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ROXANE WIRSCHUM SILVA
AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA EM Tayassu tajacu (CATETO) E
Tayassu pecari (QUEIXADA) POR MEIO DA UTILIZAÇÃO DE MARCADORES
MICROSSATÉLITES
Dissertação apresentada como requisito parcial à
obtenção do grau de Mestre em Genética, curso de
Pós Graduação em Genética, Setor de Ciências
Biológicas, Universidade Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Ives José Sbalqueiro
Co-orientador: Prof. Dr. Thales R. O. de Freitas
CURITIBA
2006
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Universidade Federal do Paraná
Sistema de Bibliotecas
Silva, Roxane Wirschum
Avaliação da variabilidade genética em Tayassu tajacu
(Cateto) e
Tayassu pecari (Queixada) por meio da utilização de marcadores
microssatélites./ Roxane Wirschum Silva. – Curitiba, 2006.
x; 76f. : il. ; 30cm.
Orientador: Ives José Sbalqueiro
Co-orientador: Thales R. O de Freitas
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de
Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Genética.
1. Genética 2. Tayassu tajacu 3. Tayassu pecari I. Título II.
Sbalqueiro, Ives José, 1947- III. Freitas, Thales, Renato Ochotorena de
IV. Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas.
CDD(20.ed.) 575.1
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ii
AGRADECIMENTOS
Ao Curso e professores da Pós-Graduação em Genética da Universidade
Federal do Paraná, pelo apoio e contribuição dados à minha formação.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pelo auxílio financeiro.
Ao Prof. Dr. Ives José Sbalqueiro, pela orientação, apoio, oportunidades de
crescimento acadêmico/científico, amizade e conhecimentos transmitidos durante
estes quase oito anos de convivência, os quais foram fundamentais para a minha
formação.
Ao Prof. Dr. Thales Renato Ochotorena de Freitas que, mesmo à distância,
não exitou em me orientar e, quando precisei, me recebeu tão prontamente, abrindo
as portas do Laboratório de Citogenética e Evolução de Vertebrados da UFRGS, no
qual passei momentos muito importantes e decisivos para a conclusão desta
dissertação.
Aos professores, Chirlei Glienke de Blanco e João Carlos Marques
Magalhães, membros da banca de acompanhamento, pelas conversas, sugestões,
correções, enfim, todas contribuições dadas ao longo da realização deste trabalho.
À Profª Drª Adriana Gonela por toda a ajuda prestada, desde indicação de
literatura a resolução de problemas técnicos enfrentados neste trabalho, sempre
muito atenciosa, educada e com palavras positivas. Mesmo não nos conhecendo
pessoalmente, nunca esquecerei o que fez por mim!
À doutoranda Cibele Biondo pela troca de experiências e auxílios prestados
às pequenas dúvidas que me apareceram durante este percurso.
A todos os chefes dos Laboratórios do Departamento de Genética que
cederam seus equipamentos, da autoclave à microcentrífuga. Sem eles, este
trabalho não teria sido possível.
Aos funcionários e ex-funcionários do Departamento de Genética que
contribuíram, de alguma forma, para a realização deste trabalho.
A todas as pessoas e instituições que auxiliaram na obtenção de material
biológico (sangue) dos catetos e queixadas e dedicaram parte de seu tempo para
esta finalidade: Sr. Lucien Araújo Ribas (proprietário da Fazenda da Praia,
iii
Tibagi/PR) e seus corajosos funcionários; funcionários do Parque Municipal das
Araucárias; Drª Luciana M. Batalha, veterinária responsável pelo Setor de Animais
Silvestres da Fazenda Experimental Gralha Azul (PUC/PR) que, sempre muito
disposta, coletou sangue dos animais, demonstrando muita preocupação com o
bem-estar deles (algo raro hoje em dia); Paulo que, da mesma forma, dedicou muito
de seu tempo ficando horas em frente aos bretes para aprisionar os animais e,
depois, para segura-los (tarefa nada fácil) para que fosse possível maneja-los; aos
alunos estagiários da Drª Luciana que também participaram intensivamente das
coletas, o meus sinceros agradecimentos. Também não posso esquecer a ajuda
corajosa que minha prima Paula e seu namorado Rodrigo (futuros Veterinários)
ofereceram quando precisei de alguém que coletasse o sangue dos animais.
Aos meus colegas de turma (Alessandro, Clarissa, Cristiane, Maria Claudia,
Márcia, Manoela, Rafael Noleto e Rafael Vargas), pela convivência e amizade.
Aos meus queridos amigos do Laboratório de Citogenética Animal (os que
estão e os que já saíram): saibam que os momentos mais divertidos (e os mais
difíceis) da minha vida eu passei ao lado de vocês. Portanto, obrigada pela ajuda e
alegria!
Aos colegas do Laboratório de Citogenética e Evolução de Vertebrados da
UFRGS, especialmente à Nice, Ligia, Tatiane, Fabiano, Elise e Gislene que foram
muito atenciosos comigo nas duas vezes em que estive em Porto Alegre.
À amiga e madrinha Maria Cristina da Silva Cortinhas, pela força e troca de
experiências eternamente dadas a mim e, à sua mãe, Dona Clélia, que me recebeu
tão bem quando estive em Porto Alegre. Eu nunca esquecerei o que vocês fizeram
por mim!
À amiga e “irmã científica” Iris Hass que, mesmo do outro lado oceano
Atlântico, sempre me apoiou, contribuindo com ajudas científicas e palavras de apoio
em momentos difíceis.
Á amiga Fátima Becker Guedes, pelo eterno apoio em laboratório e fora dele.
Com você aprendi muito, principalmente que “duas cabeças pensam melhor do que
uma” e a ter coragem de enfrentar as dificuldades!
À amiga Daniele Malheiros Ferreira que me ajudou muito a dar os primeiros
passos no mundo da Biologia Molecular, incondicionalmente.
iv
Ao Prof. Dr. José Fernando de Sousa Lima, pela amizade e incentivo dados
durante todo o tempo em que convivemos juntos no “Projeto Catetos e Queixadas”.
À Soraya que, muito profissionalmente, me fez enxergar que o Ser é mais
importante que o Ter e que todos nós somos pessoas capazes e especiais.
Aos meus pais, Juarez e Dirce e meus irmãos, Julianna e Cezar, pelo carinho,
compreensão e eterno apoio dados desde o começo da minha existência.
Aos meus familiares por me lembrarem sempre que a família é um dom de
Deus.
Aos meus sogros que fizeram e fazem tudo que está ao alcance deles para
proporcionar-nos uma vida digna.
Ao meu eterno e grande amor, Fernando, simplesmente por existir em minha
vida! Saiba que, sem você, eu não teria chegado até aqui.
Ao Bumer, meu cachorrinho que, como um anjinho, veio trazer alegria em
nossas vidas com suas brincadeiras e sua companhia.
Aos animais que, sem compreender, literalmente “deram o sangue” para que
pudéssemos compreender melhor a sua biologia. A vocês, o meu eterno respeito.
À Deus, por me dar a oportunidade de estar aqui, rodeada de coisas boas e
com força para enfrentar momentos de dificuldade. Obrigada por tudo!
v
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS................................................................................................
vii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES....................................................................................... viii
RESUMO.................................................................................................................. ix
ABSTRACT...........................................................................................................................
x
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................
1
1.1 FAMÍLIA TAYASSUIDAE....................................................................................
1
1.1.1 Tayassu tajacu.................................................................................................
2
1.1.2 Tayassu pecari.................................................................................................
4
1.2 MARCADORES MOLECULARES EM ESTUDOS POPULACIONAIS E DE
CONSERVAÇÃO.................................................................................................
6
1.3 MICROSSATÉLITES.......................................................................................... 9
1.4 EXEMPLOS DE UTILIZAÇÕES DE MARCADORES MOLECULARES EM
ARTIODACTYLA..............................................................................................
11
1.5 EXEMPLOS DE UTILIZAÇÕES DE MARCADORES MOLECULARES NA
FAMÍLIA TAYASSUIDAE.....................................................................................
13
2 OBJETIVOS...........................................................................................................
17
2.1 GERAL.................................................................................................................
17
2.2 ESPECÍFICOS.....................................................................................................
17
3 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................
18
3.1 AMOSTRA.......................................................................................................................
18
3.2 EXTRAÇÃO DE DNA..................................................................................................
18
3.3 QUANTIFICAÇÃO E TESTE DE QUALIDADE DO DNA EXTRAÍDO.................
19
3.4 DILUIÇÃO DO DNA EXTRAÍDO..................................................................................
20
3.5 REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO DOS LOCOS MICROSSATÉLITES...................
20
3.6 VISUALIZAÇÃO DOS PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO...................................
23
3.7 ANÁLISE DOS DADOS.......................................................................................
24
4 RESULTADOS.......................................................................................................
27
4.1 CARACTERIZAÇÃO DOS LOCOS MICROSSATÉLITES..................................
27
4.1.1 Regiões de Amplificação..................................................................................
27
4.1.2 Locos Polimórficos, Freqüências Alélicas e Genotípicas.................................
28
4.1.2.1 Locos polimórficos.........................................................................................
28
continua
conclusão
vi
4.1.2.2 Freqüências alélicas e genotípicas............................................................... 28
a) Loco SW1408........................................................................................................
28
b) Loco SW857..........................................................................................................
30
c) Loco SW2411........................................................................................................
32
d) Loco ACTG2..........................................................................................................
34
e) Loco SW444..........................................................................................................
36
4.2 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA EM Tayassu tajacu E Tayassu pecari............
38
4.2.1 Heterozigose Observada e Heterozigose Esperada........................................
38
4.2.2 Conteúdo de Informações Polimórficas............................................................
39
4.2.3 Probabilidade de Exclusão de Paternidade (PE) e Probabilidade de
Exclusão Combinada......................................................................................
40
4.2.4 Freqüências de Alelos Nulos............................................................................
40
4.2.5 Estrutura Populacional......................................................................................
41
4.3 COMPARAÇÕES DE ESTRUTURA POPULACIONAL E DISTÂNCIAS
GENÉTICAS ENTRE T. tajacu E T. pecari.......................................................
42
5 DISCUSSÃO..........................................................................................................
44
6 CONCLUSÕES......................................................................................................
52
REFERÊNCIAS.........................................................................................................
54
ANEXOS....................................................................................................................
60
vii
TABELA 1 – ESPÉCIES, NÚMERO DE INDIVÍDUOS, SEXO E
LOCALIDADES DOS EXEMPLARES DE PORCOS-DO-
MATO..............................................................................................
18
TABELA 2 – SEQÜÊNCIA DOS QUATRO LOCOS MICROSSATÉLITES
ESCOLHIDOS ATRAVÉS DE COMPARAÇÕES DE BANDAS G
– REGIÕES HOMEÓLOGAS – ENTRE Sus scrofa scrofa (javali),
Tayassu tajacu E Tayassu pecari E LOCALIZAÇÃO NOS
CROMOSSOMOS DE Sus scrofa domestica.................................
21
TABELA 3 – SEQÜÊNCIA DOS DOIS LOCOS MICROSSATÉLITES
UTILIZADOS POR GONELA (2003) E LOCALIZAÇÃO NOS
CROMOSSOMOS DE Sus scrofa domestica.................................
22
TABELA 4 – CONCENTRAÇÃO DE CLORETO DE MAGNÉSIO (MgCl
2
),
QUANTIDADE DE DNA E TEMPERATURA DE HIBRIDAÇÃO
DOS INICIADORES UTILIZADAS PARA OS DIFERENTES
LOCOS............................................................................................
23
TABELA 5 – COMPARAÇÃO ENTRE O TAMANHO DOS FRAGMENTOS
AMPLIFICADOS EM PARES DE BASE ENCONTRADOS EM
Sus scrofa domestica, Tayassu tajacu E Tayassu pecari...............
27
TABELA 6 – LOCOS POLIMÓRFICOS, NÚMERO DE ALELOS E AMOSTRA
ANALISADA NAS DUAS ESPÉCIES DE PORCOS-DO-
MATO..............................................................................................
28
TABELA 7 – LOCO SW1408 – ALELOS E SUAS RESPECTIVAS
FREQÜÊNCIAS EM T. tajacu E T. pecari.......................................
29
TABELA 8 – LOCO SW857 – ALELOS E SUAS RESPECTIVAS
FREQÜÊNCIAS EM T. tajacu E T. pecari.......................................
31
TABELA 9 – LOCO SW2411 – ALELOS E SUAS RESPECTIVAS
FREQÜÊNCIAS EM T. tajacu E T. pecari.......................................
33
TABELA 10 – LOCO ACTG2 – ALELOS E SUAS RESPECTIVAS
FREQÜÊNCIAS EM T. tajacu E T. pecari.......................................
35
TABELA 11 – LOCO SW444 – ALELOS E SUAS RESPECTIVAS
FREQÜÊNCIAS EM T. tajacu E T. pecari.......................................
37
TABELA 12 – HETEROZIGOSE OBSERVADA (H
o
) E HETEROZIGOSE
ESPERADA (H
e
) E VALORES DE p EM T. tajacu E T.
pecari..............................................................................................
39
TABELA 13 –
VALORES DE PIC PARA CADA LOCO EM T. tajacu E T.
pecari..............................................................................................
39
TABELA 14 – PROBABILIDADES DE EXCLUSÕES DE PATERNIDADE (PE 1
E PE 2) E DE EXCLUSÃO COMBINADA (PEC) NAS DUAS
ESPÉCIES DE PORCOS-DO-MATO.............................................
40
TABELA 15 – FREQÜÊNCIAS ESTIMADAS DE ALELOS NULOS NOS CINCO
LOCOS EM T. tajacu E T. pecari....................................................
40
TABELA 16 – VALORES INDIVIDUAIS E TOTAIS DE Fst NAS AMOSTRAS DE
T. tajacu E T. pecari........................................................................
41
TABELA 17 –
VALORES INDIVIDUAIS E TOTAIS DE Fis NA AMOSTRA DE T.
tajacu E T. pecari............................................................................
42
TABELA 18 – VALORES DE Fst PARA CADA LOCO CONSIDERANDO AS
DUAS ESPÉCIES DE PORCO-DO-MATO.....................................
42
LISTA DE TABELAS
viii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 –
Tayassu tajacu (CATETO)...............................................................
3
FIGURA 2 –
Tayassu pecari (QUEIXADA)..........................................................
5
FIGURA 3 – DENDROGRAMA REPRESENTATIVO DAS DISTÂNCIAS
GENÉTICAS ENTRE CATETOS E QUEIXADAS. OS NÚMEROS
DOS NÓS SÃO OS VALORES DE BOOTSTRAP COM 10000
REPLICAÇÕES...............................................................................
43
GRÁFICO 1 –
NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO
LOCO SW1408 EM T. tajacu..........................................................
29
GRÁFICO 2 –
NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO
LOCO SW1408 EM T. pecari..........................................................
30
GRÁFICO 3 –
NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO
LOCO SW857 EM T. tajacu............................................................
31
GRÁFICO 4 –
NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO
LOCO SW857 EM T. pecari............................................................
32
GRÁFICO 5 –
NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO
LOCO SW2411 EM T. tajacu..........................................................
33
GRÁFICO 6 –
NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO
LOCO SW2411 EM T. pecari..........................................................
34
GRÁFICO 7 –
NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO
LOCO ACTG2 EM T. tajacu............................................................
35
GRÁFICO 8 –
NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO
LOCO ACTG2 EM T. pecari............................................................
36
GRÁFICO 9 –
NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO
LOCO SW444 EM T. tajacu............................................................
37
GRÁFICO 10 -
NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO
LOCO SW444 EM T. pecari............................................................
38
ix
RESUMO
Os porcos-do-mato, catetos (Tayassu tajacu) e queixadas (Tayassu pecari), são
nativos da fauna brasileira e possuem grande importância na alimentação das
populações humanas, principalmente das indígenas, além dos criadouros com fins
de manutenção, reprodução e exploração comercial.
Nos últimos anos, estes
animais estão sendo criados e comercializados, pois a carne é saborosa e, portanto,
muito apreciada. Entretanto, existe pouca informação a respeito da genética
populacional destes animais. O presente trabalho visou avaliar a variabilidade
genética em populações de catetos e queixadas mantidas em cativeiro por meio da
utilização de marcadores microssatélites. Para tal propósito, foram utilizados seis
iniciadores desenvolvidos para porco doméstico (Sus scrofa scrofa), que
amplificaram em ambas espécies. A visualização dos alelos foi realizada em gel de
poliacrilamida não-desnaturante 10%, revelando a presença de cinco locos
polimórficos e um monomórfico. Entre os locos polimórficos, foi observada alta
diversidade alélica, sendo de quatro a dezesseis alelos em catetos e de três a dez
alelos em queixadas. Porém, a variabilidade genética foi considerada baixa, tendo
em vista a alta incidência de indivíduos homozigotos em ambas espécies e em todos
os locos, exceto o loco ACTG2 (queixadas), o qual apresentou excesso de
heterozigotos. Os valores do conteúdo de informações polimórficas (PIC), foram
considerados, em ambas espécies e em todos os locos, altamente informativos. A
probabilidade de exclusão combinada (PEC) foi considerada alta e satisfatória em
catetos (99,48%) quando se conhece um dos parentais e, em queixadas, a
probabilidade de exclusão combinada considerando toda a amostra, foi considerada
alta quando se conhece um dos parentais (95,53%), porém não satisfatória para a
realização deste tipo de teste. Através do cálculo de Fst, pôde-se verificar que as
populações de catetos (Fst=0,042) e queixadas (Fst=0,1387) não estão
estruturadas, ou seja, há fluxo gênico entre elas, sendo que a variabilidade
encontrada está dentro e não entre as populações. Já quando comparadas as duas
espécies, percebeu-se a estruturação, não havendo fluxo gênico entre elas. Os
valores de Fis, exceto no loco ACTG2 (queixadas), o qual apresentou valor negativo
(-0,0275), nos demais os locos e em ambas espécies (0,1985 a 0,9284 em catetos e
0,3621 a 0,4754 em queixadas), revelaram um alto índice de homozigose, causada,
provavelmente, por endocruzamento. O presente trabalho constatou o sucesso da
amplificação heteróloga em catetos e queixadas utilizando iniciadores de porco
doméstico, confirmando os dados da literatura e fornecendo resultados inéditos a
este respeito, bem como em relação à variabilidade genética encontrada nestes
animais. Além disso, foram apresentadas proposições que visam a otimização da
criação destes animais nos cativeiros.
Palavras-chave: Microssatélites; Variabilidade genética; Tayassu tajacu; Tayassu
pecari
x
ABSTRACT
Wild pigs, Collared peccary (Tayassu tajacu) and White-lipped peccary (Tayassu
pecari) are native species of brazilian fauna which have high social and economic
importance. Both are important as alimentary item among native human populations.
In the last years, the meat from these animals has become much appreciated and so
they have been utilized as a commercial product. However, little information
regarding the population genetics of these animals exists. The goal of the present
report was to analyze the genetic variability with microsatellites markers in White-
lipped peccary and Collared peccary. Six primers developed for domestic pig (Sus
scrofa scrofa) were successfully used regarding amplification, in both species. The
visualization of the alleles was carried out on a not-denaturing 10% polyacrylamide
gel, showing the presence of five polymorphic loci and one monomorphic locus.
Among the polymorphic loci high allelic variability was observed in Collared peccary
(from four to 16 alleles) and also in White-lipped peccary (from three to ten alleles).
However the genetic variability was considered low due to the high frequency of
homozigotes animals in both species and in all loci, except in the locus ACTG2
(White-lipped peccary). The values of the polymorphic information content (PIC) were
considered highly informative in both species, in all the loci. The probability of
paternity exclusion was considered high and satisfactory in Collared peccaries
(99,48%), when one knows one of the parental individuals. In White-lipped peccaries,
the probability of paternity exclusion taking all the sample was also considered high
when one of the parental individuals is known (95,53%), however not satisfactory for
performing this type of test. The Fst shows that populations of Collared peccary
(Fst=0,042) and White-lipped peccaries (Fst=0,1387) are not structured, i.e. there is
genetic flow among populations of each species tyresulting in a within-populations
genetic variability. When compared the two species, however, there is no genic flow
between them. The values of Fis in both species and in all loci (0,1985 to 0,9284 in
Collared and 0,3621 to 0,4754 in White-lipped peccaries), except in ACTG2 (White-
lipped peccary), which presented negative value (-0,0275), revealed a high index of
homozygotes observed, being this one probably caused for the inbreeding. The
present study showed the success of the heterologous amplification in Collared and
White-lipped peccaries using primers of domestic pig, confirming the results already
in the literature and providing new data mainly in relation to the genetic variability in
these animals. Moreover, we were able to propose some optimization for maintaining
these animals in captivity.
Keywords: Microsatellites; Genetic variability; Tayassu tajacu; Tayassu pecari.
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 FAMÍLIA TAYASSUIDAE
A família Tayassuidae pertence à Ordem Artiodactyla, subordem Suiformes,
superfamília Suoidea e possui dois gêneros e três espécies (GROVES e GRUBB,
1993): Tayassu tajacu (Linnaeus, 1758), Tayassu pecari (Link, 1795) e Catagonus
wagneri (Rusconi, 1930). Apesar dos representantes desta família serem conhecidos
como porcos-do-mato, estes não pertencem à família Suidae, que compreende,
entre outros, o porco doméstico e o javali.
A separação dos Suoidea em duas famílias distintas – Tayassuidae e Suidae
– deve-se a
importantes diferenças anatômicas e genéticas entre estes animais.
O porco-do-mato difere do porco doméstico em algumas características como,
por exemplo, estômago com dois compartimentos, pêlos mais compridos e rijos,
cauda mais curta e abertura de uma glândula de cheiro nas costas, um pouco à
frente da cauda. Possui pernas longas e finas; os pés anteriores apresentam quatro
dedos, dos quais apenas dois tocam o chão; os posteriores portam três dedos
(SILVA, 1984).
A sua distribuição normalmente está restrita ao Novo Mundo, sendo
geralmente onívoros e normalmente encontrados em florestas. Alimentam-se de
folhas, sementes, raízes, frutos, insetos, ovos de pássaros, lagartos e pequenos
mamíferos. São mais ativos à noite e apresentam também um olfato extremamente
sensível facilitando a localização de alimentos escondidos sob a vegetação,
utilizando o focinho e as presas para cavar e cortar raízes.
No Brasil, ocorrem duas espécies de taiassuídeos: Tayassu tajacu, conhecida
como cateto e Tayassu pecari, conhecida como queixada. Ambas espécies estão
sendo amplamente criadas em cativeiro devido à exploração econômica da carne
destes animais, pois a mesma, em ambas espécies, além de ser muito saborosa
apresenta o teor de gordura inferior à dos porcos domésticos. O couro destes
animais é usado em confecções finas como luvas e bolsas (DEUTSCH e PUGLIA,
1990).
Portanto, há a necessidade de serem implementados programas de manejo e
reprodução nos criadouros, uma vez que se tratam de animais silvestres que
2
requerem cuidados especiais. Quando atendidas estas condições básicas em um
criadouro, a criação destes animais em cativeiro se torna uma atividade
economicamente viável.
1.1.1 Tayassu tajacu
Das três espécies de taiassuídeos existentes, o cateto é o menor, mais
abundante e mais amplamente distribuído, sendo encontrado do sul dos Estados
Unidos até o norte da Argentina. Ocorre em diversos tipos de habitat, de florestas
tropicais úmidas a semidesertos (BODMER e SOWLS, 1993).
A ampla distribuição de T. tajacu faz dele um dos mamíferos terrestres com
uma das maiores distribuições no continente americano. Ao longo das áreas de
distribuição ocorrem numa ampla variedade de habitats: desertos, florestas de
espinhos, chacos, caatinga, florestas de carvalho e florestas tropicais.
Além de ser encontrado no continente, ocorre também em ilhas próximas a
ele, como nas do Caribe. Contudo, naquelas mais distantes não são encontrados
naturalmente, exceto quando introduzidos, como, por exemplo, em Cuba (BODMER
e SOWLS, 1993).
O cateto (fig. 1) pesa entre 18 a 25 Kg e sua altura varia de 40 a 50 cm,
sendo os machos geralmente maiores que as fêmeas. Um espécime adulto mede,
da cabeça à base da cauda, cerca de 1 m (DEUTSCH e PUGLIA, 1990; SOWLS,
1984 apud BODMER e SOWLS, 1993). Um tipo de colar branco amarelado, em
frente às patas anteriores, largo inferiormente no peito e muito estreito no dorso,
torna fácil o reconhecimento do cateto. O corpo é castanho escuro, quase preto,
salpicado de branco devido à existência de pêlos brancos e pretos (SILVA, 1984).
Porém, dentro desta espécie, são observadas variações no tamanho e cor de
pelagem de acordo com o ambiente no qual estes indivíduos são encontrados.
Este tipo de variação tem levado alguns pesquisadores a declarar que a
espécie T. tajacu é composta por subespécies. Segundo HALL (1981) apud
BODMER e SOWLS (1993), seriam em torno de dez. Para esclarecer as possíveis
confusões taxonômicas existentes neste táxon, GROVES e GRUBB (1993)
acreditam na necessidade de haver uma melhor compreensão da genética e
distribuição geográfica de T. tajacu.
3
Além disso, T. tajacu é considerada por alguns autores como uma espécie
pertencente a um gênero distinto de Tayassu sendo identificada como Pecari tajacu
(GRUBB, 1993; THEIMER e KEIM, 1998; GONGORA e MORAN, 2005). No intuito
de contribuir para um maior entendimento da filogenia da família Tayassuidae
THEIMER e KEIM (1998) e GONGORA e MORAN (2005), através da análise de
seqüências de DNA mitocondrial (citocromo b), mostraram que Tayassu pecari e
Catagonus wagneri são mais relacionadas entre si que com Pecari tajacu,
sustentando, portanto, o cateto como um gênero separado dentro da família
Tayassuidae (gênero Pecari). No entanto, ambos os trabalhos afirmam que há a
necessidade de serem realizadas combinações entre análises moleculares e
morfológicas nas amostras ao longo da distribuição geográfica e ambiental das
espécies existentes de taiassuídeos, proporcionando um maior entendimento das
origens e relações entre elas. Portanto, devido a esta nova classificação ser ainda
controvertida e haver a necessidade de se rever a taxonomia destes animais,
adotou-se, no presente trabalho, o gênero e espécie Tayassu tajacu para identificar
os catetos.
Os catetos possuem dieta de acordo com o habitat onde vivem, no qual os
alimentos podem geralmente ser classificados como raízes, tubérculos, nozes e
partes verdes comestíveis de plantas. Em florestas tropicais, a dieta dominante é
baseada em frutos de palmeiras e suplementada com invertebrados. O padrão de
atividade é crepuscular, alimentando-se nas primeiras horas da noite.
FIGURA 1 – Tayassu tajacu (CATETO)
FONTE: Ives José Sbalqueiro, 2002.
4
Como todos os taiassuídeos, T. tajacu é um animal altamente social, vivendo
em bandos, os quais variam de pouco mais de seis até 30 indivíduos. São animais
nômades e, muitas vezes, viajam vários dias, podendo percorrer grandes distâncias.
À frente do bando vai o macho líder, seguido pelos machos mais velhos e
experientes, e depois os jovens machos, as fêmeas e suas crias. A aproximação de
um bando de catetos pode ser percebida pelo som característico que produzem: o
bater dos dentes. A área ocupada pelo grupo pode variar de 60 a 400 ha, cuja
extensão média é de 100 a 200 ha (DEUTSCH e PUGLIA, 1990). No bando, os
indivíduos são mantidos juntos por vocalização e através de um forte odor emitido
por uma glândula dorsal que é esfregada em troncos de árvores, rochas e nos
próprios indivíduos (BYERS, 1980 apud BODMER e SOWLS, 1993).
O período de gestação varia de 142 a 145 dias, onde o tamanho da ninhada
é, geralmente, de dois filhotes. Estes são precoces ao nascer, seguindo suas mães
dentro de uma hora após o parto (SOWLS, 1966 apud BODMER e SOWLS, 1993).
O cariótipo de T. tajacu possui 2n=30 e número de braços autossômicos (NA)
de 46 (HUFTY, SEDGWICK e BENIRSCHKE, 1973; GIANNONI e FERRARI,
1976a,b,c,d, 1977; BENIRSCHKE e KUMAMOTO, 1989; ROCHA, 1993; VASSART
et al., 1994; ANDREA et al., 2001; GUEDES et al., 2002; LIMA et al., 2002),
mostrando-se altamente estável.
Estes animais têm sofrido ameaças para sua sobrevivência, dentre as quais
destacam-se duas: a caça e a excessiva destruição dos habitats naturais. Estes
fatores têm resultado na fragmentação de populações de catetos e, até mesmo, o
desaparecimento deles em algumas regiões de sua distribuição (BODMER e
SOWLS, 1993).
1.1.2 Tayassu pecari
A queixada (fig. 2) é o maior e mais agressivo dos porcos selvagens sul-
americanos, atingindo 1,10 m de comprimento. Ele vive do sul do México ao
nordeste da Argentina, Equador, Peru, leste da Bolívia, Paraguai até o Atlântico
brasileiro (DEUTSCH e PUGLIA, 1990).
Apresenta pelagem das costas muito longa com uma coloração negro-
pardacenta, possuindo uma grande quantidade de pêlos brancos na mandíbula e
5
focinho, característica que lhe confere o apelido de pecari do lábio branco e que o
diferencia de outro pecari também comum na América do Sul, o cateto (Tayassu
tajacu). Outra característica é a presença de uma glândula de cheiro nas costas que
serve para identificar cada indivíduo e marcar seu território (GIANNONI, FERRARI e
GIANNONI, 1982; BODMER e SOWLS, 1993).
FIGURA 2 – Tayassu pecari (QUEIXADA)
Vive em grandes grupos, geralmente de 50 a 100 indivíduos, compostos por
fêmeas e machos de todas as idades e em uma grande variedade de habitats,
desde regiões de clima árido a florestas tropicais úmidas (seu habitat preferido),
especialmente em áreas bem conservadas onde atinge sua grande abundância, pois
sua tolerância a áreas desmatadas parece ser mínima, sendo facilmente caçado. Em
florestas tropicais úmidas são predominantemente frugívoros, mas podem também
se alimentar de animais (DEUTSCH e PUGLIA, 1990).
O período de gestação de uma fêmea dura de 156 a 162 dias, nascendo de
um a três filhotes (MAYER e WETZEL, 1987).
O cariótipo desta espécie possui um 2n=26 e NA=46 (HUFTY, SEDGWICK e
BENIRSCHKE, 1973; GIANNONI e FERRARI, 1976a,b,c,d, 1977; BENIRSCHKE e
KUMAMOTO, 1989; ROCHA, 1993; VASSART et al., 1994; ANDREA et al., 2001;
GUEDES et al., 2002).
O T. pecari apresenta algumas características comportamentais muito
parecidas às do T. tajacu, mas a forma como este repertório é revelado difere muito.
FONTE: Ives José Sbalqueiro, 2002.
6
Pode-se diferenciar a queixada do cateto por seu comportamento mais expansivo
(em intensidade de exibição), geralmente executado por todos os indivíduos, pela
necessidade de marcação territorial e também pela grande agressividade. Quando
acuado, bate forte o queixo e é valentíssimo (DUBOST, 1997 apud GONELA, 2003).
A queixada tem um papel muito importante no desenvolvimento econômico e
cultural de muitas populações indígenas neotropicais, constituindo-se em uma
importante fonte de alimento e renda para diversas tribos e populações rurais
(MARCH, 1993).
Dentre as espécies de mamíferos encontradas em florestas neotropicais, o T.
pecari, juntamente com o T. tajacu, são candidatas ao aproveitamento sustentável,
mas uma das barreiras encontradas é a pouca informação sobre o comportamento,
ecologia, habitat e biologia da população. Outro fator é a falta de dados sobre a
genética populacional. Como a espécie necessita de uma vasta área para sobreviver
(100 km
2
para um grupo de aproximadamente 100 animais) provavelmente ocorram
problemas de consangüinidade (FRAGOSO, 1998).
O T. pecari está entre os animais em perigo de extinção devido à caça
extensiva, problemas de saúde (especialmente doenças infecciosas) e
desaparecimento das florestas onde vivem. Apresentando distribuição geográfica
menor que a de T. tajacu, T. pecari mostra-se mais vulnerável à pressão de caça
talvez por formarem grupos sociais maiores (BODMER e SOWLS, 1993).
A conservação do T. pecari e dos taiassuídeos em geral, deve ser
considerada prioritária, pois, a redução dos níveis populacionais pode resultar em
uma perda da fonte de proteína para comunidades rurais e a um desequilíbrio sobre
o ecossistema das florestas. Para tanto, é necessária uma caracterização genética
das populações, o que permitirá gerar informações sobre a diversidade genética
(GONELA, 2003).
1.2 MARCADORES MOLECULARES EM ESTUDOS POPULACIONAIS E DE
CONSERVAÇÃO
Os marcadores moleculares estão sendo amplamente utilizados, pois
apresentam vantagens sobre os marcadores morfológicos, aplicados até a década
de 60, para estudos de genética e melhoramento. A disponibilidade de marcadores
7
morfológicos era essencialmente restrita a poucas espécies de plantas utilizadas
como sistemas modelo para o estudo da genética. A revolução neste quadro iniciou-
se com o desenvolvimento de marcadores isoenzimáticos e, mais tarde,
aperfeiçoados com o surgimento de técnicas que detectam polimorfismo genético
diretamente no DNA. Hoje, um número ilimitado de marcadores moleculares
altamente polimórficos pode ser obtido em qualquer organismo por meio da
utilização de diversas técnicas (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998).
Os principais tipos de marcadores moleculares podem ser classificados em
dois grupos, conforme a metodologia utilizada para identificá-los: hibridização ou
amplificação de DNA. Entre os identificados por hibridização estão os marcadores
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e minissatélites ou locos VNTR
(Variable Number of Tandem Repeats). Já aqueles revelados por amplificação
incluem os marcadores do tipo RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),
microssatélite e AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism).
As análises de DNA em estudos de populações têm várias vantagens
significativas: (1) o genótipo é analisado diretamente; (2) uma ou mais seqüências
apropriadas a uma questão específica podem ser selecionadas; (3) muitos métodos
são gerais para algum tipo de DNA; (4) o DNA pode ser extraído de pequenas
quantidades de tecido e é relativamente estável (GONELA, 2003).
Os sistemas de marcadores normalmente utilizados na análise populacional
são polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), DNA
mitocondrial, DNAs polimórficos amplificados ao acaso (RAPDs) e microssatélites
(SSR). Logo que se obtém uma quantidade adequada de marcadores genéticos
para uma determinada espécie pode-se estimar aspectos da estrutura populacional
tais como subdivisões de populações, dispersão, fluxo gênico, tamanho populacional
efetivo, estratégia de melhoramento e história evolutiva (ENGEL et al., 1996; ROED,
1998 apud GONELA, 2003).
Atualmente há uma crescente preocupação com a conservação de muitas
espécies animais e vegetais. Em um esforço conjunto com ecologia e morfologia, os
dados genéticos podem ser usados para definir as unidades que serão o alvo da
conservação. As metas da conservação são, a longo prazo, evitar a endogamia em
espécies que não são naturalmente endogâmicas e permitir a elas a manutenção do
maior potencial evolutivo possível, ou seja, manter sua alta diversidade genética
8
independente de sua fragmentação atual. É possível fazer isso realizando a análise
genética das populações, incluindo a identificação da sua estrutura genética e dos
fatores que a afetam, como tamanho efetivo da população, fluxo gênico e sistemas
de acasalamento (PEREZ-SWEENEY, RODRIGUES e MELNICK, 2004).
Segundo estes autores, a avaliação da estrutura genética populacional inclui
medidas de endogamia, diversidade e diferenciação, fornecendo um retrato genético
das populações. Os níveis de endogamia e de diversidade genética estão
relacionados, sendo que se a endogamia é alta a heterozigose será baixa, e vice-
versa. Um dos principais motivos para se evitar a endogamia é o de prevenir um
aumento de indivíduos homozigotos para genes recessivos deletérios ou letais na
população. Esses efeitos poderiam levar a população a sofrer os efeitos de um
fenômeno conhecido como depressão endogâmica.
A determinação do grau de diferenciação entre as populações de uma
determinada espécie é necessária por várias razões. Uma delas seria evitar que,
durante o manejo, ocorra redução na diferenciação genética existente entre elas. O
fluxo gênico é um processo evolutivo homogeneizador que minimiza a diferenciação
genética entre as populações. Entretanto, deve-se tomar cuidado com casos em que
a diferenciação entre elas é devida às alterações genéticas decorrentes da sua
fragmentação recente e isolamento em pequenas subpopulações, o que as tornam
mais susceptíveis aos efeitos negativos do pequeno número de fundadores e da
endogamia. Nestes casos, o objetivo do manejo pode ser a recuperação da
variabilidade perdida pela ação dos processos de endogamia e deriva genética, o
que pode ser conseguido através da troca de indivíduos entre subpopulações com a
conseqüente redução da diferenciação existente entre elas (PEREZ-SWEENEY,
RODRIGUES e MELNICK, 2004). Um exemplo disto foi um estudo com focas que,
apesar de décadas de proteção e esforços para aumentar as cinco populações
conhecidas, o número de indivíduos sempre foi reduzido. Utilizando-se
seqüenciamento da região controladora do mtDNA e minissatélites observou-se um
baixíssimo nível de variabilidade dentro de cada população, mas uma alta
diferenciação entre elas (KETZMANN et al., 1997 apud SOLÉ-CAVA, 2001). Desta
forma, a nova política de proteção e tentativas de proliferação de suas populações
seriam através do cruzamento de indivíduos de colônias diferentes, na tentativa de
reverter a depressão endogâmica.
9
As implicações deste tipo de análise para estudos de conservação,
principalmente no caso de espécies raras, são muito importantes: se uma espécie
ameaçada, que ocupa uma determinada área, se apresenta estruturada, então a
estratégia de conservação deve procurar preservar a diversidade da espécie
naquela área, pois já podem existir adaptações locais que se perderiam no caso de
a população ser misturada com outras. Por outro lado, se a população da espécie é
homogênea ao longo de toda a área de ocorrência, então é viável concentrar a
proteção da espécie em apenas uma área, usando indivíduos dessa área para a
recolonização das outras quando necessário (HAIG, 1998 apud SOLÉ-CAVA, 2001).
A idéia geral, portanto, é que, ao se manejarem populações de espécies
ameaçadas, deve-se procurar preservar também sua diversidade geográfica, a não
ser nos casos de pouca diferenciação genética, ou seja, nos casos em que as
populações estão pouco estruturadas.
A determinação do tamanho efetivo pode ser feita com estimativas do
tamanho efetivo histórico e atual das populações. Essas estimativas auxiliam a
prever a taxa de perda de variação genética com o passar do tempo e ainda ajudam
na avaliação da variabilidade presente e futura das populações. Além disso,
aspectos relacionados aos sistemas de acasalamento podem, até certo ponto, ser
determinados a partir de dados genéticos através da avaliação da paternidade e do
parentesco entre indivíduos nas populações. O conhecimento do sistema de
acasalamento é muito importante para que as práticas de manejo implementadas em
um projeto de conservação causem a menor perturbação possível na história natural
da espécie manejada (PEREZ-SWEENEY, RODRIGUES e MELNICK, 2004).
1.3 MICROSSATÉLITES
Trechos curtos de seqüências simples ocorrem como elementos altamente
repetitivos em tandem em todos os genomas eucariotos e, parcialmente, também em
procariotos e eubactérias (TAUTZ, 1989). Estas seqüências, também conhecidas
como microssatélites ou SSR (“Simple Sequence Repeats”), apresentam repetições
das unidades nos diferentes locos que variam de um a cinco nucleotídeos em
tamanho. Devido a grande variabilidade no número de repetições da maioria dos
locos, os microssatélites são amplamente usados em aplicações forenses, estudos
10
genéticos de populações, mapeamento genético e físico de genomas e,
conseqüentemente, têm se tornado o suporte principal de análises genômicas em
diferentes organismos (RUBINSZTEIN et al., 1995).
Estes locos altamente polimórficos, amplificados via PCR (Reação em Cadeia
da Polimerase), também foram denominados “STMS – Sítios de Microssatélites
Marcados por Seqüências” e constituem a classe mais polimórfica de marcadores
moleculares disponíveis hoje, podendo ser rapidamente isolados em bibliotecas
genômicas. Cada segmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo
diferente do mesmo loco (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998).
Os microssatélites, em sua maioria, são seqüências dinucleotídicas repetidas
(CA)
n
/(GT)
n
(STALLINGS, 1995). Microssatélites dinucleotídeos são encontrados
freqüentemente em mamíferos como ratos, camundongos, porcos, ovinos e seres
humanos e, menos freqüentemente, em bovinos (SUN e KIRKPATRICK, 1996).
Existem dois modelos que podem explicar as elevadas taxas de mutação nos
microssatélites: crossing-over desigual entre as moléculas de DNA, resultando da
recombinação entre cromossomos homólogos que não foram alinhados
corretamente e o mecanismo do slippage durante a replicação do DNA, que é o mais
aceito atualmente, ocorrendo em regiões do DNA que contêm seqüências curtas
repetidas em tandem, ocasionado por uma elevada taxa de erros de pareamento
decorrentes do escorregamento da fita durante a replicação do DNA (EISEN, 1999).
Muitos locos de microssatélites estão localizados entre genes ou dentro de
íntrons, sendo extremamente abundantes (ENGEL et al., 1996). Entretanto, apesar
de muito raros nas regiões codificadoras, no genoma humano são encontrados
alguns tipos de repetições trinucleotídicas, que estão associadas a genes de
doenças como a Síndrome do X-Frágil e a Corea de Huntington (RUBINSZTEIN et
al., 1995).
Devido à distribuição preferencial nas regiões não codificadoras, os
microssatélites podem não sofrer ação da seleção natural (LI et al., 2002), o que os
torna um marcador seletivamente neutro muito útil para estudos da genética de
populações naturais (GONELA, 2003). No entanto, alguns estudos demonstram que
eles podem apresentar papel funcional com elementos codificantes ou reguladores,
mostrando que a utilidade dos microssatélites vai além do papel de marcadores para
estudos de genética de populações, relações evolutivas e mapeamento gênico.
11
Deste modo, um loco poderia mostrar um desvio da neutralidade se o microssatélite
estivesse ligado a uma região genômica a qual é alvo da seleção natural
(MACHADO, 2003 apud GONELA, 2003).
Devido a sua expressão codominante e ao multialelismo, os microssatélites
são os marcadores que apresentam o mais elevado conteúdo de informação de
polimorfismo (PIC) e, por isso, qualquer população segregante pode ser utilizada
como população referência para estudos de ligação e mapeamento, não sendo mais
necessário fazer a escolha da população com base na maximização da distância
genética, e sim visando a população mais informativa do ponto de vista das
características biológicas ou econômicas de interesse (FERREIRA e
GRATTAPAGLIA, 1998).
A descoberta de que locos de microssatélites dinucleotídeos são conservados
através dos genomas de mamíferos (SUN e KIRKPATRICK, 1996) indicou que
iniciadores desenvolvidos para amplificar repetições em uma espécie podem
amplificar locos em outras espécies. A utilização de iniciadores heterólogos
(amplificam dentro de um mesmo gênero, família ou ordem) pode eliminar tempo e
despesas envolvidos no isolamento de marcadores microssatélites para cada
espécie de interesse tais como, construção de biblioteca genômica de DNA,
seqüenciamento do DNA e determinação dos iniciadores (ENGEL et al., 1996).
Dentro da ordem Artiodactyla existem exemplos da utilização de iniciadores
heterólogos amplificando em diferentes espécies, assim como em outros taxa como
primatas e tartarugas (GONELA, 2003).
A utilização dos microssatélites tem aumentado significativamente em estudos
sobre comparações da variabilidade genética entre espécies e populações, história
evolutiva e estrutura populacional (ENGEL et al., 1996; GEMMELL et al., 1997;
SLATE et al., 1998; MARTÍNEZ et al., 2000; GONGORA et al., 2002; LOWDEN et
al., 2002).
1.4 EXEMPLOS DE UTILIZAÇÕES DE MARCADORES MOLECULARES EM
ARTIODACTYLA
Os marcadores microssatélites estão sendo amplamente utilizados em
rebanhos de artiodátilos de interesse econômico como bovinos, caprinos e suínos,
12
para avaliar a variabilidade genética, especialmente para fins de melhoramento e em
outros artiodátilos, como cervídeos e taiassuídeos, para estudos de estrutura
populacional e conservação.
Dentre os artiodátilos de interesse econômico, trabalhos com bovinos como o
realizado por CURI (2000), no qual o objetivo principal foi a realização de testes de
paternidade em animais da raça Gir, por meio da amplificação de regiões
microssatélites do DNA. No experimento foram utilizadas amostras de sangue de
quarenta famílias de animais da raça Gir, puros de origem e nove seqüências
iniciadoras recomendadas, para testes de paternidade em bovinos, pela Sociedade
Internacional de Genética Animal (ISAG). Para a população estudada, somente dois
dos nove microssatélites utilizados apresentaram alto polimorfismo e,
conseqüentemente, probabilidades de exclusão (PE) adequadas para se proceder a
um teste de paternidade. Além disso, a probabilidade de exclusão combinada (PEC)
de 0,9789 não atingiu o valor considerado como adequado para Testes de
Paternidade (0,99). Portanto, outros marcadores microssatélites devem ser
adicionados para se atingir a PEC pretendida.
SLATE et al. (1998) testaram 174 primers de microssatélites bovinos em duas
espécies de cervídeos – Cervus elaphus e Cervus nippon – e em uma espécie de
carneiro, Ovis aries. Neste, 73,4% dos marcadores apresentaram produtos de
amplificação sendo 42,5% polimórficos. Em C. elaphus, 74,1% dos marcadores
amplificaram e destes, 55,8% apresentaram-se polimórficos, ao passo que em C.
nippon, 73,7% apresentaram produtos, sendo 37,3% polimórficos. Os resultados
mostraram que a proporção dos locos microssatélites de bovinos conservados entre
as espécies de Artiodactyla foi significativamente maior neste trabalho do que nos
previamente relatados, tal como em ENGEL et al. (1996).
Os dados de MARTÍNEZ et al. (2000), utilizando 25 locos de microssatélites
na determinação da estrutura genética de nove variedades de porco Ibérico (Sus
scrofa sp.), mostraram que todos os locos eram polimórficos e o número de alelos
variando de quatro a 20. A heterozigose por contagem direta (H), variou de 0,028 a
0,736 e a diversidade para todos os animais (H
T
), de 0,055 a 0,9071. Desvios
significativos do equilíbrio de Hardy-Weinberg foram observados em 19 locos em
toda a amostra, porém, dentro das variedades, os desvios foram muito baixos. Os
resultados indicaram que os porcos Ibéricos apresentavam alto grau de diversidade
13
genética através dos locos microssatélites. Os valores de Fst
indicaram subdivisão
da população devido à deriva ou efeito gargalo de garrafa através do isolamento
reprodutivo de populações pequenas. A árvore individual mostra não somente que
os animais foram corretamente classificados, mas também sustentam a separação
em três grupos tradicionais de porcos Ibéricos (vermelho, preto e pintado). Já a
árvore neighbour-joining não estabeleceu claramente a topologia entre as
variedades. Os resultados mostraram, portanto, o potencial uso dos microssatélites
para estudos de biodiversidade em porcos e revelaram uma clara diferenciação
entre populações.
1.5 EXEMPLOS DE UTILIZAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES NA
FAMÍLIA TAYASSUIDAE
Devido à necessidade de desenvolvimento de iniciadores espécie-específicos
para análises com microssatélites, estudos com estes marcadores na família
Tayassuidae são escassos. Porém, este problema está sendo solucionado com a
descoberta de que locos microssatélites são conservados através dos genomas de
mamíferos (MOORE et al., 1991), conforme comentários anteriormente expressados.
Desta forma, tem sido mostrado que a amplificação heteróloga de locos
microssatélites de porco doméstico, Sus scrofa domestica, está correspondendo
satisfatoriamente em T. tajacu (LOWDEN et al., 2002; GONGORA et al., 2002) e T.
pecari (GONELA, 2003).
LOWDEN et al. (2002) utilizaram 31 primers de microssatélites de porco
doméstico em sete espécies de porcos selvagens, dentre elas, T. tajacu, na qual
sete primers amplificaram e o número de alelos variou de um a três.
GONGORA et al. (2002) avaliaram a amplificação interespecífica de
marcadores microssatélites utilizando primers de porco em T. tajacu. Dezoito primers
foram testados em seis indivíduos de T. tajacu, sendo que dezesseis amplificaram
com sucesso. Isso sugere, relativamente, baixo nível de divergência nucleotídica
entre estas linhagens. Os microssatélites de porco doméstico prometem ser de uso
considerável em estudos populacionais e filogenéticos de taiassuídeos.
GONELA (2003) trabalhou com seis locos microssatélites de porco doméstico
em queixada (T. pecari) e porco monteiro (Sus scrofa sp). Em uma das análises
14
concluiu que iniciadores desenvolvidos para Sus scrofa domestica podem ser
utilizados com sucesso em Tayassu pecari, sendo altamente informativos e podendo
ser úteis nas análises populacionais, estudos filogenéticos e, posteriormente, no
melhoramento genético. Entre os seis locos analisados, quatro foram polimórficos
(66,7%). Porém, quando se trabalha com iniciadores heterólogos é de se esperar
que haja uma redução no número de alelos observados, podendo variar de drástica
a suave. No caso específico deste trabalho, em cinco locos foi observada uma
redução drástica (mais de 50%) no número de alelos, sendo que a única exceção foi
observada em um loco, no qual houve redução de apenas um alelo. Esse fato pode
ter duas explicações. A primeira estaria relacionada ao comportamento de T. pecari,
o qual necessita de uma vasta área para sobreviver e os indivíduos de um bando
não cruzam com os de outro bando, o que pode favorecer a endogamia e efeito do
fundador. A segunda estaria relacionada à presença de alelos nulos
1
, já registrada
em muitas espécies (JONES et al., 1998 apud GONELA, 2003).
A presença de alelos nulos poderá ocorrer em homozigose e, neste caso,
será confundida com falha na PCR (ausência do produto da PCR). Quando ocorrer
em heterozigose, os heterozigotos poderão aparecer como homozigotos, implicando
em excesso de homozigotos na população, o que poderá causar erros nas análises
estatísticas que dependem das freqüências alélicas (CALLEN et al., 1993; ENGEL et
al., 1996).
Em outra análise, GONELA (2003) estimou as freqüências alélicas dos
mesmos seis locos microssatélites em Sus scrofa sp e Tayassu pecari, observando
uma considerável variação na distribuição das freqüências alélicas entre os locos
microssatélites. A distribuição das freqüências de cada microssatélite em cada
espécie foi significativamente diferente. Em quatro locos, os alelos observados foram
típicos para cada espécie, ou seja, eles identificaram claramente as duas espécies.
Para Sus scrofa sp o número médio de alelos por loco (Na) foi de 4,67, a proporção
de locos polimórficos (P) foi igual a 1,00, a heterozigose média observada (
H
o) foi
de 0,52 ± 0,09, a heterozigose média esperada (
H
e) foi de 0,50 ± 0,09, F
is
e índice
de fixação de Wright (F) foi de -0,04 e -0,11, respectivamente. Já para Tayassu
1
Segundo CALLEN et al. (1993), alelo nulo seria qualquer mutação que ocorre na seqüência
de DNA complementar do oligonucleotídeo iniciador, que pode impedi-lo de ligar-se, resultando em
redução ou perda completa de produto.
15
pecari, o número médio de alelos por loco (Na) foi de 3,17, a proporção de locos
polimórficos (P) foi igual a 0,67, a heterozigose média observada (
H
o) foi de 0,35 ±
0,04, a heterozigose média esperada (
H
e) foi de 0,34 ± 0,04, F
IS
e índice de fixação
de Wright (F) foram de -0,02 e -0,03, respectivamente.
Estes resultados indicaram a conservação das regiões de microssatélites
entre genomas de mamíferos e demonstraram a viabilidade da utilização de
iniciadores desenvolvidos para Sus scrofa domestica na análise de outras espécies
da subordem Suiformes.
THEIMER e KEIM (1998), baseando-se em outro tipo de marcador molecular
– seqüências de citocromo b de DNA mitocondrial –, estudaram as relações
filogenéticas dos taiassuídeos comparando 1.047 pares de bases das três espécies
existentes de taiassuídeos (Catagonus wagneri, Tayassu pecari e Pecari tajacu,
sinônimo de Tayassu tajacu), tendo como grupo de fora três espécies de suínos
(Sus scrofa domestica, Phacochoerus aethiopicus e Babyrousa babyrousa). A
análise filogenética, usando a parcimônia e probabilidade máxima, resultou em
árvores que colocaram Catagonus wagneri e Tayassu pecari num clado separado de
Pecari tajacu. Estimativas do tempo de divergência, baseadas em citocromo b,
sugerem que Tayassu e Catagonus divergiram no antigo Plioceno, talvez
concomitantemente com a invasão da América do Sul pelos taiassuídeos. A
divergência da linhagem de P. tajacu das outras duas espécies foi estimada em 3,4-
7,4 x 10
6
anos atrás, suportando a hipótese que estes dois clados divergiram na
América do Norte antes de cada um dos dois clados colonizarem a América do Sul.
Os resultados obtidos neste trabalho suportam a classificação das três espécies
existentes de taiassuídeos dentro de três gêneros: Pecari tajacu, Tayassu pecari e
Catagonus wagneri.
Um outro trabalho visando uma melhor compreensão da filogenia da família
Tayassuidae (GONGORA e MORAN, 2005), através da análise de seqüências de
DNA nuclear e mitocondrial, revelou que Catagonus wagneri e Tayassu pecari estão
mais relacionados entre si do que com Tayassu tajacu. Estes achados sustentam a
proposta de que esta espécie comporta um outro gênero dentro da família (Pecari
tajacu), corroborando com os resultados encontrados por THEIMER e KEIM (1998).
16
TELLES et al. (2003) avaliaram o padrão de amplificação de marcadores
RAPD em bandos de queixada (T. pecari) do Parque Nacional das Emas. Foram
amplificados com sucesso, 30 dos 40 primers testados, a partir do DNA de 18
indivíduos de dois bandos, fornecendo um total de 203 locos, com uma média de
sete locos por primer. Considerando os dois bandos analisados, cerca de 72% dos
locos foram polimórficos. A análise de variância molecular (AMOVA), para todos os
locos, mostrou que existe uma tendência de estruturação da variabilidade genética
dos bandos, com um Fst igual a 0,081 (p=0,07). Uma análise de coordenadas
principais confirma esses resultados, sugerindo que a espécie tende a formar
bandos que podem ser unidades reprodutivas.
17
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
• Visando orientações de manejo e reprodução em criadouros de espécies
silvestres, este trabalho objetivou caracterizar a variabilidade genética em
nível molecular das espécies Tayassu tajacu (cateto) e Tayassu pecari
(queixada) criadas em cativeiro utilizando marcadores moleculares
microssatélites.
2.2 ESPECÍFICOS
• Caracterizar os locos microssatélites quanto ao tamanho das regiões de
amplificação;
• Determinar os locos polimórficos, freqüências alélicas e genotípicas;
• Determinar os valores da Heterozigose Observada e Heterozigose Esperada
e Conteúdo de Informações Polimórficas (PIC);
• Verificar os valores de PEC (Probabilidade de Exclusão Combinada) com a
finalidade de determinação de paternidade;
• Analisar a estrutura populacional e fluxo gênico entre elas.
18
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 AMOSTRA
A amostra foi composta por 49 catetos (24 machos e 25 fêmeas) e 25
queixadas (16 machos e 9 fêmeas), todos criados em cativeiro. Deste total, 12
catetos foram coletados no criadouro da Fazenda da Praia, localizada no município
de Tibagi, Paraná (BR 376, Km 454), cinco catetos e 14 queixadas no Parque
Municipal das Araucárias, na cidade de Guarapuava, Paraná e 32 catetos e 11
queixadas na Fazenda Experimental Gralha Azul (PUC-PR), localizada no município
de Fazenda Rio Grande, região metropolitana de Curitiba (tabela 1).
TABELA 1 – ESPÉCIES, NÚMERO DE INDIVÍDUOS, SEXO E LOCALIDADES DOS EXEMPLARES
DE PORCOS-DO-MATO
TAXA MACHOS FÊMEAS TOTAL LOCALIDADE
Tayassu tajacu
7 5 12 Tibagi/PR
3 2 5 Guarapuava/PR
14 18 32 Fazenda Rio Grande/PR
Tayassu pecari
11 3 14 Guarapuava/PR
5 6 11 Fazenda Rio Grande/PR
De cada animal foi coletado aproximadamente 3 mL de sangue em seringa
esterilizada contendo o anticoagulante EDTA. Após a coleta, o sangue foi
armazenado a –20°C em tubos de microcentrífuga de 1 ,5 mL.
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Citogenética Animal, no
Departamento de Genética da Universidade Federal do Paraná.
3.2 EXTRAÇÃO DE DNA
A extração de DNA das amostras coletadas foi realizada através do método
salting out, segundo o protocolo descrito por MEDRANO, AESEN e SHARROW
(1990), que consistiu em:
- colocar 300 a 400 µL de sangue em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL;
- adicionar 800 µL de STE (NaCl 5 M, Tris 1 M; EDTA 0,5 M) e centrifugar durante 5
minutos a 8000 rpm;
19
- descartar o sobrenadante, adicionar 800 µL de STE com 11 µL de TRITON e
centrifugar durante 5 minutos a 8000 rpm;
- descartar o sobrenadante, adicionar 500 µl de STE e centrifugar durante 5 minutos
a 8000 rpm;
- retirar bem o STE e adicionar na seqüência:
- 550 µL solução de lise (NaCl 100 mM, Tris 50 mM, EDTA 50 mM, pH=8,0), 27,5 µL
de SDS 20%, 2,5 µL de β-mercaptofenol 2%, 11 µL de proteinase K e agitar;
- colocar em banho-maria a 55°C por 2 horas, adicionando-se 5,5 µL de RNAse-A
uma hora antes de tirar os tubos do banho-maria;
- retirar do banho-maria, adicionar 600 µL de NaCl a 5 M e passar no agitador por 20
segundos;
- centrifugar por 30 minutos a 13000 rpm e transferir o sobrenadante para três tubos
de microcentrífuga de 1,5 mL deixando 390 µL do material em cada tubo;
- adicionar 700 µL de etanol absoluto e gelado (-20°C) em cada tubo e deixar
overnight, em geladeira a 4°C;
- centrifugar por 30 minutos a 13000 rpm;
- descartar o sobrenadante e lavar o DNA com 700 µL de etanol a 70%;
- centrifugar por 5 minutos a 13000 rpm, descartando o sobrenadante;
- repetir as duas etapas anteriores;
- descartar o sobrenadante e inverter o tubo aberto em papel absorvente para retirar
todo o etanol;
- colocar os tubos em estufa a 37°C por 30 minutos;
- adicionar 30 µL de TE (Tris 10 mM e EDTA 1 mM, pH=8,0) e deixar em banho-
maria a 37°C por 30 minutos para que o DNA fique em suspensão;
- juntar a suspensão de DNA em um único tubo de microcentrífuga e estocar a -
20°C.
3.3 QUANTIFICAÇÃO E TESTE DE QUALIDADE DO DNA EXTRAÍDO
A integridade das moléculas de DNA foi verificada através de eletroforese em
gel de agarose 0,8% em TBE 1X (Tris 0,089 M, ácido bórico 0,089 M e EDTA 0,5 M),
por 30 minutos a 3 V/cm, com aplicação de 3 a 5
µL de DNA total com 1 µL de azul
20
de bromofenol 3%. A detecção de bandas de alto peso molecular foi evidenciada
através de coloração com brometo de etídeo 0,5 µL/mL em água destilada durante
15 minutos (solução estoque 10 µL/mL) e visualizadas sob luz UV.
As amostras que apresentaram banda de alto peso molecular foram
quantificadas em espectrofotômetro (Gene Quant pro, Amersham Pharmacia
Biotech), para verificação de densidade ótica em ng/µL. A espectrofotometria de
massa mostrou uma boa quantidade de DNA extraído, sendo que as amostras
iniciais de DNA apresentaram concentrações semelhantes e em quantidade
suficiente (cerca de 80 ng/µL). As amostras de DNA foram estocadas em tubos de
microcentrífuga de 1,5 mL e armazenadas em geladeira à temperatura de 4
o
C, até o
momento da diluição.
3.4 DILUIÇÃO DO DNA EXTRAÍDO
As amostras iniciais de DNA foram diluídas em água Mili-Q autoclavada a fim
de se obter amostras de DNA de trabalho, de concentração aproximada de 20 ng/µL.
Após diluição, as amostras de DNA foram estocadas em tubos de microcentrífuga de
0,6 mL e armazenadas a –20
o
C, até o momento da amplificação.
3.5 REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO DOS LOCOS MICROSSATÉLITES
Dos 17 oligonucleotídeos iniciadores de porco doméstico (Sus scrofa
domestica) escolhidos para a realização deste trabalho conseguiu-se, após vários
testes, padronizar as condições de amplificação, tanto para T. tajacu quanto para T.
pecari, para seis deles: SW1408, SW1407, SW857, SW2411, ACTG2 e SW444. Os
demais locos foram descartados ou por não apresentarem um padrão de bandas
que permitisse identificar a região microssatélite de interesse (S0008, SW2435,
SWR1928 e S0086) ou por não ter havido tempo hábil para testá-los (SW378,
SW1416, SW335, CGA, IGF-1, TNFB e ALOX12A).
Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados no presente trabalho foram objetos
de dois processos distintos de escolhas. Um deles, envolvendo quatro pares de
iniciadores (tabela 2), teve por base comparações de bandeamento cromossômico
21
G, utilizando-se os de T. tajacu (cateto), T. pecari (queixada) e Sus scrofa scrofa
(javali) e identificadas as regiões de homeologia entre eles. Por ser uma subespécie
do porco doméstico, o javali possui o cariótipo muito semelhante ao do suíno
doméstico permitindo, portanto, este tipo de comparação. O material cromossômico
das duas espécies de porcos-do-mato faz parte da amostra do presente trabalho,
enquanto que a do javali é do acervo do Laboratório de Citogenética Animal da
Universidade Federal do Paraná (UFPR). Uma vez determinada esta homeologia,
recorreu-se a um banco de dados localizado no endereço eletrônico
http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/panel.htm (2003), no qual encontram-se as
distribuições dos microssatélites ao longo do genoma do porco doméstico e
escolheram-se os pares de iniciadores microssatélites localizados nos cromossomos
que correspondiam às regiões homeólogas determinadas. Com este tipo de escolha,
aumentam-se as chances de amplificação positiva nas duas espécies de
taiassuídeos em estudo.
TABELA 2 – SEQÜÊNCIA DOS QUATRO LOCOS MICROSSATÉLITES ESCOLHIDOS ATRAVÉS
DE COMPARAÇÕES DE BANDAS G – REGIÕES HOMEÓLOGAS – ENTRE Sus
scrofa scrofa (javali), Tayassu tajacu E Tayassu pecari E LOCALIZAÇÃO NOS
CROMOSSOMOS DE Sus scrofa domestica
LOCO SEQÜÊNCIA DO INICIADOR CROMOSSOMO
SW1408
Primer F: CAGCCCTGTCACTTGAGTAGC
Primer R: TTCTGCTCTACAGCAAAGCG
2
SW1407
Primer F: AGCCACTAGGGAACTTCAAATG
Primer R: CCCACTTTTTCTCTCAAGCTG
13
SW857
Primer F: TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACC
Primer R: GATCCTCCTCCAAATCCCAT
14
SW2411
Primer F: CCTGGACTCATTCTTGCTTTG
Primer R: TTCCTATTCTGTCCTGCCTTG
16
NOTA: Primer F = primer forward; Primer R = primer reverse
Pelo outro procedimento de escolha, os dois pares de oligonucleotídeos
iniciadores restantes, também de porco doméstico, teve por base os iniciadores
utilizados por GONELA (2003) em T. pecari (tabela 3).
TABELA 3 – SEQÜÊNCIA DOS DOIS LOCOS MICROSSATÉLITES UTILIZADOS POR GONELA
(2003) E LOCALIZAÇÃO NOS CROMOSSOMOS DE Sus scrofa domestica
22
LOCO SEQÜÊNCIA DO INICIADOR CROMOSSOMO
ACTG2
Primer F: CATCTTCCTCTTCCCTTCCC
Primer R: TGTGGACTCAAGGCTGTAAGC
3
SW444
Primer F: ATAGTTTCGGTTGGCCCAG
Primer R: CTTAAGCCTCAAGCTAACAGGC
8
As condições de amplificação de cada loco foram as mesmas para as duas
espécies. Para todos os locos, a reação de amplificação foi feita em um volume final
de 15 µL utilizando-se 1,0 µM de cada iniciador (primer); 1X Tampão Sulfato (670
mM Tris-HCl pH=8,8; 160 mM (NH4)
2
SO
4
; Tween 0,1% (p/v)); 200 µM de cada dNTP
e 0,75 U de Taq DNA polimerase. A concentração de Cloreto de Magnésio, a
quantidade de DNA e a temperatura de hibridação dos iniciadores variaram
conforme o loco (tabela 4). Em três deles (SW1407, SW857 e SW2411) as
condições de amplificação consistiram de cinco passos: (1) desnaturação inicial da
fita dupla a 95
o
C por 5 minutos; (2) desnaturação a 95
o
C por 30 segundos; (3)
hibridação dos iniciadores entre 58
o
C e 62
o
C, dependendo da constituição dos
mesmos, por 40 segundos; (4) extensão a 72
o
C por 40 segundos e (5) extensão final
a 72
o
C por 10 minutos. Os passos 2, 3 e 4, constituem um ciclo, que foi repetido por
35 vezes. Já para os locos SW1408, ACTG2 e SW444 houve a necessidade de
submetê-los a decréscimos de temperatura de hibridação denominado touchdown
que consiste nos seguintes passos: (1) desnaturação inicial da fita dupla a 94
o
C por
5 minutos; (2) desnaturação a 94
o
C por 30 segundos; (3) hibridação do iniciador de
62
o
C a 54°C diminuindo um grau a cada ciclo até chegar em 54°C, por 30 segundos;
(4) extensão a 72
o
C por 40 segundos. Os passos 2, 3 e 4 são repetidos 22 vezes
após atingida a temperatura de 54°C e (5) extensão final a 72
o
C por 10 minutos.
Durante a realização das amplificações, tomou-se o cuidado de sempre
amplificar juntamente com as amostras de T. tajacu e T. pecari um exemplar de Sus
scrofa domestica para controle positivo da reação.
23
TABELA 4 – CONCENTRAÇÃO DE CLORETO DE MAGNÉSIO (MgCl
2
), QUANTIDADE DE DNA E
TEMPERATURA DE HIBRIDAÇÃO DOS INICIADORES UTILIZADAS PARA OS
DIFERENTES LOCOS
Loco
MgCl
2
(mM) DNA (ng) T°C
SW1408
3,0 100 62 a 54
SW1407 1,5 50 60
SW857 1,5 60 62
SW2411 3,0 50 58
ACTG2 2,0 50 62 a 54
SW444 2,0 100 62 a 54
Os seis locos microssatélites padronizados amplificaram em toda a amostra
de T. tajacu e T. pecari, exceto os locos SW1408 e SW2411 que não amplificaram
em 12% e 2%, respectivamente, na amostra de T. tajacu. Em ambos os casos foram
feitas repetições aumentando-se a quantidade de DNA na reação. Esta falha na
amplificação provavelmente se deve à baixa qualidade/quantidade de DNA extraído
destes indivíduos.
Comparando-se as condições de amplificação obtidas para catetos e queixadas com
as descritas na literatura para porco doméstico, observou-se que as temperaturas de
hibridação foram idênticas nas três espécies para os locos SW1407 (60°C) e
SW2411 (58°C); aumentou em dois graus para o loco SW857 em catetos e
queixadas e para os demais locos, que foram submetidos à reação touchdown, as
temperaturas descritas para porco doméstico estiveram presentes (60°C para o loco
SW1408, 58°C para o loco ACTG2 e 60°C para o loco S W444).
3.6 VISUALIZAÇÃO DOS PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO
Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de
poliacrilamida, a fim de determinar a qualidade do produto gerado em cada indivíduo
e, posteriormente, para tipagem dos locos microssatélites. Para tais finalidades, foi
utilizado gel de poliacrilamida nativo (não desnaturante) 10% em placas de 23 cm X
25 cm.
Após a polimerização, os poços foram lavados com água destilada para retirar
o excesso de solução não polimerizada de poliacrilamida. Na seqüência, o gel foi
fixado em cuba vertical contendo tampão TBE 1X e os produtos de amplificação
24
foram aplicados juntamente com corante azul de bromofenol, na proporção de 7 µL
de produto de PCR para 5 µL de corante. A eletroforese foi realizada durante 4
horas a 300 V e 40 mA.
Terminada a eletroforese, o gel foi fixado em solução de etanol 10% e ácido
acético 0,5% por 3 minutos e, em seguida, impregnado em solução de nitrato de
prata 0,2%. Após esta etapa, o gel foi revelado em solução de hidróxido de sódio
2,75% e formaldeído 1% e fixado novamente em solução fixadora por 5 minutos.
Após este processo, o gel foi conservado entre folhas de papel celofane
(TEGELSTROM, 1992, com modificações).
O tamanho dos alelos foi determinado pela comparação com marcador de
peso molecular (Ladder) de 25 pb (Invitrogen).
3.7 ANÁLISE DOS DADOS
A partir do padrão de bandas obtido para cada loco de microssatélites foram
calculados os índices de diversidade em cada população estudada. A variabilidade
genética foi estimada através de uma estatística descritiva que determinou o número
de locos polimórficos, número de alelos por loco, heterozigose observada (H
o
) e
esperada (H
e
) através do programa GDA (Genetic Data Analysis, LEWIS e ZAYKIN,
2001). A heterozigose observada (H
o
) é uma medida da variabilidade genética das
populações e reflete a quantidade de indivíduos heterozigotos para um determinado
loco. A heterozigose esperada (H
e
) é a medida que reflete a quantidade de
indivíduos heterozigotos que é esperada de acordo com o equilíbrio de Hardy-
Weinberg.
Para testar os desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg em cada loco nas
duas espécies de porcos-do-mato, foi utilizado o teste exato de Fisher, através do
método de embaralhamento de alelos (20.000 shufflings) utilizando o programa GDA
(LEWIS e ZAYKIN, 2001).
Para determinar a diferenciação entre as populações e entre as espécies foi
usada a estatística F (WRIGHT, 1951) através da estimativa Fst (WEIR e
COCKERHAM, 1984) a partir da Análise da Variância Molecular, AMOVA
(EXCOFFIER, SMOUSE e QUATTRO, 1992), utilizando o Programa ARLEQUIN 2.1
(SCHNEIDER et al., 2000). A análise dos valores de Fst foi feita considerando-se a
25
classificação de NEI (1978) apud GIACOMONI (2002) onde: valores de Fst menores
que 0,05 são considerados baixos, entre 0,05 e 0,15 são médios e maiores que 0,15
são considerados altos, indicando estruturação populacional baixa, média e alta,
respectivamente. Para avaliar o efeito do endocruzamento sobre os desvios do
equilíbrio de Hardy-Weinberg, foi calculado o Fis (WRIGHT, 1951) utilizando o
programa GDA (LEWIS e ZAYKIN, 2001), sendo este programa também utilizado
para o cálculo da distância genética entre populações (NEI, 1972) e das freqüências
alélicas. Com o auxílio do programa NTSYSpc 2.1 (RHOLF, 2000) os valores das
distâncias foram utilizados na construção de um dendrograma, empregando-se o
método UPGMA (SNEATH e SOKAL, 1973), bem como os valores da correlação
cofenética. A confiabilidade dos nós foi testada a partir do procedimento de
reamostragem (10000 bootstraps) através do programa BOOD 3.03 (COELHO,
2000).
O conteúdo de informações polimórficas (PIC) para um determinado marcador
refere-se à parcela da progênie na qual é possível determinar, exatamente, de qual
progenitor os alelos provieram. O PIC é dependente do número de alelos por loco e
da distribuição das freqüências desses alelos na amostra. De acordo com
BOTSTEIN et al. (1980) os valores de PIC são classificados em três níveis: a)
altamente informativo (PIC>0,5); b) moderadamente informativo (0,5>PIC>0,25) e c)
pouco informativo (PIC<0,25).
Os alelos nulos são originados por uma mutação no sítio de hibridação de
pelo menos um dos oligonucleotídeos iniciadores do microssatélite a ser amplificado.
Este fato leva à detecção de um excesso de aparentes homozigotos, resultando em
estimativas incorretas de freqüências alélicas, superestimando coeficientes de
endocruzamento. A freqüência estimada de alelos nulos é calculada usando um
algoritmo interativo baseado na diferença entre homozigotos esperados e
observados (SUMMERS e AMOS, 1997 apud MARSHALL et al., 1998). Segundo
MARSHALL et al. (1998), na ausência do alelo nulo, a freqüência estimada será
próxima de zero ou até mesmo negativa.
A probabilidade de exclusão (PE) representa a probabilidade de um animal,
aleatoriamente escolhido, não ser o pai/mãe de um determinado filhote. A PE é
dependente do número de alelos por loco e da distribuição das freqüências desses
alelos na amostra. A PE 1 é a probabilidade de exclusão quando não se conhece os
26
pais e a PE 2 é a probabilidade de exclusão quando um dos pais é conhecido. Já a
probabilidade de exclusão combinada (PEC) representa a probabilidade de, através
de um conjunto de locos, excluir um animal aleatoriamente escolhido, da
paternidade/maternidade de um filhote (CURI, 2000).
O conteúdo de informações polimórficas (PIC), a freqüência estimada de
alelos nulos e as probabilidades de exclusão de paternidade foram calculados
utilizando o programa CERVUS 2.0 (MARSHALL et al., 1998).
27
4 RESULTADOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DOS LOCOS MICROSSATÉLITES
4.1.1 Regiões de Amplificação
O tamanho dos fragmentos amplificados dos seis locos microssatélites em
Tayassu tajacu e Tayassu pecari são evidenciados na tabela 5, na qual contém,
além destes, dados da literatura referentes aos tamanhos de fragmentos em Sus
scrofa domestica.
TABELA 5 – COMPARAÇÃO ENTRE O TAMANHO DOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS EM
PARES DE BASE ENCONTRADOS EM Sus scrofa domestica, Tayassu tajacu E
Tayassu pecari
TAMANHO DOS FRAGMENTOS ENCONTRADOS (pb)
LOCO
Sus scrofa domestica T. tajacu T. pecari
(a) (b) (b)
SW1408 179 – 189 124 – 158 130 – 138
SW1407 138 – 178 112 114
SW857 145 – 159 128 – 156 130 – 140
SW2411 194 – 216 189 – 207 186 – 228
ACTG2 109 – 142 120 – 162 118 – 134
SW444 92 – 124 103 – 115 98 – 106
FONTES: http://www.animalgenome.org/pig.html; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
NOTAS: a) dados da literatura; b) dados do presente trabalho.
Em T. tajacu, analisando os seis locos, foram encontrados 52 alelos variando
de 103pb (SW444) a 207pb (SW2411). Já em T. pecari, foram encontrados 30 alelos
diferentes, variando de 98pb (SW444) a 228pb (SW2411).
4.1.2 Locos Polimórficos, Freqüências Alélicas e Genotípicas
4.1.2.1 Locos polimórficos
A análise dos seis marcadores para verificar a variabilidade genética nas duas
espécies de porcos-do-mato, revelou as presenças de um loco monomórfico
28
(SW1407) e cinco polimórficos (83%) em ambas. O monomórfico apresentou
fragmentos de 112pb em T. tajacu e 114pb em T. pecari (Anexo 2).
Na tabela 6 observa-se, considerando-se apenas os locos polimórficos, que a
amostra de T. tajacu apresentou 51 alelos e T. pecari , 29.
TABELA 6 – LOCOS POLIMÓRFICOS, NÚMERO DE ALELOS E AMOSTRA ANALISADA NAS
DUAS ESPÉCIES DE PORCOS-DO-MATO
N° DE ALELOS N (AMOSTRA) LOCOS
T. tajacu T. pecari T. tajacu T. pecari
SW1408 11 4 43 25
SW857 13 5 49 25
SW2411 4 10 48 25
ACTG2 16 7 49 25
SW444 7 3 49 25
TOTAL 51 29
4.1.2.2 Freqüências alélicas e genotípicas
a) Loco SW1408
A distribuição das freqüências alélicas neste loco (tabela 7) foi mais homogênea
em catetos (0,0116 a 0,2326) que em queixadas (0,04 a 0,56), havendo uma tendência
à fixação do alelo de 132pb em queixadas. Em catetos, os genótipos mais freqüentes
foram 126/126pb e 158/158pb (gráfico 1) e, em queixadas, 132/132pb (gráfico 2). Um
fato interessante observado foi o compartilhamento dos alelos de 130pb, 132pb e
136pb deste loco entre as duas espécies de porcos-do-mato. Alguns padrões de
bandas deste loco em T. tajacu e T. pecari são apresentados no Anexo 2.
29
TABELA 7 – LOCO SW1408 – ALELOS E SUAS RESPECTIVAS FREQÜÊNCIAS EM T. tajacu E T.
pecari
ALELOS (pb)
T. tajacu T. pecari
124 0,0930
126 0,2326
128 0,0116
130 0,0814 0,2800
132 0,1279 0,5600
134 0,1395
136 0,0116 0,0400
138 0,1200
150 0,0233
154 0,0814
156 0,0233
158 0,1744
GRÁFICO 1 – NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO LOCO SW1408 EM T.
tajacu
Loco SW1408
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
4
/
1
2
4
1
2
6
/
1
2
6
1
2
6
/
1
3
0
1
2
6
/
1
3
2
1
2
6
/
1
3
4
1
2
8
/
1
3
6
1
3
0
/
1
3
0
1
3
0
/
1
3
4
1
3
2
/
1
3
2
1
3
4
/
1
3
4
1
5
0
/
1
5
0
1
5
4
/
1
5
4
1
5
4
/
1
5
8
1
5
6
/
1
5
6
1
5
8
/
1
5
8
Genótipos
Nº de indivíduos
30
GRÁFICO 2 – NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO LOCO SW1408 EM T.
pecari
b) Loco SW857
Este loco apresentou distribuição das freqüências alélicas (tabela 8) mais
homogênea em catetos (0,0102 a 0,2347) que em queixadas (0,04 a 0,36), não
havendo tendência à fixação de nenhum deles. Em catetos, os genótipos mais
freqüentes foram 130/152pb, 144/144pb e 144/148pb (gráfico 3) e, em queixadas,
130/130pb (gráfico 4). Um fato interessante observado foi o compartilhamento dos
alelos de 130pb, 136pb e 140pb deste loco entre as duas espécies de porcos-do-mato.
Alguns padrões de bandas deste loco em T. tajacu e T. pecari são apresentados no
Anexo 2.
Loco SW1408
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
130/
130
130/
136
132/
132
132/
138
Genótipos
Nº de indivíduos
31
TABELA 8 – LOCO SW857 – ALELOS E SUAS RESPECTIVAS FREQÜÊNCIAS EM T. tajacu E T.
pecari
ALELOS (pb)
T. tajacu T. pecari
128 0,0204
130 0,0918 0,3600
132 0,3000
134 0,1800
136 0,0612 0,1200
138 0,0204
140 0,0612 0,0400
142 0,0612
144 0,2347
146 0,0816
148 0,0918
150 0,1327
152 0,1020
154 0,0306
156 0,0102
GRÁFICO 3 – NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO LOCO SW857 EM T.
tajacu
Loco SW857
0
1
2
3
4
5
1
2
8
/
1
2
8
1
3
0
/
1
3
0
1
3
0
/
1
4
4
1
3
0
/
1
5
2
1
3
6
/
1
3
6
1
3
6
/
1
4
0
1
3
6
/
1
4
2
1
3
6
/
1
4
6
1
3
6
/
1
5
0
1
3
8
/
1
4
4
1
4
0
/
1
4
4
1
4
0
/
1
4
6
1
4
0
/
1
5
2
1
4
2
/
1
4
2
1
4
2
/
1
4
4
1
4
2
/
1
5
0
1
4
4
/
1
4
4
1
4
4
/
1
4
8
1
4
4
/
1
5
0
1
4
4
/
1
5
2
1
4
6
/
1
4
6
1
4
6
/
1
5
2
1
4
6
/
1
5
4
1
4
8
/
1
4
8
1
4
8
/
1
5
2
1
4
8
/
1
5
4
1
5
0
/
1
5
0
1
5
0
/
1
5
6
Genótipos
Nº de indivíduos
32
GRÁFICO 4 – NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO LOCO SW857 EM T.
pecari
c) Loco SW2411
A distribuição das freqüências alélicas observadas neste loco (tabela 9) foi mais
homogênea em queixadas (0,02 a 0,22) que em catetos (0,0208 a 0,5833), havendo
tendência à fixação do alelo de 207pb. Em catetos, o genótipo mais freqüente foi
207/207pb (gráfico 5) e, em queixadas, 222/222pb (gráfico 6). Alguns padrões de
bandas deste loco em T. tajacu e T. pecari são apresentados no Anexo 2.
Loco SW857
0
1
2
3
4
5
6
7
8
130/
130
130/
132
130/
134
132/
132
132/
136
134/
134
134/
140
Genótipos
Nº de indivíduos
33
TABELA 9 – LOCO SW2411 – ALELOS E SUAS RESPECTIVAS FREQÜÊNCIAS EM T. tajacu E T.
pecari
ALELOS (pb)
T. tajacu T. pecari
186 0,0400
188 0,2000
189 0,0208
196 0,0800
198 0,1400
200 0,1200
203 0,1250
205 0,2708
207 0,5833
212 0,0200
220 0,0600
222 0,2200
224 0,1000
228 0,0200
GRÁFICO 5 – NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO LOCO SW2411 EM T.
tajacu
Loco SW2411
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
189/
205
203/203
205/205
207/
207
Genótipos
Nº de indivíduos
34
GRÁFICO 6 – NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO LOCO SW2411 EM T.
pecari
d) Loco ACTG2
Este loco apresentou distribuição das freqüências alélicas (tabela 10) mais
homogênea em catetos (0,0102 a 0,1633) que em queixadas (0,2 a 0,66), sendo que o
alelo de 130pb tendeu à fixação em queixadas. Em catetos o genótipo mais freqüente
foi 120/120pb (gráfico 7) e, em queixadas, 130/130pb (gráfico 8). Um fato interessante
observado foi o compartilhamento dos alelos de 120pb, 132pb e 134pb deste loco entre
as duas espécies de porcos-do-mato. Alguns padrões de bandas deste loco em T.
tajacu e T. pecari são apresentados no Anexo 2.
Loco SW2411
0
1
2
3
4
5
1
86/1
9
6
1
88/1
8
8
1
88/1
9
8
1
88/2
0
0
1
88/2
2
0
1
88/2
2
2
1
96/2
2
2
1
98/1
9
8
1
98/2
2
4
2
00/2
0
0
2
00/2
2
0
2
12/2
2
4
2
20/2
2
8
2
22/2
2
2
2
24/2
2
4
Genótipos
Nº de indivíduos
35
TABELA 10 – LOCO ACTG2 – ALELOS E SUAS RESPECTIVAS FREQÜÊNCIAS EM T. tajacu E T.
pecari
ALELOS (pb)
T. tajacu T. pecari
118 0,0200
120 0,1633 0,1400
122 0,0800
124 0,0400
130 0,6600
132 0,0306 0,0400
134 0,0102 0,0200
138 0,0816
140 0,0204
142 0,0918
144 0,0102
146 0,0408
148 0,0306
150 0,0612
152 0,1224
154 0,0408
156 0,1020
158 0,0714
160 0,0306
162 0,0918
GRÁFICO 7 – NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO LOCO ACTG2 EM T.
tajacu
Loco ACTG2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
0
/
1
2
0
1
3
2
/
1
3
2
1
3
2
/
1
3
4
1
3
8
/
1
3
8
1
3
8
/
1
5
0
1
4
0
/
1
5
0
1
4
0
/
1
5
2
1
4
2
/
1
4
2
1
4
2
/
1
5
2
1
4
2
/
1
5
4
1
4
4
/
1
5
0
1
4
6
/
1
5
0
1
4
6
/
1
5
2
1
4
6
/
1
5
6
1
4
8
/
1
5
6
1
5
0
/
1
5
6
1
5
2
/
1
5
2
1
5
2
/
1
5
6
1
5
2
/
1
6
0
1
5
2
/
1
6
2
1
5
4
/
1
5
4
1
5
4
/
1
5
6
1
5
6
/
1
5
6
1
5
8
/
1
5
8
1
5
8
/
1
6
0
1
6
2
/
1
6
2
Genótipos
Nº de indivíduos
36
GRÁFICO 8 – NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO LOCO ACTG2 EM T.
pecari
e) Loco SW444
A distribuição das freqüências alélicas observadas neste loco (tabela 11) foi
mais homogênea em queixadas (0,16 a 0,56), com tendência à fixação do alelo de
98pb, que em catetos (0,0204 a 0,5918), havendo tendência à fixação do alelo de
107pb. Em catetos, o genótipo mais freqüente foi 107/107pb (gráfico 9) e, em
queixadas, 98/98pb (gráfico 10). Alguns padrões de bandas deste loco em T. tajacu
e T. pecari são apresentados no Anexo 2.
Loco ACTG2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
118/
130
120/
130
120/
132
122/130
130/130
124/132
124/134
Genótipos
Nº de indivíduos
37
TABELA 11 – LOCO SW444 – ALELOS E SUAS RESPECTIVAS FREQÜÊNCIAS EM T. tajacu E T.
pecari
ALELOS (pb)
T. tajacu T. pecari
98 0,5600
100 0,2800
103 0,1531
105 0,1327
106 0,1600
107 0,5918
109 0,0408
111 0,0408
113 0,0204
115 0,0204
GRÁFICO 9 – NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO LOCO SW444 EM T.
tajacu
Loco SW444
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
1
03/1
0
3
1
03/1
0
5
1
03/1
0
7
1
03/1
0
9
1
03/1
1
5
1
05/1
0
5
1
05/1
0
7
1
07/1
0
7
1
07/1
0
9
1
07/1
1
1
1
07/1
1
3
1
11/1
1
1
Genótipos
Nº de indivíduos
38
GRÁFICO 10 – NÚMERO DE INDIVÍDUOS E GENÓTIPOS ENCONTRADOS NO LOCO SW444 EM T.
pecari
4.2 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA EM Tayassu tajacu E Tayassu pecari
4.2.1 Heterozigose Observada e Heterozigose Esperada
Os valores das heterozigoses observada (H
o
), esperada (H
e
), valores de p e
os valores médios para todos os locos em T. tajacu são apresentados na tabela 12.
Em T. tajacu, os valores da heterozigose observada foram significativamente
menores que a esperada em todos os locos, sendo que em T. pecari somente o loco
ACTG2 apresentou heterozigose observada maior que a esperada.
Loco SW444
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
98/98
98/10
6
100/1
0
0
100/1
0
6
Genótipos
Nº de indivíduos
39
TABELA 12 – HETEROZIGOSE OBSERVADA (H
o
) E HETEROZIGOSE ESPERADA (H
e
) E
VALORES DE p EM T. tajacu E T. pecari
Tayassu tajacu Tayassu pecari
LOCO Ho He p Ho He p
SW1408 0,163 0,866 0,000000 0,320 0,604 0,000000
SW857 0,714 0,889 0,000250 0,480 0,747 0,000000
SW2411 0,042 0,576 0,000000 0,520 0,873 0,000000
ACTG2 0,469 0,918 0,000000 0,560 0,545 0,065000
SW444 0,388 0,611 0,000050 0,320 0,594 0,000050
MÉDIA 0,355 0,772 0,440 0,673
p< 0,05 (significativo)
Estes valores sugerem que, exceto o ACTG2 em queixadas, os demais não
estariam em equilíbrio conforme o Teste do Equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Entretanto, como cada loco é polimórfico o que não é levado em consideração no
cálculo da significância (p), então, introduz-se um erro e, através da aplicação o
Teste de Bonferroni, este nível de significância é corrigido. Esta correção é feita
elevando-se o nível de significância (0,05) ao número de locos considerados (neste
caso, 5), sendo o novo valor 0,0000003125. Logo, nos dados acima todos os valores
de p ficaram acima do valor de significância, ou seja, são compatíveis à hipótese de
equilíbrio de Hardy-Weinberg.
4.2.2 Conteúdo de Informações Polimórficas (PIC)
Os valores obtidos relativos ao conteúdo de informações polimórficas (PIC)
foram considerados altos nos cinco locos em ambas espécies de porcos-do-mato
(tabela 13).
TABELA 13 – VALORES DE PIC PARA CADA LOCO EM T. tajacu E T. pecari
LOCO
Tayassu tajacu Tayassu pecari
SW1408 0,840 0,530
SW857 0,870 0,686
SW2411 0,507 0,839
ACTG2 0,902 0,508
SW444 0,572 0,513
40
4.2.3 Probabilidade de Exclusão de Paternidade (PE) e Probabilidade de Exclusão
Combinada
A tabela 14 apresenta as estimativas dos valores das probabilidades de
exclusão de paternidade – quando nenhum dos parentais é conhecido (PE 1) e
quando um dos parentais é conhecido (PE 2) – em cada loco e em cada uma das
espécies de porcos-do-mato. Pode-se verificar que o loco mais informativo foi o
ACTG2 em catetos e, SW2411, em queixadas.
As probabilidades de exclusão combinada (PEC) obtidas através dos cinco
sistemas em conjunto foram altas em T. tajacu (PE 1 e PE 2) e em T. pecari (PE 2).
TABELA 14 – PROBABILIDADES DE EXCLUSÕES DE PATERNIDADE (PE 1 E PE 2) E DE
EXCLUSÃO COMBINADA (PEC) NAS DUAS ESPÉCIES DE PORCOS-DO-MATO
Tayassu tajacu Tayassu pecari
LOCO
PE 1 PE 2 PE 1 PE 2
SW1408 0,551 0,713 0,184 0,333
SW857 0,615 0,763 0,318 0,493
SW2411 0,168 0,311 0,548 0,711
ACTG2 0,689 0,816 0,164 0,337
SW444 0,214 0,392 0,170 0,310
PEC 0,965 0,995 0,826 0,955
4.2.4 Freqüência de Alelos Nulos
A freqüência de alelos nulos foi estimada para os cinco locos nas duas
espécies de porcos-do-mato e os valores são apresentados na tabela 15.
TABELA 15 – FREQÜÊNCIAS ESTIMADAS DE ALELOS NULOS NOS CINCO LOCOS EM T. tajacu
E T. pecari
LOCO
Tayassu tajacu Tayassu pecari
SW1408 0,6807 0,3144
SW857 0,1032 0,2216
SW2411 0,8675 0,2514
ACTG2 0,3218 -0,0104
SW444 0,2269 0,3028
41
Em ambas espécies foram observados altos valores estimados de freqüências
de alelos nulos, exceto para o loco ACTG2 (em queixadas) que apresentou valor
negativo.
4.2.5 Estrutura Populacional
A tabela 16 apresenta os valores de Fst considerando as três amostras
populacionais de catetos (Tibagi/PR, Guarapuava/PR e Fazenda Rio Grande/PR) e
as duas de queixadas (Guarapuava/PR e Fazenda Rio Grande/PR) em cada loco e
os valores totais.
TABELA 16 – VALORES INDIVIDUAIS E TOTAIS DE Fst NAS AMOSTRAS DE T. tajacu E T. pecari
LOCO
Tayassu tajacu Tayassu pecari
SW1408 - 0,0032 0,0842
SW857 0,0305 0,1947
SW2411 0,0201 0,1514
ACTG2 0,0666 0,0972
SW444 0,1029 0,1385
TOTAL 0,0420 0,1387
Com os resultados obtidos de Fst, pôde-se observar que, de toda a amostra
de catetos e queixadas, os valores de Fst foram 0,042 e 0,1387, respectivamente.
Estes valores, para ambas espécies, indicam ausência de estruturação, ou seja, a
variabilidade genética se encontra dentro e não entre as amostras populacionais
havendo fluxo gênico entre elas. Tendo em vista estes valores, as amostras
populacionais, tanto de cateto como queixada, foram reunidas, respectivamente, em
uma única amostra para o cálculo das freqüências alélicas, heterozigose observada
(H
o
), heterozigose esperada (H
e
), teste para verificação do equilíbrio de Hardy-
Weinberg, conteúdo de informações polimórficas (PIC), probabilidades de exclusão
de paternidade (PE e PEC), coeficiente de endocruzamento (Fis) e freqüência
estimada de alelos nulos.
Os valores de Fis (coeficiente de endocruzamento) de T. tajacu e T. pecari em
todos os locos e os valores totais são apresentados na tabela 17.
42
TABELA 17 – VALORES INDIVIDUAIS E TOTAIS DE Fis NA AMOSTRA DE T. tajacu E T. pecari
LOCO
Tayassu tajacu Tayassu pecari
SW1408 0,8139 0,4754
SW857 0,1985 0,3621
SW2411 0,9284 0,4091
ACTG2 0,4914 -0,0275
SW444 0,3675 0,4667
TOTAL 0,5428 0,3506
Observa-se nesta tabela que, em ambas espécies, os valores de Fis obtidos
são muito altos, 0,5 (catetos) e 0,35 (queixadas), exceto no loco ACTG2 em
queixadas, com valor negativo.
4.3 COMPARAÇÕES DE ESTRUTURA POPULACIONAL E DISTÂNCIAS
GENÉTICAS ENTRE T. tajacu E T. pecari
O parâmetro Fst foi estabelecido comparando as duas espécies de porcos-do-
mato (tabela 18) observando-se o valor de 0,2086, o que indica estruturação entre
as espécies.
TABELA 18 – VALORES DE Fst PARA CADA LOCO CONSIDERANDO AS DUAS ESPÉCIES DE
PORCO-DO-MATO
LOCO Fst
SW1408 0,1291
SW857 0,1424
SW2411 0,2410
ACTG2 0,1982
SW444 0,3408
TOTAL 0,2086
As distâncias genéticas, conforme preconizado por NEI (1972), entre as
espécies, mostram uma separação bastante evidente entre elas, sendo o ramo
superior o que compõe as populações de catetos e o ramo inferior o que compõe as
populações de queixadas (fig. 3).
43
FIGURA 3 – DENDROGRAMA REPRESENTATIVO DAS DISTÂNCIAS GENÉTICAS ENTRE
CATETOS E QUEIXADAS. OS NÚMEROS DOS NÓS SÃO OS VALORES DE
BOOTSTRAP COM 10000 REPLICAÇÕES
r=0,96509
Tibagi/PR
Guarapuava/PR
Fazenda Rio Grande/PR
Guarapuava/PR
Fazenda Rio Grande/PR
99,7%
100%
100%
Catetos
Queixadas
44
2 DISCUSSÃO
A amplificação de regiões microssatélites, utilizando oligonucleotídeos
iniciadores de porco doméstico em espécies aparentadas, é extremamente
trabalhosa porque, além dos poucos trabalhos existentes na literatura, se tratam de
diferentes locos situados em cromossomos diferentes.
Contudo, os microssatélites são marcadores conservados na classe
Mammalia (MOORE et al., 1991; SUN e KIRKPATRICK, 1996), principalmente entre
espécies mais relacionadas evolutivamente, o que vem a ser uma alternativa que
facilita estudos utilizando estes marcadores, através de amplificação heteróloga. A
maior limitação da tecnologia de microssatélites é a grande demanda de tempo para
o desenvolvimento prévio dos oligonucleotídeos iniciadores, o qual envolve várias
etapas (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). Existem vários relatos na literatura
que comprovam o sucesso da amplificação heteróloga envolvendo microssatélites,
tais como os trabalhos de GEMMELL et al. (1997); SLATE et al. (1998); LOWDEN et
al. (2002); GONGORA et al. (2002); GONELA (2003) e LAU et al. (2004). Em todos
estes, houve mais de 50% de eficiência na amplificação. Porém, mesmo com as
dificuldades inerentes à amplificação heteróloga, estima-se que com os dados
publicados de locos microssatélites, desenvolvidos através de uma variedade de
projetos genoma, seria possível estudar mais de 30% de todas as espécies de
mamíferos (ENGEL et al., 1996).
Essa eficiência na amplificação se repetiu nos seis locos analisados no
presente trabalho, confirmando os achados de GONGORA et al. (2002) e LOWDEN
et al. (2002) para o loco SW857 em Tayassu tajacu (cateto) e de GONELA (2003)
para os locos ACTG2 e SW444 em Tayassu pecari (queixada). Além destes, os
resultados aqui apresentados com os locos SW1407, SW1408 e SW2411 em
catetos e queixadas, SW857 em queixadas e ACTG2 e SW444 em catetos, são
relatos inéditos na literatura.
Estimativas do tempo de divergência entre suínos e taiassuídeos datam de 37
milhões de anos (THEIMER e KEIM, 1998), o que é considerado satisfatório para se
conseguir uma eficiência de, pelo menos, 50% no caso de amplificação heteróloga.
Provavelmente este tempo de divergência permitiu a utilização de iniciadores
desenvolvidos para porco doméstico com bons resultados (GONELA, 2003), devido
45
à constatação da eficiência da amplificação destes nas duas espécies de
taiassuídeos aqui estudadas.
No presente trabalho, dos seis locos analisados, tanto em T. tajacu quanto em
T. pecari, cinco foram polimórficos (SW1408, SW857, SW2411, ACTG2 e SW444) e
um monomórfico (SW1407).
Em T. tajacu, comparativamente ao porco doméstico, houve uma redução no
tamanho dos fragmentos analisados, exceção aos locos ACTG2 e SW444, sendo
SW1408 o que apresentou a maior redução (55pb considerando o fragmento menor
e 31pb considerando o fragmento maior).
Em T. pecari, à semelhança em T. tajacu, os locos SW1408, SW1407 e
SW857 sofreram redução do tamanho dos fragmentos, onde SW1408 apresentou a
maior redução (49pb considerando o fragmento menor e 51pb considerando o
fragmento maior). Já os demais locos (SW2411, ACTG2 e SW444), apresentaram
redução no tamanho dos fragmentos quando comparados ao porco doméstico. Entre
T. tajacu e T. pecari, as amplitudes de tamanho foram menores do que as
encontradas entre estas espécies e o porco doméstico.
Com relação ao número de alelos, comparativamente ao porco doméstico
(sete em SW1408, onze em SW1407, sete em SW857, quinze em SW2411, nove
em ACTG2 e quatorze em SW444 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), somente
em T. pecari foi observado redução no número de alelos em todos os locos (quatro
em SW1408, um em SW1407, cinco em SW857, dez em SW2411, sete em ACTG2
e três em SW444), sendo que em T. tajacu esta ocorreu apenas nos locos SW1407,
SW2411 e SW444 (um, quatro e sete, respectivamente) e aumento nos demais
(onze em SW1408, treze em SW857 e dezesseis em ACTG2). Segundo GONELA
(2003), quando se trabalham com iniciadores heterólogos, a redução pode variar de
drástica a suave comparativamente à espécie original. Conforme ainda este autor,
dos seis locos analisados em T. pecari, cinco apresentaram redução de mais de
50% no número de alelos e em um deles, de apenas um alelo, sugerindo, neste
caso, duas explicações aos valores observados. Pela primeira, que fala a respeito do
comportamento destes animais, onde indivíduos de um bando não cruzam com os
de outros, haveria o favorecimento da endogamia e do efeito fundador. Enquanto
que na segunda explicação, a redução estaria relacionada à presença de alelos
nulos, os quais representam um problema quando se utilizam iniciadores de uma
46
espécie em outra. Se os alelos nulos ocorrerem em homozigose será considerado
falha na reação de amplificação e se ocorrerem em heterozigose, os heterozigotos
serão considerados como homozigotos, subestimando, desta forma, o número de
alelos.
De todos os locos estudados em catetos, apenas o SW857, ACTG2 e SW444
possuem relatos na literatura. Em um trabalho com porco ibérico, MARTÍNEZ et al.
(2000) encontraram sete alelos para o loco SW857. Já em trabalhos envolvendo
catetos, GONGORA et al. (2002), estudando uma amostra de seis indivíduos,
encontrou, para o mesmo loco, quatro alelos, variando de 138pb a 158pb, valores
estes próximos ou iguais aos encontrados no presente trabalho. LOWDEN et al.
(2002) encontraram numa pequena amostra de três catetos, apenas um alelo de
144pb, sendo este número reduzido devido ao tamanho da amostra avaliada. Este
alelo também foi encontrado na amostra de catetos avaliada no presente trabalho.
Com queixadas, dos locos estudados, apenas o ACTG2 e SW444 possuem
relatos na literatura (GONELA, 2003). Este trabalho envolveu uma amostra de 84
exemplares de queixadas de uma população natural e seis locos microssatélites,
dentre os quais, quatro foram polimórficos e dois monomórficos. Dentre os
polimórficos, encontram-se os dois locos citados anteriormente, os quais revelaram
oito alelos para o loco ACTG2 e cinco no loco SW444. O primeiro possui alelos
variando de 116pb a 130pb, dos quais cinco coincidiram com os alelos observados
no presente trabalho. Já o segundo possui alelos variando de 96pb a 108pb, dos
quais apenas um coincidiu com os do presente trabalho. Estes achados confirmam a
identificação correta das regiões de amplificação, processo este bastante trabalhoso
uma vez que se tratam de amplificações heterólogas.
Para complementar a avaliação da variabilidade genética em catetos e
queixadas foram calculados a heterozigose observada, a heterozigose esperada e o
conteúdo de informações polimórficas (PIC).
Na amostra de catetos, considerando cada loco separadamente, foi
observado elevado número de indivíduos homozigotos, sendo a heterozigose
observada menor que a esperada e, portanto, baixa variabilidade genética. Em
queixadas, situação semelhante foi observada sendo a única exceção o loco
ACTG2, o qual apresentou este valor maior do que a esperada, indicando, neste
loco, excesso de heterozigotos. Em seu trabalho com queixadas, GONELA (2003),
47
não encontrou diferenças significativas entre as heterozigoses observada e
esperada em nenhum dos locos estudados.
Tanto em catetos quanto em queixadas, os valores encontrados para o
conteúdo de informações polimórficas (PIC), foram considerados altamente
informativos (BOTSTEIN et al., 1980) para todos os locos. No trabalho de GONELA
(2003), os valores de PIC na população de queixadas para o loco ACTG2 e SW444
foram, respectivamente, altamente e moderadamente informativos. Segundo CURI
(2000), o número de alelos encontrados influencia diretamente na heterozigose
esperada e no PIC. Logo, um pequeno número de alelos fornecerá uma pequena
heterozigose esperada e um PIC de médio a baixo.
Com relação às freqüências estimadas de alelos nulos em ambas espécies,
estas apresentaram freqüências consideradas altas, indicando excesso de
homozigotos. A exceção observada foi o loco ACTG2 em queixadas, com valor
negativo, sendo isto mais um indicativo do excesso de heterozigotos para este loco.
Porém, para afirmar que este excesso de homozigotos é devido à presença de
alelos nulos, seria necessário, além das estimativas das freqüências, uma análise de
segregação alélica, exigindo, portanto, um acompanhamento da história familiar
destes animais (GONELA, 2003). Este mesmo autor estimou a freqüência de alelos
nulos nos locos ACTG2 e SW444 em queixadas e encontrou valores negativos,
próximos de zero, para ambos os locos, atribuindo tais achados ao excesso de
heterozigotos na população.
No presente trabalho, a freqüência de alelos nulos foi estimada usando
algoritmo interativo baseado na diferença entre homozigotos esperados e
observados (SUMMERS e AMOS, 1997 apud MARSHALL et al, 1998). Segundo
MARSHALL et al. (1998), na ausência do alelo nulo, a freqüência estimada será
próxima de zero ou até mesmo negativa. Valores negativos implicam em excesso de
genótipos heterozigotos observados. Um loco com freqüência de alelos nulos
altamente positiva, em relação aos outros locos analisados, indica excesso de
homozigotos, mas não necessariamente implica que o alelo nulo esteja presente.
Na literatura poucos são os trabalhos que fazem menção aos alelos nulos,
sugerindo que a deficiência de heterozigotos observada nas populações estudadas
poderia também estar relacionada à suas presenças, como são os casos de FOLTZ
(1986), com alozimas em bivalves marinhos, NEUMANN e WETTON (1996),
48
TREUREN (1998), com microssatélites em pássaros e GONELA (2003) com
microssatélites em Sus scrofa sp. e Tayassu pecari.
Em catetos, a probabilidade de exclusão combinada (PEC) foi considerada
alta quando nenhum dos parentais é conhecido (96,48%), o mesmo se verificando
quando se conhece um dos parentais (99,48%), sendo esta uma probabilidade de
exclusão desejável. Em queixadas, estas probabilidades foram, respectivamente,
82,57% (baixa) e 95,53% (alta), sendo que nenhuma delas atingiu um valor
desejável. Portanto, o conjunto dos cinco locos polimórficos apresentou, em catetos,
alto potencial para a utilização destes em testes de paternidade ou maternidade. Em
queixadas, no entanto, um fator que possivelmente influenciou as probabilidades
obtidas foi o número de alelos observados, que, na maioria dos locos, esteve inferior
ao número observado em catetos. Neste caso, então, é sugestivo a utilização de
novos marcadores e o aumento da amostra estudada.
Saliente-se que esta foi a primeira estimativa a respeito de teste de
paternidade já realizada em taiassuídeos, o que consideramos importante, tendo em
vista que os trabalhos envolvendo testes de exclusão de paternidade estão mais
direcionados a rebanhos de notável interesse econômico, tais como eqüinos e
bovinos.
Desta forma, GIACOMONI (2002), através de um conjunto de quatro locos
microssatélites, observou uma probabilidade de exclusão combinada de 93% em
cavalos Pantaneiros, considerada satisfatória. Já para cavalos Crioulos, a
probabilidade de exclusão combinada foi de 74%, considerada baixa, tendo em vista
que métodos ultrapassados, como tipagem sanguínea, mostram resultados
semelhantes a este valor, podendo apresentar erros. CURI (2000), estudando a
viabilidade de aplicação de determinados locos microssatélites para testes de
paternidade em bovinos da raça Gir, observou que a PEC de 0,9789 não atingiu o
valor considerado como adequado para testes de paternidade (0,99), e propôs que
outros marcadores microssatélites devam ser adicionados para se atingir a PEC
pretendida.
Em relação à estrutura genética, o índice Fst reflete a proporção da
variabilidade genética encontrada entre populações, ou seja, devido à subdivisão
populacional. Segundo NEI (1978) apud GIACOMONI (2002), valores de Fst
menores que 0,05 são considerados baixos, entre 0,05 e 0,15 são médios e maiores
49
que 0,15 são considerados altos, indicando estruturação populacional baixa, média e
alta, respectivamente. Em catetos, o valor de Fst obtido, da comparação entre as
amostras oriundas de três localidades diferentes, foi baixo (0,042), revelando
ausência de estruturação, ou seja, há pouca diferenciação entre as populações, não
havendo fluxo gênico entre elas e a variabilidade genética encontrada está dentro e
não entre as populações. Este resultado foi concordante com os valores de distância
genética, que variou de 0,2614 a 0,2638, os quais se mostraram muito semelhantes
entre as três localidades de coleta. Em queixadas observou-se o mesmo fenômeno,
ou seja, o valor de Fst igual a 0,1387, resultante da comparação entre amostras de
duas localidades, indicando, ainda, que não há estruturação apesar do valor ser
mais elevado que em catetos (0,042).
Estes valores já eram esperados, pois as populações de cativeiro são
consideradas artificiais, recentemente formadas, não havendo, portanto, tempo para
diferenciarem-se. Quando as duas espécies foram comparadas em relação aos
cinco locos polimórficos, verificou-se alta estruturação (Fst igual a 0,2086), ou seja,
uma subdivisão entre elas, fato este também esperado pelo isolamento reprodutivo
existente.
O índice Fis, que representa o coeficiente de endogamia, foi alto em toda a
amostra, tanto de catetos em todos os locos (0,1985 a 0,9284), como em queixadas
(0,3621 a 0,4754), exceto no loco ACTG2, o qual apresentou um valor negativo
(-0,0275). Estes altos valores indicam excesso de homozigotos nas populações o
que se atribui, provavelmente, ao endocruzamento existente pelo fato de serem
populações de cativeiro. Já o valor negativo, indica excesso de heterozigotos.
Uma das possíveis explicações para a alta taxa de homozigose, poderia ser
atribuída à origem e comportamento dos indivíduos que compõem as amostras das
duas espécies de porcos-do-mato. Como se tratam de populações de cativeiro,
formadas recentemente, talvez não mais que dez anos e constantemente recebendo
novos elementos, há uma heterogeneidade e incertezas com relação à procedência
dos mesmos, ou seja, são grupos de animais originários de diferentes localidades,
podendo ser naturais ou nascidos no próprio criadouro. Comportamentalmente,
animais de mesma origem tendem a se cruzarem entre si (GONELA, 2003), o que
contribui ao endocruzamento. Além disso, segundo o Instituto Ambiental do Paraná
– IAP (MIKICH e BÉRNILS, 2004), as populações naturais de catetos e queixadas
50
estão na lista dos animais ameaçados de extinção no Estado, fato este causado,
principalmente, pela devastação dos seus habitats naturais. Desta forma, é provável
que as populações destas espécies, devido a essa forte pressão seletiva, tenham
reduzido os seus tamanhos efetivos, o que estaria, conseqüentemente, favorecendo
o endocruzamento ou a deriva genética. Além do endocruzamento, outras fontes
também podem estar envolvidas ou serem igualmente responsabilizadas pelo
excesso de homozigotos observados em catetos e queixadas, como erros na
genotipagem dos indivíduos e presença de alelos nulos, como já mencionado
anteriormente. Conforme ALDRICH et al. (1998) apud CONTE (2004), algumas
distorções nas freqüências genotípicas podem ser geradas na interpretação do
padrão de bandas no gel, onde são considerados homozigotos no lugar de
heterozigotos quando alelos possuem tamanhos muito próximos entre si e não
podem ser distinguidos uns dos outros, principalmente na presença de bandas
duplicadas (stutter bands).
Portanto, diante deste panorama surgem pelo menos duas questões básicas,
importantes em suas resoluções, com implicações sócio-econômicas, tais como: a)
Estaria esta alta taxa de homozigose implicando na redução das ninhadas, em
abortos, em natimortos, perda de peso corporal, fragilidade dos híbridos, entre
outros? ou b) As populações, apesar da homozigose, estariam bem adaptadas às
condições ambientais atuais e, por conseguinte, não causando prejuízos
econômicos?
Com relação à segunda colocação, a possível perda da heterozigose, devida
à ameaça de extinção talvez não seja tão problemática, pois os animais podem estar
bem adaptados, como conseqüência de um processo seletivo tipo “gargalo de
garrafa”, no qual os alelos detrimentais já teriam sido previamente selecionados.
Exemplos disso foram observados em elefantes marinhos, castores da Escandinávia
e do tordo (uma ave) que, no século passado, devido a ações antropogênicas,
enfrentaram redução drástica no número de indivíduos e conseqüente perda de
heterozigose (SOLÉ-CAVA, 2001). Nestes três exemplos observou-se que, apesar
da baixa variabilidade, os animais conseguiram escapar das crises de
endocruzamento e, atualmente, são saudáveis e se reproduzem normalmente,
indicando que a baixa variação gênica não parece estar prejudicando suas chances
de sobrevivência. Segundo este autor, uma possível explicação para tal sucesso é
51
que no passado as populações iniciais destes animais eram muito grandes e com
poucos alelos levemente deletérios, o que diminuiria a chance de fixação por deriva.
Para atendermos as duas questões levantadas e pelo fato de não sabermos
ainda como respondê-las convenientemente, há premência na elaboração de
programas complementares ao estudo iniciado no presente trabalho.
Pelo menos duas abordagens básicas devem ser geradas: pela primeira, um
levantamento em termos de manutenção e reprodução monitoradas, cujo objetivo
seria o de verificar a real situação nestes cativeiros, ou seja, se está de fato
ocorrendo uma perda significativa de animais, seja pelo baixo número de filhotes por
gestação; baixo peso ao nascer, natimortos, fragilidade dos filhotes, produção de
leite, tamanho dos animais, susceptibilidade a doenças, entre outros.
Enquanto que à segunda abordagem, seria um programa a nível estadual
patrocinado institucionalmente ou promovido por uma associação de criadores de
animais silvestres, no caso, de catetos e/ou queixadas igualmente de manutenção e
reprodução monitoradas em cativeiro. Esta difere da anterior, pois seria um
programa envolvendo medidas extremamente rígidas quanto às origens dos animais,
sendo todos catalogados e tipados através de algum marcador molecular adequado
para tal finalidade. Assim, quando da aquisição de uma nova matriz para seu
criadouro, o proprietário seria adequadamente orientado sobre qual ou quais animais
a serem adquiridos tendo em vista o seu rebanho já previamente identificado.
52
6 CONCLUSÕES
Comprovou-se a eficiência da amplificação heteróloga através do uso de
marcadores microssatélites desenvolvidos para porco doméstico (Sus scrofa scrofa)
e aplicados em catetos (Tayassu tajacu) e queixadas (Tayassu pecari).
Dos seis locos padronizados, cinco foram polimórficos e um monomórfico
para ambas espécies. No total, foram observados 52 alelos em catetos e 30 alelos
em queixadas.
A diversidade alélica encontrada entre os locos polimórficos foi registrada em
maior número nos locos SW1408, SW857 e ACTG2 em catetos e SW2411 em
queixadas.
Houve excesso de homozigotos nas populações de catetos e queixadas,
considerando todos os locos, exceto no loco ACTG2, em queixadas, que apresentou
excesso de heterozigotos. Portanto, a variabilidade genética encontrada para estes
locos foi baixa, porém, considerada uma parcela bastante representativa da
variabilidade genética das populações naturais, pelo menos em relação a estes
marcadores.
Os valores do conteúdo de informações polimórficas (PIC), revelaram que
todos os locos em ambas espécies são altamente informativos.
A probabilidade de exclusão combinada (PEC) igual a 99,48%, quando se
conhece um dos parentais em catetos, é considerada alta e satisfatória, indicando
ser informativo para este tipo de teste. Já em queixadas, apesar desta probabilidade
ser considerada também alta (95,53%), não foi satisfatória, pois o valor mínimo de
exclusão de paternidade deve ser igual ou superior a 99%, não sendo, pois,
informativo para este tipo de teste.
Através do cálculo de Fst, percebe-se que as populações de catetos
(Fst=0,042) e queixadas (Fst=0,1387) não estão estruturadas, ou seja, a
variabilidade encontrada está dentro e não entre as populações. Já quando
comparadas as duas espécies, percebeu-se a estruturação, ou seja, não há fluxo
gênico entre as espécies.
Os valores totais de Fis (0,5428 para catetos e 0,3506 para queixadas)
indicam excesso de homozigotos observados em ambas espécies, sendo uma das
explicações o endocruzamento existente nos cativeiros.
53
A presença de alelos nulos e distorções nas freqüências genotípicas geradas
na interpretação do padrão de bandas no gel, também podem, de alguma forma,
estarem envolvidos no alto índice de homozigotos.
Duas proposições são discutidas e apresentadas para avaliar os efeitos da
homozigose nos criadouros de animais silvestres, em especial nos de catetos e
queixadas, ambas com repercussões sócio-econômicas significativas.
54
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60
ANEXOS
ANEXO 1 –
PREPARO DAS SOLUÇÕES..........................................................
61
ANEXO 2 –
PADRÃO DE BANDAS NOS SEIS LOCOS MICROSSATÉLITES
EM CATETOS E QUEIXADAS ANALISADAS EM GEL DE
POLIACRILAMIDA NÃO-DESNATURANTE 10%...........................
66
61
ANEXO 1 – PREPARO DAS SOLUÇÕES
62
ANEXO 1 – PREPARO DAS SOLUÇÕES
a) Tampão de Lise pH=8,0 (Vf=400mL)
2,4228 g de Tris-Base
7,444 g de EDTA
2,3376 g de NaCl
Completar o volume com água Mili-Q autoclavada
Acertar o pH, autoclavar e armazenar em geladeira a 4°C.
b) Tampão STE pH=8,0 (Vf=200mL)
0,2423 g de Tris-Base
0,0745 g de EDTA
1,17 g de NaCl
Completar o volume com água Mili-Q autoclavada
Acertar o pH, autoclavar e armazenar em geladeira a 4°C.
c) Tampão TE pH=8,0 (Vf=200mL)
2,4228 g Tris-Base
0,0744 g EDTA
Completar o volume com água Mili-Q autoclavada
Acertar o pH, autoclavar e armazenar em geladeira a 4°C.
d) Tampão TBE 10X (2L)
218,0 g de Tris-Base
110,0 g de Ácido Bórico
14,6 g de EDTA
Completar o volume com água destilada
e) SDS 20% (100mL)
20 g de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio)
Completar o volume com água destilada, aquecer a 70°C e guardar à
temperatura ambiente. Não autoclavar.
63
f) NaCl 5M (100mL)
29,2 g de NaCl
Completar o volume com água Mili-Q autoclavada, autoclavar e armazenar
em geladeira a 4°C.
g) RNAse-A
Dissolver a RNAse (10 mg/mL) no tampão (Tris 10 mM, NaCl 15 mM pH=7,5)
e colocar o tubo em água fervente por 15 minutos. Deixar esfriar à temperatura
ambiente. Aliquotar e estocar a –20°C.
h) Proteinase K
Dissolver 10 mg para cada mL de água Mili-Q autoclavada. Aliquotar e
estocar a –20°C.
i) Azul de Bromofenol (3%) para agarose
Estoque:
10 ml de água destilada
0,300 g bromofenol
Uso:
Água 11 mL
Glicerol 10,35 mL
j) Gel de Agarose 0,8%
0,8 g de agarose em pó
Completar para 100 mL com Tampão TBE 0,5X e dissolver em microondas
(potência máxima por 1 minuto).
k) Gel de poliacrilamida não-desnaturante 10% (30 mL)
Solução-mãe de acrilamida 30% (29:1)
145 g de acrilamida
5 g bisacrilamida
Completar para 500 mL de água destilada.
64
Preparo:
10 mL de solução de acrilamida 30%
2,1mL de glicerol
14,57 mL água destilada
3,0 mL TBE 10X
40 µL de APS (10%)
400 µL de TEMED
Misturar rapidamente e aplicar imediatamente entre as placas de vidro.
l) APS 10%
1 g de perssulfato de amônio
Completar 10 mL de água destilada
Aliquotar em microtubos de 1,5 mL e armazenar a –20°C.
m) Ladder de 25pb – diluição para aplicação no gel
0,5 µL de Ladder 25pb
6 µL de água Mili-Q
5 µL de corante azul de bromofenol
n) Soluções para fixar e corar gel de poliacrilamida
Solução fixadora:
120 mL de álcool ([ ] final 10%)
6 mL de ácido acético
Completar o volume com água até atingir 1200 mL de solução.
Solução de nitrato de prata (80%):
40 g de nitrato de prata
Completar para 50 mL de água destilada
Solução reveladora:
400 ml de água destilada
9 g de NaOH
Agitar a mistura.
65
ANEXO 2 – PADRÃO DE BANDAS NOS SEIS LOCOS MICROSSATÉLITES EM
CATETOS E QUEIXADAS ANALISADAS EM GEL DE
POLIACRILAMIDA NÃO-DESNATURANTE 10%
66
ANEXO 2 - PADRÃO DE BANDAS NOS SEIS LOCOS MICROSSATÉLITES EM
CATETOS E QUEIXADAS ANALISADAS EM GEL DE
POLIACRILAMIDA NÃO-DESNATURANTE 10%
a)
d)
b)
c)
e) f)
a) Loco SW1408; b) Loco SW1407; c) Loco SW857; d) SW2411; e) Loco ACTG2; f) Loco SW444
Setas (Ladder 25pb): 225pb; 200pb; 175pb; 150pb; 125pb; 100pb
a) b)
C
) d)
e) f)
QUEIXADAS
CATETOS
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