativação do linfócito T citotóxico (GARCIA et al., 2004). O NFATc
desloca-se para o núcleo, ligando-se à região promotora de genes IL-2, IL-3, IL-4,
INF-γ, causando a transcrição e secreção das citocinas. O bloqueio do NFATc é
considerado o principal efeito da CsA (FRUMAN et al., 1992; GARCIA et al.,
2004; TAYLOR et al., 2005).
O FK506 é um imunossupressor macrolídeo que inibe a resposta
imune celular, através de vários mecanismos de ação, envolvendo a inibição da
calcineurina. A inativação da calcineurina, através da formação do complexo com
a FKBP12 (proteína 12 acoplada ao FK506), age de maneira similar ao complexo
ciclosporina-imunofilina e interrompe a translocação do fator de transcrição das
células T ativadas, mediadas por IL-2 (STEMPFLE et al., 2002; TAYLOR et.al.,
2005), que promovem a proliferação das céls. T helper. O FK506 atua sobre a
sinalização para a produção de IL-2, neste caso, as células T (memória) ficam
suprimidas, porém suas atividades são mantidas contra o enxerto (SOTT et al.,
2003). Inibe também a imunidade humoral, embora em menor extensão do que a
imunidade celular (PLOSKER e FOSTER, 2000).
18
FIGURA 1 – MECANISMO DE AÇÃO DA CsA E FK506
NFATC: FATOR NUCLEAR DE CÉLULAS T ATIVADAS.
FKBP: PROTEÍNA LIGANTE DO FK506.
STEPKPWSKI, S.M. Disponível em: http://www- ermm.cbcu.cam.ac.uk/00001782h.htm
. Acesso
em: 4 abr. 2005).
Vias de administração e apresentação
CsA
A forma de administração mais usada em humanos é a via oral,
mas também pode ser administrada via intramuscular ou intravenosa.
Comercialmente está disponível sob a forma líquida,100 mg/mL ou comprimidos
de 25mg, 50mg ou 100 mg.
Em ratos, o nível adequado de imunossupressão com mínimos
efeitos secundários é obtido, administrando-se 10mg/Kg de peso/dia pela via
19
subcutânea (WASSEF et al., 1985), apresentado níveis séricos semelhantes para
ratos machos e fêmeas (STILLER et al., 1993).
A via de administração subcutânea, em ratos, é mais vantajosa, já
que não requer anestesia, é melhor tolerada pelo animal e permite que a droga
atinja níveis plasmáticos adequados e uniformes (WASSEF et al., 1985).
FK506
O FK506 encontra-se disponível em comprimidos de 1 e 5mg ou
na forma líquida, em ampolas, de 5mg/mL. Em humanos, preferencialmente, deve
ser tomado via oral, mas se isso não for possível, a terapia pode ser iniciada por
infusão intravenosa contínua, mas devido ao risco de reação anafilática, a via de
administração oral deve ser eleita assim que as condições clínicas permitirem, ou
seja, em torno de 2-3 dias (SCOTT et al., 2003). Tanto em humanos quanto em
ratos, a dose recomendada é de 1mg/Kg de peso/dia (JIANG et al., 1995).
Absorção e concentração sérica
CsA
A absorção da CsA ocorre de maneira incompleta após a
administração via oral, pelo trato gastrointestinal (GUERCKI et al., 1985). O pico
de concentração sérica ocorre entre 2 a 6 hs após a administração oral. A dose de
CsA de 10 a 20 mg/Kg de peso/dia proporciona níveis séricos que variam entre
100 e 400ng/mL respectivamente e é efetiva na supressão da resposta imune,
minimizando seus efeitos tóxicos (KEOWN et al., 1992; BOLTCHI et al., 1999).
FK506
20
A absorção do FK506 é rápida, porém incompleta no trato
gastrointestinal. É largamente distribuído na maioria dos tecidos e atravessa a
placenta com concentração no plasma do cordão umbilical de aproximadamente
um terço da concentração do plasma materno e os níveis no leite materno são
similares aos observados no plasma. Não foi encontrado no fluido
cerebroespinhal, mesmo em pacientes com neurotoxicidade relacionada à droga
(SCOTT et al. 2003). A baixa absorção do FK506, aliada a baixas concentrações
no plasma e sangue e ainda a presença de metabólitos e outras drogas que
interferem na sua concentração, fazem com que haja dificuldade no
desenvolvimento de uma técnica simples, específica e sensível para medir sua
concentração sanguínea (VENKATARAMANAN et al., 1995). O pico de
concentração sérica ocorre em aproximadamente 1-2 horas após a administração
oral.
Metabolização e excreção
CsA
Sua metabolização acontece no fígado, principalmente através do
citocromo P450 (ZHAO et al., 2005), com metabolismo semelhante em humanos,
cães, coelhos e ratos (MAURER et al., 1985). O fígado é o órgão responsável pela
excreção de 90% da CsA através da bile para as fezes, sendo que os 10% restantes
são excretados através da urina (DUNN, 2003).
21
FK506
É extensivamente metabolizado no fígado e em menor extensão
pela mucosa intestinal, principalmente pelo citocromo P450 (ZHAO et al., 2005).
É excretado como menos de 1% de droga inalterada pela urina (SCOTT et al.,
2003). Dados em animais mostram ser a excreção biliar a maior rota para
eliminação de metabólitos, com eliminação fecal em torno de 90% da dose
administrada.
Efeitos secundários
O monitoramento terapêutico das concentrações dos agentes
imunossupressores no sangue tem demonstrado ser de grande valor para otimizar
o tratamento imunossupressor e minimizar a toxicidade relacionada às drogas
(SCOTT et al., 2003).
Os principais efeitos secundários resultantes da administração de
CsA são: sudorese, formigamentos de mãos, pés e boca, tremores de mãos e pés,
hipertricose, principalmente face, braços e pernas, aumento gengival, às vezes
associado a dor, inchaço e eritema, corrimento nasal, alto risco de infecção,
nefrotoxicidade, neurotoxicidade, hepatotoxicidade, hipertensão arterial, fibrose
dos tecidos pulmonar, pericardial, renal e aumento do metabolismo ósseo
(BOLTCHI et al.,1999; TAYLOR et al., 2005). A maioria desses sintomas
também pode ser atribuída ao uso contínuo do FK506, entretanto, a incidência de
alguns tipos de neurotoxicidade, distúrbios no metabolismo da glicose, diarréia,
pruridos e alopécia pode ser maior no tratamento com FK506 (GARCIA et al.,
2004). Há pouquíssimos relatos de aumento gengival associado a essa droga. O
FK506 tem ações não imunes, que produzem efeitos como a hipertricose,
regeneração das células do fígado, melhora na função após lesão do nervo ciático,
melhora nos padrões de regeneração axonial nos neurônios sensoriais e
propriedades neuroprotetoras e neuroregenerativas (VOGGENREITTER et al.,
2000).
22
- Nefrotoxicidade
CsA
O maior efeito adverso da CsA parece ser a nefrotoxicidade, que
pode ocorrer em cerca de 75% dos pacientes (OETTINGER-BARAK et al.,
2001), pois altera a hemodinâmica glomerular e apresenta alterações
microscópicas caracterizadas pela presença da vacuolização tubular, fibrose
interstical e hialinose arteriolar (GARCIA et al., 2004).
FK506
Pacientes pediátricos transplantados renais, tratados com FK506
como terapia base, apresentaram função renal aceitável (CHAKRABARTI et al.,
2000). O FK506 induz a expressão de baixas quantidades de TGF-∃, fator de
crescimento associado à patogênese da nefropatia crônica do enxerto (MATL et
al., 2005).
Substituição da CsA para FK506
A conversão terapêutica da CsA para o FK506 parece ser uma
alternativa viável para os pacientes transplantados que desenvolveram algum tipo
de toxicidade (HOHAGE et al., 2005). Esta conversão oferece efetiva
compensação da toxicidade, ilustrado pela normalidade dos marcadores
bioquímicos circulantes que acusam tais toxicidades. Relatam-se também, que
outros efeitos secundários indesejáveis como hiperlipidemia, hirsutismo, aumento
gengival e neurotoxicidade tenham resolução completa ou parcial com a
conversão terapêutica da CsA para o FK506 (BURROWS et al., 1998).
23
- Diabetes mellitus
Diabetes mellitus pós-transplante é uma alteração metabólica
comum em pacientes tratados com FK506 (OBERHOLZER et al., 2005;
VICENTI et al., 2005).
Recentemente em nosso laboratório, observamos, em ratos, que o
FK506 na dose de 1mg/Kg de peso corporal/dia induziu estado de diabetes.
Verificou-se ainda que, as alterações glicêmicas dependem do tempo de
tratamento. Em períodos curtos (60 e 120 dias), observou-se elevados níveis
glicêmicos e em períodos longos (240 dias), houve normalização da glicemia
(NASSAR et al., 2006). Em alguns casos, sugere-se que haja mudança no
protocolo terapêutico dos pacientes que apresentem diabetes pós-transplante. Uma
alternativa é a conversão do FK506 para a CsA.
Substituição do FK506 para CsA
A conversão do FK506 para a CsA é uma alternativa que está
sendo estudada. O primeiro trabalho que observou as conseqüências desta
conversão como rotina na prática clínica em pacientes transplantados estáveis, foi
realizado em 2000 e nele não houve mudança nos níveis glicêmicos (HIGGINS et
al., 2000). Em outro acompanhamento de pacientes que receberam esta conversão,
houve uma reversão no quadro de diabetes em 44% no primeiro ano. Os autores
concluíram que a conversão pôde ser associada a uma melhora notável no
metabolismo da glicose e uma reversão freqüente do estado diabético
(BOUCHTA et al., 2005). Em outro estudo verificou-se que não houve episódios
de rejeição nem piora da função renal após a conversão e a partir disto, sugeriram
que a conversão para a CsA parece ser uma maneira simples, segura e eficaz na
reversão ou pelo menos uma melhora na diabetes pós-transplante
(OBERHOLZER et al., 2005).
24
- Influência da CsA e do FK506 sobre o osso
Observações clínicas assim como em trabalhos experimentais
mostram que tanto a CsA quanto o FK506 parecem estar relacionados a um
turnover ósseo aumentado (EKELUND & NILSSON, 1996; KAWANA et al.,
1996; CUETO-MANZANO et al., 1999; FU et al., 1999; FIORE et al., 2000;
GOODMAN et al., 2001; GOFFIN et al., 2003; SCOLAPIO et al., 2003; SEGAL
et al., 2003; SPOLIDORIO, 2003; GUICHELAAR et al., 2004), através de
mecanismos ainda não totalmente compreendidos e esclarecidos.
A perda óssea pós transplante têm sido relatada em pacientes que
receberam transplante de órgãos sólidos (EPSTEIN et al., 1996; EPSTEIN e
SHANE et al., 1996; SHANE et al., 1997), o que pode resultar em fraturas. Não
está claro qual a contribuição das drogas imunossupressoras para a ocorrência da
perda óssea, nem como acontece a alteração do turnover ósseo após os
transplantes seguidos de protocolos terapêuticos imunossupressores.
Trabalhos “in vivo” e “in vitro” mostram osteopenia ou
osteoporose causada pela CsA em animais e em humanos. Foram encontradas
observações histológicas de aumento da remodelação óssea, com reabsorção
excedendo a formação de osso e maiores concentrações de marcadores ósseos,
como a fosfatase alcalina (aumento da atividade osteoblástica) e osteocalcina
(proteína envolvida na mineralização) (MOVSOWITZ et al., 1988;
SCHLOSBERG et al., 1989; DERFUS et al., 1991).
Influência da CsA sobre o osso
- Estudos “in vitro”
Estudos “in vitro” são contraditórios. Alguns mostram que a CsA
pode inibir a reabsorção óssea, através do aumento de osteoblastia e diminuição
da osteoclasia (STEWART et al.,1986; KLAUSHOFER et al., 1987;
SASAGAWA et al., 1989; STEWART e STERN, 1989), enquanto outros
25
mostram inibição da proliferação osteoblástica, assim como diminuição dos níveis
de fosfatase alcalina (McCAULEY et al., 1992).
- Estudos em ratos
Alguns estudos em ratos também são inconclusivos e os autores
sugerem que a ação da CsA possa estar relacionada à dose, idade, gênero e tempo
de administração.
Dose
Alguns trabalhos relatam que o desequilíbrio homeostático dos
ossos, resultando em osteopenia, pode ser em decorrência da dosagem de
imunossupressor utilizada (EPSTEIN et al., 1990; ERBEN et al., 1998). Ratos
tratados com altas doses de CsA (30mg/Kg de peso corporal/dia) apresentam
reabsorção óssea nos sítios periodontais e diminuição da formação óssea nos
sítios sinfiseais (FU et al., 1999). Recentemente, Spolidorio et al. (2003),
relataram perda óssea alveolar em ratos tratados com 10mg/Kg de peso
corporal/dia.
Idade
A sugestão de perda óssea induzida pela CsA também pode, em
parte, estar associada à idade (MOVSOWITZ et al., 1988; SCHOLBERG et al.,
1989; EPSTEIN et al., 1990). Por outro lado, trabalhos em ratos concluíram que a
diminuição do volume ósseo alveolar não é idade dependente (SPOLIDORIO et
al., 2004).
Gênero
Pode estar associada também ao gênero, pois os trabalhos que
relatam perda óssea associada à administração de CsA, são trabalhos que
26
envolveram ratos e não ratas (MOVSOWITZ et al., 1988; ESPSTEIN et al., 1990;
ERBEN et al., 1998).
Tempo de tratamento
Ratos tratados com CsA apresentaram perda óssea proporcional ao
aumento da densidade volumétrica dos osteoclastos, sendo que ambos foram
dependentes do tempo de tratamento. A relação perda óssea/tempo de
administração parece existir, pois com a interrupção do tratamento, houve
diminuição progressiva da perda óssea (SPOLIDORIO, 2003). Mas no estudo de
Schlosberg et al., (1989), mesmo com a interrupção do tratamento com a CsA,
pareceu não haver uma restauração completa do volume ósseo.
Todos estes fatores ainda merecem ser estudados, por serem
pouco explorados na literatura pertinente.
A avaliação dos efeitos da CsA sobre o côndilo de ratos, mostrou
diminuição da espessura do trabeculado ósseo, assim como largura de tecido
osteóide, volume osteóide e espessura da cortical óssea (FU et al., 2001). O
mesmo padrão de diminuição de volume e largura de tecido osteóide foi
observado em alvéolo dental de ratos tratados com CsA (SHEN et al., 2001).
Os mesmos resultados foram obtidos por Kawana et al., (1996),
pois através do aumento da piridinolina urinária (Pyr), puderam verificar
reabsorção óssea em relação à aposição. A formação óssea foi avaliada pela
osteocalcina sérica e volume osteóide. Concluiu-se, portanto, que a CsA induz
perda óssea devido a uma dissociação entre reabsorção e formação óssea.
A administração exógena de TGF- ß pode modificar os efeitos
deletérios da CsA sobre o tecido ósseo de ratos, segundo Goodman et al., (2001),
assim como a terapia combinada com 1,25 (OH)
2
D3 foi capaz de restaurar o
volume ósseo (EPSTEIN et al., 1990).
27
- Estudos em humanos
A perda óssea em pacientes transplantados ocorre com maior
intensidade no primeiro ano pós-transplante, ocorrendo uma estabilização após
este período (GROTZ et al.,1995; EZAITOUNI et al., 1998; CUETO-
MANZANO et al., 1999).
O uso de outros medicamentos, como os esteróides combinados à
CsA, deixa dúvidas quanto à sua ação nas alterações ósseas pós-transplantes. A
associação de drogas, como por exemplo, a CsA e os esteróides, se faz necessária,
devido aos altos índices de rejeição aguda e conseqüente aumento na taxa de
perda de enxertos (KRAMER et al., 2005). Por outro lado, a associação da CsA
com o flurbiprofeno (bloqueador da Cox-1) não previne a perda óssea trabecular
induzida pela terapia com a CsA, sendo que e a administração concomitante de
ambas as drogas provoca efeitos renais adversos (SASS et al., 1996).
O monitoramento do metabolismo ósseo após transplante de
medula óssea, seguido de terapia imunossupressora com CsA, indicou um
turnover ósseo acelerado após o referido transplante, devido à estimulação dos
osteoblastos pela CsA (WITHOLD et al., 1996) e em pacientes transplantados
cardíacos, houve uma perda óssea contínua na coluna vertebral, provavelmente
associada ao alto turnover ósseo, eventualmente induzido pela CsA (THIEBAUD
et al., 1996).
O volume ósseo de transplantados renais do gênero masculino, em
um estudo por longo período de tempo, foi significantemente mais baixo quando
comparado a pacientes do gênero feminino. Os autores concluíram que houve
diminuição da densidade mineral óssea tanto no osso trabecular quanto no
cortical. Esta diminuição não foi tão severa quanto nos relatos de
acompanhamento de curto prazo. Observaram, ainda, uma estimulação
osteoclástica, supressão osteoblástica e retardo na aposição mineral e taxa de
formação óssea (CUETO-MANZANO et al., 1999).
28
Influência do FK506 sobre o osso
- Estudos em humanos:
O fator de diferenciação osteoclástica (ODF) e o fator de inibição
da osteoclastogênese (OCIF) ajudam a elucidar o mecanismo de maturação e
diferenciação osteoclástica. A expressão destes dois fatores foi encontrada em
pacientes com osteoporose pós-transplante, tratados com FK506, sugerindo que o
agente imunossupressor age nos osteoclastos promovendo a expressão de mRNA
para ODF, provocando uma diferenciação e maturação dos osteoclastos
(FUKUNAGA et al., 2004).
Em transplantados renais tratados com FK506, associado à baixas
doses de predinisona, concluiu-se que esta associação pode evitar a perda óssea,
comum no período pós transplante renal (GOFFIN et al., 2003). Esta mesma
associação, administrada por 4 meses, em pacientes hepáticos, não foi associada à
perda óssea nos períodos avaliados (SCOLAPIO et al., 2003).
Os efeitos do FK506 sobre a densidade mineral óssea também
foram investigados em pacientes transplantados cardíacos. Verificou-se rápida
perda óssea inicial após altas doses de FK506 (STEMPFLE et al., 2002). Nesse
caso, a dosagem pode ter colaborado com os achados.
Estudos comparativos entre CsA e FK506
- em ratos
Como citado anteriormente, o FK506 tem sido utilizado na
intenção de contrapor-se aos efeitos tóxicos da CsA, sem perda da eficácia clínica.
A ação, tanto da CsA quanto do FK506 sobre o metabolismo ósseo mineral têm
sido avaliada. Cvetkovic et al., (1994) verificaram expressivo aumento das
medidas de formação e reabsorção óssea, acompanhado de uma redução
29
significante em porcentagem da área trabecular, em ratos tratados com FK506,
quando comparados aos ratos tratados com a CsA
Estudo recentes discordam desses resultados. Verificaram que o
FK506 parece não induzir perda óssea severa pelo alto turnover do metabolismo
ósseo e que talvez possa exercer efeitos favoráveis no metabolismo ósseo em
pacientes transplantados, quando comparado à CsA (INOUE et al., 2000).
Por outro lado, Abdelhadi et al., (2002) sugerem que ambas as
drogas promovem efeitos adversos no osso e quando em doses elevadas, resultam
na alteração do tecido ósseo, tanto cortical quanto trabecular, com conseqüente
osteopenia.
- em humanos
Avaliações clínicas sugerem que o FK506 parece agir mais
favoravelmente sobre o metabolismo ósseo em pacientes que receberam
transplante de fígado, em comparação com a CsA (MONEGAL et al., 2001;
SEGAL et al, 2003; GUICHELAAR et al., 2004; SMALLWOOD et al., 2005). A
mesma conclusão pôde ser admitida para pacientes que receberam transplante de
rim (GOFFIN et al., 2002).
Como citado anteriormente, já é bem estabelecida na literatura a
existência de uma condição osteoporótica imediata após os transplantes renais,
caracterizada por uma rápida diminuição da densidade da coluna lombar e fêmur,
que leva à ocorrência de fraturas ósseas (TORRES et al., 2003). Esta condição
está relacionada à pacientes tratados com CsA e altas doses de esteróides,
principalmente no primeiro ano pós-transplante (MARCEN et al., 2005).
Pacientes transplantados renais, tratados com FK506 e baixas doses de
predinisona pareceu evitar a usual perda óssea pós transplante renal (GOFFIN et
al., 2003). Em outro estudo, a retirada dos esteróides demonstrou que a terapia
imunossupressora com FK506 pode ser considerada uma opção de escolha em
transplantados renais (KRAMER et al., 2005).
30
Os efeitos da conversão da CsA para o FK506 ainda não têm sido
bem avaliados em pacientes transplantados hepáticos. A administração
concomitante de glicocorticóides ou estrógenos interfere na investigação do papel
do FK506 e da CsA separadamente na alteração da densidade mineral óssea.
Embora a CsA seja uma possibilidade clínica para os transplantados hepáticos, os
efeitos secundários e o desenvolvimento de rejeição têm limitado seu uso, fazendo
da conversão para o FK506 uma opção necessária. A conversão parece ser segura
e eficaz com relação à manutenção ou até mesmo ao aumento da densidade
mineral óssea em pacientes do sexo masculino (OTT et al., 2003), sendo ainda,
um modelo apropriado nos casos de necessidade de resgate do enxerto e
tratamento de uma variedade de efeitos colaterais após o transplante de fígado.
(SELZNER et al. 2001).
Artigo 1
Tecido ósseo: aspectos morfológicos e histofisiológicos.
Bone tissue: morphologics and histophysiologics aspects.
Denise Carleto Andia - aluna de Mestrado em Periodontia (Andia DC)
a
Paulo Sérgio Cerri - Professor (Cerri PS)
b
Luis Carlos Spolidorio – Professor (Spolidorio LC)
c
a
Departamento de Periodontia,
b
Departamento de Morfologia,
c
Departamento de Fisiologia e Patologia,
Faculdade de Odontologia de Araraquara, UNESP – Brasil.
Autor correspondente: Prof. Dr. Paulo Sérgio Cerri
e-mail: [email protected]
Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP - Rua Humaitá, nº 1680
Caixa postal 331, Araraquara, SP – Brasil- CEP: 14801–903
Departamento de Morfologia
Telefone: (16) 33016497 Fax: (16) 33016433
* Artigo submetido à Revista de Odontologia da UNESP.
33
Resumo
O tecido ósseo tem papel importante no suporte, proteção e
locomoção e está sob o controle de fatores sistêmicos, como os hormônios e
fatores locais, como os fatores de crescimento e citocinas. Portanto, os sistemas
imune e esquelético encontram-se intimamente relacionados; a esta área
interdisciplinar de estudos deu-se o nome de Osteoimunologia . A homeostase do
sistema esquelético está na dependência de uma remodelação óssea equilibrada,
ou seja, da dinâmica balanceada entre a atividade dos osteoblastos, células de
formação óssea e osteoclastos, células de reabsorção óssea. Este balanço é
firmemente controlado pelo sistema imune. Se este balanço inclinar-se a favor dos
osteoclastos, levará a reabsorções patológicas, como nas periodontites, artrites
reumatóides e doenças osteoporóticas. A compreensão deste processo, como um
todo, pode ser a chave para o desenvolvimento de um protocolo de tratamento que
poderia levar ao equilíbrio dessas doenças ósseas. Sendo assim, nesta revisão da
literatura, nós fornecemos uma visão do tecido ósseo: a composição química de
sua matriz, células e componentes celulares, descrevendo como ocorre o processo
de remodelação óssea e alguns fatores locais e sistêmicos que interferem neste
processo, como citocinas e hormônios.
Palavras-chave
Osteoblastos, osteoclastos, tecido ósseo e sistema imune.
34
Abstract
The bone tissue has an important role in the support, protection and
locomotion and it is under control of systemic factors, such as hormones and local
regulatory molecules, for instance, growth factor and cytokines. Therefore, the
immune and skeletal systems are intimately related; this interdisciplinary branch
has been referred to as Osteoimmunology. The homeostasis of the skeletal system
depends directly on a balanced bone remodeling, i.e., the dynamic balance
between the activities of the osteoblasts, bone forming cells and osteoclasts, bone
resorbing cells. This balance is tightly and thoroughly controlled by some
regulatory systems, such as the immune system. Tipping this balance towards the
osteoclasts leads to pathological bone resorption, such as periodontitis,
autoimmune arthritis and osteoporotic diseases. The understanding this overall
process may be the key to development of a treatment protocol, which could lead
to the balance of these bone diseases. Thus, in this literature review, we provide
an overview of the bone tissue composition, its cells and proteins of bone matrix,
describing how the remodeling bone process occurs, as well as some local and
systemic factors that interfere in this process, such cytokines and hormones.
Keywords
Osteoblasts, osteoclasts, bone tissue and immune system.
35
INTRODUÇÃO
O tecido ósseo tem algumas funções básicas como suporte,
proteção e locomoção e está sob o controle de fatores sistêmicos, como os
hormônios e fatores locais, como os fatores de crescimento e citocinas
1
. Portanto,
os sistemas imune e esquelético encontram-se intimamente relacionados; a esta
área interdisciplinar de estudos deu-se o nome de Osteoimunologia
2
.
A homeostase do sistema esquelético está na dependência de uma
remodelação óssea equilibrada, ou seja, da dinâmica balanceada entre a atividade
dos osteoblastos, células de formação óssea e osteoclastos, células de reabsorção
óssea. Este balanço é firmemente controlado por alguns sistemas regulatórios,
como o sistema imune. Se este balanço inclinar-se a favor dos osteoclastos,
ocorrerá reabsorções patológicas, como nas periodontites, artrites reumatóides e
doenças osteoporóticas
2
.
Sendo assim, nesta revisão da literatura, nós fornecemos uma visão
do tecido ósseo: a composição química de sua matriz, células e componentes
celulares, descrevendo como ocorre o processo de remodelação óssea e alguns
fatores locais e sistêmicos que interferem neste processo, como citocinas e
hormônios.
36
TECIDO ÓSSEO
Aspectos macroscópicos
Macroscopicamente, o tecido ósseo pode se apresentar como
compacto, na região mais periférica dos ossos, denominada cortical e esponjoso
ou trabecular, com rede de trabéculas contendo espaços intercomunicantes, que
abrigam a medula óssea. As superfícies ósseas internas e externas são revestidas
respectivamente pelo endósteo e periósteo. O periósteo constitui membrana de
grande importância para a integridade dos ossos
1,3
.
Aspectos microscópicos
O tecido ósseo pode ser classificado em primário (imaturo) que se
apresenta com disposição irregular, não organizada das fibras colágenas e menor
quantidade de cristais de hidroxiapatita. Está presente no feto, no calo ósseo, nas
osteomielites, nos tumores ósseos e na doença óssea de Paget. É classificado
também como secundário (maduro, haversiano ou lamelar), com fibras colágenas
dispostas em lamelas paralelas ou concêntricas em torno dos canais de Harvers,
formando osso compacto ou esponjoso
4
.
Geralmente, sobre a superfície do tecido ósseo, deposita-se uma
camada de matriz denominada osteóide, que se caracteriza por uma matriz não
mineralizada, contendo grande quantidade de fibras colágenas tipo I produzidas
pelos osteoblastos. Assim, ao microscópio de luz, o osteóide apresenta aspecto
37
amorfo e eosinofílico; além de ser encontrado em situações fisiológicas, também é
encontrado nos tumores formadores de tecido ósseo
1,4
.
O tecido ósseo tem dois componentes básicos: células e matriz
orgânica, sobre a qual se depositam os componentes inorgânicos.
CÉLULAS DO TECIDO ÓSSEO
Nos processos de formação, reabsorção, manutenção e
remodelação óssea, participam quatro tipos celulares distintos que derivam de
duas linhagens: uma relacionada à formação e manutenção: osteoblastos, células
de revestimento ósseo e osteócitos e outra à reabsorção: osteoclastos.
Osteoblastos: são células mononucleadas, de origem mesenquimal, que se
apresentam como células polarizadas, com núcleo esférico e citoplasma basófilo.
São cubóides ou ligeiramente alongadas e formam uma camada celular contínua
sobre a superfície óssea que está sendo formada (osteóide). São as células
responsáveis pela produção da matriz orgânica do osso bem como pela sua
mineralização
5-6
. Quando ativas, possuem um citoplasma rico em organelas de
síntese e secreção, como retículo endoplasmático rugoso (RER) e complexo de
Golgi desenvolvidos, grânulos de secreção, mitocôndrias, vesículas de transporte,
vesículas endossômicas, lisossoma, além das proteínas do citoesqueleto
1,7-8
.
Sintetizam a matriz orgânica, constituída de várias proteínas colágenas e não
colágenas, tais como o colágeno tipo I, osteocalcina, osteopontina, proteoglicanas,
fosfoproteínas, proteínas produzidas pelos osteoblastos e citocinas. Estes
38
componentes interagem entre si e organizam-se, fornecendo um arcabouço que
permite a deposição de sais minerais, além de algumas destas moléculas atuarem
diretamente na mineralização
7-11
.
Osteoblastos e pré-osteoblastos exibem níveis elevados da enzima
fosfatase alcalina na superfície de suas membranas citoplasmáticas, que, quando
liberada, contribui para o início da mineralização e o progressivo crescimento dos
cristais de hidroxiapatita
1,9-11
. No processo inicial de formação do tecido ósseo, os
osteoblastos, após secretar a primeira camada de matriz orgânica, parecem
assumir um importante papel na sua mineralização. A partir dos osteoblastos
adjacentes à matriz orgânica óssea recentemente sintetizada, brotam pequenas
vesículas de sua superfície. Estas vesículas desprendem-se dos osteoblastos e
portanto, são observadas entre os constituintes orgânicos da matriz óssea. Assim,
são estruturas arredondadas, que se originam da membrana plasmática dos
osteoblastos, sendo denominadas de vesículas da matriz
11
. Estas vesículas, que
permanecem na matriz extracelular totalmente dissociadas das células, contêm
glicoproteínas e exibem forte marcação em sua membrana para a fosfatase
alcalina. A fosfatase alcalina é uma família de enzimas que hidrolisam os íons
fosfatos, fornecendo-os para o interior das vesículas. Ocorre, também, um
aumento da concentração de íons cálcio no interior dessas vesículas,
provavelmente através dos fosfolipídios em suas membranas. Sendo assim, ocorre
uma supersaturação de fosfato e cálcio, resultando na precipitação de fosfato de
cálcio no interior das vesículas. Posteriormente, ocorre o rompimento da
membrana das vesículas e a mineralização espalha-se pela matriz. Este processo é
39
característico dos locais onde está ocorrendo pela primeira vez a formação e
mineralização do tecido ósseo
11-13
. Deve-se ressaltar que as vesículas da matriz
também são liberadas pelos condrócitos durante a mineralização da cartilagem
14
,
bem como pelos odontoblastos, durante a formação da primeira camada de
dentina
15-16
.
Os osteoblastos também funcionam como receptores e
transmissores de sinais para remodelação, pois possuem receptores para
hormônios, como o da tireóide, da paratireóide (PTH), estrogênios,
glicocorticóides, insulina, Vitamina D (1,25 Dihidroxivitamina D3). Secretam
fatores de regulação como Interleucina-6 (IL-6) e fatores de crescimento como
TGF-∃ que são fatores locais que agem na proliferação, diferenciação e atividade
osteoblástica
1,7,17
. Além disso, os osteoblastos têm a capacidade de modificar a
matriz adjacente, removendo ou alterando as proteoglicanas ou glicoproteínas.
Iniciam, então a mineralização da matriz, através da secreção de vários
reguladores como IL-6, TGF-∃ e Interferon-γ (INF-γ)
8
.
Assim, os fatores sistêmicos e locais controlam a proliferação,
atividade e sobrevivência dos osteoblastos. Alguns estudos mostram que os
osteoblastos e/ou osteócitos podem sofrer apoptose, em conseqüência, por
exemplo, a trauma mecânico
18
ou deficiência de estrogênio
19-20
. Em condições
fisiológicas, a apoptose de osteoblastos parece exercer um importante papel no
controle do crescimento ósseo
21
. A apoptose é um mecanismo de morte celular,
sendo, portanto, responsável pelo equilíbrio populacional de células no tecido e
órgãos. A apoptose, quando desencadeada, ativa uma complexa cascata
40
proteolítica intracelular que coordena todo o processo de morte celular. Como
conseqüência da ativação das proteínas intracelulares promotoras da apoptose, a
célula fragmenta-se originando os corpos apoptóticos. Os corpos apoptóticos
expressam em sua membrana plasmática, entre outras moléculas, a fosfatidilserina
que atraí os fagócitos e estes rapidamente internalizam os corpos apoptóticos.
Recentemente, foi mostrado que os osteoblastos, além de participar na formação e
mineralização da matriz óssea, podem também fagocitar os corpos apoptóticos
oriundos de osteoblastos e/ou células de revestimento ósseo, durante o início da
formação óssea
6
.
Células de revestimento ósseo (bone-lining cells): representam os osteoblastos
que recobrem as superfícies ósseas quiescentes; assim, estas células exibem
escassas organelas de síntese e secreção de proteínas e formam uma camada
contínua de células interconectadas capaz de manter a homeostase, regulando a
concentração plasmática de cálcio por mecanismos parcialmente independentes
dos relacionados ao sistema de remodelação óssea
9
, sendo consideradas como
sítio primário de troca de íons entre o sangue e o osso do adulto. A transição do
osteoblasto para “bone linning cells” envolve mudanças morfológicas e
funcionais graduais que culminam com a diminuição da secreção de proteínas.
Esta transformação pode representar o fenótipo final da linhagem osteoblástica
8
.
No entanto, estas células que revestem a superfície óssea, sob determinados
estímulos, podem diferenciar-se em osteoblastos e conseqüentemente produzir
matriz óssea
11
. Assim, estas células de revestimento ósseo têm um importante
41
papel na manutenção/homeostase da matriz óssea e influência no metabolismo de
cálcio e fosfato e troca de substâncias. Além disso, acredita-se que sejam
responsáveis pela produção de moléculas que ativam a complexa cascata
molecular que culmina na remodelação óssea
8,22
.
Osteócitos: são os osteoblastos que, à medida que secretam a matriz, ficam
aprisionados no seu interior, em lacunas e mostram uma diminuição gradativa da
quantidade de organelas de síntese e de secreção como RER e complexo de Golgi,
caracterizando pobre atividade metabólica, porém indispensável para a
manutenção da homeostase óssea
1,8
. Os osteócitos são o tipo celular mais
abundante no tecido ósseo, em uma proporção de 10 osteócitos para cada
osteoblasto
10
. São células elípticas, menores que os osteoblastos, que possuem
diversos prolongamentos citoplasmáticos, situados no interior de pequenos canais
denominados canalículos ósseos. Estes prolongamentos citoplasmáticos se
estendem em direção aos prolongamentos de outros osteócitos adjacentes, aos dos
osteoblastos e células de revestimento ósseo do endósteo e periósteo,
estabelecendo junções (tipo gap) entre estas células. Estas junções do tipo gap
entre os prolongamentos dos osteócitos e entre os prolongamentos dos
osteoblastos permitem que mesmo os osteócitos localizados nas porções mais
profundas do osso possam responder às modificações sistêmicas, bem como às
modificações na superfície óssea
7,11
. Dessa maneira, os canalículos ósseos
constituem uma complexa rede que interconecta a superfície óssea às porções
mais internas, rede esta que é a responsável pela manutenção e vitalidade da
42
matriz óssea
7,11
. Portanto, os osteócitos são considerados essenciais para a
manutenção bem como para a remodelação óssea, desde que tem sido sugerido
que a apoptose dos osteócitos pode atrair e estimular a atividade dos
osteoclastos
23-24
.
Osteoclastos: são células gigantes, multinucleadas, formadas pela fusão de células
mononucleadas da linhagem hematopoiética
8,11
. Caracterizam-se,
citoquimicamente, por apresentarem fosfatase ácida resistente ao tartarato,
adenosina ácida trisfosfatada vanadato sensitiva, isosima anidrase carbônica II,
entre outras enzimas
8,11
. Os osteoclastos são responsáveis pela reabsorção óssea,
promovendo escavações na superfície óssea denominadas lacunas de Howship.
Adjacente à superfície óssea, sua membrana celular exibe numerosas
invaginações, formando uma borda em escova. Perifericamente a esta borda em
escova, há uma região do citoplasma que se assemelha a uma faixa, diretamente
apoiada na matriz óssea, denominada de zona clara. A zona clara, porção
desprovida de organelas e rica em actina e miosina, está intimamente aderida à
superfície óssea. Assim, ela parece ser responsável pela adesão do osteoclasto à
superfície óssea, delimitando, desta forma, a borda em escova, compartimento
onde ocorre a desmineralização bem como a degradação da matriz do tecido
ósseo. Este compartimento cria um microambiente propício para a liberação e
atividade das enzimas proteolíticas do osteoclasto, que, junto da geração de
prótons pela enzima anidrase carbônica, promove um ambiente ácido, ocorrendo a
desmineralização da matriz. A liberação de prótons é provavelmente necessária à
43
desmineralização do osso além de promover um ambiente ótimo para as enzimas
lisossomais exercerem suas atividades enzimáticas
8,10-11
. As metaloproteinases da
matriz, que podem ser ativadas em ambientes ácidos, também têm sido
observadas nas lacunas de reabsorção e podem contribuir para a degradação da
matriz óssea
11, 25
.
O processo de reabsorção pode ser auto-regulável, devido à
dissolução mineral que precede a degradação da matriz orgânica, o que
significaria o desenvolvimento de uma matriz porosa adjacente à borda em escova
do osteoclasto. Esta matriz porosa pode provocar o rompimento da adesão do
osteoclasto, resultando em um descolamento deste
17
. Além disso, após a
reabsorção, os osteoclastos podem migrar para outros sítios onde o tecido ósseo
deve ser reabsorvido, bem como se deslocar da superfície óssea e permanecer
como células inativas. Os osteoclastos inativos são células gigantes,
multinucleadas, porém não apresentam borda em escova e zona clara, estruturas
intimamente relacionadas à atividade reabsortiva dos osteoclastos
26
. Assim, o
fator de crescimento tumoral (TGF-ß) e estrógeno parecem promover a apoptose,
enquanto o paratormônio (PTH) e Interleucina-1 (IL-1) podem agir como
supressores da apoptose, prolongando a atividade osteoclástica
8
.
Apesar da função principal do osteoclasto ser promover a
desmineralização e degradação da matriz óssea, evidencias têm reforçado a idéia
que os osteoclastos são capazes de internalizar e digerir células e/ou restos
celulares
27-28
. Assim, os osteoclastos podem internalizar osteócitos liberados
durante a reabsorção óssea
24,27, 29
. Tem sido sugerido também que osteoblastos em
44
apoptose, possivelmente, podem estimular a migração de osteoclastos para
determinados sítios que devem ser reabsorvidos
20,30-31
. Os osteoclastos atraídos
para o local, imediatamente reconhecem e internalizam os osteoblastos e/ou
osteócitos em apoptose
24,28-29
.
MATRIZ ÓSSEA
As proteínas ósseas
O osso é constituído de uma parte orgânica e outra inorgânica. A
matriz orgânica é formada de colágeno, principalmente tipo I, proteoglicanas e
glicoproteínas adesivas e a inorgânica por íons fosfato, cálcio e em menor
quantidade, bicarbonato, magnésio, potássio, sódio e citrato. A união do fosfato e
do cálcio forma cristais com estrutura de hidroxiapatita que, associados às fibras
colágenas, fornecem a resistência e dureza características do tecido ósseo
3
.
Algumas proteínas não colágenas, típicas dos tecidos
mineralizados, como a osteocalcina e sialoproteína óssea e outras como a
osteonectina/SPARC e osteopontina que têm uma distribuição mais generalizada,
são liberadas do osso durante a sua desmineralização. Há, ainda, proteínas
derivadas do sangue e fluidos teciduais que são concentradas no osso devido à sua
afinidade pelos cristais minerais, como a albumina, ∀2HS-glicoproteína e
imunoglobulinas
8
.
Um importante grupo de glicoproteínas extraídas da matriz óssea
desmineralizada, são as proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs), que pesam
45
cerca de 18kDa e são responsáveis pela indução óssea
32-33
. Classificadas como
uma subfamília dentro da superfamília dos fatores de crescimento e
transformação-∃ (TGF- ∃), podem ser encontradas, além do tecido ósseo, em
vários outros tecidos, como cérebro, coração pulmão, rim, baço e fígado,
apresentando papel importante, não só no desenvolvimento do esqueleto, mas
também em outros processos fisiológicos, durante a embriogênese
33
. Pesquisas
demonstram que, dentre as mais de 20 BMPs descobertas até o presente
momento
34
, há diferenças entre elas na capacidade de induzir a osteogênese. As
BMPs 2, 6 e 9 parecem ter maior potencial na indução da diferenciação
osteoblástica a partir das células mesenquimais progenitoras; a BMP-2, quando
injetada localmente sobre a superfície da calvária de ratos, induz formação óssea
periosteal, sem a formação prévia de cartilagem
34
. “In vivo”, regulam alguns dos
processos do desenvolvimento embrionário, incluindo cartilagem e formação
óssea. No adulto, as BMPs regulam a proliferação e diferenciação, bem como a
apoptose de vários tipos de células, tais como células mesenquimais, osteoblastos,
condroblastos, células epiteliais e do tecido nervoso. O alvo final das BMPs é a
alteração da expressão gênica no núcleo, mudando, assim, a atividade celular,
incluindo o crescimento, diferenciação e síntese de matriz extracelular
33
.
REMODELAÇÃO ÓSSEA
O tecido ósseo, em diversos momentos, precisa modificar sua
forma ou estrutura. Seja para um osso primário (primeiro tecido ósseo formado)
tornar-se maduro, para um osso crescer mantendo sua forma, para um osso
46
esponjoso tornar-se compacto ou para se adaptar a novas situações fisiológicas ou
patológicas, o osso está em constante remodelação, por meio de reabsorção e
deposição de matriz óssea, que são processos estreitamente acoplados
1,3
.
O desenvolvimento e a homeostase do sistema esquelético está na
dependência de uma remodelação óssea equilibrada, ou seja, da dinâmica
balanceada entre a atividade dos osteoblastos e osteoclastos, firmemente
controlada pelo sistema imune. Se este balanço inclinar-se a favor dos
osteoclastos, levará a reabsorções patológicas, como nas periodontites, artrites
reumatóides, doenças osteoporóticas primárias ou secundárias e tumores ósseos
2
.
O primeiro evento celular na seqüência de remodelação é a
formação e ativação dos osteoclastos. Previamente à reabsorção da matriz
mineralizada pelos osteoclastos, os osteoblastos/células de revestimento ósseo
produzem colagenase, removendo a camada de osteóide, expondo a matriz
mineralizada aos osteoclastos que se tornam ativos em contato direto com a
matriz óssea mineralizada
12
.
Outra possibilidade de modular a formação e
atividade osteoclástica seria a partir de sinais gerados no microambiente, com a
liberação de citocinas. As citocinas são moléculas de regulação, solúveis, de baixo
peso molecular, expressas como proteínas de membrana ou secretadas, que se
ligam a receptores específicos, em células alvo. Têm um papel vital tanto na
regulação do tecido ósseo em condições fisiológicas quanto patológicas
8-9,35
.
A formação do osso envolve a proliferação e migração das células
osteoprogenitoras e diferenciação dos osteoblastos. Este processo é controlado por
uma cascata de eventos combinados a uma programação genética com a regulação
47
de genes por fatores sistêmicos e locais, entre eles os hormônios, citocinas e
fatores de crescimento
8
.
A maioria dos fatores que controla a reabsorção óssea age
diretamente nos osteoblastos, tais como PTH, 1,25 dihidroxivitamina D3,
esteróides sexuais, prostaglandinas (PGs), citocinas (Interleucina-1, Interleucina-6
e Interleucina-11), TGF-∃. Portanto, estes fatores estimulam os osteoblastos a
liberarem moléculas que estimulam a migração e adesão à superfície óssea que
deve ser reabsorvida. Sendo assim, os osteoblastos participam do processo de
remodelação óssea, não somente produzindo matriz óssea, mas também
controlando a atividade dos osteclastos. As citocinas e fatores de crescimento,
especialmente o TGF-∃, liberados da matriz durante sua degradação, atuam
como uma alça de “feed-back” e desencadeiam a formação e ativação de
osteoblastos para sintetizar e depositar uma quantidade equivalente de osso novo
na lacuna de reabsorção
3,11
.
Algumas citocinas e hormônios envolvidos na remodelação óssea
- PTH e vitamina D
3
atuam nos osteoclastos, indiretamente,
através de receptores nos pré-osteoblastos, osteoblastos e células de revestimento
ósseo
8
.
- Interleucina-1 (IL-1)
∀
e fator de necrose tumoral (TNF-
∀
) são
citocinas derivadas da linhagem dos monócitos-macrófagos e estimulam a
reabsorção óssea através de uma via autócrina. Estimulam os osteoclastos
48
maduros e a proliferação de seus precursores. Sua ação têm sido demonstrada na
reabsorção óssea tanto “in vivo” quanto “in vitro”
35
.
- Interleucina-6 (IL-6) é uma citocina produzida pelos
osteoclastos, células do estroma e células da linhagem monócito-macrófago
36
.
Aumenta a reabsorção óssea através do estímulo e receptores presentes na
membrana celular dos osteoclastos. No entanto, a ação da IL-6 estimulando a
reabsorção óssea por via parácrina também foi demonstrada
2
. Aumenta a
reabsorção óssea estimulada pela IL-1 e TNF, mas não estimula a reabsorção
óssea mediada pelo PTH e 1,25 Dihidroxivitamina D. Anticorpos para IL-6
bloqueiam a reabsorção óssea produzida pela IL-1 e TNF indireta
9
. É também
produzida pelas células osteoblásticas em resposta ao PTH e Vitamina D
3
8
.
A citocinas IL-1, TNF e IL-6 estimulam a produção dos
precursores dos osteoclastos, o que leva a um aumento do turnover ósseo
36-39
.
- Antagonista do receptor IL-1 é uma citocina relacionada à
família do gene da IL-1, proveniente da linhagem celular dos monócitos. Liga-se
ao receptor da IL-1 e compete com a IL-1∀ e ß pela ligação e ativação deste
receptor. É um inibidor muito efetivo da reabsorção óssea osteoclástica,
estimulada não apenas pela IL-1, mas pelo TNF
9
.
- RANKL é uma citocina da família do TNF, essencial para a
indução da osteoclastogênese
40-41
. Expresso pelas células T ativadas, é uma
molécula importante que vem sendo muito estudada no campo da
osteoimunologia, que é a interação entre o sistema imune e o sistema esquelético
2
.
Também é expresso pelos osteoblastos que se unem com RANK, ativando-os. O
49
fator nuclear de células T ativadas c1 (NFATc1), membro da família do fator de
transcrição gênica NFAT, é um fator de transcrição gênica fortemente induzido
pelo estímulo do RANKL
38
.
- RANK é uma proteína transmembrana, expressa nos progenitores
dos osteoclastos, osteoclastos, células T, células B, células dendríticas e células
epiteliais da glândula mamária. É um membro da superfamília dos receptores do
fator de necrose tumoral (TNFR)
42
.
- Osteoprotegerina (OPG) é um membro da superfamília dos
receptores do fator de necrose tumoral (TNFR) que regula negativamente a
formação e ativação dos osteoclastos
40,42
, interrompendo a ligação RANK-
RANKL por ligar-se ao RANKL. Secretada pelos osteoblastos, ao competir com
esta ligação é tida como a chave do mecanismo regulatório da diferenciação e
atividade osteoclástica
8
. É produzida primariamente pelos osteoblastos e seus
precursores, mas também pode ser expresso pelas células B e células dendríticas.
Sua produção é aumentada em resposta a IL-1, IL-6, IL-11, TNF, fator de
crescimento transformante (TGF-∃) e estrógeno e é inibida pelo PTH
42
.
- Fator de crescimento transformante-
∃
(TGF-ß), produzido pelos
osteoblastos e células da medula óssea, é o mais abundante dos fatores de
crescimento armazenado no osso
43-45
. Este fator estimula a formação óssea, como
também pode inibir a diferenciação, formação e atividade dos osteoclastos
maduros
46
. Armazenado no osso, é produzido quando há estímulo para reabsorção
óssea, podendo ser um mecanismo importante na desativação osteoclástica
9
.
50
- Interferon-γ (INF-γ) é uma citocina multifuncional, produzida
pelas células T, que apresenta tanto a capacidade de proliferação quanto de
diferenciação dos progenitores dos osteoclastos. Pode suprimir fortemente a
osteoclastogênese por interferir com a via de sinalização RANKL
2,38
. Pode ser um
fator crítico na manutenção da integridade óssea através de um processo mediado
pelas células T
38
.
- Interferon-
∃
(INF-
∃
) é uma citocina que está seletivamente
envolvida na regulação dos osteoclastos e possui um efeito benéfico na destruição
óssea, provavelmente regulando negativamente a osteoclastogênese, através de
uma sinalização cruzada com a via RANKL
37
.
- 1,25 Dihidroxivitamina D é um hormônio da mineralização
óssea
47
, produzido no rim, sob o comando do PTH, fosfatase e cálcio. Há
evidências de que também possa ser produzido pelas linhagens dos linfócitos e
monócitos, sendo um importante mecanismo para a formação osteoclástica no
espaço medular. Age tanto como um fator de diferenciação nas células
progenitoras quanto na célula já madura, provavelmente por ação indireta
9
.
- Estrógeno é um hormônio que suprime a produção de citocinas
de reabsorção óssea, como a IL-1 e IL-6
8
e provavelmente inibe a atividade de
reabsorção via osteoblastos
11
.
- Calcitonina é um hormônio secretado pela tireóide. Além de
diminuir os níveis plasmáticos de cálcio, inibe a proliferação e diferenciação dos
precursores dos osteoclastos
8
.
51
As células T expressam RANK, RANKL, INF
entre outras
citocinas, participando ativamente no processo de osteoclastogênese, sendo que o
equilíbrio da produção destas citocinas é primordial no balanço da remodelação
óssea, já que determinam o equilíbrio entre osteoblastos e osteoclastos
38
.
As células do tecido ósseo estão sob a ação de múltiplos fatores
locais e sistêmicos. O conhecimento da ação destes fatores sobre as células ósseas
e conseqüentemente da interferência destes fatores sobre o metabolismo ósseo,
pode contribuir para a compreensão dos mecanismos celulares e moleculares
envolvidos em diversas doenças ósseas. Assim, estudos têm sido realizados com a
finalidade de encontrar tratamentos efetivos para as doenças que promovem a
perda óssea, tais como: doença osteoporótica pós-transplante que acometem
pacientes imunossuprimidos, doença periodontal ou osteopatias metabólicas,
como a osteoporose e a osteomalácia, entre outras. Assim, os estudos de biologia
molecular relacionados ao tecido ósseo visam esclarecer os diversos fatores que
interferem com a proliferação, migração, diferenciação, atividade e sobrevivência
das células ósseas. No entanto, os estudos revelam que há uma multiplicidade de
fatores; além disso, geralmente estes fatores agem de forma coordenada.
A compreensão deste processo, como um todo, pode ser a chave
para o desenvolvimento de um protocolo de tratamento que poderia levar ao
equilíbrio dessas doenças ósseas.
52
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Artigo 2
The influence of CsA and FK506 based immunosuppression on
alveolar bone: a histometric, stereometric and ultrastructural
study
Denise Carleto Andia (Andia, DC)*
Carlos Augusto Nassar (Nassar, CA)*
Patrícia Oehlmeyer Nassar
(Nassar, PO)*
Morgana R Guimarães (Guimarães, MR)***
Paulo Sérgio Cerri (Cerri, PS)**
Luis Carlos Spolidorio (Spolidorio, LC)***
Department of Periodontology*, Department of Morphology**, Department of
Physiology and Pathology***, Dental School, Araraquara, University of State of
São Paulo, Brazil.
Corresponding author:
Prof. Dr. Paulo Sérgio Cerri
University of State of São Paulo – UNESP
Dental School - Rua Humaitá, nº 1680, caixa postal 331,
Araraquara, SP – Brazil - CEP: 14801–903
Department of Morphology
Phone: + 55 16 33016497 Fax: + 55 16 33016433
e-mail: [email protected]
Running title – The influence of CsA and FK506 on alveolar bone
* Article submitted to Journal of Periodontal Research
59
Abstract
Background and objectives: A frequent complication reported in patients
following organ transplantation is the development of osteopenia and it has been
suggested that immunosuppressive therapy may be an important factor in the
development of post-transplant bone disease. The purpose of this study was to
describe the histometry, stereometry of the alveolar bone and the ultrastructure of
osteoblasts and osteoclasts of rats treated with CsA or FK506.
Material and Methods: Rats were treated with a daily subcutaneous injection of
10mg/kg body weight of CsA or with 1mg/kg body weight of FK506 for 60 days.
At the end of experimental period, rats were sacrificed and after histological
processing, stereometric parameters: number of multinucleated osteoclasts/mm,
number of osteoblasts/mm, alveolar bone (V
bo
), marrow (V
m
) and other structures
(V
o
) were assessed at the furcation region of the first upper molar as well as
histometric parameters: linear distance of the alveolar bone surface and
ultrastructural parameters of osteoclasts and osteoblasts were analysed.
Results: The results confirmed that CsA causes a more severe alveolar bone loss
than FK506. The therapy with CsA decreased the number of osteoblasts/mm and
V
bo
and increased the number of multinucleated osteoclasts/mm and V
m.
However,
the systemic therapy with FK506 induced the decrease in multinucleated
osteoclasts/mm, but mainted V
bo
and V
m.
The surface of the alveolar bone
exhibited numerous deep excavations associated with multinucleated osteoclasts
that exhibiting typical ruffled border, abundant mitochondria and vacuoles were
60
closely apposed to irregular surfaces of the bone. Occasionally, the deep
excavations contained some osteoblasts that appeared to be producing a collagen-
rich extracellular matrix on the previously resorbed bone surface. On the other
hand, FK506-treated rats showed a continuous layer of active osteoblasts with
well-developed rough endoplasmatic reticulum. The few multinucleated
osteoclasts appeared to be detaching from the previously reabsorbed bone lacuna.
The excavated bone surfaces were often filled by active osteoblasts and rich-
collagen matrix.
Conclusions: Our data indicate that at 60 days, it is possible to suggest that the
CsA induced imbalance bone metabolism is associated with
a tendency in
increasing the osteoclast number,
decreased in the V
bo
and increased in the
osteoclast metabolism. CsA and FK506 can imbalance the bone metabolism at the
furcation region in rats, by altering the balance between the number of osteoblasts
and osteoclasts, but FK506 unlike CsA is not associated with alveolar bone loss.
Keywords - cyclosporine, tacrolimus, osteoclasts, osteoblasts
61
Introduction
Cyclosporin-A (CsA) and Tacrolimus (FK506) are drugs used as
an immunosuppressant protocol pos-transplant (1,2) and inhibit the immune
function by blocking the enzyme activity of calcineurin and the nuclear factor of
activated T cells c1 (NFATc1). This inhibition occurs by complexes formed with
their respective binding proteins: cyclophilin and FK506-binding protein12
(FKBP12) (3), reducing the expression of interleukin and other cytokines, as well
as activating the T lymphocyte (3-6). The development of osteopenia and
pathologic fractures is a frequent complication reported in patients following
organ transplant (4,7), but it is still unclear the contribution of these
immunosuppressant drugs to the occurrence of bone loss and how the imbalance
of the bone turnover happens.
Some studies using CsA have shown an increased in bone turnover
and a decrease in bone mass with biochemical and morphological changes (8-10).
Some results of high turnover that leads to an osteopenia state have been reported
in rats treated with FK506 (5,11,12) and others suggests an increase in bone
metabolism without changes in bone density (13-19).
Osteoclasts are multinucleated cells, derived from hematopoietic
precursors, which breakdown and reabsorb bone matrix (20,21). Otherwise,
osteoblasts- differentiated from mesenchymal progenitors - are responsible for the
formation and mineralization of the bone tissue (22,23). The coordinate
interaction between osteoblasts and osteoclasts plays a significant role in the
62
maintenance of bone homeostasis (21,24). The imbalance between osteoclasts and
osteoblasts could lead to bone diseases, such as osteoporosis or osteopetrosis
(25,26), and an increased metabolism (27), through change of number and activity
of these cells and it is possible that this imbalance can be related with the
inhibition of the nuclear factor of activated T cells c1 (NFATc1), identified as the
master transcription factor for osteoclastogenesis (27).
The effect of FK506 on the bone metabolism is conflicting and
some authors have reported a tendency for the bone tissue, under the FK506
influence, to conserve the structural and biochemical integrity (19), even with the
increased metabolism. The aim of this study was to describe the histometry and
stereometry of the alveolar bone and the ultrastructure of the osteoclasts and
osteoblasts of rats that were treated with CsA or FK506.
63
Material and methods
Animals
Thirty, 4-week-old male Holtzman rats (Norvegicus albinus)
weighing an average of 100g were selected and randomly distributed into three
groups of ten animals each. The rats were housed in polypropylene cages in
groups of five animals per cage at controlled temperature (23±2°C) and humidity
(55%±10%) and 12/12 hours light/dark cycle beginning at 7:00 a.m. Standard
chow and tap water were available ad libitum. All the protocols described below
were approved by the local Ethics Committee of the School of Dentistry of
Araraquara, São Paulo, Brazil.
Drugs
The animals received daily doses of either 10mg/kg body weight of
CsA (Sandimmun, Neoral, Novartis, Brasil), 1mg/kg body weight of FK506
(Prograf, Janssen-Cilag-Brasil) or saline (control group) as subcutaneous
injections (28,29). The rats were weighed weekly and monitored for abnormal
appearance of coat and abnormal level of activity and all rats were sacrificed 60
days after the beginning of the treatments.
64
Stereological analysis (Figure A)
The upper maxilla was carefully removed and the right side was
decalcified in solution of Morse (50 mL of 50% formic acid and 50 mL of 20%
sodium citrate). Serial paraffin sections of 5µm were made on the buccal-lingual
aspects and stained with hematoxylin and eosin. Volume densities of alveolar
bone (V
bo
), bone marrow (V
m
) and other structures (V
o
) (dentin, cementum and
periodontal ligament) were estimated according to the principles established by
Dellesse (30), which were applied to histology by Weibel (31).
The capture of the
images was performed by a digital camera Olympus Camedia C 5060, coupled
with a Olympus BX 51 light microscope, using a magnification of x40. A square
lattice of 120 points was projected over each image in the furcation region of the
first upper molar and the points of coincidence were counted (bone, bone marrow
and other structures). For each animal, 8 sections were used and 120 points were
counted in each section. V
bo,
V
m
and
V
o
were expressed as percentage of the total
points counts. To confirm the results, other two parameters were defined for these
same sections. Over the bone surface, from the one apical region to another one,
the number of osteoclasts-like cells (oc/mm) and the number of active
osteoblasts-
like cells (ob/mm) were counted using an Olympus X 51 light microscope in each
section for each animal (8 sections/animal), using a magnification of x400. The
data was expressed in oc/mm and ob/mm.
The Stereological and Histometric analysis were made by a single-
blind and calibrated examiner.
65
FIGURE A- Square lattice of 120 points was projected over each image in the furcation
region of the first upper mollar and the points of coincidence was counted (bone,
marrow and other structures); V
bo,
V
m
and
V
o
were expressed as percentage of the total
points counts; magnification x40.
66
Histometric analysis (Figure B)
The same images used in the stereologic analysis were used to
perform the histometric analysis. To access the linear distance of the alveolar
bone surface, a line was drawn on the bone surface in the furcation region, from
one apical region to another one, using an image analysis system (Image Tool, 3.0
version). The data was expressed in mm.
Figure B – A line was drawn on the bone surface in the furcation region, from one apical region to
another one. The data was expressed in mm.
67
Statistical analysis
Comparisons between groups regarding stereologic and histometric
data were made using the one-way analysis of variance (ANOVA) and when
ANOVA test showed significant differences, pairwise multiple comparisions were
used (Tuckey test). Significance level was always set at 99%.
Ultrastructural analysis
Fragments of the left maxilla containing the upper first molar were
fixed in a mixture of 4% glutaraldehyde and 4% formaldehyde (from
paraformaldehyde) buffered at pH 7.2 with 0.1M sodium cacodylate at room
temperature for 24 hours. After the decalcification for 45 days in 7% EDTA
containing 0.5% formaldehyde buffered at pH 7.2 in sodium cacodylate 0.1 M,
the specimens were washed in 0.1 M cacodylate buffer (pH 7.2). They were
transferred to cacodylate-buffered 1% osmium tetroxide at pH 7.2 for 1-1.5 h at
room temperature and subsequently treated with aquous 2% uranyl acetate for 2 h.
After dehydration in graded concentrations of ethanol, the specimens were treated
with propylene oxide and then embedded in Araldite. Toluidine-stained semithin
sections (250-280 µm) were examined under a light microscope for selection of
regions to be trimmed. Ultrathin sections (90µm) were collected onto grids and
stained with uranyl acetate and lead citrate before examination in a Zeiss EM10
transmission electron microscope.
68
Results
Stereologic and histometric findings
Figure 1 shows volume densities of alveolar bone (V
bo
)
,
bone
marrow (V
m
) and other (V
o
) of the CsA-treated rats, FK506-treated rats and
control group. The V
bo
was lower in CsA-treated rats (41% ± 6), than it was
verified in the control group (54% ± 4) and FK506 (50% ± 5) (P<0.01). There
were no statistical difference between FK506-treated rats and control group. On
the other hand, the V
m
was greater for the CsA-treated rats (14% ± 5) than FK506
and control groups (7.4% ± 4 and 7.5% ± 3, respectively) (fig.1). There was no
statistical difference amongst all groups for the evaluation of the V
o
(CsA 44% ±
6, FK506 42% ± 7 and control 37% ± 6) (P<0.01) (fig.1). The linear distance of
the alveolar bone surface was greater in the CsA-treated rats (4.3mm ± 0.71).
There were no difference between FK506-treated rats and control group (3.9mm ±
0.65 and 3.8mm ± 0.88 respectively) (fig.2).
Others
Bone
Marrow
Others
Bone
Marrow
Others
Marrow
FK506
CsA
%
0
10
20
30
40
50
60
70
Bone
NaCl
*
*
FIGURE 1 – Volume densities of alveolar bone (V
bo
)
,
bone marrow
(V
m
) and other (V
o
) (%) of the
furcation area of the first upper molar of the rats treated with CsA, FK506 or NaCl, at 60 days.
Difference was assessed by using ANOVA and Tukey test (P<0.01). * Significant difference for
the CsA group in comparison with FK506 and control group.
69
CsA
mm
0
1
2
3
4
5
6
FK506
NaCl
*
FIGURE 2 - Distance (mm) of alveolar bone surface of one apical region to another one on
furcation area of the first upper molar of the rats treated with CsA, FK506 or control, at 60 days.
Difference was assessed by using ANOVA and Tuckey test (P<0.01). * Significant difference for
the CsA group in comparison with FK506 and control group.
The oc/mm was assessed in all groups and is demonstrated in fig.
3. The FK506-treated rats showed a decrease in the oc/mm when compared to
CsA-treated rats and control group (0.9oc/mm ± 0.43, 2.6oc/mm ± 0.97 and
2.52oc/mm ± 0.77, respectively) (P<0.01). The ob/mm was lower in the CsA-
treated rats (20.84ob/mm ± 4.5) (P<0.01) (fig. 4), with significant difference in
regards to the other groups. There were no statistical difference between FK506-
treated rats (28.26ob/mm ± 7.4) and control group (32.60ob/mm ± 8.0) (fig.4).
70
oc/mm
0
1
2
3
4
CsA
FK506
NaCl
*
FIGURE 3 – Number of osteoclasts/mm of alveolar bone surface of one apical region to another
one on furcation area of the first upper molar of the rats treated with CsA, FK506 or NaCl, at 60
days. Difference was assessed by using ANOVA and Tukey test (P<0.01). * Significant difference
for the FK506 group in comparison with CsA and control group.
FK506
ob/mm
0
10
20
30
40
50
*
NaCl
CsA
FIGURE 4 – Number of osteoblasts/mm of alveolar bone surface of one apical region to another
one on furcation area of the first upper molar of the rats treated with CsA, FK506 or NaCl, at 60
days. Difference was assessed by using ANOVA and Tukey test (P<0.01). * Significant difference
for the CsA group in comparison with FK506 and control group.
71
Microscopy findings
The outer cortical plate, facing the lips and cheeks, and the inner
cortical plate, facing the tongue and palate, consist of a compact and lamellar
bone. The bone around the root is a layer of relatively compact bone and it is
called the alveolar bone or cribriform plate, because of the many small openings
for blood vessels and nerves that communicate between the marrow spaces and
the periodontal ligament. Between the cortical plates and the alveolar bone or
cribriform plate, spongy bone is present. Spongy bone consists of a sparse number
of bone trabeculae running inside bone marrow. The sockets of two roots of a
multi-rooted tooth are separated from each other by an interradicular septum. This
septum consists of the cribriform plates of both roots and spongy bone. The
spongy bone of control rats and FK506-treated rats (Fig. 5A and 5B) were similar
and the bone surface was continuous and regular (Fig. 5Aa and 5Bb). The spongy
bone of the CsA-treated rats (5C) showed increased marrow spaces and the bone
surface showed numerous irregularities and excavations (Fig. 5Cc).
72
FIGURES 5A, 5B e 5C - Lights micrographs of furcation region of the first upper molar stained by
hematoxylin and eosin. FIG. 5A is a first upper molar of the control group, with regular trabeculae
and marrow spaces in between. Bar: 250µm. FIG. 5Aa shows regular bone surface (arrows). Bar:
50µm. FIG. 5B is the first upper molar of the FK506-treated group with regular trabeculae and
marrow spaces in between. Bar: 250µm. FIG. 5Bb shows continuous and regular bone surface
(arrows), similar to the control group. Bar: 50µm
. FIG. 5C is a first upper molar of the CsA-treated
group, with decreased bone mass containing several marrow spaces. Bar: 250µm. FIG. 5Cc
showed irregular bone surface (arrows). Bar: 50µm. PL – periodontal ligament; B – alveolar bone.
73
Ultrastructural findings
The alveolar bone of the saline treated rats revealed numerous
secretory osteoblasts apposed to bone surface. Frequently, the polarized
osteoblasts containing several profiles of rough endoplasmic reticulum and well-
developed Golgi saculles were in close juxtaposition to unmineralized bone layer,
osteoid. The unmineralized layer exhibited predominantly cross-sectioned
collagen fibrils; in some areas, these fibrils were densely packed forming bundles
of collagen fibrils, which appeared to be in continuity to bone surface (Fig. 6A).
Bundles of longitudinal or obliquely sectioned collagen fibrils penetrated into the
bone, forming the Sharpey´s fibers. The Sharpey´s fibers, orientated perpendicular
to the bone surface, perforated the continuous layer of osteoblasts that covered the
osteoid (Fig. 6B).
In the CsA treated rats, the surface of the alveolar bone exhibited
numerous deep excavations in which multinucleated osteoclasts were observed.
Frequently, osteoclasts exhibiting typical ruffled border, abundant mitochondria
and vacuoles were closely apposed to irregular surfaces of the bone (Fig. 7A).
Large and multinucleated osteoclasts were also found next to excavated surfaces
of the bone. These detached osteoclasts exhibited elongated shape, irregular nuclei
and mitochondria sparsely distributed in their cytoplasm (Fig. 7B). An electron-
opaque line often limited the irregular surfaces of the reabsorbed bone (Figs. 7B
and 7C). Occasionally, the deep excavations contained some osteoblasts that
appeared to be producing a collagen-rich extracellular matrix on the previously
74
reabsorbed bone surface (Figs. 7B, 7C and 7D). Sometimes, irregular electron-
opaque lines, typical reversal lines, were bounding the thin layer of newly formed
bone of the original bone (Fig. 7D).
Generally, the alveolar bone surfaces of the FK-506 treated rats
showed a continuous layer of active osteoblasts with well-developed rough
endoplasmic reticulum. These large and polarized osteoblasts were in close
juxtaposition to unmineralized bone matrix containing numerous collagen fibrils
(Fig. 8A). The scarce multinucleated osteoclasts were also observed on the bone
surface; some of these cells appeared to be detaching from the previously
reabsorbed bone lacuna (Fig. 8B). The excavated bone surfaces were often filled
by active osteoblasts and rich-collagen matrix (Fig. 8B). In these areas in which
active bone formation took place, the electron-opaque lines - typical of reserval
lines - were present in the bone. Sometimes, osteoblasts exhibiting short
cytoplasmic projections were surrounded by bundles of collagen fibrils densely
packed (Fig. 8C).
75
Figures 6A and 6B – Electron micrographs showing portions of alveolar bone
from saline treated rats. In fig. 6A, a continuous layer of secretory osteoblasts
(OB) is in close juxtaposition to surface of the alveolar bone (B). These polarized
osteoblasts (OB) exhibit large cytoplasm containing numerous profiles of rough
endoplasmic reticulum (Re) and some cytoplasmic projections (arrows) towards
the bone matrix. Bar: 2.0µm. In fig. 6B, a bundle of longitudinal or obliquely
sectioned collagen fibrils (SF) penetrate into the bone (B). Portion of osteoblast
(OB) is apposed to a layer of unmineralized matrix (M) which covers the surface
of the bone (B). Bar: 2.5 µm.
B
1Aa
76
77
Figures 7A, 7B, 7C and 7D – Electron micrographs showing portions of alveolar
bone from CsA treated rats. In fig. 7A, a multinucleated osteoclast (OC)
exhibiting typical ruffled border (RF) and clear zone (CZ) is apposed to the
surface of the bone (B). This osteoclast (OC) contains numerous mitochondria (m)
distributed throughout the cytoplasm and vacuoles (v) of varied sizes, which are
mostly next to ruffled border (RF). Bar: 3.0µm. In fig. 7B, irregular osteoblasts
(OB) are present on a material rich in collagen fibrils (CF) that covers partially an
excavated surface of the bone (B). Portions of osteoblasts/bone lining cells (BC)
are also observed in close juxtaposition to the bone surface (B). A multinucleated
osteoclast (OC) is observed next to bone excavation. (Ca) Blood capillary. Bar:
2.5µm. The fig. 7C shows a deep excavation in the surface of the bone (B).
Irregular osteoblasts (OB) are observed in this bone excavation (B) in close
association to collagen fibrils, which are forming a thin layer on the bone surface.
Bar: 2.5µm. The fig. 7D shows an osteoblast (OB) surrounded by numerous cross
or obliquely sectioned collagen fibrils (CF) which extend a projection (P) towards
to bone surface. A layer of newly bone (NB) is covering the original bone (B); an
irregular and electron opaque line (arrowheads) is observed between the newly
(NB) and original bone (B). Bar: 2.5µm.
78
79
Figures 8A, 8B and 8C – Electron micrographs showing portions of alveolar
bone from FK506 treated rats. In the fig. 8A, portions of typical osteoblasts (OB)
exhibiting numerous rough endoplasmic reticulum cisternae (Re) and well-
developed Golgi apparatus (G) are juxtaposed to a layer of unmineralized bone
matrix - osteoid (M). This unmineralized bone layer (M) is formed by numerous
profiles of cross or obliquely sectioned collagen fibrils. Bar: 0.5µm. In fig. 8B, a
deep excavation in the surface of the bone contains some apparently active
osteoblasts (OB). A multinucleated osteoclast (OC) showing irregular shape
appears to be detaching from the surface excavated of the bone (B). Bar: 2.0µm.
In fig. 8C, an excavation in the surface of the alveolar bone contains an irregular
osteoblast (OB). Numerous collagen fibrils (CF) are packed around the osteoblast
(OB). In the excavated region, the alveolar bone exhibits three electron opaque
lines (arrowheads) indicating the continuous deposition of the bone matrix. Bar:
1.0µm.
80
81
Discussion
This study was designed to describe the characteristics of the
alveolar bone under treatment with immunosuppressant agents, CsA or FK506, in
rats. During the experiment, the rats presented normal level of activity and
appearance of coat. The CsA and FK506-treated animals showed a decrease in
weight when compared to the control group, without statistic difference. The
period of treatment was based on previous observations and the chosen dose of
1mg/kg body weight of FK506 and 10mg/kg body weight of CsA was sufficient
to achieve therapeutic drugs serum levels (29). The dose of FK506 (1mg/kg body
weight) is clinically relevant and within the range of doses used in studies on
organ and limb transplants as well as the ones used in studies on bone metabolism
usually between 0.6 and 1.0 mg/kg body weight (32-34). CsA injected
subcutaneously for 60days, in a dose of 10mg/kg body weight (28,35) gives
estimated peak and trough levels of 1000 mg/mL and 750 mg/mL, respectively.
All the rats used in this experiment, responded positively and uniformly to
treatments. In fact, many variables are better controlled in rats such as genetic
predisposition, gender, age, dose and duration of treatment.
Duration of the treatment with CsA seems to be an important
variable for bone metabolism. Schlosberg et al. (36) and Spolidorio et al. (10)
showed that the effect of CsA on bone metabolism is dependent on the duration of
treatment and the increased bone reabsorption seems to be more accentuated in
short periods (60 and 120 days) that long periods (180 and 240 days). The present
82
study confirmed that 60 days of CsA administration, in doses that have been
reported to be immunosuppressive in the rat (37), induced bone loss. Bone loss
was represented by a tendency in increasing osteoclast-like cell number and
decreasing osteoblast-like cell number. Deep excavations observed in alveolar
bone surfaces suggest that the CsA induces bone reabsorption. Although there has
been only a tendency of increase in osteoclast-like cell number, it is possible to
suggest that these cells presented high metabolic activity, suggested by
ultrastructural images. The osteoclast cells of rats treated with CsA showed
typical ruffled border and numerous mitochondria when compared to the control
rats and the FK506-treated rats, indicating osteoclast activity and therefore intense
bone reabsorption. At the same time, a significant decrease in the number of
osteoblast-like cells were observed, suggesting that CsA may cause disturbance in
the balance between osteoclasts and osteoblasts, which are responsible for the
homeostasis on bone tissue. In addition, bone formation on previously reabsorbed
bone surfaces was rarely observed. As a result, the present findings confirm the
idea that CsA inhibits bone formation and concomitantly promotes the bone
reabsorption what resulted in the reduction of the bone mass.
Some studies in vitro showed inhibition on bone reabsorption
(38,39) that are conflicting with some in vivo studies (8-10) and it may be due to
the fact that the whole animal is more representative of the influence of
interactions between CsA and immune system when compared with local factors
studied in vitro systems (39). The differentiation and function of osteoblasts and
osteoclasts are tightly regulated by growth factors and cytokines and the loss of
83
this balance caused by CsA immunosuppressant treatment may lead to bone
diseases, like osteoporosis post transplant. It is possible to suggest that CsA,
reducing the expression of interleukin as well as T lymphocyte activation can
imbalance the action of bone forming-osteoblasts and bone reabsorbing-
osteoclasts, unbalancing the homeostasis of bone tissue. In the present study, the
data suggest that CsA decreased osteoblast-like cells number while osteoclast-like
cells showed an increased activity, since our results showed a decrease in the
volume density of alveolar bone.
The FK506-treated rats showed maintenance on volume densitiy of
alveolar bone. This may be explained by the maintenance of osteoblast-like cell
number, comparing to the control group, frequently observed as a continuous
layer on bone surface. Besides, the osteoblasts were founded on excavated bone
surfaces and showed features of active cells, such as a fairly rough endoplasmic
reticulum and well-developed Golgi sacules (22,23). In addition, a newly forming
bone matrix was observed between these active osteoblasts and the irregular bone
surfaces. Therefore, these ultrastructural findings indicated that the osteoblasts are
producing new bone matrix on previously reabsorbed bone surfaces; this idea is
reinforced by the presence of reverse lines observed in the alveolar bone. On the
other hand, there was a decrease in the osteoclast-like cells number adjacent to
alveolar bone surface. In addition, the ultrastructural examination revealed that
some osteoclasts were detached from the bone surface indicating that these cells
were inactive. Therefore, the typical osteoclasts exhibiting ruffled border were
occasionally observed. Thus, it is reasonable to suggest that the FK506 may have
84
the ability to reduce bone resorption activity, acting on the bone tissue remodeling
process, as described by Inoue et al. (13). It has been suggested that FK-506 may
have positive effects on bone metabolism, regarding to CsA. The data of this
study are in line with the findings of Yoshikawa et al. (40) and Tang et al. (2001)
(41) that suggest a positive effect of FK506 in the osteoblast differentiation. It can
be inferred that the osteoclastogenesis pathway, through signaling calcium
pathway, can be more affected by the FK506 than by the CsA.
The signaling calcium pathway is one of the pathways that leads
to the induction and activation of nuclear factor of activated T cells (NFAT) c1,
the master transcription factor of osteoclastogenesis (27). This fact led us to
recognize how important is the signaling calcium-calcineurin pathway on the
osteoclastic differentiation. NFATc1, when translocates into the nucleus, connect
to the promoter region of interleukin genes, like interleukin-2 (IL-2), Interferon
(INF), interleukin-1∃ (IL-1∃) and necrosis tumor factor (TNF-∀) causing their
transcription and secretion (42,6).
Since CsA and FK506 are immunosuppressant agents that inhibit
calcineurin activity, an enzyme calcium dependent, they interfere with signaling
calcium pathway, inhibiting the transcription of NFATc1 and consequently
causing no only osteoclastogenesis (27) but also the inhibition of secretion of
these cytokines (5,6).
In the present study was possible to observe a significant decrease
in the number of osteoclasts-like cells in FK506 treated rats and it can be
explained by the mechanism of action above described. On the other hand, the
85
CsA-treated rats showed a decrease in the osteoblast-like cell number,
accompanied by a reduction in the bone volume. So it is possible to suggest that,
although both immunosuppressant agents are calcineurin inhibitors and exert their
effects in the immune system by similar pathways, they can promote different
results. The different effects on osteoblasts cellular proliferation and
differentiation could be explained by their distinct pathways, after forming the
complexes with their respective proteins (43). However, the exact mechanisms of
action of these immunosuppressant agents are still unclear and needs to be
clarified. In summary, the present data suggest that the rats treated with CsA
showed bone resorption greater than bone formation, associated with increased
activity of osteoclasts and a tendency in increasing the osteoclasts number and a
decrease in the osteoblasts number. On the other hand, the FK506 treated rats
showed a bone formation that overlapped the bone resorption, confirmed by the
increased activity and number of osteoblasts and decreased osteoclasts number.
Our data indicate that at 60 days, it is possible to suggest that the CsA induced
imbalance bone metabolism is associated with a tendency in increasing the
osteoclast number, decreased in the V
bo
and increased in the osteoclast
metabolism. CsA and FK506 can imbalance the bone metabolism at the furcation
region in rats, by altering the balance between the number of osteoblasts and
osteoclasts, but FK506 unlike CsA is not associated with alveolar bone loss.
86
Acknowledgements
The authors wish to thank the Prof. Dr. Pedro Duarte Novaes and
Eliene A.O.N. Romani from Department of Morfhology of Dental School of
Piracicaba (UNICAMP-Brazil) for the kind help with transmission electron
microscope. The authors express their gratitude to Ms. José Antônio Zuanon, from
Department of Physiology and Pathology of Dental School (UNESP-Araraquara-
Brazil), for histological preparation and technical assistance. This research was
supported by CNPq and CAPES, Brazil.
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Conclusão
Dentro dos limites deste estudo, os dados mostram que o desequilíbrio do
metabolismo ósseo induzido pela CsA está associado a uma tendência de aumento
do número de osteoclastos, diminuição do volume ósseo e aumento do
metabolismo dos osteoclastos. Tanto a CsA quanto o FK506 podem desequilibrar
o metabolismo ósseo na região de furca de ratos, através do desequilíbrio do
número entre osteoclastos e osteoblastos, mas o FK506 ao contrário da CsA não
está associado com perda óssea alveolar.
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com ciclosporina-a ou tacrolimus. 2006. 124f. Dissertação (Mestrado em
Periodontia) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista,
Araraquara, 2006.
Resumo
Ciclosporina-A e Tacrolimus (FK506) são os imunossupressores
mais comumente usados para reduzir a rejeição de transplantes de órgãos sólidos.
Uma freqüente complicação relatada em pacientes após o transplante de órgãos, é
o desenvolvimento de osteopenia. Assim, tem sido sugerido que a terapia
imunossupressora pode ser um fator importante no desenvolvimento da doença
óssea pós-transplante. Osteoblastos e osteoclastos são as células reguladoras do
metabolismo ósseo e estão sob a influência de fatores sistêmicos e locais. O
objetivo deste estudo foi descrever e comparar a histometria, estereometria do
osso alveolar e a ultraestrutura dos osteoblastos e osteoclastos de ratos tratados
com injeção subcutânea diária de CsA (10mg/kg peso corporal), FK506 (1mg/kg
peso corporal) ou NaCl (0.9%) (grupo controle), por 60 dias. Ao final do período
experimental, os ratos foram sacrificados e após o processamento histológico, os
parâmetros estereométricos: número de osteoclastos e osteoblastos/mm, de
superfície óssea, volume do osso alveolar (V
bo
), volume do espaço medular (V
m
) e
outras estruturas (V
o
) (ligamento peridontal, dentina e cemento) na região de furca
do primeiro molar superior, assim como os parâmetros histométricos: distância
linear da superfície óssea alveolar de uma região apical à outra e os parâmetros
118
ultraestruturais dos osteoclastos e osteoblastos foram analisados. Os resultados
confirmaram que a CsA causa uma perda óssea alveolar mais severa que o FK506.
A terapia com CsA diminuiu o número de osteoblastos/mm e V
bo
e promoveu uma
tendência do aumento do número de osteoclastos/mm de superfície óssea. Não
houve diferença entre os ratos tratados com FK506 e os ratos controle. No
entanto, a terapia sistêmica com FK506 induziu a uma diminuição do número de
osteoclastos/mm de superfície óssea. A superfície do osso alveolar de ratos
tratados com CsA apresentou numerosas excavações profundas associadas com
osteoclastos multinucleados. Os osteoclastos apresentavam borda em escova
típica, numerosas mitocôndrias e vacúolos na sua porção adjacente à superfície
óssea. Ocasionalmente, as profundas excavações continham alguns osteoblastos
que pareciam estar produzindo uma matriz extracelular rica em colágeno na
superfície óssea previamente reabsorvida. Por outro lado, os ratos tratados com
FK506 apresentavam uma camada contínua de osteoblastos ativos com retículo
endoplasmático rugoso bem desenvolvido. Os escassos osteoclastos
multinucleados pareciam estar desprendidos da lacuna óssea previamente
reabsorvida. As superfícies ósseas escavadas encontravam-se freqüentemente
preenchidas por osteoblastos ativos e matriz rica em colágeno. Os dados indicam
que, aos 60 dias, o desequilíbrio do metabolismo ósseo induzido pela CsA está
associado com a diminuição do volume ósseo, tendência de aumento do número
de osteoclastos e aumento do metabolismo dos osteoclastos. CsA e FK506 podem
desequilibrar o metabolismo ósseo na região de furca de ratos, através do
119
desequilíbrio entre o número de osteoblastos e osteoclastos, mas o FK506, ao
contrário da CsA, não está associado com perda óssea alveolar.
ANDIA, D.C. Características morfológicas do osso alveolar de ratos tratados
com ciclosporina-a ou tacrolimus. 2006. 124f. Dissertação (Mestrado em
Periodontia) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista,
Araraquara, 2006.
Abstract
Cyclosporine-A (CsA) and Tacrolimus (FK506) are the most
commonly used immunosuppressants to reduce the rejection of allogenic organ
transplants. A frequent complication reported in patients following organ
transplantation is the development of osteopenia and it has been suggested that
immunosuppressive therapy may be an important factor in the development of
post-transplant bone disease. Osteoblasts and osteoclasts are the regulators of
bone metabolism and are under influence by local microenviroment and
components of the immune system. The purpose of this study was to describe and
to compare the histometry, stereometry of the alveolar bone and the ultrastructure
of osteoblasts and osteoclasts of rats treated with a daily subcutaneous injection of
CsA (10mg/kgbody weight), FK506 (1mg/kgbody weight) or NaCl (0.9%)
(control group), for 60 days. At the end of the experimental period, rats were
sacrificed and after histological processing, stereometric parameters: number of
multinucleated osteoclasts/mm, number of osteoblasts/mm, volume of the alveolar
bone (V
bo
), volume of the marrow (V
m
) and other structures (V
o
) (periodontal
ligament, dentin and cementum) at the furcation region of the first upper molar as
well as histometric parameters: linear distance of the alveolar bone surface to one
120
apical region to another one and ultrastructural parameters of osteoclasts and
osteoblasts were analysed. The results confirmed that CsA causes a more severe
alveolar bone loss than FK506. The therapy with CsA decreased number of
osteoblasts/mm and V
bo
and increased number of multinucleated osteoclasts/mm
and V
m.
There was not difference between FK506- treated rats and control rats.
However, the systemic therapy with FK506 induced the decreased of number of
multinucleated osteoclasts/mm. The surface of the alveolar bone of the CsA
treated rats showed numerous deep excavations associated with multinucleated
osteoclasts. The osteoclasts showed typical ruffled border, abundant mitochondria
and vacuoles were closely apposed to irregular surfaces of the bone. Occasionally,
the deep excavations contained some osteoblasts that appeared to be producing an
extracellular matrix rich in collagen on the previously resorbed bone surface. On
the other hand, the FK506-treated rats showed a continuous layer of active
osteoblasts with a well-developed rough endoplasmatic reticulum. Few
multinucleated osteoclasts appeared to be detaching from the previously resorbed
bone lacuna. The excavated bone surfaces were often filled by active osteoblasts
and a rich-collagen matrix. The data indicate that, at 60 days, the imbalance of the
bone metabolism induced by CsA is associated with a tendency in increasing the
osteoclast number, decrease of the V
bo
and the increase of the osteoclast
metabolism.
CsA and FK506 can imbalance the bone metabolism at the furcation
region in rats, by altering the balance between the number of osteoblasts and
osteoclasts, but the FK506 unlike CsA is not associated with alveolar bone loss.
ANEXO
Carta de aprovação do projeto de pesquisa intitulado “Características
morfométricas e ultraestruturais do periodonto de ratos tratados com FK506 ou
Ciclosporina-A” pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal-CEEA da
Faculdade de Odontologia de Araraquara. Processo CEEA n.16/2004.
Autorizo a reprodução deste trabalho.
Araraquara, 20/01/2006.
Denise Carleto Andia.
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