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MARÍA CLAUDIA IPUCHA
Caracterização citogenética de Nereididae
(Annelida:Polychaeta), como auxilio nas relações
filogenéticas das espécies ocorrentes no Paraná
Dissertação de Mestrado apresentada como requisito
parcial à obtenção do título de Mestre em Genética,
Curso de Pós-Graduação em Genética – Área de
concentração: Citogenética Animal, Setor de
Ciências Biológicas, Universidade Federal do
Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Ives José Sbalqueiro
Co-orientador: Prof. Dr. Paulo da Cunha Lana
CURITIBA
2006
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2
SUMÁRIO
1. Introdução....................................................................................
1
1.1. O conhecimento corrente da citogenética dos poliquetas.........
1
1.2. O conhecimento corrente da citogenética dos poliquetas
nereidídeos................................................................................
4
1.3. Bandeamento cromossômico com impregnação de prata
(NOR)........................................................................................
8
2. Objetivos......................................................................................
10
3. Material e métodos......................................................................
11
3.1. Material biológico e procedência...............................................
11
3.2. Condições de manutenção e manejo dos aquários...................
12
3.3. Obtenção de células mitóticas...................................................
12
3.4. Obtenção de metáfases.............................................................
13
3.5. Obtenção de lâminas para estudos citológicos.........................
13
3.6. Técnicas de coloração...............................................................
14
3.6.1. Coloração convencional.......................................................
14
3.6.2. Bandeamento NOR (HOWELL e BLACK, 1990)..................
14
3.7. Análise do material citogenético................................................
15
3.8. Fotografia...................................................................................
15
3.9. Cariogramas e idiogramas.........................................................
15
4. Resultados...................................................................................
16
4.1. Resposta a cultivo em condições de laboratório.......................
16
4.2. Otimização da técnica de obtenção de metáfases e
bandeamento cromossômico.....................................................
16
4.3. Análise citogenética...................................................................
17
4.3.1.
Laeonereis culveri
............................................................
18
4.3.1.1. Caracterização do Cariótipo............................................
18
4.3.1.2. Bandeamento NOR de Laeonereis culveri .....................
19
4.3.2
Nereis oligohalina
............................................................
19
4.3.2.1.Caracterização do Cariótipo.............................................
19
4.3.2.2. Bandeamento NOR em Nereis oligohalina......................
19
4.3.2.3. Idiograma de Nereis oligohalina......................................
20
4.3.3. Platynereis dumerilii........................................................
22
4.3.3.1. Caracterização do cariótipo.............................................
22
4.3.3.2. Bandas NOR em Platynereis dumerilii............................
22
4.3.3.3. Idiograma de Platynereis dumerilii...................................
23
4.3.4.
Perinereis ponteni
...........................................................
25
4.3.4.1. Caracterização do cariótipo.............................................
25
4.3.4.2. Bandas NOR em Perinereis ponteni................................
25
4.3.4.3. Idiograma de Perinereis ponteni......................................
26
4.3.5. Perinereis anderssoni.....................................................
28
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3
4.3.5.1. Caracterização do cariótipo.............................................
28
4.3.5.2. Bandas NOR em Perinereis anderssoni..........................
28
4.3.5.3. Idiograma de Perinereis anderssoni................................
29
4.3.6.
Perinereis vancaurica
.....................................................
31
4.3.6.1. Caracterização do cariótipo.............................................
31
4.3.6.2. Bandas NOR em Perinereis vancaurica..........................
31
4.3.6.2. Idiograma de Perinereis vancaurica................................
32
4.3.7.
Pseudonereis palpata
.....................................................
34
4.3.7.1. Caracterização do cariótipo.............................................
34
4.3.7.2. Bandas NOR em Pseudonereis palpata..........................
34
4.3.7.3. Idiograma de Pseudonereis palpata................................
35
5. Discussão.....................................................................................
37
5.1. Platynereis dumerilii...................................................................
38
5.2. Perinereis...................................................................................
40
5.3. Pseudonereis.............................................................................
41
5.4. Nereis e Neanthes.....................................................................
41
5.5. Laeonereis culveri......................................................................
42
5.6. Nereididae.................................................................................
43
6. Conclusões..................................................................................
45
GLOSSÁRIO......................................................................................
47
REFERÊNCIAS.................................................................................
48
ANEXO 1...........................................................................................
54
ANEXO 2...........................................................................................
55
ANEXO 3...........................................................................................
57
4
RESUMO
Este trabalho apresenta os primeiros estudos citogenéticos de poliquetas do
Atlântico Sul, na Baía de Paranaguá (Paraná, Brasil). A família Nereididae foi
escolhida por ser um dos grupos de poliquetas mais freqüentes e amplamente
distribuídos. Algumas espécies da família já tinham sido estudadas citogeneticamente
por investigadores do hemisfério norte, que evidenciaram, em alguns casos, marcadas
diferenças interpopulacionais. Tais descobertas sugerem a existência de divergências
genéticas suficientes para separação de espécies morfologicamente muito próximas.
Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de tecido regenerativo depois da
região caudal ser amputada. Os indivíduos foram tratados com 0.05% colchicina, a
região caudal submetida a tratamento hipotónico e fixada em metanol: acido acético
glacial (3:1). Para a preparação das lâminas, o material fixado foi desagregado em
60% acido acético. Posteriormente as células foram esmagadas em lâminas limpas e
secas ao ar. As metáfases foram coradas com 10% Giemsa e também submetidas a
bandeamento cromossômico por impregnação de prata para a detecção de NOR ativas.
Cinco gêneros foram estudados: 1) Platynereis, representado por Platynereis dumerilii
(2n=28;NF=56), espécie presumidamente cosmopolita, mas que constitui
provavelmente um complexo de espécies. A comparação dos cariótipos e bandas NOR
das populações do Paraná com os já descritos para populações do Atlântico Norte
(2n=28; NF=56) revelou divergência cariotípica, mas as diferenças observadas em
ambas localidades não apoiam a idéia de que pertençam a um complexo de espécies
irmãs; 2) Laeonereis, representado por Laeonereis culveri, espécie ocorrente tanto no
Atlântico Sul (2n=38) como no Norte, mostrou o maior número diplóide encontrado na
família; 3) Perinereis, representado por P. vancaurica (2n=28, NF=56), P. anderssoni
(2n=28, NF=56) e P. ponteni (2n=28, NF=54), sendo as duas últimas consideradas
sinônimas por alguns autores e válidas por outros. As caraterísticas cariotípicas e de
bandas NOR permitiram associar P. anderssoni (Paraná, Brasil) com P. macropus
(Itália), revelando que a primeira apresenta caracteres mais derivados. As restantes
espécies do gênero são consideradas divergências independentes; 4) Nereis,
representada por N. oligohalina (2n=28, NF=50) ocorrente no Atlântico Sul, e 5)
Pseudonereis, representada por P. palpata (2n=28, NF=56), espécie que ocorre na
costa Sul e Sudeste do Brasil. As duas últimas compartilham o número diplóide
conservado da família. É discutida a evolução cariotípica como papel importante
durante a origem das famílias modernas de poliquetas, promovendo a diversidade
cromossômica atual (2n=6 até 2n=64), seguida de um período de estabilidade
cromossômica durante a dispersão posterior à ruptura da Pangea, a partir do qual
passam a predominar divergências cariotípicas neutras, envolvendo, principalmente,
alterações na posição do centrómero e amplificação de regiões NOR.
5
ABSTRACT
The present work describes for the first time cytogenetic characteristics of polychaetes
from South Atlantic populations (Paranagua Bay, Paraná, Brazil). The Family
Nereididae was chosen because it represents one of the most frequent and widespread
groups. Some species had already been cytogenetically investigated by researchers
from North hemisphere, showing in some cases pronounced inter-population
differences, suggesting genetic divergences enough to separate species that are
morphologically closely related. Mitotic chromosomes were obtained from
regenerative tissue after amputation of the caudal region. Individuals were then treated
with 0.05% colchicine; caudal tissue was then subjected to hypotonic treatment and
fixed in methanol: glacial acetic acid (3:1). For slide preparation, a cell suspension was
obtained by teasing the fixed material in 60% acetic acid. Cells were squashed onto
clean slides and air-dried. Metaphase plates were conventionally stained with 10%
buffered Giemsa, and slides were also submitted to a silver impregnation protocol for
detection of active NORs. Five genera were analyzed: 1) Platynereis represented by
Platynereis dumerilii (2n=28;NF=56), considered cosmopolitan but suspected as a
species-complex. Karyotypic divergences were detected when comparing chromosome
morphology and NOR distribution from Paraná and North American population
(2n=28;NF=56), although those differences are not enough to support the species-
complex idea; 2) Laeonereis, represented by Laeonereis culveri, occurring both in
South and North Atlantic, showed the highest chromosome number in the family
(2n=38); 3) Perinereis, represented by P. vancaurica (2n=28;NF=56), P.anderssoni
(2n=28;NF=56) and P. ponteni (2n=28;NF=54). Karyotypes and NOR distribution
allowed to relate P. anderssoni (Paraná, Brazil) with P. macropus (Italy), the former
showing a derived karyotype. The remaining karyotypes from Perinereis species
showed independent divergences; 4) Nereis, represented by Nereis oligohalina
(2n=28;NF=50) occurring in South Atlantic; and 5) Pseudonereis, represented by P.
palpata (2n=28;NF=56) species distributed on South and South-east coast from Brazil,
the two later share the conservative chromosome number of the family. We discuses
the important role of karyotypic evolution at the origin of modern families of
polychaete, when the actual chromosomal diversity (2n=6 to 2n=64) was promoted,
followed by a period of chromosomal stability during dispersion that follows Pangea
breakup, when came to predominate divergences of neutral chromosomal changes,
involving mainly pericentric inversions and NOR amplifications.
6
1. Introdução
1.1 O conhecimento corrente da citogenética de poliquetas
A classe Polychaeta compreende cerca de 9000 espécies reconhecidas com vários
milhares de nomes em sinonímia e uma sistemática bastante instável (ROUSE e PLEIJEL,
2001). Na costa brasileira foram descritas cerca de 800 espécies (AMARAL e JABLONSKI,
2005). A maioria das espécies são estritamente marinhas, mas ocorrem também em água
doce, cavernas e até como parasitas de outros invertebrados. É um grupo bem adaptado de
invertebrados marinhos, desempenhando nos fundos marinhos um papel semelhante aos das
minhocas nos solos terrestres, contribuindo para a aeração dos fundos de areia e lodo e para a
reciclagem de nutrientes (LANA e SANTOS, 2005) e constituindo, quase sempre, uma fração
significativa da macrofauna bêntica.
Morfologicamente caracterizam-se pela presença de um par de parapódios laterais em
cada segmento, portando numerosas cerdas (ou setas) de onde vem o nome de poliquetas. A
maioria das espécies possui também uma faringe eversível. O corpo é pouco especializado,
com exceção da cabeça que não apresenta segmentação. A região anterior do corpo está
dividida em um prostômio, onde então localizados os olhos, palpos e antenas, e um peristômio
a partir do qual emergem cirros tentaculares. Em geral os poliquetas possuem uma alta
capacidade de regeneração corporal, principalmente da região posterior, mas muitas espécies
também regeneram a região anterior. O tamanho pode variar de poucos milímetros até dois
metros, mas a maioria das espécies mede menos de cinco centímetros. Algumas espécies têm
sido utilizadas como bioindicadoras da qualidade ambiental por serem sensíveis à poluição,
podendo assim indicar se há degradação do ambiente ao desaparecerem ou terem suas
populações diminuídas. Por outro lado, algumas espécies são particularmente tolerantes ou
resistentes à poluição por óleo ou por esgotos domésticos, tornando-se neste caso indicadoras
de degradação ambiental, devido à sua presença em elevadas densidades quando a maioria das
outras espécies acaba excluída (LANA e SANTOS, 2005).
Hábitos alimentares e características reprodutivas também apresentam uma ampla
variação. Embora a maioria dos poliquetas seja comedora de detritos, existem muitas espécies
carnívoras e algumas vivem como comensais ou parasitas de esponjas, moluscos e
equinodermos. A maioria dos poliquetas é dióica e se reproduzem sexuadamente, embora
algumas espécies sejam hermafroditas.
7
Dada a extensa variedade de formas e abundância, os poliquetas exercem um papel
relevante no fluxo de energia e nutrientes do ecossistema marinho. Em vista de sua clara
importância ecológica, existe uma crescente necessidade de informações a respeito dos
cariótipos para estudos das relações evolutivas, taxonômicas e dos efeitos potenciais de
mutagêneses ambientais e outros poluentes (JHA et al., 1995).
CHRISTENSEN (1980) afirmou que só há informações sobre cariótipos de 3 % das
espécies de poliquetas. Passados 25 anos desta constatação, os estudos citogenéticos em
poliquetas continuam escassos, limitando-se em geral à determinação do número diplóide
(JHA et al.,1995), principalmente por causa da dificuldade de criação e obtenção de
metáfases.
Os poliquetas estudados até hoje apresentam uma ampla variação cariotípica, com
números diplóides que se estendem desde 2n=6 (Ophryotrocha labronica, O. costlowi, O.
macrovifera, O. notoglandulat e O. pacifica (VITTURI et al., 2000)) até 2n=64 (Marphysa
sanguinea (HAYASHI KI et al., 1996)), com o número modal próximo de 28. Até pouco
tempo, acreditava-se que os números diplóides dos poliquetas tendiam a ser menores e menos
variáveis do que em outros invertebrados marinhos (CHRISTENSEN, 1980). Porém, à
medida que mais espécies vão sendo estudadas, maior é a amplitude de números diplóides
encontrados. Não obstante, Oligochaeta continua sendo a classe de maior diversidade
cariotípica, 2n=22-190 (GREGORY e HEBERT, 2002).
Poucas famílias de poliquetas, como Capitellidae, Serpulidae, Dorvilleidae e
Nereididae, foram suficientemente estudadas para permitir generalizações acerca da evolução
de padrões cromossômicos (PESCH et al., 1988a). Um desses estudos cariotípicos
abrangentes foi realizado por ROBOTTI et al. (1991) em nove espécies do gênero
Ophryotrocha (Dorvilleidae). Este grupo apresenta uma grande uniformidade com relação à
morfologia, anatomia e fisiologia, mas um amplo espectro de estratégias reprodutivas. Apesar
de apresentarem variação em números diplóides, de 2n=6 até 2n=10, não foi observada uma
correlação direta entre alguns dos caracteres e os números diplóides. O conjunto de dados
analisados pelos autores possibilitou a inferência de que a evolução reprodutiva (variável) e a
morfológica (uniforme) não foram acompanhadas de evolução cariotípica e que, em geral,
existe bastante uniformidade cariotípica entre grupos de espécies que compartilham um
mesmo número diplóide. Tanto neste gênero como em Capitomastus (GRASSLE et al.,
1987), espécies com números diplóides conservados seguiram estratégias reprodutivas
divergentes, sem que isto implicasse qualquer mudança cromossômica. Todavia, o caso do
8
gênero Capitomastus é ainda mais extremo, já que a variabilidade está representada em todos
os níveis analisados: enzimas (com longas distâncias genéticas), reprodução, tipos de larvas,
como também sem encontrar correlações entre estas mesmas variáveis. A pergunta a ser feita
é: existe de fato uniformidade cariotípica?
As semelhanças reveladas por coloração convencional são pouco indicativas a respeito
de homeologias genéticas (SEUÁNEZ, 1987). Isto é especialmente válido para taxa mais
recentes, com compartimentalização de cromossomos reflectidos nas bandas G, e
heterocromatina presentes em praticamente todo o complemento cromossômico. Essas duas
características são as que facilitam (embora não promovam) mudanças cromossômicas
heteróticas.
Nos poliquetas, a técnica de bandeamento G foi aplicada com êxito em Ophryotrocha
diadema (DI e KNOWLES, 1992), poliqueta com 2n=8. Embora tenha sido aplicada a uma
única espécie do gênero, deve ser salientada a importância de ter sido detectada a presença de
bandas G em uma espécie de anelídeo, demonstrando que as mudanças evolutivas na
estruturação de segmentos cromossômicos, que levam à compartimentalização em
composição de bases (refletindo a formação das bandas G), já havia começado a operar em
invertebrados inferiores. Esta descoberta desmistifica a crença generalizada de que as bandas
de replicação tardia evoluíram nos primeiros deuterostômios ou nos primeiros cordados
(HOLMQUIST, 1989). DI e KNOWLES (1992) também assinalaram que a intensidade das
bandas detectadas era relativamente fraca e interpretaram tal resultado como uma
compartimentalização de bases de DNA pouco marcada.
A escassa heterocromatina, revelada por bandas C, em Platynereis dumerilii (JHA et
al., 1995) é uma característica compartilhada com o grupo de espécies do gênero
Ophryotrocha (VITTURI et al., 2000). Tendo em conta o ‘efeito de posição’ exercido pela
heterocromatina sobre a regulação gênica, quando ocorrem rearranjos cromossômicos, certos
genes podem modificar sua expressão pela proximidade de regiões heterocromáticas
(PARDUE e HENNIG, 1990). Se a heterocromatina é de fato escassa em poliquetas, então,
praticamente todo o DNA seria ativo e poderia estar se comportando como supergenes
adaptados. Como consequência, são escassos também os sítios cromossômicos inertes que
poderiam facilitar alterações na ordem gênica. Portanto, qualquer mutação estrutural exerceria
efeitos mais drásticos ou deletérios e, sendo assim, é de se esperar que a evolução cariotípica
neste grupo de animais tenha sido de fato lenta (VITTURI et al., 2000).
9
Se cariótipos conservados são de fato a norma nas diferentes linhagens de poliquetas,
ao mesmo tempo que polimorfismos de seqüências redundantes são encontrados (SELLA et
al., 1995; VITTURI et al., 2000; JHA et al., 1995), o grupo encontrar-se-ia no segundo ou
terceiro estágio do modelo de canalização cariotípica (BICKHAM e BAKER, 1979).
Indicando que, depois de terem estabelecido o cariótipo “ótimo” para a linhagem qualquer
rearranjo cromossômico com produção de heteroses negativa seria eliminado. Não é o caso
das mudanças heterocromáticas que, como é sabido, não apresentam heteroses negativa. Se o
caso for comprovado, certamente estaríamos na presença de mais um exemplo apoiando o
modelo de canalização de BICKHAM e BAKER (1979).
Em resumo, a abordagem citogenética de poliquetas é limitada quando comparada
com outros taxa. A escassez de heterocromatina e bandas G não oferece caracteres
citogenéticos do tipo a serem utilizados em comparações filogenéticas. Deste modo,
cariótipos e bandas NOR passam a ser, neste grupo, os caracteres que poderão refletir o curso
da evolução cariotípica.
1.2 O conhecimento corrente da citogenética dos poliquetas nereidídeos
A família Nereididae está organizada em 40 gêneros e cerca de 450 espécies. Desse
total, 46 espécies foram registradas na costa brasileira (SANTOS e LANA, 2001), sendo 14
na Baía de Paranaguá (LANA, 1984). Dentre os poliquetas, este é o grupo mais conhecido e
amplamente distribuído. O tamanho dos indivíduos pode variar de poucos milímetros, em
Micronereis, até um pouco mais de 1 m, em Neanthes virens. Quando vivos, podem ser
transparentes, marrons ou exibirem uma grande variedade de padrões de pigmentação em
diferentes cores (GLASBY, 1999; WILSON, 2000). A família é considerada monofilética
(GLASBY, 1993; ROUSE e FAUCHALD, 1997).
Os caracteres morfológicos distintivos da família são a presença de uma faringe
eversível composta de dois anéis, notopódios e neuropódios com cerdas compostas (Fig. 1),
sendo uma sinapomorfia do grupo as cerdas compostas do notopódio. Há um par de
mandíbulas na parte anterior da faringe e dois pares de olhos e quatro pares de cirros
peristomiais na região da cabeça.
Figura 1.: a, Faringe evertida com dois anéis (quando retraída, as
mandíbulas se localizam dentro da cabeça). b, cerda composta. Copyright
© 2004 Gre
g
Rouse.
a
b
10
As características reprodutivas apresentam uma ampla variação. A maior parte das
espécies é gonocórica, embora algumas sejam hermafroditas; a fecundação pode ser interna
ou externa. O tipo de reprodução mais conhecido é a epigamia, que envolve modificações
morfológicas em machos e fêmeas (o indivíduo modificado recebe o nome de epítoco),
seguidas de uma fase pelágica e fecundação externa na coluna d’água. Os epítocos podem ser
pouco ou marcadamente dimórficos. Platynereis dumerilii é uma das espécies mais bem
conhecidas, possuindo a forma epítoca bem descrita. No epítoco, os olhos são hipertrofiados,
os cirros dorsais e ventrais dos segmentos anteriores apresentam a base inflada, com
numerosas células sensoriais, importantes para a orientação dos parceiros durante a desova; a
região posterior caracteriza-se por uma mudança de coloração e por modificações parapodiais.
Os lóbulos e lígulas parapodiais sofrem hipertrofia, tornando-se lamelares ou foliáceos; as
setas apresentam forma de remos e são especializadas para a natação. O processo é
completado quando os epítocos nadam até a superfície e liberam seus gametas através da
ruptura do corpo. Logo após, o indivíduo morre. Em seguida, os ovos desenvolvem-se em
larvas que posteriormente sofrem assentamento. A duração do processo pode variar entre 1-2
semanas no caso de Platynereis dumerilii, dois meses em Nereis grubei e três meses em
Perinereis cultrifera (CLARK, 1961; SCHROEDER e HERMANS, 1975).
Sabe-se que mudanças na temperatura e/ou ciclo da lua, são estímulos ambientais para
os indivíduos entrarem em fase reprodutiva (LAST e OLIVE, 1999; HUTCHINSON et
al.,1995; MAZURKIEWICZ, 1975; KLESCH 1970).
Assim como os poliquetas em geral, os nereidídeos mostram uma capacidade
regenerativa bem desenvolvida, mas isto é particularmente evidente em condições naturais.
Uma espécie da família, Nereis virens, foi estudada a este respeito por LAST e OLIVE (1999)
em condições de laboratório. Eles analisaram diferentes fatores ambientais que poderiam
influenciar na regeneração e encontraram que o fotoperíodo era o fator mais crítico.
Demonstraram no seu trabalho que um fotoperíodo programado com 16h luz: 8h escuridão
(comparado com o ciclo inverso, 8:16), resultava em uma taxa de regeneração superior e,
além disso, também era maior a quantidade de segmentos adicionados antes de deterem
totalmente o crescimento. Em ambos os casos as diferenças eram estatisticamente
significativas.
Oito espécies da família Nereididae foram analisadas citogeneticamente, mostrando 10
cariomorfos diferentes. Representam 4 gêneros e a maioria das espécies apresentou um
11
número diplóide de 2n=28 (OMETZ, 1963; PESCH et al., 1988; WEINBERG, 1990; ZHENG
et al., 1992; SATO et al., 1992; LIPARI et al., 1994; JHA et al., 1995).
A Fig. 2 apresenta parte do cladograma dos gêneros da família Nereididae, destacando
os clados que contêm os gêneros de interesse nesta pesquisa (em sublinhado). O cladograma
foi construído a partir dos dados de caracteres morfológicos.
Até hoje só foram descritos cariótipos de populações ocorrentes no hemisfério Norte.
Os escassos estudos citogenéticos realizados até o presente momento, acentuam a importância
de se realizar uma abordagem genética (ou não-morfológica) como subsídio à taxonomia do
grupo.
O gênero Laeonereis está formado por duas espécies, das quais L. culveri espécie era
considerada restrita ao Atlântico Norte, enquanto L. acuta, estaria restrita Atlântico Sul
(PETTIBONE, 1971; ORENSANZ & GIANUCA, 1974). Encontra-se em andamento uma
revisão do gênero (Oliveira, segundo SANTOS, informação verbal), que evidencia que as
espécies são sinônimas e valida o nome mais antigo L. culveri. Até o momento não há na
literatura qualquer registro citogenético sobre o gênero.
O gênero Nereis compreende 134 espécies. Destas, N. oligohalina ocorre no oceano
Atlântico e é encontrada na região entre marés de manguezais e praias areno-lodosas. A
espécie ainda não foi estudada citogeneticamente, mas existem outras três espécies do gênero
já cariotipadas: Nereis diversicolor, 2n=28-32 (OMETZ, 1963), N. acuminata, 2n=18-22,
propondo a existência de um complexo de espécies irmãs (WEINBERG, 1990) e Neanthes
(Nereis) arenaceodentata, 2n=18-24, sugerindo a validação de espécies distintas (PESCH et
al.,1988).
Australonereis
Laeonereis
Dendronereides
Olganereis
Eunereis
Nereis
Platynereis
Neanthes
Perinereis
P
seudonereis
Figura 2: Cladograma
parcial dos gêneros da
família Nereididae
.
Rouse & Pleijel (2001).
12
O gênero Platynereis está formado por 20 espécies, das quais Platynereis dumerilii é
considerada cosmopolita, embora vários autores acreditem que sob este nome se abriga um
complexo de espécies com pouca diferenciação morfológica (HAGGER et al., 2002;
HUTCHINSON et al., 1998, 1995; JHA et al.,1997,1996,1995). Isto reforça a necessidade de
se realizar abordagens genéticas como suporte taxonômico. Além de ser o nereidídeo mais
bem estudado citogeneticamente, amostras populacionais de P. dumerilii estão sendo
mantidas em condições de laboratório há longa data e utilizadas como rotina em ensaios de
mutagênese ambiental (HAGGER et al., 2002; HUTCHINSON et al., 1998,1995; JHA et
al.,1997,1996). Esta espécie apresenta um cariótipo de 2n=28, NF=56, e os achados em
bandas C e NOR (JHA et al., 1995) revelaram escassa heterocromatina e dois pares
cromossômicos portadores de regiões organizadoras do nucléolo.
O gênero Neanthes está formado por 50 espécies, das quais apenas N. japonica foi
citogeneticamente analisada. Esta apresenta um número diplóide de 2n=28, NF=56, e a
particularidade de ser a primeira espécie da família na qual foi achado um sistema de
determinação do sexo do tipo XX-XY (SATO e IKEDA, 1992). Depois de Polydora curiosa
(Spionidae) (KORABLEV, 1999), é a segunda espécie de poliquetas a ser descrita com
cromossomos sexuais. Em ambos os casos, o cromossomo Y foi bem maior do que o X e
ambas as espécies, embora filogeneticamente distantes, ocorrem no Mar do Japão.
O gênero Perinereis, considerado polifilético, está composto de 60 espécies. P.
ponteni, P. anderssoni e P. vancaurica ocorrem no oceano Atlântico e são encontradas na
região entre marés. As duas primeiras espécies ocorrem em simpatria e haviam sido
consideradas sinônimas por HARTMAN (1959), embora tratadas como válidas por outros
autores (LANA, 1984; SANTOS, 1996; STEINER, 2001). Foram determinados os cariótipos
de três espécies do gênero: P. nuntia com 2n=28 (ZHENG et al., 1992), P. macropus com
2n=28 (LIPARI et al., 1994) e P. cultrifera com 2n=34 (OMETZ, 1963).
O gênero Pseudonereis compreende sete espécies. P. palpata está distribuída na região
Sul e Sudeste do Brasil e é encontrada na região entre marés, em costões rochosos entre tufos
de algas e em colônias do poliqueta sabelaríideo Phragmatopoma.
Os dados citogenéticos preliminares indicam que alguns membros da família
Nereididae podem ter sofrido diferenciação cromossômica não acompanhada de modificação
externa significativa, o que acentua a necessidade de se utilizar a citogenética como base para
refinamento dos estudos taxonômicos (PESCH, G.G.; PESCH, C.E.; MULLER, 1988).
13
1.3 Bandeamento cromossômico com impregnação de prata (NOR)
Os cromossomos podem ser bandeados longitudinalmente ou não, aplicando-se
diversas metodologias, entre as quais e amplamente utilizadas na citogenética clássica,
destacam-se as bandas C (revelando posição e quantidade de heterocromatina), as G
(mostrando o padrão de compartimentalização do DNA no genoma) e as NOR (ou RON, que
evidenciam as regiões organizadoras dos nucléolos).
As regiões organizadoras do nucléolo (NOR, do inglês Nucleolar organizer regions)
foram caracterizadas pela primeira vez por McCLINTOCK (1934), que igualmente atribuiu o
nome de NOR (ou RON) àquelas regiões cromossômicas responsáveis pela organização
nucleolar durante a intérfase mitótica. Cada organizador nucleolar corresponde a uma série
repetitiva de genes de RNAr (LEWIN, 2000). As NOR são uma exceção dentre os DNAs
transcritos por gerarem uma estrutura visível, o nucléolo, dentro do núcleo interfásico
(CLARK e WALL, 1996). O nucléolo é o sítio de formação dos ribossomos, ou seja, onde
eles são transcritos e processados. Os nucléolos são formados durante a telófase e a
transcrição cessa ao longo da mitose (MILLER, 1981; CLARK e WALL, 1996). Somente as
NOR ativas participam da formação do nucléolo. Normalmente existem várias NOR por
genoma e a quantidade pode variar de uma espécie para outra, assim como o tamanho e a
atividade em cada ciclo celular (SCHWARZACHER e WACHTLER, 1986). Os nucléolos
apresentam uma tendência à fusão, de modo que seu número por célula é usualmente inferior
ao número de NOR (MILLER, 1981).
Quando as NOR estão presentes em múltiplas cópias, usualmente são de localização
telomérica, o que minimiza os efeitos de intercâmbio entre cromossomos não homólogos
(MILLER, 1981), fenômeno que pode ser facilitado pela tendência à fusão nucleolar.
Esta técnica por impregnação de prata envolve a extração do ADN, ARN e histonas,
sugerindo que as proteínas residuais restantes da transcrição dos ribossomos seriam os
componentes corados pela prata. No entanto, a verdadeira natureza das proteínas responsáveis
pela impregnação ainda não é conhecida.
Pelo fato da técnica detectar unicamente NOR que estiveram ativas, é bastante comum
encontrar variação na quantidade de marcações inter- e intraindividualmente (INSUA e
THIRIOT-QUIÉVREUX, 1991; REN e XIANJUE, 1993; DERJUSHEVA et al., 1998;
VOLLETH, 1987, JHA et al., 1995; VITTURI et al., 2000; LIPARI e VITTURI, 1994).
Os trabalhos realizados em um grupo de espécies do gênero Ophryotrocha (SELLA et
al., 1995) são exemplos de como a aplicação de técnicas de bandeamento cromossômico,
14
neste caso NOR, proporciona informações que permitem inferir relações filogenéticas entre
grupos de espécies relacionadas. Estes trabalhos chegaram a propor que o cariótipo de O.
diadema (2n=8) teria se originado por fusão cêntrica a partir do cariótipo de O. robusta
(2n=10), dando seqüência à idéia, proposta inicialmente por ROBOTTI et al. (1991), de que o
2n=10 estaria representando o cariótipo primitivo dentro do gênero e a forma 2n=6 seria uma
condição derivada com redução de segregação independente (redução de variabilidade
genética). De um grupo de 10 espécies analisadas no gênero Ophryotrocha, novamente O.
robusta foi considerada ancestral pela presença de um só par de regiões NOR conservada,
enquanto o restante das espécies apresentou um alto grau de polimorfismos para este
marcador (VITTURI et al., 2000).
15
2 Objetivos
Há uma crescente necessidade de informações a respeito dos cariótipos para estudos
das relações evolutivas, citotaxonomia e dos efeitos potenciais de mutagêneses ambientais e
outros poluentes (JHA et al., 1995). A rica diversidade de morfologia, adaptações ecológicas,
estratégias reprodutivas e estilos de vida, entre outros, tem as suas bases na variação genética.
Apesar da importância ecológica, os conhecimentos genéticos sobre os poliquetas estão
restritos a relativamente poucas espécies (JHA et al., 1995). Em vista da clara importância
ecológica destes organismos, este trabalho objetivou caracterizar citogeneticamente espécies
de poliquetas nereidídeos ocorrentes na região litorânea do Paraná, na tentativa de fornecer
subsídios à taxonomia bem como propiciar uma melhor compreensão das relações
filogenéticas da família Nereididae.
Os objetivos específicos foram:
a) Desenvolver e padronizar condições de laboratório que permitam manter em cultura
as diferentes espécies a serem analisadas;
b) Determinar os cariótipos das diferentes espécies através da coloração convencional;
c) Caracterizar o padrão de distribuição das Regiões Organizadoras do Nucléolo
(RON) dos cromossomos.
16
3 Material e métodos
3.1 Material biológico e procedência
As espécies analisadas, sua procedência e ocorrência são indicadas na Tabela 1.
Tabela 1. Espécies analisadas.
Espécie Procedência – ambiente N Ocorrência
Platynereis dumerilii Ilha do Mel – Costão rochoso 11 Cosmopolita
Perinereis ponteni Ilha do Mel – Costão rochoso 46 Oceano Atlântico, desde
México até Brasil
Perinereis anderssoni Ilha do Mel – Costão rochoso 70 Costa Atlântica das Américas
Perinereis vancaurica Canal Perequê – Manguezal 4 Oceano Atlântico Sul
Nereis oligohalina Canal Perequê – Manguezal 18 Oceano Atlântico Ocidental
Pseudonereis palpata Ilha do Mel – Costão rochoso 4 Sul e Sudeste do Brasil
Laeonereis culveri Canal Perequê – Manguezal 20 Oceano Atlântico ocidental
Os indivíduos foram coletados em dois habitats diferentes na região costeira de Pontal
do Sul e Ilha do Mel. No costão rochoso da Ilha do Mel foram coletadas Perinereis ponteni,
P. anderssoni, Pseudonereis palpata e Platynereis dumerilii (S25º33’48,6” W48º19’05,2” e
S25º34’23,7” W48º18’35,4”). No manguezal do canal Perequê em Pontal do Sul foram
coletadas Perinereis vancaurica, Laeonereis acuta e Nereis oligohalina (S24º 34’25,7” W48º
34’23,7”) (Fig. 3).
Figura 3: a. Localidades de coletas do material biológico indicadas com setas; b. manguezal do canal Perequê;
c. Costão rochoso na Ilha do Mel.
As coletas foram realizadas de forma manual, preferencialmente nos períodos de maré
baixa. Os exemplares associados a algas e moluscos, nas rochas, foram isolados e separados
com auxilio de espátulas (Fig 3c). As espécies que ocorrem no manguezal foram coletadas em
amostras areno-lodosas, com auxílio de uma pá. Após isolados, os animais foram
a
b
c
17
acondicionados em recipientes plásticos com água do local, dentro de caixas de isopor, e
transportados até o laboratório em condições refrigeradas.
3.2 Condições de manutenção e manejo dos aquários
Uma vez no laboratório, os indivíduos foram mantidos em aquários arejados, com
água do mar proveniente da praia de Pontal do Sul, com pelo menos uma troca semanal. A
alimentação, a cada três dias, consistiu em uma mistura de espinafre triturado e alimento
comercial para organismos marinhos (Artemia salina em pasta).
Até abril de 2005, os aquários ficaram acomodados em uma prateleira distante da
janela, numa sala com uma ampla variação de temperatura. Naquelas condições, não foi
possível controlar o fotoperíodo incidente nos aquários nem a temperatura da água, que variou
de 15 a 26°C, o que resultou em dificuldades na obtenção de material citogenético,
relacionadas a dois fatores principais: 1) uma alta taxa de mortalidade como conseqüência da
entrada em fase reprodutiva dos indivíduos, quando cessa a atividade mitótica, 2) uma baixa
taxa de regeneração, relacionada com as variações de temperatura e o fotoperíodo.
A partir de maio do 2005, os aquários foram mantidos dentro de uma câmara
especialmente construída, na qual se mantiveram as condições de uma temperatura estável em
18°C e um fotoperíodo de 16h luz: 8h escuridão.
3.3 Obtenção de células mitóticas
A obtenção de tecido proliferativo é pré-requisito quando se pretende trabalhar com
metáfases. Em poliquetas, desprovidos de medula óssea, rim, ou linfócitos, estruturas
amplamente utilizadas na citogenética de organismos mais derivados, há duas alternativas
para a obtenção de metáfases. Uma delas é obter células mitóticas de tecido embrionário ou
larvas e a outra, utilizada neste trabalho, é a partir de tecido em regeneração.
Como já foi mencionado, os poliquetas sob certas condições apresentam uma alta taxa
de regeneração, além de uma região posterior em contínuo crescimento. A fim de aumentar a
quantidade de tecido em divisão os indivíduos tiveram sua região caudal amputada em
aproximadamente 1cm. A partir daí, esperou-se até duas semanas (em média), tempo
suficiente para o extremo posterior regenerar e evitar a diferenciação completa desta região
(Fig.4).
18
Figura 4: Extremo regenerando (parte mais clara).
3.4 Obtenção de metáfases
A técnica utilizada para a obtenção de metáfases foi baseada nas rotinas descritas por
JHA et al. (1995), para Platynereis dumerilii, com modificações adaptadas à utilização de
tecido regenerativo.
a. O indivíduo regenerado foi tratado com uma solução de Colchicina 0,05% em água
de mar durante 1h e 10 min, a 18°C.
b. O extremo regenerado foi amputado com bisturi e submetido a uma serie de
tratamentos hipotônicos de 10 min cada (água de mar: 0,06M KCl, nas proporções
2:1;1:1;1:2 e 1:3).
c. O restante do corpo foi conservado em formaldeído a 8% e, após dois dias,
transferido para etanol 70%, para posterior confirmação específica e, quando
possível, determinação do sexo.
d. Após o tratamento hipotônico o tecido foi pré-fixado em metanol-ácido acético
(3:1), na geladeira, por aproximadamente 20 min.
e. A solução foi retirada com pipeta e substituída por 1 ml de fixador. Este passo foi
repetido três vezes, em intervalos de 15 min cada um, e sempre trabalhando em
geladeira.
f. O tecido fixado foi mantido em freezer até ser utilizado na preparação das lâminas.
3.5 Obtenção de lâminas para estudos citológicos.
As lâminas foram previamente preparadas, sendo lavadas em detergente neutro, a
10%, enxaguadas em água corrente, secadas e colocadas em solução sulfocrômica (bicromato
de potásio- ácido sulfúrico). No dia seguinte foram retiradas, enxaguadas e novamente secas.
A seguir foram submersas em etanol PA e conservadas a 4ºC até serem utilizadas. Antes de
ser gotejado o material citológico, as lâminas foram novamente enxaguadas em água e
submersas em água destilada a 60°C. Na seqüência os seguintes passos foram observados:
19
a. O tecido, imerso em cerca de quatro a seis gotas de ácido acético glacial 60%, foi
colocado em uma lâmina côncava e, inicialmente, desagregado com ajuda de
agulhas e, posteriormente, com pipeta de Pasteur até virar uma suspensão
translúcida. O ácido acético foi utilizado para facilitar a desagregação celular.
b. A suspensão foi gotejada em várias lâminas molhadas e pré-aquecidas em banho
Maria a 60°C.
c. Alternativamente, gotas de suspensão foram colocadas em uma lâmina e o material
esmagado com uma segunda lâmina.
d. Em ambos os casos as lâminas foram secas ao ar.
3.6 Técnicas de coloração
3.6.1 Coloração convencional
As lâminas foram submersas em uma solução de Giemsa (Merck) a 10% em tampão
Sörensen, pH 6,8-7,0 (0,067M KHPO
4
, monofosfato de potássio) durante 10 minutos. Logo
após foram lavadas em água destilada e secas ao ar ambiente.
3.6.2 Bandeamento NOR (HOWELL e BLACK, 1980)
As lâminas, previamente analisadas em coloração convencional, foram lavadas em
duas trocas de xilol durante no máximo 5 min cada lavagem, até extrair todo resto de óleo de
imersão. Logo após, foram submersas em duas trocas de fixador metanol - acido acético
glacial 3:1 até o Giemsa ser eliminado. Posteriormente foram secas ao ar ambiente e os
seguintes passos foram obedecidos:
a. Os preparados foram incubados em uma solução de tampão borato (0,1M Na
2
SO
4
+
Na
2
B
4
O
7
), pH=0,0-9,2 a temperatura ambiente durante 7 min, lavados em água deionizada
e secados ao ar.
b. Após, foi colocado sobre o material uma parte de solução coloidal, a 5%, para duas partes
de nitrato de prata, a 50%, adicionando-se uma gota de formalina, a 1%, para cada ml de
prata. As soluções foram homogeneizadas com pipeta e cobertas com lamínula.
c. Em seguida foram acondicionados em uma câmara úmida a 70ºC, durante 4 a 9 min, até a
solução apresentar uma coloração caramelo-dourada com formação de pequenas bolhas de
ar.
20
d. Imediatamente foram lavados em água destilada, a seguir em tiosulfato de sódio 5%, e
secados ao ar.
3.7 Análise do material citogenético.
O material citológico foi analisado ao microscópio ótico e, em média, 10 metáfases
por espécie foram avaliadas quanto à morfologia e número cromossômico. Para esta análise,
as metáfases com cromossomos distinguíveis individualmente foram desenhadas em papel.
3.8 Fotografia
As melhores metáfases foram fotomicrografadas em um microscópio Zeiss equipado
com uma câmara fotográfica automática de 35 mm. Na maioria das fotos foi utilizado um
optovar de 1.25 até 2.0.
As fotomicrografias foram obtidas em filme preto e branco, Panatomic-X ISO 32,
35mm, revelado em D-76 (1:1). Após, foi fixado (fixador Kodak), durante 20-30min, lavado
em água corrente e seco ao ar. Nas ampliações foi utilizado papel fotográfico Kodak F3.
Alternativamente, algumas imagens de metáfases em coloração convencional foram
digitalizadas utilizando o sistema de captura Case Data Manager Expo 2.0, posteriormente
impressas em papel fotográfico.
3.9 Cariogramas e idiogramas
A partir das fotomicrografias foram montados os cariogramas dos indivíduos para,
posteriormente, serem digitalizados e mensurados no programa CorelPHOTO-PAINT 9. Os
dados das medições de cada um dos cromossomos foram inseridos em uma planilha do
EXCEL, previamente formatada para cálculo do índice centromérico, comprimento relativo e
erro padrão.
A morfologia cromossômica foi determinada segundo LEVAN et al. (1964).
Finalmente foram desenhados no WORD os idiogramas de cada uma das espécies com a
combinação de dados do índice centromérico e comprimento relativo. No Anexo 1 são
indicadas as fórmulas utilizadas para ambos os cálculos.
21
4 Resultados
4. 1 Resposta a cultivo em condições de laboratório
De todas as espécies mantidas em laboratório, somente Laeonereis culveri se mostrou
extremamente sensível, sobrevivendo, no máximo, apenas três semanas. Antes de se
conseguir controlar temperatura e fotoperíodo, a principal causa de morte nesta espécie, ao
menos no que foi possível se observar, parecia ser a entrada em fase reprodutiva. É sabido que
a espécie é induzida a se reproduzir com aumentos de temperatura, mas surpreendentemente,
após manutenção sob temperatura controlada e estável de 18-18,5°C, a taxa de mortalidade
aumentou significativamente. A profundidade do substrato e a riqueza em detritos do mesmo
são algumas das possibilidades a serem consideradas em futuros experimentos. Infelizmente,
não foi possível realizar testes e controles mais aprimorados para facilitar o cultivo da espécie.
As outras espécies, em particular aquelas dos gêneros Perinereis e Platynereis, foram
muito tolerantes à cultura em laboratório sob condições controladas de temperatura e
fotoperíodo, sendo que as mortes detectadas foram reduzidas e, na maioria dos casos,
resultantes do estresse inicial provocado pelo transporte. Também foi observada uma alta
tendência ao canibalismo em Perinereis anderssoni em relação a indivíduos da própria
espécie como também com os das outras espécies, particularmente quando a densidade
populacional no aquário era elevada. Contudo, nas condições controladas, foi possível manter
indivíduos vivos por mais de quatro meses até o processamento. Todos aceitaram bem o
alimento administrado.
Platynereis dumerilii, que também mostrou facilidade de cultivo, formava o seu tubo
poucos minutos após colocação no aquário, seja na superfície do vidro ou nas conchas
presentes no fundo.
4. 2 Otimização das técnicas de obtenção de metáfases e bandeamento
cromossômico
A obtenção de metáfases em geral, e em particular daquelas com uma qualidade
adequada para as análises com todos os cromossomos do complemento, devidamente
espalhados, com as cromátides nítidas e posição do centrômero evidente, foi a etapa mais
difícil de se reproduzir. A experiência acumulada sugere que para os próximos ensaios seja
realizada uma pré-seleção por faixa etária, priorizando etapas larvais e juvenis, já que
indivíduos mais jovens regeneram uma quantidade de segmentos significativamente maior do
22
que os adultos, no mesmo período de tempo e sob as mesmas condições ambientais. Maior
quantidade de segmentos regenerados reflete não somente uma maior taxa de divisão mitótica,
mas também indica que o ciclo de divisão mitótica está inversamente correlacionado à idade.
A aplicação da técnica de bandas C, conforme o preconizado por SUMNER (1972),
para a detecção da heterocromatina constitutiva foi realizada repetidas vezes sem se obter
êxito. Acreditamos que a falta de marcação não esteja refletindo ausência de heterocromatina
nas espécies analisadas, mas uma falha na extração diferencial de cromatina, devido ao grau,
em geral elevado, de contração cromossômica dos preparados.
Por outro lado, na técnica de bandeamento NOR, cujo mecanismo de ação é
independente do grau de contração da cromatina, marcações foram obtidas com relativa
facilidade. No entanto, foi inesperada a instabilidade das marcações nos preparados, que
simplesmente desapareciam em poucas horas, dificultando a obtenção de microfotografias de
boa qualidade, na maioria dos casos.
4. 3 Análise citogenética
Na tabela 2 são apresentados o total de indivíduos e metáfases analisadas para
determinar os cariótipos, índice centromérico e localização dos organizadores nucleolares. O
número de indivíduos analisados refere-se à quantidade de indivíduos que foram processados
citogeneticamente e dos quais se obtiveram metáfases. As metáfases analisadas referem-se ao
total de metáfases observadas ao microscópio. Foram utilizadas no cálculo do índice
centromérico somente aquelas metáfases com uma morfologia nítida que permitisse
identificar a localização do centrômero em todos os cromossomos do complemento. Em
bandas NOR são indicadas unicamente aquelas metáfases que apresentaram pelo menos uma
marcação.
Tabela 2. Resumo da análise citogenética nas espécies estudadas. N= quantidade de indivíduos processados;
Met. = metáfases; N/d= não determinado.
Espécie N Indivíduos
analisados
Metáfases
analisadas
Met. utilizadas
no I.C.
Met. Com
bandas NOR
Laeonereis culveri 20 6 17 N/d N/d
Nereis oligohalina 18 10 21 1 1
Platynereis dumerilii 117467 3
Perinereis ponteni 46 28 87 10 7
Perinereis anderssoni 70 28 209 10 17
Perinereis vancaurica 41 30 2 1
Pseudonereis palpata 42 23 6 7
23
Com exceção de Laeonereis culveri, que apresentou um número diplóide de 2n=38
cromossomos, todas as demais espécies de nereidídeos analisadas apresentaram um 2n=28,
com números fundamentais (=NF) que variam de 50 a 56. As diferenças mais marcadas entre
os cariótipos das distintas espécies começaram a se evidenciar a partir da construção dos
respectivos idiogramas. Nenhuma das espécies de nereidídeos evidenciou a presença de
cromossomos sexuais. As fórmulas utilizadas para os cálculos de índice centromérico e
comprimento relativo estão detalhadas no anexo 1.
4.3.1 Laeonereis culveri
4.3.1.1 Caracterização do cariótipo.
Laeonereis culveri apresentou um número diplóide de 2n=38. Não foi possível
determinar com precisão o NF devido à qualidade dos cromossomos da única metáfase
completa que foi achada
Foram analisadas 17 metáfases de seis indivíduos (Tabela 3). Embora o número modal
corresponda aos menores valores observados, a confirmação do 2n=38 foi realizada a partir da
observação de duas células não rompidas, no interior das quais se pode observar, a presença
de 38 elementos, como mostrado na metáfase da Figura 5. Devido à impossibilidade de
definir a localização do centrômero em todos os elementos do cariótipo, não foi possível
elaborar o idiograma de Laeonereis culveri.
Tabela 3: Análise do complemento cromossômico de Laeonereis culveri.
Número cromossômico
Células analisadas
N=17
31 ou menos 33 36 38
Quantidade de células 6 5 4 2
Porcentagem 35,3 29,41 23,52 11,76
Número cromossômico modal (2n)=29-31
Figura 5. Metáfase em coloração com convencional de Laeonereis culveri.
24
4.3.1.2 Bandeamento NOR
Nenhuma das metáfases tratadas com impregnação de prata exibiu marcações satisfatórias.
4.3.2 Nereis oligohalina
4.3.2.1 Caracterização do cariótipo
Nereis oligohalina apresentou um número diplóide de 2n=28 e NF=50 (Fig 6). O
complemento cromossômico está composto de sete pares metacêntricos, um par
submetacêntrico, três pares subtelocêntricos e três pares telocêntricos.
O complemento cromossômico foi caracterizado a partir da observação de 21
metáfases obtidas de três indivíduos (Tabela 4), nos quais o número modal de cromossomos
igual a 28 ocorreu em 57% das células analisadas. Metáfases com menos cromossomos do
que o número modal foram consideradas produto de rupturas celulares, ocorridas durante a
preparação das lâminas citológicas.
Tabela 4: Análise do complemento cromossômico de Nereis oligohalina.
Número cromossômico
Células analisadas
N=21
25 ou menos 26 27 28
Quantidade de células 6 3 ... 12
Porcentagem 28,57 14,28 0 57
Número cromossômico modal (2n)=28; NF=50
4.3.2.2 Bandeamento NOR em
Nereis oligohalina
Duas metáfases originárias de dois indivíduos, coradas com nitrato de prata,
mostraram quatro marcações. As localizações dos organizadores nucleolares foram
evidenciadas nas regiões teloméricas dos braços longo do par 1 e curto do par 12 (Fig. 6b e 7).
25
Figura 6: Cariograma de Nereis oligohalina em coloração convencional, organizado segundo o tamanho e
morfologia cromossômica (a); Bandeamento NOR (b). As setas indicam os cromossomos portadores da região
organizadora do nucléolo. As barras representam 10µm.
4.3.2.3 Idiograma de
Nereis oligohalina
O idiograma de N. oligohalina (Fig. 7) foi construído a partir das medições de uma
única metáfase. Por esse motivo na Tabela 5 não são indicados os valores do erro padrão.
a
b
26
Tabela 5: Medidas cromossômicas e classificação baseadas em uma única metáfase. “m”=metacêntrico;
“sm”=submetacêntrico; “st”=subtelocêntrico; “t”=telocêntrico; “T”=telocêntrico estrito.
Par cromossômico Comprimento
relativo (%)
(média ± 2SE)
Índice
centromérico
(média ± 2SE)
Morfologia
cromossômica
1
12,86 43,36
m
2
10,61 47,79
m
3
9,28 44,3
m
4
6,63 40,1
m
5
6,1 47,8
m
6
5,83 49,95
m
7
5,16 41,99
m
8
5,17 35,85
Sm
9
8,89 19,34
St
10
5,96 22,18
St
11
5,57 16,18
St
12
7,54 11,63
t
13
5,56 11,8
t
14
4,66 0
T
Figura 7: Idiograma dos cromossomos de Nereis oligohalina construído a partir dos valores do comprimento
relativo e índice centromérico apresentados na Tabela 5. As regiões escuras representam os organizadores
nucleolares.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m sm st t T
27
4. 3. 3 Platynereis dumerilii
4. 3. 3 . 1 Caracterização do Cariótipo
Platynereis dumerilii apresenta um complemento cromossômico de 2n=28, NF=56,
com todos os cromossomos bibraquiados (igual a dois braços distintos) distribuídos em 10
pares metacêntricos e quatro pares submetacêntricos (Fig. 8). Em dois dos indivíduos
analisados, observou-se um heteromorfismo no quarto par cromossômico (três metáfases no
total). Considerando que um mesmo indivíduo mostrou presença e ausência do
heteromorfismo, não existiria suspeita se tratar de cromossomos sexuais. Esta diferença
poderia ser explicada por uma contração cromossômica diferencial nesta fase mitótica.
A tabela 6 sintetiza os resultados dos números cromossômicos analisados em um total
de 46 células a partir de sete indivíduos adultos. As metáfases com números inferiores ao
valor modal de 2n=28 (56%) foram consideradas incompletas devido a rupturas celulares
ocorridas durante o preparado das lâminas citológicas.
Tabela 6.: Análise do complemento cromossômico de Platynereis dumerilii
Número cromossômico
Células analisadas
N=46
25 ou menos 26 27 28
Quantidade de células 15 3 2 26
Porcentagem (%) 32,6 6,5 4,4 56
Numero cromossômico modal (2n)=28
4.3.3.2 Bandeamento NOR de
Platynereis dumerilii
Três metáfases de dois indivíduos foram coradas com nitrato de prata. Em um dos
animais foram observadas duas marcações localizadas na região telomérica do par
cromossômico 7, enquanto que no outro, com quatro marcações, além do par 7, foi detectada
também uma marcação intersticial proximal no braço longo do par 1 (Fig. 8b e 9).
28
Figura 8: Cariograma de Platynereis dumerilii em coloração convencional com Giemsa (a); metáfase com
bandeamento NOR (b). As setas indicam os cromossomos portadores das regiões organizadoras do nucléolo nos
pares 1 e 7. As barras representam 10µm.
4. 3. 3 . 3 Idiograma de
Platynereis dumerilii
O idiograma de Platynereis dumerilii (Fig 9) foi construído a partir das medições de
sete metáfases obtidas dos três indivíduos analisados (Tabela 7).
7
1
a
b
29
Tabela 7: Medidas cromossômicas e classificação baseada em sete metáfases de Platynereis dumerilii.
”m”=metacêntrico; “sm”=submetacêntrico, SE = Erro padrão.
Par cromossômico Comprimento
relativo (%)
(média ± 2SE)
Índice
centromérico
(média ± 2SE)
Morfologia
cromossômica
1
13,29 ± 0,17 43,9 ± 05
m
2
11,36 ± 0,12 40,99 ± 0,62
m
3
10,56 ± 0 40,37 ± 0,08
m
4
9,2 ± 0,04 44,3 ± 1,29
m
5
7,03 ± 0,09 44,07 ± 1,17
m
6
6,23 ± 0,15 45,72 ± 1,07
m
7
5,68 ± 0 45,21 ± 0,11
m
8
5,56 ± 0,06 43,89 ± 0,54
m
9
5,16 ± 0,12 48,7 ± 1,98
m
10
5,01 ± 0,05 49,66 ± 0,01
m
11
5,01 ± 0,05 49,82 ± 0,06
m
12
6,13 ± 0,22 31,88 ± 0,26
sm
13
5,11 ± 0,28 31,87 ± 1,2
sm
14
4,6 ± 0,02 33,59 ± 1,19
sm
Figura 9. Idiograma da morfologia dos cromossomos de Platynereis dumerilii construído a partir dos valores do
comprimento relativo e índice centromérico (Tabela 7). As regiões escuras representam as regiões organizadoras
do nucléolo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m sm
30
4.3.4 Perinereis ponteni
4.3.4.1 Caracterização do Cariótipo
O cariótipo de Perinereis ponteni apresenta um número diplóide de 2n=28 e NF=54,
formado de 13 pares metacêntricos e um par telocêntrico pequeno (Fig. 10).
O número diplóide (2n = 28, 66,66%), foi caracterizado a partir da observação de 87
metáfases obtidas de 25 indivíduos (Tabela 8). Metáfases com mais ou menos cromossomos
do que o número modal foram consideradas produtos de rupturas e misturas celulares,
respectivamente, ocorridas durante a preparação das lâminas citológicas.
Tabela 8: Análise do complemento cromossômico de Perinereis ponteni.
Número cromossômico
Células analisadas
N=87
25 ou menos 26 27 28 29 ou +
Quantidade de células 17 11 9 58 4
Porcentagem 19,54 12,64 10,34 66,66 4,59
Número cromossômico modal (2n)=28; NF = 54
4.3.4.2 Bandeamento NOR em
Perinereis ponteni
Além de sete metáfases mitóticas de três exemplares, coradas com nitrato de prata,
também foram analisadas três metáfases meióticas (MI), onde se evidenciou um único par
cromossômico (par 1) com marcação na região telomérica do braço longo (Fig. 10b,c e 11).
31
Figura 10: Cariograma de Perinereis ponteni em coloração convencional, organizado em dois grupos conforme
a morfologia cromossômica (a); bandeamento NOR em uma metáfase mitótica (b); bandeamento NOR em duas
metáfase meióticas (MI) (c). As setas mostram os cromossomos portadores da região do organizador nucleolar.
As barras representam 10µm.
4.3.4.3 Idiograma de
Perinereis ponteni
O idiograma de Perinereis ponteni (Fig. 11) foi construído a partir das medições de
nove metáfases obtidas dos três indivíduos analisados (Tabela 9)
a
b
c
32
Tabela 9: Medidas cromossômicas e classificação baseada em nove metáfases de Perinereis ponteni.
”m”=metacêntrico; “t”=telocêntrico; SE= Erro padrão.
Par cromossômico Comprimento
relativo (%)
(média ± 2SE)
Índice
centromérico
(média ± 2SE)
Morfologia
cromossômica
1
13,57±0,05 45,67 ± 0,39
m
2
12,04±0,14 46,82 ± 0,42
m
3
11,67±0,08 45,67 ± 0,54
m
4
8,32±0,06 44,48 ± 0,23
m
5
6,53±0,07 45,65 ± 0,56
m
6
6,05±0,12 43,51 ± 0,83
m
7
6,01±0,03 43,59 ± 0,86
m
8
5,77±0,06 43,19 ± 0,62
m
9
5,68±0,06 45,32 ± 1,2
m
10
5,28±0,06 43,62 ± 0,46
m
11
5,14±0,1 42,19 ± 1,33
m
12
5,03±0,05 41,64 ± 1
m
13
4,73±0,06 38,19 ± 1,5
m
14
4,1±0,24 0 ± 0
t
Figura 11: Idiograma dos cromossomos de Perinereis ponteni construído a partir dos valores do comprimento
relativo e índice centromérico apresentados na Tabela 9. A região escura representa a região organizadora do
nucléolo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m T
33
4.3.5 Perinereis anderssoni
4.3.5.1 Caracterização do cariótipo
Perinereis anderssoni apresenta um complemento cromossômico de 2n=28, NF=56.
Os 14 pares cromossômicos bibraquiados foram agrupados em 10 pares metacêntricos e
quatro pares submetacêntricos (Fig. 12), conforme o índice centromérico.
Para a caracterização do número diplóide foram analisadas 209 metáfases de um total
de 70 indivíduos (Tabela 10). Metáfases que apresentaram números diplóides menores que o
modal (2n=28, 71%) foram consideradas incompletas como resultado de rupturas celulares
durante a preparação citológica.
Tabela 10: Análise do complemento cromossômico de Perinereis anderssoni.
Número cromossômico
Células analisadas
N=209
25 ou menos 26 27 28
Quantidade de células 31 13 15 150
Porcentagem 14,83 6,22 7,17 71,0
Número cromossômico modal (2n)=28; NF=56
4.3.5.2 Bandeamento NOR em
Perinereis anderssoni
Nas dezessete metáfases de quatro indivíduos, coradas com nitrato de prata, foram
evidenciadas de duas a dez marcações, sendo esta variação inter- e intraindividual. Na figura
12b se observa uma com quatro marcações. No idiograma (Fig. 13), foram representadas
aquelas com o número máximo de marcações observadas (= 10), com a seguinte distribuição:
regiões teloméricas do braço longo do cromossomo 7, do braço curto do cromossomo 8, do
braço curto e intersticial proximal do braço longo do cromossomo 11, e telomérica do braço
curto do cromossomo 12. Infelizmente as marcações desta metáfase foram perdidas, pois se
esvaeceram antes de serem fotomicrografadas. A reconstrução da localização das bandas foi
realizada tendo por base as metáfases em coloração convencional junto ao desenho
esquemático, em papel, das mesmas, porém bandeadas. Esse padrão de bandas foi observado
em cinco metáfases de um mesmo indivíduo, que apresentou de duas a dez marcações.
34
Figura 12: Cariograma de Perinereis anderssoni, em coloração convencional e organizado segundo a
morfologia cromossômica (a); bandeamento NOR de uma metáfase com quatro marcações (b). As setas indicam
cromossomos portadores do organizador nucleolar. As barras representam 10µm.
4.3.5.3 Idiograma de
Perinereis anderssoni
O idiograma de Perinereis anderssoni (Fig. 13) foi construído a partir das medições de
seis metáfases obtidas de quatro indivíduos (Tabela 11).
a
b
35
Tabela 11: Medidas cromossômicas e classificação baseada em seis metáfases de Perinereis anderssoni.
”m”=metacêntrico; “sm”=submetacêntrico; SE=Erro padrão..
Par cromossômico Comprimento
relativo (%)
(média ± 2SE)
Índice
centromérico
(média ± 2SE)
Morfologia
cromossômica
1
12,16 ± 0,15 41,34 ± 0,2
m
2
11,47 ±0,16 45,23 ± 0,7
m
3
10,77 ± 0,11 46,34 ± 0,43
m
4
8,18 ± 0,09 46,59 ± 0,3
m
5
6,72 ± 0,05 43,03 ± 0,9
m
6
6,33 ± 0,07 43,27 ± 0,79
m
7
6 ± 0,05 43,46 ± 0,72
m
8
5,6 ± 0,07 43,9 ± 0,9
m
9
5,25 ± 0,09 46,69 ± 0,73
m
10
4,79 ± 0,13 44,46 ± 0,76
m
11
6,68 ± 0,09 30,63 ± 0,54
sm
12
5,93 ± 0,07 33,32 ± 0,35
sm
13
5,24 ± 0,07 33,23 ± 0,48
sm
14
4,8 ± 0,05 33,84 ± 0,48
sm
Figura 13: Idiograma dos cromossomos de Perinereis anderssoni baseados nos valores do comprimento relativo
e índice centromérico apresentados na Tabela 11. As regiões escuras representam os organizadores nucleolares.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m sm
36
4.3.6 Perinereis vancaurica
4.3.6.1 Caracterização do cariótipo.
O complemento cromossômico de Perinereis vancaurica mostra um número diplóide
de 2n=28 e NF=56, com todos os elementos bibraquiados (Fig. 14). Conforme o índice
centromérico foram evidenciados 13 pares cromossômicos metacêntricos e um par
submetacêntrico.
O complemento cromossômico foi caracterizado a partir da observação de 30
metáfases de um único indivíduo, (Tabela 12). Metáfases com mais ou menos cromossomos
do que o número modal (2n=28, 70%) foram consideradas produto de rupturas e misturas
celulares, respectivamente, ocorridas durante a preparação das lâminas citológicas.
Tabela 12: Análise do complemento cromossômico de Perinereis vancaurica.
Número cromossômico
Células analisadas
N=30
25 ou menos 26 27 28 30
Quantidade de células 7 1 .. 21 1
Porcentagem 23,4 3,3 0 70 3,3
Número cromossômico modal (2n)=28; NF=56
4.3.6.2 Bandeamento NOR em
Perinereis vancaurica
Uma única metáfase (a mesma apresentada no cariograma) foi analisada com nitrato
de prata. O indivíduo apresentou dois pares cromossômicos portadores da região organizadora
nucleolar, em um deles localizada na região telomérica do braço longo do segundo par
cromossômico, e a outra localizada na região telomérica do braço curto do nono par
cromossômico (Fig. 14b e 15)
37
Figura 14: Cariograma de Perinereis vancaurica em coloração com Giemsa (a); bandeamento NOR (b). As
setas indicam os cromossomos portadores da região organizadora do nucléolo. As barras representam 10µm.
4.3.6.3 Idiograma de
Perinereis vancaurica
.
O idiograma de Perinereis vancaurica (Fig. 15) foi construído a partir das medições de duas
metáfases obtidas de um único indivíduo (Tabela 13).
a
b
38
Tabela 13: Medidas cromossômicas e classificação baseada em duas metáfases. “m”=metacêntrico;
“sm”=submetacêntrico; SE=Erro padrão.
Par cromossômico Comprimento
relativo (%)
(média ± 2SE)
Índice
centromérico
(média ± 2SE)
Morfologia
cromossômica
1
10,82 ± 0,36 40,01 ± 0,19
m
2
9,72 ± 0,12 45,14 ± 0,27
m
3
8,96 ± 0,25 40,31 ± 0,69
m
4
7,2 ± 0,09 45,62 ± 0,86
m
5
7,08 ± 0,1 47,35 ± 1,32
m
6
7,2 ± 0,15 41,58 ± 0,18
m
7
6,5 ± 0,3 45,65 ± 0,19
m
8
6,6 ± 0,06 45,88 ± 1,3
m
9
6,35 ± 0,03 49,01 ± 0,05
m
10
6,35 ± 0,02 46,91 ± 1,35
m
11
6,08 ± 0 41,86 ± 1,08
m
12
6,1 ± 0,01 43,98 ± 0,02
m
13
5,62 ± 0,04 46,52 ± 0,15
m
14
5,3 ± 0,14 29,07 ± 3,88
Sm
Figura 15: Idiograma dos cromossomos de Perinereis vancaurica baseando-se nos valores do comprimento
cromossômico relativo e índice centromérico (Tabela 13). As regiões escuras representam as regiões
organizadoras do nucléolo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m sm
39
4.3.7 Pseudonereis palpata
4.3.7.1 Caracterização do cariótipo.
Pseudonereis palpata apresenta um número diplóide de 2n=28, NF=56, com todos os
cromossomos bibraquiados (Fig. 16). O cariótipo está organizado em 11 pares cromossômicos
metacêntricos e três pares submetacêntricos.
O complemento cromossômico foi caracterizado a partir da observação de 23
metáfases de dois indivíduos (Tabela 14), sendo que 86,95% das metáfases analisadas
mostraram 2n=28. Metáfases com menos cromossomos do que o número modal de 28, são
consideradas produto de rupturas celulares, ocorridas durante a preparação das lâminas
citológicas.
Tabela 14: Análise do complemento cromossômico de Pseudonereis palpata.
Número cromossômico
Células analisadas
N=23
25 ou menos 26 27 28
Quantidade de células 1 ... 2 20
Porcentagem 4,34 0 8,69 86,95
Número cromossômico modal (2n)=28; NF=56
4.3.7.2 Bandeamento NOR em
Pseudonereis palpata.
Sete metáfases de dois indivíduos foram bandeadas com prata. Um dos indivíduos
apresentou uma única metáfase com duas marcações cromossômicas e o outro mostrou uma
metáfase com duas e cinco com uma. Em ambas as situações, as marcações foram localizadas
no telômero do braço curto do par 13 (Fig.16b,c e 17).
40
Figura 16: Cariograma de Pseudonereis palpata com coloração convencional, organizado segundo o tamanho
e morfologia cromossômica (a); bandeamento NOR com uma marcação (b) e com duas marcações (c). As setas
indicam os cromossomos portadores das regiões organizadoras do nucléolo. As barras representam 10µm.
4.3.7.3 Idiograma de
Pseudonereis palpata
O idiograma de P. palpata (Fig. 17) foi construído a partir das medições de 4
metáfases obtidas dos dois indivíduos analisados (Tabela 15).
a
b
c
41
Tabela 15: Medidas e classificação cromossômicas baseadas em quatro metáfases. “m”=metacêntrico;
“sm”=submetacêntrico; SE= Erro padrão.
Par
cromossômico
Comprimento
relativo (%)
(média ± 2SE)
Índice
centromérico
(média ± 2SE)
Morfologia
cromossômica
1
14,32 ± 0,26 46,48 ±0,33
m
2
12,95 ± 0,06 47,21 ± 0,27
m
3
11,93 ± 0,13 46,97 ±0,5
m
4
9,2 ± 0,13 41,59 ± 1,17
m
5
6,22 ± 0,11 42,75 ± 0,49
m
6
5,42 ± 0,03 40,73 ± 0,93
m
7
5,33 ± 0,09 45,06 ± 0,1
m
8
4,92 ±0,09 39,93 ± 0,3
m
9
4,62 ± 0,13 42,14 ± 0,3
m
10
4,47 ± 0,09 42,26 ± 1,02
m
11
3,8 ± 0,1 43,56 ± 0,67
m
12
7,63 ± 0,03 32,67 ± 0,8
sm
13
4,8 ± 0,03 34,61 ± 0,6
sm
14
4,3 ± 0,17 33,65 ± 0,6
sm
Figura 17: Idiograma de Pseudonereis palpata, construído a partir dos valores do comprimento relativo e índice
centromérico apresentados na Tabela 15. A região escura indica a posição do organizador nuleolar.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m sm
42
5 Discussão
A Tabela 16 sumariza o conjunto de dados citogenéticos das espécies da família
Nereididae obtidos no presente trabalho e aqueles descritos na literatura.
Tabela 16. Resumo dos dados citogenéticos de espécies da família Nereididae. Pro = procedência (IM = Ilha do
Mel, AN = Atlântico Norte, CP = canal Perequê, IT = Itália, CM = canal da Mancha, PN = Pacífico Norte, SC =
Escandinávia, RO = Rio Omoi -Japão); 2n = número diplóide; NF = número fundamental; N
o
NOR = quantidade
máxima de marcações NOR; int = localização intersticial; t = localização telomérica. N/d = Não determinado.
Fórmula cariotípica
Espécie Pro 2n NF
Msmst t T
N
o
NOR
Cromossomo
marcado
Platynereis dumerilii
(9)
IM 28 56 11 3 - - - 4 1 . int.
8 . t
Platynereis dumerilii
(1)
AN 28 56 7 7 - - - 4 5-6 . t
Perineris anderssoni
(9)
IM 28 56 10 4 - - - 10 7-8-11-12. t
11 . int
Perinereis ponteni
(9)
IM 28 “54” 13 - - - 1 2 1 . t
Perinereis vancaurica
(9)
CP 28 56 13 1 - - - 4 2-9 . t
Perinereis macropus
(2)
IT 28 56 6 5 3 - - 2 12-? . t
Perinereis nuntia
(3)
28 56 10 4 N/d
Perinereis cultrifera
(4)
CM 34 ? N/d
Pseudonereis palpata
(9)
IM 28 56 11 3 - - - 2 13 . t
Nereis oligohalina
(9)
CP 28 55 7 1 3 2 1 4 1-12. t
Nereis diversicolor
(4)(8)
SC
CM
28
32 ?
Nereis acuminata
(5)
AN
PN
22
18
22
36
-
4
-
-
-
5
-
-
11
-
N/d
Nereis arenaceodentata
(6)
AN
PN
24
18
26
34
1
1
-
-7
-11
1
N/d
Neanthes japonica
(7)
RO 28 56 - - Sis XX-XY N/d
Laeonereis culveri
(9)
CP 38
74/75
N/d
(1) Jha et al. (1995). (4) Ometz (1963). (7) Sato e Ikeda (1992).
(2) Lipari e Vitturi (1994). (5) Weinberg (1990). (8) Christensen (1980).
(3) Zheng et al (1992). (6) Pesch (1988). (9) Presente Trabalho.
Os tamanhos cromossômicos e números diplóides em poliquetas tendem a ser menores
e menos variáveis se comparados com outros invertebrados marinhos, como por exemplo, os
oligoquetas (2n=22-190, moda=36) (GREGORY e HEBERT, 2002). O número diplóide (2n =
28) de seis das sete espécies de nereidídeos analisadas no presente trabalho coincide com o da
maioria dos nereidídeos descritos na literatura (JHA et al., 1995; LIPARI e VITTURI, 1994;
ZHENG et al., 1992; SATO e IKEDA, 1992). As exceções a este padrão foram registradas em
Nereis arenaceodentata (2n=18-24) (PESCH, 1988), Perinereis cultrifera (2n=34), Nereis
43
diversicolor (2n=32) (Ometz, 1963), e Laeonereis culveri (2n=36) (presente trabalho).
Posterior à primeira descrição de N. diversicolor, acima mencionada, D. R. DIXON
(informação verbal em JHA et al., 1995), analisando material de varias localidades da costa
da Inglaterra, mostrou que o 2n para esta espécie é igual a 28, contrariando, assim, a
determinação original.
Uma particularidade dos poliquetas no tocante à variação no número cromossômico é
que esta às vezes está relacionada com o padrão reprodutivo, como é o caso de algumas
espécies da família Dorvilleidae (AKESSON, 1975), e do nereidídeo N. arenaceodentata
(2n=18-24) que exibe um modo de reprodução pouco comum entre os nereidídeos, já que os
juvenis são criados dentro do tubo com cuidados parentais. Situação similar e peculiar ocorre
em L culveri (2n=38), uma espécie gonocórica como a maior parte dos nereidídeos, mas sem
formação de epítoco. Os indivíduos reprodutores são átocos como muitos nereidídeos de água
doce e baixa salinidade (KLESCH, 1970).
O restante dos nereidídeos estudados, com 2n=28, passam pelo processo de epigamia
liberando seus gametas na água. Embora a variação no número diplóide dentro de um grupo
taxonômico não esteja, provavelmente, ligada a uma única causa ou efeito (KING, 1993), a
natureza conservadora do resto do grupo parece indicar que as variações cromossômicas
interespecíficas dentro dos nereidídeos estariam relacionadas de alguma maneira com o
padrão reprodutivo, embora os mecanismos ainda não estejam claros.
A análise dos dados das bandas NOR levou em conta o número máximo de marcações
observadas em pelo menos uma célula. Em alguns casos foram observadas variações em
número de marcações inter e intraindividualmente. A técnica de detecção de NOR, pela
impregnação de prata, permite detectar unicamente as que estiveram ativas na última
intérfase, isto é, que colaboraram com a produção de ribossomos para a replicação gênica. No
contexto desta discussão, interessa saber a quantidade total de regiões de seqüências de rDNA
no cariótipo, independente da sua atividade num ou outro ciclo celular.
5.1 Platynereis dumerilii.
Platynereis dumerilii é uma espécie presumidamente cosmopolita, embora seja
provável que este nome abrigue de fato um complexo de espécies (FAUCHALD, 1977). Os
dados citogenéticos de exemplares de P. dumerilii da Ilha do Mel (= IM), quando comparados
aos dos do Atlântico Norte (= AN)(JHA et al., 1995), mostraram semelhanças e diferenças.
Populações de ambas as localidades apresentaram o 2n=28, NF=56, e o comprimento relativo
44
dos cromossomos praticamente igual. As fórmulas cariotípicas diferem na quantidade de
cromossomos metacêntricos e submetacêntricos, o que sugere a ação de rearranjos
cromossômicos do tipo das inversões pericêntricas envolvidas na modelagem dos respectivos
cariótipos.
Esta afirmação está baseada na análise comparativa entre os idiogramas e tamanhos
relativos dos cromossomos envolvendo as duas populações: população NA (JHA et al., 1995)
e população IM, dados do presente trabalho, o que representa uma comparação mais realista
cromossomo a cromossomo. Ao reagrupar os cromossomos por tamanho, independente da
morfologia, as bandas NOR de P. dumerilii do AN ficam localizadas nos cromossomos 9 e
11, ambos metacêntricos pequenos, enquanto que as NOR de P. dumerilii da IM ficam
localizadas nos cromossomos 1 (intersticial) e 9.
Nas relações filogenéticas, a presença de um único par portador da NOR tem sido
considerada condição ancestral na maioria dos vertebrados (SCHMID 1978; AMEMIYA e
GOLD 1990), em alguns invertebrados (VITTURI et al., 1991), inclusive em poliquetas
(SELLA, VITTURI e RAMELLA, 1995), todos os demais fenótipos NOR (com dois ou mais
pares portadores das NOR) são considerados derivados (HSU et al., 1975). As NOR achadas
nos dois citótipos de P. dumerilii conduzem à hipótese de um cariótipo ancestral composto de
28 cromossomos bibraquiados e uma NOR localizada no cromossomo 9. Durante ou após a
radiação colonizadora da espécie, as NOR teriam se amplificado para outros cromossomos em
forma independente, gerando os dois citótipos NOR divergentes observados, cada um
ocupando hoje sua respectiva distribuição geográfica. P. dumerilii é a primeira espécie de
poliquetas a apresentar uma NOR de posição intersticial.
Apesar da existência destas diferenças elas não são suficientes para a argumentação de
que Platynereis dumerilii seja de fato um complexo de espécies, tendo em vista que mudanças
cromossômicas de adição de seqüências repetitivas, seja heterocromatina ou NOR, são
alterações cariotípicas consideradas neutras, não gerando, portanto, heteroses negativa, i.e.,
diminuição da fertilidade (KING, 1993), embora possam acompanhar a radiação adaptativa de
populações ou subpopulações, não têm a capacidade de causar divergência evolutiva nas
espécies.
Se existir tal complexo, as diferenciações específicas não estão se refletindo
citogeneticamente ou não existem entre as duas localidades analisadas (zonas de entre marés).
Neste caso, seriam interessantes estudos comparativos envolvendo populações entre marés
com aquelas de locais mais profundos.
45
5.2 Perinereis
O gênero Perinereis é considerado polifilético e é também um dos mais politípicos da
família. As três espécies analisadas, P. ponteni, P. anderssoni e P. vancaurica, além de
Perinereis macropus (LIPARI e VITTURI, 1994) e P. nuntia (ZHENG et al., 1992)
apresentaram um 2n=28, com diferenças nas fórmulas cariotípicas, isto é, na quantidade de
cromossomos em cada uma das categorias morfológicas com respeito à posição do
centrômero. Dentre estas, P. ponteni é a única espécie com o NF=54; ao contrário das outras
quatro espécies mencionadas, com todos os cromossomos bibraquiados (NF=56), o seu
cariótipo contêm um par telocêntrico (Fig 11; Tabela16 ).O surgimento de um elemento
telocêntrico pode ser produto de uma inversão pericêntrica. Porem, no caso particular de
Perineris ponteni, não se descarta a possibilidade de que o par telocêntrico, o menor do
complemento cromossômico, seja produto da preparação citológica, já que todas as metáfases
analisadas desta espécie apresentaram os cromossomos com um alto grau de contração.
As cinco espécies de Perinereis com 2n=28 e NF=56, mostram uma tendência à
estabilidade cariotípica. As diferenças nas fórmulas cariotípicas (localização do centrômero)
(Tabela 16), considerando a escassez geral de heterocromatina nestes organismos, levam a
supor que rearranjos cromossômicos do tipo das inversões pericêntricas foram os responsáveis
pela modelação dos diferentes cariótipos. Uma exceção à constância cariotípica foi observada
em P. cultrifera que mostrou o número diplóide discordante com o grupo (2n=34).
Em uma análise morfológica relativamente abrangente de nereidídeos com paragnatas
(BAKKEN e WILSON, 2005), foram estabelecidos quatro clados principais separando grupos
de espécies. Em dois destes clados localizam-se espécies do gênero Perinereis junto com
espécies do gênero Nereis e Neanthes, entre outros. P. cultrifera encontra-se num clado
distante, e mais derivado, daquele que inclui P. nuntia. A separação de P. cultrifera com base
na morfologia, do grupo de espécies com 2n=28, permite por enquanto supor que pode ter
existido mais de uma tendência cariotípica dentro do gênero Perinereis.
O padrão de localização cromossômica das NOR mostrou uma ampla variação dentro
do gênero Perinereis, exibindo de um a quatro pares cromossômicos portadores. Com base na
discussão anterior sobre Platynereis dumerilii, observa-se que P. ponteni é a espécie que
conserva a condição mais primitiva (um único par portador de NOR), enquanto P. macropus,
P. vancaurica e P. anderssoni apresentam condições mais derivadas por apresentarem mais
de um par cromossômico com NOR, embora não necessariamente formando um agrupamento
46
de espécies compartilhando algum caráter. De fato, a localização cromossômica das bandas
NOR nestas últimas três espécies é bastante diversa.
Com base na posição das NOR nos cariótipos, P. macropus, com uma de suas
marcações num metacêntrico pequeno, seria ancestral em relação a P. anderssoni, que
apresenta dois metacêntricos pequenos portadores. Este agrupamento mostra concordância
com a proposta de HUTCHINGS et al. (1991) (ver Anexo 3), na qual ambas as espécies
pertencem ao grupo 1B. Por outro lado, P. ponteni (com a NOR no par 1) e P. vancaurica
(nos pares 2 e 9) indicam origens independentes às duas mencionadas anteriormente e
igualmente independentes entre si. Sem dúvida, há a necessidade de se analisar um número
maior de espécies para preencher estas lacunas e melhor esclarecer as relações cariotípicas
entre as espécies do gênero Perinereis, gênero reconhecidamente polifilético.
5.3 Pseudonereis palpata
P. palpata apresentou também o número diplóide mais comum dentre os nereidídeos,
2n=28, e um cariótipo semelhante aos das espécies do gênero Perinereis, pela presença dos
três primeiros cromossomos de tamanho relativamente maior ao resto do complemento. A
presença de um único cromossomo portador da NOR revela a conservação de uma condição
ancestral.
5.4 Nereis e Neanthes
Nereis é o gênero mais diversificado cariotipicamente da família. Duas das espécies
listadas na Tabela 18, Neanthes japonica (segundo SATO e IKEDA, 1992) e Nereis
diversicolor (segundo OMETZ, 1963), já foram posteriormente referidas ao gênero Hediste
(FONG e GARTHWAITE 1994).
Os nomes Neanthes arenaceodentata, Nereis acuminata e Neanthes caudata têm sido
aplicados indistintamente a populações de nereidídeos com ampla distribuição no Atlântico
norte, tanto na Europa como nas costa pacífica e atlântica dos Estados Unidos. Não é objetivo
deste trabalho clarificar a confusa história taxonômica deste táxon, considerado cosmopolita,
com base nas semelhanças morfológicas de espécies geograficamente isoladas. Apesar disto, é
quase certo que sob este nome se abriga um complexo de espécies morfologicamente muito
próximas, como sugerido a seguir. PESCH et al. (1988), analisaram duas populações referidas
a Neanthes (Nereis) arenaceodentata, respectivamente da costa da Califórnia (Pacífico dos
47
USA) e do Connecticut (costa Atlântica dos EUA). As diferenças cariotípicas: 2n=18, NF=34
(oito pares bibraquiados) e 2n=22, NF=24 (um par bibraquiado), fizeram com que estes
autores reconhecessem estas populações como pertencentees a espécies distintas.
Posteriormente, WEINBERG et al (1990) analisaram também duas populações alopátricas de
Nereis acuminata da Califórnia (Pacífico) e Connecticut (Atlântico), mas de localidades
diferentes às de PESCH et al. (1988). Novamente, as diferenças cariotípicas achadas: 2n=18,
NF=36 (Pacífico) e 2n=22, NF=22 (Atlântico), somada ao isolamento reprodutivo observado
em laboratório, levaram os autores a propor a existência de um complexo de espécies irmãs.
Em resumo, os dados citogenéticos e comportamentais, apresentados por WEINBERG
et al. (1990) e PESCH et al. (1988), sugerem que a as populações do Pacífico representam
uma nova espécie distinta daquelas populações descritas no Atlântico. Adicionalmente, cada
uma das espécies seria politípica devido à existência de populações com diferentes NF. É
bastante provável que situações similares ocorram com outros taxa de Nereididae, atualmente
reconhecidos como cosmopolitas, mas que se revelarão verdadeiros complexos de espécies,
com a intensificação de estudos ecológicos, citogenéticos e moleculares.
A espécie Nereis oligohalina compartilha o 2n=28 com a maioria das espécies de
nereidídeos. No entanto, quando comparada com outras espécies do gênero, como N.
acuminata e N. arenaceodentata, mostra-se bem distante do ponto de vista da citogenética.
FAUCHALD (1977) afirmou que Nereis como gênero constitui um grupo heterogêneo de
espécies que pode ser dividido em diferentes grupos menores mais ou menos homogêneos,
mas tal revisão ainda necessita ser feita.
5.5 Laeonereis culveri
Esta foi a única espécie a apresentar um número diplóide superior ao característico
2n=28, e também o maior número até agora registrado para a família, 2n=38.
Filogeneticamente encontra-se em uma posição basal e bem distante das outras espécies já
apresentadas. Uma outra característica distintiva da espécie foi a presença de uma quantidade
extremamente elevada de nucléolos (revelados pela impregnação de prata), na ordem de 20
marcações em média. Nas demais espécies analisadas, o número de nucléolos nas células
interfásicas, concordante com o número de cromossomos portadores das NOR, alcançou um
máximo de cinco marcações por célula. Embora não tenha sido possível o bandeamento NOR
nas metáfases de L. culveri, a quantidade de nucléolos observada leva a supor a existência de
numerosos cromossomos portadores de NOR, sugerindo uma elevada capacidade de
48
amplificação e dispersão de seqüências rDNA entre cromossomos não homólogos. Esta
marcada diferença no número diplóide sugere que a separação desta espécie, em relação às
demais, teria acontecido na origem do grupo taxonômico e seguido um curso independente de
evolução cariotípica.
5.6 Nereididae
A uniformidade cariotípica já sugerida por JHA et al. (1995), foi reafirmada com o
incremento de mais seis espécies caracterizadas por um número diplóide de 2n=28, NF=56.
Neste sentido, a família Nereididae não é um caso particular de uniformidade cromossômica.
As famílias Capitellidae, Nephtyidae, Syllidae e Dorvilleidae têm números diplóides
relativamente uniformes (Anexo 2). Ao nível de família ou sub-família, estas estão
caracterizadas na sua maior parte por números cromossômicos pouco variáveis, e cada grupo
pela sua vez é distinguível dos outros. Em um nível hierárquico inferior de classificação
(gênero e espécie), observa-se ainda menos variação, o que indica que as espécies recentes
tenham sofrido especiação na ausência de rearranjos cromossômicos. Por outro lado, as
diferenças existentes entre as categorias superiores, com 2n=6 a 2n=64, indicam que durante a
origem e estabelecimento das famílias modernas existiu um período de marcada evolução
cromossômica, seguido de diversificação morfológica não acompanhada de mudanças
cromossômicas significativas. Um padrão similar foi observado em famílias de tartarugas
(BULL, MOON e LEGUER, 1974; BICKHAM, e BAKER, 1976).
Pseudonereis palpata, uma das espécies cariotipicamente uniforme dentro da família,
é endêmica das águas do Atlântico Sul, sugerindo que a estabilidade cromossômica do grupo
teria sido atingida antes dos membros da família colonizarem a atual costa do Atlântico Sul.
Todas as famílias de poliquetas, incluindo a maioria dos seus gêneros, têm sido
reportadas em todos os oceanos e em todas as profundidades (GLASBY e ALVAREZ, 1999).
Segundo FAUCHALD (1984), a ampla distribuição das famílias e gêneros é conseqüência da
antiga história evolutiva do grupo. Os escassos registros fósseis mostram que as famílias
atuais teriam se diferenciado bem antes da ruptura da Pangea, em contraste com os teleósteos,
equinodermos e crustáceos, que experimentaram radiação posterior.
O fator que parece estar correlacionado com o padrão de estabilidade cromossômica é
a idade geológica do grupo. Esse tipo de estabilidade dentro de grupos antigos de espécies é
explicado pelo “Modelo de Canalização” de BICKHAM e BAKER (1979), ou seja, o nível
taxonômico no qual ocorre variação cromossômica está correlacionado com o tempo
49
evolutivo em que a linhagem tenha ocupado uma zona adaptativa. No gênero Ctenomys
(Rodentia), por exemplo, surgido há menos de 2 milhões de anos, as variações cromossômicas
atingiram o nível específico (BIDAU, GIMENEZ e CONTRERAS, 1996; MASCHERETTI et
al., 2000).
O Modelo de Canalização prediz que a evolução cromossômica é mais rápida
imediatamente após as colonizações de novas zonas adaptativas e que a estabilidade
cromossômica caracteriza linhagens que tenham evoluído para um cariótipo ótimo na sua
respectiva zona adaptativa. Neste ponto, então, a progressão do processo evolutivo fica por
conta de mudanças gênicas sem perturbação da estrutura cromossômica. No contexto deste
modelo, os autores formularam a hipótese de que os diferentes graus de estabilidade
cromossômica não estariam relacionados, primariamente, com a estrutura social das
populações (baixa fertilidade, alta capacidade de movimentação e delimitação de nichos),
como sugerido para explicar a uniformidade cariotípica em Cetacea (ARNASON et al.,
1980)), mas com o tempo de permanência destes grupos em suas zonas adaptativas.
O modelo poderia tentativamente explicar o curso evolutivo nos poliquetas, em
especial nos Nereididae, mas está ainda longe de ser conclusivo. Varias são as dificuldades
impostas pela natureza do modelo, destacando-se a absoluta ausência de evidências a favor do
valor adaptativo inerente ao cariótipo de um organismo, principal premissa do modelo.
As espécies atuais da família apresentam uma das características mais favoráveis à
conservação cariotípica: genomas pequenos com quase ausência de regiões heterocromáticas,
ou neutras; característica compartilhada por espécies da Classe Hirudinea (VITTURI et al.,
2002).
As características na estrutura dos genomas e o potencial dos elementos transponíveis
causando rupturas em sítios particulares, podem levar à formação de certos tipos de rearranjos
envolvendo cromossomos específicos ou genomas inteiros. A aparente uniformidade
cromossômica encontrada em famílias de plantas e animais (KING, 1993), sugere que
genomas particulares têm um alto potencial de mudança, enquanto outros permanecem
congelados no tempo. O tipo e a freqüência dos rearranjos cromossômicos dependem da
estrutura e organização do DNA. Se como observado por (COLLINS e RUBIN, 1984), os
sítios de inserção de elementos móveis não são aleatórios, os sítios e as freqüências dos
rearranjos cromossômicos também não são.
O que levou a estes genomas a interromper a reestruturação de seus cariótipos foram
provavelmente fatores adaptativos, de difícil determinação nas condições metodológicas hoje
50
disponíveis. O atual conhecimento sobre a citogenética dos nereidídeos não deixa dúvidas de
que existe uma constância no número diplóide e NF, ao mesmo tempo que a morfologia
cromossômica atingiu certo grau de variação. Na medida em que as inversões pericêntricas
constituem-se, aparentemente, no único tipo de rearranjo capaz de alterar a posição do
centrômero sem modificar o 2n e NF, é provável que seja este o principal mecanismo de
evolução cromossômica operando nos gêneros e espécies atuais da família.
6 Conclusões
- Para o estabelecimento de rotinas laboratoriais para trabalhos citogenéticos, as espécies
dos gêneros Perinereis, Nereis, Pseudonereis e Platynereis reagem satisfatoriamente às
condições de cultivo, aceitam alimento artificial e são capazes de entrar em fase
reprodutiva. Laeonereis culveri mostrou-se muito mais sensível em condições de
laboratório.
- A taxa de regeneração de tecido é dependente do fotoperíodo e da faixa etária.
- Os cariótipos determinados em Perinerei ponteni (2n=28; NF=55), P. anderssoni (2n=28;
NF=56), P. vancaurica (2n=28; NF=56), Pseudonereis palpata (2n=28; NF=56), Nereis
oligohalina (2n=28; NF=56) e Platynereis dumerilii (2n=28; NF=56) reafirmam mais uma
vez a estabilidade cariotípica das espécies de Nereidídeos. A conservação dos números
diplóides, números fundamentais e, por outro lado, as variações nas fórmulas cariotípicas
indicam que as inversões pericêntricas representam, aparentemente, o principal
mecanismo responsável pela evolução cromossômica na família Nereididae.
- As poucas diferenças encontradas entre Platynereis dumerilii do Atlântico Norte (2n=28;
NF=56), e P. dumerilii da Ilha do Mel (Paraná, Brasil) (2n=28; NF=56), reveladas nas
suas fórmulas cariotípicas e localização cromossômica das NOR, não apoiam a idéia da
existência de um complexo de espécies, mas sim de espécie politípica.
- As localizações cromossômicas das regiões organizadoras do nucléolo (NOR) permitiram
relacionar Perinereis anderssoni a P. macropus, sendo esta última ancestral em relação à
primeira.
- As bandas NOR presentes em Perinereis ponteni e P. vancaurica têm origens
independentes.
51
- Laeonereis culveri com 2n=38, mostrou o maior número diplóide encontrado na família
Nereididae. Mostrou-se também distinta no que se refere às NOR, devido à presença de
numerosas marcações com nitrato de prata.
- A estabilidade cariotípica tem atingido o nível de família no caso dos poliquetas. A
diversidade em números diplóides, 2n=6 até 2n=64, indica que durante a origem e
estabelecimento das famílias modernas (antes da ruptura da Pangea) a evolução
cromossômica teve um papel importante, seja causal ou não. Ocorreu em um período
restrito (não necessariamente curto) de radiação adaptativa do grupo, deixando de operar
durante os processos de dispersão ou vicariância posteriores, o que propiciou um período
de conservação cariotípica que se estende até a época atual. Já nos níveis genéricos e
específicos, as mudanças cromossômicas operantes são do tipo neutro, envolvendo
principalmente inversões pericêntricas em algumas famílias e fusões cêntricas em outras.
- Os achados citogenéticos aqui relatados são inéditos à América do Sul.
52
GLOSSÁRIO
BIBRAQUIADO: cromossomo de dois braços
CARIOGRAMA: representação gráfica do cariótipo, tomando-se em conta o número e
morfologia cromossômica.
CARIOMORFOS: refere-se aos diferentes cariótipos presentes numa espécie polimórfica
(dentro de uma mesma população) ou politípica (em subespécies diferentes).
CARIÓTIPO: conjunto de características cromossômicas de uma determinada espécie, entre
outros, números diplóide e fundamental, morfologia e padrões de bandas cromossômicas.
EFEITO DE POSIÇÃO: diferença na expressão fenotípica de um ou mais genes causada por
uma modificação em sua relação espacial com outros genes no cromossomo.
EPIGAMIA: modificação estrutural no indivíduo adulto em um estágio reprodutivo ou
epítoco.
FUSÃO CÊNTRICA: a fusão de dois cromossomos acrocêntricos para formar um
cromossomo bibraquiado.
GENOMA: conteúdo genético dos cromossomos.
GONOCÓRICO(A): indivíduo com gônadas funcionais de apenas um sexo; população
reprodutora composta de indivíduos machos e fêmeas.
HETEROCROMATINA (CONSTITUTIVA): segmento cromossômico que se apresenta
permanentemente condensado; geneticamente inactivo; composto por DNA altamente
repetitivo e que replica tardiamente na fase S.
HETEROMORFISMO (CROMOSSÔMICO): cromossomos homólogos que diferem em
tamanho ou morfologia.
HETEROSES: superioridade do heterozigoto em relação ao homozigoto respeito de um ou
mais caracteres; também conhecido como vigor híbrido. É o resultado fenotípico da
interacção gênica em heterozigotos.
HOMEOLOGIA: refere-se à homologia residual de cromossomos originalmente homólogos.
IDIOGRAMA: representação esquemática do cariótipo, fundamentada em medições do
índice centromérico e tamanho relativo dos cromossomos.
INVERSÃO PERICÊNTRICA: rearranjo cromossômico que envolve duas quebras em dois
locais distintos do cromossomo, com o centrômero entre as duas quebras, seguido de um giro
de 180º do fragmento e posterior fusão deste ao restante do cromossomo. Na maioria dos
casos, a posição relativa do centrômero é alterada.
LÍGULA: projeção cônica ou arredondada dos parapódios.
NEUROPÓDIO: ramo ventral do parapódio.
NF (NÚMERO FUNDAMENTAL): o número de braços cromossômicos de um cariótipo.
NOTOPÓDIO: ramo dorsal do parapódio.
PARAGNATA: dentículos esclerotizados presentes na probóscide dos nereidídeos .
POLITÍPICA: uma espécie é dita politípica quando composta de várias subespécies, um
gênero quando formado de várias espécies.
PROSTÔMIO: região anterior, região do corpo pré-segmentar e pretrocal com origem na
larva episfera; olhos e antenas, quando presentes, localizam-se no prostômio.
SEGREGAÇÃO INDEPENDENTE: quando os membros de um par alélico se transmitem
aos gametas de forma independente dos membros de qualquer outro par alélico.
SUPERGENES: conjunto de dois ou mais genes fisicamente ligados no cromossomo e que
são herdados como uma unidade.
53
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59
ANEXO 1
Fórmulas utilizadas nos cálculos do Índice Centromérico e comprimento relativo. IC=Índice
centromérico; bc=braço curto; lt=comprimento total
IC (x)=
()
bc lt x
N
÷
∑
100
Variança. s
2
=
(
)
1
2
−
−
∑
n
xx
i
Desvío. S=
2
s
Error padrão. ES=
n
σ
Morfologia=IC ± ES
Comprimento relativo =
χ
χ
T
Compl
∑
x 100
onde X
T
=média do comprimento de um par cromossômico dado,e
X
Compl
=média do comprimento dos complementos cromossômicos.
Na prática, os dados das medições cromossômicas e as fórmulas foram inseridos numa
planilha do Excel.
Clasificação cromossômica segundo Levan (1972)
IC Cromossomo Nomenclatura
50 metacêntrico M (isocromossomo)
50-37,5 metacêntrico M
37,5-25 submetacêntrico Sm
25-12,5 subtelocêntrico St
12,5-0 Telocêntrico T
0 Telocêntrico T
60
ANEXO 2
Tabela 17. Números cromossômicos de espécies pertencentes a outras famílias de poliquetas.
Família Espécie 2n-NF Ref.
Capitellidae
Capitella TXFF 18 1
Capitella MB/sl 20 1
Capitella ORL 20 1
Capitella sp. Ia 20 1
Capitella sp. I 20 1
Capitella OSLO/11 26 1
Capitella sp. II 26 1
Capitella sp. IIIa 26 1
Capitella NYB 26 1
Capitomastus sp 18 1
Capitomastus YAK 26 1
Capitomastus LINK 26 1
Nephthyidae
Nephtys incisa 38-76 2
Nephtys hombergi 36 3
Syllidae Sub-F: Exogoninae
Parapionasyllis labronica 12-24 4
Parapionasyllis elegans 12-24 4
Pseudobrania clavata 12-24 4
Exogone naidina 8-16 4
Exogone brevipes 16 5
Sphaerosyllis austriaca 14-28 4
Sphaerosyllis pirifera 14-28 4
Sphaerosyllis bulbosa 18 5
Sub-F: Eusyllinae
Syllides fulva 18 4
Sub-F: Syllinae
Syllidea armillaris 26-52 4
Sub-F: Autolytinae
Autolytus edwarsi 12 3
Autolytus prolifer 12 3
Proceraea picta 84
Proceraea macrophthalma 10 4
Dorvilleidae
Ophryotrocha costlowi 6-12 6
O sp. macrovifera 6-12 6
O. notoglandulata 6-12 6
O. sp.l.pacifica 6-12 6
O. l. labronica 6-12 6
O. p. puerilis 8-16 6
O. p. siberti 8-16 7
O. diadema 8-16 6
O. hartmanni 10-20 6
O. gracilis 10-20 6
O. robusta 10-18 6
Spionidae
Polidora curiosa 34 8
Serpulidae
Pomatoceros lamarkii 24 9
Pomatoceros triqueter 24 9
61
Archiannelida
Dinophilus gyrocilatus 32 10
1. Grassle JP (1987)
2. Pesch et al (1988b)
3. Christensen (1980)
4. Curini-Galletti et al (1991)
5. Congetti-Varriale (1967)
6. Vitturi et al (2000)
7. Robotti et al (1991)
8. Korablev et al (1999)
9. Dixon et al (1998)
10. Martin e Traut (1987)
62
ANEXO 3
HUTCHINGS, REID e WILSON (1991) organizaram as espécies do gênero Perinereis em
um agrupamento informal de acordo com o número de paragnatas em forma de barra
presentes na região VI da faringe: grupo 1 - espécies com uma paragnata em barra; grupo 2,
espécies com duas paragnatas em barra; grupo 3, com três ou mais paragantas em barra. Cada
um destes grupos foi, por sua vez, subdividido em A e B, sendo que as espécies incluídas no
subgrupo A são aquelas que apresentam lígula notopodial dorsal não expandida, enquanto
que as que pertencem ao subgrupo B, lígula notopodial dorsal expandida. (Fig. 18)
Figura 18: A, lígula notopodial de parapódios posteriores expandida (lino); B, paragnatas em forma de barra
(pg).
A
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