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PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO
Rosângela Assis Jacques
i
DECLARAÇÃO DE AUTORIA
Este trabalho foi realizado pela autora, orientado pela Prof
a
Dra. Elina
Bastos Caramão e co-orientado pelo Prof. Dr. José Vladimir de Oliveira. Todo o
trabalho foi desenvolvido no laboratório de pesquisa E-202 e Central Analítica,
do Instituto de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e nos
laboratórios de Termodinâmica Aplicada e Central Analítica do Departamento
de Engenharia de Alimentos da Universidade Regional Integrada do Alto
Uruguai e Missões-Campus de Erechim.
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Rosângela Assis Jacques
ii
Esta tese foi julgada adequada para a obtenção do título de Doutor em
Química e aprovada em sua forma final, pela orientadora e pela banca
examinadora do Programa de Pós-Graduação em Química.
Orientadora: Profa. Dra. Elina Bastos Caramão
Co-orientador: Prof. Dr. José Vladimir de Oliveira
Banca Examinadora:
________________________________________
Profa. Dra. Martha Bohrer Adaime (UFSM/Santa Maria)
________________________________________
Profa. Dra. Sílvia Sargenti (UFSM/Santa Maria)
________________________________________
Prof. Dr Cláudio Dariva (URI/Erechim)
________________________________________
Profa. Dra. Cláudia Alcaraz Zini (IQ-UFRGS/Porto Alegre)
________________________________________
Prof. Dr. Sílvio Luiz Pereira Dias (IQ-UFRGS/Porto Alegre)
Prof. Dr. Adriano Lisboa Monteiro
Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Química
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Rosângela Assis Jacques
iii
CHIMARRÃO
Amargo doce que sorvo
num beijo em lábios de prata.
Tens o perfume da mata,
molhada pelo sereno.
E a cuia, seio moreno,
que passa de mão em mão,
traduz o meu chimarrão
na sua simplicidade
a velha hospitalidade,
da gente do meu rincão.
(Glauco Saraiva)
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Rosângela Assis Jacques
iv
DEDICATÓRIA
Aos meus amados pais Terezinha e Manoel, pela infinita paciência e
suporte a todo este trabalho e, simplesmente, por serem super pais.
Ao Edilson De Toni, pelo infinito amor, dedicação e, principalmente pela
paciência e companheirismo diário.
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Rosângela Assis Jacques
v
AGRADECIMENTOS
À professora Dra. Elina Bastos Caramão pela amizade, orientação, dedicação
e incentivo especialmente nos momentos mais difíceis deste trabalho.
Aos professores Dr. José Vladimir de Oliveira e Dr. Cláudio Dariva,
supervisores do trabalho desenvolvido na Universidade Regional Integrada do
Alto Uruguai e Missões, Campus de Erechim, pela amizade, incentivo,
dedicação e valiosas contribuições.
Aos colegas e amigos do Curso, em especial a Inês, Valéria, Cecília, Fernanda
e Lisiane pelo companheirismo e pelas sugestões e observações valiosas.
À Anelise Schmith e Flávio Pavan pela amizade.
Aos bolsistas de iniciação científica Ana Paula, Rafael, Jonathan, Bruna e
Camila que realizaram um trabalho sério e responsável, pela amizade e
companheirismo.
Aos demais alunos do Laboratório E-202 pela colaboração e amizade.
Aos demais professores e funcionários do Instituto de Química da UFRGS, pelo
apoio técnico.
Ao Dr. Sérgio do Amaral professor da URI-campus de Erechim, pela
contribuição na discussão das variáveis agronômicas da erva-mate.
À Eunice Valduga pela prestatividade, amizade e profissionalismo.
À Rositânia, funcionária da URI-campus de Erechim, pela amizade, incentivo, e
apoio técnico.
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Rosângela Assis Jacques
vi
À toda a família da prof. Elina que me acolheu carinhosa e cuidadosamente,
com verdadeira amizade, durante a execução da parte escrita deste trabalho.
À Ervateira Barão pelo plantio da erva-mate e cuidados com a colheita das
plantas utilizadas neste estudo.
Aos amigos do Instituto de Química da UFRGS e a todos aqueles que de uma
forma ou de outra contribuíram para a realização deste trabalho.
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Rosângela Assis Jacques
vii
ÍNDICE GERAL
Índice Geral.............................................................................................................................. vii
Lista de Figuras.................................................................................................................... x
Lista de Tabelas................................................................................................................... xi
Lista de Abreviaturas.............................................................................................................. xiii
Resumo.................................................................................................................................. xv
Abstract.................................................................................................................................. xvi
CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO................................................................................................ 1
CAPÍTULO 2: REVISÃO DA LITERATURA........................................................................... 6
1.0 ERVA-MATE................................................................................................................ 7
1.1 Classificação taxonômica......................................................................................... 7
1.2 Biologia reprodutiva.................................................................................................. 8
1.3 Habitat e distribuição geográfica............................................................................... 8
1.4 Importância da erva-mate......................................................................................... 9
1.5 Composição química da erva-mate........................................................................... 11
2.0 TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO APLICÁVEIS A PLANTAS........................................... 15
2.1 Extração por maceração......................................................................................... . 16
2.2 Extração com ultra-som............................................................................................ 16
2.3 Extração com líquidos pressurizados (PLE)............................................................. 20
2.3.1 Vantagens e desvantagens da extração com líquido pressurizado....................... 23
2.4 Extração com fluido supercrítico............................................................................... 25
2.4.1 Dióxido de carbono como solvente........................................................................ 26
2.4.2 Técnica de extração supercrítica........................................................................... 27
2.4.3 Equipamento típico da extração supercrítica......................................................... 26
2.5 Comparação das técnicas de extração..................................................................... 29
3.0 PLANEJAMENTO ESTATÍSTICO DE EXPERIMENTOS............................................. 30
4.0 ANÁLISE INSTRUMENTAL......................................................................................... 32
4.1 Cromatografia gasosa (GC)...................................................................................... 32
4.2 Espectroscopia de absorção atômica (FAAS).......................................................... 34
CAPÍTULO 3: DETERMINAÇÃO DOS MINERAIS DAS FOLHAS DE ERVA-MATE SOB
DIFERENTES CONDIÇÕES AGRONÔMICAS..............................................
35
1.0 EXPERIMENTAL.......................................................................................................... 36
1.1 Detalhamento experimental de campo...................................................................... 36
1.2 Amostras................................................................................................................... 37
1.2.1 Digestão das amostras.......................................................................................... 38
1.3 Procedimento para determinação dos minerais........................................................ 38
2.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 40
2.1 Influência das condições agronômicas sobre o teor de minerais nas folhas de
erva-mate........................................................................................................................
40
3.0 CONCLUSÕES PARCIAIS........................................................................................... 48
CAPÍTULO 4: APLICAÇÃO DO CO
2
A ALTAS PRESSÕES NA EXTRAÇÃO DE
COMPOSTOS ORGÂNICOS DA ERVA-MATE............................................. 49
1.0 EXPERIMENTAL......................................................................................................... 50
1.1 Reagentes e solventes.............................................................................................. 50
1.2 Extração com CO
2
supercrítico................................................................................. 51
1.3 Variáveis de extração................................................................................................ 51
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Rosângela Assis Jacques
viii
1.4 Cromatografia líquida preparativa em sílica gel........................................................ 53
1.5 Cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas (GC/MS) ......... 53
1.5.1 Derivatização......................................................................................................... 55
2.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 56
2.1 Efeito das variáveis de extração (P x T).................................................................... 56
2.2 Fracionamento dos extratos...................................................................................... 58
2.2.1 Análise cromatográfica (GC/MS) dos extratos obtidos no fracionamento
cromatográfico ...................................................................................................................
56
2.3 Efeito das variáveis agronômicas sobre o rendimento da SFE................................. 64
2.3.1 Efeito da adubação e sombreamento................................................................... 65
2.3.2 Efeito da idade de poda........................................................................................ 66
2.4 Análise quantitativa dos compostos da erva-mate.................................................... 67
3.0 CONCLUSÕES PARCIAIS........................................................................................... 71
CAPÍTULO 5: APLICAÇÃO DO ULTRA-SOM NA EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS
ORGÂNICOS DA ERVA-MATE...................................................................... 73
1.0 EXPERIMENTAL.......................................................................................................... 74
1.1 Extração por ultra-som.............................................................................................. 74
1.2 Cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas (GC/MS).......... 75
2.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 77
2.1 Variáveis de extração................................................................................................ 77
2.2 Caracterização química dos extratos........................................................................ 80
3.0 CONCLUSÕES PARCIAIS........................................................................................... 83
CAPÍTULO 6: APLICAÇÃO DA EXTRAÇÃO COM LÍQUIDO PRESSURIZADO NA
ANÁLISE DOS COMPOSTOS ORGÂNICOS DE ERVA-MATE..................... 85
1.0 EXPERIMENTAL.......................................................................................................... 86
1.1 Amostras, reagentes e solventes.............................................................................. 86
1.2 Extração com líquido pressurizado (PLE) ou extração acelerada com solventes
ASE)......................................................................................................................... 86
1.3 Cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas (GC/MS).......... 88
2.0 ESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................... 89
2.1 Variáveis de extração................................................................................................ 89
2.2 Caracterização química dos extratos........................................................................ 92
3.0 CONCLUSÕES PARCIAIS....................................................................................... 95
CAPÍTULO 7: COMPARAÇÃO DE METODOLOGIAS DE EXTRAÇÃO COM SOLVENTES
ORGÂNICOS DE COMPOSTOS ORGÂNICOS DA ERVA –MATE............ .
97
1.0 EXPERIMENTAL.......................................................................................................... 98
1.1 Amostras, reagentes e solventes.............................................................................. 98
1.2 Técnicas de extração utilizadas................................................................................ 98
1.2.1 Procedimento para a extração por maceração.....................................................
98
1.2.2 Procedimento para a extração por ultra-som........................................................ 99
1.2.3 Procedimento para a extração com líquido pressurizado..................................... 100
1.3 Análise cromatográfica dos extratos (GC/MS)........................................................ . 100
2.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 101
2.1 Análise do rendimento dos extratos de erva-mate.................................................... 101
2.2 Análise dos extratos de erva-mate por GC/MS........................................................ 102
2.2.1 Extração por maceração...................................................................................... 102
2.2.2 Extração por ultra-som........................................................................................... 105
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ix
2.2.3 Extração com líquido pressurizado....................................................................... 108
2.2.4. Análise quantitativa comparativa dos extratos de erva-mate............................... 111
3.0 CONCLUSÕES PARCIAIS.......................................................................................... 114
CAPÍTULO 8: CONCLUSÕES............................................................................................... 113
CAPÍTULO 9: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 120
CAPÍTULO 10: SUGESTÃO PARA TRABALHOS FUTUROS............................................... 132
CAPÍTULO 11: PRODUÇÃO CIENTÍFICA GERADA............................................................. 134
CAPÍTULO 12: ANEXOS........................................................................................................ 137
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x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Foto ilustrativa da planta de erva-mate............................................................. 7
Figura 2: Distribuição da erva-mate plantada no Brasil [3].............................................. 9
Figura 3: Esquema geral de sistemas de aplicação de ondas ultra-sonoras no campo
da química: (a) banho indireto, (b) banho direto e (c) sonda............................ 18
Figura 4: (A) Esquema geral do equipamento e (B) Etapas da extração com líquido
pressurizado no sistema ASE........................................................................... 22
Figura 5: Esquema representativo de um processo de extração supercrítica................. 29
Figura 6: Foto ilustrativa do experimento de campo: (a) área a pleno sol e (b) área
sombreada........................................................................................................
38
Figura 7: Foto das folhas da erva mate com idade de 18 meses, sem adubação e
cultivada sob sol (a) e sombra (b).....................................................................
40
Figura 8: Esquema representativo de um sistema de extração a altas pressões. 51
Figura 9: Fotografia com a vista parcial da unidade de extração com dióxido de
carbono pressurizado....................................................................................... 52
Figura 10: Esquema do fracionamento aplicado à mistura dos extratos obtidos por SFE 54
Figura 11: Curvas de extração obtidas para erva-mate usando CO
2
a altas pressões 57
Figura 12: Cromatograma do íon total da mistura dos extratos de erva-mate obtido via
extração supercrítica com CO
2
......................................................................... 60
Figura 13: Cromatograma do íon total das frações do extrato fracionado dos extratos
de erva-mate obtido por CO
2
a altas pressões................................................. 62
Figura 14: Cinética da extração da erva-mate de 12 meses de poda, sob diferentes
intensidades de luz e adubação.......................................................................
65
Figura 15: Cinética da extração da erva-mate sob diferentes idades de poda, plantadas
a pleno sol e adubadas com nitrogênio............................................................
66
Figura 16: Equipamento utilizado para extração com ultra-som das folhas de erva-mate 75
Figura 17: Correlação entre os rendimentos obtidos experimentalmente e aqueles
calculados pelo modelo teórico do planejamento fatorial fracionário 2
5-1
......... 78
Figura 18: Cromatogramas do íon total dos extratos obtidos por ultra-som com hexano
(A) e metanol (B), das amostras de erva-mate com idade de poda de 18
meses, cultivado a pleno sol e adubadas com fonte de nitrogênio.................. 81
Figura 19: Foto ilustrativa do aparelho de extração acelerada com solventes ASE
®
....... 87
Figura 20: Comparação dos rendimentos do modelo teórico e dos valores obtidos
experimentalmente de um planejamento fatorial fracionário 2
6-2
para a
extração acelerada com solventes.................................................................. 90
Figura 21: Cromatogramas do íon total dos extratos obtidos por extração com líquido
pressurizado (PLE) com hexano (A) e metanol (B), das amostras de erva-
mate com idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com
fonte de nitrogênio...........................................................................................
93
Figura 23: Desenho esquemático do equipamento usado para maceração..................... 99
Figura 24: Cromatogramas do íon total dos extratos das folhas de erva-mate obtidos
por maceração com hexano (A), tolueno(B), diclorometano(C), acetato de
etila(D), acetona(E) e metanol (F).................................................................... 103
Figura 25: Cromatogramas do íon total dos extratos das folhas de erva-mate obtidos
por extração com ultra-som com hexano (A), tolueno(B), diclorometano(C),
acetato de etila(D), acetona(E) e metanol (F).................................................. 106
Figura 26: Cromatogramas do íon total dos extratos das folhas de erva-mate obtidos
por extração com líquido pressurizado (PLE) com hexano (A), tolueno(B),
diclorometano(C), acetato de etila(D), acetona(E) e metanol
(F)..................................................................................................................... 109
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Rosângela Assis Jacques
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela I: Distribuição dos teores de nutrientes nos diferentes tecidos de erva-
mate (g/100 g)............................................................................................ 14
Tabela II: Revisão da literatura sobre aplicação de ultra-som na extração de
plantas....................................................................................................... 20
Tabela III: Revisão da literatura sobre aplicação da extração com líquido
pressurizado (PLE) na extração de plantas............................................... 24
Tabela IV: Propriedades termodinâmicas dos fluidos................................................. 25
Tabela V: Aplicações da extração com fluído supercrítico em plantas..................... 28
Tabela VI: Comparação entre métodos de extração................................................... 30
Tabela VII: Parâmetros instrumentais utilizados no FAAS.......................................... 39
Tabela VIII: Teor de cinzas [g/100g
base seca
] das amostras de erva-mate. 44
Tabela IX: Conteúdo de macronutrientes das folhas de erva-mate em função da
idade da folha, incidência de luz e adubação............................................
45
Tabela X: Conteúdo de micronutrientes das folhas de erva-mate em função da
idade da folha, incidência de luz e adubação............................................
46
Tabela XI: Análise estatística (ANOVA com teste de Tukey a 5%) dos conteúdos
dos minerais das folhas de erva-mate,sob diferentes condições
agronômicas............................................................................................... 47
Tabela XII: Condições cromatográficas utilizadas na análise dos extratos obtidos
com CO
2
a altas pressões por GC/MS.......................................................
54
Tabela XIII: Condições experimentais e rendimentos obtidos nas extrações de erva-
mate com CO
2
a altas pressões. Erva-mate com idade de poda de 12
meses cultivada a pleno sol e sem adubação............................................ 56
Tabela XIV: Rendimentos dos extratos (misturas dos extratos da Tabela XII)I obtidos
por cromatografia líquida preparativa (fracionamento), expressos em
g (extrato) por 100 g de amostra............................................................... 59
Tabela XV: Compostos identificados na mistura dos extratos da Tabela XIII e das
frações do extrato fracionado de erva-mate com idade de poda de 12
meses, cultivada a pleno sol e sem adubação, obtido por SFE................ 63
Tabela XVI: Compostos das folhas de erva-mate com idade de 18 meses de poda,
quantificados em função do tipo de fertilização e incidência de luz........... 68
Tabela XVII: Análise estatística (ANOVA com teste de Tukey a 5%): Efeito da
intensidade de luz e do tipo de adubação sobre a concentração (mg/kg
de amostra) de compostos selecionados do extrato de folhas de erva-
mate com 18 meses de idade, obtidos por SFE........................................ 69
Tabela XVIII: Variáveis e resultados de um planejamento fatorial fracionário 2
5-1
do
processo de extração por ultra-som, das folhas de erva-mate.................. 78
Tabela XIX: Principais compostos identificados nos extratos por ultra-som com
hexano e metanol, das amostras de erva-mate com idade de poda de
18 meses, plantada a pleno sol e adubadas com fonte de nitrogênio. 81
Tabela XX: Variáveis e resultados de um planejamento fatorial fracionário 2
6-2
,
utilizados na extração com líquido pressurizado......................................
90
Tabela XXI: Principais compostos identificados nos extratos por extração com
líquido pressurizado com hexano e metanol, nas amostras de erva-mate
com idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubadas com
fonte de nitrogênio......................................................................................
94
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Rosângela Assis Jacques
xii
Tabela XXII: Rendimento das extrações por maceração, ultra-som e extração
acelerada por solvente, obtido para as amostras de erva-mate,
expresso em g de (extrato) por 100 g de amostra.................................. 101
Tabela XXIII: Análise estatística (ANOVA com teste de Tukey a 5%). Efeito das
técnicas de extração e o tipo de solvente considerado sobre o
rendimento de extrato das folhas de erva-mate..................................... 102
Tabela XXIV: Principais compostos identificados nos extratos obtidos por
maceração com hexano (A), tolueno(B), diclorometano(C), acetato de
etila(D), acetona(E) e metanol (F) nas amostras de erva-mate com
idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com
fonte de nitrogênio.................................................................................. 104
Tabela XXV: Principais compostos identificados nos extratos por extração com
ultra-som com hexano (A), tolueno(B), diclorometano(C), acetato de
etila(D), acetona(E) e metanol (F) nas amostras de erva-mate com
idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com
fonte de nitrogênio.................................................................................. 107
Tabela XXVI: Principais compostos identificados nos extratos por extração por
líquido pressurizado com hexano (A), tolueno(B), diclorometano(C),
acetato de etila(D), acetona(E) e metanol (F) nas amostras de erva-
mate com idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e
adubada com fonte de nitrogênio...........................................................
110
Tabela XXVII: Concentração dos compostos quantificados nos extratos obtidos nos
extratos obtidos nas diferentes técnicas de extração (maceração,
ultra-som e extração com líquido pressurizado) das folhas de erva-
mate com idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e
adubada com fonte de nitrogênio, expressos em mg/kg........................ 112
Tabela XXVIII: Análise estatística (ANOVA com teste de Tukey a 5%) referente à
concentração dos compostos das folhas de erva-mate com idade de
poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de
nitrogênio (mg/kg
de amostra) obtidos por maceração, ultra-som e
extração por líquido pressurizado........................................................... 112
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Rosângela Assis Jacques
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
US - ultra-som
ASE - extração acelerada por solvente
PLE - extração com líquido pressurizado
SPME – micro - extração em fase sólida
SPE - extração em fase sólida
MAE - extração assistida por microondas
SFE – extração com fluido supercrítico
GC/MS - cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
LC/MS - cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas
MS – espectrometria de massas
MIC – cromatograma por monitoramento de íons
TIC - cromatograma de íon
SIM – monitoramento de íons simples
SCAN – modo de operação na espectrometria de massas por varredura de
íons
EI - impacto por elétrons
FM - fase móvel
FAAS – espectroscopia de absorção atômica
PM – peso molecular
p/p – peso/ peso
p/v – peso/volume
C
18
– fase estacionária octadecil – silano
t
R
– tempo de retenção
P - pressão
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Rosângela Assis Jacques
xiv
T - temperatura
P
c
- pressão crítica
ρ - densidade
v/v – volume/volume
IAL- Instituto Adolfo Lutz
CTC-capacidade de troca de cátions
BSTFA - (N,O-bis(trimetilsil)trifluoroacetamida)
TMS – trimetilclorossilano
OV-5 – fase estacionária de metil silicone com 5 % de grupos fenila
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Rosângela Assis Jacques
xv
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi estudar a composição química das folhas de erva-
mate, sob diferentes condições agronômicas e técnicas de extração. Os
métodos de extração usados foram maceração, ultra-som, extração com líquido
pressurizado e extração com fluído supercrítico. Foram investigadas as
variáveis que podem influenciar no processo de extração, tais como
temperatura, pressão, polaridade do solvente, tempo de extração, massa de
amostra, entre outras. A identificação dos compostos foi realizada por
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. Todos os
métodos de extração utilizados mostraram-se eficientes para a obtenção dos
extratos, com as diferenças sendo mais quantitativas do que qualitativas . Entre
os métodos de extração que utilizam solventes orgânicos, a extração com
líquido pressurizado mostrou-se mais eficiente, produzindo maior rendimento
em massa de extrato e maior concentração de alguns dos compostos de
interesse, com as vantagens de redução de solvente e tempo de extração. A
composição química da erva-mate é influenciada pelas condições agronômicas
de plantio, bem como pelas condições de extração de suas folhas. A melhor
condição agronômica avaliada, ou seja, aquela que produziu maior quantidade
de extrato, foi o cultivo das plantas a pleno sol, adubadas com nitrogênio e com
idade de poda de 18 meses. A variável mais importante das técnicas de
extração utilizadas foi a polaridade do solvente. Solventes de maior polaridade
produziram maior rendimento em extrato. A análise cromatográfica dos extratos
obtidos permitiu identificar cerca de 50 compostos qualitativamente e 6
quantitativamente, destacando-se a cafeína, fitol, ácido palmítico, ácido
esteárico, esqualeno e vitamina E.
PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO
Rosângela Assis Jacques
xvi
ABSTRACT
The main objective of this work was to study the chemical composition of the
extracts of mate leaves cultivated under different agronomic conditions obtained
from different extraction techniques. The extraction methods used were
maceration, sonication, pressurized liquid extraction and supercritical fluid
extraction. It was investigated the influence of temperature, pressure, solvent
polarity, extraction time, sample amount, etc., on the extraction process. The
identification of the compounds was accomplished by gas chromatography
coupled to mass spectrometry detector (GC/MS). Results showed that all the
extraction methods were efficient, with more quantitative differences than
qualitative. Among the extraction methods using organic solvents, the
pressurized liquid extraction showed to be more efficient, producing larger mass
yields and larger concentration of some of the present compounds in the mate
leaves, with the advantages of solvent consumption and time reduction. It was
verified that the chemical composition of the mate is influenced by the
agronomic conditions, as well as the extraction conditions of the mate leaves.
The best-evaluated agronomic condition, i.e., that produced the greatest
amount of extract was the fertilization with nitrogen and the complete exposure
to sunlight. Solvent polarity demonstrated to be the most important variable in
the extraction procedure. Thus, solvents of greater polarity produced larger
mass yields. The chromatographic analysis of the extracts allowed the
qualitative identification of 50 compounds and 6 quantitative determined
(caffeine, phytol, palmitic acid, stearic acid, squalene and vitamin E).
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Rosângela Assis Jacques
1
CAPÍTULO 1:
INTRODUÇÃO
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Rosângela Assis Jacques
2
A erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hill.) é uma espécie nativa da região
sul do Brasil e tem importância histórica na cultura e na economia dessa região
e de países limítrofes, como Argentina, Uruguai e Paraguai.
Por um longo período, a erva-mate tem sido um importante produto das
exportações brasileiras e a sua produção ainda se constitui em uma grande
fonte de renda e emprego, especialmente para os pequenos e médios
produtores da região de ocorrência da espécie [1,2].
O setor ervateiro retomou seu crescimento a partir de 1993 com uma
produção de 529 mil toneladas nos estados do Paraná, Santa Catarina e Rio
Grande do Sul [1], atingindo cerca de 670 mil toneladas nos três estados em
2000 [2].
No estado do Rio Grande do Sul, a cultura compreende cerca de 250
municípios, onde estão direta ou indiretamente envolvidas 39.000 pequenas
propriedades e empresas, gerando cerca de 165.000 empregos diretos [3], o
que reforça a importância do setor ervateiro para a região.
O setor ervateiro, na microrregião de Erechim, compreende 9.363
famílias de produtores rurais, que têm na atividade ervateira uma importante
fonte de renda e 42 empresas agroindustriais que produzem e comercializam
erva-mate para diversas regiões do Brasil e também para exportação [3].
Atualmente, a erva-mate recupera seu “status” na economia, não pelo
desbravamento físico de fronteiras, mas pela conquista de novos mercados
face ao desenvolvimento de produtos no setor de bebidas, cosméticos,
medicamentos e higiene, além do desenvolvimento de estudos fitoquímicos
que objetivam explorar seu potencial.
A forma mais difundida de consumo da erva-mate é o chimarrão (infusão
de erva-mate) em cuias de madeira ou porongo [5,6]. O mate é uma bebida
estimulante: elimina a fadiga, estimula a atividade física e mental, atuando
beneficamente sobre os nervos e músculos e favorecendo o trabalho
intelectual. Por possuir vitaminas do complexo B, o mate participa do
aproveitamento do açúcar nos músculos, nervos e atividade cerebral. Com a
presença das vitaminas C e E, age como defesa orgânica e apresenta
benefícios sobre os tecidos do organismo. A presença de sais minerais,
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3
juntamente com a cafeína, estimula o trabalho cardíaco ajudando na circulação
do sangue e diminuindo a tensão arterial, pois a cafeína atua como vaso
dilatador [7].
O mate favorece a diurese e atua também sobre o tubo digestivo: ativa os
movimentos peristálticos, facilita a digestão, suaviza os embaraços gástricos,
favorecendo a evacuação e a micção. A ação estimulante do mate é mais
prolongada que a do café, não deixando, porém, os efeitos colaterais ou
residuais como irritabilidade e insônia [7].
Além de alimento, a erva-mate há muito tempo vem sendo considerada
como tendo valor terapêutico, sendo recomendada como antiinflamatório, anti-
reumático, tônico, estimulante, diurético, etc. Dada a sua utilização medicinal
foi incorporada em várias Farmacopéias, podendo-se citar a argentina de 1898,
a brasileira de 1929, as francesas de 1866 e 1844, as mexicanas de 1904,
1925 e 1952, a paraguaia de 1944, a portuguesa de 1876 e as venezuelanas
de 1898, 1919, 1927 e 1939. Junto ao Ministério da Saúde Brasileiro estão
registradas 14 preparações derivadas de Ilex paraguariensis St. Hil. A erva-
mate também é comercializada no exterior, por exemplo, na Alemanha onde há
6 preparações homeopáticas e 452 outras preparações comerciais [4].
No mercado há uma demanda por produtos orgânicos de uma forma
geral, e esta tendência configura um diferencial no valor agregado quando a
matéria-prima (erva-mate) é proveniente de ervais nativos ou ervais
submetidos a condições agronômicas, que obedecem a princípios de
sustentabilidade.
Além de garantir o suprimento das exigências da cultura através da
adubação, outros fatores são determinantes para manter as propriedades
originais da planta.
Salienta-se, também, que hoje há uma grande oferta desse produto (erva-
mate), o que tem incentivado a busca não apenas de melhorias na qualidade
dos produtos em exploração, como também de novas formas de
aproveitamento [3,4].
O conhecimento científico sobre a taxonomia do gênero, a composição
química e as propriedades farmacológicas da espécie Ilex paraguariensis e do
produto erva-mate são ainda incipientes.
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4
O desenvolvimento de técnicas modernas de preparação de amostras
com significantes vantagens sobre os métodos convencionais, também
chamados oficiais (descritos em farmacopéias de diversos países), assume um
papel importante em garantir a alta qualidade e certificação dos produtos
provenientes de plantas, como por exemplo, a erva-mate.
A extração consiste na primeira etapa para que ocorra uma análise
qualitativa ou quantitativa de uma planta, pois a extração separa os compostos
da matriz celular para serem posteriormente analisados. As técnicas
convencionais que podem ser empregados para extração de compostos da
erva-mate compreendem extração com solvente orgânico, por maceração e
ultra-som. No entanto, pouco tem sido apresentado na literatura com relação à
identificação de compostos presentes na erva-mate obtidos por extração com
solventes orgânicos. Esta justificativa, aliada ao interesse na utilização das
técnicas modernas de extração, como extração com fluido supercrítico (SFE) e
extração com líquido pressurizado (PLE), mostra a relevância do presente
trabalho.
Objetivos:
Dentro deste contexto, o presente trabalho teve como objetivo geral
desenvolver e/ou adaptar métodos para extração, separação e análise dos
compostos químicos das folhas de erva-mate.
Podemos ainda citar os seguintes objetivos específicos:
Î Determinar a condição ótima de extração dos compostos da erva-mate
através da técnica de extração por fluido supercrítico, utilizando um
planejamento de experimentos.
Î Extrair os compostos da erva-mate empregando a técnica de extração com
fluido supercrítico, levando em consideração o efeito das variáveis
agronômicas (intensidade de luz, idade de poda das folhas e fertilização).
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5
ÎDeterminar a composição mineral da erva-mate e verificar a influência das
variáveis agronômicas de plantio (intensidade de luz, idade de poda das folhas
e fertilização) sobre sua composição.
ÎEstudar as técnicas de ultra-som e extração com líquido pressurizado
através de planejamentos experimentais para a obtenção da melhor condição
de extração dos compostos orgânicos da erva-mate.
ÎComparar as técnicas de extração utilizando solventes orgânicos, na
condição ótima de extração, para análise qualitativa e quantitativa das folhas
de erva-mate.
ÎIdentificar compostos ou classes de compostos de alto valor agregado em
diferentes condições agronômicas (idade de folha, sombreamento e adubação).
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6
CAPÍTULO 2:
REVISÃO DA LITERATURA
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7
1.0 ERVA-MATE
1.1 Classificação taxonômica
A erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hill) é originária da América do
Sul. A classificação botânica da erva-mate, segundo o naturalista francês
August de Saint Hillaire [5], é a seguinte:
• Divisão: Angiosperma
• Classe: Dicotiledônea
• Sub-classe: Archichlamydeae
• Família: Aquifoliaceae
• Gênero: Ilex
• Espécie: Ilex paraguariensis A. St. Hill
Figura 1: Foto ilustrativa da planta de erva-mate
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8
O gênero Ilex pertence à família Aquifoliaceae e possui cerca de 500
espécies. A área de dispersão inclui as Américas, Ásia, Europa e o sul da
África. O maior número de espécies está na região tropical da Ásia e das
Américas [5, 6].
Algumas espécies de Ilex são bastante populares no mundo,
destacando-se I. aquifolium L. (Europa), I. Opaca Ait (América do norte) e
I.cornuta Lindley (Ásia), das quais os ramos com frutos tornaram-se símbolo de
festividades importantes, como o Natal.
1.2 Biologia reprodutiva:
A erva-mate é uma espécie dióica, cuja floração ocorre de setembro a
dezembro. Quanto à frutificação, ocorrem frutos maduros de dezembro até
abril. A floração e frutificação iniciam gradativamente, aos 2 anos em árvores
oriundas de propagação vegetativa e aos 5 anos em árvores provenientes de
sementes, em sítios adequados. A dispersão das sementes é realizada por
pássaros, principalmente sabiás [9].
1.3 Habitat e distribuição geográfica
A espécie possui grande ocorrência, atingindo aproximadamente
540.000 Km
2
. A erva-mate ocorre no nordeste da Argentina, leste do Paraguai,
noroeste do Uruguai e Brasil [7].
No Brasil, ela pode ser encontrada nos estados do Mato Grosso do Sul,
Paraná, Rio Grande do Sul e Santa Catarina. Sua área de ocorrência natural é
de, aproximadamente, 450.000 Km
2
, o que equivale a quase 5% do território
brasileiro [8]. . Estes dados estão apresentados na Figura 2.
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9
A região sul é a maior produtora, onde 596 municípios desenvolvem a
atividade ervateira, envolvendo um contingente de 710.000 pessoas, para uma
produção anual aproximada de 650.000 toneladas de folhas.
Figura 2: Distribuição da erva-mate plantada no Brasil [3].
1.4 Importância da erva-mate
No Brasil, são relatadas 68 espécies deste gênero [6,10]. Destas, Ilex
paraguariensis, popularmente conhecida como erva-mate, é de importância
histórica incontestável na região sul do Brasil e em países limítrofes, como
Argentina, Paraguai e Uruguai. O consumo de erva-mate como chimarrão é um
hábito fortemente incorporado pelas populações sul-brasileiras, em especial no
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10
Rio Grande do Sul, maior consumidor do país, fazendo parte do perfil
comportamental gaúcho.
As folhas da erva-mate são utilizadas tanto para o chimarrão como para
o tererê, o mate solúvel e o chá mate [8,9]. A região sul é a que mais utiliza o
chimarrão, consumindo em média, mais de 90% da produção. Os outros 10%
são utilizados para produtos como chás, mate solúvel, entre outros.
O processamento básico para o beneficiamento da erva-mate para
chimarrão constitui-se das etapas da colheita, recepção, sapeco, secagem,
trituração, classificação, armazenagem, moagem, mistura, embalagem e
expedição [7]. A indústria da erva-mate evoluiu consideravelmente nos últimos
anos, e hoje utiliza modernos soques ervateiros e máquinas movidas a energia
elétrica.
O sapeco é utilizado para evitar que as folhas da erva-mate escureçam.
O escurecimento ocorre pela presença das enzimas polifenoloxidase (PFO) e
peroxidase (POD) que, em 1928, foram identificadas por Senglet como as
responsáveis pela oxidação dos compostos fenólicos quando as folhas são
retiradas da planta e expostas ao ar. O sapeco, que tem por finalidade a
inativação destas enzimas, consiste na passagem rápida dos ramos com
folhas sobre as chamas do sapecador [7].
Além das tradicionais bebidas, a erva-mate é também utilizada em
preparações farmacêuticas, tendo sido incorporada a várias farmacopéias. No
Ministério da Saúde brasileiro estão registradas 14 preparações derivadas de
Ilex paraguariensis, em função das propriedades terapêuticas, sendo
recomendada como estimulante, antiinflamatório, anti-reumático, tônico e
diurético [7,11].
Da erva-mate podem ser obtidos corantes e detergentes, especialmente
para uso hospitalar. No Brasil, esses produtos estão sendo pesquisados em
nível laboratorial. No exterior, especialmente nos países do hemisfério norte,
essa planta já tem mercado em função das amplas possibilidades de
aproveitamento [12].
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11
1.5 Composição química da erva-mate
Alguns trabalhos [8,13-15] mostram que a composição química da erva-
mate é muito complexa, apresentando metilxantinas, saponinas, taninos,
vitaminas, componentes minerais, substâncias aromáticas, ácidos graxos,
terpenos, álcoois, cetonas, aldeídos, fenóis, entre outros.
A presença de saponinas em folhas de Ilex paraguariensis foi
estabelecida através de trabalhos realizados por Gosmann [4] e Montanha [16].
Gosmann e colaboradores [17] e Kraemer [18] descreveram a presença
de 11 glicosídeos, como agliconas, ácido ursólico e ácido oleanólico e os
açúcares arabinose, glicose e ramnose. Com o objetivo de conhecer mais
detalhadamente a composição, em termos de saponinas, de outros órgãos
além de folhas, Kraemer [19] analisou através de cromatografia em camada
delgada, amostras de erva-mate (ramos, raízes, frutos verdes e maduros),
além da cultura de células de Ilex paraguariensis. Athayde [14] estudou as
saponinas presentes em folhas e frutos de árvores de Ilex paraguariensis
nativas nos estados de Mato Grosso do Sul, Santa Catarina e Rio Grande do
Sul.
Desde a descoberta da presença da cafeína por Stenhouse em 1843 e
da teobromina por Oehrli em 1927 em Ilex paraguariensis [20], muitos trabalhos
têm sido publicados a respeito dos teores destas metilxantinas, tanto nas
folhas, talos ou frutos, como no produto erva-mate [9,14,21-28]. Alguns autores
fazem referência à presença de teofilina nas folhas e em produtos comerciais
da erva-mate [21-22].
Cafeína, teofilina e teobromina são três alcalóides estreitamente
relacionados, presentes na erva-mate, e, nesta planta, são os compostos mais
interessantes sob o ponto de vista farmacológico e terapêutico. Os alcalóides
são responsáveis pelas propriedades estimulantes do mate. A cafeína tem
efeito sobre o sistema nervoso central, acelera a entrada de oxigênio nos
pulmões, aumenta a velocidade do metabolismo e acelera o batimento
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12
cardíaco [29]. As estruturas químicas destes compostos estão apresentadas no
Anexo 1.
Diversas metodologias para a extração e a quantificação de
metilxantinas em produtos vegetais têm sido propostas ao longo do tempo,
comparando diversos métodos de extração e análise.
Gosmann, em 1989 analisou por cromatografia em camada delgada as
metilxantinas nos extratos dos talos e folhas de Ilex paraguariensis de
procedência do Rio Grande do Sul [4].
Clifford & Martinez [23] analisaram amostras comerciais de erva-mate
quanto ao teor de cafeína, teobromina e teofilina, através da técnica de
cromatografia líquida de alta eficiência com fase reversa, utilizando uma coluna
C18 com detecção a 276 nm.
Lacerda e colaboradores [24] realizaram uma avaliação dos teores de
metilxantinas (cafeína, teobromina e teofilina) em amostras de chá preto e chá
mate, utilizando como técnicas de extração a decocção, extração com ultra-
som e microondas. Para a quantificação dos compostos foi utilizada a técnica
de cromatografia líquida de alta eficiência com fase reversa.
Além das técnicas convencionais de extração (decocção ou maceração)
e de técnicas não convencionais como ultra-som e microondas, tem sido
utilizada a extração com fluído supercrítico para a extração das metilxantinas
de amostras de erva-mate, verificando a influência dos parâmetros temperatura
e pressão [25-28].
Kawakami & Kobayashi [30] identificaram os componentes voláteis de
erva-mate comercial (mate cancheado argentino, mate tostado brasileiro) pela
técnica de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
(GC/MS). Um total de 196 compostos foram identificados no óleo volátil,
incluindo 23 álcoois alifáticos, 24 aldeídos, 29 cetonas, 15 ácidos, 8 lactonas, 9
terpenos, 11 álcoois terpênicos, 25 alicíclicos, 11 fenóis, 7 aromáticos, 13
furanonas, 6 pirazidas e 2 pirróis.
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13
Valduga [7] analisou por cromatografia gasosa o óleo essencial obtido
por destilação a vapor das folhas de erva-mate e identificou os seguintes
compostos: linalool, geraniol, benzaldeído, 2,4 hexadienal, 2-hexenal, 2-
pentenol. A atividade antibactericida dos compostos linalool, β-ionona, α-
terpineol, geraniol, 1-octanol, ácido octanóico, nerolidol e eugenol presentes no
chá-mate foi estudada por Kubo e colaboradores [31], contra o Streptococcus
mutans, que é uma das bactérias responsáveis pelas cáries dentárias. Todos
os compostos exibiram alguma atividade contra esta bactéria cariogênica.
A erva-mate é rica em polifenóis hidrossolúveis, tais como ácido
isoclorogênico, ácido caféico e ácido clorogênico, os quais apresentam alta
capacidade antioxidante e podem conferir para suas infusões um papel
hepatoprotetor (função de auxílio ao fígado) e reforçar a defesa antioxidante do
organismo humano [32-36].
Chandra & Mejia [37] determinaram e compararam os teores de
polifenóis e a capacidade antioxidante de Ardisia compressa, Camélia sinensis
e Ilex paraguariensis. As folhas de erva-mate apresentaram uma capacidade
antioxidante elevada frente ao ácido gálico em comparação com as outras
plantas.
Segundo alguns trabalhos, os flavonóides e as substâncias lipofílicas
presentes nas folhas de Ilex paraguariensis St. Hill causam efeitos
farmacológicos, destacando-se a redução do apetite [38]. Estes compostos
também apresentam propriedades anticarcinogênicas e antimutagênicas [39-
40]. Entre os flavonóides presentes na erva-mate, podemos citar a rutina,
quercetina e o canferol-3-ο-rutinosídeo.
Pesquisas confirmam que a erva-mate responde pela presença de
aminoácidos essenciais ao organismo humano, além de açúcar assimilável (em
forma de glicose). A vitamina E, presente na erva-mate é benéfica aos diversos
tipos de tecidos do organismo humano, enquanto a vitamina C participa da
circulação sanguínea, agindo como defesa orgânica. Com as vitaminas do
complexo B, participa do aproveitamento do açúcar pelos músculos e nervos e
pela atividade cerebral. Entre as enzimas, foi identificada a oxidase, que junto
com a cafeína, exerce a função de nutrição do organismo humano [12].
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14
Os carboidratos (açúcares) nas folhas de erva-mate foram analisados
por Paredes e colaboradores [41] tendo-se verificado teores de 2,85 %, 0,64%
e 0,35% de sacarose, glicose e frutose, respectivamente.
Além destes compostos, a erva-mate contém quantidades significativas
de minerais como cálcio, potássio, magnésio e manganês [7].
Alguns pesquisadores têm determinado o teor de macronutrientes (K,
Ca, Mg e Na) e micronutrientes (Mn, Fe, Zn e Cu) nas folhas da erva-mate, no
chá mate processado e suas infusões por digestão ácida e posterior análise
pela técnica de espectroscopia atômica. Os elementos que apresentam as
maiores concentrações nas infusões são K, Ca e Mg [42-44].
Reismann e colaboradores [22, 45] investigaram os níveis de nutrientes
nos diferentes tecidos de erva-mate em ervais nativos, para avaliação das
migrações de macronutrientes que ocorrem por ocasião da safra. Na Tabela I
são apresentados os resultados obtidos com as análises, em duas épocas
distintas: julho, quando o nível dos nutrientes é relativamente estável e baixo, e
em outubro, período de franco desenvolvimento que culmina na floração.
Tabela I: Distribuição dos teores de nutrientes nos diferentes tecidos de erva-
mate (g/100 g) de acordo com Reismann et al [45].
Julho Outubro Elemento
Folhas Ramos Folhas Ramos Flores
N (%) 1,92 1,01 2,20 1,21 2,67
P (%) 0,17 0,057 0,12 0,10 0,20
K (%) 1,59 0,98 1,86 1,70 3,71
Ca (%) 0,61 0,88 0,43 1,19 0,70
Mg (%) 0,42 0,34 0,33 0,23 0,37
Os resultados apresentados nesta Tabela são importantes quando se
associa a eles o fato do cultivo comercial da erva-mate apresentar duas épocas
de colheita, inverno e verão, chamadas respectivamente de safra e safrinha.
Verificou-se um aumento considerável dos nutrientes fósforo, nitrogênio
e potássio até o mês de outubro (final da safra), enquanto que para o cálcio e
magnésio há maior quantidade na safra de julho (meio da safra).
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15
As concentrações de minerais são específicas, não somente para a
espécie, idade e tecido, como também dependem do ambiente. Diversos
fatores controlam o teor de minerais nos vegetais, principalmente o genético
[20,46].
Os nutrientes nas árvores podem ser armazenados nos seus diferentes
compartimentos em função das necessidades fisiológicas imediatas, ou como
reserva para uso posterior, em outros órgãos [21, 47].
Zampier [23] analisou os teores de macro e micronutrientes por
espectrometria de absorção atômica (FAAS) em folhas de 1 ano de idade de
árvores nativas de erva-mate submetidas à adubação com matéria orgânica,
sulfato de amônio, superfosfato simples e cloreto de potássio. Segundo esta
pesquisadora, os teores de K, Ca, Mg, Mn e Cu foram significativamente
maiores nos tratamentos submetidos à adubação orgânica.
Bertoni e colaboradores [12] ressaltam que o tipo de solo, idade da
planta, data de coleta e características climáticas, influenciam
significativamente na composição química da erva-mate.
2.0 TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO APLICÁVEIS A PLANTAS
O preparo da amostra é uma etapa importante na análise de materiais
de plantas, pois é necessário extrair os compostos químicos para posterior
separação e caracterização [48].
Um extrato de planta pode ser definido como um composto ou mistura
de compostos obtidos de plantas frescas ou secas, ou parte das plantas(flores,
folhas, semente, raiz e casca), por diferentes métodos de extração.
Caracteristicamente, os compostos ativos são obtidos juntamente com outros
materiais presentes na massa vegetal (extrato) [49].
O desenvolvimento de técnicas modernas de preparação de amostras
com significantes vantagens sobre os métodos convencionais, também
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16
chamados oficiais (descritos em farmacopéias de diversos países), assume um
papel importante em garantir a alta qualidade dos produtos provenientes de
plantas.
Surgiram nos últimos anos uma série de novas técnicas de extração,
como a micro-extração em fase sólida (SPME), extração em fase sólida (SPE),
extração assistida por microondas (MAE), extração por fluido supercrítico (SFE)
e extração com líquidos pressurizados (PLE) (conhecida também como
extração por fluido pressurizado – PFE, ou extração acelerada com solventes –
ASE). Estas técnicas são mais rápidas, utilizam menos solventes, diminuem a
degradação da amostra, podem eliminar a etapa de “clean-up” da amostra,
eliminam etapas de concentração antes das análises cromatográficas,
melhoram a eficiência de extração, seletividade e/ou cinética, e são de fácil
automação [50-55].
2.1 Extração por maceração
A maceração é uma técnica na qual a extração da planta é realizada em
um recipiente fechado, em temperatura ambiente, durante um longo período
(horas ou dias), sob agitação ocasional e também sem renovação do solvente
extrator. Esta técnica utiliza os solventes orgânicos em função da polaridade.
Pela sua natureza, não conduz ao esgotamento da matéria-prima vegetal, seja
devido à saturação do líquido extrator ou ao estabelecimento de um equilíbrio
difusional entre o meio extrator e o interior da célula [56].
2.2 Extração com ultra-som
O ultra-som é um processo que utiliza a energia das ondas sonoras que
são transmitidas em freqüência superior à da capacidade auditiva humana. O
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17
ultra-som é definido com freqüências acima de 20,0 kHz. Estas ondas sonoras
criam uma variação de pressão no líquido gerando a cavitação [57].
Os principais efeitos do ultra-som na extração de plantas são: aumento
da permeabilidade das paredes celulares, produção de cavitações (formação
espontânea de bolhas em um líquido abaixo do seu ponto de ebulição,
resultando num forte estresse dinâmico) e aumento do estresse mecânico das
células, o que é também chamado de fricção interfacial [49].
Algumas células das plantas ocorrem na forma de glândulas (externas
ou internas) preenchidas com o óleo essencial. Uma característica das
glândulas externas é que a membrana é muito fina e pode ser facilmente
destruída pelo colapso das bolhas de cavitação próximo a parede das células.
Assim, facilita a penetração dos solventes nas células e a liberação do
conteúdo do óleo no solvente [49,50].
O ultra-som pode facilitar a dilatação e hidratação do material da planta
e causar alargamento dos poros da parede celular. Melhora a inchação e a
razão de transferência de massa e, ocasionalmente, quebra a parede celular,
resultando no aumento da eficiência de extração e/ou redução do tempo de
extração [58].
Para as glândulas internas, é importante reduzir o tamanho das
partículas do material, aumentando assim o número de células diretamente
expostas à extração por solvente com ultra-som.
Sumarizando, podemos dizer que os possíveis benefícios do ultra-som
na extração são: o aumento da transferência de massa, quebra das células
vegetais, aumento na penetração do solvente e diminuição de efeitos capilares
[59].
O efeito do ultra-som no processo de extração depende da freqüência,
potência do aparelho e do tempo de extração [60].
Existem dois tipos distintos de aparelhos geradores de ondas ultra-
sonoras [59,60]: o banho de ultra-som e a sonda, que podem ser visualizados
na Figura 3.
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18
No banho de ultra-som, o transdutor é diretamente preso no fundo da
cuba do aparelho e a energia ultra-sonora é transmitida através de um líquido,
usualmente a água. A energia é irradiada verticalmente pelas ondas sonoras
geradas na base do banho e transmitidas através das paredes do vaso para o
frasco com a mistura extratora [51,57].
Figura 3 Esquema geral de sistemas de aplicação de ondas ultra-sonoras no
campo da química: (a) banho indireto, (b) banho direto e (c) sonda.
O banho de ultra-som, a mais ampla fonte laboratorial disponível de
irradiação ultra-sônica, apresenta como vantagens uma melhor distribuição de
energia através das paredes do vaso de extração e o fato de não requerer
adaptação especial para o frasco extrator. Apresenta como desvantagens o
fato de que a quantidade de energia fornecida para o frasco extrator não é
a) b)
c)
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19
facilmente quantificável, porque depende do tamanho do banho, do tipo de
recipiente, da espessura das paredes do recipiente e da posição do frasco de
extração no banho. É difícil controlar a temperatura do sistema, pois o
equipamento tende a aquecer quando usado por longos períodos (a
temperatura do meio extrator é mais alta que a temperatura do líquido no
banho) [49].
A sonda, por outro lado, encontra-se fixada na extremidade do
amplificador do transdutor, em contato direto com o sistema extrator. Apresenta
como vantagens a potência totalmente disponível (não há transferência de
irradiação ultra-sônica pelas paredes do vaso) e a possibilidade de ser
sintonizada para fornecer um melhor desempenho a diferentes potências.
Como desvantagens, apresenta: freqüência fixa, dificuldade de controle de
temperatura em sistemas sem refrigeração e o fato de que espécies radicalares
podem ser formadas na ponteira da sonda, conseqüentemente apresentando
problemas relacionados à contaminação do meio extrator com a ponteira [51-
57].
A eficiência da extração por ultra-som é comparável, ou pode ser ainda
melhor que a obtida por Soxhlet, e tem como vantagens: alta reprodutibilidade,
possibilidade de utilização de vários tamanhos de amostra, rapidez de
processamento da amostra e baixo custo.
Na área de química analítica, a radiação de ultra-som tem sido usada
freqüentemente no pré-tratamento de amostras sólidas, o que facilita e acelera
operações, tais como a extração de compostos orgânicos e inorgânicos,
dispersão, homogeneização, nebulização, lavagem e derivatização [61-63].
Nesta técnica, a amostra moída é misturada ao solvente e colocada em
um recipiente, que é imerso em um banho de ultra-som. A amostra é
submetida, geralmente, a vários solventes em ordem crescente de polaridade,
dependendo da classe de compostos a serem extraídos, em um tempo
determinado (muito menor do que na extração por Soxhlet) e a uma freqüência
própria do banho. Após, o extrato é submetido à filtração e concentração.
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20
Exemplos de trabalhos publicados utilizando ultra-som como técnicas de
extração de plantas estão apresentados na Tabela II.
Tabela II: Revisão da literatura sobre aplicação de ultra-som na extração de
plantas
Amostra Analito Referência N°
Hibiscus tiliaceus l. ésteres, ácidos carboxílicos Melechi et al. [64]
Mentha x piperata mentol Shotipruk et al. [65]
Fagopyrum
esculentum
hemicelulose Hromádková et al. [66]
Chá preto, chá mate metilxantina Lacerda et al. [24]
Valerian officinalis l. borneol Valachovic et al. [41]
Salvia officinalis
cineol, borneol Salisová et al. [44]
Chresta spp
esteróides e triterpenos Schinor et al. [67]
Macleaya cordata
alcalóides Zhang et al [68]
Sophora japonica
antioxidantes Paniwnyk et al. [69]
Manjerona e orégano cis-sabineno hidratado, terpineol-4 e
α-terpineol, timol e carvacrol
Rodrigues [70]
Panax ginseng
saponinas Wu et al. [71]
Soja gordura
Stavarache
et al.
[72]
Celulose eucalipto
Pappas
et al.
[73]
Rosmarinus officinalis vitamina E
Torre
et al.
[74]
Soja isoflavonas
Rostagno
et al.
[75]
Pastinaca sativa
furanocumarinas Sowa et al. [76]
Flores de citros linalol
A
lissandrakis et
al.
[77]
Pistachia vera
antioxidantes Goli et al. [78]
Óleo vegetal ácidos graxos Chemat et al. [79]
Eucommia ulmodies
ácidos clorogênicos Li et al. [80]
2.3 Extração com líquidos pressurizados (PLE)
A extração com líquidos pressurizados (PLE) é uma técnica de extração
relativamente nova, que utiliza solventes convencionais em elevada
temperatura e pressão, com o objetivo de melhorar extrações quantitativas de
amostras sólidas e semi-sólidas [81-82]. A elevação da temperatura aumenta a
solubilidade, razão de difusão e transferência de massa, enquanto a
viscosidade e a tensão superficial dos solventes são menores do que à
temperatura ambiente. Também ocorre a interrupção das fortes interações
soluto-matriz, causadas por forças de Van der Waals, pontes de hidrogênio e
interações de dipolo entre as moléculas do soluto e os sítios ativos da matriz. A
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21
alta pressão melhora a penetração do solvente na matriz, o que favorece a
extração. A técnica de extração com líquido pressurizado tem a vantagem de
reduzir o tempo de extração e o descarte de solventes [83].
O processo de extração com líquido pressurizado (PLE) usando o
equipamento ASE 300
TM
é constituído de 6 etapas: 1) colocação da célula no
forno; 2) preenchimento da célula com solvente; 3) extração estática; 4)
flushing com solvente novo; 5) purga do solvente do sistema com liberação da
pressão residual e 6) esvaziamento da célula. Um esquema geral do
equipamento assim como a descrição das principais etapas pode ser
visualizado na Figura 4.
Uma pressão controlada é aplicada à célula de extração contendo uma
quantidade de amostra conhecida. A célula é mantida aquecida (temperatura
constante) durante todo o tempo de extração. Após a extração, o extrato é
liberado através da passagem de gás inerte (N
2
ultra-puro) e a amostra é
lavada com uma quantidade definida do mesmo solvente usado na extração
(flushing). O extrato e o líquido de lavagem são coletados em um frasco
apropriado.
Neste sistema, o processo de extração é realizado em temperaturas que
excedem o ponto normal de ebulição do solvente, e, dessa forma, a pressão na
célula de extração deve permanecer alta para manter o solvente no estado
líquido. Temperatura e pressão influenciam na eficiência do processo. Devido
às altas pressões e temperaturas utilizadas, a capacidade de solubilização, a
difusividade e a cinética de extração são aumentadas, acompanhadas por uma
diminuição dos tempos de extração e volumes de solventes [52].
Desde o desenvolvimento do primeiro aparelho de extração acelerada
com solvente, em 1995, poucas referências podem ser encontradas quanto à
aplicação da mesma na extração de plantas [84].
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22
Figura 4: (A) Esquema geral do Equipamento e (B) Etapas da extração com
líquido pressurizado no sistema ASE
TM
: 1)colocação da célula no forno; 2)
preenchimento da célula com solvente; 3) extração estática; 4) flushing com
solvente novo; 5) purga do solvente do sistema com liberação da pressão
residual e 6) esvaziamento da célula.
A
B
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23
2.3.1 Vantagens e desvantagens da extração com líquido pressurizado
O uso da extração acelerada por solventes apresenta algumas
vantagens e desvantagens sobre a utilização de técnicas convencionais de
extração:
Vantagens:
• Reduzido tempo de extração;
• Fácil de operar;
• Preparo da amostra antes da extração é fácil e rápido;
• Alta pressão durante a extração permite a extração de compostos
termicamente degradáveis;
• Pode-se utilizar somente um solvente ou uma mistura de solventes;
• Utiliza pouco solvente;
• Sistema automatizado; resultando em alta reprodutibilidade dos
parâmetros de extração (temperatura, pressão, tempo estático, volume
de “flush”);
• Extração de várias amostras em um ciclo.
Desvantagens:
• Alto custo do equipamento;
• A extração não é seletiva;
• “Clean-up” geralmente é necessário antes das análises cromatográficas.
Desde o desenvolvimento do primeiro aparelho de extração acelerada
com solvente, em 1995, poucas referências podem ser encontradas quanto à
aplicação da mesma na extração de plantas [84].
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24
Algumas referências bibliográficas utilizando extração acelerada por
solventes aplicadas a plantas encontram-se resumidas na Tabela III.
Tabela III: Revisão da literatura sobre aplicação da extração com líquido
pressurizado (PLE) na extração de plantas.
amostra analito Referência
N°
Chá preto,café cafeína Dawidowicz et al.
85
Chá preto, café cafeína Dawidowicz et al.
86
Spirulina platensis
antioxidantes Herrero, M. et al.
87
Spirulina platensis
antioxidantes Herrero, M. et al.
88
Maçã polifenóis Alonso-Salces et al.
89
Castanha vitamina E Delgado-Zamarreño et al.
90
Soja isoflavonas Rostagno et al.
91
Alecrim antioxidantes Herrero, M. et al.
92
Curcuma phaeocaulis
sesquiterpenos Yang et al.
93
Plantas medicinais ginsenosídeos Choi et al.
94
Plantas medicinais alcalóides Ong et al.
95
Soja isoflavonas Klejdus et al.
96
Plantas medicinais timol, saponinas Benthin et al.
97
Chá catequinas
Piñeiro et al.
98
Juniperus virginianna
cedrol, cedreno Eller et al.
99
Angelica sinensis
ácido ferrúlico Lao et al.
100
Maçã polifenóis Alonso-Salces et al.
101
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25
2.4 Extração com fluido supercrítico
A extração com fluido supercrítico é uma operação unitária que explora
as propriedades dos solventes acima de seus pontos críticos [102,103].
O solvente é chamado de supercrítico porque se encontra acima de sua
temperatura crítica e de sua pressão crítica. A temperatura crítica é a
temperatura mais alta, na qual um gás pode ser convertido em líquido pelo
aumento da pressão. Por sua vez, a pressão crítica é a pressão mais elevada,
na qual o líquido pode ser convertido em gás pelo aumento da temperatura
[104-106]. Neste estado, comparativamente aos líquidos, o solvente apresenta
coeficiente de difusão mais alto, viscosidade mais baixa e maior densidade do
que os gases. As viscosidades mais baixas e as taxas de difusão mais altas do
fluido supercrítico o tornam adequado para extração de compostos presentes
em matrizes sólidas, por exemplo, extratos de plantas [107 –110].
A densidade, viscosidade e difusividade são propriedades da região
crítica que são afetadas por mudanças na temperatura e/ou pressão. O
aumento da pressão leva a maior densidade (o que favorece o rendimento do
processo), por outro lado, menores difusividades e maiores viscosidades são
produzidas (o que desfavorece o rendimento) [111-114]. Estas propriedades
são apresentadas na Tabela IV [58].
Tabela IV: Propriedades termodinâmicas dos fluidos [58]
Estado do
Fluído
Densidade
(g.cm
–3
)
Difusividade
(cm
2
. seg
-1
)
Viscosidade
(g.cm
-1
. seg
-1
)
Gás
(0,6-2) x 10
-3
0,1-0,4
(1-3) x 10
-4
Líquido
0,6-1,6
(0,2-2) x 10
-5
(0,2-3) x 10
-2
Supercrítico
0,2-0,5
0,7 x 10
-3
(1-3) x 10
-4
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26
A temperatura apresenta, em determinado limite, um efeito oposto ao da
pressão: o incremento da temperatura ocasiona uma diminuição na densidade
(desfavorece o rendimento), um aumento na difusividade e diminuição da
viscosidade (favorece o rendimento). Há de se salientar também, que o
aumento da temperatura ocasiona um aumento na pressão de vapor do óleo,
favorecendo o incremento do rendimento na extração. Assim, o efeito da
temperatura e pressão é complexo, e o seu entendimento é de fundamental
importância na análise do processo de SFE [115-118].
2.4.1 Dióxido de carbono como solvente
O dióxido de carbono (CO
2
) é um solvente particularmente atrativo para
aplicação em alimentos, mais especificamente em plantas, pois, além de
atender aos critérios para escolha do solvente, apresenta certas características
que comprovam a sua habilidade e justificam seu uso. No caso do CO
2
, o
ponto crítico é alcançado sobre a curva líquido-gás a uma temperatura próxima
à ambiente (31,3 ºC) e pressão relativamente baixa de 73 atm.
O CO
2
supercrítico é completamente miscível em hidrocarbonetos de
baixo peso molecular e em compostos orgânicos oxigenados. Sua solubilidade
mútua com a água é pequena, o que possibilita sua utilização na extração de
compostos orgânicos de soluções aquosas. Tem alta volatilidade, comparado
com qualquer composto orgânico, facilitando a separação e possibilitando a
recuperação do produto e sua recirculação como solvente. As propriedades de
transporte são favoráveis, pois apresenta baixa viscosidade e alto coeficiente
de difusão. Com seu baixo calor de vaporização, especialmente perto do ponto
crítico, o consumo de energia em muitos processos é baixo [119].
No estado líquido, o CO
2
é miscível com todos os solventes líquidos
comuns, do metanol ao pentano, e com hidrocarbonetos monoterpênicos
puros, monoterpenos aldeídicos e todos os ácidos carbônicos líquidos [120].
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27
2.4.2 Técnica de extração supercrítica
A SFE é uma técnica analítica que apresenta meios bastante atrativos
para o processamento de produtos de ocorrência natural, devido a várias
características distintas, tais como a facilidade de recuperação do soluto e
reciclagem do solvente com a simples manipulação de temperatura e/ou
pressão, a possibilidade de direcionar a separação pela escolha das condições
termodinâmicas de temperatura e/ou pressão, e, com isso, a sintonia do poder
de solvência do fluido usado na extração para uma determinada extração e/ou
separação, e o controle da seletividade do processo pela escolha apropriada
do solvente e da combinação solvente/co-solvente utilizados [121].
Vários trabalhos são apresentados na literatura relacionados ao
emprego de fluidos supercríticos como solventes na extração de compostos
naturais. Os resultados apresentados apontam para um aumento considerável
no rendimento do processo, através do emprego de um solvente atóxico,
totalmente liberado no final do processo e da utilização de temperaturas
amenas, evitando a possível degradação de compostos termolábeis. Em
adição, os meios supercríticos permitem ainda elevada controlabilidade no
poder de solvatação do solvente, possibilitando processos simples e pouco
onerosos de separação após a extração. Tais características dos meios
supercríticos são de grande valia para a extração e a obtenção de produtos
naturais de alto valor, tanto que tem sido amplamente empregados.
Na Tabela V são apresentadas algumas referências bibliográficas
encontradas na literatura sobre a técnica de SFE aplicada à extração de
produtos naturais.
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Tabela V: Aplicações da extração com fluído supercrítico em plantas.
Amostra Analito Referência N°
Ilex paraguariensis
metilxantinas Saldaña et al. 122
Ilex paraguariensis
alcalóides Saldaña et al. 123
Ilex paraguariensis
cafeína, teobromina,
esqualeno, fitol, vitamina E,
ácido palmítico, esteróides.
Esmelindro et al. 124
Laurus nobilis L.
cineol, linalol, metil eugenol Caredda et al. 125
Lupinus spp
alcalóides Lanças et al. 126
Carum copticum
timol, mirceno, limoneno Khajeh et al. 127
Mentha pulegium L.
menta Aghel et al. 128
Zataria multiflora Boiss
timol, terpineno, ρ-cimeno
Ebrahimzadeh et al. 129
Hypericum perforatum
L.
alcanos, ácidos orgânicos e
ésteres
Seger et al. 130
Ginkgo biloba
flavanóides e terpenóides Yang et al. 131
Majorana hortensis
Moench
cis-sabineno hidratado,
acetato de cis-sabineno
hidratado, terpineol-4 e α-
terpineol.
Rodrigues et al.
132
Origanum vulgare
cis-trans-sabineno
hidratado, timol
Rodrigues et al. 133
Euphorbia macroclada
hidrocarbonetos Özcan et al. 134
Tabernaemontana
catharinensis
alcalóides Pereira et.al. 135
Pistachia vera
antioxidantes Goli et.al. 136
Lupinus spp, Plinia
pinnata
alcalóides Lanças et al. 137
Chá
catequinas Chang et al. 138
Ferula assa-foetida
α-pineno, β-pineno,
mirceno, limoneno, β-
ocimeno
Khajeh et al.
139
Foeniculum vulgare Mill
ácido hexadecanóico,
tetradecano,sabineno, α-
pineno, mirceno
Khajeh et al.
140
Juglans regia L compostos fenólicos Amaral et al. 141
2.4.3 Equipamento típico da extração supercrítica
O sistema de extração por CO
2
supercrítico consiste basicamente de
cinco componentes: (A) fonte de CO
2
; (B) bomba de alta pressão; (C) cela de
extração; (D) restritor de pressão e (E) coletor, além dos sistemas
controladores de temperatura e pressão [142], conforme pode ser visualizado
na Figura 5.
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29
O CO
2
é fornecido ao sistema já pressurizado através de cilindros
sifonados (A). A pressão de operação, se superior a do cilindro, é obtida por
uma bomba de alta pressão (B). A matriz do soluto é “lavada” pelo solvente no
extrator (C) e a mistura solvente-soluto é submetida a uma descompressão por
válvula redutora de pressão (D). A mistura passa a ser, então, gás-soluto,
sendo este recolhido no separador (E) para posterior análise. O gás que emana
do separador pode ser recirculado, quando em escala preparativa.
Figura 5: Esquema representativo de um processo de extração supercrítica,
composto por: cilindro sifonado do solvente, bomba de alta pressão, célula de
extração, válvula de descompressão e frasco coletor.
2.5 Comparação das técnicas de extração
Na Tabela VI são comparadas as principais vantagens e desvantagens
das diferentes técnicas de extração utilizadas.
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30
Tabela VI: Comparação entre métodos de extração utilizados em plantas.
Técnica Vantagens Desvantagens
Maceração
método padrão;
grande quantidade de amostra;
baixo custo.
tempo elevado de extração;
grande quantidade de solvente;
exposição do analista a solventes;
requer evaporação do solvente.
SFE
rápido;
o CO
2
não é contaminante ambiental;
método seletivo, pode-se variar a
temperatura e pressão;
pequena quantidade de solvente;
não requer filtração;
sem exposição a solventes;
pode ser automatizado.
tamanho da amostra é limitado;
depende da matriz;
alto custo.
Ultra-som
rápido;
grande quantidade de amostra;
baixo custo.
grande quantidade de solvente;
trabalhoso;
requer filtração;
requer evaporação do solvente;
exposição do analista a solventes.
PLE
rápido;
mínima quantidade de solvente;
não requer filtração;
totalmente automatizado;
fácil de usar
custo muito elevado
3.0 PLANEJAMENTO ESTATÍSTICO DE EXPERIMENTOS
As variáveis de um planejamento estatístico representam características
físicas, químicas ou físico-químicas, as quais definem ou influenciam uma
determinada resposta. Em geral, estas variáveis são avaliadas dentro de um
campo experimental previamente delimitado [143].
A resolução deste tipo de problema seguiu, durante muito tempo,
metodologias baseadas no método empírico de tentativa e erro, ou aquelas
onde todas as variáveis, menos uma, eram mantidas constantes. Na maioria
das situações, esta abordagem representa um gasto desnecessário de tempo,
esforço e recursos [144]. Em contraposição a essa sistemática, a abordagem
moderna utiliza metodologias estatísticas de planejamento e otimização de
experimentos, as quais têm se mostrado bastante promissoras [145]. Através
de planejamentos experimentais baseados em princípios estatísticos, os
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31
pesquisadores podem extrair do sistema em estudo o máximo de informação
útil, fazendo um número mínimo de experimentos [146].
Planejar experimentos é definir uma seqüência de coleta de dados
experimentais para atingir certos objetivos. De forma geral, podemos dividir as
técnicas de planejamento de experimentos em três grandes grupos: a)para
desvendar o grau de dependência entre variáveis e respostas; b)para
desenvolver e discriminar modelos; c) para estimativa ótima de parâmetros dos
modelos. Os dois últimos grupos exigem modelos do processo/fenômeno
(teóricos ou semi-empíricos) sob investigação [147].
Um experimento fatorial é aquele que consiste em selecionar um
número de variáveis (fatores e condições) a serem investigadas realizando-se
experimentos em todas as combinações possíveis destes níveis e fatores.
Desta forma, um projeto fatorial 2
2
possui dois níveis e dois fatores requerendo
quatro condições experimentais. O número de condições experimentais,
obtidas a partir de um projeto fatorial, cresce exponencialmente com o aumento
do número de níveis e/ou variáveis empregadas. Por exemplo, com três
variáveis e três níveis, têm-se 27 condições experimentais.
Os experimentos fatoriais têm como característica principal incluir, em
cada ensaio completo, todas as combinações possíveis dos diferentes fatores
ou conjuntos de tratamentos, exceto no caso particular dos experimentos
fatoriais fracionários [148].
Os experimentos fatoriais fracionários são utilizados quando o número
de experimentos a serem realizados é elevado. Neste caso, pode-se realizar
um planejamento com uma fração determinada do planejamento fatorial
completo, denominado de fração meia. A construção dessa fração meia segue
metodologia descrita nos modelos estatísticos [146].
É importante salientar que números de experimentos e número de
condições experimentais são conceitos distintos, já que certo número de
réplicas deve ser adicionado ao número de condições experimentais para
fornecer o número de experimentos.
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32
As réplicas ou repetições de experimentos são de fundamental
importância e servem para determinar o erro experimental na resposta em
estudo e/ou a reprodutibilidade do esquema experimental utilizado
(metodologia + equipamento).
Existem várias maneiras de abordar tal aspecto durante o planejamento
dos experimentos, sendo que a escolha da abordagem é peculiar a cada
experimento/equipamento e será ditada, principalmente, pela experiência do
analista [147].
4.0 ANÁLISE INSTRUMENTAL
4.1 Cromatografia gasosa (GC)
A cromatografia é uma poderosa técnica de separação usada para os
componentes de uma mistura complexa. Os componentes da amostra são
distribuídos entre duas fases, uma das quais permanece estacionária,
enquanto a outra elui entre os interstícios ou sobre a superfície da fase
estacionária. O movimento da fase móvel (FM) resulta numa migração
diferencial dos componentes da amostra. O mecanismo envolvido nesta
migração diferencial vai depender do tipo de fase móvel e estacionária utilizada
[149,70].
A amostra, que pode ser um gás ou um líquido volátil, é injetada no
injetor do cromatógrafo através de uma micro-seringa ou de um sistema de
injeção automático, onde é aquecida e vaporizada. Em determinadas
temperaturas, as substâncias vaporizam e, de acordo com as suas
propriedades e as da fase estacionária, são retidas por determinado tempo,
chegando à saída da coluna em tempos diferentes. Os componentes da
amostra movem-se na coluna numa velocidade determinada por vários fatores,
mas principalmente pela força de retenção, que vai depender da solubilidade
destes compostos na fase estacionária e da sua volatilidade na fase móvel. Os
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33
componentes da amostra, já separados na coluna, entram no detector, onde
são individualmente detectados [150,71].
Atualmente, a maioria dos espectrômetros de massas é conectada a um
cromatógrafo a gás (GC/MS) ou líquido (LC/MS), assim este último serve como
um meio de separação dos analitos e posterior introdução no espectrômetro de
massas. O tipo de fonte de ionização mais comum em espectrometria de
massas é a de impacto por elétrons (EI), a qual emprega um filamento
aquecido para gerar elétrons com energia suficiente para provocar ionização
dos analitos de interesse, mediante impacto destes elétrons energizados. Os
íons formados são direcionados para o analisador, cuja função é separá-los de
acordo com sua relação massa/carga (m/z) [151,72].
GC/MS é uma técnica muito utilizada pelos pesquisadores para análise
de extratos de plantas, pois permite a separação dos componentes
vaporizáveis e fornece um espectro de massas para cada pico. Esse espectro
indica a massa molecular e o padrão de fragmentação. Pela massa molecular
obtêm-se dados sobre a classe química a qual a substância pertence,
enquanto que o padrão de fragmentação serve para comparar com os dados
da biblioteca de espectros de massas do computador. Uma vez feita a
comparação, o computador mostra as probabilidades quanto à identidade da
substância analisada. Para aumentar a sensibilidade e melhorar a seletividade
da técnica GC/MS, os analitos podem ser analisados no modo SIM
(monitoramento de íons selecionados) [152,73].
Para selecionar os íons a serem monitorados, analisa-se o espectro de
massas de cada composto, ou classe de compostos tentativamente
identificados e realiza-se uma nova injeção da amostra marcando estes íons.
Tem-se, desta forma, a transformação do espectrômetro de massas de
detector universal para detector seletivo. O cromatograma resultante (MIC –
Monitoring Ion Chromatogram) difere do cromatograma inicial (TIC – Total Ion
Chromatogram) por apresentar maior sensibilidade, maior seletividade e menor
número de picos.
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34
4.2 Espectroscopia atômica (FAAS)
Essa técnica de determinação de elementos químicos envolve a
absorção ou emissão de luz por átomos, causada pela absorção de uma
determinada forma de energia, que altera a estabilidade da configuração
eletrônica destes elementos, promovendo a excitação de elétrons. Após este
estado de instabilidade, o átomo imediatamente retorna à forma estável. Esse
processo libera energia em quantidades proporcionais àquelas absorvidas na
excitação, e os comprimentos de onda de energia emitida são característicos
de cada elemento. Portanto, cada comprimento de onda da radiação absorvida
ou emitida corresponde a um determinado elemento [74,154].
A energia absorvida ou emitida no processo é mensurada e aplicada a
três campos da espectroscopia atômica: absorção, emissão e plasma. No caso
da emissão atômica, a amostra recebe uma carga de energia, produzindo a
excitação dos elétrons aptos a emitir luz. Caso o átomo absorva luz com
comprimento de onda específico para atingir o estado de excitação, o processo
é chamado de absorção atômica. Em emissão atômica, a energia de excitação
é gerada por uma chama, enquanto que o processo de absorção atômica utiliza
principalmente uma lâmpada (cátodo oco) como fonte de energia. Existem
lâmpadas que emitem espectro de um só elemento, como também lâmpadas
para vários elementos, ficando a cargo de o monocromador selecionar o
comprimento de onda desejado.
O processo que utiliza lâmpada de cátodo oco para análise simples, ou
seja, de um elemento cada vez, é mais confiável, pois produz uma intensidade
de emissão superior àquela da lâmpada para análise de vários elementos, o
que compromete a análise quando uma maior precisão é exigida [75,155].
Foram desenvolvidos equipamentos que utilizam processadores altamente
especializados nas determinações químicas. A automatização proporcionou
agilidade e confiabilidade às análises, calibrando e tornando estas curvas de
calibração mais precisas, fornecendo resultados e correlações entre dados de
absorbância e concentração com maior exatidão [76,156].
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35
CAPÍTULO 3:
DETERMINAÇÃO DOS MINERAIS
DAS FOLHAS DE ERVA-MATE
CULTIVADAS SOB DIFERENTES
CONDIÇÕES AGRONÔMICAS
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36
1.0 EXPERIMENTAL
1.1 Detalhamento experimental de campo
As amostras de erva-mate foram coletadas em um experimento de
campo, montado nas dependências da Indústria e Comércio de Erva-Mate
Barão Ltda., no município de Barão de Cotegipe - RS, com manejo realizado
mediante controle de adubação, intensidade de luz e idade da folha. Neste
experimento foram conduzidos oito (8) tratamentos, onde cada tratamento
dispunha de sete (7) plantas para a coleta das amostras. Todas as plantas, no
início do experimento, tinham idade em torno de sete anos e foram podadas
em condições idênticas. Neste ponto elas foram identificadas como tendo zero
(0) meses de idade de folha.
O efeito da idade de folha foi avaliado com coletas semestrais,
possibilitando a análise de folhas de 6, 12, 18 e 24 meses, onde se alternam as
fases de inverno e verão. Desta forma, as amostras de 6 e 18 meses
corresponderam ao período de verão, e as amostras de 12 e 24 meses ao
período de inverno.
O método utilizado para investigar o efeito da adubação empregou
quatro tratamentos diferentes: no primeiro deles (linha 1), nenhum adubo foi
adicionado às plantas; no segundo (linha 2), foi aplicada uma dose de
300g/planta/ano de uréia (fonte de nitrogênio); no terceiro (linha 3) aplicou-se
uma dose de 120 g/planta/ano de cloreto de potássio (fonte de potássio); no
quarto tratamento (linha 4) foi aplicada uma dose de 300g/planta/ano de uréia e
mais 120 g/planta/ano de cloreto de potássio.
Para avaliar o efeito da incidência de luz sobre a composição química da
erva-mate, a área experimental foi dividida em duas metades, sendo que em
uma delas foi utilizada uma tela de sombreamento (sombrite), na qual 75% da
luminosidade incidente é retida, e na outra metade as plantas foram deixadas a
pleno sol.
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37
A Figura 6 mostra o experimento de campo que evidencia o controle de
intensidade de luz.
(a) (b)
Figura 6: Foto ilustrativa do experimento de campo: (a) área a pleno sol e (b)
área sombreada.
1.2 Amostras
A amostra de cada tratamento constituiu-se de ramos e folhas de sete
(7) plantas. Em cada uma destas sete plantas foram coletados de 500 a 600 g
de folhas e ramos do terço superior, médio e inferior. Para cada tratamento
foram retirados 4 kg de amostras homogeneizadas, para cada idade de poda.
Após a coleta, as amostras foram submetidas ao processo de secagem
em estufa com recirculação de ar por um período de 24 horas, a uma
temperatura entre 32 e 35º C.
A umidade total das amostras foi determinada segundo o método padrão
do Instituto Adolfo Lutz (IAL) citado por Valduga [7], ficando em torno de 5 %
para todas as amostras. Após a secagem, as amostras foram moídas e
classificadas quanto à granulometria, em peneiras Tyler (40 mesh). Para evitar
a oxidação, as amostras foram acondicionadas em ambiente inerte (com N
2
)
dentro de frascos de vidro e armazenadas em refrigerador (6 a 8 ºC) até o
momento da extração.
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38
1.2.1 Digestão das amostras
As amostras de cada tratamento (3g) foram calcinadas a 700 °C por um
período de 5 horas, até a decomposição de toda a matéria orgânica. As cinzas
obtidas foram solubilizadas em 2 mL de ácido nítrico e 2 mL de peróxido de
hidrogênio a 30% e aquecidas até a obtenção uma solução clara.
Posteriormente, esta solução foi transferida para balões volumétricos,
completando-se o volume a 50 mL com água deionizada.
1.3 Procedimento para determinação dos minerais
Para a determinação dos minerais foi utilizado um espectrômetro de
absorção atômica com chama (FAAS) modelo Varian AA55.
Foram utilizadas lâmpadas de cátodo oco de Ca, Mg, Na, Mn, Zn, Fe e
Cu como fonte de radiação. Os elementos foram medidos em condições de
operação otimizadas por FAAS em chama de ar/acetileno ou óxido
nitroso/acetileno. Os parâmetros instrumentais são apresentados na Tabela
VII.
As determinações de Ca, Mg, Cu, Mn, Zn e Fe foram realizadas no
FAAS, no modo absorção, e a determinação de Na e K no modo emissão.
Todas as análises foram realizadas em triplicata para as amostras e soluções
padrão. Os cálculos dos teores dos minerais nas amostras foram baseados em
uma curva de calibração obtida com as soluções padrão.
Para eliminar possíveis interferências na determinação de Ca e Mg, foi
adicionado cloreto de lantânio nas amostras e nas soluções padrão na
proporção de 1% (w/v).
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39
Tabela VII: Parâmetros instrumentais utilizados no FAAS.
Elemento
λ (nm)
Intensidade da
lâmpada (mA)
Fenda (nm) Concentração de
trabalho (mg L
-1
)
Ca 239,9 10 0,2 2 – 800
Na 303,2 5 0,2 2 – 400
Mg 202,6 4 1,0 0,15 – 20
Mn 403,1 5 0,2 0,5 – 60
Zn 213,9 5 1,0 0,01- 2.0
Cu 324,7 4 0,5 0,03 – 10
Fe 248,3 5 0,2 0,06 – 15
Os efeitos das variáveis investigadas no conteúdo dos metais
selecionados foram estatisticamente avaliados por análise de variância
acoplada ao teste de Tukey, com nível de confiança de 95%. Todas as análises
estatísticas foram realizadas usando o software Statistica Windows 6.0.
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40
2.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.1 Influência das condições agronômicas sobre o teor de minerais nas
folhas de erva-mate
A Figura 7 apresenta uma foto das folhas de erva-mate detalhando o
efeito da intensidade de luz sobre as mesmas.
Figura 7: Foto das folhas da erva-mate com idade de 18 meses, sem
adubação e cultivada sob sol (a) e sombra (b).
Percebe-se que a folha da planta cultivada sob menor intensidade de luz
(Figura 7(b)) é mais escura e mais espessa.
Os teores de cinzas obtidos para as folhas de erva-mate, em função das
condições agronômicas investigadas, estão apresentados na Tabela VIII
(página 43). As análises foram realizadas em triplicata e os resultados
representam a média dos experimentos. Os teores de cinzas das folhas de
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41
erva-mate ficaram em torno de 4,97 a 7,63 %, mostrando-se de acordo com a
literatura [7].
Os valores das cinzas são mais elevados em amostras de plantas
protegidas do sol, uma vez que o metabolismo da planta é diminuído devido à
redução na fotossíntese das folhas. Segundo Kaspary [156], mudas de erva-
mate desenvolvidas em condição de sombreamento adquirem maior altura e
maior produção de matéria seca, ou seja, maior produção de material mineral.
Este fato talvez esteja ligado à aparência da folha, como já foi visualizado na
Figura 7.
As Tabelas IX e X (páginas 44 e 45) mostram os resultados em termos
de quantidade de macronutrientes e micronutrientes em mg/100g nas folhas de
erva-mate proveniente de plantas cultivadas ao sol e à sombra, em diferentes
épocas de poda e com diferentes tipos de adubação. Pode-se observar que os
macro-nutrientes (K, Ca, Mg e Mn) apresentam valores entre 500 e 2500
mg/100g, sendo o potássio o composto majoritário.Estes valores estão de
acordo com os valores encontrados por Sanz et al.[42] e Garcia et al.[43]. Em
geral, o teor de K, Ca, Mg e Mn são altos para tecidos de plantas, e a ordem
crescente de concentração destes metais é: K>Ca>Mg>Mn [157, 158].
Entre os micronutrientes (Na, Zn, Fe e Cu), o sódio é o elemento
majoritário, apresentando um teor acima de 50 mg/100 g nas folhas de erva-
mate.
A Tabela XI (página 46) apresenta os resultados da análise estatística
da influência da intensidade de luz, idade das folhas e adubação no teor de
macro e micro-nutrientes das folhas de erva-mate. Os valores apresentados
nesta tabela são a média dos valores do conteúdo dos metais para cada
condição. Pode-se observar que a idade das folhas exerce uma grande
influência no seu conteúdo mineral.
O comportamento dos macro e micronutrientes é levemente afetado
pelas condições agronômicas (idade das folhas, fertilização e intensidade de
luz). Em folhas jovens (6 meses) os macronutrientes e os micronutrientes têm
geralmente os maiores valores de concentração.
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42
A concentração dos macronutrientes, exceto para magnésio, diminui
com o aumento da idade de poda das folhas. Além disso, o conteúdo de alguns
micronutrientes é aumentado em folhas de idade intermediária, em torno de 12
meses, e alguns deles não apresentam uma significativa diminuição do teor
com o tempo.
Com relação à intensidade de luz, plantas cultivadas à sombra
apresentaram maiores teores de minerais (com exceção do magnésio e
manganês) do que as cultivadas ao sol.
A erva-mate é uma espécie arbórea que ocorre naturalmente nas
florestas, nas condições de sub-bosque, ou seja, tolerando o sombreamento
natural causado por espécies de maior altura, o que faz com que seja
conhecida também como planta reprodutora à sombra. Portanto, ao ser
cultivada fora de suas condições naturais, pode-se esperar alterações
fisiológicas no sentido de sua adaptação ao meio. É o que ocorre quando a
mesma é cultivada em condições de luminosidade mais intensa. Nesta
situação, a planta tende a reduzir a superfície foliar não só para diminuir a
fotoinibição (inibição da captação de luz pela clorofila, o que resulta em menor
fotossíntese das plantas) e o aquecimento excessivo, mas também para reduzir
a perda de água [159].
Em condições de sombreamento, a erva mate é considerada uma
espécie de alta longevidade foliar. A planta metaboliza substâncias químicas
inibidoras de insetos desfoliadores, o que propicia à folha muito mais tempo
para realizar a fotossíntese que numa planta que se desenvolve em condições
de pleno sol. Com isso, a planta sombreada também deve assimilar uma maior
quantidade de nutrientes [160].
Em relação ao Mg, o mesmo é absorvido pelas plantas na forma de íon
Mg
+2
e constitui o núcleo central da molécula de clorofila, fundamental para a
fotossíntese. Como não houve diferença de concentração deste elemento nas
folhas sombreadas e não sombreadas, o maior acúmulo dos outros nutrientes
(K, Ca, Cu, Zn e Fe) nas folhas sombreadas pode não ser só devido à
fotossíntese, mas também a outros fatores, como menor evapotranspiração
(perda de água durante o processo de evaporação e transpitação) e menor
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43
aquecimento foliar. Isso faz com que a própria fotossíntese seja mais eficiente,
uma vez que os estômatos tendem a ficar mais tempo abertos, em função da
menor perda de água. Assim, pode-se esperar que no ambiente mais
sombreado, a atividade metabólica seja mais constante.
Na Tabela XI também é observado um aumento expressivo no conteúdo
de manganês quando as plantas são adubadas com fontes de nitrogênio e
potássio ao mesmo tempo. No caso do Mn, a maior concentração foliar no
ambiente sombreado foi observada somente no tratamento sem adubação.
Quando se aplicou só N, os teores de Mn não diferiram significativamente.
Porém, chama a atenção o fato de que quando se aplicou N juntamente com K
ou apenas K, houve um expressivo aumento de Mn foliar nas duas situações
de luminosidade. Como não há na literatura informações a respeito de uma
possível sinergia entre K e Mn, pode-se trabalhar com a hipótese de que tenha
ocorrido um deslocamento de íons Mn
+2
da CTC (capacidade de troca de
cátions) do solo pela aplicação do adubo potássico, o que levaria a uma maior
disponibilidade de Mn
+2
para as plantas. A hipótese se fundamenta pelo fato de
que em solos ácidos (pH < 5,0) o Mn pode estar ocupando, como cátion
adsorvido eletrostaticamente, 20 a 30% da CTC do solo. Neste caso, a
concentração de Mn
+2
na solução do solo, que é, em última análise, de onde as
plantas retiram os nutrientes, pode ter aumentado em função da sua
substituição na CTC pelos íons K
+
que foram supridos através da adubação
potássica [159].
Os teores de K foliar foram maiores na condição de sombreamento,
entretanto, nas duas condições de luminosidade, os tratamentos envolvendo
aplicação de N ao solo propiciaram sensíveis decréscimos no teor de K
(Tabela IX). Embora não ocorra na literatura registros de antagonismo entre N
e K, os dados obtidos indicam a possibilidade de o N inibir a absorção de K na
cultura da erva-mate.
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44
Tabela VIII: Teor de cinzas [g/100g
base seca
] das amostras de erva-mate sob diferentes condições agronômicas (intensidade
de luz, idade de poda da folha e adubação).
Teor de cinzas (g/100g ) ± desvio padrão
6 meses 12 meses 18 meses 24 meses
Adubação
sol sombra sol sombra sol sombra sol sombra
Sem adub. 5,39±0,04 6,43±0,03 5,30±0,10 7,47±0,15 5,88±0,14 5,94±0,21 6,23±0,04 6,71±0,06
N 5,25±0,05 6,40±0,04 5,30±0,14 7,63±0,05 5,11±0,06 5,60±0,14 5,85±0,01 6,84±0,01
K 4,97±0,05 5,69±0,06 5,40±0,10 7,10±0,20 6,07±0,10 6,23±0,01 5,47±0,01 6,26±0,06
N + K 5,34±0,05 5,77±0,11 5,32±0,05 7,00±0,10 6,40±0,36 6,44±0,13 6,35±0,06 7,21±0,10
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45
Tabela IX: Conteúdo de macronutrientes das folhas de erva-mate em função da idade da folha, incidência de luz e adubação.
Conteúdo de metais (mg/100g base seca) ± desvio padrão
6 meses 12 meses 18 meses 24 meses
Mineral
Fertilização
Sol sombra sol sombra sol sombra sol sombra
sem adubação 1476,3 + 7,9 1746,9 + 55,5 1072,9 + 15,5 1136,2 + 11,8 612,6 + 7,7 649,6 + 5,3 545,0 + 4,0 590,40 + 7,7
N 1034,9 + 7,4 1430,3 + 31,5 810,8 + 4,6 857,1 + 13,9 513,9 + 13,7 597,3 + 0,7 513,9 + 13,7 543,2 + 2,5
K 1637,2 + 18,6 2084,6 + 12,5 1220,3 + 17,9 1535,1 + 12,0 653,2 + 8,5 696,0 + 14,1 653,2 + 8,5 673,4 + 8,8
K
N + K 1159,1 + 29,5 1933,5 + 3,2 1082,0 + 10,1 1260,5 + 18,4 612,6 + 2,5 667,2 + 8,9 612,6 + 2,5 554,3 + 6,0
sem adubação 464,6 + 16,1 755,1 + 6,1 345,3 + 6,4 480,9 + 16,8 415,0 + 2,2 648,1 + 10,4 414,5 + 1,6 514,1 + 13,4
N 814,9 + 2,9 852,0 + 16,2 630,7 + 8,8 811,9 + 17,6 639,0 + 1,4 815,0 + 2,7 550,7 + 7,9 720,1 + 8,2
K 631,2 + 12,4 826,0 + 9,7 598,1 + 0,4 691,4 + 7,4 521,1 + 6,9 721,0 + 4,4 521,1 + 6,9 703,1 + 3,1
Ca
N + K 598,1 + 0,4 793,4 + 12,2 517,0 + 9,5 628,7 + 28,1 429,4 + 5,4 661,9 + 3,0 424,3 + 5,3 569,6 + 6,6
sem adubação 761,8 + 1,8 743,0 + 7,1 788,8 + 4,7 777,5 + 2,1 748,5 + 4,0 757,6 + 4,8 726,8 + 3,7 753,8 + 6,0
N 768,5 + 3,0 780,5 + 7,2 797,7 + 5,0 797,0 + 0,5 768,0 + 8,2 773,7 + 13,4 797,5 + 3,8 786,9 + 3,3
K 744,7 + 1,6 729,7 + 1,1 765,3 + 7,5 765,2 + 2,8 727,7 + 10,7 749,2 + 10,4 709,5 + 1,3 726,8 + 3,8
Mg
N + K 762,0 + 1,0 755,0 + 2,0 794,0 + 1,4 784,0 + 5,7 754,5 + 4,7 773,4 + 6,5 775,6 + 2,5 775,9 + 2,8
sem adubação 182,7 + 3,3 186,5 + 7,7 128,5 + 2,3 172,6 + 2,7 116,8 + 3,8 149,8 + 2,1 122,1 + 0,8 148,1 + 0,8
N 219,3 + 6,1 216,2 + 4,1 170,0 + 1,1 182,4 + 5,7 149,1 + 0,9 158,7 + 1,2 152,4 + 0,8 152,7 + 2,1
K 271,2 + 7,4 318,4 + 9,5 180,2 + 2,9 210,0 + 2,8 267,1 + 2,6 201,8 + 1,6 240,6 + 1,6 182,6 + 1,6
Mn
N + K 275,8 + 8,8 354,2 + 10,5 258,8 + 2,5 221,7 + 4,7 282,6 + 2,2 217,5 + 2,1 262,1 + 2,4 239,7 + 3,2
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46
Tabela X: Conteúdo de micronutrientes das folhas de erva-mate em função da idade da folha, incidência de luz e adubação.
Conteúdo de metais (mg/100g base seca) ± desvio padrão
6 meses 12 meses 18 meses 24 meses
Mineral
Fertilização
sol sombra sol sombra sol sombra sol sombra
sem adubação 4,7 + 0,1 6,5 + 0,2 3,6 + 0,1 6,8 + 0,2 4,2 + 0,1 5,7 + 0,1 3,3 + 0,1 4,9 + 0,1
N 6,5 + 0,1 8,1 + 0,1 5,1 + 0,1 9,8 + 0,1 5,9 + 0,1 6,4 + 0,1 5,4 + 0,1 9,1 + 0,1
K 5,3 + 0,1 6,9 + 0,2 4,1 + 0,1 8,7 + 0,1 5,4 + 0,1 6,4 + 0,1 3,9 + 0,1 8,7 + 0,1
Zn
N + K 5,4 + 0,1 7,7 + 0,1 4,4 + 0,1 9,2 + 0,1 4,5 + 0,1 6,4 + 0,1 4,3 + 0,1 8,2 + 0,2
sem adubação 5,4 + 0,1 8,8 + 0,1 6,4 + 0,1 11,6 + 0,2 7,9 + 0,1 8,2 + 0,1 7,6 + 0,1 7,8 + 0,1
N 5,8 + 0,1 9,0 + 0,1 6,6 + 0,1 11,6 + 0,1 8,1 + 0,1 8,5 + 0,1 7,7 + 0,1 8,1 + 0,1
K 6,0 + 0,1 9,3 + 0,1 6,7 + 0,1 11,8 + 0,1 8,3 + 0,1 8,7 + 0,1 8,0 + 0,1 8,3 + 0,1
Fe
N + K 6,2 + 0,1 9,2 + 0,1 7,0 + 0,1 12,0 + 0,1 8,3 + 0,1 8,9 + 0,1 8,2 + 0,1 8,4 + 0,1
sem adubação 1,00 + 0,1 1,50 + 0,1 0,88 + 0,1 1,47 + 0,1 0,73 + 0,2 1,10 + 0,1 0,80 + 0,1 0,91 + 0,1
N 0,93 + 0,1 1,33 + 0,1 0,77 + 0,1 1,27 + 0,1 0,68 + 0,1 0,89 + 0,1 0,79 + 0,1 0,89 + 0,1
K 0,88 + 0,1 1,17 + 0,1 0,74 + 0,1 1,17 + 0,1 0,64 + 0,1 0,82 + 0,1 0,75 + 0,1 0,76 + 0,1
Cu
N + K 0,84 + 0,1 1,00 + 0,1 0,70 + 0,1 0,98 + 0,1 0,62 + 0,1 0,78 + 0,1 0,73 + 0,1 0,74 + 0,1
sem adubação 31,9 + 1,2 48,7 + 1,1 21,1 + 0,6 50,1 + 1,9 37,2 + 0,6 56,5 + 0,8 30,6 + 2,1 22,0 + 0,1
N 27,9 + 1,3 46,3 + 0,5 22,5 + 0,6 41,1 + 1,3 26,1 + 0,7 34,4 + 0,6 29,9 + 2,5 26,2 + 0,2
K 30,9 + 1,8 38,8 + 2,3 29,4 + 0,3 34,6 + 0,7 27,0 + 0,7 32,8 + 2,3 29,5 + 1,1 32,8 + 0,1
Na
N + K 20,8 + 1,3 40,2 + 1,5 24,3 + 0,8 29,6 + 0,4 34,3 + 0,3 27,6 + ,8 31,7 + 1,3 30,4 + 3,5
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47
Tabela XI: Análise estatística (ANOVA com teste de Tukey a 5%) dos conteúdos dos minerais das folhas de erva-mate, sob
diferentes condições agronômicas.
Idade das folhas
mg/100g
Intensidade de luz
mg/100g
Adubação
mg/100g
Mineral
06
meses
12
meses
18
meses
24
meses
Sol sombra Sem adubação N K N + K
K 1562,9
a
1121,9
b
625,3
c
585,8
d
926,7
b
1030,8
a
978,7
b
787,7
c
1144,1
a
985,2
b
Ca 716,9
a
588,0
b
606,3
c
522,2
d
532,2
b
699,5
a
504,7
d
729,3
a
651,6
b
577,8
c
Mg 755,6
b
783,7
a
756,6
b
756,7
b
761,9
a
764,3
a
757,2
c
783,7
a
739,7
d
771,8
b
Mn 253,0
a
190,5
b
192,9
b
187,5
b
205,0
a
207,0
a
150,9
d
175,1
c
234,0
b
264,0
a
Na 35,67
a
31,56
b
34,58
a
29,12
b
28,4
b
37,0
a
37,30
a
31,79
b
31,97
b
29,88
c
Fe 7,45
d
9,22
a
8,37
b
8,01
c
7,14
b
9,39
a
7,95
c
8,18
bc
8,40
ab
8,52
a
Zn 6,37
a
6,45
a
5,59
c
5,97
b
4,73
b
7,45
a
4,95
c
7,01
a
6,19
b
6,25
b
Cu 1,08
a
1,00
b
0,78
c
0,80
c
0,80
b
1,05
a
1,05
a
0,94
b
0,87
c
0,80
d
Letras iguais entre dois níveis da média de um fator, não tem diferença significativa a 5 % (Teste de Tukey).
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48
3.0 CONCLUSÕES PARCIAIS
A avaliação da influência das variáveis agronômicas na quantidade dos
minerais nas folhas de erva-mate permitiu concluir que:
• As folhas de erva-mate apresentaram altas quantidades dos metais K, Ca,
Mn e Mg estando de acordo com os níveis encontrados para as plantas.
• Analisando a influência da idade de poda das folhas de erva-mate pode-
se observar que o teor de minerais é mais alto em folhas jovens.
• Plantas cultivadas em áreas sombreadas apresentam maior quantidade
de nutrientes do que aquelas plantadas ao sol.
• As variáveis agronômicas que mais influenciaram foram a idade de poda
das folhas e a intensidade de luz.
• A Espectrometria de Absorção Atômica (FAAS) permitiu determinar com
segurança a composição mineral das amostras estudadas.
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49
CAPÍTULO 4:
APLICAÇÃO DO CO
2
A ALTAS
PRESSÕES NA EXTRAÇÃO DE
COMPOSTOS ORGÂNICOS
DE ERVA-MATE
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50
1.0 EXPERIMENTAL
Neste capítulo foram estudadas as variáveis da técnica de extração
(temperatura e pressão) com fluido supercrítico (SFE) nas amostras de folhas
de erva-mate sob diferentes condições agronômicas (intensidade de luz, idade
de folha e adubação) sobre o rendimento de extrato. Também foram
identificados e quantificados os principais compostos das folhas de erva-mate
de 18 meses, avaliando a intensidade de luz e a adubação sobre estes
compostos. Foi utilizado o mesmo experimento de campo descrito no capítulo
3. O tratamento inicial das amostras seguiu o mesmo procedimento indicado no
capítulo 3, quanto à coleta das amostras, secagem, moagem, classificação
granulométrica e estocagem.
1.1 Reagentes e solventes
Para o procedimento de extração supercrítica foi utilizado CO
2
(White
Martins) de grau UP, com 99,9% de pureza (cilindro com tubo pescador). Os
padrões cafeína, teobromina, ácido mirístico, ácido hexadecanóico, ácido
esteárico, esqualeno, eicosano, docosano, hexacosano, nonacosano,
tricosano, heneicosano, heptacosano, triacontano, linolenato de metila,
linoleato de metila, oleato de metila, β-sitosterol, agnosterol, hexadecanoato de
metila, hexadecanoato de etila, pentadecanoato de etila, gama-delactona,
estearato de metila, tetracosano, vitamina E, estigmasterol, fitol e bifenila foram
adquiridos da Aldrich, Palo Alto, Califórnia, EUA. Foram preparadas soluções
estoques de cada padrão (1000 µg mL
-1
) em diclorometano e guardadas sob
refrigeração. Os solventes (grau p.a.) utilizados foram adquiridos da Merck,
bidestilados.
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51
1.2 Extração com CO
2
supercrítico
As extrações foram realizadas em uma unidade em escala de
laboratório, que consiste basicamente de um cilindro de CO
2
, dois banhos
termostáticos (QUIMIS), uma bomba de alta pressão (ISCO 260D), um reator
em aço inoxidável (100 mL), um transdutor de pressão (SMAR LD301)
equipado com um controlador (SMAR, HT 201) com uma precisão de ± 0,012
MPa e um tubo coletor de vidro, conforme esquematizado na Figura 8 e
visualizado através de foto na Figura 9.
Figura 8: Esquema representativo de um sistema de extração a altas
pressões: (A) – cilindro de CO
2
; (B) e (C) – banhos termostáticos; (D) - extrator;
(E) – tubo coletor de vidro; (F) – bomba de alta pressão; (G) – medidor de
pressão; (H) – válvula micrométrica com sistema de aquecimento.
1.3 Variáveis de extração
As condições de extração foram estabelecidas nas temperaturas de 20,
30 e 40 ºC e nas pressões de 100, 175 e 250 atm. Foram avaliados os efeitos
destas variáveis sobre o rendimento de extrato da folha (seca) de erva-mate e
sua composição química. O intervalo de variáveis estudado (temperatura e
C
A
G
F
E
D
B
H
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52
pressão) foi estabelecido de forma a cobrir a região de interesse no que se
refere às propriedades de transporte e poder solvente do dióxido de carbono.
Figura 9: Fotografia com vista parcial da unidade de extração com dióxido de
carbono pressurizado.
As amostras de erva-mate (25 g) foram colocadas no extrator e o CO
2
foi
bombeado até a pressão de extração. Este solvente foi deixado em contato
com a amostra por 1 h para estabilização do sistema. Após, a válvula
micrométrica foi aberta, sendo coletado o óleo solubilizado. O fluxo de CO
2
foi
acompanhado através do registrador da bomba de alta pressão. O óleo
extraído foi coletado e pesado em intervalos de tempo definidos (15 a 20 min).
Um outro tubo foi conectado ao equipamento e a extração continuou até que
não se obteve quantidade significativa de extrato em intervalo de tempo
determinado. O tempo de extração em cada experimento foi estabelecido em
aproximadamente 400 minutos, isotermicamente, à pressão constante. Cada
experimento consumiu em média 10 h, incluindo-se pesagem da amostra,
carga do extrator, estabilização da temperatura do extrator e dos banhos,
extração, despressurização e descarga do extrator.
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53
Um planejamento experimental fatorial 2
2
foi estabelecido para avaliar a
influência das variáveis do processo no rendimento e na composição química
do extrato. As extrações foram realizadas nas temperaturas de 20 a 40°C e
pressões de 100 a 250 atm. As corridas foram realizadas em duplicata, em
todas as condições.
1.4 Cromatografia líquida preparativa em sílica gel
Os extratos brutos de SFE foram submetidos à cromatografia líquida
preparativa em sílica gel, conforme a seguinte metodologia: em uma coluna de
vidro (30 cm x 11 mm) foram adicionados 3,0 g de sílica previamente ativada a
180
0
C por 20 horas em cápsula de porcelana revestida com papel de alumínio
perfurado e, posteriormente, guardada em dessecador. A coluna foi
condicionada com 20 mL de hexano e este eluente foi descartado. Em um
béquer, foram adicionados cerca de 100 mg da mistura dos extratos obtidos
por SFE, e misturados com 0,5 g de sílica e 3 mL de hexano, homogeinizando
bem. Após a evaporação do solvente, esta mistura foi colocada no topo da
coluna. A seguir fez-se eluir cerca de 150 mL dos seguintes solventes,
seguindo a ordem de polaridade: hexano, tolueno, diclorometano, acetato de
etila, acetona e metanol. Foram obtidas seis frações (Figura 10) que foram
concentradas em atmosfera de nitrogênio e mantidas em dessecador até peso
constante.
1.5 Cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas
(GC/MS)
Os extratos obtidos na extração das amostras de erva-mate com CO
2
a
altas pressões foram analisados por GC/MS, conforme condições analíticas
descritas na Tabela XII.
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54
Figura 10: Esquema do fracionamento aplicado à mistura dos extratos
obtidos por SFE.
Tabela XII: Condições cromatográficas utilizadas na análise dos extratos
obtidos com CO
2
a altas pressões por GC/MS.
A identificação de alguns compostos foi feita com base na injeção de
padrões (cafeína, teobromina, ácido mirístico, ácido hexadecanóico, ácido
esteárico, esqualeno, eicosano, docosano, hexacosano, nonacosano,
tricosano, heneicosano, heptacosano, triacontano, linolenato de metila,
linoleato de metila, oleato de metila, β-sitosterol, agnosterol, hexadecanoato de
metila, hexadecanoato de etila, pentadecanoato de etila, gama-delactona,
estearato de metila, tetracosano, vitamina E, estigmasterol, fitol e bifenila),
Parâmetro Condição
Equipamento GC/MS – Shimadzu QP-5050
A
Coluna OV – 5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm)
Ionização Impacto eletrônico com 70 eV
Modo de injeção Split 1:20
Gás de arraste e fluxo He; 1,5 mL min
-1
Programação de Temperatura
100°C (1 min)
- 3°C min
-1
- 280°C (30 min)
Temperatura do injetor e interface
280°C
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55
usando a bifenila como padrão interno, através da comparação dos espectros
de massas e dos tempos de retenção dos compostos. Os demais compostos
foram identificados por comparação com os espectros de massas da biblioteca
Wiley do equipamento. Foram preparadas soluções estoque de cada padrão a
1000 µg mL
-1
em diclorometano e soluções contendo todos os padrões em
várias concentrações, além de soluções de cada extrato em torno de 3000 µg
mL
-1
em diclorometano, sendo injetado 1µL de cada solução. A quantificação
de alguns destes compostos nos extratos foi efetuada a partir da injeção da
mistura padrão e dos extratos no sistema GC/MS operando no modo SIM
(monitoramento de íons individuais). A programação de temperatura foi
modificada para a quantificação dos compostos utilizando-se uma programação
de temperatura mais rápida. As condições cromatográficas foram: 140 °C (0
min)-10 °C/min-170 °C(5 min.)-10°C/min –230 °C –20°C/min –290 °C (10 min),
T
injetor
=280 °C, T
detector
: 290 °C, split: 1:20 e fluxo de 1,5 mL/ min. Usou-se o
método de padronização interna, com a bifenila como padrão interno. Os íons
usados neste procedimento foram: cafeína (m/z = 194), ácidos palmítico e
esteárico (m/z = 73), fitol (m/z = 143), esqualeno (mz/ = 69), vitamina E (m/z =
165) e bifenila (PI) (m/z = 154) (m/z=massa/carga).
1.5.1 Derivatização
As amostras e os padrões foram derivatizados utilizando-se a
combinação de BSTFA (N, O-bis (trimetilsil) trifluoroacetamida) e TMCS
(trimetilclorossilano) na proporção de 99:1 dos reagentes e amostra e a mistura
de BSTFA e TMCS foi realizada na proporção de 1:1(v/v) [161]. Uma reação
esquemática do processo de derivatização está apresentada no Anexo 1,
exemplificando a derivatização para o caso do ácido hexadecanóico (ácido
palmítico) e para o fitol. Esta derivatização tornou-se necessária para melhorar
a separação cromatográfica de substâncias muito polares, as quais podem ficar
retidas irreversivelmente na coluna cromatográfica.
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56
2.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.1 Efeito das variáveis de extração (P x T)
A etapa inicial da extração das amostras de erva-mate consistiu em
avaliar o efeito da pressão e da temperatura sobre o rendimento da mesma.
A Tabela XIII resume as condições de extração e os resultados
alcançados quanto ao rendimento. Os rendimentos foram calculados com base
na porcentagem do óleo extraído em relação à massa seca da amostra
colocada no extrator, em um tempo de 400 minutos. Observa-se uma grande
variação na densidade do solvente (0,612 a 0,963 g/cm
3
) calculada com base
em dados fornecidos por Angus e colaboradores [162]. As variáveis, vazão do
solvente e massa de erva-mate, foram mantidas constantes em 2 g min
-1
e
25 g, respectivamente.
Tabela XIII: Condições experimentais e rendimentos obtidos nas extrações de
erva-mate com CO
2
a altas pressões. Erva-mate com idade de poda de 12
meses cultivada a pleno sol e sem adubação.
Experimento Temperatura
(°C)
Pressão
(atm)
Densidade
(g cm
-3
)
Rendimento
(g
extrato
/100g
erva -mate
)
1 30 175 0,868 1,93
2 20 250 0,963 1,73
3 40 250 0,880 2,46
4 20 100 0,854 1,19
5 40 100 0,612 0,53
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57
A Figura 11 mostra o efeito da temperatura e da pressão sobre o
rendimento da extração da erva-mate, empregando dióxido de carbono a alta
pressão como solvente. As curvas experimentais de extração foram
construídas através do rendimento total de extrato de erva-mate, em função da
massa de dióxido de carbono utilizada, que foi monitorada pelo decaimento no
volume do solvente na bomba de seringa.
Figura 11: Curvas de extração obtidas para erva-mate usando CO
2
a altas
pressões (condições descritas na Tabela XIII). Erva-mate com idade de poda
de 12 meses cultivada a pleno sol e sem adubação.
Como se observa nesta Figura, as curvas de extração são formadas por
uma etapa linear inicial (taxa constante de extração), onde a solubilidade do
óleo no solvente (função somente de temperatura e da pressão) governa a
extração. Nesta etapa, o óleo está completamente exposto e as partículas
sólidas estão cobertas por uma camada deste. Neste período, o solvente deixa
o extrator saturado de óleo e a concentração do óleo no solvente, na saída do
extrator, é igual a sua solubilidade no solvente. Numa segunda etapa, a taxa de
extração decresce em função da resistência à difusão no interior das folhas.
Neste período, a superfície do sólido começa a apresentar falha na camada
superficial de óleo e a área efetiva de troca diminui consideravelmente. Assim,
a transferência de massa é controlada pela difusão do solvente para o interior
Massa de dióxido de carbono [g]
Rendimento[%]
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 100 200 300 400 500 600
40
o
C 250atm
20
o
C 250atm
40
o
C 100atm
20
o
C 100atm
30
o
C 175atm
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58
das partículas do sólido e pela difusão do solvente-soluto para fora da matriz
porosa.
Pode-se observar que em pressões menores (100 atm), à medida que
se aumenta a temperatura, diminui o rendimento da extração. Este fato se deve
à brusca redução da densidade. Para altas pressões (250 atm), o aumento da
temperatura até 40 °C resulta no aumento do rendimento da extração. Nesta
região está claramente demonstrado que, apesar da densidade diminuir com o
aumento da temperatura, a diminuição da viscosidade, o aumento do
coeficiente de difusão do solvente e o aumento da pressão de vapor do óleo,
compensam este decréscimo. Isto faz com que o rendimento seja aumentado
quando se altera a temperatura de 20 para 40
o
C. Em termos de rendimento, a
amostra de erva-mate analisada a 250 atm e 40 °C foi a que apresentou maior
valor, de 2,46 %.
2.2 Fracionamento dos extratos
Após a definição dos efeitos das variáveis temperatura e pressão no
processo de extração por SFE, uma mistura de todos os extratos da Tabela
XIII foi submetida a um fracionamento em sílica gel. Diferentes solventes foram
utilizados e a ordem de eluição foi seguida de acordo com o aumento da
polaridade dos solventes: hexano, tolueno, diclorometano, acetato de etila,
acetona e metanol. A Tabela XIV apresenta os resultados dos rendimentos dos
extratos obtidos na cromatografia líquida preparativa (fracionamento).
Podemos observar nesta tabela que o extrato da fração de tolueno é o
que apresenta maior rendimento em comparação com as outras frações. Este
fato pode estar associado à presença de ceras isoladas nesta fração. A perda
máxima de massa durante o fracionamento foi de 4%.
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59
Tabela XIV: Rendimentos dos extratos (mistura dos extratos da Tabela XIII)
obtidos por cromatografia líquida preparativa (fracionamento), expressos em
gramas (extrato) de cada solvente pela quantidade global da mistura do
extrato.
Fração Eluente Rendimento(%)
1 Hexano 3,6
2 Tolueno 59,2
3 Diclorometano 8,8
4 Acetato de etila 14,8
5 Acetona 3,2
6 Metanol 6,4
2.2.1 Análise cromatográfica (GC-MS) dos extratos obtidos no
fracionamento cromatográfico
A mistura de todos os extratos de SFE (conforme Tabela XIII),
fracionados com hexano, tolueno, diclorometano, acetato de etila, acetona e
metanol foram analisados via GC/MS.
A identificação de alguns compostos foi feita com base na injeção de
padrões e da bifenila como padrão interno, através da comparação dos
espectros de massas e do tempo de retenção de cada padrão.
A Figura 12 apresenta o cromatograma do íon total da mistura dos
extratos de erva-mate obtidos por extração com fluído supercrítico.
Os extratos de erva-mate apresentaram uma mistura complexa de
hidrocarbonetos, compostos oxigenados (álcoois, ácidos graxos, ésteres,
fitoesteróis) e nitrogenados (cafeína e teobromina), estando de acordo com a
literatura [7,15,28].
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60
Figura 12 - Cromatograma do íon total da mistura dos extratos de erva-mate
obtido via extração supercrítica com CO
2
(condições de extração da mistura
dos extratos apresentada na Tabela XIII). Identificação dos picos apresentada
na Tabela XV. Condições cromatográficas descritas na Tabela XII.
Alguns trabalhos citados na literatura têm se preocupado em identificar
e quantificar as metilxantinas (cafeína, teobromina e teofilina) dos extratos de
erva-mate obtidos via extração com fluido supercrítico. Em geral, todos estes
estudos esclarecem que, nas condições de extração estudadas, a cafeína é o
composto majoritário [7,15,24-28].
Em outro trabalho, Esmelindro e colaboradores [28] estudaram os
efeitos das condições de processamento industrial sobre os compostos da
erva-mate utilizando a técnica de extração por fluído supercrítico. Neste estudo,
os extratos obtidos da extração com CO
2
da erva-mate, analisados via GC/MS,
apresentaram em sua composição cafeína, teobromina, ácido hexadecanóico,
fitol, esqualeno, octacosanol, esteróides e terpenos.
Nos extratos obtidos das folhas de erva-mate com fluido supercrítico,
51 compostos foram detectados e identificados (por comparação dos tempos
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61
de retenção dos padrões ou tentativamente identificados com base na
biblioteca Wiley NBS do equipamento), e se encontram listados na Tabela XV
em ordem de eluição na coluna cromatográfica OV-5. Foram considerados
tentativamente identificados quando as probabilidades de semelhança do
espectro de massa foram superiores a 84%.
Cafeína (pico 7), ácido hexadecanóico (picos 11, 13 e 14), esqualeno
(pico 37), fitol (picos 15 e 18), vitamina E (pico 44), stigmasterol (picos 49 e 50)
e sitosterol ou stigmastadienol (picos 48 e 51) são alguns dos mais abundantes
e importantes constituintes dos extratos de erva mate. A cafeína é responsável
pelas propriedades estimulantes das folhas de erva-mate, pois tem efeito sobre
o sistema nervoso central, acelera a entrada de oxigênio nos pulmões,
aumenta a velocidade do metabolismo e acelera o batimento cardíaco [29]. O
esqualeno apresenta propriedades de prevenção contra o câncer [163,164] e o
stigmasterol e seus derivados são reconhecidos como antioxidantes [87,88]. A
extração de fitoesteróis de plantas tem aumentado o interesse de
pesquisadores devido aos seus efeitos na redução de osteosporose e o
controle dos níveis de colesterol [165,166]. A vitamina E é uma substância
reconhecida pelas suas propriedades medicinais (é o mais potente antioxidante
nutricional lipossolúvel), sendo utilizada contra aproximadamente 80 doenças,
como câncer, fibrose cística, insuficiência pancreática e doenças neurológicas,
como Alzheimer [167]. A indústria alimentícia tem utilizado a vitamina E nos
óleos comestíveis como um protetor contra a peroxidação lipídica, auxiliando a
conservação de suas propriedades [168].
Os ésteres graxos (ésteres de ácidos e álcoois de cadeias longas) formam uma
das principais classes na composição das ceras epicuticulares. Essa classe é
composta, principalmente, por derivados do ácido palmítico (C16) (ácido
hexadecanóico) e ácido esteárico (C18) [169].
O fracionamento dos extratos de plantas utilizando uma coluna
preparativa com sílica resultou em distintas frações com diferentes graus de
complexidade, que pode ser visualizado nos cromatogramas da Figura 13 e
Tabela XV.
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62
A fração de hexano (A) contém principalmente hidrocarbonetos,
incluindo esqualeno e vitamina E. Cafeína e teobromina foram encontradas nas
frações de acetato de etila (D) e acetona (E). Álcoois e fenóis, tais como fitol,
também estão presentes nestas frações.
Figura 13 : Cromatograma do íon total das frações do extrato fracionado dos
extratos de erva-mate obtido por CO
2
a altas pressões. Identificação dos picos
apresentada na Tabela XV. Condições cromatográficas descritas na Tabela
XII.
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63
Tabela XV: Compostos identificados na mistura dos extratos da Tabela XIII e
das frações do extrato fracionado de erva-mate com idade de poda de 12
meses, cultivada a pleno sol e sem adubação, obtido por SFE.
N°
t
R
médio
nome do composto fórmula/MM identificação (*) prob.(%)
1 6,6 ácido octanóico (*) C
11
H
24
O
2
Si/206 padrão, MS 85
2 8,8 ácido nonanóico (*) C
12
H
26
O
2
Si/220 padrão, MS 88
3 11,5 ácido decanóico (*) C
13
H
28
O
2
Si/234 padrão, MS 85
4 14,3 ácido undecanóico (*) C
14
H
30
O
2
Si/248 padrão, MS 88
5 16,7 ácido dodecanóico (*) C
15
H
32
O
2
Si/262 padrão, MS 87
6 18,6 ácido tridecanóico (*) C
16
H
34
O
2
Si/286 padrão, MS 86
7 22,1 cafeína C
8
H
10
N
4
O
2
/194 padrão, MS 96
8 21,9 ácido tetradecanóico (*) C
17
H
36
O
2
/300 padrão, MS 92
9 22,8 teobromina C
7
H
8
N
4
O
2
/180 padrão, MS 90
10 23,2 pentadecanoato de metila C
16
H
32
O
2
/254 MS 88
11 24,1 hexadecanoato de metila C
17
H
34
O
2
/270 MS 86
12 24,5 ácido pentadecanóico (*) C
18
H
38
O
2
/314 padrão, MS 85
13 25,5 hexadecanoato de etila C
18
H
36
O
2
/284 padrão, MS 90
14 26,9 ácido hexadecanóico (*) C
19
H
40
O
2
Si/328 padrão, MS 96
15 28,6 fitol C
20
H
40
O/296 padrão, MS 93
16 29,1 ácido heptadecanóico (*) C
20
H
42
O
2
Si/342 padrão, MS 90
17 29,2 linolenato de metila C
19
H
32
O
2
/292 padrão;MS 89
18 29,9 fitol (éter-TMS) C
23
H
48
OSi/368 padrão, MS 90
19 30,3 docosano C
22
H
46
/310 MS 88
20 30,7 ácido linolêico (*) C
21
H
40
O
2
Si/352 MS 92
21 30,9 ácido linolênico (*) C
21
H
38
O
2
Si/350 MS 90
22 31,0 ácido oléico (*) C
21
H
42
O
2
Si/354 MS 90
23 31,4 ácido esteárico (*) C
21
H
44
O
2
Si/356 padrão, MS 92
24 32,5 tricosano C
23
H
48
/324
padrão, MS 86
25 33,7 ácido nonadecanóico (*) C
22
H
46
O
2
Si/370 MS 89
26 34,6 tetracosanol C
24
H
50
O/354 MS 85
27 34,7 tetracosano C
24
H
50
/338 padrão, MS 86
28 35,6 ácido eicosanóico (*) C
23
H
48
O
2
Si/384 MS 85
29 36,6 pentacosanol C
25
H
52
O/368 MS 87
30 36,7 pentacosano C
25
H
52
/352 padrão, MS 88
31 38,6 hexacosanol C
26
H
54
O/382 MS 88
32 38,7 hexacosano C
26
H
54
/366 padrão, MS 88
33 40,5 heptacosanol C
27
H
56
O/396 MS 86
34 40,6 heptacosano C
27
H
56
/380 padrão, MS 87
35 42,4 octacosanol C
28
H
58
O/410 MS 88
36 42,5 octacosano C
28
H
58
/394 padrão, MS 88
37 42,7 esqualeno C
30
H
50
/410
padrão;MS 92
38 44,2 nonacosano C
29
H
60
/408 padrão, MS 90
39 45,8 triacontanol C
30
H
62
O/438 MS 89
40 45,9 triacontano C
30
H
62
/422 padrão, MS 88
41 47,5 commato de metila (C ou D) C
31
H
50
0
4
/486
MS 87
42 47,7 commato de metila (C ou D) C
31
H
50
0
4
/486 MS 87
43 47,9 untriacontano C
31
H
64
/436 padrão/MS 87
44 48,8 vitamina E C
29
H
50
O
2
/430 padrão/MS 90
45 50,2 dotriacontano C
32
H
66
/450 padrão, MS 89
46 52,3 estigmasterol C
29
H
48
O/412 padrão, MS 87
47 53,0 tritriacontano C
33
H
68
/464 padrão, MS 88
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64
Continuação da Tabela XV
N°
t
R
médio
nome do composto fórmula/MM Identificação (*) prob.(%)
48 53,2 estigmasterol (éter-TMS) C
29
H
48
OSi/528 padrão, MS 89
49 54,1 estigmast-5-em-3-ol (3-beta) C
29
H
50
O/414 MS 89
50 54,9 estigmast-8-em-3-ol (3-beta) C
29
H
50
O/414 MS 88
51 55,1 beta-sitosterol (éter-TMS) C
32
H
58
OSi/486 padrão, MS 88
(*) identificado sob a forma de éster trimetil silil (TMS)
As frações obtidas pela eluição com acetato de etila (D), acetona (E) e
metanol (F) apresentaram principalmente ésteres, ácidos saturados e
insaturados. Alguns destes compostos têm sido citados na literatura em
extratos de erva-mate obtidos por SFE [28] e por outros processos de extração.
Também podemos observar na Figura 13 que a maior porcentagem de cafeína
foi eluída na fração de acetato de etila (D), completando-se a eluição nos
solventes subsequentes. É interessante notar que nos extratos brutos foram
encontrados ácidos carboxílicos e também ésteres metílicos e etílicos. Isto
pode ser afirmado, pois os ácidos livres foram derivatizados formando o éster
TMS, enquanto os outros aparecem como ésteres metílicos e etílicos. É
também interessante observar que o cromatograma da fração (B) (eluído com
tolueno) apresenta alguns compostos que não foram identificados com picos
intensos e também que esta fração tem uma alta porcentagem de extrato
(Tabela XIV). Podemos concluir que alguns compostos a base de cera podem
ter sido isolados nesta fração.
Em geral alguns órgãos (as folhas) são recobertos externamente por
uma fina camada de cera, que desempenha grande importância biológica nas
relações entre a planta e o meio ambiente em que esteja inserida. Por
definição, ceras epidérmicas são compostos hidrofóbicos, da superfície das
plantas, que são removidos por uma breve imersão em solvente orgânico,
como clorofórmio ou hexano. Elas são misturas complexas de compostos de
cadeias longas (> C
18
), tais como ácidos graxos, hidrocarbonetos, álcoois,
aldeídos, cetonas, ésteres, compostos alifáticos polinucleares e compostos
fenólicos; compostos que podem apresentar massas moleculares altas [169].
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65
2.3 Efeito das variáveis agronômicas sobre o rendimento da SFE
Para analisar o efeito das variáveis agronômicas, as extrações foram
realizadas mantendo fixas a temperatura em 30 ºC e a pressão em 175 atm, ou
seja, as condições do ponto central do planejamento estatístico.
2.3.1 Efeito da adubação e sombreamento
Para avaliar o efeito da adubação, foram selecionadas as plantas a
pleno sol com idade de poda de 12 meses. Tendo-se dividido o terreno de
plantio em linhas, os diferentes tratamentos foram distribuídos como descrito a
seguir: as plantas da Linha 1 não receberam nenhum tipo de adubação; as da
Linha 2 receberam uma adubação, tendo como fonte de nitrogênio a uréia; as
da Linha 3 receberam adubação, tendo como fonte de potássio o cloreto de
potássio e as plantas da Linha 4 receberam uma adubação com fonte de
nitrogênio e de potássio simultaneamente.
A Figura 14 apresenta o efeito da adubação e sombreamento sobre as
curvas cinéticas da extração da erva-mate.
Figura 14: Cinética da extração da erva-mate de 12 meses de poda, sob
diferentes intensidades de luz e adubação. Temperatura de extração de 30
o
C
e pressão de extração de 175 atm.
Observa-se que quando a adubação das plantas é feita somente com
fontes de nitrogênio, maiores foram os rendimentos obtidos, comparados com
massa de CO
2
[g]
rendimento [%]
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 100 200 300 400 500 600 700
Sol-Linha 1
Sol-Linha 2
Sol-Linha 3
Sol-Linha 4
Sombra-Linha 1
Sombra-Linha 2
Sombra-Linha 3
Sombra-Linha 4
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66
as plantas que não receberam nenhum tipo de adubo. O mesmo efeito, embora
em menor escala, acontece quando se aduba as plantas com fonte de potássio
(cloreto de potássio). Quando as plantas foram adubadas simultaneamente
com fontes de nitrogênio e potássio, uma sinergia negativa foi observada, e o
rendimento da extração não apresentou mudanças significativas em relação
aquele obtido a partir de plantas não adubadas.
Também podemos observar que, independente da condição de
adubação, quando as plantas se encontram a pleno sol o rendimento da
extração (quantidade de compostos solúveis no dióxido de carbono) é
aumentado em relação aquele obtido com plantas sombreadas. Porém, quando
as plantas sombreadas são adubadas com fonte de nitrogênio, um apreciável
aumento no rendimento da extração é observado.
2.3.2 Efeito da idade de poda
O efeito da idade de poda das folhas sobre o rendimento da extração
pode ser observado através da Figura 15.
Figura 15: Cinética da extração da erva-mate sob diferentes idades de poda,
plantadas a pleno sol e adubadas com nitrogênio. Temperatura de extração de
30
o
C e pressão de extração de 175 atm.
Massa de dióxido de carbono [g]
Rendimento [%]
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
0 100 200 300 400 500 600 700
6 meses
12 meses
18 meses
24 meses
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67
Podemos observar que até os 18 meses, o acréscimo na idade de poda
das folhas proporciona um aumento significativo no rendimento da extração. A
partir de 18 meses, a quantidade de compostos voláteis passíveis de extração
diminui consideravelmente, chegando aos 24 meses com rendimentos
similares aos obtidos com plantas de 6 meses de idade de poda. Este
comportamento pode ser explicado em termos do tempo de vida das folhas,
onde, segundo Mosele [3], as folhas de erva-mate caem antes de completarem
24 meses e, neste sentido, as folhas coletadas após 24 meses de poda podem
ser, na verdade, folhas bastante jovens.
2.4 Análise quantitativa dos compostos da erva-mate
A análise quantitativa dos extratos por CO
2
a altas pressões sob
diferentes condições agronômicas (intensidades de luz, fertilização e idade de
poda de 18 meses), foi realizada utilizando-se como padrões a cafeína, ácido
palmítico, fitol, ácido esteárico, esqualeno, vitamina E, e a bifenila como padrão
interno. Para a quantificação dos compostos da erva-mate foram escolhidas as
folhas com idade de poda de 18 meses, pois nesta idade a folha apresentou
maior rendimento de extrato. A Tabela XVI apresenta as concentrações dos
compostos quantificados da erva-mate (cafeína, ácido palmítico, fitol, ácido
esteárico, esqualeno e vitamina E) calculadas usando como padrão interno a
bifenila. Todas as análises foram realizadas em duplicata (extrações e injeção
da amostra e padrões). Alguns destes compostos foram selecionados em
função de suas características e aplicações. A cafeína é um alcalóide
pertencente ao grupo das metilxantinas [8, 9,14]. As xantinas são substâncias
capazes de estimular o sistema nervoso, produzindo um estado de alerta de
curta duração [5,29]. Particularmente, a cafeína é a substância estimulante de
maior consumo em todo o mundo. O fitol é um álcool diterpênico, que é
material básico para a produção sintética de vitamina K1 e E [170]. O
esqualeno é um bactericida natural, empregado amplamente na indústria
cosmética, na fabricação de cremes e emulsões [163-164]. A vitamina E é uma
vitamina essencial para a atividade do organismo e, atualmente vem sendo
amplamente estudada em função de sua poderosa atividade antioxidante [167].
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68
Tabela XVI: Compostos das folhas de erva mate com idade de 18 meses de poda, quantificados em função do tipo de fertilização
e incidência de luz.
mg/kg ± desvio padrão(*)
sombra sol
composto
sem adubo N K N+K sem adubo N K N+K
cafeína 4290 ± 84,8 8688,9±69,1 5487,0±80,6 4689,3±83,9 1705,0±21,2 5418,1±27,6 2889,8±15,5 2058,2±10,3
ác. palmítico 242,2 ± 16,7 229±9,3 358,4±12,9 256,8±11,5 129,2±4,7 210,6±9,6 288,8±6,4 255,8±10,5
fitol 336,3 ± 10,8 182,7±8,2 229,9±3,4 102,8±5,9 332,8±10,2 111,8±5,6 132,7±5,2 93,4±2,2
ác. esteárico 29,75 ± 1,0 27,3±0,9 28,6±0,6 28,0±0,7 28,4±0,8 31,8±0,4 31,4±0,3 26,6±0,7
esqualeno 10501,1±158,7 9596,9±118 8389,6±40,7 9193,8±52,6 12801,1±71,8 9742,7±104,2 8595,7±87,7 9073,8±24
vitamina E 1260,1 ± 39,1 1525,6±50,1 1227,8±46,5 1091,6±29,6 1930,0±40,1 2755,4±56,1 1548,5±26,7 999,2±16,4
(*) média de três determinações
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69
A Tabela XVII apresenta os resultados da análise estatística da influência
de intensidade de luz e do tipo de adubação na quantidade dos compostos
orgânicos selecionados. Os valores apresentados nesta tabela são os valores
médios obtidos em cada nível das variáveis. Letras iguais entre dois níveis da
média de um fator, não tem diferença significativa a 5 % (teste de “Tukey”), o que
pode ser observado com o conteúdo de ácido esteárico.
Tabela XVII: Análise estatística (ANOVA com teste de Tukey a 5%). Efeito da
intensidade de luz e do tipo de adubação sobre a concentração (mg/kg de
amostra) de compostos selecionados do extrato de folhas de erva-mate com 18
meses de idade, obtidos por SFE.
mg/kg
intensidade de luz adubação
composto sombra sol sem adubo N K N+K
cafeína 5788,8
a
3017,8
b
4188,4
b
7053,5
a
2997,5
d
3373,8
c
ác.palmítico 271,6
a
221,1
b
185,7
d
219,8
c
323,6
a
256,3
b
fitol 212,9
a
167,7
b
334,6
a
147,2
c
181,3
b
98,2
d
ác. esteárico 28,4
a
29,6
a
29,1
a
29,6
a
30,0
a
27,3
a
esqualeno 9420,3
b
10053,4
a
11651,2
a
9669,8
b
8492,7
d
9133,6
c
vitamina E 1808,3
a
1276,3
b
1595,1
b
2140,5
a
1388,2
c
1045,4
d
Analisando a Tabela XVII, pode-se observar que a intensidade de luz tem
um efeito negativo sobre as concentrações de cafeína, fitol, ácido palmítico e
vitamina E. Desta forma, maiores teores de cafeína, fitol, ácido palmítico e
vitamina E podem ser obtidos das plantas que se encontram em áreas protegidas
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70
do sol. Em relação ao esqualeno e ao ácido esteárico, a concentração é
aumentada sob intensidade de luz, ou seja, em plantas cultivadas a pleno sol.
Mazzafera [171], estudando a erva-mate, observou as mesmas tendências
quando analisou cafeína, ou seja, encontrou maiores concentrações em folhas
parcialmente sombreadas.
O efeito da adubação sobre a composição química mostrou-se bastante
correlacionado com a intensidade de luz. Quando as plantas de erva-mate são
adubadas com fontes de nitrogênio ocorre um aumento significativo do teor de
cafeína e vitamina E. O fitol e o esqualeno apresentaram maiores concentrações
em plantas não adubadas, enquanto que o teor de ácido palmítico aumentou em
plantas adubadas com K.
O efeito da fertilização nitrogenada sobre a produção de alcalóides tem
sido objeto de pesquisas. Embora com algumas exceções, muitas pesquisas têm
apresentado aumento no conteúdo de alcalóides nas folhas de erva-mate com
fertilização nitrogenada. Em alguns casos, a resposta pode variar de acordo com
a fonte nitrogenada utilizada na fertilização (nitrato, amônia ou uréia) [23].
Segundo Mazzafera [172], como os alcalóides são compostos nitrogenados,
baixo teor de cafeína é esperado em tratamentos com menor disponibilidade de
N. O nível de cafeína varia como parte integrada do metabolismo de compostos
nitrogenados da planta, e em função do fornecimento deste elemento.
Também podemos observar na Tabela XVII que a concentração de
cafeína diminuiu com a utilização de adubação com fonte de potássio e com fonte
de nitrogênio e potássio simultaneamente. Além do nitrogênio, pesquisas
demonstram que a redução de K geralmente resulta em aumento da
porcentagem de alcalóides em plantas [23]. Mazzafera [171], ao estudar o
comportamento do suprimento de nutrientes sobre o conteúdo de cafeína em
folhas de café (Coffea arábica L.), observou que a ausência de K induziu o
aumento do conteúdo de cafeína nas folhas.
De acordo com a literarura, a concentração de cafeína nas folhas de erva-
mate pode variar de 0,16 % em folhas velhas, a 1,4 % em folhas jovens, sobre a
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71
massa das folhas secas [8, 14, 22,23,173]. Saldaña et al. [26] identificaram e
quantificaram a cafeína em extratos de folhas de erva-mate obtidos por extração
por fluído supercrítico e encontraram valores de 4308 mg/kg deste composto, na
temperatura de 70 °C e pressão de 255 atm.
Em um outro trabalho, Saldaña et al. [27], observaram que a modificação
do solvente com diferentes quantidades de etanol resultou em um aumento da
concentração de cafeína nos extratos das folhas de erva-mate obtida por SFE a
200 atm e 70°C (de 3320 mg/kg para 6110 mg/kg de cafeína nas folhas erva-
mate). Os valores de cafeína da Tabela XVII estão dentro da faixa de
concentração encontrada por estes pesquisadores.
3.0 CONCLUSÕES PARCIAIS
A verificação da influência das variáveis de extração da técnica de
extração por fluido supercrítico e das variáveis agronômicas das folhas de erva-
mate, permitiu concluir que:
• As variáveis temperatura e pressão exercem efeito pronunciado sobre a
quantidade de extrato produzido. Pressões maiores (250atm) levam a
melhores rendimentos, uma vez que a elevação da pressão (aumento da
densidade) incrementa o poder de solubilização do solvente.
• Foi observado um maior rendimento de extrato das folhas de erva-mate
na pressão de 250 atm e 40 °C;
• O fracionamento dos extratos obtido por SFE permitiu a identificação de 51
compostos presentes nas folhas de erva-mate.
• O manejo da planta também interfere no rendimento da extração.
• Em relação ao sombreamento das plantas, observou-se que plantas
cultivadas a pleno sol produzem maior quantidade de extratos orgânicos
do que plantas sombreadas, utilizando a técnica de SFE.
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72
• A idade de poda das folhas também afeta notadamente o rendimento da
extração. Até os 18 meses, o acréscimo na idade de poda das folhas
proporciona um aumento significativo no rendimento da extração. Após os
18 meses a quantidade de compostos voláteis passíveis de extração
diminui consideravelmente, chegando aos 24 meses com rendimentos
semelhantes aos das plantas de 6 meses de idade de poda.
• Quando as plantas são adubadas somente com fontes de nitrogênio,
obtêm-se maiores rendimentos em massa de extrato quando comparados
com as plantas sem adubação. O mesmo efeito acontece quando se
aduba as plantas com fonte de potássio (cloreto de potássio). Quando as
plantas são adubadas simultaneamente com fontes de nitrogênio e
potássio, o rendimento da extração não apresenta mudanças significativas
em relação aquele obtido a partir de plantas não adubadas.
• A partir dos resultados alcançados pode-se concluir que a intensidade de
luz tem um efeito negativo sobre a concentração da cafeína, fitol, ácido
hexadecanóico e vitamina E. A concentração do esqualeno é aumentada
sob intensidade de luz.
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73
CAPÍTULO 5:
APLICAÇÃO DO ULTRA-SOM
NA EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS
ORGÂNICOS DE ERVA-MATE
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74
1.0 EXPERIMENTAL
Neste capítulo foram estudadas as condições da extração por ultra-som,
utilizando um planejamento estatístico 2
5-1
nas amostras de folhas de erva-mate,
adubadas com nitrogênio, plantadas ao sol e com idade de folha de 18 meses.
Neste planejamento foram avaliadas as seguintes variáveis de extração: tempo
de extração, polaridade do solvente, quantidade de amostra, temperatura do
banho de extração e relação de massa de amostra/volume de solvente.O
tratamento inicial das amostras seguiu o mesmo procedimento indicado nos
capítulos anteriores, quanto à secagem, moagem, classificação granulométrica e
estocagem. De forma idêntica, também os padrões e soluções estoque foram
preparados conforme o item 1.2 da parte experimental do capítulo 4.
1.1 Extração por ultra-som
Utilizou-se um aparelho modelo Fisher Scientific – FS14H, com potência
de 90 W, freqüência de 40 kHz e intensidade de radiação de 0,27 W/cm
2
. As
dimensões do banho utilizado foram de 24 cm x 14 cm x 10 cm (Figura 16).
Foram utilizados erlenmeyers de 250 e 500 mL, com boca esmerilada,
conectados a um condensador de ar de 30 cm de altura.
Primeiramente, realizou-se um planejamento fatorial fracionário 2
5-1
, que
inclui a avaliação dos seguintes parâmetros:
• X
1
: tempo de extração (60 e 180 minutos)
• X
2
: temperatura do banho (25 e 75 °C)
• X
3
: polaridade do solvente (hexano e metanol)
• X
4
: quantidade de amostra (2,5 e 7,5 g)
• X
5
: relação de massa de amostra/volume de solvente (1:10 e 1:30) (g/mL)
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75
Figura 16: - Equipamento utilizado para extração por ultra-som das folhas de
erva-mate.
Como variável de resposta, em todos os planejamentos realizados
considerou-se a porcentagem do rendimento de cada extração e o perfil
cromatográfico, resultando em 16 experimentos (Tabela XVIII, apresentada na
seção de resultados já com os rendimentos obtidos), gerando uma equação que
descreve um modelo ajustado ao experimento global. Nesta equação identificam-
se as variáveis mais importantes do processo de extração e a interação entre as
mesmas.
1.2 Cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas
(GC/MS)
Os extratos obtidos na extração das amostras de erva-mate por ultra-som
foram analisados por GC/MS, conforme condições analíticas descritas na Tabela
XII.
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76
A identificação e quantificação de alguns compostos (cafeína, teobromina,
ácido mirístico, ácido hexadecanóico, ácido esteárico, esqualeno, eicosano,
docosano, hexacosano, nonacosano, tricosano, heneicosano, heptacosano,
triacontano, linolenato de metila, linoleato de metila, oleato de metila, β-sitosterol,
agnosterol, hexadecanoato de metila, hexadecanoato de etila, pentadecanoato
de etila, gama-delactona, estearato de metila, tetracosano, vitamina E,
estigmasterol, fitol), bem como as derivatizações foram realizadas conforme
descrito no item 1.6.1 do capítulo 4.
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77
2.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.1 Variáveis de extração
A etapa inicial da extração das amostras de erva-mate por ultra-som
consistiu em avaliar o efeito das variáveis tempos de extração, quantidade de
amostra, relação massa/solvente, polaridade do solvente e temperatura de
extração sobre o rendimento das mesmas.
A Tabela XVIII apresenta os resultados e as condições experimentais de
um planejamento estatístico 2
5-1
, aplicado em dois níveis (+1 e -1) para cada
variável. Foi considerada como variável de resposta à porcentagem em massa
(g/100g) da extração. Os rendimentos foram calculados com base na
porcentagem do extrato em relação à massa da amostra utilizada na extração.
Os resultados foram analisados utilizando o software “Statistics for
Windows” versão 6.0 e, discriminando os efeitos significativos, foi obtida a
seguinte equação empírica:
y (%) = A
0
*
+ A
1
X
1
+ A
2
X
2
*
+ A
3
X
3
*
+ A
4
X
4
+ A
5
X
5
*
+ A
6
X
1
X
4
*
+ A
7
X
1
X
5
+ A
8
X
4
X
5
+ A
9
X
4
X
3
+ A
10
X
5
X
3
A partir desta equação, temos a média dos coeficientes assinalados com
asterisco, na qual o efeito apresenta diferença significativa em nível de 5% de
confiança (p< 0,05), utilizando o teste de “Tukey”. Em outras palavras, os
parâmetros assinalados, que são a troca do nível baixo ao nível alto de uma
variável, causam uma significante variação na variável de saída (rendimento de
extrato). Substituindo os valores teóricos de A
i
(i = 1 a 10) a equação é expressa
como:
Y (%) = 5.32 + 0.48X
1
+ 1.08X
2
+ 4.59X
3
+ 0.38X
4
+ 0.85X
5
+ 0.83X
1
X
4
– 0.59X
1
X
5
– 0.47X
4
X
5
+ 0.43 X
4
X
3
+ 0.63 X
5
X
3
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78
Tabela XVIII: Variáveis e resultados de um planejamento fatorial fracionário 2
5-1
do processo de extração por ultra-som, das folhas de erva-mate.
variáveis e valores rend. em massa (%)
exp
X
1
X
2
X
3
X
4
X
5
exper. teor.
1
(-) 60 (-) 25 (-) Hex (-) 2,506 (-) 1:10 0,33 0,00
2
(-) 60 (-) 25 (-) Hex (-) 2,508 (+) 1:30 0,63
1,32
3
(-) 60 (-) 25 (+) Met (+) 7,501 (-) 1:10 5,84 6,73
4
(-) 60 (-) 25 (+) Met (+) 7,486 (+) 1:30 9,95 9,93
5
(+) 180 (-) 25 (-) Hex (+) 7,506 (-) 1:10 0,66 0,13
6
(+) 180 (-) 25 (-) Hex (+) 7,501 (+) 1:30 1,13 0,80
7
(+) 180 (-) 25 (+) Met (-) 2,502 (-) 1:10 6,78
7,98
8
(+) 180 (-) 25 (+) Met (-) 2,505 (+) 1:30 13,4
13,07
9
(-) 60 (+) 75 (-) Hex (+) 7,509 (-) 1:10 0,33 1,77
10
(-) 60 (+) 75 (-) Hex (+) 7,506 (+) 1:30 0,64 0,07
11
(-) 60 (+) 75 (+) Met (-) 2,507 (-) 1:10 6,6 6,31
12
(-) 60 (+) 75 (+) Met (-) 2,505 (+) 1:30 9,6 9,02
13
(+) 180 (+) 75 (-) Hex (-) 2,503 (-) 1:10 0,78 1,43
14
(+) 180 (+) 75 (-) Hex (-) 2,504 (+) 1:30 1,39 1,61
15
(+) 180 (+) 75 (+) Met (+) 7,505 (-) 1:10 12,1 12,70
16
(+) 180 (+) 75 (+) Met (+) 7,503 (+) 1:30 12,6 13,53
(-1) nível baixo; (+1) nível alto; X
1
(tempo de extração em minutos); X
2
(temperatura de
extração ºC); X
3
(polaridade do solvente); X
4
(massa de amostra em g); X
5
(massa de
amostra/volume de solvente em g/L).
Os maiores valores estão em negrito na equação e representam uma
grande influência no processo, sendo os coeficientes que possuem valores p <
0,05 no teste de “Tukey”. Os valores experimentais de porcentagem de extrato
em massa (mg/100g) e os obtidos pela aplicação da equação acima (valor
teórico) para cada experimento são apresentados na Tabela XVIII.
A análise da equação permitiu observar que todas as variáveis
manifestaram um efeito positivo. As principais variáveis que influenciaram o
processo de extração por ultra-som foram X
2
(tempo de extração), X
3
(polaridade
do solvente) e X
5
(razão massa de amostra / volume de solvente). Assim, maior
tempo de extração (180 minutos), maior quantidade de solvente (225 mL) e
solvente mais polar (metanol), produzem maior quantidade de extrato nas folhas
de erva-mate. A variável X
3
(polaridade do solvente) apresentou um efeito
positivo mais alto (+ 4.59 X
3
), isto é, quanto maior a polaridade do solvente maior
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79
será a massa de extrato. A interação entre as variáveis (X
1
X
4
) apresentou efeito
significativo (0.83X
1
X
4
), indicando que grande quantidade de amostra e maior
temperatura de extração produzem mais extrato. As outras interações entre as
variáveis não apresentaram efeito significativo.
Baseado nestas informações, pode-se concluir que as condições mais
favoráveis, entre as estudadas para a extração por ultra-som, são: maior
quantidade de solvente, solvente polar e maior tempo de extração.
A Figura 17 apresenta a correlação entre os valores experimentais e
aqueles calculados pelo modelo empírico.
Figura 17: Correlação entre os rendimentos obtidos experimentalmente e
aqueles calculados pelo modelo empírico do planejamento fatorial fracionário 2
5-1
.
Pode-se observar que, para alguns experimentos (1, 6, 8, 11 e 14), existe
uma apropriada aproximação entre os dados experimentais e teóricos. Também é
possível concluir que o modelo é capaz de capturar as principais tendências das
observações experimentais, com o valor do coeficiente de correlação entre o
experimental e o calculado (R = 0,984) bastante próximo da unidade. O
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80
experimento 16 (7,5 g de amostra, 225 mL de metanol, 180 minutos de extração a
75°C) foi o que apresentou as melhores condições de extração pelo processo de
ultra-som.
2.2 Caracterização química dos extratos
A Figura 18 apresenta os cromatogramas do íon total dos extratos de erva
-mate obtido por sonicação com hexano e metanol.
A Tabela XIX e a Figura 18 apresentam os principais compostos
identificados nos extratos das folhas de erva-mate com idade de poda de 18
meses, cultivadas a pleno sol, adubadas com fonte de nitrogênio e a composição
química individual de cada extrato obtida para cada solvente, utilizando o método
de extração por ultra-som.
Os extratos das folhas de erva-mate obtidos por ultra-som apresentam em
sua composição uma mistura complexa de hidrocarbonetos, álcoois, éteres,
ésteres, ácidos carboxílicos e compostos nitrogenados (cafeína, teobromina),
estando tal composição de acordo com a literatura [7].
Nos extratos de erva-mate, 25 compostos foram detectados e identificados
(por comparação dos tempos de retenção dos padrões ou tentativamente
identificados com base na biblioteca Wiley NBS de espectros de massas do
equipamento) e estão listados na Tabela XIX em ordem de eluição na coluna
cromatográfica OV-5 (metil silicone com 5% de grupos fenila). Os compostos só
foram considerados positivamente identificados quando as probabilidades de
semelhança entre os espectros de massa (comparando com o banco de
espectros da biblioteca do equipamento) foram superiores a 84%.
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Rosângela Assis Jacques
81
Figura 18: Cromatogramas do íon total dos extratos obtidos por ultra-som com
hexano (A) e metanol (B), das amostras de erva-mate com idade de poda de 18
meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de nitrogênio. Os picos
identificados estão na Tabela XIX. As condições cromatográficas estão descritas
na Tabela XII.
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82
Tabela XIX: Principais compostos identificados nos extratos por ultra-som com
hexano e metanol, das amostras de erva-mate com idade de poda de 18 meses,
plantada a pleno sol e adubada com fonte de nitrogênio.
Solvente
N° t
R
médio
compostos identificados
hexano metanol
fórmula/MM identificação
prob.
(%)
1 6,54 ácido octanóico(*) X X C
11
H
24
O
2
Si/206 MS 85
2 8,80 ácido nonanóico(*) X X C
12
H
26
O
2
Si/220 MS 88
3 11,36 ácido decanóico (*) X X C
13
H
28
O
2
Si/234 MS 85
4 15,48 ácido heptanodióico(*) X C
13
H
28
O
4
Si
2
/304 MS 85
5 16,74 ácido dodecanóico (*) X C
15
H
32
O
2
Si/262 MS 87
6 18,10 ácido octanodióico(*) X C
14
H
30
O
4
Si
2
/318 MS 92
7 20,74 ácido nonanodióico(*) X X C
15
H
32
O
4
Si
2
/332 MS 90
8 21,81 cafeína X X C
8
H
10
N
4
O
2
/194 Padrão/MS 96
9 22,82 teobromina X C
7
H
8
N
4
O
2
/180 Padrão/MS 92
10 24,47 ácido pentadecanóico(*) X X C
18
H
38
O
2
/314 Padrão/MS 85
11 25,70 ácido undecanodióico(*) X C
17
H
36
O
4
Si
2
/360 MS 86
12 26,40 ácido palmitoleico (*) X C
38
H
74
O
2
Si/ 591 padrão/MS 87
13 26,94 ácido hexadecanóico(*) X X C
19
H
40
O
2
Si/ 328 padrão/MS 96
14 29,22 ácido heptadecanóico(*) X X C
20
H
42
O
2
Si/ 342 padrão/MS 90
15 29,99 fitol(TMS-derivado) X C
23
H
48
OSi / 368 padrão/MS 90
16 30,63 ácido linoleico(*) X X C
21
H
40
O
2
Si/ 352 MS 92
17 30,80 ácido linolênico(*) X X C
21
H
38
O
2
Si/ 350 MS 90
18 30,91 ácido oléico (*) X X C
21
H
42
O
2
Si/ 354 MS 90
19 31,38 ácido esteárico(*) X X C
21
H
44
O
2
Si/ 356 padrão/MS 92
20 35,62 ácido eicosanóico(*) X C
23
H
48
O
2
Si/ 384 MS 85
21 39,52 ácido docosanóico(*) X C
25
H
52
O
2
Si/412 MS 85
22 42,92 esqualeno X X C
30
H
50
/ 410 padrão/MS 92
23 44,18 nonacosano X X C
29
H
60
/ 408 padrão/MS 90
24 54,97 estigmast-8-en-3-ol X X C
29
H
50
O/414 padrão/MS 85
25 62,86 agnosterol(TMS-derivado) X C
33
H
56
OSi / 496 padrão/MS 85
(*) identificado sob a forma de éster trimetil silil (TMS)
Cafeína (8) e ácido hexadecanóico (13) são os compostos predominantes
dos extratos de erva-mate obtidos por ultra-som. A cafeína, segundo vários
autores, está associada com as propriedades estimulantes e diuréticas das folhas
de erva-mate [29].
Comparando-se os cromatogramas da Figura 18 podemos verificar que o
ácido heptanodióico, ácido dodecanóico, ácido octanodióico, teobromina, ácido
undecanodióico, ácido palmitoleico, ácido eicosanóico, ácido docosanóico e
agnosterol foram identificados somente no extrato utilizando metanol.
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83
Pela comparação dos extratos de erva-mate obtidos por ultra-som,
podemos verificar que o metanol apresenta uma maior capacidade extratora dos
compostos relativamente ao hexano.
Os compostos identificados neste extrato foram: hidrocarbonetos,
metilxantinas (cafeína e teobromina), ácidos carboxílicos saturados e
insaturados, ésteres, fitol e fitosteróis (estigmasterol e agnosterol).
Em geral, a polaridade do solvente apresenta uma grande influência no
rendimento de extrato, sendo que a alta polaridade produz maior quantidade de
extrato [88]. O planejamento fatorial 2
5-1
também mostrou que um maior tempo de
extração aumenta o rendimento do extrato.
Pela análise dos resultados pode-se observar que a técnica de ultra-som
pode ser aplicada às amostras de erva-mate, como um método de extração, com
as vantagens de redução do tempo de extração e solvente.
3.0 CONCLUSÕES PARCIAIS:
Os resultados obtidos para a determinação da melhor condição de
extração por ultra-som dos compostos orgânicos da erva-mate e da análise
qualitativa dos extratos possibilitaram estabelecer as seguintes conclusões:
• As principais variáveis que influenciaram o processo de extração por ultra-
som foram: tempo de extração, polaridade do solvente e razão massa de
amostra / volume de solvente.
• Maior tempo de extração (180 minutos), maior quantidade de solvente
(225 mL) e solvente mais polar (metanol), produzem maior quantidade de
extrato nas folhas de erva-mate.
• A utilização de um planejamento experimental possibilitou a determinação
da melhor condição de extração dos compostos orgânicos da erva-mate
utilizando a técnica de extração com líquido pressurizado. A condição
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84
ótima ocorreu com 225 mL de metanol, 7,5 g de erva-mate, 180 minutos
de extração a 75 °C.
• As condições mais favoráveis, entre as estudadas para a extração por
ultra-som, são: maior quantidade de solvente, solvente polar e maior
tempo de extração.
• O metanol apresenta uma maior capacidade extratora dos compostos da
erva-mate do que o hexano.
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85
CAPÍTULO 6:
APLICAÇÃO DA EXTRAÇÃO COM
LÍQUIDO PRESSURIZADO NA
ANÁLISE DOS COMPOSTOS
ORGÂNICOS DE ERVA-MATE
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86
1.0 EXPERIMENTAL
1.1 Amostras, reagentes e solventes.
Neste capítulo foram estudadas as condições da extração por extração com
líquido pressurizado (PLE), utilizando um planejamento estatístico 2
6-2
nas
amostras de folhas de erva-mate, adubadas com nitrogênio, plantadas ao sol e
com idade de folha de 18 meses. Neste planejamento foram avaliadas as
seguintes variáveis de extração: tempo de extração, polaridade do solvente,
quantidade de amostra, “flushing”, número de ciclos e temperatura de extração.
Como variável de resposta, em todos os planejamentos realizados, considerou-se
a porcentagem do rendimento em massa de cada extração e o perfil
cromatográfico. O tratamento inicial das amostras seguiu o mesmo procedimento
indicado nos capítulos anteriores, quanto à secagem, moagem, classificação
granulométrica e estocagem. De forma idêntica, também os padrões e soluções
estoque foram preparados conforme o item 1.2 da parte experimental do capítulo
4.
1.2 Extração com líquido pressurizado (PLE) ou extração acelerada com
solventes (ASE)
A partir deste capítulo o termo ASE será usado como sinônimo de PLE,
uma vez que o equipamento usado é assim designado comercialmente. As folhas
de erva-mate foram extraídas em um equipamento de ASE 300
TM
da marca
Dionex, conforme visualizado na foto da Figura 19. Foram utilizadas células de
aço inoxidável para extração, com capacidade máxima de 100 mL e frascos
coletores de vidro com capacidade de 250 mL.
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87
Figura 19: Foto ilustrativa do aparelho de Extração Acelerada com Solventes
ASE
®
300
TM
Para a otimização do processo de extração, foi elaborado um planejamento
fatorial fracionário 2
6-2
que envolve as seguintes variáveis:
• X
1
= temperatura (50 e 100°C)
• X
2
= flushing (50 e 100 %)
• X
3
= polaridade do solvente (hexano e metanol)
• X
4
= massa de amostra (2,5 e 7,5 g)
• X
5
=tempo de extração (10 e 30 min)
• X
6
= número de ciclos (1 e 3 ciclos)
As variáveis pressão e tempo estático foram mantidas constantes em 1500
psi e 5 minutos, respectivamente. A matriz obtida para este primeiro
planejamento, utilizando 2 níveis, é mostrada na Tabela XX.
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88
Como variável de resposta, em todos os planejamentos realizados,
considerou-se a porcentagem do rendimento em massa de cada extração e o
perfil cromatográfico, resultando 16 experimentos.
1.3 Cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas
(GC/MS)
As análises cromatográficas dos padrões e dos extratos obtidos das
amostras de erva-mate por PLE foram analisados por GC/MS, conforme
condições analíticas descritas na Tabela XII, seguindo-se o procedimento
descrito nos capítulos 4 e 5.
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89
2.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.1 Variáveis de extração
A etapa inicial na extração das amostras de erva-mate consistiu em avaliar
o efeito das variáveis temperatura de extração, ”flushing”, quantidade de amostra,
polaridade do solvente, tempo de extração e número de ciclos sobre o
rendimento das mesmas.
A Tabela XX apresenta os resultados e as condições experimentais de um
planejamento estatístico 2
6-2
, aplicado em dois níveis (+1 e -1) para cada variável.
Foi considerada como variável de resposta a porcentagem em massa (g/100g) da
extração. Os rendimentos foram calculados como porcentagem do extrato em
relação à massa da amostra utilizada na extração.
Os resultados foram analisados utilizando o software “Statistics for
Windows” versão 6.0, e discriminando os efeitos significativos foi obtida a
seguinte equação empírica:
y % = A
0
*
+ A
1
X
1
*
+ A
2
X
2
+ A
3
X
3
*
+ A
4
X
4
*
+ A
5
X
5
+ A
6
X
6
+ A
7
X
1
X
4
+ A
8
X
1
X
2
*
+ A
9
X
4
X
6
Nesta equação, é apresentada a média dos coeficientes sinalizados com
asterisco, na qual o efeito apresenta diferença significativa em nível de 5% de
confiança (p< 0,05) utilizando o teste de “Tukey”. Em outras palavras, para os
parâmetros assinalados, a troca do nível baixo ao nível alto de uma variável
causa uma significativa variação na variável de saída (rendimento de extrato).
Substituindo os valores teóricos de A
i
(i = 1 a 10) :
y % = 7.753 + 1.030 X
1
+ 0.608 X
2
+ 6.089 X
3
+ 1.788 X
4
- 0.841 X
5
+ 0.283 X
6
+ 0.546 X
1
X
4
+ 2.009 X
1
X
2
- 0.649 X
4
X
6
.
Os altos valores (em negrito) apresentam uma grande influência no
processo, sendo os coeficientes que possuem valores p < 0,05 no teste de
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90
“Tukey”. Os valores experimentais de porcentagem de extrato em massa (g/100g)
e os obtidos pela aplicação da equação acima (valor teórico) para cada
experimento são apresentados na Tabela XX.
Tabela XX: Variáveis e resultados de um planejamento fatorial fracionário 2
6-2
,
utilizados na extração com líquido pressurizado.
variáveis e valores rend. em massa
(%)
Exp. X
1
X
2
X
3
X
4
X
5
X
6
exp. teórico
1 (-) 50 (-) 50 (-) Hex (-) 2,483 (-) 10 (-) 1 1,1 0,70
2 (-) 50 (-) 50 (-) Hex (-) 2,589 (+) 30 (+) 3 1,3 0,91
3 (-) 50 (-) 50 (+) Met (+) 7,575 (-) 10 (-) 1 14,1 16,58
4 (-) 50 (-) 50 (+) Met (+) 7,517 (+) 30 (+) 3 15,9 14,21
5 (-) 50 (+) 100 (-) Hex (+) 7,480 (-) 10 (+) 3 1,0 0,90
6 (-) 50 (+) 100 (-) Hex (+) 7,661 (+) 30 (-) 1 0,70 0,0
7 (-) 50 (+) 100 (+) Met (-) 2,627 (-) 10 (+) 3 11,5 11,98
8 (-) 50 (+) 100 (+) Met (-) 2,538 (+) 30 (-) 1 8,1 8,44
9 (+) 100 (-) 50 (-) Hex (+) 7,681 (-) 10 (+) 3 2,5 2,89
10 (+) 100 (-) 50 (-) Hex (+) 7,656 (+) 30 (-) 1 1,5 1,91
11 (+) 100 (-) 50 (+) Met (-) 2,541 (-) 10 (+) 3 12,5 11,73
12 (+) 100 (-) 50 (+) Met (-) 2,505 (+) 30 (-) 1 8,2 8,17
13 (+) 100 (+) 100 (-) Hex (-) 2,568 (-) 10 (-) 1 2,9 2,98
14 (+) 100 (+) 100 (-) Hex (-) 2,579 (+) 30 (+) 3 2,4 3,13
15 (+) 100 (+) 100 (+) Met (+) 7,596 (-) 10 (-) 1 23,1 20,93
16 (+) 100 (+) 100 (+) Met (+) 7,587 (+) 30 (+) 3 17,2 18,56
Legenda: X
1
= Temperatura (50 e 100°C); X
2
= Flushing (50 e 100 %); X
3
= Polaridade
do solvente (hexano e metanol); X
4
= massa de amostra (2,5 e 7,5 g); X
5
=tempo de
extração (10 e 30 min) e X
6
= número de ciclos (1 e 3 ciclos)
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91
A análise da equação permitiu observar que todas as variáveis
manifestaram um efeito positivo, com exceção da variável X
5
. As principais
variáveis que influenciaram a técnica por extração com líquido pressurizado
foram X
1
(temperatura de extração), X
3
(polaridade do solvente) e X
4
(massa de
amostra). Assim, maior temperatura de extração (100 °C), maior quantidade de
amostra (7,5 g) e solvente mais polar (metanol) produzem maior quantidade de
extrato das folhas de erva-mate. A variável X
3
(polaridade do solvente)
apresentou um efeito positivo mais elevado (+ 6,089 X
3
), isto é, quanto maior a
polaridade do solvente maior será a massa de extrato.
As variáveis como volume de “flushing” (X
2
), tempo de extração (X
5
), e
número de ciclos (X
6
) não influenciaram significativamente o processo de
extração acelerada com solvente. A interação entre as variáveis X
1
e
X
2
manifestou efeito significativo (2,009 X
1
X
4
), indicando que elevada temperatura
de extração e elevado volume de “flushing” produzem mais extrato. Portanto,
maior quantidade de amostra, maior polaridade de solvente e elevado volume de
“flushing” implicam um maior rendimento nos extratos de erva-mate utilizando
esta técnica.
A influência da temperatura no processo de ASE pode ser explicada pelo
aumento do coeficiente de difusão do solvente na amostra (matriz sólida) com o
aumento da temperatura de extração, que favorece a cinética de dessorção dos
compostos da matriz.
A Figura 20 apresenta a interação entre os dados experimentais com
aqueles propostos pelo modelo empírico. Pode-se observar que somente para os
experimentos 3, 4, 15 e 16 os valores experimentais e teóricos não foram
semelhantes. Para os outros experimentos existe uma apropriada aproximação
entre os dados experimentais e teóricos.
Também na Figura 20 é possível observar que o modelo é capaz de
capturar as principais tendências das observações experimentais, com o valor do
coeficiente de correlação entre o experimental e o calculado R = 0,984. O
experimento 15 (7,5 g de amostra, 100% de “flushing”, metanol, 10 minutos de
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92
extração a 100 ºC e um ciclo) foi o que apresentou as melhores condições de
extração pelo processo de extração com líquido pressurizado.
Para efeito de comparação, o experimento 13 (2,5 g de amostra, 100%
“flushing”, hexano, 10 minutos de extração a 100 ºC e um ciclo) também foi
considerado, pois, esta foi a melhor condição do processo de PLE com hexano.
Figura 20: Comparação dos rendimentos do modelo empírico e dos valores
obtidos experimentalmente de um planejamento fatorial fracionário 2
6-2
para a
extração acelerada com solventes.
2.2 Caracterização química dos extratos
A Figura 21 presenta os cromatogramas do íon total dos extratos de erva -
mate obtidos por extração com líquido pressurizado (PLE) utilizando hexano e
metanol como solventes. A identificação dos picos está apresentada na Tabela
XXI.
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93
Figura 21: Cromatogramas do íon total dos extratos obtidos por extração com
líquido pressurizado (PLE) com hexano (A) e metanol (B), das amostras de erva-
mate com idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte
de nitrogênio. Os compostos correspondentes aos picos identificados estão
listados na Tabela XXI. As condições cromatográficas estão descritas na Tabela
XII.
PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO
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94
Tabela XXI: Principais compostos identificados nos extratos por extração com
líquido pressurizado com hexano e metanol, nas amostras de erva-mate com
idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de
nitrogênio.
Solvente
N° t
R
médio
compostos identificados
hexano metanol
fórmula/MM identificação
prob.
(%)
1 6,54 ácido octanóico(*) X X C
11
H
24
O
2
Si/206 MS 85
2 7,67 ácido butanodióico(*)) X X C
10
H
22
O
4
Si
2
/262 MS 87
3 8,80 ácido nonanóico(*) X X C
12
H
26
O
2
Si/220 MS 88
4 11,36 ácido decanóico (*) X X C
13
H
28
O
2
Si/234 MS 85
5 14,30 ácido undecanóico(*) X X C
14
H
30
O
2
Si/ 248 MS 88
6 16,74 ácido dodecanóico (*) X X C
15
H
32
O
2
Si/262 MS 87
7 18,10 ácido octanodióico(*) X X C
14
H
30
O
4
Si
2
/318 MS 92
8 20,74 ácido nonanodióico(*) X X C
15
H
32
O
4
Si
2
/332 MS 90
9 21,81 cafeína X X C
8
H
10
N
4
O
2
/194 Padrão/MS 96
10 22,0 ácido tetradecanóico(*) X X C
17
H
36
O
2
/ 300 Padrão/MS 92
11 23,86 hexadecanoato de metila X X C
17
H
34
O
2
/ 270 Padrão/MS 85
12 24,45 ácido hexadecanóico X C
16
H
32
O
2
/256 Padrão/MS 85
13 24,47 ácido pentadecanóico(*) X X C
18
H
38
O
2
/ 314 MS 85
14 25,70 hexadecanoato de etila X C
18
H
36
O
2
/ 284 padrão/MS 96
15 26,40 ácido palmitoleico (*) X X C
38
H
74
O
2
Si/ 591 padrão/MS 87
16 26,94 ácido hexadecanóico(*) X X C
19
H
40
O
2
Si/ 328 padrão/MS 96
17 28,56 fitol X C
20
H
40
O / 296 padrão/MS 93
18 29,22 ácido heptadecanóico(*) X X C
20
H
42
O
2
Si/ 342 padrão/MS 90
19 29,99 fitol(TMS-derivado) X C
23
H
48
OSi / 368 padrão/MS 90
20 30,63 ácido linoleico(*) X X C
21
H
40
O
2
Si/ 352 MS 92
21 30,80 ácido linolênico(*) X X C
21
H
38
O
2
Si/ 350 MS 90
22 30,91 ácido oléico (*) X X C
21
H
42
O
2
Si/ 354 MS 90
23 31,38 ácido esteárico(*) X X C
21
H
44
O
2
Si/ 356 padrão/MS 92
24 33,69 ácido nonadecanóico(*) X C
22
H
46
O
2
Si/ 370 MS 89
25 35,62 ácido eicosanóico(*) X X C
23
H
48
O
2
Si/ 384 MS 85
26 36,72 pentacosano X C
25
H
52
/ 352 padrão/MS 88
27 39,52 ácido docosanóico(*) X X C
25
H
52
O
2
Si/412 MS 85
28 40,48 heptacosanol X C
27
H
56
O / 396 MS 86
29 40,50 heptacosano X C
27
H
56
/ 380 padrão/MS 87
30 42,43 octacosanol X C
28
H
58
O / 410 MS 88
31 42,55 octacosano X C
28
H
58
/ 394 padrão/MS 88
32 42,92 esqualeno X C
30
H
50
/ 410 padrão/MS 92
33 43,12 hexadecanal X C
16
H
40
O padrão/MS 88
34 44,18 nonacosano X C
29
H
60
/ 408 padrão/MS 90
35 45,82 triacontanol X C
30
H
62
O / 438 MS 89
36 45,88 triacontano X C
30
H
62
/ 422 Padrão/MS 88
37 47,68 acet. estigmasta-5,22-dien-ol X C
31
H
50
O
2
/454 MS 87
38 47,87 untriacontano X C
31
H
64
/ 436 padrão/MS 87
39 48,7 vitamina E X X C
29
H
50
O
2
/ 430 padrão/MS 89
40 54,97 estigmast-8-en-3-ol X X C
32
H
56
OSi / 528 padrão/MS 85
41 62,86 agnosterol(TMS-derivado) X C
33
H
56
OSi / 496 padrão/MS 85
(*) identificado sob a forma de éster trimetil silil (TMS)
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95
Nos extratos de erva-mate obtidos por PLE, 41 compostos foram
detectados e identificados (por comparação dos tempos de retenção dos padrões
ou tentativamente identificados com base na biblioteca Wiley NBS do
equipamento) e estão listados na Tabela XXI em ordem de eluição na coluna
cromatográfica OV-5. Foram considerados tentativamente identificados quando
as probabilidades de semelhança do espectro de massa foram superiores a 84%.
Nos extratos das folhas de erva-mate obtidos por extração com líquido
pressurizado foram identificados cafeína, hidrocarbonetos, ácidos carboxílicos,
fitosteróis, ésteres, álcoois, vitamina E, e aldeídos. Cafeína (9), ácido
hexadecanóico (16), ácido linolênico (21), ácido esteárico (23) e nonacosano (34)
são os maiores compostos dos extratos de erva-mate obtidos por extração com
líquido pressurizado (PLE) utilizando hexano e metanol como solventes. Na
fração hexânica foram identificados um número maior de compostos em
comparação com a fração metanólica. Podemos observar que alguns compostos
são identificados simultaneamente nas duas frações, o que indica que a extração
destes compostos pode ser realizada com apenas um solvente.
3.0 CONCLUSÕES PARCIAIS
Os resultados obtidos para a determinação da melhor condição de
extração dos compostos orgânicos da erva-mate e da análise qualitativa dos
extratos possibilitaram estabelecer as seguintes conclusões:
• As principais variáveis que influenciaram a técnica por extração com
líquido pressurizado foram temperatura de extração, polaridade do
solvente e massa de amostra.
• As variáveis como volume de “flushing”, tempo de extração e número de
ciclos não influenciaram significativamente no processo de extração
acelerada por solvente.
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96
• A utilização de elevada temperatura de extração e elevado volume de
“flushing” produzem mais extrato das folhas de erva-mate.
• A utilização de um planejamento experimental possibilitou a determinação
da melhor condição de extração dos compostos orgânicos da erva-mate
utilizando a técnica de extração com líquido pressurizado. A condição
ótima ocorreu com metanol, 7,5 g de erva-mate, 100% de “flushing”, 10
minutos de extração a 100 °C e 1 ciclo.
• Apesar da fração metanólica apresentar um maior rendimento, esta exibe
um menor número de compostos, mas com massa molecular mais elevada
do que os compostos da fração hexânica.
• Nos extratos de erva-mate obtidos por PLE, 41 compostos foram
detectados e identificados. Entre eles podemos citar a cafeína, fitol,
hidrocarbonetos, ácidos carboxílicos, fitosteróis, ésteres, álcoois, vitamina
E, e aldeídos.
• Cafeína, ácido hexadecanóico, ácido linolênico, ácido esteárico e
nonacosano são os compostos majoritários dos extratos de erva-mate
obtidos por extração com líquido pressurizado (PLE) utilizando hexano e
metanol como solventes.
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97
CAPÍTULO 7:
COMPARAÇÃO DE TÉCNICAS DE
EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS
ORGÂNICOS DA ERVA -MATE
USANDO SOLVENTES ORGÂNICOS
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1.0 EXPERIMENTAL
Neste capítulo foram comparados os métodos de extração utilizando
solventes orgânicos (ultra-som e extração com líquido pressurizado), na condição
ótima de extração, com o método clássico de maceração. Foram utilizadas
amostras de erva-mate, adubada com nitrogênio, plantada ao sol e com idade de
poda da folha de 18 meses. O tratamento inicial das amostras seguiu o mesmo
procedimento indicado nos capítulos anteriores, quanto à secagem, moagem,
classificação granulométrica e estocagem. De forma idêntica, também os padrões
e soluções estoque foram preparados conforme o item 1.2 da parte experimental
do capítulo 4.
1.1 Amostras, reagentes e solventes
O tratamento das amostras e a escolha dos solventes e reagentes
seguiram o mesmo método descrito nos capítulos anteriores.
1.2 Técnicas de extração utilizadas
Além das técnicas já discutidas e desenvolvidas nos capítulos anteriores
(extração por ultra-som e extração com líquido pressurizado) foi também
aplicado, para fins de comparação, o método clássico de extração por
maceração.
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99
1.2.1 Procedimento para a extração por maceração
Cerca de 7,5 g de amostra foram colocados em um erlenmeyer de 500
mL, conforme esquema da Figura 22. A extração foi realizada utilizando 225 mL
dos seguintes solventes orgânicos: hexano, tolueno, diclorometano, acetato de
etila, acetona e metanol (razão massa/solvente 1:30). Solvente e amostra
permaneceram misturados por um período de 10 dias, com agitação ocasional. O
mesmo procedimento foi repetido para os outros solventes, utilizando uma nova
amostra. Após uma filtragem, os filtrados foram concentrados em evaporador
rotatório, secos sob N
2
e guardados ao abrigo da luz e calor.
Figura 22 – Desenho esquemático do equipamento usado para maceração
1.2.2 Procedimento para a extração por ultra-som
Para a comparação de métodos, a extração dos compostos ativos das
folhas de erva-mate foi realizada na melhor condição de extração estudada no
Capítulo 5 (7,5 g de amostra, 225 mL de solvente, 180 minutos de extração a
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100
75°C). O extrato foi recuperado por filtração em papel filtro Whatman 1PS. Os
solventes foram usados na mesma ordem de polaridade do processo de
maceração: hexano, tolueno, diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol.
Após a extração com um solvente, uma nova amostra de erva-mate foi extraída
com o solvente seguinte, e assim sucessivamente. Estes extratos foram secos
sob N
2
, pesados e guardados ao abrigo da luz e calor.
1.2.3 Procedimento para a extração com líquido pressurizado
Para a extração dos compostos ativos, as folhas de erva-mate foram
extraídas na melhor condição de extração estudada no Capítulo 6 (7,5 g de
amostra, 100% de “flushing”, 10 minutos de extração a 100 °C e 1 ciclo). O
extrato foi recuperado por filtração em papel filtro Whatman 1PS. Os solventes
foram usados pela ordem de polaridade: hexano, tolueno, diclorometano, acetato
de etila, acetona e metanol. Após a extração com um solvente, uma nova
amostra de erva-mate foi extraída com o solvente seguinte e assim
sucessivamente. Estes extratos foram secos sob N
2
, pesados e guardados ao
abrigo da luz e calor.
1.3 Análise cromatográfica dos extratos (GC/MS).
A análise cromatográfica dos extratos obtidos na extração das amostras
de erva-mate foi realizada por GC/MS, conforme condições analíticas descritas
na Tabela XII, e seguindo o procedimento descrito nos Capítulos 5 e 6.
A identificação e quantificação dos compostos seguiram o procedimento
experimental descrito no capítulo 4, item 1.5, página 55.
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101
2.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.1 Análise do rendimento dos extratos de erva-mate
Os resultados obtidos nas extrações por maceração, ultra-som e extração
acelerada por solvente dos extratos das folhas de erva-mate com hexano,
tolueno, diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol expressos em g/100g
são apresentados na Tabela XXII. O teor de umidade de cada amostra foi
calculado e apresentou um valor médio de 6%.
Tabela XXII – Rendimento das extrações por maceração, ultra-som e extração
acelerada por solvente, obtido para as amostras de erva-mate, expresso em
gramas de (extrato) por 100 g de amostra.
solventes- extrato (g/100 g)
método hexano tolueno diclorometano acetato de etila acetona metanol
maceração
2,40±0,05 1,90±0,04 2,50±0,10 1,80±0,06 7,3±0,14 14,3±0,14
ASE
2,90±0,08 4,20±0,07 2,10±0,04 1,30±0,05 3,20 ±0,08 23,1 ±0,2
US
1,35±0,07 4,40 ±0,1 1,90±0,09 2,30±0,1 3,0±0,08 14,4±0,2
A Tabela XXIII apresenta os resultados da análise estatística dos efeitos
das técnicas de extração e do tipo de solvente utilizado sobre o rendimento de
extrato das folhas de erva-mate. Os valores apresentados nesta tabela são a
média dos valores do rendimento do extrato para cada condição. Letras iguais
entre dois níveis da média de um fator não tem diferença significativa a 5% (teste
de Tukey).
Pode-se verificar nesta Tabela que os três métodos de extração
estudados apresentam diferença significativa (p < 0,05), sendo que o método de
extração com líquido pressurizado exibiu maior rendimento. A alta pressão e
temperatura de 100 °C utilizados no processo de extração favoreceram a
penetração do solvente dentro da matriz, aumentando a transferência de massa,
e, conseqüentemente, melhorando a extração. A técnica de extração com líquido
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102
pressurizado tem a vantagem de reduzir o tempo de extração, a diminuição do
descarte de solventes e várias amostras podem ser extraídas ao mesmo tempo.
Tabela XXIII: Análise estatística (ANOVA com teste de Tukey a 5%). Efeito das
técnicas de extração e o tipo de solvente considerado sobre o rendimento de
extrato das folhas de erva-mate.
extrato (g/100g)
método de extração
solventes
maceração US PLE hexano tolueno diclorometano
acetato
de etila
acetona metanol
5,0
b
4,6
c
6,2
a
2,2
d
3,5
c
2,2
d
1,8
d
4,5
b
17,3
a
Os extratos obtidos por ultra-som por 180 minutos são comparáveis
aqueles realizados pelo método de extração por maceração por 10 dias. A
eficiência da extração utilizando-se a técnica de ultra-som é comparável a obtida
por maceração e tem ainda como vantagens a possibilidade de utilização de
vários tamanhos de amostra, a rapidez de processamento da amostra e o baixo
custo.
Quanto aos solventes utilizados, podemos constatar que os solventes
hexano, diclorometano e acetato de etila não apresentaram diferença
significativa, ou seja, os três solventes exibiram praticamente o mesmo
rendimento. Entre os solventes utilizados, o que apresentou maior rendimento foi
o metanol, resultado devido à maior polaridade deste solvente [88].
2.2 Análise dos extratos de erva-mate por GC/MS
2.2.1 Extração por maceração
A Figura 23 apresenta os cromatogramas das frações de hexano, tolueno,
diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol, dos extratos obtidos por
maceração das folhas de erva-mate. A Tabela XXIV apresenta os principais
compostos identificados nos extratos obtidos por maceração.
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103
Figura 23: Cromatogramas do íon total dos extratos das folhas de erva-mate
obtidos por maceração com hexano (A), tolueno (B), diclorometano (C), acetato
de etila (D), acetona (E) e metanol (F). As condições cromatográficas estão
descritas na Tabela XII. Os picos detectados ou tentativamente identificados
estão na Tabela XXV.
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104
Tabela XXIV: Principais compostos identificados nos extratos obtidos por
maceração com hexano(H), tolueno(T), diclorometano(D), acetato de etila (AE),
acetona (A) e metanol(M) nas amostras de erva-mate com idade de poda de 18
meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de nitrogênio.
N° t
R
médio
compostos identificados H T D AE A M identificação prob.
(%)
1 6,54 ácido octanóico (*) X X X X X MS 85
2 8,80 ácido nonanóico (*) X X X X X MS 88
3 11,36 ácido decanóico(*) X X X X X MS 85
4 14,3 ácido undecanóico(*) X MS 88
5 16,74 ácido dodecanóico (*) X X X X X MS 87
6 18,10 ácido octanodióico (*) X X X MS 92
7 20,74 ácido nonanodióico(*) X X X X X MS 90
8 21,81 cafeína X X X X X X padrão/MS 96
9 22,00 ácido tetradecanóico(*) X padrão/MS 92
10 22,82 teobromina X X X padrão/MS 90
11 23,22 pentadecanoato de etila X padrão/MS 89
12 23,86 hexadecanoato de metila X X padrão/MS 88
13 24,47 ácido pentadecanóico (*) X X X MS 85
14 24,87 ácido hexadecanóico X X X X padrão/MS 89
15 26,40 ácido palmitoleico(*) X X MS 87
16 26,94 ácido hexadecanóico (*) X X X X X X padrão/MS 96
17 28,56 fitol X X padrão/MS 93
18 29,22 ácido heptadecanóico (*) X X X X padrão/MS 90
19 29,99 fitol (*) X X X X X padrão/MS 90
20 30,25 docosano X padrão/MS 88
21 30,63 ácido linoleico (*) X X X X MS 92
22 30,80 ácido linolênico(*) X X X X MS 90
23 30,91 ácido oleico(*) X X X X MS 90
24 31,38 ácido esteárico(*) X X X X X X padrão/MS 92
25 33,69 ácido nonadecanóico (*) X MS 89
26 35,62 ácido eicosanóico(*) X X X X MS 85
27 36,72 pentacosano X X X padrão/MS 88
28 39,52 ácido docosanóico X X MS 85
29 40,50 heptacosano X X X X padrão/MS 87
30 42,43 octacosanol X padrão/MS 88
31 42,55 octacosano X X padrão/MS 88
32 42,92 esqualeno X X X X X X padrão/MS 92
33 43,02 estigmast-5-en-3-ol X padrão/MS 85
34 44,18 nonacosano X X X X X padrão/MS 90
35 45,82 triacontanol X MS 89
36 45,88 triacontano X padrão/MS 88
37 47,87 untriacontano X X X padrão/MS 87
38 48,7 vitamina E X padrão/MS 89
39
54,15
estigmat-5-en-3-ol (3-beta) X X X padrão/MS 85
(*) identificado sob a forma de éster trimetil silil (TMS)
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105
Como pode ser observado nos cromatogramas da Figura 23, os extratos
de hexano, tolueno, diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol
permitiram a identificação dos principais compostos extraídos das amostras de
erva-mate.
Pelo método de extração por maceração foram tentativamente
identificados 39 compostos, como metilxantinas, ácidos graxos, ésteres, álcoois,
fitoesteróis e hidrocarbonetos. Pode-se destacar a cafeína, teobromina, fitol,
esqualeno, ácido palmítico, esqualeno, vitamina E e fitoesteróis característicos
desse tipo de amostra [27,28], sendo a cafeína, o ácido palmítico (ácido
hexadecanóico) e o esqualeno os compostos majoritários. Comparando-se esses
cromatogramas, constata-se que a cafeína, ácido hexadecanóico, ácido esteárico
e o esqualeno são identificados em todos os extratos, não se podendo diferenciar
os solventes extratores, segundo a eficiência de extração. Também podemos
observar que alguns compostos foram identificados em uma única fração, como é
o caso do ácido undecanóico, ácido tetradecanóico, pentadecanoato de metila,
docosano, ácido nonadecanóico, octacosanol, estigmast-5-en-3-ol e vitamina E,
devido à maior seletividade destes compostos relativamente ao solvente extrator.
2.2.2 Extração por ultra-som
A Figura 24 apresenta os cromatogramas das frações de hexano, tolueno,
diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol, dos extratos obtidos por ultra-
som das folhas de erva-mate.
A Tabela XXV apresenta os principais compostos identificados nestes
extratos, o tempo de retenção médio dos compostos e o método de identificação
utilizado.
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106
Figura 24: Cromatogramas do íon total dos extratos obtidos por extração com
ultra-som com hexano (A) tolueno (B), diclorometano (C), acetato de etila (D),
acetona (E), metanol (F) das amostras de erva-mate com idade de poda de 18
meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de nitrogênio. Os picos
identificados estão na Tabela XXV. As condições cromatográficas estão
descritas na Tabela XII.
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107
Tabela XXV: Principais compostos identificados nos extratos obtidos por extração com
ultra-som com hexano(H), tolueno(T), diclorometano(D), acetato de etila (AE), acetona (A)
e metanol(M) nas amostras de erva-mate com idade de poda de 18 meses, cultivada a
pleno sol e adubada com fonte de nitrogênio.
N° t
R
médio
compostos identificados H T D AE A M identificação prob.
(%)
1 6,54 ácido octanóico (*) X X X MS 85
2 6,99 glicerol(*) X MS 89
3 7,67 ácido butanodióico(*) X X X X MS 89
4 8,80 ácido nonanóico (*) X X X MS 88
5 11,36 ácido decanóico(*) X X MS 85
6 14,3 ácido undecanóico(*) X X X MS 88
7 15,48 ácido heptanodióico(*) X MS 87
8 16,74 ácido dodecanóico (*) X MS 87
9 18,10 ácido octanodióico (*) X X X X X MS 90
10 20,74 ácido nonanodióico(*) X X X X X X MS 90
11 21,81 cafeína X X X X X X padrão/MS 96
12 22,82 teobromina X X padrão/MS 90
13 23,86 hexadecanoato de metila X padrão/MS 88
14 24,11 linoleato de etila X X padrão/MS 89
15 24,45 gama-delactona X padrão/MS 91
16 24,47 ácido pentadecanóico (*) X X X MS 87
17 24,87 ácido hexadecanóico X padrão/MS 89
18 25,55 eicosano X MS 87
19 25,57 Hexadecanoato de etila X padrão/MS 89
20 25,70 ácido undecanodióico(*) X MS 88
21 26,40 ácido palmitoleico(*) X X MS 88
22 26,94 ácido hexadecanóico (*) X X X X X X padrão/MS 96
23 28,56 fitol X X padrão/MS 93
24 29,22 ácido heptadecanóico (*) X X X X padrão/MS 90
25 29,25 ácido cafeico(*) X X MS 88
26 29,99 fitol (*) X X X X X X padrão/MS 93
27 30,63 ácido linoleico(*) X X X X X X MS 92
28 30,80 ácido linolênico(*) X X X X X X MS 90
29 30,91 ácido oleico X X X X X X padrão/MS 90
30 31,38 ácido esteárico(*) X X X X X X padrão/MS 92
31 33,69 ácido nonadecanóico (*) X MS 87
32 35,62 ácido eicosanóico(*) X X MS 85
33 39,52 ácido docosanóico X X MS 85
34 42,92 esqualeno X X X X padrão/MS 92
35 44,18 nonacosano X X padrão/MS 90
36 48,7 vitamina E X X padrão/MS 89
37 54,15 estigmaterol (éter-TMS)(*) X X X X X X padrão/MS 85
38 62,89 agnosterol (éter -TMS) (*) X padrão/MS 85
(*) identificado sob a forma de éster trimetil silil (TMS)
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108
Analisando os cromatogramas da Figura 24, podemos observar que as
frações de hexano, tolueno, diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol
permitiram a identificação dos principais compostos extraídos das folhas de erva-
mate. Na técnica de extração por ultra-som foram identificados praticamente os
mesmos compostos presentes nos extratos obtidos por maceração. Além destes
compostos, podemos destacar o ácido cafeico, que é um ácido fenólico
conhecido como ácido clorogênico, com propriedades antioxidantes e
anticarcinogênicas [40,172]. Também foram tentativamente identificados os
compostos glicerol, linoleato de etila e gama-delactona.
2.2.3 Extração com líquido pressurizado
A Figura 25 apresenta os cromatogramas das frações de hexano, tolueno,
diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol, dos extratos obtidos por
extração com líquido pressurizado. A Tabela XXVI apresenta a identificação
destes compostos.
No presente estudo, os extratos obtidos por PLE apresentaram em sua
composição metilxantinas, hidrocarbonetos, álcoois, ésteres, ácidos graxos,
vitamina E e fitoesteróis, característicos das folhas de erva-mate como
apresentado nos capítulos anteriores. Como pode ser observado na Figura 25,
nos extratos obtidos por extração com líquido pressurizado, foi tentativamente
identificado um maior número de compostos comparados aos métodos de
extração por maceração e ultra-som.
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109
Figura 25: Cromatogramas do íon total dos extratos das folhas de erva-mate
obtidos por extração com líquido pressurizado (PLE) com hexano (A), tolueno (B),
diclorometano (C), acetato de etila (D), acetona (E) e metanol (F). As condições
cromatográficas estão descritas na Tabela XII. Os picos identificados estão na
Tabela XXVI.
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110
Tabela XXVI: Principais compostos identificados nos extratos obtidos por
extração com líquido pressurizado com hexano (H), tolueno(T), diclorometano(D),
acetato de etila (AE), acetona (A) e metanol(M) nas amostras de erva-mate com
idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de
nitrogênio.
N° t
R
médio
compostos identificados H T D AE A M identificação prob.
(%)
1 6,54 ácido octanóico (*) X X X MS 85
2 7,67 ácido butanodióico(*) X X X X MS 89
3 8,80 ácido nonanóico (*) X X X MS 88
4 11,36 ácido decanóico(*) X X X MS 85
5 14,3 ácido undecanóico(*) X X X X X MS 88
6 16,74 ácido dodecanóico (*) X X X X MS 87
7 18,10 ácido octanodióico (*) X X X X X X MS 90
8 20,74 ácido nonanodióico(*) X X X X X X MS 90
9 21,81 cafeína X X X X X X padrão/MS 96
10 22,0 ácido tetradecanóico(*) X padrão/MS 90
11 22,82 teobromina X X padrão/MS 90
12 23,86 hexadecanoato de metila X X X X X X padrão/MS 88
13 24,44 Iso-fitol X X MS 89
14 24,45 gama-delactona X padrão/MS 91
15 24,47 ácido pentadecanóico (*) X X X MS 87
16 24,87 ácido hexadecanóico X padrão/MS 89
17 25,55 eicosano X X MS 87
18 25,57 Hexadecanoato de etila X X X padrão/MS 89
19 26,40 ácido palmitoleico(*) X X X MS 88
20 26,94 ácido hexadecanóico (*) X X X X X X padrão/MS 96
21 27,98 linoleato de metila X padrão/MS 89
22 28,15 linolenato de metila X padrão/MS 90
23 20,28 oleato de metila X X padrão/MS 90
24 28,56 fitol X padrão/MS 93
25 28,78 estearato de metila X X padrão/MS 90
26 29,22 ácido heptadecanóico (*) X X X padrão/MS 90
27 29,99 fitol (*) X X X X padrão/MS 93
28 30,63 ácido linoleico(*) X X X X MS 92
29 30,80 ácido linolênico(*) X X X X X MS 90
30 30,91 ácido oleico X X X X padrão/MS 90
31 31,38 ácido esteárico(*) X X X X padrão/MS 92
32 33,69 ácido nonadecanóico (*) X X MS 87
33 34,58 tetracosanol X padrão/MS 86
34 35,62 ácido eicosanóico(*) X X X MS 85
35 36,72 pentacosano X X padrão/MS 88
36 39,52 ácido docosanóico X X X X X MS 85
37 40,48 Heptacosanol X MS 87
38 40,50 heptacosano X X X X padrão/MS 88
39 42,43 octacosanol X X MS 87
40 42,55 octacosano X X padrão/MS 89
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111
Continuação da Tabela
XXVI.
N° t
R
médio
compostos identificados H T D AE A M identificação prob.
(%)
41 42,92 esqualeno X X X padrão/MS 92
42 43,02 estigmast-5-em-ol X padrão/MS 85
43 44,18 nonacosano X X X padrão/MS 90
44 45,82 triacontanol X X MS 88
45 45,88 triacontano X X padrão/MS 89
46 47,69 estigmasta-5,22-dien-ol acetato X X padrão/MS 85
47 47,87 untriaconatano X X padrão/MS 88
48 48,7 vitamina E X X X X X padrão/MS 89
49 54,15 estigmast-5-em-ol (3-beta) X X X X padrão/MS 86
50 62,89 agnosterol(éter-TMS)(*) X padrão/MS 87
(*) compostos identificados como derivados TMS
2.2.4. Análise quantitativa comparativa dos extratos de erva-mate
A Tabela XXVII apresenta as concentrações dos compostos quantificados
nos extratos das folhas de erva-mate utilizando as técnicas de extração por
maceração, ultra-som e extração com líquido pressurizado expressos em mg/kg,
em base seca, calculadas usando-se como padrão interno a bifenila.
A Tabela XXVIII apresenta os resultados da análise estatística dos
efeitos das técnicas de extração e da polaridade dos solventes utilizados na
concentração dos compostos das folhas de erva-mate. Os valores apresentados
nesta tabela são a média dos valores das concentrações dos compostos para
cada condição. Letras iguais entre dois níveis da média de um fator, não tem
diferença significativa a 5% (teste de Tukey). Analisando a Tabela XXVIII pode-
se observar que as técnicas de extração utilizadas apresentaram diferença
significativa (p < 0,05) sobre a concentração dos compostos analisados.
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112
Tabela XXVII: Concentração dos compostos quantificados nos extratos obtidos
nas diferentes técnicas de extração (maceração, ultra-som e extração com líquido
pressurizado) das folhas de erva-mate com idade de poda de 18 meses, cultivada
a pleno sol e adubada com fonte de nitrogênio, expressos em mg/kg.
mg/kg ± desvio padrão (*)
extração por maceração
composto
hexano tolueno diclorometano acetato de etila acetona metanol
cafeína
458,8 ± 15,5 4271,9 ± 95 2977,9 ± 45 1047,6 ± 32,4 2786,7 ± 76 950,2 ± 23,5
ácido palmítico.
228,1 ± 10,5 216,8 ± 8,7 114,5 ± 5,5 29,5 ± 0,8 45,1 ± 2,3 13,4 ± 0,6
fitol
2,1 ± 0,14 4,4 ± 0,3 2,1 ± 0,2 1,4 ± 0,1 1,9 ± 0,08 0,35 ± 0,01
ácido esteárico
2,0 ± 0,1 0,07 ± 0,001 5,2 ± 0,7 0,5 ± 0,05 0,8 ± 0,07 0,05 ± 0,001
esqualeno
1157,4 ± 40,1 121,8 ± 5,5 33,6 ± 1,9 104,3 ± 4,4 389,1 ± 10,0 309,9 ± 10,5
vitamina E
131,3 ± 6,5 280,4 ± 13 115,5 ± 4,0 57,4 ± 2,0 111,9 ± 4,5 83,1 ± 3,0
extração por ultra-som
cafeína
574,9 ± 25 3878,5 ± 86,5 4184,1 ± 65,3 1057,8 ± 11,9 932,6 ± 16,6 568,3 ± 17,8
ácido palmítico.
256,4 ± 10,1 137,2 ± 5,0 31,8 ± 2,3 8,9 ± 0,4 4,4 ± 0,2 12,5 ± 0,3
fitol
3,4 ± 0,3 0,33 ± 0,01 0,34 ± 0,01
ND
2,5 ± 0,07 0,035 ± 0,001
ácido esteárico
9,9 ± 0,3 0,34 ± 0,07 15,8 ± 0,5
ND
2,3 ± 0,14 0,05 ± 0,001
esqualeno
841,3 ± 24,8 893,2 ± 15,1 1416,3 ± 50,9 520,6 ± 14 60,1 ± 2,8 151 ± 7,0
Vitamina E
279,3 ± 16,3 514,3 ± 8,3 366 ± 7,7 120,3 ± 6,6 27,8 ± 1,3 55,0 ± 1,4
extração com líquido pressurizado
cafeína
1895,2 ± 55 6358,5 ± 80 4805,2 ± 65 1040,4 ± 45 4724,6 ± 85 848,9 ± 36
ácido palmítico.
744,3 ± 20,1 52,3 ± 3,1 13,2 ± 0,5 473,8 ± 17,5 42,9 ± 1,8 34,3 ± 1,0
fitol
4,7 ± 0,2 0,84 ± 0,08 1,2 ± 0,14 11,2 ± 1,0 1,3 ± 0,2 0,44 ± 0,0
ácido esteárico
7,3 ± 0,4 0,4 ± 0,02 0,37 ± 0,01 8,3 ± 0,08 0,9 ± 0,05 1,4 ± 0,1
esqualeno
1187,5 ± 83,1 120,2 ± 3,2 34,2 ± 2,0 105,8 ± 6,5 389,1 ± 10 313,4 ± 5,7
vitamina E
76,1 ± 1,2 64,3 ± 1,8 6,85 ± 0,5 27 ± 1,6 91,8 ± 2,9 90,9 ± 1,6
ND = NÃO DETECTADO (*) Os resultados referem-se à média de três determinações
Tabela XXVIII: Análise estatística (ANOVA com teste de Tukey a 5%) referente à
concentração dos compostos das folhas de erva-mate com idade de poda de 18
meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de nitrogênio (mg/kg
de
amostra) extraídos por maceração, ultra-som e extração com líquido
pressurizado.
mg/kg de erva-mate (base seca)
técnica solventes
composto
maceração US ASE hexano tolueno diclorometano acetato
de etila
acetona metanol
cafeína
2082,2
b
1866
c
3278,8
a
976,3
e
4836,3
a
3989,1
b
1048,6
d
2814,6
c
789,1
f
ácido
palmítico
107,9
b
75,2
c
226,8
a
409,6
a
135,4
c
53,2
d
170,7
b
30,8
e
20,1
e
fitol
2,0
b
1,1
c
3,3
a
3,4
b
1,9
c
1,2
e
4,2
a
1,9
c
0,27
f
ácido
esteárico
1,4
c
4,7
a
4,8
a
9,7
a
0,3
e
7,1
b
3,0
c
1,3
d
0,5
e
esqualeno
352,7
b
647,1
a
358,4
b
1062,1
a
378,4
c
494,7
b
243,6
d
279,5
d
258,1
d
vitamina E
129,9
b
227,1
a
59,5
c
162,2
b
286,3
a
162,8
b
68,2
f
77,1
d
76,3
e
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113
Através da análise quantitativa dos extratos da erva-mate, pode-se
observar que as concentrações de cafeína, ácido palmítico e fitol apresentaram
maiores valores utilizando-se como técnica a extração com líquido pressurizado.
Também se observa na Tabela XXII que os extratos brutos obtidos por esta
técnica de extração apresentaram maior rendimento.
Analisando a Tabela XXVII pode-se verificar que a polaridade do solvente
extrator influencia na concentração dos compostos estudados. Para obter
maiores concentrações de cafeína devemos utilizar como solvente o tolueno. O
hexano é eficiente na extração do ácido hexadecanóico, ácido esteárico e
esqualeno. Na extração por fluído supercrítico, utilizando-se o dióxido de carbono
como solvente, foram extraídas maiores quantidades de esqualeno (Tabela XVI,
Capítulo 4). Como este composto é mais apolar, o mesmo será mais
eficientemente extraído em compostos apolares. O fitol é extraído mais
eficientemente no solvente acetona.
Dawidowicz e Dorota [85] compararam as técnicas de extração por
maceração, extração assistida por microondas, dispersão da matriz em fase
sólida, ultra-som e extração com líquido pressurizado para extração e isolamento
de cafeína em amostras de chá e café. Os resultados obtidos por estes autores
revelaram que o método de extração acelerada por solvente é mais efetivo na
extração de cafeína do que os outros métodos utilizados. A temperatura e a
pressão são fatores importantes na extração da cafeína, e após 10 minutos de
extração o efeito do tempo é insignificante no processo. Em outro trabalho, os
mesmos autores mostraram que a quantidade total de cafeína em amostras de
café e chá é extraída no primeiro ciclo. A condição de extração utilizada por estes
pesquisadores foi de 100°C, 60 bar e de 10 minutos de extração[86]. A técnica
de PLE foi menos eficiente para a extração da vitamina E (talvez pela sua
possível degradação nesta temperatura) e do esqualeno.
Delgado-Zamarreño [90] e colaboradores utilizaram a técnica de extração
com líquido pressurizado para a extração de vitamina E de girassol, utilizando
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114
temperaturas mais baixas (50°C), acetonitrila como solvente extrator, 10 minutos
de extração e 2 ciclos. Foram obtidas recuperações entre 82 e 110 % do analito.
3.0 CONCLUSÕES PARCIAIS
A comparação das técnicas de extração utilizando solventes orgânicos na
extração das folhas de erva-mate permitiu concluir que:
• A extração acelerada por solventes possibilitou a identificação de um maior
número de compostos, comparados com as técnicas de ultra-som e
maceração. Esta técnica também apresentou o maior rendimento de extrato.
• Na extração com ultra-som utilizando como solvente extrator o acetato de etila
e acetona foi identificado o ácido cafeico, que é um ácido clorogênico que
apresenta propriedades antioxidantes e anticarcinogênicas.
• Na extração com líquido pressurizado utilizando como solvente extrator o
diclorometano foram identificados os ésteres oleato de metila, linoleato de
metila, linolenato de metila e estearato de metila.
• As concentrações de cafeína, ácido palmítico e fitol apresentaram maiores
valores utilizando-se a extração com líquido pressurizado.
• A polaridade do solvente extrator influencia na concentração dos compostos
estudados.
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115
CAPÍTULO 8:
CONCLUSÕES
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CONCLUSÕES GERAIS
Considerando que a erva-mate é uma matriz complexa, as técnicas de
extração estudadas mostraram-se eficientes para a extração, separação e
caracterização das amostras.
A composição química dos extratos mostrou-se dependente das variáveis
agronômicas, da polaridade do solvente e da técnica de extração utilizada.
CONCLUSÕES ESPECÍFICAS
Quanto à extração por fluido supercrítico (SFE):
• As variáveis temperatura e pressão exercem efeito pronunciado sobre a
quantidade de extrato produzido. Pressões maiores (250atm) levam a
maiores rendimentos, uma vez que a elevação da pressão (aumento da
densidade) incrementa o poder de solubilização do solvente.
• Foi observado um maior rendimento de extrato das folhas de erva-mate na
pressão de 250 atm e 40 °C.
• O fracionamento dos extratos obtido por SFE permitiu a identificação de 51
compostos presentes nas folhas de erva-mate.
Quanto à extração com ultra-som:
• A utilização de um planejamento experimental possibilitou a determinação
da melhor condição de extração dos compostos orgânicos da erva-mate
utilizando a técnica de ultra-som. A condição ótima ocorreu com metanol,
180 minutos de extração, a 75 ºC e usando-se 7,5 g de amostra em 225
mL de solvente.
• As condições mais favoráveis, entre as estudadas para a extração por
ultra-som, são: maior quantidade de solvente, solvente polar e maior
tempo de extração.
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117
• É uma técnica rápida, bastante reprodutiva, fácil de ser operada e barata.
Quanto à extração com líquido pressurizado (PLE):
• A utilização de um planejamento experimental possibilitou a determinação
da melhor condição de extração dos compostos orgânicos da erva-mate
utilizando a técnica de extração com líquido pressurizado. A condição
ótima ocorreu com metanol, 7,5 g de erva-mate, 100% de “flushing”, 10
minutos de extração a 100 °C e 1 ciclo.
• Temperatura, pressão e massa de amostra são variáveis que afetam o
processo da extração.
• Apesar da fração metanólica apresentar um maior rendimento, esta exibe
um menor número de compostos, mas com massa molecular mais elevada
do que os compostos da fração hexânica.
• A PLE é uma técnica rápida, bastante reprodutiva, fácil de ser operada,
totalmente automatizada e não requer filtração.
Quanto à comparação entre os métodos de extração usando solventes
orgânicos:
• O método de extração com líquido pressurizado apresentou maior
rendimento, especialmente quando se utiliza o solvente mais polar, no
caso o metanol.
• A extração acelerada por solventes possibilitou a identificação de um
maior número de compostos, comparados com as técnicas de ultra-som e
maceração.
• As concentrações de cafeína, ácido palmítico e fitol apresentaram maiores
valores utilizando-se a extração com líquido pressurizado.
• A eficiência da extração utilizando-se a técnica de ultra-som é comparável
à obtida por maceração e tem ainda como vantagens a alta
reprodutibilidade, a possibilidade de utilização de vários tamanhos de
amostra, a rapidez de processamento da amostra e o baixo custo.
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118
Quanto às técnicas analíticas utilizadas:
• A cromatografia líquida preparativa serviu como um fracionamento do
extrato, permitindo um melhor isolamento dos compostos de interesse.
• A cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas
mostrou-se eficiente para análise orgânica dos extratos das folhas de erva-
mate, independente do método de extração, especialmente pela
possibilidade de utilizar os modos SCAN e SIM na identificação e
quantificação dos mesmos.
• A espectrometria de absorção atômica (FAAS) permitiu determinar com
segurança a composição mineral das amostras estudadas.
Quanto à composição química das amostras:
• As folhas de erva-mate apresentaram altas quantidades dos metais K, Ca,
Mn e Mg estando de acordo com os níveis encontrados para as plantas.
• A constituição orgânica da erva-mate (Ilex paraguariensis) apresentou-se
muito diversificada. Nas folhas de erva-mate foram identificadas as
metilxantinas (cafeína e teobromina), ésteres, ácidos orgânicos, álcoois,
hidrocarbonetos, vitamina E, aldeídos e fitosteróis.
Quanto à importância dos compostos identificados:
• Entre os compostos identificados foram encontradas substâncias de
elevado valor agregado tais como: cafeína (responsável pelas
propriedades estimulantes da erva-mate), fitosteróis (reconhecidos pelas
suas características antioxidantes), vitamina E (com reconhecidas
propriedades medicinais e utilizada pela indústria alimentícia, nos óleos
comestíveis, contra a peroxidação lipídica), ácido cafeico (antioxidante e
anticarcinogênico) e esqualeno (bactericida natural, empregado
amplamente na indústria coméstica, na fabricação de cremes e emulsões).
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119
Quanto às variáveis agronômicas investigadas:
• Em relação a intensidade de luz , observou-se que plantas a pleno sol
produzem maior quantidade de extratos orgânicos do que plantas
sombreadas, utilizando a técnica de SFE.
• A idade de poda das folhas também afeta notadamente o rendimento da
extração. Até os 18 meses, o acréscimo na idade de poda proporciona um
aumento significativo no rendimento da extração. Após os 18 meses a
quantidade de compostos voláteis passíveis de extração diminui
consideravelmente, chegando aos 24 meses com rendimentos
semelhantes aos das plantas de 6 meses de idade de poda.
• Quando as plantas são adubadas somente com fontes de nitrogênio,
obtém-se maiores rendimentos em massa de extrato quando comparados
com plantas sem adubação. O mesmo efeito acontece quando se aduba
as plantas com fonte de potássio (cloreto de potássio). Quando as plantas
são adubadas simultaneamente com fontes de nitrogênio e potássio, o
rendimento da extração não apresenta mudanças significativas em relação
aquele obtido a partir de plantas não adubadas.
• Analisando a influência da idade de poda das folhas de erva-mate, pode-
se observar que o teor de minerais é mais alto em folhas jovens. Plantas
cultivadas em áreas sombreadas apresentam maior quantidade de
nutrientes do que aquelas plantadas ao sol. O metabolismo da planta de
erva-mate é fortemente influenciado pelas condições agronômicas de
plantio, que se reflete diretamente na composição mineral das folhas. As
variáveis agronômicas que mais influenciaram foram a idade de poda das
folhas e a intensidade de luz.
• A partir dos resultados alcançados pode-se concluir que a intensidade de
luz tem um efeito negativo sobre a concentração da cafeína, fitol, ácido
hexadecanóico e vitamina E. A concentração do esqualeno é aumentada
sob intensidade de luz, ou seja, em plantas cultivadas a pleno sol.
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120
CAPÍTULO 9:
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ROM Censo Agropecuário, N° 22, RS, 1995-1996.
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Alto Uruguai Rio-Grandense.Tese de Mestrado em Administração, Porto
Alegre, Ed. UFRGS, 2002.
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[171] Mazzafera, P. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, 1994, v.60, 149-151.
[172] Mazzafera, P. Bragantia, 1999, v.58, 387-391.
[173] Choi, Y.H., Sertic, S., Kim, H.K., Wilson, E. G., Michopoulos, F., Lefeber,
A.W.M., Erkelens, C., Kricun, S.D.P., Verpoorte, R. J. Agric. Food Chem.,
2005, v.53, 1237-1245.
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132
CAPÍTULO 10:
SUGESTÕES PARA TRABALHOS
FUTUROS
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133
A partir dos resultados constatados durante o desenvolvimento deste
trabalho, pode-se propor as seguintes pesquisas nesta área:
• Estudar a presença de antioxidantes nos extratos: determinar sua ação e
identificar os principais compostos responsáveis por esta ação.
• Estudar a extração “sub-crítica” com água operando o equipamento ASE
300
TM
.
• Estudar a extração com fluido supercrítico (SFE) mediante a utilização de
co-solvente, com a avaliação do co-solvente adequado e da proporção
necessária de adição ao solvente principal.
• Estudar os compostos voláteis da erva-mate usando microextração em
fase sólida (SPME).
• Estudar a composição química das flores e frutos da erva-mate.
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134
CAPÍTULO 11:
PRODUÇÃO CIENTÍFICA GERADA
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135
11.1. Trabalhos publicados em periódicos
-Influence of agronomic variables on the composition of mate tea leaves (Ilex
paraguariensis) extracts obtained from CO
2
extraction at 30ºC and 175 bar,
Jacques, Rosângela Assis, Esmelindro, Ângela Aquino; Santos, Jonathan G. dos;
Dariva, Cláudio; Mossi, Altemir;, J. Agric. Food Chem., 52: 1990-1995, 2004.
- Comparison of accelerated solvent extraction, Soxhlet extraction and ultrasound-
assisted extractions of nerolidol, fatty acids, phytosterols and vitamin E from
leaves of Piper gaudichaudianum Kunth, Péres, Valéria Flores; Jacques,
Rosângela Assis; Melecchi, Maria Inês Soares; Abad, Fernanda Contieri;
Martinez, Migdalia Miranda, Oliveira, Eniz Conceição;
Caramão, Elina Bastos, J.
of Chromatogr. A, 2005, in press (disponível on line).
- Optimization of Accelerated Solvent Extraction of Piper gaudichaudianum Kunth
leaves, Péres, Valéria Flores; Jacques, Rosângela Assis; Melecchi, Maria Inês
Soares; Abad, Fernanda Contieri; Martinez, Migdalia Miranda, Oliveira, Eniz
Conceição;
Caramão, Elina Bastos, J. of Chromatogr. A, 2005, in press
(disponível on line).
-The use of ultrasound in the extraction of Ilex paraguariensis leaves: A
comparison with maceration, Jacques, Rosângela Assis; Freitas, Lisiane dos
Santos; Dariva, Cláudio; Oliveira, Ana Paula; Oliveira, José Vladimir. and
Caramão, Elina Bastos, paper aceito para publicação na revista Ultrasonics
Sonochemistry.
11.2 Trabalhos completos em anais de eventos
Influência das variáveis agronômicas na composição mineral da erva-mate (Ilex
paraguariensis).Jacques, Rosângela Assis; Oliveira, Ana Paula de; Dariva,
Cláudio; Caramão, Elina Bastos;Oliveira, José Vladimir de. In: XIX CONGRESSO
BRASILEIRO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS, 2004, Recife.
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136
11.3 Resumos em anais de eventos
- Preliminary studies of accelerated solvent extracts (ASE) of Ilex paraguariensis.
Jacques, Rosângela Assis; Caramão, Elina Bastos; Oliveira, José Vladimir de;
Caovilla, Marcela. X COLACRO, 2004, Campos do Jordão,SP.
- Determinação da composição química mineral da erva-mate de 6,12,18 e 24
meses. Jacques, Rosângela Assis; Oliveira, Ana Paula de; Caramão, Elina
Bastos; Oliveira, José Vladimir de, 12° ENCONTRO NACIONAL DE QUÍMICA
ANALÍTICA, 2003 , São Luis-MA.
- Estudo preliminar da composição dos extratos de erva-mate obtidos por SFE.
Jacques, Rosângela Assis; Dariva, Cláudio; Vecchia, Rafael Dalla; Caramão,
Elina Bastos; Oliveira, José Vladimir de. 12° ENCONTRO NACIONAL DE
QUÍMICA ANALÍTICA, 2003, v. 12, p. SE-73; São Luis-MA.
- Avaliação do conteúdo mineral da folha de erva-mate Jacques, Rosângela
Assis; Caramão, Elina Bastos; Oliveira, José Vladimir de; Oliveira, Ana Paula
IX CONGRESSO CATARINENSE DE FARMACÊUTICOS E BIOQUÍMICOS,
Florianópolis 2002.
- Comparação de técnicas de extração (maceração, ultra-som e extração
acelerada com solvente) no estudo dos compostos da erva-mate Ilex
paraguariensis), Jacques, Rosângela Assis; Caramão, Elina Bastos; Oliveira,
José Vladimir de; Oliveira, Ana Paula, Dariva, Cláudio;Freitas, Lisiane Santos
13° ENCONTRO NACIONAL DE QUÍMICA ANALÍTICA, 2005, Niterói, RJ.
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CAPÍTULO 12:
ANEXOS
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ESTRUTURAS QUÍMICAS
A.1 - Estruturas das Metilxantinas
O
N
CH
3
ON
N
CH
3
H
3
C
N
O
N
CH
3
ON
N
CH
3
N
H
Cafeína
Teobromina
O
N
H
ON
N
CH
3
H
3
C
N
Teofilina
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A.2 - Derivatização
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