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JUÇAÍRA STELLA MARTINS GIUSTI
AVALIAÇÃO DA TERAPIA FOTODINÂMICA UTILIZANDO DIODO
EMISSOR DE LUZ (LED) NA DESCONTAMINAÇÃO DE DENTINA
BOVINA ARTIFICIALMENTE CARIADA
Tese apresentada ao Curso de Pós-graduação
em Ciências Odontológicas – Área
Odontopediatria, da Faculdade de Odontologia
de Araraquara, da Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, para
obtenção do título de Doutor.
Orientadora: Profa. Adjunto Lourdes dos Santos-Pinto
Araraquara
2005
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARARAQUARA
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2
JUÇAÍRA STELLA MARTINS GIUSTI
Avaliação da terapia fotodinâmica utilizando diodo emissor de luz
(LED) na descontaminação de dentina bovina artificialmente
cariada
COMISSÃO EXAMINADORA
TESE PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR
PRESIDENTE: Prof
a
Dr
a
Lourdes dos Santos-Pinto
2
0
EXAMINADOR: Prof Dr Vanderlei Salvador Bagnato
3
0
EXAMINADOR: Prof
a
Dr
a
Cristina Kurachi
4
0
EXAMINADOR: Prof Dr Fábio César Braga de Abreu e Lima
5
0
EXAMINADOR: Prof Dr Antonio Carlos Pizzolitto
Araraquara, 09 de dezembro de 2005
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3
DADOS CURRICULARES
JUÇAÍRA STELLA MARTINS GIUSTI
Nascimento: 29 de maio de 1965 – São Carlos – SP
Filiação: Osvaldo Gonçalves Martins
Edna Stella Martins
1984-1987: Curso de Graduação – Faculdade de Odontologia de Araraquara –
UNESP
1993-1994: Curso de Pós-Graduação em Odontologia, nível Especialização em
Odontopediatria – EAP-APCD- Regional Araraquara
2000-2002: Curso de Pós-Graduação em Odontologia, nível Mestrado, área de
Odontopediatria – Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP
2002-2005: Curso de Pós-Graduação em Odontologia, nível Doutorado, na área
de Odontopediatria – Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP
1997-2001: Professora do Curso de Especialização em Odontopediatria da EAP–
APCD regional São Carlos
2000-...: Professora do Curso de Especialização em Odontopediatria da EAP–
APCD regional Araraquara
4
A Deus,
por me dar a vida, a capacidade, a força de vontade e a oportunidade de
encontrar todas as pessoas que me ajudaram a realizar este trabalho.
Aos meus pais,
Edna e Osvaldo, pelo exemplo de retidão, perseverança e
humildade além do apoio entusiasta e confiança sempre presentes durante toda
minha vida.
Ao meu marido,
André Luiz, pelo incentivo, apoio, paciência, tolerância e
amor incondicional, sempre presente nos momentos mais difíceis.
Aos meus filhos,
André e Lorenzo, pela luz e alegria com que preenchem
minha vida, sempre oferecendo amor e carinho em troca da minha ausência.
A VOCÊS DEDICO ESTE TRABALHO
5
Agradecimentos especiais
Tuka,
não posso transformar em palavras a minha gratidão por tê-la tido como
orientadora. Falo não só pela profissional dedicada, segura e competente que é
mas, principalmente pelo ser humano que me compreendeu, animou, esclareceu e
incentivou em todos os momentos. Que Deus a abençoe e ilumine sempre para
que outras pessoas possam passar pela experiência por que passei e tê-la como
mestra e amiga.
Vanderlei
, foi muito importante para mim além do conhecimento formal, poder
receber o exemplo de determinação, de fé, trabalho incansável, a busca pela
perfeição e o desafio constante de avançar sempre rumo ao desconhecido. Muito
obrigada por me aceitar como aprendiz e prossiga sempre abrindo portas para
aqueles que o procuram.
6
Agradecimentos
À Faculdade de Odontologia do Campus de Araraquara – UNESP, na pessoa de
sua diretora, Profa. Dra. Rosemary Adriana Chierici Marcantonio, seu Vice-
Diretor, Prof.Dr. José Cláudio Martins Segalla.
Aos docentes da Disciplina de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia de
Araraquara UNESP: Lourdes Aparecida Martins dos Santos-Pinto, Rita de Cássia
Loiola Cordeiro, Cyneu Aguiar Pansani, Elisa Maria aparecida Giro, Fábio César
de Abreu Lima, Josimeri Hebling Costa e Ângela Cristina Cilense Zuanon, pela
atenção e carinho a mim dedicados.
À Profa. Dra. Rita de Cássia Loiola Cordeiro, coordenadora do curso de Pós-
graduação, pela competência e dedicação à frente da coordenação do curso,
visando sempre o melhor aproveitamento e desempenho de todos.
Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Pizzolitto, da Disciplina de Microbiologia Clínica do
Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de
Araraquara – UNESP, por seu entusiasmo e boa vontade em passar adiante os
valiosos conhecimentos adquiridos ao longo de sua carreira.
À Profa.Dra. Cristina Kurachi, Responsável pelo Laboratório de Biofotônica do
IFSC- USP, por sua presteza e dedicação, quando tudo parecia que não ia dar
certo.
7
À Lílian Tan Moriyma, mestranda em Física aplicada do Laboratório de
Biofotônica do IFSC – USP, por sua ilimitada paciência em dirigir meus passos
entre números, gráficos e fórmulas.
Ao Eurico de Carvalho Filho, graduando do curso de Engenharia Física da
UFSCAR e estagiário do Laboratório de Biofotônica do IFSC-USP, por seu
entusiasmo e inteligência perspicaz, sempre pronto a me ajudar a desvendar os
mistérios dos gráficos e funções.
À Profa. Dra. Rosane de Fátima Zaniratto Lizarelli, pesquisadora do Laboratório
de Biofotônica do IFSC, pela competência e alegria com que desenvolve seu
trabalho, contagiando a todos.
À Maria do Carmo Dória Martins, funcionária do Laboratório de Microbiologia
clínica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara – UNESP, pelo
carinho e atenção que sempre me concedeu e pela colaboração e eficiência nos
trabalhos de laboratório, permitindo a concretização dessa obra
À Profa. Dra. Flávia Maria Costa e Carvalho Konishi, pelo apoio e incentivo
incondicionais durante esta minha caminhada.
Às minhas companheiras na carreira docente, Profa. Elina Mara Silva Marcomini,
Profa. Karina Dela Coleta Pizol e Profa Maristela Cayetano, pela compreensão e
amizade que sempre demonstraram.
8
Aos Funcionários do Departamento de Clínica Infantil da Faculdade de
Odontologia de Araraquara – UNESP, Célia, Cristina, Dulce, Odete, Pedro,
Regina, Silvia, Sônia, Tânia e Toninho, pela atenção e carinho que sempre me
dedicaram.
Aos Funcionários da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Araraquara –
UNESP, Adriano, Eliane, Inês, Maria Helena, Maria José e Silvia pela
cordialidade e atenção com que sempre atenderam às minhas solicitações e em
especial à Ceres, pela correção deste trabalho.
Às Funcionárias da Biblioteca da Faculdade de Física da USP – São Carlos, Maria
Neusa A. Azevedo e Ana Mara M C. Prado, pela atenção e dedicação em me
atender sempre.
Aos Funcionários da Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP e, em
especial aos da Seção de Pós-Graduação, Mara, Rosângela, Vera e Silvia, pela
paciência e disposição com que sempre me atenderam.
Às Secretárias do Grupo de Óptica do IFSC- USP Isabel e Benê, pela atenção e
disposição com que sempre me receberam.
Aos colegas da Pós-Graduação, “irmãos de orientação”, Fábio, Cristiane e
Luciana, pelos momentos de companheirismo dessa caminhada.
À amiga e colega de Pós-Graduação, Paula, pelos momentos de alegria, tristeza,
comemoração, decepção, compreensão, determinação, aflição, enfim, pela
9
oportunidade de convivermos e crescermos juntas nesta árdua caminhada. Foi
muito gratificante.
A todos os companheiros do Laboratório de Biofotônica: Adalberto, Ângelo,
Alessandra, Augusto, Clóvis, Daniel, Denis, Dirceu, Emery, Fábio, Fernando,
Juliana, Mardoqueu e Vitória pela colaboração, companheirismo e carinho em
todos os momentos.
Às minhas irmãs Janaína e Maria Júlia, ao meu Irmão Osvaldo, aos meus sogros
Edson e Neuda e aos meus cunhados e cunhadas: Ana Paula, Eduardo E. e
Eduardo R., Junior, Bel, Marcelo e Socorro, pelo incentivo e torcida constantes.
À minha avó Maria, que acompanha de perto minha vida desde meu nascimento,
ajudando, apoiando e torcendo sempre.
À CAPES, pelo apoio financeiro
A todos aqueles que participaram direta ou indiretamente da minha formação e da
realização deste trabalho, peço a Deus que os abençoe proteja.
10
SUMÁRIO
PREFÁCIO ..................................................................................11
ABREVIAÇÕES .........................................................................12
INTRODUÇÃO ...........................................................................13
PROPOSIÇÃO ............................................................................20
CAPÍTULO 1 -
Efetividade do Photogem
®
ativado por LED na
descontaminação de dentina bovina cariada artificialmente .................21
CAPÍTULO 2 -
Efetividade do TBO ativado por LED na
descontaminação de dentina bovina cariada artificialmente ................ 45
CAPÍTULO 3 -
Incorporação de Photogem
®
e TBO em dentina bovina
sadia e cariada ............................................................................... 69
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................... 92
APÊNDICE -
Metodologia ilustrada............................................ 100
11
Prefácio
Esta tese foi dividida em três capítulos que correspondem a três
artigos científicos intitulados:
1) Efetividade do Photogem
®
ativado por LED na descontaminação de
dentina bovina cariada artificialmente.
Submetido para publicação no periódico Lasers Physics
2) Efetividade do TBO ativado por LED na descontaminação de dentina
bovina cariada artificialmente.
Submetido para publicação no periódico Lasers in Surgery and Medicine
3) Avaliação da incorporação do Photogem
®
e do TBO em dentina bovina
sadia e cariada artificialmente.
Submetido para publicação no periódico Caries Research.
12
Abreviações:
BHI- Brain-heart infusion (infusão de cérebro-coração)
cm
2
- centímetros quadrados
D- dose de luz
FDA – Food and Drug Administration
FS – Fração de sobrevivência
I - intensidade de luz
J – Joule
LED – Light emission diode (diodos emissores de luz)
mW – mili Watts
NaOCl – Hipoclorito de sódio
nm- nanômetros
PDT – Photodynamic Therapy (Terapia fotodinâmica)
TBO - Toluidine blue O (orto azul de toluidina)
UFC – unidades formadoras de colônias
13
=======================================
==================================
INTRODUÇÃO
==================================
=======================================
14
Introdução
O conceito da terapia fotodinâmica (PDT, Photodynamic Therapy) foi
introduzido por Oscar Raab em 1900
e a era moderna da PDT iniciou-se na
década de 1960 com os estudos de Lipson et al.
21
, que observaram fluorescência
em lesões neoplásicas induzida por injeção de hematoporfirina em estado natural
com conseqüente melhor observação das mesmas durante as cirurgias. Desde
então muito tem sido estudado para entender a eficácia e os mecanismos desse
processo.
11,16,20,23,24
A técnica da terapia fotodinâmica usa a propriedade de seletividade da
luz laser e emprega uma droga fotossensibilizadora (aquela que torna o meio onde
se encontra sensível à ação da luz) que é administrada por via endovenosa,oral ou
tópica no caso de pacientes oncológicos. A droga percorre todo corpo, sendo
absorvida por todas as células. As células sadias eliminam grande quantidade
dessa droga em um período que varia de 24 a 36 horas, enquanto as células
tumorais, por apresentarem metabolismo diferenciado, retêm essa droga por um
tempo mais prolongado. Assim, 24 horas após a administração da droga, a
substância fotossensibilizadora estará mais concentrada nas células neoplásicas,
estabelecendo uma diferenciação entre essas células e as demais. Esta substância
fotossensibilizadora é excitada quando iluminada por uma luz de cor específica e
uma vez neste estado energético, provoca uma reação química com o oxigênio
molecular, produzindo uma espécie eletrônica de oxigênio (o estado singleto),
15
altamente reativa para os constituintes celulares e, portanto, bastante citotóxica.
Como conseqüência, a célula neoplásica e o tecido tumoral como um todo são
levados à necrose, eliminando a lesão.
1,23,30
A primeira droga fotossensibilizadora aprovada em tratamento de
alguns tipos de tumores foi o Photofrin
, uma mistura de porfirinas oligômeras.
10
Novas gerações de drogas estão sendo estudadas, não apenas em tratamento de
tumores, como também em outras aplicações nas áreas da oftalmologia,
17
cardiologia,
43
dermatologia,
7
odontologia,
5,26,32,37,41
imunologia
31
e hematologia.
2
Devido ao fato de ainda não existir um consenso na utilização dos corantes para
PDT na descontaminação de tecido cariado, neste trabalho, optamos por utilizar
dois tipos diferentes de fotossensibilizadores: O Photogem
®
, um medicamento de
origem russa equivalente ao Photofrin, produzido nos EUA e amplamente
utilizado na PDT em pacientes oncológicos, e o TBO (azul de toluidina O), que é
um corante básico bastante utilizado em experimentos com bactérias bucais.
3,7,25,27,29,30,36,38,39,41
Atualmente, o laser é a fonte de luz mais empregada para ativar os
fotossensibilizadores. Devido às propriedades que o mesmo apresenta:
concentração elevada de energia, pouca dispersão de energia à medida que a luz
se propaga, coerência e monocromaticidade, é possível iluminar um meio
composto por materiais diversos e só interagir com um determinado componente.
A essa característica do laser damos o nome de seletividade e ela ocorre devido à
propriedade da monocromaticidade, que nos permite selecionar a cor do laser de
16
tal forma que a luz só interaja com uma determinada molécula, dentro de um
universo de várias moléculas.
Porém, com o desenvolvimento dos LED (diodos emissores de luz),
começaram a surgir os primeiros estudos que utilizam esta tecnologia aplicada à
terapia fotodinâmica.
22,33,36
Tanto o laser como o LED produzem irradiação num
comprimento de onda específico, porém a irradiação LED é emitida numa faixa
mais ampla do espectro eletromagnético, não é coerente e colimada como ocorre
com a irradiação laser. Com o surgimento desses estudos que verificaram a
eficácia do LED e ao comparar seu uso ao do laser, constatou-se que os aparelhos
emissores de LED têm um custo muito menor. Espera-se, com isso, que possa
haver uma popularização dessa técnica.
Estudos da década de 1990 mostravam que um grande número de
bactérias bucais, incluindo-se as periodontopatogênicas e as cariogênicas, era
susceptível a essa terapia.
6,9,25,29,32,43
Assim sendo, adaptou-se a utilização de uma
técnica empregada a pacientes oncológicos para combater bactérias orais,
surgindo daí o interesse em desenvolver um método de descontaminação da
dentina cariada, baseado na terapia fotodinâmica.
A técnica da PDT pode oferecer diversas vantagens em relação a
agentes antimicrobianos tradicionais. Primeiramente, a morte bacteriana é rápida,
diminuindo a necessidade da manutenção de altas concentrações de substâncias
químicas por longos períodos de tempo como no caso do uso de antibióticos e
anti-sépticos. Em segundo lugar, como a morte das bactérias não está ligada à
mediação de radicais químicos, o desenvolvimento de resistência seria
17
improvável. Como nem o fotossensibilizador nem a luz empregada são
bactericidas quando utilizados isoladamente, a morte das bactérias pode ser
controlada restringindo-se a região irradiada e evitando-se a destruição da
microbiota em outros locais.
5,40,42
Por essa razão, a PDT pode ser uma alternativa interessante a
antibióticos e anti-sépticos utilizados como coadjuvantes de métodos mecânicos
de controle de biofilme, subgengival e supra gengival, e também um método de
descontaminação bacteriana do tecido dental cariado.
Segundo Consolaro,
8
(1996) podemos distinguir clinicamente dois
tipos de dentina comprometida no sentido da superfície para a polpa. A dentina
infectada, caracterizada por consistência mole e cor amarelada, contendo 10
8
bactérias/g, predominantemente proteolíticas. Nesta dentina podemos distinguir
uma zona necrótica, desorganizada, amolecida e praticamente amorfa e uma outra
região, mais profundamente localizada em relação à necrótica, correspondente à
zona de dentina desmineralizada superficial, caracterizada pela deformação da
morfologia canalicular e manutenção da matriz orgânica. Esse tipo de dentina não
pode ser remineralizada. Abaixo da dentina infectada encontramos a dentina
contaminada, que se mostra com estrutura distorcida, mas com textura
parcialmente mantida, assemelhando-se à do couro, contendo 10
5
bactérias/g,
correspondendo a 0,1% das bactérias da zona infectada, sendo predominantemente
acidogênicas e, divido à sua considerável preservação estrutural, pode ser
considerada remineralizável. Na dentina contaminada podem distinguir-se, da
superfície para a polpa, três regiões: zona de dentina desmineralizada profunda
18
(localizada logo abaixo da zona de desmineralização superficial), uma de
esclerose dentinária e, freqüentemente, a dentina reacional; juntas, elas constituem
a zona de dentina hipermineralizada. A diferença entre a dentina desmineralizada
profunda e a dentina hígida, basicamente se estabelece pela perda de minerais;
macroscopicamente, esta dentina se apresenta seca e coriácia.
O aspecto cor, isoladamente, bem como a consistência da dentina, não
são capazes de diferenciar o estágio de desenvolvimento da lesão de cárie e
tampouco a existência de bactérias remanescentes em tecido firme.
4,18,19
Por essa
razão, devido à grande dificuldade de identificar clinicamente o estágio de
comprometimento da dentina, é de fundamental importância que o tecido
remanescente não contenha microrganismos suficientes para desencadear a
reativação do processo, para permitir ao tecido que se repare.
15
Não podemos deixar de considerar, também, que durante as últimas
décadas observamos o declínio da prevalência da doença cárie, atribuído ao
sucesso da prevenção de cáries primárias. Porém, as lesões de cárie secundárias
continuam sendo as maiores causas de falha e reposição das restaurações. Assim
sendo, a eliminação ou redução desses microrganismos no tecido dentário
remanescente constitui um artifício importante para minimizar esse problema.
5,32,37,40,42
19
=======================================
==================================
PROPOSIÇÃO
==================================
=======================================
20
Proposição
Objetivo Geral
O objetivo deste trabalho foi verificar a efetividade da PDT na
desinfecção do tecido dental cariado, utilizando o LED como fonte emissora de
luz.
Objetivos Específicos
1) A efetividade do Photogem
®
(em diferentes concentrações) como
agente fotossensibilizador, ativado por diferentes doses de energia produzida pelo
LED na efetividade da terapia fotodinâmica para redução bacteriana em tecido
artificialmente cariado.
2) A efetividade do TBO (em diferentes concentrações) como agente
fotossensibilizador ativado por diferentes doses de energia produzida pelo LED na
efetividade da terapia fotodinâmica para redução bacteriana em tecido
artificialmente cariado.
3) Incorporação de Photogem
®
e TBO em dentina bovina sadia e
cariada artificialmente.
21
=======================================
==================================
CAPÍTULO 1
==================================
=======================================
22
Efetividade do Photogem® ativado por LED na descontaminação
de dentina bovina cariada artificialmente
GIUSTI, Juçaíra S.M. *
SANTOS-PINTO, Lourdes **
PIZZOLITTO, Antonio Carlos ***
KURACHI, Cristina****
BAGNATO, Vanderlei S. *****
Endereço para correspondência:
Profa. Dra. Lourdes Santos-Pinto
Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP
Rua Humaitá, 1680
CEP 14801-903 Araraquara – SP, Brasil
Fax: 55- 16- 3301-6330
* Mestre em Odontopediatria pela Faculdade de Odontologia de Araraquara –
UNESP
** Prof. Adjunto do Departamento de Clínica Infantil da Faculdade de
Odontologia de Araraquara – UNESP
*** Prof. Dr. do Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Araraquara – UNESP
****Doutora em Ciência e Engenharia dos Materiais pelo Instituto de Física de
São Carlos- USP
*****Prof. Titular do Departamento de Física e Ciência dos Materiais do Instituto
de Física de São Carlos – USP
23
Resumo
O objetivo deste trabalho foi avaliar a efetividade da terapia fotodinâmica na
descontaminação de dentina bovina cariada artificialmente, utilizando o
Photogem
®
como agente fotossensibilizador e um diodo emissor de luz (LED)
como fonte ativadora. Para este fim, foram obtidos, a partir de incisivos bovinos,
espécimes em dentina que foram imersos em um meio de cultura estéril,
acrescidos de Lactobacillus acidophilus 10
8
UFC e Streptococcus mutans 10
8
UFC. Em seguida, os espécimes foram submetidos a diferentes concentrações de
fotossensibilizador : PA= 1mg/mL, PB= 2 mg/mL e PC= 3 mg/mL e diferentes
doses de luz, 60s (D= 24 J/ cm
2
) e 120s (D= 48 J/ cm
2
) de aplicação. A análise
estatística do resultado constituído pelo número das UFC por miligrama de
dentina cariada, evidenciou que o uso do LED associado ao fotossensibilizador
Photogem
foi efetivo na redução bacteriana em dentina bovina cariada
artificialmente, sendo o melhor efeito promovido pela aplicação do Photogem
®
2
mg/mL e 24 J/cm
2
de dose de luz (Fração de sobrevivência = 0,14). Quanto maior
a concentração do fotossensibilizador, maior sua toxicidade na ausência de luz e
maior sua interferência na observação do efeito da luz, quando aplicada.
Palavras-chave: Fotoquimioterapia; dentina; luz; laser; bactéria
24
Abstract
The aim of this study was the evaluation of the effectiveness of photodynamic
therapy in the decontamination of artificiall carious bovine dentin, using
Photogem
®
as a photosensitizer agent and a LED based emission light as an
activating source. Dentin samples obtained from bovine incisors were immersed
in sterile broth plus Lactobacillus acidophilus 10
8
CFU and Streptococcus mutans
10
8
CFU. Different concentrations of photosensitizer: PA= 1mg/mL, PB= 2
mg/mL and PC= 3 mg/mL and two light doses, 60 seconds of application (D= 24
J/ cm²) and 120 seconds (D= 48 J/cm²) were applied on the specimens. After CFU
counting per milligram of carious dentin and data statistical analysis, we observed
that the use of LED associated to the photosensitizer (Photogem
®
) was effective in
bacterial reduction count in artificially carious bovine dentin. The best effect was
obtained with the application of Photogem
®
2 mg/ ml and 24 J/cm² of light dose
(survival fraction = 0.14) and, the photosensitizer toxicity increased in the absence
of light.
Key-words: Photochemoterapy; dentin; LED; photosensitizer; light; letal
photosensitization; bacteria.
25
Introdução
Devido ao grande avanço na prevenção da cárie primária nas últimas
décadas, temos assistido a um declínio da ocorrência da doença. No entanto, a
cárie secundária continua sendo a maior causa de falhas e substituição de
restaurações. Uma das grandes dificuldades durante a remoção do tecido cariado é
o reconhecimento visual e tátil da dentina desorganizada, sem potencial reparador
e a determinação dos limites para remoção deste tecido.
2,11,12,23
As técnicas atualmente empregadas para remoção da lesão de cárie
não são seletivas e utilizam evidências subjetivas para determinar a quantidade do
tecido dentário a ser removido. Assim, a avaliação da cor e da consistência da
dentina não são suficientes para garantir que o tecido dentário remanescente
esteja com um número de microrganismos suficiente para evitar um processo de
recidiva de cárie.
5,9,11,12,19
Na tentativa de reduzir o número de microrganismos presentes na
dentina cariada remanescente após a realização do preparo cavitário, tem sido
indicada a aplicação de substâncias tais como a clorexidina e o NaOCL
8,21,22,25
.
Recentemente, estudos têm apontado a terapia fotodinâmica (Photodynamic
Therapy–PDT) como um possível método para descontaminação do tecido cariado
remanescente.
4,6,17,29,30,31
A técnica da terapia fotodinâmica baseia-se na ativação de um agente
fotossensibilizador pela luz,o que resulta em efeito citotóxico. Inicialmente foi
desenvolvida para o uso em pacientes com lesões oncológicas superficiais. As
26
células tumorais foram capazes de reter um agente fotossensibilizador injetado por
via endovenosa que quando irradiado pela luz laser com comprimento de onda
específico, na região do tumor, provocava a necrose do tecido, eliminando a
lesão.
7,10
O início do emprego da técnica da terapia fotodinâmica para combater
microrganismos na cavidade bucal ocorreu na década de 1990, na qual trabalhos
realizados com microrganismos em suspensão comprovaram sua seletividade, ou
seja, sua ação ocorria apenas em áreas onde o agente fotossensibilizador e a luz
estivessem presentes.
4,6,17,29,30,31,32
Como a maioria dos estudos que comprovaram a ação bactericida da
terapia fotodinâmica foi realizada utilizando-se bactérias em suspensão, optamos
por aplicar esta técnica diretamente sobre a dentina bovina cariada, procurando
dessa forma, reproduzir, da melhor maneira possível, as condições clínicas da
cárie dentária.
O objetivo deste trabalho foi, portanto, avaliar a eficácia da terapia
fotodinâmica na descontaminação de dentina bovina cariada artificialmente,
utilizando-se o Photogem
®
como agente fotossensibilizador e variando-se a dose
de luz aplicada.
Material e Método
Para a realização deste estudo foram utilizados nove incisivos
bovinos, sem anomalias estruturais visíveis a olho nu. Os dentes, após serem
limpos por meio de raspagem do tecido periodontal, tiveram o esmalte da face
27
vestibular da coroa removido por meio de uma ponta diamantada tronco-cônica
(FG 1036G- KG Sorensen do Brasil), montada em alta-rotação. Em seguida, com
uma broca trefina de titânio (2,7 mm de diâmetro interno, Impladonto – São
Paulo, Brasil) montada em baixa rotação, foram obtidos, de cada dente, 4
fragmentos de dentina. Um dos fragmentos serviu como controle e os três
restantes foram distribuídos para as diferentes condições experimentais. Cada
fragmento foi seco com ar comprimido durante 60s e pesado em uma balança
(Marte AL500, Marte Balanças e Aparelhos de Precisão Ltda, São Paulo – Brasil),
identificado e armazenado em água destilada até o início do experimento.
Os espécimes foram autoclavados por 20 minutos a 121
0
C e, após a
esterilização, cada um foi transferido para um tubo de cultura identificado
contendo 2 mL de suspensão indutora de cárie. Esta suspensão foi preparada com
uma infusão de cérebro-coração modificada (BHI 3,7 g/100 mL, extrato de levedo
0,5 g/100 mL, glicose 1g/100 mL e sacarose P.A . 2g /100 mL) e a cada 50 mL
dessa suspensão foram acrescidos 5 mL de Lactobacilus acidophillus
(ATCC#ITAL-523) - 10
8
UFC e 5 mL de Streptococcus mutans (ATCC25175) -
10
8
UFC, com o intuito de promover o crescimento bacteriano. Os tubos contendo
os espécimes foram mantidos a 37
0
C, em microaerofilia, por 14 dias, sendo a
suspensão trocada a cada 48 horas. Decorrido esse período, os espécimes foram
mantidos sob refrigeração a 4
0
C, com a finalidade de paralisar a multiplicação
bacteriana, até o momento do tratamento.
Os espécimes do grupo controle não receberam qualquer tipo de
tratamento e foram transferidos diretamente do meio de cultura para outros tubos
28
contendo 5 mL de solução salina para realização da análise da presença de
bactérias pelo método de diluições sucessivas para contagem das UFC.
Nos grupos experimentais, o fotossensibilizador aplicado foi o
Photogem
, uma mistura de monômeros e oligômeros de derivados de
hematoporfirina, em três diferentes concentrações: PA= 1mg/mL, PB= 2 mg/mL e
PC= 3 mg/mL durante 60 s, ficando protegido da luz com a finalidade de evitar a
fotoativação pela luz ambiente. A fonte de luz utilizada para a ativação do
fotossensibilizador foi um protótipo com 2 LED vermelhos de luxeon, com uma
banda de emissão centrada em 630nm, diâmetro da ponta 0,8 cm (área de 0,5
cm
2
), intensidade de 400 mW/cm
2
e potência de 200 mW. Foram utilizados dois
tempos diferentes de aplicação: 60s (D= 24 J/ cm
2
) e 120s (D= 48 J/ cm
2
).
Os espécimes foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes grupos
experimentais:
Concentração do Fotosensibilizador
Dose de Luz
em J/cm
2
Tempo de Aplicação
(s)
1 mg/mL 2mg/mL 3mg/mL
- 0 P A P B P C
24 60 P A 60 P B 60 P C 60
48 120 P A 120 P B 120 P C 120
Os espécimes dos grupos experimentais após o tratamento, foram
colocados em tubos de ensaio contendo 5 mL de solução salina e agitados em
Vortex (Heidolph, 60 Hz, Germany) por 60s. Desta suspensão foram retirados 0,5
mL e transferidos para tubos de cultura contendo 4,5 mL de solução salina,
segundo o método das diluições sucessivas. Foram feitas duas diluições e
plaqueados 0,1 mL de cada uma destas em placas de Petri contendo BHI
29
modificado acrescido de Ágar e seguindo-se incubação das placas a 37
0
C por 48
horas, em jarras de microaerofilia. Foram realizadas três repetições para cada
condição experimental. Após a incubação, o cálculo da presença de bactérias nos
espécimes foi feito através da contagem de colônias em contador digital
(Gallenkamp, Inglaterra) e dividiu-se o número de unidades formadoras de
colônia pelo peso de cada amostra, obtendo-se assim a quantidade de UFC por
miligrama de dentina cariada. Detalhes da descrição da metodologia utilizada
estão apresentados nas figuras 1 a 7 e 11 a 16 do apêndice (Capítulos 1 e 2). Para
a padronização dos valores com relação ao grupo controle, a quantidade de UFC
obtida nos espécimes do grupo controle, foi dada como contaminação máxima
(100%) e os valores de UFC obtidos nos grupos experimentais foram
transformados segundo sua proporção com relação ao seu controle. Como os
dados não apresentaram uma distribuição normal, foi realizada a transformação
em logaritmo para a aplicação do teste estatístico de análise de variância (p≤
0,05) a dois critérios fixos e completada a análise com o teste de comparação
múltipla de Tukey. Para complementar a análise dos resultados, determinou-se a
variação da Fração de Sobrevivência (FS) para diferentes concentrações de
Photogem
®
, doses de luz e suas interações. Foi elaborada uma expressão empírica
que relaciona a FS com a concentração e a dose de luz utilizada, considerando
como primeiro passo, a variação da FS na ausência de luz. Assim, para esse
regime, determinou-se que:
C 0 FS = 1
C FS = 0
Onde C= concentração do fotossensibilizador
30
Resultando numa expressão do tipo :
0
1
1
)0(
C
C
DFS
A presença da luz faz com que o efeito tóxico da droga seja
amplificado. Assim, à medida que se aumentou a dose de luz, deve-se ter
aumentado a toxicidade e, portanto, chegou-se a seguinte expressão:
0
0
1
1
),(
D
D
e
C
C
CDFS
Resultado
O Gráfico 1 evidencia que o primeiro tratamento utilizado,
Photogem
®
1mg/mL sem aplicação de luz (PA) apresentou maiores valores para a
Fração de Sobrevivência (FS), ou seja, maior proporção de UFC sobreviventes por
miligrama de dentina cariada e, os demais grupos não seguiam um padrão de
aumento ou diminuição das proporções.
GRÁFICO 1 - Dispersão dos dados observados para o corante Photogem
®
nas diferentes
concentrações e doses de luz utilizada.
Onde D= dose de luz
C é expressa em mg/mL
C
0
~ 1mg/mL
31
A aplicação da análise de variância aos dados obtidos (Tabela 1),
evidenciou que a interação entre os fatores foi estatisticamente significante. Desta
forma, a análise dos fatores individualmente foi excluída e procedeu-se à análise
da interação utilizando o método de Comparações Múltiplas de Tukey descrito na
Tabela 2.
Tabela 1 -Análise de Variância aplicada aos valores de UFC obtidos nos grupos tratados e controle
Análise de Variância – ANOVA
Componentes GL
Soma de
Quadrados
Quadrado
Médio
Valor
F
p valor
Modelo
8 46,82829338 5,85353667 13,99 <,0001*
Concentração
2 14,04692028 7,02346014 16,78 <,0001*
Irradiação
2 11,15556560 5,57778280 13,33 <,0001*
Concentração*Irradiação
4 21,62580750 5,40645188 12,92 <,0001*
Erro
72 30,13433486 0,41853243
Total
80 76,96262824
* significância estatística
Tabela 2 - Comparações Múltiplas de Tukey
Grupos de Tukey
Média do logaritmo das
Respostas
Número das
Médias
A
4,18771750 1
B
2,90425614 4
B
2,87567778 2
B
2,61322830 6
B
2,55407809 8
B
2,27277917 3
C B
2,05102637 7
C B
1,99647033 9
C
1,26188034 5
Médias com mesmas letras são não significativamente diferentes
32
O grupo que apresentou a maior média de UFC por miligrama de dentina
cariada, foi o tratado com Photogem
®
na concentração 1mg/mL e ausência de luz
(PA). Observamos, também, que existe uma combinação dos dois fatores que
minimiza a resposta, ou seja, a redução da proporção de UFC por miligrama de
dentina cariada com relação ao grupo controle. Essa combinação é dada pelo fator
Concentração (Photogem
®
2 mg/mL) e pelo fator Irradiação (60s), que representa
neste caso uma dose equivalente a 24 J/cm
2
(Tabela 2) .
Analisando os resultados da expressão:
0
0
1
1
),(
D
D
e
C
C
CDFS
observamos que as concentrações de fotossensibilizador utilizadas produziram
efeito tóxico em diferentes níveis na ausência de luz (Gráfico 2).
0
0
1
1
D
D
e
C
C
y
Com a aplicação de uma dose de luz de 24 J/cm
2
, pudemos observar
uma redução na FS, comparado ao grupo onde a luz não foi aplicada (Gráfico 3).
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Escuro
Fração de sobrevivência
Concentração do Photogem (mg/mL)
onde
D
0
=24 J/cm
2
,
D=0 J/cm
2
e
C
0
=1mg/mL
GRÁFICO 2 - FS em relação à concentração de Photogem
®
sem aplicação de luz.
33
0
0
1
1
D
D
e
C
C
y
E, quando aplicamos uma dose de luz de 48 J/cm
2
, observamos uma tendência de
redução da FS (Gráfico 4), com as mesmas concentrações de fotossensibilizador.
0
0
1
1
D
D
e
C
C
y
Ainda baseados na expressão proposta, pudemos construir um gráfico de
FS em função da dose de luz, através do qual foi possível calcular a FS de acordo
com a concentração do fotossensibilizador e a dose de luz empregada. Este
0,00,51,01,52,02,53,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
24 J/cm²
Fração de sobrevivência
Concentração de Photogem (mg/mL)
onde
D
0
=24 J/cm
2
,
D=24 J/cm
2
e
C
0
=1mg/mL
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
48 J/cm²
Fração de Sobrevivência
Concentração de Photogem (mg/mL)
GRÁFICO 4 - FS em relação à Concentração de Photogem
®
, quando é aplicada uma dose de 48J/ cm
2
de
luz.
GRÁFICO 3 - FS em relação à Concentração de Photogem
®
quando é aplicada uma dose de 24J/ cm
2
de luz
onde
D
0
=24 J/cm
2
,
D=48 J/cm
2
e
C
0
=1mg/mL
34
gráfico, evidenciou que, quanto maior a concentração de Photogem
®
, menor a
dose de luz necessária para eliminar a mesma quantidade de microrganismos.
Gráfico 5.
0
0
1
1
D
D
e
C
C
y
Com essa expressão podemos definir também a chamada região de
segurança, determinando os parâmetros de D (dose) e C (concentração) FS <
90%, 95% e 99 %, ou seja, a relação entre a dose de luz e a concentração de
fotossensibilizador capaz de eliminar entre 90 e 99% dos microrganismos
presentes. Gráfico 6.
0 1020304050
0,0
0,5
1,0
Fração de sobrevivência
Dose de luz (J/cm
2
)
Ausência de Porfirina
1 mg/mL de Porfirina
2 mg/mL de Porfirina
3 mg/mL de Porfirina
onde
D
0
= 24 J/cm²
C
0
= 1 mg/mL
GRÁFICO 5 - FS em rela
ç
ão à dose de luz
,
na
p
resen
ç
a de diferentes concentra
ç
ões de Photo
g
e
m
®
.
35
Discussão
A utilização de um procedimento clínico capaz de reduzir bactérias
presentes no tecido cariado infectado, dando a este tecido capacidade de
remineralização, possibilitaria a preservação de uma maior quantidade de tecido
dentário durante a remoção da lesão de cárie.
A aplicação da técnica da PDT na erradicação de microrganismos,
tem sido amplamente estudada, com resultados que demonstraram sua eficácia na
eliminação de microrganismos da cavidade bucal, quando estão em
suspensão.
4,6,17,27,29,30,32
Estudos mais recentes comprovaram sua eficácia na
eliminação de microrganismos na presença de biofilme, de uma matriz de
colágeno ou dentina.
3,28,33
No presente estudo, optou-se por realizar a técnica da PDT em
microrganismos aderidos à dentina bovina artificialmente cariada, procurando
simular com maior fidelidade a sua aplicação clínica.
012345
0
20
40
60
80
100
C/C
0
D/D
0
90%
95%
99%
GRÁFICO 6 - correlação entre as razões de concentração de
fotossensibilizador e dose de luz para eliminação de microrganismos.
36
A fonte de luz empregada nos estudos iniciais de PDT foi o laser,
porém recentemente, começaram a surgir os primeiros estudos utilizando LED
como fontes emissoras de luz para a realização da técnica da PDT
em
medicina.
13,20
O primeiro trabalho avaliando o efeito do Azul de Toluidina O
(TBO), como fotossensibilizador, associado tanto com o laser de HeNe como com
o LED, na destruição de Streptococcus mutans em biofilme,
33
utilizou doses entre
49 e 294 J/cm
2
e mostrou que ambas as fontes de luz foram efetivas na redução da
viabilidade de S. mutans.
Uma das principais vantagens da utilização de uma fonte de luz à base
de LED, é o seu custo mais acessível, além da praticidade por ser um aparelho
compacto, seguro, fácil de usar e com capacidade para irradiar grandes áreas. O
dispositivo utilizado no presente estudo, possui uma ponta ativa de 0,8 cm de
diâmetro, suficiente para irradiar cavidades extensas em uma única aplicação.
Os fotossensibilizadores são compostos que absorvem energia de uma
luz de um determinado comprimento de onda e são capazes de utilizar essa
energia para induzir reações em outras moléculas.
18
Uma grande variedade de
fotossensibilizadores também vem sendo estudada, e para que os mesmos possam
produzir um efeito antimicrobiano, é necessário que apresentem picos de
absorção próximos ao comprimento de onda da luz usada para sua ativação.
Vários estudos, entre eles o realizado por Venezio,
24
(1985) já demonstrava que
derivados de hematoporfirina possuíam efeito bactericida sobre S. mutans e
outros microrganismos
1,14,16
. Associado a esse fato, os derivados de
hematoporfirina foram as primeiras substâncias a receberem a autorização da
37
FDA para o uso clínico na terapia fotodinâmica. Seu efeito citotóxico é mediado
principalmente pela produção de oxigênio singleto, sendo um evento oxigênio
dependente. As bactérias gram-negativas parecem ser mais refratárias à sua
utilização, provavelmente devido à complexidade de sua parede celular.
15,26
Neste estudo, pudemos observar que a citotoxicidade do Photogem
®
na ausência da luz, aumenta com o aumento da sua concentração, e, que, em
concentrações muito elevadas, não é possível verificar o efeito do aumento da
dose de luz.
Os gráficos 2,3 e 4 descrevem a toxicidade do Photogem
®
no escuro e
sua fototoxicidade com a ativação pela luz nas doses de 24 J/cm
2
e 48 J/cm
2
.
Observamos que, as concentrações utilizadas foram tóxicas no escuro em
diferentes níveis, e que à medida que a dose de luz aumentava , havia uma
redução na FS. Malik et al.
14
(1990) e Dobson e Wilson
6
(1992), utilizando
hematoporfirina 0,005% e um laser de HeNe de 7,3 mW de potência e dose de 5,5
J/cm
2
não obtiveram bons resultados na destruição de microrganismos gram-
negativos. Porém, Wilson et al.
31
(1993) observaram fotossensibilização letal de
P. gingivalis com hematoporfirina, estando os microrganismos não em biofilme,
mas em suspensão. Nossos resultados evidenciaram que as concentrações de
fotossensibilizadores, combinadas com as doses de luz empregadas, produziram
efeito bactericida.
O Photogem
®
na concentração 3 mg/mL tem um efeito de toxicidade
no escuro muito elevado, o que dificulta a observação de sua interação com a luz,
ou seja, em concentrações menores como 2 mg/mL e 1 mg/mL (principalmente),
38
a toxicidade no escuro é menor, e, à medida que a dose de luz aumenta, o fator de
sobrevivência é consideravelmente reduzido (Gráfico 5).
A função que nos possibilitou o cálculo da dose de luz e concentração
de fotossensibilizador necessárias para alcançarmos 90%, 95% e 99% de morte
bacteriana, nos mostrou que altas concentrações de fotossensibilizador são
capazes de eliminar os microrganismos com doses baixas de luz, porém, doses
mais elevadas de luz também são capazes de eliminar microrganismos com
concentrações mais baixas de fotossensibilizador. Por meio dessa função,
podemos definir a meta a ser alcançada em relação à porcentagem de morte
bacteriana, e ajustarmos a concentração de fotossensibilizador e a dose de luz, de
acordo com as fontes de luz e corantes disponíveis a fim de obtermos o efeito
desejado (Gráfico 6).
O método de comparações múltiplas de Tukey demonstrou que a
maior redução do número de microrganismos foi obtida no grupo do Photogem
®
2mg/mL e dose de luz de 24 J/cm
2
(tempo de irradiação 60s). Os outros
tratamentos são considerados estatisticamente iguais e produziram redução
significante no número de microrganismos; no entanto, no grupo PC ( Photogem
®
3 mg/mL) a citotoxicidade da porfirina no escuro foi tão intensa, que não foi
possível observar o efeito da dose de luz nesse grupo
Em 2003, Williams et al
27
observaram 100% de morte de
Streptococcus mutans em suspensão planctônica, utilizando como fonte emissora,
de luz um laser diodo de 633 +- 2nm e energia variando entre 0,4 – 4,8 J e o TBO
como fotossensibilizador. Em 2004, os mesmos autores,
28
utilizando a mesma
39
fonte de luz, com energias variando entre 1,8 a 14,4 J. e o mesmo
fotossensibilizador na concentração 10g/mL, observaram uma redução no
efeito bactericida da PDT em Streptococcus mutans presentes em matriz de
colágeno e dentina humana cariada. A presença do biofilme e da dentina
propriamente dita, afetam negativamente a eficiência da técnica, pois o sucesso
da mesma depende da difusão do corante e da absorção da luz para que o maior
número possível de microrganismos seja atingido.
Assim, nossos estudos evidenciaram que, o uso do LED associado ao
Photogem,
®
foi efetivo na redução bacteriana em dentina bovina cariada
artificialmente e que o Photogem
®
na concentração de 2 mg/mL e associado à
uma dose de irradiação de 24 J/ cm
2
(PB60), apresentou a maior eficiência na
redução da viabilidade de Streptococcus mutans e Lactobacillus acidophilus, e
quanto maior a concentração do fotossensibilizador, maior a toxicidade na
ausência de luz.
40
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32. WILSON, M.; DOBSON, J.; SARKAR, S. Sensitization of
periodontopathogenic bacteria to killing by light from a low-power laser.
Oral Microbiol. Immunol., Copenhagen, v. 8, n.3, p.182-187, June 1993.
33. ZANIN, I.C.; GONÇALVES, R.B.; JUNIOR, A.B.; HOPE, C.K.; PRATTEN,
J. Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy:
an in vitro study. J. Antimicrob. Chemother., London, v.56, n.2, p.324-330,
Aug.2005.
45
=======================================
==================================
CAPÍTULO 2
==================================
=======================================
46
Efetividade do TBO ativado por LED na descontaminação de dentina
bovina cariada artificialmente
GIUSTI, Juçaíra S.M. *
SANTOS-PINTO, Lourdes **
PIZZOLITTO, Antonio Carlos ***
CARVALHO FILHO, Eurico****
BAGNATO, Vanderlei S. *****
Endereço para correspondência:
Profa. Dra. Lourdes Santos-Pinto
Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP
Rua Humaitá, 1680
CEP 14801-903 Araraquara – SP, Brasil
Fax: 55- 16- 3301-6330
* Mestre em Odontopediatria pela Faculdade de Odontologia de Araraquara -
UNESP
** Prof. Adjunto do Departamento de Clínica Infantil da Faculdade de
Odontologia de Araraquara – UNESP
*** Prof. Dr. do Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Araraquara – UNESP
****Graduando em Engenharia Física da Universidade Federal de São Carlos
-UFSCar
*****Prof. Titular do Departamento de Física e Ciência dos Materiais do
Instituto de Física de São Carlos - USP
47
Resumo
O objetivo deste trabalho foi avaliar a efetividade da terapia fotodinâmica na
descontaminação de dentina bovina cariada artificialmente, utilizando o Azul de
toluidina O (TBO) como agente fotossensibilizador e um emissor de luz à base de
LED como fonte ativadora. Foi desenvolvida cárie artificial em fragmentos de
dentina de incisivos bovinos, na presença de Lactobacillus acidophillus - 10
8
UFC
e Streptococcus mutans -10
8
UFC. Esses fragmentos foram embebidos em
solução fotossensibilizadora de TBO nas concentrações de 0,025 mg/mL e 0,1
mg/mL por 60s e expostos a diferentes doses de luz, 60s de aplicação (D= 24 J/
cm
2
) e 120s (D= 48 J/ cm
2
). Após a contagem das UFC por miligrama de dentina
cariada, pode-se observar que o uso do LED associado ao fotossensibilizador
TBO foi eficaz na descontaminação da dentina bovina artificialmente cariada,
sendo a maior redução bacteriana obtida com a aplicação do TBO 0,1 mg/mL e
48 J/cm
2
de dose de luz (tempo de aplicação 120s) que não houve uma interação
entre concentração do fotossensibilizador e dose de luz aplicada.
Palavras-chave: Fotoquimioterapia; dentina; luz; laser; bactéria
48
Abstract
The aim of this study was the evaluation of the photodynamic therapy effect on
the decontamination of artificial caries in bovine dentin; using toluidine blue O
(TBO) as photosensitizer agent and a LED light as activating source. Artificial
caries was developed on fragments of bovine dentin in the presence of
Lactobacillus acidophilus-10
8
CFU and Streptococcus mutans-10
8
CFU. The
fragments were immersed in the TBO photosensitizer solution of 0.025 mg/mL
and 0.1 mg/mL concentrations for 60s and exposed to different light dose, 60s
(D= 24 J/ cm
2
) and 120s (D= 48 J/ cm
2
) application time. After CFU counting per
mg of carious dentin, it was observed that the LED associated to TBO
photosensitizer was efficient on bacterial reduction in artificiall carious bovine
dentin, being the best effect promoted by the application of 0.1 mg/mL TBO and
48 J/cm
2
of light dose (application time = 120s) and, there was no interaction
between the photosensitizer concentration and light dose applied.
Key-words: Photodynamic therapy; tooth; LED; photosensitizer; light; lethal
photosensitization, bacteria, light emitting diodes.
49
Introdução
A técnica da terapia fotodinâmica (Photodynamic Thepary - PDT) é
uma modalidade terapêutica relativamente nova no tratamento de lesões
neoplásicas e não neoplásicas, que envolve a ativação de certos corantes
(fotossensibilizadores) por luz, na presença de oxigênio tecidual, resultando em
espécies reativas capazes de induzir à inviabilização das células.
1,8,12
Atualmente o laser é a fonte de luz mais empregada para a ativação
dos fotossensibilizadores, porém, com o desenvolvimento dos LED (diodos
emissores de luz) surgiram os primeiros estudos que utilizam esta fonte de luz
aplicada à terapia fotodinâmica.
6,7,14,15
A luz produzida pelos LED possuí características ligeiramente
diferentes da luz laser, pois trata-se de uma emissão espontânea, policromática
(numa faixa estreita), não coerente, sem aquecimento e com um certo
espalhamento. Os aparelhos emissores de luz à base de LED, têm um custo muito
menor que o dos aparelhos laser, tecnologia de produção mais simples e, além
disso, podem cobrir uma área extensa de irradiação conjugando-se vários LED em
uma mesma ponta. Desse modo, o emprego do LED na terapia fotodinâmica pode
reduzir os custos da sua realização, favorecendo o emprego da mesma por um
maior número de profissionais.
Estudos da década de 1990, utilizando principalmente o Azul de
Toluidina O (Toluidine Blue O – TBO) como agente fotossensibilizador,
evidenciaram que um grande número de bactérias bucais, incluindo-se as
periodontopatogênicas e as cariogênicas são susceptíveis a essa terapia.
3,4,9,11,13,21
50
A destruição de bactérias por essa técnica, pode apresentar diversas
vantagens em relação à utilização de agentes antimicrobianos tradicionais.
Primeiramente, a morte bacteriana é rápida, diminuindo a necessidade da
manutenção de altas concentrações de substâncias químicas por longos períodos,
como no caso do uso de antibióticos e anti-sépticos. Em segundo lugar, como a
morte bacteriana não está ligada à mediação de radicais químicos, o
desenvolvimento da resistência seria improvável. Finalmente, como nem o
fotossensibilizador, nem a luz empregada são bactericidas quando utilizados
isoladamente, a morte das bactérias pode ser controlada restringindo-se a região
irradiada, evitando a destruição da microbiota em outros locais.
2,17,20
A utilização de fontes de luz à base de LED para ativar
fotossensibilizadores com a finalidade de eliminar microrganismos da cavidade
bucal ainda é pouco estudada.
21
Assim, foi objetivo deste estudo, avaliar a
efetividade do TBO, ativado por LED na descontaminação bacteriana em dentina
bovina cariada artificialmente.
Material e Método
Foram utilizados seis incisivos bovinos, que foram limpos por meio de
raspagem do tecido periodontal e não apresentavam anomalias estruturais visíveis
a olho nu. O esmalte da face vestibular da coroa foi removido por meio de uma
fresa diamantada cônico-invertida (FG 1036G- KG Sorensen do Brasil), montada
em alta-rotação e quatro fragmentos foram obtidos desta superfície, utilizando-se
de uma broca trefina de titânio (2,7 mm de diâmetro interno, Impladonto - São
51
Paulo, Brasil), montada em baixa rotação. Um dos fragmentos serviu como
controle e os outros três foram aleatoriamente distribuídos entre os grupos
experimentais. Cada fragmento, após a identificação, foi seco com ar comprimido
durante 60s e pesado em uma balança (Marte AL500, Marte Balanças e Aparelhos
de Precisão Ltda, São Paulo – Brasil). Em seguida, foram armazenados em água
destilada até o momento do início do experimento.
Os espécimes foram autoclavados por 20 minutos a 121
0
C e na
seqüência, cada um foi transferido para um tubo de cultura identificado, contendo
2 mL de suspensão indutora de cárie preparada com uma infusão de cérebro-
coração modificada (BHI 3,7 g/100 mL, extrato de levedo 0,5 g/100 mL, glicose
1g/100 mL e sacarose P.A . 2g /100 mL) e a cada 50 mL dessa suspensão, foram
acrescidos 5 mL de Lactobacillus acidophilus (ATCC#ITAL-523) - 10
8
UFC e 5
mL de Streptococcus mutans (ATCC25175) - 10
8
UFC, com o intuito de
promover a colonização bacteriana. Os tubos contendo os espécimes foram
mantidos a 37
0
C, em microaerofilia, por 14 dias, sendo a suspensão trocada a cada
48 horas. Decorrido esse período, os espécimes foram mantidos sob refrigeração a
4
0
C, com a finalidade de paralisar a multiplicação bacteriana, até o momento do
tratamento.
O fotossensibilizador utilizado foi o Azul de Toluidina O (Toluidine
Blue O, C.I.52040), produzido pela Aldrich
(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Steinheim, Alemanha); é um corante básico cujo grupamento cromóforo é
catiônico e que se combina com grupamentos aniônicos das moléculas celulares
(DNA e RNA) e foi utilizado em duas diferentes concentrações: TBO A= 0,025
52
mg/mL e TBO B= 0,1mg/mL, durante 60s, ficando protegido da luz com a
finalidade de evitar a fotoativação pela luz ambiente.
A fonte de luz utilizada para a ativação do fotossensibilizador foi
um protótipo à base de LED vermelho com 2 LED de luxeon, com uma banda de
emissão centrada em 630nm, diâmetro da ponta 0,8 cm (área de 0,5 cm
2
) e
intensidade de 400 mW/cm
2
e potência de 200 mW (Figura 12). Foram utilizados
dois tempos diferentes de aplicação: 60s (D= 24 J/ cm
2
) e 120s (D= 48 J/ cm
2
).
Os espécimes foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes
grupos experimentais:
Concentração do
Fotosensibilizador
Dose de Luz em J/cm
2
Tempo de Aplicação (s)
0,025 mg/mL 0,1 mg/mL
- 0 TBO A TBO B
24 60 TBO A 60 TBO B 60
48 120 TBO A 120 TBO B 120
No grupo controle não se aplicou nenhum tipo de tratamento e seus
espécimes foram transferidos diretamente do meio de cultura para outro tubo
contendo 5 mL de solução salina para realização do método de diluições
sucessivas para contagem das UFC. Foram realizadas três repetições para cada
situação.
Após o tratamento, os espécimes dos grupos experimentais foram
colocados em tubos de cultura contendo 5 mL de solução salina e agitados em
Vortex (Heidolph, 60 Hz, Germany) por 60s. Desta suspensão, 0,5 mL foram
transferidos para tubos de cultura contendo 4,5 mL de solução salina, para
53
determinação das UFC, segundo o método das diluições sucessivas. Foram feitas
duas diluições e plaqueadas 0,1 mL de cada suspensão em placas de Petri
contendo BHI modificado, acrescido de ágar sendo as placas incubadas a 37
0
C por
48 horas, em jarras de microaerofilia.
Posteriormente à incubação, procedeu-se à contagem de colônias de
bactérias em contador digital (Gallenkamp, Inglaterra) e dividiu-se, o número de
unidades formadoras de colônias pelo peso de cada amostra, para que se obtivesse
o valor de UFC por miligrama de dentina cariada. Detalhes da descrição da
metodologia utilizada estão apresentados nas figuras 1 a 4 e 8 a 16 do apêndice
(Capítulos 1 e 2). Para padronizar os valores obtidos em cada espécime com seu
controle, este foi considerado como máximo de contaminação (100%) e os demais
valores para os espécimes dos grupos experimentais foram obtidos segundo sua
proporção em relação ao grupo controle que foi denominada Fração de
Sobrevivência (FS).
Os resultados obtidos foram analisados utilizando-se a análise de
variância a dois critérios fixos (p≤ 0,05) e comparações múltiplas de Tukey, após
a transformação logarítmica dos valores obtidos.
Após observarmos a variação da Fração de Sobrevivência (FS) para as
diferentes concentrações de TBO e tempos de irradiação ou doses de luz,
elaboramos uma expressão empírica que relaciona o FS com a concentração e a
dose de luz utilizada. Como primeiro passo, consideramos a variação da FS na
ausência de luz para esse regime:
C 0 FS = 1
C FS = 0
Onde C= concentração do fotossensibilizador
54
Determinando uma expressão do tipo :
0
1
1
)0(
C
C
DFS
A presença da luz faz com que o efeito tóxico da droga seja
aumentado. Assim, à medida que a dose de luz é aumentada, a toxicidade também
é intensificada chegando-se a seguinte expressão:
0
0
1
1
),(
D
D
e
C
C
CDFS
Resultado
O grupo TBO A (TBO 0,025 mg/mL, sem aplicação de luz)
apresentou maior média de proporção de UFC por miligrama de dentina cariada
com relação ao grupo controle. Também pudemos perceber que o aumento no
tempo de irradiação produziu menores valores de UFC por miligrama de dentina
cariada e à medida que a concentração aumentava, esses valores também
diminuíram (Gráfico1).
Onde D= dose de luz e C é expressa em mg/ml
C
0
~ 1m
g
/mL
55
A aplicação da análise de variância aos dados obtidos, revelou que os
fatores são significativos isoladamente, mas não conjuntamente. Assim, como os
fatores não interagiram, foram analisados separadamente, procurando evidenciar
os melhores níveis para cada um.
Tabela 1 - Análise de Variância aplicada aos valores de UFC observados
Componentes GL
Soma de
Quadrados
Quadrado
Médio
Valor
F
p valor
Modelo
5 87,2977385 17,4595477 25,18 <.0001*
Concentração
1 23,64788992 23,64788992 34,11 <.0001*
Irradiação
2 60,21303608 30,10651804 43,43 <.0001*
Concentração*Irradiação
2 3,43681252 1,71840626 2,48 0.0945
Erro
48 33,2772663 0,6932764
Total
53 120,5750048
* significância estatística
GRÁFICO 1- Valores representativos das UFC/ mg de dentina cariada de acordo com
a
concentração do fotossensibilizador e o tempo de exposição à luz.
56
Para evidenciar o melhor nível de cada fator, onde a proporção de
Unidades Formadoras de Colônias foi mínima, utilizou-se o método de
Comparações Múltiplas de Tukey, tendo sido as comparações realizadas para cada
nível de cada fator (Tabela 2).
Tabela 2 - Comparação Múltipla de Tukey aplicada ao fator concentração
Grupos de Tukey
Média do
logaritmo das
Respostas
N
Níveis de
Concentração
A 3,4170 27 1
B 2,0935 27 2
Médias com mesmas letras são não significativamente diferentes.
Diferença Mínima Significativa: 0,4556
A Tabela 2, na qual os níveis de Concentração são comparados,
evidenciou que a concentração B (TBO = 0,1mg/mL) foi a mais eficaz. Para o
fator tempo de irradiação todos os níveis foram considerados diferentes
estatisticamente, sendo o mais eficaz o terceiro nível (120s), D=48 J/cm
2
(Tabela 3).
Tabela 3- Comparação Múltipla de Tukey aplicada ao fator tempo de irradiação
Grupos de Tukey
Média do
logaritmo das
Respostas
N Níveis de Irradiação
A 4,1840 18 1
B 2,4173 18 2
C 1,6645 18 3
Médias com mesmas letras são não significativamente diferentes
Diferença Mínima Significativa: 0,6712
57
Observamos que a combinação que minimiza a variável de interesse
(proporção de UFC/mg de tecido cariado) com maior eficácia é a segunda
Concentração B (TBO = 0,1 mg/mL) com 120s de exposição, D=48 J/cm
2
.
Assim, aplicando a expressão proposta:
0
0
1
1
),(
D
D
e
C
C
CDFS
Observamos que o efeito tóxico do TBO na ausência de luz, é
discreto, e, que o aumento da dose de luz em ambas concentrações provocou
redução significativa da FS (Gráficos 2,3 e 4).
0
0
1
1
D
D
e
C
C
Fs
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
Escuro
Fração de Sobrevivência
Concentração de TBO (mg/mL)
Gráfico 2 - FS em rela
ç
ão à concentra
ç
ão de TBO sem a
p
lica
ç
ão de luz.
Onde
D
0
=9 J/cm²
D= 0 J/cm²
C
0
=0,13mg/mL
58
0
0
1
1
D
D
e
C
C
Fs
Ainda baseados na expressão proposta, pudemos construir um gráfico de
FS em função da dose de luz através do qual é possível calcular a FS de acordo
com a concentração do fotossensibilizador e a dose de luz empregada. Ficou então
evidente que à medida que a concentração aumenta, menor é a dose de luz
necessária para eliminar a mesma quantidade de microrganismos.
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
24J/cm²
Fração de Sobrevivência
Concentração de TBO (mg/mL)
GRÁFICO 3 - FS em relação à Concentração de TBO, quando é aplicada uma dose de 24J/ cm
2
de luz.
GRÁFICO 4 - FS em relação à Concentração de TBO, quando é aplicada uma dose de 48J/ cm
2
de luz.
Onde
D
0
=9 J/cm²
D= 24 J/cm²
C
0
=0,13mg/mL
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
48 J/cm²
Fração de Sobrevivência
Concentração de TBO (mg/mL)
0
0
1
1
D
D
e
C
C
Fs
Onde
D
0
=9 J/cm²
D= 48 J/cm²
C
0
=0,13mg/m
59
0
0
1
1
D
D
e
C
C
Fs
Com essa expressão, pudemos definir também a chamada região de
segurança, determinando os parâmetros de D (dose) e C (concentração) para
obtenção de valores deFS < 90%, 95% e 99 %, ou seja, a relação entre a dose de
luz e a concentração de fotossensibilizador capaz de eliminar entre 90 e 99% dos
microrganismos presentes. (Gráfico 6).
0 1020304050
0,0
0,5
1,0
Fração de Sobrevivência
Doses de Luz (J/cm²)
Ausência de TBO
0,025 mg/ml de TBO
0,1 mg/ml de TBO
GRÁFICO 5 - FS em fun
ç
ão da dose de luz.
Onde
D
0
= 24 J/cm²
C
0
=0,13mg/mL
024681012
0
20
40
60
80
100
C/C
0
D/D
0
90%
95%
99%
GRÁFICO 6 – Correlação entre concentração de fotossensibilizador e dose de luz para redução
microbiana de 90%, 95% e 99%.
60
Discussão
Desde 1900 sabe-se que é possível provocar a morte de bactérias
através da associação de luz visível a fotossensibilizadores. A luz em um
comprimento de onda inferior a 300 nm é absorvida por proteínas e ácidos
nucléicos e isso pode resultar na morte celular, principalmente através da
desnaturação do DNA. Devido a esse potencial mutagênico, emissão luminosa
nessa faixa de comprimento de onda, como a ultravioleta, não é apropriada para o
tratamento de infecções em seres humanos.
20
Mais recentemente, a administração de um fotossensibilizador que
exibe uma predileção por células tumorais e a irradiação da região com uma luz
laser vermelha, recebeu o nome de terapia fotodinâmica – PDT e tem sido
utilizada no tratamento do câncer.
5,12
Na odontologia essa técnica vem sendo
empregada para eliminar microrganismos presentes na cavidade bucal. Corantes
que se fixem à parede bacteriana e tenham picos de absorção próximos ao
comprimento de onda do laser utilizado, levam à absorção de fótons pelo corante,
que é convertido a um estado excitado. A energia transferida para as moléculas
vizinhas pode resultar na formação de moléculas reativas como oxigênio singleto,
íons superóxidos, hidroxilas e outros radicais livres, capazes de provocar danos e
até matar as bactérias.
4,17,20,21
A seleção de um fotossensibilizador efetivo é essencial para o sucesso
da técnica. Além de não apresentar risco de toxicidade ao ser humano, o
fotossensibilizador ideal deve absorver bem a luz no comprimento de onda
61
utilizado na irradiação, ter uma alta capacidade de produzir oxigênio singleto e
este deve ter uma vida longa (alguns microssegundos).
20
Ito
5
(1970) demonstrou que o corante TBO era fotodinamicamente
ativo, provocando a morte celular sem indução de alteração genética, e que
provavelmente, a membrana celular fosse o local onde o oxigênio singleto agia
para inativar as células de levedura, causando aumento da permeabilidade ou
perda do controle da permeabilidade, resultando em desequilíbrio das substâncias
intracelulares e morte celular sem aparente dano cromossômico. Em 1995,
Paardekooper et al.
10
observaram que o Azul de Toluidina (TB) entrava na célula
durante a iluminação devido a uma mudança súbita das propriedades da
membrana celular e estruturas intracelulares eram danificadas. Desse modo, além
do dano causado à membrana plasmática, o dano fotodinâmico também atingiria
estruturas intracelulares.
O efeito do TBO associado à luz laser sobre microrganismos bucais
foi também reportado por Donbson e Wilson
4
(1992) que observaram a
sensibilização pelo TBO ( 0,01% e 0,1%) de Streptococcus sanguis, Porfiromonas
gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans e Fusobacterium nucleatum,
em biofilmes com a morte bacteriana evidente após exposição à luz laser de
HeNe 7,3 mW, por 30s, energia de 219 mJ e dose de 16,5 J/ cm
2
. Okamoto et al.
9
também, reportaram a morte de várias espécies de Streptococcus utilizando um
laser de HeNe energia de 720 mJ, numa dose de 5,7 J/ cm
2
na presença de
corantes como o TBO (7,5 µg/mL). e, Burns et al
3
,1993
observaram que quando
uma suspensão de bactérias cariogênicas Streptococcus mutans, S. sobrinus,
62
Lactobacillus casei e Actinomyces viscosus foram expostas a uma luz laser de
HeNe 7,3 mW na presença de TBO, uma considerável taxa de morte celular foi
conseguida quando a concentração de corante utilizada foi 50g/mL e a dose de
energia 33,6 J/cm
2
.
A efetividade do corante TBO associado ao LED na descontaminação
de dentina cariada não foi ainda amplamente estudada. A utilização de dentina
artificialmente cariada, neste estudo, teve como objetivo a padronização do tecido
cariado com relação às características clínicas de textura e consistência e o
controle do tipo de microrganismos presentes na massa de tecido cariado. Estudos
que avaliaram o efeito do TBO sobre bactérias cariogênicas, foram realizados com
microrganismos em suspensão, e sabemos que o efeito da luz está altamente
relacionado com o tecido alvo, devido à interação tecidual que ocorre no momento
da irradiação
3,4,16,17
.
Os resultados obtidos evidenciaram que, tanto o aumento da
concentração, como o aumento da dose de luz, foram capazes de provocar redução
na Fração de Sobrevivência (FS) e que não existiu interação entre esses fatores, ou
seja, irradiação e concentração são importantes para explicar a redução na
FS(Tabelas 2 e 3).A mesma observação ocorre na comparação dos Gráficos 2, 3 e
4, que nos mostram a baixa toxicidade do TBO na ausência de luz (Gráfico 2) e
sua fototoxicidade, ampliada à mediada que a dose de luz aumenta (24 J/ cm
2
e 48
J/ cm
2
), (Gráficos 3 e 4).
Wilson et al.
20
(1995) reportaram que o aumento da energia dos
lasers de GaAs (11 mW, diâmetro do feixe 9 mm e comprimento de onda 660nm,
63
modo pulsado com freqüência de 20 kHz) associado ao fotossensibilizador AlPcS
2
e o laser de HeNe (7,3 mW, diâmetro do feixe e 632,8 nm de comprimento de
onda) associado ao fotossensibilizador TBO, provocava a redução de
Streptococcus sp. e Actinomyces sp. No entanto é interessante observar que,
devido ao fato dos autores não possuírem lasers mais potentes, esse aumento de
energia (de 0,44 J para 1,31 J para o laser de HeNe e 0,59 J para 1,78 J para o
laser GaAs) foi obtido através do aumento do tempo de exposição.
Em 2003, o mesmo grupo de pesquisadores
16
testou um equipamento
mais potente (80 mW, comparado com 7,3 mW do equipamento anterior) com um
novo sistema de entrega de luz através de um cabo de fibra óptica de 800 m de
diâmetro cuja densidade máxima na superfície da ponta era de 4 W/cm
2
,
comparado a 0,6 W/cm
2
do equipamento anterior, e observaram que o novo
sistema era muito mais eficiente na redução do número de S. mutans em
suspensão. Atribuíram esse resultado ao tamanho reduzido da ponta emissora de
luz que pode ser colocada em contato direto com a suspensão bacteriana e que a
dose era maior na superfície da ponta (100 J/cm
2
). Concluíram que existia uma
potência mínima de energia, capaz de provocar a morte bacteriana e que era
improvável que a dose de energia fosse o fator mais importante na morte
bacteriana.
Os estudos sobre o azul de toluidina O utilizado como
fotossensibilizador que utilizaram o laser como fonte de luz
3,9,11,16,18,20,21
foram
realizados com bactérias em suspensão. No entanto, outras pesquisas que
utilizaram bactérias aderidas à dentina ou à uma matriz de colágeno, revelaram
64
que a redução de S mutans presentes em dentina cariada e em matriz de colágeno
foram semelhantes, porém menores que a redução observada quando as bactérias
estavam em suspensão e, concluíram que o tempo de contato entre a bactéria e o
TBO é um fator crítico.
19
No Gráfico 5 comparando a FS nas diferentes concentrações do TBO
e diferentes doses de luz, observamos que o aumento da concentração no escuro,
aumenta sua toxicidade e que, à medida que a dose de luz aumenta, o fator de
sobrevivência é consideravelmente reduzido para ambas as concentrações. Dentre
as combinações testadas, a TBO B 120 ( 0,1 mg/mL e D= 48J/ cm
2
), foi a mais
eficaz, fato que também pode ser verificado através do método de comparações
múltiplas de Tukey (Tabelas 2 e 3).
O cálculo da dose de luz e concentração de fotossensibilizador
indicados para alcançarmos 90%, 95% e 99% de morte bacteriana está descrito no
Gráfico 6. Por meio dessa função pudemos definir a meta em relação à
porcentagem de morte bacteriana e ajustarmos a concentração de
fotossensibilizador e a dose de luz, de acordo com nossa disponibilidade, a fim de
obtermos o efeito desejado. Pudemos observar ainda, que devido à sua
fototoxicidade elevada, em altas doses de luz, é possível reduzir drasticamente a
concentração do fotossensibilizador e, ainda, assim obter valores consideráveis na
redução da FS, fato este relevante, uma vez que, quanto maior a concentração do
fotossensibilizador, maior a sua toxicidade na ausência de luz.
65
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69
=======================================
==================================
CAPÍTULO 3
==================================
=======================================
70
Avaliação da incorporação do Photogem e TBO em dentina
bovina sadia e cariada
GIUSTI, Juçaíra S. M.*
RIBEIRO FIGUEIREDO, Augusto Cesar**
SANTOS-PINTO, Lourdes***
MORIAMA, Lílian T.****
BAGNATO, Vanderlei S.*****
Endereço para correspondência:
Profa. Dra.Lourdes Santos-Pinto
Rua Humaitá, 1680
CEP 14801-903 Araraquara – SP – Brasil
Fax: 55- 16- 33016330
* Mestre em Odontopediatria pela Faculdade de Odontologia de Araraquara –
UNESP
** Mestre em Ciências e Engenharia dos Materiais pelo Instituto de Física de São
Carlos- USP
*** Prof. Adjunto do Departamento de Clínica Infantil da Faculdade de
Odontologia de Araraquara – UNESP
**** Mestranda em Física pelo Instituto de Física de São Carlos - USP
***** Prof. Titular do Departamento de Física e Ciências dos Materiais do
Instituto de Física de São Carlos – USP
71
Resumo
O objetivo desse estudo foi avaliar a incorporação dos fotossensibilizadores
Photogem
e Azul de Toluidina O – TBO em dentina bovina sadia e
artificialmente cariada. Cavidades padronizadas foram realizadas em dentina, na
face vestibular de incisivos bovinos, que foram imersos em um meio de cultura
estéril acrescidos de Lactobacillus acidophillus10
8
UFC e Streptococcus mutans-
10
8
UFC para a indução da cárie artificial. Em seguida, diferentes concentrações
do fotossensibilizador Photogem
: PA= 1mg/mL, PB= 2 mg/mL e PC= 3 mg/mL
e do TBO: 0,025 mg/mL e 0,1 mg/mL foram aplicados às cavidades durante 60s.
As medidas e leitura de fluorescência em dentina sadia previamente ao
desenvolvimento da carie artificial, em dentina cariada e cariada após a aplicação
dos fotossensibilizadores foram feitas por um aparato experimental composto por
um laser de excitação (532 nm), espectrômetro, computador com programa de
aquisição LightView e uma sonda tipo Y. Pudemos observar que houve uma
maior incorporação do Photogem
em tecido cariado que em tecido sadio e que
não houve diferença na incorporação do fotossensibilizador entre as concentrações
testadas. Para o TBO embora tenha ocorrido uma maior intensidade da
fluorescência em dentina cariada e após a fotossensibilização, não houve variação
evidente no parâmetro de incorporação do TBO, revelando uma menor
seletividade pelo tecido cariado. Com base nos resultados obtidos pudemos
concluir que a incorporação do Photogem
em dentina bovina foi mais seletiva
para o tecido cariado que para o TBO e que o aumento da concentração do
fotossensibilizador não aumentou a incorporação do mesmo.
Palavras-chave:Fotoquimioterapia; fluorescência; dentina; luz; laser;bactéria
72
Abstract
The aim of this study was to evaluate the incorporation of two photosensitizers:
Photogem
e Toluidine Blue O (TBO) in dental cavities prepared on health and
artificially carious bovine dentin. Photosensitizer Photogem
in three different
concentrations (PA= 1 mg/mL, PB = 2 mg/mL e PC= 3 mg/mL) and TBO in two
different concentrations (0.025 mg/mL e 0.1 mg/mL) were applied for 60s in the
cavities. For each experimental condition (health dentin, carious dentin and
carious dentin with photosensitizer) six spectra were taken measured by a spectral
fluorescence system consisted of laser, optical probe, spectrophotometer and
computer. There was more incorporation of Photogem
by carious dentin than by
health dentin, and the photosensitizer incorporation was similar in the three
different concentrations. When TBO was applied as photosensitizer, although
greater fluorescence intensity was observed, there was not an evident variation in
the parameter of TBO incorporation showing lower selectivity for the carious
tissue. Based in these results we concluded that Photogem
incorporation in
carious bovine dentin was more selective than TBO, and higher concentrations did
not improve photosensitizer incorporation.
Key-words: Fluorescence spectroscopy; photodynamic therapy; bovine dentin;
photosensitizer.
73
Introdução
O emprego da técnica da terapia fotodinâmica na eliminação dos
microrganismos presentes na cavidade bucal, em especial aqueles presentes na
cárie dentária, vem sendo apontado como uma alternativa promissora para a
descontaminação do tecido cariado.
5
Uma das vantagens na utilização dessa
técnica, é a seletividade, uma vez que sua ação somente ocorre na região onde há
presença de um fotossensibilizador ativado por uma fonte de luz. Assim sendo, é
possível delimitarmos o raio de ação desejado, restringindo o local de aplicação
do fotossensibilizador e da luz.
4,5,14,22,23,26,27
Inicialmente o efeito bactericida da terapia fotodinâmica foi estudado
sobre microrganismos em suspensão.
5,14,22,27
Recentemente, novos estudos
começaram a avaliar a efetividade dessa terapia em microrganismos presentes em
biofilme, aderidos à dentina e à matriz de colágeno.
4,6,23,28
. A mudança no perfil
das pesquisas ocorreu devido ao conhecimento da importância do efeito da
interação da luz com o tecido alvo uma vez que a terapia fotodinâmica tem se
mostrado menos efetiva na redução de bactérias presentes em dentina e em matriz
de colágeno do que em suspensão (Williams et al.,
23
2004)
A avaliação da eficiência de uma terapia que envolve a ação de um
fármaco e sua fotoativação para a indução da resposta desejada, deve levar em
consideração, no caso específico da aplicação em dentina, a incorporação do
fotossensibilizador pelo tecido dental e a interação luz/tecido, principalmente
considerando os fenômenos de absorção e espalhamento da luz. Porém, ainda não
está claro na literatura como ocorre a incorporação dos fotossensibilizadores ao
74
tecido dentário sendo este um ponto fundamental para o sucesso da técnica. Da
mesma forma, não foi ainda reportado se existe uma maior incorporação do
fotossensibilizador no tecido cariado em relação ao tecido sadio, ou seja, uma
seletividade destas substâncias pelo tecido afetado pela doença, fato que
contribuirá de forma decisiva para a utilização desta técnica como meio de
descontaminação de dentina cariada.
A espectroscopia de fluorescência é uma técnica capaz de detectar e
caracterizar mudanças físicas e químicas que ocorrem nos materiais, através do
estudo do espectro de absorção-emissão e relaxamento cinético.
1
Embora esta
técnica venha sendo bastante estudada como um método alternativo de
diagnóstico precoce da cárie dentária, também é possível utilizá-la para avaliar a
incorporação dos fotossensibilizadores pelo tecido dentário.
1,8,10,17,20
A análise por fluorescência é um método não invasivo no qual
emprega-se apenas instrumental óptico para a identificação de componentes. A
fluorescência traz informação sobre a estrutura química das moléculas, sendo,
portanto um método de análise bastante sensível. A espectroscopia de
fluorescência pode ser empregada no monitoramento e na detecção de agentes
fotossensibilizadores para terapia fotodinâmica uma vez que eles fluorescem, ou
seja, são capazes de absorver energia luminosa e posteriormente liberar o excesso
de energia também na forma de luz, a fluorescência.
O objetivo desse estudo foi, portanto, avaliar através da
espectroscopia de fluorescência a incorporação das diferentes concentrações de
75
fotossensibilizadores utilizados na terapia fotodinâmica, Photogem
e Azul de
Toluidina O – TBO, na dentina bovina sadia e cariada artificialmente.
Material e Método
Dezoito incisivos bovinos íntegros foram isolados com resina epóxi e
esmalte cosmético na região da coroa. Cavidades padronizadas foram então
preparadas em dentina, nas faces vestibulares, utilizando-se uma fresa diamantada
cônico-invertida (FG 1036G – KG Sorensen do Brasil) montada em alta rotação.
Na porção radicular de cada dente foi confeccionado um orifício para a adaptação
de um fio ortodôntico dobrado em forma de gancho utilizado para pendurar os
dentes a uma tela de arame .
Na seqüência os dentes foram armazenados em água destilada até o
início do experimento, quando foram autoclavados por 20 minutos a 121
0
C e
introduzidos em uma suspensão para desenvolvimento de cárie artificial;
preparada uma infusão de cérebro-coração modificada ( BHI 3,7 g/ 100 mL,
extrato de levedo 0,5 g / 100 mL, glicose 1g/ 100 mL e sacarose P.A. 2g / 100
mL) e a cada 50 mL dessa suspensão foram acrescidos 5 mL de Lactobacillus
acidophilus (ATCC#ITAL-523) - 10
8
UFC e 5 mL Streptococcus mutans
(ATCC25175) - 10
8
UFC, com o intuito de promover a colonização bacteriana.
Nesse caldo os dentes ficaram imersos a 37
0
C, em microaerofilia, por 14 dias
sendo o mesmo trocado cada 48 horas. Após esse período, os dentes foram
mantidos sob refrigeração a 4
0
C, com a finalidade de inibir a multiplicação
bacteriana, até o momento do tratamento.
76
Dois fotossensibilizadores diluídos em água, um derivado de
hematoporfirina, o Photogem
nas concentrações de 1, 2 e 3 mg/mL e um corante
básico, Azul de Toluidina O (TBO) nas concentrações de 0,025 e 0,1 mg/mL
foram utilizados neste experimento. Foram realizadas 32 medidas de
autofluorescência em dentina sadia previamente à esterilização dos espécimes e
32 medidas de autofluorescência na dentina após o desenvolvimento da cárie.
Após a aplicação dos fotossensibilizadores (até o preenchimento da cavidade)
durante 60s tanto em dentina sadia como em dentina cariada, as cavidades foram
lavadas em água corrente por 60s e secas com ar comprimido por 10s quando
foram realizadas 6 medidas de fluorescência para cada concentração de
fotossensibilizador.
O aparato experimental utilizado para leitura por fluorescência (Clusta
MTD, Rússia) é composto por um laser de excitação (442 ou 532 nm),
espectrômetro, computador com programa de aquisição LightView e uma sonda
tipo Y. O laser de excitação acoplado à fibra óptica é entregue à superfície de
dentina analisada e a sonda deve ser mantida perpendicularmente em contato com
o tecido irradiado. A outra extremidade da sonda é conectada ao espectrômetro,
levando a luz coletada do tecido. A sonda Y é composta por uma fibra central, que
leva a luz de excitação e seis fibras ao redor coletoras da luz emitida pelo tecido
avaliado. O espectrômetro está conectado ao computador e ao programa
LightView que fornece os resultados obtidos da intensidade luminosa em função
do comprimento de onda. Neste trabalho o laser de excitação utilizado foi no
comprimento de onda de 532 nm, na região do verde do espectro eletromagnético.
77
Detalhes da descrição da metodologia utilizada estão apresentados nas figuras 1 a
6 do apêndice (Capítulo 3).
Os resultados obtidos foram tabulados e analisados graficamente
utilizando o programa LightView.
Resultados
Os dados de fluorescência obtidos refletem a relação da intensidade
luminosa em função do comprimento de onda. Para a análise desses dados foi
realizada uma normalização de todo o espectro pela máxima intensidade na região
do comprimento de onda de excitação (532 nm).
Após a análise dos espectros de autofluorescência da dentina sadia e
cariada, da fluorescência da dentina cariada na presença das três diferentes
concentrações de Photogem
®
utilizadas (PA= 1mg/mL, PB=2 mg/mL e PC= 3
mg/mL), obtivemos o Gráfico 1 que representa a média dos espectros coletados
em cada grupo. Como os espectros de fluorescência para as três concentrações do
Photogem
®
foram semelhantes optamos pelo PA para elaboração do gráfico.
78
400 500 600 700 800
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
Intensidade (u. arb.)
(nm)
dentina sadia
dentina cariada
cárie + PA
Neste gráfico observamos que a dentina cariada apresenta maior
intensidade de autofluorescência total que a dentina sadia e há uma maior
contribuição da emissão na região de 620 nm.
A fluorescência do tecido cariado submetido a fotossensibilização
com Photogem
®
na concentração 1 mg/mL mostra uma maior emissão em 620
nm, evidenciando a incorporação de porfirina exógena neste tecido.
As setas indicam dois comprimentos de onda (585 e 620 nm)
escolhidos para determinação do “parâmetro de incorporação da porfirina em
dentina”. Esse parâmetro é determinado pela razão entre a amplitude de emissão
em 620nm e pela amplitude de emissão em 585nm. Desta forma, quanto maior o
valor calculado, maior a incorporação de porfirina pelo tecido, uma vez que a
região ao redor de 620nm está evidenciando uma maior quantidade de porfirina no
tecido. Os parâmetros de incorporação do Photogem
®
pela dentina sadia bem
GRÁFICO 1- Representação da autofluorescência da dentina sadia e cariada e
fluorescência da dentina cariada na
p
resen
ç
a de Photo
g
em.
®
79
como pela dentina cariada, em relação à concentração do mesmo estão descritas
no Gráfico 2.
0,75
0,80
0,85
0,90
0,95
1,00
1,05
1,10
1,15
1,20
PC
PB
620/585 nm
dentina sadia
dentina cariada
auto PA
A incorporação em tecido cariado foi mais evidente na concentração
PA= 1mg/mL, mantendo-se praticamente estável para as outras concentrações
As médias dos espectros obtidos após a análise dos espectros de
autofluorescência da dentina sadia e cariada, da fluorescência da dentina cariada
na presença das duas diferentes concentrações de TBO
utilizadas (TBO = 0,025
mg/mL e 0,1 mg/mL ) estão representadas no Gráfico 3.
GRÁFICO 2 : Incorporação das diferentes concentrações de Photogem
®
na dentina sadia e cariada.
80
400 500 600 700 800
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Intensidade de Fluorescência (u.arb.)
Comprimento de onda (nm)
dentina sadia
dentina cariada
TBO25
Observamos através do Gráfico 3 que a dentina cariada também
apresenta maior autofluorescência que a dentina sadia, porém não há evidência de
um aumento da intensidade de fluorescência em uma determinada região, esse
aumento ocorre no espectro como um todo, não existindo uma banda de emissão
mais característica.
Para a determinação do parâmetro de incorporação do TBO em
dentina as regiões espectrais escolhidas foram 578 e 612nm. Os parâmetros de
incorporação do TBO pela dentina sadia bem como pela dentina cariada, em
relação à concentração do mesmo estão descritos no Gráfico 4.
GRÁFICO 3 - Representação da autofluorescência da dentina sadia e cariada e
fluorescência da dentina cariada na presença de TBO
81
Embora tenha ocorrido uma maior intensidade da fluorescência como
um todo em dentina cariada após a sensibilização com TBO, não houve variação
evidente no parâmetro de incorporação do TBO, revelando uma menor
seletividade do TBO pelo tecido cariado em comparação como Photogem
®
.
As Figuras 1 a e b mostram respectivamente o aspecto clínico das
cavidades após a aplicação dos fotossensibilizadores Photogem
®
e TBO, onde
podemos evidenciar a pigmentação residual causada pelo TBO, após a lavagem
em água corrente e secagem com ar comprimido.
FIGURA 1 – Pigmentação das cavidades após a aplicação do
fotossensibilizador Photogem
®
(a) e TBO (b).
GRÁFICO 4 – Incorporação das diferentes concentrações de TBO na dentina sadia e cariada.
auto TBO0,025 TBO0,1
0,75
0,80
0,85
0,90
0,95
1,00
1,05
1,10
1,15
1,20
578/612 nm
dentina sadia
dentina cariada
b
a
82
Discussão
Até que ponto o tecido dentinário de um preparo cavitário deve estar
livre de microrganismos antes da realização da restauração? Essa pergunta foi
feita por Kidd
7
(2004) e ainda continua sem reposta. Após a revisão da literatura
feita pelo autor, o mesmo concluiu que não há evidências claras o bastante de que
seja prejudicial a manutenção de dentina infectada, ainda que a mesma esteja
úmida e macia, previamente à restauração da cavidade. Dessa forma, põe dúvida a
relevância das técnicas de descontaminação do tecido remanescente após o
preparo cavitário. Porém, o próprio autor sugere que sejam realizados novos
estudos para responder perguntas tais como: como os microrganismos
remanescentes sobrevivem? Eles sofrem mudanças em seu fenótipo ou em seu
genótipo? Eles continuam a desmineralizar a dentina? Como a polpa reage a sua
presença a curto e longo prazo?
Partindo do princípio de que os microrganismos relacionados ao
desenvolvimento da cárie estão presentes na cavidade bucal apenas em uma
situação patológica, acreditamos que a eliminação dos mesmos presentes no
tecido dentinário remanescente após o preparo cavitário proporcionaria uma
condição mais semelhante à condição fisiológica favorecendo as condições de
reparo do tecido afetado. Assim sendo, o emprego da terapia fotodinâmica na
eliminação desses microrganismos seria uma alternativa promissora.
Uma desvantagem na utilização da terapia fotodinâmica na eliminação
de microrganismos bucais seria o alto custo dos equipamentos para sua realização,
uma vez que até recentemente, a fonte de luz mais empregada para sua realização
83
era o laser. Porém, com o desenvolvimento de novas fontes de luz, como os LED
essa desvantagem passa a não existir, pois esses aparelhos são de baixo custo,
fácil operação e manutenção. Estudos na área médica têm demonstrado a
efetividade da terapia fotodinâmica utilizando o LED como fonte ativadora.
11,18
Embora a eficácia desta técnica sobre microrganismos em suspensão
já tenha sido evidenciada
5,6,14,24,25,26,27
e estudos recentes, com os microrganismos
em biofilme, aderidos à dentina ou matriz de colágeno também comprovaram sua
eficácia,
6,23,28
a resposta induzida e sua aplicação em tecidos duros dentais ainda
são temas a serem investigados. Nesse sentido, o estudo da incorporação dos
fotossensibilizadores é de grande relevância, considerando que a efetividade da
terapia fotodinâmica depende da incorporação, pelo tecido afetado, de um agente
fotosensibilizador e sua ativação por luz.
O principal mecanismo de ação da terapia ocorre após a excitação do
fotossensibilizador que promove principalmente a modificação do estado
eletrônico do oxigênio presente nos tecido. O oxigênio utilizado fisiologicamente
nas reações celulares está num estado eletrônico chamado tripleto. Ao contrário, o
oxigênio singleto formado na reação fotodinâmica é altamente reativo, levando à
morte bacteriana.
16
As modificações que ocorrem nos componentes da membrana
citoplasmática da bactéria parecem ser os maiores responsáveis por sua morte, por
isso há uma maior dificuldade na eliminação de bactérias gram-negativas, devido
a maior complexidade de sua parede celular.
13,21
A espectroscopia de fluorescência é um método bastante viável para o
monitoramento da incorporação de fotossensibilizadores, uma vez que mostra a
84
resposta em tempo real através de um procedimento não invasivo e não destrutivo,
permitindo a análise in situ. Além disso, dentro de um regime de não-saturação, a
intensidade de fluorescência é diretamente proporcional à concentração do
composto fluorescente.
Neste estudo pudemos observar que a autofluorescência da dentina
cariada foi maior que da dentina sadia decorrente das alterações teciduais na
região espectral ao redor de 620-630nm. Esse fato ocorreu provavelmente, devido
à presença de porfirinas endógenas produzidas pelas bactérias presentes na lesão
de cárie, como já havia sido evidenciado por outros autores.
1,2,9,19,20
Pudemos
observar também que a fluorescência da dentina cariada na presença do
Photogem
®
foi maior, principalmente na região espectral de 620nm (mesma
região de emissão das porfirinas), evidenciando a incorporação de porfirina
exógena (Gráfico1). Esse fato garante que a ação fotodinâmica ocorrerá no tecido
dentinário onde a porfirina foi incorporada, uma vez que já é conhecido que a luz
é capaz de “penetrar” no tecido
29
e também que para a ação ser efetiva
necessitamos da presença do fotossensibilizador e da luz ao mesmo tempo.
Quando determinamos o parâmetro de incorporação do Photogem
®
em dentina (Gráfico2) pudemos observar que a incorporação em tecido cariado foi
mais evidente na concentração PA = 1 mg/mL, provavelmente isso se deva a
presença de uma maior quantidade de agregados nas concentrações mais elevadas,
fato que pode dificultar a difusão da porfirina pelo tecido.
3,12
Observamos nesse mesmo gráfico, a baixa incorporação de
Photogem
®
em tecido sadio, evidenciando a seletividade da técnica, pois a reação
85
fotodinâmica não será efetiva nessa região. O tecido sadio apresenta uma menor
susceptibilidade à difusão de moléculas por se tratar de um tecido mais bem
estruturado e com maior grau de mineralização em comparação com o tecido
cariado, onde a maior presença de compostos orgânicos pode facilitar a difusão do
fotossensibilizador.
O mecanismo de ação do TBO também ocorre na parede celular,
aumentando sua permeabilidade.
21
Quando o TBO foi empregado como
fotossensibilizador, não observou-se evidência de um aumento da intensidade de
fluorescência em uma determinada região, mas sim um aumento de intensidade
do espectro como um todo.
A incorporação do TBO pela dentina sadia e cariada foi mais
semelhante, já com relação ao Photogem
®
, a incorporação foi mais evidente no
tecido cariado, o que mostra uma maior seletividade do Photogem
®
como agente
fotossensibilizador da terapia fotodinâmica para redução bacteriana em dentina
contaminada (Gráfico 3).
A análise do parâmetro de incorporação do TBO em dentina (Gráfico
4) demonstra a baixa seletividade desse corante, uma vez que há pouca variação
entre a autofluorescência do tecido sadio e cariado e a fluorescência na presença
do corante.
A maioria dos estudos realizados na eliminação de microrganismos
bucais utilizou o TBO como agente fotossensibilizador
5,6,15,22,26,27
porém, como
muitos deles foram realizados com microrganismos em suspensão,
5,22,26,27
não foi
86
possível observar a pigmentação residual desse corante, que podemos observar na
Figura 1 b, fato que dificulta sua aplicação clínica.
Com base nos resultados observados pudemos concluir que o
Photogem
®
apresentou uma maior incorporação pelo tecido cariado em relação ao
tecido sadio, conferindo a ele uma maior seletividade em relação ao TBO, que é
incorporado tanto pelo tecido sadio como pelo tecido cariado sem evidente
variação. Além disso, observamos que a pigmentação residual do TBO pode ser
um fator de restrição para sua aplicação clínica.
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100
=======================================
==================================
APÊNDICE
==================================
=======================================
101
Metodologia Ilustrada – Capítulos 1 e 2
1- Obtenção dos espécimes:
FIGURA 1: Remoção do esmalte da face
vestibular do incisivo bovino utilizando fresa
diamantada cônico-invertida (FG 1036G- KG
Sorensen do Brasil) montada em alta-rotação.
FIGURA 2: Obtenção dos espécimes
utilizando broca trefina de titânio (2,7 mm de
diâmetro interno, Impladonto – São Paulo,
Brasil) em baixa rotação.
FIGURA 3: Espécime obtido com 2,7 mm de
diâmetro.
102
2- Indução de cárie artificial:
FIGURAS 4a, 4b e 4c – A solução indutora de cárie foi preparada
com uma infusão de cérebro-coração modificada (BHI 3,7 g/100 mL, extrato de
levedo 0,5 g/100 mL, glicose 1g/100 mL e sacarose P.A . 2g /100 mL a cada 50
mL dessa solução foram acrescidos 5 mL de Lactobacillus acidophillus
(ATCC#ITAL523) - 10
8
UFC (a) e 5 mL de Streptococcus mutans
(ATCC25175) - 10
8
UFC (b), com o intuito de promover o crescimento
bacteriano. Após a esterilização, cada espécime foi transferido para um tubo de
cultura identificado contendo 2 mL de suspensão indutora de cárie. Esses tubos
foram mantidos a 37
0
C, em microaerofilia, por 14 dias, sendo a suspensão trocada
a cada 48 horas (c).
3- Terapia fotodinâmica:
a
bc
103
FIGURA 5 - Fotossensibilizador Photogem
(Moscou, Rússia).
FIGURA 6 - Photogem
preparado em três
diferentes concentrações: PA= 1mg/mL, PB= 2
mg/mL e PC= 3 mg/mL
FIGURA 7 – O Photogem
foi mantido em contato com os
espécimes por 60 segundos antes da irradiação.
FIGURA 8 - Fotossensibilizador Azul de
Toluidina O –TBO ( Sigma-Aldrich Chenie
GmbH, Steinheim, Alemanha)
104
FIGURA 9 - TBO preparado em duas diferentes concentrações: TBO A= 0,025
mg/mL e TBO B= 0,1 mg/mL
FIGURA 10 – O TBO foi mantido em contato com os
espécimes por 60 segundos antes da irradiação.
FIGURA 11- As soluções fotossensibilizadoras preparadas
ficaram protegidas da luz com papel alumínio com a finalidade
de evitar a fotoativação pela luz ambiente.
FIGURA 12 - Protótipo com 2
LED vermelhos de luxeon com
uma banda de emissão centrada
em 630nm, diâmetro da ponta 0,8
105
0,5 mL
60s
10
-1
10
-3
10
-2
0,5 mL 0,5 mL
cm (área de 0,5 cm
2
), intensidade
de 400 mW/cm
2
e potência de 200
mW.
FIGURA 13 – Aplicação do LED sobre o
espécime, 60s (D= 24 J/ cm
2
) e 120 (D=
48 J/ cm
2
).
4- Análise da presença de bactérias:
106
FIGURA 14 - Espécimes tratados foram colocados em tubos de ensaio contendo 5
mL de solução salina e agitados em Vortex (Heidolph, 60 Hz, Germany) por 60s.
Desta solução foram retirados 0,5 mL e transferidos para tubos de ensaio contendo
4,5 mL de solução salina, segundo o método das diluições sucessivas.
FIGURAS 15a e 15b - Foram plaqueados 0,1 mL de cada solução em placas de
Petri contendo BHI modificado acrescido de Ágar (a) e as placas incubadas a
37
0
C por 48 horas, em jarras de microaerofilia (b).
FIGURAS 16a, 16b e 16c – Placas de Petri representando a ausência de bactérias
(a), quantidade reduzida de colônias de bactérias (b) e presença de grande
quantidade de colônias de bactérias nos espécimes (c).
a
b
a
b
c
107
Metodologia Ilustrada – Capítulo 3
FIGURA 1 - Dentes incisivos bovinos isolados com resina epóxi e esmalte
cosmético na região da coroa com cavidades preparadas em dentina na face
vestibular (setas). Os dentes foram mantidos suspensos na solução indutora de
cárie a fim de obtermos cárie em dentina.
FIGURA 2 – Detalhe das cavidades após a indução da cárie
artificial
108
Laser
excitação
Fluorescência
Ponteira
Espectrômetro
Laser
FIGURA 3 – Aplicação da solução fotossensibilizadora, na cavidade preparada.
FIGURA 4 – Aplicação da ponta ativa do
aparato de leitura por fluorescência sobre a
cavidade preparada.
FIGURA 5 – Aparato experimental utilizado
p
ara leitura por fluorescência composto por u
m
laser de excitação (532 nm), espectrômetro,
computador com programa de aquisição
LightView e uma sonda tipo Y.
Excitação
109
FIGURA 6- Representação esquemática do aparato utilizado para leitura por
fluorescência.
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